KR20170139095A - 면역세포 함유 조성물의 제조방법 및 암 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
단핵구를 NK 세포, NKT 세포 및 T 세포로 균형적으로 분화시키고, 이것들의 세포를 증식시키는 방법을 제공하는 것. 본 발명은 IL-2 및/또는 IL-15와, 항-CD16 모노클로널 항체를 포함하는 배지 중에서 단핵구를 배양하는 제1 공정과, 상기 제1 공정 후에, 단핵구를 우선적으로 세포 상해성 T 세포로 분화시키는 조건 하에서 배양을 실시하는 제2 공정을 포함하는 면역세포 함유 조성물의 제조방법을 제공한다. 상기 제2 공정 후에는, IL-2 및/또는 IL-15와, 항 CD16 모노클로널 항체를 포함하는 배지 중에서 배양을 실시하는 제3 공정을 포함할 수도 있다.
Description
본 발명은 면역세포 함유 조성물의 제조방법 및 암 치료용 조성물에 대한 것이다.
최근, 암의 치료에 있어서, 다양한 방법이 개발되고 있다. 특히, 환자의 체내의 면역력을 강화하는 면역요법이 주목받고 있다. 면역요법으로서는 예를 들면, 세포면역요법 등을 들 수 있다.
세포면역요법은 환자 유래의 면역세포를, 생체 외에서 활성화 및 증식 등 시킨 후에, 다시 그 환자의 체내로 되돌림으로써, 당해 환자의 면역력을 높이는 것으로 양자면역요법 등으로도 불린다. 예를 들면, 세포면역요법의 하나인 LAK 요법은 환자로부터 채취한 혈액으로부터 단핵구를 분리하고, 이것을 주로 세포 상해성 T 세포 등으로 분화시켜서 환자의 체내로 되돌리는 것이다. 또, 다른 세포면역요법으로서 NK 세포 등의 세포를 사용하는 방법이 알려져 있었다(예를 들면, 특허문헌 1).
한편, 본 발명자들은 종래의 세포면역요법과 같이, 단핵구를 세포 상해성 T 세포 등의 단일의 면역세포로 분화시키고, 이것을 증식시켜서 수득된 배양물을 생체 내로 되돌려 보내도, 생체내의 면역력을 반드시 강화할 수 없다는 점을 발견했다. 따라서 본 발명은 단핵구를 복수의 면역세포(특히, NK 세포, NKT 세포 및 T 세포)로 균형적으로 분화시키고, 이것들의 세포를 증식시키는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 면역세포의 제조방법에 있어서, 소정의 세포 배양공정을 조합시킴으로써 과제를 해결할 수 있다는 점을 찾아내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명은 구체적으로는, 이하와 같은 것을 제공한다.
(1) IL-2 및/또는 IL-15와, 항-CD16 모노클로널 항체를 포함하는 배지 중에서 단핵구를 배양하는 제1 공정과,
상기 제1 공정 후에, 단핵구를 우선적으로 세포 상해성 T 세포로 분화시키는 조건하에서 배양을 실시하는 제2 공정을 포함하는 면역세포 함유 조성물의 제조방법.
(2) 상기 (1)에서, 상기 제2 공정 후에, IL-2 및/또는 IL-15와, 항-CD16 모노클로널 항체를 포함하는 배지 중에서 배양을 실시하는 제3 공정을 포함하는 면역세포 함유 조성물의 제조방법.
(3) 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 제조방법으로 제조된 면역세포 함유 조성물을 포함하는 암 치료용 조성물.
본 발명에 의하면, 단핵구를 NK 세포, NKT 세포 및 T 세포로 균형적으로 분화시키고, 이것들의 세포를 증식시키는 방법이 제공된다.
도 1의 (A)는 6명의 정상인으로부터 회수한 PBMC의 세포 수를 나타내고. (B-1) 및 (B-2)는 수득된 PBMC에 대한 FACS 분석의 대표적인 결과를 나타낸다.
도 2는 정상인으로부터 회수한 PBMC에 대한 FACS 분석의 대표적인 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예에 있어서 수득된 면역세포 함유 조성물에 대한 FACS분석의 대표적인 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예에 있어서 수득된 면역세포 함유 조성물에 대한 FACS 분석의 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예에 있어서 수득된 면역세포 함유 조성물에 대한 세포 상해활성의 측정 결과를 나타낸다.
도 2는 정상인으로부터 회수한 PBMC에 대한 FACS 분석의 대표적인 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예에 있어서 수득된 면역세포 함유 조성물에 대한 FACS분석의 대표적인 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예에 있어서 수득된 면역세포 함유 조성물에 대한 FACS 분석의 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예에 있어서 수득된 면역세포 함유 조성물에 대한 세포 상해활성의 측정 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대해서 설명하지만, 본 발명을 한정하는 것을 의도하는 것은 아니다.
본 발명의 면역세포 함유 조성물의 제조방법은, 소정의 조건 하에서 배양을 실시하는 제1 공정과, 제2 공정을 포함한다. 이하, 각 공정에 대해서 설명한다. 또, 본 발명에서 「면역세포 함유 조성물」이란 적어도 NK 세포, NKT 세포 및 T 세포를 포함하는 조성물을 가리킨다.
<제1 공정(NK 세포 증식공정)>
본 발명에서의 제1 공정은, 후술하는 배지 중에서 단핵구를 배양하고, 단핵구를 NK 세포 및 NKT 세포 등으로 분화시키며, 또 NK 세포 및 NKT 세포 등을 증식시키는 공정이다. 이 공정에서는 단핵구를 NK 세포 및 NKT 세포뿐만 아니라, γδT 세포 등으로 선택적으로 분화시키고, 증폭시킬 수 있다. NK 세포(자연살해 세포), NKT 세포(자연살해 T 세포), γδT 세포란 각각 림프구의 일종으로, 암 세포를 공격하는 작용을 가지는 것이 알려진다. 또, 본 발명에서 「NK 세포 등」이란 적어도 NK 세포 및 NKT 세포를 가리킨다.
(단핵구)
단핵구란 림프구 및 단구의 총칭이다. 단핵구는 체액(말초혈, 골수, 제대혈 등의 혈액 등)으로부터, 원심분리, 자성비드, 유세포 분석(Flow cytometry) 등의 공지의 방법을 사용해서 수득된다. 단핵구로서는 iPS 세포, ES 세포 및 체세포 줄기세포 등의 줄기세포로부터 유도된 것일 수도 있다. 본 발명에서는 말초혈 단핵구(PBMC) 등을 단핵구로서 바람직하게 사용할 수 있다.
세포면역요법에 있어서 필요한 단핵구를 채취하기 위한 종래의 방법으로서는, 성분 채혈장치를 사용해서 혈액중의 백혈구를 분리하는 방법(이 방법을 「분리반출법(apheresis)」라고 한다.)이 알려져 있다. 그러나, 분리반출법은 장치의 운용에 비용이 드는데다가, 장치의 조작을 위해서 고도의 기술이 요구된다.
또, 세포면역요법에 의해 소망하는 치료효과를 얻기 위해서는, 환자의 체내로 되돌리는 전체 면역세포 수는 예를 들면, 림프구를 사용하는 경우, 10 억개 이상인 것이 바람직하다. 그러나, 혈액 중에 존재하는 단핵구의 비율은 적기 때문에, 10 억개 이상이나 되는 세포 수를 확보하기 위해서는, 통상, 동일한 대상으로부터 간격을 두고 복수 회의 분리반출법을 실시하는 것이 필요하게 된다. 그러나, 복수 회의 분리반출법은 체력적 또 시간적으로 매우 큰 부담을 환자에게 제공한다. 또, 분리반출법에 의해 채취 가능한 단핵구의 수는 환자의 혈액상태 등에 따라서 변동한다.
한편, 본 발명의 제조방법에서는, 단핵구를 효율적으로 면역세포로 분화시키고, 면역세포를 증식시킬 수 있기 때문에, 단핵구를 얻기 위한 혈액의 양이 적어도 되고(예를 들면, 1∼100㎖, 바람직하게는 1∼50㎖), 또, 1회의 채혈로 충분할 수 있다. 따라서 본 발명은 종래 사용되어 온 분리반출법 등의 방법과 비교해서 단핵구를 얻기 위한 환자에 대한 부담(비용, 시간 등)을 현저하게 저감시킬 수 있다. 단, 본 발명에서의 단핵구는 분리반출법에 의해 수득된 것일 수도 있다.
(배지)
제1 공정에서의 배지는 IL-2(인터류킨-2) 및/또는 IL-15(인터류킨-15)와, 항-CD16 모노클로널 항체를 포함한다. IL-2, IL-15 및 항-CD16 모노클로널 항체를 포함하는 배지는 단핵구를 특히 선택적으로 NK 세포, NKT 세포, γδT 세포 등으로 분화시킬 수 있다는 점에서 바람직하다. 그 배지에 의해, 단핵구를 NK 세포, NKT 세포, γδT 세포 등으로 분화시키고, 이것들의 면역세포를 증식시킬 수 있다.
단핵구로부터 NK 세포 등으로의 분화 및 증식을 위해서 호적한 배지 중의 IL-2의 농도는 특별하게 한정되지 않지만, 1∼200000 IU/㎖, 바람직하게는 100∼200000 IU/㎖, 가장 바람직하게는 1000∼200000 IU/㎖ 일 수도 있다. 또, 단핵구로부터 NK 세포 등으로의 분화 및 증식을 위해서 호적한 배지 중의 IL-15의 농도는 특별하게 한정되지 않지만, 1∼100ng/㎖, 바람직하게는 1∼50ng/㎖, 가장 바람직하게는 1∼30ng/㎖ 일 수도 있다. 또, 단핵구로부터 NK 세포 등으로의 분화 및 증식을 위해서 호적한 배지 중의 항-CD16 모노클로널 항체의 농도는 특별하게 한정되지 않지만, 1∼100000 ng/㎖, 바람직하게는 10∼100000 ng/㎖, 가장 바람직하게는 100∼100000 ng/㎖ 일 수도 있다. IL-2 , IL-15 및 항-CD16 모노클로널 항체는 상기 농도범위에서 제1 공정에서의 배지 중에 배합할 수 있다.
본 발명에서의 배지에는 IL-2 및/또는 IL-15, 및, 항-CD16 모노클로널 항체에 첨가하고, 공지의 NK 세포 자극제(항-NKp46 항체 등), NKT 세포 자극제(항-TCRVa24 항체, 항-TCRVb11 항체, 알파갈락토실세라미드 등), γδT 세포 자극제(항-TCRγ/δ항체, 졸레드론산 등) 등이 포함될 수도 있다. 이들 성분의 배지 중의 배합량은 수득하려 하는 세포량 등에 따라서 적당하게 조정할 수 있다.
본 발명에서의 배지에는 단핵구를 배양 가능하게 하기 위한 영양성분이나, pH 조정제 등이 포함될 수도 있다. 이러한 성분을 포함하는 배지로서는 특별하게 한정되지 않지만, 림프구용 무혈청 합성 배양지(KB550, KB570 등), AIM-V, DC Medium, DMEM, RPMI-1640, X-VIVO 배지 등을 들 수 있다. 또, 본 발명에서의 배지의 형태는 특별하게 한정되지 않고, 조제 전의 성분 혼합물(분체인 것 등), 조제 필의 형태(액체인 것 등) 등일 수도 있다.
본 발명에서의 배지에는 세포배양에 있어서 통상 사용되는 시약이 포함될 수도 있다. 이러한 시약으로서, 항생물질(겐타마이신, 카나마이신 등), 알부민, 혈청(인간 혈청, 소 태아 혈청 등), 2-메르캅토에탄올, 피루브산 나트륨, 인슐린 등의 증식인자, L-글루타민, 트랜스페린 등을 들 수 있다.
IL-2 및/또는 IL-15와, 항-CD16 모노클로널 항체를 포함하는 배지는 공지의 배지의 제조방법에 의해서 조제할 수 있다. 예를 들면, 상기의 배지성분에 IL-2 및/또는 IL-15와, 항-CD16 모노클로널 항체를 첨가하는 것에 의해서 조제할 수 있다. 또, 항-CD16 모노클로널 항체를 포함하는 배지는 플라스크에 항-CD16 모노클로널 항체를 미리 프리코팅해 두고, 그 플라스크에 항-CD16 모노클로널 항체 이외의 배지성분을 첨가하는 것에 의해서, 항-CD16 모노클로널 항체를 포함하는 배지를 조제할 수도 있다.
제1 공정에서의 배양조건은 특별하게 한정되지 않고, 통상의 세포배양에 있어서 사용하는 조건을 사용할 수 있다. 예를 들면, 30∼38℃, 5∼10% CO2로 배양할 수도 있다. 배양기간은 단핵구가 활성화 및 증식하고, NK 세포 및 NKT 세포 등으로 분화 및 증식하기 위해서 충분한 기간일 수 있고, 3일간 이상, 바람직하게는 5일간일 수도 있다. 또, 장기간에 걸쳐서 배양하면, 단핵구나 NK 세포 등의 활성이 저감될 가능성이 있기 때문에, 배양기간은 14일간 이하일 수도 있다. 그러나, 14일간 이상의 배양을 실시해도, NK 세포 및 NKT 세포 등의 증식은 진행될 수 있기 때문, 예를 들면, 21일간의 배양으로 50억개 이상이나 되는 세포 수를 얻는 것도 가능하다. 배양기간 중, 공지의 방법으로 적당하게 배지교환을 실시함으로써, 장기간(예를 들면, 21일간)의 배양을 실시해도, 세포의 활성을 유지할 수 있다.
<제2 공정(T 세포 증식공정)>
본 발명에서의 제2 공정은 상기의 제1 공정의 후에 이루어진다. 제2 공정에서는 단핵구를 우선적으로 세포 상해성 T 세포로 분화시키는 조건 하에서 배양이 이루어지고, 제1 공정에서 자극되기 어려웠던(또는 자극되지 않았던) 단핵구가 선택적으로 T 세포로 분화되고, 게다가 증식한다. 또, 제2 공정에서는 제1 공정에서 분화되고, 게다가 활성화 및 증식한 NK 세포, NKT 세포, γδT 세포 등이, 제2 공정에서 활성화된 T 세포에 의해, 직접 또는 간접적으로 자극된다. 그 결과, 제2 공정은 T 세포를 선택적으로 자극하는 배양조건하에서 이루어지지만, NK 세포, NKT 세포, γδT 세포도 증폭될 수 있다. 또, 본 발명에서 「단핵구를 우선적으로 T 세포로 분화시키는 조건」이란 단핵구로부터 T 세포로 분화시키기 위해서 일반적으로 사용되는 배양조건(예를 들면, 항-CD3 항체의 존재하에서의 배양, 항-CD3 항체 및 IL-2의 존재 하에서의 배양, 항-CD3 항체, IL-2 및 IL-15의 존재 하에서의 배양, 항-TCR 항체의 존재 하에서의 배양 등)을 가리킨다.
단핵구를 우선적으로 세포 상해성 T 세포로 분화시키는 조건으로 배양한 후에, NK 세포 등으로의 분화를 실시하려고 하면(즉, 제2 공정을 제1 공정보다도 먼저 실시하면), T 세포가 많이 증폭되기 때문에 NK 세포 등의 비율이 감소하고, T 세포의 비율이 과다한 면역세포 함유 조성물 밖에 수득되지 않기 때문에, 단핵구를 복수의 면역세포로 균형적으로 분화시키고, 이것들의 면역세포를 증식시키는 것이 어렵다.
제2 공정에서는 제1 공정 후에 배지교환 등을 실시하고, 단핵구로부터 T 세포로의 분화 및 T 세포의 증식이 가능한 배지 중에서 세포를 배양한다. 이러한 배지로서는 단핵구로부터 T 세포로 분화시키고, T 세포를 증식시킬 수 있는 배지로서 공지의 것을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 제1 공정에서 사용 가능한 배지(림프구용 무혈청 합성 배양지 등) 중에 1∼100㎍/㎖의 항-CD3 항체(예를 들면, 항-CD3ε 모노클로널 항체)을 첨가한 배지를 사용할 수 있다.
제2 공정에서의 배양조건은 특별하게 한정되지 않고, 통상의 세포배양에서 사용하는 조건을 사용할 수 있다. 예를 들면, 30∼38℃, 5∼10% CO2로 배양할 수도 있다. 배양기간은 단핵구가 T 세포로 분화되기 위해서 충분한 기간일 수 있고, 48시간 이상, 바람직하게는 3일간일 수도 있다. 또, 장기간에 걸쳐서 배양하면, T 세포의 증식이 과다가 되고, NK 세포, NKT 세포 및 T 세포를 균형적으로 포함하는 면역세포 함유 조성물이 수득되기 어려워질 가능성이 있기 때문에, 배양기간은 7일간 이하, 바람직하게는 5일간 이하, 더 바람직하게는 3일간 이하일 수도 있다. 또, 배양 중, 종래 공지의 방법으로 적당하게 배지교환을 실시할 수도 있다.
제2 공정의 후에는, 추가로, IL-2 및/또는 IL-15와, 항-CD16 모노클로널 항체를 포함하는 배지 중에서 배양을 실시하는 제3 공정을 설치할 수 있다. 이에 따라 제1 공정에서 수득된 NK 세포 등을 증식시킬 수 있고, 면역세포 함유 조성물 중의 NK 세포, NKT 세포 및 T 세포의 비율을 조정할 수 있기 위해서, 보다 효율적으로 복수의 면역세포를 균형적으로 포함하는 면역세포 함유 조성물이 수득된다. 제3 공정의 조건으로서는 상기의 제1 공정에서의 조건을 사용할 수 있다.
<본 발명의 제조방법으로부터 수득되는 면역세포 함유 조성물>
본 발명의 제조방법으로부터 수득되는 면역세포 함유 조성물에는 종래의 방법과 같이, 특정한 세포의 비율이 과도가 되지 않고, 복수의 면역세포가 균형적으로 포함된다. 본 발명에서 「복수의 면역세포가 균형적이다.」란 면역세포 함유 조성물 중의 각 면역세포의 비율이 생체 내에서의 비교적 가까운 것을 가리킨다. 단, 면역력을 효율적으로 강화할 수 있다는 관점으로부터, 면역세포 함유 조성물 중의 NK 세포의 비율이 생체 내에서의 통상의 비율보다도 높아도, 「복수의 면역세포의 균형이 좋다」인 상태라고 할 수 있다. 복수의 면역세포의 균형적으로 좋은 상태로서는, 예를 들면, 전체 세포 중, NK 세포 40∼60%, NKT 세포 15∼25%, γδT 세포 2∼5%, T 세포 20∼30%, Treg 세포 0.01∼0.2%인 상태를 들 수 있다. 면역세포 함유 조성물 중의 각 면역세포의 비율은 유세포 분석기(Flow cytometry)에 의해 특별히 지정할 수 있다. 그러나, 상기에 예시한 세포의 균형은 환자의 치료방침 에 따라서 배양조건의 조정 등에 의해 적당하게 변경될 수 있다. 배양조건의 조정의 내용으로서는 예를 들면, 배지 중의 NK 세포 자극제의 양보다도 NKT 세포 자극제의 양을 늘리는 것 등을 들 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의해 수득된 세포가 NK 세포 등 인지의 여부는 유세포 분석(Flow cytometry)에 의해, 수득된 세포의 세포 표면 마커를 해석함으로써 확인한다. 예를 들면, NK 세포, T 세포, NKT 세포, γδT 세포 및 Treg 세포는 CD3+CD56+ 세포, CD3-CD19+ 세포, CD3+CD19- 세포, CD3-CD56+ 세포, 및 CD3+γδTCR+ 세포로 특정된다. 또, T 세포 및 NKT 세포는 각각, 항-TCR alpha 항체, 항-TCRV alpha24 항체 등에 의해 특별히 지정할 수 있다.
또, 본 발명에 의하면, 적은 혈액(예를 들면, 1∼100㎖, 바람직하게는 1∼50㎖)으로부터 충분량의 면역세포(예를 들면, 106∼108cells/㎖ 이상)이 수득되기 때문에, 생체에 부담을 주지 않고, 세포면역요법에 있어서 필요한 양의 면역세포를 간편하게 얻을 수 있다. 여기에서, 본 발명에서 「면역세포의 량」이란 적어도 NK 세포, NKT 세포, 및 T 세포의 합계량(합계 세포 수)을 가리킨다. 추가로, 본 발명에 의하면, 제1 공정 및 제2 공정을 합쳐서, 예를 들면 합계 14일간이라고 하는 짧은 배양시간으로 상기의 충분량의 면역세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 제조방법으로부터 수득되는 면역세포 함유 조성물은 그대로 환자의 치료에 사용할 수도 있고, 종래 공지의 방법을 사용해서 동결보존 등으로 보존할 수도 있다. 본 발명의 제조방법으로부터 수득되는 면역세포 함유 조성물 중의 면역세포(NK 세포, NKT 세포, T 세포 등)은, 생리식염수 중 등에서 유지해도, 활성상태를 유지하고 있다. 면역세포의 활성상태는 수득된 세포의 세포표면 마커(CD69 등)를 유세포 분석기(Flow cytometry)에 의해 해석함으로써 확인할 수 있다. 또, 본 발명의 제조방법으로부터 수득되는 면역세포 함유 조성물에 생리식염수, 인간 혈청 알부민 등을 첨가해서 암 치료용 조성물을 조제할 수 있다. 이 암 치료용 조성물은 주사제 등으로 해서 환자의 체내에 투여할 수 있다.
본 발명의 제조방법으로부터 수득되는 면역세포 함유 조성물 중의 면역세포(NK 세포, NKT 세포, T 세포 등)는 세포 상해활성을 가지기 때문에 암 치료 등에 유효하게 사용할 수 있다. 면역세포의 세포 상해활성은 51Cr 릴리스법 등으로 판단할 수 있다. 또, 본 발명의 제조방법으로부터 수득되는 면역세포 함유 조성물 중의 면역세포는 항종양 활성을 가지는 IFN-γ도 생산할 수 있다. IFN-γ는 공지의 ELISA법 등으로 측정할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의거해서 설명하지만, 본 발명은 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<참고시험 1: 정상인의 혈액 중에 포함되는 각 면역세포의 비율>
채혈기구(상품명 「BD Vacutainer CPT cell preparation tube」, Becton, Dickinson and Company.)에 의해, 6명의 정상인의 팔로부터 혈액을 24㎖ 채혈했다. 각 혈액으로부터 인간 말초혈 단핵구(PBMC)를 회수하고, 수득된 PBMC으로부터 인간 NK 세포를 얻었다.
도 1의 (A)는 6명의 각 정상인에 대한, 회수한 PBMC의 세포 수를 나타낸다. (B-1)은 수득된 PBMC 중의 대표적인 세포분포를 나타낸다. (B-2)는 수득된 PBMC에 대한, FITC 표지 항-CD19 항체 및 PE표지 항-CD3 항체를 사용한 FACS 분석의 대표적인 결과를 나타낸다. 도 1의 (B-1) 중, 「FSC」란 전방산란(Forward scatter)을 가리키고, 「SSC」란 측방산란(Side scatter)을 가리킨다.
또, 표 1 및 2에, 수득된 PBMC 중의 각 세포의 비율을 나타낸다. 또, 이하, B세포, T 세포, NKT 세포, NK 세포, 및 γδT 세포는 각각, CD3-CD19+ 세포, CD3+CD19- 세포, CD3+CD56+ 세포, CD3-CD56+ 세포, 및 CD3+γδTCR+ 세포이다.
<실시예 1: 면역세포 함유 조성물의 제조-1>
(PBMC의 회수)
24㎖의 혈액을 4명의 정상인으로부터 채취하고(이 시점을 「Day 0」이라고 한다), PBMC를 회수했다.
도 2는 수득된 PBMC에 대한, 하기의 항체의 조합 중 어느 하나를 사용한 FACS 분석의 대표적인 결과를 나타낸다.
항-CD3 항체 및 항-CD19 항체
항-CD3 항체 및 항-CD56 항체
항-CD3 항체 및 항γδTCR 항체
CD56 항체 및 γδTCR 항체
CD4 항체 및 CD25 항체
도 2(A)는 수득된 PBMC에서의 림프구 서브세트의 패턴을 나타내고, 도 2(B)는 수득된 PBMC에서의 단구의 패턴을 나타낸다.
(제1 공정)
이어서, 수득된 PBMC를, 175 IU/㎖의 인간 IL-2 및 25 ng/㎖의 인간 IL-15를 첨가한 50㎖의 배지(KBM550, Kohjin Bio Co, Ltd.) 중에서 현탁시키고, 항-CD16 모노클로널 항체로 프리코팅된 75㎠ 플라스크 중에서 5일간 배양했다(이 공정은 「제1 공정」에 상당하고, 최종 배양일을 「Day 5」라고 한다.). 또, 이하, 175 IU/㎖의 인간 IL-2 및 25ng/㎖의 인간 IL-15를 첨가하고, 프리코팅된 항-CD16 모노클로널 항체에 접촉시킨 배지를, 「NK 세포 증식배지」라고 한다. 그NK 세포 증식배지에는 IL-2, IL-15 및 항-CD16 모노클로널 항체가 포함된다.
(제2 공정)
Day 5에 있어서, 세포를 플라스크로부터 회수하고, NK 세포증식 배지 중에서 현탁시시키고, NK 세포 증식배지(150㎖)를 넣고, 항-CD3 ε모노클로널 항체로 프리코팅된 멸균된 가스 투과성의 세포배양 백(250㎖, Kohjin Bio Co, Ltd.) 중에서 2일간 배양했다(이 공정은 「제2 공정」에 상당하고, 최종 배양일을 「Day 7」이라고 한다.). 이 배양물은 본 발명의 제조방법으로부터 수득되는 면역세포 함유 조성물에 상당한다.
(제3 공정)
Day 7에 있어서, 배양후의 세포배양 백을, NK 세포 증식배지(1000㎖)를 넣은 멸균된 가스 투과성의 세포배양 백(1L, Kohjin Bio Co, Ltd.)에 연결하고, 추가로 37℃, 5% CO2에서의 습도환경 하에서 7일간 배양해서(이 공정은 「제3 공정」에 상당한다.) 배양물을 얻었다. 이 배양물, 본 발명의 제조방법으로부터 수득되는 면역세포 함유 조성물에 상당한다.
도 3은 상기의 제1 내지 3의 공정을 거쳐서 수득된 면역세포 함유 조성물 중의 면역세포에 대한 FACS 분석의 대표적인 결과를 나타낸다. 도 3과 같이, 배양 후의 각 세포의 비율은, NK 세포=75.1%, NKT 세포=7.7%, γδT 세포=4.9%, T 세포=16.7%, CD56 음성 γδT 세포=1.1%, 세포 상해성 γδT 세포=3. 8%, 제어성 T 세포(Treg)=0.05%, 헬퍼 T 세포=4.2%이었다. 즉, 본 발명에 의하면, T 세포의 비율이 과도가 되지 않고, NK 세포 등을 균형적으로 증식시킬 수 있다.
<실시예 2: 면역세포 함유 조성물의 제조-2>
실시예 1와 동일하게 「제1 공정」 및 「제2 공정」을 실시하고, 배양전(「제1 공정」의 전) 및 배양후(「제1 공정」 및 「제2 공정 」의 후)의 각 면역세포의 비율을 검토했다. 그 결과를 표 3∼5에 나타낸다.
표 3∼5에 나타내는 바와 같이, 본 발명에 의하면 T 세포의 비율이 과도가 되지 않고 NK 세포 등을 균형적으로 포함하는 면역세포 함유 조성물이 수득된다.
<실시예 3: 면역세포 함유 조성물 중의 면역세포의 활성>
실시예 1과 동일하게 해서 얻은 면역세포 함유 조성물을, 1ℓ의 배양 배지(KBM550, Kohjin Bio Co, Ltd.)에 회수하고, 0.2% 인간 혈청 알부민(NIHON PHARMACEUTICAL CO., LTD.)을 첨가한 100㎖의 의약품 그레이드의 생리식염수(TERUMO CORPORATION), 또는, 의약품 그레이드의 생리식염수만 있는 중에서 재현탁했다. 이어서, 세포를 4℃에서 24시간 유지하고, FACS에 의해 분석했다. 그 대표적인 결과를 도 4에 나타낸다.
도 4의 (1) 및 (2)에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 의해 수득된 면역세포 함유 조성물 중의 각 면역세포는 24시간의 생리식염수 중의 유지 후에 있어서도, CD69를 발현하고 있는 것임을 알 수 있었다. CD69는 세포의 활성화 마커이기 때문에, 본 발명의 제조방법에 의해 수득된 면역세포 함유 조성물 중의 각 면역세포는 활성상태를 유지할 수 있는 것임을 알 수 있었다. 이러한 면역세포는 조제 후, 원격지 등에 수송해도, 수송 중에 발생할 수 있는 활성의 저감이 억제되고 있는 것을 기대할 수 있다.
<실시예 4: 면역세포 함유 조성물의 제조-3>
실시예 2와 동일한 시험을, 배지를 「KBM550」 대신에, 표 6∼8에 기재된 것을 사용해서 실시했다. 또, 「KBM570」은 Kohjin Bio Co, Ltd., 「AIM-V」는 Invitrogen Corporation, 「Milteni」는 Miltenyi Biotec K.K.의 제품이다. 표 6∼8에, 수득된 면역세포 함유 조성물 중의 각 면역세포의 비율 등을 나타낸다. 또, 표 6 중, 「배양개시 시」란 「제1 공정」을 실시하기 전을 가리키고, 「배양후」란 「제1 공정」 및 「제2 공정」을 실시한 후를 가리킨다.
표 6∼8에 나타내는 바와 같이, 본 발명에 의하면, 사용하는 배지의 종류에 관계없이, T 세포의 비율이 과도가 되지 않고 NK 세포 등을 균형적으로 포함하는 면역세포 함유 조성물을 얻어진다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5: 면역세포 함유 조성물의 제조-4>
배지를 「KBM550」 대신에, 표 9∼11에 기재된 것을 사용해서 실시하고, 추가로, 인간 IL-2 또는 인간 IL-15 중 어느 하나를 첨가한 배지를 사용한 이외는, 실시예 2와 동일한 시험을 실시했다. 표 9∼11에, 수득된 면역세포 함유 조성물 중의 각 면역세포의 비율등을 나타낸다. 또, 표 중, 「배양개시 시」 또는 「배양전」이란 「제1 공정」을 실시하기 전을 가리키고, 「배양후」란 「제1 공정」 및 「제2 공정」을 실시한 후를 가리킨다.
표 9∼11에 나타낸 바와 같이, 인간 IL-2 또는 인간 IL-15 중 어느 하나의 존재 하에서도, 본 발명에 의하면 T 세포의 비율이 과도가 되지 않고 NK 세포 등을 균형적으로 포함하는 면역세포 함유 조성물이 수득된다.
<실시예 6: 세포 상해활성(cytotoxic activity)의 측정>
실시예 2와 동일하게 면역세포 함유 조성물을 얻었다. 수득된 면역세포 함유 조성물을, 15㎖ 원심관에 넣고, 원심분리(1400rpm, 5분)를 실시하고, 상청액을 제거해서 세포를 얻었다. 수득된 세포에 대해서, 인간 적아구-유사 백혈병 세포(K562)를 사용해서, 51Cr 릴리스법(이펙터 세포(면역세포 함유 조성물 중의 세포 수) 및 타깃 세포(K562의 세포 수)의 비(E:T)=20:1)를 실시하고, 세포 상해활성을 산출했다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.
또, 세포 상해활성은 하기 식에 의거해서 산출했다. 식에서, 「cpm(counts per minutes의 약칭이다.)」란 1분간 당의 방사선의 수를 나타낸다.
((mean cpm experimental release-mean cpm spontaneous release)/(mean cpm maximal release-mean cpm spontaneous release)) ×100
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의하면, 세포 상해활성의 높은 면역세포를 얻어진다는 것을 알 수 있었다.
<참고시험 2: 제1 공정 및 제2 공정의 순서에 대한 검토>
실시예 1과 동일하게 해서 PBMC을 얻었다. 이어서, 10㎍/㎖의 항-CD3 모노클로널 항체를 프리코팅한 75㎠ 플라스크에, 50㎖의 배지(KBM550, Kohjin Bio Co, Ltd.)를 첨가하고, 그 배지 중에서 7일간 배양한 후(이 공정은 「제2 공정」에 상당한다.), 항-CD16 모노클로널 항체를 프리코팅한 75㎠ 플라스크에, IL-2 및 IL-15을 포함하는 50㎖의 배지(KBM550, Kohjin Bio Co, Ltd.)를 첨가하고, 그 배지 중에서 7일간 배양했다(이 공정은 「제1 공정」에 상당한다.). 표 12∼14는 배양전(「제2 공정」의 전) 및 배양후(「제2 공정」 및 「제1 공정」의 후)세포에 대한 FACS 분석의 결과를 나타낸다.
표 12∼14에 나타내는 바와 같이, 항-CD3 모노클로널 항체의 존재 하에서의 배양 공정(즉, 제2 공정)이, IL-2, IL-15 및 항-CD16 모노클로널 항체의 존재 하에서의 배양공정(즉, 제1 공정)의 전에 설치되면, T 세포의 비율이 과도가 되고, NK 세포 등을 균형적으로 포함하는 면역세포 함유 조성물이 수득되지 않는 것임을 알 수 있었다.
Claims (2)
- 면역세포 함유 조성물의 제조 방법으로서,
IL-2 및 IL-15 중 적어도 어느 하나 이상과, 항-CD16 모노클로널 항체를 포함하는 배지 중에서 단핵구를 배양하는 제1 공정과,
상기 제1 공정 후에, 단핵구를 우선적으로 세포 상해성 T 세포(cytotoxic T cell)로 분화시키는 조건 하에서 배양을 실시하는 제2 공정,
을 포함하며,
상기 면역세포 함유 조성물은, 해당 조성물 중의 전체 세포 수에 대하여, NK 세포 40∼60% 및 T 세포 20∼30%을 포함하는, 면역세포 함유 조성물의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제2 공정 후에, IL-2 및 IL-15 중 적어도 어느 하나 이상과, 항-CD16 모노클로널 항체를 포함하는 배지 중에서 배양을 실시하는 제3 공정을 포함하는 면역세포 함유 조성물의 제조방법.
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