CN107109366B - 致耐受性树突细胞、其生成方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文中描述了用于制备稳定的半成熟致耐受性树突细胞的方法和包含此类稳定的半成熟致耐受性树突细胞的组合物。可以在治疗自身免疫性疾病、移植物排斥和/或移植物抗宿主病时使用本文中描述的稳定的半成熟致耐受性树突细胞及其组合物以建立免疫耐受性。

Description

致耐受性树突细胞、其生成方法及其用途
本申请要求2014年10月22日提交的美国临时申请No.62/066,994的优先权，其通过引用完整并入本文。
1.发明领域
本文中描述了用于制备稳定的半成熟致耐受性树突细胞的方法和包含此类稳定的半成熟致耐受性树突细胞的组合物。可以在治疗自身免疫性疾病、移植物排斥和/或移植物抗宿主病时使用本文中描述的稳定的半成熟致耐受性树突细胞及其组合物以建立免疫耐受性。
2.发明背景
淋巴细胞可被抗原活化，导致免疫应答，或被灭活或消除，导致对抗原的耐受性。对自身抗原的耐受性是免疫系统的基本特性。免疫系统不能建立耐受性导致自身免疫性疾病。
用于治疗自身免疫性疾病的新疗法包括向患者产生或给予特定类型的淋巴细胞，调节性T细胞(Treg)。Treg抑制其它自身反应性和潜在致病性淋巴细胞的活化和效应器功能，这导致免疫应答受抑制和维持自身耐受性。Treg是CD4+T细胞的一个子集。最佳表征的Treg是CD4+CD25+FoxP3+T细胞。Treg可通过胸腺中的自身抗原识别以及通过外周淋巴样器官中的抗原识别产生。树突细胞(DC)是最有效的抗原呈递细胞。DC参与先天免疫和获得性免疫应答。DC对免疫系统执行许多功能，如：1)抗原的摄取、加工和呈递，2)效应细胞如T细胞、B细胞和NK细胞的活化，以及3)分泌细胞因子和其它免疫调节分子以指导免疫应答。DC识别特定病原体和各种危险信号。由DC上的特定受体介导的病原体衍生的产物和危险信号的识别引发成熟过程，其可以通过炎性刺激或T细胞衍生的信号进一步修饰。成熟是当活化的DC经历形态学、表型和功能变化的过程，所述变化最终导致从抗原捕获细胞到完全成熟的抗原呈递细胞(APC)的完全转变。成熟的特征在于共刺激分子如CD40、CD80和CD86的表达增加、MHC上调、吸收和加工抗原的能力的丧失以及产生一大批炎性细胞因子和趋化因子(IL-1β、IL-6、IL-8和IL-12)。一旦被活化，DC迁移到淋巴结，在那里它们与T细胞和B细胞相互作用以引发和定形(shape)适应性免疫应答。
DC衍生自造血细胞的髓样谱系。骨髓中的髓样祖先产生巨噬细胞-DC祖先，进一步分化成共同/髓样DC和浆细胞样DC。单核细胞也可以分化成DC。分化引起未成熟的树突细胞(iDC)。iDC的主要功能是捕获和加工抗原。未成熟DC可以在炎症环境中接触和加工抗原时成熟。多种因素可以在DC内的抗原摄取和加工后诱发成熟，包括：全细菌或细菌衍生的抗原(例如脂多糖，LPS)、炎性细胞因子、选择细胞表面受体(例如CD40)和病毒产物(例如双链RNA)的连接。细菌衍生的抗原和病毒产物可以通过Toll样受体(TLR)识别。TLR识别侵入性病原体的各种成分。配体与DC上的TLR的结合诱导促炎细胞因子产生和增强的对幼稚T细胞的抗原呈递，从而活化抗原特异性适应性免疫应答。不同的TLR配体为抗原呈递细胞提供不同的活化状态和细胞因子产生模式，导致差异免疫应答的诱导。因此，根据侵入性病原体，TLR是微调适应性免疫应答的关键分子。鉴于由TLR配体的刺激可以微调针对特定病原体的免疫应答，对于治疗性疫苗接种来说重要的是，一旦细胞施用于患者，DC性质即被维持。
DC也可以部分成熟，导致MHC和共刺激分子的上调和淋巴结归巢能力，但缺乏促炎细胞因子产生。这种DC被称为半成熟DC(Lutz et al.2002.Trends Immunol 23:445-449)。
致耐受性DC(tolDC)是具有免疫抑制特性的抗原呈递细胞。它们可以通过呈递对于效应细胞活化具有不足的共刺激和细胞因子生成的抗原诱导耐受性。除了显著增加的抗原摄取能力之外，TolDC通常由MHCII、共刺激分子CD80、CD86和CD40以及趋化因子受体CCR7的低水平或中间水平定义。TolDC表达高水平的抑制性分子如Ig样转录物(ILT)分子(ILT3/ILT4)和/或PD-L分子(PD-L1，PD-L2)。此外，tolDC分泌少量促炎细胞因子(IL-12p70)和大量抗炎细胞因子，如IL-10。TolDC通过几种机制诱导T细胞无反应性、T细胞抑制和调节性T细胞的产生，所述机制包括将幼稚T细胞转化为Treg、免疫抑制细胞因子的释放和功能性吲哚胺-2,3双加氧酶(IDO)的表达。TolDC通常被认为是半成熟DC。已经鉴定了涉及诱导和维持tolDC的免疫抑制作用的几种信号传导途径。促炎性DC成熟通常与包括转录因子NF-κB和p38MAPK的许多信号传导途径的活化有关(Nakahara et al.2006,J Derm Science 42:1-11；Katholnig et al.2013,J Immunol 190:1519-1527)。在tDC中触发的活化的信号传导事件的模式是大大不同的，并且涉及ERK1/2、非规范NF-κB途径、STAT3和IDO的活化(Qianet al.2006,Blood 108:2307-2315；Harden et al.2012,Immunol Invest 41:738-764；Manches et al.2012,PNAS 109:14122-14127；Farias et al.2013,CNS 19:269-277)。
吲哚胺2,3-双加氧酶在tolDC中的表达和随后的色氨酸代谢产物的产生已经显示出诱导效应T细胞活性的直接抑制和Treg的同时扩充(Harden et al.2013.ImmunolInvest 41:738-764)。TolDC可以从前体细胞体外产生，并且代表了用于在移植和自身免疫性疾病背景下诱导或恢复免疫耐受性的特定形式的基于细胞的疗法的潜在有希望的工具(Fischbach et al.2013.Sci Transl Med 5:179ps7)。已经显示通过各种机制靶向DC分化和功能的不同方法建立了tolDC表型(Naranjo-Gomez et al.2011.J Transl Med 9:89；Liet al.2007.J Immunol 178:5480-7；Torres-Aguilar et al.2010.J Immunol 184:1765-75)。值得注意的是，已经描述了地塞米松(Dexamethasone)和/或维生素D3受体激动剂(VDR；1,25(OH)2D 3及其类似物)通过抑制NF-κB依赖性DC成熟来产生tolDC(Adorin etal.2009.Handb Exp Pharmacol 251-73；van Hooten et al.2009.Handb Exp Pharmacol233-49)。已经显示此类Dex/VitD3条件化表达获得强大的免疫调节表型，并且目前在类风湿性关节炎患者的早期临床试验中测试(Stoop et al.2010.Arthritis Rheum 62:3656-65)。TolDC也可以从用用19-去甲-1,25-二羟基维生素D2(19-nor-1,25-dihydroxyvitaminD2)(帕立骨化醇(paricalcitol))，维生素D2的活性形式的类似物(Sochorova etal.2009.Clin Immunol 133:69-77)调理的DC产生。建立tolDC表型的其它方法也涉及神经肽(血管活性肠肽或垂体腺苷酸环化酶活化多肽)(Chorny et al.2005.Proc Nat AcadSci 102:13562-7；Chorny et al.2006.Blood 107:3787-84；Gonzalez-Rey etal.2006.Gastroenterology 131:1799-811)或mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)(Haidinger et al.2010.J Immunol 185:3919-31)的使用。通过这些方法产生的细胞无一证明具有本文中所述的Dex/维生素D2tolDC的特征。
与体外建立的tolDC的治疗性疫苗接种相关的主要问题之一是其功能稳定性。一旦注射到患者中，tolDC必须在没有致耐受性剂的情况下保持高度稳定的致耐受性性质。离体制备的tolDC的潜在风险是它们在具有慢性炎症(如自身免疫性疾病)的生物体中的应用可在体内遇到促炎信号时将其转化为活化的表型。这然后可以促成自身免疫应答的进一步扩张，并且对治疗结果将是有害的。
3.发明概述
在一个方面，本文中描述了用于生成稳定的半成熟tolDC的方法。在一个实施方案中，用于生成稳定的半成熟致耐受性树突细胞的方法包括：(a)从患者血液分离单核细胞；(b)在培养基(例如cGMP培养基)中培养单核细胞，所述培养基包含一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子；并且(c)利用地塞米松和维生素D2生成致耐受性树突细胞；并且(d)在培养基(例如cGMP培养基)中培养所述致耐受性树突细胞，所述培养基包含MPLA或MPLA和与自身免疫性疾病、移植物抗宿主病或移植物排斥有关的抗原。在某些实施方案中，贯穿用于生成稳定的半成熟tolDC的方法，培养基包含一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子。诱导单核细胞分化为树突细胞的因子的例子包括GM-CSF和IL-4、IL-13、IL-15或IFN-alpha或Flt3L的组合。在一个具体的实施方案中，贯穿用于生成稳定的半成熟tolDC的方法，培养基包含GM-CSF和IL-4。可以通过本领域技术人员已知或本文中描述的任何技术从受试者的血液分离。例如，可以通过白细胞去除术从受试者的血液分离单核细胞。在具体的实施方案中，在培养第3天利用培养基中的地塞米松和培养第6天利用培养基中的地塞米松和维生素D2生成所述致耐受性树突细胞。在一些实施方案中，在培养第3天利用培养基中的地塞米松和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子培养第6天利用培养基中的地塞米松、维生素D2和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子生成所述致耐受性树突细胞。在具体的实施方案中，在培养第3天利用培养基中的地塞米松和GM-CSF和IL-4和培养第6天利用培养基中的地塞米松、维生素D2和GM-CSF和IL-4生成所述致耐受性树突细胞。在某些实施方案中，地塞米松以每升0.5-3微摩尔的终浓度存在于所述培养基中。在一些实施方案中，维生素D2以每升0.1-10纳摩尔的终浓度存在于所述培养基中。在具体的实施方案中，在培养第7天在包含MPLA或MPLA以及所述抗原的培养基中培养所述致耐受性树突细胞。在一些实施方案中，在培养第7天在包含MPLA和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子或MPLA、一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子和所述抗原的培养基中培养所述致耐受性树突细胞。在一个具体的实施方案中，在培养第7天在包含MPLA、GM-CSF和IL-4或MPLA、GM-CSF、IL-4以及所述抗原的培养基中培养所述致耐受性树突细胞。在某些实施方案中，所述MPLA以每ml 1-3μg的终浓度存在于所述培养基中。在某些实施方案中，在收获所述细胞前在包含MPLA或MPLA以及所述抗原的培养基中将所述致耐受性树突细胞培养某个时间段(例如24小时)。在一些实施方案中，在收获所述细胞前在包含MPLA和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子或MPLA、一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子和所述抗原的培养基中将所述致耐受性树突细胞培养某个时间段(例如24小时)。在具体的实施方案中，在收获所述细胞前在包含MPLA、GM-CSF和IL-4或MPLA、GM-CSF、IL-4以及所述抗原的培养基中将所述致耐受性树突细胞培养某个时间段(例如24小时)。在某些实施方案中，用于生成稳定的半成熟tolDC的方法花费约8天的细胞培养。
在另一个实施方案中，用于生成稳定的半成熟致耐受性树突细胞的方法包括：(a)在包含GM-CSF和IL-4的培养基(例如cGMP培养基)中将从受试者的血液分离的单核细胞培养某个时间段；(b)利用培养物中的地塞米松和维生素D2生成致耐受性树突细胞；并且(c)在培养基(例如cGMP培养基)中培养所述致耐受性树突细胞，所述培养基包含MPLA或MPLA和与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原。在某些实施方案中，贯穿用于生成稳定的半成熟tolDC的方法，培养基包含一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子。诱导单核细胞分化为树突细胞的因子的例子包括GM-CSF和IL-4、IL-13、IL-15或IFN-alpha或Flt3L的组合。在一个具体的实施方案中，贯穿用于生成稳定的半成熟tolDC的方法，培养基包含GM-CSF和IL-4。可以通过本领域技术人员已知或本文中描述的任何技术从受试者的血液分离。例如，可以通过白细胞去除术从受试者的血液分离单核细胞。在具体的实施方案中，在培养第3天利用培养基中的地塞米松和培养第6天利用培养基中的地塞米松和维生素D2生成所述致耐受性树突细胞。在一些实施方案中，在培养第3天利用培养基中的地塞米松和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子培养第6天利用培养基中的地塞米松、维生素D2和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子生成所述致耐受性树突细胞。在具体的实施方案中，在培养第3天利用培养基中的地塞米松和GM-CSF和IL-4和培养第6天利用培养基中的地塞米松、维生素D2和GM-CSF和IL-4生成所述致耐受性树突细胞。在某些实施方案中，地塞米松以每升0.5-3微摩尔的终浓度存在于所述培养基中。在一些实施方案中，维生素D2以每升0.1-10纳摩尔的终浓度存在于所述培养基中。在具体的实施方案中，在培养第7天在包含MPLA或MPLA以及所述抗原的培养基中培养所述致耐受性树突细胞。在一些实施方案中，在培养第7天在包含MPLA和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子或MPLA、一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子和所述抗原的培养基中培养所述致耐受性树突细胞。在一个具体的实施方案中，在培养第7天在包含MPLA、GM-CSF和IL-4或MPLA、GM-CSF、IL-4以及所述抗原的培养基中培养所述致耐受性树突细胞。在某些实施方案中，所述MPLA以每ml 1-3μg的终浓度存在于所述培养基中。在某些实施方案中，在收获所述细胞前在包含MPLA或MPLA以及所述抗原的培养基中将所述致耐受性树突细胞培养某个时间段(例如24小时)。在一些实施方案中，在收获所述细胞前在包含MPLA和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子或MPLA、一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子和所述抗原的培养基中将所述致耐受性树突细胞培养某个时间段(例如24小时)。在具体的实施方案中，在收获所述细胞前在包含MPLA、GM-CSF和IL-4或MPLA、GM-CSF、IL-4以及所述抗原的培养基中将所述致耐受性树突细胞培养某个时间段(例如24小时)。在某些实施方案中，用于生成稳定的半成熟tolDC的方法花费约8天的细胞培养。
在另一个实施方案中，用于生成能够维持稳定的半成熟致耐受性表型的致耐受性树突细胞的方法包括：(a)从受试者的血液分离单核细胞；(b)在培养基(例如cGMP培养基)中培养单核细胞，所述培养基包含一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)；(c)在培养的第一时间段后，在包含地塞米松的培养基(例如cGMP培养基)中培养来自步骤(b)的细胞；(d)在培养的第二时间段后，在包含地塞米松和维生素D2的培养基(例如cGMP培养基)中将来自步骤(c)的细胞培养第三时间段以生成致耐受性树突细胞；并且(e)在培养基(例如cGMP培养基)中培养所述致耐受性树突细胞，所述培养基包含MPLA或MPLA和与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原。在某些实施方案中，贯穿用于生成稳定的半成熟tolDC的方法，培养基包含一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子。诱导单核细胞分化为树突细胞的因子的例子包括GM-CSF和IL-4、IL-13、IL-15或IFN-alpha或Flt3L的组合。在一个具体的实施方案中，贯穿用于生成稳定的半成熟tolDC的方法，培养基包含GM-CSF和IL-4。可以通过本领域技术人员已知或本文中描述的任何技术从受试者的血液分离。例如，可以通过白细胞去除术从受试者的血液分离单核细胞。在某些实施方案中，在培养第3天在包含地塞米松的培养基中培养来自步骤(b)的细胞。在一些实施方案中，在培养第3天在包含地塞米松和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)的培养基中培养来自步骤(b)的细胞。在一些实施方案中，在培养的第6天在包含地塞米松和维生素D2的培养基中培养来自步骤(c)的细胞。在一些实施方案中，在培养的第6天在包含地塞米松、维生素D2和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)的培养基中培养来自步骤(c)的细胞。在具体的实施方案中，在培养第3天在包含地塞米松的培养基中培养来自步骤(b)的细胞，并且在培养的第6天在包含地塞米松和维生素D2的培养基中培养来自步骤(c)的细胞。在一些实施方案中，在培养第3天在包含地塞米松和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)的培养基中培养来自步骤(b)的细胞，并且在培养的第6天在包含地塞米松、维生素D2和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)的培养基中培养来自步骤(c)的细胞。在某些实施方案中，所述MPLA以每ml 1-3μg的终浓度存在于所述培养基中。在具体的实施方案中，在收获所述细胞前在包含MPLA或MPLA以及所述抗原的培养基中将所述致耐受性树突细胞培养某个时间段(例如24小时)。在一些实施方案中，在收获所述细胞前在包含MPLA和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)或MPLA、一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)和所述抗原的培养基中将所述致耐受性树突细胞培养某个时间段(例如24小时)。在某些实施方案中，用于生成稳定的半成熟tolDC的方法花费约8天的细胞培养。
在另一个实施方案中，用于生成能够维持稳定的半成熟致耐受性表型的致耐受性树突细胞的方法包括：(a)在培养基中培养从受试者的血液分离的单核细胞，所述培养基包含一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)；(b)在培养的第一时间段后，在包含地塞米松的培养基(例如cGMP培养基)中培养来自步骤(a)的细胞；(c)在培养的第二时间段后，在包含地塞米松和维生素D2的培养基(例如cGMP培养基)中将来自步骤(b)的细胞培养第三时间段以生成致耐受性树突细胞；并且(d)在培养基(例如cGMP培养基)中培养所述致耐受性树突细胞，所述培养基包含MPLA或MPLA和与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病有关的抗原。在某些实施方案中，贯穿用于生成稳定的半成熟tolDC的方法，培养基包含一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子。诱导单核细胞分化为树突细胞的因子的例子包括GM-CSF和IL-4、IL-13、IL-15或IFN-alpha或Flt3L的组合。在一个具体的实施方案中，贯穿用于生成稳定的半成熟tolDC的方法，培养基包含GM-CSF和IL-4。可以通过本领域技术人员已知或本文中描述的任何技术从受试者的血液分离。例如，可以通过白细胞去除术从受试者的血液分离单核细胞。在某些实施方案中，在培养第3天在包含地塞米松的培养基中培养来自步骤(b)的细胞。在一些实施方案中，在培养第3天在包含地塞米松和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)的培养基中培养来自步骤(b)的细胞。在一些实施方案中，在培养的第6天在包含地塞米松和维生素D2的培养基中培养来自步骤(c)的细胞。在一些实施方案中，在培养的第6天在包含地塞米松、维生素D2和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)的培养基中培养来自步骤(c)的细胞。在具体的实施方案中，在培养第3天在包含地塞米松的培养基中培养来自步骤(b)的细胞，并且在培养的第6天在包含地塞米松和维生素D2的培养基中培养来自步骤(c)的细胞。在一些实施方案中，在培养第3天在包含地塞米松和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)的培养基中培养来自步骤(b)的细胞，并且在培养的第6天在包含地塞米松、维生素D2和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)的培养基中培养来自步骤(c)的细胞。在某些实施方案中，所述MPLA以每ml 1-3μg的终浓度存在于所述培养基中。在具体的实施方案中，在收获所述细胞前在包含MPLA或MPLA以及所述抗原的培养基中将所述致耐受性树突细胞培养某个时间段(例如24小时)。在一些实施方案中，在收获所述细胞前在包含MPLA和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)或MPLA、一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)和所述抗原的培养基中将所述致耐受性树突细胞培养某个时间段(例如24小时)。在某些实施方案中，用于生成稳定的半成熟tolDC的方法花费约8天的细胞培养。
在某些实施方案中，用于生成稳定的半成熟tolDC的本文中所述的方法导致收获所述细胞时培养的致耐受性树突细胞的产率类似于通过在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂(tolerising agent)，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞的产率。在一些实施方案中，用于生成稳定的半成熟tolDC的本文中所述的方法导致收获所述细胞时培养的致耐受性树突细胞的产率类似于通过在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的非粘附树突细胞的产率。在具体的实施方案中，在本段中的术语“类似”意指树突细胞产率中有小于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％差异。
在一些实施方案中，用于生成稳定的半成熟tolDC的本文中所述的方法导致收获tolDC时培养的CD11c+树突细胞的百分比等同于或优于通过在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的CD11c+树突细胞的百分比。在具体的实施方案中，收获tolDC时培养的CD11c+树突细胞的百分比是至少20％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的培养时间后评估CD11c+树突细胞培养物的百分比。
在某些实施方案中，用于生成稳定的半成熟tolDC的本文中所述的方法导致收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的PD-L1表达低于通过在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞群体上的PD-L1表达。在一些实施方案中，tolDC群体上的PD-L1表达比通过在包含GM-CSF和IL-4的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞群体上的PD-L1表达低70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,10％或5％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估通过在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞群体和tolDC群体上的PD-L1表达。
在某些实施方案中，用于生成稳定的半成熟tolDC的本文中所述的方法导致收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的CD14表达比通过在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞群体上的CD14表达高至少3倍。在一些实施方案中，CD14表达比通过在包含GM-CSF和IL-4的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞群体上的CD14表达高约3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、11.5倍、12倍、12.5倍或13倍。在某些实施方案中，CD14表达比通过在包含GM-CSF和IL-4的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞群体上的CD14表达高3至4倍、3至5倍、3至6倍、3至10倍、3至15倍、4至6倍、5至10倍、10至15倍、5至12倍、10至13倍、或5至15倍。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估通过在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞群体和tolDC群体上的CD14表达。
在某些实施方案中，用于生成稳定的半成熟tolDC的本文中所述的方法导致收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的CD86表达低于通过在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞群体上的CD86表达。在一些实施方案中，tolDC群体上的CD86表达比通过在包含GM-CSF和IL-4的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD86表达低70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估通过在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞群体和tolDC群体上的CD86表达。
在某些实施方案中，用于生成稳定的半成熟tolDC的本文中所述的方法导致收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的CXCR3表达高于通过在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞群体上的CXCR3表达。在一些实施方案中，tolDC群体上的CXCR3表达比通过在包含GM-CSF和IL-4的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CXCR3表达高200％,150％,100％,90％,80％,70％,60％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估通过在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体和tolDC群体上的CD86表达。
在某些实施方案中，用于生成稳定的半成熟tolDC的本文中所述的方法导致tolDC比通过在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞诱导更高数目的CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞。在某些实施方案中，用于生成稳定的半成熟tolDC的本文中所述的方法导致tolDC比通过在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞诱导高250％,200％,150％,100％,75％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％的数目的CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞。在一个具体的实施方案中，如在下文6、7和/或8部分中描述的那样诱导Treg。
在一个具体的实施方案中，本文中所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致具有下文6、7和/或8部分中描述的Dex/维生素D2tolDC的1、2、3或更多种功能特性的tolDC。在另一个具体的实施方案中，本文中所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致具有下文6、7和/或8部分中描述的Dex/维生素D2tolDC的所有功能特性的tolDC。
在某些实施方案中，根据本文中所述的方法，感兴趣的抗原可以是与自身免疫性疾病有关的任何抗原。关于自身免疫性疾病和与那些自身免疫性疾病有关的抗原列表，参见例如下文表1。在一个具体的实施方案中，抗原是GAD65多肽。在另一个具体的实施方案中，抗原是胰岛素多肽。在一些实施方案中，将tolDC与抗原一起培养的步骤牵涉与1、2、3或更多种与自身免疫性疾病有关的抗原，如GAD65和胰岛素一起培养。
在一些实施方案中，根据本文中所述的方法，感兴趣的抗原可以是与移植物排斥或移植物抗宿主病有关的任何抗原。在一些实施方案中，将tolDC与抗原一起培养的步骤牵涉与1、2、3或更多种与移植物排斥或移植物抗宿主病有关的抗原一起培养。在某些实施方案中，使用从移植物(例如组织或细胞样品)供体获得或衍生的细胞溶胞物或MHC-肽作为抗原。
在另一个方面，本文中提供了稳定的半成熟tolDC。在一个具体的实施方案中，本文中提供了通过本文中所述的方法生成的稳定的半成熟致耐受性树突细胞群体。在具体的实施方案中，稳定的半成熟tolDC诱导细胞因子概况(profile)并且产生Treg，其对于治疗自身免疫性疾病是有利的。在具体的实施方案中，稳定的半成熟tolDC诱导细胞因子概况(profile)并且产生Treg，其对于治疗移植物排斥或移植物抗宿主病是有利的。在某些实施方案中，冷冻保存稳定的半成熟致耐受性树突细胞。
在另一个方面中，本文中提供了用于治疗受试者中的自身免疫性疾病的方法，其包括对受试者施用本文中所述的稳定的半成熟tolDC，其在包含MPLA和与自身免疫性疾病有关的抗原的培养基中培养。在一个具体的实施方案中，本文中提供了用于治疗受试者中的1型糖尿病的方法，其包括对受试者施用稳定的半成熟致耐受性树突细胞，其在包含MPLA和与1型糖尿病有关的抗原，如GAD65多肽或胰岛素多肽的培养基中培养。在某些实施方案中，致耐受性树突细胞源自具有等于或小于60mmol/mol Hb的血红蛋白(“Hb”)A1c(“HbA1c”)水平的受试者的单核细胞。在其它实施方案中，致耐受性树突细胞源自来自具有完全代偿性血糖水平的受试者的单核细胞。在具体的实施方案中，致耐受性树突细胞源自对于治疗的受试者自体的单核细胞。在具体的实施方案中，受试者是人受试者。
在另一个方面中，本文中提供了用于治疗移植物排斥或移植物抗宿主病的方法，其包括对受试者施用本文中所述的稳定的半成熟tolDC，其在包含MPLA和与移植物排斥或移植物抗宿主病有关的抗原的培养基中培养。在具体的实施方案中，致耐受性树突细胞源自对于治疗的受试者自体的单核细胞。在具体的实施方案中，受试者是人受试者。
在另一个方面中，本文中提供了用于治疗受试者中的自身免疫性疾病的方法，其包括：(a)与T细胞一起在培养基中培养稳定的半成熟致耐受性树突细胞以诱导Treg，所述稳定的半成熟致耐受性树突细胞在包含MPLA和与自身免疫性疾病有关的抗原的培养基中培养；(b)分离Treg；并且(c)对受试者施用Treg。在某些实施方案中，在对受试者施用前在培养基中扩充分离的Treg.在具体的实施方案中，致耐受性树突细胞源自对于治疗的受试者自体的单核细胞。在具体的实施方案中，Treg源自对于治疗的受试者自体的T细胞。在具体的实施方案中，受试者是人受试者。
在一个具体的实施方案中，本文中提供了治疗受试者中的1型糖尿病的方法，其包括：(a)与T细胞一起在培养基中培养稳定的半成熟致耐受性树突细胞以诱导Treg，所述稳定的半成熟致耐受性树突细胞在包含MPLA和与1型糖尿病有关的抗原，如GAD65多肽或胰岛素多肽的培养基中培养；(b)分离Treg；并且(c)对受试者施用Treg。在某些实施方案中，在对受试者施用前在培养基中扩充分离的Treg。在某些实施方案中，致耐受性树突细胞源自来自具有等于或小于60mmol/mol Hb的血红蛋白(“Hb”)A1c(“HbA1c”)水平的受试者的单核细胞。在具体的实施方案中，致耐受性树突细胞源自对于治疗的受试者自体的单核细胞。在某些实施方案中，T细胞分离自具有等于或小于60mmol/mol Hb的血红蛋白(“Hb”)A1c(“HbA1c”)水平的受试者。在具体的实施方案中，Treg源自对于治疗的受试者自体的T细胞。在具体的实施方案中，受试者是人受试者。
在另一个方面中，本文中提供了用于治疗受试者中的移植物排斥或移植物抗宿主病的方法，其包括：(a)与T细胞一起在培养基中培养稳定的半成熟致耐受性树突细胞以诱导Treg，所述稳定的半成熟致耐受性树突细胞在包含MPLA和与移植物排斥或移植物抗宿主病有关的抗原的培养基中培养；(b)分离Treg；并且(c)对受试者施用Treg。在某些实施方案中，在对受试者施用前在培养基中扩充分离的Treg。在具体的实施方案中，致耐受性树突细胞源自对于治疗的受试者自体的单核细胞。在具体的实施方案中，Treg源自对于治疗的受试者自体的T细胞。在具体的实施方案中，受试者是人受试者。
附图简述
图1：通过tolDC方案1产生的tolDC当与通过其它方法建立的其它tolDC相比时具有最终培养物中的最高细胞产率(yield)(A)和最终培养物中的最高CD11c+DC百分比(B)。在没有致耐受性因子(对照DC)、具有Dex(第3天+第6天)和VitD2(第6天)-tolDC 1、具有Dex(第3天+第6天)和Vit D2(第0天、第3天、第6天)-tolDC 2、仅具有VitD2(第0天、第3天、第6天)-tolDC 3的Cell Gro培养基中将DC培养8天。通过FAC分析评估最终培养物中CD11c+DC百分比。
图2：通过tolDC方案1产生的tolDC与通过其它方法产生的tolDC相比表达显著更低水平的致耐受性分子PD-L1(A)，但是显著更高水平的CD14(B)。在没有致耐受性因子(对照DC)、具有Dex(第3天+第6天)和VitD2(第6天)-tolDC 1、具有Dex(第3天+第6天)和VitD2(第0天、第3天、第6天)-tolDC 2、仅具有VitD2(第0天、第3天、第6天)-tolDC 3的Cell Gro培养基中将DC培养8天。通过FACS分析评估DC上的PD-L1和CD14表达。
图3：通过tolDC方案1产生的tolDC与通过其它方法产生的tolDC相比表达显著更低水平的成熟标志物CD86(A)，但是显著更高水平的趋化因子受体CXCR3(B)。在没有致耐受性因子(对照DC)、具有Dex(第3天+第6天)和VitD2(第6天)-tolDC 1、具有Dex(第3天+第6天)和VitD2(第0天、第3天、第6天)-tolDC 2、仅具有VitD2(第0天、第3天、第6天)-tolDC 3的Cell Gro培养基中将DC培养8天。通过FACS分析评估DC上的CD86和CXCR3表达。
图4：通过使用tolDC方案1生成的tolDC(VitD2)，而非通过使用tolDC方案4(VitD3)生成的tolDC与对照DC相比诱导更高水平的CD4+CD25+FoxP3+T调节细胞。在具有Dex和维生素D2(tolDC VitD2)、Dex和维生素D3(tolDC VitD3)或没有Dex和维生素D(对照DC)的Cell Gro培养基中将DC生成8天。以1:10(DC:T细胞)的比率将DC与幼稚异基因(allogeneic)T细胞培养9天。通过FACS分析来分析CD4+CD25+FoxP3+T调节细胞的百分比。
图5：通过tolDC 1 8天方案生成的tolDC当与通过tolDC 1方案持续7天产生的tolDC相比时诱导更高水平的CD4+CD25+FoxP3+T调节细胞。在具有Dex和维生素D2的CellGro培养基中将TolDC生成7天(空心圆圈)或8天(黑色方框)。。以1:10(tolDC:T细胞)的比率将TolDC与幼稚异基因T细胞培养9天。通过FACS分析来分析CD4+CD25+FoxP3+T调节细胞的百分比。
图6：显示培养方案tolDC 1的时间线的示意图。
图7：通过tolDC 1方案生成的Dex/VitD2tolDC显示致耐受性特征，并且表现出稳定的半成熟表型。在存在(tolDC)或缺乏Dex和VitD2(cDC)的情况下在Cell Gro中分化DC，然后用MPLA活化。A(1-4)通过流式细胞术评估成熟后tolDC和cDC上的表面标志物表达。B(1-4)在CG(CG)中培养tolDC和cDC，然后清洗，并且在没有耐受化因子的完全RPMI中再培养，并且用以下刺激物处理：含有IL-1β(10ng/ml)、TNF-α(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和IFN-γ(100ng/ml)或LPS(1μg/ml)或poly(I:C)(25μg/ml)或CD40L(1000ng/ml)的细胞因子混合物(CC)或使它们在RPMI中保持未刺激。通过流式细胞术分析表面标志物的表达。柱形图表示再刺激24h后的表面标志物的表达，连续线表示再刺激24-72h后的表达水平。数据表示为均值荧光强度(MFI)±SEM或来自最小10名供体的阳性细胞(CD1a和CD11c表达)的百分比。
图8：通过tolDC 1方案生成的tolDC表现出抗炎性细胞因子分泌概况。(A)在存在(tolDC)或缺乏Dex和VitD2(cDC)的情况下在Cell Gro中分化DC，然后用MPLA活化。通过Luminex分析细胞培养上清液中IL-6、TNF-γ、IL-10和IL-12p70(以pg/ml计)的浓度。(B)清洗tolDC和cDC，在没有耐受化因子的完全RPMI中再培养，并且用以下刺激物处理：含有IL-1β(10ng/ml)、TNFα(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和IFNγ(100ng/ml)或LPS(1μg/ml)或poly(I:C)(25μg/ml)或CD40L(1000ng/ml)的细胞因子混合物(CC)或使它们在RPMI中保持未刺激。在24h后，收集细胞培养上清液，并且通过Luminex和ELISA分析细胞因子浓度。对于至少5名供体，数据表示为均值±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。
图9：通过tDCs 1方案生成的tolDC即使在再刺激后显示异基因刺激测定法中的降低的刺激潜在。在存在(tolDC)或缺乏Dex和VitD2(cDC)的情况下在Cell Gro中分化DC，并且用MPLA活化。然后，清洗tolDC和cDC，在没有耐受化因子的完全RPMI中再培养，并且用以下刺激物处理：含有IL-1β(10ng/ml)、TNFα(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和IFNγ(100ng/ml)或LPS(1μg/ml)或poly(I:C)(25μg/ml)或CD40L(1000ng/ml)的细胞因子混合物(CC)或使它们在RPMI中保持未刺激。在再刺激24h后，收获tolDC和DC，清洗，并且以1:10比率(DC/T细胞)与异基因T细胞一起温育。A(1-2)通过CFSE稀释法在第6天评估与通过来自Cell Gro(CG)的tolDC和DC诱导的T细胞增殖相比由在其再培养到RPMI中并且在再刺激后的tolDC和DC诱导的T细胞的增殖。显示了增殖T细胞的百分比和代表性直方图。(B)与通过来自CellGro(CG)的tolDC和DC诱导的T细胞IFNγ生成相比由在其再培养到RPMI中并且在再刺激后的tolDC和DC诱导的T细胞的IFNγ生成。在第6天通过IFNγ胞内染色评估IFNγ生成性T细胞的数目。显示了IFNγ阳性T细胞的百分比和代表性的点图。(C)与通过来自Cell Gro(CG)的tolDC和DC诱导的T细胞的IL-10生成相比由在其再培养到RPMI中并且在再刺激后的tolDC和DC诱导的T细胞的IL-10生成。在第9天通过IL-10胞内染色评估IL-10生成性T细胞的数目。显示了IL-10阳性T细胞的百分比和代表性的点图。对于至少10名供体，数据表示为均值±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。
图10：通过tolDC 1方案生成的tolDC诱导从幼稚CD4+T细胞的从头CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞分化。在存在(tolDC)或缺乏Dex和VitD2(cDC)的情况下在Cell Gro中分化DC，并且用MPLA活化。然后，清洗tolDC和cDC，在没有耐受化因子的完全RPMI中再培养，并且用以下刺激物处理：含有IL-1β(10ng/ml)、TNFα(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和IFNγ(100ng/ml)或LPS(1μg/ml)或poly(I:C)(25μg/ml)或CD40L(1000ng/ml)的细胞因子混合物(CC)或使它们在RPMI中保持未刺激。在再刺激24h后，收获tolDC和DC，清洗，并且以1:10比率(DC/T细胞)与异基因T细胞一起温育。在第9天通过FoxP3胞内染色评估从幼稚CD4+T细胞分化CD4+CD25+FoxP3+T细胞。显示了CD4+CD25+FoxP3+T细胞的百分比和代表性的点图。对于至少10名供体，数据表示为均值±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。
图11：在模拟体内DC活化后在tolDC 1和cDC中触发不同胞内信号传导途径。在存在(tolDC)或缺乏Dex和VitD2(cDC)的情况下在Cell Gro中分化DC，并且用MPLA活化。然后，清洗tolDC和cDC，在没有耐受化因子的完全RPMI中再培养，并且用以下刺激物处理60分钟：含有IL-1β(10ng/ml)、TNFα(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和IFNγ(100ng/ml)或LPS(1μg/ml)或poly(I:C)(25μg/ml)或CD40L(1000ng/ml)的细胞因子混合物(CC)或使它们在RPMI中保持未刺激。(A)在刺激60分钟后，制备细胞溶胞物，并且使用特异性单抗实施磷酸化p38MAPK、JNK/SAPK、ERK1/2、IkB-α的western印迹分析。还使用特异性mAb分析IDO的水平。使用每份样品中的总p38MAPK、JNK/SAPK、ERK1/2、IkB-α或β-肌动蛋白作为相等的加载对照。显示了实施的三个实验之一。(B)分析NF-κB亚基p50、p65/RelA、RelB和c-Rel的DNA结合活性。将DC保持未处理(CG)或单独或与CC、LPS、poly(I:C)和CD40L组合在RPMI中再刺激90分钟。通过比色测定法分析NF-κB亚基的DNA结合活性。C(1-6)通过ELISA评估在存在p38MAPK抑制剂SB203580(SB)、JNK/SAPK抑制剂SP600125(SP)、ERK1/2抑制剂PD98059(PD)、NF-κB抑制剂Bay 11-0782(Bay)的情况下用RPMI、CC、LPS、poly(I:C)和CD40L再刺激后IL-10和IL-12的生成。D(1-3)通过流式细胞术评估了在存在p38MAPK抑制剂SB203580(SB)和ERK1/2抑制剂PD98059(PD)的情况下用RPMI、CC、LPS、poly(I:C)和CD40L再刺激24h后tolDC和cDC上的PD-L1和ILT-3表达。对于至少10名供体，数据表示为均值±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。
图12：通过tDCs 1方案生成的tolDC在用CC、LPS、poly(I:C)和CD40L再刺激后表现出mTOR和STAT3的活化。在存在(tolDC)或缺乏Dex和VitD2(cDC)的情况下在Cell Gro中分化DC，并且用MPLA活化。然后，清洗tolDC和cDC，在没有耐受化因子的完全RPMI中再培养，并且用以下刺激物处理60分钟：含有IL-1β(10ng/ml)、TNFα(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和IFNγ(100ng/ml)或LPS(1μg/ml)或poly(I:C)(25μg/ml)或CD40L(1000ng/ml)的细胞因子混合物(CC)或使它们在RPMI中保持未刺激。在指出时，在再刺激前用mTOR抑制剂雷帕霉素或STAT3抑制剂Stattic将细胞预处理30分钟。(A)在刺激的60分钟后，制备细胞溶胞物，并且实施特异性单抗实施磷酸化mTOR、p70S6K和STAT3的western印迹分析。使用β-肌动蛋白作为相等的加载对照。显示了实施的三个实验之一。(B)通过ELISA测量刺激24h后由DC分泌的IL-10和IL-12的水平。C(1-4)通过FACS分析评估在存在mTOR抑制剂雷帕霉素或STAT3抑制剂Stattic的情况下用RPMI、CC、LPS、poly(I:C)和CD40L再刺激24h后PD-L1和ILT-3分子的表达。对于至少4个独立实验，数据表示为均值±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。
图13：使用tDC 1方案从T1D患者建立的tolDC表现出稳定的半成熟表型。A(1-3)成熟后tolDC和cDC上的表面标志物表达。在存在(tolDC)或缺乏Dex和VitD2(cDC)的情况下在Cell Gro中分化来自T1D患者的DC，用胰岛素(1μg/ml)或GAD-65(5μg/ml)加载，并且用MPLA活化。B(1-2)与对来自Cell Gro(CG)的tolDC和DC测定的基础表达相比在其再培养到RPMI中后并且在再刺激后tolDC和cDC上的表面标志物表达。清洗tolDC和cDC，在没有耐受化因子的完全RPMI中再培养，并且用以下刺激物处理：IL-1β(10ng/ml)、TNFα(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和IFNγ(100ng/ml)或LPS(1μg/ml)或poly(I:C)(25μg/ml)的细胞因子混合物(CC)或使它们在RPMI中保持未刺激24h。通过流式细胞术评估细胞表面标志物表达。对于至少3名供体，数据表示为荧光强度(MFI)±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。
图14：使用tDC 1方案从T1D患者建立的tolDC降低从自体T细胞的IFN-γ分泌。通过ELISPOT评估的与自体tolDC或cDC一起温育的T1D患者的T细胞对胰岛素或GAD65的细胞因子应答。在96孔经抗IFN-γ单抗包被的ELISPOT测定板中每孔将3x 104个加载有胰岛素(1μg/ml)或GAD65(5μg/ml)的tolDC或cDC与3×105个自体T细胞一起接种，并且于37℃温育48小时。使用生物素化的抗IFN-γ二抗和缀合的链霉亲合素–碱性磷酸酶用BCIP/NBT缓冲液显现代表IFN-γ生成性细胞的点，并且使用Series-1Immunospot分析仪量化。显示了来自11名患者的数据。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。
图15：Dex/VitD2tDC表现出稳定的半成熟表型和抗炎性细胞因子分泌概况。在补充有GM-CSF和IL-4的Cell Gro中在存在(tDC，黑色柱形)或缺乏Dex和VitD2(cDC，灰色柱形)的情况下从单核细胞分化DC以获得未成熟的tDC或未成熟的cDC(MEDIUM)。最终，用MPLA活化细胞24h(MPLA)。A(1-4)通过流式细胞术分析表面标志物表达，并且(C)通过Luminex从上清液分析由DC释放的细胞因子(tDC黑色方框，cDC灰色方框)。在Cell Gro(CG)中用MPLA活化24h后，清洗细胞，并且在没有耐受化因子的完全RPMI中再培养，并且用图7B中所述的细胞因子混合物(CC)或LPS(1μg/ml)或polyI:C(25μg/ml)或CD40L(1000ng/ml)处理或使它们保持未刺激(RPMI)。B(1-2)柱形图代表通过流式细胞术分析的表面标志物表达和(D)再刺激24h后通过Luminex或ELISA分析的由DC释放的细胞因子。数据表示来自至少3个独立实验和最少10名供体的MFI±SEM或阳性细胞CD1a和CD11c表达)百分比(*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)，nt-未测试。
图16：Dex/VitD tDC在再刺激后维持降低的T细胞刺激能力。在存在(tDCs)或缺乏Dex和VitD2(cDCs)的情况下在Cell Gro中分化DC，并且用MPLA(CG)活化。然后，清洗DC，在没有耐受化因子的完全RPMI中再培养，并且用图7B中所述的细胞因子混合物(CC)或LPS(1μg/ml)或polyI:C(25μg/ml)或CD40L(1000ng/ml)处理或使它们保持未刺激(RPMI)。在24h后，清洗tDC和cDC，并且与异基因T细胞以1:10比率(DC/T细胞)温育。(A)通过CFSE稀释法在第6天评估T细胞的增殖。显示了增殖T细胞的百分比。(B)在第6天通过ELISA分析DC/T细胞共培养物中的IL-17A生成。(C)分别在第6天或第9天评估IFN-γ生成性T和(D)IL-10生成性T细胞的百分比。对于至少3个独立实验和至少10名供体，数据表示均值±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。
图17：Dex/VitD2tDC诱导IL-10生成性Treg，其能够抑制响应T细胞的增殖。在存在(tDCs)或缺乏(cDC)Dex和VitD2(cDC)的情况下在Cell Gro中分化DC(供体B)，并且用MPLA活化。在RPMI(5％人AB血清)中以1:10比率(DCs/T细胞)将Dex/VitD2tDC与异基因T细胞(供体A)温育，用于两轮引发。然后，评估诱导的Treg的细胞因子生成和抑制能力。(A)以1:10比率(DCs/T细胞)将Treg(供体A)与特定的cDCs(供体B)共培养。来自3个独立供体的代表性点图显示了第6天评估的IL-10、IFN-γ和IL-17生成性T细胞的百分比。在第6天通过ELISA在细胞上清液中分析IL-10、IFN-γ和IL-17的生成。(B)在MLR测定法中对CD4+Treg测试抑制能力。将CD4+Treg(供体A)与响应T细胞(供体A)和cDCs(供体B)一起铺板。cDC与用于诱导Treg的Dex/VitD2tDC来自相同供体。以Treg/Tresp/DCs比率10:10:1或5:10:1铺板细胞。作为另外的对照，单独或与cDC一起培养Tresp。在6d后，回收细胞，并且通过流式细胞术测量KI-67分析响应细胞的增殖。描绘了响应T细胞增殖的百分比抑制(黑色柱形，对于3个独立供体的均值±SEM，每个一式三份实施)和显示响应T细胞的增殖的一个代表性点图。(C)回收细胞培养上清液，用于IL-10、IFN-γ和IL-17A分析。对于3个独立供体(每个一式三份实施)，数据代表均值±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01(配对t检验)。
图18：在模拟体内DC活化后在tDC和cDC中触发不同胞内信号传导途径。在存在(tDCs)或缺乏Dex和VitD2(cDC)的情况下在Cell Gro中分化DC，并且用MPLA(CG)活化。然后，清洗tDC和cDC，在没有耐受化因子的完全RPMI中再培养，并且用图7B中所述的细胞因子混合物(CC)或LPS(1μg/ml)或polyI:C(25μg/ml)或CD40L(1000ng/ml)处理或使它们保持未刺激(RPMI)。(A)在再刺激60分钟后，通过western印迹分析来分析p38MAPK、JNK/SAPK、ERK1/2、IκB-α的磷酸化和IDO的水平。使用每份样品中的总p38MAPK、JNK/SAPK、ERK1/2、IκB-α或β-肌动蛋白作为相等的加载对照。显示了实施的三个实验之一。(B)在再刺激90分钟后，通过比色测定法分析NF-κB亚基的DNA结合活性。(C)通过ELISA评估在存在p38MAPK抑制剂SB203580(SB)、JNK/SAPK抑制剂SP600125(SP)、ERK1/2抑制剂PD98059(PD)、NF-κB抑制剂Bay 11-7082(Bay)的情况下用CC、LPS、polyI:C和CD40L再刺激tDC和cDCs达24h后的IL-10和IL-12生成。(D)通过流式细胞术评估在存在p38MAPK抑制剂SB203580(SB)、JNK/SAPK抑制剂SP600125(SP)和ERK1/2抑制剂PD98059(PD)的情况下用CC、LPS、polyI:C和CD40L再刺激tDC和cDCs达24h后的tDC和cDC上的ILT-3、PD-L1和CD86表达。(E)在再刺激前，用p38MAPK抑制剂SB203580(SB)和ERK1/2抑制剂PD98059(PD)预处理tDC，并且刺激24h，然后，将tDC与异基因T细胞共培养。在第6天测量增殖。数据表示来自至少3个独立实验的均值±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。
图19：mTOR和STAT3在再刺激后调节tDC的致耐受性特性。在存在(tDCs)或缺乏Dex和VitD2(cDC)的情况下在Cell Gro中分化DC，并且用MPLA(CG)活化。然后，清洗tDC和cDC，在没有耐受化因子的完全RPMI中再培养，并且图7B的图注中描述的细胞因子混合物(CC)或LPS(1μg/ml)或polyI:C(25μg/ml)或CD40L(1000ng/ml)处理或使它们保持未刺激(RPMI)。在指示时，在再刺激前将细胞用mTOR抑制剂雷帕霉素或STAT3抑制剂Stattic预处理30分钟。(A)在再刺激60分钟后，使用特异性单抗实施磷酸化mTOR、p70S6K和STAT3的western印迹分析。使用β-肌动蛋白作为相等的加载对照。显示了实施的三个实验之一。(B)通过ELISA测量再刺激24h后由DC的IL-10和IL-12生成。(C)通过FACS分析评估在存在mTOR抑制剂雷帕霉素或STAT3抑制剂Stattic的情况下用CC、LPS、polyI:C和CD40L再刺激24h后CD86、PD-L1和ILT-3的表达。(D)在再刺激前，用mTOR抑制剂雷帕霉素或STAT3抑制剂Stattic预处理tDC，并且刺激24h。然后，将tDC与异基因T细胞共培养。在第6天测量增殖。数据表示来自至少4个独立实验的均值±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。
图20:增强的糖酵解调节Dex/VitD tDC的致耐受性表型和功能。在存在(tDCs)或缺乏Dex和VitD2(cDC)的情况下在Cell Gro中分化DC，并且用MPLA(CG)活化。然后，清洗tDC和cDC，在没有耐受化因子的完全RPMI中再培养，并且用以下刺激物处理：图1B中所述的细胞因子混合物(CC)或LPS(1μg/ml)或polyI:C(25μg/ml)或CD40L(1000ng/ml)或使它们保持未刺激(RPMI)。当指示时，在再刺激前用雷帕霉素或10mM 2-脱氧葡萄糖(2-DG)将细胞预处理30分钟。(A)在24h后，对上清液分析葡萄糖和乳酸的浓度作为糖酵解活性的至少。在细胞溶胞物中分析乳酸脱氢酶(LDH)活性。(B)24h后，通过评估DC上清液中的乳酸浓度分析再刺激前通过用用雷帕霉素或10mM 2-脱氧葡萄糖将DC处理30分钟对糖酵解的抑制。(C)通过FACS分析评估在存在糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖的情况下再刺激24h后DC上的ILT-3、PD-L1和CD86表达。(D)通过ELISA测量再刺激24h后由DC的IL-10和IL-12生成。(E)在再刺激前，用2-DG预处理tDC，并且刺激24h。然后，将tDC与异基因T细胞共培养。在第6天测量增殖。数据表示来自至少4个独立实验的均值±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。
图21：从T1D患者的单核细胞制备的tDC表现出稳定的半成熟表型。A(1-2)在未成熟tDC或cDC上和MPLA成熟的tDC或cDC上的表面标志物的表达。B(1-2)在冷冻/融化并且再刺激MPLA成熟的tDC或cDC上的表面标志物的表达。将MPLA成熟的来自CellGro(CG)的tDC或cDC冷冻，并且在液氮中贮存至少1个月，然后融化，清洗，并且在具有5％HS且没有耐受化因子的RPMI中再培养，并且使它们保持未刺激(5％HS)或用LPS(1μg/ml)或CD40L(1μg/ml)将它们再刺激24h。图代表通过流式细胞术分析的表面标志物的表达。数据表示为来自最少15名供体的至少5个独立实验的荧光强度(MFI)±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。ns，不显著。
图22：从T1D患者的单核细胞制备的tDC表现出抗炎性细胞因子分泌概况。A在未成熟tDC或cDC上和MPLA成熟的tDC或cDC上的细胞因子的生成。B(1-2)在冷冻/融化并且再刺激MPLA成熟的tDC或cDC上的细胞因子生成。将MPLA成熟的来自CellGro(CG)的tDC或cDC冷冻，并且在液氮中贮存至少1个月，然后融化，清洗，并且在具有5％HS且没有耐受化因子的RPMI中再培养，并且使它们保持未刺激(5％HS)或用LPS(1μg/ml)或CD40L(1μg/ml)将它们再刺激24h。图表示使用多重细胞因子测定法在培养3h或24h后或者再刺激24h后细胞培养上清液中检测的细胞因子的分泌。数据表示为来自最少10名供体的至少3个独立实验的荧光强度(MFI)±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。ns，不显著。
图23:tDC诱导较低的自身反应性T细胞增殖。(A)具有HbA1c≤60mmol/mol Hb(组1，G1)或HbA1c＞60mmol/mol Hb(组2，G2)的患者的CD4+和CD8+T cells的增殖。(B)HbA1c水平与GAD特异性CD4+或CD8+T细胞应答(以通过加载有GAD的cDC诱导的％增殖T细胞-由未脉冲的cDC诱导的％增殖T细胞给出)的关联分析和HbA1c水平与由未脉冲的cDC诱导的％增殖CD4+或CD8+T细胞的关联分析。在第6天时，通过KI-67的胞内染色检测增殖的T细胞的百分比，并且通过流式细胞术分析。每个点代表来自至少10个独立实验的个体患者的数值。(C)HbA1c水平与PPD特异性CD4+T细胞响应的关联分析。r＝根据Pearson分析的关联指数，*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。ns，不显著。
图24：tDC诱导较低的自身反应性T细胞活化。(A)来自具有HbA1c≤60mmol(组1,G1)或HbA1c＞60mmol(组2,G2)的患者的CD4+或CD8+T细胞的IFN-γ+KI-67+T细胞的百分比。(B)来自具有HbA1c≤60mmol(G1)或HbA1c＞60mmol(G2)的患者的CD4+或CD8+T细胞的KI-67+IL-17A+T细胞的百分比。(C)HbA1c水平与GAD特异性CD4+或CD8+T细胞应答(以通过加载有GAD的cDC诱导的％IFN-γ+KI-67+T细胞-由未脉冲的cDC诱导的％IFN-γ+KI-67+T给出)的关联分析和HbA1c水平与由未脉冲的cDC诱导的％IFN-γ+KI-67+T细胞的关联分析。(D)HbA1c水平与GAD特异性CD4+或CD8+T细胞应答(以通过加载有GAD的cDC诱导的％IL-17A+KI-67+T细胞-由未脉冲的cDC诱导的％IL-17A+KI-67+T给出)的关联分析和HbA1c水平与由未脉冲的cDC诱导的％IL-17A+KI-67+T细胞的关联分析。在第6天时，通过KI-67的胞内染色检测细胞因子生成性KI-67+T细胞的百分比，并且通过流式细胞术分析。每个点代表来自至少10个独立实验的个体患者的数值。r＝根据Pearson分析的关联指数，*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。ns，不显著。
图25A–25B：tDC诱导DC和T细胞培养物中的促炎性细胞因子的较低的量。用未脉冲的或加载有GAD的来自具有HbA1c≤60mmol(组1，G1)或HbA1c＞60mmol(组2，G2)的患者的tDC或cDC刺激自体T细胞。图表示在第6天通过多重细胞因子测定法量化的T细胞和tDC或cDC培养物中的细胞因子浓度。数据表示来自最少8名供体的至少3个独立实验的均值±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。ns，不显著。
图26：tDC能够抑制cDC诱导的T细胞活化。用加载有GAD来自具有HbA1c≤60mmol(组1，G1)或HbA1c＞60mmol(组2，G2)的患者的tDC或cDC刺激自体T细胞。将各种数目的加载有GAD的tDC添加到加载有GAD的cDC和T细胞(T细胞:cDCs:tDC比率分别是10:1:0.25、10:1:0.5或10:1:1)的培养物。图表示在第6天通过多重细胞因子测定法量化的T细胞和tDC或cDC培养物中的细胞因子浓度。数据表示来自最少8名供体的至少3个独立实验的均值±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01(配对t检验)。
图27：致耐受性DC在来自T1D患者组的GAD65反应性T细胞中诱导稳定的抗原特异性低反应性。来自用CFSE染色先前用加载有GAD65的自体cDC或tDC刺激的T1D患者的组1或组2的淋巴细胞，并且用加载有GAD的cDC或加载有PPD的cDC再攻击。6天后通过CFSE染色分析T细胞增殖。数据表示为来自8名供体的5个独立实验的均值±SEM。**p≤0.01(配对t检验)。ns，不显著。
图28：tDC能够诱导幼稚CD4+T细胞分化成调节FoxP3+T细胞。(A)用未脉冲的或加载有GAD的tDC或cDC刺激自体幼稚CD4+T细胞。图表示在第9天时通过流式细胞术检测的由未脉冲的或加载有GAD的tDC或cDC诱导的CD4+KI-67+T细胞的CD127-CD25+FoxP3+的百分比。数据表示为来自7名供体的5个独立实验的均值±SEM。**p≤0.01(配对t检验)。ns，不显著。(B)来自CD4+KI-67+T细胞的CD127-CD25+FoxP3+的诱导诱导加载有GAD的来自具有HbA1c≤60mmol(组1,G1)或HbA1c＞60mmol(组2,G2)的患者的tolDC或cDC。
图29A–29C：从T1D患者的单核细胞制备的tDC表现出半成熟表型。成熟前(半成熟)和MPLA成熟后(MPLA)的tDC(黑线)或cDC(灰线)上的表面标志物的表达。亮灰色实心直方图表示同种型对照单抗染色。通过流式细胞术获得数据。显示了最少10名独立供体的代表性直方图。
图30：用于tDC生成的Dex和VitD2不影响DC存活力。(A)成熟前(未成熟)和MPLA成熟后(MPLA)的tDC或cDC的存活力。(B)融化并且再刺激的MPLA成熟的tDC或cDC的存活力。将MPLA成熟的来自CellGro(CG)的tDC或cDC冷冻，并且在液氮中贮存至少1个月，然后融化，清洗，并且在补充有5％人血清(HS)且没有耐受化因子的RPMI中再培养，并且用以下刺激物再刺激：由IL-1β、TNF-α、IL-6(均为10ng/ml)和IFN-γ(100ng/ml)或LPS(1μg/ml)或CD40L(1μg/ml)组成的细胞因子混合物(CC)或使它们保持未刺激(5％HS)。通过流式细胞术获得数据，并且基于膜联蛋白V和DAPI染色评估。结果表示为来自最少5名供体的至少3个独立实验的均值±SEM。**p≤0.01,***p≤0.001(配对t检验)。ns，不显著。显示了最少5名独立供体的代表性点图。
图31：用各种DC组引发幼稚CD4+T细胞后调节性T细胞生成的分析的门控策略。第一个点图描绘了基于前向散射和侧向散射的门中的T细胞。第二个点图描绘了对CD4+和KI-67+T细胞的门控。第三个图显示了CD25和FoxP3的表达。随后，对CD25+FoxP3+T细胞分析CD127的表达。
图32：Dex/VitD2tDC表现出比cDC更高的PD-L1/CD86比率。PD-L1/CD86比率是致耐受性的标志物。细胞表面标志物PD-L1和CD86的比率在tolDC中高于在cDC中。从T1D患者的单核细胞和从健康供体的单核细胞制备tDC或cDC。在存在(tDC，黑色柱形)或缺乏Dex和VitD2(cDC，灰色柱形)的情况下在补充有GM-CSF和IL-4的Cell Gro中从单核细胞分化DC以获得未成熟的tDC或未成熟的cDC。最终用MPLA将细胞活化24h。通过流式细胞术分析表面标志物表达。
5.发明详述
5.1术语
在描述和要求保护本发明中，应如下理解以下术语。
如本文中所用，除非另有说明，术语“蛋白质”和“多肽”可互换地指通过肽键连接在一起的氨基酸链。在一些实施方案中，术语“蛋白质”和“多肽”是指包含通过肽键连接在一起的氨基酸的大分子。
如本文中所用，在培养中扩充调节性T细胞(Treg)的情况下，术语“扩充”是指培养含有少量Treg的混合或纯的细胞群，使得Treg增殖到更大的数目。
“自体细胞”是指从通过细胞疗法治疗的相同受试者衍生的细胞。
“供体细胞”是指衍生自除了通过细胞疗法治疗的受试者之外的受试者的细胞。
“异基因细胞”是指遗传上不同的细胞。
如本文中所用，术语“治疗”和“处理”在对受试者施用疗法的上下文中是指受试者从疗法得到的有益效果。在某些实施方案中，根据本文所述的方法治疗具有自身免疫性疾病的受试者实现至少一种、两种、三种、四种或更多种以下效果：(i)减少或改善自身免疫性疾病的一种或多种症状的严重程度；(ii)减少与自身免疫性疾病相关的一种或多种症状的持续时间；(iii)保护免受与自身免疫性疾病有关的症状的复发；(iv)受试者的住院治疗减少；(v)减少住院时间；(vi)受试者存活的增加；(vii)增强或改善另一疗法的治疗效果；(viii)受试者的存活率增加；(xiii)住院率下降；(ix)防止与自身免疫性疾病相关的一种或多种症状的发展或发作；(x)减少与自身免疫性疾病有关的症状数目；(xi)自身免疫性疾病受试者无症状存活的增加；(xii)如通过本领域熟知的方法评估的生活质量的改善；(xiii)降低死亡率；(xiv)患者的无自身免疫性疾病的存活率增加；(xv)无复发存活的增加；(xvi)缓解的患者数目的增加；和/或(xvi)患者缓解时间的增加。
在某些实施方案中，根据本文中所述的方法治疗具有移植物排斥或移植物抗宿主病的受试者实现至少一种、两种、三种、四种或更多种以下效果：(i)减少或改善移植物排斥或移植物抗宿主病的一种或多种症状的严重程度；(ii)减少与移植物排斥或移植物抗宿主病相关的一种或多种症状的持续时间；(iii)保护免受与移植物排斥或移植物抗宿主病有关的症状的复发；(iv)受试者的住院治疗减少；(v)减少住院时间；(vi)受试者存活的增加；(vii)增强或改善另一疗法的治疗效果；(viii)受试者的存活率增加；(xiii)住院率下降；(ix)防止与移植物排斥或移植物抗宿主病相关的一种或多种症状的发展或发作；(x)减少与移植物排斥或移植物抗宿主病有关的症状数目；(xi)移植物排斥或移植物抗宿主病受试者无症状存活的增加；(xii)如通过本领域熟知的方法评估的生活质量的改善；(xiii)降低死亡率；(xiv)患者的无移植物排斥或移植物抗宿主病的存活率增加；(xv)无复发存活的增加；(xvi)缓解的患者数目的增加；和/或(xvi)患者缓解时间的增加。
如本文中所用，术语“树突细胞”(有时在本文中称为“DC”)是指能够引发初级免疫应答的抗原呈递细胞类型。在具体的实施方案中，树突细胞是指执行免疫系统的一个或全部以下功能的细胞：1)抗原的摄取、加工和呈递，2)效应细胞如T细胞、B细胞和NK细胞的活化，和/或3)细胞因子和其它免疫调节分子的分泌以引导免疫应答。在稳态(稳态条件)下，树突细胞可以在血液中未成熟的状态下发现。当被活化时，它们迁移到它们与T细胞和B细胞相互作用的淋巴结中。
如本文中所用，术语“成熟”是指当未成熟的DC经历形态学、表型和功能性变化的过程，其最终导致从抗原捕获细胞到完全成熟的抗原呈递细胞的完全转变。成熟的特征可以在于增加的共刺激分子如CD40，CD80和CD86的表达，MHC上调，吸收和处理抗原的能力的丧失以及一大批炎性细胞因子和趋化因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12)的生成。一旦被活化或成熟，DC可以迁移到淋巴结，在那里它们与T细胞和B细胞相互作用以启动和成形适应性免疫应答。
如本文中所用，术语“成熟树突细胞”和“活化树突细胞”是指呈递抗原的突变细胞，其特征在于共刺激分子如CD40、CD80和CD86的表达、MHC上调、能够吸收和加工抗原的能力丧失，以及产生一大批炎性细胞因子和趋化因子(如IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12)。
如本文中所用，术语“致耐受性树突细胞”或“tolDC”或“tDC”是指具有免疫抑制性质的抗原呈递细胞。TolDc具有低的活化效应T细胞的能力，但具有高的诱导和活化调节性T细胞的能力。TolDC可以通过呈递对于效应细胞活化具有不足的共刺激和细胞因子生成的抗原诱导耐受性。除了明显增加的抗原摄取能力之外，TolDC通常由MHC II、共刺激分子CD80、CD86和CD40以及趋化因子受体CCR7的低水平或中间水平定义。TolDC表达高水平的抑制性分子，如Ig样转录物(ILT)分子(ILT3/ILT4)和/或PD-L分子(PD-L1，PD-L2)。此外，tolDC分泌少量促炎细胞因子(IL-12p70)和大量抗炎细胞因子，如IL-10。TolDC通过几种机制诱导T细胞无反应性、T细胞抑制和调节性T细胞的产生，所述机制包括将幼稚T细胞转化为Treg、免疫抑制细胞因子的释放和功能性吲哚胺-2,3双加氧酶(IDO)的表达。
如本文中所用，术语“半成熟致耐受性树突细胞”或“半成熟tolDC”是指以相对于在包含GM-CSF和IL-4而没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2(例如如下文第6、7和/或8部分中描述)的培养基中培养的树突细胞，细胞表面标志物CD86、CD83、CD80和CD40的低表达水平和TLR-2、CD14、TIM-3和ILT-3的上调表达为特征的树突细胞。与未成熟的树突细胞形成对比，半成熟树突细胞能够迁移到淋巴结。
如本文中所用，术语“稳定的半成熟致耐受性树突细胞”和“稳定的半成熟tolDC”是指在不存在致耐受剂的情况下并且在存在炎症信号的情况下保留其半成熟致耐受性性质的tolDC。在一个具体的实施方案中，稳定的半成熟tolDC在成熟和细胞因子产生方面在通过炎症例如体内模拟DC活化的再刺激后在功能上保持稳定。在另一个实施方案中，稳定的tolDC仍然能够诱导Treg并且减少与再生刺激后自身免疫性疾病相关的细胞因子的分泌。在另一个具体实施方案中，稳定的半成熟tolDC在遇到类似于治疗条件的生理环境之后是功能稳定的。在另一个具体实施方案中，稳定的半成熟tolDC在用脂多糖(LPS)、poly(I:C)或促炎细胞因子混合物如IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-γ混合物再刺激后在不存在致耐受剂，如地塞米松和维生素D2的情况下在成熟和细胞因子产生方面保持功能稳定的，并且可以用于免疫耐受性治疗。在另一个具体实施方案中，稳定的半成熟致耐受性树突细胞在不存在致耐受剂(如地塞米松和维生素D2)的情况下在用脂多糖(LPS)、poly(I:C)或促炎细胞因子的混合物，如IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-γ的混合物刺激后维持其半成熟的致耐受性性质。在另一个具体实施方案中，稳定的半成熟致耐受性树突细胞是稳定的，如通过下文第6、7和/或8部分中描述的一种、两种或全部方法评估。
如本文中所用，在致耐受性树突细胞(tolDC)的上下文中，术语“稳定的半成熟致耐受性表型”是指在不存在致耐受剂且存在炎性信号的情况下保持其半成熟致耐受性性质的tolDC。在一个具体的实施方案中，维持稳定的半成熟致耐受性表型的tolDC在例如通过炎症体内模拟DC活化的再刺激后在成熟和细胞因子产生方面在功能上保持功能稳定。在另一个实施方案中，维持稳定的半成熟致耐受性表型的tolDC仍然能够诱导Treg并且减少再刺激后与自身免疫性疾病相关的细胞因子的分泌。在另一个具体实施方案中，维持稳定的半成熟致耐受性表型的tolDC在遇到与治疗条件类似的生理环境之后保持功能稳定。在另一个具体实施方案中，维持稳定的半成熟致耐受性表型的tolDC在不存在致耐受剂如地塞米松和维生素D2的情况下在使用脂多糖(LPS)、poly(I:C)或促炎性细胞因子的混合物，如IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-γ的混合物再刺激后在成熟和细胞因子产生方面保持功能稳定，并且可以用于免疫耐受性治疗。在另一个具体实施方案中，维持稳定的半成熟致耐受性表型的tolDC在不存在致耐受剂如地塞米松和维生素D2的情况下在用脂多糖(LPS)、poly(I:C)或促炎性细胞因子的混合物，如IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-γ的混合物再刺激后保持半成熟致耐受性特性。在另一个具体实施方案中，维持稳定的半成熟致耐受性表型的tolDC是稳定的，如通过下文第6、7和/或8部分中描述的一种、两种或全部方法评估。
如本文中所用，术语“耐受化剂”和“致耐受剂”是指可产生致耐受性树突的药剂。致耐受剂的实例包括地塞米松、维生素D2或其类似物、维生素D3或其类似物、神经肽，如血管活性肠肽或垂体腺苷酸环化酶活化多肽。
如本文中所用，术语“调节性T细胞”或“Treg”是指通过抑制免疫系统的活化，从而维持免疫系统的稳态并有利于针对自身抗原的耐受性起作用的T细胞的特化亚群的细胞。调节性T细胞可以表征为CD4+CD25+FoxP3+细胞。
如本文中所用，术语“单核细胞”是指特征在于豆形核和不存在颗粒的在血液中循环的白细胞。单核细胞可以引起树突细胞。
如本文中所用，术语“维生素D2”是指维生素D2的活性形式。维生素D2的活性形式包括旁卡西醇(paracalcitol)、19-去甲-1,25-二羟基维生素D2、Zemplar和本领域已知的活性维生素D2的所有其它形式，包括维生D2类似物。在一个具体的实施方案中，维生素D2是下文第6、第7和/或第8部分中引用的形式。在另一个具体实施例中，维生素D2是下文第6、第7和/或第8部分中引用的维生素D2。维生素D2在本文中有时称为vitD2。
如本文中所用，术语“地塞米松”是指可溶性地塞米松磷酸钠、地地塞米松和地塞米松的所有其它形式以及在本领域中所知的地塞米松名称。在一个具体的实施方案中，地塞米松是下文第6、第7和/或第8部分中引用的地塞米松。地塞米松在本文中有时称为Dex。
如本文中所用，术语“单磷酰脂质A”或“MPLA”是指来自革兰氏阴性细菌的脂质A级分的天然衍生物(包括肠沙门氏菌明尼苏达(Salmonella enterica Minnesota)R595脂多糖)或相同衍生物的合成形式或本领域已知的任何可用形式。从细菌中纯化的MPLA可以含有4、5、6、7或8种酰基脂质A的混合物。合成的MPLA可以仅含有一类酰基脂质A，如6种酰基脂质A。在一个具体的实施方案中，MPLA是下文第6、第7和/或第8部分中引用的MPLA。
如本文所使用的，术语“受试者”和“患者”可互换使用并且指动物。在一个具体的实施方案中，这些术语是指哺乳动物如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类(如猴和人)，最优选人。
如本文中所用，术语“显著(significant)”，如在“显著”数目、改变或影响中，例如意味着产生的数目、变化或效果将不可能由随机机会发生，如通过任何用于统计分析的标准方法，如p检验确定，其中ap值小于临界α水平表示事件不太可能。因此，本文描述的上下文中的“显著”变化表示P值小于临界α水平，并且偶然发生变化的概率较小。
如本文中所用，在对受试者施用治疗的上下文中的术语“有效量”是指达到期望的预防或治疗效果的治疗量。有效量的实例见下文第5.8.2和5.8.3节。
除非另有定义，本文使用的所有术语将被给予其在本公开时本领域普通技术人员通常理解的普通技术或科学意义。
5.2用于生成树突细胞的方法
本领域技术人员已知的技术可用于从外周血单核细胞获得/产生树突细胞。在一个具体的实施方案中，从患者获得全血样品，并分离外周血单核细胞。单核细胞可以通过例如Ficoll-Paque Plus梯度离心从患者的外周血中分离。此外，可以使用淘洗(elutriation)或使用系统对单核细胞进行分级。树突细胞可以通过成分输血(apheresis)外周血单核细胞的连续密度离心来富集。从患者血液中分离的单核细胞可以在因子，诸如GM-CSF和IL-4、IL-13、IL-15和IFNα或Flt3L的组合的存在下培养，以在例如4到5天的一段时间后分化成未成熟的DC。为了产生成熟的树突细胞，可以用TNF-α、IFN-γ、LPS、MPLA、CpG、IL-1或CD40L活化细胞。在一个具体的实施方案中，使用TLR-3和/或TLR-4活化剂如poly(I:C)和/或LPS和/或MPLA活化成熟树突细胞。此外，也可以使用CMRF-44抗原、CD1c、BDCA-4和其它树突细胞特异性标记物来促进DC成熟。在具体实施方案中，如下文第6、7和/或8部分中所述产生树突细胞。
本领域技术人员已知的技术可用于评估/确认树突细胞的存在。例如，可以通过使用诸如FACS的技术检测树突细胞表面标志物的表达来评估/确认树突细胞的存在。在一个具体的实施方案中，使用下文第6、7和/或8部分中的方法评估/确认树突细胞的存在。
5.3用于生成tolDC的方法
可以使用本领域技术人员已知的技术来诱导/产生tolDC。使用上述5.2部分中描述的方法可以从外周血单核细胞产生树突细胞。树突细胞可以用大量的介质，包括例如IL-10和其它细胞因子，皮质类固醇如地塞米松，维生素D3或维生素D2，雷帕霉素，神经肽和维生素D3或维生素D2和地塞米松。在诱导成tolDC某些实施方案中，地塞米松和维生素D2用于生成tolDC。
在一个具体的实施方案中，生成稳定的致耐受性树突细胞的方法包括：(a)从受试者的血液中分离单核细胞；(b)在包含一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)的培养基中培养单核细胞；(c)在培养的第一时间段后，在包含地塞米松的培养基中培养来自步骤(b)的细胞；(d)在培养的第二时间段后，在包含地塞米松和维生素D2的培养基中将来自步骤(c)的细胞培养第三时间段以产生致耐受性树突细胞，以建立致耐受性树突细胞；并且(d)在第三时间段后，在包含MPLA或MPLA和与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原的cGMP培养基中培养致耐受性树突细胞。在某些实施方案中，贯穿生成稳定的半成熟的tolDC的方法。培养基包含一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子。诱导单核细胞分化为树突细胞的因子的实例包括GM-CSF和IL-4、IL-13、IL-15或IFN-α或Flt3L的组合。在一个具体的实施方案中，贯穿生成稳定的半成熟的tolDC的方法，培养基包括GM-CSF和IL-4。在某些实施方案中，生成稳定的半成熟致耐受性树突细胞的方法的起点是步骤(b)。在某些实施方案中，将GM-CSF添加到培养基中以达到250IU/ml,300IU/ml,350IU/ml,400IU/ml,450IU/ml,500IU/ml,550IU/ml,600IU/ml,650IU/ml,700IU/ml或750IU/ml的终浓度。在一些实施方案中，将GM-CSF添加到培养基中以达到250IU/ml至500IU/ml,300IU/ml至400IU/ml,300IU/ml至600IU/ml,500IU/ml至750IU/ml,或250IU/ml至750IU/ml的终浓度。在一个具体的实施方案中，将GM-CSF添加到培养基中以达到500IU/ml的终浓度。在某些实施方案中，将IL-4添加到培养基中以达到10ng/ml,15ng/ml,20ng/ml,25ng/ml,30ng/ml,35ng/ml,40ng/ml,45ng/ml或50ng/ml的终浓度。在一些实施方案中，将IL-4添加到培养基中以达到10ng/ml至20ng/ml,20ng/ml至40ng/ml,25ng/ml至50ng/ml或10ng/ml至50ng/ml的终浓度。在一个具体的实施方案中，将IL-4添加到培养基中以达到20ng/ml的终浓度。
可以通过本领域技术人员已知的或本文所述(参见例如上文第5.2节)的任何技术从受试者的血液中分离单核细胞。在一些实施方案中，根据本文所述方法使用的单核细胞来自具有小于或等于60mmol/mol Hb的HbA1c水平的1型糖尿病患者。在其它实施方案中，根据本文所述方法使用的单核细胞来自高于60mmol/mol Hb的HbA1c水平的1型糖尿病患者。在某些实施方案中，生成稳定的半成熟tolDC的方法花费细胞培养约8天。在一些实施方案中，用抗原培养tolDC的步骤涉及用与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病相关的一种、两种、三种或更多种抗原的培养。例如参见下文表1，关于自身免疫性疾病和与那些自身免疫性疾病相关的抗原的列表。
在具体的实施方案中，在培养第3天将来自上述步骤(b)的细胞在包含地塞米松的培养基中培养。在某些实施方案中，在首先在包含一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子如GM-CSF和IL-4的培养基中培养单核细胞后约60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71或72小时，将来自步骤(b)的细胞在含有塞塞松中培养。在具体的实施方案中，在细胞培养的第3天将地塞米松添加到培养基中。在具体的实施方案中，培养基包括地塞米松和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子如GM-CSF和IL-4。在某些实施方案中，将地塞米松添加到培养基中达到最终浓度，以终浓度0.5-3微摩尔每升将地塞米松添加到培养基中。在一些实施方案中，将地塞米松添加到培养基中，以达到终浓度0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5或4微摩尔/升。在另一个实施方案中，将地塞米松以1微摩尔/升的终浓度添加到培养基中。在某些实施方案中，将GM-CSF添加到培养基中以达到250IU/ml,300IU/ml,350IU/ml,400IU/ml,450IU/ml,500IU/ml,550IU/ml,600IU/ml,650IU/ml,700IU/ml或750IU/ml的终浓度。在一些实施方案中，将GM-CSF添加到培养基中以达到250IU/ml至500IU/ml,300IU/ml至400IU/ml,300IU/ml至600IU/ml,500IU/ml至750IU/ml,或250IU/ml至750IU/ml的终浓度。在一个具体的实施方案中，将GM-CSF添加到培养基中以达到500IU/ml的终浓度。在某些实施方案中，将IL-4添加到培养基中以达到10ng/ml,15ng/ml,20ng/ml,25ng/ml,30ng/ml,35ng/ml,40ng/ml,45ng/ml或50ng/ml的终浓度。在一些实施方案中，将IL-4添加到培养基中以达到10ng/ml至20ng/ml,20ng/ml至40ng/ml,25ng/ml至50ng/ml或10ng/ml至50ng/ml的终浓度。在一个具体的实施方案中，将IL-4添加到培养基中以达到20ng/ml的终浓度。
在具体的实施方案中，培养第6天将来自上述步骤(c)的细胞在包含地塞米松和维生素D2的培养基中培养。在一些实施方案中，在首先在包含一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子如GM-CSF和IL-4的培养基中培养单核细胞后约135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149或150小时，将来自步骤(c)的细胞在包含地塞米松和维生素D2的培养基中培养。在某些实施方案中，在首先在包含一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子如GM-CSF和IL-4的培养基中培养单核细胞后约135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149或150小时将地塞米松和维生素D2同时添加到培养基中。在一些实施方案中，在培养的第6天将地塞米松和维生素D2同时添加到细胞培养物中的来自步骤(c)的细胞中。在某些实施方案中，在培养第6天期间分别将维生素D2和地塞米松添加到细胞培养物中的细胞(例如彼此在5分钟，10分钟，15分钟，30分钟，45分钟，1小时，1.5小时，2小时内或更长)。在具体的实施方案中，培养基包括地塞米松、维生素D2和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子如GM-CSF和IL-4。在某些实施方案中，将地塞米松添加到培养基中，达到最终浓度，以终浓度0.5-3微摩尔每升将地塞米松添加到培养基中。在一些实施方案中，将地塞米松添加到培养基中，以达到终浓度0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5或4微摩尔/升。在一个具体的实施方案中，以终浓度1微摩尔/升将地塞米松添加到培养基中。在某些实施方案中，将维生素D2添加到培养基中以达到0.1至10nM的最终浓度。在一些实施方案中，将维生素D2添加到培养基中以达到0.1,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9或10nM的终浓度。在一个具体的实施方案中，将维生素D2添加到培养基中以达到3.6nM的终浓度。在某些实施方案中，将GM-CSF添加到培养基中以达到250IU/ml,300IU/ml,350IU/ml,400IU/ml,450IU/ml,500IU/ml,550IU/ml,600IU/ml,650IU/ml,700IU/ml或750IU/ml的终浓度。在一些实施方案中，将GM-CSF添加到培养基中以达到250IU/ml至500IU/ml,300IU/ml至400IU/ml,300IU/ml至600IU/ml,500IU/ml至750IU/ml或250IU/ml至750IU/ml的终浓度。在一个具体的实施方案中，将GM-CSF添加到培养基中以达到500IU/ml的终浓度。在某些实施方案中，将IL-4添加到培养基中以10ng/ml,15ng/ml,20ng/ml,25ng/ml,30ng/ml,35ng/ml,40ng/ml,45ng/ml或50ng/ml的终浓度。在一些实施方案中，将IL-4添加到培养基中以达到10ng/ml至20ng/ml,20ng/ml至40ng/ml,25ng/ml至50ng/ml或10ng/ml至50ng/ml的终浓度。在一个具体的实施方案中，将IL-4添加到培养基中以达到20ng/ml的终浓度。
在具体的实施方案中，在培养第7天在包含MPLA或MPLA和与自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原的培养基中培养致耐受性树突细胞。在一些实施方案中，在首先在包含一种或多种诱导单核分化为树突细胞的因子如GM-CSF和IL-4的培养基中培养单核细胞后156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169或170小时在包含MPLA或MPLA和与自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原的培养基中培养致耐受性树突细胞。在具体的实施方案中，培养基包括MPLA和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)，或MPLA、一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)、以及与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原。在某些实施方案中，在收获细胞前将致耐受性树突细胞在包含MPLA或MPLA和与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原的培养基中培养18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30小时。在一些实施方案中，在收获细胞前将致耐受性树突细胞在包含MPLA和一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)，或MPLA、一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)、以及与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原的培养基中培养18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30小时。
在某些实施方案中，在首先在包含诸如GM-CSF和IL-4的因子的培养基中培养单核细胞之后约135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149或150小时将MPLA、MPLA和与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原添加到培养基中。在一些实施方案中，在培养的第7天将MPLA或MPLA以及与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原添加到培养基中。在一些实施方案中，在培养的第7天将MPLA和与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病毒相关的抗原同时添加到细胞培养物中的致耐受性树突细胞。在某些实施方案中，在培养的第7天期间将MPLA和与自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原分别添加细胞培养物中的致耐受性树突细胞(例如彼此在5分钟，10分钟，15分钟，30分钟，45分钟，1小时，1.5小时，2小时内或更长)。当分开添加时，在MPLA之前添加抗原。在某些实施方案中，在收获细胞前将致耐受性树突细胞在包含MPLA或MPLA和与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原的培养基中培养18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30小时。在具体的实施方案中，培养基还包含一种或多种诱导单核细胞分化为树突细胞的因子(例如GM-CSF和IL-4)。
在某些实施方案中，将MPLA添加到培养基中以达到0.1至10nM的最终浓度。在一些实施方案中，将MPLA添加到培养基中以达到1至3微克/毫升的终浓度。在一个具体的实施方案中，将MPLA添加到培养基中，以达到每毫升2微克的终浓度。在某些实施方案中，将GM-CSF添加到培养基中以达到250IU/ml,300IU/ml,350IU/ml,400IU/ml,450IU/ml,500IU/ml,550IU/ml,600IU/ml,650IU/ml,700IU/ml或750IU/ml的终浓度。在一些实施方案中，将GM-CSF添加到培养基中以达到250IU/ml至500IU/ml,300IU/ml至400IU/ml,300IU/ml至600IU/ml,500IU/ml至750IU/ml,或250IU/ml至750IU/ml的终浓度。在一个具体的实施方案中，将GM-CSF添加到培养基中以达到500IU/ml的终浓度。在某些实施方案中，将IL-4添加到培养基中以达到10ng/ml,15ng/ml,20ng/ml,25ng/ml,30ng/ml,35ng/ml,40ng/ml,45ng/ml或50ng/ml的终浓度。在一些实施方案中，将IL-4添加到培养基中以达到10ng/ml至20ng/ml,20ng/ml至40ng/ml,25ng/ml至50ng/ml或10ng/ml至50ng/ml的终浓度。在一个具体的实施方案中，将IL-4添加到培养基中以达到20ng/ml的终浓度。
在一些实施方案中，将与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原添加到培养基中以达到1nM至500nM的终浓度。在某些实施方案中，将与自身免疫性疾病相关的抗原添加到培养基中以达到10nM至200nM的终浓度。在一个具体的实施方案中，抗原是纯化的GAD65多肽。在某些实施方案中，将纯化的GAD65多肽添加到培养基中以达到20,30,40,50,60,70,80,90,100或110nM的终浓度。在另一个实施方案中，将纯化的GAD65多肽添加到培养基中以达到80nM的终浓度。在另一具体实施方案中，抗原是纯化的胰岛素多肽。在某些实施方案中，将纯化的胰岛素多肽添加到培养基中以达到50,100,150,200,250,300,350或400nM的终浓度。在一个具体的实施方案中，将纯化的胰岛素多肽添加到培养基中以达到170nM的终浓度。在一些实施方案中，抗原是纯化的GAD65多肽和纯化的胰岛素多肽。在某些实施方案中，将纯化的GAD65多肽添加到培养基中以达到20,30,40,50,60,70,80,90,100或110nM的终浓度，并且将纯化的胰岛素多肽添加到培养基以达到50,100,150,200,250,300,350或400nM的终浓度。在某些实施方案中，将获自或衍生自移植物(例如组织或细胞样品)供体的细胞溶胞物或MHC肽用作与移植物排斥和/或移植物抗宿主病相关的抗原。本领域技术人员已知的技术可用于从供体产生细胞溶胞物或MHC-肽(参见例如Lu etal,1995,Transplantation 62:659-665,Hayamizu et al.,1998,Transplantation 66:1285-1291)。在一个具体的实施方案中，供体是受试者(优选人受试者)。
在具体的实施方案中，根据本文描述的方法使用的培养基是适于培养单核细胞、树突细胞和/或致耐受性树突细胞的培养基。在具体实施方案中，根据本文所述方法使用的培养基是cGMP培养基。在一个具体的实施方案中，根据本文所述方法使用的培养基是下文第6、7和/或8部分中描述的培养基。
在一个具体的实施方案中，稳定的半成熟tolDC是按照图6中的方法生成的。在优选的实施方案中，使用维生素D2和地塞米松，从外周血单核细胞生成稳定的半成熟tolDC，如下文第6、7和/或8部分所述。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的树突细胞的产率与通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞的产率相似。在一些实施方案中，本文所述的用于生成tolDC的方法导致在收获细胞时培养的树突细胞的产率与通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的非粘附树突细胞的产率相似。在具体的实施方案中，本段中的术语“相似”是指树突细胞的产率上存在有小于50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％差异。
在一些实施方案中，本文描述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获tolDC时培养的CD11c+树突细胞的百分比相当于或优于通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的CD11c+树突细胞的百分比。在具体的实施方案中，收获tolDC时培养的CD11c+树突细胞的百分比是至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％。在某些实施方案中，在收集tolDC时培养的CD11c+树突细胞的百分比在20％至30％，25％至50％或20％至40％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的培养时间后评估CD11c+树突细胞培养物的百分比。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体中的PD-L1表达低于通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的PD-L1表达。在一些实施方案中，tolDC群体上的PL-L1表达量比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的PD-L1表达低约70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,10％或5％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的PD-L1表达。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的CD14表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD14表达高至少3倍。在一些实施方案中，CD14表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD14表达高3.5倍，4倍，4.5倍，4倍，4.5倍，5倍，5.5倍，6倍，6.5倍，7倍，7.5倍，8倍，8.5倍，9倍数，9.5倍，10倍，10.5倍，11倍，11.5倍，12倍，12.5倍或13倍。在某些实施方案中，CD14表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD14表达高3-4倍，3-5倍，3-6倍，3-10倍，3-15倍，4-6倍，5-10倍，10-15倍，5-12倍，10-13倍或5-15倍。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD14表达。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的CD86表达低于通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD86表达。在一些实施方案中，tolDC群体上的CD86表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD86表达低约70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD86表达。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的PD-L1/CD86表达比率比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的PD-L1/CD86表达比率高。在一些实施方案中，比率比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的相同比率高1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，3.5倍，4倍，4.5倍，4倍，4.5倍，5倍，5.5倍，6倍，6.5倍，7倍，7.5倍，8倍，8.5倍，9倍，9.5倍，10倍，10.5倍，11倍，11.5倍，12倍，12.5倍或13倍。在一个具体的实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的PD-L1/CD86表达比率比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的PD-L1/CD86表达比率高到如图32中描绘的相同或相似的量。根据本实施方案，术语“相似”是指在图32中数值的5％，10％，15％，20％，25％或30％内。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的CXCR3表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CXCR3表达高。在一些实施方案中，tolDC群体上的CXCR3表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CXCR3表达高约200％,175％,150％,125％,100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CXCR3表达。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的CD83表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD83表达高。在一些实施方案中，tolDC群体上的CD83表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD83表达高约10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,98％或100％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD83表达。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的ITL-3表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的ITL-3表达高。在一些实施方案中，tolDC群体上的ITL-3表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的ITL-3表达高约200％,175％,150％,125％,100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的ITL-3表达。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的CD40表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD40表达低。在一些实施方案中，tolDC群体上的CD40表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD40表达低约10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,98％或100％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD40表达。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的TLR-2表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的TLR-2表达高。在一些实施方案中，tolDC群体上的TLR-2表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的TLR-2表达高约200％,175％,150％,125％,100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的TLR-2表达。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体的IL-10分泌比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体的IL-10分泌高。在一些实施方案中，tolDC群体的IL-10分泌比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体的IL-10分泌高约200％,175％,150％,125％,100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体的IL-10分泌。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体的TGF-β分泌比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体的TGF-β分泌高。在一些实施方案中，tolDC群体的IL-10分泌比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体的TGF-β分泌高约200％,175％,150％,125％,100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％,或10％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体的TGF-β分泌。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的TIM-3表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的TIM-3表达高。在一些实施方案中，tolDC群体上的TIM-3表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的TIM-3表达高约200％,175％,150％,125％,100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的TIM-3表达。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体的IL-12p70分泌比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体的IL-12p70分泌低。在一些实施方案中，tolDC群体的IL-10分泌比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体的IL-12p70分泌低约10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,98％或100％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体的IL-12p70分泌。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致致耐受性树突细胞群体，其相对于与通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体共培养的T细胞的IL-17生成，当将致耐受性树突细胞与如本文中所述的T细胞(参见例如下文第6、7和/或8部分)共培养时诱导低水平的IL-17生成。在一些实施方案中，由tolDC诱导的IL-17生成比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体诱导的IL-17生成低约10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,98％或100％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体诱导的IL-17生成和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体诱导的IL-17生成。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致：(i)在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的CD86、CD83、和CD40表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD86、CD83、和CD40表达低；和(ii)在收获细胞时培养的致耐受性树突细胞群体上的ILT-3、TIM-3、TLR-2和PD-L1表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的ILT-3、TIM-3、TLR-2和PD-L1表达高。在一些实施方案中，tolDC群体上的ILT-3,TIM-3,TLR-2和PD-L1表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的ILT-3,TIM-3,TLR-2和PD-L1表达高约200％,175％,150％,125％,100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。在一些实施方案中，tolDC群体上的CD86,CD83和CD40表达比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD86,CD83和CD40表达低约10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,98％或100％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体上的CD86,CD83,CD40,ILT-3,TIM-3,TLR-2和PD-L1表达。
在某些实施方案中，相对于通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物处理的树突细胞群体的糖酵解，通过本文描述的方法和随后用炎症刺激物(例如，细胞因子混合物)处理后产生的稳定的半成熟tolDC具有增强的糖酵解。在一些实施方案中，用炎性刺激物处理后由tolDC群体的糖酵解比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物处理的树突细胞群体的糖酵解高约200％,175％,150％,125％,100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。根据这些实施方案，在具体的实施方案中，在相同长度的细胞培养时间后评估用炎性刺激物处理后由tolDC群体的糖酵解和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物处理的树突细胞群体的糖酵解。在一个具体的实施方案中，相对于通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物处理的树突细胞群体的糖酵解，用炎症刺激物(例如，细胞因子混合物)处理后tolDC群体的糖酵解增强，如下文第7部分所述。在另一个具体实施方案中，相对于通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物处理的树突细胞群体的糖酵解，用炎症刺激物(例如，细胞因子混合物)处理后tolDC群体的糖酵解增强多达下文第7部分所述。根据这些实施方案，在相同长度的细胞培养时间后评估用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的tolDC群体的糖酵解水平和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物处理的树突细胞群体的糖酵解水平。在一个具体的实施方案中，乳酸的积累作为糖酵解的测量评估。用于测量乳酸积累的技术在本领域中是已知的(参见例如以下的第7部分)。因此，在一些实施方案中，用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的tolDC群体的乳酸的积累比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物处理的树突细胞群体的乳酸的积累高10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,98％或100％。
在具体的实施方案中，相对于通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理的树突细胞群体中触发的信号途径，用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的本文中所述的tolDC群体中触发不同的胞内信号传导途径。在另一个具体的实施方案中，相对于通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理的树突细胞群体中的MAPK,JNK,SAPK,ERK1/2和IDO活化，MAPK,JNK,SAPK,ERK1/2和IDO在用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的本文中所述的tolDC群体中差异活化。在一个具体的实施方案中，本文所述的tolDC表现出下文第6和/或7部分中描述的一个、两个、三个或更多个或全部信号传导特性。
在另一个具体实施方案中，用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的本文中所述的稳定半成熟tolDC中的JNK和/或ERK1/2活化(即磷酸化)的水平高于通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理的树突细胞群体中的JNK和/或ERK1/2活化(即磷酸化)的水平。在一些实施方案中，用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的tolDC群体中的JNK和/或ERK1/2活化水平比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物处理的树突细胞群体中的JNK和/或ERK1/2活化的水平高约200％,175％,150％,125％,100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。在具体实施方案中，可以通过测量JNK和/或ERK1/2的磷酸化来评估JNK和/或ERK1/2活化。用于测量磷酸化的技术是本领域已知的(参见例如以下的第6和/或7部分)。根据这些实施方案，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体中的JNK和/或ERK1/2活化水平。
在另一个具体实施方案中，用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的本文中所述的稳定半成熟tolDC中的p38MAPK活化(即磷酸化)的水平低于通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理的树突细胞群体中的p38MAPK活化(即磷酸化)的水平。在一些实施方案中，用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的tolDC群体中的p38MAPK活化水平比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物处理的树突细胞群体中的p38MAPK活化的水平低约200％,175％,150％,125％,100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。在具体实施方案中，可以通过测量p38MAPK的磷酸化来评估p38MAPK活化。用于测量磷酸化的技术是本领域已知的(参见例如以下的第6和/或7部分)。根据这些实施方案，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体中的p38MAPK活化水平。
在另一个具体实施方案中，用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的本文中所述的稳定半成熟tolDC中的NF-κB活化的水平低于通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理的树突细胞群体中的NF-κB活化的水平。在一些实施方案中，用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的tolDC群体中的NF-κB活化水平比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物处理的树突细胞群体中的NF-κB活化的水平低约10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,98％或100％。在具体实施方案中，可以通过测量NF-κB的磷酸化来评估NF-κB活化。用于测量磷酸化的技术是本领域已知的(参见例如以下的第6和/或7部分)。根据这些实施方案，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体中的NF-κB活化水平。
在另一个具体实施方案中，用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的本文中所述的稳定半成熟tolDC中的IDO水平高于通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理的树突细胞群体中的IDO水平。在一些实施方案中，用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的tolDC群体中的IDO水平比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物处理的树突细胞群体中的IDO水平高约200％,175％,150％,125％,100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。在具体实施方案中，可以使用本领域中已知的技术评估IDO水平(参见例如以下的第6和/或7部分)。根据这些实施方案，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体中的IDO水平。
在另一个具体实施方案中，用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的本文中所述的稳定半成熟tolDC中的mTOR和/或STAT3活化水平高于通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理的树突细胞群体中的mTOR和/或STAT3活化水平。在一些实施方案中，用炎性刺激物(例如细胞因子混合物)处理后的tolDC群体中的mTOR和/或STAT3活化水平比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂的培养基中培养单核细胞获得并且用炎性刺激物处理的树突细胞群体中的mTOR和/或STAT3活化水平高约200％,175％,150％,125％,100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％。在具体实施方案中，可以通过测量mTOR和/或STAT3的磷酸化来评估mTOR和/或STAT3活化。用于测量磷酸化的技术是本领域已知的(参见例如以下的第7部分)。根据这些实施方案，在相同长度的细胞培养时间后评估tolDC群体和通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞群体中的mTOR和/或STAT3活化水平。
在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致tolDC比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞诱导更高数目的CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞。在某些实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致tolDC比通过在包含GM-CSF和IL-4且没有耐受化剂，如地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞诱导高约250％,225％,200％,175％,150％,125％,100％,95％,90％,85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％,20％,15％或10％的数目的CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞。在一个具体的实施方案中，如下文第6、7和/或8部分中所述诱导Treg。
在一个具体的实施方案中，本文中描述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致具有下文第6、7和/或8部分中描述的Dex/维生D2tolDC的一种、两种、三种或更多种功能特性的tolDC。在另一个具体实施方案中，本文所述的用于生成稳定的半成熟tolDC的方法导致具有下文第6、7和/或8部分中中描述的Dex/Vitamin D2tolDC的所有功能特性的tolDC。
5.4用于扩充和检测Treg的方法
本领域技术人员已知的技术可用于扩充和检测Treg。为了定义tolDC诱导调节性T细胞扩充的能力，tolDC可以与异基因幼稚CD4+T细胞一起培养。在某些实施方案中，从具有小于或等于60mmol/mol Hb的HbA1c水平的1型糖尿病患者获得T细胞。在其它实施方案中，从具有大于至60mmol/mol Hb的HbA1c水平的1型糖尿病的受试者获得T细胞。在一些实施方案中，用于生成本文所述的tolDC的T细胞和单核细胞来自相同的受试者。在其它实施方案中，用于生成本文所述的tolDC的T细胞和单核细胞来自不同的受试者。通过使用针对CD4、CD25和FoxP3+的抗体的流式细胞术可以测定与tolDC共培养诱导的Treg的百分比。为了在与tolDC一起温育后扩充Treg，Treg可以使用针对CD4、CD25和CD127的抗体通过FACS分选仪进行分选。随后可以在IL-2和自体血清的存在下培养分选的Treg，并且可以用针对CD3、CD28的抗体或与tolDC的第二次温育刺激增殖。可以在生物反应器中进一步扩充Treg。在GMP条件下获得的Treg可以转移回要治疗的患者。
5.5组合物
在一方面，本文中提供了包含稳定的半成熟致耐受性树突细胞的组合物。在某些实施方案中，组合物还包含生理上可接受的载体，如盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些实施方案中，组合物可以进一步包含另一种疗法。组合物可以是疫苗。
在另一方面，本文中提供了包含Treg的组合物。在某些实施方案中，组合物还包含生理上可接受的载体，如盐水或PBS。在一些实施方案中，组合物可以进一步包含另一种疗法。组合物可以是疫苗。
在一些实施方案中，将稳定的半成熟tolDC等分取样，并且在3,4,5,6,7,8,9,10或更多个的冷冻瓶中冷冻保存。在一些实施方案中，每个冷冻瓶将包含3x 106,4x 106,5x106,6x 106,7x 106,8x 106,9x 106,10x 106或更多个的细胞。在一些实施方案中，在含有5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15或更多％DMSO的最终溶液中冷冻保存稳定的半成熟tolDC。在某些实施方案中，在CryoStor CS10中冷冻保存稳定的半成熟tolDC。在一些实施方案中，可以使用本领域已知的任何冷冻保存方法和冷冻保存介质来保存稳定的半成熟tolDC。在一个具体的实施方案中，冷冻保存的tolDC在融化后保持表型稳定性，如通过本领域已知的技术评估。在另一个具体实施方案中，冷冻保存的tolDC维持表型稳定性，如通过下文第6、7和/或8部分中描述的技术评估。
在一个具体的实施方案中，本文中提供了含有冷冻保存的本文所述的稳定的半成熟tolDC的冷冻瓶。在某些实施方案中，冷冻瓶含有3x 106,4x 106,5x 106,6x 106,7x 106,8x 106,9x 106,10x 106或更多个细胞。在一个具体的实施方案中，冷冻保存的tolDC在融化后保持表型稳定性，如通过本领域已知的技术评估。在另一个具体实施方案中，冷冻保存的tolDC维持表型稳定性，如通过下文第6、7和/或8部分中描述的技术评估。
5.6用于治疗自身免疫性疾病、移植物排斥和移植物抗宿主病的方法
在另一方面，本文提供了治疗受试者中的自身免疫性疾病的方法，其包括对受试者施用在包含MPLA或MPLA和与自身免疫性疾病有关的抗原的培养基中培养的本文所述的稳定的半成熟tolDC或包含此类稳定的半成熟致耐受性树突细胞的组合物。在一个具体的实施方案中，本文中提供了治疗受试者中1型糖尿病的方法，包括对受试者施用在包含MPLA或MPLA和与1型糖尿病相关的抗原(如GAD65多肽或胰岛素多肽)的培养基中培养的本文所述的稳定的半成熟tolDC或包含此类稳定的半成熟致耐受性树突细胞的组合物。在具体的实施方案中，致耐受性树突细胞衍生自对所治疗的受试者自体的单核细胞。在具体的实施方案中，受试者是人受试者。
另一方面，本文提供了治疗受试者中的自身免疫性疾病的方法，包括：(a)在培养基中与T细胞一起培养稳定的半成熟致耐受性树突细胞以诱导Treg，所述稳定的半成熟致耐受性树突细胞在包含MPLA或MPLA和与自身免疫性疾病相关的抗原的培养基中培养；(b)分离Treg；和(c)将Treg施用于受试者。本领域技术人员已知或本文所描述的技术(例如，上文第5.4部分，下文第6、7和/或8部分)可用于分离Treg。例如，如上文第5.4部分所述的流式细胞术可用于分离Treg。在某些实施方案中，在分离后并且在对受试者施用前在培养物中扩充Treg。本领域技术人员已知或本文所述的技术(例如，上文第5.4部分)可用于扩充培养物中的Treg。在具体的实施方案中，致耐受性树突细胞衍生自对所治疗的受试者是自体的单核细胞。在具体的实施方案中，Treg衍生自治疗的受试者自体的T细胞。在具体的实施方案中，受试者是人受试者。
在一个具体的实施方案中，本文提供了治疗受试者中的1型糖尿病的方法，包括：(a)在培养基中与T细胞一起培养稳定的半成熟致耐受性树突细胞以诱导Treg，所述稳定的半成熟致耐受性树突细胞在包含MPLA或MPLA和与1型糖尿病相关的抗原如GAD65多肽或胰岛素多肽的培养基中培养；(b)分离Treg；和(c)将Treg或包含此类Treg的组合物施用于受试者。本领域技术人员已知或本文所描述的技术(例如，上文第5.4部分，和下文第6、7和/或8部分)可用于分离Treg。例如，如上文第5.4部分中所述的流式细胞术可用于分离Treg。在某些实施方案中，在分离后并在对受试者施用前在培养物中扩充Treg。本领域技术人员已知或本文所述的技术(例如，上文第5.4部分)可用于扩充培养物中的Treg。在某些实施方案中，致耐受性树突细胞衍生自单核细胞，其来自具有HbA1c水平小于或等于60mmol/mol Hb的患者。在其它实施方案中，致耐受性树突细胞衍生自来自HbA1c水平大于60mmol/mol Hb的患者的单核细胞。在具体的实施方案中，致耐受性树突细胞衍生自对所治疗的受试者是自体的单核细胞。在某些实施方案中，T细胞衍生自HbA1c水平小于或等于60mmol/mol Hb的患者。在其它实施方案中，T细胞衍生自来自HbA1c水平大于60mmol/mol Hb的患者的单核细胞。在具体的实施方案中，Treg衍生自治疗的受试者自体的T细胞。在具体的实施方案中，受试者是人受试者。
在某些实施方案中，稳定的半成熟tolDC或其组合物与另一种疗法组合施用以治疗自身免疫性疾病。在一些实施方案中，Treg或其组合与另一种疗法组合施用以治疗自身免疫性疾病。
在某些实施方案中，待治疗的自身免疫性疾病是1型糖尿病或幼年型糖尿病(Juvenile diabetes)。在另一个实施方案中，待治疗的自身免疫性疾病是急性传播性脑脊髓炎(Acute Disseminated Encephalomyelitis)(ADEM)、急性坏死性出血性白质脑炎(Acute necrotizing hemorrhagic leukoencephalitis)、斑秃(Alopecia areata)、强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis)、抗GBM病(Anti-GBM disease)、抗TBM肾炎(Anti-TBMnephritis)、抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome，APS)、自身免疫性血管性水肿(Autoimmune angioedema)、自身免疫性再生障碍性贫血(Autoimmune aplastic anemia)、自身免疫性家族性自主神经异常(Autoimmune dysautonomia)，自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis)、自身免疫性高脂血症(Autoimmune hyperlipidemia)、自身免疫性免疫缺陷(Autoimmune immunodeficiency)、自身免疫性内耳疾病(Autoimmune innerear disease，AIED)、自身免疫性心肌炎(Autoimmune myocarditis)，自身免疫性卵巢炎(Autoimmune oophoritis)、自身免疫性胰腺炎(Autoimmune pancreatitis)、自身免疫性视网膜病变(Autoimmune retinopathy)，自身免疫性血小板减少性紫癜(Autoimmunethrombocytopenic purpura,ATP)/特发性血小板减少性紫癜(Idiopathicthrombocytopenic purpura,ITP)、自身免疫性甲状腺疾病(Autoimmune thyroiddisease)，自身免疫性荨麻疹(Autoimmune urticarial)、贝切特氏病(Behcet’sdisease)，大疱性类天疱疮(Bullous pemphigoid)、乳糜泻(Celiac disease)、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮(Cicatricial pemphigoid)/良性粘膜性类天疱疮(benign mucosal pemphigoid)、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、柯根斯综合征(Coganssyndrome)、冷凝集素病(Cold agglutinin disease)、柯萨奇心肌炎(Coxsackiemyocarditis)、疱疹样皮炎(Dermatitis herpetiformis)、皮肌炎(Dermatomyositis)、德维克病(Devic’s disease)(视神经脊髓炎(neuromyelitis optica))、盘状狼疮(Discoidlupus)、德雷斯勒综合征(Dressler’s syndrome)，伊文恩综合征(Evans syndrome)、肾小球肾炎(Glomerulonephritis)、肺出血肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、肉芽肿病伴多血管炎(Granulomatosis with Polyangiitis)(GPA)(以前称为韦格纳肉芽肿病(Wegener’s Granulomatosis))、格雷夫斯病(Graves’disease)、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本脑炎(Hashimoto’s encephalitis)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、包涵体肌炎(Inclusion body myositis)、幼年型关节炎(Juvenile arthritis)、川崎综合征(Kawasaki syndrome)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)，扁平苔藓(Lichen planus)、狼疮(SLE)、显微镜下多血管炎(Microscopic polyangiitis)、混合性结缔组织病(Mixed connective tissue disease，MCTD)、多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)、重症肌无力(Myasthenia gravis)、肌炎(Myositis)、视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica)(德维克氏(Devic's))、中性粒细胞减少症(Neutropenia)、眼瘢痕性类天疱疮(Ocular cicatricial pemphigoid)、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神病症(Pediatric Autoimmune NeuropsychiatricDisorders Associated with Streptococcus))、副肿瘤性小脑变性(Paraneoplasticcerebellar degeneration)、帕-罗二氏综合征(Parry Romberg syndrome)、天疱疮(Pemphigus)、I型、II型和III型自身免疫性多腺综合征(autoimmune polyglandularsyndromes)、多肌炎(Polymyositis)、心肌梗死后综合征(Postmyocardial infarctionsyndrome)、孕酮皮炎(Progesterone dermatitis)、原发性胆汁性肝硬化(Primarybiliary cirrhosis)、原发性硬化性胆管炎(Primary sclerosing cholangitis)、银屑病(Psoriasis)、银屑病关节炎(Psoriatic arthritis)、纯红细胞不发育(Pure red cellaplasia)、反应性关节炎(Reactive Arthritis)、反射性交感神经营养不良(Reflexsympathetic dystrophy)、莱特尔氏病(Reiter’s syndrome)、风湿热(Rheumatic fever)、类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis)、施密特综合征(Schmidt syndrome)、硬皮病(Scleroderma)、舍格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、精子和睾丸自身免疫(Sperm&testicular autoimmunity)、苏萨克综合征(Susac’s syndrome)、交感性眼炎(Sympathetic ophthalmia)、大动脉炎(Takayasu’s arteritis)、未分化结缔组织病(Undifferentiated connective tissue disease，UCTD)或韦氏肉芽肿病(Wegener’sgranulomatosis)(现称为肉芽肿病伴多血管炎(GPA))。
表1：自身免疫性疾病和其相关抗原。
在另一方面，本文提供了治疗受试者中移植物排斥或移植物抗宿主病的方法，其包括对受试者施用本文所述的稳定的半成熟tolDC或包含此类稳定的半成熟致耐受性树突细胞的组合物，所述稳定的半成熟tolDC在包含MPLA或MPLA和与移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原的培养基中培养。在具体的实施方案中，致耐受性树突细胞衍生自对所治疗的受试者是自体的单核细胞。在具体的实施方案中，受试者是人受试者。
另一方面，本文提供了治疗受试者中移植物排斥或移植物抗宿主病的方法，包括：(a)在培养基中与T细胞一起培养稳定的半成熟致耐受性树突细胞以诱导Treg，所述稳定的半成熟致耐受性树突细胞在含有MPLA或MPLA以及与移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原的培养基中培养；(b)分离Treg；并且(c)将Treg施用于受试者。本领域技术人员已知或本文所描述的技术(例如，上文第5.4部分，下文第6、7和/或8部分)可用于分离Treg。例如，如上文第5.4部分所述的流式细胞术可用于分离Treg。在某些实施方案中，在分离后并在对受试者施用前在培养物中扩充Treg。本领域技术人员已知或本文所述的技术(例如，上文第5.4部分)可用于扩展培养物中的Treg。在具体的实施方案中，致耐受性树突细胞衍生自对所治疗的受试者是自体的单核细胞。在具体的实施方案中，Treg衍生自治疗受试者自体的T细胞。在具体的实施方案中，受试者是人受试者。
在某些实施方案中，稳定的半成熟tolDC或其组合物与另一种疗法组合施用以治疗移植物排斥或移植物抗宿主病。在一些实施方案中，Treg或其组合与另一种疗法组合施用以治疗移植物排斥或移植物抗宿主病。
5.7患者群体
在一些实施方案中，将本文中所述的稳定的半成熟tolDC、包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物或组合疗法施用于患有或诊断为自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病的受试者。在其它实施方案中，本文所述的稳定的半成熟tolDC、包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物或组合疗法被施用于倾向于或易于发展自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病的受试者。
在一些实施方案中，将本文中所述的稳定的半成熟tolDC、包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物或组合疗法施用于哺乳动物。在某些实施方案中，将本文中所述的稳定的半成熟tolDC、包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物或组合疗法施用于哺乳动物，所述哺乳动物是0至6个月龄、6至12个月龄、1至5岁龄、5至10岁龄、10至15岁龄、15至20岁龄、20至25岁龄、25至30岁龄、30至35岁龄、35至40岁龄、40至45岁龄、45至50岁龄、50至55岁龄、55至60岁龄、60至65岁龄、65至70岁龄、70至75岁龄、75至80岁龄、80至85岁龄、85至90岁龄、90至95岁龄或95至100岁龄。
在某些实施方案中，将本文中所述的稳定的半成熟tolDC、包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物或组合疗法施用于有形成自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病的风险的人。在一些实施方案中，将本文中所述的稳定的半成熟tolDC、包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物或组合疗法施用于具有自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病的人。在某些实施方案中，将本文中所述的稳定的半成熟tolDC、包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物或组合疗法施用于诊断为自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病的人。在某些实施方案中，患者是0至6个月龄、6至12个月龄、1至5岁龄、5至10岁龄、5至12岁龄、10至15岁龄、15至20岁龄、20至25岁龄、25至30岁龄、30至35岁龄、35至40岁龄、40至45岁龄、45至50岁龄、50至55岁龄、55至60岁龄、60至65岁龄、65至70岁龄、70至75岁龄、75至80岁龄、80至85岁龄、85至90岁龄、90至95岁龄或95至100岁龄的人。在具体的实施方案中，患者具有或有风险形成1型糖尿病。在某些实施方案中，患者是具有小于或等于60mmol/mol Hb的HbA1c水平的人。在其它实施方案中，患者是具有大于60mmol/mol Hb的HbA1c水平的人。在一些实施方案中，对待治疗的人类患者进行HbA1c水平评估。用于测量HbA1c水平的技术是本领域技术人员已知的(参见例如下文的第8部分)。
在一些实施方案中，施用本文所述的稳定的半成熟tolDC、包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物或组合疗法的受试者在施用本文中所述的稳定的半成熟tolDC、包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物或组合疗法前尚未接受疗法。在其它实施方案中，将本文所述的稳定的半成熟tolDC、包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物或组合疗法可以施用于在施用本文中所述的稳定的半成熟tolDC、包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物或组合疗法之前已经接受疗法的受试者。在一些实施方案中，施用本文所述的稳定的半成熟tolDC、包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物或组合疗法的受试者是先前疗法难治的或者经历先前疗法的不利副作用或者由于对受试者的不可接受的毒性水平而中断先前疗法。
在一些实施方案中，将根据本文所述的方法产生的Treg、包含此类Treg的组合物或组合疗法施用于患有或诊断为自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病的受试者。将在其它实施方案中，根据本文所述的方法产生的Treg，包含此类Treg的组合物或组合疗法施用于倾向于或易于发展自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病的受试者。
在一些实施方案中，将根据本文所述的方法产生的Treg、包含此类Treg的组合物或组合疗法施用于哺乳动物。在某些实施方案中，将根据本文所述的方法产生的Treg、包含此类Treg的组合物或组合疗法施用于哺乳动物，所述哺乳动物是0至6个月龄、6至12个月龄、1至5岁龄、5至10岁龄、10至15岁龄、15至20岁龄、20至25岁龄、25至30岁龄、30至35岁龄、35至40岁龄、40至45岁龄、45至50岁龄、50至55岁龄、55至60岁龄、60至65岁龄、65至70岁龄、70至75岁龄、75至80岁龄、80至85岁龄、85至90岁龄、90至95岁龄或95至100岁龄。
在某些实施方案中，将根据本文所述的方法产生的Treg、包含此类Treg的组合物或组合疗法施用于有形成自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病的风险的人。在一些实施方案中，将根据本文所述的方法产生的Treg、包含此类Treg的组合物或组合疗法施用于具有自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病的人。在某些实施方案中，将根据本文所述的方法产生的Treg、包含此类Treg的组合物或组合疗法施用于诊断为自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病的人。在某些实施方案中，患者是0至6个月龄、6至12个月龄、1至5岁龄、5至10岁龄、5至12岁龄、10至15岁龄、15至20岁龄、20至25岁龄、25至30岁龄、30至35岁龄、35至40岁龄、40至45岁龄、45至50岁龄、50至55岁龄、55至60岁龄、60至65岁龄、65至70岁龄、70至75岁龄、75至80岁龄、80至85岁龄、85至90岁龄、90至95岁龄或95至100岁龄的人。在具体的实施方案中，患者具有或有风险形成1型糖尿病。在某些实施方案中，患者是具有小于或等于60mmol/mol Hb的HbA1c水平的人。在其它实施方案中，患者是具有大于60mmol/mol Hb的HbA1c水平的人。在一些实施方案中，对待治疗的人类患者进行HbA1c水平评估。用于测量HbA1c水平的技术是本领域技术人员已知的(参见例如下文的第8部分)。
在一些实施方案中，施用根据本文所述的方法产生的Treg、包含此类Treg的组合物或组合疗法的受试者在施用本文所述的方法产生的Treg、包含此类Treg的组合物或组合疗法的受试者前尚未接受疗法。在其它实施方案中，将本文所述的方法产生的Treg、包含此类Treg的组合物或组合疗法可以施用于在施用本文所述的方法产生的Treg、包含此类Treg的组合物或组合疗法之前已经接受疗法的受试者。在一些实施方案中，施用本文所述的方法产生的Treg、包含此类Treg的组合物或组合疗法的受试者是先前疗法难治的或者经历先前疗法的不利副作用或者由于对受试者的不可接受的毒性水平而中断先前疗法。
5.8施用和剂量
5.8.1施用模式
本文描述的稳定的半成熟tolDC或包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物可以通过本领域已知的任何途径施用。本文所述的稳定的半成熟tolDC或包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物可以通过例如输注或推注进行施用，并且可以与另一种生物活性剂一起施用。施用可以是系统的或局部的。各种递送系统是已知的，并且可以用于递送本文所述的稳定的半成熟tolDC或包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物。
施用方法包括但不限于肠胃外、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下或脑内。在一个具体的实施方案中，本文所述的稳定的半成熟tolDC或包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物经静脉内、皮内或皮下施用于患者。在另一个具体实施方案中，本文所述的稳定的半成熟tolDC或包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物通过直接结节内递送施用于患者。施用模式由从业人员判断。
在具体的实施方案中，可以期望施用本文所述的稳定的半成熟tolDC或包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物。在具体的实施方案中，本文所述的稳定的半成熟tolDC或包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物在自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病的部位通过局部输注施用。例如，在类风湿性关节炎的情况下，本文所述的稳定的半成熟tolDC或包含此类稳定的半成熟tolDC的组合物可以直接进行关节内施用。
根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物可以通过本领域已知的任何途径施用。根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物可以通过例如输注或推注注射施用，并且可以与另一种生物活性剂一起施用。施用可以是系统的或局部的。各种递送系统是已知的，并且可以用于递送根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物。
施用方法包括但不限于肠胃外，皮内，肌内，腹膜内，静脉内，皮下或脑内。在一个具体的实施方案中，根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物经静脉内，皮内或皮下施用于患者。在另一个具体实施方案中，根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物通过直接结节内递送施用于患者。施用方式由从业人员判断。
在具体的实施方案中，可以期望局部施用根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物。在具体的实施方案中，通过局部输注在自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病的部位施用根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物。例如，在类风湿性关节炎的情况下，根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物可直接进行关节内施用。
5.8.2稳定的半成熟致耐受性树突细胞的剂量
在治疗自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病中有效的本文所述的稳定的半成熟tolDC的量或包含稳定的半成熟tolDC的组合物的量可以可以由标准临床技术确定。可以任选地使用体外或体内测定来帮助鉴定最佳剂量范围。所使用的精确剂量还将取决于例如施用途径、症状的类型和症状的严重程度，并且应根据从业人员的判断和每个患者或受试者的情况来决定。
用于通过任何施用途径施用于受试者的稳定的半成熟tolDC的剂量可以为至少100,200,300,400,500,700,1,000,5,000,10,000,25,000,50,000或100,000个细胞。在具体的实施方案中，稳定的半成熟tolDC的数目至少为100,200,300,400,500个细胞。在其它实施方案中，稳定的半成熟tolDC的数目是至少为300,400,500,700,1,000个细胞。在其它具体实施方案中，稳定的半成熟tolDC的数目为至少700,1,000,5,000,10,000个细胞。在一些实施方案中，稳定的半成熟tolDC数目为至少5,000，10,000,25,000，50,000或100,000个细胞。在又一实施方案中，稳定的半成熟tolDC的数目至少为5,000,10,000,25,000,50,000,或100,000个细胞。在其它实施方案中，稳定的半成熟tolDC的数目是至少1x106,5x106,1x107,5x107,1x108,5x108或更多个细胞。在具体的实施方案中，稳定的半成熟tolDC的数目是1x102-1x104,5x104-5x106,1x105-1x107,1x105-5x108,1x106-1x108或1x106-1x107,或1x104至1x105个细胞。
在某些实施方案中，相对于阴性对照，以有效抑制或减少与自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病相关的症状达至少20％至25％，优选至少25％至30％，至少30％至35％，至少35％至40％，至少40％至45％，至少45％至50％，至少50％至55％，至少55％至60％，至少60％至65％，至少65％至70％，至少70％至75％，至少75％至80％，或直至至少85％的量对受试者施用本文所述的稳定的半成熟tolDC或其组合物，如使用本文所述的测定法或本领域技术人员已知的其它测定法测定。在治疗的某些实施方案中，相对于阴性对照，以有效抑制或减少与自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病有关的症状达至少1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，4倍，5倍，8倍，10倍，15倍，20倍或2至5倍，2至10倍，5至10倍或5至20倍的量对受试者施用本文所述的稳定的半成熟tolDC或其组合物，如使用本文所述的测定法或本领域技术人员已知的其它测定法测定。
在某些实施方案中，相对于阴性对照，以有效减少自身免疫性应答或移植物排斥达至少20％至25％，优选至少25％至30％，至少30％至35％，至少35％至40％，至少40％至45％，至少45％至50％，至少50％至55％，至少55％至60％，至少60％至65％，至少65％至70％，至少70％至75％，至少75％至80％，或直至至少85％的量对受试者施用本文所述的稳定的半成熟tolDC或其组合物，如使用本文所述的测定法或本领域技术人员已知的其它测定法测定。在某些实施方案中，相对于阴性对照，以有效减少自身免疫性应答或移植物排斥达至少1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，4倍，5倍，8倍，10倍，15倍，20倍或2至5倍，2至10倍，5至10倍或5至20倍的量对受试者施用本文所述的稳定的半成熟tolDC或其组合物，如使用本文所述的测定法或本领域技术人员已知的其它测定法测定。
在某些实施方案中，相对于阴性对照，以有效增加或增强Treg(在一些实施方案中，在特定靶身体区室中)达至少20％至25％，优选至少25％至30％，至少30％至35％，至少35％至40％，至少40％至45％，至少45％至50％，至少50％至55％，至少55％至60％，至少60％至65％，至少65％至70％，至少70％至75％，至少75％至80％，或直至至少85％的量对受试者施用本文所述的稳定的半成熟tolDC或其组合物，如使用本文所述的测定法或本领域技术人员已知的其它测定法测定。在某些实施方案中，相对于阴性对照，以有效增加或增强Treg(在一些实施方案中，在特定靶身体区室中)达至少1.5倍，至少2倍，至少2.5倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少8倍，至少10倍，至少15倍，或至少20倍；或约2至5倍，2至10倍，5至10倍或5至20倍的量对受试者施用本文所述的稳定的半成熟tolDC或其组合物，如使用本文所述的测定法或本领域技术人员已知的其它测定法测定。在具体的实施方式中，增加或增强Treg数目的特定靶身体区室是受自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病影响的身体区室。
在某些实施方案中，每天，每隔一天，每隔二天，每三天，每周一次，每周两次，每周三次，或每两周一次，或每月一次，或更少对受试者施用本文所述的稳定的半成熟tolDC或其组合物的剂量。在其它实施方案中，两剂，三剂或四剂的本文所述的稳定的半成熟tolDC或其组合物每天，每两天，每三天，每周一次或每两周一次施用。在一些实施方案中，将本文所述的稳定的半成熟tolDC或其组合物的剂量施用2天，3天，5天，7天，14天，21天，28天或31天。在某些实施方案中，本文所述的稳定的半成熟tolDC或其组合物的剂量施用0.5个月，1个月，1.5个月，2个月，2.5个月，3个月，4个月，5个月，6个月或者更多。
在一个具体实施方案中，对患者施用多剂的本文所述的稳定的半成熟tolDC或其组合物，其中每剂的本文所述的稳定的半成熟tolDC或其组合物包含用与自身免疫性疾病(例如，1型糖尿病)，移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原脉冲的tolDC。在一些实施方案中，对患者施用的稳定的半成熟的tolDC脉冲相同的抗原。在其它实施方案中，稳定的半成熟tolDC用不同抗原脉冲。在另一个实施方案中，对患者施用多剂的本文所述的稳定的半成熟tolDC或其组合物，其中每剂的本文所述稳定的半成熟tolDC或其组合物包含用GAD65和/或胰岛素肽脉冲的tolDC。在一个具体的实施方案中，将本文所述的一批稳定的半成熟tolDC(其已经用与自身免疫性疾病(例如GAD65和/或胰岛素肽)，移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原脉冲)冷冻并储存在分开的容器中(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多的容器，如小瓶)，并且将1个容器，如小瓶或任选地多于1个容器融化以将本文所述的稳定的半成熟tolDC递送给患者。
已经或目前用于治疗自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病的预防或治疗剂的剂量可以使用临床医生可用的参考文献，例如Physicians’ Desk Reference(68thed.2014)来确定。
上述施用时间表仅用于说明目的，不应被认为是限制性的。
5.8.3Treg剂量
有效治疗自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病的根据本文所述的方法产生的Treg的量或包含Treg的组合物的量可以通过标准临床技术确定。可以任选地使用体外或体内测定来帮助鉴定最佳剂量范围。所使用的精确剂量还将取决于例如给药途径，症状的类型和症状的严重程度，并且应根据从业人员的判断和每个患者或受试者的情况来决定。
用于通过任何施用途径施用于受试者的Treg的剂量可以为至少100,200,300,400,500,700,1,000,5,000,10,000,25,000,50,000或100,000个细胞。在具体的实施方案中，Treg的数目至少为100,200,300,400,500个细胞。在其它实施方案中，Treg的数目是至少为300,400,500,700,1,000个细胞。在其它具体实施方案中，Treg的数目为至少700,1,000,5,000,10,000个细胞。在一些实施方案中，Treg数目为至少5,000，10,000,25,000，50,000或100,000个细胞。在又一实施方案中，Treg的数目至少为5,000,10,000,25,000,50,000,或100,000个细胞。在其它实施方案中，单元格的数目是至少1x106,5x106,1x107,5x107,1x108,5x108或更多个细胞。在具体的实施方案中，单元格的数目是1x102-1x104,5x104-5x106,1x105-1x107,1x105-5x108,1x106-1x108或1x106-1x107,或1x104至1x105个细胞。
在某些实施方案中，相对于阴性对照，以有效抑制或减少与自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病相关的症状达至少20％至25％，优选至少25％至30％，至少30％至35％，至少35％至40％，至少40％至45％，至少45％至50％，至少50％至55％，至少55％至60％，至少60％至65％，至少65％至70％，至少70％至75％，至少75％至80％，或直至至少85％的量对受试者施用根据本文所述的方法产生的Treg或其组合物，如使用本文所述的测定法或本领域技术人员已知的其它测定法测定。在治疗的某些实施方案中，相对于阴性对照，以有效抑制或减少与自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病有关的症状达至少1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，4倍，5倍，8倍，10倍，15倍，20倍或2至5倍，2至10倍，5至10倍或5至20倍的量对受试者施用根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物，如使用本文所述的测定法或本领域技术人员已知的其它测定法测定。
在某些实施方案中，相对于阴性对照，以有效减少自身免疫性应答或移植物排斥或移植物抗宿主病达至少20％至25％，优选至少25％至30％，至少30％至35％，至少35％至40％，至少40％至45％，至少45％至50％，至少50％至55％，至少55％至60％，至少60％至65％，至少65％至70％，至少70％至75％，至少75％至80％，或直至至少85％的量对受试者施用根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物，如使用本文所述的测定法或本领域技术人员已知的其它测定法测定。在某些实施方案中，相对于阴性对照，以有效减少自身免疫性应答或移植物排斥或移植物抗宿主病达至少1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，4倍，5倍，8倍，10倍，15倍，20倍或2至5倍，2至10倍，5至10倍或5至20倍的量对受试者施用根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物，如使用本文所述的测定法或本领域技术人员已知的其它测定法测定。
在某些实施方案中，每天，每隔一天，每隔二天，每三天，每周一次，每周两次，每周三次，或每两周一次，或每月一次，或更少对受试者施用根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物的剂量。在其它实施方案中，两剂，三剂或四剂的根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物每天，每两天，每三天，每周一次或每两周一次施用。在一些实施方案中，将根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物的剂量施用2天，3天，5天，7天，14天，21天，28天或31天。在某些实施方案中，根据本文所述的方法产生的Treg或包含Treg的组合物的剂量施用0.5个月，1个月，1.5个月，2个月，2.5个月，3个月，4个月，5个月，6个月或者更多。
在一个具体的实施方案中，将一批Treg冷冻并储存在分开的容器中(例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多的容器，如小瓶)，并且将1个容器，如小瓶或任选地多于1个容器融化以将本文所述的Treg递送给患者。
已经或目前用于治疗自身免疫性疾病，移植物排斥或移植物抗宿主病的预防或治疗剂的剂量可以使用临床医生可用的参考文献，例如Physicians’ Desk Reference(68thed.2014)来确定。
上述施用时间表仅用于说明目的，不应被认为是限制性的。
5.8.3生物检测
可以使用本领域技术人员已知的技术评估tolDC的免疫耐受性诱导能力。可以使用本领域已知的各种测定法来评估本文所述的tolDC是否诱导免疫耐受性。在一方面，本文所述的tolDC通过抗炎细胞因子(例如IL-10)的增加的分泌和促炎细胞因子(例如IL-12p70,IL-6,TNFα)的减弱分泌创建抗炎环境来诱导免疫耐受性。在一个具体的实施方案中，使用ELISA测定法或Luminex xMAP测定法评估tolDC分泌IL-10，IL-12p70，IL-6和TNFα的能力，如下文第6、7和/或8部分中所述。
ELISA测定法也可用于评估tolDC的稳定性。在一个具体的实施方案中，可以通过测量在用TLR配体、细胞因子混合物或模拟活化的T细胞的分子再刺激已建立的tolDC后分泌的细胞因子(例如，II-10和IL-12p70)来评估tolDC的稳定性。在具体实施方案中，TLR配体是LPS或poly(I:C)。在另一具体实施方案中，细胞因子混合物含有IL-1β，TNFα，IL-6和IFNγ。在另一个具体实施方案中，模拟活化的T细胞的分子是CD40L。
T细胞增殖可用于测试tolDC的异基因刺激特性的降低的潜力。本领域众所周知的方法，例如流式细胞术，CFSE染色，3H-胸苷掺入可用于评估T细胞增殖。更具体地，可以通过稀释CFSE和相关染料的细胞分裂的流式细胞分析来评估T细胞的增殖，如本领域中所述的。在一个具体的实施方案中，通过如下文第6和/或7部分中所述的CFSE稀释法评估与tolDC温育后CD4+和CD8+T细胞的增殖。
可以通过测量与tolDC一起温育的T细胞的细胞因子(例如IFNγ或IL-10)产生来测试tolDC的致耐受性性质的异基因刺激中降低的潜力。在一个实施方案中，通过IFNγ细胞内免疫细胞化学测定T细胞的IFNγ产生，如下文第6、7和/或8部分中所述。FoxP3的免疫细胞化学也可用于评估异基因T细胞与tolDC一起温育时从幼稚CD4+T细胞从头诱导Treg分化。
在具体的实施方案中，本文所述的tolDC在受试者中诱导或增强Treg增殖，其相对于阴性对照达至少0.2至5倍，5至20倍，10至30倍，20至50倍，50至200倍，100至500，200至1000倍或500至2,000倍，如本领域中公知的方法测定。
可以使用ELISPOT测定来测量由本文所述的脉冲tolDC共培养的淋巴细胞的细胞因子释放。可以通过对特定细胞因子，例如IL-2，IL-4，IL-10，IL-17，IFN-γ或趋化因子特异性的抗体检测细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，可以使用下文第6、7和/或8部分中描述的技术来评估与自体tolDC温育的自体T细胞的细胞因子分泌。在具体的实施方案中，相对于用非tolDC的对照实验中自体T细胞的细胞因子分泌，本文所述的tolDC减少或增加受试者中自体T细胞的细胞因子的表达和分泌高至少0.2至5倍，5至20倍，10至30倍，20至50倍，50至200倍，100至500倍，200至1000倍，或500至2000倍。
在一个具体的实施方案中，可以使用下文第6、7和/或8部分中描述的一种、两种、三种或更多种测定法来评估本文所述的稳定的半成熟tolDC的功能特性和特征，包括稳定的半成熟tolDC的稳定性。此外，本领域技术人员已知的技术可以评估本文所述的稳定的半成熟tolDC的功能特性和特征，包括稳定的半成熟tolDC的稳定性。
6.实施例1
本实施例证明了即使在不存在耐受化因子的情况下用多种生物相关的炎症刺激物刺激后，使用地塞米松和维生素D2产生的致耐受性DC在表型和功能上是稳定的。
6.1材料和方法：
试剂和抗体：流式细胞术：商业抗体抗CD86-FITC,CD274(PD-L1)-FITC,CD273(PD-L2)-PE,HLA-DR-PE-Cy7,IFNγ-FITC购自BD Biosciences；CD83-PerCP-Cy5.5购自BeckmanCoulter；CD80-FITC,CD40-PerCP-eFluor710,CD1a-PE-Cy7,CD4-PE-Cy7,FoxP3-AF488购自eBiosciences；TLR2-FITC,CD25-PerCP-Cy5.5,IL-10-PE购自BioLegend；TIM-3-PE,CD14-PE-DL594,CD11c-APC,CD3-AF700,CD8-PE-Dy590购自Exbio；CD85k(IL-T3)-PE,CD85d(IL-T4)-FITC购自R&D Systems。
对于蛋白质印迹，抗p-ERK1/2,抗p-JNK/SAPK,抗p-IкB-α,抗IDO,抗p-mTOR,抗p-STAT3,抗p-p70S6K,抗p38mAPK,抗ERK1/2,抗JNK/SAPK和抗STAT3Ab购自Cell SignalingTechnology；抗肌动蛋白来自BioLegend。
DC分化和刺激：如先前所述(Palova-Jelinkova et al.2005,J Immunol 175:7038-7045)，从健康供体的血沉棕黄层(buffy coat)获得未成熟的DC。简言之，通过Ficoll梯度分离人PBMC，并且通过在75cm2培养瓶(Nunc)中允许2小时的细胞粘附分离单核细胞。通过在含有青霉素和链霉素溶液(分别为100U/ml和100μg/ml，Gibco)的cGMP级Cell GroDC培养基(CellGenix)中在GM-CSF(500IU/ml,Gentaur)和IL-4(20ng/ml,CellGenix)存在下将单核细胞培养6天产生DC。在第3天补充培养基和细胞因子。在第6天，收获DC并以1x106个细胞/ml接种在96孔板(Nunc)中。
使用与上述相同的培养基(即，含有青霉素和链霉素溶液(分别为100U/ml和100μg/ml，Gibco)的cGMP级Cell Gro DC培养基(CellGenix))在存在根据实验如此补充的GM-CSF(500IU/ml,Gentaur)和IL-4(20ng/ml,CellGenix))的情况下培养致耐受性DC(tolDCs)：
1.在第3天的地塞米松(Dex)(1μM，Medochemie)和在第6天的Dex和帕立骨化醇(paricalcitol)(VitD2)(1,5ng/ml，Zemplar，Abbott Laboratories)(使用该方案生成的tolDC在本文中称为“tolDC 1”)
2.第0、3和6天的帕立骨化醇(VitD2)(1.5ng/ml，Zemplar，Abbott Laboratories)和第3和6天的Dex(使用该方案产生的tolDC在本文中称为“tolDC2”)
3.在第0、3和6天的帕立骨化醇(VitD2)(1.5ng/ml，Zemplar，AbbotLaboratories)(使用该方案生成的tolDC在本文中称为为“tolDC 3”)
4.在第3天的地塞米松(Dex)(1μM，Medochemie)和在第6天的Dex和维生素D3(1,5ng/ml，Calcijex)(使用本方案生成的tolDC在本文中称为“tolDC 4”)
为了诱导成熟，在第6天或第7天用疫苗级单磷酰脂质A(MPLA)(2μg/ml，Cayla-InvivoGen)处理DC。在第7天或第8天，收获DC，清洗，并且实施功能测定法。在没有耐受化因子的情况下培养对照DC(cDC)。对于再刺激测定，彻底清洗tolDC和cDC，并且在缺乏耐受化因子的情况下在完全RPMI 1640培养基(Gibco)中在具有或不具有脂多糖(LPS,1μg/ml,Sigma-Aldrich)、poly I:C(25μg/ml,Cayla-InvivoGen)、CD40L(1000ng/ml,Enzo)或含有IL-1β(10ng/ml),TNFα(10ng/ml),IL-6(10ng/ml)和IFNγ(100ng/ml)(都来自R&Dsystems)的促炎性细胞因子的混合物的情况下再培养。收集上清液和细胞进行进一步分析。在规定刺激条件下，在实验开始前1小时添加信号传导抑制剂。SB203580(10μM的p38MAPK抑制剂)、SP600125(20μM的JNK/SAPK抑制剂)、PD98059(20μM的ERK1/2抑制剂)、Bay11-7082(10μM的NF-κB抑制剂)、Stattic(5μM的STAT3抑制剂)和雷帕霉素(100nM的mTOR抑制剂)获自Calbiochem，并且在DMSO中溶解。
来自1型糖尿病(T1D)患者的DC的分化和刺激：
使用关于从健康供体的血沉棕黄层制备未成熟DC相同的方案，从单核细胞分化来自T1D患者的未成熟DC。在第6天，收获DC并以1x106个细胞/ml接种在96孔板(Nunc)中。为了诱导抗原特异性成熟，用重组人胰岛素(1μg/ml,Sigma Aldrich)或重组人谷氨酸脱羧酶(GAD65,5μg/ml,Diamyd Medical)加载DC，并且在3小时后，通过疫苗级单磷酰脂质A(MPLA)(2μg/ml，Cayla-InvivoGen)活化DC。在第8天，收获DC，清洗并进行功能测定法。为了诱导致耐受性DC(tolDC)，在第3天用地塞米松(Dex)(1μM，Medochemie)和第6天用Dex和帕立骨化醇(1,5ng/ml，Zemplar，Abbott Laboratories)处理DC。在没有耐受化因子的情况下培养对照DC(cDC)。
如对来自健康供体的血沉棕黄层的DC所述准备来自T1D患者的tolDC和DC的再刺激测定法。
流式细胞术分析：用缀合有荧光染料的单抗在4℃在PBS中染色细胞30分钟，清洗，并在LSRFortessa细胞分析仪(BD Biosciences)上分析。包括合适的同种型对照。使用FlowJo软件(Tree Star)对数据进行分析。根据FSC，SSC和CD11c+参数门控DCC进行分析。基于DAPI染色从分析排除死细胞。对于细胞内细胞因子染色，在细胞分析前在存在布雷菲德菌素A(Brefeldin A)(5μg/ml，BioLegend)的情况下用佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)(50ng/ml，Sigma-Aldrich)加离子霉素(1μg/ml，Sigma-Aldrich)刺激T细胞4-16小时。刺激后，清洗细胞，在固定/透化缓冲液(eBiosciences)中于4℃温育30分钟，然后在透化缓冲液(eBiosciences)中清洗，并在4℃用适当的单抗染色30分钟。
DC细胞因子检测：在DC刺激24小时后收获细胞上清液，并在-80℃冷冻直至分析。使用Luminex测定(MILLIPLEXTM人细胞因子/趋化因子试剂盒，Merck Millipore)和ELISA测定(DuoSet ELISA试剂盒，R&D systems)依照制造商的用法说明，在活化DC的细胞培养物上清液中测定IL-10，IL-12p70，IL-6和TNFα浓度。
DC和T细胞培养物：从PBMC非粘附级分获得T细胞。用EasySepTM人幼稚CD4+T细胞增殖试剂盒(StemCell Technologies)通过阴性选择纯化幼稚CD4+T细胞。在含有5％人AB血清(Invitrogen)，1％L-谷氨酰胺(Gibco)，青霉素和链霉素(分别为100U/ml和100μg/ml，Gibco)，1％非必需氨基酸(Gibco)，1mM丙酮酸钠(Gibco)和50μMβ-巯基乙醇(Gibco)的完全RPMI培养基中，将tolDC或cDC与异基因T细胞一起培养。细胞以1:10的比率(DC/T细胞)在96孔圆底板中培养。在第3、6和9天添加IL-2(20U/ml，PeproTech)。
异基因刺激测定：对于初级MLR测定，用5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester)(CFSE，Invitrogen)标记的异基因T细胞(2x105)与tolDC或cDC(2x104)在96孔圆底板中温育。通过T细胞的CFSE荧光的序贯稀释测定T细胞增殖，如在第6天通过流式细胞术检测的。
T细胞因子产生：为了检测T细胞产生的IFNγ和IL-10，用2x105个异基因T细胞培养2x104个tolDC或cDC。分别在第6天和第9天通过流式细胞术的细胞内染色测定细胞因子的产生。
调节性T细胞的扩充和检测：为了限定tolDC诱导调节性T细胞扩充的能力，将2x104个tolDC或cDC与2x105个异基因幼稚CD4+T细胞一起培养。通过流式细胞仪在第9天测量定义为CD4+CD25+FoxP3+的调节性T细胞的百分比。
Western印迹法：从Cell Gro中培养或在单独或与细胞因子混合物、LPS、poly(I:C)或CD40L一起在完全RPMI中再培养1小时的细胞制备细胞溶胞物(2x106DC)，如先前所述(Palova-Jelinkova et al.2005,J Immunol 175:7038-7045)。当指示时，刺激前1小时添加雷帕霉素(100nM)。将等量的溶胞物进行10％SDS-PAGE，并转移到硝酸纤维素膜上，然后用指定的特异性单抗进行免疫印迹。通过使用West Femto Maximum SensitivitySubstrate(Pierce)通过缀合有HRP的二抗(Cell Signaling Technology)揭示膜。剥离后，用适当的单抗作为加载对照再探查膜。
核提取物的制备和比色NF-kB测定法
使用核提取试剂盒(Active Motif)从Cell Gro中培养或在单独或与细胞因子混合物、LPS、poly(I:C)或CD40L一起的完全RPMI中再培养90分钟的DC制备核提取物。测量p50，p65，c-Rel和Rel-b的NF-kB DNA结合活性，如先前所述(Palova-Jelinkova etal.2005,J Immunol 175:7038-7045)。
细胞因子ELISPOT分析：按照制造商的说明进行ELISPOT分析。首先用35％乙醇处理PVDF底部的96孔微量滴定板，然后在4℃下用抗人IFNγ单克隆抗体(Millipore，Bedford，MA)包被过夜。通过用无菌PBS溶液清洗三次来除去未结合的抗体。在用具有10％FCS的RPMI封闭后，将3x104个加载有胰岛素(1μg/ml)或GAD65(5μg/ml)的从T1D患者建立的tolDC或cDC与每孔3x105个自体T细胞一起接种，并在37℃温育48小时。使用生物素化的抗IFNγ检测抗体和缀合的链霉亲合素-碱性磷酸酶用BCIP/NBT缓冲液显现代表产生IFNγ的细胞的点，并使用Series-1 Immunospot Analyzer进行定量。尽管点的尺寸和密度差异较大，但在阳性孔中均看到同质染色的点，而在具有细胞的孔和无细胞的对照孔两者中偶尔看到的小密度点区分为伪像(artifacts)。
统计分析：结果以至少3个样品的均值±均值标准差(SEM)给出。使用GraphPadPrism 6进行双尾配对t检验进行数据分析。p≤0.05的值被认为是统计学显著的。
6.2结果
比较通过使用Dex和VitD2建立致耐受性DC的各种方案：在第一组实验中，评估了用于建立致耐受性DC的不同方案以确定方案类型是否影响单核细胞分化为未成熟的DC的过程。发现当与没有致耐受性因子的情况下生成的对照DC相比时，通过方案tolDC 1生成8天的TolDC具有在最终培养物中相当的非粘附细胞产率和最终培养物中相当的CD11c+非粘附DC的百分比(图1A，表2和表3)。通过方案tolDC2和tolDC3产生的tolDC揭示了当与tolDCs1相比时最终培养物中显著更低的细胞产率和显著更低的CD11c+DC百分比(图1B，表2和表3)。
表2：与cDC的产率相比tolDC的标准化产率(以cDC的％计)
表3：与CD11c+Cells cDC培养物的产率(以cDC的％CD11c+细胞计)相比tolDC中CD11c+细胞的标准化产率
实验 tolDC 1 tolDC 2 tolDC 3
1 1.282051282 -88.92307692 -76.92307692
2 29.33333333 -93.5 -56.66666667
3 25.74626866 -93.09701493 -47.76119403
4 16.71232877 -91.80821918 -67.12328767
5 52.90697674 -92.09302326 -70.93023256
6 71.1026616 -95.51330798 -23.95437262
7 15 -67.9
8 44.44444444 -57.22222222 -65.55555556
9 12.82051282 -35.8974359 -74.35897436
通过各种方案产生的tolDC的表型：接下来，分析了成熟标志物CD86、致耐受性标志物PD-L1、趋化因子受体CXCR3和CD14分子的表达(图2和3，表4、5、6和7)。当与对照DC相比时，CD86和PD-L1的表达在通过方案tolDC 1产生的tolDC上显著降低(图2A和3A，表4和6)。当与通过方案tolDC 1生成的tolDC相比时，通过方案tolDC 2和方案tolDC 3产生的tolDC表达显著更高的CD86和PD-L1的水平(图2A和3A，表4和6)。相比之下，当与对照DC相比时，通过方案tolDC 1产生的tolDC上CD14和CXCR3的表达显著更高(图2B和3B，表5和7)。当与通过方案tolDC 1产生的tolDC相比时，通过方案tolDC 2和方案toCsD 3产生的tolDC表达显著更低的CD14和CXCR3水平(图2B和3B，表5和7)。
表4：tolDC和cDC之间PD-L1表达的倍数增加
表5：tolDC和cDC之间的CD14表达的倍数增加
实验 tolDC 1 tolDC 2 tolDC 3
1 12.68 2.59
2 7.4 0.84
3 11.23 1
4 8 1.3
5 4.91 1.57
6 2.05
7 3 3 0.9
8 6.2 2.6 1.8
9 6.6 4 1.6
10 5.8 3
11 5.5 2.8 1.32
12 4.5 2.2 0.7
13 2.6 2.2 0.5
14 7.1 2.7
表6：tolDC和cDC之间的CD86表达的倍数增加
表7：tolDC和cDC之间的CXCR3表达的倍数增加
通过使用VitD2或VitD3制备的tolDC从幼稚T细胞诱导CD4+CD25+FoxP3+调节性T 细胞的差异：接下来，测试了通过使用VitD2的方案tolDCs 1建立的tolDC、通过使用VitD3(骨化三醇)的方案tolDCs 1建立的tolDC和对照DC促进Treg的从头分化的能力。将异基因幼稚T细胞与DC以10:1的比率共培养9天。如图4和表8所示，与对照DC相比，用VitD2产生的tolDC诱导显著更高的CD4+CD25+FoxP3+Treg水平。然而，与对照DC相比，用VitD3产生的tolDC诱导相当的CD4+CD25+FoxP3+Treg水平。
表8：与由cDC产生的Treg产率相比由tolDC产生的Treg产率的倍数增加
实验 tolDC 1 tolDC 4
1 1.6916996047 0.664031621
2 1.3029315961 0.631921824
3 1.1811320755 0.950943396
4 1.3867403315 0.947513812
5 1.1627218935 1.405325444
6 1.2857142857 0.847826087
通过tolDC 1方案制备7天或8天的tolDC从幼稚T细胞诱导CD4+CD25+FoxP3+调节 性T细胞的差异：接下来，评估通过方案tolDC 1建立7天的tolDC(在第6天添加MPLA并将细胞最终成熟24小时)和通过tolDC 1方案建立8天的tolDC(在第7天添加MPLA并将细胞最终成熟24小时)促进Treg的从头分化的能力。将异基因幼稚T细胞与DC以10:1的比率共培养9天。如图5和表9中所示，当与通过7天方案建立的tolDC相比，由8天方案产生的tolDC诱导出显著更高的CD4+CD25+FoxP3+Treg水平。
表9：由cDC产生的Treg产率相比于由tolDC产生的Treg的产率的倍数增加
实验 7天 8天
1 2.43781095 3.383928571
2 0.42368421 2.909090909
3 1.74637681 2.807486631
4 0.98913043 1.232804233
5 1.07079646 1.517412935
6 0.18802817 1.863247863
7 0.78804348 1.792243767
8 1.06434316 1.198369565
Dex/VitD2处理的tolDC(tolDC 1)即使在用LPS，CC，poly(I:C)和CD40L再刺激后 也保持稳定的半成熟致耐受性表型：为了研究tolDC的稳定性和功能特性，将新鲜分离的人单核细胞在GM-CSF，IL-4，Dex，VitD2和MPLA存在下在cGMP培养基Cell Gro中培养。在没有Dex和VitD2的情况下培养对照DC。如图7A(1-4)中所示，与对照DC相比，在Cell Gro中培养的tolDC表现出半成熟表型，CD86，CD83，CD80和CD40，而不是CD1a，CD11c和HLA-DR的表面水平显著降低。相比之下，tolDC 1具有更高的TLR-2，CD14和抑制性分子T细胞免疫球蛋白和粘蛋白蛋白质3(TIM-3)和ILT-3的表达。tolDC 1上的致耐受性标志物ILT-4，PD-L1和PD-L2的表达没有改变。接下来，分析在没有耐受剂的完全RPMI中再培养，随后用LPS，CC，poly(I:C)或CD40L刺激24、48和72小时的Cell Gro中产生的对照DC和tolDC 1的表型。用CC，LPS，poly(I:C)或CD40L的再刺激导致tolDC 1上CD86，CD83和CD40略有上调，但与其非致耐受性对应物相比较时，即使在刺激后72小时保持较低(图7B(1-4))。重要的是，即使在72小时后，在与对照DC相比时，二次刺激后，在tolDC 1上的TLR2，CD14和ILT-3表达仍然较高。CC，LPS和CD40L刺激后，TIM-3的表达降低了约两倍，但与对照DC相比，它仍然较高。致耐受性分子PD-L1表达(其在tolDC 1上较低)在用LPS以及CC再刺激tolDC 1达24小时后显著增加，并且在poly(I:C)和CD40L刺激后略微增加。总之，这些数据证明了尽管成熟刺激物的存在，Dex/VitD2tolDC保持稳定的表型，并且能够增加致耐受性标志物的表达。
致耐受性DC保持高IL-10/IL-12比率：接下来，评估tolDC 1和对照DC的细胞因子产生。与对照DC相比，tolDC 1产生高水平的IL-10，少量的TNF-α，几乎相等水平的IL-6，以及无IL-12p70(图8A)。随后用CC，LPS，poly(I:C)或CD40L再刺激tolDC 1导致IL-10产生的强烈增加，伴随着最小的IL-12p70分泌，表明增加的优先IL-10分泌是响应成熟刺激物的tolDC 1的特征。由tolDC 1生成的TNF-α和IL-6水平在用测试的所有成熟剂再刺激后保持降低，只是与对照DC相比时，IL-6生成在LPS刺激后明显上调。DC在用CC，poly(I:C)和CD40L再刺激后产生略高的IL-10水平以及在LPS再刺激后产生强烈的IL-10增加。此外，它们在二次再刺激后明显提高IL-12，IL-6和TNF-α水平，尤其是在LPS和CD40L再刺激后(图8B)。这些数据共同支持tolDC 1的稳定的非促炎性概况。
TolDC 1表现出受损的同种刺激(allostimulatory)能力并且即使在再刺激后将T 细胞细胞因子概况倾斜到更高的IL-10和更低的IFN-γ产生：接下来，评估tolDC 1降低T细胞增殖和成熟刺激物的能力可以逆转tolDC 1对T细胞增殖的抑制功能。因此，tolDC 1或对照DC以1:10的比率与异基因T细胞一起培养。在Cell Gro中建立的致耐受性DC是T细胞增殖的弱诱导剂。与对照DC相比，即使测试的任何再刺激条件再刺激后，tolDC 1的同种刺激能力仍然较低(图9A(1-2))。
接下来，通过测量IFN-γ和IL-10生成性T细胞的频率来表征由tolDC 1或对照DC诱导的异基因T细胞分化。如图9B和9C中所示，与对照DC相比，异基因T细胞与在Cell Gro中培养的tolDC 1的共培养使T细胞细胞因子概况倾斜到CD4+以及CD8+T细胞的显著降低的IFN-γ产生和显著增加的IL-10产生。此外，T细胞与用CC，LPS，poly(I:C)和CD40L再刺激的tolDC 1的共温育导致CD4+IFN-γ生成性T细胞的显著减少以及CD4+IL-10生成性细胞的稳定数目。CD8+IFN-γT细胞的百分比在CC和CD40L再刺激tolDC 1后保持稳定或略微降低，而CD8+IL-10生成性T细胞的量在用LPS再刺激tolDC 1后仍保持几乎相同，并且在用CC，poly(I:C)和CD40L再刺激tolDC 1后稍微降低。
TolDC 1诱导从幼稚CD4+T细胞分化CD4+CD25+FoxP3+T：促进从幼稚前体分化/诱导Treg的能力提高似乎是tolDC最重要的标志之一(Mahnke et al.2003,Blood 101:4862-4869)。为了测试tolDC 1促进Treg的从头分化的能力，将异基因的幼稚CD4+T细胞与DC以10:1的比率共培养9天。如图10中所示，与对照DC相比，在Cell Gro中产生的tolDC 1显著扩大了从幼稚T细胞产生的CD4+CD25+FoxP3细胞的数目。重要的是，即使在再刺激后，tolDC 1维持诱导从头CD4+CD25+FoxP3+T细胞的能力。与对照DC相比，用CC和LPS再刺激的TolDC 1维持从幼稚CD4+T细胞诱导CD4+CD25+FoxP3+T细胞的显著更高的能力。
致耐受性或对照DC在再刺激后使用不同的信号传导途径：为了破译在保持tolDC的致耐受性质中起作用的分子机制，分析信号传导途径，包括p38MAPK,JNK/SAPK,ERK1/2,NF-κB,mTOR和STAT3，其先前已经报告影响DC成熟并且协调(orchestrate)IL-10和IL-12生成(Weichhart et al.2008,Immunity 29:565-577；Qian et al.2006,Blood 108:2307-2315；Jackson et al.European Cytokine Network 21:319-328)。
首先，评估MAPK，包括p38MAPK，JNK/SAPK和ERK1/2，以确定它们在tolDC 1和对照DC中是否差异调节。如图11A中所示，来自Cell Gro的tolDC 1表达更高的活化JNK/SAPK水平；然而p38MAPK和ERK1/2在tolDC 1和对照DC中相当地活化。然后，将在RPMI中条件化的DC中的MAPK的活化与用CC，LPS，poly(I:C)和CD40L刺激的DC中的MAPK的活化进行比较。类似于预刺激，在RPMI存在下或用CC，LPS，poly(I:C)和CD40L刺激的tolDC 1表达更高水平的活化JNK/SAPK，但较低水平的活化p38MAPK。ERK1/2在tolDC 1中测试的所有刺激条件下，但仅在对照DC中的LPS刺激后显著上调。结果表明了与对照DC相比，p38MAPK，JNK/SAPK和ERK1/2在tolDC 1中差异调控，这可以在再攻击后维持tolDC 1的致耐受性性能中发挥作用。
鉴于DC分化和成熟与NF-κB的活化相关并且显示了Dex/VitD tolDC通过抑制NF-κB途径产生(Adorini et al 2009,Handbook of Experimental Pharmacology:251-273；van Kooent et al,Handbook of Experimental Pharmacology:233-249)，评估了TLR激动剂，CC或CD40L在没有耐受化因子的情况下逆转NF-κB抑制的能力。与对照DC相反，IkB-α的磷酸化在测试的所有刺激条件下在tolDC 1中显著降低(图11A)。为了定量NF-κB活化，分析了核中的NF-κB亚基p50，p65/RelA，c-Rel和RelB的结合活性(图11B)。当与对照DC相比时，来自CG的DEX/VitD2tolDC 1在核提取物中表现出显示反映DC成熟(Scheinman etal.1995,Mol Cell Biol 15:943-953)的RelB的低水平和显示牵涉IL-12生成(Grumont etal 2001,J Exp Med 194:1021-1032)的c-Rel的低水平。Rel-B和c-Rel水平仍然较低，即使在不存在VitD2和DEX的情况下在在tolDC 1中再攻击时。此外，与对照DC相比，tolDC 1表现出显著降低的p65水平和几乎相同的p50水平(图11B)。
最后，发现tolDC 1表达高水平的IDO，一种免疫耐受性促进酶。即使在随后用CC，LPS，poly(I:C)和CD40L再刺激后，IDO表达保持稳定。对照DC在再刺激后表达检测不到或非常低水平的IDO(图11A)。
接下来，评估在存在p38MAPK,JNK1/2,ERK1/2,和NF-κB抑制剂SB203580,SP600125,PD98059和Bay 11-7082的情况下分别响应LPS，CC，poly(I:C)和CD40L的MAPK和NF-κB信号传导途径对IL-10和IL-12产生水平的相对贡献以及致耐受性标记物的表达(图11C(1-6)和11D(1-3))。在tolDC 1中，CC，LPS和CD40L再刺激后，IL-10的产生显著依赖于p38MAPK，JNK/SAPK，ERK1/2和NF-κB活化途径，但是观察到仅在对照DC中LPS触发后的相同情况(图11C(1-6))。另一方面，p38MAPK和NF-κB抑制剂在RPMI，LPS和CC触发后，在对照DC中显著下调IL-12的产生，但并不影响tolDC 1中IL-12的产生。在致耐受性分子表达方面，tolDC 1在所有测试条件下或CC和LPS触发剂后分别以p38MAPK依赖的方式表达ILT-3和PD-L1分子，与对照DC形成对比。ERK1/2抑制剂在tolDC 1以及对照DC中的LPS触发剂后下调PD-L1表达。测试的其它抑制剂对两种类型的DC中的IL-12产生(图11C(1-6))和ILT-3和PD-L1表达没有显著影响(数据未显示)。
mTOR和STAT-3在再刺激后在tolDC 1中显著上调，并支持tolDC 1的致耐受性性 质：最近，发现mTOR通过减弱NF-κB以及上调STAT3活性协调人DC中的促炎性对抗炎性事件(Weichhart et al.2008,Immunity 29:565-577)。Western印迹分析揭示了，与对照DC形成对比，在用CC，LPS，poly(I:C)和CD40L再刺激后，tolDC 1显著上调mTOR和STAT3分子的磷酸化。mTOR磷酸化导致p70S6K的磷酸化和mTOR依赖性事件，其通过使用mTOR特异性抑制剂雷帕霉素证实(图12A)。为了进一步证实mTOR和STAT3的活化和IL-10，IL-12的产生以及IL-3和PD-L1分子表达之间的联系，分别实施使用化学抑制剂雷帕霉素和Stattic-3的mTOR和STAT3的阻断实验。用mTOR抑制剂雷帕霉素和STAT3抑制剂Stattic治疗tolDC 1降低IL-10产生(图12B)。雷帕霉素和Stattic在对照DC中LPS的再刺激后下调IL-10产生(图12B)。然而，与对照DC(其中雷帕霉素处理在CC和LPS处理后显著增加IL-12产生)形成对比，雷帕霉素不能恢复所有再刺激的tolDC 1中的IL-12产生(图12B)。在测试的这两种DC中，在Stattic处理后，IL-12的产生不受影响(图12B)。此外，致耐受性标志物ILT-3和PD-L1的表达在雷帕霉素和Stattic处理后的tolDC中减少，表明mTOR和STAT3活化在维持tolDC的致耐受性质中起作用(图12C(1-4))。
从T1D患者建立的致耐受性DC表现出稳定的半成熟表型：调查与对照DC相比，使用cGMP培养基CellGro，VitD2，DEX和成熟因子MPLA建立的来自1型糖尿病患者的tolDC 1的表面表型。在最终成熟之前，对DC加载GAD65(5ug/ml)或胰岛素(1μg/ml)。如图13A(1-3)和B(1-2)中所示，在Cell Gro中培养的tolDC 1表现出半成熟表型，与对照DC相比，CD86,CD80,CD40和HLA-DR表达的表面水平显著更低。相比之下，tolDC 1上调TLR-2，CD14和抑制性分子Tim-3和ILT-3的表达。致耐受性标志物PD-L1在tolDC 1上的表达没有改变。用细胞因子混合物，LPS或poly(I:C)的二次再刺激导致tolDC 1上CD86和CD40的轻微上调，然而，与它们的非致耐受性对应物相比，它仍然较低。此外，致耐受性标志物ILT-3的水平在成熟刺激物的二次再攻击后保持较高或甚至增加。
从T1D患者建立的致耐受性DC减少从自体T细胞的IFNγ分泌：在T1D患者中，与仅用MPLA处理的DC一起培养的T细胞中IFNγ的自发产生在相似的非常低的水平上存在(对于tolDC，每3x105个T细胞为2±1个点；对于cDC，每3x105个T细胞为5±1个点)(图14)。然而，在存在胰岛素或GAD65蛋白的情况下，用tolDC 1或cDC培养的T细胞之间的反应性存在主要差异(图14)。对由对照DC呈现的GAD65的IFNγ应答在大多数患者中看到(n＝7/11；平均每3x105个T细胞为20±5个点)，并且当T细胞与tolDC 1一起温育时显著降低(平均每3x105个T细胞为2±1个点)。用加载有胰岛素的cDC培养T细胞导致在3/11患者的细胞中产生IFNγ(平均每3x105个T细胞为13±1个点)，并且当T细胞用加载有胰岛素的tolDC 1培养时降低(平均每3x105个T细胞为2±1个点)。
6.3讨论
对由炎症信号的后续活化有抗性的稳定tolDC的施用是用于实现自身免疫性疾病中的病理性免疫反应的下调的先决条件。本实施例描述了在符合GMP的Cell Gro培养基中Dex，VitD2和MPLA存在下的tolDC的制备，以及在除去耐受化因子并且通过在具有5％AB血清的RPMI 1640培养基中LPS，细胞因子混合物，poly(I:C)或CD40L模拟体内DC活化后对其稳定性的全面测试。
在用LPS，CC或CD40L再刺激后本文所述的tolDC 1具有低至中等CD80，CD86，CD83和CD40表达的表型概况，其指示tolDC的抗炎表型的保存。本文提供的数据还证明了在模拟体内tolDC成熟后，抑制性和致耐受性标志物ILT-3，TIM-3的稳定的升高水平，TLR2和CD14的稳定高表达以及显著上调的PD-L1表达。据报道，用VitD3处理DC后，ILT-3的高表达参与CD4+FoxP3+Tregs的诱导(Manavalan et al.2003,Transpl Immunol 11:245-258；Penna etal.2005,Blood 106:3490-3497)。TIM-3在Th1/细胞毒性T细胞上显示为抑制性分子，但是TIM-3对抗原呈递细胞(APC)的作用是难以捉摸的。最初报告APC中的TIM-3信号传导与TLR协同促进炎症(Anderson et al.2007,Science 318:1141-1143)，然而，最近的研究表明TIM-3充当TLR驱动的IL-12产生(依赖于TIM-3表达水平)的负调节物(Zhang et al.2012,JLeukoc Biol 91:189-196)。与对照DC相比，本文所述的tolDC 1具有高水平的TIM-3。在CC，LPS或poly(I:C)刺激后，tolDC的TIM-3表达下降。然而，TIM-3是否在维持tolDC的调控性质中具有作用仍有待阐明。
TLR触发后tolDC上的TLR-2上调显示导致增强的IL-10产生和减少的促炎状态(Chamorro et al.2009,J Immunol 183:2984-2994)。与PD-L1一起，报道了TLR-2信号传导参与Treg诱导(Unger et al.2009,Eur J Immunol 39:3147-315915；Sutmuller etal.2006,J Clin Invest 116:485-494)。本文所述的数据表明特别用CC或LPS再刺激tolDC1导致PD-L1表达的显著上调，IL-10产生和诱导CD4+CD25+FoxP3+Treg的高能力的显著上调。因此，本文所述的数据预测在tolDC 1再刺激后TLR2的稳定表达和PD-L1的上调可以在耐受性诱导中起作用。
炎性信号再刺激的TolDC 1也维持稳定的细胞因子概况，具有高IL-10产生，降低的TNF-α表达和实际上没有IL-12表达。这些结果证实，高IL-10和低或无IL-12产生的模式是tolDC的稳定和内在特征(Naranjo-Gomez et al.2011,J Transl Medicine 9:893；Chamorro et al.2009,J Immunol 183:2984-2994)。
接下来，从功能观点看的再刺激的tolDC 1的稳定性就其对T细胞极化和诱导Treg的能力而言进行了全面的测试。与对照DC相比，tolDC 1在初级MLR中显示诱导T细胞增殖的能力降低。即使在用所有炎症刺激物对tolDC的二次活化后，tolDC 1的这一特征仍然得到保持。
当与对照DC诱导的T细胞应答相比时，通过由CD4+和CD8+区室的具有低IFN-γ生成和高IL-10生成的炎性信号诱导的T细胞再刺激本文中所述的tolDC 1。类似地，当用热灭活的革兰氏阴性细菌刺激Dex tolDC时，显示了异基因IFN-γ阳性T细胞的稳定的下调诱导(Cabezon et al.2012,PloS One 7:e52456)。在伴随稳定的IL-10阳性T细胞再刺激后，IFN-γ阳性T细胞的减少可以是通过由于来自再刺激的tolDC和对照DC的较高的IL-10生成而将T细胞应答转换到Th2引起的(Langenkamp et al.2000,Nature Immunology 1:311-316)。
该实例的一个重要和新颖的观察是，即使在再刺激之后，tolDC 1能够诱导从头CD4+CD25+FoxP3+T细胞。
最近，评估在模拟随后的促炎活化时在tolDC 1中触发的活化途径。该实施例第一次描述了在不存在致耐受剂的情况下对tolDC的再刺激后许多活化途径的调节。促炎性DC成熟通常与包括转录因子NF-κB和p38MAPK的许多信号途径的活化有关(Nakahara etal.2006,J Derm Science 42:1-11；Katholnig et al.2013,J Immunol 190:1519-1527)。tolDC中触发的信号传导时间是完全不同的，并且牵涉活化ERK1/2，非典型NF-κB途径，STAT3和IDO(Qian et al.2006,Blood 108:2307-2315；Harden et al.2012,ImmunolInvest 41:738-764；Manches et al.2012,PNAS 109:14122-14127；Farias et al.2013,CNS 19:269-277)。
本文描述的结果证明了通过IκB-α的消除的磷酸化呈现的tolDC 1中稳定的下调的NF-κB活化。另外，在tolDC 1中NF-κB亚基p65/RelA，RelB和c-Rel的核移位在再刺激后保持降低。这些数据与下述观察一致，即DC中作为p50/RelB异二聚体的RelB的核表达与成熟程度相关(Scheinman et al.1995,Mol Cel Biol 15:943-953)。由于c-Rel在IL-12产生中起作用(Grumont et al.2001,J Exp Med 194:1021-1032)，Dex/VitD2tolDCs 1中c-Rel的下调水平反映了它们在没有致耐受剂时即使在二次刺激后消除的产生IL-12的能力。tolDC核中p50的高水平可以反映p50同二聚体充当IL-10的转录活化物的实情(Cao et al.2006,J Biol Chem 281:26041-26050)。tolDC中p50的高水平与IL-10的高生成之间的联系可以通过用以前报道阻断p50磷酸化的NF-κB抑制剂Bay处理后强烈的IL-10产生减少来支持(Lee at al.2012,Med Inflamm 2012:416036)。
本文所述的数据支持在用炎性刺激物再刺激后在tolDC对对照DC中独特的MAPK活化途径的使用。在tolDC 1中，与对照DC相比，再刺激后p38MAPK的活化是低的。然而，用p38MAPK抑制剂的实验显示了p38MAPK在tolDC中的IL-10产生和致耐受性分子ILT-3和PD-L1的表达中起重要作用。相比之下，p38MAPK在再刺激后在对照DC中明显活化，并且主要控制IL-12的产生，但对致耐受性分子的表达无显著影响。这些数据表明p38MAPK在致耐受性对促炎性成熟中的独特作用。p38MAPK在致耐受性成熟中的作用由PD-L1表达以p38/细胞因子/STAT3依赖性方式调节的事实报道(Wolfle et al.2011,Eur J Immunol 41:413-424)。
数据还显示ERK1/2在用tolDC中测试的所有刺激物再刺激后，但仅在对照DC中LPS再刺激后显著地磷酸化。这可以与这些刺激条件下IL-10产生的显著上调相关。ERK1/2抑制剂PD98059的阻断实验证实了tolDC中炎性触发剂后IL-10生成中的ERK1/2作用，并且支持据报告与IL-10分泌联系的ERK1/2活化(Saraiva et al.2010,Nature Immunol 10:170-181)。
接下来，数据证明了tolDC 1表达IDO的高水平，其即使在再刺激后保持稳定。由于显示了tolDC中的IDO表达和接踵而至的色氨酸代谢物生成诱导对效应T细胞活性的直接抑制和Treg的同时扩充(Harden et al.2012,Immunol Invest 41:738-764；Manches etal.2012,PNAS 109:14122-14127；Farias et al.2013,CNS 19:269-277)，稳定的IDO表达可以支持tolDC 1的致耐受性质。
最后，数据证明了mTOR和STAT3分子的活化参与在再刺激后保持tolDC1的致耐受性质。用mTOR和STAT3特异性抑制剂的阻断实验导致在tolDC中减少的IL-10产生和ILT-3和PD-L1表达下调。最近，显示JAK/STAT信号传导途径参与APC中的PD-L1表达(Song etal.2014,Int Immunopharmacol 20:117-123)。本文所述的数据与下述观察一致：mTOR作用为在APC中IL-10和IL-12产生的早期调节物(11)。然而，与对照DC相反，对mTOR的抑制对再刺激后的tolDC 1中的IL-12生成没有影响。
总之，本文所述的结果证明了，即使在不存在耐受化因子的情况下用多种生物学相关的炎症刺激物刺激时，临床级tolDC 1维持稳定的表型和功能特性。此外，致耐受性和对照DC在用炎症刺激物再刺激后采用独特的活化途径。与以p38MAPK和NF-κB的强活化为特征的对照DC形成对比，致耐受性DC采用p38MAPK，ERK1/2，IDO，mTOR和STAT3来保持其致耐受性质。炎症刺激物触发的信号传导途径的不同模式也可以充当可行的测试，其会区分培养中的炎性和致耐受性DC。该实施例提供了在临床环境中，例如在自身免疫性疾病或移植(例如，移植物排斥或移植物抗宿主病)中使用Dex/VitD2tolDC(例如，tolDC 1)的理由。
7.实施例2
该实施例证明了使用地塞米松和维生素D2产生的致耐受性DC(tDC)即使在不存在耐受化因子的情况下用多种生物学相关的炎性刺激物刺激时是表型和功能性稳定的。本实施例进一步证明，tDC在炎症环境中的稳定性受到多种信号途径的调节。
7.1材料和方法：
试剂和抗体：流式细胞术：商业抗体抗CD86-FITC(克隆2231FUN-1),CD274(PD-L1)-FITC(克隆MIH1),CD273(PD-L2)-PE(克隆MIH-18),HLA-DR-PE-Cy7(克隆L243),IFN-γ-FITC(克隆4SB3)购自BD Biosciences；CD83-PerCP-Cy5.5(克隆HB15a)购自BeckmanCoulter；CD80-FITC(克隆MAB104),CD40-PerCP-eFluor710(克隆5C3),CD1a-PE-Cy7(克隆HI149)和CD4-PE-Cy7(克隆RPA-T4)购自eBioscience；TLR2-FITC(克隆T2.5),TIM-3-PE(克隆F38-2E2),IL-10-PE(克隆JES3-9D7),KI-67-PE(克隆Ki-67)购自BioLegend；CD14-PE-DL594(克隆MEM-15),CD11c-APC(克隆BU15),CD3-AF700(克隆MEM-57),CD8-PE-Dy590(克隆MEM-31)购自Exbio；CD85k(ILT-3)-PE(克隆293623),CD85d(IL-T4)-FITC(克隆287219)购自R&D Systems。对于western印迹，抗p-p38MAPK,抗p-ERK1/2,抗p-JNK/SAPK,抗p-IκB-α,抗IDO,抗p-mTOR,抗p-STAT3,抗p-p70S6K,抗p38MAPK,抗ERK1/2,抗JNK/SAPK和抗STAT3Ab购自Cell Signaling Technology；抗肌动蛋白来自BioLegend。
DC分化、刺激和抑制：从健康供体的血沉棕黄层获得未成熟的DC，如先前描述[Palova-Jelinkova L,Rozkova D,Pecharova B,Bartova J,Sediva A,Tlaskalova-Hogenova H,Spisek R,Tuckova L:Gliadin fragments induce phenotypic andfunctional maturation of human dendritic cells.J Immunol2005；175:7038-7045]。简言之，通过Ficoll梯度分离人外周血单核细胞(PBMC)，并且通过在75cm2培养瓶(Nunc)中允许2小时的细胞粘附分离单核细胞。在GM-CSF(500IU/ml，Gentaur)和IL-4(20ng/ml，CellGenix)存在下，在含有青霉素和链霉素(分别100U/ml和100μg/ml，Gibco)的GMP级CellGro DC培养基(CellGenix)中培养单核细胞6天产生DC。在第3天补充培养基和细胞因子。在第6天，收获DC并以1x106个细胞/ml接种在96孔板(Nunc)中。在第7天，用疫苗级MPLA(2μg/ml，Cayla-InvivoGen)活化未成熟的DC达24小时。为了诱导tDC，在第3天用Dex(1μM，Medochemie)和在第6天Dex和VitD2-帕立骨化醇(1,5ng/ml，Zemplar，AbbottLaboratories)处理DC。在没有耐受化因子的情况下培养对照DC(cDC)。对于再刺激测定法，清洗tDC和cDC，并且在不存在耐受化因子的情况下，在含有或不含LPS(1μg/ml,Sigma-Aldrich),polyI:C(25μg/ml,Cayla-InvivoGen),megaCD40LTM(1000ng/ml,Enzo LifeSciences)或含有IL-1β,TNF-α,IL-6(都是10ng/ml)和IFN-γ(100ng/ml)(都来自R&Dsystems)的促炎性细胞因子的混合物的情况下，在含有5％人AB血清(Invitrogen)的完全RPMI培养基(Gibco)中再培养24小时。在规定刺激条件下，在实验开始前1小时添加信号传导抑制剂。SB203580(10μM的p38MAPK抑制剂)，SP600125(20μM的JNK/SAPK抑制剂)，PD98059(20μM的ERK1/2抑制剂)，Bay 11-7082(10μM的NF-κB抑制剂)，Stattic(5μM的STAT3抑制剂)和雷帕霉素(100nM的mTOR抑制剂)获自Calbiochem，并溶于二甲亚砜中。收集上清液和细胞用于进一步分析。
流式细胞术：用荧光染料缀合的单抗在4℃在PBS中染色细胞(2x105/孔)30分钟，清洗，并在LSR Fortessa细胞分析仪(BD Biosciences)上分析。包括合适的同种型对照。使用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。根据前向散射，侧向散射和CD11c+参数门控DC。基于DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚((4',6-diamidin-2-fenylindol)))染色从分析排除死细胞。对于细胞内细胞因子染色，在细胞分析前在存在布雷菲德菌素A(5μg/ml，BioLegend)的情况下用佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)(50ng/ml，Sigma-Aldrich)加离子霉素(1μg/ml，Sigma-Aldrich)刺激T细胞4-16小时。刺激后，清洗细胞，在固定/透化缓冲液(eBiosciences)中于4℃温育30分钟，然后在透化缓冲液(eBiosciences)中清洗，并在4℃用适当的单克隆抗体(单抗)染色30分钟。
DC细胞因子产生：在DC刺激24小时后收获细胞上清液，并在-80℃冷冻，直至分析。根据制造商的说明书，使用Luminex测定法(MILLIPLEXTM人细胞因子/趋化因子试剂盒，Merck Millipore)和ELISA测定法(DuoSet ELISA试剂盒，R&D系统)测定IL-10，IL-12p70，TNF-α和TGF-β浓度。在根据制造商的说明书测量TGF-β水平之前，将细胞上清液酸化。
DC和T细胞培养、同种刺激测定法：从PBMC非粘附级分获得T细胞。将tDC或cDC(2x104)与含有5％人AB血清(Invitrogen)的完全RPMI培养基(Gibco)中的异基因T细胞(2x105)一起培养。在第2、5和7天添加IL-2(20U/ml，PeproTech)。对于初次混合淋巴细胞反应(MLR)测定，用5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Invitrogen)标记的异基因T细胞(2x105)与tDC或cDC(2x104)一起温育。如通过第6天的流式细胞术检测，通过T细胞的CFSE荧光的序贯稀释测定T细胞增殖。为了检测T细胞的IFN-γ，IL-10和IL-17A产生，将2x104个tDC或cDC与2x105个异基因T细胞一起培养。细胞因子产生通过流式细胞术在第6天(IFN-γ)和第9天(IL-10)的细胞内染色测定。在第6天通过ELISA分析来自细胞培养物上清液的IL-17A产生。
调节性T细胞的扩充和抑制测定法：用EasySepTM人幼稚CD4+T细胞富集试剂盒(StemCell Technologies)通过阴性选择纯化幼稚CD4+T细胞(供体A)。以10:1的比率将幼稚CD4+T细胞与异基因的人白细胞抗原(HLA)错配Dex/VitD2tDC(供体B)一起在完全RPMI(5％人AB血清)中在24孔板中分配6天。在第2天和第5天添加IL-2(20U/ml，PeproTech)。接下来，用完全RPMI(5％人AB血清)和IL-2清洗并静置2天，随后用Dex/VitD2tDC在相同条件下再刺激5天。5天后，在使用抑制测定法之前将T细胞回收并静置2天。将用Dex/VitD2tDC引发两轮的T细胞称为Treg。在随后的MLR测定中测试CD4+Treg的抑制能力。用Vybrant DiD细胞标记溶液(5μM，Millipore)标记CD4+Treg(供体A)，清洗并分配在用1:20000抗CD3mAb(克隆MEM-57)包被的圆底96孔板中，与响应T细胞(供体A)和MPLA成熟的cDC(未用Dex和VitD2处理)(供体B)一起。cDC来自与用于诱导Treg的Dex/VitD2tDC相同的供体。以10:10:1或5:10:1的Treg/Tresp/DC比率分配细胞。作为额外的对照，Tresp和Treg单独或与cDC一起培养。6天后，回收细胞，并且通过流式细胞术测定Ki-67来分析响应细胞的增殖。回收细胞培养上清液用于IL-10，IFN-γ和IL-17A分析。
Western印迹分析：从在Cell Gro中培养或在完全RPMI中单独或与细胞因子混合物、LPS、polyI:C或CD40L一起再培养1小时的细胞制备细胞溶胞物(2x106DC)[Palova-Jelinkova L,Rozkova D,Pecharova B,Bartova J,Sediva A,Tlaskalova-Hogenova H,Spisek R,Tuckova L:Gliadin fragments induce phenotypic and functionalmaturation of human dendritic cells.J Immunol 2005；175:7038-7045]。当指示时，刺激前1小时添加雷帕霉素(100nM)。将细胞溶胞物进行10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到硝酸纤维素膜上，然后用指定的特异性单抗进行免疫印迹。通过缀合有辣根过氧化物酶的二抗(Cell Signaling Technology)使用West Femto Maximum SensitivitySubstrate(Pierce)揭示膜。剥离后，用适当的单抗作为加载对照再探查膜。
核提取物的制备和比色NF-κB测定：使用核提取试剂盒(Active Motif)从在CellGro中培养或在完全RPMI中单独或与细胞因子混合物、LPS、polyI:C或CD40L一起再培养90分钟的DC(2x106)制备核提取物。测量p50，p65/RelA，c-Rel和RelB的NF-κB DNA结合活性[Palova-Jelinkova L,Rozkova D,Pecharova B,Bartova J,Sediva A,Tlaskalova-Hogenova H,Spisek R,Tuckova L:Gliadin fragments induce phenotypic andfunctional maturation of human dendritic cells.J Immunol 2005；175:7038-7045]。
代谢量化：乳酸、葡萄糖和乳酸脱氢酶测量：分别用基于糖酵解细胞的测定试剂盒(Cayman Chemicals)和葡萄糖比色测定试剂盒(BioVision)测量DC培养物上清液中乳酸和葡萄糖的浓度。当指示时，在Cell Gro中培养的DC暴露于RPMI，LPS，CC，polyI:C或CD40L之前1小时通过用10mM 2-脱氧葡萄糖(Sigma)处理来抑制糖酵解。用乳酸脱氢酶活性测定试剂盒(Sigma)测定DC提取物的LDH活性。
统计分析：从至少三次独立实验获得结果，并且以平均值±SEM给出。将双尾配对t检验用于使用GraphPad PRISM 6进行数据分析。p≤0.05的值被认为是统计学显著的。
7.2结果
tDC在用LPS，CC，polyI:C和CD40L再刺激后保留半成熟致耐受性表型：为了研究tDC的功能特性和稳定性，将新鲜分离的人单核细胞在符合GMP的培养基Cell Gro中在存在GM-CSF，IL-4和致耐受性因子Dex和VitD2的情况下培养。在不含Dex和VitD2的情况下培养对照DC(cDC)。最后，用MPLA活化DC。
如图15A(1-4)所示，在Cell Gro培养的tDC表现出致耐受性表型，与cDC相比具有显著更低的CD86,CD83,CD80和CD40的表面水平，但是更高的Toll样受体(TLR)-2,CD14和抑制性分子TIM-3和ILT-3水平。CD1a，CD11c，HLA-DR和抑制性分子ILT-4，PD-L1和PD-L2的水平在tDC和cDC中相当。然而，PD-L1表达与CD86表达的比率在tolDC中高于在cDC中(图32)。该比率可以用作致耐受性的标记。为了研究DC的稳定性，在Cell Gro中产生的cDC和tDC在没有耐受化剂的完全RPMI中再培养，随后用LPS，CC，polyI:C和CD40L刺激24小时(图15B(1-2))。再刺激导致了tDC上的CD86，CD83和CD40的略微上调，然而，与cDC相比，它仍然显著更低。重要的是，当与cDC相比时，tDC上TLR2，CD14和ILT-3的表达在再刺激后仍然较高。在CC，LPS和CD40L刺激后，TIM-3的表达降低了约两倍，然而，与cDC相比，它仍然较高。致耐受性分子PD-L1的表达(其在来自Cell Gro的tDC上较低)在用CC以及LPS再刺激tDC后显著增加并且在在polyI:C刺激24小时后略有增加。
与致耐受性细胞表面表型一致，tDC与cDC相比产生较高水平的IL-10和TGF-β，少量的TNF-α和无IL-12p70(图15C)。随后用CC，LPS，polyI:C或CD40L再刺激tDC导致IL-10产生的强烈增加，TGF-β的略微上调，TNF-α的低产生和最小的IL-12产生(图15D)。这些数据共同证明了尽管存在成熟刺激物，Dex/VitD2tDC保留非促炎概况，具有高表达的致耐受性标志物，高IL-10/IL-12p70比率和持续的TGF-β产生。
Dex/VitD2 tDC在再刺激后保持降低的T细胞刺激能力：以1:10的比率将TDC或cDC与异基因T细胞一起培养。与cDC相比，即使在再刺激后，无论成熟剂如何，TDC也是CD4+以及CD8+T细胞增殖的较弱的诱导剂(图16A)。与此一致，即使在再刺激后，tDC也诱导了异基因T细胞的低IL-17A产生，与作为特别在CC和LPS刺激后通过T细胞的IL-17A的有力诱导剂的cDC相反(图16B)。此外，与cDC相比，异基因T细胞与在Cell Gro培养的tDC的共温育将T细胞细胞因子概况偏移到由CD4+以及CD8+T细胞的降低的IFN-γ和显著增加的IL-10产生(图16C，16D)。此外，T细胞与用CC，LPS，polyI:C和CD40L再刺激的tDC的共温育导致产生CD4+IFN-γ的T细胞的显著减少以及稳定数目的产生CD4+IL-10的T细胞。在CC和CD40L再刺激tDC后，产生CD8+IFN-γ的T细胞的百分比保持稳定或稍微降低，而在用LPS再刺激tDC后，产生CD8+IL-10的T细胞的量保持几乎相同，并且在用CC，polyI:C和CD40L再刺激tDC后略微降低。
Dex/VitD2 tDC诱导从幼稚CD4+T细胞分化Treg：促进从幼稚前体的Treg分化/诱导的能力增加似乎是tDC最重要的标志之一[Mahnke K,Qian Y,Knop J,Enk AH:Inductionof CD4+/CD25+regulatory T cells by targeting of antigens to immaturedendritic cells.Blood 2003；101:4862-4869]。在与cDC相比时，用Dex/VitD2tDC共培养异基因T细胞诱导产生更高和稳定的IL-10生成性CD4+T细胞的水平。以前，显示通过用由VitD3产生的未成熟DC或tDC重复引发CD4+幼稚T细胞产生的IL-10生成性CD4+T细胞表现出调节性质[Unger WW,Laban S,Kleijwegt FS,van der Slik AR,Roep BO:Induction ofTreg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3or dexamethasone:Differential role for PD-L1.Eur J Immunol2009；39:3147-3159；Jonuleit H,SchmittE,Schuler G,Knop J,Enk AH:Induction of interleukin 10-producing,nonproliferating CD4(+)T cells with regulatory properties by repetitivestimulation with allogeneic immature human dendritic cells.J ExpMed 2000；192:1213-1222]。因此，为了测试由Dex/VitD2tDC诱导的IL-10生成性CD4+T细胞(称为Treg)在通过重复引发扩充后是否拥有调节活性，将幼稚CD4+T细胞与异基因Dex/VitD2tDC一起培养两轮刺激。如图17A所示，由Dex/VitD2tDC扩充的Treg产生IL-10，但实际上没有IFN-γ和IL-17A。用cDC在特异性活化后IL-10产生增加。IFN-γ和IL-17的产生在用cDC的特异性活化后仅略有增加。为了分析在用Dex/VitD2tDC进行两轮刺激后扩充的Treg的抑制功能，将Treg滴定入包含异基因cDC(来自与原始刺激中使用的相同的DC供体)和自体响应T细胞(与Treg来自相同的T细胞供体)的MLR。如图17B所示，Treg剂量依赖性地抑制响应T细胞增殖。此外，将Treg添加到MLR中以剂量依赖的方式导致IL-10的上调和IFN-γ和IL-17A产生的下调(图17C)。因此，由Dex/VitD2tDC诱导的IL-10生成性Treg是功能性的并且抑制响应T细胞的增殖。
Dex/VitD2 tDC使用NF-κB，p38 MAPK和ERK1/2调节其在炎性环境中的致耐受性性 质：为了破译在维持tDC的致耐受性性质中起作用的分子机制，分析先前已报道影响DC成熟和协调IL-10和IL-12产生的信号传导途径，包括p38MAPK，c-Jun N末端激酶(JNK/SAPK)，ERK1/2，NF-κB，吲哚胺2,3脱氧酶(IDO)，mTOR和STAT3[Nakahara T,Moroi Y,Uchi H,FurueM:Differential role of MAPK signaling in human dendritic cell maturation andTh1/Th2engagement.J Derm Sci 2006；42:1-11；Weichhart T,Costantino G,PoglitschM,Rosner M,Zeyda M,Stuhlmeier KM,Kolbe T,Stulnig TM,Horl WH,Hengstschlager M,Muller M,Saemann MD:The TSC-mTOR signaling pathway regulates the innateinflammatory response.Immunity2008；29:565-577；Qian C,Jiang X,An H,Yu Y,Guo Z,Liu S,Xu H,Cao X:TLR agonists promote ERK-mediated preferential IL-10production of regulatory dendritic cells(diffDCs),leading to NK-cellactivation.Blood2006；108:2307-2315；Harden JL,Egilmez NK:Indoleamine 2,3-dioxygenase and dendritic cell tolerogenicity.Immunol Invest 2012；41:738-764；Jackson AM,Mulcahy LA,Porte J,Franks HA,El Refaee M,Wang Q,Shah S,Zhu X,PatelPM:Role of mitogen-activated protein kinase and PI3K pathways in theregulation of IL-12-family cytokines in dendritic cells and the generation ofTh-responses.Eur Cyt Net2010；21:319-328]。
首先，评估tDC和cDC中MAPK，包括p38MAPK，JNK/SAPK和ERK1/2是否差异调控。如图18A所示，来自Cell Gro的tDC表达较高水平的活化的JNK/SAPK，然而p38MAPK和ERK1/2在tDC和cDC中相当地活化。再次暴露DC于炎性刺激后，与cDC形成对比，tDC表达较高的活化JNK/SAPK的水平，较低的活化p38MAPK的水平，和明显上调的ERK1/2。
接下来，显示tDC在测试的所有刺激条件下表达高水平的免疫调节分子IDO。相比之下，IDO在cDC中缺乏或弱表达。这些结果表明了与cDC相比，p38MAPK，JNK/SAPK，ERK1/2和IDO在tDC中差异调节，这可以在维持再攻击后tDC的致耐受性特性中起作用。
鉴于DC分化和成熟与NF-κB的活化有关并且显示了通过抑制NF-κB途径介导Dex/VitD tDC分化[Adorini L,Penna G:Induction of tolerogenic dendritic cells byvitamin D receptor agonists.Handbook of Experimental Pharmacology 2009:251-273；van Kooten C,Stax AS,Woltman AM,Gelderman KA:Handbook of experimentalpharmacology"dendritic cells":The use of dexamethasone in the induction oftolerogenic DCs.Handbook of Experimental Pharmacology 2009:233-249]，评估LPS，polyI:C，CC或CD40L是否可以在没有致耐受性因子的情况下逆转NF-κB抑制。首先，已经显示了在测试的所有刺激条件下，IκB-α(一种抑制NF-κB的调节蛋白，通过与其复合并且在细胞质中捕获它进行)磷酸化在tDC中显著减少。相比之下，IκB-α在cDC中被磷酸化(图18A)。为了定量NF-κB活化，分析了核中NF-κB亚基p50，p65/RelA，RelB和c-Rel的DNA结合活性(图18B)。在与cDC相比时，来自Cell Gro的Dex/VitD2tDC表现出在核提取物中的p65/RelA的低结合活性，和RelB(其显示反映DC成熟[Scheinman RI,Gualberto A,Jewell CM,CidlowskiJA,Baldwin AS,Jr.:Characterization of mechanisms involved in transrepressionof NF-kB by activated glucocorticoid receptors.Mol Cell Biol 1995；15:943-953])和c-Rel(其显示参与IL-12产生[Grumont R,Hochrein H,O'Keeffe M,Gugasyan R,White C,Caminschi I,Cook W,Gerondakis S:C-Rel regulates interleukin 12p70expression in CD8(+)dendritic cells by specifically inducing p35 genetranscription.J Exp Med2001；194:1021-1032])的低结合活性。在没有VitD2和Dex的情况下，即使在再攻击后，tDC中p65/RelA，RelB和c-Rel的DNA结合活性仍然较低。另一方面，NF-κB亚基p50(其显示了创建IL-10的同二聚体增加生成[Cao S,Zhang X,Edwards JP,Mosser DM:NF-kB1(p50)homodimers differentially regulate pro-and anti-inflammatory cytokines in macrophages.J Biol Chem 2006；281:26041-26050])的结合活性在所有测试条件下在tDC中较高(图18B)。
接下来，确定了MAPK和NF-κB信号传导途径利用如何有助于响应LPS，CC，polyI:C和CD40L的DC的炎症表型对致耐受性表型。刺激前，分别通过p38MAPK，JNK/SAPK，ERK1/2和NF-κB抑制剂SB203580，SP600125，PD98059和Bay 11-7082预处理DC。分析IL-10和IL-12产生显示，在tDC中CC，LPS和CD40L再刺激后，IL-10产生显著依赖于p38MAPK，JNK/SAPK和ERK1/2活化途径。Bay 11-7082也消除了tDC中的IL-10产生。然而，仅在cDC中LPS触发后才观察到相同的情况(图18C)。另一方面，p38MAPK和NF-κB抑制剂在LPS和CC触发后明显下调cDC中的IL-12产生，但不影响tDC中的IL-12产生。分析细胞表面分子显示，与cDC相反，p38MAPK抑制下调了tDC中的ILT-3和PD-L1表达(图18D)。此外，ERK1/2抑制剂在tDC中LPS刺激后下调PD-L1表达，但在所有测试条件下，在tDC中显著上调CD86表达(图18D)。测试的其它抑制剂对tDC中的ILT-3，PD-L1和CD86表达没有显著影响(数据未显示)。p38MAPK和ERK1/2抑制剂调节tDC中IL-10产生和共刺激和抑制性分子表达的能力表明对后续T细胞活化的影响。通过使用异基因T细胞活化模型，显示了在与没有ERK1/2抑制剂的tDC相比时，ERK1/2抑制剂增加了Dex/VitD tDC刺激CD4+以及CD8+T细胞增殖的能力(图18E)。这些数据共同表明tDC对cDC中的活化信号传导途径的不同模式，p38MAPK，ERK1/2和下调的NF-κB对于维持下调CD86和上调ILT-3和PD-L1表达，高IL-10产生和Dex/VitD tDC的减少的同种刺激潜力是重要的。
mTOR和STAT3在再刺激后调节tDC中的IL-10产生和ILT-3，PD-L1和CD86表达：最近，发现mTOR通过减弱NF-κB和上调STAT3活性来协调人单核细胞和DC中的促炎性事件对抗炎性事件[Weichhart T,Costantino G,Poglitsch M,Rosner M,Zeyda M,Stuhlmeier KM,Kolbe T,Stulnig TM,Horl WH,Hengstschlager M,Muller M,Saemann MD:The TSC-mTORsignaling pathway regulates the innate inflammatory response.Immunity 2008；29:565-577；Haidinger M,Poglitsch M,Geyeregger R,Kasturi S,Zeyda M,ZlabingerGJ,Pulendran B,Horl WH,Saemann MD,Weichhart T:A versatile role of mammaliantarget of rapamycin in human dendritic cell function and differentiation.JImmunol 2010；185:3919-3931]。蛋白质印迹分析揭示了，tDCs在再暴露于炎性刺激物后强烈磷酸化mTOR和STAT3，而mTOR的磷酸化较弱，并且磷酸化的STAT3在cDC中几乎检测不到。mTOR磷酸化导致p70S6K的磷酸化，mTOR依赖性事件，其被mTOR特异性抑制剂雷帕霉素消除(图19A)。为了进一步证实mTOR和STAT3活化和IL-10和IL-12产生以及CD86，ILT-3和PD-L1表达之间的联系，分别使用化学抑制剂雷帕霉素和Stattic进行mTOR和STAT3的阻断实验。在mTOR和STAT3抑制作用下，tDC降低了IL-10的产生(图19B)。雷帕霉素和Stattic在cDC中LPS再刺激后下调IL-10产生(图19B)。然而，与cDC(其中雷帕霉素处理在CC和LPS处理后显著增加IL-12产生)相反，雷帕霉素不能恢复tDC中的IL-12产生，不管刺激剂如何。在测试的这两种DC中，在Stattic处理后，IL-12的产生不受影响(图19B)。此外，mTOR和STAT3抑制显著降低致耐受性标记物PD-L1和ILT-3的表达，但在CC和LPS触发剂(mTOR抑制)或所有测试条件(STAT3抑制)后，显著增加tDC中的CD86表达。这与当与在没有雷帕霉素或Stattic情况下培养的tDC相比时，tDC尤其刺激CD4+T细胞增殖的能力的部分恢复相平行(图19D)。这些数据共同表明，mTOR和STAT3不仅在再刺激后控制tDC中的IL-10产生和ILT-3，PD-L1和CD86表达，而且在其免疫调节功能中起作用(图19C)。
mTOR依赖性糖酵解调节再刺激后tDC的稳定致耐受性性质：TLR诱导的促炎成熟和DC的活化显示依赖于PI3/Akt介导的代谢再编程，从氧化磷酸化(OXPHOS)转化到有氧糖酵解[Krawczyk CM,Holowka T,Sun J,Blagih J,Amiel E,DeBerardinis RJ,Cross JR,JungE,Thompson CB,Jones RG,Pearce EJ:Toll-like receptor-induced changes inglycolytic metabolism regulate dendritic cell activation.Blood 2010；115:4742-4749]。mTOR是PI3/Akt的下游靶标，并且显示出调节糖酵解代谢[Locasale JW,CantleyLC:Genetic selection for enhanced serine metabolism in cancerdevelopment.Cell Cycle 2011；10:3812-3813]。然而，本文提供的数据证明了在用TLR配体，细胞因子混合物和CD40L活化后在Dex/VitD tDC中的mTOR的强磷酸化，其不伴随tDC成熟。此外，mTOR抑制下调Dex/VitD tDC中的致耐受性分子ILT-3和PD-L1表达和IL-10产生。因此，研究了tDC中的mTOR活化是否伴随糖酵解活化，以及糖酵解如何调节在炎症环境中tDC的稳定致耐受性概况。
为了调查糖酵解活性，在tDC和cDC上清液中分析葡萄糖消耗和乳酸生成作为糖酵解活性的指标。如图20A所示，在Cell Gro中培养的Dex/VitD tDC与cDC分泌类似的乳酸水平。然而，与cDC相比，tDC的再刺激导致细胞上清液中乳酸的强烈积累，其伴随着培养基葡萄糖含量的更显著的逐渐降低。与增加的葡萄糖消耗和乳酸产生一致，再刺激后的tDC揭示了与cDC相比，在测试的所有条件下，细胞乳酸脱氢酶(一种催化丙酮酸和乳酸的相互转化的氧化还原酶)的活性较高。与cDC相比，这些数据表明Dex/VitD2tDC中的糖酵解增加。为了测试mTOR在再刺激后是否调节tDC中增强的糖酵解代谢，使用化学mTOR抑制剂雷帕霉素进行阻断实验。雷帕霉素在Dex/VitD tDC中显著下调乳酸生成(图20B)。因此，Dex/VitD tDC的再刺激伴随着通过mTOR活化途径增强的糖酵解。接下来，通过添加10mM 2-脱氧葡萄糖(2-DG)测试了增强的糖酵解是否调节再刺激后tDC的致耐受性特性，所述2-脱氧葡萄糖(2-DG)充当糖酵解抑制剂并且防止向DC培养物产生乳酸。向DC培养物添加2-DG显著阻止Dex/VitD tDC中的乳酸生成(图20B)。此外，在这些条件下，tDC不能上调ILT-3和PD-L1分子(图20C)并显著降低IL-10产生(图20D)。与cDC形成对比，CD86的表达和IL-12p70产生在tDC中的2-DG处理后仍然不受影响。另一方面，在tDC中糖酵解的抑制部分地增加诱导异基因CD4+以及CD8+T细胞增殖的能力(图20D)。这些数据共同显示，增强的糖酵解在模拟体内随后促炎性活化后，改变抑制分子的表达，IL-10产生和Dex/VitD tDC的同种刺激潜力。
7.3讨论
本分析显示了Dex/VitD tDC在没有致耐受性因子的情况下在炎性环境中维持致耐受性表型和功能。本文呈现的数据第一次显示了Dex/VitD tDC在炎症环境中的稳定性由下调的NF-κB，p38MAPK的适度活化和调节CD86，ILT-3和PD-L1表达的ERK1/2，mTOR和STAT3分子的强活化，IL-10和IL-12p70的产生以及Dex/VitD tDC的异种刺激潜能(down-regulated NF-κB,modest activation of p38MAPK and strong activation of ERK1/2,mTOR and STAT3molecules that regulate expression of CD86,ILT-3and PD-L1,production of IL-10and IL-12p70and allostimulatory potential of Dex/VitD tDC)协调。
最近的研究显示在用LPS或促炎性细胞因子的重复成熟时就成熟标志物表达和稳定的高IL-10生成而言Dex和/或VitD处理的DC的稳定的致耐受性表型[Unger WW,Laban S,Kleijwegt FS,van der Slik AR,Roep BO:Induction of Treg by monocyte-derived DCmodulated by vitamin D3or dexamethasone:Differential role for PD-L1.Eur JImmunol2009；39:3147-3159；Chamorro S,Garcia-Vallejo JJ,Unger WW,Fernandes RJ,Bruijns SC,Laban S,Roep BO,T Hart BA,van Kooyk Y:TLR triggering ontolerogenic dendritic cells results in TLR2up-regulation and a reducedproinflammatory immune program.J Immunol 2009；183:2984-2994；Harry RA,AndersonAE,Isaacs JD,Hilkens CM:Generation and characterisation of therapeutictolerogenic dendritic cells for rheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis 2010；69:2042-2050]。显示与tDC再刺激后ILT-3，TIM-3，TLR2和PD-L1的高表达相反稳定的低至中等CD86，CD83和CD40表达的本文呈现的数据证实并且显著扩展了关于tDC的稳定性的最新的发现，并且指示tDC的抗炎性表型的保存[Naranjo-Gomez M,Raich-Regue D,Onate C,Grau-Lopez L,Ramo-Tello C,Pujol-Borrell R,Martinez-Caceres E,Borras FE:Comparative study of clinical grade human tolerogenic dendritic cells.JTransl Med 2011；9:89；Unger WW,Laban S,Kleijwegt FS,van der Slik AR,Roep BO:Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3ordexamethasone:Differential role for PD-L1.Eur J Immunol2009；39:3147-3159]。显示ILT-3信号传导途径导致DC中NF-κB和p38MAPK途径的抑制[Chang CC,Liu Z,Vlad G,QinH,Qiao X,Mancini DM,Marboe CC,Cortesini R,Suciu-Foca N:Ig-like transcript3regulates expression of proinflammatory cytokines and migration of activatedT cells.J Immunol 2009；182:5208-5216]。据报道TLR-2，ILT-3和PD-L1信号传导参与Treg诱导[Unger WW,Laban S,Kleijwegt FS,van der Slik AR,Roep BO:Induction ofTreg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3or dexamethasone:Differential role for PD-L1.Eur J Immunol2009；39:3147-3159；Sutmuller RP,denBrok MH,Kramer M,Bennink EJ,Toonen LW,Kullberg BJ,Joosten LA,Akira S,NeteaMG,Adema GJ:Toll-like receptor 2controls expansion and function of regulatoryT cells.J Clin Invest 2006；116:485-494]。在本研究中，特别用CC和LPS再刺激tDC导致PD-L1和ILT-3表达的上调和诱导拥有抑制能力的IL-10生成性CD4+T细胞的稳定能力。因此，本文呈现的数据预测tDC的再刺激后TLR2，ILT-3的稳定表达和PD-L1的上调可以在耐受性诱导中起作用。
本文呈现的数据证明了，通过炎症信号再刺激的致耐受性DC维持稳定的细胞因子概况，具有高IL-10产生，上调的TGF-β，降低的TNF-α和实际上不存在IL-12。IL-10的高生成以及促炎细胞因子TNF-α和IL-12的低生成可以有利于Dex/VitD2tDC进行免疫治疗。
与观察到的致耐受性表型一致，由炎症信号再刺激的Dex/VitD2tDC不仅显示诱导T细胞增殖的能力降低，而且当与cDC诱导的T细胞应答相比时，还能够诱导通过CD4+和CD8+区室两者的具有低IFN-γ和高IL-10产生的T细胞。再刺激后IFN-γ阳性T细胞的减少及伴随的稳定IL-10阳性T细胞可以由于来自再刺激的tDC和cDC的较高的IL-10生成而将T细胞应答转化为Th2引起[Langenkamp A,Messi M,Lanzavecchia A,Sallusto F:Kinetics ofdendritic cell activation:Impact on priming of Th1,Th2and nonpolarized Tcells.Nature Immunology 2000；1:311-316]。
由于本研究中报道的tDC产生可诱导Treg和Th17细胞的TGF-β[Xu L,Kitani A,Fuss I,Strober W:Cutting edge:Regulatory T cells induce CD4+CD25-FoxP3-Tcells or are self-induced to become Th17cells in the absence of exogenousTGF-b.J Immunol 2007；178:6725-6729]，通过测试从与tDC共培养的T细胞的IL-17的产生来分析其Th17极化活性。证明了与cDC相反，Dex/VitD2tDC显著降低T细胞的IL-17A产生，甚至在用促炎性刺激物再刺激后。由于Th17以及IFN-γ有助于自身免疫性疾病的发病机制[Li CR,Mueller EE,Bradley LM:Islet antigen-specific Th17cells can induce TNF-a-dependent autoimmune diabetes.J Immunol 2014；192:1425-1432]，分泌IL-17A和IFN-γ的T细胞的减少可停止或逆转具有自身免疫性疾病的受试者中的有害的自身免疫过程。重要的是，在用Dex/VitD2tDC重复刺激后产生的CD4+Treg中观察到IFN-γ和IL-17A的低生成以及伴随的增加的IL-10分泌，并且即使在用成熟的DC再刺激时也保持相似。因此，用Dex/VitD2DC引发后的T细胞的细胞因子改变不能简单地解释为刺激不足的直接结果。
接下来，本研究聚焦于通过模拟随后的促炎性活化时在Dex/VitD2tDC中触发的活化途径。本文呈现的数据表明Dex/VitD2tDC中NF-κB途径的稳定下调，这进一步由IκB-α的消除的磷酸化证明。与cDC相反，Dex/VitD2tDC表现出已显示上调促炎性细胞因子产生的NF-κB亚基p65/RelA，RelB和c-Rel的低核易位[Cao S,Zhang X,Edwards JP,Mosser DM:NF-kB1(p50)homodimers differentially regulate pro-and anti-inflammatorycytokines in macrophages.J Biol Chem 2006；281:26041-26050]。本文中呈现的数据与下述观察一致：RelB作为DC中p50/RelB异二聚体的核表达程度与成熟程度相关[ScheinmanRI,Gualberto A,Jewell CM,Cidlowski JA,Baldwin AS,Jr.:Characterization ofmechanisms involved in transrepression of NF-kB by activated glucocorticoidreceptors.Mol Cell Biol 1995；15:943-953]。由于c-Rel在IL-12产生中起作用[GrumontR,Hochrein H,O'Keeffe M,Gugasyan R,White C,Caminschi I,Cook W,Gerondakis S:C-Rel regulates interleukin 12p70expression in CD8(+)dendritic cells byspecifically inducing p35gene transcription.J Exp Med2001；194:1021-1032]，本研究的tDC中c-Rel的下调水平反映了即使在二次刺激之后，当致耐受剂不存在时，其消除的产生IL-12的能力。tDC细胞核中p50的高水平可以反映p50同二聚体抑制促炎性细胞因子产生，但充当IL-10的转录活化物的实情[Cao S,Zhang X,Edwards JP,Mosser DM:NF-kB1(p50)homodimers differentially regulate pro-and anti-inflammatory cytokinesin macrophages.J Biol Chem 2006；281:26041-26050]。tDC中的高水平p50和高水平IL-10之间的联系由以前报道为阻断p50磷酸化的NF-κB抑制剂Bay 11-7082处理后IL-10产生的强烈减少支持[Lee J,Rhee MH,Kim E,Cho JY:Bay 11-7082is a broad-spectruminhibitor with anti-inflammatory activity against multiple targets.Mediatorsof Inflammation 2012；2012:416036]。
本文呈现的数据支持在用炎症刺激物再刺激后在tDC对cDC中使用不同的MAPK活化途径。在tDC中，再刺激后p38MAPK的活化与cDC相比更低。然而，用p38MAPK抑制剂的实验显示了p38MAPK在tDC中的IL-10产生和致耐受性分子ILT-3和PD-L1的表达中起重要作用。相比之下，p38MAPK在再刺激后在cDC中明显活化，并且主要控制IL-12的产生，对致耐受性分子的表达没有显著影响。接下来，显示在tDC中测试的所有刺激物再刺激后，但在cDC中仅在LPS再刺激后，显著的ERK1/2磷酸化。这可以与这些刺激条件下IL-10产生的显著上调相关。用ERK1/2抑制剂PD98059的阻断实验证实了ERK1/2在tDC中炎性触发剂后IL-10产生中的作用，并且支持ERK1/2活化在IL-10分泌中的作用[Saraiva M,O'Garra A:Theregulation of IL-10production by immune cells.NatRev Immunol 2010；10:170-181]。此外，阻断ERK1/2活化部分恢复CD86上调，阻止PD-L1上调和部分恢复tDC的同种刺激潜力。这些数据表明p38MAPK和ERK在致耐受性成熟对促炎性成熟中的不同作用。证实了本文呈现的结果，p38MAPK和ERK显示调节不同DC类型中的PD-L1表达[Wolfle SJ,StrebovskyJ,Bartz H,Sahr A,Arnold C,Kaiser C,Dalpke AH,Heeg K:PD-L1expression ontolerogenic APCs is controlled by STAT-3.EurJ Immunol 2011；41:413-424]。
Dex/VitD2tDC也表达高水平的IDO，其在再刺激后保持稳定。由于已经显示了IDC在tDC中的表达和随后的色氨酸代谢产物的产生诱导效应T细胞活性的直接一致和同时的Treg扩充[Harden JL,Egilmez NK:Indoleamine 2,3-dioxygenase and dendritic celltolerogenicity.Immunol Invest 2012；41:738-764；Manches O,Fernandez MV,PlumasJ,Chaperot L,Bhardwaj N:Activation of the noncanonical NF-kB pathway by HIVcontrols a dendritic cell immunoregulatory phenotype.PNAS 2012；109:14122-14127]，稳定的IDO表达可支持Dex/VitD2tDC的致耐受性性质。
最后，本研究最新证实，mTOR和STAT3抑制导致再刺激后在Dex/VitD2tDC中上调的CD86表达，下调的ILT-3和PD-L1表达，下调的IL-10的产生和增加的刺激T细胞增殖的能力。在对照DC中没有观察到该表型，其中CD86的表面表达下调，但是在mTOR抑制时PD-L1和ILT-3的表达保持相似。本文呈现的数据证明了mTOR和STAT3在Dex/VitD2tDC中的新颖重要的抗炎作用，并提供了关于mTOR在DC活化中的多功能作用的额外知识。最近，PI3K/mTOR途径已被证明是人单核细胞和髓样DC中TLR信号传导的负调节因子。经雷帕霉素处理的髓样免疫细胞表现出强烈的Th1和Th17极化[Weichhart T,Costantino G,Poglitsch M,Rosner M,Zeyda M,Stuhlmeier KM,Kolbe T,Stulnig TM,Horl WH,Hengstschlager M,Muller M,Saemann MD:The TSC-mTOR signaling pathway regulates the innate inflammatoryresponse.Immunity 2008；29:565-577]，并且能够阻断地塞米松的抗炎作用[WeichhartT,Haidinger M,Katholnig K,Kopecky C,Poglitsch M,Lassnig C,Rosner M,ZlabingerGJ,Hengstschlager M,Muller M,Horl WH,Saemann MD:Inhibition of mTOR blocks theanti-inflammatory effects of glucocorticoids in myeloid immune cells.Blood2011；117:4273-4283]。这可表明用于产生本研究的Dex/VitD2tDC的地塞米松需要活性的mTOR来维持其抗炎效果。另一方面，据记载，证明了mTOR对于单核细胞衍生的DC存活和分化是不可或缺的[Weichhart T,Costantino G,Poglitsch M,Rosner M,Zeyda M,StuhlmeierKM,Kolbe T,Stulnig TM,Horl WH,Hengstschlager M,Muller M,Saemann MD:The TSC-mTOR signaling pathway regulates the innate inflammatory response.Immunity2008；29:565-577；Haidinger M,Poglitsch M,Geyeregger R,Kasturi S,Zeyda M,Zlabinger GJ,Pulendran B,Horl WH,Saemann MD,Weichhart T:A versatile role ofmammalian target of rapamycin in human dendritic cell function anddifferentiation.J Immunol 2010；185:3919-3931；Hackstein H,Taner T,ZahorchakAF,Morelli AE,Logar AJ,Gessner A,Thomson AW:Rapamycin inhibits IL-4--induceddendritic cell maturation in vitro and dendritic cell mobilization andfunction in vivo.Blood 2003；101:4457-4463]。来自本文呈现的工作的数据表明，在Dex/VitD tDC中，mTOR途径决定了致耐受性DC表型的维持。
令人惊讶的是，本文呈现的数据证明了，通过mTOR信号途径调节的增强糖酵解通过调节CD86，ILT-3和PD-L1表达、IL-10/IL-12比率和刺激T细胞增殖的能力来调节炎性环境中Dex/VitD tDC的致耐受性表型和功能。本文呈现的数据与以前的研究结果形成对比，这些研究显示增强的糖酵解和PI3/Akt/mTOR信号传导途径对于促炎性成熟和DC和T细胞的功能是不可缺少的[Krawczyk CM,Holowka T,Sun J,Blagih J,Amiel E,DeBerardinisRJ,Cross JR,Jung E,Thompson CB,Jones RG,Pearce EJ:Toll-like receptor-inducedchanges in glycolytic metabolism regulate dendritic cell activation.Blood2010；115:4742-4749；Locasale JW,Cantley LC:Genetic selection for enhancedserine metabolism in cancer development.Cell Cycle 2011；10:3812-3813]。然而，与根据本文呈现的数据一样，Ferreira等人最近记录了VitD3产生的致耐受性DC使用由PI3/Akt/mTOR信号传导途径控制的葡萄糖代谢的活化以促进致耐受性表型和功能[FerreiraGB,Vanherwegen AS,Eelen G,Gutierrez AC,Van Lommel L,Marchal K,Verlinden L,Verstuyf A,Nogueira T,Georgiadou M,Schuit F,Eizirik DL,Gysemans C,CarmelietP,Overbergh L,Mathieu C:Vitamin D3induces tolerance in human dendritic cellsby activation of intracellular metabolic pathways.Cell Reports 2015]。
总之，本研究报道，本文呈现的临床级Dex/VitD2tDC在不存在致耐受性因子的情况下在用多种生物相关性炎性刺激物刺激后保留其表型和功能特性。本研究第一次描述了在没有致耐受剂的情况下再刺激tDC后关键活化途径的调节。本文呈现的数据显示，与以p38MAPK和NF-κB的强烈活化为特征的cDC形成对比，tDC使用不同的活化途径，如p38MAPK，ERK1/2，IDO，mTOR和STAT3，以在其模拟随后的促炎性活化后维持其致耐受性表型和免疫调节功能。由炎症刺激物触发的信号传导途径的不同模式也可以充当可行且强力的身份测试，其可区分培养中的炎性和致耐受性DC。这项关于临床级tDC的研究为其在临床环境中，如在自身免疫性疾病或移植中的测试提供了理论。
8.实施例3
本实施例证明了使用地塞米松和维生素D2从1型糖尿病(T1D)患者产生的单核细胞衍生的致耐受性DC(tDC)在表型和功能上是稳定的。此外，本实施例证明了衍生自小于或等于60mmol/mol Hb的糖化血红蛋白(Hb)A1c(“HbA1c”)水平的患者的tDC诱导GAD特异性T细胞的稳定低反应性。本实施例进一步证明了在未来临床试验中使用冷冻保存的tDC重新建立耐受性的可行性。
8.1材料和方法：
受试者：签署知情同意表/或其法定代表人(在需要时)签字后，从共有71名T1D儿童获得抗凝血血液样品(50-60ml，EDTA)。除了诸如甲状腺炎或乳糜泻等T1D相关同病(15.5％，招募受试者的18％)外，登记患者无一具有其它合并症(comorbidity)。在本研究中，登记具有疾病持续的不同时间和疾病的不同长期控制的患者(表10)。受试者无一在诊断时招募，在抽血时也没有酮酸中毒(ketoacidosis)。在所有受试者中，通过用序列特异性引物的聚合酶链反应(PCR)进行风险等位基因的完整HLA-DQA1和HLA-DQB1基因型分型(表11)。
表10：研究中登记的患者的临床数据
表11：登记的患者的分析的HLA等位基因的分布
树突细胞产生：使用Ficoll-Paque(GE Healthcare)梯度离心分离患者全血的外周血单核细胞(PBMC)，并且通过在75cm2培养瓶(Nunc)中允许2小时的细胞粘附分离单核细胞。然后，将非粘附细胞洗出并冷冻。从在IL-4(248IU/ml CellGenix)和GM-CSF(500IU/ml，Gentaur)存在下在含有青霉素和链霉素(分别为100U/ml和100μg/ml；Gibco)的CellGro培养基(CellGenix)中的单核细胞产生树突细胞(DC)达6天。在第3天添加具有细胞因子的新鲜培养基。通过在第3天添加地塞米松(1μM,Medochemie)和第6天添加地塞米松(1μM)和维生素D2(Zemplar；1,5ng/ml,Abbott Laboratories)诱导致耐受性树突细胞(tolDC)。在没有致耐受性因子的情况下产生对照DC(cDC)。在第6天，收获tolDC和cDC并且接种到96孔板(均为1x106个DC/ml)中。在第7天，将tolDC和cDC保持未脉冲或加载GAD-65(65kDa谷氨酸脱羧酶同等型；5μg/ml，Diamyd Medical)或PPD(结核菌素纯化蛋白衍生物；5μg/ml，StatensSerum Institut)中。4小时后，最终用VacciGrade MPLA(2μg/ml，Cayla-InvivoGen)成熟tolDC和cDC，持续接下来的24小时。
在第8天，分析DC的表面标志物的表达、存活力、冷冻和融化后的表型稳定性，并且实施对重复成熟和功能测试的抗性。收集来自DC刺激的上清液，并在-80℃冷冻直到分析。
冷冻和融化后的树突细胞表型稳定性：用MPLA最终成熟后24小时，使用细胞冷冻容器(BioCision)将1x106个tolDC和1x106个cDC在CryoStore溶液(BioLife Solutions)中冷冻并储存在液氮中1个月。融化后，将MPLA成熟的tolDC和MPLA成熟的cDC清洗并转移到含有5％人血清(HS；Invitrogen)、1％L-谷氨酰胺(Gibco)、青霉素和链霉素(分别为100U/ml和100μg/ml，Gibco)、1％非必需氨基酸(Gibco)、1mM丙酮酸钠(Gibco)和50μM beta-巯基乙醇(Gibco)的完全RPMI 1640(Gibco)培养基。将DC保持未刺激或用LPS(1μg/ml,Sigma-Aldrich)或megaCD40LTM(1000ng/ml,Enzo Life Sciences)将它们刺激24小时。收集上清液和细胞用于进一步分析。
流式细胞分析：使用缀合有荧光染料的单克隆抗体(mAb)：抗CD86-FITC(克隆2231FUN-1),CD274(PD-L1)-FITC(克隆MIH1),HLA-DR-PE-Cy7(克隆L243)，购自BDBiosciences；CD83-PerCP-Cy5.5(克隆HB15a)，购自Beckman Coulter；CD80-FITC(克隆MAB104),CD40-PerCP-eFluor710(克隆5C3),CD54-FITC(克隆RR1/1),CD184(CXCR4)-PE(克隆12G5),CD197(CCR7)-APC-eFluor780(克隆3D12),CD4-PE-Cy7(克隆RPA-T4),FoxP3-AF488(克隆PCH101)，购自eBioscience；TLR2-FITC(克隆T2.1),CD183(CXCR3)-PerCP-Cy5.5(克隆G025H7),TGFβ(LAP)-PE-Cy7(克隆TW4-2F8),CD25-PerCP-Cy5.5(克隆BC96),TIM-3-PE(克隆F38-2E2),KI-67-PE(克隆Ki-67),IFN-γ-PB(克隆4S.B3)，购自BioLegend；CD14-PE-DL594(克隆MEM-15),CD11c-APC(克隆BU15),CD3-AF700(克隆MEM-57),CD8-PE-Dy590(克隆MEM-31)，购自Exbio；CD85k(IL-T3)-PE(克隆293623)，购自R&D Systems。
在4℃在PBS中用单抗染色细胞30分钟，清洗并通过LSR Fortessa细胞分析仪(BDBiosciences)进行分析。使用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。基于SSC和FSC位置和CD11c表达定义DC；只将活(DAPI阴性)细胞纳入分析。用Annexin V-PE(Exbio)加DAPI(Invitrogen)染色评估DC存活力。基于SSC和FSC位置和CD3，CD4和CD8表达定义T细胞。包括合适的同种型对照。
在细胞内标志物染色之前，在固定/透化缓冲液(eBioscience)中在4℃下透化细胞30分钟，清洗，然后在透化缓冲液(eBioscience)中在4℃下用单抗染色30分钟。当指示时，在布雷菲德菌素A(5μg/ml，BioLegend)存在下，用PMA(50ng/ml，Sigma-Aldrich)加离子霉素(1μg/ml，Sigma-Aldrich)将T细胞刺激4小时，实现最大细胞因子产生，然后进行胞内细胞因子染色用于流式细胞术分析。
细胞培养上清液中细胞因子的分析：收集来自DC和用DC刺激的T细胞培养物的上清液，并在-80℃冷冻直至分析。根据制造商的说明，使用多重细胞因子测定(MILLIPLEXTM人细胞因子/趋化因子试剂盒，Merck Millipore)测定IL-10，IL-12p70，IL-6，TNF-α，IL-23，IFN-γ和IL-17A浓度。使用Luminex MAGPIX获得数据。
DC和T细胞培养物：从非粘附的PBMC级分获得自体T细胞。在96孔圆底板(Nunc)中在完整的RPMI培养基(含有5％的人AB血清，1％L-谷氨酰胺，青霉素和链霉素(分别为100U/ml和100μg/ml)，1％非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠和50μMβ-巯基乙醇)中用未脉冲或加载有抗原的tolDC或cDC(2x104)刺激T细胞(2x105)。在第3、6和9天添加IL-2(20U/ml，PeproTech)。
在第6天通过流式细胞术通过细胞内检测KI-67测定T细胞增殖。在第6天收集细胞培养物上清液并冷冻。如上所述，使用多重细胞因子测定来检测这些上清液中的细胞因子。对于第6天的IFNγ，IL-17A的细胞内流式细胞术检测，在布雷菲尔德A存在下，用PMA和离子霉素再刺激T细胞4小时。
树突细胞抑制测定：为了评估tolDC对cDC诱导的GAD-65特异性T细胞细胞因子分泌的抑制作用，将2x105个T细胞与cDC一起培养(T细胞与cDC的比率为10:1)，并且添加不同数目的tolDC(tolDC与cDC比率为0.25:1；0.5:1；和1:1)。收集来自用DC刺激的T细胞培养物的上清液，在-80℃冷冻，并使用多重细胞因子测定法分析分泌的细胞因子。
用于检测抗原特异性T细胞低反应性的耐受性测定：为了验证tolDC是否诱导抗原特异性T细胞低反应性，用未脉冲或GAD脉冲的tolDC或cDC刺激2×105个未标记的T细胞。7天后，收获T细胞，用3μM CFSE染色，并用未加脉冲或加载有GAD或PPD的cDC重复刺激(T细胞与cDC的比率为10:1)。在第6天通过流式细胞术定量增殖T细胞的数目。收集来自培养物的上清液，在-80℃下冷冻，随后使用多重细胞因子测定(如上所述)分析分泌的细胞因子。
调节性T细胞诱导：通过阴性选择试剂盒(EasySepTM人幼稚CD4+T细胞富集试剂盒，StemCell Technologies)从解冻且过夜静息的自体T细胞中幼稚CD4+T细胞。用2x104个未脉冲或加载有GAD的tolDC或cDC刺激2x105个幼稚CD4+T细胞9天。通过流式细胞术评估分化的调节性T细胞的表型。在第9天收集细胞培养上清液并冷冻。在第2、5和7天添加IL-2(20U/ml，PeproTech)。
统计分析：结果以至少3个独立实验的至少3个样品的平均值±SEM给出。在GraphPad PRISM 6中分析数据。使用用于参数数据的配对和非配对的双尾Student t检验，和用于非参数数据的Wilcoxon检验(配对数据)实施两组之间的比较。使用Pearson相关性检验(相关系数：r)计算相关性的概率水平。p≤0.05的值被认为是统计学显著的。
8.2结果
来自T1D患者的GMP制备的单核细胞衍生的tolDC表现出高度稳定的半成熟表型：最初调查与在没有致耐受性因子的情况下产生的对照(cDC)相比，在存在Dex和VitD2的情况下在符合GMP的CellGro培养基中建立的来自T1D患者的tolDC的表型和稳定性。这两种类型的DC用单磷酰脂质A(MPLA)进一步成熟24h。如图21A(1-2)和图29(A-C)所示，在与cDC相比时，成熟相关标志物CD80，CD83，CD86，CD54，CD40和HLA-DR在tolDC上较低，并且在MPLA成熟时略微增强。相比之下，与在cDC相比时，未成熟以及成熟的tolDC表达显著更高水平的表面CD14，TLR2，TGF-β和致耐受性标志物IL-T3和TIM-3。与cDC相比，调节分子PD-L1的表达在tolDC上较低。此外，PD-L1表达相对于CD86表达的比率在tDC中高于在cDC中(图32)。该比率可以用作致耐受性的标记。与成熟cDC相比，趋化因子受体CCR7(进入淋巴样组织必需)和牵涉迁移到炎性组织的CXCR3和CXCR4的表达在成熟tolDC中更高(图21A(1-2)和图29(A-C))。所有这些分子的细胞表面的表达不受用致糖尿病性β细胞抗原GAD(65kDa的谷氨酸脱羧酶同等型)脉冲tolDC或cDC的影响(数据未显示)。虽然Dex和VitD2表明对DC的成熟能力的明显影响，但Dex和VitD200不影响DC的存活力(图30A)。
用于免疫治疗自身免疫性病症的tolDC的关键质量之一是其调节表型的稳定性。因此，测试了冷冻保存和随后将tolDC转移至促炎性环境中对其表面分子表达的影响。将MPLA成熟的tolDC或MPLA成熟的cDC冷冻并置于液氮中至少1个月。然后，融化DC，在补充有5％HS的RPMI中再培养，并将其保持未刺激或随后暴露于LPS或可溶性CD40L。冷冻/融化循环和随后的再刺激均不能逆转tolDC的致耐受性表型。尽管tolDC在冷冻保存和再刺激后适度增加活化分子CD86和CD83的表达，但是其表达比在等同的cDC中保持显著更低。另一方面，除了在cD40L刺激后ILT-3下调外，尽管再刺激，在tolDC上维持TLR2，CD14和IL-T3的表达。此外，tolDC在LPS刺激后显示上调PD-L1表达的潜力(图21B(1-2))。冷冻和融化循环仅略微影响tolDC的存活力，如图30B所示。
来自T1D患者的致耐受性DC比对照DC分泌更多的抑制性IL-10和少量的促炎性细 胞因子：使用多重细胞因子测定来测定用MPLA进行DC成熟后24小时的细胞培养上清液中的IL-6，TNF-α，IL-12p70，IL-23和IL-10的浓度。与cDC相比，成熟的tolDC分泌明显较少量的促炎性细胞因子IL-6，TNF-α和IL-23以及几乎检测不到的IL-12水平。相比之下，tolDC产生更高量的抗炎IL-10(图22A)。尽管冷冻保存并且随后用LPS和CD40L再刺激后tolDC分泌的IL-6和TNF-α的量增加，但是与cDC相比，IL-12p70的水平几乎检测不到，并且IL-23水平非常低，而IL-10的量增加(图22B(1-2))。
致耐受性DC与cDC相比诱导自身反应性T细胞的低增殖：在DC/T细胞共培养6天后，通过细胞内KI-67染色定量了tolDC对自体T细胞应答结果的影响。已经显示DC诱导的T细胞抗原特异性应答取决于T1D患者的临床参数[Segovia-Gamboa,N.,et al.,Tolerogenicdendritic cells induce antigen-specific hyporesponsiveness in insulin-andglutamic acid decarboxylase 65-autoreactive T lymphocytes from type 1diabeticpatients.Clin Immunol,2014.154(1):p.72-83]。因此，在本研究中，根据糖化血红蛋白(Hb)A1c水平将患者分为2组(组1，完全补偿：HbA1c≤60mmol/mol Hb，组2，未补偿：HbA1c＞60mmol/mol Hb)。
如图23A所示，来自这两组的未脉冲的tolDC以及加载有GAD的tolDC与其cDC对应物相比都较差诱导CD4+和CD8+T细胞两者的增殖。对加载有GAD的tolDC的应答与这两组中未加载的tolDC的应答相似。然而，T细胞对加载有GAD的cDC的抗原特异性应答的研究显示组1与组2之间的显著差异。在T1D患者的组1中，观察到与由未脉冲的cDC诱导的抗原特异性增殖形成对比针对加载有GAD的cDC的CD4+和CD8+T细胞两者的显著的抗原特异性增殖(CD4+T细胞：p＝0.0023，20名患者中17名；CD8+T细胞：p＝0.029，16名患者中15名)。相比之下，仅在CD4+而非CD8+T细胞中记录针对加载有GAD的cDC的来自组2的T细胞的显著抗原特异性增殖，并且趋于较弱(CD4+T细胞：p＝0.041，18名患者中13名)；CD8+T细胞：p＝0.49，18名患者中10名)。此外，与组1相比，与未脉冲的cDC一起培养的CD4+T细胞的稳态增殖在组2(具有高水平HbA1c的患者)中明显更高(p<0.04)。这些数据表明，HbA1c的较高水平与增加的稳态T细胞增殖有关，继而影响T细胞的抗原特异性增殖。
CD4+和CD8+T细胞应答与T1D患者临床参数的相关性分析：根据具有较低和较高HbA1c水平的T1D患者之间不同的抗原特异性T细胞应答，实施与对加载有GAD的cDC的CD4+T细胞和CD8+T细胞特异性应答的相关性分析。HbA1c水平与T细胞呈负相关(CD4+T细胞：r＝-0.38，p＝0.018；CD8+T细胞：r＝-0.347，p＝0.03)。由未脉冲的cDC诱导的T细胞增殖与CD4+和CD8+T细胞两者中的HbA1c水平明显呈正相关(CD4+T细胞：r＝0.37，p＝0.03；CD8+T细胞：r＝0.36，p＝0.039)(图23B)。
为了测试，具有较高的HbA1c水平的T1D患者中较低的T细胞对GAD的反应性是否可简单地反映较高的基础T细胞增殖或可反映T细胞对其它抗原的反应性的一般下调，实施与T细胞对加载有PPD的cDC的应答和HbA1c水平的关联测试。在这种情况下，CD4+T细胞对PPD的应答与HbA1c水平不呈负相关，表明较高的HbA1c水平特别影响对GAD65的应答，但不影响对其它抗原的应答(图23C)。
致耐受性DC较差地诱导通过自体T细胞产生IFN-γ和IL-17：测量了用自体T细胞诱导tolDC或cDC的培养物中的IFNγ或IL-17A生成性T细胞。在这两组中与加载有GAD的cDC相比，加载有GAD的tolDC诱导显著更低数目的IFNγ生成性CD4+和CD8+T细胞。然而，cDC诱导的IL-17A生成性CD4+T细胞数目与由tolDC诱导的数目之间的显著差异仅在充分补偿患者的组1中显著不同。由无加载和加载有抗原的tolDC诱导的IFNγ或IL-17A生成性T细胞的百分比是相当的(图24A和24B)。
此外，在与未脉冲cDC相比时，在组1中而非组2中观察到针对加载有GAD的cDC，由CD4+和CD8+T细胞的IFNγ产生中的抗原特异性应答(CD4+T细胞：p＝0.022，17名患者中的14名；CD8+T细胞：p＝0.02，17名患者中的14名以及CD4+T细胞：p＝0.1，16名患者中的11名；CD8+T细胞：p＝0.86，16名患者中的8名)(图24A)。对在IL-17A产生中的抗原特异性应答获得了相同的结果，其中在与未脉冲的cDC相比时，在组1中而非组2中检测到针对加载有GAD的cDC的抗原特异性IL-17A生成(CD4+T细胞：p＝0.012，16名患者中的12以及CD4+T细胞：p＝0.67，14名患者中的6名)(图24B)。
与组1相比，由未脉冲的cDC诱导的IFNγ生成性CD4+或IFNγ生成性CD8+T细胞的基础水平在组2中更高(CD4+IFNγT细胞，p＝0,05,CD8+IFNγT细胞，p＝0,05)。这些数据指示HbA1c的高水平也与基础细胞因子产生的水平增加以及T细胞的抗原特异性活化较低有关。
HbA1c水平与针对加载有GAD的cDC由CD4+T细胞的特异性IFNγ或IL-17A生成显著呈负相关(IFNγ:r＝-0.41,p＝0.023；IL-17A:r＝-0.40,p＝0.04)。HbA1c水平仅与针对加载有GAD的cDC由CD8+T细胞的特异性IFNγ生成呈中等负相关(r＝-0.14,p＝0.44)(图24C)。此外，HbA1c水平与由未脉冲的cDC诱导的CD4+及CD8+T细胞的细胞因子生成强烈正相关(CD4+IFNγ:r＝0.52,p＝0.002；CD8+IFNγ:r＝0.35,p＝0.05；CD4+IL-17A:r＝0.51,p＝0.007)(图24C和24D)。
致耐受性DC在tolDC和T细胞共培养物中诱导较低量的促炎性细胞因子：在用cDC或tolDC(未脉冲或加载有GAD65)刺激的T细胞的6天培养物的上清液中测量Th1、Th17和调节T细胞相关细胞因子的量。在从G1患者制备的tolDC的存在下，与同cDC的共培养物相比，上清液含有显著降低的Th1相关细胞因子IFN-γ和TNF-α和Th17相关细胞因子IL-17A的浓度。与加载有GAD的cDC一起的培养物中IFN-γ，TNF-α和IL-17的水平优于与未脉冲cDC一起的培养物中相应的水平。IL-23和IL-6的水平在用tolDC刺激的T细胞的培养物中较低，但是仅对于含有加载有GAD的tolDC的培养物中的IL-23达到统计学显著性。相比之下，与用加载有GAD的cDC培养的T细胞的上清液相比，在用加载有GAD的tolDC刺激的T细胞的上清液中发现更高量的IL-10(图25A和25B)。
对于G2患者，与其cDC对应物相比，仅检测到具有未脉冲或加载有GAD的tolDC的培养物中IFN-γ和IL-17水平的显著降低。此外，与G1患者相比，未检测到与未脉冲的cDC相比具有加载有GAD的cDC的培养物中细胞因子的优异产生(图25A和25B)。
致耐受性DC抑制由对照DC诱导的促炎性细胞因子的产生：先前的实验显示了tolDC是比cDC更弱的T细胞活化诱导物。为了研究tolDC是否也能够减轻cDC诱导的自身反应性T细胞应答，实施抑制测定法。将不同数目的加载有GAD的tolDC添加到用加载有GAD的cDC刺激的T细胞以揭示tolDC抑制潜力。如图26所示，来自G1和G2两者的tolDC在1:1和0.5:1比率(tolDC/cDC)时分别上调cDC诱导的IL-10生成。然而，仅来自G1的tolDC在1:1或所有测试比率时分别显著降低cDCs诱导的IFN-γ和IL-17A产生(图26)。这些数据表明，主要由充分补偿患者包含的一组T1D患者的tolDC能够抑制由cDC诱导的T细胞应答。
tolDC在具有良好T1D补偿的患者中诱导稳定的抗原特异性低反应性：上述数据显示，tolDC能够诱导GAD反应性T细胞的低反应性，伴随着促炎细胞因子的下调和IL-10的上调。为了进一步评估由tolDC促进的T细胞应答，测试了T细胞低反应性的稳定性和抗原特异性。用CFSE染色从具有加载有GAD的cDC(GAD-cDC T细胞)或加载有GAD的tolDC(GAD-tolDCDT细胞)的原代培养物中回收的T细胞，随后用加载有GAD的cDC进行再刺激(图27)。在充分补偿患者的组(G1)中，与GAD-tolDC T细胞形成对比，GAD-cDC T细胞在用加载有GAD的cDC再刺激后容易响应，如通过显著降低的增殖显示。相比之下，来自G2患者的GAD-tolDC T细胞在用加载有GAD的cDC再刺激后不容易耐受化。
此外，测试了由tolDC诱导的稳定的低反应性的诱导是否是抗原特异性的，即，tolDC诱导的T细胞是否维持响应无关抗原的能力。无关抗原是PPD(结核菌素纯化蛋白衍生物)。从具有加载有GAD的tolDC(GAD-tolDC T细胞)的原代培养物中回收的对PPD反应的T1D患者的T细胞用加载有PPD的cDC再刺激。结果显示了当与用加载有GAD的cDC再刺激的GAD-tolDC T细胞相比时，来自T1D患者的G1组的GAD-tolDC T细胞在用加载有PPD的cDC再刺激后容易响应。总体上，这些数据显示，来自T1D患者组1的加载有GAD的tolDC选择性地诱导GAD特异性T细胞的稳定低反应性，但不损害其对无关抗原如PPD响应的能力(图27)。
致耐受性DC诱导调节性CD4+CD25+CD127lowFoxP3+T增殖细胞从幼稚CD4+T细胞的 分化：致耐受性DC的关键特征之一是其引发调节性T细胞分化的能力。这种tolDC能力对于诱导在患者体内持续进行的自身免疫过程的长期调节至关重要。为了测试tolDC诱导Treg的能力，分离了自体幼稚CD4+T细胞，并且用未脉冲的或加载有GAD的tolDC或加载有GAD的cDC刺激9天。测量诱导的调节性T细胞的频率，其特征在于CD4+KI-67+CD25+CD127low，并由FoxP3表达定义(图31)。加载有GAD的tolDC能够比cDC从幼稚CD4+T细胞诱导明显更高比例的FoxP3+调节性T细胞(图28A)，并且这种倾向在患者组1中更明显(图28B)。
本文描述的实施方案旨在仅仅是示例性的，并且本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验能够确定本文所述的具体过程的许多等同方案。所有这些等同方案被认为在本发明的范围内，并且由所附权利要求书覆盖。
本文引用的所有参考文献(包括专利申请，专利和出版物)通过引用整体并入本文用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请被具体和单独地指明通过引用完整并入用于所有目的一样。

Claims (37)

1.用于生成稳定的半成熟致耐受性树突细胞的体外方法，所述方法包括：
a.在包含GM-CSF和IL-4的培养基中培养从受试者的血液分离的单核细胞；
b.在培养的第一时间段后，在包含地塞米松、GM-CSF和IL-4的培养基中培养来自步骤(a)的细胞；
c.在培养的第二时间段后，在包含地塞米松、维生素D2、GM-CSF和IL-4的培养基中将来自步骤(b)的细胞培养第三时间段以生成致耐受性树突细胞；并且
d.在培养的第三时间段后，在培养基中培养所述致耐受性树突细胞，所述培养基包含MPLA、GM-CSF和IL-4，或MPLA、GM-CSF、IL-4以及与自身免疫性疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病相关的抗原；
其中在培养第3天在包含地塞米松、GM-CSF和IL-4的培养基中培养来自步骤(a)的细胞，并且
其中在培养第6天在包含地塞米松、维生素D2、GM-CSF和IL-4的培养基中培养来自步骤(b)的细胞，并且
其中在培养第7天在包含MPLA、GM-CSF和IL-4，或GM-CSF、IL-4、MPLA以及所述抗原的培养基中培养所述致耐受性树突细胞。
2.权利要求1的方法，其中通过白细胞去除术(leukapheresis)从受试者的血液分离单核细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述维生素D2以每升0.1-10纳摩尔的终浓度存在于所述培养基中。
4.权利要求1的方法，其中所述地塞米松以每升0.5-3微摩尔的终浓度存在于所述培养基中。
5.权利要求1的方法，其中所述MPLA以每ml 1-3μg的终浓度存在于所述培养基中。
6.权利要求1的方法，其中在收获所述细胞前在包含MPLA或MPLA以及所述抗原的培养基中将所述致耐受性树突细胞培养某个时间段。
7.权利要求1的方法，其中在收获所述细胞前在包含MPLA或MPLA以及所述抗原的培养基中将所述致耐受性树突细胞培养约24小时。
8.权利要求1的方法，其中所述单核细胞来自具有小于或等于60mmol/mol Hb的血红蛋白(Hb)A1c(HbA1c)水平的1型糖尿病(T1D)受试者。
9.权利要求1的方法，其中所述单核细胞来自具有大于60mmol/mol Hb的血红蛋白(Hb)A1c(HbA1c)水平的1型糖尿病(T1D)受试者。
10.权利要求6的方法，其中收获所述细胞时培养的致耐受性树突细胞的产率类似于通过在包含GM-CSF和IL-4而没有地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的树突细胞的产率。
11.权利要求6的方法，其中收获所述细胞时培养的CD11c+树突细胞的百分比等同于或优于通过在包含GM-CSF和IL-4而没有地塞米松和维生素D2的培养基中培养所述单核细胞获得的CD11c+树突细胞的产率。
12.权利要求11的方法，其中收获所述细胞时培养的CD11c+树突细胞的百分比是至少20％。
13.权利要求6的方法，其中收获所述细胞时培养的所述致耐受性树突细胞上的PD-L1表达低于通过在包含GM-CSF和IL-4而没有地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞上的PD-L1表达。
14.权利要求6的方法，其中收获所述细胞时培养的所述致耐受性树突细胞上CD14的表达比通过在包含GM-CSF和IL-4而没有地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞上的CD14表达高至少3倍。
15.权利要求6的方法，其中收获所述细胞时培养的所述致耐受性树突细胞上的CD86表达低于通过在包含GM-CSF和IL-4而没有地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞上的CD86表达。
16.权利要求6的方法，其中收获所述细胞时培养的所述致耐受性树突细胞上的CXCR3表达高于通过在包含GM-CSF和IL-4而没有地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞上的CXCR3表达。
17.权利要求6的方法，其中所述致耐受性树突细胞比通过在包含GM-CSF和IL-4而没有地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞诱导更高数目的CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞。
18.权利要求6的方法，其中冷冻保存所述收获的致耐受性树突细胞。
19.前述权利要求1的方法，其中所述抗原与自身免疫性疾病有关。
20.权利要求19的方法，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病。
21.权利要求20的方法，其中所述抗原是纯化的GAD65多肽。
22.权利要求20的方法，其中所示抗原是纯化的胰岛素多肽。
23.权利要求20的方法，其中所述抗原是纯化的GAD65多肽和纯化的胰岛素多肽。
24.权利要求1的方法，其中所述抗原与移植物排斥或移植物抗宿主病有关。
25.通过权利要求1的方法生成的稳定的半成熟致耐受性树突细胞的群体，其中所述致耐受性树突细胞比通过在包含GM-CSF和IL-4而没有地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞诱导更高数目的CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞。
26.通过权利要求19的方法生成的稳定的半成熟致耐受性树突细胞的群体，其中所述致耐受性树突细胞比通过在包含GM-CSF和IL-4而没有地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞诱导更高数目的CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞。
27.通过权利要求20的方法生成的稳定的半成熟致耐受性树突细胞的群体，其中所述致耐受性树突细胞比通过在包含GM-CSF和IL-4而没有地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞诱导更高数目的CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞。
28.通过权利要求24的方法生成的稳定的半成熟致耐受性树突细胞的群体，其中所述致耐受性树突细胞比通过在包含GM-CSF和IL-4而没有地塞米松和维生素D2的培养基中培养单核细胞获得的树突细胞诱导更高数目的CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞。
29.权利要求27的稳定的半成熟致树突细胞的群体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中的1型糖尿病。
30.权利要求29的用途，其中所述受试者具有小于或等于60mmol/mol Hb的HbA1c水平。
31.权利要求29的用途，其中所述受试者具有大于60mmol/mol Hb的HbA1c水平。
32.权利要求29的用途，其中所述稳定的半成熟致耐受性树突细胞的群体源自对于治疗的所述受试者自体的单核细胞。
33.权利要求25或26的稳定的半成熟树突细胞的群体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中的自身免疫性疾病。
34.权利要求33的用途，其中所述稳定的半成熟致耐受性树突细胞的群体源自对于治疗的所述受试者自体的单核细胞。
35.权利要求25或28的稳定的半成熟致树突细胞的群体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中的移植物抗宿主病或移植物排斥。
36.权利要求35的用途，其中所述稳定的半成熟致耐受性树突细胞的群体源自对于治疗的所述受试者自体的单核细胞。
37.权利要求33的用途，其中所述受试者是人受试者。
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