CN113382768A - 细胞的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了检测调节性树突状细胞的方法，其包括以下步骤：步骤a：在包含调节性树突状细胞的细胞群中，检测细胞表面上的1种以上分子的存在或不存在的步骤；和步骤b：基于该1种以上分子的存在或不存在，鉴定调节性树突状细胞的步骤。本申请公开了制造富集有调节性树突状细胞的细胞群的方法，其包括以下步骤：步骤1：在包含调节性树突状细胞的细胞群中，检测细胞表面上的1种以上分子的存在或不存在的步骤；和步骤2：基于该1种以上分子的存在或不存在，获得富集有调节性树突状细胞的细胞群的步骤。本申请还公开了通过该方法得到的富集有调节性树突状细胞的细胞群。

Description

细胞的检测方法
技术领域
本发明涉及检测调节性树突状细胞的方法、制造富集有调节性树突状细胞的细胞群的方法、富集调节性树突状细胞的方法、富集有调节性树突状细胞的细胞群、调节性树突状细胞的检测用试剂、以及包含该富集有调节性树突状细胞的细胞群的药物组合物。
背景技术
树突状细胞具有树突状突起，在表达主要组织相容性抗原(MHC)II类分子的免疫应答开始时作为抗原呈递细胞发挥作用。树突状细胞从造血干细胞经髓系分化路径分化成未成熟树突状细胞，进而成为成熟树突状细胞。
在被微生物、病毒、异物等外来抗原侵入的外周炎症组织中，未成熟树突状细胞通过吞噬它们而分化为成熟树突状细胞，并向所属的次级淋巴组织迁移。进而，成熟树突状细胞给予幼稚T细胞抗原刺激和共刺激，诱导其分化为抗原特异性效应T细胞，引起初级免疫应答(这样的树突状细胞(常规树突状细胞，conventional dendritic cell)在下文中有时被称为conDC)。
另一方面，还提示存在有在炎症环境下也低水平表达共刺激分子的树突状细胞，这些树突状细胞抑制性地调节T细胞，诱导针对自身组织等的免疫耐受。这样的树突状细胞被称为调节性树突状细胞(regulatory dendritic cell；在下文中有时被称为regDC)。
如上文所述，已提示调节性树突状细胞能诱导免疫耐受，因此，如果能够实现调节性树突状细胞的补充和再生，则可期待器官移植时的免疫抑制(例如，实现无免疫抑制剂条件的器官移植)、自身免疫性疾病(例如，炎性肠病)等广泛的临床应用。因此，已经尝试了从iPS细胞诱导造血祖细胞(Hematopoietic Progenitor Cell；在下文中有时被称为HPC)，然后从所述HPC诱导髓系祖细胞(Myeloid Progenitor；在下文中有时被称为MP)，之后从所述MP诱导树突状细胞，等等。
例如，非专利文献1描述了通过将猕猴的CD14+单核细胞在添加有GM-CSF、IL-4、维生素D3和IL-10的培养基中进行培养，诱导出源自单核细胞的未成熟树突状细胞。此外，非专利文献2描述了从人iPS细胞诱导出树突状细胞，进而确立了在不含动物来源成分的(xeno-free)培养条件下从iPS细胞诱导树突状细胞的方法。此外，非专利文献3描述了从小鼠iPS细胞诱导出调节性树突状细胞，得到的调节性树突状细胞在体外和体内均显示出免疫应答调节作用，并在体外显示出生成调节性T细胞的能力。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：AF Zahorchak等，Transplantation,84(2007)；196-206
非专利文献2：S Senju等，Gene Therapy,18(2011),874-883
非专利文献3：Q Zhang等，Scientific Reports,4:3979,DOI:10.1038/srep03979
发明内容
发明要解决的课题
如上文所述，已报道了从猕猴的单核细胞、小鼠iPS细胞等诱导调节性树突状细胞的方法，但通过这样的方法得到的细胞群中仍含有conDC。考虑临床应用的情况下，期望使用纯化的调节性树突状细胞，但迄今为止尚未知晓与调节性树突状细胞相关的特异性标志物，也尚未确立对调节性树突状细胞进行鉴定和分离的方法。
本发明的目的是提供检测调节性树突状细胞的方法、制造富集有调节性树突状细胞的细胞群的方法、富集调节性树突状细胞的方法、富集有调节性树突状细胞的细胞群、调节性树突状细胞的检测用试剂，以及包含该富集有调节性树突状细胞的细胞群的药物组合物。
用于解决课题的手段
本申请的发明人为了达成上述目的而反复进行了锐意研究，结果发现，在包含调节性树突状细胞的细胞群中，检测特定的细胞表面上的分子的存在或不存在，基于所述结果可以鉴定和分离调节性树突状细胞。
本发明是在上述发现的基础上，进一步反复研究而完成的，其提供了以下的检测调节性树突状细胞的方法、制造富集有调节性树突状细胞的细胞群的方法、富集调节性树突状细胞的方法、富集有调节性树突状细胞的细胞群、调节性树突状细胞的检测用试剂，以及药物组合物。
[1]检测调节性树突状细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤a：在包含调节性树突状细胞的细胞群中，检测细胞表面上的1种以上分子的存在或不存在的步骤；和
步骤b：基于该1种以上分子的存在或不存在，鉴定调节性树突状细胞的步骤。
[2]如[1]所述的方法，其中，所述1种以上分子为选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的至少1种分子。
[3]如[1]所述的方法，其中，所述1种以上分子为选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的2种以上分子。
[3-1]如[1]所述的方法，其中，所述1种以上分子为CD200R和CD44。
[4]如[1]～[3-1]中任一项所述的方法，其中，所述包含调节性树突状细胞的细胞群为通过对多能干细胞进行分化诱导而得到的细胞群。
[5]如[4]所述的方法，其中，所述多能干细胞为人诱导性多能干细胞。
[6]制造富集有调节性树突状细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1：在包含调节性树突状细胞的细胞群中，检测细胞表面上的1种以上分子的存在或不存在的步骤；和
步骤2：基于该1种以上分子的存在或不存在，获得富集有调节性树突状细胞的细胞群的步骤。
[7]如[6]所述的方法，其中，所述1种以上分子为选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的至少1种分子。
[8]如[6]所述的方法，其中，所述1种以上分子为选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的2种以上分子。
[8-1]如[6]所述的方法，其中，所述1种以上分子为CD200R和CD44。
[9]富集调节性树突状细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤A：在包含调节性树突状细胞的细胞群中，检测细胞表面上的1种以上分子的存在或不存在的步骤；和
步骤B：基于该1种以上分子的存在或不存在，选择调节性树突状细胞的步骤。
[9-1]如[9]所述的方法，其中，所述1种以上分子为选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的至少1种分子。
[9-2]如[9]所述的方法，其中，所述1种以上分子为选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的2种以上分子。
[9-3]如[9]所述的方法，其中，所述1种以上分子为CD200R和CD44。
[10]富集有调节性树突状细胞的细胞群，其是通过[6]～[9-3]中任一项所述的方法得到的。
[11]富集有调节性树突状细胞的细胞群，所述调节性树突状细胞表达或不表达选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的至少1种或多种分子。
[12]富集有调节性树突状细胞的细胞群，所述调节性树突状细胞表达或不表达选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的2种以上分子。
[12-1]富集有调节性树突状细胞的细胞群，所述调节性树突状细胞表达或不表达CD200R和CD44。
[13]调节性树突状细胞的检测用试剂，其包含针对选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的至少1种分子中每种的抗体。
[13-1]调节性树突状细胞的检测用试剂，其包含针对选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的2种以上分子中每种的抗体。
[13-2]调节性树突状细胞的检测用试剂，其包含针对CD200R和CD44中每种的抗体。
[14]药物组合物，其包含[10]～[12-1]中任一项所述的富集有调节性树突状细胞的细胞群。
发明效果
根据本发明，可以在包含调节性树突状细胞的细胞群中检测调节性树突状细胞，在包含调节性树突状细胞的细胞群中富集调节性树突状细胞。
具体实施方式
下面，针对本发明的实施方式进行详细说明。
需要说明的是，在本说明书中，“包含(comprise)”涵盖“基本上由……组成(essentially consist of)”的含义和“仅由其组成(consist of)”的含义。
本发明的检测调节性树突状细胞的方法的特征在于包括以下步骤。
步骤a：在包含调节性树突状细胞的细胞群中，检测细胞表面上的1种以上分子的存在或不存在的步骤；和
步骤b：基于该1种以上分子的存在或不存在，鉴定调节性树突状细胞的步骤。
本发明的制造富集有调节性树突状细胞的细胞群的方法的特征在于包括以下步骤。
步骤1：在包含调节性树突状细胞的细胞群中，检测细胞表面上的1种以上分子的存在或不存在的步骤；和
步骤2：基于该1种以上分子的存在或不存在，获得富集有调节性树突状细胞的细胞群的步骤。
本发明的富集调节性树突状细胞的方法的特征在于包括以下步骤。
步骤A：在包含调节性树突状细胞的细胞群中，检测细胞表面上的1种以上分子的存在或不存在的步骤；和
步骤B：基于该1种以上分子的存在或不存在，选择调节性树突状细胞的步骤。
在本说明书中，“细胞群(population)”意指相同种类或不同种类的1个以上细胞。“细胞群(population)”还表示相同种类或不同种类的细胞团块(mass)。
在本说明书中，所谓“进行富集(enrich)”和“富集(enrichment)”，是指使细胞的组合物等组合物中的特定的构成成分的量增加，所谓“经富集的(enriched)”，在用于说明细胞的组合物、例如细胞群的情况下，是指特定的构成成分的量较之被富集前的细胞群中的该构成成分的比例而言增加的细胞群。例如，可以将细胞群等组合物按靶细胞型进行富集，因此，靶细胞型的比例较之存在于被富集前的细胞群内的靶细胞的比例而言增加。在本发明的特定实施方式中，通过富集靶细胞群的方法，可将细胞群按靶细胞群计富集至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％(即，靶细胞群的比例增加)。此外，在本发明的特定实施方式中，通过富集靶细胞群的方法，使得经过富集的细胞群包含至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、或者100％的靶细胞群。
在本说明书中，所谓“细胞表面上的1种以上分子的存在或不存在”，是指分子为2种以上的情况下，对每种分子就存在或不存在进行判断(例如，针对某一分子判断其存在，而针对其他分子判断其不存在的情况等)(类似的表达也具有相同的含义)。
在本说明书中，所谓“多能干细胞(pluripotent stem cell)”，是指胚胎干细胞(ES细胞)以及具有与其相同的分化多能性、即潜在地分化为生物体的各种组织(内胚层、中胚层、外胚层中的全部)的能力的细胞。作为具有与ES细胞相同的分化多能性的细胞，可举出“诱导性多能干细胞”(在本说明书中有时被称为“iPS细胞”)。
在本发明中，所谓“调节性树突状细胞”，是指在炎症环境下也低水平表达共刺激分子的树突状细胞，并且，所述细胞抑制性地调节T细胞，诱导针对自身组织等的免疫耐受，其优选为在表达CD11b和CD11c(CD11b/c双阳性)的“树突状细胞”中、表现出白细胞介素10(IL-10)生产能力的细胞。表现出IL-10生产能力的细胞是实质上生产IL-10的细胞，细胞的IL-10的产生可以通过流式细胞术等已知的方法来进行检测。
用于本发明中的调节性树突状细胞没有特别限定，例如，可以是按照已知的方法(例如，非专利文献1和3中记载的方法)在体外进行诱导而得的调节性树突状细胞(例如，通过对多能干细胞进行分化诱导而得的调节性树突状细胞)，或者可以是从生物体组织通过已知的方法分离得到的调节性树突状细胞。
作为所述多能干细胞，可举出例如胚胎干细胞(embryonic stemcell：ES细胞)、诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell：iPS细胞)、胚胎肿瘤细胞(EC细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)，优选为iPS细胞(更优选人iPS细胞)。在上述多能干细胞为ES细胞或源自人胚胎的任何细胞的情况下，该细胞可以是破坏胚胎而制得的细胞，或者也可以是不破坏胚胎而制得的细胞，优选为不破坏胚胎而制得的细胞。
作为“ES细胞”，为小鼠ES细胞时，可使用inGenious targeting laboratory公司、理研(理化学研究所)等建立的各种小鼠ES细胞株，为人ES细胞时，可使用威斯康星大学、NIH、理研、京都大学、日本国家儿童健康与发展中心、Cellartis公司等建立的各种人ES细胞株。例如，作为人ES细胞株，可使用ESI Bio公司出售的CHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WiCell Research出售的H1株、H9株等、理研出售的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。
所谓“诱导性多能干细胞”，是指通过向哺乳动物体细胞或者未分化干细胞中导入特定的因子(核重编程因子)进行重编程而得的细胞。目前，“诱导性多能干细胞”存在各种细胞，除了由山中等人通过向小鼠成纤维细胞导入Oct3/4·Sox2·Klf4·c-Myc这4种因子而建立的iPS细胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)以外，也可使用下述细胞：将同样的4种因子导入人成纤维细胞而建立的来源于人细胞的iPS细胞(Takahashi K,Yamanaka S.,等，Cell,(2007)131:861-872.)、导入上述4种因子之后以Nanog的表达作为指标分选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita,K.,Ichisaka,T.和Yamanaka,S.(2007)Nature 448,313-317.)、通过不含c-Myc的方法制得的iPS细胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,等，Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)、通过无病毒方法导入6种因子而建立的iPS细胞(Okita K等，Nat.Methods 2011May；8(5):409-12,Okita K等，StemCells.31(3):458-66.)。另外，也可使用由Thomson等制备的导入OCT3/4·SOX2·NANOG·LIN28这4种因子而建立的诱导性多能干细胞(Yu J.,Thomson JA.等，Science(2007)318:1917-1920.)、由Daley等制备的诱导性多能干细胞(Park IH,Daley GQ.等，Nature(2007)451:141-146)、由樱田等制备的诱导性多能干细胞(日本特开2008-307007号公报)等。
此外，也可使用已公开的全部论文(例如，Shi Y.,Ding S.,等，Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,等，Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,等，Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)、或专利(例如，日本特开2008-307007号公报、日本特开2008-283972号公报、美国专利申请公开第2008/2336610号说明书、美国专利申请公开第2009/047263号说明书、国际公开第2007/069666号、国际公开第2008/118220号、国际公开第2008/124133号、国际公开第2008/151058号、国际公开第2009/006930号、国际公开第2009/006997号、国际公开第2009/007852号)中记载的该领域中已知的诱导性多能干细胞中的任何。
作为人工多能性细胞株，可利用NIH、理研、京都大学等建立的各种iPS细胞株。例如，为人iPS细胞株时，可举出理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学的253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等。
通过将多能干细胞供于本身已知的方法，可以制造调节性树突状细胞。多能干细胞为iPS细胞的情况下，可以通过例如国际公开第2017/221975号和Cell Reports 2(2012)1722-1735中记载的方法来制造造血祖细胞。然后，可以通过例如非专利文献1～3中记载的方法，自该造血祖细胞诱导髓系祖细胞，再自该髓系祖细胞诱导树突状细胞，由此制造调节性树突状细胞。
另外，作为供分离上述调节性树突状细胞的生物体组织，只要包含调节性树突状细胞则不受限制，可举出例如淋巴结、胸腺、脾脏、肠道、皮肤等。
从适用于治疗的观点考虑，本发明中使用的调节性树突状细胞和多能干细胞优选为GMP(良好生产规范，Good Manufacturing Practice)标准的细胞。
在本说明书中，将可以实现调节性树突状细胞的检测、富集及/或分离的细胞表面上的分子称为“regDC标志物”。
作为regDC标志物，优选选自由CD99、CD183(CXCR3)、CD107a、CD366(Tim3)、CD172a(SIRPa)、CD200R、CD44、CD206(MR)、CD181(CXCR1)、CD354(TREM1)、CD300c、CD50和CD84组成的组中的至少1种分子。作为regDC标志物的组合，可举出例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种或13种分子的任意组合。其中，选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的2种以上分子的组合是优选的。
在本说明书中，有时将以存在于细胞表面作为指标的标志物称为“regDC阳性标志物”，有时将以不存在于细胞表面作为指标的标志物称为“regDC阴性标志物”。另外，在本发明中，将存在所述regDC阳性标志物的细胞称为regDC标志物阳性细胞，例如，有时将表达CD200R分子的细胞的情况称为CD200R阳性细胞。另外，在本发明中，有时将不存在所述regDC阴性标志物的细胞称为regDC标志物阴性细胞，例如，有时将不表达CD44分子的细胞的情况称为CD44阴性细胞。
在本发明中，各regDC标志物不限于仅用作regDC阳性标志物和regDC阴性标志物中的任一者。作为能够用作regDC阳性标志物和regDC阴性标志物这两者的情况，可举出例如下述情况：针对某一regDC标志物，在检测调节性树突状细胞的情况下可用作regDC阳性标志物，在富集调节性树突状细胞的情况下可用作regDC阴性标志物。另外，当组合两种regDC标志物进行检测和富集时，regDC阳性标志物和regDC阴性标志物的组合成为4种，其中，有时可以使用2种以上的组合来检测和富集调节性树突状细胞(例如，针对regDC标志物A、B而言，成为A+B+、A-B-、A+B-、A-B+这4种组合，其中，有时可以使用2种以上的组合(例如，A+B+和A+B-))。另外，还可举出在检测和富集中能够使用不同组合的情况。在使用3种以上的regDC标志物的组合的情况下也是同样。
作为2种regDC标志物分子的组合，具体可举出以下组合。CD99和CD183、CD99和CD107a、CD99和CD366、CD99和CD172a、CD99和CD200R、CD99和CD44、CD99和CD206、CD99和CD181、CD99和CD354、CD99和CD300c、CD99和CD50、CD99和CD84、CD183和CD107a、CD183和CD366、CD183和CD172a、CD183和CD200R、CD183和CD44、CD183和CD206、CD183和CD181、CD183和CD354、CD183和CD300c、CD183和CD50、CD183和CD84、CD107a和CD366、CD107a和CD172a、CD107a和CD200R、CD107a和CD44、CD107a和CD206、CD107a和CD181、CD107a和CD354、CD107a和CD300c、CD107a和CD50、CD107a和CD84、CD366和CD172a、CD366和CD200R、CD366和CD44、CD366和CD206、CD366和CD181、CD366和CD354、CD366和CD300c、CD366和CD50、CD366和CD84、CD172a和CD200R、CD172a和CD44、CD172a和CD206、CD172a和CD181、CD172a和CD354、CD172a和CD300c、CD172a和CD50、CD172a和CD84、CD200R和CD44、CD200R和CD206、CD200R和CD181、CD200R和CD354、CD200R和CD300c、CD200R和CD50、CD200R和CD84、CD44和CD206、CD44和CD181、CD44和CD354、CD44和CD300c、CD44和CD50、CD44和CD84、CD206和CD181、CD206和CD354、CD206和CD300c、CD206和CD50、CD206和CD84、CD181和CD354、CD181和CD300c、CD181和CD50、CD181和CD84、CD354和CD300c、CD354和CD50、CD354和CD84、CD300c和CD50、CD300c和CD84、CD50和CD84。
其中，作为优选的2种regDC标志物分子的组合，可举出CD99和CD183、CD99和CD107a、CD99和CD366、CD99和CD200R、CD99和CD44、CD99和CD300c、CD99和CD50、CD99和CD84、CD183和CD107a、CD183和CD366、CD183和CD44、CD107a和CD366、CD107a和CD200R、CD172a和CD206、CD172a和CD200R、CD172a和CD44、CD200R和CD44、CD200R和CD206、CD44和CD206、CD44和CD300c、CD44和CD50、CD44和CD84、CD181和CD354、CD300c和CD50、CD50和CD84。
在富集调节性树突状细胞的情况下，作为优选的2种regDC标志物分子的组合，可举出CD99和CD183(N(阴性)：P(阳性)、P：P、P：N)、CD99和CD107a(P：P、P：N、N：N)、CD99和CD366(N：N)、CD99和CD200R(N：P、P：P)、CD99和CD44(N：P、P：P、P：N)、CD99和CD300c(P：P、P：N、N：N)、CD99和CD50(N：P、P：P、P：N)、CD99和CD84(N：P、P：P)、CD183和CD107a(P：N、N：N)、CD183和CD366(P：P、P：N、N：N)、CD183和CD44(N：P、P：P)、CD107a和CD366(N：P、N：N)、CD107a和CD200R(N：P、P：P)、CD172a和CD206(N：N)、CD172a和CD200R(N：P、P：P)、CD172a和CD44(N：N)、CD200R和CD44(P：P、P：N)、CD200R和CD206(P：P、P：N)、CD44和CD206(N：N)、CD44和CD300c(P：P、P：N、N：N)、CD44和CD50(N：P、P：P、P：N)、CD44和CD84(P：P、N：P)、CD181和CD354(N：P、P：P)、CD300c和CD50(N：P、P：P、N：N)、CD50和CD84(P：N、P：P)。需要说明的是，括号内示出了作为阳性标志物(P)和阴性标志物(N)的优选组合(下文也是同样)。例如，记载为CD99和CD183(N：P)表示优选将CD99作为regDC阴性标志物、将CD183作为regDC阳性标志物使用。
作为更优选的2种regDC标志物分子的组合，可举出CD99和CD107a(N：N)、CD99和CD200R(P：P)、CD99和CD44(P：P、P：N)、CD99和CD50(N：P、P：P)、CD183和CD107a(P：N)、CD107a和CD366(N：P)、CD172a和CD200R(N：P、P：P)、CD200R和CD44(P：N)、CD200R和CD206(P：N)、CD44和CD50(N：P、P：P)、CD44和CD84(N：P)、CD300c和CD50(N：P、P：P)、CD50和CD84(P：N、P：P)。
作为进一步优选的2种regDC标志物分子的组合，可举出CD99和CD50(N：P、P：P)、CD172a和CD200R(N：P)、CD200R和CD44(P：N)、CD200R和CD206(P：N)、CD44和CD50(N：P、P：P)、CD44和CD84(N：P)、CD300c和CD50(N：P、P：P)、CD50和CD84(P：N、P：P)。
作为进一步更优选的2种regDC标志物分子的组合，可举出CD99和CD50(N：P、P：P)、CD200R和CD44(P：N)、CD200R和CD206(P：N)、CD44和CD50(N：P、P：P)、CD300c和CD50(N：P、P：P)、CD50和CD84(P：P)。
作为更进一步优选的2种regDC标志物分子的组合，可举出CD200R和CD44(P：N)的组合。
在检测调节性树突状细胞的情况下，作为优选的2种regDC标志物分子的组合，可举出CD99和CD183(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD99和CD107a(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD99和CD366(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD99和CD200R(N：P、P：P、N：N)、CD99和CD44(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD99和CD300c(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD99和CD50(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD99和CD84(N：P、P：P、N：N)、CD183和CD107a(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD183和CD366(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD183和CD44(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD107a和CD366(N：P、P：P、N：N)、CD107a和CD200R(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD172a和CD206(N：P、P：N、N：N)、CD172a和CD200R(N：P、P：P、N：N)、CD172a和CD44(N：P、P：N、N：N)、CD200R和CD44(P：P、P：N、N：N)、CD200R和CD206(P：P、P：N)、CD44和CD206(N：P、P：P、N：N)、CD44和CD300c(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD44和CD50(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD44和CD84(N：P、P：P、N：N)、CD181和CD354(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD300c和CD50(N：P、P：P、P：N、N：N)、CD50和CD84(N：P、P：P、P：N、N：N)。
作为更优选的2种regDC标志物分子的组合，可举出CD99和CD183(N：P)、CD99和CD107a(N：N)、CD99和CD366(N：P)、CD99和CD200R(N：P)、CD99和CD44(N：N)、CD99和CD300c(N：N)、CD99和CD50(N：P)、CD99和CD84(N：N)、CD183和CD107a(P：N)、CD183和CD44(P：N)、CD172a和CD206(N：N)、CD172a和CD200R(N：P)、CD172a和CD44(N：N)、CD200R和CD44(P：N)、CD200R和CD206(P：N)、CD44和CD206(N：N)、CD44和CD50(N：P)、CD44和CD84(N：P)、CD181和CD354(N：P)、CD300c和CD50(N：P)、CD50和CD84(P：N)。
作为进一步优选的2种regDC标志物分子的组合，可举出CD99和CD183(N：P)、CD99和CD107a(N：N)、CD99和CD200R(N：P)、CD99和CD44(N：N)、CD99和CD50(N：P)、CD183和CD107a(P：N)、CD183和CD44(P：N)、CD172a和CD206(N：N)、CD172a和CD200R(N：P)、CD172a和CD44(N：N)、CD200R和CD44(P：N)、CD200R和CD206(P：N)、CD44和CD206(N：N)、CD181和CD354(N：P)。
作为进一步更优选的2种regDC标志物分子的组合，可举出CD172a和CD200R(N：P)、CD172a和CD44(N：N)、CD200R和CD44(P：N)。
作为更进一步优选的2种regDC标志物分子的组合，可举出CD200R和CD44(P：N)的组合。
本说明书中的检测、选择和鉴定并非意指仅对调节性树突状细胞进行特异性的检测、选择和鉴定，还允许同时检测、选择和鉴定具有regDC标志物的其他种类的细胞的情况。
在本发明中，分子存在意指通过检测细胞时使用的方法能够检测到分子，分子不存在意指以检测细胞时使用的方法的检测灵敏度无法检测到分子。
作为在包含调节性树突状细胞的细胞群中，对1种以上regDC阳性标志物存在、及/或1种以上regDC阴性标志物不存在的细胞进行检测和分离的方法，可举出使用流式细胞术和质谱流式细胞术的方法、磁性细胞分离方法等，上述方法可以使用已知的方法来实施。例如，存在1种以上regDC阳性标志物的细胞、及/或不存在1种以上regDC阴性标志物的细胞可以通过包括使所述细胞与特异性地结合于各regDC标志物的物质(例如抗体)接触的步骤的方法来检测和分离。上述物质包括自身添加有可检测标记(如GFP)的物质和自身没有添加标记的物质。当上述物质自身没有添加标记时，可以通过进一步使用直接或间接地识别该物质的添加有可检测标记的物质来进行上述检测和分离。例如，当所述物质是抗体时，可在所述抗体上直接或间接担载荧光素、金属同位素或珠粒(例如磁珠)，藉此对细胞表面的regDC标志物加以标记，并可基于所述标记来检测细胞。在上述情况下使用的抗体可以是仅1种，或者可以是2种以上抗体。
另外，本发明中所谓“获得富集有调节性树突状细胞的细胞群”、“选择调节性树突状细胞”的含义等同于从包含调节性树突状细胞的细胞群中基于regDC标志物分离调节性树突状细胞。
根据本发明的方法，通过使用regDC标志物，能够在包含调节性树突状细胞的细胞群中对调节性树突状细胞进行检测，在包含调节性树突状细胞的细胞群中对调节性树突状细胞进行富集。
本发明的细胞群的特征在于，其富集有表达或不表达选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的至少1种分子的调节性树突状细胞。
该细胞群可以通过例如前述的本发明的制造富集有调节性树突状细胞的细胞群的方法、和本发明的富集调节性树突状细胞的方法获得。
在本发明中，所谓表达分子，是指通过检测细胞时使用的方法能够检测到分子，所谓不表达分子，是指以检测细胞时使用的方法的检测灵敏度无法检测到分子。
本发明的细胞群中的“富集有调节性树突状细胞”意指表达1种以上regDC阳性标志物、及/或不表达1种以上regDC阴性标志物的调节性树突状细胞的比例(该调节性树突状细胞数量/细胞群中包含的总细胞数量)为高于以往的细胞群的比例。其中，调节性树突状细胞的比例优选为1％以上、2％以上、3以上％、4％以上、5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％。
本发明的细胞群由于富集有调节性树突状细胞而具有优异的免疫耐受诱导作用。
本发明的调节性树突状细胞的检测用试剂的特征在于，其包含针对选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的至少1种分子中每种的抗体。
当本发明的检测用试剂包括针对2种以上regDC标志物的抗体时，该试剂可以以在分开的试剂中包含各抗体的试剂盒的形式提供。本发明的检测用试剂中包含的抗体可以以例如与荧光素、金属同位素或珠粒(例如磁珠)结合的方式提供。另外，本发明的试剂可包含上述以外的抗体(例如，能够检测调节性树突状细胞的其他抗体)等。
本发明的调节性树突状细胞的检测用试剂包含针对regDC标志物的抗体，因此，能够用于上述的本发明的检测调节性树突状细胞的方法、制造富集有调节性树突状细胞的细胞群的方法、和富集调节性树突状细胞的方法。
本发明的药物组合物的特征为包含上述富集有调节性树突状细胞的细胞群。
本发明的药物组合物包含这样的富集有调节性树突状细胞的细胞群，因此可以抑制或避免亢进的免疫应答。
本发明的药物组合物可以根据已知的手段，通过将有效量的上述富集有调节性树突状细胞的细胞群与药学上允许的担载体混合等，制造为经口/非经口制剂。本发明的药物组合物通常可制造为注射剂、悬浮剂、滴注剂等非经口制剂。作为药学上允许的担载体，可举出例如赋形剂、镇痛剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、悬浮剂、等渗剂、表面活性剂等。
本发明的药物组合物的施予量可以根据患者的体重、年龄、性别、症状等各种条件而适宜确定。本发明的药物组合物适用于包括人在内的哺乳动物。
本发明的药物组合物可用于治疗及/或预防器官移植中的排斥反应、自身免疫性疾病(例如，克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化、发作性睡病、帕金森氏病)、变态反应疾病(例如，花粉症、食物过敏(food allergy)、药物过敏、哮喘、特应性皮炎、湿疹、食物超敏反应(foodhypersensitivity)、荨麻疹、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎)，以及移植物抗宿主病。
实施例
以下，举出实施例用于更具体地说明本发明。但本发明不限于这些实施例
实施例1：使用Ff-I01s04株的研究
作为包含造血祖细胞(HPC)的细胞群，使用根据已知的方法(例如，Cell Reports,2(2012),1722-1735和国际公开第2017/221975号中记载的方法)使iPS细胞(Ff-I01s04株)分化而得的悬浮细胞群。具体而言，在经超低粘附处理的6孔板中以3×105个/孔接种Ff-I01s04株(第0天)、向EB培养基(向StemPro34中添加10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠、2mM L-谷氨酰胺、45mMα-硫代甘油和50μg/ml抗坏血酸)中加入10ng/ml BMP4、5ng/ml bFGF、15ng/ml VEGF、2μM SB431542，在低氧条件下(5％O2)培养5天(第5天)。随后，添加50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml Flt3L，继续培养5～9天(～第14天)，获得悬浮细胞群。需要说明的是，在培养期间，每2天或每3天更换培养基。
之后，作为包含调节性树突状细胞(regDC)的细胞群，使用根据已知的方法(例如，Transplantation 84:196-206,2007,Gene Therapy18:874-883,2011,ScientificReports 4:3979,2014)使上述中获得的HPC分化而得的细胞群。具体而言，将HPC按1×105个/孔接种至6孔板中，向DC培养基(将Macrophage-SFM和CTS OpTmizer T Cell ExpansionSFM按1:1混合而得的培养基)中加入20ng/ml GM-CSF、20ng/ml M-CSF，培养11天(第14～25天)，获得髓系祖细胞。需要说明的是，在培养期间，每3天或每4天更换培养基。将获得的髓系祖细胞按1×106个/孔接种至6孔板中，向DC培养基中加入20ng/ml GM-CSF、20ng/ml IL-4、20ng/ml IL-10、20nM维生素D3，培养7～8天(第25～32、33天)，获得包含regDC的细胞群。需要说明的是，在培养期间添加两次上述细胞因子(第27天和第28天)。为了鉴定包含regDC的上述细胞群中的IL-10生产细胞，使用表1所示的抗体组进行染色。
将细胞分注至96孔V型底板中，于室温以300g离心5分钟。去除上清液后，添加针对表面分子的抗体与细胞染色缓冲液(autoMACS Rinsing Solution，Miltenyi)的混合液100μl，于4℃静置20分钟。然后，添加150μl细胞染色缓冲液，于室温以300g离心5分钟。去除上清液，添加100μl细胞固定液(Fixation buffer，Biolegend)，于室温静置15分钟后，添加100μl细胞内染色缓冲液(Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer,Biolegend)，于室温以300g离心5分钟。去除上清液，添加IL-10抗体与细胞内染色缓冲液的混合液100μl，于室温静置20分钟。然后，添加150μl细胞内染色缓冲液，于室温以300g离心5分钟。去除上清液，添加200μl细胞染色缓冲液，移至5ml管中，用于流式细胞仪中的分析。使用流式细胞仪FACS LSR Fortessa X20取得数据，使用FlowJo软件分析数据。
[表1]
Figure BDA0003188840240000191
对包含regDC的细胞群中的DC标志物(CD11b和CD11c)阳性细胞之中的IL-10生产细胞(regDC)的各表面标志物的表达分布进行分析。具体而言，根据各抗体组中的两种标志物将包含regDC的细胞群分为4类(阴性+阳性、阳性+阳性、阳性+阴性、阴性+阴性)，计算这些级分中包含的IL-10生产细胞的比例。下表2～4中示出了标志物候选、以及各级分中的IL-10生产细胞百分率(各级分中包含的IL-10生产细胞的比例)、IL-10生产细胞在各级分中的存在比例(各级分中的IL-10生产细胞之中，表达或不表达各标志物的细胞的比例)、级分比例。表2～4分别为抗体组1～3的结果。
级分总体的IL-10生产百分率在抗体组1～3中分别为3.82％、4.06％、1.58％。即，如果级分中的IL-10生产百分率大于级分总体的IL-10生产百分率，则表示实现了IL-10生产细胞(regDC)的富集。另外，显示出IL-10生产细胞在各级分中存在的比例越大，则越有可能以高精度检测出IL-10生产细胞(regDC)。
[表2]
Figure BDA0003188840240000201
[表3]
Figure BDA0003188840240000211
[表4]
Figure BDA0003188840240000221
实施例2：使用TKT3V1-7株的研究
作为包含抑制性树突状细胞的细胞群，使用将iPS细胞(TKT3V1-7株)供于实施例1中记载的方法而得到的细胞群。包含regDC的细胞群使用下表5所示的抗体组进行染色。
[表5]
Figure BDA0003188840240000231
用与实施例1相同的方法进行分析，标志物候选、以及各级分中的IL-10生产细胞百分率、IL-10生产细胞在各级分中的存在比例、级分比例示于下表6～10。表6～10分别为抗体组4～8的结果。
级分总体的IL-10生产百分率在抗体组4～8中分别为1.77％、2.01％、2.3％、3.48％、3.56％。
[表6]
Figure BDA0003188840240000241
[表7]
Figure BDA0003188840240000251
[表8]
Figure BDA0003188840240000261
[表9]
Figure BDA0003188840240000271
[表10]
Figure BDA0003188840240000281

Claims (14)

1.检测调节性树突状细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤a：在包含调节性树突状细胞的细胞群中，检测细胞表面上的1种以上分子的存在或不存在的步骤；和
步骤b：基于该1种以上分子的存在或不存在，鉴定调节性树突状细胞的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述1种以上分子为选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的至少1种分子。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述1种以上分子为选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的2种以上分子。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述包含调节性树突状细胞的细胞群为通过对多能干细胞进行分化诱导而得到的细胞群。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述多能干细胞为人诱导性多能干细胞。
6.制造富集有调节性树突状细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1：在包含调节性树突状细胞的细胞群中，检测细胞表面上的1种以上分子的存在或不存在的步骤；和
步骤2：基于该1种以上分子的存在或不存在，获得富集有调节性树突状细胞的细胞群的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述1种以上分子为选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的至少1种分子。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述1种以上分子为选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的2种以上分子。
9.富集调节性树突状细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤A：在包含调节性树突状细胞的细胞群中，检测细胞表面上的1种以上分子的存在或不存在的步骤；和
步骤B：基于该1种以上分子的存在或不存在，选择调节性树突状细胞的步骤。
10.富集有调节性树突状细胞的细胞群，其是通过权利要求6～9中任一项所述的方法得到的。
11.富集有调节性树突状细胞的细胞群，所述调节性树突状细胞表达或不表达选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的1种以上分子。
12.富集有调节性树突状细胞的细胞群，所述调节性树突状细胞表达或不表达选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的2种以上分子。
13.调节性树突状细胞的检测用试剂，其包含针对选自由CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50和CD84组成的组中的至少1种分子中每种的抗体。
14.药物组合物，其包含权利要求10～12中任一项所述的富集有调节性树突状细胞的细胞群。
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