TW202045718A - 細胞的檢測方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係揭示:一種方法,其為檢測控制性樹狀細胞之方法,其包含步驟a:在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中,檢測細胞表面上之1種以上分子之存在或不存在的步驟,及步驟b:基於該1種以上之分子之存在或不存在,鑑定控制性樹狀細胞的步驟;一種製造控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的方法,其包含步驟1:在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中,檢測細胞表面上之1種以上分子之存在或不存在的步驟,及步驟2:基於該1種以上之分子存在或不存在,得到控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的步驟;以及藉由該方法所得到的控制性樹狀細胞被富化之細胞集團。
Description
本發明係關於檢測控制性樹狀細胞之方法、製造控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的方法、富化控制性樹狀細胞之方法、控制性樹狀細胞被富化之細胞集團、控制性樹狀細胞之檢測用試藥、及包含該控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的醫藥組成物。
樹狀細胞係具有樹狀突起,在表現主要組織適合性抗原(MHC)類型II分子之免疫應答開始時,作為抗原呈現細胞的細胞。樹狀細胞從造血幹細胞,經由骨髓系統分化途徑,分化成未成熟樹狀細胞,再變為成熟樹狀細胞。
被微生物、病毒、異物等外來抗原侵襲的末梢炎症組織中,未成熟樹狀細胞吞噬此等而分化為成熟樹狀細胞,移行至所屬二次淋巴組織。再者,成熟樹狀細胞對初始T細胞賦予抗原刺激及共刺激,分化誘導抗原特異性效應T細胞,引起一次免疫應答(此種樹狀細胞(傳統樹狀細胞(conventional dendritic cell)),以下亦被稱為conDC)。
另一方面,在炎症環境下,亦存在共刺激分子之表現降低的樹狀細胞,此等樹狀細胞抑制性地控制T細胞,此暗示誘導對自體組織等的免疫寬容。此種樹狀細胞,稱為控制性樹狀細胞(regulatory dendritic cell;以下亦被稱為
regDC)。
如上述,由於控制性樹狀細胞暗示誘導免疫寬容,若能進行控制性樹狀細胞之補充及再生,可期待臟器移植時之免疫抑制(例如,達成無免疫抑制劑之臟器移植)、自體免疫疾病(例如,炎症性腸疾病)等之廣泛臨床應用。因此,嘗試從iPS細胞誘生造血前驅細胞(Hematopoietic Progenitor Cell;以下亦被稱為HPC),然後,從該HPC誘生骨髓前驅細胞(Myeloid Progenitor;以下亦稱為MP),繼而從該MP誘生樹狀細胞等。
例如,在非專利文獻1中,記載藉由將恆河猴之CD14+單核球於添加有GM-CSF、IL-4、維生素D3及IL-10之培養基中培養,誘生來自單核球之未成熟樹狀細胞。又,在非專利文獻2中,記載從人類iPS細胞誘生樹狀細胞,進一步確立藉由不含來自動物之成分(無異種來源(xeno-free))培養,從iPS細胞誘生樹狀細胞的方法。再者,在非專利文獻3中,記載從小鼠iPS細胞誘生控制性樹狀細胞,所得到之控制性樹狀細胞,於試管中及活體中二者,均顯示免疫反應控制作用,於試管中顯示控制性T細胞之生成能力。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1] AF Zahorchak et al., Transplantation, 84 (2007); 196-206
[非專利文獻2] S Senju et al., Gene Therapy, 18 (2011), 874-883
[非專利文獻3] Q Zhang et al., Scientific Reports, 4:3979, DOI:10.1038/srep03979
如上述,報導從恆河猴之單核球、小鼠iPS細胞等誘生控制性樹狀細胞的方法,然而依照此種方法所得到之細胞群中,亦包含conDC。考慮臨床應用等之情況,期望使用純粹之控制性樹狀細胞,然而關於控制性樹狀細胞之特異性標記迄今仍未知,鑑定及分離控制性樹狀細胞的方法仍未確立。
本發明之目的,為提供檢測控制性樹狀細胞之方法、製造控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的方法、富化控制性樹狀細胞之方法、控制性樹狀細胞被富化之細胞集團、控制性樹狀細胞之檢測用試藥、及包含該控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的醫藥組成物。
本發明人等,為達成上述目的而專心研究之結果,得到「在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中,檢測特定之細胞表面上分子之存在或不存在,可根據其結果鑑定及分離控制性樹狀細胞」的見識。
本發明即基於此等見識,進一步重覆檢討而完成者,係提供以下之檢測控制性樹狀細胞的方法、製造控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的方法、富化控制性樹狀細胞之方法、控制性樹狀細胞被富化之細胞集團、控制性樹狀細胞之檢測用試藥、及醫藥組成物者。
[1]一種方法,其為檢測控制性樹狀細胞之方法,其中,包含下列步驟:
步驟a:在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中,檢測細胞表面上1種以上之分子之存在或不存在的步驟,及
步驟b:基於該1種以上之分子之存在或不存在,鑑定控制性樹狀細胞的步驟。
[2]如[1]記載之方法,其中前述1種以上之分子為選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的至少1種分子。
[3]如[1]記載之方法,其中前述1種以上之分子,為選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的2種以上分子。
[3-1]如[1]記載之方法,其中前述1種以上之分子為CD200R及CD44。
[4]如[1]至[3-1]中任一項記載之方法,其中包含前述控制性樹狀細胞之細胞集團為藉由分化誘導多能性幹細胞所得到的細胞集團。
[5]如[4]記載之方法,其中前述多能性幹細胞為人類人工多能性幹細胞。
[6]一種方法,其為製造控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的方法,其包含下列步驟:
步驟1:在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中,檢測細胞表面上之1種以上分子之存在或不存在的步驟,及
步驟2:基於該1種以上之分子之存在或不存在,得到控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的步驟。
[7]如[6]記載之方法,其中前述1種以上之分子係選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的至少1種分子。
[8]如[6]記載之方法,其中前述1種以上之分子係選自CD99、CD183、
CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的2種以上分子。
[8-1]如[6]記載之方法,其中前述1種以上之分子為CD200R及CD44。
[9]一種方法,其為富化控制性樹狀細胞之方法,其中,包含下列步驟:
步驟A:在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中,檢測細胞表面上1種以上之分子之存在或不存在的步驟,及
步驟B:基於該1種以上之分子之存在或不存在,選擇控制性樹狀細胞的步驟。
[9-1]如[9]記載之方法,其中前述1種以上之分子為選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的至少1種分子。
[9-2]如[9]記載之方法,其中前述1種以上之分子為選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的2種以上分子。
[9-3]如[9]記載之方法,其中前述1種以上之分子為CD200R及CD44。
[10]一種控制性樹狀細胞被富化之細胞集團,其係藉由[6]至[9-3]中任一項記載之方法得到者。
[11]一種控制性樹狀細胞被富化之細胞集團,其係表現或不表現選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的至少1種以上之分子。
[12]一種控制性樹狀細胞被富化之細胞集團,其係表現或不表現選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、
CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的2種以上之分子。
[12-1]一種控制性樹狀細胞被富化之細胞集團,其係表現或不表現CD200R及CD44。
[13]一種控制性樹狀細胞之檢測用試藥,其包含分別針對選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中之至少1種分子的抗體。
[13-1]一種控制性樹狀細胞之檢測用試藥,其包含分別針對選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中之2種以上分子的抗體。
[13-2]一種控制性樹狀細胞之檢測用試藥,其包含分別針對CD200R及CD44之抗體。
[14]一種醫藥組成物,其包含如[10]至[12-1]中任一項記載的控制性樹狀細胞被富化之細胞集團。
若依照本發明,可在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中,檢測控制性樹狀細胞,並在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中將控制性樹狀細胞富化。
以下,針對本發明之實施態樣詳細地進行說明。
再者,在本說明書中,「包含(comprise)」,亦包含「本質上由…構成(essentially consist of)」之意義,及「只由…構成(consist of)」之意義。
本發明之檢測控制性樹狀細胞之方法,其特徵為包含下列步驟。
步驟a:在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中、檢測細胞表面上之1種以上之分子之存在或不存在的步驟,及
步驟b:基於該1種以上之分子之存在或不存在,鑑定控制性樹狀細胞的步驟。
本發明之製造控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的方法,其特徵為包含下列步驟。
步驟1:在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中,檢測細胞表面上之1種以上之分子之存在或不存在的步驟,及
步驟2:基於該1種以上之分子之存在或不存在,得到控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的步驟。
將本發明之控制性樹狀細胞富化之方法,其特徵為包含下列步驟。
步驟A:在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中,檢測細胞表面上之1種以上之分子之存在或不存在的步驟,及
步驟B:基於該1種以上之分子之存在或不存在,選擇控制性樹狀細胞的步驟。
在本說明書中,「細胞集團(population)」意指相同種類或相異種類之1種以上細胞。「細胞集團(population)」亦意指相同種類或相異種類的細胞之一塊(mass)。
在本說明書中,「使…富化(enrich)」及「富化(enrichment)」意指使細胞組成物等組成物中的特定構成成分之量增加;「被富化(enriched)」意指,細胞之組成物(在例如為了說明細胞集團而予以使用的情況)之特定構成成分之
量比被富化前之細胞集團中該構成成分之比率增加的細胞集團。例如,可將細胞集團等組成物,針對標的細胞型進行富化,因此,標的細胞型之比率比被富化前之細胞集團內所存在的標的細胞之比率增加。在本發明之特定實施態樣中,藉由將標的細胞集團富化之方法,使細胞集團中的標的細胞集團至少被富化成占1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%(亦即,標的細胞集團之比率增加)。又,在本發明之特定實施態樣中,藉由將標的細胞集團富化之方法,被富化之細胞集團變得包含至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%、或100%之標的細胞集團。
在本說明書中,「細胞表面上1種以上之分子之存在或不存在」,意指在分子為2種以上之情況,判斷各分子分別存在或不存在(例如,關於某分子,被判斷存在,而關於其他分子,被判斷不存在的情況等)(關於類似之表達亦具有相同之意味)。
在本說明書中,「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」意指胚性幹細胞(ES細胞)及潛在地具有與其同樣之分化多能性,亦即分化成活體之各種組織(內胚葉、中胚葉、外胚葉全部)之能力的細胞。就具有與ES細胞同樣之分化多能性的細胞而言,可列舉「人工多能性幹細胞」(在本說明書中,亦被稱為「iPS細胞」)。
在本發明中,「控制性樹狀細胞」意指即使於炎症環境下,共刺激分子之表現仍然降低的樹狀細胞,其為抑制性地控制T細胞,誘導針對自體組織等之免疫寬容的細胞,較佳為表現CD11b及CD11c(CD11b/c雙陽性)之「樹狀細胞」中,表現介白素10(IL-10)產生能力的細胞。表現IL-10產生能力之細
胞,意指實質上產生IL-10的細胞,細胞之IL-10之產生可依照流式細胞術等周知之方法檢測。
本發明所用的控制性樹狀細胞無特別限制,例如,可為依照周知之手法(例如,非專利文獻1及3記載之手法),於試管中誘生的控制性樹狀細胞(例如,藉由分化誘導多能性幹細胞而得到之控制性樹狀細胞),或亦可為從活體組織藉由周知之手法單離的控制性樹狀細胞。
就前述多能性幹細胞而言,例如,可列舉胚性幹細胞(embryonic stem cell:ES細胞)、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell:iPS細胞)、胚性腫瘤細胞(EC細胞)、胚性生殖幹細胞(EG細胞),較佳為iPS細胞(更佳為人類iPS細胞)。在上述多能性幹細胞為ES細胞或源自人類胚之任何細胞的情況,該細胞可為破壞胚而製作之細胞,或亦可為不破壞胚而製作之細胞,較佳為不破壞胚而製作之細胞。
就「ES細胞」而言,若為小鼠ES細胞,可利用Ingenious targeting laboratory公司、理研(理化學研究所)等所建立的各種小鼠ES細胞株,若為人類ES細胞,可利用威斯康辛大學、NIH、理研、京都大學、日本國立成育醫療研究中心、Cellartis公司等所建立的各種人類ES細胞株。例如,就人類ES細胞株而言,可利用ESI Bio公司分售之CHB-1~CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1~HUES28株等、WiCell Research分售之H1株、H9株等、理研分售之KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。
「人工多能性幹細胞」意指藉由在哺乳動物體細胞或未分化幹細胞中,導入特定之因子(核初期化因子),再進行程序編排所得到的細胞。現今,
「人工多能性幹細胞」方面有各式各樣者,除依照山中氏等,藉由在小鼠纖維母細胞中導入4因子:Oct3/4‧Sox2‧Klf4‧c-Myc而建立的iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)外,亦可使用:將同樣之4因子導入人類纖維母細胞而建立的源自人類細胞之iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,et al.Cell,(2007)131:861-872.);導入上述4因子後,以Nanog之表現作為指標篩選而建立的Nanog-iPS細胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.);藉由不含c-Myc之方法而製作的iPS細胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.Nature Biotechnology,(2008)26,101-106);藉由無病毒法導入6因子而建立的iPS細胞(Okita K et al.Nat.Methods 2011 May;8(5):409-12,Okita K et al.Stem Cells.31(3):458-66.)。又,亦可使用依照Thomson氏等所製作的導入OCT3/4‧SOX2‧NANOG‧LIN28之4因子而建立的人工多能性幹細胞(Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318:1917-1920.);藉由Daley氏等所製作之人工多能性幹細胞(Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451:141-146);藉由櫻田氏等所製作之人工多能性幹細胞(日本國特開2008-307007號公報)等。
此外,亦可使用公開之所有論文(例如,Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574;Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650;Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797);或者專利(例如,日本特開2008-307007號公報、日本特開2008-283972號公報、美國專利申請案公開第2008/2336610號說明書、美國專利申請案公開第2009/047263號說明書、國際公開第2007/069666號、國際公開第2008/118220號、國際公開第2008/124133號、國際公開第2008/151058號、國際公開第2009/006930號、國際公開第2009/006997號、國際公開第2009/007852
號)中所記載而在該領域周知的人工多能性幹細胞之任一種。
就人工多能性細胞株而言,可利用NIH、理研、京都大學等所建立的各種iPS細胞株。例如,若為人類iPS細胞株,可列舉理研之HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大學之253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等。
可藉由將多能性幹細胞付諸於本身周知之方法,製造控制性樹狀細胞。在多能性幹細胞為iPS細胞之情況,例如,可依照國際公開第2017/221975號及Cell Reports 2(2012)1722-1735記載的方法,製造造血前驅細胞。再者,例如,可依照非專利文獻1~3記載的方法,從該造血前驅細胞誘生骨髓前驅細胞,繼而從該骨髓前驅細胞誘生樹狀細胞,製造控制性樹狀細胞。
又,就將上述之控制性樹狀細胞單離之活體組織而言,只要含有控制性樹狀細胞,無任何限制,例如,可列舉淋巴節、胸腺、脾臟、腸管、皮膚等。
本發明所用的控制性樹狀細胞及多能性幹細胞,從對治療適用之觀點而言,以GMP(Good Manufacturing Practice)規格之細胞為較佳。
在本說明書中,將可進行控制性樹狀細胞之檢測、富化及/或分離的細胞表面上之分子,稱為「regDC標記」。
就regDC標記而言,以選自CD99、CD183(CXCR3)、CD107a、CD366(Tim3)、CD172a(SIRPa)、CD200R、CD44、CD206(MR)、CD181(CXCR1)、CD354(TREM1)、CD300c、CD50及CD84構成之群組的至少1種分子為較佳。就regDC標記之組合而言,例如,可列舉2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種或13種分子之任意組合。其中,以選自CD99、
CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84構成之群組中的2種以上分子之組合為較佳。
在本說明書中,以在細胞表面上之存在作為指標的標記,稱為「regDC陽性標記」,以在細胞表面上之不存在作為指標的標記,稱為「regDC陰性標記」。又,在本發明中,將存在前述regDC陽性標記的細胞,稱為regDC標記陽性細胞,例如,在表現CD200R分子之細胞的情況,稱為CD200R陽性細胞。又,在本發明中,將不存在前述regDC陰性標記之細胞,稱為regDC標記陰性細胞,例如,在不表現CD44分子之細胞的情況,稱為CD44陰性細胞。
在本發明中,各regDC標記並不限定只用作regDC陽性標記及regDC陰性標記之任一者。就可作為regDC陽性標記及regDC陰性標記之兩者使用的情況而言,例如,關於某regDC標記,在控制性樹狀細胞之檢測的情況,可作為regDC陽性標記使用,而在控制性樹狀細胞之富化的情況,可作為regDC陰性標記使用。又,在將2種regDC標記組合的檢測及富化之情況,regDC陽性標記及regDC陰性標記之組合成為4種,然而於控制性樹狀細胞之檢測及富化中,有時亦可使用其中2種以上之組合(例如,關於regDC標記A、B,有A+B+、A-B-、A+B-、A-B+之4種組合,不過有時可使用其中2種以上之組合(例如,A+B+及A+B-)。又,檢測及富化,可使用相異的組合。此在使用3種以上regDC標記之組合的情況亦相同。
就regDC標記之2種分子的組合,具體而言,可列舉以下者。CD99及CD183、CD99及CD107a、CD99及CD366、CD99及CD172a、CD99及CD200R、CD99及CD44、CD99及CD206、CD99及CD181、CD99及CD354、CD99及CD300c、CD99及CD50、CD99及CD84、CD183及CD107a、CD183
及CD366、CD183及CD172a、CD183及CD200R、CD183及CD44、CD183及CD206、CD183及CD181、CD183及CD354、CD183及CD300c、CD183及CD50、CD183及CD84、CD107a及CD366、CD107a及CD172a、CD107a及CD200R、CD107a及CD44、CD107a及CD206、CD107a及CD181、CD107a及CD354、CD107a及CD300c、CD107a及CD50、CD107a及CD84、CD366及CD172a、CD366及CD200R、CD366及CD44、CD366及CD206、CD366及CD181、CD366及CD354、CD366及CD300c、CD366及CD50、CD366及CD84、CD172a及CD200R、CD172a及CD44、CD172a及CD206、CD172a及CD181、CD172a及CD354、CD172a及CD300c、CD172a及CD50、CD172a及CD84、CD200R及CD44、CD200R及CD206、CD200R及CD181、CD200R及CD354、CD200R及CD300c、CD200R及CD50、CD200R及CD84、CD44及CD206、CD44及CD181、CD44及CD354、CD44及CD300c、CD44及CD50、CD44及CD84、CD206及CD181、CD206及CD354、CD206及CD300c、CD206及CD50、CD206及CD84、CD181及CD354、CD181及CD300c、CD181及CD50、CD181及CD84、CD354及CD300c、CD354及CD50、CD354及CD84、CD300c及CD50、CD300c及CD84、CD50及CD84。
其中就較佳之regDC標記之2種分子的組合而言,可列舉CD99及CD183、CD99及CD107a、CD99及CD366、CD99及CD200R、CD99及CD44、CD99及CD300c、CD99及CD50、CD99及CD84、CD183及CD107a、CD183及CD366、CD183及CD44、CD107a及CD366、CD107a及CD200R、CD172a及CD206、CD172a及CD200R、CD172a及CD44、CD200R及CD44、CD200R及CD206、CD44及CD206、CD44及CD300c、CD44及CD50、CD44及CD84、
CD181及CD354、CD300c及CD50、CD50及CD84。
在控制性樹狀細胞之富化的情況,就較佳之regDC標記之2種分子的組合而言,可列舉CD99及CD183(N(陰性):P(陽性),P:P,P:N)、CD99及CD107a(P:P,P:N,N:N)、CD99及CD366(N:N)、CD99及CD200R(N:P,P:P)、CD99及CD44(N:P,P:P,P:N)、CD99及CD300c(P:P,P:N,N:N)、CD99及CD50(N:P,P:P,P:N)、CD99及CD84(N:P,P:P)、CD183及CD107a(P:N,N:N)、CD183及CD366(P:P,P:N,N:N)、CD183及CD44(N:P,P:P)、CD107a及CD366(N:P,N:N)、CD107a及CD200R(N:P,P:P)、CD172a及CD206(N:N)、CD172a及CD200R(N:P,P:P)、CD172a及CD44(N:N)、CD200R及CD44(P:P,P:N)、CD200R及CD206(P:P,P:N)、CD44及CD206(N:N)、CD44及CD300c(P:P,P:N,N:N)、CD44及CD50(N:P,P:P,P:N)、CD44及CD84(P:P,N:P)、CD181及CD354(N:P,P:P)、CD300c及CD50(N:P,P:P,N:N)、CD50及CD84(P:N,P:P)。再者,括弧內表示作為陽性標記(P)及陰性標記(N)之較佳組合(以下亦相同)。例如,「CD99及CD183(N:P)」之記載,表示以CD99作為regDC陰性標記,CD183作為regDC陽性標記使用為較佳。
就更佳之regDC標記之2種分子的組合而言,可列舉CD99及CD107a(N:N)、CD99及CD200R(P:P)、CD99及CD44(P:P,P:N)、CD99及CD50(N:P,P:P)、CD183及CD107a(P:N)、CD107a及CD366(N:P)、CD172a及CD200R(N:P,P:P)、CD200R及CD44(P:N)、CD200R及CD206(P:N)、CD44及CD50(N:P,P:P)、CD44及CD84(N:P)、CD300c及CD50(N:P,P:P)、CD50及CD84(P:N,P:P)。
就進一步更佳之regDC標記之2種分子的組合而言,可列舉CD99及CD50(N:P,P:P)、CD172a及CD200R(N:P)、CD200R及CD44(P:N)、CD200R
及CD206(P:N)、CD44及CD50(N:P,P:P)、CD44及CD84(N:P)、CD300c及CD50(N:P,P:P)、CD50及CD84(P:N,P:P)。
就進一步再更佳之regDC標記之2種分子的組合而言,可列舉CD99及CD50(N:P,P:P)、CD200R及CD44(P:N)、CD200R及CD206(P:N)、CD44及CD50(N:P,P:P)、CD300c及CD50(N:P,P:P)、CD50及CD84(P:P)。
就進一步特佳之regDC標記之2種分子的組合而言,可列舉CD200R及CD44(P:N)之組合。
在控制性樹狀細胞之檢測的情況,就較佳之regDC標記之2種分子的組合而言,可列舉CD99及CD183(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD99及CD107a(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD99及CD366(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD99及CD200R(N:P,P:P,N:N)、CD99及CD44(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD99及CD300c(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD99及CD50(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD99及CD84(N:P,P:P,N:N)、CD183及CD107a(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD183及CD366(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD183及CD44(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD107a及CD366(N:P,P:P,N:N)、CD107a及CD200R(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD172a及CD206(N:P,P:N,N:N)、CD172a及CD200R(N:P,P:P,N:N)、CD172a及CD44(N:P,P:N,N:N)、CD200R及CD44(P:P,P:N,N:N)、CD200R及CD206(P:P,P:N)、CD44及D206(N:P,P:P,N:N)、CD44及CD300c(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD44及CD50(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD44及CD84(N:P,P:P,N:N)、CD181及CD354(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD300c及CD50(N:P,P:P,P:N,N:N)、CD50及CD84(N:P,P:P,P:N,N:N)。
就更佳之regDC標記之2種分子的組合而言,可列舉CD99及CD183(N:P)、CD99及CD107a(N:N)、CD99及CD366(N:P)、CD99及CD200R
(N:P)、CD99及CD44(N:N)、CD99及CD300c(N:N)、CD99及CD50(N:P)、CD99及CD84(N:N)、CD183及CD107a(P:N)、CD183及CD44(P:N)、CD172a及CD206(N:N)、CD172a及CD200R(N:P)、CD172a及CD44(N:N)、CD200R及CD44(P:N)、CD200R及CD206(P:N)、CD44及CD206(N:N)、CD44及CD50(N:P)、CD44及CD84(N:P)、CD181及CD354(N:P)、CD300c及CD50(N:P)、CD50及CD84(P:N)。
就進一步更佳之regDC標記之2種分子的組合而言,可列舉CD99及CD183(N:P)、CD99及CD107a(N:N)、CD99及CD200R(N:P)、CD99及CD44(N:N)、CD99及CD50(N:P)、CD183及CD107a(P:N)、CD183及CD44(P:N)、CD172a及CD206(N:N)、CD172a及CD200R(N:P)、CD172a及CD44(N:N)、CD200R及CD44(P:N)、CD200R及CD206(P:N)、CD44及CD206(N:N)、CD181及CD354(N:P)。
就進一步再更佳之regDC標記之2種分子的組合而言,可列舉CD172a及CD200R(N:P)、CD172a及CD44(N:N)、CD200R及CD44(P:N)。
就進一步特佳之regDC標記之2種分子的組合而言,可列舉CD200R及CD44(P:N)之組合。
本說明書中的檢測、選擇及鑑定,並非意指僅對控制性樹狀細胞進行特異的檢測、選擇及鑑定,亦容許同時對具有regDC標記之其他種類細胞進行檢測、選擇及鑑定。
在本發明中,「分子存在」意指藉由檢測細胞時所使用之方法可檢測到分子,「分子不存在」意指藉由檢測細胞時所使用之方法的檢測感度無法檢測到分子。
在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中,就檢測及分離存在1種以上之regDC陽性標記之細胞,及/或不存在1種以上之regDC陰性標記之細胞的方法而言,可列舉使用流式細胞術(flow cytometry)及質譜細胞術(mass cytometry)的方法、磁性細胞分離法等,此等方法可使用周知之方法實施。例如,存在1種以上regDC陽性標記之細胞,及/或不存在1種以上regDC陰性標記之細胞,可藉由包含使該細胞與各regDC標記特異地結合之物質(例如:抗體)接觸之步驟的方法檢測及分離。上述物質方面,亦包含其本身附加可檢測之標識(例:GFP)者、及其本身未附加標識者。在上述物質為其本身未附加標識者的情況,藉由進一步使用直接或間接識別該物質而附加有可檢測之標識的物質,變得可進行上述檢測及分離。例如,在該物質為抗體之情況,使螢光色素、金屬同位素或珠粒(例如:磁珠)直接或間接地承載於該抗體,藉其可將細胞表面之regDC標記進行標識,基於該標識,可檢測細胞。此時所用之抗體,可為僅只1種,或2種以上之抗體。
又,本發明中的「得到控制性樹狀細胞被富化之細胞集團」、「選擇控制性樹狀細胞」,意指與「從包含控制性樹狀細胞之細胞集團,基於regDC標記,將控制性樹狀細胞分離」同義。
若依照本發明之方法,藉由使用regDC標記,可在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中檢測控制性樹狀細胞,並可在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中將控制性樹狀細胞富化。
本發明之細胞集團,其特徵為可將表現或不表現選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的至少1種以上分子之控制性樹狀細胞
富化。
該細胞集團可藉由例如前述製造本發明之控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的方法,及將本發明之控制性樹狀細胞富化的方法而得到。
在本發明中,「分子表現」意指藉由檢測細胞時所使用的方法,可檢測出分子,「分子不表現」意指檢測細胞時所使用之方法的檢測感度,無法檢測出分子。
本發明之細胞集團中的「將控制性樹狀細胞富化」意指表現1種以上regDC陽性標記,及/或表現1種以上之regDC陰性標記的控制性樹狀細胞之比率(該控制性樹狀細胞數/細胞集團所含之全細胞數),為比先前之細胞集團高的比率。其中,控制性樹狀細胞之比率以1%以上、2%以上、3以上%、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或100%為較佳。
本發明之細胞集團,由於將控制性樹狀細胞富化,而具有優良之免疫寬容誘導作用。
本發明之控制性樹狀細胞的檢測用試藥,其特徵為包含分別針對選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84構成之群組中的至少1種分子之抗體。
在本發明之檢測用試藥為針對2種以上regDC標記之抗體的情況,該試藥可將各抗體包含於各別試藥中,作為試藥套組而提供。本發明之檢測用試藥所含的抗體,例如,可藉由與螢光色素、金屬同位素或珠粒(例:磁珠)結合的形式提供。又,本發明之試藥可包含上述以外之抗體(例如:可檢測控制性
樹狀細胞的其他抗體)等。
本發明之控制性樹狀細胞之檢測用試藥,由於包含針對regDC標記之抗體,可使用於上述之檢測本發明之控制性樹狀細胞的方法、製造控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的方法、及將控制性樹狀細胞富化之方法。
本發明之醫藥組成物,其特徵為包含上述控制性樹狀細胞被富化的細胞集團。
本發明之醫藥組成物,由於包含此種控制性樹狀細胞被富化的細胞集團,所以可抑制或避免亢進之免疫反應。
本發明之醫藥組成物,依照周知之手段,將有效量之上述控制性樹狀細胞被富化之細胞集團與藥學上可容許之擔體混合等,可製造作為經口/非經口製劑。本發明之醫藥組成物,通常可製造作為注射劑、懸浮劑、點滴劑等之非經口製劑。就藥學上可容許之擔體而言,例如,可列舉賦形劑、無痛化劑、緩衝劑、保存料、安定劑、懸浮劑、等張化劑、界面活性劑等。
本發明之醫藥組成物的投與量,可依據患者之體重、年齡、性別、症狀等各種條件而適宜決定。本發明之醫藥組成物適用於包含人類之哺乳動物。
本發明之醫藥組成物有助於在臟器移植中的排斥反應、自體免疫疾病(例如:克隆氏病、潰瘍性大腸炎、乳糜瀉、風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、乾癬、多發性硬化症、肌萎縮性側索硬化症、發作性睡病、巴金森氏病)、過敏疾病(例如:花粉症、食品過敏、藥劑過敏、氣喘、異位性皮膚炎、濕疹、食物過敏症、蕁麻疹、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎)、以及移植物抗宿主疾病的治療及/或預防。
[實施例]
以下,為將本發明進一步詳細說明,列舉實施例。然而,本發明不受此等實施例等之任何限定。
實施例1:使用Ff-I01s04株之檢討
就包含造血前驅細胞(HPC)之細胞集團而言,使用將iPS細胞(Ff-I01s04株)依據周知之方法(例如,Cell Reports,2(2012),1722-1735及國際公開第2017/221975號記載之方法)分化的浮游細胞集團。具體而言,將Ff-I01s04株以3×105個/孔播種(第0日)在經超低接著處理之6孔培養盤中,於EB培養基(在StemPro34中添加10μg/ml人類胰島素、5.5μg/ml人類轉鐵蛋白、5ng/ml亞硒酸鈉、2mM L-麩醯胺酸、45mM α-單硫甘油、及50μg/ml抗壞血酸)中添加10ng/ml BMP4、5ng/ml bFGF、15ng/ml VEGF、2μM SB431542,在低氧條件下(5% 02)進行5日培養(第5日)。繼而,添加50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml Flt3L,進一步進行5~9日培養(至第14日),得到浮游細胞集團。並且,於培養期間中每2日或3日進行培養基交換。
繼而,就包含控制性樹狀細胞(regDC)之細胞集團而言,使用將上述所得到之HPC依據周知之方法(例如:Transplantation 84:196-206,2007、Gene Therapy 18:874-883,2011、Scientific Reports 4:3979,2014)分化的細胞集團。具體而言,將HPC以1×105個/孔播種於6孔培養盤中,於DC培養基(將巨噬細胞-SFM及CTS OpTmizer T Cell Expansion SFM以1:1混合者)中添加20ng/ml GM-CSF、20ng/ml M-CSF,培養11日(Day14~25),得到骨髓前驅細胞。並且,於培養期間中,每3日或4日進行培養基交換。將所得到之骨髓前驅細胞以1×106個/孔於6孔培養盤中,在DC培養基中添加20ng/ml GM-CSF、20ng/ml IL-4、20ng/ml IL-10、20nM維生素D3,進行7~8日培養(Day25~32、33),得到包含regDC
的細胞集團。並且,在培養期間中添加2次(Day27及Day28)上述細胞激素。在包含regDC之上述細胞集團中,為鑑定IL-10產生細胞,使用表1所示的抗體組染色。
將細胞分注於96孔V底培養盤,以300g,於室溫下進行離心5分鐘。除去上清液後,添加100μl之針對表面分子之抗體及細胞染色緩衝液(autoMACS Rinsing Solution,Miltenyi)的混合液,於4℃靜置20分鐘。然後,添加150μl的細胞染色緩衝液,並以300g,於室溫下進行離心5分鐘。除去上清液,添加100μl的細胞固定液(Fixation buffer,Biolegend),於室溫靜置15分鐘後,添加100μl的細胞內染色緩衝液(Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer,Biolegend),以300g,於室溫下進行離心5分鐘。除去上清液,添加100μl之IL-10抗體與細胞內染色緩衝液的混合液,在室溫靜置20分鐘。然後,添加150μl的細胞內染色緩衝液,以300g,於室溫下進行離心5分鐘。除去上清液後添加200μl之細胞染色緩衝液並移至5ml試管,使用於流式細胞儀之解析。使用流式細胞儀FACS LSR Fortessa X20而取得數據,並藉由FlowJo軟體解析數據。
解析在包含regDC之細胞集團中,於DC標記(CD11b及CD11c)陽性細胞中的IL-10產生細胞(regDC)上各表面標記的表現分布。具體而言,藉由各個抗體組中之2個標記,分劃為包含regDC之4個細胞集團(陰性+陽性、陽性+陽性、陽性+陰性、陰性+陰性),算出在該分劃(fraction)中IL-10產生細胞所占的比率。將候選標記及各個分劃中之IL-10產生細胞率(各個部分中IL-10產生細胞所占之比率)、IL-10產生細胞於各分劃中存在的比率(於各分劃中之IL-10產生細胞之中,表現或不表現各標記之細胞的比率)、分劃比率示於以下之表2至4中。表2至4分別為抗體組1至3之結果。
全部分劃之IL-10產生率,在抗體組1至3中,分別為3.82%、
4.06%、1.58%。亦即,若分劃中之IL-10產生率比全部分劃之IL-10產生率大,則表示可將IL-10產生細胞(regDC)富化。又,IL-10產生細胞存在於各分劃中之比率越大,表示越能以高精度檢測IL-10產生細胞(regDC)。
實施例2:使用TKT3V1-7株之檢討
就包含抑制性樹狀細胞之細胞集團而言,使用將iPS細胞(TKT3V1-7株)付諸於實施例1記載之方法所得到的細胞集團。包含regDC之細胞集團,使用以下之表5所示的抗體組進行染色。
藉由與實施例1同樣之方法解析,將候選標記及各個分劃中之IL-10產生細胞率、IL-10產生細胞存在於各分劃中之比率、分劃比率示於以下之表6至10。表6至10分別為抗體組4至8之結果。
全部分劃之IL-10產生率,在抗體組4至8中,分別為1.77%、
2.01%、2.3%、3.48%、3.56%。
Claims (14)
- 一種檢測控制性樹狀細胞之方法,其包含下列步驟:步驟a:在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中,檢測細胞表面上之1種以上分子之存在或不存在的步驟,及步驟b:基於該1種以上之分子之存在或不存在,鑑定控制性樹狀細胞的步驟。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,前述1種以上之分子為選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的至少1種之分子。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,前述1種以上之分子為選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的2種以上之分子。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法,其中,包含前述控制性樹狀細胞之細胞集團為藉由將多能性幹細胞分化誘導所得到的細胞集團。
- 如申請專利範圍第4項所述之方法,其中前述多能性幹細胞為人類人工多能性幹細胞。
- 一種製造控制性樹狀細胞被富化之細胞集團的方法,其包含下列步驟:步驟1:在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中,檢測細胞表面上之1種以上分子之存在或不存在的步驟,及步驟2:基於該1種以上之分子之存在或不存在,得到控制性樹狀細胞被富 化之細胞集團的步驟。
- 如申請專利範圍第6項所述之方法,其中,前述1種以上之分子為選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的至少1種之分子。
- 如申請專利範圍第6項所述之方法,其中,前述1種以上之分子為選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的2種以上之分子。
- 一種將控制性樹狀細胞富化之方法,其包含下列步驟:步驟A:在包含控制性樹狀細胞之細胞集團中,檢測細胞表面上之1種以上分子之存在或不存在的步驟,及步驟B:基於該1種以上之分子之存在或不存在,選擇控制性樹狀細胞的步驟。
- 一種控制性樹狀細胞被富化之細胞集團,其係藉由如申請專利範圍第6至9項中任一項所述之方法而得到者。
- 一種控制性樹狀細胞被富化之細胞集團,其係表現或不表現選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的至少1種以上之分子。
- 一種控制性樹狀細胞被富化之細胞集團,其係表現或不表現選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、CD300c、CD50及CD84所構成之群組中的2種以上之分子。
- 一種控制性樹狀細胞之檢測用試藥,其包含分別針對選自CD99、CD183、CD107a、CD366、CD172a、CD200R、CD44、CD206、CD181、CD354、 CD300c、CD50及CD84所構成之群組中之至少1種分子的抗體。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第10至12項中任一項所述之控制性樹狀細胞被富化之細胞集團。
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