CN109415699A - Cd4cd8双阳性t细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种CD4CD8双阳性T细胞的制备方法，其包括以下工序：(1)在培养液中培养多能性干细胞，诱导造血祖细胞的步骤；(2)在含有p38抑制剂和/或SDF‑1的培养液中培养上述步骤(1)中得到的造血祖细胞，诱导CD4CD8双阳性T细胞的步骤。

Description

CD4CD8双阳性T细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及从造血祖细胞制备CD4CD8双阳性T细胞的方法、从多能性干细胞制备CD4CD8双阳性T细胞的方法、以及从该CD4CD8双阳性T细胞制备CD8阳性T细胞的方法。
背景技术
认为T细胞在针对细菌或病毒等外来病原体或癌细胞等异常细胞的免疫系统中发挥中心作用，但由于各种原因而T细胞的功能发生降低，而变为易感染性或罹患癌症等。如果能够对于这样的疾病进行免疫细胞等的补充、再生，则会成为对于疾病的病情改善或治疗效果的提高等极为有效的手段。在这样的免疫细胞的补充疗法中，强烈要求负责细胞免疫的T淋巴细胞的功能补充、再生，但现在尚未建立有效的治疗方法。
作为这样的T淋巴细胞的补充疗法，提出了将抗原特异性的T细胞受体(TCR)基因在各种淋巴细胞类细胞中进行基因导入，而补充或赋活*特异性免疫反应的方案(非专利文献1或2)。在这些尝试中，作为基因导入细胞，使用了作为骨髓祖细胞的CD34阳性细胞、天然T淋巴细胞等，但存在许多问题：它们在Ex-vivo中的自我再生能力低、基因导入的效率低、难以进行基于基因导入的分化的调节等。
另外，也提出了使用了从iPS细胞等多能性干细胞诱导而成的T淋巴细胞的补充疗法(非专利文献3或专利文献1)。在从多能性干细胞诱导T淋巴细胞的方法中，提出了(1)从多能性干细胞诱导造血祖细胞的步骤、(2)从造血祖细胞诱导CD4CD8双阴性细胞的步骤、(3)从CD4CD8双阴性细胞诱导CD4CD8双阳性细胞的步骤、以及(4)从CD4CD8双阳性细胞诱导T淋巴细胞的步骤。
对于(1)的步骤，已知从多能性干细胞形成网状结构物Sac(ES-sac)来制备造血祖细胞的方法(非专利文献4)。另外，对于(2)和(3)的步骤，已知在OP9-DL1细胞层上用添加了IL-7和Flt-3L的培养基进行培养的方法(非专利文献5或6)。此外，对于(4)的步骤，已知用添加了抗CD3抗体(OKT-3)和IL-2的培养基进行培养的方法。
另外，专利文献2中公开了利用添加了维生素C类的培养液从多能性干细胞制备CD4CD8双阳性T细胞的方法。
但是，利用这些方法从多能性干细胞制备T淋巴细胞的效率并不充分，希望进行改良。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO 2011/096482
专利文献2：WO 2016/076415
非专利文献
非专利文献1：Gattinoni L,et al.,Nat Rev Immunol.6(5):383-393,2006非
专利文献2：Morgan RA,et al.,Science.314(5796):126-129,2006
非专利文献3：Nishimura T,et al.,Cell Stem Cell.12(1):114-126,2013.
非专利文献4：Takayama N,et al.,Blood.111(11):5298-5306,2008
非专利文献5：Timmermans F,et al.,J Immunol.182(11):6879-6888,2009
非专利文献6：Ikawa T,et al.,Science.329(5987):93-96,2010
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于从造血祖细胞高效地制备CD4CD8双阳性T细胞、以及从多能性干细胞高效地制备CD4CD8双阳性T细胞。
解决问题的方法
本发明的发明人为了达到上述目的，为了从造血祖细胞高效地诱导CD4CD8双阳性T细胞而进行了有效的物质的探索。其结果发现，通过在培养液中添加p38抑制剂和/或SDF-1来培养造血祖细胞，可有效地诱导CD4CD8双阳性T细胞，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下的发明。
[1]一种制备CD4CD8双阳性T细胞的方法，其包括在含有p38抑制剂和/或SDF-1的培养液中培养造血祖细胞，诱导CD4CD8双阳性T细胞的步骤。
[2]根据[1]所述的方法，其中，上述培养液含有p38抑制剂和SDF-1。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，上述p38抑制剂为SB203580。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，在上述步骤中，培养液含有维生素C类。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，上述步骤利用贴壁培养进行。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，上述造血祖细胞的培养不使用饲养细胞。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，上述造血祖细胞是从多能性干细胞分化诱导而成的造血祖细胞。
[8]根据[7]所述的方法，其中，多能性干细胞为人工多能性干细胞。
[9]根据[8]所述的方法，其中，人工多能性干细胞来自T细胞以外的体细胞。
[10]根据[8]或[9]所述的方法，其中，人工多能性干细胞为导入了嵌合抗原受体的人工多能性干细胞。
[11]一种CD4CD8双阳性T细胞的制备方法，其包括以下步骤：
(1)在培养液中培养多能性干细胞，诱导造血祖细胞的步骤；
(2)在含有p38抑制剂和/或SDF-1的培养液中培养上述步骤(1)中得到的造血祖细胞，诱导CD4CD8双阳性T细胞的步骤。
[12]根据[11]所述的方法，其中，在上述步骤(2)中，培养液含有p38抑制剂和SDF-1。
[13]根据[11]或[12]所述的方法，其中，上述p38抑制剂为SB203580。
[14]根据[11]～[13]中任一项所述的方法，其中，上述步骤(1)利用悬浮培养进行。
[15]根据[11]～[14]中任一项所述的方法，其中，上述步骤(2)利用贴壁培养进行。
[16]根据[11]～[15]中任一项所述的方法，其中，在上述步骤(1)和(2)中，培养液含有维生素C类。
[17]根据[11]～[16]中任一项所述的方法，其中，在上述步骤(1)和(2)中，培养不使用饲养细胞。
[18]根据[11]～[17]中任一项所述的方法，其中，多能性干细胞为人工多能性干细胞。
[19]根据[18]所述的方法，其中，人工多能性干细胞来自除了T细胞以外的体细胞。
[20]根据[18]或[19]所述的方法，其中，人工多能性干细胞为导入了嵌合抗原受体的人工多能性干细胞。
[21]一种CD8阳性T细胞的制备方法，其包括：利用[1]～[20]中任一项所述的方法制备CD4CD8双阳性T细胞的步骤；以及在添加了肾上腺皮质激素剂的培养液中培养所得到的CD4CD8双阳性T细胞而得到CD8阳性T细胞的步骤。
[22]细胞制剂，其包含通过[1]～[20]中任一项所述的方法得到的CD4CD8双阳性T细胞和/或通过[21]的方法得到的CD8阳性T细胞。
发明的效果
根据本发明，能够从造血祖细胞高效地制备CD4CD8阳性T细胞。另外，能够从多能性干细胞高效地制备CD4CD8阳性T细胞。此外，通过在培养液中添加肾上腺皮质激素剂，能够从CD4CD8双阳性T细胞高效地制备CD8阳性T细胞。
附图说明
图1示出了从iPS细胞(TkT3V1-7)分化诱导而成的细胞的流式细胞术的结果。从左依次示出了以CD45和SSC的染色强度展开的图、以CD7和CD3的染色强度展开的图、以CD7和CD5的染色强度开的图、以CD8和CD4的染色强度展开的图。上段表示不添加SB203580和SDF-1α的结果，下段表示添加了SB203580和SDF-1α的结果。
图2示出了从iPS细胞(Ffl-01)分化诱导而成的细胞的流式细胞术的结果。从左依次示出了以CD45和SSC的染色强度展开的图、以CD7和CD3的染色强度展开的图、以CD7和CD5的染色强度展开的图、以CD8和CD4的染色强度展开的图。上段表示不添加SB203580和SDF-1α的结果，下段表示添加了SB203580和SDF-1α的结果。
图3示出了从iPS细胞(Ffl-14)分化诱导而成的细胞的流式细胞术的结果。从左依次表示以CD45和SSC的染色强度展开的图、以CD7和CD3的染色强度展开的图、以CD7和CD5的染色强度展开的图、以CD8和CD4的染色强度展开的图。上段表示不添加SB203580和SDF-1α的情况的结果，下段表示添加了SB203580和SDF-1α的结果。
图4示出了从ES细胞(KhES-3)分化诱导而成的细胞的流式细胞术的结果。从左依次表示以CD45和SSC的染色强度展开的图、以TCRab和CD3的染色强度展开的图、以CD7和CD5的染色强度展开的图、以CD8和CD4的染色强度展开的图。上段表示不添加SB203580和SDF-1α的情况的结果，下段表示添加了SB203580和SDF-1α的结果。
图5示出了从iPS细胞(TkT3V1-7)分化诱导而成的细胞的流式细胞术的结果(以CD8和CD4的染色强度展开的图)。从左依次表示不添加SB203580和SDF-1α的结果、添加了SB203580的结果、添加了SDF-1α的结果、添加了SB203580和SDF-1α的结果。
图6示出了从来自脐带血的CD34阳性细胞(CBCD34+)分化诱导而成的细胞的流式细胞术的结果。上段表示不添加SB203580和SDF-1α的结果，下段表示添加了SB203580和SDF-1α的结果。
图7示出了从iPS细胞(TkT3V1-7)和来自脐带血的CD34阳性细胞(CBCD34+)分化诱导而成的细胞数。对于每种细胞，左侧表示不添加SB203580和SDF-1α(-)的结果，右侧表示添加了SB203580和SDF-1α的结果。
图8示出了使从iPS细胞(H25-4、H25-31、GPC3#16)分化诱导而成的CD4CD8双阳性T细胞分化成CD8阳性T细胞的流式细胞术的结果。
图9示出了在图8中分化成的CD8阳性T细胞用作为特异性抗原进行识别的四聚体(H25-4、H25-31)或多聚体(Dextramer)(GPC3#16)染色后的细胞的流式细胞术的结果。
图10示出了在图8中得到的CD8阳性T细胞的抗原特异性细胞毒性试验的结果。示出了在特异性抗原的非存在下(无肽、SK-Hep载体)、在阴性对照抗原的存在下(GAG肽)、在特异性抗原的存在下(Nef肽、SK-Hep GPC3)的细胞杀伤(killing)的结果。
图11示出了从iPS细胞(在Ff-I01株中导入了人工抗原受体(CAR)的Ff-I01GC33株)分化诱导而成的细胞的流式细胞术的结果。
具体实施方式
本发明提供从造血祖细胞制备CD4CD8双阳性T细胞的方法。
从造血祖细胞诱导CD4CD8双阳性T细胞的步骤
在本发明中，造血祖细胞(Hematopoietic Progenitor Cells(HPC))是指能分化成淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、红细胞、巨核细胞等血细胞类细胞的细胞。在本发明中，造血祖细胞和造血干细胞没有区别，只要没有特别理由，就表示相同的细胞。造血干细胞/祖细胞例如能够通过作为表面抗原的CD34和/或CD43为阳性来识别。
此外，对造血祖细胞而言，能够使用如后所述从多能性干细胞诱导的造血祖细胞，也能够使用如来自脐带血的CD34阳性细胞那样的、用其他方法获得的造血祖细胞。
在本发明中，CD4CD8双阳性T细胞是指T细胞中，表面抗原CD4和CD8均为阳性的细胞(CD8+CD4+)，T细胞能够通过作为表面抗原的CD3和CD45为阳性来识别，因此CD4CD8双阳性T细胞能够鉴定为CD4、CD8、CD3和CD45为阳性的细胞。CD4CD8双阳性T细胞能够通过诱导向CD4阳性细胞或CD8阳性细胞分化。
在本发明中，CD4CD8双阳性T细胞能够通过包括在添加了p38抑制剂和/或SDF-1的培养液中培养造血祖细胞的步骤的方法来制造。
<p38抑制剂>
本说明书的“p38抑制剂”定义为抑制p38蛋白(p38MAP激酶)的功能的物质，可列举例如p38的化学性抑制剂、p38的显性负突变体或编码显性负突变体的核酸等，但不限定于这些。
作为本发明中的p38的化学性抑制剂，可例示：SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)、及其衍生物、SB202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物、SB239063(反式-4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基-4-嘧啶基)-1H-咪唑-1-基]环己醇)及其衍生物、SB220025及其衍生物、PD169316、RPR200765A、AMG-548、BIRB-796、SCIO-469、SCIO-323、VX-702、FR167653，但不限定于这些。这些化合物是市售的，例如对于SB203580、SB202190、SC239063、SB220025和PD169316，可以从Calbiochem公司获得，SCIO-469和SCIO-323可以从Scios公司等获得。
另外，p38的显性负突变体，可列举对位于p38的DNA结合区域的第180位的苏氨酸进行点突变而成为丙氨酸的p38T180A、使人和小鼠中的p38的第182位的酪氨酸点进行点突变而成为苯丙氨酸的p38Y182F等。
p38抑制剂在培养基中的含量为，例如，约1μM～约50μM的范围。
<SDF-1>
在本发明中，SDF-1(Stromal cell-derived factor 1，基质细胞衍生因子1)不仅可以为SDF-1α或其成熟型，还可以为SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1ε或SDF-等的亚型或它们的成熟型，还可以为它们的任意比例的混合物等。优选使用SDF-1α。此外，SDF-1有时也被称为CXCL-12或PBSF。
在本发明中，对SDF-1而言只要具有作为该趋化因子的活性即可，其氨基酸序列中的1个或数个氨基酸可以被取代、缺失和/或进行添加，另外同样地，糖链也可以被取代、缺失和/或进行添加。只要在至少保持4个半胱氨酸残基(在人SDF-1α的情况下，为Cys30、Cys32、Cys55和Cys71)、且与天然体的氨基酸序列具有90％以上的同源性的范围内，则允许氨基酸突变。SDF-1可以为哺乳动物例如人，或非人哺乳动物例如猴、羊、牛、马、猪、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等的SDF-1。例如，作为人的SDF-1α，可以使用以GenBank登录号：NP_954637登录的蛋白质，作为SDF-1β，可以使用以GenBank登录号：NP_000600登录的蛋白质。
SDF-1既可以使用市售的，也可以使用从天然纯化的，或可以使用利用肽合成或基因工程的方法制备的那些。
SDF-1在培养基中的含量为，例如，约10ng/ml到约100ng/ml的范围。
此外，对于SDF-1，也可以使用具有SDF-1样的活性的SDF-1代替物。作为这样的SDF-1代替物，可例示CXCR4激动剂，也可以代替SDF-1而在培养基中添加具有CXCR4激动剂活性的低分子化合物等。
在本发明中，对在CD4CD8双阳性T细胞的制造中使用的培养液没有特别限定，可以以在动物细胞培养中使用的培养基作为基础培养基，在其中添加p38抑制剂和/或SDF-1、更优选添加维生素C类来制备。此外，在CD4CD8双阳性T细胞制造步骤中使用的维生素C类的种类如上所述，其中维生素C类的浓度例如为5μg/ml到200μg/ml。对于基础培养基，包括例如：Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)培养基、Medium 199培养基、Eagle'sMinimum Essential Medium(EMEM)培养基、αMEM培养基、Dulbecco's modified Eagle'sMedium(DMEM)培养基、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、OP9培养基、Neurobasal Medium(Life Technologies公司)和它们的混合培养基等。培养基中任选含有血清，或可以使用无血清培养基。根据需要，基础培养基例如也可以包含以下中的1种以上的物质：白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生物质、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子等。
对于本发明的CD4CD8双阳性T细胞的制备中使用的培养液，可以进一步在培养液中添加选自SCF、TPO(促血小板生成素)、FLT-3L和IL-7中的细胞因子。它们的浓度例如为SCF为10ng/ml到100ng/ml，TPO为10ng/ml到200ng/ml，IL-7为1ng/ml到100ng/ml，FLT-3L为1ng/ml到100ng/ml。
在CD4CD8双阳性T细胞的制备中，造血祖细胞可以使用饲养细胞培养，但优选不使用饲养细胞地进行培养。
造血祖细胞可以进行贴壁培养或悬浮培养，但本步骤中优选贴壁培养。在进行贴壁培养时，可以对培养容器进行涂层后使用，例如作为涂布剂，可列举：基底胶(Matrigel)(Niwa A,et al.PLoS One.6(7):e22261,2011)、胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、RetroNectin、Fc-DLL4或巢蛋白、及它们的组合。
此外，在将拟胚体进行悬浮培养而得到造血祖细胞的情况下，优选将其解离成单细胞后，进行贴壁培养。
在本发明中，对为了制备CD4CD8双阳性T细胞而培养造血祖细胞时的培养温度条件没有特别限定，例如优选为约37℃～约42℃左右、约37～约39℃左右。另外，关于培养时期，作为本领域技术人员可以一边监测CD4CD8双阳性T细胞的数量等一边适当确定。只要可以得到造血祖细胞即可，对天数没有特别限定，例如为至少10天以上、12天以上、14天以上、16天以上、18天以上、20天以上、22天以上、23天以上，优选为23天。
在本发明中，所得到的CD4CD8双阳性T细胞可以分离而使用，也可以为含有其他细胞种类的细胞团形式。在分离的情况下，可以使用包括CD4、CD8、CD3和CD45的任意一种指标进行分离，该分离的方法可以使用本领域技术人员公知的方法，例如可列举：利用CD4、CD8、CD3和CD45的抗体进行标记，使用流式细胞仪分离的方法、或使用将所希望的抗原固定化而成的亲和柱等纯化的方法。
从多能性干细胞诱导造血祖细胞的步骤
本发明提供从多性干细胞制备CD4CD8双阳性T细胞的方法。该制备方法包括：(1)从多能性干细胞诱导造血祖细胞的步骤、以及(2)从该造血祖细胞诱导CD4CD8双阳性T细胞的步骤。
步骤(2)的从造血祖细胞诱导CD4CD8双阳性T细胞的步骤如上所述，以下对步骤(1)的从多能性干细胞诱导造血祖细胞的步骤进行说明。
多能性干细胞
在本发明中，多能性干细胞是指具有能够分化成生物体中存在的众多细胞的多能性、且兼具增殖能力的干细胞，至少包括任何可被诱导为本发明中使用的造血祖细胞的细胞。多能性干细胞优选来自哺乳动物，更优选来自人。
对多能性干细胞没有特别限定，包括例如：胚胎干(ES)细胞、源自由核移植得到的克隆胚胎的胚胎干(ntES)细胞、精子干细胞(“GS细胞”)、胚胎生殖细胞(“EG细胞”)、人工多能性干(iPS)细胞、来自培养成纤维细胞或脐带血的多能性干细胞、来自骨髓干细胞的多能性细胞(Muse细胞)等。从在制造步骤中能够不破坏胚、卵子等而获得这些点来看，优选的多能性干细胞为iPS细胞、更优选为人iPS细胞。
iPS细胞的制备方法在本领域中是公知的，能够通过向任意体细胞中导入初始化因子而制备。其中，初始化因子可例示例如：Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等基因或基因产物，这些初始化因子可以单独使用，也可以组合使用。作为初始化因子的组合，可例示：WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D,etal.(2008),Nat.Biotechnol.,26:795-797、Shi Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,2:525-528、Eminli S,et al.(2008),Stem Cells.26:2467-2474、Huangfu D,et al.(2008),Nat.Biotechnol.26:1269-1275、Shi Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,3,568-574、ZhaoY,et al.(2008),Cell Stem Cell,3:475-479、Marson A,(2008),Cell Stem Cell,3,132-135、Feng B,et al.(2009),Nat.Cell Biol.11:197-203、R.L.Judson et al.,(2009),Nat.Biotechnol.,27:459-461、Lyssiotis CA,et al.(2009),Proc Natl Acad Sci U SA.106:8912-8917、Kim JB,et al.(2009),Nature.461:649-643、Ichida JK,et al.(2009),Cell Stem Cell.5:491-503、Heng JC,et al.(2010),Cell Stem Cell.6:167-74、Han J,et al.(2010),Nature.463:1096-100、Mali P,et al.(2010),Stem Cells.28:713-720、Maekawa M,et al.(2011),Nature.474:225-9.中记载的组合。
对于体细胞，包括但不限于：胎儿(仔)的体细胞、新生儿(仔)的体细胞、以及已成熟的健康或疾病性的体细胞中的任一种，另外，还包括初代培养细胞、传代细胞和株化细胞中的任一种。具体而言，对体细胞而言，可例示例如：(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(成体干细胞)、(2)组织祖细胞、(3)血液细胞(末梢血细胞、脐带血细胞等)、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰腺细胞(胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞和脂肪细胞等已分化的细胞等。
此外，为了制备CD4CD8阳性T细胞的目的，所使用的体细胞优选为T细胞，但在本发明中，也可以从使用非T细胞作为体细胞而得到的iPS细胞制备CD4CD8阳性T细胞。
在本发明中，对采集体细胞的来源哺乳动物个体没有特别限制，优选为人。在输血中使用由本发明制备的CD4CD8阳性T细胞或CD8阳性T细胞时，从容易与被输血的患者的人白血细胞型抗原(HLA)的类型匹配的观点出发，作为iPS细胞来源的体细胞优选是从被输血的对象分离的。
在本发明中，在造血祖细胞的诱导中使用的iPS细胞可以为导入了嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor:CAR)的iPS细胞。其中，嵌合抗原受体(CAR)是指一种融合蛋白，其包含与抗原结合的细胞外结构域和来源于与该细胞外结构域不同的多肽的细胞内结构域，例如将针对特定抗原的抗体的抗原识别部位(可变区的L链和H链)、CD3等T细胞受体的细胞内结构域、及CD28或4-1BB等共刺激分子的细胞内结构域进行结合而得到的融合蛋白(例如日本特表2015-509716)。
CAR的抗原识别部位可以根据目标抗原进行选择，由此能够制作针对目标抗原特异性的T细胞。例如，在以CD19为抗原的情况下，可以通过克隆抗CD19抗体的抗原识别部位，使其与CD3分子的细胞内结构域结合而制成CAR(例如，Cancer Res 2006；66:10995-11004.)。另外，通过选择与其结合的共刺激分子的种类和数量，可以控制活性化的强度和持续时间(例如，Mol Ther.2009；17:1453-1464.)。
通过导入CAR，使得无论是从T细胞来源的iPS细胞还是从非T细胞来源的iPS细胞分化诱导而成的T细胞均有可能被赋予针对目标抗原的特异性。另外，可以能够直接识别抗原分子，即使对HLA I类基因表达较低的肿瘤也能够产生较高的免疫反应。
从多能性干细胞诱导造血祖细胞的步骤
造血祖细胞优选通过在添加了维生素C类的培养液中培养多能性干细胞来制备。其中，维生素C类是指L-抗坏血酸及其衍生物，L-抗坏血酸衍生物是指在生物体内通过酶反应而形成维生素C的物质。作为L-抗坏血酸的衍生物，可例示：维生素C磷酸酯、抗坏血酸葡萄糖苷、抗坏血酸乙酯、维生素C酯、抗坏血酸四己基癸酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯和抗坏血酸-2磷酸-6棕榈酸酯。优选为维生素C磷酸酯，可列举例如：磷酸-L抗坏血酸钠或磷酸-L-抗坏血酸酶等磷酸-L抗坏血酸盐。维生素C类在培养液中例如以5μg/ml到500μg/ml的浓度含有。
对在造血祖细胞的制造中使用的培养液没有特别限定，能够以在动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基，并向其中添加维生素C类等而制备。基础培养基包括例如：Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)培养基、Medium 199培养基、Eagle'sMinimum Essential Medium(EMEM)培养基、αMEM培养基、Dulbecco's modified Eagle'sMedium(DMEM)培养基、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、NeurobasalMedium(Life Technologies公司)和它们的混合培养基等。培养基中任选含有血清，或可以使用无血清培养基。根据需要，基础培养基例如也可以包含以下中的1种以上的物质：白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生物质、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子等。
在本发明中，造血祖细胞的制备中使用的培养液中可以进一步添加选自下组中的细胞因子：BMP4(Bone morphogenetic protein 4，骨形态发生蛋白4)、VEGF(vascularendothelial growth factor，血管内皮生长因子)、bFGF(basic fibroblast growthfactor，碱性成纤维细胞生长因子)、SCF(Stem cell factor，干细胞因子)、TPO(促血小板生成素)和FLT-3L(Flt3Ligand，Flt3配体)。
它们的浓度例如为BMP4为1ng/ml到100ng/ml，VEGF为1ng/ml到100ng/ml，SCF为10ng/ml到100ng/ml，TPO为1ng/ml到100ng/ml，FLT-3L为1ng/ml到100ng/ml，bFGF为1ng/ml到100ng/ml。
另外，也可以添加TGFβ抑制剂。TGFβ抑制剂是指干涉TGFβ家族的信号传导的低分子抑制剂，例如包括：SB431542、SB202190(以上参考R.K.Lindemannet al.,Mol.Cancer 2:20(2003))、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)等，例如在TGFβ抑制剂为SB431542的情况下，在培养基中的浓度优选为0.5μM～100μM。
多能性干细胞可以与C3H10T1/2(Takayama N.,et al.J Exp Med.2817-2830,2010)、来自不同种类的基质细胞(Niwa A et al.J Cell Physiol.2009Nov；221(2):367-77.)等饲养细胞进行共培养，但在本发明中，优选不使用饲养细胞地进行培养。
在本发明的造血祖细胞的制造中，多能性干细胞的培养方法可以为贴壁培养或悬浮培养，优选为悬浮培养。例如对多能性干细胞而言，可以对培养至相对于使用的培养皿达到80％汇合后形成的群体分离，将其解离成单细胞后提供至悬浮培养。作为多能性干细胞的分离方法，可以列举例如力学分离的方法、使用了具有蛋白酶活性和胶原酶活性的分离溶液(例如、Accutase(商标)和Accumax(商标)等)或仅具有胶原酶活性的分离溶液的分离方法。
悬浮培养是指将细胞以与培养容器为非粘附的状态培养，没有特别限定，可以使用没有以提高与细胞的粘附性的目的进行人工处理(例如利用细胞外基质等的涂层处理)的培养容器、或者进行了人工地抑制粘附的处理(例如，利用聚羟乙基甲基丙烯酸酯(poly-HEMA)或非离子性的表面活性多元醇(Pluronic F-127等)的涂层处理)的培养容器进行。悬浮培养时优选使其形成拟胚体(EB)进行培养。
在本发明中，造血祖细胞能够从通过培养多能性干细胞所得到的网状结构物(也称为ES-sac或iPS-sac)制备。其中，“网状结构物”是指来自多能性干细胞的立体的囊状(内部伴有空间)结构体，为由内皮细胞团等形成、在内部包含造血祖细胞的结构体。
在本发明中，用于制备造血祖细胞的培养时的温度条件没有特别限定，例如优选约37℃～约42℃左右、约37～约39℃左右。另外，关于培养时期，作为本领域技术人员可以一边监测造血祖细胞的数量等一边适当确定。只要可以得到造血祖细胞即可，对天数没有特别限定，例如为至少6天以上、7天以上、8天以上、9天以上、10天以上、11天以上、12天以上、13天以上、14天以上，优选为14天。对于培养时期较长的问题，不会在造血祖细胞的制造上构成问题。另外，可以以低氧条件进行培养，在本发明中，低氧条件可例示15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或其以下的氧浓度。
从CD4CD8双阳性T细胞诱导CD8阳性T细胞的步骤
在本发明中，能够从如上所述得到的CD4CD8阳性T细胞诱导CD8阳性T细胞。
CD8阳性T细胞是指T细胞中的表面抗原CD8为阳性的细胞(CD8+CD4-)，也被称为细胞毒性T细胞。T细胞能够通过作为表面抗原的CD3和CD45为阳性来识别，因此CD8阳性T细胞可以作为CD8、CD3和CD45为阳性、CD4为阴性的细胞进行鉴定。
在本发明中，CD8阳性T细胞能够通过包括在添加了肾上腺皮质激素剂的培养液中培养CD4CD8双阳性T细胞的步骤的方法制造。
肾上腺皮质激素剂为糖质类皮质激素或其衍生物，可例示：乙酸可的松、氢化可的松、乙酸氟氢可的松、泼尼松龙、曲安奈德、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、丙酸倍氯米松。优选为地塞米松。在肾上腺皮质激素剂为地塞米松的情况下，其在培养液中的浓度例如为1nM到100nM。
对在CD8阳性T细胞的制造中使用的培养液没有特别限定，可以以在动物细胞培养中使用的培养基作为基础培养基，在其中添加肾上腺皮质激素剂来制备。对于基础培养基，包括例如：Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)培养基、Medium 199培养基、Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)培养基、αMEM培养基、Dulbecco's modifiedEagle's Medium(DMEM)培养基、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、Neurobasal Medium(Life Technologies公司)和它们的混合培养基等。培养基中任选含有血清，或可以使用无血清培养基。根据需要，基础培养基例如也可以包含以下中的1种以上的物质：白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生物质、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子等。
在本发明中CD8阳性T细胞的制造中使用的培养液，优选进一步含有抗CD3抗体、维生素C类、细胞因子。作为该细胞因子，可例示IL-2和IL-7等。
抗CD3抗体只要是特异性识别CD3的抗体即可，没有特别限定，例如可列举由OKT3克隆产生的抗体。抗CD3抗体在培养液中的浓度例如为10ng/ml到1000ng/ml。
在本发明中CD8阳性T细胞的制造中使用的维生素C类可以利用与上述相同的条件使用。
对在本发明中CD8阳性T细胞的制造中使用的各成分在培养液中的浓度而言，例如IL-2为10U/ml到1000U/ml、IL-7为1ng/ml到100ng/ml。
在本发明中，对为了制备CD8阳性T细胞而培养CD4CD8双阳性T细胞时的温度条件没有特别限定，例如优选约37℃～约42℃左右、约37～约39℃左右。另外，关于培养时期，作为本领域技术人员可以一边监测CD8阳性T细胞的数量等一边适当确定。只要可以得到造血祖细胞即可，对天数没有特别限定，例如为至少1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上，优选为3天。
细胞制剂
本发明提供包含通过上述方法制备而成的CD4CD8双阳性T细胞和/或CD8阳性T细胞的细胞制剂。
本发明的细胞制剂由于能够抗原特异性地发挥细胞杀伤活性，所以适合在癌症治疗或免疫补充疗法等中使用。
作为对患者给药本发明的细胞制剂的方法，可列举例如：使制备而成的CD4CD8双阳性T细胞和/或CD8阳性T细胞悬浮于生理盐水等中，直接移植到患者的患部的方法、或静脉注射的方法等。
通过以下实施例更加具体地说明本发明，但本发明的范围不限于这些实施例。
实施例
iPS细胞(TKT3v 1-7株、H25-4株和H25-31株)使用Nishimura T,et al.,CellStem Cell.12(1):114-126,2013中记载的方法，由在告知后获得同意而分离到的人CD3阳性T细胞建立。
iPS细胞(Ffl-01株和Ffl-14株)使用了通过Nakagawa M,et al.,Sci Rep.4:3594(2014)中记载的方法建立的细胞(来自外周血单个核细胞(但不包括T细胞和B细胞))。此外，Ffl-14株为从与Ffl-01株相同的供体建立的其他克隆。
对iPS细胞(GPC3#16株)而言，使用了从由外周血单个核细胞分离的抗原特异性T淋巴细胞并使用Nishimura T,et al.,Cell Stem Cell.12(1):114-126,2013中记载的方法建立的细胞。
iPS细胞(Ff-I01GC33株)使用了在Ff-I01株中利用病毒载体导入了嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor:CAR)的细胞。CAR使用了通过对抗CD19抗体的抗原识别部位进行克隆、使其与CD3分子的细胞内结构域结合而制作成的CAR。
ES细胞(KhES-3株)从京都大学再生医科学研究所获得。
<实施例1>
在经超低粘附处理的6孔板(CORNING公司：#3471)上，以3x105～6x105个/孔接种了TkT3V1-7、FfI-01、Ffl-14或KhES-3(第0天)，向EB培养基(在StemPro34中添加10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠、2mM L-谷氨酰胺、45mMα-单硫代甘油、50μg/ml抗坏血酸)加入了10ng/ml BMP4、5ng/ml bFGF、15ng/ml VEGF、2μM SB431542而在低氧条件下(5％O2)进行培养5天(第5天)。
接着，添加了50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml Flt3L，再进行5～9天培养(～第14天)。
得到的造血祖细胞在包被了Fc-DLL4(5μg/ml)(Sino Biological Inc.)和Retronectin(5μg/ml)(Takara Bio株式会社)的48孔板上，在添加了50ng/ml SCF、50ng/mlIL-7、50ng/ml Flt3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580(Tocris Bioscience)、30ng/ml SDF-1α(PeproTech)的OP9培养基(15％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100Uml青霉素、100ng/ml链霉素、55μM 2-巯基乙醇、50μg/ml抗坏血酸、10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠)中进行培养21天(第35天)。
在第35天，用FACS分离了CD45(+)、CD3(+)、CD4(+)、CD8(+)组分，得到了CD4CD8双阳性(Double positive)细胞(称为DP细胞)。
结果示于图1(TKT3v 1-7)、图2(Ffl-01)、图3(Ffl-14)、图4(KhES-3)。此外，在各个图的上段，示出了培养造血祖细胞时不添加SB203580和SDF-1α而进行培养的结果。由这些结果可知，通过从iPS细胞或ES细胞等多能性干细胞诱导造血祖细胞，并将其在含有p38抑制剂和SDF-1的培养基中培养，可以高效地得到CD4CD8双阳性T细胞。
此外，利用与上述相同的步骤，分别用不含SB203580和SDF-1α的培养基、含SB203580的培养基、含SDF-1α的培养基、含SB203580和SDF-1α的培养基进行了TKT3v 1-7株的培养，结果可知，p38抑制剂和SDF-1的效果在单独存在时也可以发挥(图5)。
<实施例2>
将来自脐带血的CD34阳性造血祖细胞(HemaCare公司#CBCD34C-1)与实施例1的来自iPS细胞的造血祖细胞同样地，在包被了Fc-DLL4(5μg/ml)和Retronectin(5μg/ml)的48孔板上，在添加了50ng/ml SCF、50ng/ml IL-7、50ng/ml Flt3L、100ng/ml TPO、15μMSB203580、30ng/ml SDF-1α的OP9培养基中进行培养21天(第35天)。在第35天用FACS分离了CD45(+)、CD3(+)、CD4(+)、CD8(+)组分，得到了CD4CD8双阳性(Double positive)细胞(称为DP细胞)。结果示于图6。此外，在图6的上段，示出了培养造血祖细胞时不添加SB203580和SDF-1α而进行培养的结果。由这些结果可知，即使在使用了来自脐带血的CD34阳性造血祖细胞的情况下，通过用包含p38抑制剂和SDF-1的培养基进行培养，也可以高效地得到CD4CD8双阳性T细胞。
在实施例1和实施例2中，在FACS解析时，使用血细胞计数板(Waketevic株式会社：#WC2-100)测量了总细胞数(该数值中也包含除了CD4CD8双阳性细胞以外的群体)。结果如图7所示，可知通过加入SB203580和SDF-1α进行培养，细胞数明显增加。
<实施例3>
作为iPS细胞使用了H25-4、H25-31或GPC3#16，通过用与实施例1同样的方法进行培养，得到了CD4CD8双阳性细胞。将得到的CD4CD8双阳性细胞在添加了肾上腺皮质激素剂(富士制药工业株式会社:10171-H02H)的培养液中使用抗CD3抗体(eBioscience:16-0037-85)进行刺激，由此如图8所示，得到了CD8阳性T细胞(CD8阳性T淋巴细胞)。
将所得到的CD8阳性T淋巴细胞用各个T细胞受体特异性识别并结合的四聚体(H25-4、H25-31)或多聚体(Dextramer)(GPC3#16)染色并进行了FACS解析。结果如图9所示，可知上述得到的CD8阳性T细胞具有针对特异性抗原的反应性。
另外，将上述得到的CD8阳性T淋巴细胞与分别表达各个特异性识别的抗原的癌细胞株共培养，利用51Cr释放试验评价了免疫反应性。结果如图10所示，可知H25-4株和H25-31株对于提呈特异性识别的肽(Nef或GAG)的癌细胞株显示了特异性且高效率的细胞杀伤免疫反应。另外可知，GPC3#16株对于因基因导入而表达了GPC3抗原的癌细胞株显示了较高的细胞杀伤免疫反应。
<实施例4>
作为iPS细胞使用了在Ff-I01株中导入了人工抗原受体(CAR)的Ff-I01GC33株，通过用与实施例1同样的方法进行培养，得到了CD4CD8双阳性细胞。结果如图11所示，可知即使是导入了CAR的iPS细胞，通过用包含SB203580和SDF-1的培养基培养，也可以高效地得到CD4CD8双阳性细胞。

Claims (22)

1.一种制备CD4CD8双阳性T细胞的方法，其包括在含有p38抑制剂和/或SDF-1的培养液中培养造血祖细胞，诱导CD4CD8双阳性T细胞的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养液含有p38抑制剂和SDF-1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述p38抑制剂为SB203580。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，在所述步骤中，培养液含有维生素C类。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述步骤利用贴壁培养进行。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述造血祖细胞的培养不使用饲养细胞。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述造血祖细胞是从多能性干细胞分化诱导而成的造血祖细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，多能性干细胞为人工多能性干细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，人工多能性干细胞来自T细胞以外的体细胞。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，人工多能性干细胞为导入了嵌合抗原受体的人工多能性干细胞。
11.一种制备CD4CD8双阳性T细胞的方法，其包括以下步骤：
(1)在培养液中培养多能性干细胞，诱导造血祖细胞的步骤；
(2)在含有p38抑制剂和/或SDF-1的培养液中培养所述步骤(1)中得到的造血祖细胞，诱导CD4CD8双阳性T细胞的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，培养液含有p38抑制剂和SDF-1。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述p38抑制剂为SB203580。
14.根据权利要求11～13中任一项所述的方法，其中，所述步骤(1)利用悬浮培养进行。
15.根据权利要求11～14中任一项所述的方法，其中，所述步骤(2)利用贴壁培养进行。
16.根据权利要求11～15中任一项所述的方法，其中，在所述步骤(1)和(2)中，培养液含有维生素C类。
17.根据权利要求11～16中任一项所述的方法，其中，在所述步骤(1)和(2)中，培养不使用饲养细胞。
18.根据权利要求11～17中任一项所述的方法，其中，多能性干细胞为人工多能性干细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，人工多能性干细胞来自T细胞以外的体细胞。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中，人工多能性干细胞为导入了嵌合抗原受体的人工多能性干细胞。
21.一种制备CD8阳性T细胞的方法，其包括：
利用权利要求1～20中任一项所述的方法制备CD4CD8双阳性T细胞的步骤、以及将所得到的CD4CD8双阳性T细胞在添加了肾上腺皮质激素剂的培养液中培养而得到CD8阳性T细胞的步骤。
22.细胞制剂，其包含通过权利要求1～20中任一项所述的方法得到的CD4CD8双阳性T细胞和/或通过权利要求21的方法得到的CD8阳性T细胞。
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