EA045419B1 - Маркер гемопоэтических клеток-предшественников - Google Patents
Маркер гемопоэтических клеток-предшественников Download PDFInfo
- Publication number
- EA045419B1 EA045419B1 EA201992483 EA045419B1 EA 045419 B1 EA045419 B1 EA 045419B1 EA 201992483 EA201992483 EA 201992483 EA 045419 B1 EA045419 B1 EA 045419B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- positive
- fraction
- antibody
- cell population
- Prior art date
Links
- 239000003550 marker Substances 0.000 title description 20
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 433
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 78
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 77
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 claims description 60
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 claims description 60
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 58
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 58
- 101000914496 Homo sapiens T-cell antigen CD7 Proteins 0.000 claims description 43
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 claims description 43
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 35
- 101000599858 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 2 Proteins 0.000 claims description 33
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 33
- 102100037872 Intercellular adhesion molecule 2 Human genes 0.000 claims description 33
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 33
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 claims description 31
- 101000773743 Homo sapiens Angiotensin-converting enzyme Proteins 0.000 claims description 31
- 101000961065 Homo sapiens Interleukin-18 receptor 1 Proteins 0.000 claims description 31
- 102100039340 Interleukin-18 receptor 1 Human genes 0.000 claims description 31
- 101001098352 Homo sapiens OX-2 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 30
- 102100037589 OX-2 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 30
- 101000610602 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Proteins 0.000 claims description 29
- 102100040115 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Human genes 0.000 claims description 29
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 28
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 28
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 claims description 27
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 claims description 27
- 102000001760 Notch3 Receptor Human genes 0.000 claims description 27
- 108010029756 Notch3 Receptor Proteins 0.000 claims description 27
- 102100029761 Cadherin-5 Human genes 0.000 claims description 26
- 101000794587 Homo sapiens Cadherin-5 Proteins 0.000 claims description 26
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 claims description 26
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 claims description 26
- 101000994365 Homo sapiens Integrin alpha-6 Proteins 0.000 claims description 25
- 101001046677 Homo sapiens Integrin alpha-V Proteins 0.000 claims description 25
- 102100032816 Integrin alpha-6 Human genes 0.000 claims description 25
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 claims description 25
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 21
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 claims description 19
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 claims description 19
- 102100036364 Cadherin-2 Human genes 0.000 claims description 18
- 101000714537 Homo sapiens Cadherin-2 Proteins 0.000 claims description 18
- 101001015004 Homo sapiens Integrin beta-3 Proteins 0.000 claims description 18
- 101000622137 Homo sapiens P-selectin Proteins 0.000 claims description 18
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 claims description 18
- 102100032999 Integrin beta-3 Human genes 0.000 claims description 18
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 claims description 18
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 claims description 18
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 102100037086 Bone marrow stromal antigen 2 Human genes 0.000 claims description 17
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 17
- 101000740785 Homo sapiens Bone marrow stromal antigen 2 Proteins 0.000 claims description 17
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 17
- 101001078158 Homo sapiens Integrin alpha-1 Proteins 0.000 claims description 17
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 claims description 17
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 claims description 17
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 17
- 101001070790 Homo sapiens Platelet glycoprotein Ib alpha chain Proteins 0.000 claims description 17
- 101001133085 Homo sapiens Sialomucin core protein 24 Proteins 0.000 claims description 17
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 claims description 17
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 claims description 17
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 17
- 102100034173 Platelet glycoprotein Ib alpha chain Human genes 0.000 claims description 17
- 102100034258 Sialomucin core protein 24 Human genes 0.000 claims description 17
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 17
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims description 16
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 16
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 claims description 14
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 claims description 14
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 claims description 14
- 101001074244 Homo sapiens Glycophorin-A Proteins 0.000 claims description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 11
- -1 CD 102 Proteins 0.000 claims description 8
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 210000002861 immature t-cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 52
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 52
- 241000894007 species Species 0.000 description 42
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 21
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 6
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 6
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 6
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 5
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 5
- 102100037917 CD109 antigen Human genes 0.000 description 4
- 101000738399 Homo sapiens CD109 antigen Proteins 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 4
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 4
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 210000000540 fraction c Anatomy 0.000 description 4
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 238000003320 cell separation method Methods 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 3
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 238000012083 mass cytometry Methods 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 101150011813 DLL1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 2
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 2
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 2
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 108700041286 delta Proteins 0.000 description 2
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 2
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 2
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 2
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- KUVIULQEHSCUHY-XYWKZLDCSA-N Beclometasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(Cl)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)COC(=O)CC)(OC(=O)CC)[C@@]1(C)C[C@@H]2O KUVIULQEHSCUHY-XYWKZLDCSA-N 0.000 description 1
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N Cortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2=O ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100026818 Inhibin beta E chain Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M Methylprednisolone sodium succinate Chemical compound [Na+].C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)COC(=O)CCC([O-])=O)CC[C@H]21 FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- MIJPAVRNWPDMOR-UHFFFAOYSA-N [2-(1,2-dihydroxyethyl)-3-hydroxy-5-oxo-2h-furan-4-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound OCC(O)C1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229950000210 beclometasone dipropionate Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N betamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N 0.000 description 1
- 229960001102 betamethasone dipropionate Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 229960003290 cortisone acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229950000250 dexamethasone dipropionate Drugs 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 101150109170 dll4 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- SYWHXTATXSMDSB-GSLJADNHSA-N fludrocortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O SYWHXTATXSMDSB-GSLJADNHSA-N 0.000 description 1
- 229960003336 fluorocortisol acetate Drugs 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 210000001978 pro-t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 235000011649 selenium Nutrition 0.000 description 1
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способу продуцирования CD8-позитивных клеток с использованием маркеров гемопоэтических клеток-предшественников одного или более видов (маркеров НРС) и популяции клеток, экспрессирующих маркеры НРС одного или более видов и т.п.
Предпосылки создания изобретения
Т-клетки играют главную роль в иммунной системе против чужеродных патогенов, таких как бактерии, вирусы и т.п., и против аномальных клеток, таких как раковые клетки и т.п. В частности, цитотоксический Т-лимфоцит (CTL) распознает, посредством Т-клеточного рецептора (TCR), присутствующего на клеточной поверхности, антигенные пептиды, происходящие от вирусов, опухолей и т.п. и презентированные вместе с антигеном главного комплекса гистосовместимости класса 1 антигенпрезентирующих клеток, и обладает специфической цитотоксической активностью, направленной против клеток, презентирующих указанный антигенный пептид как чужеродное вещество.
Большинство CTL представляет собой клетки, позитивные по одному CD8 (SP). Известно, что вышеупомянутые CD8SP-клетки дифференцируются в тимусе незрелых клеток, не экспрессирующих TCR и не содержащих CD4 или CD8 (клеток, негативных по двум CD4/CD8 (в описании настоящей заявки, отсутствие двух антигенов иногда обозначается DN)), посредством клеток, экспрессирующих CD8 и CD4 (клеток, позитивных по двум CD4/CD8 (в описании настоящей заявки, присутствие двух антигенов иногда обозначается DP)).
Как упоминалось выше, поскольку Т-клетки играют важную роль в иммунной системе, то если Тклетка может быть введена или регенерирована, то она становится в высокой степени эффективным средством для профилактики или лечения заболеваний, таких как опухоль, инфекция, аутоиммунное расстройство и т.п. Поэтому были предприняты попытки получить гемопоэтические клеткипредшественники и клетки Т-клеточной линии способом индуцирования гемопоэтических клетокпредшественников (иногда обозначаемых в настоящей заявке как НРС) из iPS-клеток, то есть, способом индуцирования CD4/CD8DP-клеток и т.п. Так, например, в непатентном документе 1 показано, что CD34/CD43DP-клетки могут быть индуцированы путем совместного культивирования iPS-клеток с фидерными клетками (в частности, клетками ОР9). В патентном документе 1 и в непатентном документе 2 описаны: способ выделения НРС из клеточной популяции, содержащей НРС, индуцированные из человеческих плюрипотентных стволовых клеток, где экспрессия CD43 и CD34, CD31 или CD144 используется в качестве индекса; способ дифференцировки отдельных клеток в клетки Т-клеточной линии, а также показано, что в случае дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в НРС, свойства индуцированных клеток линии дифференцировки крови значительно варьируется в зависимости от того, действует ли активин/Nodal на ранней стадии индуцирования или нет. В патентном документе 2 описан способ продуцирования CD4/CD8DP в условиях отсутствия фидерных клеток. Кроме того, в патентном документе 3 описаны различные способы индуцирования гемопоэтических клеток, включая гемопоэтические клетки-предшественники, из человеческих плюрипотентных стволовых клеток, и указывается, что низкая эффективность продуцирования является одной из причин, по которой клиническое применение клеток крови, индуцированных in vitro, не осуществлялось.
Список документов.
Патентные документы.
Патентный документ 1: WO 2013/075222.
Патентный документ 2: WO 2017/221975.
Непатентные документы.
Непатентный документ 1: Choi K.D. et al., Stem Cells, 27 (2009); 559-567.
Непатентный документ 2: Kennedy M. et al., Cell Reports, 2 (2012); 1722-1735.
Непатентный документ 3: Liu S. et al., Cytotherapy, 17 (2015); 344-358.
Сущность изобретения
Проблемы, которые могут быть решены с помощью изобретения
Целью настоящего изобретения является получение большого числа клеток Т-клеточной линии (например, CD8-позитивных клеток (например, CD4/CD8DP-клеток, CD8SP-клеток)) и/или их получение в повышенных концентрациях (то есть, разработка способа продуцирования клеток) для проведения стабильной клеточной терапии. Кроме того, целью настоящего изобретения является получение клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, для решения вышеупомянутых проблем.
Способы решения указанных проблем
Для разработки способа продуцирования CD4/CD8DP-клеток, который позволит решить вышеупомянутую проблему, авторами настоящего изобретения были идентифицированы маркеры, экспрессируемые на поверхности НРС (маркеры НРС). Кроме того, авторами было обнаружено, что НРС, выделенные из клеточной популяции, содержащей НРС, с использованием маркеров одного или более видов, обнаруживают высокую эффективность дифференцировки в CD8-позитивные клетки (например, CD4/CD8DP-клетки), а также высокую активность пролиферации, то есть, может быть получено большее число CD8-позитивных клеток (например, CD4/CD8DP-клеток), и/или эти клетки могут быть получены в
- 1 045419 более высоких концентрациях в клеточной популяции с использованием маркеров НРС одного или более видов. Кроме того, авторами было обнаружено, что способ продуцирования согласно изобретению дает меньшую вариабельность выхода и может стабильно продуцировать CD8-позитивные клетки (например,
CD4/CD8DP-kлетки), в результате чего может быть осуществлено настоящее изобретение.
Следовательно, настоящее изобретение включает следующее.
[1] Способ продуцирования клеток, позитивных по двум CD4/CD8, где указанный способ включает следующие стадии:
стадию 1: выделения из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клеткипредшественники, клеток, экспрессирующих молекулы одного или более видов, выбранные из первой группы, состоящей из CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262 и CD325, и/или клеток, не экспрессирующих молекулы одного или более видов, выбранные из второй группы, состоящей из CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102 и CD156c, и стадию 2: дифференцировки клеток, выделенных в стадии 1, в клетки, позитивные по двум CD4/CD8.
[2] Способ по [1], где клетки, отобранные в вышеупомянутой стадии 1, не экспрессируют CD235a или CD14, но экспрессируют CD45, CD34 и CD43.
[3] Способ по [1] или [2], где вышеупомянутая стадия 1 включает выделение из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, клеток, экспрессирующих молекулы одного или более видов, выбранные из первой группы, состоящей из CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262 и CD325.
[4] Способ по [3], где первая группа в вышеупомянутой стадии 1 состоит из CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD200, CD218a, CD7 и CD144.
[5] Способ по [1] или [2], где вышеупомянутая стадия 1 включает выделение из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, клеток, не экспрессирующих молекулы одного или более видов, выбранные из второй группы, состоящей из CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102 и CD156c.
[6] Способ по [5], где вторая группа в вышеупомянутой стадии 1 состоит из CD49f, CD51 и CD102.
[7] Способ по любому из [1]-[6], где клеточную популяцию, содержащую гемопоэтические клеткипредшественники в вышеупомянутой стадии 1, получают путем индуцирования дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток.
[8] Способ по [7], где вышеупомянутыми плюрипотентными стволовыми клетками являются человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.
[9- 1] Способ получения клеток, позитивных по одному CD8, включающий стадию индуцирования клеток, позитивных по двум CD4/CD8, и полученных способом по любому из [1]-[8], в клетки, позитивные по одному CD8.
[9-2 ] Способ по [9-1], где вышеупомянутая стадия индуцирования, например, включает культивирование клеток, позитивных по двум CD4/CD8, в присутствии гормона коры надпочечников, антитела и/или цитокина, где предпочтительно, гормон коры надпочечников представляет собой дексаметазон, и/или антитело представляет собой анти-CD3 антитело, и/или цитокин представляет собой IL-2.
[10] Способ по [9-1] или [9-2], где вышеупомянутые клетки, позитивные по одному CD8, представляют собой цитотоксические Т-лимфоциты.
[11] Клеточную популяцию, полученную путем выделения из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, клеток, экспрессирующих молекулы одного или более видов, выбранные из первой группы, состоящей из CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262 и CD325, и/или клеток, не экспрессирующих молекулы одного или более видов, выбранные из второй группы, состоящей из CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102 и CD156c.
[12] Клеточную популяцию по [11], где выделенная клетка не экспрессирует CD235a или CD14 и экспрессирует CD45, CD34 и CD43.
[13] Клеточную популяцию по [11] или [12], где вышеупомянутую клеточную популяцию, содержащую гемопоэтические клетки-предшественники, получают путем индуцирования дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток.
[14] Клеточную популяцию по [13], где вышеупомянутыми плюрипотентными стволовыми клетками являются человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.
[15] Клеточную популяцию, содержащую гемопоэтические клетки-предшественники, экспрессирующие молекулы одного или более видов, выбранные из первой группы, состоящей из CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262 и CD325, и/или гемопоэтические клетки-предшественники, не экспрессирующие молекулы одного или более видов, выбранные из второй группы, состоящей из CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102 и CD156c, в отношении [число гемопоэтических клеток-
- 2 045419 предшественников/общее число клеток в клеточной популяции] не менее, чем 40%.
[16] Клеточную популяцию по [15], где указанным отношением является отношение гемопоэтических клеток-предшественников, также экспрессирующих молекулы одного или более видов, выбранные из первой группы, состоящей из CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD200, CD218a, CD7 и
CD144.
[17] Клеточную популяцию по [15], где указанным отношением является отношение гемопоэтических клеток-предшественников, также не экспрессирующих молекулы одного или более видов, выбранные из второй группы, состоящей из CD49f, CD51 и CD102.
[18] Реагент для разделения гемопоэтических клеток-предшественников, где указанный реагент включает антитело против каждой из молекул одного или более видов, выбранных из группы, состоящей из CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262, CD325, CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102 и CD156c.
[19] Реагент по [18], также включающий антитела одного или более видов против CD235a, CD14, CD45, CD34 и/или CD43.
[20] Способ детектирования белка на поверхности гемопоэтических клеток-предшественников, где указанный способ включает контактирование гемопоэтических клеток-предшественников с регентом, который специфически связывается с CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262, CD325, CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102, CD109 или CD156c.
[21] Способ в соответствии с [20], где реагент содержит антитело или его фрагмент.
[22] Способ в соответствии с [20] или [21], где реагент также содержит флуорофор.
[23] Способ в соответствии с любым из [20]-[22], также включающий контактирование гемопоэтических клеток-предшественников с реагентом, который специфически связывается с CD34, CD43, CD14, или CD235a.
[24] Способ детектирования множества белков на поверхности гемопоэтических клетокпредшественников, где указанный способ включает контактирование гемопоэтических клетокпредшественников с реагентом, который специфически связывается с каждым из множества белков, где множество белков включает любую комбинацию белков двух или более видов, выбранных из группы, состоящей из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или всех 29: CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262, CD325, CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102, CD109 и CD156c.
[25] Способ отбора гемопоэтических клеток-предшественников из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, где указанный способ включает детектирование присутствия или отсутствия белков одного или более видов на поверхности клетки в соответствии со способом по любому из [20] - [24], и отбор клеток, если:
(i) на поверхности клеток детектируются нижеследующие белки одного или более видов: CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262 и CD325, и/или если:
(ii) на поверхности клеток не детектируются нижеследующие белки одного или более видов: CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102, CD109 и CD156c.
[26] Способ в соответствии с [25], где клетку отбирают, если на ее поверхности детектируются нижеследующие белки одного или более видов: CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD200, CD218a, CD7 и CD144.
[27] Способ в соответствии с [25] или [26], где клетку отбирают, если на ее поверхности не детектируются нижеследующие белки одного или более видов: CD49f, CD51 и CD102.
[28] Способ отбора гемопоэтических клеток-предшественников из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, где указанный способ включает детектирование присутствия или отсутствия белков одного или более видов на поверхности клетки в соответствии со способом по любому из [20] - [24], и отбор клеток, если:
(i) на поверхности клеток детектируются CD45, CD34 и/или CD43 и нижеследующие белки одного или более видов: CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262 и CD325, и/или если:
(ii) на поверхности клеток не детектируются CD14 и/или CD235a, и на поверхности клеток также не детектируются нижеследующие белки одного или более видов: CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102, CD109 и CD156c.
Эффект изобретения
Способ продуцирования согласно изобретению с использованием маркеров НРС одного вида позволяет получить большее число CD8-позитивных клеток (например, CD4/CD8DP-клеток, CD8SPклеток) и/или получить CD8-позитивные клетки в более высокой концентрации. Кроме того, способ продуцирования согласно изобретению позволяет получить стабильные CD8-позитивные клетки (например,
- 3 045419
CD4/CD8DP-клетки, CD8SP-клетки) с меньшей вариабельностью выхода. Таким образом, способ продуцирования согласно изобретению представляет собой усовершенствованный способ выделения гемопоэтических клеток-предшественников из популяции клеток. Это позволяет получить улучшенный источник клеток для продуцирования CD8-позитивных клеток. Этот новый способ продуцирования основан на удивительном и неожиданном обнаружении авторами того факта, что некоторые НРС-позитивные маркеры и НРС-негативные маркеры могут быть использованы для значительного улучшения качества и/или увеличения количества CD8-позитивных клеточных популяций, происходящих от НРС. Этот предпочтительный источник CD8-позитивных клеток согласно изобретению позволяет получить улучшенные CD8позитивные клеточные популяции для их применения в клинических целях (например, в клеточной терапии, в диагностике и для введения in vitro).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу продуцирования CD8-позитивных клеток (например, CD4/CD8DP-клеток), включающему (стадия 1) выделение клеток, экспрессирующих маркеры гемопоэтических клеток-предшественников одного или более видов (иногда сокращенно называемых в настоящем описании маркерами НРС), и/или клеток, не экспрессирующих маркеры НРС одного или более видов из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, и (стадия 2) дифференцировку клеток, выделенных в стадии 1, в CD8-позитивные клетки (например, клетки, позитивные по двум CD4/CD8 (иногда сокращенно называемые в настоящем описании CD4/CD8DPклетками)(далее в настоящем изобретении, это способ будет сокращенно называться способом продуцирования согласно изобретению) и т.п.
В настоящем изобретении, CD8-позитивная клетка означает клетку, экспрессирующую CD8, и их примерами являются CD4/CD8DP-клетка и клетка, позитивная по одному CD8 (иногда сокращенно называемая в настоящем описании CD8SP-клеткой). В настоящем изобретении, CD4/CD8DP-клетка означает Т-клетку, одновременно экспрессирующую CD4 и CD8, a CD8SP-клетка означает Т-клетку, которая не экспрессирует CD4, но экспрессирует CD8. Примерами CD8SP-клеток являются цитотоксический Т-лимфоцит и его клетка-предшественник. Кроме того, в настоящем изобретении, Т-клетка означает, например, клетку, экспрессирующую антигенный рецептор, называемый Т-клеточным рецептором (TCR), на ее поверхности, и ее клетку-предшественника (например, про-Т-клетку, которая не экспрессирует TCR (TCRae), пре-Т-клтеку, в которой TCRe и пре-TCRa являются ассоциированными).
В настоящем изобретении, гемопоэтическая клетка-предшественник означает CD34-позитивную клетку, а предпочтительно CD34/CD43DP-клетку. Производные гемопоэтических клетокпредшественников, используемых в настоящем изобретении, не имеют конкретных ограничений и могут представлять собой, например, гемопоэтическую клетку-предшественника, индуцированную in vitro (например, гемопоэтическую клетку-предшественника, полученную путем индуцирования дифференцировки плюрипотентной стволовой клетки) известным методом (например, методами, описанными в патентных документах 1, 2, и в непатентных документах 1-3), или гемопоэтическую клетку-предшественника, выделенную из биологической ткани известным методом.
Примерами плюрипотентных стволовых клеток являются эмбриональная стволовая клетка (ESклетка), индуцированная плюрипотентная стволовая клетка (iPS-клетка), эмбриональная клетка карциномы (ЕС-клетка) и эмбриональная зародышевая клетка (EG-клетка), а предпочтительно, iPS-клетка (более предпочтительно, человеческая iPS-клетка). Если вышеупомянутой плюрипотентной стволовой клеткой является ES-клетка или любая клетка, происходящая от человеческого эмбриона, то такая клетка может быть получена путем разрушения эмбриона или без его разрушения, причем, предпочтительной является клетка, полученная без разрушения эмбриона.
Вышеупомянутой iPS-клеткой является искусственная стволовая клетка, происходящая от соматической клетки, свойства которой являются почти такими же, как свойства ES-клетки, например, плюрипотентность и способность пролиферироваться посредством ауторепликации, и такая клетка может быть получена путем введения конкретных факторов перепрограммирования в форме ДНК или белка в соматическую клетку (см., например, Takahashi K. и Yamanaka S. (2006) Cell, 126; 663-676: Takahashi K. et al. (2007) Cell, 131; 861-872: Yu J. et al. (2007) Science, 318; 1917-1920: Nakagawa M.et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26; 101-106). Если используется iPS-клетка, то она может быть получена из соматической клетки методом, известным per se, либо может быть также использована iPS-клетка, которая уже была продуцирована и культивирована. Хотя соматическая клетка, от которой происходит iPS-клетка, используемая в настоящем изобретении, не имеет конкретных ограничений, однако, предпочтительной является клетка, происходящая от периферической крови или пуповинной крови. Животные, от которых происходит плюрипотентная стволовая клетка, не имеют конкретных ограничений, например, такими животными являются млекопитающие, такие как мыши, крысы, хомячки, морские свинки, собаки, обезьяны, орангутанги, шимпанзе, человек и т.п., но предпочтительным является человек.
Гемопоэтическая клетка-предшественник может быть получена путем обработки вышеупомянутой плюрипотентной стволовой клетки методом, известным per se. Если вышеупомянутой плюрипотентной стволовой клеткой является iPS-клетка, то гемопоэтическая клетка-предшественник может быть получена методом, описанным, например, в WO 2017/221975.
- 4 045419
Вышеупомянутая биологическая ткань не имеет конкретных ограничений, при условии, что она содержит гемопоэтические клетки-предшественники. Примерами являются периферическая кровь, лимфоузел, костный мозг, тимус, селезенка и пуповинная кровь. Из них предпочтительными являются периферическая кровь и пуповинная кровь, поскольку они имеют низкую степень инвазивности у животных и могут быть легко получены.
Гемопоэтическими клетками-предшественниками и плюрипотентными стволовыми клетками, используемыми в настоящем изобретении, предпочтительно, являются клетки, удовлетворяющие стандартам GMP (Стандартам по приготовлению лекарственных средств) в соответствии с аспектами их применения для лечения.
В настоящем изобретении, маркер НРС означает любую молекулу, выбранную из CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262 и CD325, представляющих собой молекулы, которые могут экспрессироваться на поверхности гемопоэтической клетки-предшественника (в настоящем описании, эти маркеры иногда называются маркером(ами), позитивным(и) по НРС, маркером(ами) отбора, позитивным(и) по НРС или позитивным(и) маркером(ами) НРС), или любую молекулу, выбранную из CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102 и CD156c, представляющих собой молекулы, которые обычно не экспрессируется на поверхности гемопоэтической клетки-предшественника (в настоящем описании, эти маркеры иногда называются маркером(ами), негативным(и) по НРС, маркером(ами) отбора, негативным(и) по НРС или негативным(и) маркером(ами) НРС)(в описании настоящей заявки, маркер, позитивный по НРС и маркер, негативный по НРС, иногда называются общим термином маркер(ы) НРС согласно изобретению). Из этих НРС-позитивных маркеров согласно изобретению, предпочтительными являются CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD200, CD218a, CD200, CD7 или CD144, а более предпочтительными являются CD90, CD143, CD218a или CD200. В другом варианте осуществления изобретения, предпочтительными являются CD24, CD62L, CD90, CD143, Cd263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200 или CD218a, а более предпочтительными являются CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD200 или CD218a. В настоящем изобретении, клетка, экспрессирующая вышеупомянутый НРС-позитивный маркер, также иногда называется клеткой, позитивной по маркеру НРС (или клеткой, позитивной по маркеру НРС), и, например, клетка, экспрессирующая молекулу CD24, иногда называется клеткой, позитивной по CD24. Из НРС-негативных маркеров согласно изобретению, предпочтительными являются CD49f, CD51 или CD102. В настоящем изобретении, клетка, которая не экспрессирует вышеупомянутые НРС-негативные маркеры, иногда называется клеткой, негативной по маркеру НРС.
В репрезентативном варианте осуществления изобретения, CD8-позитивные клетки, предпочтительно, клетки, позитивные по двум CD4/CD8, получают путем выделения из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, клеток (а) экспрессирующих CD34 и CD43, и (b) экспрессирующих CD62L, CD24, CD90, CD143, CD218a, CD263 или Notch3, и (с) не экспрессирующих CD235а или CD14.
В репрезентативном варианте осуществления изобретения, CD8-позитивные клетки, предпочтительно, клетки, позитивные по двум CD4/CD8, получают путем выделения из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, клеток (а) экспрессирующих CD34 и CD43, и (b) экспрессирующих CD90, CD143, CD200, CD218a или CD263 и (с) не экспрессирующих CD235a или CD14.
В репрезентативном варианте осуществления изобретения, CD8-позитивные клетки, предпочтительно, клетки, позитивные по двум CD4/CD8, получают путем выделения из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, клеток, (а) экспрессирующих CD34 и CD43, и (b) экспрессирующих CD7, CD144, CD56, CD226, CD262 или CD325 и (с) не экспрессирующих CD235a или CD14.
В репрезентативном варианте осуществления изобретения, CD8-позитивные клетки, предпочтительно, клетки, позитивные по двум CD4/CD8, получают путем выделения из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, клеток, экспрессирующих (a) CD34 и CD43, и (b) не экспрессирующих CD49f, CD51, CD426, CD61, CD62P, CD69 или CD156c, и (с) не экспрессирующих CD235a или CD14.
В настоящем изобретении, термин экспрессирующий означает, что экспрессия может быть детектирована методом, применяемым для разделения клеток, а не экспрессирующий означает, что детектирование не может быть достигнуто в нужных пределах чувствительности методом, применяемым для разделения клеток. В качестве метода, применяемого для разделения клеток, может служить метод, осуществляемый на основе нижеупомянутой проточной цитометрии или масс-цитометрии, метод магнитного разделения клеток и т.п.
В качестве клеток, разделенных в вышеупомянутой стадии 1, может служить клетка, экспрессирующая НРС-позитивные маркеры одного или более видов, и клетка, не экспрессирующая НРСнегативные маркеры одного или более видов. В одном из вариантов осуществления изобретения, клетки, разделенные в вышеупомянутой стадии 1, представляют собой клетки, которые экспрессируют, помимо НРС-позитивных маркеров согласно изобретению одного или более видов, CD34 и/или CD43, и/или
- 5 045419 клетки, которые не экспрессируют НРС-негативные маркеры одного или более видов согласно изобретению и экспрессируют CD34 и/или CD43. Выделяемой клеткой предпочтительно, является CD235анегативная, CD14-негативная и/или CD45-позитивная клетка. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения, вышеупомянутую стадию 1 осуществляют путем выделения клеток одного или более видов, которые являются CD235а-негативными, CD14-негативными, CD45позитивными, CD34-позитивными и CD43-позитивными, и позитивными по НРС-позитивному(ым) маркеру(ам) одного или более видов согласно изобретению, и/или клеток, негативных по НРС-негативным маркерам согласно изобретению одного или более видов, из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники.
В настоящем изобретении, термин разделение клеток охватывает вариант, включающий отбор клеток, экспрессирующих НРС-позитивные маркеры одного или более видов и/или не экспрессирующих НРС-негативные маркеры одного или более видов, а также выделение отобранных клеток, и вариант, включающий обработку отобранных клеток в следующей стадии дифференцировки.
Каждый из используемых здесь терминов, таких как содержащий или содержит может быть, но необязательно, заменен термином состоящий из или состоит из.
Примерами способов выделения клеток, экспрессирующих НРС-позитивные маркеры одного или более видов и/или не экспрессирующих НРС-негативные маркеры одного или более видов, из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, являются способ, проводимый с использованием проточной цитометрии или масс-цитометрии, способ магнитного разделения клеток и т.п., и эти способы могут быть осуществлены известными методами. Так, например, клетка, экспрессирующая НРС-позитивные маркеры одного или более видов, и/или клетка, не экспрессирующая НРСнегативные маркеры одного или более видов, могут быть разделены способом, включающим стадию контактирования клетки с веществом (например, с антителом), которое специфически связывается с каждым из маркеров НРС. Вышеупомянутое вещество включает вещество, непосредственно добавленное с детектируемой меткой (например, GFP), и вещество, которое не было непосредственно добавлено с меткой. Если вышеупомянутое вещество не было непосредственно добавлено с меткой, то вышеупомянутое разделение может быть осуществлено дополнительно с использованием вещества, добавленного с детектируемой меткой, которая непосредственно или опосредованно распознает вещество. Так, например, если вышеупомянутым веществом является антитело, то антитело может содержать, непосредственно или опосредованно, флуоресцентный краситель, изотоп металла или сферу (например, магнитную сферу) для мечения маркера НРС на клеточной поверхности. Клетки могут быть разделены на основе такой метки. Используемым здесь антителом могут быть антитела только одного вида или двух или более видов.
Примерами методов дифференцировки клеток, выделенных как клетки, экспрессирующие НРСпозитивные маркеры одного или более видов, и/или клетки, не экспрессирующие НРС-негативные маркеры одного или более видов согласно изобретению, из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, в CD8-позитивные клетки, являются известные методы (например, методы, описанные в WO 2016/076415, Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175, Cell Reports 2(2012) 1722-1735, WO 2017/221975).
1. Способ продуцирования CD4/CD8DP-клеток.
Примерами базальной среды для культивирования клеток, используемой в стадии 2 способа продуцирования согласно изобретению, являются среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков (IMDM); среда 199; минимальная поддерживающая среда Игла (ЕМЕМ); среда аМЕМ; модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM); среда Хэмса F12; среда RPMI 1640; среда Фишера; нейробазальная среда (Life Technologies) и их смесь. Среда может содержать, а может и не содержать, сыворотку. Если это необходимо, то базальная среда может также содержать одно или более веществ, выбранных из витаминов С (например, аскорбиновой кислоты, фосфата витамина С), альбумина, инсулина, трансферина, селена, жирной кислоты, микроэлементов, 2-меркаптоэтанола, тиола-глицерина, липидов, аминокислот, L-глутамина, заменимых аминокислот, витаминов, факторов роста, низкомолекулярных соединений, антибиотиков, антиоксидантов, пировиноградной кислоты, буферов, неорганических солей, цитокинов и т.п.
Вышеупомянутая среда, предпочтительно, содержит цитокин. В качестве цитокина могут быть использованы IL-7, FLT-3L, SCF, ТРО и их комбинация и т.п., а предпочтительными являются FLT-3L и IL-7. Концентрация IL-7 в среде, предпочтительно, составляет 1 нг/мл - 50 нг/мл (например, 1 нг/мл, 2 нг/мл, 3 нг/мл, 4 нг/мл, 5 нг/мл, 6 нг/мл, 7 нг/мл, 8 нг/мл, 9 нг/мл, 10 нг/мл, 20 нг/мл, 30 нг/мл, 40 нг/мл, 50 нг/мл), а особенно предпочтительно, 5 нг/мл. Концентрация FLT-3L в среде, предпочтительно, составляет 1 нг/мл - 100 нг/мл (например, 1 нг/мл, 2 нг/мл, 3 нг/мл, 4 нг/мл, 5 нг/мл, 6 нг/мл, 7 нг/мл, 8 нг/мл, 9 нг/мл, 10 нг/мл, 20 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл), а особенно предпочтительно, 10 нг/мл. Специалист в данной области может самостоятельно определить концентрацию других цитокинов исходя из условий культивирования и т.п. Среда, предпочтительно, содержит лиганд Notch (например, гибридный белок Dll1, Dll4, Dll1 или Dll4 и Fc). При использовании лиганда Notch, он может быть добавлен в среду или нанесен на поверхность контейнера с культурой. Кроме того, может быть также использована фидерная клетка, экспрессирующая лиганд Notch.
В способе продуцирования согласно изобретению, гемопоэтические клетки-предшественники, по
- 6 045419 лученные в стадии 1, могут быть культивированы в виде адгезионной культуры или суспензионной культуры. В случае адгезионной культуры, может быть использован сосуд для культивирования с покрытием, и гемопоэтические клетки-предшественники могут быть совместно культивированы с фидерными клетками или другими клетками. Для применения в терапии, предпочтительно, чтобы культура не содержала фидерных клеток. Примерами субстрата для покрытия контейнера с культурой являются фрагмент фибронектина (например, ретронектин), пронектин, витронектин, Матригель (BD), коллаген типа I, коллаген типа IV, желатин, ламинин, протеогликан, содержащий гепарансерную кислоту и их комбинация. В качестве фидерных клеток, подвергаемых совместному культивированию, могут служить, например, клетки интерстициальной клеточной линии костного мозга ОР9, клетки мышиной мезенхимальной клеточной линии 10T1/2 и клетки Tst-4. При использовании фидерных клеток, эти клетки, предпочтительно, должны быть заменены в процессе культивирования. Замена фидерных клеток может быть осуществлена путем переноса рассматриваемых клеток, которые культивируют на предварительно засеянных фидерных клетках. Замену, предпочтительно, осуществляют через каждые 2-5 дней.
В настоящем изобретении, температура культивирования гемопоэтических клетокпредшественников для индуцирования CD4/CD8DP-клеток не имеет конкретных ограничений. Такая температура, предпочтительно, составляет, приблизительно от 37°С до приблизительно 42°С, а более предпочтительно, приблизительно от 37°С до приблизительно 39°С. Время культивирования может быть соответствующим образом определено специалистом в данной области путем мониторинга числа CD4/CD8DP-клеток и других клеток. Число дней культивирования для индуцирования CD4/CD8DPклеток из гемопоэтических клеток-предшественников не имеет конкретных ограничений при условии, что могут быть получены CD4/CD8DP-клетки. Время культивирования составляет, предпочтительно, не менее, чем 10 дней (например, 12 дней, 14 дней, 16 дней, 18 дней, 20 дней или более), и не более чем 60 дней. Как показано в описанных ниже примерах, в конкретном варианте осуществления изобретения, большое количество CD4/CD8DP-клеток может быть успешно получено путем культивирования в течение 21 дня - 28 дней.
В настоящем изобретении, полученные CD4/CD8DP-клетки могут быть выделены до их использования, либо они могут быть использованы в виде клеточной популяции, содержащей клетки другого типа (например, CD8SP-клетки). При выделении, клетки могут быть выделены с использованием молекул CD4, CD8, CD3, CD45 и т.п. в качестве индекса. В качестве метода выделения может быть применен метод, хорошо известный специалистам в данной области, и такими методами могут быть, например, метод мечения молекулой антитела в качестве индекса и метод с использованием вышеупомянутой проточной цитометрии или масс-цитометрии, метод магнитного разделения клеток или метод очистки с использованием аффинной колонки, на которой иммобилизуют нужный антиген, и т.п.
2. Способ получения клеток, позитивных по одному CD8.
CD8SP-клеткu могут быть получены путем обработки CD4/CD8DP-клеток, полученных способом продуцирования согласно изобретению в стадии индуцирования дифференцировки в CD8SP-клетки (такой способ продуцирования CD8SP-клеток иногда сокращенно называется способом продуцирования CD8SP-клеток согласно изобретению). Способ продуцирования CD4/CD8DP-клеток описан в параграфе 1.
В качестве базальной среды и среды, используемой в способе продуцирования CD8SP-клеток согласно изобретению, могут быть использованы среды, аналогичные базальной среде и среде, описанной в параграфе 1.
Вышеупомянутая среда может содержать гормон коры надпочечников в качестве агента. Примерами гормонов коры надпочечников являются, например, глюкокротикоид и его производное. Примерами глюкокротикоидов являются, например, ацетат кортизона, гидрокортизон, ацетат флудрокортизона, преднизолон, тримацинолон, метилпреднизолон, дексаметазон, бетаметазон и дипропионат беклометазона. Из них предпочтительным является дексаметазон. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения, способ продуцирования клеток, позитивных по одному CD8, включает стадию индуцирования клеток, позитивных по двум CD4/CD8, с получением клеток, позитивных по одному CD8, путем культивирования указанных клеток, позитивных по двум CD4/CD8, в присутствии гормона коры надпочечников, а предпочтительно, дексаметазона.
При использовании дексаметазона в качестве гормона коры надпочечников, его концентрация в культуральной среде составляет, предпочтительно, 1 нМ - 100 нМ (например, 1 нМ, 5 нМ, 10 нМ, 20 нМ, 30 нМ, 40 нМ, 50 нМ, 60 нМ, 70 нМ, 80 нМ, 90 нМ, 100 нМ), а особенно предпочтительно, 10 нМ.
Вышеупомянутая среда может содержать антитело (например, анти-CD3 антитело, анти-CD28 антитело, анти-CD2 антитело), цитокин (например, IL-7, IL-2, IL-15) и т.п.
Ahtu-CD3 антитело, используемое в настоящем изобретении, не имеет конкретных ограничений, при условии, что оно будет специфически распознавать CD3. Так, например, может быть использовано антитело, продуцированное из клона OKT3. Ahtu-CD3 антитело может быть связано с магнитными сферами и т.п., или вместо добавления вышеупомянутого анти-CD3 антитела к среде, может быть осуществлена стимуляция путем инкубирования Т-лимфоцитов в течение определенного периода времени в сосуде для культивирования, на поверхности которого находится связанное анти-CD3 антитело. Концентрация анти-CD3 антитела в среде, предпочтительно, составляет 10 нг/мл - 1000 нг/мл (например, 10 нг/мл,
- 7 045419 нг/мл, 100 нг/мл, 200 нг/мл, 300 нг/мл, 400 нг/мл, 500 нг/мл, 600 нг/мл, 700 нг/мл, 800 нг/мл, 900 нг/мл, 1000 нг/мл), а особенно предпочтительно, 500 нг/мл. Концентрация других антител может быть также соответствующий образом определена специалистом в данной области исходя из условий культивирования и т.п. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения, способ продуцирования клеток, позитивных по одному CD8, включает стадию индуцирования клеток, позитивных по двум CD4/CD8, с получением клеток, позитивных по одному CD8, путем культивирования указанных клеток, позитивных по двум CD4/CD8, в присутствии анти-CD3 антитела.
Концентрация IL-2 в среде, используемой в настоящем изобретении, предпочтительно, составляет 10 ед./мл - 1000 ед./мл (например, 10 ед./мл, 20 ед./мл, 30 ед./мл, 40 ед./мл, 50 ед./мл, 60 ед./мл, 70 ед./мл, 80 ед./мл, 90 ед./мл, 100 ед./мл, 500 ед./мл, 1000 ед./мл), а особенно предпочтительно, 100 ед./мл. Концентрация IL-7 или IL-15 в среде, используемой в настоящем изобретении, предпочтительно, составляет 1 нг/мл - 100 нг/мл (например, 1 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 20 нг/мл, 30 нг/мл, 40 нг/мл, 50 нг/мл, 60 нг/мл, 70 нг/мл, 80 нг/мл, 90 нг/мл, 100 нг/мл), а особенно предпочтительно, 10 нг/мл. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения, способ продуцирования клеток, позитивных по одному CD8, включает стадию индуцирования клеток, позитивных по двум CD4/CD8, с получением клеток, позитивных по одному CD8, путем культивирования указанных клеток, позитивных по двум CD4/CD8, в присутствии цитокина, а предпочтительно, IL-2.
В способе продуцирования CD8SP-клеток согласно изобретению, температура культивирования CD4/CD8DP-клеток не имеет конкретных ограничений. Такая температура, предпочтительно, составляет, приблизительно от 37°С до приблизительно 42°С, а более предпочтительно, приблизительно от 37°С до приблизительно 39°С. Время культивирования может быть соответствующим образом определено специалистом в данной области путем мониторинга числа CD8-позитивных клеток и других клеток. Число дней культивирования не имеет конкретных ограничений при условии, что могут быть получены CD8SPклетки. Время культивирования, предпочтительно, составляет не менее, чем 1 день, не менее, чем 3 дня, не менее, чем 7 дней, а, предпочтительно, не более, чем 60 дней.
CD8SP-клетки, полученные способом продуцирования согласно изобретению, не ограничиваются клетками, полученными путем дифференцировки из CD4/CD8DP-клеток (например, клеток, полученных как описано выше в параграфе 2). Следовательно, например, CD8SP-клетки, полученные без использования CD4/CD8DP-клеток, из клеток, выделенных как клетки, экспрессирующие один или более НРСпозитивных маркеров и/или не экспрессирующие один или более НРС-негативных маркеров согласно изобретению, из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, также входят в объем CD8SP-клеток, полученных способом продуцирования согласно изобретению.
3. Клеточная популяция, содержащая гемопоэтические клетки-предшественники, экспрессирующие один или более маркеров НРС.
Настоящее изобретение относится к клеточной популяции (далее сокращенно называемой клеточной популяцией согласно изобретению), содержащей большое количество гемопоэтических клетокпредшественников, экспрессирующих НРС-позитивные маркеры одного или более видов и/или не экспрессирующих НРС-негативные маркеры одного или более видов. Вышеупомянутая клеточная популяция может быть получена, например, путем выделения клеток, экспрессирующих НРС-позитивные маркеры одного или более видов и/или не экспрессирующих НРС-негативные маркеры одного или более видов, из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, методом разделения, описанным выше. Определение маркера НРС, специфических молекул и гемопоэтических клетокпредшественников является таким, как оно описано выше.
Клеточная популяция согласно изобретению не имеет конкретных ограничений при условии, что она будет давать более высокое отношение гемопоэтических клеток-предшественников, экспрессирующих НРС-позитивные маркеры одного или более видов и/или не экспрессирующих НРС-негативные маркеры одного или более видов (число гемопоэтических клеток-предшественников/общее число клеток, содержащихся в клеточной популяции), чем отношение, полученное стандартным методом (например, методом разделения с использованием CD34-позитивных, CD34-позитивных и CD43-позитивных, или CD43-позитивных и CD34-, CD31- или CD144-позитивных клеток в качестве индекса). Предпочтительно, чтобы такое количество составляло не менее, чем 40% (например, не менее, чем 50%, не менее, чем 60%, не менее, чем 70%, не менее, чем 80%, не менее, чем 90%, 100%). Клеточная популяция согласно изобретению может быть получена методом, описанным в стадии 1 способа продуцирования согласно изобретению. Число гемопоэтических клеток-предшественников, экспрессирующих НРС-позитивные маркеры одного или более видов и/или не экспрессирующих НРС-негативные маркеры одного или более видов, может быть определено с помощью проточной цитометрии.
Как показано в примерах, описанных ниже, клеточная популяция согласно изобретению обнаруживает высокую эффективность дифференцировки в CD4/CD8DP-клетки и CD8SP-клетки по сравнению с клеточной популяцией, которая не была подвергнута разделению клеток, экспрессирующих НРСпозитивные маркеры одного или более видов и/или не экспрессирующих НРС-негативные маркеры одного или более видов, а также превосходную способность к пролиферации.
4. Реагент для разделения клеточной популяции согласно изобретению.
- 8 045419
Настоящее изобретение также относится к реагенту для разделения клеточной популяции согласно изобретению (далее сокращенно называемому реагентом согласно изобретению), где указанный реагент содержит антитело против маркера НРС согласно изобретению, а именно, против одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD56, CD226, CD262, CD325, CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102 и CD156c, а предпочтительно, CD24, CD62L, CD90, CD143, CD263, Notch3, CD200, CD218a, CD7, CD144, CD49f, CD51 и CD102. Если реагент согласно изобретению содержит антитела против маркера НРС двух или более видов, то такой реагент может поставляться в виде набора реагентов, содержащего каждое антитело в отдельном реагенте. Антитело, содержащееся в реагенте согласно изобретению, может быть получено в форме, например, антитела, связанного с флуоресцентным красителем, изотопом металла или сферой (например, магнитой сферой), в соответствии со способами разделения, применяемыми в стадии 1 способа продуцирования согласно изобретению.
Реагент согласно изобретению может также содержать анти-CD4 антитело и/или анти-CD8 антитело и, если это необходимо, антитела одного или более видов против других маркеров клеточной поверхности (например, CD3, CD45, CD235a, CD14, CD45, CD34, CD43), которые, как известно, экспрессируются и/или не экспрессируются в CD4/CD8DP-клетке и/или в CD8SP-клетке, и может быть использован как реагент для разделения CD4/CD8DP-клетки или CD8SP-клетки, индуцированной для дифференцировки из клеточной популяции согласно изобретению.
Кроме того, реагент согласно изобретению может также содержать реагенты (например, базальную среду, аддитивную среду и т.п.) для индуцирования дифференцировки гемопоэтических клетокпредшественников в CD4/CD8DP-клетку, а также в CD8SP-клетку. В качестве реагентов могут быть аналогичным образом использованы вещества, перечисленные в вышеупомянутом параграфе 1 и в вышеупомянутом параграфе 2.
Настоящее изобретение более подробно описано со ссылкой на примеры, которые приводятся лишь в иллюстративных целях и не рассматриваются как ограничение объема изобретения.
Примеры
Пример 1. Условия культивирования с использованием штамма TKT3V1-7.
В качестве клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники (далее иногда обозначаемые НРС), может быть использована неадгезивная клеточная популяция, полученная посредством дифференцировки iPS-клеток (штамма TKT3V1-7) в соответствии с известным методом (например, методами, описанными в Cell Reports 2(2012) 1722-1735 и WO 2017/221975). Для сообщения специфичности, штамм TKT3V1-7 высевали при 3x105 клеток/лунку в 6-луночный планшет, который подвергали обработке в условиях сверхнизкой адгезии (день 0) и культивировали в течение 5 дней в условиях низкой концентрации кислорода (5% О2) в среде ЕВ (в среде StemPro34, в которую добавляли 10 мкг/мл человеческого инсулина, 5,5 мкг/мл человеческого трансферина, 5 нг/мл селенита натрия, 2 мМ L-глутамина, 45 мМа-монотиоглицераина и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты) с добавлением 10 нг/мл ВМР4, 5 нг/мл bFGF, 15 нг/мл VEGF, 2 мкМ SB431542 (день 5). Затем последовательно добавляли 50 нг/мл SCF, 30 нг/мл ТРО, 10 нг/мл Flt3L, и клетки снова культивировали в течение 5-9 дней (день -14) с получением популяции неадгезивных клеток. Во время культивирования, среду заменяли через каждые 2 или 3 дня. Вышеупомянутую популяцию неадгезивных клеток, содержащую НРС, окрашивали нижеследующей серией антител для каждой группы образцов.
- 9 045419
Таблица 1
| Группа образцов (серия антител) | Антитело | Производитель | Флуоресцентная молекула, связанная с антителом |
| 1 | анти-СПЗ 4 антитело | Abeam | РЕ-Су7 |
| анти-СП43 антитело | BD | АРС | |
| анти-СП45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| анти-СО235а антитело | BD | FITC | |
| aHTH-CD62L антитело | Biolegend | РЕ | |
| 2 | анти-СО34 антитело | Abeam | РЕ-Су7 |
| анти-СО43 антитело | BD | АРС | |
| анти-СО45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| анти-СО235а антитело | BD | FITC | |
| анти-СО24 антитело | Biolegend | РЕ | |
| 3 | анти-СО34 антитело | Abeam | РЕ-Су7 |
| анти-СО43 антитело | BD | АРС | |
| анти-СО45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| анти-СО235а антитело | BD | FITC | |
| aHTH-CD90 антитело | Biolegend | РЕ | |
| 4 | анти-СО34 антитело | Abeam | РЕ-Су7 |
| анти-СО43 антитело | BD | АРС | |
| анти-СО45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| анти-СО235а антитело | BD | FITC | |
| анти-CD 143 антитело | Biolegend | РЕ | |
| 5 | анти-СО34 антитело | Abeam | РЕ-Су7 |
| aHTH-CD43 антитело | BD | BV510 | |
| анти-СО45 антитело | Biolegend | АРС/Су7 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | FITC | |
| анти-СО235а антитело | BD | FITC | |
| анти-СО218а антитело | eBioscience | АРС | |
| 6 | анти-СО34 антитело | Abeam | РЕ-Су7 |
- 10 045419
| анти-СП43 антитело | BD | APC | |
| анти-СП45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| aHTn-CD235a антитело | BD | FITC | |
| aHTn-CD263 антитело | Biolegend | PE | |
| 7 | анти-СО34 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| анти-СО43 антитело | BD | APC | |
| aHTn-CD45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| aHTn-CD235a антитело | BD | FITC | |
| aHTn-Notch3 антитело | Biolegend | PE |
После вышеупомянутого окрашивания, клеточные популяции подвергали сортингу с помощью FACSAria. Клеточные фракции, полученные от каждой вышеупомянутой группы образцов, представлены ниже.
Таблица 2
| Группа образцов | Полученная фракция клеток |
| 1 | Фракция А, фракция В и фракция С |
| 2 | Фракция D и фракция Е |
| 3 | Фракция F и фракция G |
| 4 | Фракция Н и фракция I |
| 5 | Фракция J и фракция К |
| 6 | Фракция L и фракция М |
| 7 | Фракция N и фракция О |
В вышеупомянутой таблице фракции A-G, соответственно, показаны ниже.
фракция А: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-nозитивная, CD43-позитивная, фракция В: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD62Lпозитивная, фракция С: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD62Lнегативная, фракция D: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD24позитивная, фракция Е: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-nозитивная, CD43-позитивная, CD24негативная, фракция F: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD90позитивная, фракция G: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD90негативная, фракция Н: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD143позитивная, фракция I: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-nозитивная, CD143негативная, фракция J: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD218апозитивная, фракция K: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD218анегативная, фракция L: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-nозитивная, CD43-позитивная, CD263позитивная, фракция М: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-πозитивная, CD263негативная фракция N: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-πозитивная, Notch3позитивная, фракция О: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-πозитивная, Notch3негативная.
- 11 045419
Клетки, содержащиеся в вышеупомянутых фракциях А-О, подвергали дифференцировке в лимфоидные клетки известным методом (например, методами, описанными в Journal of Leukocyte Biology 96(2016) 1165-1175 и WO 2017/221975). Для сообщения специфичности, каждую клеточную популяцию фракций А-О высевали при 2000 клеток/лунку в 48-луночный планшет, покрытый рекомбинантной химерой h-DLL4/Fc (Sino Biological) и ретронектином (Takara Bio Inc.), и культивировали в условиях при 5% СО2, 37°С. Во время культивирования, среду заменяли через каждые 2 или 3 дня. В качестве среды использовали среду ОР9 (содержащиую 15% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 нг/мл стрептамицина, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 10 мкг/мл человеческого инсулина, 5,5 мкг/мл человеческого трансферина, 5 нг/мл селенита натрия) с добавлением 50 нг/мл SCF, нг/мл IL-7, 50 нг/мл Flt3L, 100 нг/мл ТРО, 15 мкМ SB203580, 30 нг/мл SDF-1a. На день 7 и день 14 после начала культивирования, клетки пассировали в 48-луночный планшет с аналогичным покрытием. Все клетки выделяли на 21-й день после начала культивирования, подсчитывали на гемоцитометре и окрашивали нижеследующей серией антител.
Таблица 3
| Серия антител | Производитель | Флуоресцентная молекула, связанная с антителом |
| анти-СВЗ антитело | Biolegend | АРС/Су7 |
| анти-СП45 антитело | Biolegend | Бриллиантовый фиолетовый 510 |
| анти-TCRab антитело | eBio science | FITC |
| анти-CD 8Ь антитело | Beckman | РЕ |
| анти-СП7 антитело | Biolegend | АРС |
| анти-CD 5 антитело | eBio science | РЕ/Су7 |
| анти-CD 8 а антитело | Biolegend | РегСР/Су5.5 |
| aHTH-CD4 антитело | Biolegend | BV421 |
Клеточные популяции, полученные после вышеупомянутого окрашивания, подвергали сортингу с помощью FACSAria. Клеточные фракции, полученные путем вышеупомянутого окрашивания, представлены ниже. В настоящем описании, фракция лимфоцитов представляет собой фракцию, разделенную с использованием FSC (прямого рассеяния) и SSC (бокового рассеяния) и используемую в качестве индексов в методе, аналогичном методу, описанному в руководстве по цитометрии (Communications in Clinical Cytometry 18 (1994) 199-208).
Фракция Р: фракция лимфоцитов.
Фракция Q: фракция лимфоцитов, CD3-позитивнαя, CD45-позитивная, CD5-позитивная, CD7позитивная.
Фракция R: фракция лимфоцитов, CD3-позитивная, CD45-позитивная, CD7-позитивная, CD8апозитивная, CD4-позитивная.
Фракция S: фракция лимфоцитов, CD3-позитивная, CD45-позитивная, CD7-позитивная, CD8апозитивная, CD4-негативная.
Число клеток в каждом образце, взятом из фракций А-0 на день 21 после начала культивирования (отношение к числу клеток образца, взятого из фракции А) представлено в табл. 4.
Таблица 4
| Фракци я А | Фраки ИЯ В | Фрак ция С | Фрак ция D | Фрак ция Е | Фрак ция F | Фрак ция G | Фрак ция Н | Фрак ция I | Фрак ция J | Фрак ция К | Фрак ция L | Фрак ция М | Фрак ция N | Фрак ция О |
| 1 | 6,1 | 0,9 | 4,9 | 1 | 2,4 | 0,5 | 5,8 | 1 | 9,4 | 1,6 | 5,9 | 0,6 | 14 | 0,8 |
Из табл. 4 видно, что клеточные популяции, содержащиеся в образцах, взятых из фракции В (CD62L-позитивной), фракции D (CD24-позитивной), фракции F (CD90-позитивной), фракции Н (CD143позитивной), фракции J (CD218α-позитивной), фракции L (CD263-позитивной) и фракции N (Notch3позитивной), обладали большей способностью к пролиферации по сравнению с клеточной популяцией, содержащейся в образцах, взятых из фракции А.
Число клеток в влеточных фракциях P-S, полученных путем сортинга с помощью FACSAria на 21-й день культивирования (отношение к числу клеток образца, взятого из фракции А), представлено в табл. 5.
- 12 045419
Таблица 5
| Фракция Р | Фракция Q | Фракция R | Фракция S | |
| Взятые из фракции А | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Взятые из фракции F | 4,2-7,9 | 19-62 | 26-222 | 23-69 |
| Взятые из фракции Η | 6,4-9,2 | 42-83 | 143-458 | 46-67 |
| Взятые из фракции J | 6,1-7,9 | 31-50 | 191-455 | 20-28 |
В результате было показано, что клеточная популяция, содержащая (a) CD3-nозитивные, CD45позитивные, CD5-позитивные, CD7-позитивные, CD8а-позитивные и CD4-позитивные клетки или (b) CD3-позитивные, CD45-позитивные, CD5-позитивные, CD7-позитивные, CD8а-позитивные и CD4негативные клетки в высоком соотношении, может быть получена с использованием клеток, происходящих от фракции F, по сравнению с использованием клеток, происходящих от фракции G или фракции А. Аналогичным образом, было показано, что клеточная популяция, содержащая высокое соотношение (a) CD3-позитивных, CD45-позитивных, CD5-позитивных, CD7-позитивных, CD8а-позитивных, и CD4позитивных клеток, или (b) клеточная популяция, содержащая высокое соотношение CD3-позитивных, CD45-позитивных, CD5-позитивных, CD7-позитивных, CD8a-позитивных и CD4-негативных клеток, может быть получена с использованием клеток, происходящих от фракции Н. Кроме того, было показано, что клеточная популяция, содержащая CD3-nозитивные, CD45-позитивные, CD5-позитивные, CD7позитивные, CD8а-позитивные и CD4-позитивные клетки или CD3-позитивные, CD45-позитивные, CD5позитивные, CD7-nозитивные, CD8a-позитивные и CD4-негативные клетки в высоком соотношении, может быть получена с использованием клеток, происходящих от фракции J, по сравнению с использованием клеток, происходящих от фракции К или фракции А. То есть, было показано, что клеточная популяция, содержащая клетки, позитивные по двум CD4/CD8 (или CD8-позитивные клетки) в высоком соотношении, может быть получена путем выделения клеток, экспрессирующих CD90, CD143 или CD218a в виде клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, и путем дифференцировки выделенных клеток.
Пример 2. Условия культивирования с использованием штамма Ff-I01s04.
В качестве клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники (далее иногда обозначаемые НРС), была использована популяция неадгезивных клеток, полученная путем дифференцировки iPS-клеток (штамма Ff-I01s04) в соответствии с методами, описанными в примере 1.
Клеточную популяцию, содержащую НРС, окрашивали серией антител 3, 4, 5 или 6 для каждой группы образцов, представленной в примере 1 (соответственно, указанной как 3b, 4b, 5b, 6b в этом примере) или серией антител 8b, указанной ниже.
- 13 045419
Таблица 6
| Группа образцов (серия антител) | Антитело | Производитель | Флуоресцентная молекула, связанная с антителом |
| ЗЬ | анти-СО34 антитело | Abeam | РЕ/Су7 |
| анти-СП43 антитело | BD | АРС | |
| анти-СО45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| анти-СП235а антитело | BD | FITC | |
| анти-СП90 антитело | Biolegend | РЕ | |
| 8Ь | анти-СПЗ 4 антитело | Abeam | РЕ/Су7 |
| анти-СП43 антитело | BD | BV510 | |
| анти-СП45 антитело | Biolegend | АРС/Су7 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | FITC | |
| aHTn-CD235a антитело | BD | FITC | |
| aHTH-CD200 антитело | Biolegend | Бриллиантовый фиолетовый 421 | |
| 4Ь | aHTH-CD34 антитело | Abeam | РЕ-Су7 |
| aHTH-CD43 антитело | BD | АРС | |
| анти-СО45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| aHTH-CD235a антитело | BD | FITC | |
| анти-CD 143 антитело | Biolegend | РЕ | |
| 5Ь | aHTH-CD34 антитело | Abeam | РЕ-Су7 |
| aHTH-CD43 антитело | BD | BV510 | |
| aHTH-CD45 антитело | Biolegend | АРС/Су7 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | FITC | |
| aHTH-CD235a антитело | BD | FITC | |
| aHTH-CD218a антитело | eBioscience | АРС | |
| 6Ь | aHTH-CD34 антитело | Abeam | РЕ-Су7 |
| aHTH-CD43 антитело | BD | АРС | |
| aHTH-CD45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| анти-СО235а антитело | BD | FITC | |
| анти-СО263 антитело | Biolegend | РЕ |
После вышеупомянутого окрашивания, клеточные популяции подвергали сортингу с помощью FACSAria. Клеточные фракции, полученные от каждой вышеупомянутой группы образцов, представлены ниже.
- 14 045419
Таблица 7
| Группа образцов | Полученная фракция клеток |
| ЗЬ | Фракция f и фракция g |
| 8Ь | Фракция t и фракция и |
| 4Ь | Фракция h и фракция i |
| 5Ь | Фракция j и фракция к |
| 6Ь | Фракция 1 и фракция m |
В вышеуказанной таблице показаны фракции f-m, t и u, соответственно:
фракция f: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD90позитивная, фракция g: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD90негативная, фракция h: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD143позитивная, фракция i: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD143негативная, фракция j: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD218апозитивная, фракция k: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD218анегативная, фракция l: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD263позитивная, фракция m: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD263негативная, фракция t: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD200позитивная, фракция u: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD200негативная.
Клетки, содержащиеся в вышеупомянутых фракциях f-m, t и u, подвергали дифференцировке в лимфоидные клетки методами, описанными в примере 1. Все клетки выделяли на день 28 после начала культивирования и окрашивали нижеследующей серией антител.
Таблица 8
| Серия антител | Производитель | Флуоресцентная молекула, связанная с антителом |
| CD3 | Biolegend | АРС/Су7 |
| CD45 | Biolegend | Бриллиантовый фиолетовый 510 |
| TCRab | eBio science | FITC |
| CD8b | Beckman | РЕ |
| CD7 | Biolegend | АРС |
| CD5 | eBio science | РЕ/Су7 |
| CD8a | Biolegend | РегСР/Су5.5 |
| CD4 | Biolegend | BV421 |
После вышеупомянутого окрашивания, клеточные популяции подвергали сортингу с помощью FACSAria. Клеточные фракции, полученные от каждой вышеупомянутой группы образцов, представлены ниже:
фракция р: фракция лимфоцитов, фракция q: фракция лимфоцитов, CD45-позитивная, CD5-позитивная, CD7-позитивная, фракция r: фракция лимфоцитов, CD45-позитивная, CD7-позитивная, CD8a-позитивная, CD4позитивная, фракция s: фракция лимфоцитов, CD45-nозитивная, CD7-позитивная, CD8a-позитивная, CD4негативная.
Число клеток в каждом образце, взятом из фракций f-m, t и и на день 28 после начала культивирования (отношение к числу клеток в начале культивирования), представлено в табл. 9.
- 15 045419
Таблица 9
| Фракци | Фракци | Фракци | Фракци | Фракци | Фракци | Фракци | Фракци | Фракци | Фракци |
| я | я | я | я | я | я | я | я | я | я |
| f | g | h | i | j | к | 1 | ш | t | и |
| 462,5 | 111,9 | 462,5 | 112,5 | 1125 | 50 | 1222,6 | 56,25 | 850 | 62,5 |
Из табл. 9 видно, что, по способности к пролиферации, фракция f превышает фракцию g, фракция h превышает фракцию i, фракция j превышает фракцию k, фракция l превышает фракцию m, а фракция t превышает фракцию u. То есть, было обнаружено, что клеточные популяции, содержащиеся в образцах, происходящих от CD90-позитивных, CD143-позитивных, CD218а-позитивных, CD263-позитивных или CD200-позитивных фракций, обладают большей способностью к пролиферации.
Число клеток в клеточных фракциях p-s, полученных путем сортинга с помощью FACSAria на 28-й день культивирования клеток, содержащихся во фракциях f-m, t и u и засеянных при 1000 клеток/лунку, представлено в табл. 10.
Таблица 10
| Фракция р | Фракция q | Фракция г | Фракция s | |
| Взятые из фракции f | 208125 | 139860 | 7553 | 40626 |
| Взятые из фракции g | 12085 | 0 | 0 | 0 |
| Взятые из фракции h | 151700 | 96801 | 18704 | 81257 |
| Взятые из фракции i | 11216 | 0 | 0 | 0 |
| Взятые из фракции j | 409500 | 322088 | 83093 | 228521 |
| Взятые из фракции к | 4430 | 0 | 0 | 0 |
| Взятые из фракции 1 | 419352 | 257113 | 22019 | 277591 |
| Взятые из фракции ш | 8325 | 2683 | 159 | 3992 |
| Взятые из фракции t | 342550 | 262480 | 59781 | 125477 |
| Взятые из фракции и | 2569 | 0 | 0 | 0 |
FACS-анализ на день 28 культивирования клеток, представленных в табл. 10, показал, что (а) CD45позитивные, CD5-позитивные, CD7-позитивные, CD8а-позитивные, и CD4-позитивные клетки или (b) CD45-позитивные, CD5-позитивные, CD7-позитивные, CD8a-позитивные и CD4-негативные клетки могут быть получены в высоком соотношении с использованием клеток, происходящих от каждой маркерпозитивной клетки, по сравнению с использованием клеток, происходящих от каждой маркернегативной клетки.
Исходя из этих результатов было показано, что клеточная популяция, содержащая CD8-позитивные клетки (например, CD4/CD8DP-клетки, CD8SP-клетки) в высоком соотношении, может быть получена путем выделения клеток, экспрессирующих CD90, CD143, CD200, CD218a или CD263, в виде клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, и путем дифференцировки выделенных клеток.
Пример 3. Условия культивирования с использованием штамма Ff-I01s04.
В качестве клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники (далее иногда обозначаемые НРС), была использована популяция неадгезивных клеток, полученная путем обработки iPS-клеток (штамма Ff-I01s04) в соответствии с методами, описанными в примере 1. Вышеупомянутую популяцию неадгезивных клеток, содержащую НРС, окрашивали нижеследующей серией антител для каждой группы образцов.
- 16 045419
Таблица 11-1
| Группа образцов (серия антител) | Антитело | Производитель | Флуоресцентная молекула, связанная с антителом |
| 1с | анти-СО34 антитело | Abeam | РЕ-Су7 |
| анти-СП43 антитело | BD | АРС | |
| анти-СП45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| анти-СП235а антитело | BD | FITC | |
| анти-CD? антитело | Biolegend | РЕ |
- 17 045419
| 2c | анти-СП34 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| анти-СП43 антитело | BD | APC | |
| анти-СП45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| анти-СП235а антитело | BD | FITC | |
| анти-CD 144 антитело | BD | BV421 | |
| Зс | aHTH-CD34 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| aHTH-CD43 антитело | BD | APC | |
| aHTH-CD45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| aHTH-CD235a антитело | BD | FITC | |
| анти-CD 5 6 антитело | Biolegend | PE | |
| 4c | aHTH-CD34 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| aHTH-CD43 антитело | BD | APC | |
| анти-СО45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| aHTH-CD235a антитело | BD | FITC | |
| aHTH-CD226 антитело | Biolegend | PE | |
| 5c | aHTH-CD34 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| aHTH-CD43 антитело | BD | APC | |
| aHTH-CD45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| aHTH-CD235a антитело | BD | FITC | |
| анти-СО262 антитело | Biolegend | PE | |
| 6c | aHTH-CD34 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| aHTH-CD43 антитело | BD | APC | |
| aHTH-CD45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| анти-СО235а антитело | BD | FITC | |
| aHTH-CD325 антитело | Biolegend | PE | |
| 7c | aHTH-CD34 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| aHTH-CD43 антитело | BD | APC | |
| aHTH-CD45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 |
- 18 045419
| анти-СП235а антитело | BD | FITC | |
| анти-СП49£ антитело | Biolegend | PE | |
| 8с | анти-СПЗ 4 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| анти-СП43 антитело | BD | APC | |
| анти-СП45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| aHTH-CD235a антитело | BD | FITC | |
| анти-CDS 1 антитело | Biolegend | PE |
Таблица 11-2
| 9c | aHTH-CD34 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| aHTH-CD43 антитело | BD | APC | |
| aHTH-CD45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| aHTH-CD235a антитело | BD | FITC | |
| анти-CD 102 антитело | Biolegend | PE | |
| 10c | aHTH-CD34 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| aHTH-CD43 антитело | BD | APC | |
| aHTH-CD45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| aHTH-CD235a антитело | BD | FITC | |
| aHTH-CD42b антитело | Biolegend | PE | |
| 11c | анти-СО34 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| aHTH-CD43 антитело | BD | APC | |
| aHTH-CD45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| анти-СО235а антитело | BD | FITC | |
| aHTH-CD61 антитело | Biolegend | PE | |
| 12c | aHTH-CD34 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| aHTH-CD43 антитело | BD | APC | |
| aHTH-CD45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| aHTH-CD235a антитело | BD | FITC | |
| aHTH-CD62P антитело | Biolegend | PE | |
| 13c | aHTH-CD34 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
- 19 045419
| анти-СП43 антитело | BD | APC | |
| анти-СВ45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| анти-СП235а антитело | BD | FITC | |
| анти-СО69 антитело | Biolegend | PE | |
| 14с | анти-СПЗ 4 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| анти-СП43 антитело | BD | APC | |
| анти-СП45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| aHTn-CD235a антитело | BD | FITC | |
| анти-CD 102 антитело | Biolegend | PE | |
| 15с | анти-СО34 антитело | Abeam | PE-Cy7 |
| aHTn-CD43 антитело | BD | APC | |
| aHTn-CD45 антитело | Biolegend | BV510 | |
| анти-CD 14 антитело | Biolegend | APC/eFluor780 | |
| aHTn-CD235a антитело | BD | FITC | |
| анти-CD 15 6с антитело | Biolegend | PE |
После вышеупомянутого окрашивания, клеточные популяции подвергали сортингу с помощью FACSAria. Клеточные фракции, полученные от каждой вышеупомянутой группы образцов, представлены ниже.
Таблица 12
| Группа образцов | Полученная фракция клеток |
| 1c | фракция Ас и фракция Вс |
| 2c | фракция Сс |
| 3c | фракция Dc |
| 4c | фракция Ес |
| 5c | фракция Fc |
| 6c | фракция Gc |
| 7c | фракция Нс |
| 8c | фракция 1с |
| 9c | фракция Jc |
| 10c | фракция Кс |
| 11c | фракция Lc |
| 12c | фракция Мс |
| 13c | фракция Nc |
| 14c | фракция Ос |
| 15c | фракция Рс |
В вышеуказанной таблице представлены нижеследующие фракции Ас-Рс, соответственно: фракция Ас: CD235а-негативнαя, CD14-негативная, CD34-nозитивнαя, CD43-позитивная, фракция Вс: CD235а-негативнαя, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD7позитивная, фракция Сс: CD235а-негативнαя, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD144позитивная, фракция Dc: CD235а-негативная, CD14-негативная, CD34-позитивная, CD43-позитивная, CD56позитивная,
- 20 045419 фракция Ec: CD235a-негaтивнaя, CD14-негaтuвнaя, CD34-позитивнaя, CD43-позитивнaя, CD226позитивная, фракция Fc: CD235a-негaтивнaя, CD14-негaтивнaя, CD34-позитивнaя, CD43-позитивнaя, CD262позитивная, фракция Gc: CD235a-негaтивнaя, CD14-негaтивнaя, CD34-позитивнaя, CD43-позитивнaя, CD325позитивная, фракция Hc: CD235a-негaтивнaя, CD14-негaтивнaя, CD34-позитивнaя, CD43-позитивнaя, CD49fпозитивная, фракция Ic: CD235a-негaтивнaя, CD14-негaтивнaя, CD34-позитивнaя, CD43-позитивнaя, CD51позитивная, фракция Jc: CD235a-негaтивнaя, CD14-негaтивнaя, CD34-позитивнaя, CD43-позитивнaя, CD102позитивная, фракция Kc: CD235a-негaтивнaя, CD14-негaтивнaя, CD34-позитивнaя, CD43-позитивнaя, CD42bпозитивная, фракция Lc: CD235a-негaтивнaя, CD14-негaтивнaя, CD34-позитивнaя, CD43-позитивнaя, CD61позитивная, фракция Mc: CD235a-негaтивнaя, CD14-негaтивнaя, CD34-позитивнaя, CD43-позитивнaя, CD62Pпозитивная, фракция Nc: CD235a-негaтивнaя, CD14-негaтивнaя, CD34-позитивнaя, CD43-позитивнaя, CD69позитивная, фракция Ос: CD235a-негaтивнaя, CD14-негaтивнaя, CD34-позитивнaя, CD43-позитивнaя, CD102позитивная, фракция Рс: CD235a-негaтивнaя, CD14-негaтивнaя, CD34-позитивнaя, CD43-позитивнaя, CD156cпозитивная.
Клетки, содержащиеся в вышеупомянутых фракциях Ас-Рс, подвергали дифференцировке в лимфоидные клетки методом, описанным в примере 1. Все клетки выделяли на 21-й день после начала культивирования, подсчитывали на гемоцитометре и окрашивали нижеследующей серией антител.
Таблица 13
| Серия антител | Производитель | Флуоресцентная молекула, связанная с антителом |
| анти-CDS антитело | Biolegend | АРС/Су7 |
| анти-СП45 антитело | Biolegend | Бриллиантовый фиолетовый 510 |
| анти-TCRab антитело | eBioscience | FITC |
| анти-CD 8Ь антитело | Beckman | РЕ |
| анти-СП7 антитело | Biolegend | АРС |
| анти-CD 5 антитело | eBioscience | РЕ/Су7 |
| анти-CD 8 а антитело | Biolegend | РегСР/Су5.5 |
| анти-СП4 антитело | Biolegend | BV421 |
После вышеуказанного окрашивания, клеточные популяции подвергали сортингу с помощью FACSAria. Клеточные фракции, полученные от каждой вышеуказанной группы образцов, представлены ниже:
фракция Qc: фракция лимфоцитов, фракция Rc: фракция лимфоцитов, CD3-позитивнaя, CD45-позитивнaя, CD5-позитивнaя, CD7позитивная, фракция Sc: фракция лимфоцитов, CD3-позитивнaя, CD45-позитивнaя, CD7-позитuвнaя, CD8aпозитивная, CD4-позuтивнaя, фракция Тс: фракция лимфоцитов, CD3-позитивнaя, CD45-позитивнaя, CD7-позитивнaя, CD8aпозитивная, CD4-негaтивнaя.
Число клеток в каждом образце, взятом из фракций Ас-Рс на день 21 после начала культивирования (отношение к числу клеток в образце, взятом из фракции Ас), указано в табл. 14.
- 21 045419
Таблица 14
| фракция Ас | фракция Вс | фракция Сс | Фракция Dc | Фракция Ес | Фракция Fc |
| 1 | 3,1 | 3,5 | 1,2 | 2,0 | 3,9 |
| фракция Gc | фракция Нс | Фракция 1с | Фракция Jc | Фракция Кс | Фракция Lc |
| 1,8 | 0 | 0,2 | 1,0 | 0,7 | 0,5 |
| фракция Мс | фракция Nc | фракция Ос | фракция Рс | ||
| 0 | 0,1 | 1,0 | 0,2 |
Из табл. 14 видно, что все клеточные популяции, содержащиеся в образцах, взятых из фракции Вс (СО7-позитивной), фракции Cc (CD144-позитивной), фракции Dc (CD56-позитивной), фракции Ec (CD226-пoзитивнoй), фракции Fc (СО262-позитивной) и фракции Gc (СН325-позитивной), обладают большей способностью к пролиферации по сравнению с клеточной популяцией в образце, взятом из фракции Ас. Кроме того, было обнаружено, что клеточные популяции, содержащиеся в образцах, взятых из фракции Hc (СО49Г-позитивной), фракции Ic (СО51-позитивной), фракции Kc (СО42Ь-позитивной), фракции Lc (СО61-позитивной), фракции Мс (СО62Р-позитивной), фракции Nc (СО69-позитивной) и фракции Рс (СН156с-позитивной), обладают меньшей способностью к пролиферации.
Число клеток в клеточных фракциях Qc-Tc, полученных путем сортинга с помощью FACSAria на 21-й день культивирования (отношение к числу клеток в клеточных фракциях Qc-Tc в образце, взятом из фракции Ас), указано в табл. 15.
Таблица 15
| фракция Qc | фракция Rc | фракция Sc | фракция Тс | |
| Взятые из фракции Вс | 3,3 | 3,7 | 3,1 | 2,6 |
| Взятые из фракции Сс | 3,8 | 4,3 | 7,0 | 2,4 |
| Взятые из фракции Dc | 1,3 | 1,4 | 2,2 | 0,9 |
| Взятые из фракции Ес | 0,9 | 1,0 | 1,7 | 0,7 |
| Взятые из фракции Fc | 4,1 | 4,7 | 6,5 | 2,9 |
| Взятые из фракции Gc | 2,1 | 2,4 | 3,1 | 1,7 |
| Взятые из фракции Нс | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Взятые из фракции 1с | 0,2 | 0,1 | 0 | 0,2 |
| Взятые из фракции Jc | 1,2 | 0,7 | 0,3 | 0,6 |
| Взятые из фракции Кс | 0,8 | 0,7 | 0,3 | 0,8 |
| Взятые из фракции Lc | 0,3 | 0,3 | 0,5 | 0,3 |
| Взятые из | 0 | 0 | 0 | 0 |
-
Claims (21)
- фракции МсВзятые из фракции Nc 0 0 0 0Взятые из фракции Ос 1,2 0,7 0,3 0,6Взятые из фракции Рс 0,1 0,1 0,1 0,1В результате было показано, что клеточная популяция, содержащая CD3-nозитивные, CD45позитивные, CD7-позитивные, CD8а-позитивные, CD4-позитивные клетки или CD3-позитивные, CD45позитивные, CD7-позитивные, CD8а-позитивные и CD4-негативные клетки в высоком соотношении, может быть получена с использованием клеток, происходящих от фракции Вс, фракции Сс, фракции Dc, фракции Ec, фракции Fc или фракции Gc, но не с использованием клеток, происходящих от фракции Ас. Кроме того, было показано, что клеточная популяция, содержащая CD3-позитивные, CD45-позитивные, CD7-позитивные, CD8a-позитивные, CD4-позитивные клетки или CD3-позитивные, CD45-позитивные, CD7-позитивные, CD8а-позитивные и CD4-негативные клетки в низком соотношении, может быть получена с использованием клеток, происходящих от фракции Hc, фракции Ic, фракции Jc, фракции Kc, фракции Lc, фракции Мс, фракции Nc, фракции Ос или фракции Рс, но не с использованием клеток, происходящих от фракции Ас. То есть, было показано, что клеточная популяция, содержащая клетки, позитивные по двум CD4/CD8 (или клетки, позитивные по одному CD8) в высоком соотношении, может быть получена путем выделения клеток, экспрессирующих один или более из CD7, CD144, CD56, CD226, CD262 и CD325, или клеток, не экспрессирующих один или более из CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69, CD102 и CD156c, в виде клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клеткипредшественники, и путем дифференцировки выделенных клеток.Эта заявка основана на патентной заявке No. 2017-087723, поданной в Японии (дата подачи: 26 апреля, 2017), содержание которой включено в настоящее изобретение в полном объеме.Промышленное применениеНастоящее изобретение позволяет получить более незрелые Т-клетки и зрелые Т-клетки и/или получить эти клетки в более высоких концентрациях. Полученные таким образом клетки могут быть использованы для профилактики или лечения заболеваний, таких как опухоль, инфекция, аутоиммунное расстройство и т.п.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ продуцирования клеток, позитивных по двум CD4/CD8, где указанный способ включает следующие стадии:стадию 1: выделения из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клеткипредшественники, клеток, экспрессирующих одну или более молекулы, выбранные из первой группы, состоящей из CD62L, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD144, CD226, CD262 и CD325, где выделенные клетки экспрессируют CD34 и CD43, и стадию 2: дифференцировки клеток, выделенных в стадии 1, в клетки, позитивные по двум CD4/CD8, таким образом получая клетки, позитивные по двум CD4/CD8.
- 2. Способ продуцирования клеток, позитивных по двум CD4/CD8, где указанный способ включает следующие стадии:стадию 1: выделения из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клеткипредшественники, клеток, экспрессирующих одну или более молекулы, выбранные из первой группы, состоящей из CD62L, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD144, CD226, CD262 и CD325, и клетки, не экспрессирующие одну или более молекулы, выбранные из второй группы, состоящей из CD24, CD90, CD7 и CD56, и/или не экспрессирующие одну или более молекулы, выбранные из третьей группы, состоящей из CD49f, CD51, CD102, CD42b, CD61, CD62P, CD69 и CD156c, где выделенные клетки экспрессируют CD34 и CD43, и стадию 2: дифференцировки клеток, выделенных в стадии 1, в клетки, позитивные по двум CD4/CD8, таким образом получая клетки, позитивные по двум CD4/CD8.
- 3. Способ по п.1 или 2, где клетки, отобранные в указанной стадии 1, не экспрессируют CD235a или CD14, но экспрессируют CD45.
- 4. Способ по п.3, где первая группа в указанной стадии 1 состоит из CD62L, CD143, CD263, Notch3, CD200, CD218a и CD144.
- 5. Способ по любому из пп.1-4, где указанная стадия 1 включает выделение из клеточной популя-- 23 045419 ции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, клеток, не экспрессирующих одну или более молекулы, выбранные из третьей группы, состоящей из CD49f, CD51, CD 102, CD42b, CD61, CD62P,CD69hCD156c.
- 6. Способ по π.5, где третья группа в указанной стадии 1 состоит из CD49f, CD51 и CD102.
- 7. Способ по любому из пп.1-6, где клеточную популяцию, содержащую гемопоэтические клеткипредшественники, в указанной стадии 1, получают путем индуцирования дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток.
- 8. Способ по п.7, где указанными плюрипотентными стволовыми клетками являются человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.
- 9. Способ получения клеток, позитивных по одному CD8, включающий стадию индуцирования клеток, позитивных по двум CD4/CD8, и полученных способом по любому из пп.1-8, в клетки, позитивные по одному CD 8.
- 10. Способ по п.9, где указанные клетки, позитивные по одному CD8, представляют собой цитотоксические Т-лимфоциты.
- 11. Клеточная популяция, полученная путем выделения из клеточной популяции, содержащей гемопоэтические клетки-предшественники, клеток, экспрессирующих одну или более молекулы, выбранные из первой группы, состоящей из CD62L, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD144, CD226, CD262 и CD325, где выделенные клетки экспрессируют CD34 и CD43.
- 12. Клеточная популяция по п.11, где выделенные клетки экспрессируют одну или более молекул, выбранных из второй группы, состоящей из CD24, CD90, CD7 и CD56, и/или не экспрессируют одну или более молекул, выбранных из третьей группы, состоящей из CD49f, CD51, CD 102, CD42b, CD61, CD62P, CD69hCD156c.
- 13. Клеточная популяция по п.11 или 12, где выделенные клетки не экспрессируют CD235a или CD 14, но экспрессируют CD45.
- 14. Клеточная популяция по любому из пп. 11-13, где указанную клеточную популяцию, содержащую гемопоэтические клетки-предшественники, получают путем индуцирования дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток.
- 15. Клеточная популяция по п.14, где указанными плюрипотентными стволовыми клетками являются человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.
- 16. Клеточная популяция, содержащая гемопоэтические клетки-предшественники, экспрессирующие одну или более молекулы, выбранные из первой группы, состоящей из CD62L, CD 143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD144, CD226, CD262 и CD325, в отношении [число гемопоэтических клеток-предшественников/общее число клеток в клеточной популяции] не менее чем 40%, для получения позитивных по двум CD4/CD8 клеток, где выделенные клетки экспрессируют CD34 и CD43.
- 17. Клеточная популяция по п.16, где выделенные клетки экспрессируют одну или более молекул, выбранных из второй группы, состоящей из CD24, CD90, CD7 и CD56, и/или не экспрессируют одну или более молекул, выбранных из третьей группы, состоящей из CD49f, CD51, CD 102, CD42b, CD61, CD62P, CD69hCD156c.
- 18. Клеточная популяция по п.16 или 17, где отношением является отношение гемопоэтических клеток-предшественников, экспрессирующих одну или более молекулы, выбранные из первой группы, состоящей из CD62L, CD143, CD263, Notch3, CD200, CD218a и CD144.
- 19. Клеточная популяция по любому из пп.16-18, где отношением является отношение гемопоэтических клеток-предшественников, не экспрессирующих одну или более молекулы, выбранные из второй группы, состоящей из CD49f, CD51 и CD102.
- 20. Набор для разделения гемопоэтических клеток-предшественников, где указанный набор включает антитело против CD34 и антитело против CD43, а также антитело против каждой из одной или более молекул, выбранных из группы, состоящей из CD24, CD62L, CD143, CD263, Notch3, CD32, CD39, CD49a, CD164, CD317, CD200, CD218a, CD7, CD226, CD262, CD325, CD49f, CD51, CD102, CD61, CD62P, CD69hCD156c.
- 21. Набор по π.20, также включающий одно или более антител против CD235a, CD14 и CD45.Евразийская патентная организация, ЕАПВРоссия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017-087723 | 2017-04-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045419B1 true EA045419B1 (ru) | 2023-11-24 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11578310B2 (en) | Method for producing CD4/CD8 double-positive T cells | |
| US10947502B2 (en) | Methods for directed differentiation of pluripotent stem cells to immune cells | |
| US10660915B2 (en) | Method for induction of T cells from pluripotent stem cells | |
| US20180362927A1 (en) | Human t cell derived from t cell-derived induced pluripotent stem cell and methods of making and using | |
| KR20180057641A (ko) | 자연살해 세포의 증식방법 | |
| CA3038701A1 (en) | Methods for directed differentiation of pluripotent stem cells to hla homozygous immune cells | |
| WO2018135646A1 (ja) | ＣＤ８α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法 | |
| US20210238550A1 (en) | METHOD FOR PRODUCING REGENERATED T CELL POPULATION VIA iPS CELLS | |
| JP2023164892A (ja) | 造血前駆細胞マーカー | |
| US20200345789A1 (en) | Production method for ips cell-derived population of genetically diverse t cells | |
| TW202345878A (zh) | 控制性ｔ細胞之製造方法 | |
| KR20240005792A (ko) | B 계통 세포의 분화 및 확장을 위한 조성물 및 방법 | |
| US20220233665A1 (en) | Medicinal composition | |
| EA045419B1 (ru) | Маркер гемопоэтических клеток-предшественников | |
| Ma | Derivation of lymphocytes from human induced pluripotent stem cells |