JP2015529450A - 幹細胞微粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)神経学的障害、疾患又は欠損、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、卒中若しくはALS、
(ii)リソソーム蓄積症、
(iii)心血管障害、例えば心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢動脈性疾患、糖尿病性潰瘍、創傷治癒、
(iv)特発性肺線維症、呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺高血圧症、嚢胞性線維症及び喘息を含む肺の疾患、
(v)代謝性又は炎症性障害、例えば糖尿病(I若しくはII型)、関節リウマチ、変形性関節症、ループス、クローン病、過敏性腸疾患又は移植片対宿主病、
(vi)精神障害、例えば鬱病、双極性障害、統合失調症、又は自閉症候群障害、例えば自閉症、アスペルガー症候群若しくはレット症候群、
(vii)失明を引き起こす網膜の疾患、例えば加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、糖尿病性網膜症、網膜色素変性症、並びに
(viii)脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、脳性麻痺、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、白質萎縮症、ギラン・バレー症候群、抗MAG末梢神経障害及びシャルコー・マリー・トゥース病
が挙げられる。
本発明は一態様において、神経幹細胞から得られる微粒子を提供する。神経幹細胞微粒子は、神経幹細胞により産生される微粒子である。典型的には、微粒子は神経幹細胞から分泌される。より典型的には、微粒子はエキソソーム又は微小胞である。間葉系幹細胞等の他の細胞からの微粒子が当分野で知られている。
微粒子は、該微粒子を産生する幹細胞の機能の少なくともいくつかを保持する。従って、幹細胞(幹細胞は任意の幹細胞型であることができ神経幹細胞に限定されないが、本発明の神経幹細胞微粒子は実施形態として明白に含まれる)を操作することにより、1種以上の所望の機能、典型的にはタンパク質又はmiRNAを有するように微粒子を設計することができる。その操作は典型的には、1種以上の外因性のコード核酸配列、非コード核酸配列又は調節核酸配列を幹細胞に導入するための遺伝子操作であることができる。例えば、VEGF及び/又はbFGFを含有するエキソソームが所望される場合、エキソソームを産生する幹細胞を形質転換して又は該幹細胞にトランスフェクションしてVEGF及び/又はbFGFを(高レベルで)発現させることができ、次いでそれらは幹細胞により産生される微粒子中に組み入れられるだろう。同様に、iPS細胞を使用して微粒子を産生することができ、この細胞を、iPS細胞により産生される微粒子に必要なタンパク質及び核酸(例えばmiRNA)を産生するように設計することができる。従って、本発明は、微粒子が産生される幹細胞中において天然には存在しない機能を含有し(即ち、微粒子(例えばエキソソーム)は1種以上の外因性のタンパク質配列又は核酸配列を含有する)、天然には生じない及び操作されている、任意の幹細胞型由来の特別な微粒子を提供する。
本発明は、単離された神経幹細胞微粒子の集団を提供し、該集団は本質的に本発明の微粒子のみを含み、即ち微粒子集団は純粋である。多くの態様では、微粒子集団は、本発明の微粒子を少なくとも約80%(他の態様では少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%又は100%)含む。
表18及び20は、Integra Cellineの多区画のバイオリアクタ中で2週にわたって培養したCTX0E03細胞から単離したエキソソーム及び微小胞それぞれにおいて質量分析で検出される全てのタンパク質を列挙する。一実施形態では、本発明のエキソソームは、表18に列挙したタンパク質の少なくとも70%を、少なくとも80%を、少なくとも90%を、少なくとも95%を、少なくとも99%を又は少なくとも99.5%を含む。同様に、本発明の微小胞は典型的には、表20に列挙したタンパク質の少なくとも70%を、少なくとも80%を、少なくとも90%を、少なくとも95%を、少なくとも99%を又は少なくとも99.5%を含む。更なる実施形態では、本発明の微小胞又はエキソソームのプロテオームは、表18(エキソソーム)又は表20(微小胞)に記載されたプロテオームと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%又は少なくとも99.5%同一である。微小胞又はエキソソームのタンパク質含有量を決定する場合、典型的には質量分析を使用し、例えば実施例13で説明するLC/MS/MS法を使用する。
実施例12(及び関連する図11)は、CTX0E03細胞、この細胞により産生される微小胞及びエキソソーム中に存在するmiRNAの大規模シーケンシングの結果を示す。この実施例は予想外にも、微粒子中に存在する異なるmiRNA種の数は細胞中に存在する異なるmiRNA種の数と比較して大幅に減少しており、微粒子は120未満の異なるmiRNAを含有するが細胞は450〜700のmiRNA種を含有することを示す。微粒子はhsa-miR-1246の大部分を含有する。
AC079949.1 (配列番号738)
GGCCGCGCCCCGTTTCCCAGGACAAAGGGCACTCCGCACCGGACCCTGGTCCCAGCG;
AP000318.1 (配列番号739)
CCCACTCCCTGGCGCCGCTTGTGGAGGGCCCAAGTCCTTCTGATTGAGGCCCAACCCGTGGAAG;
AL161626.1 (配列番号740)
CGCCGGGACCGGGGTCCGGGGCGGAGTGCCCTTCCTCCTGGGAAACGGGGTGCGGC;
AC004943.1 (配列番号741)
GCTTCACGTCCCCACCGGCGGCGGCGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCTC;及び
AL121897.1 (配列番号742)
GCCGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCTTTCGGCTCGGGCCTCAGGTGAGTCGGAGGGGCCGGGCGCC
ggcggagugcccuucuuccugg (AL161626.1-201に由来する) (配列番号743)
ggagggcccaaguccuucugau (AP000318.1-201に由来する) (配列番号744)
gaccaggguccggugcggagug (AC079949.1-201に由来する) (配列番号745)。
実施例5は、CTX0E03細胞により産生される微粒子中に存在し、ドットブロットで検出されるタンパク質を示す。典型的には、本発明の微粒子は、以下のタンパク質の1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種又は全てを含有する。
以下の実施例10及び図9に示すように、3週にわたる多区画のバイオリアクタでの培養後に、神経幹細胞は、標準的な単一区画のT175フラスコ中において標準的な手順に従って培養された神経幹細胞よりも有意に高いレベルで多くのマーカーを発現する。一実施形態では、本発明の微粒子は、典型的には多区画のバイオリアクタ中で、少なくとも2週にわたって、典型的には少なくとも3週にわたって、少なくとも4週にわたって、少なくとも5週にわたって又は少なくとも6週にわたって培養されたNSCから単離される。任意選択で、NSCは10週以下にわたって、例えば2〜10週にわたって、3〜10週にわたって、4〜10週にわたって、5〜10週にわたって又は6〜10週にわたって培養されている。
前述したように、神経幹細胞微粒子は幹細胞に由来する少なくとも1種の生物学的機能を保持する。保持され得る生物学的機能として、血管新生、組織再生、組織修復及び/又は神経新生を促進する能力、卒中を患っている患者の脳における認知の改善をもたらす能力あるいは末梢動脈性疾患における血流の回復を加速させる能力が挙げられる。
本発明の(同種異系の)神経幹細胞微粒子は典型的には、インビトロ若しくはインビボで免疫応答を誘発しない、又は同種の幹細胞集団の患者への注入時に誘発されると予期されるであろう免疫応答よりも実質的に弱い免疫応答を誘発する。本発明の特定の態様では、神経幹細胞微粒子は、該微粒子の少なくとも約70%が免疫応答を誘発しない場合に免疫応答を誘発しないと見なされる。いくつかの実施形態では、微粒子の少なくとも約80%が、少なくとも約90%が又は少なくとも約95%が、99%が若しくはそれ以上が免疫応答を誘発しない。好ましくは、本発明の微粒子は、抗体媒介免疫応答を誘発しない、又はヒト免疫応答を誘発しない。より好ましくは、本発明の微粒子は、インビトロで抗体媒介応答又はヒト免疫応答を誘発しない。更により好ましくは、本発明の微粒子は、混合リンパ球免疫応答を誘発しない。免疫応答を誘発する本発明の細胞の能力を様々な方法で試験することができることが当業者に理解されるだろう。
微粒子を産生する神経幹細胞は幹細胞株であることができ、即ち安定して分裂する幹細胞の培養物であることができる。単一の規定の供給源を使用して幹細胞株を大量に生育させることができる。不死化は自発的事象から生じることができ、又は不死化因子をコードする外因性の遺伝情報を幹細胞中に導入することにより不死化を実現することができ、その結果、適切な培養条件下で幹細胞が無限に細胞増殖する。そのような外因性の遺伝因子として遺伝子「myc」を挙げることができ、該遺伝子「myc」は転写因子Mycをコードする。トランスフェクション又は形質導入等の様々な適切な手段により、外因性の遺伝情報を幹細胞中に導入することができる。形質導入のために、遺伝子操作されたウイルス媒体を使用することができ、該ウイルス媒体として、レンチウイルス等のレトロウイルスから得られるものが挙げられる。
・ヒト血清アルブミン 0.03%
・トランスフェリン、ヒト 5μg/ml
・プトレシン二塩酸塩 16.2μg/ml
・ヒト組換えインスリン 5μ/ml
・プロゲステロン 60ng/ml
・L-グルタミン 2mM
・亜セレン酸ナトリウム(セレン) 40ng/ml。
本発明の神経幹細胞微粒子は治療に有用であり、従って医薬組成物として製剤化され得る。薬学的に許容される組成物は典型的には、本発明の微粒子に加えて少なくとも1種の薬学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル及び/又は賦形剤を含む。適切な担体の例として乳酸リンゲル液が挙げられる。そのような成分の詳細な考察がGennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 第20版、ISBN: 0683306472で説明されている。
本発明の微粒子は、疾患の処置(治療)又は予防に有用である。よって、本発明は、本発明の微粒子を使用して患者の疾患又は障害を治療する又は予防する方法を含む。用語「患者」は、予防的処置又は治療的処置を受けるヒト対象及び他の哺乳動物対象を含む。
(i)神経学的障害、疾患又は欠損、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、卒中若しくはALS、
(ii)リソソーム蓄積症、
(iii)心血管障害、例えば心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢動脈性疾患、糖尿病性潰瘍、創傷治癒、
(iv)特発性肺線維症、呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺高血圧症、嚢胞性線維症及び喘息を含む肺の疾患、
(v)代謝性又は炎症性障害、例えば糖尿病(I若しくはII型)、関節リウマチ、変形性関節症、ループス、クローン病、過敏性腸疾患又は移植片対宿主病、
(vi)精神障害、例えば鬱病、双極性障害、統合失調症、又は自閉症候群障害、例えば自閉症、アスペルガー症候群若しくはレット症候群、
(vii)失明を引き起こす網膜の疾患、例えば加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、糖尿病性網膜症、網膜色素変性症、並びに
(viii)脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、脳性麻痺、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、白質萎縮症、ギラン・バレー症候群、抗MAG末梢神経障害及びシャルコー・マリー・トゥース病
が挙げられる。
本発明は、神経幹細胞により産生された微粒子に特徴的なマーカープロファイルを提供する。従って、患者から得たサンプルを試験して該サンプルにおけるマーカープロファイルが微粒子のマーカーと一致するかどうかを決定することにより、インビボでこの微粒子の存在を検出することができる。サンプルのプロファイルが本明細書で説明した微粒子のプロファイルと一致する場合、これにより微粒子の存在が確認される。このことを使用して、微粒子自体の存在及び/又は体内分布だけでなく微粒子を産生する幹細胞の存在も検出することができる。これは、例えばADME(T)研究において、インビボで投与した幹細胞が宿主組織中に生着しているかどうか及び/又は遊走しているかどうかを検出する際に特に有用である。
微粒子は幹細胞の条件培地から単離する。「条件培地」(CM)は幹細胞用の増殖培地であることができ、該増殖培地は、少なくとも約12時間にわたる、少なくとも24時間にわたる、少なくとも48時間にわたる又は少なくとも72時間にわたる、典型的には最大168時間(7日)にわたる幹細胞の大量培養に使用されており、必要に応じて使用前に任意の適切な手段により、好ましくはろ過により、除去される及び無菌化される。
本発明の一態様では、条件的不死化された幹細胞を使用して微小胞及び/又はエキソソーム等の微粒子を産生する。この条件的不死化された幹細胞は典型的には神経幹細胞であるが、任意の種類の幹細胞であることができ、例えば造血幹細胞又は間葉系幹細胞であることができる。従って、条件的不死化された幹細胞を培養する工程及び該幹細胞により産生された微粒子を回収する工程を含む、幹細胞微粒子の製造方法が提供される。上記で説明したように、幹細胞の条件的不死化は当分野で公知である。疑義を避けるために、本方法は神経幹細胞の使用に限定されない。
本発明者らは、幹細胞による微粒子の産生を増進させることができることを発見した。神経幹細胞に限定されない及び任意の幹細胞からの微粒子の産生に使用され得るこの発見により、幹細胞培養から得られる微粒子の収率を改善することが可能になる。
本発明は、幹細胞による微粒子の産生を変化させる薬剤のスクリーニング方法を提供する。本方法は、典型的には微粒子の産生に適した条件下で、幹細胞を候補薬剤と接触させること、及び(i)接触した幹細胞による微粒子の産生速度が増加するか若しくは低下するかを観測すること、又は(ii)薬剤に接触していない対照幹細胞と比較した微粒子の特徴(例えばサイズ、タンパク質、mRNA若しくはmiRNAの含有量)の変化を観測することを含む。
遠心分離(1500rpmで5分)後に、ろ過(0.02〜0.2μm又は100K MWCO)により条件培地から微粒子を回収する。トリゾールに基づく抽出を使用して、続いてQiagen RNaesyミニキットを使用する精製により全RNAを得る。水中の抽出物は、それがRNAである可能性があることを示唆する260:280nmの吸光度を有する。全RNAは、mRNA(Superscript II RT、Invitrogen)又はmiRNA(mScript RTキット、Qiagen)に適したプロトコルにより逆転写される。mRNA及びmiRNAの存在の妥当性を、miRNAに関してはATP5B及びYWHAZ用のプライマー並びにmiRNAハウスキーピング遺伝子に関してはU6B及び15a用のプライマーをそれぞれ使用するqRT-PCRで証明した。RNAを、アレイ(マイクロアレイ又はPCRに基づくアレイ)及びシーケンシング等の一般的な遺伝子発現分析アッセイにより評価することができる。
本発明は、本発明の微粒子の製造方法に使用するためのキットを提供する。キットは、神経幹細胞の培養培地、神経幹細胞及び本キットを使用して請求項1から16又は23のいずれかの微粒子を産生するための指示書を含む。任意選択で、キットは請求項19又は20の1種以上の成分を含む。キットはまた、対照として使用するための本発明に係る微粒子も含む。対照の微粒子は任意選択で凍結乾燥されている。キットは任意選択で、産生した微粒子の検出に適した検出剤を含有することもでき、例えば微粒子の同定に使用され得るマーカータンパク質に特異的に結合する抗体を含有することもできる。
電子顕微鏡による可視化のための神経幹細胞及び神経幹細胞微粒子の調製
方法
電子顕微鏡のためのCTX0E03細胞の包埋
・5×70%CTX0E03培養物
・+/-4OHT、IFNγ、TNFα及びTGFβによる(全て24時間にわたる10ngでの)処理
・細胞の剥離及びpH7.4の0.1Mカコジル酸塩中の2.5%グルテルアルデヒド(Gluteraldehyde)中における終夜にわたる固定
・細胞の回転沈殿300g
・緩衝化オスミウム2%、1.5時間
・回転、洗浄水、終夜
・酢酸ウラン2%、2時間
・回転、洗浄水、30分
・エタノール勾配20、30、50、70、80、90、100%、週末の間。
・100%酸化プロピレン(PO)、1時間
・回転、PO中の50%寒天LV樹脂、1時間
・75%LV樹脂/PO 5時間
・60℃で終夜にわたる100%樹脂
・室温までの冷却後に切断(60〜80nm)、200KvでのTEMの撮像。
図1A〜Eは、直径が約30nm〜50nmのエキソソームを含有する多小胞体(MVB)の電子顕微鏡写真を示す。図1Fは、直径が100nm超の微小胞を示す。
神経幹細胞株からの神経幹細胞微粒子の産生
方法
CTX0E03細胞の同じ培養物を含有する5個のサブコンフルエントフラスコを、4OHTが添加されている又は添加されていない完全増殖培地対照と共に、10ng/mlのTGF-β、10ng/mlのIFNγ又は10ng/mlのTNFαで個々に処理した。処理の72時間後、電子顕微鏡による評価のために、細胞を、トリプジーン(trypzean)/EDTAを使用して回収して洗浄し、pH7.4の0.1Mカコジル酸塩中の2.5%グルテアルデヒド中において終夜にわたり固定した。
TGF-β、IFN-γ又はTNF-αの存在により多小胞体(MVB)の発生の頻度が変化することを観測した。頻度はTGF-βの存在下で最も高く、続いてIFN-γであり、続いてTNF-αであった。
因子TGF-β、IFN-γ又はTNF-αの添加により、神経幹細胞からの微粒子の産生を刺激することができる。このことは、微粒子のより効率的な産生の可能性を有する。
神経幹細胞微粒子の精製、定量化、及び特性決定
方法
大量の微粒子を産生するためのプロトコルの概要を図2に示す。主要な工程は、精製、定量化、特性決定、効果試験及び製造である。
超遠心分離により、例えば1〜2時間にわたる100000×gでの超遠心分離により、微粒子を幹細胞の条件培地から精製することができる。特異的抗体を使用する、免疫沈降等の抗体に基づく方法、磁性ビーズ精製、樹脂に基づく精製等の代替の又は追加の精製法を使用してもよい。
全核酸レベル又は全タンパク質レベルの定量化により、例えば様々なPCR又はBCAアッセイ等の比色タンパク質定量化法により、精製した微粒子を定量化することができる。電子顕微鏡グリッド、又は微粒子特異的マーカーに特異的に結合する抗体若しくは抗体フラグメントを使用する免疫アッセイ(例えばELISA、免疫ブロッティング)等の他の定量化技法を代替として使用することができる。
微粒子を機能的に又は構造的に特性決定することができる。当分野で公知の方法(SDS-PAGE、質量分析、PCR)を使用して、RNA/mRNA/miRNA及びタンパク質プロファイリングを使用することができる。構成的に分泌された微粒子を試験し、形質転換増殖因子-ベータ(TGF-β)、インターフェロン-ガンマ(INF-γ)、及び/又は腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)等の誘導剤の添加により誘導される微粒子と比較することができる。
微粒子の効果をインビトロアッセイ及びインビボアッセイにより試験することができる。インビトロでの評価に関して、単球、PBMC、内皮細胞、及び/又は線維芽細胞の培養物に神経幹細胞微粒子を添加することができ、これらの細胞に対する微粒子の効果を評価することができる。適切な動物モデルへの神経幹細胞微粒子の投与を使用してインビボでの効果を評価することができる。臨床試験を実施してヒト対象における神経幹細胞微粒子の安全性及び転帰を評価することができる。
神経幹細胞微粒子の大規模製造にIntegra disposable T1000等のバイオリアクタを使用することができる。次いで、精製した微粒子を治療用製品として製剤化する。
CTX0E03微粒子におけるmiRNAの特性決定
方法
・3条件:標準的な培養におけるCTX0E03細胞、標準的な培養におけるCTX0E03細胞から得られる微粒子、及びIntegra CELLineシステムにおけるCTX0E03細胞から得られる精製エキソソーム(以下の実施例7〜11参照)
・製造業者の指示に従ってqRT-PCRパネル(Qiagen)を使用するmiRNAアレイの検討。このアッセイでは、方法/参照遺伝子の選択に感受性のあるデータ正規化により高精度及び高感度が実現される。このアッセイではゲノム全体の配列決定が実現されない。
タンパク質ドットブロットを使用するCTX0E03条件培地の分析
方法
・条件付けした24時間及び72時間条件培地(RMM及びITS培地)
・回収した培地を透析により「濃縮」し、タンパク質をビオチン化する(典型的な全タンパク質濃度は0.5mg/mlであると思われる)。次いで、培地をRaybiotech L507ヒトタンパク質アレイでインキュベートする(全タンパク質濃度0.1mg/ml)。洗浄及びHRP結合ストレプトアビジンを有するアレイのインキュベーション後に、タンパク質の存在を化学発光により検出する。アレイは定性的データを提供する(即ち、タンパク質は存在するが、他のタンパク質と比較した発現レベルは示されない)。
ヒト血管新生ELISAストリップ(Signosis)を使用する条件培地の分析
方法
製造業者の指示に従ってヒト血管新生ELISAストリップ(Signosis)を利用した。新鮮なRMM培地及び24時間にわたり条件付けたCTX0E03 RMM培地を8種の血管新生サイトカイン、即ち腫瘍壊死因子α(TNFα)、インスリン様増殖因子1(IGF-1)、VEGFA、インターロイキン-6(IL-6)、bFGF、形質転換増殖因子β1(TGFβ1)、EGF及びレプチンに関して分析した。特定の血管新生サイトカインに対する各一次抗体でコーティングしたストリップの個々のウェルに試験用サンプルをロードした。分光計により450nmでの吸光度を測定した。血管新生サイトカインの濃度は試験用サンプルの色強度に正比例した。
結果を図3に示す。
Integra CELLINE-CTX0E03細胞から微粒子を産生するための使い捨てバイオリアクタ
細胞株からの効率的な微粒子の産生及び回収は、最大密度の細胞に関する最適培養条件の維持に依存する。細胞に供給される酸素若しくは栄養素の任意の制限又は代謝老廃物(waste metabolic product)の蓄積により培養の寿命が制限され、そのため微粒子の産生が制限されるだろう。
CELLine AD1000の最適な性能を得るために、25mlの完全増殖培地(増殖因子及び4OHTを有するRMM)をフラスコの培地区画中に配置して半透膜を予め濡らす。室温で5分にわたりフラスコを放置した後、37℃で最低1時間にわたり15mlのラミニン溶液(DMEM/F12中に20μg/ml)を細胞区画に添加することにより、マウスラミニンでマトリクスインレイをコーティングする。ラミニン溶液を除去し、15mlの温かいDMEM/F12を細胞区画に添加して過剰なラミニンを除去する。マトリクスインレイが乾燥するのを避け、合計で15mlの完全増殖培地中の約15×106個のCTX0E03細胞を緩やかに導入する。細胞区画から気泡を注意深く除去する。更に460mlの完全増殖培地を細胞区画に慎重に添加した後に、37℃で5%CO2中において終夜にわたりフラスコをインキュベートする。翌日、細胞区画から培地を除去して15mlの予め温めた増殖培地と置き換える。
効果アッセイ
(A)創傷治癒アッセイにおける、CTX0E03条件培地の機能とCTX0E03細胞由来の精製エキソソームの機能との比較
方法-創閉鎖/掻創アッセイ
・12ウェルプレートのウェル当たり0.25×106個のNHDF(正常ヒト皮膚線維芽細胞)を播種してコンフルエントにさせる(24時間)
・24時間にわたり増殖因子を除去する
・細胞を除去し(掻創)、エキソソーム/条件培地と共にインキュベートする
・影響を受けた領域を48時間にわたって撮像する
・Image Jを使用して面積を評価する。
ibidi μ-スライドを使用して、初代HUVECに対する血管新生を検出するための24時間アッセイを行い、Wimtube検出及び(管長及び分岐点の)分析を自動化した。1週目に、2週目に、3週目に、4週目に及び6週目にIntegraフラスコから回収した微小胞をHUVECに添加し、血管新生を基礎のHUVEC(添加なし)と比較した。LSGS(低血清増殖サプリメント)を陽性対照として使用した。図12に図示した結果は、神経幹細胞微粒子が血管新生を増進させることを示す。更に、これらのデータは、1週又は2週にわたって培養した微小胞によりもたらされる場合に比べて血管新生における大きな増進が、少なくとも3週間の培養後(即ち、Integra cellineバイオリアクタ中における3週の、4週の及び6週の培養後)に回収した微小胞によりもたらされることを示す。少なくとも3週にわたって培養した微小胞は、統計的に有意なレベルまで、及び陽性対照のレベルに達するレベルまで血管新生を刺激した。血管新生における最も大きな増進は4週後に回収した微小胞によりもたらされることが示されており、この微小胞は、陽性対照と同じ量まで血管新生を刺激した。
これらのデータは、hNSC微小胞が血管新生を刺激することを示す。
1μmのインサートを介してPC-12細胞を使用して神経突起伸長を決定した。72時間後にPC-12細胞体を除去し、インサートの下側の神経突起を染色した。次いで、染料を抽出して分光光度計で定量化した。2週目にIntegraフラスコから回収した微小胞を0.03μg、0.3μg及び3μgでそれぞれ100ng/mlのNGF(神経増殖因子)と共に細胞に添加した。神経突起伸長を基礎の細胞(添加なし)と比較した。100ng/mlのNGFを対照として使用した。図13に示すように、3μgのhNSC微小胞の添加により、NGFのみの添加と比較して神経突起伸長が顕著に増進した。
これらのデータは、hNSC微小胞が神経突起伸長を刺激することを示す。
Integra CELLineシステムを使用するエキソソームの産生
実施例7で説明したようにIntegra CELLineシステムを使用してCTX0E03細胞を培養してエキソソームを精製した。3週目の時点でCELLineシステムを使用して、及び対照として当分野で日常的に使用する標準的なT175システムを使用して、培地から精製したエキソソームの濃度を、(タンパク質含有量を評価するためのBCAアッセイを使用して)定量化した。図7は、Integra CELLineシステムを使用するエキソソームの産生が従来の培養(T175フラスコ)を使用する場合と比較して数倍に増加していることを示す。
Integra CELLine及び標準的な(T175)培養システムから得た細胞の表現型の特性決定
実施例7で説明したように、Integra CELLineバイオリアクタ及び標準的な培養を使用してCTX0E03細胞を培養した。マーカー特異的抗体及び蛍光顕微鏡を使用して、DCXタンパク質マーカー及びGFAPタンパク質マーカーの発現を確認した。
Integra CELLine培養物から得たエキソソームのmiRNA発現プロファイル及び標準的な(T175)培養物から得た微粒子のmiRNA発現プロファイルの特性決定
単一区画のT-175フラスコ中において、Integra CELLine培養を使用して及び標準的な培養で3週にわたってCTX0E03細胞を培養した。実施例7で説明したように、Integra培養物からエキソソームを精製し、標準的なT-175培養物から微粒子を精製した。標準的な培養又はIntegra CELLineシステムから得たエキソソーム及び微粒子中で発現した様々なmiRNAの相対的な発現レベルを、製造業者の指示に従ってqRT-PCRパネル(Qiagen)を使用するmiRNAアレイで決定し、標準的なCTX0E03細胞株対照群と比較した上方制御レベル及び下方制御レベルの倍率に変換した(表3及び図10参照)。これらのデータは、3週にわたるIntegra CELLine培養システムから得たエキソソーム、微粒子、及び標準的な単一のフラスコ培養から得た細胞の間で示差的なmiRNA発現プロファイルを示す。
CT=サイクル閾値
GOI=目的の遺伝子(調べたmiRNA)
HKG=ハウスキーピング遺伝子(データを正規化するために使用した参照miRNA)]。
全miRNA分析
細胞は、細胞外空間への放出で決定される微粒子中にRNAをシャトルすることができる。このことにより、遺伝子的にコードされたメッセージの細胞間での伝達が可能になる。本明細書において、細胞外RNAを「シャトルRNA(shuttle RNA)」と総称する。次世代シーケンシングを使用して、CTX0E03神経幹細胞(NSC)から放出された非コードRNA種を包括的に分析することを目的とした。
図14に示すように、エキソソーム及び微小胞の両方におけるRNAは、低分子RNA種から主に成る。大部分のヌクレオチド(nt)は、分子ラダーと対比して示すように200以下であった。
大規模シーケンシング(次世代シーケンシング)により低分子RNAのシーケンシングライブラリを作成し、シャトル及び細胞内RNAの組成を調べた。結果を図15に示す。
大規模シーケンシングはcDNAライブラリの調製及びその後のシーケンシングに基づいており、微小胞及びエキソソームにおける様々なmiRNAの全配列の読み取りに関する情報を提供する。これらの大規模配列データにより、上記に示すqRT-PCRアレイデータが補完され、細胞及び微粒子のmiRNAプロファイルが包括的に分析される。qRT-PCRアレイ分析とは異なり、大規模シーケンシングはプローブアレイ中に存在する配列の同定に限定されず、そのため、同定される配列は前もって既知である必要はない。大規模シーケンシングはまた、直接読み取ることもでき、非常に短い配列を配列決定する能力も有する。しかしながら、大規模シーケンシングは、発現が低い転写産物の検出に適していない。
分画遠心で精製した、親細胞並びにそのエキソソーム(30〜100μm)及び微小胞(100〜1000μm)中における様々なmiRNAの存在を、各サンプルに関して1つのタグ付きmiRNAライブラリの構築後の大規模シーケンシングで同定した。
・各サンプルの3'末端及び5'末端の両方に特異的RNAアダプターをライゲーションし、その後に逆転写、増幅及び低分子RNAライブラリの精製を行うことにより、シーケンシングライブラリを作成した(含有される低分子RNA画分のサイズ範囲は22〜30nt)。
・Illumina HiSeq 2000(シングルリード)を使用してシーケンシングを実施した。1プールの分析は最大45,000,000シングルリードを含むことができ、各リード長は最大50塩基である。FastQファイル(配列及び品質スコア)を使用してシーケンシングの品質をコントロールした。
・得られた配列からRNAアダプターを切り取り、生データをきれいにした。生データをクラスター化し、各クラスターに関して多くのリードを付与した。miRNAをmiRBaseの精査(Ssearch)により同定した。
多くの微小胞及びエキソソームではmiRNAが細胞に比べて豊富であり、このことは、細胞が、細胞外へ放出するためにmiRNAを特異的に選別することを示した。更に、miRNAの含有量はエキソソーム及び微小胞の両方で類似しており、このことは、排出された微小胞中に選択的にmiRNAを取り込む共通の器官を示す。理論に拘束されることを望まないが、このことは、分泌された微小胞及びエキソソームにおけるmiRNA含有量を、hNSCサブタイプを同定するためのフィンガープリントとして使用することができることを示しうる。
AC079949.1-201(配列番号738)
遺伝子:AC079949.1 ENSG00000239776
>12 dna:染色体 染色体:GRCh37:12:127650616:127650672:1
GGCCGCGCCCCGTTTCCCAGGACAAAGGGCACTCCGCACCGGACCCTGGTCCCAGCG
遺伝子:AP000318.1 ENSG00000266007
>21 dna:染色体 染色体:GRCh37:21:35677430:35677493:1
CCCACTCCCTGGCGCCGCTTGTGGAGGGCCCAAGTCCTTCTGATTGAGGCCCAACCCGTGGAAG
遺伝子:AL161626.1 ENSG00000241781
>9 dna:染色体 染色体:GRCh37:9:79186731:79186787:1
CGCCGGGACCGGGGTCCGGGGCGGAGTGCCCTTCCTCCTGGGAAACGGGGTGCGGC
遺伝子:AC004943.1 ENSG00000265573
>16 dna:染色体 染色体:GRCh37:16:72821592:72821672:-1
GCTTCACGTCCCCACCGGCGGCGGCGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCTC
AL121897.1 (配列番号742)
遺伝子:AL121897.1 ENSG00000264308
>20 dna:染色体 染色体:GRCh37:20:30865503:30865591:1
GCCGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCTTTCGGCTCGGGCCTCAGGTGAGTCGGAGGGGCCGGGCGCC
misc_RNAは多種多様なRNAの略であり、一連の多種多様な低分子RNAの総称である。多種多様な転写産物の特徴は他のRNAキーでは定義されない。
7SL、6S、ffs又は4.5S RNAとしても知られるシグナル認識粒子RNAは、シグナル認識粒子(SRP)リボ核タンパク質複合体のRNA成分である。SRPは、細胞内でのタンパク質の交通を方向付けて該タンパク質の分泌を可能にする、普遍的に保存されたリボ核タンパク質である。SRP RNAは、1種以上のSRPタンパク質と共にシグナルペプチドの結合及び放出に寄与する。この複合体のRNA成分及びタンパク質成分は高度に保存されているが、異なる界の生物の間では変化する。
リボソームRNA(rRNA)はリボソームとして知られるタンパク質合成オルガネラの一部を形成し、細胞質にエクスポートされてメッセンジャーRNA(mRNA)の情報のタンパク質への翻訳を促進する。真核生物リボソーム(80S)rRNA成分は、大ユニット(rRNA 5S、5.8S及び28S)、小ユニット(rRNA 18S)である。エキソソーム及びMVでは、rRNAの28S及び5.8Sの両方が選択的に多くシャトルされる。
核小体低分子RNA(snoRNA)は他のRNAの、即ちリボソームRNA、トランスファーRNA及び核小体低分子RNAの化学修飾を主に導く低分子RNAの一種である。snoRNAには主に2種のクラス、即ちメチル化と関係するC/DボックスsnoRNA及びプソイドウリジン化と関係するH/ACAボックスsnoRNAがある。
一般にU-RNAとも称される核内低分子リボ核酸(snRNA)は、U1、U2、U4、U5及びU6と名付けられている主要なスプライセオソームを構成し、いくつかのRNA-RNA相互作用及びRNA-タンパク質相互作用に関与する低分子RNAの一種である。核内低分子リボ核酸の主な機能は、核内でのプレmRNA(hnRNA)のプロセシングにある。核内低分子リボ核酸が転写因子(7SK RNA)又はRNAポリメラーゼII(B2 RNA)の制御及びテロメアの維持を補助することも分かっている。
長鎖遺伝子間非コードRNA(lincRNA)は、多様な細胞プロセスの主要制御因子として現れている。個々のlincRNAの機能を決定することは依然として困難である。長鎖非コードRNA(長鎖ncRNA、lncRNA)は、200ヌクレオチドよりも長い、タンパク質をコードしない転写産物である。
大規模シーケンス分析の主な目的は、神経幹細胞由来の小胞(エキソソーム及び微小胞)中におけるmiRNA成分を同定することであった。この分析により、エキソソーム及びMVの両方に選択的にシャトルされる新たな一連の既知及び新規miRNAを同定した。同定したmiRNAの内、mirbaseデータベースに既に含まれているのは、hsa-miR-1246、hsa-miR-4488、hsa-miR-4492、hsa-miR-4508、hsa-miR-4516、hsa-miR-4532であり、新規mirRNAの内ではAC079949.1、AP000318.1、AL161626.1、AC004943.1、AL121897.1であった。エキソソームにおいて新規のシャトルされたmiRNA等の上位にランクするシャトルされたmiRNAをqRT-PCRで確認した。
プロテオーム分析
方法
分画超遠心法を使用して、CTX0E03細胞Integra培養物(2週目)からエキソソーム画分及び微小胞画分を調製した。エキソソーム及び微小胞を変性RIPA緩衝液(50mMのTris HCl、pH8.0、150mMのNaCl、1%SDS、0.1%Triton X100、10mMのDTT、1×完全プロテアーゼ阻害剤(Roche)及び1×PhosStopホスファターゼ阻害剤(Roche))中で破砕し、1mLのツベルクリン注射器及び25ゲージ針を使用して手動でせん断した。Qubit蛍光光度計(Invitrogen)を使用して、破砕後にサンプルを再定量した。各サンプル20μgを4〜12%SDS-PAGEゲル(Novex、Invitrogen)上にロードした。ゲルをレーン毎に40個の切片に切り出し、以下のプロトコルによりロボット(ProGest、DigiLab)を使用してゲル薄片を処理した:
a)25mMの重炭酸アンモニウムで洗浄し、続いてアセトニトリルで洗浄する、
b)60℃において10mMのジチオスレイトールで還元し、続いて室温において50mMのヨードアセトアミドでアルキル化する、
c)37℃において4時間にわたりトリプシン(Promega)で消化する、
d)ギ酸でクエンチする、
e)更に処理することなく質量分析により上清を直接分析する。
ThermoFisher Q ExactiveにつないだWaters NanoAcquity HPLCシステムを使用するナノLC/MS/MSにより、各ゲル消化物を分析した。捕捉カラム及び分析カラムの両方にJupiter Proteo樹脂(Phenomenex)を充填し、ペプチドを捕捉カラム上にロードして350nL/分で75μmの分析カラムを通して溶出させた。それぞれ70,000FWHM分解能及び17,500FWHM分解能でOrbitrap中において実施したMS及びMS/MSにより、データ依存型モードで質量分析器を操作した。
超遠心分離で精製したエキソソームにおいて、質量分析により2572種のタンパク質を同定した。初期段階(2週目)のIntegra培養物からエキソソームを単離した。2572種全てのタンパク質の遺伝子名及び対応するSWISSPROTアクセッション番号(括弧内)を表18に(遺伝子名のアルファベット順に)列挙し、最も多量に存在する100種のタンパク質を表19に、量が減少する順に列挙する。特徴的なエキソソームマーカーCD9、CD81及びAlix(PDCD6IPとしても知られる)は、最も多量に存在する100種のタンパク質中に存在する。
初期段階(2週目)のIntegra培養物から単離し、10,000×gでの遠心分離で精製した微小胞において、質量分析により2940種のタンパク質を同定した。2940種全てのタンパク質の遺伝子名及び対応するSWISSPROTアクセッション番号(括弧内)を表20に(遺伝子名のアルファベット順に)列挙し、最も多量に存在する100種のタンパク質を表21に、量が減少する順に列挙する。
CD63(MLA1及びTSPAN30としても知られる)、TSG101(ESCRT-I複合体サブユニットTSG101としても知られる)、CD109(150kDaのTGF-ベータ-1-結合タンパク質としても知られる)及びthy-1(CD90としても知られる)をエキソソーム及び微小胞の両方で検出した。
微粒子のサイズ分布
NanoSight分析を行い、1週、2週、3週、4週、5週及び6週にわたりIntegra Cellineシステム中で培養したCTX0E03細胞から単離した微小胞(「mv1」〜「mv6」)及びエキソソーム(「exo1」〜「exo6」)の粒子サイズ(粒径)及び濃度を決定した。全ての結果は5回の反復測定に基づく。
1.神経幹細胞微粒子。
2.微粒子が、エキソソーム、微小胞、膜粒子、膜小胞、エキソソーム様小胞、エクトソーム様小胞、エクトソーム又はエキソベシクルである、実施形態1に記載の神経幹細胞微粒子。
3.微粒子が神経幹細胞株に由来する、実施形態1又は2に記載の神経幹細胞微粒子。
4.神経幹細胞株が、条件的不死化され、及び/又は無血清培地で生育されている、実施形態3に記載の神経幹細胞微粒子。
5.神経幹細胞株が、ECACC受託番号04091601を有するCTX0E03、ECACC受託番号04110301を有するSTR0C05、及びECACC受託番号04092302を有するHPC0A07である、実施形態4に記載の神経幹細胞微粒子。
6.微粒子が、
(a)電子顕微鏡で決定した場合に30nm〜1000nmの若しくは30〜200nmの若しくは30〜100nmのサイズ、又は
(b)1.1〜1.2g/mlのスクロース中密度
を有する、実施形態1から5のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
7.RNAを含む、実施形態1から6のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
8.RNAがmRNA及び/又はmiRNAである、実施形態7に記載の神経幹細胞微粒子。
9.微粒子が、hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532の1種、2種、3種又は4種を含む、実施形態8に記載の神経幹細胞微粒子。
10.(a)セラミド、コレステロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール及び/若しくはホスファチジルコリンから選択される脂質、
(b)任意選択で、hsa-let-7g、hsa-miR-101、hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、hsa-miR-126、hsa-miR-128、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-130a、hsa-miR-134、hsa-miR-137、hsa-miR-155、hsa-miR-15a、hsa-miR-15b、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-182、hsa-miR-183、hsa-miR-185、hsa-miR-18b、hsa-miR-192、hsa-miR-194、hsa-miR-195、hsa-miR-20a、hsa-miR-20b、hsa-miR-210、hsa-miR-218、hsa-miR-301a、hsa-miR-302a、hsa-miR-302c、hsa-miR-345、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-7、hsa-miR-9、hsa-miR-93、hsa-miR-96、及びhsa-miR-99aから選択される、miRNA、
(c)任意選択でCD63、CD81、CD9、CD53、CD82及び/若しくはCD37から選択される、テトラスパニン、
(d)TSG101、Alix、CD109及び/若しくはthy-1、並びに/又は
(e)CD133
の1種以上を含む、実施形態1から9のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
11.表19又は表21に示されるタンパク質の少なくとも10種を含む、実施形態1から10のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
12.神経幹細胞又は神経幹細胞の条件培地の少なくとも1種の生物学的活性を含む、実施形態1から11のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
13.少なくとも1種の生物学的活性が再生活性である、実施形態12に記載の神経幹細胞微粒子。
14.治療に使用するための、実施形態1から13のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
15.治療が再生治療である、実施形態14に記載の神経幹細胞微粒子。
16.治療が、
(i)神経学的障害、疾患又は欠損、例えばパーキンソン、アルツハイマー、卒中若しくはALS、
(ii)リソソーム蓄積症、
(iii)心血管障害、例えば心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢動脈性疾患、糖尿病性潰瘍、創傷治癒、
(iv)特発性肺線維症、呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺高血圧症、嚢胞性線維症及び喘息を含む肺の疾患、
(v)代謝性又は炎症性障害、例えば糖尿病(I若しくはII型)、関節リウマチ、変形性関節症、ループス、クローン病、過敏性腸疾患又は移植片対宿主病、
(vi)精神障害、例えば鬱病、双極性、統合失調症、又は自閉症候群障害、例えば自閉症、アスペルガー症候群若しくはレット症候群、
(vii)失明を引き起こす網膜の疾患、例えば加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、糖尿病性網膜症又は網膜色素変性症、並びに
(viii)脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、白質萎縮症、ギラン・バレー症候群、抗MAG末梢神経障害及びシャルコー・マリー・トゥース病
に対するものである、実施形態14又は15に記載の神経幹細胞微粒子。
17.治療が機能及び/又は認知の回復を改変する、実施形態14から16のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
18.治療が卒中、末梢動脈性疾患又は失明を引き起こす網膜の疾患に対するものである、実施形態14から17のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
19.(i)微粒子がエキソソームであり、治療が組織の置換、再生若しくは修復を必要とする疾患若しくは状態に対するものである、あるいは
(ii)微粒子が微小胞であり、治療が血管新生を必要とする疾患又は神経学的障害、疾患若しくは欠損に対するものである、実施形態14から17のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子。
20.疾患の処置用の医薬の製造における、実施形態1から19のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子の使用。
21.神経幹細胞の条件培地から微粒子を単離することを含む、実施形態1から13のいずれかに記載の神経幹細胞微粒子の製造方法。
22.幹細胞の条件培地から微粒子を単離することを含む幹細胞微粒子の製造方法であって、
(i)幹細胞の条件培地が、幹細胞による培地中への微粒子の放出を誘導する1種以上の成分を含み、
(ii)幹細胞が低酸素条件下で培養されたものであり、
(iii)幹細胞が異なる細胞型と共培養されたものであり、
(iv)幹細胞が多区画のバイオリアクタ中で培養されたものであり、及び/又は
(v)幹細胞が部分的に分化させたものである、上記方法。
23.幹細胞が神経幹細胞であり、任意選択で実施形態3から5のいずれかに記載の神経幹細胞である、実施形態22に記載の方法。
24.1種以上の成分が、形質転換増殖因子-ベータ(TGF-β)、インターフェロン-ガンマ(INF-γ)及び腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)から選択される、実施形態22(i)又は実施形態22(i)に従属する場合の実施形態23に記載の方法。
25.異なる細胞型が内皮細胞である、実施形態22(iii)、実施形態22(iii)に従属する場合の実施形態23又は24に記載の方法。
26.実施形態22から25のいずれかに記載の方法により得られる微粒子。
27.実施形態1から13のいずれか又は実施形態26に記載の微粒子と、薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤とを含む組成物。
28.実施形態1から13のいずれか又は実施形態26に記載の微粒子の製造方法に使用するためのキットであって、(a)培地、(b)神経幹細胞、(c)任意選択で、実施形態22から24のいずれかに記載の1種以上の成分、(d)任意選択で、対照としての使用に適した実施形態1から13のいずれか又は実施形態26に記載の微粒子、(e)任意選択で、産生した微粒子の特異的検出に適した検出剤、及び(f)キットを使用して実施形態1から13のいずれか又は実施形態26に記載の微粒子を製造するための指示書、を含むキット。
29.幹細胞と候補薬剤とを接触させること、及び接触した幹細胞による微粒子の産生速度が対照と比較して増加するか又は低下するかを観測することを含む、幹細胞による微粒子の産生速度を変化させる薬剤のスクリーニング方法。
30.hsa-miR-1246、hsa-miR-4492、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532の2種、3種又は4種全てを含む組成物。
31.薬学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル及び/又は賦形剤を含む医薬組成物である、実施形態30に記載の組成物。
32.治療に使用するための、実施形態30又は31に記載の組成物。
33.治療が実施形態16に記載したものである、実施形態32に記載の治療に使用するための組成物。
Claims (33)
- 幹細胞微粒子の製造方法であって、
(i)幹細胞の分化が可能な環境下で幹細胞を培養すること、及び
(ii)上記細胞により産生される微粒子を回収すること
を含む方法。 - 幹細胞の分化が可能な環境が、多区画のバイオリアクタ中の培養であり、例えば、バイオリアクタが細胞を含有する区画をガス及び/又は培養培地を含有する1つ以上の区画から分離する1つ以上の膜又は障壁で分離されている少なくとも2つの区画を含有する、請求項1に記載の方法。
- 培養が7日を超えるものである、請求項2に記載の方法。
- 幹細胞の条件培地から微粒子を単離することを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 幹細胞の条件培地が、幹細胞による培地中への微粒子の放出を刺激する1種以上の添加成分又は薬剤を含む、請求項4に記載の方法。
- 1種以上の成分が、形質転換増殖因子-ベータ(TGF-β)、インターフェロン-ガンマ(INF-γ)及び/又は腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)から選択される、請求項5に記載の方法。
- 幹細胞が低酸素条件下で培養されたものである、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 幹細胞が別の細胞型と共培養されたものである、請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 別の細胞型が内皮細胞である、請求項8に記載の方法。
- 幹細胞が神経幹細胞である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 幹細胞が神経幹細胞株である、請求項10に記載の方法。
- 神経幹細胞株が条件的不死化されている、請求項11に記載の方法。
- 神経幹細胞株が、ECACC受託番号04091601を有するCTX0E03、ECACC受託番号04110301を有するSTR0C05、及びECACC受託番号04092302を有するHPC0A07である、請求項11又は12に記載の方法。
- 神経幹細胞株が無血清培地で生育されている、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 神経幹細胞が、Nestin、Sox2、GFAP、βIIIチューブリン、DCX、GALC、TUBB3、GDNF及びIDOの1種以上のマーカーを発現する、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 微粒子がエキソームであり、該エキソームがDCX、GFAP、GALC、TUBB3、GDNF及びIDOの1種以上を発現する、請求項10〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも2種の、3種の、4種の、5種の、6種の又は7種のmiRNAが、制御倍率により算出した場合に、標準的なT-175フラスコ中で培養された対応する幹細胞における場合と比較して微粒子において上方制御又は下方制御される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 微粒子がエキソームであり、該エキソームが、以下のmiRNA:hsa-miR-146b-5p; hsa-let-7c; hsa-miR-99a; hsa-miR-132; hsa-miR-378; hsa-miR-181a; hsa-let-7b; hsa-miR-100; hsa-let-7e; hsa-miR-23b; hsa-miR-185; hsa-let-7i; hsa-let-7a; hsa-let-7d; hsa-let-7g; hsa-miR-222; hsa-let-7f; hsa-miR-218; hsa-miR-24; hsa-miR-9; hsa-miR-126; hsa-miR-134; hsa-miR-128; 及びhsa-miR-155の1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種又はそれ以上を、制御倍率により算出した場合に、標準的なT-175フラスコ中で培養された対応する幹細胞において発現される場合よりも高いレベルで発現する、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 微粒子がエキソームであり、該エキソームが、以下のmiRNA:hsa-miR-22; hsa-miR-26a; hsa-miR-210; hsa-miR-92a; hsa-miR-93; hsa-miR-424; hsa-miR-195; hsa-miR-127-5p; hsa-miR-21; hsa-miR-103a; hsa-miR-16; hsa-miR-125a-5p; hsa-miR-10a; hsa-miR-10b; hsa-miR-345; hsa-miR-130a; hsa-miR-15b; hsa-miR-20b; hsa-miR-20a; hsa-miR-17; hsa-miR-7; hsa-miR-106b; hsa-miR-101; hsa-miR-302a; hsa-miR-301a; hsa-miR-183; hsa-miR-219-5p; hsa-miR-18a; hsa-miR-15a; hsa-miR-182; hsa-miR-33a; hsa-miR-96; 及びhsa-miR-18bの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種又はそれ以上を、制御倍率により算出した場合に、標準的なT-175フラスコ中で培養された対応する幹細胞において発現される場合よりも低いレベルで発現する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 微粒子が、hsa-miR-1246、hsa、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532の1種、2種、3種又は4種を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 単離された又は精製された微粒子に、1種以上の外因性の核酸、脂質、タンパク質、薬物又はプロドラッグを負荷することをさらに含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 外因性の核酸が、1種以上の病態遺伝子をサイレンシングすることができるsiRNAである、請求項21に記載の方法。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法により得ることができる微粒子。
- DCX、GFAP、GALC、TUBB3、GDNF及びIDOの1種以上を発現するエキソームである微粒子。
- エキソームが、以下のmiRNA:hsa-miR-146b-5p; hsa-let-7c; hsa-miR-99a; hsa-miR-132; hsa-miR-378; hsa-miR-181a; hsa-let-7b; hsa-miR-100; hsa-let-7e; hsa-miR-23b; hsa-miR-185; hsa-let-7i; hsa-let-7a; hsa-let-7d; hsa-let-7g; hsa-miR-222; hsa-let-7f; hsa-miR-218; hsa-miR-24; hsa-miR-9; hsa-miR-126; hsa-miR-134; hsa-miR-128; 及びhsa-miR-155の1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種又はそれ以上を、制御倍率により算出した場合に、標準的なT-175フラスコ中で培養された対応する幹細胞において発現される場合よりも高いレベルで発現する、請求項23又は24に記載の微粒子。
- エキソームが、以下のmiRNA:hsa-miR-22; hsa-miR-26a; hsa-miR-210; hsa-miR-92a; hsa-miR-93; hsa-miR-424; hsa-miR-195; hsa-miR-127-5p; hsa-miR-21; hsa-miR-103a; hsa-miR-16; hsa-miR-125a-5p; hsa-miR-10a; hsa-miR-10b; hsa-miR-345; hsa-miR-130a; hsa-miR-15b; hsa-miR-20b; hsa-miR-20a; hsa-miR-17; hsa-miR-7; hsa-miR-106b; hsa-miR-101; hsa-miR-302a; hsa-miR-301a; hsa-miR-183; hsa-miR-219-5p; hsa-miR-18a; hsa-miR-15a; hsa-miR-182; hsa-miR-33a; hsa-miR-96; 及びhsa-miR-18bの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種又はそれ以上を、制御倍率により算出した場合に、標準的なT-175フラスコ中で培養された対応する幹細胞において発現される場合よりも低いレベルで発現する、請求項23〜25のいずれか1項に記載の微粒子。
- hsa-miR-1246、hsa、hsa-miR-4488及びhsa-miR-4532の1種、2種、3種又は4種を含む、請求項23〜26のいずれか1項に記載の微粒子。
- 治療に使用するための、請求項23〜27のいずれか1項に記載の微粒子。
- 治療が、
(i)神経学的障害、疾患又は欠損、例えばパーキンソン、アルツハイマー、卒中若しくはALS、
(ii)リソソーム蓄積症、
(iii)心血管障害、例えば心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢動脈性疾患、糖尿病性潰瘍、創傷治癒、
(iv)特発性肺線維症、呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺高血圧症、嚢胞性線維症及び喘息を含む肺の疾患、
(v)代謝性又は炎症性障害、例えば糖尿病(I型若しくはII型)、関節リウマチ、変形性関節症、ループス、クローン病、過敏性腸疾患又は移植片対宿主病、
(vi)精神障害、例えば鬱病、双極性、統合失調症、又は自閉症候群障害、例えば自閉症、アスペルガー症候群若しくはレット症候群、
(vii)失明を引き起こす網膜の疾患、例えば加齢性黄斑変性、シュタルガルト病、糖尿病性網膜症又は網膜色素変性症、あるいは
(viii)脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、脳性まひ、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、白質萎縮症、ギラン・バレー症候群、抗MAG末梢神経障害及びシャルコー・マリー・トゥース病
に対するものである、請求項28に記載の微粒子。 - 請求項23〜27のいずれか1項に記載の微粒子及び幹細胞を含む組成物であって、場合により該幹細胞が、該微粒子が由来する幹細胞であり、例えば幹細胞がECACC受託番号04091601を有するCTX0E03である、上記組成物。
- 治療に使用するための、請求項30に記載の組成物。
- 幹細胞及び微粒子が、
(i)単一の医薬組成物で共に投与される、
(ii)同時期に又は同時に投与されるが別々に投与される、あるいは
(iii)別々に及び連続して投与される、例えば細胞の投与と微粒子の投与との間の期間が1時間、1日、1週間、2週間又はそれ以上である、
請求項31に記載の組成物。 - 治療が、微粒子が由来する幹細胞を受ける宿主において寛容、典型的には免疫寛容を誘導する、あるいは幹細胞を微粒子と共に投与することにより幹細胞に対する寛容が増強する、請求項31又は32に記載の組成物。
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