WO2023182507A1 - 薬学的組成物、間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法、エクソソームの製造方法、および薬学的組成物の製造方法 - Google Patents
薬学的組成物、間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法、エクソソームの製造方法、および薬学的組成物の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2023182507A1 WO2023182507A1 PCT/JP2023/011889 JP2023011889W WO2023182507A1 WO 2023182507 A1 WO2023182507 A1 WO 2023182507A1 JP 2023011889 W JP2023011889 W JP 2023011889W WO 2023182507 A1 WO2023182507 A1 WO 2023182507A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- mir
- culture
- stem cells
- dimensional culture
- mesenchymal stem
- Prior art date
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 127
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 90
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 69
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims description 144
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 101
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims abstract description 98
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 96
- 108091061970 miR-26a stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 108091091807 let-7a stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 108091057746 let-7a-4 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 108091028376 let-7a-5 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 108091024393 let-7a-6 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 108091091174 let-7a-7 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 108091057188 miR-369 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 108091029119 miR-34a stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 108091070404 miR-27b stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 claims abstract description 51
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 31
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 25
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 42
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 42
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 42
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 26
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 18
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 16
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 claims description 14
- 230000006999 cognitive decline Effects 0.000 claims description 13
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 11
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 11
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 11
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 11
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 5
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 47
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 42
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 38
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 35
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 31
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 30
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 29
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 28
- 238000010175 APPswe/PSEN1dE9 Methods 0.000 description 22
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 21
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 20
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 20
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 20
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 18
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 17
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 16
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 15
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 14
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 13
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 12
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 210000003703 cisterna magna Anatomy 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 8
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 8
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 7
- 238000012347 Morris Water Maze Methods 0.000 description 7
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 7
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000007792 alzheimer disease pathology Effects 0.000 description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 6
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 4
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 3
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 3
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 3
- 101000882584 Homo sapiens Estrogen receptor Proteins 0.000 description 3
- 238000003231 Lowry assay Methods 0.000 description 3
- 238000009013 Lowry's assay Methods 0.000 description 3
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 3
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 210000002987 choroid plexus Anatomy 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011818 5xFAD mouse Methods 0.000 description 2
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 108091070521 Homo sapiens let-7a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091070522 Homo sapiens let-7a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091070513 Homo sapiens let-7a-3 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091070372 Homo sapiens miR-26a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091065428 Homo sapiens miR-26a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091069018 Homo sapiens miR-27b stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091067619 Homo sapiens miR-34a stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091067253 Homo sapiens miR-369 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091007424 MIR27B Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 2
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026821 Artificial microRNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 241001269524 Dura Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 208000007353 Hip Osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000009829 Lewy Body Disease Diseases 0.000 description 1
- 201000002832 Lewy body dementia Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000283089 Perissodactyla Species 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000008717 functional decline Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004394 hip joint Anatomy 0.000 description 1
- 238000011540 hip replacement Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003933 intellectual function Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000008449 language Effects 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000007087 memory ability Effects 0.000 description 1
- 108091027943 miR-16 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000003253 miRNA assay Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 108010024603 neurotensin mimic 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000006403 short-term memory Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000006886 spatial memory Effects 0.000 description 1
- 210000002330 subarachnoid space Anatomy 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
Definitions
- FIG. 2 is a diagram showing the measurement results of OCT4 expression level, SOX2 expression level, and NANOG expression level in AD-MSC cultured using a two-dimensional culture carrier and AD-MSC cultured using Prime Surface. miR-26a expression, let-7a expression, miR-27b expression, miR -34a expression level and miR-369 expression level measurement results.
- FIG. 2 is a diagram showing an outline of an experiment to confirm the influence of intranasal administration of exosomes isolated from the culture medium of AD-MSCs cultured on Prime Surface on the cognitive function of 5 ⁇ FAD mice.
- the cell culture solution is not particularly limited as long as it can culture mesenchymal stem cells, and may be a culture solution that is commonly used for culturing animal cells.
- it may be a culture solution containing fetal bovine serum, sheep serum, etc., or a culture solution containing serum collected from the subject itself from which the mesenchymal stem cells are derived, or from another individual of the same or closely related species as the subject. It may be.
- known culture solutions, commercially available culture solutions, and the like may be used.
- it may be a commercially available complete growth medium.
- arbitrary components for culturing mesenchymal stem cells may be added to the cell culture solution.
- the optional components may include, for example, physiological saline and buffer solutions.
- a culture having excellent activity is one in which the expression level of at least one of let-7a, miR-26a, miR-27b, miR-34a, and miR-369 is more significant than that of a culture obtained by two-dimensional culture. Refers to highly cultured products. Moreover, since the three-dimensional culture can be collected under mild conditions through the above-described collection process, a culture having excellent activity can be stably produced.
- a method for producing a three-dimensional culture of mesenchymal stem cells includes a culture step of culturing spheroids as a three-dimensional culture using a spheroid culture plate, and a method for producing a three-dimensional culture of mesenchymal stem cells.
- the method includes a recovery step of recovering the culture from the spheroid culture plate.
- the three-dimensional culture of mesenchymal stem cells has higher levels of let-7a, miR-26a, miR-27b, miR-34a, and miR- This is a culture in which the expression level of at least one type of microRNA of 369 is increased.
- a pharmaceutical composition containing the above-mentioned microRNA, three-dimensional culture, and/or exosome as an active ingredient may be administered.
- the therapeutic method may be a therapeutic method aimed at preventing or ameliorating cognitive decline, and particularly may be a therapeutic method aiming at preventing or ameliorating Alzheimer's dementia.
- Pharmaceutical compositions may be administered, for example, intrathecally, intranasally, intravascularly, and the like.
- the pharmaceutical composition according to Aspect 7 is the pharmaceutical composition according to any one of Aspects 4 to 6, wherein the three-dimensional culture includes a spheroid.
- the pharmaceutical composition according to Aspect 8 is the pharmaceutical composition according to any one of Aspects 1 to 7, wherein the cognitive decline is due to Alzheimer's type dementia.
- the method for producing a three-dimensional culture of mesenchymal stem cells provides a method for producing a three-dimensional culture of mesenchymal stem cells, in which the mesenchymal stem cells are grown on a culture carrier containing a hydrogel whose main component is a polysaccharide polymer, or a culture carrier containing collagen as a main component.
- RNA expression levels of PTEN, EGFR, BRCA1, and ESR1 which are target genes regulated by both let-7a and miR-26a, in three groups: NN, AD-N, and AD-D. Analyzed. Total RNA was extracted from the samples of each group using RecoverAll (trademark) Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE (Thermo Fisher Scientific). cDNA was synthesized by reverse transcription reaction, and real-time PCR was performed for PTEN, EGFR, BRCA1, and ESR1 using primer sets corresponding to the sequence numbers shown in Table 2.
- the microRNAs of miR-26a, miR-27b, and miR-369 are higher in AD-MSCs (collagen) cultured on a collagen membrane than in AD-MSCs (2D) cultured on a two-dimensional culture carrier. It was revealed that the expression level of .
- the expression level of microRNA in AD-MSCs (collagen) cultured with collagen membranes derived from each case shown in Figure 21 is calculated by setting the expression level of microRNA in 2D-MSCs (2D) derived from the corresponding case to 1. It is plotted as a relative value when
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
認知機能の予防または改善に有効な新規の薬学的組成物を提供することを目的とする。ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡを有効成分として含む薬学的組成物、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した間葉系幹細胞の三次元培養物、または間葉系幹細胞をハイドロゲルを含む培養担体を用いて三次元培養する培養工程および前記培養担体から分離することで前記三次元培養物を回収する回収工程を含む三次元培養物の製造方法である。
Description
本発明は薬学的組成物、間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法、エクソソームの製造方法、および薬学的組成物の製造方法に関する。
我が国の認知症患者は約４６２万人と推定されている。アルツハイマー型認知症は認知症の中でも患者数が最も多い。アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ＡＤ）は、脳内の変性蛋白（Ａβまたはタウ）が原因とされている。このような状況下、脳内の変性蛋白の蓄積を抑えて認知機能を予防、向上、または改善するために、例えば、特許文献１にはＡβに対する抗体療法、特許文献２にはＡβの産生を抑制する薬剤、および特許文献３には抗タウ抗体がそれぞれ開示されている。これらを用いた治療方法については、その効果を検証した治験が行われている。
しかしながら、上述のような従来技術は、認知機能の予防、向上、または改善に対する有効性が示されていない。このため、新たな治療法の開発が課題となっていた。
本発明の一態様は認知機能の予防または改善に有効な新規の薬学的組成物を提供することを目的とする。
本発明の一態様は認知機能の予防または改善に有効な新規の薬学的組成物を提供することを目的とする。
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る薬学的組成物は、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡを有効成分として含むことを特徴とする、認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物である。
上記の課題を解決するために、本発明の別の一態様に係る薬学的組成物は、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする、認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物である。
上記の課題を解決するために、本発明の別の一態様に係る薬学的組成物は、間葉系幹細胞の三次元培養物を有効成分として含み、前記間葉系幹細胞の三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物であることを特徴とする、認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物である。
上記の課題を解決するために、本発明の別の一態様に係る薬学的組成物は、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含有するエクソソームを有効成分として含み、前記エクソソームは間葉系幹細胞の三次元培養物に由来する、かつ、前記間葉系幹細胞の二次元培養物から分泌されたエクソソームと比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの含有量が増加することを特徴とする、認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物である。
上記課題を解決するために、本発明の別の一態様に係る間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法は、前記間葉系幹細胞を、主成分が多糖ポリマーであるハイドロゲルを含む培養担体、または主成分としてコラーゲンを含む培養担体を用いて三次元培養する培養工程、および前記培養工程で得られた三次元培養物を前記培養担体から分離して前記三次元培養物を回収する回収工程を含み、前記三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物であることを特徴とする、間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法である。
上記課題を解決するために、本発明の別の一態様に係る間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法は、間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法であって、前記製造方法は、スフェロイド培養用プレートを用いて三次元培養物としてスフェロイドを培養する培養工程、および前記培養工程で得られた前記三次元培養物を前記スフェロイド培養用プレートから回収する回収工程を含み、前記三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物であることを特徴とする、間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法である。
本発明の一態様によれば、認知機能の予防または改善に有効な新規の薬学的組成物を提供することができる。
本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意図する。
〔薬学的組成物〕
以下、本発明の一実施形態に係る薬学的組成物について、詳細に説明する。
以下、本発明の一実施形態に係る薬学的組成物について、詳細に説明する。
本実施形態において、「薬学的組成物」とは、対象の認知機能低下の予防用または改善用の有効成分を含む任意の組成物である。有効成分の他に含まれる成分は特に限定されず、任意の添加剤（充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、および界面活性剤等の賦形剤ならびに希釈剤等）を含むものであってもよい。薬学的組成物の剤形は特に限定されず、たとえば固体剤および液剤等であってもよい。以下、本実施形態等において、単に「薬学的組成物」と記載する場合においても、認知機能低下の予防または改善用の薬学的組成物を意味する。
本明細書において、「対象」とは、動物の個体を指し、好ましくは哺乳動物の個体、例えば、ヒト、チンパンジー等の霊長類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の齧歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の偶蹄目、ウマ等の奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコ等の個体であり、さらに好ましくはヒトの個体である。
本明細書において、「認知機能」とは、記憶能力、言語能力、判断能力、計算能力、遂行能力等の知的機能を指す。認知機能の低下とは、これらの機能が健常な状態よりも低下することを指す。認知機能の低下の原因は主に脳の機能低下によって引き起こされ、特に限定されないが、例えば脳における病変、遺伝子発現量の変化およびタンパク質発現量の変化等によって引き起こされる。Ａβおよびタウの蓄積等によって引き起こされるアルツハイマー型認知症による認知機能の低下も「認知機能の低下」に含まれる。
＜薬学的組成物の有効成分＞
（マイクロＲＮＡ）
本発明の一実施形態に係る薬学的組成物は、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（以下、ｌｅｔ－７ａ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ（以下、ｍｉＲ－２６ａ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ（以下、ｍｉＲ－２７ｂ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ（以下、ｍｉＲ－３４ａ）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３６９－３ｐ（以下、ｍｉＲ－３６９）の少なくとも１種のマイクロＲＮＡを有効成分として含む。薬学的組成物は、ｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種のマイクロＲＮＡを有効成分として含むことが好ましい。ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９は、脳におけるＡβおよびタウの蓄積に代表されるアルツハイマー型認知症の病変を有するにも関わらず認知機能が正常であった対象の海馬を解析することで、認知機能低下を予防するまたは改善するという効果を有することが新たに見出されたマイクロＲＮＡである。これらのマイクロＲＮＡを有効成分として含む薬学的組成物は、対象の認知機能の低下を予防または改善することができる。ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９は以下の表１に示す塩基配列を少なくとも有する。
（マイクロＲＮＡ）
本発明の一実施形態に係る薬学的組成物は、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（以下、ｌｅｔ－７ａ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ（以下、ｍｉＲ－２６ａ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ（以下、ｍｉＲ－２７ｂ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ（以下、ｍｉＲ－３４ａ）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３６９－３ｐ（以下、ｍｉＲ－３６９）の少なくとも１種のマイクロＲＮＡを有効成分として含む。薬学的組成物は、ｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種のマイクロＲＮＡを有効成分として含むことが好ましい。ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９は、脳におけるＡβおよびタウの蓄積に代表されるアルツハイマー型認知症の病変を有するにも関わらず認知機能が正常であった対象の海馬を解析することで、認知機能低下を予防するまたは改善するという効果を有することが新たに見出されたマイクロＲＮＡである。これらのマイクロＲＮＡを有効成分として含む薬学的組成物は、対象の認知機能の低下を予防または改善することができる。ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９は以下の表１に示す塩基配列を少なくとも有する。
表１に示す塩基配列は、本実施形態に係るマイクロＲＮＡの効果が得られる範囲であれば塩基が置換されていてもよい。一塩基置換によって置換される場合、置換される塩基数は１以上であってもよく、２以上であってもよく、３以上であってもよい。また、置換される塩基数は５以下であってもよく、４以下であってもよく、３以下であってもよい。マイクロＲＮＡの配列における塩基置換の位置は特に限定されないが、例えば表１に示すマイクロＲＮＡ配列の３’末端および５’末端の少なくとも一方において塩基が置換されていてもよい。
さらに、本実施形態に係るマイクロＲＮＡの効果が得られる範囲であれば、任意の数の塩基配列を塩基配列の３’末端および５’末端の少なくとも一方に、任意の塩基配列を付加してもよい。例えば、マイクロＲＮＡの安定性を高めるために、任意の塩基配列を付加してもよい。付加される塩基数は、１以上であってもよく、３以上であってもよく、５以上であってもよい。また、付加される塩基数は、７以下であってもよく、５以下であってもよく、３以下であってもよい。
マイクロＲＮＡは天然および非天然のマイクロＲＮＡのどちらであってもよい。天然のマイクロＲＮＡとは、対象の体液および組織等から得られたマイクロＲＮＡを指す。人工のマイクロＲＮＡとは、従来公知の方法によって製造されるマイクロＲＮＡを指し、任意の化学修飾を加えたマイクロＲＮＡであってもよい。
対象の体内におけるマイクロＲＮＡの安定性を向上させる観点から、マイクロＲＮＡの任意の残基がアデノシン残基、ウリジン残基、グアノシン残基、およびシチジン残基とは異なる公知の残基に置換されていてもよい。例えば、マイクロＲＮＡの少なくとも一部のウリジン残基がシュードウリジン残基に置換されてもよい。これにより、対象の体内において、マイクロＲＮＡが対象の免疫機構に排除されず、マイクロＲＮＡの安定性が向上する。この結果、マイクロＲＮＡによる認知機能低下の予防または改善の効果を安定的に奏することが可能となり、かつ、この効果が長く持続する。
（ベクター）
本発明のさらなる一実施形態に係る薬学的組成物は、上述のｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含む。発現ベクターは、ｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むことが好ましい。発現ベクターは対象の体内において発現可能な任意の基材ベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ等を用いることができ、より具体的には、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター等のベクター、ならびにそれらの組み合わせに由来するコスミドおよびファージミド等が挙げられる。発現ベクターは用途に応じて適宜に選択してもよく、例えば、標的とする組織に応じて選択してもよい。
本発明のさらなる一実施形態に係る薬学的組成物は、上述のｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含む。発現ベクターは、ｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むことが好ましい。発現ベクターは対象の体内において発現可能な任意の基材ベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ等を用いることができ、より具体的には、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター等のベクター、ならびにそれらの組み合わせに由来するコスミドおよびファージミド等が挙げられる。発現ベクターは用途に応じて適宜に選択してもよく、例えば、標的とする組織に応じて選択してもよい。
発現ベクターに含まれる塩基配列は、発現ベクターとしての機能を得る目的および機能を向上する目的等において、任意の配列を含んでもよい。例えば、本実施形態に係る発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー等をコードする配列を含んでもよい。
上述のような発現ベクターを有効成分として含む薬学的組成物であることで、薬学的組成物を適用した対象内においてｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種を発現することができる。
（三次元培養物）
本発明のさらなる一実施形態に係る薬学的組成物は、間葉系幹細胞の三次元培養物を有効成分として含み、前記間葉系幹細胞の三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物であってもよい。三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物であることが好ましい。本実施形態に係る三次元培養物は、三次元培養担体を用いて生体内に近い条件で三次元培養された培養物である。二次元培養物は、平面培養等で二次元培養された培養物である。ここで、「培養物」とは、間葉系幹細胞を培養して得られた結果物、すなわち培養した間葉系幹細胞自体および間葉系幹細胞の培養液を指す。
本発明のさらなる一実施形態に係る薬学的組成物は、間葉系幹細胞の三次元培養物を有効成分として含み、前記間葉系幹細胞の三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物であってもよい。三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物であることが好ましい。本実施形態に係る三次元培養物は、三次元培養担体を用いて生体内に近い条件で三次元培養された培養物である。二次元培養物は、平面培養等で二次元培養された培養物である。ここで、「培養物」とは、間葉系幹細胞を培養して得られた結果物、すなわち培養した間葉系幹細胞自体および間葉系幹細胞の培養液を指す。
三次元培養物は、二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の発現量が増加していればよく、その増加の程度は特に限定されない。例えば三次元培養物の当該マイクロＲＮＡの発現量は、二次元培養物の当該マイクロＲＮＡの発現量に対して、１．３倍以上であればよく、１．５倍以上であることが好ましく、２倍以上であることが特に好ましい。発現量の増加の判断は、例えば、複数の反復ごとに測定された各発現量の平均値の比較に基づいてもよい。
本実施形態に係る三次元培養物は、三次元培養後に三次元培養担体から分離して得られる三次元培養物であることが好ましい。三次元培養物のみを対象に投与することで、不純物である三次元培養担体を対象内に投与することを防ぐことができる。また、三次元培養物のみを対象に投与することで、有効成分の濃度の調整が容易になる。例えば、有効成分を高い濃度で含む薬学的組成物を作製できる。
本実施形態に係る三次元培養物に含まれる間葉系幹細胞はエクソソームを分泌する。特に、本実施形態に係る三次元培養物に含まれる間葉系幹細胞は、同一の間葉系幹細胞を用いて作製した二次元培養物に含まれる間葉系幹細胞と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡを多く含むエクソソームを分泌する。本実施形態に係る三次元培養物を対象に投与すると、対象の標的組織においてエクソソームを分泌し、エクソソーム内のｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９が対象の認知機能の低下を予防または改善する効果を奏する。
また、三次元培養物は、薬学的組成物として対象に投与された後に対象の標的組織に定着することが好ましい。これにより、対象内において三次元培養物からのエクソソームの分泌を長期間維持できる。例えば、投与後１ヶ月後であっても標的期間において存在していてもよい。
三次元培養物に含まれる培養液を濃縮して対象に投与してもよい。これにより、当該培養液に含まれる有効成分の濃度が高まるため好ましい。なお、培養液に含まれる有効成分とは、エクソソームであってもよい。
三次元培養物は、スフェロイドを含んでもよい。本開示において、スフェロイドとは、細胞が凝集した細胞塊を意味する。好ましくは、スフェロイドは略球形の形態である。
間葉系幹細胞は、多分化能および自己複製能を有する幹細胞であり、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞といった間葉系に属する細胞に分化するだけでなく、神経細胞または肝細胞等にも胚葉を超えて分化する能力を有する。本実施形態において、間葉系幹細胞は、任意の対象から分離または抽出された間葉系幹細胞、および多能性幹細胞から分化誘導して得られた間葉系幹細胞等が挙げられるが、特に限定されない。以下、間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）のことをＭＳＣと称する場合がある。
「任意の対象から分離もしくは抽出されたＭＳＣ」とは、例えば、健常な対象または疾患を有する対象から分離されたＭＳＣ、および哺乳動物の胎児付属物からの抽出物から得られたＭＳＣ等である。
「健常な対象または疾患を有する対象から分離されたＭＳＣ」は、薬学的組成物の有効成分として対象へ適用する際の安全性の観点から、薬学的組成物の適用を受ける対象自体、または対象と同種もしくは近縁種の別個体から採取するのが好ましい。本実施形態において、間葉系幹細胞は、対象由来である自家性細胞であってもよいし、同種の別の対象に由来する他家性細胞であってもよい。例えば、ヒトの個体に本実施形態の薬学的組成物を投与する場合、同種であるヒトから採取されたＭＳＣであることが好ましく、投与を受ける同一のヒト個体から採取された細胞、すなわち自己ＭＳＣが特に好ましい。
ＭＳＣは、対象の骨髄液、脂肪組織、歯髄等の任意の試料から採取したものであってもよい。特に骨髄液、脂肪組織に由来するＭＳＣ、すなわち、骨髄由来間葉系幹細胞（Ｂｏｎｅ－ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：ＢＭ－ＭＳＣ）、脂肪由来間葉系幹細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：ＡＤ－ＭＳＣ）であることが好ましい。ＭＳＣを試料から分離する方法は、公知の手法に従って行えばよく、特に限定されない。試料として骨髄液を用いる場合、密度勾配遠心法、骨髄播種法等の公知の手法により、ＭＳＣを分離することが可能である。
「哺乳動物の胎児付属物からの抽出物」は、哺乳動物、好ましくはヒトの胎児娩出後に後産として母体から娩出されるかまたは帝王切開により母体から摘出された胎児付属物であってもよい。特に、臍帯組織、胎盤組織または卵膜を、任意の方法で調製して得られる抽出物であることが好ましい。抽出物は、特に、ドナーである哺乳動物由来の増殖能を有する細胞を含まないものであることが好ましい。
多能性幹細胞から分化誘導して得られた間葉系幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）等の多能性幹細胞から分化誘導して得ることができる。
（エクソソーム）
本発明のさらなる一実施形態に係る薬学的組成物は、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含有するエクソソームを有効成分として含んでもよい。エクソソームは、特に、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含有するエクソソームを有効成分として含むことが好ましい。ここで、当該エクソソームは、例えば、間葉系幹細胞の三次元培養物に由来するエクソソームであり、かつ、前記間葉系幹細胞の二次元培養物から分泌されたエクソソームと比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの含有量が増加したものである。
本発明のさらなる一実施形態に係る薬学的組成物は、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含有するエクソソームを有効成分として含んでもよい。エクソソームは、特に、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含有するエクソソームを有効成分として含むことが好ましい。ここで、当該エクソソームは、例えば、間葉系幹細胞の三次元培養物に由来するエクソソームであり、かつ、前記間葉系幹細胞の二次元培養物から分泌されたエクソソームと比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの含有量が増加したものである。
エクソソームは上述の三次元培養物中の三次元培養した幹細胞より分泌され、三次元培養物中の培養液に含まれる。単に「三次元培養物から分泌されたエクソソーム」と記載する場合においても、三次元培養物中の三次元培養した幹細胞より分泌されたことを意味する。ここで、当該マイクロＲＮＡの増加の程度は特に限定されない。例えば三次元培養物から分泌されたエクソソームのｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの含有量は、二次元培養物から分泌されたエクソソームの対応するマイクロＲＮＡの含有量に対して、１．３倍以上であればよく、１．５倍以上であることが好ましく、２倍以上であることが特に好ましい。
エクソソームを分離するため三次元培養物の製造方法は、本実施形態に係るエクソソームが得られる製造方法であれば、特に限定されない。また、三次元培養物中の培養液からエクソソームを分離する方法は、従来公知の方法により行うことが可能である。例えば、遠心分離によって、培養液からエクソソームを分離することができる。
培養液からエクソソームを分離する際は、三次元培養物は三次元培養担体から除去されていてもよいし、除去されていなくてもよい。三次元培養物から三次元培養担体を除去するか否かは、三次元培養担体の種類によって判断してもよい。例えば、三次元培養担体として、ゲル状の担体を用いる場合は、ゲルを液化して三次元培養物から担体を除去し、遠心分離によって培養液の上清を得てもよい。一方で、三次元培養担体として、シート状の担体を用いる場合は、三次元培養物から担体を除去することなく、培養上清からエクソソームを分離してもよい。
＜用途＞
本発明の一実施形態における薬学的組成物は、認知機能低下を予防または改善する薬学的組成物である。ここで、認知機能低下とは、例えばアルツハイマー型認知症であってもよい。
本発明の一実施形態における薬学的組成物は、認知機能低下を予防または改善する薬学的組成物である。ここで、認知機能低下とは、例えばアルツハイマー型認知症であってもよい。
本発明の一実施形態に係る治療方法は、前記薬学的組成物を用いる認知機能低下を予防または改善するための治療方法である。特に、前記薬学的組成物を用いるアルツハイマー型認知症の治療方法であることが好ましい。
治療方法において、薬学的組成物の投与回数、投与経路等の薬学的組成物の投与方法は特に限定されず、対象の状態およびその他の医学的要因に基づいて適宜に変更してもよい。
薬学的組成物は任意の投与経路によって対象に投与することにより、認知機能の低下を治療してもよい。薬学的組成物の対象への投与方法は特に限定されないが、例えば髄腔内投与、鼻腔内投与、および血管内投与等であってもよい。例えば、薬学的組成物に含まれる有効成分が前記マイクロＲＮＡ、前記三次元培養物、または前記エクソソームである場合、薬学的組成物の投与方法は特に限定されないが、髄腔内投与、鼻腔内投与、および血管内投与等であってもよい。
薬学的組成物に含まれる有効成分の量は、対象の状態、投与経路、およびその他の医学的要因によって適宜に決定され、特に限定されない。
好ましい実施形態において、前記間葉系幹細胞の三次元培養物の投与量は、全身投与の場合で投与される個体の体重１ｋｇあたり全身投与の場合で投与される個体の体重１ｋｇあたり１０４細胞～１０９細胞であってもよく、好ましくは１０５細胞～１０８細胞である。局所投与の場合では、投与される個体の体重１ｋｇあたり１０２細胞～１０９細胞であってもよく、好ましくは１０４細胞～１０７細胞である。
さらに、その他の薬学的組成物を投与する態様は公知の方法を組み合わせたものであってもよい。例えば、標的とする組織に薬学的組成物を送達させる際に用いるドラックデリバリーシステムは、薬学的組成物の適用時に任意に決定すればよい。また、薬学的組成物は公知の認知機能改善剤と併用してもよい。
〔三次元培養物の製造方法〕
本発明の一実施形態の間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法は、前記間葉系幹細胞を培養担体を用いて三次元培養する培養工程、および前記培養工程で得られた三次元培養物を前記培養担体から分離して前記三次元培養物を回収する回収工程を含む。ここで、前記間葉系幹細胞の三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物である。特に、当該製造方法によって得られた三次元培養物から分離されたエクソソームとして、同一の間葉系幹細胞の二次元培養物から分離されたエクソソームと比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加したエクソソームを得ることができる。三次元培養物またはエクソソームは、同一の間葉系幹細胞の二次元培養物またはその二次元培養物に由来するエクソソームと比較して、特にｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加したものであってもよい。
本発明の一実施形態の間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法は、前記間葉系幹細胞を培養担体を用いて三次元培養する培養工程、および前記培養工程で得られた三次元培養物を前記培養担体から分離して前記三次元培養物を回収する回収工程を含む。ここで、前記間葉系幹細胞の三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物である。特に、当該製造方法によって得られた三次元培養物から分離されたエクソソームとして、同一の間葉系幹細胞の二次元培養物から分離されたエクソソームと比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加したエクソソームを得ることができる。三次元培養物またはエクソソームは、同一の間葉系幹細胞の二次元培養物またはその二次元培養物に由来するエクソソームと比較して、特にｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加したものであってもよい。
当該三次元培養物の製造方法によれば、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した好適な三次元培養物を得ることができる。さらに、培養前に播種した細胞数の少なくとも４０％以上、または少なくとも５０％以上の三次元培養物が得ることができる。
間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法において、間葉系幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞であることが好ましい。
（培養工程）
培養工程において用いられる培養担体は、同一の間葉系幹細胞による二次元培養担体を用いた場合よりも、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種の発現量が高くなる三次元培養担体であれば、特に限定されない。
培養工程において用いられる培養担体は、同一の間葉系幹細胞による二次元培養担体を用いた場合よりも、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種の発現量が高くなる三次元培養担体であれば、特に限定されない。
三次元培養を行う日数は、０．１日以上であってもよく、０．２日以上であることが好ましい。また、三次元培養を行う日数は、７日以下であってもよく、６日以下であることが好ましい。三次元培養を行う日数が当該下限および上限を満たす範囲内であることにより、三次元培養物を好適に得ることができる。
三次元培養を行う温度条件は、０℃以上であってもよく、４℃以上であることが好ましい。また、三次元培養を行う温度条件は、４０℃以下であってもよく、３８℃以下であることが好ましい。温度条件が当該上限および下限を満たすことにより三次元培養物を好適に得ることができる。
本発明の一実施形態において、培養工程は、間葉系幹細胞を、主成分が多糖ポリマーであるハイドロゲルを含む培養担体、または主成分としてコラーゲンを含む培養担体を用いて三次元培養する工程であってもよい。
ハイドロゲルを用いた培養工程は、高質な細胞を十分量得ることができるため、三次元培養物自体を対象に投与する場合に特に好ましい。また、当該培養担体として、ハイドロゲルに加えて、細胞培養液、およびハイドロゲルを希釈するための糖溶液を含む培養担体であることが好ましい。
本実施形態のハイドロゲルの主成分は多糖ポリマーであってもよい。ここで、培養工程において用いられる培養担体に含まれるハイドロゲルの主成分とは、ハイドロゲル成分中において、最も多い成分を占める成分のことを指す。多糖ポリマーは人工的に合成して得られた合成多糖ポリマーであってもよい。さらに、多糖ポリマーは、担体機能を高める観点から、任意の置換基およびペプチド類等によって修飾されていてもよい。
培養担体に含まれるハイドロゲルは、多糖ポリマーが細胞培養液に含まれるＣａ２＋イオンおよびＮａ＋イオン等の陽イオンと反応してゲル化してなる。多糖ポリマーに加える細胞培養液の比率を調節することにより、ハイドロゲルの粘性を調節することができる。
ハイドロゲルを希釈するための糖溶液に含まれる糖の種類、および濃度は特に限定されない。糖溶液に含まれる糖は、グルコース、スクロース、ガラクトース、フルクトース、およびマンノース等の糖であってもよく、これらの糖を単独で含んでも、複数を混合して含んでもよい。糖溶液の濃度は、１％以上であってもよく、２％以上であることが好ましく、３％以上であることがさら好ましい。また、糖溶液の濃度は１０％以下であってもよく、９％以下であることが好ましく、８％以下であることがさらに好ましい。本実施形態において、糖溶液はハイドロゲルを希釈する際に用いられるものであってもよい。
本実施形態において、細胞培養液の体積を１とすると、細胞培養液量に対して加えられるハイドロゲルの体積は０．５以上であってもよく、０．６以上であることが好ましく、０．７以上であることがさらに好ましい。また、細胞培養液の体積を１とすると、細胞培養液量に対して加えられるハイドロゲルの体積は４以下であってもよく、２以下であることが好ましく、１．５以下であることがさらに好ましい。ハイドロゲルが、細胞培養液に対して当該比率で加えられることで、間葉系幹細胞の培養に適した粘性を有する培養担体とすることができる。
本実施形態において、ハイドロゲルの体積を１とすると、ハイドロゲルに対して加えられる糖溶液は１以上であってもよく、２以上であることが好ましく、２．５以上であることがさらに好ましい。また、ハイドロゲルの体積を１とすると、ハイドロゲルに対して加えられる糖溶液は、５以下であってもよく、４以下であることが好ましく、３．５以下であることがさらに好ましい。
細胞培養液の体積を１とすると、細胞培養液量に対して加えられる糖溶液は、０．５以上であってもよく、１以上であることが好ましく、１．２５以上であることがさらに好ましい。また、細胞培養液の体積を１とすると、細胞培養液量に対して加えられる糖溶液は、１２以下であってもよく、６以下であることが好ましく、４．５以下であることがさらに好ましい。これにより、ハイドロゲルの希釈倍率を好適な範囲とすることができるため、間葉系幹細胞の培養に適した粘性を有する培養担体とすることができる。
細胞培養液の体積を１とすると、ハイドロゲルおよび糖溶液の混合物の体積は１以上であってもよく、１．６以上であることが好ましく、１．９５以上であることがさらに好ましい。また、細胞培養液の体積を１とすると、ハイドロゲルおよび糖溶液を合計したゲル組成物の体積は１６以下であってもよく、８以下であることが好ましく、６以下であることがさらに好ましい。
培養担体は、上述のようなハイドロゲルを含む培養担体であれば、特に限定されない。このような培養担体として、例えばＴｈｅＷｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣが提供するＶｉｔｒｏｇｅｌ（登録商標）が挙げられる。
Ｖｉｔｒｏｇｅｌ（登録商標）を用いることにより、後述する回収工程において、酵素処理および／または任意の溶液による化学処理のような、細胞にダメージを与える処理を行うことなく、穏やかな条件で三次元培養物を回収することができる。これにより、細胞回収率が高くなる。
本発明の一実施形態において、培養工程において用いられる培養担体は、コラーゲン含む培養担体であることが好ましい。コラーゲンを用いた培養工程は、高質な細胞を十分量得ることができるため、三次元培養物自体を対象に投与する場合に特に好ましい。また、当該培養担体として、コラーゲンに加えて、細胞培養液を含む培養担体であることが好ましい。
コラーゲン培養担体としては、ゲル状担体、膜状担体、およびスポンジ状担体等を用いることができる。特に、コラーゲン培養担体として、膜状担体が好ましい。
このようなコラーゲンを含む培養担体として、例えばＫＯＫＥＮ社が提供する透過性コラーゲン膜、および新田ゼラチン株式会社が提供するＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ等が挙げられる。
細胞培養液は、間葉系幹細胞を培養できる培養液であれば特に限定されず、通常の動物細胞の培養に用いられる培養液であってもよい。例えば、ウシ胎児血清、ヒツジ血清などを含む培養液であってもよいし、間葉系幹細胞が由来する対象自体、または対象と同種もしくは近縁種の別個体から採取された血清を含む培養液であってもよい。また、公知の培養液および市販の培養液等を用いてもよい。例えば、市販の完全増殖培地であってもよい。このほか、細胞培養液には、間葉系幹細胞を培養するための任意の成分を添加してもよい。任意の成分とは、例えば生理食塩水および緩衝液等であってもよい。
（回収工程）
回収工程において、培養工程によって得られた三次元培養物は、細胞分離溶液による処理および遠心分離によって、培養担体から分離されることが好ましい。この構成により、三次元培養物を穏やかな条件で回収することができる。
回収工程において、培養工程によって得られた三次元培養物は、細胞分離溶液による処理および遠心分離によって、培養担体から分離されることが好ましい。この構成により、三次元培養物を穏やかな条件で回収することができる。
主成分が多糖ポリマーであるハイドロゲルを含む培養担体を用いた培養工程を行った場合、細胞分離溶液は、高質な細胞を十分量得る観点から、ハイドロゲル構造中におけるイオン化分子を除去することにより、培養担体を三次元培養物から分離する機能を有する溶液であることが好ましい。このような細胞分離溶液として、例えばＶｉｔｒｏｇｅｌ（登録商標） ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎが挙げられる。
コラーゲンを主成分として含む培養担体を用いた培養工程を行った場合、細胞分離溶液は、高質な細胞を十分量得る観点から、培養担体を溶解する機能を有する溶液であることが好ましい。このような細胞分離溶液として、例えばコラゲナーゼを含む溶液が挙げられる。また、細胞分離溶液はプロテアーゼであってもよく、例えばトリプシンであってもよい。
細胞分離溶液により処理した後に、遠心分離を行い、三次元培養物と培養担体とを分離する。遠心分離の条件（時間、遠心力等は）は、三次元培養物および培養担体の量、濃度、粘度等に応じて適宜に決定すればよい。
遠心分離の遠心力は１００Ｇ以上であってもよく、２００Ｇ以上であることが好ましい。また、遠心分離の遠心力は５００Ｇ以下であってもよく、４００Ｇ以下であることが好ましい。遠心力がとりわけ下限を下回らないことで、三次元培養物と培養担体とを適切に分離することができる。また、遠心力がとりわけ上限を上回らないことで、適切な形態を保った三次元培養物を得ることができる。
遠心分離の時間は、例えば、３００Ｇの条件で２分以上であってもよく、３分以上であることが好ましい。また、遠心分離の時間は、１２分以下であってもよく、１１分以下であることが好ましい。遠心分離の時間が上記下限および上限を満たす範囲内であれば、三次元培養物と培養担体とを好適に分離することができる。
回収工程における温度条件は、３０℃以上であってもよく、３５℃以上であることが好ましい。また、回収工程における温度条件は４０℃以下であってもよく、３８℃以下であることが好ましい。
上述した回収工程を行うことにより、優れた活性を有する培養物を得ることができる。優れた活性を有する培養物とは、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種の発現量が二次元培養によって得られた培養物よりも顕著に高い培養物のことを指す。また、上述の回収工程により、三次元培養物を穏やかな条件で回収できるため、優れた活性を有する培養物を安定的に製造することができる。
〔スフェロイドの製造方法〕
本発明の一実施形態の間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法は、スフェロイド培養用プレートを用いて三次元培養物としてスフェロイドを培養する培養工程、および培養工程で得られた前記三次元培養物を前記スフェロイド培養用プレートから回収する回収工程を含む。ここで、当該間葉系幹細胞の三次元培養物は、同一の間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物である。特に、当該製造方法によって得られた三次元培養物から分離されたエクソソームとして、同一の間葉系幹細胞の二次元培養物から分離されたエクソソームと比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加したエクソソームを得ることができる。三次元培養物またはエクソソームは、同一の間葉系幹細胞の二次元培養物またはその二次元培養物に由来するエクソソームと比較して、特にｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加したものであってもよい。
本発明の一実施形態の間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法は、スフェロイド培養用プレートを用いて三次元培養物としてスフェロイドを培養する培養工程、および培養工程で得られた前記三次元培養物を前記スフェロイド培養用プレートから回収する回収工程を含む。ここで、当該間葉系幹細胞の三次元培養物は、同一の間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物である。特に、当該製造方法によって得られた三次元培養物から分離されたエクソソームとして、同一の間葉系幹細胞の二次元培養物から分離されたエクソソームと比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加したエクソソームを得ることができる。三次元培養物またはエクソソームは、同一の間葉系幹細胞の二次元培養物またはその二次元培養物に由来するエクソソームと比較して、特にｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加したものであってもよい。
間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法において、間葉系幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞であることが好ましい。
（スフェロイドの培養工程）
本発明の一実施形態において、培養工程は、スフェロイド培養用プレートを用いて三次元培養物としてスフェロイドを培養する培養工程であってもよい。
本発明の一実施形態において、培養工程は、スフェロイド培養用プレートを用いて三次元培養物としてスフェロイドを培養する培養工程であってもよい。
スフェロイド培養用プレートとは、例えば、スフェロイドを培養する培養面に低接着材料または非接着材料が塗布されたプレートであってもよい。低接着材料または非接着材料は、親水ポリマーを含む材料であってもよい。また、例えば、スフェロイド培養用プレートの培養面は凹部を有していてもよい。凹部の開口部の直径は０．３ｍｍ以上０．６ｍｍ以下であってもよい。凹部の開口部から最低面までの距離は０．１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下であってもよい。スフェロイド培養用プレートとしては、特に限定されないが、住友ベークライト社が提供するＰｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）シャーレ９０ｍｍ、ＡＧＣテクノグラスが提供するＥＺＳＰＨＥＲＥディッシュ１００ｍｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社が提供するＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）培養チャンバー、およびＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社が提供するＮｕｎｃｌｏ（商標）Ｓｐｈｅｒａ（商標）Ｆｌａｓｋｓ等であってもよい。
（スフェロイドの回収工程）
三次元培養物は、ピペッティング、遠心分離、および濾過等を用いた任意の方法によって、スフェロイド培養用プレートから回収することができる。
三次元培養物は、ピペッティング、遠心分離、および濾過等を用いた任意の方法によって、スフェロイド培養用プレートから回収することができる。
回収工程における温度条件は、３０℃以上であってもよく、３５℃以上であることが好ましい。また、回収工程における温度条件は４０℃以下であってもよく、３８℃以下であることが好ましい。
上述した回収工程を行うことにより、優れた活性を有する培養物を得ることができる。優れた活性を有する培養物とは、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種の発現量が二次元培養によって得られた培養物よりも顕著に高い培養物のことを指す。また、上述の回収工程により、三次元培養物を穏やかな条件で回収できるため、優れた活性を有する培養物を安定的に製造することができる。
（三次元培養物）
本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の三次元培養物は、上述の製造方法によって製造される。上述の製造方法によって得られた三次元培養物において、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種の発現量が、同一の間葉系幹細胞による二次元培養物よりも顕著に高くなる。特に、上述の製造方法によって得られた三次元培養物において、ｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種の発現量が、同一の間葉系幹細胞による二次元培養物よりも顕著に高くなる。
本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の三次元培養物は、上述の製造方法によって製造される。上述の製造方法によって得られた三次元培養物において、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種の発現量が、同一の間葉系幹細胞による二次元培養物よりも顕著に高くなる。特に、上述の製造方法によって得られた三次元培養物において、ｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種の発現量が、同一の間葉系幹細胞による二次元培養物よりも顕著に高くなる。
本実施形態の三次元培養物について、いわゆる製造方法によって生産物を記述している。これは、上述の幹細胞の培養の結果として得られた三次元培養物自体について、構造的にどのようなものか一義的に規定することが極めて困難であるため、および、その構造的特徴の測定のために、考え得る全ての構成について調べる作業を出願前に行うことは、不可能かつ非現実的であるためである。
〔エクソソームの製造方法〕
本発明の一実施形態であるエクソソームの製造方法は、上述の製造方法により間葉系幹細胞の三次元培養物を製造する工程、および三次元培養物から、エクソソームを分離する分離工程を含む。
本発明の一実施形態であるエクソソームの製造方法は、上述の製造方法により間葉系幹細胞の三次元培養物を製造する工程、および三次元培養物から、エクソソームを分離する分離工程を含む。
分離工程において、エクソソームは、任意の方法によって三次元培養物から分離されてもよい。例えば分離工程は、三次元培養物を遠心分離により処理することによって培養液の上清を得る工程を含んでもよい。また、分離工程は、上清からエクソソームを抽出または精製する工程をさらに含む工程であってもよい。上清からエクソソームを抽出または精製する工程は、例えば、超遠心分離による処理、限外濾過による処理、クロマトグラフィーによる処理、および分離試薬を用いた処理等を含むことができる。
上清を得る処理における遠心分離の遠心力は１００Ｇ以上であってもよく、２００Ｇ以上であることが好ましい。また、遠心分離の遠心力は５００Ｇ以下であってもよく、４００Ｇ以下であることが好ましい。遠心力がとりわけ下限を下回らないことで、エクソソームを含む上清と培養された間葉系幹細胞とを適切に分離することができる。また、遠心力がとりわけ上限を上回らないことで、損傷の少ないエクソソームを含む上清を得ることができる。
上清を得る処理における遠心分離の時間は、例えば、３００Ｇの条件で２分以上であってもよく、３分以上であることが好ましい。また、遠心分離の時間は、２０分以下であってもよく、１５分以下であることが好ましい。遠心分離の時間が上記下限および上限を満たす範囲内であれば、エクソソームを含む上清と培養された間葉系幹細胞とを好適に分離することができる。
分離工程における温度条件は、０℃以上であってもよく、２℃以上であることが好ましい。また、分離工程における温度条件は４０℃以下であってもよく、３８℃以下であることが好ましい。
（エクソソーム）
本発明の一実施形態に係るエクソソームは、上述のエクソソームの製造方法によって製造される。上述の製造方法によって得られたエクソソームにおいて、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種の発現量が、同一の間葉系幹細胞による二次元培養物から分泌されたエクソソームよりも顕著に高くなる。特に、上述の製造方法によって得られたエクソソームにおいて、ｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種の発現量が、同一の間葉系幹細胞による二次元培養物から分泌されたエクソソームよりも顕著に高くなる。エクソソームは４０ｎｍ以上４００ｎｍ以下の粒子であってもよい。
本発明の一実施形態に係るエクソソームは、上述のエクソソームの製造方法によって製造される。上述の製造方法によって得られたエクソソームにおいて、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種の発現量が、同一の間葉系幹細胞による二次元培養物から分泌されたエクソソームよりも顕著に高くなる。特に、上述の製造方法によって得られたエクソソームにおいて、ｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種の発現量が、同一の間葉系幹細胞による二次元培養物から分泌されたエクソソームよりも顕著に高くなる。エクソソームは４０ｎｍ以上４００ｎｍ以下の粒子であってもよい。
本実施形態のエクソソームについて、いわゆる製造方法によって生産物を記述している。これは、上述の幹細胞の培養の結果として得られた三次元培養物から分泌されたエクソソーム自体について、構造的にどのようなものか一義的に規定することが極めて困難であるため、および、その構造的特徴の測定のために、考え得る全ての構成について調べる作業を出願前に行うことは、不可能かつ非現実的であるためである。
〔薬学的組成物の製造方法〕
本発明の一実施形態に係る薬学的組成物の製造方法は、上述の製造方法により間葉系幹細胞の三次元培養物を製造する工程、および前記三次元培養物を用いて認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物を製造する工程、を含む。
本発明の一実施形態に係る薬学的組成物の製造方法は、上述の製造方法により間葉系幹細胞の三次元培養物を製造する工程、および前記三次元培養物を用いて認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物を製造する工程、を含む。
また、本発明の一実施形態に係る薬学的組成物の製造方法は、上述の製造方法によりエクソソームを製造する工程、および前記エクソソームを用いて認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物を製造する工程、を含む。
薬学的組成物を製造する工程は特に限定されず、適応する対象の状態およびその他の医学的要因を考慮して、適用すればよい。
〔エクソソームのスクリーニング方法〕
本発明の一実施形態に係るエクソソームのスクリーニング方法は、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加していることを指標として、エクソソームを選別する工程を含んでもよい。特に、エクソソームのスクリーニング方法は、ｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加していることを指標として、エクソソームを選別する工程を含むことが好ましい。発現量の増加の程度は特に限定されないが、例えばエクソソームの当該マイクロＲＮＡの発現量は、二次元培養物から分離されたエクソソームのマイクロＲＮＡの発現量に対して、１．３倍以上であればよく、１．５倍以上であることが好ましく、２倍以上であることが特に好ましい。
本発明の一実施形態に係るエクソソームのスクリーニング方法は、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加していることを指標として、エクソソームを選別する工程を含んでもよい。特に、エクソソームのスクリーニング方法は、ｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加していることを指標として、エクソソームを選別する工程を含むことが好ましい。発現量の増加の程度は特に限定されないが、例えばエクソソームの当該マイクロＲＮＡの発現量は、二次元培養物から分離されたエクソソームのマイクロＲＮＡの発現量に対して、１．３倍以上であればよく、１．５倍以上であることが好ましく、２倍以上であることが特に好ましい。
上記スクリーニング方法で選別されたエクソソームは、認知機能低下の予防薬または改善薬として有用である。
〔培養物〕
本発明の一実施形態に係る培養物は、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量がコントロールの培養物と比較して、増加しているものであってもよい。ここで、培養物は、三次元培養によって得られる培養物、および各マイクロＲＮＡがトランスフェクションされた培養物等であってもよい。本発明の一実施形態に係る培養物が三次元培養によって得られる培養物であるときは、コントロールの培養物は二次元培養によって得られる培養物である。本発明の一実施形態に係る培養物が、各マイクロＲＮＡがトランスフェクションされた培養物であるときは、コントロールの培養物はトランスフェクションがされていない培養物またはＮｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃがトランスフェクションされた培養物である。
本発明の一実施形態に係る培養物は、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量がコントロールの培養物と比較して、増加しているものであってもよい。ここで、培養物は、三次元培養によって得られる培養物、および各マイクロＲＮＡがトランスフェクションされた培養物等であってもよい。本発明の一実施形態に係る培養物が三次元培養によって得られる培養物であるときは、コントロールの培養物は二次元培養によって得られる培養物である。本発明の一実施形態に係る培養物が、各マイクロＲＮＡがトランスフェクションされた培養物であるときは、コントロールの培養物はトランスフェクションがされていない培養物またはＮｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃがトランスフェクションされた培養物である。
〔治療方法〕
本発明の一実施形態に係る治療方法は、上述のマイクロＲＮＡ、三次元培養物、および／またはエクソソームを有効成分として含む薬学的組成物を投与してもよい。治療方法は、認知機能低下の予防または改善を目的とした治療方法であってもよく、特にアルツハイマー型認知症の予防または改善を目的とした治療方法であってもよい。薬学的組成物は、例えば髄腔内投与、鼻腔内投与、および血管内投与等によって投与されてもよい。
本発明の一実施形態に係る治療方法は、上述のマイクロＲＮＡ、三次元培養物、および／またはエクソソームを有効成分として含む薬学的組成物を投与してもよい。治療方法は、認知機能低下の予防または改善を目的とした治療方法であってもよく、特にアルツハイマー型認知症の予防または改善を目的とした治療方法であってもよい。薬学的組成物は、例えば髄腔内投与、鼻腔内投与、および血管内投与等によって投与されてもよい。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
〔まとめ〕
本発明を以下のように表現することもできる。
本発明を以下のように表現することもできる。
本態様１に係る薬学的組成物は、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡを有効成分として含むことを特徴とする、認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物である。この構成により認知機能低下の予防または改善を目的とした、新規の薬学的組成物を提供できる。
本態様２に係る薬学的組成物は、前記態様１において、前記マイクロＲＮＡの少なくとも一部のウリジン残基がシュードウリジン残基に置換されていることを特徴とする、薬学的組成物である。この構成により、対象内におけるマイクロＲＮＡの安定性を高めることができる。
本態様３に係る薬学的組成物は、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする、認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物である。この構成により、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９を対象内において発現させることができる。
本態様４に係る薬学的組成物は、間葉系幹細胞の三次元培養物を有効成分として含み、前記間葉系幹細胞の三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物であることを特徴とする、認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物である。この構成により、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９を含むエクソソームを対象内において発現させることができる、薬学的組成物を提供できる。
本態様５に係る薬学的組成物は、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含有するエクソソームを有効成分として含み、前記エクソソームは間葉系幹細胞の三次元培養物に由来する、かつ、前記間葉系幹細胞の二次元培養物から分泌されたエクソソームと比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの含有量が増加することを特徴とする、認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物である。この構成により認知機能低下の予防または改善を目的とした、新規の薬学的組成物を提供できる。
本態様６に係る薬学的組成物は、前記態様４または５において、間葉系幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、薬学的組成物である。
本態様７に係る薬学的組成物は、前記三次元培養物はスフェロイドを含む、前記態様４～６のいずれかに記載の薬学的組成物。
本態様８に係る薬学的組成物は、前記認知機能低下がアルツハイマー型認知症によるものであることを特徴とする、前記態様１～７のいずれかの薬学的組成物である。
本態様９に係る間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法は、前記間葉系幹細胞を、主成分が多糖ポリマーであるハイドロゲルを含む培養担体、または主成分としてコラーゲンを含む培養担体を用いて三次元培養する培養工程、および前記培養工程で得られた三次元培養物を前記培養担体から分離して前記三次元培養物を回収する回収工程を含み、前記三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物であることを特徴とする、間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法である。この構成により、認知機能低下の予防用または改善用の三次元培養物が提供できる。
本態様１０に係る間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法は、スフェロイド培養用プレートを用いて三次元培養物としてスフェロイドを培養する培養工程、および前記培養工程で得られた前記三次元培養物を前記スフェロイド培養用プレートから回収する回収工程を含み、前記三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物であることを特徴とする、間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法である。
本態様１１に係る三次元培養物の製造方法は、前記態様９または１０において、前記間葉系幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法である。
本態様１２に係るエクソソームの製造方法は、前記態様９～１１のいずれかに記載の製造方法により前記間葉系幹細胞の三次元培養物を製造する工程、および前記三次元培養物から、エクソソームを分離する分離工程を含むことを特徴とする、エクソソームの製造方法である。
本態様１３に係る三次元培養物は、前記態様９～１１のいずれかによって製造されることを特徴とする、間葉系幹細胞の三次元培養物である。この構成の三次元培養物は、認知機能低下の予防用途または改善用途において好適な性質を有する。
本態様１４に係るエクソソームは、前記態様１２の製造方法によって製造されることを特徴とする、エクソソームである。
本態様１５に係る薬学的組成物の製造方法は、前記態様１１に記載の方法により前記間葉系幹細胞の三次元培養物を製造する工程、および前記三次元培養物を用いて認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物を製造する工程、含むことを特徴とする、薬学的組成物の製造方法である。
〔実施例〕
＜実施例１：アルツハイマー病理を有する被献体の認知機能＞
札幌医科大学に献体された被験者の死後脳のアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ
ｄｉｓｅａｓｅ： ＡＤ）病理および生前の認知機能について調査した（倫理委員会承認研究：２６－２－５１）。被験者として、肉眼的に脳梗塞および脳出血等の病変がみられず、かつ、既往歴に脳血管障害、ＡＤ以外の脳疾患（レビー小体型認知症等等）、および精神疾患（うつ等）がみられなかった被験者を選別した。
〔実施例〕
＜実施例１：アルツハイマー病理を有する被献体の認知機能＞
札幌医科大学に献体された被験者の死後脳のアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ
ｄｉｓｅａｓｅ： ＡＤ）病理および生前の認知機能について調査した（倫理委員会承認研究：２６－２－５１）。被験者として、肉眼的に脳梗塞および脳出血等の病変がみられず、かつ、既往歴に脳血管障害、ＡＤ以外の脳疾患（レビー小体型認知症等等）、および精神疾患（うつ等）がみられなかった被験者を選別した。
被験者のＡＤ病理の有無は次の通り評価した。まず、１）Ｐｈａｓｅ ｆｏｒ Ａβ ｐｌａｑｕｅｓ（Ａスコア）、２） Ｂｒａａｋ ＮＦＴ ｓｔａｇｅ（Ｂスコア）、３） ＣＥＲＡＤ ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｐｌａｑｕｅ ｓｃｏｒｅ（Ｃスコア）のＡＢＣスコアを算出した。次に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｎ Ａｇｉｎｇ－Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの診断基準に従い、ＡＤ病理をＮｏｔ／Ｌｏｗ／Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ／Ｈｉｇｈに分類した。Ｎｏｔ／Ｌｏｗの場合は「ＡＤ病理なし」、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ／Ｈｉｇｈの場合は「ＡＤ病理あり」と評価した。
被験者の認知機能は認知症の有無に基づいて評価した。認知症の有無は、被験者の死亡前６ヶ月時点における認知機能について、臨床認知症評価法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ：ＣＤＲ）に従い、遺族に質問することによって評価した。ＣＤＲの結果が０点および０．５点の場合は「認知症なし」、ＣＤＲが１点・２点および３点の場合は「認知症あり」と判断した。
ここで、ＡＤ病理なしの群（Ｎ）中、認知症なしの群（Ｎ－Ｎ）と認知症ありの群（Ｎ－Ｄ）とに分類し、ＡＤ病理ありの群（ＡＤ）中、認知症なしの群（ＡＤ－Ｎ）と認知症ありの群（ＡＤ－Ｄ）とに分類した。各群に、分類された被験者の数は４～５であった。
＜実施例２：マイクロＲＮＡ発現量の解析＞
各群の海馬からマイクロＲＮＡを抽出し、ｔｏｔａｌ マイクロＲＮＡの発現量についてアレイ解析を行った。アレイ解析はマイクロアレイキット（Thermo Fisher Scientific社）を用いて実施し、データはΔΔCt法を用いて解析した。ＡＤ－ＮおよびＡＤ－Ｄのアレイ解析の結果を比較した。図１はその結果を示すプロット図である。図１のプロット図は、ｍｉＲ－１６を参照遺伝子として、ＡＤ－ＮのマイクロＲＮＡの発現量を縦軸とし、ＡＤ－ＤにおけるマイクロＲＮＡの発現量を横軸として、各遺伝子を発現量に基づきプロットした。
各群の海馬からマイクロＲＮＡを抽出し、ｔｏｔａｌ マイクロＲＮＡの発現量についてアレイ解析を行った。アレイ解析はマイクロアレイキット（Thermo Fisher Scientific社）を用いて実施し、データはΔΔCt法を用いて解析した。ＡＤ－ＮおよびＡＤ－Ｄのアレイ解析の結果を比較した。図１はその結果を示すプロット図である。図１のプロット図は、ｍｉＲ－１６を参照遺伝子として、ＡＤ－ＮのマイクロＲＮＡの発現量を縦軸とし、ＡＤ－ＤにおけるマイクロＲＮＡの発現量を横軸として、各遺伝子を発現量に基づきプロットした。
ＡＤ－Ｄに比べてＡＤ－Ｎで発現量が高いマイクロＲＮＡの中でも、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ（以下、「ｍｉＲ－２６ａ」）およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（以下、「ｌｅｔ－７ａ」）の発現量が特に高かった。図１において、１と示されているプロットがｍｉＲ－２６ａを示し、２と示されているプロットがｌｅｔ-７ａの発現量を示す。また、ＡＤ－Ｄに比べてＡＤ－Ｎで発現量が高いマイクロＲＮＡとして、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ（以下、ｍｉＲ－２７ｂ）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ（以下、ｍｉＲ－３４ａ）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３６９－３ｐ（以下、ｍｉＲ－３６９）があった。図１において、３と示されているプロットがｍｉＲ－２７ｂであり、４と示されているプロットがｍｉＲ－３４ａであり、５と示されているプロットがｍｉＲ－３６９の発現量を示す。
さらに、ｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａの両方が制御しているターゲット遺伝子であるＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ、ＢＲＣＡ１、ＥＳＲ１のｍＲＮＡの発現量について、Ｎ－Ｎ、ＡＤ－Ｎ、ＡＤ－Ｄの３群で解析した。各群の試料より、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標） Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＦＦＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ、ＢＲＣＡ１、ＥＳＲ１について、表２に示した配列番号に対応するプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。
各遺伝子のｍＲＮＡの発現量の結果を図２に示す。これらの遺伝子のｍＲＮＡは、ＡＤ－ＤがＡＤ－Ｎよりも高い発現量を示した。図２中、ＡＤ－ＤおよびＡＤ－ＮのｍＲＮＡの発現量の平均値は、Ｎ－ＮのｍＲＮＡの発現量の平均値を１としたときの相対値として示されており、エラーバーは各群における標準誤差を示す。
＜実施例３：マイクロＲＮＡ投与実験＞
（マウスの準備）
ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｍｉｃ（７５ｐｍｏｌ）、ｍｉＲ－２６ａ ｍｉｍｉｃ（７５ｐｍｏｌ）、ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃ（７５ｐｍｏｌ）、ならびにｍｉＲ－２６ａおよびｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃの混合（各７５ｐｍｏｌ、以下、「ｍｉＲ－２６ａ＋ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃ」）を、それぞれＩｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）に混合し計５μｌに調整した。これにより、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｍｉｃ試薬（１５ｎｍｏｌ／ｍｌ）、ｍｉＲ－２６ａ ｍｉｍｉｃ試薬（１５ｎｍｏｌ／ｍｌ）、ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃ試薬（１５ｎｍｏｌ／ｍｌ）、ならびにｍｉＲ－２６ａおよびｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃの混合試薬（各１５ｎｍｏｌ／ｍｌ）を作成した。なお、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｍｉｃとしては、ｍｉｒＶａｎａ（商標） ｍｉＲＮＡ Ｍｉｍｉｃ， Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＃１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。
（マウスの準備）
ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｍｉｃ（７５ｐｍｏｌ）、ｍｉＲ－２６ａ ｍｉｍｉｃ（７５ｐｍｏｌ）、ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃ（７５ｐｍｏｌ）、ならびにｍｉＲ－２６ａおよびｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃの混合（各７５ｐｍｏｌ、以下、「ｍｉＲ－２６ａ＋ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃ」）を、それぞれＩｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）に混合し計５μｌに調整した。これにより、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｍｉｃ試薬（１５ｎｍｏｌ／ｍｌ）、ｍｉＲ－２６ａ ｍｉｍｉｃ試薬（１５ｎｍｏｌ／ｍｌ）、ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃ試薬（１５ｎｍｏｌ／ｍｌ）、ならびにｍｉＲ－２６ａおよびｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃの混合試薬（各１５ｎｍｏｌ／ｍｌ）を作成した。なお、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｍｉｃとしては、ｍｉｒＶａｎａ（商標） ｍｉＲＮＡ Ｍｉｍｉｃ， Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＃１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。
１８月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウス（チャールズリバー社）の頭蓋骨に一部穴をあけ、脳室まで届く直径０．４ｍｍのカニューレを設置した。カニューレはブレグマの０．４ｍｍ後方、正中線（ｍｉｄｌｉｎｅ）から１ｍｍ右側、かつ深さ２．５ｍｍの位置に設置した。カニューレによりマイクロＲＮＡ試薬５μＬをマウスの脳室に注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。注入は、直径０．１３ｍｍのハミルトンシリンジを用いて、１μＬ／分の速度で行った。この処理を１週間おきに計４回行い、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｍｉｃ投与群、ｍｉＲ－２６ａ ｍｉｍｉｃ投与群、ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃ投与群、ｍｉＲ－２６ａ＋ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃ投与群のマウスを準備した。図３において、この処理の概要図を示す。なお、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは遺伝子的にＡβが多く蓄積するマウスであり、１８月齢で既に認知機能障害を呈していた。
（Ｙ迷路試験）
４１．５ｃｍの長さ、４ｃｍの幅、１０ｃｍの高さのアーム３本を１２０°の角度で連結したＹ迷路用装置（室町機械株式会社製）を用いて、Ｙ迷路試験（Ｙ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）を行った。図４にＹ迷路試験の概略図を示す。野生型のマウスおよび各マイクロＲＮＡ試薬によって処理したＡＰＰ／ＰＳ１マウスをＹ迷路用装置のいずれかのアームの先端に置き、７分間にわたって迷路内を自由に探索させ進入したアームを順に記録した。マウスが測定時間内に各アームに進入した回数（総アーム進入回数）および連続して異なる３本のアームに進入した組み合わせの数（交替行動数）を調べ、下記の式より交替行動率（％）を算出し、短期記憶の指標とした。
４１．５ｃｍの長さ、４ｃｍの幅、１０ｃｍの高さのアーム３本を１２０°の角度で連結したＹ迷路用装置（室町機械株式会社製）を用いて、Ｙ迷路試験（Ｙ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）を行った。図４にＹ迷路試験の概略図を示す。野生型のマウスおよび各マイクロＲＮＡ試薬によって処理したＡＰＰ／ＰＳ１マウスをＹ迷路用装置のいずれかのアームの先端に置き、７分間にわたって迷路内を自由に探索させ進入したアームを順に記録した。マウスが測定時間内に各アームに進入した回数（総アーム進入回数）および連続して異なる３本のアームに進入した組み合わせの数（交替行動数）を調べ、下記の式より交替行動率（％）を算出し、短期記憶の指標とした。
交替行動率（％）＝交替行動数÷（総アーム進入回数－２）×１００
測定した交替行動率（Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ａｌｔｅｒｍａｔｉｏｎ）を図５に示す。図５より明らかな通り、ｍｉＲ－２６ａ ｍｉｍｉｃ投与群、ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃ投与群、ｍｉＲ－２６ａ＋ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃ投与群では、Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｍｉｃ投与群に比べて、有意に認知機能が改善した。
測定した交替行動率（Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ａｌｔｅｒｍａｔｉｏｎ）を図５に示す。図５より明らかな通り、ｍｉＲ－２６ａ ｍｉｍｉｃ投与群、ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃ投与群、ｍｉＲ－２６ａ＋ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃ投与群では、Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｍｉｃ投与群に比べて、有意に認知機能が改善した。
＜実施例４：三次元間葉系幹細胞の作製＞
変形性股関節症である被験者（ｎ＝４）から、人工股関節置換術の際に漏出した骨髄を培養し、間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）を取得した（札幌医科大学倫理委員会承認研究３２２－１１７０）。被験者について、表３に詳細に示す。三次元培養担体にＢＭ－ＭＳＣを播種し、三次元培養を行った。ここで、三次元培養担体として、Ｖｉｔｒｏｇｅｌ（登録商標、ＴｈｅＷｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ）およびネオベールナノ（登録商標、グンゼ株式会社）を用いた。
変形性股関節症である被験者（ｎ＝４）から、人工股関節置換術の際に漏出した骨髄を培養し、間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）を取得した（札幌医科大学倫理委員会承認研究３２２－１１７０）。被験者について、表３に詳細に示す。三次元培養担体にＢＭ－ＭＳＣを播種し、三次元培養を行った。ここで、三次元培養担体として、Ｖｉｔｒｏｇｅｌ（登録商標、ＴｈｅＷｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ）およびネオベールナノ（登録商標、グンゼ株式会社）を用いた。
Ｖｉｔｒｏｇｅｌキットに含まれるハイドロゲルをVitroGel Dilution Solutionもしくは５％スクロース溶液によって１段階希釈し、ハイドロゲル：スクロース溶液（ｖ／ｖ）が１：３となるように希釈した。希釈したハイドロゲル：ＢＭ－ＭＳＣ懸濁液が４：１の比率となるように混合して混合物を得た。混合物における最終的な細胞濃度は２．７×１０５細胞／ｍＬであった。次に、混合物は２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） ２４Ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ、ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に加え、室温で１５分間安定させ、完全増殖培地３００μＬ（D-MEM High Glucose、SIGMA-ALDRICH社＋10% fetal bovine serum、Cell Culture Bioscience社）を混合物に加えた。混合物を２日間、３７℃で維持し、三次元培養を行った。
三次元培養を行った２４ウェルプレートに、１ｍＬのＶｉｔｒｏｇｅｌ（登録商標） ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅＷｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
ＬＬＣ）を注入し懸濁し、さらに５ｍＬのＶｉｔｒｏｇｅｌ ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎと混ぜ合わせ、１５ｍｌ遠心管（ビーエム機器社）に混入させた。その後、遠心管を２０回転倒混和させ、３７度のウォーターバス（イウチ社）に２分間静置した。この混和と静置の工程を、５回繰り返し行った。その後に遠心分離機（トミー精工社製）を用いて、５分間、３００Ｇの条件で遠心分離を行った。遠心分離の結果、沈殿物を三次元培養物として得た。三次元培養物として得られた細胞数は最初に播種した細胞の約４０～６０％であった。
ＬＬＣ）を注入し懸濁し、さらに５ｍＬのＶｉｔｒｏｇｅｌ ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎと混ぜ合わせ、１５ｍｌ遠心管（ビーエム機器社）に混入させた。その後、遠心管を２０回転倒混和させ、３７度のウォーターバス（イウチ社）に２分間静置した。この混和と静置の工程を、５回繰り返し行った。その後に遠心分離機（トミー精工社製）を用いて、５分間、３００Ｇの条件で遠心分離を行った。遠心分離の結果、沈殿物を三次元培養物として得た。三次元培養物として得られた細胞数は最初に播種した細胞の約４０～６０％であった。
１０×１０ｃｍのネオベールナノ（ポリグリコール酸を材料に含む不織布）にＢＭ－ＭＳＣを播種し、ＭＳＣ培養液１３．４ｍＬを添加した。ＢＭ－ＭＳＣは２日間、３７℃で維持して、三次元培養物を得た。三次元培養物をネオベールナノから分離するために、三次元培養物をトリプシンで処理した。
ネオベールナノを用いて三次元培養した結果、三次元培養物として得られた細胞数は最初に播種した細胞の約１０％であった。三次元培養物の取得の観点より、Ｖｉｔｒｏｇｅｌを用いた三次元培養方法は、ネオベールナノを用いた三次元培養方法よりも、優れた培養効率を有していることがわかった。
＜実施例５：培養物投与＞
（ＢＭ－ＭＳＣの調製）
実施例４と同様にＶｉｔｒｏｇｅｌを用いて三次元培養を行い、三次元培養物（３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ）を得た。また、実施例４と同様の対象より得たヒト由来ＢＭ－ＭＳＣをニ次元培養担体（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） ２４Ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ、ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に２×１０４細胞／ウェルのヒト由来ＢＭ－ＭＳＣを播種して、２日間培養を行った。
（ＢＭ－ＭＳＣの調製）
実施例４と同様にＶｉｔｒｏｇｅｌを用いて三次元培養を行い、三次元培養物（３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ）を得た。また、実施例４と同様の対象より得たヒト由来ＢＭ－ＭＳＣをニ次元培養担体（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） ２４Ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ、ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に２×１０４細胞／ウェルのヒト由来ＢＭ－ＭＳＣを播種して、２日間培養を行った。
各培養物を光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製）を用いて撮影した。２Ｄ－ＭＳＣおよび３Ｄ－ＭＳＣの形態を図６および７に示す。図６に示す通り、２Ｄ－ＭＳＣは紡錘形を示した。一方、図７に示す通り、３Ｄ－ＭＳＣはゲル内で丸まった形態を示した。
さらに、幹細胞マーカーのＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧのｍＲＮＡの発現量を表４に示す配列番号に対応するプライマーセットを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。なお、各群の試料より、Ｔｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ）を用い、そのプロトコールに基づいてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧについて、表４に示した配列番号に対応するプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。その結果を図８に示す。図８に示す通り、２Ｄ－ＭＳＣ（ｃｏｎｔｒｏｌ）よりも３Ｄ－ＭＳＣ（Ｖｉｔｒｏｇｅｌ）の方がすべての幹細胞マーカーの発現量が上昇していることが明らかとなった。図８に示す各試料のｍＲＮＡの発現量は、ｃｏｎｔｒｏｌのｍＲＮＡの発現量の平均値を１としたときの相対値としてプロットされており、エラーバーは各群における標準誤差を示す。
Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ）を用い、そのプロトコールに基づいてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧについて、表４に示した配列番号に対応するプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。その結果を図８に示す。図８に示す通り、２Ｄ－ＭＳＣ（ｃｏｎｔｒｏｌ）よりも３Ｄ－ＭＳＣ（Ｖｉｔｒｏｇｅｌ）の方がすべての幹細胞マーカーの発現量が上昇していることが明らかとなった。図８に示す各試料のｍＲＮＡの発現量は、ｃｏｎｔｒｏｌのｍＲＮＡの発現量の平均値を１としたときの相対値としてプロットされており、エラーバーは各群における標準誤差を示す。
表３の内、３症例に由来する３Ｄ ＡＤ－ＭＳＣおよび２Ｄ ＡＤ－ＭＳＣについての各三次元培養物から、３００Ｇ、３分の条件で遠心分離を行うことにより、上清を回収した。さらに、得られた上清を、３０００Ｇ、１５分の条件の遠心分離に供し、上清を回収した。上清をＥｘｏＱｕｉｃｋ－ＴＣ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と反応させ、そのプロトコールに基づいて、エクソソームを分離した。
エクソソームに含まれるｍｉＲＮＡをｍｉｒＶａｎａ（商標） ＰＡＲＩＳ（商標） ＲＮＡ ａｎｄ Ｎａｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて単離した。さらにＴａｑＭａｎ（商標） Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｃＤＮＡを作製した。マイクロＲＮＡの発現量は、ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲにより測定した。その結果を図９に示す。図９に示す通り、２Ｄ－ＭＳＣ（ｃｏｎｔｒｏｌ）よりも３Ｄ－ＭＳＣ（Ｖｉｔｒｏｇｅｌ）の方がｌｅｔ－７ａ、およびｍｉＲ－２６ａのマイクロＲＮＡの発現量が上昇していることが明らかとなった。図９に示す各症例に由来する３Ｄ－ＭＳＣにおけるマイクロＲＮＡの発現量は、対応する症例の２Ｄ－ＭＳＣにおけるマイクロＲＮＡの発現量を１としたときの相対値としてプロットされている。
（投与）
２Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ（２．５×１０４細胞／匹）および３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ（２．５×１０４細胞／匹）を５μＬのＰＢＳで懸濁した各ＭＳＣ懸濁液を調製した。２０月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを麻酔下で首の皮膚および皮下組織および筋肉を切開して大槽（Ｃｉｓｔｅｒｎａ Ｍａｇｎａ）の硬膜を露出させ、ＭＳＣ懸濁液またはビヒクル（ＰＢＳ）を大槽に注入することにより髄腔内投与した。髄腔内投与は、１０μＬハミルトンシリンジを用いて、ＭＳＣ懸濁液をゆっくりと投与した。投与後から２分後にハミルトンシリンジを除去し、切開箇所を縫合した。マウスは髄腔内投与から１ヶ月維持した後に、認知機能を確認する試験に用いた（図１０）。
２Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ（２．５×１０４細胞／匹）および３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ（２．５×１０４細胞／匹）を５μＬのＰＢＳで懸濁した各ＭＳＣ懸濁液を調製した。２０月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを麻酔下で首の皮膚および皮下組織および筋肉を切開して大槽（Ｃｉｓｔｅｒｎａ Ｍａｇｎａ）の硬膜を露出させ、ＭＳＣ懸濁液またはビヒクル（ＰＢＳ）を大槽に注入することにより髄腔内投与した。髄腔内投与は、１０μＬハミルトンシリンジを用いて、ＭＳＣ懸濁液をゆっくりと投与した。投与後から２分後にハミルトンシリンジを除去し、切開箇所を縫合した。マウスは髄腔内投与から１ヶ月維持した後に、認知機能を確認する試験に用いた（図１０）。
＜実施例６：認知機能の確認試験＞
２Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群のマウスについて、Ｙ迷路試験およびＭｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ（Ｈｉｄｄｅｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｅｓｔおよびｐｒｏｂｅ ｔｅｓｔ）を行った。さらに、２Ｄ ＢＭ―ＭＳＣ群および３Ｄ
ＢＭ－ＭＳＣ群のそれぞれの試験時のコントロールとして、ビヒクルのみを髄腔内投与した点以外は２Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群のマウスと同様にして準備したビヒクル群のマウスを準備した。各群において準備したマウスは４～８匹であった。
２Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群のマウスについて、Ｙ迷路試験およびＭｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ（Ｈｉｄｄｅｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｅｓｔおよびｐｒｏｂｅ ｔｅｓｔ）を行った。さらに、２Ｄ ＢＭ―ＭＳＣ群および３Ｄ
ＢＭ－ＭＳＣ群のそれぞれの試験時のコントロールとして、ビヒクルのみを髄腔内投与した点以外は２Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群のマウスと同様にして準備したビヒクル群のマウスを準備した。各群において準備したマウスは４～８匹であった。
（Ｙ迷路試験）
実施例５において準備したマウスについて、Ｙ迷路試験は実施例３と同様の方法で行った。図１１および１４に結果を示す。図１１に示す通り、２Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群のマウスの交替行動率（％）とビヒクル群のマウスの交替行動率（％）とには有意差はなかった（Ｐ＝０．５１５８）。一方、図１４に示す通り、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群のマウスの交替行動率（％）はビヒクル群のマウスの交替行動率（％）よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）。
実施例５において準備したマウスについて、Ｙ迷路試験は実施例３と同様の方法で行った。図１１および１４に結果を示す。図１１に示す通り、２Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群のマウスの交替行動率（％）とビヒクル群のマウスの交替行動率（％）とには有意差はなかった（Ｐ＝０．５１５８）。一方、図１４に示す通り、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群のマウスの交替行動率（％）はビヒクル群のマウスの交替行動率（％）よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）。
（モリス水迷路試験）
１．Ｈｉｄｄｅｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｅｓｔ
モリス水迷路試験のＨｉｄｄｅｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｅｓｔは次の通りに行った。すなわち、水（２５℃）を張った円形のプール（直径１．２ｍ）において、プールの端の任意の位置に設定されるスタート位置からマウスを入れ、制限時間を６０秒とし、ゴールとなるプラットフォームまでの到達時間（Ｅｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙ）を測定する試験を行った。プールの水面下にはゴールとなるプラットフォーム（直径１０ｃｍ）を配置し、プールの周囲にｖｉｓｕａｌ ｃｕｅを配置した。制限時間の６０秒を過ぎてもゴールできなかったマウスは、プラットフォーム上に１５秒乗せてから試験を終えた。スタート位置を変更した以外は同様にした試験を１日に４回行い、これを４日間行った。遊泳中、マウスはプール周囲に配置されたｖｉｓｕａｌ ｃｕｅを手がかりにしてプラットフォームの位置を記憶する。このため、認知機能が正常なマウスであれば、試験を繰り返すことで、学習により到達時間が短縮する。各群において、Ｅｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙの結果を繰り返しのある二元配置分散分析によって検定した。結果を図１２および図１５を示す。図１２に示す通り、２Ｄ－ＭＳＣ群のマウスのＥｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙはビヒクル群のマウスのＥｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙに対する有意差はなかった。一方、図１５に示す通り、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群のマウスは３日目および４日目のＥｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙの短縮が確認された（Ｐ＜０．０５）。
１．Ｈｉｄｄｅｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｅｓｔ
モリス水迷路試験のＨｉｄｄｅｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｅｓｔは次の通りに行った。すなわち、水（２５℃）を張った円形のプール（直径１．２ｍ）において、プールの端の任意の位置に設定されるスタート位置からマウスを入れ、制限時間を６０秒とし、ゴールとなるプラットフォームまでの到達時間（Ｅｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙ）を測定する試験を行った。プールの水面下にはゴールとなるプラットフォーム（直径１０ｃｍ）を配置し、プールの周囲にｖｉｓｕａｌ ｃｕｅを配置した。制限時間の６０秒を過ぎてもゴールできなかったマウスは、プラットフォーム上に１５秒乗せてから試験を終えた。スタート位置を変更した以外は同様にした試験を１日に４回行い、これを４日間行った。遊泳中、マウスはプール周囲に配置されたｖｉｓｕａｌ ｃｕｅを手がかりにしてプラットフォームの位置を記憶する。このため、認知機能が正常なマウスであれば、試験を繰り返すことで、学習により到達時間が短縮する。各群において、Ｅｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙの結果を繰り返しのある二元配置分散分析によって検定した。結果を図１２および図１５を示す。図１２に示す通り、２Ｄ－ＭＳＣ群のマウスのＥｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙはビヒクル群のマウスのＥｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙに対する有意差はなかった。一方、図１５に示す通り、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群のマウスは３日目および４日目のＥｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙの短縮が確認された（Ｐ＜０．０５）。
２．Ｐｒｏｂｅ ｔｅｓｔ
Ｐｒｏｂｅ ｔｅｓｔは次の通りに行った。すなわち、Ｈｉｄｄｅｎ ｐｌａｔ ｆｏｒｍ ｔｅｓｔを４日間行った後の５日目に、プラットフォームを取り除いた以外はＨｉｄｄｅｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｅｓｔと同一の条件でマウスを６０秒間遊泳させて、元プラットフォーム位置を横切った回数（Ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔ ｆｏｒｍ）を測定した。これにより、マウスの空間記憶に基づいてゴールに接近する能力を判定した。Ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔ ｆｏｒｍは対応のないｔ検定によって検定した。結果を図１３および図１６に示す。図１３に示す通り、２Ｄ－ＭＳＣ群のマウスのＣｒｏｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔ ｆｏｒｍはビヒクル群のマウスのＣｒｏｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｌａｔ ｆｏｒｍに対して有意差はなかった（ｐ＝０．９０５４）。一方、図１６に示す通り、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群のマウスのＣｒｏｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔ ｆｏｒｍはビヒクル群のマウスのＣｒｏｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔ ｆｏｒｍよりも有意に高かった（Ｐ＜０．０１）。
Ｐｒｏｂｅ ｔｅｓｔは次の通りに行った。すなわち、Ｈｉｄｄｅｎ ｐｌａｔ ｆｏｒｍ ｔｅｓｔを４日間行った後の５日目に、プラットフォームを取り除いた以外はＨｉｄｄｅｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｅｓｔと同一の条件でマウスを６０秒間遊泳させて、元プラットフォーム位置を横切った回数（Ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔ ｆｏｒｍ）を測定した。これにより、マウスの空間記憶に基づいてゴールに接近する能力を判定した。Ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔ ｆｏｒｍは対応のないｔ検定によって検定した。結果を図１３および図１６に示す。図１３に示す通り、２Ｄ－ＭＳＣ群のマウスのＣｒｏｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔ ｆｏｒｍはビヒクル群のマウスのＣｒｏｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｌａｔ ｆｏｒｍに対して有意差はなかった（ｐ＝０．９０５４）。一方、図１６に示す通り、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ群のマウスのＣｒｏｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔ ｆｏｒｍはビヒクル群のマウスのＣｒｏｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔ ｆｏｒｍよりも有意に高かった（Ｐ＜０．０１）。
（考察）
以上より、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣの髄腔内投与により、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの認知機能が改善することがわかった。
以上より、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣの髄腔内投与により、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの認知機能が改善することがわかった。
＜実施例７：大槽における３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣ＞
３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣをＰＫＨでラベル化し、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（２０月齢）に実施例５と同様にして、髄腔内投与 （２．５×１０４細胞／匹）した。髄腔内投与から１日後、１４日後、および２８日後において大槽（ＣＭ）をマウスから採取した。厚み２０μｍの大槽凍結切片を作成し、ＤＡＰＩによって染色し、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社）で画像データを取得した。
３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣをＰＫＨでラベル化し、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（２０月齢）に実施例５と同様にして、髄腔内投与 （２．５×１０４細胞／匹）した。髄腔内投与から１日後、１４日後、および２８日後において大槽（ＣＭ）をマウスから採取した。厚み２０μｍの大槽凍結切片を作成し、ＤＡＰＩによって染色し、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社）で画像データを取得した。
画像データを図１７に示す。図１７においてＰＫＨのシグナルが検出された箇所を矢印で示す。特に、大槽（ＣＭ）のくも膜下腔および脈絡叢（ＣＰ）にＰＫＨでラベル化された３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣが存在していることが確認された。さらに、図１７に示す通り、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣの投与から２８日後であっても、ＰＫＨでラベル化された３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣが大槽および脈絡叢に存在していた。このことから、３Ｄ ＢＭ－ＭＳＣが投与対象の標的組織において定着していることがわかった。
＜実施例８：コラーゲン膜により三次元培養した脂肪由来間葉系幹細胞の形態評価＞
脂肪由来間葉系幹細胞（以下、「ＡＤ－ＭＳＣ」）として、３３歳、女性、ｃａｕｃａｓｏｉｄの症例に由来するヒトＡＤ－ＭＳＣ（ロンザ社）を用いて、三次元培養および二次元培養を行った。
脂肪由来間葉系幹細胞（以下、「ＡＤ－ＭＳＣ」）として、３３歳、女性、ｃａｕｃａｓｏｉｄの症例に由来するヒトＡＤ－ＭＳＣ（ロンザ社）を用いて、三次元培養および二次元培養を行った。
ＡＤ－ＭＳＣを、透過性コラーゲン膜 ６ｗｅｌｌプレート用ＣＭ－６（ＫＯＫＥＮ社）または二次元培養担体（細胞培養プレート ６ｗｅｌｌ 平底, ビーエム機器株式会社製）を備えた通常２Ｄディッシュを用いて、培養した。
透過性コラーゲン膜 ６ｗｅｌｌプレート（以下、「コラーゲン膜プレート」）のウェル内に培地２ｍｌおよびコラーゲン膜上に培地１ｍｌをそれぞれ加え、５分以上浸し、コラーゲン膜の中和を行った。その後、中和に用いた培地を除去し、ウェル内に新しい培地２ｍｌを添加して、コラーゲン膜プレートを調製した。調製したコラーゲン膜プレートが備えるコラーゲン膜上に各ＡＤ－ＭＳＣの細胞懸濁液１ｍｌ（４．１×１０４／ｍｌ）を添加した。添加後、ＡＤ－ＭＳＣを３７℃で２日間、培養を行った。二次元培養として、二次元培養担体上に６×１０４細胞／ウェルの各ＡＤ－ＭＳＣを播種して、３７℃で２日間、培養を行った。培養した細胞を光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製）によって観察した。その結果を図１８に示す。図１８に示す通り、コラーゲン膜を用いて培養したＡＤ－ＭＳＣは紡錘形を示していた。
コラーゲン膜プレートによって培養したＡＤ－ＭＳＣと、二次元培養担体によって培養したＡＤ－ＭＳＣと、を、走査型電子顕微鏡（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）によって観察した。その結果を図１９に示す。図１９に示す通り、二次元培養担体（通常２Ｄディッシュ）によって培養したＡＤ－ＭＳＣはディッシュにへばりついた形態を示した一方で、コラーゲン膜プレートで培養したＡＤ－ＭＳＣは細胞に膨らみがあり、多くの細かい突起を有していた。
さらに、ＡＤ－ＭＳＣとして、３症例に由来するヒトＡＤ－ＭＳＣ（ロンザ社）の三次元培養を、コラーゲン膜プレートを用いて行った。ＡＤ－ＭＳＣが由来する各症例に関する年齢、性別、および人種を下記表５に示す。
コラーゲン膜プレートによって培養したＡＤ－ＭＳＣと、二次元培養担体によって培養したＡＤ－ＭＳＣと、について、幹細胞マーカーのＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧのｍＲＮＡの発現量を測定するために、実施例５と同様の方法により、ＲＴ－ＰＣＲを実施した。その結果を図２０に示す。図２０に示す通り、二次元培養担体によって培養した２Ｄ ＡＤ－ＭＳＣ（２Ｄ）よりも３Ｄ ＡＤ－ＭＳＣ（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の方がＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧの発現量にて、増加傾向であった。図２０に示す各試料のｍＲＮＡの発現量は、２Ｄ－ＭＳＣ（ｃｏｎｔｒｏｌ）のｍＲＮＡの発現量の平均値を１としたときの相対値としてプロットされており、エラーバーは各群における標準偏差を示す。
コラーゲン膜プレートによって培養したＡＤ－ＭＳＣの培養液と、二次元培養担体によって培養したＡＤ－ＭＳＣの培養液と、を、それぞれ３００Ｇ、３分の条件で遠心分離を行うことにより、上清を得た。得られた上清について、さらに３０００Ｇ、１５分の条件で遠心分離を行い、その上清を回収した。上清をＥｘｏＱｕｉｃｋ－ＴＣ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と反応させ、そのプロトコールに基づいて、エクソソームを分離した。エクソソーム中のｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９のマイクロＲＮＡの発現量を、実施例５と同様の方法により、測定した。その結果を図２１に示す。図２１に示す通り、二次元培養担体によって培養したＡＤ－ＭＳＣ（２Ｄ）よりもコラーゲン膜によって培養したＡＤ－ＭＳＣ（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の方がｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、およびｍｉＲ－３６９のマイクロＲＮＡの発現量が上昇していることが明らかとなった。図２１に示す各症例に由来するコラーゲン膜によって培養されたＡＤ－ＭＳＣ（ｃｏｌｌａｇｅｎ）におけるマイクロＲＮＡの発現量は、対応する症例に由来する２Ｄ－ＭＳＣ（２Ｄ）におけるマイクロＲＮＡの発現量を１としたときの相対値としてプロットされている。
＜実施例９：コラーゲン膜プレートにより三次元培養した脂肪由来間葉系幹細胞に由来するエクソソームの投与実験＞
表５中、２番の症例（３７歳、女性、hispanic）に由来するＡＤ－ＭＳＣを、コラーゲン膜プレートを用いて三次元培養した。三次元培養は実施例８と同様の方法によって行われた。
表５中、２番の症例（３７歳、女性、hispanic）に由来するＡＤ－ＭＳＣを、コラーゲン膜プレートを用いて三次元培養した。三次元培養は実施例８と同様の方法によって行われた。
（Ｙ迷路試験）
ビヒクル（ＰＢＳ）およびエクソソーム懸濁液を調製した。ここで、ＡＤ－ＭＳＣの培養液を遠心分離に供することにより上清を得て、上清をさらに超遠心分離に供することによりエクソソームを分離した。ＡＤ－ＭＳＣの培養液から上清を得るための遠心分離は、２０００Ｇ、１０分の条件で行われた。上清からさらにエクソソームを含む上清を得るための超遠心分離として、１００００Ｇ、６０分の条件の第１の遠心分離、１０００００Ｇ、７０分の条件の第２の遠心分離、および１０００００Ｇ、１６時間の条件の密度勾配法による第３の遠心分離を行った。超遠心分離の結果、得られたエクソソームを含む上清について、ＢＣＡ法（ＢＣＡ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｌｏｗｒｙ Ａｓｓａｙｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によってタンパク量を測定した。エクソソーム懸濁液は、コラーゲン膜プレートによって培養したＡＤ－ＭＳＣに由来するエクソソーム（タンパク質５μｇ相当／匹）を２５μｌ ＰＢＳにより懸濁して調製した。また、ヒアルロニダーゼ１００Ｕ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を５μｌＰＢＳで懸濁したヒアルロニダーゼ懸濁液を調整した。２１月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスに麻酔下で、鼻腔からヒアルロニダーゼ懸濁液５μｌを投与した。ヒアルロニダーゼ懸濁液の投与の３０分後から、エクソソーム懸濁液またはビヒクルを５μｌずつ５分毎に５回投与し、計２５μｌとなるように鼻腔内投与した。同様に、ヒアルロニダーゼ懸濁液と、エクソソーム懸濁液またはビヒクルと、を、１週間おきに計４回鼻腔内投与した。マウスは最初の投与から１か月後に、認知機能を確認する試験を行った（図２２）。
ビヒクル（ＰＢＳ）およびエクソソーム懸濁液を調製した。ここで、ＡＤ－ＭＳＣの培養液を遠心分離に供することにより上清を得て、上清をさらに超遠心分離に供することによりエクソソームを分離した。ＡＤ－ＭＳＣの培養液から上清を得るための遠心分離は、２０００Ｇ、１０分の条件で行われた。上清からさらにエクソソームを含む上清を得るための超遠心分離として、１００００Ｇ、６０分の条件の第１の遠心分離、１０００００Ｇ、７０分の条件の第２の遠心分離、および１０００００Ｇ、１６時間の条件の密度勾配法による第３の遠心分離を行った。超遠心分離の結果、得られたエクソソームを含む上清について、ＢＣＡ法（ＢＣＡ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｌｏｗｒｙ Ａｓｓａｙｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によってタンパク量を測定した。エクソソーム懸濁液は、コラーゲン膜プレートによって培養したＡＤ－ＭＳＣに由来するエクソソーム（タンパク質５μｇ相当／匹）を２５μｌ ＰＢＳにより懸濁して調製した。また、ヒアルロニダーゼ１００Ｕ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を５μｌＰＢＳで懸濁したヒアルロニダーゼ懸濁液を調整した。２１月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスに麻酔下で、鼻腔からヒアルロニダーゼ懸濁液５μｌを投与した。ヒアルロニダーゼ懸濁液の投与の３０分後から、エクソソーム懸濁液またはビヒクルを５μｌずつ５分毎に５回投与し、計２５μｌとなるように鼻腔内投与した。同様に、ヒアルロニダーゼ懸濁液と、エクソソーム懸濁液またはビヒクルと、を、１週間おきに計４回鼻腔内投与した。マウスは最初の投与から１か月後に、認知機能を確認する試験を行った（図２２）。
エクソソーム懸濁液またはビヒクルを投与したマウスについて、Ｙ迷路試験を行った。Ｙ迷路試験は実施例３と同様の方法で行った。図２３に結果を示す。図２３に示す通り、コラーゲン膜プレートによって培養したＡＤ－ＭＳＣに由来するエクソソーム群のマウスの交替行動率（％）は、ビヒクル群のマウスの交替行動率（％）よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）。
＜実施例１０：スフェロイド培養した脂肪由来間葉系幹細胞の形態評価＞
ＡＤ－ＭＳＣとして、３３歳、女性、ｃａｕｃａｓｏｉｄの症例に由来するヒトＡＤ－ＭＳＣ（ロンザ社）を用いて、三次元培養および二次元培養を行った。三次元培養として、Ｐｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅシャーレ９０ｍｍ（住友ベークライト社）を用いた培養を行った。シャーレ内にＡＤ－ＭＳＣの細胞懸濁液 ９ｍｌ（４．０×１０５分）を播種した。二次元培養として、二次元培養担体（細胞培養ディッシュ １００ｍｍ， ビーエム機器株式会社製）上に、ＡＤ－ＭＳＣの細胞懸濁液 ９ｍｌ（４．０×１０５分）を播種した。その後、３７℃で２日間培養して得られた培養物を光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製）によって観察した。その結果を図２４に示す。Ｐｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅシャーレを用いた場合は、ＡＤ－ＭＳＣはスフェロイドを形成した。
ＡＤ－ＭＳＣとして、３３歳、女性、ｃａｕｃａｓｏｉｄの症例に由来するヒトＡＤ－ＭＳＣ（ロンザ社）を用いて、三次元培養および二次元培養を行った。三次元培養として、Ｐｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅシャーレ９０ｍｍ（住友ベークライト社）を用いた培養を行った。シャーレ内にＡＤ－ＭＳＣの細胞懸濁液 ９ｍｌ（４．０×１０５分）を播種した。二次元培養として、二次元培養担体（細胞培養ディッシュ １００ｍｍ， ビーエム機器株式会社製）上に、ＡＤ－ＭＳＣの細胞懸濁液 ９ｍｌ（４．０×１０５分）を播種した。その後、３７℃で２日間培養して得られた培養物を光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製）によって観察した。その結果を図２４に示す。Ｐｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅシャーレを用いた場合は、ＡＤ－ＭＳＣはスフェロイドを形成した。
さらに、二次元培養担体を用いて培養したＡＤ－ＭＳＣと、ＡＤ－ＭＳＣのスフェロイドについて、幹細胞マーカーのＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧのｍＲＮＡの発現量を測定するために、実施例５と同様の方法により、ＲＴ－ＰＣＲを実施した。その結果を図２５に示す。図２５に示す通り、２Ｄ－ＭＳＣ（２Ｄ）と比較して、ＡＤ－ＭＳＣのスフェロイド（Ｐｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅ）のＮＡＮＯＧの発現量が上昇していたことが明らかとなった。図２５に示す各試料のｍＲＮＡの発現量は、２Ｄ－ＭＳＣ（２Ｄ）のｍＲＮＡの発現量の平均値を１としたときの相対値としてプロットされており、エラーバーは各群における標準偏差を示す。
二次元培養担体で培養したＡＤ－ＭＳＣの培養液の上清と、Ｐｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅによって培養したＡＤ－ＭＳＣの培養液の上清と、を、実施例８と同様の方法によって回収した。また、実施例８と同様の方法によって、各上清からエクソソームを分離した。エクソソームを含む上清について、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９のマイクロＲＮＡの発現量を実施例５と同様の方法により、測定した。その結果を図２６に示す。図２６に示す通り、二次元培養担体によって培養したＡＤ－ＭＳＣ（２Ｄ）よりもＰｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅシャーレによって培養したＡＤ－ＭＳＣ（Ｐｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅ）の方がｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９のマイクロＲＮＡの発現量が上昇していることが明らかとなった。図２６に示す各症例に由来するＰｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅによって培養された３Ｄ－ＭＳＣ（Ｐｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅ）におけるマイクロＲＮＡの発現量は、対応する症例の２Ｄ－ＭＳＣ（２Ｄ）におけるマイクロＲＮＡの発現量を１としたときの相対値としてプロットされている。
＜実施例１１：スフェロイド培養した脂肪由来間葉系幹細胞に由来するエクソソームの投与実験＞
３３歳、女性、ｃａｕｃａｓｏｉｄの症例に由来するヒトＡＤ－ＭＳＣ（ロンザ社）を、実施例１０と同様の方法によってスフェロイド培養した。
（Ｙ迷路試験）
ビヒクル（ＰＢＳ）およびエクソソーム懸濁液を調製した。ここで、ＡＤ－ＭＳＣの培養液を遠心分離に供することにより上清を得て、さらにその上清をアミコンウルトラ遠心式限外ろ過フィルター（Ｍｅｒｋ社）を用いて濃縮し、濃縮した上清からＭａｇＣａｐｔｕｒｅ（商標） Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＰＳ（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いてエクソソームを単離した。単離したエクソソームは、ＢＣＡ法（ＢＣＡ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｌｏｗｒｙ Ａｓｓａｙｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にてタンパク量を測定した。エクソソーム懸濁液は、Ｐｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅシャーレによって培養したＡＤ－ＭＳＣに由来するエクソソーム（タンパク質５μｇ相当／匹）を２５μｌ ＰＢＳにより懸濁して調製した。またヒアルロニダーゼ１００Ｕ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を５μｌＰＢＳで懸濁したヒアルロニダーゼ懸濁液を調整した。６月齢の５ｘＦＡＤマウスに麻酔下で、鼻腔からヒアルロニダーゼ懸濁液５μｌを投与した。ヒアルロニダーゼ懸濁液の投与の３０分後から、エクソソーム懸濁液またはビヒクルを５μｌずつ５分毎に５回投与し、計２５μｌとなるように鼻腔内投与した。同様に、ヒアルロニダーゼ懸濁液と、エクソソーム懸濁液またはビヒクルと、を、１週間おきに計４回鼻腔内投与した。マウスは最初の投与から１か月後に、認知機能を確認する試験を行った（図２７）。
３３歳、女性、ｃａｕｃａｓｏｉｄの症例に由来するヒトＡＤ－ＭＳＣ（ロンザ社）を、実施例１０と同様の方法によってスフェロイド培養した。
（Ｙ迷路試験）
ビヒクル（ＰＢＳ）およびエクソソーム懸濁液を調製した。ここで、ＡＤ－ＭＳＣの培養液を遠心分離に供することにより上清を得て、さらにその上清をアミコンウルトラ遠心式限外ろ過フィルター（Ｍｅｒｋ社）を用いて濃縮し、濃縮した上清からＭａｇＣａｐｔｕｒｅ（商標） Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＰＳ（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いてエクソソームを単離した。単離したエクソソームは、ＢＣＡ法（ＢＣＡ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｌｏｗｒｙ Ａｓｓａｙｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にてタンパク量を測定した。エクソソーム懸濁液は、Ｐｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅシャーレによって培養したＡＤ－ＭＳＣに由来するエクソソーム（タンパク質５μｇ相当／匹）を２５μｌ ＰＢＳにより懸濁して調製した。またヒアルロニダーゼ１００Ｕ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を５μｌＰＢＳで懸濁したヒアルロニダーゼ懸濁液を調整した。６月齢の５ｘＦＡＤマウスに麻酔下で、鼻腔からヒアルロニダーゼ懸濁液５μｌを投与した。ヒアルロニダーゼ懸濁液の投与の３０分後から、エクソソーム懸濁液またはビヒクルを５μｌずつ５分毎に５回投与し、計２５μｌとなるように鼻腔内投与した。同様に、ヒアルロニダーゼ懸濁液と、エクソソーム懸濁液またはビヒクルと、を、１週間おきに計４回鼻腔内投与した。マウスは最初の投与から１か月後に、認知機能を確認する試験を行った（図２７）。
エクソソーム懸濁液またはビヒクルを投与したマウスについて、Ｙ迷路試験を行った。図２８に結果を示す。図２８に記載の通り、Ｐｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅによって培養したＡＤ－ＭＳＣ由来エクソソーム群のマウスの交替行動率（％）は、ビヒクル群のマウスの交替行動率（％）よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）。
＜比較例１：２Ｄディッシュにより二次元培養した脂肪由来間葉系幹細胞に由来するエクソソームの投与実験＞
３３歳、女性、ｃａｕｃａｓｏｉｄの症例に由来するヒトＡＤ－ＭＳＣ（ロンザ社）を、二次元培養担体（細胞培養ディッシュ １５０ｍｍ， ビーエム機器株式会社製）上に、ＡＤ－ＭＳＣの細胞懸濁液 ２０mｌ（1．０×１０6分）を播種し、３７℃で３日間培養した。
ビヒクル（ＰＢＳ）およびエクソソーム懸濁液を調製した。ここで、ＡＤ－ＭＳＣの培養液を遠心分離に供することにより上清を得て、さらにその上清をアミコンウルトラ遠心式限外ろ過フィルター（Ｍｅｒｋ社）を用いて濃縮し、濃縮した上清からＭａｇＣａｐｔｕｒｅ（商標） Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＰＳ（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いてエクソソームを単離した。単離したエクソソームは、ＢＣＡ法（ＢＣＡ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｌｏｗｒｙ Ａｓｓａｙｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にてタンパク量を測定した。エクソソーム懸濁液は、二次元培養したＡＤ－ＭＳＣに由来するエクソソーム（タンパク質５μｇ相当／匹）を２５μｌ ＰＢＳにより懸濁して調製した。また、ヒアルロニダーゼ１００Ｕ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を５μｌＰＢＳで懸濁したヒアルロニダーゼ懸濁液を調整した。６月齢の５ｘＦＡＤマウスに麻酔下で、鼻腔からヒアルロニダーゼ懸濁液５μｌを投与した。ヒアルロニダーゼ懸濁液の投与の３０分後から、エクソソーム懸濁液またはビヒクルを５μｌずつ５分毎に５回投与し、計２５μｌとなるように鼻腔内投与した。同様に、ヒアルロニダーゼ懸濁液と、エクソソーム懸濁液またはビヒクルと、を、１週間おきに計４回鼻腔内投与した。マウスは最初の投与から１か月後に、認知機能を確認する試験を行った（図２９）。
３３歳、女性、ｃａｕｃａｓｏｉｄの症例に由来するヒトＡＤ－ＭＳＣ（ロンザ社）を、二次元培養担体（細胞培養ディッシュ １５０ｍｍ， ビーエム機器株式会社製）上に、ＡＤ－ＭＳＣの細胞懸濁液 ２０mｌ（1．０×１０6分）を播種し、３７℃で３日間培養した。
ビヒクル（ＰＢＳ）およびエクソソーム懸濁液を調製した。ここで、ＡＤ－ＭＳＣの培養液を遠心分離に供することにより上清を得て、さらにその上清をアミコンウルトラ遠心式限外ろ過フィルター（Ｍｅｒｋ社）を用いて濃縮し、濃縮した上清からＭａｇＣａｐｔｕｒｅ（商標） Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＰＳ（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いてエクソソームを単離した。単離したエクソソームは、ＢＣＡ法（ＢＣＡ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｌｏｗｒｙ Ａｓｓａｙｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にてタンパク量を測定した。エクソソーム懸濁液は、二次元培養したＡＤ－ＭＳＣに由来するエクソソーム（タンパク質５μｇ相当／匹）を２５μｌ ＰＢＳにより懸濁して調製した。また、ヒアルロニダーゼ１００Ｕ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を５μｌＰＢＳで懸濁したヒアルロニダーゼ懸濁液を調整した。６月齢の５ｘＦＡＤマウスに麻酔下で、鼻腔からヒアルロニダーゼ懸濁液５μｌを投与した。ヒアルロニダーゼ懸濁液の投与の３０分後から、エクソソーム懸濁液またはビヒクルを５μｌずつ５分毎に５回投与し、計２５μｌとなるように鼻腔内投与した。同様に、ヒアルロニダーゼ懸濁液と、エクソソーム懸濁液またはビヒクルと、を、１週間おきに計４回鼻腔内投与した。マウスは最初の投与から１か月後に、認知機能を確認する試験を行った（図２９）。
エクソソーム懸濁液またはビヒクルを投与したマウスについて、Ｙ迷路試験を行った。Ｙ迷路試験は実施例３と同様の方法で行った。図３０に結果を示す。図３０に示す通り、二次元培養によって得られたＡＤ－ＭＳＣに由来するエクソソーム群のマウスの交替行動率（％）と、ビヒクル群のマウスの交替行動率（％）と、には有意差は見られなかった（Ｐ＝０．０６３５、対応のないｔ検定）。
＜実施例１２：トランスフェクトされた脂肪由来間葉系幹細胞に由来するエクソソームの投与実験＞
＜実施例１２：トランスフェクトされた脂肪由来間葉系幹細胞に由来するエクソソームの投与実験＞
Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃ、ｍｉＲ－２６ａ ｍｉｍｉｃ、ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃ（すべてＴｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１５ｎｍを、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ヒトＡＤ－ＭＳＣにトランスフェクションした。ここで、ヒトＡＤ－ＭＳＣは、３３歳、女性、ｃａｕｃａｓｏｉｄの症例に由来する。各マイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃがトランスフェクトされたヒトＡＤ－ＭＳＣを、細胞培養ディッシュ １００ｍｍ (ビーエム機器株式会社製）を用いて培養した。培養上清を実施例８と同様の方法で回収し、培養上清からＭａｇｃａｐｔｕｒｅ（商標） Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ ＰＳ（富士フィルム和光純薬）を用いて、エクソソームを分離した。
エクソソーム懸濁液は、各マイクロＲＮＡ ｍｉｍｉｃをトランスフェクトされたＡＤ－ＭＳＣに由来するエクソソーム（タンパク質１．６μｇ相当／匹）を２５μｌ ＰＢＳにより懸濁して調製した。またヒアルロニダーゼ１００Ｕ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を５μｌ ＰＢＳで懸濁したヒアルロニダーゼ懸濁液を調整した。１３－１５月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスに麻酔下で、鼻腔からヒアルロニダーゼ懸濁液５μｌを投与した。ヒアルロニダーゼ懸濁液の投与の３０分後から、各エクソソーム懸濁液を５μｌずつ５分毎に５回投与し、計２５μｌとなるように鼻腔内投与した。同様に、ヒアルロニダーゼ懸濁液と、エクソソーム懸濁液と、を、１日おきに計４回鼻腔内投与した。マウスは最初の投与から４日後に、認知機能を確認する試験を行った（図３１）。
図３２に示すように、Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃをトランスフェクトされたＡＤ－ＭＳＣ由来エクソソーム群に比べて、ｍｉＲ－２６ａ ｍｉｍｉｃをトランスフェクトされたＡＤ－ＭＳＣ由来エクソソーム群のマウス交替行動率（％）は改善傾向であった。Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃをトランスフェクトされたＡＤ－ＭＳＣ由来エクソソーム群に比べて、ｌｅｔ－７ａ ｍｉｍｉｃをトランスフェクトされたＡＤ－ＭＳＣ由来エクソソーム群のマウス交替行動率（％）は有意に高かった（Ｐ＜０．０５， 対応のないｔ検定）。
本発明は、認知機能低下の予防または改善に利用することができる。
Claims (15)
- ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡを有効成分として含むことを特徴とする、認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物。
- 前記マイクロＲＮＡの少なくとも一部のウリジン残基がシュードウリジン残基に置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
- ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする、認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物。
- 間葉系幹細胞の三次元培養物を有効成分として含み、
前記間葉系幹細胞の三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物であることを特徴とする、認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物。 - ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡを含有するエクソソームを有効成分として含み、
前記エクソソームは間葉系幹細胞の三次元培養物に由来する、かつ、前記間葉系幹細胞の二次元培養物から分泌されたエクソソームと比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの含有量が増加することを特徴とする、認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物。 - 間葉系幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成物。
- 前記三次元培養物はスフェロイドを含む、請求項５に記載の薬学的組成物。
- 前記認知機能低下がアルツハイマー型認知症によるものであることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法であって、
前記製造方法は、前記間葉系幹細胞を、主成分が多糖ポリマーであるハイドロゲルを含む培養担体、または主成分としてコラーゲンを含む培養担体を用いて三次元培養する培養工程、および
前記培養工程で得られた三次元培養物を前記培養担体から分離して前記三次元培養物を回収する回収工程を含み、
前記三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物であることを特徴とする、間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法。 - 間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法であって、
前記製造方法は、スフェロイド培養用プレートを用いて三次元培養物としてスフェロイドを培養する培養工程、および
前記培養工程で得られた前記三次元培養物を前記スフェロイド培養用プレートから回収する回収工程を含み、
前記三次元培養物は、前記間葉系幹細胞の二次元培養物と比較して、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、およびｍｉＲ－３６９の少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が増加した培養物であることを特徴とする、間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法。 - 前記間葉系幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞または脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法。
- エクソソームの製造方法であって、
請求項１１に記載の製造方法により前記間葉系幹細胞の三次元培養物を製造する工程、および
前記三次元培養物から、エクソソームを分離する分離工程を含むことを特徴とする、エクソソームの製造方法。 - 請求項１１に記載の製造方法によって製造されることを特徴とする、間葉系幹細胞の三次元培養物。
- 請求項１２に記載の製造方法によって製造されることを特徴とする、エクソソーム。
- 請求項１１に記載の方法により前記間葉系幹細胞の三次元培養物を製造する工程、および
前記三次元培養物を用いて認知機能低下の予防用または改善用の薬学的組成物を製造する工程、
を含むことを特徴とする、薬学的組成物の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022-049132 | 2022-03-24 | ||
| JP2022049132 | 2022-03-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2023182507A1 true WO2023182507A1 (ja) | 2023-09-28 |
Family
ID=88101723
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2023/011889 WO2023182507A1 (ja) | 2022-03-24 | 2023-03-24 | 薬学的組成物、間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法、エクソソームの製造方法、および薬学的組成物の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2023182507A1 (ja) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011160678A (ja) * | 2010-02-05 | 2011-08-25 | Sumitomo Chemical Co Ltd | 検体を提供する哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の存在を検出するために有効なマイクロｒｎａ |
| JP2014530803A (ja) * | 2011-08-04 | 2014-11-20 | イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド | セロトニン関連の医学的状態、アドレナリン関連の医学的状態、ノルアドレナリン関連の医学的状態、グルタミン酸関連の医学的状態および副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン関連の医学的状態の処置および診断のためのミクロｒｎａおよび該ミクロｒｎａを含む組成物 |
| JP2015529450A (ja) * | 2012-07-19 | 2015-10-08 | リニューロン・リミテッドＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ | 幹細胞微粒子 |
| JP2017517505A (ja) * | 2014-05-18 | 2017-06-29 | チルドレンズ メディカル センター コーポレーション | エキソソームに関連する方法および組成物 |
| JP2019529425A (ja) * | 2016-09-19 | 2019-10-17 | フォンダツィオーネ・イスティトゥート・イタリアーノ・ディ・テクノロジャＦｏｎｄａｚｉｏｎｅ Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｉｔａｌｉａｎｏ Ｄｉ Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ | ｍｉＲＮＡ医薬組成物およびその治療的使用 |
| WO2020184390A1 (ja) * | 2019-03-08 | 2020-09-17 | キユーピー株式会社 | マイクロｒｎａの発現亢進剤及びマイクロｒｎａ発現亢進用飲食品 |
| WO2021003403A1 (en) * | 2019-07-02 | 2021-01-07 | Ohio State Innovation Foundation | Neurodegenerative disease therapies utilizing the skin-brain axis |
| JP2021122205A (ja) * | 2020-02-03 | 2021-08-30 | 株式会社フルステム | エクソソーム回収方法 |
| WO2022228516A1 (zh) * | 2021-04-28 | 2022-11-03 | 西比曼生物科技（上海）有限公司 | 含有干细胞胞外囊泡的滴鼻剂及其在治疗脑神经血管疾病中的应用 |
-
2023
- 2023-03-24 WO PCT/JP2023/011889 patent/WO2023182507A1/ja unknown
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011160678A (ja) * | 2010-02-05 | 2011-08-25 | Sumitomo Chemical Co Ltd | 検体を提供する哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の存在を検出するために有効なマイクロｒｎａ |
| JP2014530803A (ja) * | 2011-08-04 | 2014-11-20 | イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド | セロトニン関連の医学的状態、アドレナリン関連の医学的状態、ノルアドレナリン関連の医学的状態、グルタミン酸関連の医学的状態および副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン関連の医学的状態の処置および診断のためのミクロｒｎａおよび該ミクロｒｎａを含む組成物 |
| JP2015529450A (ja) * | 2012-07-19 | 2015-10-08 | リニューロン・リミテッドＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ | 幹細胞微粒子 |
| JP2017517505A (ja) * | 2014-05-18 | 2017-06-29 | チルドレンズ メディカル センター コーポレーション | エキソソームに関連する方法および組成物 |
| JP2019529425A (ja) * | 2016-09-19 | 2019-10-17 | フォンダツィオーネ・イスティトゥート・イタリアーノ・ディ・テクノロジャＦｏｎｄａｚｉｏｎｅ Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｉｔａｌｉａｎｏ Ｄｉ Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ | ｍｉＲＮＡ医薬組成物およびその治療的使用 |
| WO2020184390A1 (ja) * | 2019-03-08 | 2020-09-17 | キユーピー株式会社 | マイクロｒｎａの発現亢進剤及びマイクロｒｎａ発現亢進用飲食品 |
| WO2021003403A1 (en) * | 2019-07-02 | 2021-01-07 | Ohio State Innovation Foundation | Neurodegenerative disease therapies utilizing the skin-brain axis |
| JP2021122205A (ja) * | 2020-02-03 | 2021-08-30 | 株式会社フルステム | エクソソーム回収方法 |
| WO2022228516A1 (zh) * | 2021-04-28 | 2022-11-03 | 西比曼生物科技（上海）有限公司 | 含有干细胞胞外囊泡的滴鼻剂及其在治疗脑神经血管疾病中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HASHIZUME SHIN, NAKANO MASAKO, KUBOTA KENTA, SATO SEIICHI, HIMURO NOBUAKI, KOBAYASHI EIJI, TAKAOKA AKINORI, FUJIMIYA MINEKO: "Mindfulness intervention improves cognitive function in older adults by enhancing the level of miRNA-29c in neuron-derived extracellular vesicles", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 11, no. 1, XP093095175, DOI: 10.1038/s41598-021-01318-y * |
| NAKANO MASAKO, FUJIMIYA MINEKO: "Potential effects of mesenchymal stem cell derived extracellular vesicles and exosomal miRNAs in neurological disorders", NEURAL REGENERATION RESEARCH, MEDKNOW PUBLICATIONS AND MEDIA PVT. LTD., CN, vol. 16, no. 12, 1 January 2021 (2021-01-01), CN , pages 2359, XP093095174, ISSN: 1673-5374, DOI: 10.4103/1673-5374.313026 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rogers et al. | Disease-modifying bioactivity of intravenous cardiosphere-derived cells and exosomes in mdx mice | |
| US20060247195A1 (en) | Method of altering cell properties by administering rna | |
| CN101595212B (zh) | 肾源细胞及在组织修复和再生中的使用方法 | |
| KR101310578B1 (ko) | 심혈관 증상의 치료에 지방조직-유래 세포를 사용하는 방법 | |
| ES2776408T3 (es) | Método de proliferación celular y agente farmacéutico para reparación y regeneración de tejido | |
| US8945919B2 (en) | Methods and composition for treating neural degeneration | |
| JP2019534898A (ja) | 中枢神経系の疾患および障害を処置するための組成物および方法 | |
| US10870830B2 (en) | Method for culturing differentiation-promoting and -sustaining spheroid form of tonsil-derived stem cells | |
| JPWO2006041088A1 (ja) | 脳移行性骨髄前駆細胞 | |
| JP2022527998A (ja) | 高機能な製造されたａｂｃｂ５＋間葉系幹細胞 | |
| Liu et al. | IL-1β-primed mesenchymal stromal cells exert enhanced therapeutic effects to alleviate Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome through systemic immunity | |
| JP7353652B2 (ja) | 生体移植用細胞シート及びその製造方法 | |
| JP6235795B2 (ja) | 細胞のリプログラミングのための組成物 | |
| WO2023182507A1 (ja) | 薬学的組成物、間葉系幹細胞の三次元培養物の製造方法、エクソソームの製造方法、および薬学的組成物の製造方法 | |
| CN104232570A (zh) | 建立单克隆间充质干细胞的方法及其应用 | |
| CN117320733A (zh) | 包含三维球状体型细胞聚集体来源细胞外囊泡的用于促进神经再生的组合物 | |
| TWI708847B (zh) | 組織再生促進劑 | |
| TW202227615A (zh) | 心肌幹/前驅細胞之製作方法及心肌纖維化抑制方法 | |
| US20080233090A1 (en) | Method of Treatment by Administration of Rna | |
| JP2021512654A (ja) | 温熱条件の組織からの幹細胞の単離方法及びその使用 | |
| US20090022699A1 (en) | Method Of Genotypically Modifying Cells By Administration Of RNA | |
| EP4227404A1 (en) | Osteoblasts differentiated from mesenchymal stem cells and composition for treating bone disease comprising same | |
| EP3739040B1 (en) | Sheeting method for pluripotent stem cell-derived cells | |
| RU2762855C1 (ru) | Генно-клеточный везикулярный терапевтический препарат и способ терапии рассеянного склероза посредством трансплантации генно-клеточного везикулярного терапевтического препарата | |
| Xing et al. | Overexpression of CCR2 in mesenchymal stem cells contributes to homing and liver regeneration. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 23775100 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |