JP2022527998A - 高機能な製造されたａｂｃｂ５＋間葉系幹細胞 - Google Patents

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Abstract

合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の集団であって、当該集団の９６．８％は、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫であるものが提供される。また提供されるのは、合成細胞を作製する方法およびその使用の方法である。

Description

関連出願
本願は、２０１９年３月２８日に出願された米国仮出願シリアル番号６２／８２５，７８５、表題「HIGHLY FUNCTIONAL MANUFACTURED STEM CELLS」、および２０１９年３月２９日に出願された米国仮出願シリアル番号６２／８２６，９３１、表題「HIGHLY FUNCTIONAL MANUFACTURED STEM CELLS」の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９（ｅ）下における利益を主張し、当該仮出願の各々の全体は、本明細書において参考として援用される。
発明の背景
あまり定義されていないが、自己再生する成体多能性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、真皮［１，２］を含むほぼ全ての成体の結合組織中に存在する。それらの最も重要な機能は、それらの微小環境を維持することであり、これは、組織の恒常性、修復および臓器の維持のために必須のそれら自身の幹細胞性および長期の自己再生能力を保護するために不可欠な要件である［３］。
ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー５、短鎖ＡＢＣＢ５、別名Ｐ－糖タンパク質ＡＢＣＢ５は、細胞膜貫通タンパク質である（Allikmets, et al., 1996）。がん患者における薬物耐性の原因であることが示唆されている（Moitra and Dean, 2011）、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）、ＡＢＣＢ４（ＭＤＲ２／３）およびＡＢＣＧ２（Ｂｃｒｐ１、ＭＸＲ１）のようなトランスポーターを含む活性なトランスポーターのＡＢＣスーパーファミリーは、非悪性の細胞型における通常の細胞輸送、分化および生存機能に役立つ。これらの周知のＡＢＣトランスポーターは、幹細胞および前駆体細胞の集団において高レベルで発現することが知られている。これらのおよび関連するＡＢＣトランスポーターにより媒介される蛍光色素ローダミン１２３およびヘキスト３３３４２の排出能力は、複数の組織からのかかる細胞のサブセットの単離のために利用されてきた。
最近、ＡＴＰ発現カセット、サブファミリーＢ、メンバー５（ＡＢＣＢ５）が、新規の真皮免疫調節性分集団を同定し、これは、加えて、ＭＳＣマーカーを発現し、エフェクターＴ細胞に対して抑制性効果を発揮する一方で、調節性Ｔ細胞をin vitroおよびin vivoで増強することが示された［５］。ＡＢＣＢ５は、多剤耐性の細胞膜アンカータンパク質に属し、また、眼の角膜縁幹細胞において発現し、そこでは、その不在は失明をもたらす［６］。
さらなる構造分析により、ＡＢＣＢ５は、ＡＢＣトランスポータースーパーファミリーの新規のＰ－糖タンパク質であることが確認された（Frank, et al., 2003）。染色体７ｐ２１－１５．３上に位置する指定されたＡＢＣＢ５タンパク質は、ヒト上皮性メラノサイト中でＣＤ１３３を発現する前駆体細胞を標識する。ＡＢＣＢ５遺伝子は、１９個のエクソンを含み、ゲノムＤＮＡのうちの１０８ｋｂに広がる。推定される８１２アミノ酸のＡＢＣＢ５タンパク質は、細胞外および細胞内の両方のＡＴＰ結合ドメインに挟まれた５つの膜貫通ヘリックスを有する。
いくつかの特徴は、ローダミン－１２３排出トランスポーターおよび倍数体前駆体細胞融合ハイブリッドの標識としての機能としての、皮膚前駆体細胞の膜電位および細胞融合の調節のように、Ｐ－糖タンパク質ＡＢＣＢ５に関連し、これは、培養での増殖およびヒトの皮膚における分化に寄与する。生理学的な皮膚前駆体細胞において、ＡＢＣＢ５は、膜を過分極させ、膜電位の決定因子として、この細胞分集団が未分化であり続ける、または分化を起こす傾向を調節する（Frank, et al., 2005、Frank, et al., 2003）。加えて、ＡＢＣＢ５陽性細胞は、抗炎症性、血管新生促進性および免疫調節性の特性を有することが示された（Schatton, et al., 2015, Webber, et al., 2017）。
発明の要旨
ここで、ＡＢＣＢ５＋幹細胞の集団を、組織から確実に単離し、ＧＭＰ標準に従って処理して、高機能合成幹細胞を作製することができることが示される。
いくつかの側面において、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の集団を含む組成物が提供され、ここで、集団のうちの９６％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。いくつかの態様において、集団の９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％より多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。いくつかの態様において、集団の１００％が、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。
いくつかの態様において、集団中の合成幹細胞のうちの９０％より多くは、ＣＤ９０を共発現する。他の態様において、合成幹細胞の集団は、低酸素下においてＶＥＧＦを分泌することができ、これはＥＬＩＳＡにより測定される。他の態様において、合成幹細胞の集団は、Ｍｉに極性化したマクロファージと共培養した後で、ＩＬ－１ＲＡを分泌することができる。他の態様において、合成幹細胞の集団は、単離された生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞と比較して、マクロファージ共培養物において、ＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－１２／ＩＬ－２３ｐ４０の分泌の減少、ならびにＩＬ－１０分泌の増大を誘導する。他の態様において、合成幹細胞の集団は、多能性分化能を有する。他の態様において、合成幹細胞の集団は、３つ全ての胚葉、内胚葉、中胚葉および外胚葉に由来する細胞へと分化する能力を有する。他の態様において、合成幹細胞の集団は、角膜上皮分化能力を有する。他の態様において、合成幹細胞の集団は、、単離された生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞と比較して、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ３を含む幹細胞マーカーの発現の増大を示す。他の態様において、合成幹細胞の集団は、単離された生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞と比較して、ＭＣＡＭ、ＣＲＩＧ１およびＡＴＸＮ１を含む間葉系間質細胞分化マーカーの発現の低下を示す。他の態様において、合成幹細胞の集団のうちの少なくとも５％は、外来遺伝子を含む。他の態様において、合成幹細胞の集団のうちの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、外来遺伝子を含む。他の態様において、外来遺伝子は、組織特異的ホーミング因子、分泌型組織リモデリングタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ホルモンおよび神経伝達物質からなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子である。他の態様において、合成幹細胞の集団のうちの少なくとも５％は、遺伝子の修飾を含む。他の態様において、合成幹細胞の集団のうちの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、遺伝子の修飾を含む。他の態様において、合成幹細胞は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイドヌクレアーゼおよび遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含む複合体を送達することにより修飾される。さらに他の態様において、修飾された遺伝子は、ＣＯＬ７ＡまたはＡＢＣＢ５＋細胞における欠損遺伝子からなる群より選択される遺伝子である。
本発明は、いくつかの側面において、ヒト対象からの皮膚組織からの初代細胞を単離すること；初代細胞を、細胞が、６０％より高いコンフルエンスの混合細胞に達するために十分な子孫を生成するまで、培養培地中で培養し、混合細胞を収集し、収集した混合細胞を培養し、再収集し、および細胞を、細胞の集団が、少なくとも９９％が製造された合成細胞であり、１０％未満が初代の生理学的に存在する皮膚由来細胞である状態に達するまで、少なくとも５回の継代を通して培養すること；ならびにＡＢＣＢ５＋抗体を用いるＡＢＣＢ５陽性細胞の単離により、細胞の集団を調製するための方法である。
いくつかの態様において、方法は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６回の継代を通して、細胞を再収集および培養することを含む。他の態様において、方法は、細胞の集団が、少なくとも９９．９９％が製造された合成細胞であり、０．０１％未満が、初代の生理学的に存在する皮膚由来細胞である状態に達するまで、細胞を再収集および培養することを含む。他の態様において、方法は、細胞の集団が、少なくとも９９．９９９５％が製造された合成細胞であり、０．０００５％未満が初代の生理学的に存在する皮膚由来細胞である状態に達するまで、細胞を再収集および培養することを含む。他の態様において、方法は、細胞の集団が、少なくとも９９．９９９９９７％が製造された合成細胞であり、０．０００００３％未満が初代の生理学的に存在する皮膚由来細胞である状態に達するまで、細胞を再収集および培養することを含む。他の態様において、単離ステップは、磁気ビーズに共役したＡＢＣＢ５抗体を含む。他の態様において、細胞は、基礎培地としてハムＦ－１０を用いて調製された培養培地中で培養される。他の態様において、細胞のコンフルエンスおよび細胞形態学は、各々の細胞増殖ステップにおいて評価される。他の態様において、最終培養と単離ステップとは、少なくとも３日間離れている。他の態様において、細胞は、ＥＤＴＡを用いて収集される。
いくつかの側面において、組織の発生を誘導する方法が提供される。方法は、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団の分化した組織への分化を促進することを含み、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。
他の側面において、本発明は、同系移植を促進するための方法であって、該方法は、同系移植片を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団を投与することを含み、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。
他の側面において、本発明は、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）を処置するための方法であって、該方法は、ＰＡＯＤを有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団を、疾患を処置するための有効量において投与することを含み、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。
他の側面において、本発明は、慢性肝不全の急性増悪（ＡＯＣＬＦ）を処置するための方法であって、該方法は、ＡＯＣＬＦを有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団を、疾患を処置するための有効量において投与することを含み、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。
他の側面において、本発明は、角膜縁幹細胞欠損（ＬＳＣＤ）を処置するための方法であって、該方法は、ＬＳＣＤを有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団を、疾患を処置するための有効量において投与することを含み、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。
他の側面において、本発明は、角膜疾患を処置するための方法であって、該方法は、角膜疾患を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫であるを、疾患を処置するための有効量において投与することを含む。
他の側面において、本発明は、表皮水疱症（ＥＢ）を処置するための方法であって、該方法は、ＥＢを有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、を、疾患を処置するための有効量において投与することを含む。
他の側面において、本発明は、皮膚の創傷治癒のための方法であって、該方法は、創傷を、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団と、創傷の治癒を促進するための有効量において接触させることを含み、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。いくつかの態様において、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団は、マトリックスまたはスカフォールド上に播種される。他の態様において、マトリックスは、ポリマーのメッシュまたはスポンジ、ポリマーハイドロゲル、またはコラーゲンマトリックスである。
他の側面において、本発明は、臓器移植を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団の、同種移植片の生存を促進するための有効量を投与することを含む方法であって、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。
他の側面において、本発明は、自己免疫疾患を処置する方法であって、該方法は、自己免疫疾患を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団の、自己免疫疾患を処置するための有効量を投与することを含み、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。
他の側面において、本発明は、肝臓疾患を処置する方法であって、該方法は、肝臓疾患を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団の、肝臓疾患を処置するための有効量を投与することを含み、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。
他の側面において、本発明は、神経変性疾患を処置する方法であって、該方法は、神経変性疾患を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団の、神経変性疾患を処置するための有効量を投与することを含み、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫であり、およびここで、神経変性疾患は、宿主細胞に対する免疫応答に関連する。
他の側面において、本発明は、心血管疾患を処置する方法であって、該方法は、心血管疾患を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団の、心血管疾患を処置するための有効量を投与することを含み、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫であり、およびここで、心血管疾患は、組織リモデリングに関連する。
他の側面において、本発明は、腎臓疾患を処置する方法であって、該方法は、腎臓疾患を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団の、腎臓疾患を処置するための有効量を投与することを含み、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。
他の側面において、本発明は、炎症性障害を処置する方法であって、該方法は、炎症性障害を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団の、炎症性障害を処置するための有効量を投与することを含み、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。いくつかの態様において、炎症性障害は、心血管疾患、虚血性脳卒中、アルツハイマー病および加齢からなる群より選択される。
他の側面において、本発明は、筋骨格障害を処置する方法であって、該方法は、炎症性障害を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団の、筋骨格障害を処置するための有効量を投与することを含み、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である。いくつかの態様において、筋骨格障害は、遺伝性筋ジストロフィーである。他の態様において、合成幹細胞の集団は、本明細書において記載される合成細胞である。
他の側面において、本発明は、請求項１～１８のいずれか一項において請求されるような合成幹細胞の集団を、多能性による細胞のリプログラミングのための基質として用いることによる、細胞のリプログラミングのための方法である。
他の側面において、本発明は、本明細書において記載されるような合成幹細胞の集団であって、外来ＰＡＸ６遺伝子をさらに含む。
本明細書において記載されるような障害のいずれかを処置するため、組織工学のため、または創傷治癒のための、本発明の幹細胞の集団の使用もまた、本発明の側面として提供される。
本明細書において記載されるような障害のいずれかを処置するため、組織工学のため、または創傷治癒のための、本発明の幹細胞の集団の医薬を製造するための方法もまた提供される。
本発明の限定の各々は、本発明の多様な態様を包含し得る。したがって、任意の１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の限定の各々が、本発明の各々の側面において包含され得ることが理解される。本発明は、その適用において、以下の説明において記載されるか、または図面において説明される構造および組成の配置の詳細に限定されない。本発明は、他の態様、および多様な方法において実施されることまたは実行されることが可能である。また、本明細書において用いられる表現法および用語法は、説明を目的とするものであって、限定するものとしてみなされるべきではない。「含むこと（including）」、「含むこと（comprising）」、または「有すること（having）」、「含むこと（containing）」、「含むこと（involving）」および本明細書におけるそれらのバリエーションの使用は、そのあとに列記される項目およびそれらの均等物ならびにさらなる項目を包含することを意図される。
添付の図面は、実寸において描画されることを意図されない。図面において、多様な図面において表される各々の同一またはほぼ同一の構成成分は、類似の番号により表される。明確性のために、全ての構成成分が全ての図面において標識されているわけではない。図面において：
合成幹細胞の製造プロセスをまとめるフローチャート。 合成幹細胞の製造プロセスをまとめるフローチャート。
ＡＢＣＢ５＋ＭＳＣは、より下位の線維芽細胞系列ではなく、より上位の線維芽細胞系列に属し得る。（２Ａ）低い（２～３）および高い（１０より上）継代数のＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣからの試料（ｎ＝３）のトランスクリプトームプロファイリングを表すヒートマップ。色は、相対的発現のｌｏｇ２スケールを反映する。（２Ｂ）初期および後期の継代されたＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣからの幹細胞性の維持に関与する遺伝子を表すヒートマップ。 ＡＢＣＢ５＋ＭＳＣは、より下位の線維芽細胞系列ではなく、より上位の線維芽細胞系列に属し得る。（２Ｃ）真皮細胞の区別し得る分集団において、ＡＢＣＢ５と幹細胞マーカーＳＳＥＡ－４との明らかな共局在が観察された。（２Ｄ－２Ｅ）ＡＢＣＢ５、および「上位系列」線維芽細胞の２つのマーカータンパク質についての二重免疫蛍光染色に供されたヒト皮膚の顕微鏡写真は、ＡＢＣＢ５とＤＰＰ４（ＣＤ２６）との共発現、およびＡＢＣＢ５とＰＲＤＭ１（ＢＬＩＭＰ１）との部分的な共局在を明らかにした。スケールバー：５０μｍ；ｅ＝上皮；ｄ＝真皮。破線は、真皮層から上皮層へを描写する。 ＡＢＣＢ５＋ＭＳＣは、より下位の線維芽細胞系列ではなく、より上位の線維芽細胞系列に属し得る。（２Ｆ）ＡＢＣＢ５と幹細胞マーカーＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ－４）との共局在。（２Ｇ）ＡＢＣＢ５は、一貫して、より下位の系列の線維芽細胞筋線維芽細胞のマーカーであるα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）とは共発現することは見出されなかった。核および全ての研究された皮膚切片は、ＤＡＰＩでカウンター染色した。スケールバー：５０μｍ；ｅ＝上皮；ｄ＝真皮。破線は、真皮層から上皮層へを描写する。
発明の説明
いくつかの側面において、本発明は、in vitroで製造された皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞の集団である。これらの細胞は、皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞の単離された初代細胞集団に対して、顕著な進歩を表す。典型的には、初代細胞を単離してin vitroで培養すると、細胞は、元の初代細胞に関連する重要な特性を失う。本発明により、適切な条件下において、ヒト組織から単離されたＡＢＣＢ５＋幹細胞を、培養中で継代して、組織から単離された元の初代細胞とは構造的および機能的に区別し得る、細胞の集団を生成することができることを見出した。これらの細胞は、本明細書において、合成または製造されたＡＢＣＢ５＋幹細胞として言及される。これらの細胞は、ほぼ全ての細胞が、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫であって、ヒトの身体に関して存在したことのないものとなるように、in vitroで製造される。むしろ、それらは、新たに確立された培養方法に従って、新たに作製される。これらのこれらの細胞集団は、多くの治療用途を有する高機能多能性細胞である点において、元の初代細胞とは区別し得る。
合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、本明細書において用いられる場合、以下の特性のうちの１つ以上を有する：
・ＣＤ９０を＞９０％で共発現する；
・低酸素下においてＶＥＧＦを分泌することができ、これはＥＬＩＳＡにより測定される；
・Ｍｉに極性化したマクロファージと共培養した後で、ＩＬ－１ＲＡを分泌することができる；
・マクロファージ共培養物において、ＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－１２／ＩＬ－２３ｐ４０の分泌の減少、ならびにＩＬ－１０分泌の増大を誘導する；
・多能性分化能を有する；または
・異なる遺伝子発現プロフィール。
本発明の組成物は、細胞の集団である。用語「細胞の集団」とは、本明細書において用いられる場合、少なくとも２つ、例えば２つ以上、例えば１つより多くの合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞を含む組成物を指し、別段に特定されない限り、他の細胞型の純度の任意のレベルまたは存在もしくは不在を意味するものではない。例示的な態様において、集団は、他の細胞型を実質的に含まない。別の態様において、集団は、例えば上で列記されるような、特定された細胞型の、または特定された機能もしくは特製を有する、少なくとも２つの細胞を含む。
いくつかの態様において、合成幹細胞は、ＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－１２／ＩＬ－２３ｐ４０の分泌の減少を誘導する。細胞のこれらの特性は、それらの抗炎症性機能のために重要である。これらのサイトカインの結果として、細胞は、多数の炎症性疾患を処置するために有用である。他の態様において、細胞は、マクロファージ共培養物中において、ＩＬ－１０分泌の増大をもたらす。ＩＬ－１０の生成は、合成幹細胞の免疫寛容原性機能を支持するために重要である。
本発明の細胞はまた、多能性分化能を有する。換言すると、これらの細胞は、間葉系間質細胞（脂肪生成性、軟骨形成性、骨原性分化）のみならず、３つ全ての胚葉に由来する細胞への分化、すなわち、１．内胚葉（例えば血管新生－例えば管形成、ＣＤ３１およびＶＥＧＦＲ１発現）、２．中胚葉（例えば筋形成－例えばスペクトリン、デスミン発現）、ならびに３．外胚葉（例えば神経発生－例えばＴｕｊ１発現）を含む他の能力をも定義する。
さらに、in vitroで製造された細胞は、角膜上皮分化能力（例えばＫＲＴ１２発現）を有し、これは、角膜縁幹細胞欠損および他の角膜障害をin vivoで処置するために用いることができる。重要なことに、この合成細胞集団におけるＫＲＴ１２の存在は、これらの細胞に、角膜障害を処置するためのユニークな能力を提供する。この因子は、しばしば、ヒト組織から単離された幹細胞の集団において失われている。角膜疾患をこれらの単離されたヒト細胞で処置するために、ＫＲＴ１２を細胞に加えるべきであることが提案されている。
本発明の合成細胞はまた、ヒト組織から単離された初代幹細胞と比較して区別し得る遺伝子発現プロフィールを有する。本明細書において表される図２を含む例において示されるとおり、合成細胞の集団（高継代数のものから単離されたＡＢＣＢ５＋細胞としても言及される）は、初代細胞（生体において見いだされるネイティブのＡＢＣＢ５＋細胞を含む低継代培養に由来するもの）とは異なる。例えば、特定の幹細胞マーカー、例えばＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ３は、高継代細胞において増大し、一方、特定の間葉系間質細胞分化マーカー、例えばＭＣＡＭ、ＣＲＩＧ１およびＡＴＸＮ１は、減少する。ヒト皮膚におけるＡＢＣＢ５＋細胞におけるＥＡ－４、ＤＰＰ４（ＣＤ２６）、ＰＲＤＭ１（ＢＬＩＭＰ１）およびＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ－４）などの選択された幹細胞性マーカーのタンパク質レベルにおける発現を、免疫染色により確認した。一方、より下位の線維芽細胞系列のマーカーであるα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）の発現は、ヒト皮膚のＡＢＣＢ５＋細胞において不在であった。これらのデータは、これらの後期継代合成細胞がＡＢＣＢ５＋細胞の多能性特性を維持し、さらには元の細胞と比較して増強された特性を有するという知見を支持する。
本明細書において記載される方法は、高純度の合成細胞集団をもたらす。いくつかの好ましい態様において、細胞のうちの１００％が合成であり、細胞のうちの０％がヒト組織に由来する。本発明のプロセスは、１６回までの継代を可能にし、これは、２５回の細胞の倍加に等しい。したがって、in vitroで合成される細胞のパーセンテージは、各継代において、少なくとも以下であるべきであり、以下の式により概算される：
［１-１／（２ｎ）］×１００％、ここでｎは、各継代についての倍加数である（すなわち、継代数１６については２５、または継代数ｘについてはｘ／１６×２５）
２回目および３回目の継代のこととして、細胞の構造が変化し始める。例えば、上で議論される、および例において表される遺伝子発現プロファイリングにおけるデータは、低継代数（２～３回）について示されている。したがって、３回という比較的低い継代数（３／１６×２５＝４．６８７５回の倍加を伴う）は、少なくとも９６．１２％のin vitroで製造または合成された細胞をもたらすであろう。少なくとも１０／１６×２５＝１５．６２５回の倍加を伴う高い（＞１０回）継代培養数は、少なくとも９９．９９８％のin vitroで製造または合成された細胞をもたらすであろう。２５回の倍加を伴う本明細書において試験された最も高い継代数の細胞集団（１６継代）は、少なくとも９９．９９９９９７％のin vitroで製造または合成された細胞をもたらすであろう。
幹細胞はまた、対称に、および非対称に分裂し得るので、高度に継代した細胞は、の合成細胞に達し得る。プロセスにおける典型的な継代数は、６回（９．３７５回の倍加）から１６回の継代（２５回の倍加）までの範囲であり、すなわち、生成物の合成純度の範囲は、典型的には、［１－１／（２９．３７５）］×１００％～［１－１／（２２５）］×１００％であり、すなわち、９９．８５～９９．９９９９９７％である。
細胞製造プロセス
細胞の調製および処理は、ＧＭＰに一致したガイドラインおよび標準に従って行われる。製造プロセスは、清潔な室内環境において行うことができる。本明細書において記載されるように生成された製造された細胞は、凍結保存され、液体窒素の気相において保存される（≦－１３０℃）。
基本的な製造プロセスは、典型的には、４つのステップを含む：組織の調達；皮膚組織の処理；細胞の増殖；およびＡＢＣＢ５陽性細胞の単離。皮膚組織は、腹壁形成術（または他の医学的介入であって余りの皮膚組織を生じるもの）などの、ヒトの外科標本から採取してもよい。皮膚ドナー組織（≧１０ｃｍ２）を用いて開始する、本明細書において開示される合成幹細胞を生成するために必要とされる製造ステップを表す一般的なフローチャートを、図１において示す。インプロセスおよびリリースの制御を、オレンジ色に着色する。Ｔ２５、Ｔ７５、Ｔ１７５は、細胞培養フラスコの増殖面積および関連する名称を指す（ｃｍ２）。Ｃｒｙｏは、液体窒素の気相における細胞の低温貯蔵を指す。ＢＣは、バーコード付けされたクライオバイアルである。ｍＣｃＰは、細胞生成物の微生物学的制御を指す。加えて、皮膚のコラゲナーゼ／TrypZean解離［％］、細胞形態学、継代の間の時間、コンフルエンス、TrypZean適用後の細胞の脱離、インキュベーション時間を含む、他のインプロセス制御（ＩＰＣ）を利用してもよい。
１回の単離（抗体とカップリングされた磁気ビーズによる）から生じるＡＢＣＢ５陽性細胞は、「シングルバッチ」として言及される。並行単離から生じるシングルバッチ（同じ皮膚組織に由来し、同じ継代の数および時間において単離されたもの）をプールし（「マスターバッチ」を作製する）、少なくとも２×１０６個の細胞／バーコード付けされたクライオバイアル（ＢＣ）を含めて凍結保存する。製造プロセスに並行して、全てのステップならびに使用された試薬および重要な材料の全てのロット数を、特定のバッチ文書において記述する。ユニークなＢＣ番号、ユニークなバッチ番号および保存場所の明確な割付（窒素タンク中の）は、生成された細胞バッチの明確な割付を可能にする。これらの性質は、バッチ文書において、および加えて、対応する窒素保存タンクにおける「保存場所リスト」において記述する。
組織調達：
出発材料は、腹壁形成術などの外科手技または特化した除去センターにおいて行われる他の医学的介入の余りの皮膚組織である。
皮膚組織の処理
過剰な皮下脂肪から皮膚を取り除き、その後、そのサイズを決定する（皮膚サイズは≧１０ｃｍ２である必要がある）。この皮膚を、次いで、等分の切片にカットする（各々約２．５ｃｍ２）。処理日１日あたり最大で３０片を処理することができる（残りの切片は、＋２～＋８℃において処理時までＨＴＳ－ＦＲＳ生検輸送溶液中で保存する）。２片の各々を組み合わせ、それにより合計で処理日１日あたりいくつかの調製を並行して行うことができる。消毒のために、皮膚片を、第１に、水性のポビドンヨード溶液（Braunol（登録商標））中で、次いで、アルコールベースのポビドンヨード溶液（Braunoderm（登録商標））中で室温（ＲＴ）でインキュベートする。その後、各々の洗浄ステップについて、ＰＢＳＣａ／Ｍｇを用いて皮膚組織を３回洗浄する、皮膚を、剪刃およびピンセットを用いて解剖する。生じた皮膚片は、酵素コラゲナーゼを用いてさらに分離させる：皮膚試料を、３７℃で１．５～６時間（ＩＰＣ）、コラゲナーゼ／ＰＢＳＣａ／Ｍｇ／Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ溶液中でインキュベートする。インキュベーション期間の後の消化効率は、６０％（ＩＰＣ）より高い必要があり、目視で決定される。皮膚－細胞溶液をろ過し、残りの皮膚を、非動物組み換えトリプシン（TrypZean（登録商標）；Sigma-Aldrich）を用いて、３７℃で１０～６０分間（ＩＰＣ）にわたりさらにインキュベートする。フィルター通過画分、ならびに繰り返してろ過されたTrypZean処置された残りの皮膚（消化効率：＞８５％、目視により決定される）（ＩＰＣ）を、遠心分離により洗浄する（５００×ｇ、ＲＴで５分間）。遠心分離後、上清を取り除き、細胞ペレットを、幹細胞培地（１５％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．６ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ／ＦＧＦ－２、６ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．８μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０μｇ／ｍｌのインスリン、１．１２ｍｇ／ｍｌのグルコース、６．１６ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ、０．５μｇ／ｍｌのアンホテリシンおよび１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したハムＦ１０）中で再懸濁する。細胞をプールし、３０ウェルまでのＣ６細胞培養プレート上に等分に分配し、細胞培養インキュベーター（ＣＯ２含有量：３．１％、湿度：９０％；温度：３７℃）中でインキュベートする。
細胞の増殖（混合細胞培養）
混合細胞培養は、単離前のＡＢＣＢ５陽性およびＡＢＣＢ５陰性細胞からなる分離されていない細胞培養として定義される。
細胞コンフルエンスの第１の評価（熟練の従事者により目視で決定される）は、Ｃ６ウェル中での初代皮膚細胞の培養の１～４日（ＩＰＣ）後に行われる。コンフルエンスが＜７０％（ＩＰＣ）である場合、培養培地を交換し、細胞を、Ｃ６ウェル中でさらに培養する。細胞が≧７０％コンフルエンス（ＩＰＣ）に達するまで、この手順を繰り返す。初代皮膚細胞は、初期の４～６日（ＩＰＣ）の間のみ、抗生物質／抗真菌薬を含有する培養培地中に保持されることに注意すべきである。この初期の期間の後、細胞は、抗生物質フリーの培地中でのみ培養される。加えて、Ｃ６ウェル中での最大培養時間は、１６日間（ＩＰＣ）である。この期間内に細胞がコンフルエンス≧７０％（ＩＰＣ）に達することができない場合、それらは廃棄される。
≧７０％（ＩＰＣ）の標的コンフルエンスに達した場合、TrypZean（登録商標）を用いて細胞を収集し、さらなる増殖のためにＴ２５プレート中で培養する。継代の１～４日（ＩＰＣ）後に、細胞コンフルエンスを再度決定する。細胞コンフルエンスが＜７０％（ＩＰＣ）である場合、培地を交換し、細胞を、Ｔ２５容器中で合計で７日間（ＩＰＣ）までさらにインキュベートする（細胞コンフルエンスが再び＜７０％である場合、細胞を廃棄する）（ＩＰＣ）。７日間以内に細胞コンフルエンス≧７０％に達した際には、TrypZean（登録商標）を用いて細胞を収集し、さらなる増殖のためにＴ７５プレート中で培養する。この時点において、２．６．７．Ｅ．Ｐ．に従ったマイコプラズマ試験のための試料を採取する（ＩＰＣ）。さらなる細胞増殖は、同じスキームに従う。
ＭＫ凍結保存
TrypZeanを用いて細胞を採取し、細胞カウントおよびバイタリティーの決定のために細胞試料を取得する。細胞懸濁液を遠心分離し、細胞を、ＤＭＳＯ含有凍結保存培地ＣＳ１０（ＤＭＳＯを含有する凍結用培地）中で再懸濁する。マイコプラズマ試験のための試料を取得し、その後、細胞を、規定数のバーコード標識された凍結管（「ＢＣ」）中に移す。数は、決定された細胞カウントに依存する。少なくとも８×１０６細胞が、ＭＫの凍結保存のために必要とされる。最少で１つのＢＣ（より高い細胞数においてはより多く）を、５～１２×１０６細胞で充填する（最終細胞－ＣＳ１０溶液容積は１．５ｍｌである）。さらに、混合された初代培養物の無菌性を決定するために、ｍＣｃＰを試験するために細胞試料を取得する。
継代培養
残りの４×Ｔ１７５フラスコを、細胞を１６×Ｔ１７５培養フラスコに継代するために用いる。これらの１６×Ｔ１７５フラスコを、ＡＢＣＢ５陽性細胞（合成幹細胞）を単離するために用いる。第１の単離のために、最後の継代からの時間は、３～１０日間でなければならず、細胞は、一定のコンフルエンスに達していなければならない。一般的に、さらなる生成ステップを開始するために、コンフルエンスは、４０％～９５％である必要がある。
ＡＢＣＢ５陽性細胞の単離のために、１６×Ｔ１７５フラスコのうちの１２個を用いる。残りの４×Ｔ１７５容器の細胞を、すでに記載されたように、１６×Ｔ１７５フラスコに分配し、次のラウンドの合成幹細胞単離のための細胞を、最大の継代数が１６に達するか、または細胞形態学が変化する（例えばより分化した細胞形態学）、または細胞が老化するまで増殖させる。
ＡＢＣＢ５陽性細胞（合成幹細胞）の単離
単離プロセスを二つの部分に分ける：
・ＡＢＣＢ５陽性細胞の磁気単離－ＡＢＣＢ５－陽性細胞のシングルバッチの作製
・同じ継代数による１ドナーのシングルバッチのプーリング（並行する同じ皮膚組織に由来する細胞の単離－マスターバッチの作製
ＡＢＣＢ５陽性細胞の磁気単離
（１６×Ｔ１７５フラスコの）細胞が７５％～９５％のコンフルエンスに達した場合、１２×Ｔ１７５フラスコの培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄する。加えて、起こり得るマイコプラズマ汚染を決定するために試料を取得する。収集のために、細胞を、Versene（登録商標）（ＰＢＳ中０．０２％ＥＤＴＡ）で２０～３０分間にわたり３７℃で、細胞の＞９０％が培養容器から解離するまでインキュベートする。このプロセスステップのために、TrypZeanの代わりにVerseneを用いる。なぜならば、TrypZean処置は、抗体に基づく細胞単離のために必要とされるエピトープの喪失をもたらすからである。ＰＢＳを細胞懸濁液に添加することにより細胞を希釈し、これを次いで、室温で５００×ｇで５分間にわたり遠心分離する。上清を取り除き、全細胞を、合計１４ｍｌのＨＲＧ（４９．５Ｖｏｌ／％の５％ＨＳＡ／４９．５Ｖｏｌ／％の乳酸リンガー／１Ｖｏｌ／％の４０％グルコース）溶液中で再懸濁し、５０ｍｌの反応管に移す。試料を取り除き、細胞のカウントおよびバイタリティーの決定のための試料、および細胞周期分析（１０６細胞）のために、品質管理機構（Quality Control）に移す。
４００μｌのＡＢＣＢ５を標的とする抗体共役磁気ビーズを細胞に添加し、ＨＲＧで最終容積を１６ｍｌに調整する。抗体で標識されたビーズ－細胞混合物を、試料ローテーターを用いて２０分間にわたり室温でインキュベートする。
２９ｍｌのＨＲＧを溶液に添加し、試料を、磁石上で４分間にわたりインキュベートして、磁気ビーズを容器壁に誘引する。このインキュベーション期間の後で、主にＡＢＣＢ５陰性またはこれを低く発現する細胞からなる上清を、慎重に取り除く。残りの抗体－ビーズ－細胞混合物を、４５ｍｌのＨＲＧ溶液を用いて洗浄する。ＡＢＣＢ５含有量決定のために試料（ビーズ－細胞混合物）を取り除き、品質管理機構に移す（放出パラメーター）。
残りの溶液を、磁石上でさらなる４分間にわたりインキュベートする。上清を廃棄した後で、３ｍｌの脱離溶液（TrypZean）を添加して、抗体－標識されたビーズをＡＢＣＢ５陽性細胞から酵素的に取り除く。これは、TrypZean処置が、抗体に結合したエピトープの非特異的な除去（ペプチド切断）をもたらし、したがって細胞からの抗体－ビーズの分離をもたらすことにより可能である。
３７℃での３分間のインキュベーションの後で、３ｍｌのＨＲＧ溶液を反応管に添加し、これを、再び、６分間にわたり磁石上に置き、磁気ビーズに結合させる。分離したＡＢＣＢ５陽性細胞を含む上清を、次いでフレッシュな１５ｍｌの反応管に移す。５０ｍｌの反応管を、３．５ｍｌのＨＲＧ溶液を添加することにより２回リンスし、４分間にわたり磁石インキュベーションを行う。上清を、次いでまた、フレッシュな１５ｍｌの管に移す。
ＡＢＣＢ５陽性細胞を残りのビーズからさらに精製するために、それらを、４分間にわたり磁石に保持させる。上清（１３ｍｌの細胞懸濁液）を、新たな１５ｍｌの反応管に移し、ＲＴで５分間にわたり５００×ｇで遠心分離する。上清を廃棄し、細胞ペレットを１０ｍｌのＨＲＧ溶液中で再懸濁し、磁石上で６分間にわたり再びインキュベートし、その後、細胞懸濁液を新たな１５ｍｌの反応管に移す。単離されたＡＢＣＢ５陽性細胞（ＩＰＣ）のマイコプラズマ試験（放出パラメーター）および細胞カウントの決定のための試料を取得し、品質管理機構に移す。溶液を、ＲＴで５分間にわたり５００×ｇで遠心分離する。上清を廃棄する前に、１００μｌを、エンドトキシン決定（放出パラメーター）のために用いられるエンドトキシンフリーの管に（エンドトキシンフリーのピペットチップで）移す。残りの上清をまた、慎重に取り除く。
マスターバッチを作製するためのプーリングステップ
マスターバッチ（合成幹細胞の１つの最終バッチ）は、シングルバッチからなり、これは：
・同じ出発材料（同じドナー）に由来する
・同じ日に同じ継代数により並行して単離される
シングルバッチの細胞ペレットを、CryoStor（商標）ＣＳ１０中で再懸濁する。ＣＳ１０の合計数および関連するバーコード管（ＢＣ）の数は、利用可能な細胞の数に依存する。各々のＢＣを、ＣＳ１０中の１．５ｍｌの細胞懸濁液で充填する。
バイアルを、最少で２×１０６個の細胞で充填する（２～１８×１０６細胞／ＢＣ）。ＢＣを凍結する前に、１つのＢＣを「ＱＣのための分析用ＢＣ（Analytic BC for QC）」として選択して（ＢＣ番号１）、以下の試料を取り除き、分析試験（放出試験）のための品質管理機構に移す：
・細胞のカウントおよびバイタリティー
・バイアビリティー、ＣＤ９０の共発現、ビーズ残渣
・細胞生成物の微生物学的管理（microbiological control of cellular products：ｍＣｃＰ）
ＢＣ管を、速度制御されたフリーザー（凍結速度：－１００℃までは１℃／分；－１５０℃までは５℃／分）で－１５０℃まで凍結し、それらの放出まで隔離保存タンク中に移す。
３つ全ての効力アッセイ（管形成アッセイ、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡおよびＩＬ－１ＲＡ ＥＬＩＳＡ）を行うために、「ＱＣのための分析用ＢＣ」を品質管理機構により融解させ、アッセイ試験のための細胞試料を取得する。
これらの場合において、凍結保存された混合培養物（ＭＫ）を、融解して、さらなる細胞生成のために使用することができる。したがって、単一の皮膚組織から多数のＡＢＣＢ５陽性細胞を単離して、臨床的使用のための「バイオバンク（Biobank）」をもたらすことができる。
これらの方法により生成される合成幹細胞は、以下の規格を有するものと決定された：
Figure 2022527998000001
これらの規格を評価するために用いられた分析手順を、以下により詳細に記載する。
１．ｍＣｃＰ（細胞生成物の微生物学的管理）
生成物である合成幹細胞の無菌性試験のために、方法「ｍＣｃＰ」を用いる。サンプリングおよびプロービングは、清潔な室内施設において、層流フード下において、製造部門の熟練の従事者により行われる。インキュベーションおよび分析は、部門の熟練の従事者により行われる。
手順の説明：
１％の総最終容積の生成物を、ｍＣｃＰ試験のために用いる。２ｘ１５μｌを、ｍＣｃＰ試験のために、各々の単離された合成幹細胞バッチの各々のクライオバイアル（１．５ｍｌ）から直接取得する。
ｍＣｃＰは、BacT/Alert 3D 60システム（Biomerieux）により行う。BacT/Alert 3D 60システムは、２つのモジュールからなり、一方はコントローラーモジュール、一方はインキュベーターモジュールであり、６０個の試料内のインキュベーションおよび汚染の検出を同時に行う能力を有する。培地を含有するボトルを、振盪機構を備えたインキュベーターモジュール中に置く。
以下の培養培地（ボトル中に提供される）を用いる：
・ＢＰＡ（好気性）：４０ｍｌの酸素中の補充ＴＳＢ ＣＯ２大気
・ＢＰＮ（嫌気性）：４０ｍｌの窒素中の補充ＴＳＢ ＣＯ２大気
ｍＣｃＰ試験のために、１５μｌの試験材料を、それぞれＢＰＮまたはＢＰＡフラスコ中に移す。
試料サイズが非常に小さいので、それを、４ｍｌの容積まで、ＮａＣｌ－ペプトンバッファー溶液で希釈する。ｍＣｃＰ試験のために、４ｍｌの試料溶液（１５μｌの細胞／ＣＳ１０溶液を含む）を、無菌のシリンジを用いてＢＰＡおよびＢＰＮボトル中に注射する。微生物によりＣＯ２が生成されたことによるＣＯ２の上昇に起因してｐＨが変化した場合、各々の培養ボトルの底の特化した液体エマルジョンセンサー（ＬＥＳ）が、眼に見えて色を変える（灰色から黄色に）。BacT/ALERT（登録商標）３Ｄ装置は、１０分ごとに色の変化を測定し、変化を分析する。増殖が検出されると、システムは、音によりおよび目に見えるかたちで警告を発し、試料データが記録される。
感受性が高い手順により、７日間以内の正確な記載が可能となる。この時間の後、全ての陰性プローブについて、固体培養培地上への播種を行う。さらに、全ての陽性の試料を、一般的に、検出の時点において固体培養培地上に播種する。
サンプリングのための計画的進行
計画的サンプリングのために、ｍＣｃＰのための試料のサイズの計算は、クライオバイアルの容積の代わりに総バッチ容積に基づき、全試料容積を、１つの専用の単位から取得する。
生成物の総最終容積のうちの少なくとも１％を、ｍＣｃＰ試験のために用いる。このことは、ｍＣｃＰ試験のために、１００μｌ（総生成物容積≦１０ｍｌ）または総生成物容積のうちの１％（容積＞１０ｍｌ）のうちのいずれかを、合成幹細胞バッチの「ＱＣのための分析用ＢＣ」（ＢＣ番号１）から直接取得することを意味する
小さい試料サイズを、４ｍｌの容積まで、ＮａＣｌ－ペプトンバッファー溶液で希釈する（Ｅ．Ｐ．に従う）。ｍＣｃＰ試験のために、４ｍｌの試料溶液（１００μｌ～３００μｌ細胞／ＣＳ１０溶液を含む）を、無菌のシリンジを用いてＢＰＡおよびＢＰＮボトル中に注射する。
インキュベーション時間の後で、微生物の増殖が検出されなくてもよい。この許容基準が満たされる場合には、次いで、生成物は、規格パラメーター「細胞生成物の微生物増殖」の要件「増殖なし」を満たす。
２．マイコプラズマ試験
生成物である合成幹細胞のマイコプラズマ試験のために、ｑＰＣＲ法を行う。定量リアルタイムＰＣＲに基づくマイコプラズマ試験のために、Microsart（登録商標）ＡＴＭＰマイコプラズマキット（Minerva Biolabs）を行い、これは、製造者（Minerva Biolabs）により、全てのリストにあるマイコプラズマ種についての検出限界、培養細胞および自家細胞移植片についての特異性および頑健性に関して検証された。マイコプラズマ検出は、マイコプラズマゲノム中の高度に保存されたＲＮＡ－オペロン、１６Ｓ ｒＲＮＡコード領域の増幅および検出に基づく。
マイコプラズマｑＰＣＲの実行について、Life technologies製のStepOne（商標）リアルタイムＰＣＲシステムを用いる。
マイコプラズマ試験のために、ＡＢＣＢ５陽性細胞の単離の後で、磁石上での最後の洗浄ステップの間に、２００μｌの細胞懸濁液を取得し、その後、細胞をプールして凍結保存する。試料の遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１５分間）の後で、ペレットを２００μｌのＴｒｉｓバッファー中で懸濁する。
試料に、内部対照ＤＮＡを加え（spike）、Microsart（登録商標）ＡＭＰ抽出キットを用いてゲノムＤＮＡを単離する。単離されたＤＮＡのうちの１０μｌをｑＰＣＲのために用い、これは、４８ウェルプレート中で行う。ｑＰＣＲは、陽性および陰性の対照（Microsart（登録商標）ＡＴＭＰマイコプラズマキットにより提供される）のみならず、内部単離対照、ならびにマイコプラズマ種Mycoplasma orale（ＭＯ）、Mycoplasma fermentans（ＭＦ）およびMycoplasma pneumoniae（ＭＰ）のための10 CFUTM感受性標準を感受性についての標準として含む。
ｑＰＣＲ結果の分析を行う。陰性対照は、Ｃｔ－値≧４０を示さなければならず、陽性対照ならびに感受性標準は、Ｃｔ－値＜４０を示さなければならない。プロセスから取得された試料は、Ｃｔ－値＜４０によりマイコプラズマ陽性であり、Ｃｔ－値≧４０によりマイコプラズマ陰性である。
試験された細胞懸濁液中で、マイコプラズマＤＮＡの増幅は検出可能でなくともよい（検出限界１０ＣＦＵ／ｍｌ）。この許容基準が満たされる場合（マスターバッチのうちの全てのシングルバッチについて）、次いで、生成物は、規格パラメーター「マイコプラズマ」の要件「検出可能でない、＜１０ＣＦＵ／ｍｌ」を満たす。
３．エンドトキシンレベル
エンドトキシンレベルの定量的決定のために、発色-動態学的ＬＡＬ試験を用いる。これが、定量的測光法である。測定は、Endosafe（登録商標）－ＰＴＳ（商標）およびマッチするＬＡＬ－カートリッジ（いずれもCharles River Laboratories製）を用いて行う。Endosafe（登録商標）－ＰＴＳカートリッジは、薬理学的生成物のインプロセス制御および生成物のエンド制御のためのＬＡＬ試験法としてＦＤＡにより許可されている。エンドトキシン試験は、３７℃±１℃のインキュベーション温度で行い、これは、ライセートの製造者により推奨される。各々のカートリッジは、規定量のＦＤＡにより承認されたＬＡＬ試薬、発色性基質およびエンドトキシン標準対照（ＣＳＥ）を含む。
ＡＢＣＢ５陽性細胞の単離、抗体－ビーズ複合体からの分離および細胞の遠心分離の後で、１００μｌの上清をエンドトキシン試験のために取得し、ＬＡＬ試薬水（ＬＲＷ－水）で１：１０に希釈する。各々の測定のために、２５μｌの試料を、ＬＡＬ－カートリッジ（Endosafe（登録商標）－ＰＴＳ（商標）中に挿入される）の４つの試料リザーバの各々の中にピペッティングする。ＰＴＳ（商標）リーダーは、試料を、各２つのチャネルにおいて、ＬＡＬ試薬と（試料チャネル）、またはＬＡＬ試薬および陽性対照（スパイクチャネル）と混合する。インキュベーションおよび発色性基質の添加の後で、各々のウェルの光学密度を、動態学敵に分析し、内部バッチ特異的標準曲線に基づいて測定する。
２回の測定の間の応答時間のバリエーションを計算することにより、二重の決定の評価を行う。二重の測定の応答時間のバリエーションが２５パーセント未満である場合、エンドトキシン測定は妥当であるとみなす。
本明細書に従って、測定された試料によりエンドトキシンレベル≦２ＥＵ／ｍｌが達成されなければならない（マスターバッチのうちの全てのシングルバッチについて）。
４．細胞カウントおよび細胞バイタリティー
細胞カウントおよび細胞バイタリティーの決定のための自動化された方法は、フローサイトメトリーを用いることにより用いられる。フローサイトメトリー（BD AccuriTM C6フローサイトメーター）は、細胞懸濁液中の生細胞を定量するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供する。細胞バイタリティーを評価するための一方法は、色素排除を用いることである。生細胞は、完全な膜を有し、これは、非生細胞の損傷を受けた透過性の膜には容易に浸透する多様な色素を排除する。
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、膜非透過性の色素であって、一般に生細胞から排除されるが、死にかけているかまたは死んだ細胞の細胞膜を透過することができるものである。それは、塩基対の間に挿入されることにより、二本鎖ＤＮＡに結合する。ＰＩは、４８８ｎｍにおいて励起され、相対的に大きなストークスシフトを有し、６１７ｎｍの最大波長において発光する。
細胞カウントならびにバイタリティーの決定は、合成幹細胞の単離の後に、それらの凍結保存の直前に行う。
分析のために、１０μｌの細胞懸濁液を、クライオバイアルから１．５ｍｌの反応管（８０μｌのVerseneを含有する）中にピペッティングし、品質管理部門にひき渡す。１０μｌのＰＩ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の添加の後で、Verseneで総容積を５００μｌに調整し、BD AccuriTM C6フローサイトメーターにより、作業説明書に従って測定を行う。各々の測定の実行は、５５μｌの試料溶液により行う。細胞カウントおよびバイタリティーを計算し、試験報告において記載する。
細胞バイタリティーについての特定された許容基準は、≧９０％である。単離された合成幹細胞の各々のバッチの細胞カウントについて特定された許容基準は、２×１０６～１８×１０６細胞／クライオバイアルである。
５．細胞バイアビリティー
細胞バイアビリティーの決定のための自動化された方法は、フローサイトメトリーを用いることにより行う。バイアビリティーを決定するために、細胞を、カルセイン－ＡＭ（カルセインアセトキシメチルエステル）で染色する。カルセインＡＭは、非蛍光の疎水性化合物であって、無傷の生細胞に容易に透過するものである。細胞に入った後、細胞内のエステラーゼが、アセトキシメチル（ＡＭ）エステル基を切断してカルセインを生成する。カルセインは、親水性の強力に蛍光の化合物であって、細胞質中でよく保持されるものである。
細胞膜が損なわれたアポトーシス細胞および死んだ細胞はは、カルセインを保持しない。カルセインは、４９５ｎｍにおいて最適に励起され、５１５ｎｍのピーク発光を有する。
単離されたＡＢＣＢ５陽性細胞（合成幹細胞）について、細胞の凍結保存の直前に、細胞バイアビリティーの測定を行う。細胞バイアビリティー率は、生細胞を死細胞と区別するだけのＰＩによる細胞バイタリティー決定とは異なり、単離された細胞の実際の代謝活性についての情報を提供する。
測定のために、１００μｌの細胞懸濁液（凍結保存培地ＣＳ１０中）をクライオ管から取得し、１ｍｌのVersene（０．０２％ＥＤＴＡ）を含有する１．５ｍｌの反応管に移し、品質管理機構に引き渡す。試料は、２～８℃で、最大２時間にわたり保存することができる。試料の調製のために、細胞を遠心分離し（５分間、１５００ｒｐｍ）、上清を取り除き、細胞ペレットを２００μｌのVersene中で再懸濁する。２μｌのカルセイン－ＡＭ（１：２００希釈、ｆ．ｃ．０，１μＭ）（および１μｌのＣＤ９０－抗体）の添加の後で、試料を３０分間にわたり３７℃でインキュベートし、その後、１ｍｌのVerseneでの洗浄ステップ、遠心分離（５分間、１５００ｒｐｍ）および２００μｌのVersene中でのペレットの再懸濁を行う。BD AccuriTM C6フローサイトメーターにより、細胞バイアビリティーの測定を行う。検出されたカルセイン蛍光を用いてバイアビリティーを計算し、試験報告において記述する。
細胞バイアビリティーについての特定された許容基準は、≧９０％である
６．ＣＤ－９０表面マーカー
単離されたＡＢＣＢ５＋細胞が実際に幹細胞であることを示すために、間葉系幹細胞マーカーである表面タンパク質ＣＤ９０の発現を、フローサイトメトリー（BD AccuriTM C6フローサイトメーター）により分析する。ＣＤ９０の検出のために、ＣＤ９０に対して配向するAlexa Fluor（登録商標）６４７共役抗体を用いる。Alexa Fluor（登録商標）６４７色素は、明るい近赤外蛍光色素であって、フローサイトメトリーの適用のために高度に好適であり、５９４ｎｍまたは６３３ｎｍのレーザー線について理想的に好適に励起される。イメージングおよびフローサイトメトリーにおける好適なシグナル発生のために、Alexa Fluor（登録商標）６４７色素は、広いモル濃度範囲にわたりｐＨ非感受性である。Alexa Fluor（登録商標）６４７とカルセインとの励起および発光の波長が異なることに起因して（バイアビリティー試験を参照）、Alexa Fluor（登録商標）６４７ ＣＤ９０およびカルセイン－ＡＰの並行フローサイトメトリー分析を行うことができる。
測定のために、１００μｌの細胞懸濁液（凍結保存培地ＣＳ１０中）をクライオ管から取得し、１ｍｌのVersene（０．０２％ＥＤＴＡ）を含有する１．５ｍｌの反応管に移し、品質管理機構に引き渡す。試料は、２～８℃で、最大２時間にわたり保存することができる。試料の調製のために、細胞を遠心分離し（５分間、１５００ｒｐｍ）、上清を取り除き、細胞ペレットを２００μｌのVersene中で再懸濁する。１μｌのＣＤ９０－Alexa Fluor（登録商標）６４７抗体（１：２００）および２μｌのカルセイン－ＡＭ（１：２００希釈、ｆ．ｃ．０，１μＭ）の添加の後で、試料を、３０分間にわたり３７℃でインキュベートし、その後、１ｍｌのVerseneによる洗浄ステップ、遠心分離（５分間、１５００ｒｐｍ）および２００μｌのVersene中でのペレットの再懸濁を行う。BD AccuriTM C6フローサイトメーターによるＣＤ－９０発現の測定を行う。ＣＤ９０＋細胞は、それらの高いAlexa Fluor（登録商標）６４７蛍光により検出し、それらの含有量を計算し、試験報告において記載する。
特定された許容基準は、≧９０％ＣＤ９０陽性細胞である。
７．ビーズ残渣
単離された合成幹細胞が、脱離溶液によりＡＢＣＢ５抗体－ビーズから効果的かつ完全に分離されたか否かをチェックするために、細胞をビーズ残渣について試験する。この分析方法はまた、フローサイトメトリーにより、バイアビリティーおよびＣＤ９０発現試験と並行して行う。
単離されたＡＢＣＢ５陽性細胞は、TrypZeanで処置する。TrypZeanの酵素活性は、ＡＢＣＢ５タンパク質の細胞外ループ上のｍＡｂ結合部位の完全な切断を引き起こす。不十分なビーズの脱離または細胞の洗浄は、単離された合成幹細胞中の残留ビーズをもたらし得るので、分析しなければならない。
フローサイトメトリーによる残留ビーズの可視化／検出のために、BD AccuriTM C6を用いる。第１の分析の前に、FSC/SSA-Dot Plotにおいて、ビーズ残渣を可視化するために、セルフリーＡＢＣＢ５－ビーズ溶液を用いてゲートを設定する。細胞がそのゲートにおいてもまたカウント／検出されることを除外することはできないので、分析は、バイアビリティー試験のカルセイン染色と組み合わせる。分析のために、ビーズゲート中に存在するイベントであってカルセイン陰性のもののみを考慮する。したがって、生細胞は分析から除外され、ビーズのみがカウントされる。
試料の調製およびBD AccuriTM C6フローサイトメーターによる測定は、「細胞バイアビリティー」および「ＣＤ９０－表面マーカー」において既に記載されるように、作業説明書に従って行う。残留ビーズの比率を計算し、試験報告において記載する。
特定された許容基準は、合成幹細胞中、≦０．５％の残留ビーズである。
８．ＡＢＣＢ５含有量の決定
合成幹細胞の単離の後で、ＡＢＣＢ５陽性細胞の実際の含有量を、フローサイトメトリーにより決定する。
ＡＢＣＢ５陽性細胞は、ロバα－マウスAlexa-647抗体を用いることにより検出する。この二次抗体は、モノクローナルα－ＡＢＣＢ５抗体に対して配向する。加えて、当該二次抗体は、フローサイトメトリーによる検出を可能にする蛍光色素であるAlexa-647にカップリングされている。したがって、放出された蛍光は、結合した抗体の数と直接的に相関するが、遊離／未結合のビーズ－抗体複合体もまた検出されるので、ＡＢＣＢ５陽性細胞に結合した抗体の実際の量とは相関しない。ＡＢＣＢ５陽性細胞の実際の数を得るために、細胞（生）とビーズ－抗体複合体（非生）との区別を可能にするカルセイン－ＡＭによるさらなる染色を行う。カルセイン陽性のイベントのみを分析のために考慮することにより、遊離ビーズ－抗体複合体が除外される。
TrypZeanによる細胞からの磁気ビーズの脱離は、細胞表面上のＡＢＣＢ５タンパク質の喪失をもたらすので、抗体によるＡＢＣＢ５の検出は、脱離の後では不可能である。したがって、磁気ビーズの添加、インキュベーションおよび磁気分離の後であるがTrypZeanの添加の前に、含有量決定のための２００μｌの試料を取得する。磁気抗体にカップリングされたビーズになお結合している細胞は、品質管理機構に引き渡し、直接的に分析のために用いるか、または２～８℃で最大２時間にわたり保存する。遠心分離の後で、細胞を、２００μｌの二次抗体－溶液（ロバα－マウスAlexa 647、Verseneで1:500に希釈）および７μｌのカルセイン－ＡＭ中で再懸濁し、２０～３０分間にわたり３７℃でインキュベートする。細胞を遠心分離し、Verseneで洗浄し、最終的に分析のために２００μｌのVersene中で再懸濁する。
BD AccuriTM C6フローサイトメーターによるＡＢＣＢ５含有量の測定を、作業説明書に従って行う。高いカルセイン蛍光を有する細胞のみをゲーティングすることにより、未結合のビーズ－抗体複合体を分析から除外する。ＡＢＣＢ５陽性細胞の比率を、二次抗体のAlexa-647蛍光から計算する。
合成幹細胞の単離の後のＡＢＣＢ５陽性細胞の含有量についての特定された許容基準は、≧９０％である（マスターバッチの各々のシングルバッチについて）。
９．効力アッセイ１：血管新生性分化（管形成アッセイ）
合成幹細胞の放出のための１つの重要な基準は、細胞が分化転換する効力である。当該プロセス中に、合成幹細胞が血管新生性分化を起こすことができるか否かを試験する。分化能／能力は、血管新生を測定するために最も広く用いられているin vitroアッセイの一つである、いわゆる管形成アッセイを用いて試験する。この迅速アッセイにより、細胞が細胞外マトリックスの存在下において三次元構造（管形成）を構築する能力が試験される。
全３種の効力アッセイの試験のために、定義される「ＱＣのための分析用ＢＣ」を用い、これを融解する。分化アッセイは、作業説明書に従って行う。管形成アッセイのために、１×１０５および１．５×１０５個の細胞を、２４ウェルプレート（ＥＣＭマトリックスでコーティングされたもの）の２つのウェル中に（幹細胞培地中で）播種し、１９時間～２２時間にわたりＣＯ２－インキュベーター中でインキュベートする。顕微鏡下において（４０ｘ倍率）写真を撮影し、分析のために保存する。
効力アッセイについての特定された許容基準は、２つの試験された細胞濃度のうちの少なくとも１つについての管の形成である（定量的分析）。
１０．効力アッセイ２：低酸素後のＶＥＧＦ分泌
単離された細胞の低酸素培養後のＶＥＧＦ分泌は、第２の効力アッセイとして役立つ。この方法により、ＡＢＣＢ５陽性細胞がパラクリン因子を介して血管新生を増強する能力を試験する。
試験のために、定義される「ＱＣのための分析用ＢＣ」を用い、これを融解する。アッセイのために、３×１０５個の細胞を、細胞培養ディッシュ（３５×１０ｍｍ）中に（幹細胞培地中で）播種し、低酸素条件下において（低酸素チャンバー中で１％Ｏ２）、４８時間（±２時間）にわたり３７℃で培養する。上清を回収し、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡのために用いる。
特定された許容基準は、検証データに基づき、低酸素培養後の細胞上清中で＞４６．９ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦである。
１１．効力アッセイ３：Ｍ１に極性化したマクロファージとの共培養後のＩＬ－１ＲＡ分泌
Ｍ１に極性化したマクロファージとの共培養後のＩＬ－１ＲＡ分泌の決定および炎症性の環境の刺激は、ＡＢＣＢ５陽性細胞の免疫調節能力を示すはずである。
アッセイの開始時において、ＴＨＰ－１細胞を、細胞培養培地へのＰＭＡ（１５０ｎｍｏｌ／ｍｌ）の添加によりマクロファージ（Ｍφ）に分化させる。４８時間後、マクロファージをＡＢＣＢ５陽性細胞（合成幹細胞）と共培養する。したがって、定義される「ＱＣのための分析用ＢＣ」を用い、融解する。２４ウェルプレートの２つのウェル中で、２×１０４個のＡＢＣＢ５陽性細胞を、１ｘ１０５個のマクロファージと４８時間にわたり共培養する。１つのウェルにおいて、共培養の開始時において５０ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ－ｇの添加により環境を刺激する。共培養の２４時間後に、２０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳおよび再び５０ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ－ｇの添加により、刺激を繰り返す。共培養の２日後に、上清を収集し、ＩＬ－１ＲＡ ＥＬＩＳＡのために用いる。
特定された許容基準は、検証データに基づき、マクロファージとの共培養後（および炎症性環境の刺激）の＞１２５ｐｇ／ｍｌのＩＬ－１ＲＡの分泌である。
本発明の合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、多くの異なる治療目的のために用いることができる。例えば、合成細胞は、同系移植皮膚の創傷治癒、同種移植、末梢動脈閉塞性疾患－ＰＡＯＤ、慢性肝不全の急性増悪－ＡＯＣＬＦ、表皮水疱症－ＥＢおよび多くの他の疾患のために用いることができる。例えば、新たに示されたＫＲＴ１２＋角膜分化能力に基づいて、角膜縁幹細胞欠損（ＬＳＣＤ）および他の角膜障害の処置のため（既に同種移植として臨床試験中である角膜縁ＡＢＣＢ５＋幹細胞に類似するが、ＬＳＣＤまたは角膜障害において、患者皮膚からの単離により、ＡＢＣＢ５＋皮膚幹細胞を患者自家の同系移植片として用いて、移植片拒絶を回避することができるという利点を有する）。
Dinarello et al Nat Rev Drug Discov. 2012の論文において概説されるとおり、炎症により、および免疫により引き起こされる障害であって、ＩＬ１ベータが関連し、ＩＬ－１ＲＡに対して応答性であるもの処置、または、ＴＮＦ－アルファにより駆動される障害（例えば関節リウマチ）もしくはＩＬ－１２／ＩＬ－２３ｐ４０により駆動される障害（例えば乾癬）、またはＩＬ－１０／調節性Ｔ細胞処置により受け入れられる疾患（例えば移植片拒絶）の処置もまた企図される。炎症により駆動される疾患プロセスのための潜在的な適用は非常に大きく、例えば、心血管疾患、虚血性脳卒中、アルツハイマー病および加齢を含む。同様に、移植拒絶または移植片対宿主疾患などの免疫障害は、この細胞治療による処置を受けれいるはずである。
この合成細胞調製物の神経原性および筋原性の分化能力に基づく疾患のさらなる処置は、脳卒中もしくは改善について組織修復に依存する他のＣＮＳ障害、または例えば遺伝性筋ジストロフィーを含む筋肉修復に依存する筋骨格障害であろう。
細胞組成物はまた、ＡＢＣＢ５＋幹細胞において、例えば、それらを特定の組織にターゲティングする組織特異的ホーミング因子、組織リモデリングに関与する分泌型分子、ならびに患者において調節不全であり得る増殖因子、サイトカイン、ホルモンおよび神経伝達物質の発現を誘導する遺伝子導入を含む、さらなる改善において有用であると企図される。加えて、特定の遺伝子が欠損している（例えばＲＤＥＢにおけるＣＯＬ７Ａ）遺伝子疾患の幹細胞に基づく修復を可能にするために、正しい遺伝子を導入してもよい。あるいは、ＡＢＣＢ５＋幹細胞における欠損遺伝子を、同系患者への移植の前に、多様な遺伝子編集技術により補正してもよい。
加えて、これらの細胞は、多能性による細胞のリプログラミングまたは前駆体遺伝子のための組成物として用いてもよい。例えば、本発明者らは、これらの細胞が、ＡＢＣＢ５－細胞よりも容易にｉＰＳＣにリプログラムされることを示した。さらに、これらの細胞におけるＰＡＸ６の過剰発現は、他の皮膚前駆体について示されているように、それらの角膜分化能力を、さらに改善することができる。
それらが創傷治癒促進因子を移植および放出する能力に起因して、急性および慢性の創傷を罹患する患者のための先端的なＭＳＣベースの治療に深い関心が生じる。今日まで、先進国における人口の１～２％が、非治癒性の創傷を罹患し、世界的な高齢の肥満および糖尿病の患者の増加に起因して、慢性創傷の発生率は増加すると推定されている［４］。大規模なＭＳＣベースの治療の臨床的実施における首尾よい実行をなお妨害している１つの主なハードルは、再現可能なパラクリンの有効性および効力のために、ＭＳＣを濃縮して増殖させることを確実に可能にする、細胞表面マーカーの不在である。
病因学においては異なるが、慢性創傷は、持続的な多数の過剰に活性化された炎症促進性Ｍ１マクロファージの共通の特徴を共有し［７、８］、ＴＮＦαおよび他の炎症促進性サイトカインの放出が増強されている。これらの炎症促進性サイトカインは、プロテアーゼおよび反応性酸素種と共に、組織の破壊および常在する創傷部位の線維芽細胞における老化プログラムの設置をもたらし、それにより、これらの創傷の非治癒性の状態を永続化させる。鉄の蓄積は、先に、慢性静脈性下肢潰瘍において存在するマクロファージにおいて、血圧の上昇および静脈弁の不全に起因する創傷部位における赤血球の持続的な血管外漏出の結果として同定された。これらの創傷における鉄過負荷マクロファージは、それらの炎症促進性のＭ１状態から、組織のリモデリングおよび修復のために必要とされる抗炎症性Ｍ２マクロファージに切り替えることができない［７］。Ｍ２マクロファージは、それらのＭ１カウンターパートとは反対に、より低い炎症性サイトカイン放出を示し、増殖因子および組織修復および創傷治癒を刺激する代謝物を生成する［９］。逆に、ＴＮＦαおよびＩＬ－１βのようなエフェクター分子は、とりわけＭ１マクロファージにより放出され、Ｍ１マクロファージの自己分泌の動員および定常的な活性化の悪循環を維持し、それにより、実質的に創傷を持続的な炎症の非治癒性の状態にロックする［７、８］。
持続性の炎症に対抗し、支配的なＭ１マクロファージを、慢性創傷の治癒のための必要条件である組織修復促進性Ｍ２マクロファージに切り替えるための、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣにより使用されるパラクリン機構の関与に、特に取り組んだ。
任意の移植または細胞融合の効果を除外するために、ヒト慢性創傷における無制限のＭ１マクロファージ活性化の主なう病原性の側面を厳密に写す［７］鉄過剰症マウスモデルの慢性創傷へのヒトＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの局所注射による異種移植片モデルを故意に用いた。臨床グレードで承認されたＡＢＣＢ５＋ＭＳＣ調製物を使用し、これは、実証されたクローナルな三系列の分化能力、増強されたクローン増殖、およびin vivoでの慢性創傷の首尾よい処置についての有用な予測因子としてin vitroでのＴＮＦα抑制性活性を有する。鉄過剰症の創傷中に注射されたＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣは、パラクリンのＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ＲＡ）の放出を増強し、実際に、慢性鉄過剰症マウス創傷において過剰に増加している支配的なＭ１炎症促進性マクロファージ表現型を、抗炎症性Ｍ２マクロファージに切り替え、全体的な創傷治癒を促進することが見出された。注射されたＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣからのＩＬ－１ＲＡのパラクリン放出の因果的役割は、ヒト組み換えＩＬ－１ＲＡの注射は創傷治癒を促進した一方で、ＩＬ－１ＲＡがサイレンシングされたＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの注射は創傷治癒を促進しなかったという知見により支持された。注目すべきことに、これらのデータは、ヒト化されたＮＯＤ－スキッドＩＬ２ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスにおいて、ヒト炎症促進性Ｍ１から抗炎症性Ｍ２マクロファージへのシフトと共に再現され、患者の長期的利益のための、マーカーリッチなＡＢＣＢ５＋ＭＳＣ治療の臨床的実施への首尾よい置き換えのために、さらに道を開いた。
合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、好ましくは単離される。「単離された合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞」とは、本明細書において用いられる場合、その天然の環境とは異なる条件中に置かれる細胞の調製物を指す。用語「単離された」は、他の細胞との組み合わせまたは混合物中での、またはin vivo環境における、これらの細胞のその後の使用を妨げない。
合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、実質的に純粋な調製物として調製してもよい。用語「実質的に純粋」とは、調製物が、ＡＢＣＢ５陽性幹細胞以外の細胞を実質的に含まないことを意味する。例えば、ＡＢＣＢ５細胞は、存在する総細胞のうちの少なくとも７０パーセントを構成すべきであり、より大きなパーセンテージ、例えば、少なくとも８５、９０、９５または９９パーセントが好ましい。細胞は、注射バイアル、アンプルまたは注入バッグなどの完成した医薬用容器中に、所望され得る任意の他の構成成分、例えば細胞を保存するかまたは細菌の増殖を減少させるための剤と共に、パッケージングされていてもよい。組成物は、単位投与形態におけるべきものである。
合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、免疫媒介性疾患を処置するために、いくつかの態様において有用である。免疫媒介性疾患は、有害な免疫応答と関連する疾患、すなわち、組織に損傷を与えるものである。これらの疾患として、これらに限定されないが、移植、自己免疫疾患、心血管疾患、肝臓疾患、腎臓疾患および神経変性疾患が挙げられる。
抗原に対する免疫応答が軽減されるかまたは取り除かれるように、免疫系による応答を回復させるために、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞を移植において用いることができることが見出された。移植は、１つの身体または身体の部分から別のものへ組織または臓器を移植する行為またはプロセスである。合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、宿主に対して自家性（同じ宿主から得られる）であっても、宿主に対して同種または同系である細胞などの非自家性であってもよい。非自家細胞は、患者または臓器のドナー以外の人物に由来する。あるいは、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、宿主に対して異種性であるソースから得てもよい。
同種とは、遺伝的に異なる細胞であるが、主またはドナーと同じ種に属するか、またはこれから得られたものを指す。したがって、同種ヒト間葉系幹細胞は、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞または臓器ドナーの意図されるレシピエント以外のヒトから得られた間葉系幹細胞である。同系とは、遺伝的に同一または近接して関連する細胞であって、宿主またはドナーに対して免疫学的に適合可能なもの、すなわち、同一の遺伝子型を有する個体または組織からの細胞を指す。異種とは、宿主またはドナーとは異なる種の生物に由来するかまたはこれから得られた細胞を指す。
したがって、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、移植片レシピエントに合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞を移植片に対する免疫応答を抑制するかまたはこれを回復させるために有効な量で投与することにより、移植片（組織、臓器、細胞など）に対する免疫応答を抑制するかまたはこれを回復させるために用いられる。
したがって、方法は、ドナー組織のレシピエントを合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞と接触させることにより、達成することができる。合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、移植片より前に、またはこれと同時に、またはこれより後に、レシピエントに投与することができる。幹細胞を移植片の前に投与する場合、典型的には、幹細胞は、手術の１４日前まで、および好ましくは７日前までに投与すべきである。投与は、その後定期的に（例えば、１週間に１回）繰り返してもよい。
合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞はまた、移植片の部分としてレシピエントに投与することができる。例えば、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、移植の前に、臓器または組織中に灌流してもよい。あるいは、組織を移植し、次いで、手術の間に処置してもよい。
移植片を受け取った患者の、移植片に対する拒絶エピソードの重篤度を軽減するか、または移植片に対する拒絶エピソードを取り除くための処置は、ドナー組織がレシピエント中に移植された後に、ドナー組織合成のレシピエントにＡＢＣＢ５＋幹細胞を投与することによっても達成することができる。
レシピエントに対するドナー組織、臓器または細胞による免疫応答、すなわち移植片対宿主応答、を低下させることは、ドナー組織、臓器または細胞を、組織、臓器または細胞のレシピエント中への移植の前に、ex vivoで合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞で処置することにより、達成することができる。合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、後でレシピエントの抗原提示細胞に対して活性化され得る移植片中のＴ細胞の応答性を低下させ、それにより、移植片が、宿主に対する移植片の有害な応答の発生を伴うことなく、またはこれを軽減しつつ、レシピエントの（宿主の）体内に導入され得るようになる。したがって、いわゆる「移植片対宿主」疾患を防ぐことができる。
合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、例えば移植の前に、レシピエントまたはドナーから得てもよい。合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、単離して、必要とされるまで冷凍保存してもよい。合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞はまた、所望される量まで培養により増殖させて、必要とされるまで保存してもよい。あるいは、それらは、使用の直前に得てもよい。
合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、ドナー移植片により宿主に対して引き起こされた進行中の有害な免疫応答を低下させるかまたはこれを取り除くために有効な量において、レシピエントに投与される。移植片により引き起こされた有害な免疫応答を起こしている宿主に対する、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の提示は、進行中の応答を阻害し、Ｔ細胞の再刺激を防止し、それにより、宿主組織に対する活性化されたＴ細胞による有害な応答を低下させるかまたはこれを取り除く。
移植手順の部分として、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞を、また、保護的効果を増強するために、細胞死を誘導する分子などの分子を発現するように改変してもよい。以下により詳細に記載されるように、真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、外因的に加えられた核酸を用いて、タンパク質を生成するように操作することができる。例えば、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、免疫系に、当該分子のための受容体を担持する活性型Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する分子を送達するために、用いることができる。このことは、活性型Ｔリンパ球の欠損、および移植片に対する望ましくない免疫応答の抑制をもたらす。したがって、真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞を、細胞死分子を発現するように改変してもよい。本明細書において記載される方法の好ましい態様において、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、細胞死分子ＦａｓリガンドまたはＴＲＡＩＬリガンドを発現する。
全ての場合において、細胞の有効用量（すなわち、同種移植片の生存を延長するために十分な数）を患者に投与すべきである。投与される細胞の数は、一般に、１×１０７～１×１０１０の範囲であるべきであり、ほとんどの場合においては、１×１０８～５×１０９であるべきである。実際の投与量および投与スケジュールは、症例ごとに、主治医により、臨床医学の分野において標準である方法を用いて、患者の年齢、体重および身体的状態などの要因を考慮して、決定されるであろう。患者が移植片拒絶の徴候を示している場合、投与量および／または投与の頻度を増大させてもよい。細胞は、通常は静脈内注射または注入により投与されるであろうが、例えば臓器移植の部位の近傍に細胞を移植する方法を用いてもよい。
合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、単独の免疫調節因子として、または他の免疫調節因子も含む処置計画の部分として、移植患者に投与することができる。例えば、患者にまた、以下を投与してもよい：ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの間の相互作用を遮断するモノクローナル抗体または他の化合物；シクロスポリン、タクロリムスおよびラパマイシンなどのリンパ球活性化およびその後の増殖の阻害剤；またはメトトレキサート、アザチオプリン、シクロホスファミドなどの他の機構により作用する免疫抑制剤、または抗炎症性化合物（例えば、デキサメタゾンおよびプレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド）と共に。
本発明の真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞はまた、自己免疫疾患を処置および予防するためにも有用である。自己免疫疾患とは、対象自身の抗体が宿主組織に対して反応するか、または免疫エフェクターＴ細胞が内因性の自己のペプチドに対して自己反応性であり、組織の破壊を引き起こす、疾患のクラスである。したがって、免疫応答が、自己抗原として言及される対象自身の抗原に対して開始される。自己免疫疾患として、これらに限定されないが、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合型結合組織疾患、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊、糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン耐性、および自己免疫性糖尿病が挙げられる。「自己抗原」とは、本明細書において用いられる場合、正常な宿主組織の抗原を指す。正常な宿主組織は、癌細胞を含まない。
自己免疫疾患の一例は、抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）疾患である。ＧＢＭ疾患は、ＩＶ型コラーゲンの３鎖の非コラーゲン性ドメイン１（３（ＩＶ）ＮＣ１）に対して配向された自己免疫応答から生じ、罹患した患者において、迅速な進行性の糸球体腎炎（ＧＮ）、最終的には腎不全を引き起こす。以下の例において記載されるように、ＧＢＭのモデルにおける真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の有効性が示された。３（ＩＶ）ＮＣ１を認識する自己反応性抗体は、疾患の特徴と考えられている。加えて、３（ＩＶ）ＮＣ１自己反応性Ｔヘルパー（Ｔｈ）１媒介性の細胞免疫が、その病因に関連付けられている。感受性のマウス株において、組み換え３（ＩＶ）ＮＣ１（ｒ３（ＩＶ）ＮＣ１）を含む抗原調製物による免疫により、抗ＧＢＭ疾患を実験的に誘導することができ、これにより、治療的免疫調節に対する応答を研究するための有益な疾患モデル系を提供する。抗原依存的なＴ細胞の活性化および結果としてもたらされるインターロイキン２（ＩＬ－２）の生成は、２つの特徴的なシグナルを必要とする：抗原との遭遇の際に、ナイーブなＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）プラス抗原性ペプチド複合体とのＴ細胞受容体の会合を通したシグナル１、および正の共刺激経路を通したシグナル２を受けて、これが完全活性化をもたらす。実験的な抗ＧＢＭ自己免疫性ＧＮにおける疾患の発症のための、１つのかかる正の共刺激経路の重要な役割である、ＡＰＣにより発現されるＣＤ４０とそのＴｈリガンドであるＣＤ４０Ｌとの相互作用が、最近示されており、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ経路の遮断は、自己免疫性ＧＮの発症を予防することが見出されている。一方、負のＴ細胞共刺激シグナルは、免疫応答を下方調節するように機能する。調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）、ならびにインターロイキン１０およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）ファミリーのメンバーなどの可溶性サイトカインメディエーターはまた、Ｔ細胞活性化および免疫エフェクター応答を減弱化させることができる。
別の自己免疫疾患は、クローン病である。合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞を用いるクローン病の処置のための臨床治験が行われてきた。クローン病は、大腸および胃腸管の炎症に関連する慢性の状態である。行われた治験に基づいて、クローン病の処置のための合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の使用は、有望であると考えられる。
自己免疫疾患の処置において用いられる場合、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、好ましくは静脈内注射により投与され、有効用量は、疾患の進行を遅延させるか、疾患に関連する１つ以上の症状を緩和するために必要とされる量であろう。例えば、再発性の多発性硬化症の場合、有効用量は、少なくとも、発作の頻度または重篤度を軽減するために必要とされる量であるべきである。関節リウマチの場合、有効量は、少なくとも、患者により経験される疼痛および炎症を軽減するために必要とされる細胞の数であろう。細胞の単一の単位用量は、典型的には、１×１０７～１×１０１０細胞であるべきであり、投与は、主治医により適切であると決定されるように、定期的な間隔を空けて繰り返されるべきである（例えば、週１回、月１回など）。
合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞はまた、肝臓疾患の処置においても有用である。肝臓疾患は、肝臓組織に対して損傷をもたらす肝炎などの疾患を含む。より一般的に、本発明の合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、これらに限定されないが以下を含む肝臓の疾患、障害または状態の処置のために有用であり得る：アルコール性肝臓疾患、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄなど）、限局性肝臓病変、原発性肝細胞癌、肝臓大嚢胞性病変、限局性結節性過形成性肉芽腫性肝臓疾患、肝肉芽腫、遺伝性ヘモクロマトーシスなどのヘモクロマトーシス、鉄過剰症候群、急性脂肪肝、妊娠悪阻、妊娠中の介入性肝臓疾患、肝内胆汁うっ滞、肝不全、劇症肝不全、黄疸性または無症候性高ビリルビン血症、肝細胞に対する傷害、クリグラー・ナジャー症候群、ウィルソン病、アルファ－１－アンチトリプシン欠損、ギルバート症候群、高ビリルビン血症、非アルコール性脂肪性肝炎、ポルフィリン症、非肝硬変性門脈圧亢進症、非肝硬変性門脈圧亢進症、門脈線維症、住血吸虫症、原発性胆汁性肝硬変、バッド・キアリ症候群、骨髄移植後の肝静脈閉塞症など。
身体に対するストレスは、成体幹細胞を、損傷領域に遊走して傷害を修復することを補助する、特化した細胞へと変化させ得る。例えば、損傷を受けた肝臓は、幹細胞にシグナルを送ることができ、肝細胞は、損傷を受けた肝臓ために肝細胞を作製することにより応答する。（Journal of Clinical Investigation 2003 July 15;112 (2):160-169）。
いくつかの態様において、本発明は、真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞で神経変性疾患を処置することに対して配向される。いくつかの場合において、本発明は、神経変性疾患、または神経変性をもたらし得る神経細胞に対する傷害を有する対象の処置を企図する。神経細胞は、主に、それらの局所性／領域性のシナプス結合（例えば、局所回路介在ニューロン・対・長距離投射ニューロン）および受容体のセット、および関連するセカンドメッセンジャー系に基づいて分類される。神経細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンおよび末梢神経系（ＰＮＳ）ニューロンの両方を含む。多くの異なる神経細胞型が存在する。例として、これらに限定されないが、感覚および交感神経系ニューロン、コリン作動性ニューロン、後根神経節ニューロン、自己受容反射ニューロン（三叉神経中脳路核におけるもの）、毛様体神経節ニューロン（副交感神経系におけるもの）などが挙げられる。当業者は、典型的には、細胞形態学的特徴、細胞特異的マーカーの発現、特定の分子の分泌などを利用して、神経細胞を容易に同定して、それらを膠細胞などの非神経細胞と区別することができるであろう。
「神経変性障害」または「神経変性疾患」は、本明細書において、末梢神経系においてまたは中枢神経系においてニューロンの進行性の喪失が起こる障害として定義される。神経変性障害の非限定的な例として、以下が挙げられる：（ｉ）慢性神経変性疾患、例えば家族性および孤発性の筋萎縮性側索硬化症（それぞれ、ＦＡＬＳおよびＡＬＳ）、家族性および孤発性のパーキンソン病、ハンチントン病、家族性および孤発性のアルツハイマー病、多発性硬化症、オリーブ橋小脳萎縮症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、びまん性レビー小体病、大脳皮質基底核変性症（corticodentatonigral degeneration）、進行性家族性ミオクローヌスてんかん、線条体黒質変性、捻転ジストニア、家族性振戦、ダウン症候群、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、糖尿病性末梢神経障害、拳闘家認知症、ＡＩＤＳ認知症、加齢性認知症、加齢性記憶障害、ならびに伝達性海綿状脳症（クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、スクレイピーおよびクールー）に関連するプリオンタンパク質（ＰｒＰ）により引き起こされるもの、および過剰なシスタチンＣ蓄積により引き起こされるもの（遺伝性シスタチンＣ血管障害）などのアミロイドーシス関連神経変性疾患；ならびに（ｉｉ）外傷性脳損傷（例えば、手術関連脳損傷）などの急性神経変性障害、脳浮腫、末梢神経損傷、脊髄損傷、リー症候群、ギランバレー症候群、リポフスチン沈着症などのリソソーム蓄積障害、アルパース病、ＣＮＳ変性の結果としての回転性めまい；例えば青斑核および小脳におけるニューロンの変性を含む、慢性アルコールまたは薬物乱用により生じる病態；認知および運動の失調をもたらす小脳ニューロンおよび皮質ニューロンの変性を含む、加齢により生じる病態；ならびに運動失調をもたらす基底核ニューロンの変性を含む、慢性アンフェタミン乱用により生じる病態；脳卒中、局所性虚血、血行障害、低酸素－虚血性脳症、高血糖、低血糖または直接的な外傷などの局所的な外傷から生じる病的変化；治療薬および処置の負の副作用として生じる病態（例えば、グルタミン酸受容体のＮＭＤＡクラスのアンタゴニストの抗けいれん薬の用量に応答しての帯状皮質および嗅内皮質ニューロンの変性）、およびウェルニッケ・コルサコフ関連認知症。感覚ニューロンに影響を及ぼす神経変性疾患として、フリートライヒ運動失調症、糖尿病、末梢神経障害、および網膜神経変性が挙げられる。辺縁および皮質系の神経変性疾患として、大脳アミロイドーシス、ピック萎縮症およびレット症候群が挙げられる。前述の例は、包括的であることを意図されず、単に用語「神経変性障害」または「神経変性疾患」の説明として役立つ。
慢性神経変性疾患のほとんどは、中年期の間の発症により典型的に表され、神経系内のニューロンの特定のサブセットの迅速な変性をもたらし、最終的には若年死亡をもたらす。真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞を含む組成物は、神経変性疾患を処置するために、単独で、またはこれらの障害または疾患の処置もしくは予防のための他の治療用化合物と組み合わせて、対象に投与してもよい。これらの薬物のうちの多くは、当該分野において公知である。例えば、抗パーキンソン剤として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：ベンズトロピンメシル酸塩；ビペリデン；ビペリデン塩酸塩；ビペリデン乳酸塩；カルマンタジン；シラドパ塩酸塩；ドパマンチン；エトプロパジン塩酸塩；ラザベミド；レボドパ；ロメトラリン塩酸塩；モフェギリン塩酸塩；ナキサゴリド塩酸塩；硫酸パレプチド；プロシクリジン塩酸塩；キネロラン塩酸塩；ロピニロール塩酸塩；セレギリン塩酸塩；トルカポン；トリヘキシフェニジル塩酸塩。筋萎縮性側索硬化症の処置のための薬物として、これに限定されないが、リルゾールが挙げられる。パジェット病の処置のための薬物として、チルドロン酸二ナトリウムが挙げられる。
神経変性疾患の処置における成体幹細胞の有用性は、記載されている。脳卒中を経験したマウスにおいて、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞が、ニューロン様細胞に変化することができることが示されている。Journal of Cell Transplantation Vol. 12, pp. 201-213, 2003。加えて、骨髄に由来する幹細胞は、神経細胞へと発達し、これは、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および脊髄損傷を有する患者を処置するために有望である。
本発明の方法はまた、腎臓疾患に関連する障害の処置においても有用である。腎臓中に先に注射された合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、ほぼ即座の腎機能の改善および細胞の再生をもたらすことが示されている。Resnick, Mayer, Stem Cells Brings Fast Direct Improvement, Without Differentiation, in Acute Renal Failure, EurekAlert!, August 15, 2005。したがって、本発明の真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、単独で、または透析などの腎機能および細胞の再生を改善するための他の治療剤もしくは手順と組み合わせて、腎臓疾患を有する対象に投与してもよい。
本発明の方法に従って処置することができる他の疾患として、角膜および肺の疾患が挙げられる。これらの組織における合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の投与に基づく治療は、正の結果を示している。例えば、ヒト合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、損傷を受けた角膜を再構成するために用いられてきた。Ma Y et al, Stem Cells, August 18, 2005。加えて、骨髄に由来する幹細胞は、肺の傷害に対する肺の修復および保護のために重要であることが見出された。Rojas, Mauricio, et al., American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, Vol. 33, pp. 145-152, May 12, 2005。したがって、本発明の真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞はまた、角膜組織または肺組織の修復において用いてもよい。
骨髄などのソースからの合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞はまた、心血管疾患の処置のための治療においても用いられてきた。骨髄幹細胞は、心臓が新たな機能的組織を発達させることを補助することにより、損傷を受けた心筋を修復することを補助することができる。Goodell MA, Jackson KA, Majka SM, Mi T, Wang H, Pocius J, Hartley CJ, Majesky MW, Entman ML, Michael LH, Hirschi KK. Stem cell plasticity in muscle and bone marrow. Ann N Y Acad Sci. 2001 Jun;938:208-18。心筋梗塞の後で損傷を受けた心臓に入れられた骨髄幹細胞は、心臓のポンプ能力を８０％改善した。Nature Medicine Journal September 2003 vol. 9 no. 9: 1195-1201。
心血管疾患は、心臓および／または血管に関する疾患のクラスを指す。用語は、技術的には、心臓および／または血管に影響を及ぼす疾患を指すが、一方、例えば肺などの他の臓器、および関節も、当該疾患において影響を受ける場合がある。心血管疾患の例として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：アテローム動脈硬化症、動脈硬化症、動脈瘤、狭心症、慢性安定狭心症、不安定狭心症、心筋虚血（ＭＩ）、急性冠症候群、冠動脈疾患、脳卒中、冠動脈再狭窄、冠動脈ステント再狭窄、冠動脈ステント再血栓症、血行再建、心筋梗塞後（ＭＩ）リモデリング（例えば、左心室のＭＩ後リモデリング）、ＭＩ後左室肥大、血管形成、一過性虚血発作、肺塞栓症 。血管閉塞、静脈血栓症、不整脈、心筋症、うっ血性心不全、先天性心疾患、心筋炎、弁膜症（valve disease）、拡張型心筋症, 拡張障害、心内膜炎、リウマチ熱、高血圧（高い血圧）、肥大型心筋症、動脈瘤、および僧帽弁逸脱。
アテローム動脈硬化症は、大きい、および中くらいのサイズの筋肉の動脈の疾患であって、内皮機能不全、血管の炎症、ならびに血管壁の内膜中の脂質、コレステロール、カルシウムおよび／または細胞デブリの蓄積により特徴づけられる。この蓄積は、プラーク（アテローム性プラーク）の形成、血管リモデリング、急性および慢性の管腔の閉塞、血流の異常、ならびに標的臓器に対する酸素供給の減少をもたらす。
アテローム動脈硬化症は、２つの主な問題を引き起こし得る。第１に、アテローム性プラークは、プラークの破裂および動脈の狭窄（狭くなること）をもたらし得、したがって、それが養う臓器に対する不十分な血液供給をもたらし得る。あるいは、動脈瘤が生じる。これらの合併症は、慢性であり、ゆっくりと進行し、累積性である。最も一般的には、プラークは、突然破裂し（「不安定プラーク」）、迅速に血流を遅滞させるかまたは停止させるであろう血栓の形成を引き起こし（例えば数分間にわたり）、当該動脈により養われる組織の死をもたらす。このイベントは、梗塞と称される。最も一般的な認識されるシナリオのうちの１つは、心筋梗塞（ＭＩ）（一般的には心臓発作として知られる）を引き起こす冠動脈の冠動脈血栓である。非常に進行型の疾患における別の一般的なシナリオは、下肢への不十分な血液供給からの跛行であり、これは、典型的には、血塊により狭められた狭窄および動脈瘤の両方のセグメントの組み合わせに起因する。アテローム性動脈硬化症は、身体の広範囲のプロセスであるので、類似のイベントはまた、脳、腸、腎臓、下肢などへの動脈においても起こる。
アテローム性動脈硬化症は、青年期において始まる場合があり、通常は、最も主要な動脈において見いだされるが、無症候性であり、人生の間、ほとんどの診断方法により検出されない。それは、最も一般的には、心臓に供給する冠循環または脳に供給する脳循環を妨げる場合に、深刻に症候性となり、脳卒中、心臓発作、うっ血性心不全およびほとんどの心血管疾患全般を含む多様な心臓疾患を引き起こす最も重要な根底の原因であると考えられる。体内の任意の動脈が関与しているが、通常、より決定的に重要な臓器に供給するいくつかの動脈の重篤な狭窄または閉塞のみが認識される。心筋に供給している動脈の閉塞は、心臓発作をもたらす。脳に供給している動脈の閉塞は、脳卒中をもたらす。血流の低下をもたらす上肢または下肢の動脈におけるアテローム性プラークは、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）を引き起こす。
心臓ストレス試験は、最も一般的に行われる血流の限定のための非侵襲試験方法のうちの１つである。それは、一般的に、約７５％以上の管腔の狭窄を検出する。血管造影により検出可能な重篤な狭窄の面積、およびより低い程度までの「ストレス試験」は、長い間、一般的に心血管疾患についてのヒト診断技術の焦点であった。最も重篤なイベントは、重いプラークを有する位置において起こる。プラークの破裂は、数秒間から数分間以内の動脈の管腔の閉塞、ならびに潜在的な永続的な組織損傷および時には突然死をもたらし得る。
アテローム性動脈硬化症について、多様な解剖学的、生理学的および行動学的なリスク因子が公知である。これらのリスク因子として、高齢、男性、糖尿病、脂質異常症（上昇した血清コレステロールまたはトリグリセリドレベル）、高い血清濃度の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ、「悪玉コレステロール」）、リポタンパク質（ａ）（ＬＤＬのバリアント）、および／または非常に低い低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）粒子、低い血清濃度の機能的高密度リポタンパク質（ＨＤＬ、「善玉コレステロール」）粒子、タバコの喫煙、高血圧、肥満（例えば、中心性肥満、別名、腹部肥満または男性型肥満）、心血管疾患の家族歴（例えば冠動脈心疾患または脳卒中）、上昇したレベルの炎症性マーカー（例えば、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰまたはｈｓ－ＣＲＰ）、ｓＣＤ４０Ｌ、ｓＩＣＡＭ，など）、上昇した血清レベルのホモシステイン、上昇した血清レベルの尿酸、および上昇した血清レベルのフィブリノーゲン濃度が挙げられる。
心筋梗塞（ＭＩ）という用語は、心筋（心臓の筋肉）および梗塞（酸素飢餓に起因する組織の死）に由来する。ＭＩは、心臓の一部への血液供給が妨げられた場合に起こる疾患の状態である。急性ＭＩ（ＡＭＩ）は、急性の冠動脈症候群の型であり、これは最もしばしば（しかし必ずしもではない）冠動脈疾患の徴候である。最も一般的な引き金となるイベントは、心外膜冠動脈におけるアテローム硬化型プラークの破壊であり、これは凝固のカスケードをもたらし、時に動脈の完全な閉塞をもたらす。結果として生じる虚血または酸素不足は、心臓組織の損傷および潜在的な死を引き起こす。
ＭＩまたはＡＭＩについての重要なリスク因子として、アテローム硬化型の冠動脈心疾患および／または狭心症などの血管疾患の既往歴、異常な心臓の律動または失神などの任意の先のエピソード、高齢（例えば、男性は４０歳超、および女性は５０歳超）、タバコの喫煙、過剰なアルコール摂取、高トリグリセリドレベル、高ＬＤＬ（「低密度リポタンパク質」）および低ＨＤＬ（「高密度リポタンパク質」）、糖尿病、高血圧、肥満およびストレスが挙げられる。
ＭＩまたはＡＭＩの症状として、胸部疼痛、息切れ、悪心、嘔吐、動悸、発汗、および差し迫った悲運（impending doom）の不安または感情が挙げられる。対象は、しばしば突然の病気を感じる。全ての心筋梗塞のうちの約３分の１が、無症状であり、胸部疼痛または他の症状を伴わない。
ＭＩを有することが疑われる対象は、心電図（ＥＣＧ、ＥＫＧ）、胸部Ｘ線、およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）またはトロポニンレベル（損傷を受けた組織、特に心筋により放出されるマーカー）の上昇を検出するための血液検査などの多くの診断検査を受ける。冠血管造影図は、心血管上の狭窄または閉塞を可視化することを可能にする。
心筋梗塞は、心筋細胞の不可逆的な喪失を引き起こし、心臓の機能に寄与することができない薄い線維性瘢痕をもたらす。幹細胞治療は、リモデリングを伴う心筋梗塞ならびにアテローム性動脈硬化症の後の心不全の処置に対して可能なアプローチを提供する。幹細胞治療の基本的な概念は、損傷を受けた心臓の壁の中に未成熟の心筋細胞を直接的に注射することにより、機能的な心筋細胞の数を増大させることである。心筋梗塞は、心筋細胞の喪失と、その後の病態的なリモデリングおよび心不全の進行をもたらす。幹細胞治療の１つのゴールは、虚血の後に失われた心筋細胞を置き換え、注射された領域の血行再建を誘導することである。別のゴールは、心筋梗塞後の、およびアテローム性動脈硬化に関連する、有害な病態的リモデリングを予防することである。自家または同種の合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、幹細胞治療のための潜在的な細胞ソースのうちの１つであると考えられる。したがって、本発明の真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、心血管疾患の処置のために用いてもよい。
本発明の真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞についての別の使用は、組織再生におけるものである。この本発明の側面において、ＡＢＣＢ５陽性細胞を用いて、分化の誘導により組織を生成する。単離および精製された合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、特定の培地中での有糸分裂増殖を通して、未分化状態において増殖させることができる。これらの細胞を、次いで、採集して活性化させ、機械的、細胞的および生化学的刺激因子を含む多数の要因により、骨、軟骨および多様な他の型の結合組織へと分化させることができる。ヒト合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、広範囲な間葉系組織細胞、ならびに腱、靭帯および真皮を生成する骨芽細胞および軟骨細胞などの細胞へと分化する能力を有し、この能力は、単離後、および培養中での数回の集団の増殖にわたり、保持される。したがって、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞を、単離し、精製し、大きく増殖し、および次いでこれを活性化して、所望される特定の細胞型の間葉系細胞、例えば骨、軟骨、腱、靭帯、筋肉および脂肪などの骨格および結合組織へと分化させることができることにより、骨格および他の結合組織障害を処置するためのプロセスが存在する。結合組織という用語は、本明細書において、特化した要素を支援する身体の組織を含み、骨、軟骨、靭帯、腱、間質、筋肉および脂肪組織を含むように用いられる。
本発明の方法およびデバイスは、単離された真皮間葉系前駆体細胞を利用し、これは、特定の条件下において、様々な型の所望される結合組織へ、例えば骨または軟骨を形成する細胞へと分化し、これを生成するように、誘導することができる。
別の側面において、本発明は、結合組織損傷を修復するための方法に関する。方法は、真皮間葉系肝細胞を、細胞を修復のために必要な型の結合組織へと分化させるために好適な条件下において、結合組織損傷の領域に適用するステップを含む。
用語「結合組織欠損」とは、正常な結合組織と比較した任意の損傷または不規則性を含む欠損を指し、これは、外傷、疾患、加齢、先天性欠損、外科的介入などに起因して起こり得る。結合組織の欠損はまた、例えば美容整形のために、骨形成のみが所望される非損傷領域をも指す。
真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、任意の既知の投与の様式により直接的に対象に投与してもよく、または、マトリックスまたはインプラント上に播種してもよい。マトリックスまたはインプラントは、線維性またはハイドロゲルベースのデバイスなどのポリマー性マトリックスを含む。２つの型のマトリックスが、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞が軟骨または骨へと分化する場合にそれらを支持するために一般的に用いられている。マトリックスのうちの一方の形態は、ポリマーのメッシュまたはスポンジである；他方は、ポリマーハイドロゲルである。マトリックスは、生分解性または非生分解性であってもよい。生分解性という用語は、本明細書において用いられる場合、所望される適用において受入可能な期間、ｐＨ６～８の約２５℃～３８°Ｃの温度を有する生理学的溶液に暴露された後約６か月未満、および最も好ましくは約１２週間未満内に、溶解または分解するポリマーを意味する。マトリックスは、ある期間にわたり、例えば１年未満、より好ましくは６か月未満、最も好ましくは２～１０週間にわたり、生分解性であってよい。
線維性マトリックスは、市販の材料を用いて製造または構築することができる。マトリックスは、典型的には、天然または合成のポリマーで形成される。新たに形成された軟骨が、滑液性関節において存在する過重負荷下においてそれ自体を維持して正常に機能することができるように、生分解性ポリマーが好ましい。１～２４週間以内に分解するポリマーが好ましい。合成ポリマーは、それらの分解速度をより正確に決定することができ、天然のポリマーより多くのロット間の一致およびより低い免疫原性を有するので、好ましい。用いることができる天然のポリマーは、コラーゲン、アルブミンおよびフィブリンなどのタンパク質；ならびにアルギネートなどの多糖およびヒアルロン酸などのポリマーを含む。
合成ポリマーは、生分解性および非生分解性の両方のポリマーを含む。生分解性ポリマーの例として、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、およびポリ乳酸－グリコール酸（ＰＬＧＡ）などのヒドロキシ酸のポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。非生分解性ポリマーとして、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エチレン酢酸ビニルおよびポリビニルアルコールが挙げられる。これらは、軟骨におけるそれらの存在が、不可避的に軟骨の機械的損傷および破壊をもたらすであろうことから、避けるべきである。
いくつかの態様において、ポリマーは線維を形成し、これは、絡み合うか、織られるか、またはメッシュ状になって、１００～３００マイクロンの間質性の空間を有するマトリックスを形成する。用いることができるポリグリコール酸のメッシュは、Ethicon, N.J.などの外科用品の会社から得ることができる。スポンジもまた用いることができる。本明細書において用いられる場合、用語「線維性」とは、絡み合うか、織られるか、またはメッシュ状になったマトリックスまたはスポンジマトリックスを指す。
マトリックスは、好ましくは、欠損を充填するように成形される。ほとんど場合において、これは、ポリマー線維を剪刀またはナイフで整えることにより達成することができる；あるいは、マトリックスは、揮発性溶媒中で加熱または溶解することにより形成されたポリマー溶液から鋳型成型（cast）してもよい。
合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、細胞懸濁液のマトリックスへの適用により、マトリックス上に播種される。これは、マトリックスを細胞培養容器中に浸漬すること、または細胞のマトリックスへの注射もしくは他の直接適用により達成することができる。
細胞を播種されたマトリックスは、標準的な外科技術を用いて、欠損の部位に移植される。マトリックスは、移植の前にin vitroで播種および培養しても、播種してすぐに移植しても、または移植してから細胞を播種してもよい。好ましい態様において、細胞を、マトリックス上およびこれの中に播種し、in vitroで、約１６時間～２週間にわたり培養する。細胞がマトリックスに付着していることのみが重要である。２週間が、細胞の培養のために好ましい時間であるが、それはより長くてもよい。播種または移植の時の細胞密度は、約２５，０００細胞／ｍｍ３であるべきである。
イオン的にまたは共有結合により架橋された、順応的であるハイドロゲルを形成することができるポリマーを、細胞をカプセル化するために用いる。例えば、ハイドロゲルは、アルギン酸、海藻から単離された炭水化物ポリマーなどのポリマーのアニオン性の塩を、カルシウムカチオンと共に架橋することにより生成され、その強度は、カルシウムイオンまたはアルギネートの濃度を増大させることにより増大する。アルギネート溶液を、移植されるべき細胞と混合して、アルギネート懸濁液を形成させる。次いで、懸濁液を、懸濁液を硬化させる前に、直接的に患者中に注射する。懸濁液は、その後、生理学的な濃度のカルシウムイオンのin vivoでの存在に起因して、短期間で硬化する。
体内への移植のために細胞と混合されるポリマー性材料は、ハイドロゲルを形成すべきである。ハイドロゲルとは、有機ポリマー（天然または合成）が、共有結合、イオン結合、または水素結合を介して架橋され、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元の開格子構造を生じた場合に形成される物質として定義される。ハイドロゲルを形成すさせために用いることができる材料の例として、include アルギネートなどの多糖、ポリホスファジン（polyphosphazine）、およびイオン的に架橋されるポリアクリレート、またはPluronics（商標）もしくはTetronics（商標）、それぞれ温度もしくはｐＨにより架橋されるポリエチレンオキシド－ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのブロックコポリマーが挙げられる。他の材料として、フィブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどのポリマー、ヒアルロン酸およびコラーゲンが挙げられる。
一般的に、これらのポリマーは、水、干渉化食塩水溶液、または荷電された側鎖を有する水性アルコール溶液などの水溶液中で少なくとも部分的に可溶性であるか、またははその一価イオンの塩である。カチオンと反応することができる酸性の側鎖を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、およびスルホン化ポリマー、例えばスルホン化ポリスチレンである。アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーまたはポリマーとの反応により形成された酸性の側鎖を有するコポリマーもまた用いることができる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ素化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基、および酸性ＯＨ基である。
アニオンと反応することができる塩基性の側鎖を有するポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）、およびいくつかのイミノ置換ポリホスファゼンである。ポリマーのアンモニウムまたは四級塩もまた、骨格の窒素またはペンダントイミノ基から形成させることができる。塩基性の側鎖の例は、アミノおよびイミノ基である。
アルギネートを、二価のカチオンにより水中で室温でイオン的に架橋させてハイドロゲルマトリックスを形成させることができる。これらの温和な条件起因して、アルギネートは、例えばLimに対する米国特許第４，３５２，８８３号において記載されるようなハイブリドーマ細胞のカプセル化のために最も一般的に用いられるポリマーであった。Limのプロセスにおいて、カプセル化されるべき生物学的材料を含む水溶液を、水溶性ポリマーの溶液中で懸濁し、懸濁液に液滴を形成させて、これを多価のカチオンと接触させることにより個々のマイクロカプセルを形成させ、次いで、マイクロカプセルの表面をポリアミノ酸で架橋して、カプセル化された材料の周りに半透性膜を形成させる。
ポリホスファゼンは、交互の単結合および二重結合により分離された窒素およびリンからなる骨格を有するポリマーである。架橋のために好適なポリホスファゼンは、その大部分が酸性であって二価または三価のカチオンと塩架橋を形成することができる側鎖基を有する。好ましい酸性の側鎖基の例は、カルボン酸基およびスルホン酸基である。加水分解により分解するポリマーは、イミダゾール、アミノ酸エステル、またはグリセロール側鎖基を組み込むことにより、合成することができる。例えば、ポリアニオン性ポリ［ビス（カルボキシレートフェノキシ（carboxylatophenoxy））］ホスファゼン（ＰＣＰＰ）を合成することができ、これは、水性培地中で、室温以下で、溶解した多価カチオンで架橋されて、ハイドロゲルマトリックスを形成する。
荷電された側鎖基を有する水溶性ポリマーは、ポリマーを、逆の電荷の多価イオン（ポリマーが酸性の側鎖基を有する場合には多価のカチオン、またはポリマーが塩基性の側鎖基を有する場合には多価のアニオンのいずれか）を含む水溶液と反応させることにより、イオン的に架橋される。ハイドロゲルを形成させるための、酸性の側鎖基を有するポリマーの架橋のために好ましいカチオンは、銅、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、亜鉛およびスズなどの二価および三価のカチオンであるが、アルキルアンモニウム塩などの二官能性、三官能性または四官能性の有機カチオン。これらのカチオンの塩の水溶液を、ポリマーに添加して、軟質の、高度に膨潤したハイドロゲルおよびメンブレンを形成させる。カチオンの濃度が高いか、または原子価が高いほど、ポリマーの架橋の程度が大きい。わずか０．００５Ｍからの濃度が、ポリマーを架橋させることが示されいている。より高い濃度は、塩の溶解度により限定される。
好ましくは、ポリマーを、水溶液、好ましくは０．１Ｍのリン酸カリウム溶液中で、生理学的なｐＨにおいて、ポリマーハイドロゲルを形成する濃度、例えば、アルギネートについては０．５～２重量％、好ましくは１％のアルギネートまで、溶解する。単離された細胞を、ポリマー溶液中で、１，０００，０００～１０，０００，０００細胞／ｍｌ、最も好ましくは１０，０００，０００～２０，０００，０００細胞／ｍｌの濃度に懸濁する。
一態様において、細胞を、ハイドロゲル溶液と混合し、ハイドロゲルの硬化の前に、それが移植された細胞にとって所望される部位中に、直接的に注射する。しかし、特定の適用に合わせるために、マトリックスはまた、鋳型成型（mold）して、身体の１つ以上の異なる領域に移植してもよい。この適用は、特定の構造的設計が所望される場合、または細胞が移植されるべき領域が、細胞の生育および増殖を促進するための特定の構造または支持体を欠く場合に、特に適切である。
細胞が移植されるべき部位は、個々の必要性に基づいて決定され、必要とされる細胞の数も同様である。注射された溶液を成形するために、外的な鋳型を適用することができる。加えて、重合の速度を制御することにより、細胞－ハイドロゲルを注入されたインプラントを鋳型成型することが可能である。あるいは、混合物を鋳型中に注入し、ハイドロゲルを硬化させ、次いで、材料を移植してもよい。
嵩高剤が所望される場合、特に軟組織が欠損する場合はいつでも、懸濁液を、シリンジおよび針を介して、特定の領域中に直接的に注射することができる。懸濁液はまた、骨または軟骨の欠損などの硬組織の欠損（先天的もしくは後天的な疾患状態、または外傷、熱傷などに続発するもののいずれであっても、）のための嵩高剤として、注射することができる。これの一例は、外傷に続発的な骨の変形が存在する頭蓋骨の周囲の領域への注射であろう。これらの例における注射は、必要とされる領域中に、針およびシリンジの使用により、局所または全身麻酔下において、直接的に行うことができる。
真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、下でより詳細に記載されるように、治療適応症において有用であるタンパク質を発現するように改変してもよい。例えば、細胞は、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の分化系列への分化をさらに誘導または促進する、少なくとも１つの生理活性因子を生成する核酸を含んでもよい。骨が形成されている例において、生理活性因子は、多様な組織増殖因子、特に骨形態形成タンパク質を含むＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのメンバー、例えば、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－３、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６およびＢＭＰ－７からなる群より選択される少なくとも１つであってもよい。
本発明の細胞は、in vitroでＴ細胞アネルギーを誘導するための方法において有用であり得る。Ｔ細胞アネルギーの誘導は、抗原の存在下において、Ｔ細胞および／またはＴ細胞前駆体の形成を誘導するため、ならびに形成されたＴ細胞および／またはＴ細胞前駆体の活性化を阻害するために十分な条件下において、真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞を培養することを含む。アネルギーは、Ｔ細胞の非応答性の状態として定義される（すなわち、それらは、再刺激に対してＩＬ－２を生成することができないか、再刺激された場合に増殖する）（Zamoyska R, Curr Opin Immunol, 1998, 10(1):82-87; Van Parijs L, et al., Science, 1998, 280(5361):243-248；Schwartz RH, Curr Opin Immunol, 1997, 9(3):351-357；Immunol Rev, 1993, 133:151-76）。アネルギーは、処置されたＴ細胞を採取して、それらをＡＰＣの存在下において抗原で再刺激することにより、測定することができる。細胞がアネルギー性である場合、それらは、ＡＰＣに関して適切な濃度における抗原に対して、応答しないであろう。
本明細書において用いられる場合、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類である。ヒト真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞およびヒト対象は、特に重要な態様である。
本明細書において記載される本発明のなおさらなる側面において、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、目的の遺伝子により、遺伝子操作（または形質導入もしくは遺伝子導入）してもよい。形質導入された細胞は、例えば遺伝子障害または疾患を処置するために、それを必要とする患者に投与することができる。
合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞およびその子孫は、遺伝子的に改変されていてもよい。合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の遺伝子改変は、外来遺伝子材料の添加により作製される細胞の遺伝子材料の全ての一過性および安定性の変化を含む。遺伝子改変の例は、変異したかまたは発現しない遺伝子を置き換えるための機能的遺伝子の導入、ドミナントネガティブな遺伝子産物をコードするベクターの導入、リボザイムを発現するように操作されたベクターの導入、および治療用遺伝子産物をコードする遺伝子の導入などの、任意の遺伝子治療の手順を含む。任意の剤の導入を伴わないＴ細胞受容体遺伝子の自発的再配列などの天然の遺伝子の変化は、この概念においては含まれない。外来遺伝子材料は、天然または合成のいずれかの、核酸またはオリゴヌクレオチドであって、真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞中に導入されるものを含む。外来遺伝子材料は、細胞中に天然に存在するもののコピーであってもよく、または、細胞において天然には見出されないものであってもよい。それは、典型的には、天然に存在する遺伝子の少なくとも一部であって、ベクターコンストラクト中でプロモーターの作動的制御下に置かれたものである。
核酸を細胞中に導入するために、多様な技術を用いることができる。かかる技術は、核酸－ＣａＰＯ４沈殿物の遺伝子導入、ＤＥＡＥに関連する核酸の遺伝子導入、目的の核酸を含むレトロウイルスによる遺伝子導入、リポソーム媒介性遺伝子導入などを含む。特定の使用のために、核酸を特定の細胞にターゲティングすることが好ましい。かかる例において、本発明による核酸を細胞に送達するために用いられるビヒクル（例えば、レトロウイルス、または他のウイルス；リポソーム）は、それに結合したターゲティング分子を有していてもよい。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に対して特異的な抗体または標的細胞上の受容体に対するリガンドなどの分子を、核酸送達ビヒクルに結合させるか、またはこれの中に組み込むことができる。例えば、本発明の核酸を送達するためにリポソームが使用される場合、ターゲティングのため、および／または取り込みを促進するために、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム処方物中に組み込んでもよい。かかるタンパク質として、特定の細胞型に向性を有するタンパク質またはそのフラグメント、循環中に内部移行を起こすタンパク質に対する抗体。細胞内局在を標的として細胞内半減期を増強するタンパク質などが挙げられる。ポリマー性の送達系もまた、核酸を細胞中に首尾よく送達するために用いられてきたことは、当業者に公知のとおりである。かかる系は、核酸の経口送達すら許容する。
外来遺伝子材料を真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞中に導入する一方法は、細胞に、複製欠損レトロウイルスを用いて形質導入することによる。複製欠損レトロウイルスは、全てのビリオンタンパク質の合成を指揮することができるが、感染性粒子を作製することはできない。したがって、これらの遺伝子改変されたレトロウイルスベクターは、培養細胞における高効率な遺伝子の形質導入のために、一般的な有用性を有する。レトロウイルスは、遺伝子材料を細胞中にトランスファーするために、広範に使用されてきた。複製欠損レトロウイルスを生成するための標準的なプロトコル（外来遺伝子材料のプラスミド中への組み込み、プラスミドによるパッケージング細胞株の遺伝子導入、パッケージング細胞株による組み換えレトロウイルスの生成、組織培養培地からのウイルス粒子の回収、およびウイルス粒子による標的細胞の感染のステップを含む）は、当該分野において提供される。
レトロウイルスを用いることの主な利点は、ウイルスが、治療剤をコードする遺伝子の単一のコピーを宿主細胞のゲノム中に効率的に挿入し、それにより、外来遺伝子材料が、細胞が分裂する際に、その子孫へと伝えられることを可能にすることである。加えて、ＬＴＲ領域中の遺伝子プロモーター配列は挿入されたコード配列の発現を増強することが、多様な細胞型において報告されている。レトロウイルス発現ベクターを用いることの主な欠点は、（１）挿入変異、すなわち、例えば制御されない細胞増殖をもたらす、標的細胞ゲノム中の望ましくない位置への治療用遺伝子の挿入、および（２）ベクターにより担持される治療用遺伝子が標的ゲノム中に組み込まれるために、標的細胞の増殖を必要とすること、である。これらの明らかな限定要因にもかかわらず、レトロウイルスを介した治療有効量の治療剤の送達は、形質導入の効果が高いか、および／または形質導入のために利用可能な標的細胞の数が高い場合には、効果的である。
真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の形質転換のための発現ベクターとして有用なさらに別のウイルス候補は、二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスである。レトロウイルスと同様に、アデノウイルスゲノムは、遺伝子の形質導入のための発現ベクターとしての使用のために、すなわち、ウイルス自体の生成を制御する遺伝子情報を取り除くことにより、適応可能である。アデノウイルスは、通常、染色体外の様式において機能するので、組み換えアデノウイルスは、挿入変異の理論的問題を有しない。一方、標的真皮間葉系幹細胞のアデノウイルスによる形質転換は、安定な形質導入をもたらさない場合がある。しかし、より最近になって、特定のアデノウイルスの配列が、キャリア配列に染色体内組み込み特異性を付与し、それにより、外来遺伝子材料の安定な形質導入をもたらすことが報告されている。
したがって、当業者には明らかであろうとおり、多様な好適なベクターが、外来遺伝子材料を真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞中にトランスファーするために利用可能である。遺伝子置換治療を受入可能な特定の状態のための治療剤を送達するための適切なベクターの選択、および選択された発現ベクターの細胞中への挿入のための条件の最適化は、当業者の技術の範囲内であり、過度の実験を必要としない。プロモーターは、特徴的に、転写を開始させるために必要な特定のヌクレオチド配列を有する。任意に、外来遺伝子材料は、所望される遺伝子転写活性を得るために必要とされるさらなる配列（すなわち、エンハンサー）を、さらに含む。この議論の目的のために、「エンハンサー」とは、単純に、任意の翻訳されないＤＮＡ配列であって、コード配列と（シスで）近接して働き、プロモーターにより指示される基線の転写レベルを変化させるものである。好ましくは、外来遺伝子材料は、コード配列の転写を可能にするために、プロモーターとコード配列とが作動的に連結されるように、プロモーターのすぐ下流において真皮間葉系幹細胞ゲノム中に導入される。好ましいレトロウイルス発現ベクターは、挿入された外来遺伝子の転写を制御するために、外来プロモーターエレメントを含む。かかる外来プロモーターは、構成的および誘導性プロモーターの両方を含む。
天然に存在する構成的プロモーターは、必須の細胞機能の発現を制御する。結果として、構成的プロモーターの制御下の遺伝子は、細胞増殖の全ての条件下において発現される。例示的な構成的プロモーターとして、特定の構成的または「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子のためのプロモーターが挙げられる：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（Scharfmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4626-4630 (1991)）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、アクチンプロモーター（Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10006-10010 (1989)）、および当業者に公知の他の構成的プロモーター。加えて、多くのウイルスプロモーターは、真核細胞において、構成的に機能する。これらは、以下を含む：ＳＶ４０の初期および後期プロモーター；モロニーマウス白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの末端反復配列（ＬＴＲＳ）；ならびに単純ヘルペスウイルスのチジミンキナーゼプロモーター、その他多数。したがって、上で言及される構成的プロモーターのうちの任意のものを、異種遺伝子インサートの転写を制御するために用いることができる。
誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導剤の存在下においてのみ、または誘導剤の存在下においてはより大きな程度まで、発現される（例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下における転写は、特定の金属イオンの存在下において大きく増加する）。誘導性プロモーターは、その誘導因子が見出される場合に転写を刺激する応答エレメント（ＲＥ）を含む。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸およびサイクリックＡＭＰについてのＲＥが存在する。特定のＲＥを含むプロモーターを、誘導型応答を得るために選択することができ、およびいくつかの場合においては、ＲＥ自体は異なるプロモーターに結合していてもよく、それにより、組み換え遺伝子に対して誘導性を付与するものであってもよい。したがって、適切なプロモーター（構成的・対・誘導性；強い・対・弱い）を選択することにより、遺伝子改変された真皮間葉系幹細胞において、治療剤の存在および発現のレベルの両方を制御することが可能である。特定の治療剤の治療有効用量の送達のためのこれらの要因の選択および最適化は、過度の実験を伴うことなく、上で開示される要因および対象の臨床プロフィールを考慮して、当業者の技術の範囲内であると考えられる。
少なくとも１つのプロモーターおよび治療剤をコードする少なくとも１つの異種核酸に加えて、発現ベクターは、好ましくは、発現ベクターにより遺伝子導入または形質導入されている真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の選択を容易にするための選択遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子を含む。あるいは、真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞を、２つ以上の発現ベクター、治療剤をコードする遺伝子を含む少なくとも１つのベクター、選択遺伝子を含む別のベクターで遺伝子導入する。好適なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子および／またはシグナル配列の選択は、過度の実験を伴うことなく、当業者の技術の範囲内であると考えられる。
単離された真皮間葉系幹細胞において特定の遺伝子産物を発現するための特定の発現ベクターの選択および最適化は、好ましくは１つ以上の適切な制御領域（例えば、プロモーター、挿入配列）を有する遺伝子を得ること；遺伝子が挿入されるベクターを含むベクターコンストラクトを調製すること；培養された真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞をin vitroでベクターコンストラクトにより遺伝子導入または形質導入すること；および、培養された細胞において遺伝子産物が存在するか否かを決定することにより達成される。
したがって、本発明は、真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞を、ヒト幹細胞においては通常は生物学的に顕著な量では生成されないか、または少量で生成されるが、過剰生成が治療上の利益をもたらす状況にある、ポリペプチド、ホルモンおよびタンパク質を生成するような様式において、遺伝子操作することを可能にする。これらの産物は、次いで、血流中、または中枢神経系などの身体の他の領域に分泌される。この方法において形成されたヒト幹細胞は、必要とされる物質の周期的投与を必要とする（内服、注射、デポー注入など）現在のレジメンを置き換える持続的な薬物送達系として役立ち得る。本発明は、ホルモン、酵素および薬物を、かかる物質を必要とするヒトに提供することにおいて有用性を有する。それは、長期間にわたる持続用量において必要とされるホルモン（例えば、副甲状腺ホルモン、インスリン）などのかかる物質を提供することにおいて有用である。
例えば、それは、インスリンの連続送達を提供するために用いることができ、結果として、毎日のインスリンの注射が必要なくなるであろう。遺伝子操作されたヒト合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞はまた、因子ＶＩＩＩなどの凝固因子の生成のために、または、筋ジストロフィーのための筋肉細胞へのジストロフィンの連続送達のために、用いることができる。
真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞中への目的の遺伝子材料の組み込みは、遺伝性または後天的な疾患の処置において有用である。遺伝性疾患の場合、このアプローチは、遺伝子改変されたヒト合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞、およびメタボリックシンクとして用いることができる他の細胞を提供するために用いられる。すなわち、かかる真皮合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞は、潜在的に毒性の物質を分解するために役立つであろう。例えば、これは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼの欠損に起因する高フェニルアラニン血症；シスタチオニンベータ－シンターゼの欠損に起因するホモシステイン血症を含むアミノ酸異化の障害を処置するために用いることができる。
本発明は、その適用において、以下の説明において記載されるか、または図面において説明される構造および組成の配列の詳細に限定されない。本発明は、他の態様が可能であり、多様な方法において実施されるかまたは実行されることが可能である。また、本明細書において用いられる表現法および用語法は、説明を目的とするものであり、限定するものとしてみなされるべきではない。「含むこと（including）」、「含むこと（comprising）」、または「有すること（having）」、「含むこと（containing）」、「含むこと（involving）」およびそれらのバリエーションの使用は、本明細書において、その後に列記される項目およびそれらの均等物ならびにさらなる項目を包含することを意図される。
例
ここで、ＡＴＰ発現カセットサブファミリーＢメンバー５（ＡＢＣＢ５）を発現する新たに同定された真皮細胞分集団の、非治癒性の創傷の治療のために有益な効果を報告した。真皮ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの局所投与は、ヒト静脈性下肢潰瘍の非治癒性の状態を模倣する鉄過剰症マウスモデルにおいて、マクロファージにより支配される炎症を弱め、それにより全層切除創傷の治癒を促進した。観察された有益な効果は、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣにより分泌されたインターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ＲＡ）に起因し、これは、創傷部位において、炎症を弱め、無制限の炎症促進性Ｍ１マクロファージの割合を、修復を促進する抗炎症性Ｍ２マクロファージへとシフトさせた。ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣにより放出されたＩＬ－１ＲＡのヒト創傷マクロファージに対する有益な抗炎症効果は、ヒト化されたＮＯＤ－スキッドＩＬ２ｒγｎｕｌｌマウスにおいて保存された。結論として、ヒト真皮ＡＢＣＢ５＋細胞は、新規の、容易にアクセス可能であり、マーカーが濃縮されたＭＳＣのソースを表し、これは、ヒトにおいて慢性の非治癒性の創傷を首尾よく処置するために、実質的な見込みを保持する。
単分子マーカーであるＡＴＰ発現カセットタンパク質ＡＢＣＢ５は、多能性の間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の特徴を有する皮膚の真皮細胞分集団を、その内部微小環境から単離するために、用いることができる。ＡＢＣＢ５＋ＭＳＣは、大規模なin vitroでの増殖培養の間、それらの幹細胞性および間葉系マーカーのほとんどを維持するのみならず、クローン自己再生のための能力は、重要なことに、マウスモデルにおいて、非治癒性の鉄過剰症創傷の治癒を促進し、これは、ヒト患者における慢性静脈性下肢潰瘍のための潜在的な再生治療として利用することができる。
ヒトおよびマウスの真皮は、血管周囲および濾胞間微小環境（interfollicular niche）において、ＡＢＣＢ５＋間質細胞を内包する。
健康なヒト皮膚切片の免疫染色を用いて、ＡＢＣＢ５＋細胞が、真皮を含む様々な成体組織においてＭＳＣ上で発現することが先に報告されている［１１、１２、１３］、胚性生殖細胞および幹細胞のマーカーである［１０］、炭水化物ステージ特異的胎児抗原－４（ＳＳＥＡ－４）と共染色することを示した。
興味深いことに、ＡＢＣＢ５＋細胞は、ＣＤ３１＋内皮細胞と緊密に関連して血管周囲の内部微小環境に限局するか、または毛包に依存せず濾胞間の真皮中に分散していた。ＡＢＣＢ５＋細胞は、１０人の異なるドナーの皮膚中の全真皮細胞のうちの２．４５％±０．６１％を構成し、ＡＢＣＢ５＋細胞のうち、５５．３％±２３．９％は、血管周囲に局在し、これは、ＣＤ３１＋内皮細胞とＡＢＣＢ５＋細胞との間の最大で１つのさらなる細胞により定義した。二重免疫染色されたヒト皮膚切片においてＮＧ２とＡＢＣＢ５との共局在はほとんど存在しなかったので、血管周囲ＡＢＣＢ５＋細胞は、ニューロン／膠細胞抗原２（ＮＧ２）陽性周皮細胞［１４］から区別し得た。それらの内部微小環境におけるＡＢＣＢ５＋細胞の同様の分布を、マウス皮膚において見出した。
さらに、ＡＢＣＢ５＋リッチなＭＳＣからのＲＮＡ配列分析は、高い継代数までの培養において増殖した場合であっても、区別し得る幹細胞性ならびに間葉系マーカーの遺伝子の発現を明らかにした。さらに、ヒト皮膚中のＡＢＣＢ５＋細胞における、ＳＳＥＡ－４、ＤＰＰ４（ＣＤ２６）、ＰＲＤＭ１（ＢＬＩＭＰ１）およびＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ－４）などの選択された幹細胞性マーカーの、タンパク質レベルでの発現を、免疫染色により確認した。一方、より低い線維芽細胞系列のマーカーであるα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）の発現は、ヒト皮膚のＡＢＣＢ５＋細胞においては不在であった。まとめると、これらの結果は、ＡＢＣＢ５＋細胞の幹細胞性の特性を支持し、これは、in vitroで少なくとも部分的に維持され、非治癒性の創傷の処置のために治療的に利用することができる。
ヒト真皮ＡＢＣＢ５細胞は間葉系幹細胞特性を明らかにする
ＡＢＣＢ５についての選択が、ＭＳＣ特性を有する細胞画分をもたらすか否かを評価するために、酵素により消化された皮膚に由来する真皮シングルセル懸濁液を、複数回のＡＢＣＢ５磁気ビーズ選別により分離した。これは、平均で９８．３３％±１．１２％のＡＢＣＢ５＋細胞を含む二倍ＡＢＣＢ５濃縮画分、およびドナーＢ０１からの細胞についてのフローサイトメトリードットプロットで図示されるとおり（表１Ａ－Ｂ）非常に低いパーセンテージのＡＢＣＢ５＋細胞のみを含む３倍ＡＢＣＢ５－枯渇画分の、２つの異なる細胞画分をもたらした。ＡＢＣＢ５＋およびＡＢＣＢ５－画分のいずれも、線維芽細胞様細胞（fibroblastoid）を示し、紡錘様の細胞形態学、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ７３の特徴的な最小限の間葉系系列マーカーのセットを発現したが、一方、造血幹細胞および系列のマーカーＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ２０およびＣＤ４５［１５］の発現は、フローサイトメトリーによっては検出されなかった。ＡＢＣＢ５＋細胞について、ドナーが一致するＡＢＣＢ５枯渇細胞と比較して、脂肪生成性、骨原性および軟骨形成性の系列への分化についての一貫した、および著しく増大した能力が観察され、それにより、ＡＢＣＢ５＋画分を、ＡＢＣＢ５－ヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）からの多能性の成人のＭＳＣとして描写する。これは、ＡＢＣＢ５＋により選別された細胞は、シングルセル由来のコロニーを生じたが、一方、ＡＢＣＢ５枯渇画分はこれを生じなかったという知見により、さらに確認された。真皮ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣのin vitroでの自己再生能力を評価するために、６人の異なるドナーからのＡＢＣＢ５＋で選別されたＭＳＣの５４個のクローン培養物のサブクローン原性（subclonogenic）増殖および三系列分化の能力を決定した。興味深いことに、クローンコロニーのうちの７５．６１±１６．８６％が、再び、クローン原性増殖およびシングルセルから生じた全ての研究されたクローンのうちの６２．４０±７．５４％を示し、３つ全ての間葉系細胞系列に分化するそれらの能力を維持した。これらのクローンのうちのさらなる２９．８４±１１．５７％は、二分化能であり、７．７７±１０．０２％は骨原性分化についての単分化能であった。６人のドナーからのクローンのうちのいずれも、３つ全ての系列に対して陰性ではなかった。２００個を超える研究されたシングルセルクローンにおいて３４％の三系列分化能力を有する骨髄由来ＭＳＣの至適基準と比較した場合［１６］、ＡＢＣＢ５＋皮膚由来ＭＳＣににおける＞７０％の三系列分化能力は、明らかにより良好であった。
三重ＡＢＣＢ５枯渇細胞とは対照的に、ＡＢＣＢ５＋で選別された細胞画分は、ＳＳＥＡ－４［１７］の発現に関連する区別し得る幹細胞を明らかにした。これは、ヒト皮膚においてＡＢＣＢ５＋細胞のＳＳＥＡ－４とが共発現したという観察と一致する。スライドグラス上で増殖させたＡＢＣＢ５＋細胞の核は、ＳＯＸ２（幹細胞関連転写因子である性決定領域Ｙ－ボックス２）について陽性に染色されたが、一方、ＡＢＣＢ５－細胞は、そうではなかった。ＡＢＣＢ５＋またはＡＢＣＢ５－のいずれの真皮のプラスチック接着細胞画分も、加えて試験された細胞表面マーカーであるメラン－Ａ（メラニン細胞）、ＣＤ１３３（癌幹細胞）、ＣＤ３１８（上皮細胞）およびＣＤ２７１（他のＭＳＣ集団において見出される神経栄養因子）を発現しなかった。
ヒトＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣは、Ｍ１からＭ２へのマクロファージの切り替えを引き起こすことを通して鉄過剰症マウスにおいて創傷治癒を促進する
ここで特徴づけられた真皮ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣが、古典的に活性化されたＭ１マクロファージに対して抗炎症効果を発揮するか否かに取り組むために、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを、組み換えヒトＩＦＮ－γおよびＬＰＳで活性化された同種のＰＢＭＣ ＣＤ１４＋単球由来マクロファージと共培養した。注目すべきことに、活性化されたマクロファージをＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを共培養した場合に、ドナーが一致するＡＢＣＢ５－ＨＤＦまたは単独で培養されたマクロファージと共培養した場合と比較して、著しくより少ないＭ１マクロファージ由来炎症促進性サイトカインＴＮＦαおよびＩＬ－１２／ＩＬ－２３ｐ４０が上清中で検出された。逆に、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣと共培養したマクロファージの上清中で、ドナーが一致するＡＢＣＢ５－ＨＤＦまたは単独で培養されたマクロファージと比較して、増大した量のＩＬ－１０（Ｍ２マクロファージ由来抗炎症性サイトカイン）が見出された。注目すべきことに、６人の異なるドナーからプールされたＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣは、単一のＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣと比較した場合に、Ｍ１マクロファージサイトカインに対して、類似の抑制性作用と、同時にＭ２マクロファージサイトカインＩＬ－１０の上方調節を明らかにした。これらのデータは、プールされたＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの調製物が、臨床ルーチンにおいて、非治癒性の創傷の処置のための現実的に妥当な選択肢であろうことを暗示する。
ヒトＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣとヒトマクロファージとの共培養と同様に、ヒトＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣは、異種間のセッティングにおいて、マウスマクロファージに対して同一の効果を発揮し、それにより、その後のマウス異種移植モデルにおける創傷治癒研究についての機能的関連性を確認する。
次に、（それらの無制限の活性化に起因して）慢性ヒト創傷の非治癒性の状態の原因であるＭ１マクロファージの抑制に対する、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣのパラクリン効果を特に検討するために、異種移植セッティングにおいて全層切除創傷を有する、鉄過剰症マウスモデルを使用した［７］。鉄過剰症創傷モデルは、慢性静脈性下肢潰瘍の主な病態的側面を忠実に再現する［７］。ＡＢＣＢ５＋由来およびＡＢＣＢ５枯渇の真皮ヒト細胞を、創傷形成（wounding）の１日後に創傷の輪郭の周りの真皮中に注射した。創傷形成の３日後における注射されたヒト細胞の残留性を、ヒト主要組織適合性複合体Ｉ定常サブユニットβ２－ミクログロブリン（β２Ｍ）についての免疫染色により確認した。創傷切片から単離されたゲノムＤＮＡに対するヒト特異的ベータアクチン配列のＰＣＲにより、ヒト特異的ベータアクチンシグナルの残留性は、ＡＢＣＢ+由来ＭＳＣまたはＡＢＣＢ５－細胞を注射した創傷において、示された時点において、類似の程度まで確認された。したがって、ＡＢＣＢ５＋細胞とＡＢＣＢ５－細胞との間の残留性の差異は、結果を交絡させない。
鉄過剰症モデルにおいてＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの注射が創傷閉鎖を促進するか否かという問題に、次に取り組んだ。予想されたとおり、鉄処置／ＰＢＳ注射マウスにおいて、デキストラン処置／ＰＢＳ注射対照マウスと比較して、創傷閉鎖の遅延が観察された。注目すべきことに、４つの創傷（マウス１個体あたり）周囲において、１０６のＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの真皮内注射の後で、ドナーが一致するＡＢＣＢ５－ＨＤＦまたはＰＢＳ単独の注射と比較して、著しく促進された創傷閉鎖が観察された。ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣによる処置は、デキストラン処置／ＰＢＳ注射対照マウスのものに対して、創傷閉鎖速度を完全に回復させた。
まとめると、これらの知見は、非治癒性の慢性創傷の治癒のためのＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの有益な効果を示唆する。
鉄過剰症マウスにおいて、ヒトＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣは、炎症を抑制し、全てのその後の創傷期を改善する
慢性創傷は、無制限のＭ１マクロファージ活性化により、炎症性創傷期において持続し、創傷治癒の正常相に進行することができない。ここでは、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの注射が、無制限のＭ１マクロファージ依存的炎症を抑制し、創傷が様々な創傷の相の正常な配列を追うことを可能にすることができるか否かを研究した。二重免疫染色を使用して、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣは、鉄過剰症創傷において注射された場合に、内在マウスマクロファージに緊密に関連することを見出し、このことは、創傷組織においてマクロファージに対するＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣのパラクリン効果が可能であることを暗示する。鉄過剰症創傷におけるマクロファージにより支配される炎症に対するＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣのパラクリンの影響を調べる第１の試みにおいて、全創傷サイトカインプロフィールを、タンパク質ライセートに対するＥＬＩＳＡにより研究した。注目すべきことに、創傷形成の後の第５日に、炎症性サイトカインＴＮＦαの創傷組織タンパク質レベルは弱まった。一方、抗炎症性ＩＬ－１０は、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを注射した鉄過剰症創傷において増加したが、ＡＢＣＢ５－ＨＤＦ対照を注射した場合にはそうではなかった。さらに、典型的には、ヒトＣＶＵにおいて、および鉄過剰マウスモデルにおいて上方調節される炎症性サイトカインであるＩＬ－１βは、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣによる処置の後で、著しく抑制された。
ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを注射した場合に、ＡＢＣＢ５－ＨＤＦを注射した創傷と比較して、第７日の鉄過剰症創傷において、首尾よい皮膚修復の重要な特徴である創傷床全体を被覆する完全に回復したＫ１４＋上皮細胞層による、より早い再上皮化もまた、観察された。血管新生の著しい改善が観察され、これは、第７日における創傷床中のＣＤ３１＋血管の出芽の数および面積の増大により確認された。加えて、鉄過剰症マウスの創傷の輪郭におけるＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの注射は、コラーゲン線維の成熟の増大により、組織リモデリングを著しく改善し、肉芽組織の深度を減少させ、より高密度にかご状に織られた繊維状構造におけるコラーゲン線維の組織化を改善した。注目すべきことに、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを注射された鉄過剰症創傷は、ＡＢＣＢ５－ＨＤＦまたはＰＢＳ処置された鉄過剰症創傷の瘢痕組織におけるより低い引っ張り強さと比較して、著しくより高い瘢痕組織の引っ張り強さを示し、これは、修復組織の質の改善についての強力な指標である。これらのデータは、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣが、いくつかの創傷治癒相に対して、正の影響を及ぼし、組織の修復を促進するのみならず、より重要なことには、瘢痕が減少し、質が改善した修復組織をもたらすことを示す。
ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣはＩＬ－１ＲＡの適応性分泌を介してマクロファージにより支配される炎症を抑制する
急性創傷において一過性に誘導された低いＩＬ－１β濃度と比較して、慢性創傷におけるＩＬ－１βおよびその炎症増幅性エフェクターであるＴＮＦα［７］の豊富さを考慮して、ヒト真皮ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣが、ＩＬ－１シグナル伝達の天然のアンタゴニストであるＩＬ－１ＲＡを生成することができるか否かに関する問題に取り組んだ。培養中の未刺激のＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣは、ＩＬ－１ＲＡを容易には生成しないことを見出し、これは、特異的ＥＬＩＳＡにより評価した。しかし、ドナーが一致するＡＢＣＢ５－ＨＤＦとは対照的に、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣは、ＩＦＮ－γ／ＬＰＳで刺激された場合に、高いＩＬ－１ＲＡレベルを放出した。注目すべきことに、ＩＬ－１ＲＡ濃度は、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣとＩＦＮ－γ／ＬＰＳで活性化されたＭ１マクロファージとの共培養において、さらにより高かった。注射の６時間後に、鉄過剰症マウスの創傷部位におけるＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣにおいて、特異的なＩＬ－１ＲＡ発現を観察し、これは、明確に共局在したヒト特異的β２ＭおよびＩＬ－１ＲＡによる二重免疫染色により示された。ウェスタンブロット分析を使用して、鉄過剰症のＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを注射された創傷から調製した、プールされた第３日の創傷ライセートにおいて、ＡＢＣＢ５－ＨＤＦにおいて、またはＰＢＳ注射対照創傷ライセートにおけるＩＬ－１ＲＡ発現の不在と比較して、高いＩＬ－１ＲＡ発現を確認した。注目すべきことに、および先には報告されていないこととして、ＩＬ－１ＲＡ発現はまた、鉄過剰症モデル創傷治癒における内在マウスＡＢＣＢ５＋ＭＳＣにおいても観察されたが、一方、健康な皮膚においては、マウスまたはヒトのいずれの内在ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣも、ＩＬ－１ＲＡを発現することは見出されなかった。これらのデータは、鉄過剰症創傷の炎症性環境に応答しての、真皮ＡＢＣＢ５＋ＭＳＣによるＩＬ－１ＲＡの適応性の生成を暗示する。マウスマクロファージの小さな画分は、鉄過剰症慢性創傷においてＩＬ－１ＲＡを放出するが、好中球はそうではない。鉄過剰症創傷の治癒の促進に対する、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣから放出されるＩＬ－１ＲＡの治療的影響は、しかし、著しくより重要である。なぜならば、ＩＬ－１ＲＡがサイレンシングされたＭＳＣは、，鉄過剰症創傷中に注射された場合に、創傷治癒の遅延を修復することができない。次に、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣにより放出されたＩＬ－１ＲＡが、Ｍ１マクロファージ由来のＴＮＦαの抑制の原因であるか否かを、in vitroおよびin vivoで調べた。ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを、ＩＬ－１ＲＡがサイレンシングされた、またはコンピテントなＡＢＣＢ５＋由来のＭＳＣのいずれかを注射された鉄過剰症マウスの創傷上清中のＴＮＦα放出について評価した。注目すべきことに、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣにおけるＩＬ－１ＲＡのサイレンシングは、ヒトまたはマウスのいずれかのマクロファージと共培養におけるＴＮＦαの抑制を、少なくとも部分的に抑止した。予想されたとおり、スクランブルされた対照ｓｉＲＮＡを遺伝子導入されたＩＬ－１ＲＡコンピテント対照ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣは、活性化されたマクロファージからのＴＮＦα放出に対するそれらの完全な抑制性効果をin vitroで明らかにした。驚くべきことに、鉄過剰症マウスの創傷の輪郭中へのＩＬ－１ＲＡをサイレンシングされたＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの皮内注射は、創傷閉鎖の促進の完全な喪失をもたらした。対照的に、スクランブルされたｓｉＲＮＡを遺伝子導入されたＩＬ－１ＲＡコンピテントＡＢＣＢ５＋ＭＳＣは、in vivoで、示された時点において、創傷治癒を促進するそれらの能力を維持した。ＩＬ－１ＲＡをサイレンシングされたＡＢＣＢ５＋ＭＳＣが鉄過剰症創傷の治癒を促進する能力の喪失は、ＴＮＦαおよびＩＬ－１βの抑制の逆転ならびにＩＬ－１０の上方調節と関連した。これらのデータは、創傷部位における刺激の後でＡＢＣＢ５＋ＭＳＣから適応性に放出されたＩＬ－１ＲＡは、ＩＬ－１シグナル伝達のみならず、下流のエフェクターＴＮＦαをもを抑制し、重要なことに、さらには抗炎症性のＩＬ－１０を誘導することを示す。創傷部位におけるＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣから放出されたＩＬ－１ＲＡが、無制限のＭ１活性化を抑制し、創傷治癒を改善するという考えは、鉄過剰症創傷の周囲での組み換えヒトＩＬ－１ＲＡの皮内注射もまた、創傷閉鎖を促進するという知見により、さらに支持される。対照的に、急性創傷中への組み換えＩＬ－１ＲＡの注射は、治癒を促進しなかった。ＴＳＧ－６もまた、鉄過剰症創傷におけるＡＢＣＢ５ヒトＭＳＣにおいて発現されることが見出された。しかし、組み換えＴＳＧ－６を鉄過剰症創傷中に注射した場合、創傷閉鎖の改善は起こらなかった。結果は、ＩＬ－１ＲＡは実際に鉄過剰症創傷において中心的役割を果たすが、一方、組み換えヒトＴＳＧ－６のみでは、鉄過剰症の状況において治癒を促進するために十分ではないことことを暗示する。このことは、様々な創傷の型が、それらの治癒の治療的促進のための区別し得る要件を明らかにすることを暗示する。
ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣは鉄過剰症マウスの創傷におけるＭ１マクロファージ残留を中断させる
ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣによる創傷処置が、鉄過剰症マウスの創傷におけるＭ１マクロファージの長期残留を、ＩＬ－１ＲＡ依存的に中断させるであろうという仮説を、さらに維持するために、第５日の創傷切片の一連の二重免疫染色を行った。実際に、ＴＮＦαを発現するＦ４／８０＋マクロファージは、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを注射された鉄過剰症創傷において実質的に不在であった。はっきりと対照的に、多くのＴＮＦα＋Ｆ４／８０＋二重陽性マクロファージは、ＩＬ－１ＲＡをサイレンシングされたＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの注射後に、創傷の周辺部において残留し、これは、デキストランで前処置された急性治癒対照マウスと同様であった。これらのデータは、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣは、in vivoで、創傷マクロファージにより放出されるＴＮＦαの生成を、ＩＬ－１ＲＡ依存的に抑制することを示す。興味深いことに、ＣＤ２０６＋Ｆ４／８０＋創傷治癒促進性Ｍ２マクロファージは、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを注射された創傷において、創傷形成の５日後において、ＩＬ－１ＲＡ依存的に濃縮されると考えられる。実際に、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを注射された第５日の創傷のシングルセル調製物の免疫表現型決定は、炎症性Ｍ１の創傷治癒促進性Ｍ２マクロファージへのＩＬ－１ＲＡ依存的な切り替えを定量的に確認し、これは、表面マーカーの区別し得るセットにより定義される。したがって、Ｆ４／８０＋創傷マクロファージにおいて、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣ注射の後で、サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ－１２／ＩＬ－２３ｐ４０）および誘導型一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ２）を含むＭ１活性化マーカーは下方調節され、マンノース受容体ＣＤ２０６、β－グリカンデクチン－１およびアルギナーゼ－１（ＡＲＧ１）のようなＭ２活性化マーカーは上方調節された。このＭ１からＭ２へのシフトは、スクランブルされたｓｉＲＮＡを遺伝子導入されたＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣにおいて維持されたが、一方、ＩＬ－１ＲＡ ｓｉＲＮＡを遺伝子導入されたＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを注射した後で、それはほぼ完全に抑止された。まとめると、これらの結果は、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣにより分泌されるＩＬ－１ＲＡが慢性創傷におけるＭ１マクロファージの残留を抑止することについての原因的役割を明らかにする。
ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣ依存的なＭ１からＭ２へのマクロファージシフトは、ヒト化されたＮＳＧマウスにおいて保存される
ＰＢＭＣでヒト化されたＮＳＧマウスは、ヒト造血系列由来細胞に対するin vivoでの治療的介入の効果を検討するための、高度に好適な前臨床モデルを表す［１８］。このモデルを個々で使用して、ＮＳＧ鉄過剰症マウスにおけるヒト由来のＭ１／Ｍ２創傷マクロファージ表現型に対するＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの注射の効果を評価した。この目的のために、ＰＢＭＣでヒト化されたＮＳＧマウスに全層創傷を与え、その後、ヒト同種ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣ、ドナーが一致するＡＢＣＢ５－ＨＤＦ、またはｗｉｔｈ ＰＢＳのみのいずれかを、創傷の輪郭中に皮内注射した。上の知見と一致して、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの注射により、ＰＢＳおよびＡＢＣＢ５－ＨＤＦ注射と比較して、ＰＢＭＣ－ヒト化されたＮＳＧマウスにおける創傷の、全層創傷の閉鎖の促進が観察された。ヒト特異的抗ＣＤ６８と抗ＣＤ２０６または抗ＴＮＦαのいずれかとによる第５日の創傷の共免疫染色は、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを注射された創傷床において、ＰＢＳを注射された創傷と比較して、より多数のＣＤ６８＋ＣＤ２０６＋ヒトＭ２マクロファージを示した。注目すべきことに、ＣＤ６８＋ＴＮＦα＋炎症促進性マクロファージの数は、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣにおいて、ＰＢＳを注射された創傷と比較して、減少した。創傷部位におけるヒトＣＤ６８＋Ｍ１およびＭ２マクロファージの数を確認するために、第５日の創傷組織に由来するシングルセル懸濁液を、多色フローサイトメトリーにより分析した。ヒトのＭ１に対してＭ２のマクロファージマーカーを発現するＣＤ６８＋ヒトマクロファージの比は、デクチン－１／ＩＬ－１２ｐ４０およびＣＤ２０６／ＴＮＦαを発現する細胞の両方の比について、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣで処置された創傷組織において、ＰＢＳと比較して増大した。これらのデータは、ヒト創傷マクロファージに対するＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣから放出されたＩＬ－１ＲＡの有益な抗炎症性効果が、ヒト化されたＮＯＤ－スキッドＩＬ２ｒγｎｕｌｌマウスにおいて保存されたことを示す。
考察
本明細書において、ＭＳＣの特徴を有する新たに定義された皮膚の真皮細胞分集団を、単一のマーカー、Ｐ－糖タンパク質ＡＢＣＢ５により、高い純度および均一性で、その内部微小環境から首尾よく単離することができることを報告する。単離されたＡＢＣＢ５＋ ＭＳＣ分集団は、クローン性自己再生およびクローン性の三系列分化の能力をin vitroで確実に維持する。主要な先に報告されていない知見は、慢性鉄過剰症創傷において、新たに記載されるＡＢＣＢ５＋系列由来ＭＳＣの創傷周辺での注射が（パラクリンＩＬ－１ＲＡ放出を介して）、無制限の活性化を有する炎症促進性Ｍ１マクロファージを、抗炎症性創傷修復促進性のＭ２マクロファージに切り替え、結果として、損なわれた創傷治癒をin vivoで促進する（図面による要約）ということである。このことは、これまで（適切な選択マーカーの不在に起因して）、不整合な有効性および効力を有する、より特徴づけられていないＭＳＣ集団の治療的適用に苦しんできた［１９］トランスレーショナル医療における、ＭＳＣベースの治療の最先端における主要な前臨床ブレークスルーを構成する。
ＭＳＣを皮膚から高い均一性で単離および増殖することの利点は、ＡＢＣＢ５が、ＭＳＣにおいて排他的に発現するが、皮膚における他の細胞においては発現しないことに依存する。網羅的なトランスクリプトミクスのアプローチを使用して、ＭＳＣの特徴的な細胞表面発現プロフィールを有する真皮ＡＢＣＢ５＋細胞の存在を、本明細書において確認し［１、１５］、さらなる多能性および幹細胞マーカーとの共発現を、本明細書において報告する（１０～１３）。エビデンスはまた、ＡＢＣＢ５＋リッチなＭＳＣが（高い継代数まで培養中で増殖される場合であっても）、少なくとも部分的に、それらの幹細胞性である、皮膚中の内在ＡＢＣＢ５＋細胞のＭＳＣおよび間葉系マーカーの発現を維持するというＲＮＡ配列分析からも提供される。しかし、内在ＡＢＣＢ５＋ＭＳＣおよびその誘導体が、先に特徴づけられている線維芽細胞系列と関係を有するか否かは、不明である［２０、２１］。実際に、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣにおける、Ｂリンパ球の成熟マーカーであるＰｒｄｍ１／Ｂｌｉｍｐ－１ならびに増殖因子、ケモカイン、神経ペプチドおよび血管作動性ペプチドなどのペプチドからジペプチドを切断するジペプチジルペプチダーゼであるＣＤ２６／Ｄｐｐ４のような、ＰＤＧＦα線維芽細胞系列を追跡するマウスのいくつかの上位系列マーカーの発現［２０］が見出された。しかし、ＡＢＣＢ５＋細胞と、皮膚における下位の瘢痕促進性線維芽細胞系列マーカーであるαＳＭＡ＋との共発現は見出されなかった［２０］。これらのデータは、本明細書において使用されるＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣが、瘢痕を軽減する上位系列の線維芽細胞のいくつかの発現の特徴を共有する場合があることを示唆する。それらの発現プロフィールに関して、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣのエングレイルド（Engrailed）－１由来線維芽細胞系列との関係は、除外することができない［２１］。
線維芽細胞系列との正確な関係には依存せず、主な意図は、ＡＢＣＢ５を、皮膚からのＭＳＣの濃縮のための単一マーカーとして使用し、これを処置が難しい創傷においてＭＳＣベースの治療のために利用することであった。実質的に全ての研究された鉄過剰症創傷の相における、損なわれた創傷治癒の印象的なレスキューは、実際に、注射されたＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣからの増強されたＩＬ－１ＲＡの放出に依存し、これは、支配的な好ましくないＭ１マクロファージを創傷治癒促進性のＭ２マクロファージへと能動的にシフトさせた。この知見は、ヒトにおいて処置することが困難な慢性創傷において損なわれた創傷治癒を引き起こす炎症促進性Ｍ１マクロファージの無制限の活性化の共有された病原性の役割を考慮すると、特に臨床的に興味深い［７、８、２２］。いくつかの系統のエビデンスが、この知見を支持する。
第１に、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの注射は、鉄過剰症マウスにおいて損なわれた創傷治癒の修復の増強をもたらすが、ＡＢＣＢ５枯渇真皮細胞の注射は、これをもたらさない。鉄過剰症マウスの創傷床中で、Ｍ２マクロファージは、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣ注射後に、鉄過剰症創傷においてＰＢＳまたはＡＢＣＢ５枯渇真皮細胞画分のいずれかの注射後に見出された残留する多数の過剰に活性化されたＭ１マクロファージと比較して、より豊富であった。第２に、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを注射された鉄過剰症創傷の創傷床におけるＭ２マクロファージの発生は、炎症を抑制する典型的なＭ２サイトカインである抗炎症性ＩＬ－１０の増加と関連した。同時に、初期創傷治癒相の間にのみ殺菌性のＭ１マクロファージを動員および活性化することにおいて重要である［２３］古典的なＭ１マクロファージサイトカインであるＴＮＦα、ＩＬ－１、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３の減少が観察された。第３に、先のデータは、Ｍ１マクロファージ枯渇条件下において、鉄過剰症創傷は、非鉄過剰症創傷と同様に改善された創傷治癒を伴うＭ２マクロファージへの、完全に回復した切り替えを示すことを示す［７］。
なぜＩＬ－１ＲＡが（ＩＬ－１βを別として）ＴＮＦαをも著しく減少させることができるのかという問題について、以下のシナリオが、最も可能性が高い。鉄過剰症マウス創傷モデルにおいて、ＴＮＦαの濃度、および、ＩＬ－１βの濃度はより高い程度まで、増大し、いずれのサイトカインも、炎症性細胞、特にマクロファージの活性化を駆動する。ＩＬ－１βおよびＴＮＦαはいずれも、ＮＦκＢを活性化することができ［２４、２５］、これは、それ自体が、他の炎症促進性サイトカインおよびケモカインの中でも、ＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＴＮＦαなどの標的遺伝子をトランス活性化する。結果として、ＩＬ－１ＲＡが高い量のＩＬ－１βを中和する場合、ＮＦκＢ活性化の悪循環が著しく軽減され、ＩＬ－１βおよびＴＮＦαなどの標的遺伝子の活性化および発現が、全体的により低くなることが予想される。ＩＬ－１βが主にＩＬ－６の誘導を介してその効果を発揮することから［２４、２６］、ＩＬ－１ＲＡは、全体的なＩＬ－６濃度に対して影響を及ぼし、その結果としてＮＦκＢ活性化および下流の標的遺伝子に対して影響を及ぼす可能性が最も高い。無論、ＩＬ－１βおよびＴＮＦα以外の他のドライバーサイトカインを除外することはできない。データから結論付けられることは、ＡＢＣＢ５＋ＭＳＣから放出されたＩＬ－１ＲＡが、慢性鉄過剰症創傷の敵対的な微小環境のリバランスにおいて原因的役割を果たすということである。
多タンパク質複合体であるインフラマソームは、鉄過剰症創傷モデルにおけるＩＬ－１βの放出の増強の原因である可能性がある。実際に、慢性創傷を汚染する鉄ならびに細菌の構成成分はいずれも、インフラマソームの過剰活性化を促進する［２７、２８］。急性および慢性の組織損傷におけるインフラマソームの役割は、複雑であり、完全に理解されているというにはほど遠い。生理学的な創傷治癒の間のインフラマソームの一過性の活性化は、微生物の侵入に対する防御における炎症性応答を調和させるため、および組織デブリを効果的に取り除くために、必須の条件である［２８］。インフラマソーム依存的なＩＬ－１βの成熟は、カスパーゼ１を通したプロペプチドの切断を介して起こり、好中球およびマクロファージを傷害の部位に動員して活性化するために必要である。カスパーゼ１を欠損するマウスにおけるこのインフラマソーム依存的なＩＬ－１βの成熟ステップの阻害は、創傷治癒の遅延を明らかにする［２９］。ＩＬ－１受容体アンタゴニストであるＩＬ－１ＲＡを欠損するマウスにおけるＩＬ－１βの無制限の活性化は、クラミジア・ニューモニエ感染のモデルにおける肺組織において線維性の応答をもたらす［３０］。本データと同様に、糖尿病マウスにおける残留性のインフラマソーム依存的なＩＬ－１βの活性化もまた、皮膚創傷の創傷治癒の遅延と相関し［３１］、これは、インフラマソームの抑制により、ほぼ完全に正常な治癒へと回復させることができる［３２］。知見は、上の報告と組み合わせて、バランスがとれたインフラマソーム活性化は、調和のとれた組織修復のために重要であり、このバランスが妨げられた場合、創傷治癒が損なわれるであろうことを示す。
ＭＳＣは、in vitroで［３３、３４、３５、３６、３７］、および急性創傷モデルにおいてすら［３３、３６、３７、３８］、マクロファージ活性化の単一の側面を弱めるという記述的エビデンスが報告されている。しかし、Ｍ１からＭ２へのマクロファージの切り替え、または原因であるパラクリン機構の徹底的な特徴づけは不在である。したがって、本アプローチは、慢性創傷の治癒に対するＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣのパラクリン効果のより完全な評価の有用性を強調し、ＩＬ－１ＲＡを、炎症促進性の有害なＭ１マクロファージから抗炎症性のＭ２マクロファージへの厳格な切り替えの原因である重要なエフェクター分子として同定することを補助した。
ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣから放出されたＩＬ－１ＲＡのパラクリン効果についてのデータは、先の知見と一致する［３９］。このことに関して、ＩＬ－１ＲＡノックアウトマウスは、急性創傷の創傷治癒の遅延を示した［３９］。さらに、ＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ）のターゲティングされた欠損を有するマウスにおいて、または野生型マウス［４０］および糖尿病マウス［８］の急性創傷の組み換えＩＬ－１ＲＡによる処置の後で、治癒の改善が報告された。あまりよく特徴づけられていないＭＳＣからのＩＬ－１ＲＡ分泌は、前臨床研究において多様な病理学的状態において有益であることが記載されている［４１］。無制限の炎症促進性Ｍ１から抗炎症性Ｍ２マクロファージへのシフトが、マクロファージにより支配される組織炎症を確実に制御する有益なＩＬ－１ＲＡ効果に起因するという理解は、本明細書において明確に前進する。
概念およびデータと位置して、文献［４２］から、ヒトＩＬ－１ＲＡは、マウス細胞に高アフィニティーで効率的に結合することができ、それによりマウスＩＬ－１βの結合およびシグナル伝達を阻害することができるという明白なエビデンスが存在する。このことに関して、ヒトＩＬ－１ＲＡは、ヒトＩＬ－１αおよびＩＬ－１βの結合と等しい１５０ｐＭのアフィニティーで、マウス細胞におけるＩ型ＩＬ－１受容体に結合することが、先に示されている。
本知見は、無制限のＭ１マクロファージ活性化に起因する組織損傷に対抗するために、ＩＬ１ＲＡに加えて、他の機構が寄与し得ることを除外することはできない。実際に、本発明者らを含む複数の研究者が、先に、ＭＳＣが、腫瘍壊死因子誘導型遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ－６）の放出を介して、炎症を弱め、結果として、組織修復における瘢痕形成を軽減することを示している［３６、４３］。創傷部位に注射されたＭＳＣからのＴＳＧ－６放出の後の全層創傷の治癒の促進と対照的に［３６］、ＴＳＧ－６は、鉄過剰症創傷の創傷部位において発現されるにもかかわらず、ＴＳＧ－６は、見かけ上、鉄過剰症創傷の治癒を促進することにおいて主要な役割を果たさない。実際に、急性創傷治癒を増強する濃度での組み換えＴＳＧ－６の注射は、鉄過剰症創傷の治癒を増強しない。微小環境の差異は、注射されたＭＳＣにより感知され、これは、結果として、放出された抗炎症性因子により、様々な適応性の応答を生じ得る。
ＩＬ－１ＲＡの他に、他の因子が、治癒を促進することに寄与し得る。このことに関して、ＭＳＣは、ＰＧＥ２依存的なマクロファージのリプログラミングにより抗炎症性ＩＬ－１０の放出を促進することを介して、敗血症の間の酸化的損傷を抑制することが報告されている［４４］。加えて、ＩＬ－６およびＴＧＦ－βの放出を増強することにより、ＭＳＣは、サイトカインにより活性化された内皮細胞による好中球の動員を阻害する［４５］。
使用されたマウス創傷モデルのマイナーな限定要因は、患者における非治癒ＣＶＵと比較して、創傷閉鎖における中程度の遅延である。しかし、このモデルは、鉄により誘導される長期の炎症および組織の破壊を伴う創傷Ｍ１マクロファージの無制限の活性化を模倣し、したがって、これらの特定の病態生理学的な形質に対する処置戦略の効果を研究するために良好に適したモデルを表す［７］。
まとめると、知見は、臨床ルーチンへの計画された実行のための、実質的な臨床的影響を有する。ここで、鉄過剰症慢性創傷における調節不全の組織修復の根底にある無制限のＭ１マクロファージにより支配される炎症を効率的に弱める重要な因子の適応性の放出を、初めて明らかにした。第２に、単一マーカー戦略の使用は、ヒト皮膚から、容易にアクセス可能な均一なＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣ集団を、臨床施設への移行のためにすぐ使用できるＧＭＰグレードの品質で、濃縮することを可能にする。第３に、使用されるＭＳＣ調製物の慢性マウス創傷モデルにおける首尾よい作用について予測的な、in vitroアッセイを開発した。様々なドナーからの、単独の、またはプールされた、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣ調製物は、Ｍ１マクロファージサイトカインの放出を首尾よく抑制し、この抑制性効果は、対応するＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣが鉄過剰症創傷中に注射される場合に、治癒の改善とよく相関する。
したがって、上のデータは、新たに記載される真皮ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの増強された有効性および効力を明らかにし、これは、非治癒性の創傷の首尾よい臨床治療のために実質的な見込みを保持する。実際に、第ＩＩ相臨床研究が、最近開始され（EudraCT番号：2015-000399-81）、最初に研究された患者の結果は有望である。
材料および方法
研究デザイン
本研究の目的は、ヒト真皮ＡＢＣＢ５＋細胞が、ＭＳＣであるか否か、および細胞治療的適用において慢性創傷の治癒に対して有益な効果を有するか否かを決定することである。in vitroで、少なくとも６人の異なるドナー（表１：Ｂ０２－Ｂ０７）からのＡＢＣＢ５＋ＭＳＣおよびドナーが一致するＡＢＣＢ５－ＨＤＦを、ＭＳＣの特徴的な三系列分化、表面マーカー発現、クローン原性の増殖、自己再生、および活性化されたマクロファージに対する抗炎症性効果について、定量的測定により試験した。in vivoで、抗炎症性機構による創傷治癒に対する改善を、創傷閉鎖の遅延、長期の炎症および活性化されたＭ１マクロファージの豊富さにより特徴づけられる［７］、慢性静脈性潰瘍についてのマウス鉄過剰症全層切除創傷モデルにおいて評価した。これらの動物研究について、遺伝子改変されたマウスにおける創傷治癒の遅延を同定した先の研究から［４６］、創傷閉鎖の差異に基づいて試料サイズを概算し、ウェルチ検定により５％の有意レベルおよび８０％の検定力に達するために、ガウス分布からの偏差に対して保護するために、１個体のさらなる動物（４つの創傷）を含めた。ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣおよびドナーが一致するＡＢＣＢ５－ＨＤＦの注射による重要な動物実験は、３人の異なるドナー（表１：Ｂ０１、Ｂ１３、Ｂ１４）からの細胞を用いて、３回行った。細胞調製純度および創傷閉鎖のデータがここで示される内部番号Ｂ０１を有するドナーからのヒト真皮細胞を用いて、または表現型的に機能的に検証された、６人の異なるドナーからプールされた細胞の試料を用いて、試料回収のための反復実験を行った（表１）。このプールされた真皮ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣ調製物はまた、Ｉｌ－１ＲＡノックダウンおよびヒト化ＮＳＧマウス創傷閉鎖実験のためにも用いた。各々の定量的アッセイにおいて分析された、独立した生物学的資料の量。顕微鏡画像は、処置群ごとの６つの創傷試料についての代表的なものである。異種移植されたＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣの残留性の、創傷切片に対するヒト特異的ベータアクチンｑＰＣＲおよび創傷サイトカイン力価のＥＬＩＳＡ定量による分析のための生物学的試料は、各々２つの独立した創傷から、ｈＩＬ－１ＲＡウェスタンブロットおよび創傷マクロファージフローサイトメトリーのためには、４つの独立した創傷からプールする。
ヒト皮膚試料
本研究においてＡＢＣＢ５＋およびＡＢＣＢ－細胞画分の単離のために用いられた皮膚生検は、１ｃｍ２のサイズであり、University Clinic of Dermatology and Allergic Diseases in Ulm、University Clinic of Gynecology（乳房縮小術を行っている健康な女性からの皮膚）（ドナーＢ０２～Ｂ０７）における若い健康な志願者から、ウルム大学における倫理委員会により承認された後に取得されたか、または、直接的に、ヘルシンキ宣言の原則に従って書面によるインフォームドコンセントが得られた後で、Ticeba GmbH（Heidelberg, Germany）のクライアント（ドナーＢ０１、Ｂ０８～Ｂ１４）に由来する。皮膚の日光に暴露された領域からの細胞の単離を回避するために、局在を選択した。局在のバリエーション(臀部領域、上腕の内側または左耳の後ろ）は、外科的標準およびドナーの好みに依存する。全ての生検を、任意の病態について組織学的に評価した。病態を有さない生検のみを、免疫染色のために、およびＡＢＣＢ５＋およびＡＢＣＢ－細胞画分の単離のために使用した。取得された生検のうち、ＡＢＣＢ５＋細胞を生じることができなものはなかった。匿名のドナーデータを表１において見出すことができる。Frankら［４７］から改変されたプラスチック接着性の真皮細胞の増殖およびＡＢＣＢ５に基づく分離は、示されるように行った（詳細については材料および方法を参照）。in vitro実験の前に細胞バイアビリティーを評価し、ＡＢＣＢ５＋およびＡＢＣＢ５－の両方の集団の間に差異は見出されなかった（＞９０％）。また、創傷中への注射のためにAccutaseによりＡＢＣＢ５＋ＭＳＣおよびＡＢＣＢ５－細胞画分を収集する場合、バイアビリティーは、トリパンブルー除外により慣用的にチェックされ、ＡＢＣＢ５＋およびＡＢＣＢ５－の両方の集団において、一貫して非常に高い（＞９０％）。
in vivo創傷治癒実験における適用の前に、ＡＢＣＢ５＋細胞調製物を、それらのＭ１マクロファージ抑制機能について、ＩＦＮ－γ／ＬＰＳで活性化されたマウス骨髄由来マクロファージとの共培養において試験し、ＴＮＦαの放出を、マウス特異的ＴＮＦαＥＬＩＳＡ（R&D Systems）により評価した。
分化およびクローン原性増殖アッセイ
in vitroでの脂肪生成性、骨原性および軟骨形成性の分化能力を、市販の分化培地（Lonza）；ＴＧＦ－β３（CellSystems）および手順を用いて、製造者の指示に従って試験した。脂肪生成性分化のために、脂質液滴の蓄積を、オイルレッドＯ（Sigma-Aldrich）による染色により検証し、先に記載されるとおり、色素抽出により定量した［４８］。骨芽細胞の細胞外マトリックスのミネラル化は、アリザリンレッドＳ染色（Sigma-Aldrich）により検証し、記載されるとおり、その後の色素抽出により定量した［４９］。軟骨形成性分化を可視化するために、３Ｄ－マイクロマス（micromass）培養物を、標準的な手順に従って（「免疫蛍光染色」を参照）アグリカンについて免疫染色した（R&D Systems、AF1220）。軟骨形成の定量のために、マイクロマス中で形成された軟骨特異的硫酸化プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンを、Blyscanグリコサミノグリカンアッセイキット（Biocolor）を製造者の指示に従って用いて、測定した。クローン原性増殖の評価のために、ＡＢＣＢ５＋真皮ＭＳＣおよびドナーが一致するＡＢＣＢ５－ＨＤＦを、培養ディッシュ１００ｍｍあたり２００細胞の密度で播種した。１４日後、コロニーを、０．５％クリスタルバイオレット（Sigma-Aldrich）で染色し、試料１つあたり３～５枚の平行したディッシュ上で、≧２５細胞のコロニーをカウントした。クローン増殖アッセイのために、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣを、培養ディッシュ１００ｍｍあたり２００細胞の密度で播種したた。１４日後、隣接するコロニーから少なくとも１顕微鏡視野分離れた１２個のコロニーをピックアップし、増殖させた。良好に増殖しているクローン培養物を、二次的な三系列分化およびクローン原性増殖アッセイのために選択した。
ヒトおよびマウスマクロファージ共培養物
大腿骨からマウス骨髄由来マクロファージを単離し、Ｌ９２９細胞上清の補充を含むマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）と共に、６日間にわたり成熟させた［４６］。ヒトマクロファージは、正の磁気ビーズ選択（Miltenyi Biotec）によりＣＤ１４発現について＞９５％の純度で選別されたＰＢＭＣ由来単球から、２０ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトＭ－ＣＳＦ（Miltenyi Biotec）の存在下において、８日間にわたり成熟させた。勾配遠心分離（ＰＡＡ）によるＰＢＭＣ単離のためのフレッシュなバフィーコートは、German Red Crossから得た。共培養実験のために、ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣまたはドナーが一致するＡＢＣＢ５－ＨＤＦを、２４ウェルプレート中に、２×１０４細胞／ウェルにおいて、１０％高品質ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ－グルタミンを含む０．５ｍｌのＤＭＥＭ中で、播種してこれに接着させた。２４時間後、マクロファージを、最上部に１×１０５細胞／ウェルで０．５ｍｌにおいて播種し、異なることが示されない限り、１：５細胞比を得た。共培養物を、５０Ｕｍｌ－１の組み換えマウスまたはヒトＩＦＮ－γ（R&D Systems）と共に２４時間にわたりインキュベートし、次いで、２０ｎｇｍｌ－１のＬＰＳ（Sigma-Aldrich）および５０Ｕｍｌ－１のＩＦＮ－γで、さらなる２４時間にわたり刺激し、その後、上清を収集して、ＥＬＩＳＡにより分析した（R&D Systems）。
マウスおよび創傷治癒モデル
メスＣ５７ＢＬ／６Ｎ（Charles River、系統０２７）およびメスまたはオスのＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃスキッドＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（Jax strain 005557）マウスはいずれも、実験の開始時において１０～１２週齢であり、ウルム大学の動物施設における個々に換気されたケージにおいて、特定の病原体フリー条件下に保持された。実験は、ドイツの実験動物保護法（law for welfare of laboratory animals）に従って行い、バーデン＝ヴュルテンベルク州政府の審査会により承認された。.
ＣＶＵの生理病理学に関連するＣ５７ＢＬ／６マウスモデルは、先に記載されるとおりに行った［７］。ヒト真皮ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣまたは対応するＡＢＣＢ５－ＨＤＦによる細胞処置のために、ＰＢＳ中に懸濁されたマウス１個体あたり１×１０６の細胞を、各々の創傷の輪郭の周囲の３つの５０μｌの注射点において、真皮中に注射した。
創傷閉鎖の評価のために、創傷形成の８日前に、ＮＳＧマウスを、先に記載されるとおり、尾静脈注射による２００μｌのＰＢＳ中の２×１０７のヒトＰＢＭＣでヒト化した［１８］。創傷形成後の第１日において、マウスを、無作為に、６人のドナーのプールのＡＢＣＢ５＋ＭＳＣ調製物（表１：Ｂ０１＋Ｂ０８＋Ｂ０９＋Ｂ１０＋Ｂ１１＋Ｂ１２）、ドナーが一致するＡＢＣＢ５－ＨＤＦまたはＰＢＳ単独のいずれかの皮内注射を受ける処置群に割り当てた。マクロファージ表現型シフトの評価のために、創傷形成の１日前に、ＮＳＧマウスをヒト化した。創傷形成後の第１日において、無作為群を、上記のとおり、ドナーＢ０１からのＡＢＣＢ５＋ＭＳＣまたはＰＢＳのいずれかで処置した。創傷形成後の第５日において、各々のマウスの２つの独立した創傷の半分を、免疫蛍光染色のために処理し、他方を、フローサイトメトリーのためにプールした。
ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣにおけるｓｉＲＮＡに媒介されるＩＬ－１ＲＡ発現のノックダウン
ＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣに、２０ｎＭのヒトＩＬ－１ＲＡに対して特異的な４つのｓｉＲＮＡの組み合わせまたはスクランブルされた対照－Ａ ｓｉＲＮＡのいずれかを、最少推奨濃度における付随する遺伝子導入培地（全製品Santa Cruz Biotechnologies製）を製造者の指示に従って用いて、一過性に遺伝子導入した。in vivo実験において用いる前に、ＩＦＮ－γ／ＬＰＳで活性化されたマウス骨髄由来マクロファージによるin vitroの炎症性刺激、およびヒトＩＬ－１ＲＡ（R&D Systems）についての培養上清培地のＥＬＩＳＡにより、首尾よいノックダウンをタンパク質レベルで試験し、これは、典型的には約８０％であった。
組織学および免疫蛍光染色
ヒト皮膚組織試料は、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（TissueTek）中に包埋し、－８０℃で凍結し、５μｍの切片に処理し、アセトン中で固定した。マウス創傷は、４％ＰＦＡで一晩固定し、中心で切り開き、パラフィン包埋し、創傷の輪郭を避けるために、第１のシリーズの５μｍの切片のみを用いた。接着細胞を、ガラスのカバーグラス上で培養し、４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳ中０．５％のTritonX-100で透過処理した。切片またはスライドグラスを、製造者の推奨により抗体希釈液（DAKO）中で希釈された、補充材料中の列記される一次抗体（表３）と共に、４℃でインキュベートした。マウス抗ＡＢＣＢ５は、凍結切片の染色のためには、１４μｇｍｌ－１の濃度でで用い、４０分間３７℃でインキュベートし、接着細胞の染色のためには、４μｇｍｌ－１で４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳによる洗浄の後で、切片を、AlexaFluor488またはAlexaFluor555と共役した対応する二次抗体のいずれか（全てInvitrogen製）と共にインキュベートした。核を、ＤＡＰＩでカウンター染色し、その後、蛍光マウント用培地（DAKO）中にマウントした。バックグラウンド染色は、適切なアイソタイプが一致する対照抗体により対照を得た。抗ＡＢＣＢ５染色の特異性を、ペプチド競合アッセイにより評価し、２００倍のモル濃度過剰のエピトープアミノ酸配列のペプチド［４７］（ＲＦＧＡＹＬＩＱＡＧＲＭＴＰＥＧ、GeneCrust）と共にプレインキュベートし、その後、免疫蛍光染色を行い、これは、蛍光シグナルの喪失を示した。
マッソントリクローム（Sigma-Aldrich）およびピクロシリウスレッド（Polysciences）染色を、製造者の指示により、パラフィン切片において行い、ピクロシリウスレッド染色されたスライドグラスを、円偏波光で分析した。AxioImager.M1顕微鏡、AxioCam MRcカメラおよびAxioVisionソフトウェア（Carl Zeiss）により画像を取得した。
ヒト特異的ベータアクチン配列特異的ｑＰＣＲ
マウス創傷切片中の注射されたヒトＡＢＣＢ５＋由来ＭＳＣおよびＡＢＣＢ５－ＨＤＦの定量を、ヒト特異的ベータアクチン配列ＰＣＲにより行った。簡単に述べると、QIAamp DNA FFPE組織キット（５６４０４、Qiagen）を使用して、ＰＦＡ固定されたパラフィン包埋創傷切片からゲノムＤＮＡを単離し、その後、ヒト特異的ベータアクチンプライマー（順方向プライマー：ＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＣおよび逆方向プライマー：ＧＣＴＧＧＣＣＧＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧ）を用いてＰＣＲを行った。次いで、デンシトメトリー分析を行って、ゲル画像上で分離し、マウス特異的ベータアクチン配列ＰＣＲ生成物で正規化した、ＰＣＲ生成物の密度を定量した。マウス特異的ベータアクチンプライマー（順方向プライマー：ＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＡＧＴＴＧＴＡＧＣおよび逆方向プライマー：ＣＣＡＴＡＣＣＴＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＴＣ）を用いて、マウスベータアクチンのＰＣＲを行った。
ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット
凍結して細かく刻んだ創傷組織試料を、Lysing Dカラム（MP Biomedicals）中で、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）ならびにホスファターゼ阻害剤Ｎａ３ＶＯ４（２ｍＭ）およびＮａＦ（１０ｍＭ）を補充したＲＩＰＡバッファー（Sigma）中で溶解し、３ラウンドの２０秒間の冷却振動力に供した。ブラッドフォードアッセイおよびＢＳＡ－標準希釈に対する分光光度法的分析により、タンパク質の収量を測定した。全てのＥＬＩＳＡアッセイは、DuoSet kits（R&D Systems）により、製造者の指示に従って行った。ＩＬ－１ＲＡについてのウェスタンブロット分析は、先に公開されるとおり行った［５０］。ヒトおよびマウスのＩＬ－１ＲＡを検出するウサギ抗ＩＬ－１ＲＡ ＩｇＧ１抗体（Abcam＃ａｂ１２４９６２）を１：１０００の希釈率で、および二次ＨＲＰ共役抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Dianova）を１：１０，０００の希釈率で用いた。同等のローディングを、アクチンにより検証した。ＴＭＢ基質（BD OptEIA）の添加の後で、Vilber Fusion Fx7（Vilber Lourmat）により、化学発光を検出した。
フローサイトメトリー
ＡＢＣＢ５についてのフローサイトメトリーは、抗ＡＢＣＢ５マウスＩｇＧ１（クローン３Ｃ２－１Ｄ１２；［４７］）および二次AlexaFluor647共役ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Fisher Scientific）を用いて行った。ＭＳＣ－マーカーパネルＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ１０５について、ならびにＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ２０およびＣＤ４５についての細胞の多色標識を、ヒトＭＳＣ表現型決定キット（Miltenyi Biotec）により、製造者の指示に従って行った。抗ヒトＳＳＥＡ４－ＰＥ、ＣＤ２７１－ＦＩＴＣ、ＣＤ１３３、ＣＤ３１８およびメラン－Ａ抗体（表３）を、細胞と共に、４５分間にわたり４℃で、製造者により推奨される濃度でインキュベートした。ＣＤ１３３、ＣＤ３１８およびメラン－Ａの検出のために、ＦＡＣＳ－バッファー（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）で洗浄した細胞を、その後、蛍光色素共役二次抗体と共に、４５分間にわたり４℃でインキュベートした。SYTOX Blue（Invitrogen）による共染色により、死細胞を除外した。アイソタイプが一致する対照抗体を、ゲートの設定のために用いた。
創傷マクロファージ単離のために、マウス創傷を、先に記載されるとおり、消化した［３３、３６］。簡単に述べると、細かく刻んだ組織は、ＨＥＰＥＳ干渉化食塩水中で、１．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩおよび１．５ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼＩ（Sigma-Aldrich）と共に、１時間にわたり３７℃でインキュベートした。シングルセル調製物をろ過し、１５分間にわたりＦｃＲブロッキング（MACS）と共にインキュベートし、その後、補充材料（表３）中の列記される抗体により染色した。市販のキット（BD）を製造者のプロトコルに従って用いた固定および透過処理の後で、さらなる細胞内染色を行った。ブランクおよび単染色した試料をＰＭＴおよび補償セッティングのために用いた。創傷マクロファージについて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ試料中のシングレット（singlet）のＦ４／８０＋マウスマクロファージおよびヒト化されたＮＳＧマウス試料中のシングレットのＣＤ６８＋ヒトマクロファージを、マクロファージ集団中の相対的蛍光単位（ＲＦＵ＝アイソタイプ対照試料に相対的な幾何平均蛍光強度）または％陽性イベントに基づいて、その後のＭ１およびＭ２マーカー発現分析のためにゲーティングした。これに対して、正の閾値を、適切な蛍光共役アイソタイプ対照およびマクロファージゲーティングマーカーで染色された対照試料に対して設定した。フローサイトメトリーは、FACSCanto II、FACSAria FusionまたはAccuriフローサイトメーター（BD Biosciences）において行い、データは、その後、FlowJo分析ソフトウェア（TreeStar Inc.）を用いて分析した。
網羅的トランスクリプトームプロファイリングおよび定量的ＰＣＲ
全ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーを調製するために、５００ｎｇの全ＲＮＡをインプットとして用いた。５００ｎｇの全ＲＮＡを、第１に、市販のキット（Low Input Ribominus Eukaryotic System v2、Thermo）を、マニュアルにおいて記載されるとおりわずかな改変と共に用いて、ｒＲＮＡを枯渇させるために用いた。簡単に述べると、RiboMinus（商標）Eukaryote Probe Mixを用いてｒＲＮＡを枯渇させた後、ｒＲＮＡが枯渇したＲＮＡを含む上清を収集し、３×Agencourt RNAClean XPビーズと共に２０分間にわたり氷上でインキュベートし、その後、上清を取り除き、RNAClean XPビーズの洗浄を、８０％エタノールで２回行い、最後に、ｒＲＮＡが枯渇したＲＮＡを、１０μｌのヌクレアーゼフリー水中でビーズから溶離させた。このｒＲＮＡが枯渇したＲＮＡを、NEBNext Ultra II Directional RNAライブラリープレップキット（NEB）をいくつかの改変と共に用いて、IlluminaプラットフォームのためのＲＮＡＳｅｑライブラリーを調製するために用いた。ＲＮＡＳｅｑライブラリーの品質管理は、Agilent Bioanalyzerにより行い、ライブラリーの濃度は、dsDNA HSアッセイキット（Thermo）を用いて量子ビット中で測定した。ライブラリーは、Illumina NextSeq 500システムにおいて、NextSeq 500/550 v2キット（Microsynth AG, Switzerland）を用いて、７５サイクルのシークエンシング（１×７５シングルエンド読み値）および各８サイクルの２回のインデックス読み値について、配列決定した。デマルチプレクスの粗読み値（ｆａｓｔｑ）を、先に記載されるとおり、遺伝子発現分析のために用いた［５１］。簡単に述べると、fastq/span>ファイルを用いて、Hisat2を用いてヒトゲノム基準（GRCh38）とアラインメントし、その後、トランスクリプトのアセンブリーを行い、存在量の概算および差次的発現を、それぞれcufflinksおよびcuffdiffにより行った。ＲＮＡＳｅｑデータ分析の可視化は、R packages、cummeRbund、gplots、ggplot2により、カスタムスクリプトを用いて行った。
データの利用可能性
ＲＮＡＳｅｑデータは、GEOにおいてアクセッション番号GEO GSE125829によりアップロードした。２９０６塩基対のＡＢＣＢ５ ｃＤＮＡ配列は、NCBI GenBankにおいてアクセッション番号AY234788下において見出すことができる。
統計学的分析
in vitroおよびin vivoでの独立した定量的測定における各々の２つの処置群の間の差異の統計学的分析は、両側独立スチューデントｔ検定を用いて行い、ウェルチ補正により、不等分散性データセットに対して保護した。ＡＢＣＢ５＋およびドナーが一致するＡＢＣＢ５－細胞画分についてのin vitro比較は、対応ｔ検定により分析した。稀な場合において、データの目視により検出された外れ値は、グラブス検定によるα＝５％による事後検証の後で、分析から除外した。統計学的データ分析は、GraphPad Prism 6ソフトウェア（Software for Science）を用いて行った。別段に示されない限り、グラフは平均値を示し、エラーバーは標準偏差を表し、星は、有意レベルを表す：ｎｓ＝有意ではない；*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１。
材料および方法
ＡＢＣＢ５＋およびＡＢＣＢ５－真皮細胞画分の増殖および単離
プラスチック接着真皮細胞を、２５回の累積集団の倍加に等しい最大１６回の継代で増殖させ、それぞれ２回および３回の連続したラウンドの、マウス抗ヒトＡＢＣＢ５ ＩｇＧ１抗体（クローンＵＧ３Ｃ２－２Ｄ１２；（５１））による磁気ビーズ選別により、ＡＢＣＢ５＋およびＡＢＣＢ５－画分に分けた。９０％を超える選別純度は、ＧＭＰグレードの真皮ＡＢＣＢ５＋細胞の放出基準の一つである（表２）。フローサイトメトリーにより、ＡＢＣＢ５＋細胞の平均純度は、９８．３３％±１．１２％（ｎ＝２４３）であった。実験のために、選別された細胞を、凍結保護するか、または最大で７２時間まで培養した。この時点における純度は、典型的には＞７０％であった。ＡＢＣＢ５＋真皮ＭＳＣを、１５％の熱不活化高品質ウシ胎仔血清、６ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．８μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０μｇ／ｍｌのインスリン、０．２ｍｇ／ｍｌのグルコース、６．１６ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Sigma-Aldrich）および０．６ｎｇ／ｍｌの組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（Prospecbio）を補充したハムＦ１０中で、３７℃および３％ＣＯ２で培養した。Versene（Gibco）を用いて、ＡＢＣＢ５＋真皮細胞を培養ブラスチックから解離させた。ＡＢＣＢ５－ＨＤＦは、１０％高品質ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ－グルタミン（Biochrom）を含むＤＭＥＭ中で、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。
ＣＶＵ病態生理学に関連するＣ５７ＢＬ／６マウスモデル
Ｃ５７／ＢＬ／６マウスに、５ｍｇ／２００μｌの鉄－デキストランまたは２００μｌのＰＢＳ－デキストラン（Sigma-Aldrich）を、３日間の間隔で７回、腹腔内注射した。最後の鉄注射の１日後に、麻酔下において、剃毛したマウスの背側の皮膚上に生検用パンチ（Stiefel）で４つの６ｍｍの全層切除創傷を与えた。Adobe Photoshopソフトウェア（Adobe Systems）を用いて創傷面積を定量するために、創傷を線状のメジャーの隣で撮影した。
ＩＬ－１β定量ＰＣＲ
ヒト慢性静脈性下肢潰瘍（ＣＶＵ）、マウス創傷、および対応する健康な対照皮膚から、市販のキット（RNeasy Microarray Tissue Mini Kit、Qiagen）を製造者により記載されるとおり用いて、全ＲＮＡを単離した。試料１つあたり２μｇのＲＮＡを、illustra Ready-To-Go RT-PCR Beads（GE Healthcare）を用いて逆転写した。全ＲＮＡおよびｃＤＮＡの量および質は、Nanodrop 1000（Thermo Scientific）およびQIAxcel Advanceシステム（Qiagen）を用いて評価した。7300リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems, Life Technologies）を用いて、Power SYBRグリーンマスターミックス（Applied Biosystems、Life Technologies）を用いてｃＤＮＡを増幅した。図Ｓ４において示されるデータのために、ヒトＩＬ－１βに対して特異的なプライマー（ＦＷ：５’－ＣＣＣＡＡＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡ－３’およびＲＥＶ：５’－ＣＣＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＴＧＡＣＴＴＣＴＡ－３’）ならびにマウスＩＬ－１βに対して特異的なプライマー（ＦＷ：５’－ＴＣＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＣＡＡＧ－３’およびＲＥＶ：５’－ＧＡＡＡＣＡＧＴＣＣＡＧＣＣＣＡＴＡＣ－３’）を用いた。
遅延した創傷治癒に対するヒト組み換えＩＬ－１ＲＡ皮内注射の効果
鉄過剰負荷慢性創傷治癒モデルマウスを、無作為に、以下を含む３つの処置群に分けた：（ｉ）デキストラン／ＰＢＳ急性創傷治癒対照、（ｉｉ）鉄／ＰＢＳ群、および（ｉｉｉ）急性モデルについて先に記載されるとおり（３６）、第２日および第４日における創傷の輪郭の周囲における２５０ｎｇ／創傷組み換えヒトＩＬ－１ＲＡの皮内注射による鉄／ｒｈＩＬ－１ＲＡ処置群。急性創傷治癒モデルマウスを、無作為に、（ｉ）ＰＢＳを注射された対照群、および（ｉｉ）慢性モデルについて記載されるようなｒｈＩＬ－１ＲＡ処置群に割り当てた。第０日と比較した、第３日、第５日、第７日および第１０日における創傷表面の面積により、経時的な創傷閉鎖を定量した（図Ｓ５）。
表１．ヒト皮膚ドナー。（Ａ）本研究において、in vivoでのＡＢＣＢ５＋真皮細胞およびＣＶＵの特徴づけのために用いられた健康な皮膚のドナーのＣＶＵおよび正常なヒト皮膚のＩＬ－１β免疫染色についてのデータ。（Ｂ）本研究において、真皮細胞ＡＢＣＢ５－選別のために用いられた健康な皮膚のドナーのデータ。
Figure 2022527998000002
Figure 2022527998000003
表２．本研究において用いられたＧＭＰに準拠した真皮ＡＢＣＢ５＋ＭＳＣ調製物についての放出基準。
Figure 2022527998000004
表３．本研究において用いられた抗体のリスト。
Ａ：免疫染色のために用いられた一次抗体。
Figure 2022527998000005
Ｂ：フローサイトメトリー抗体。
Figure 2022527998000006
Figure 2022527998000007
参考文献
Figure 2022527998000008
Figure 2022527998000009
Figure 2022527998000010
Figure 2022527998000011
Figure 2022527998000012
Figure 2022527998000013
本明細書において引用される全ての参考文献は、完全に参照として援用される。そのようにして記載される本発明の少なくとも１つの態様のいくつかの側面を有することにより、当業者は、多様な改変、修飾および改善を容易に想起するであろうことが、理解されるべきである。かかる改変、修飾および改善は、本開示の部分であることを意図され、本発明の精神および範囲のうちのものであることを意図される。したがって、前述の説明および図面は、単なる例にすぎない。

Claims (54)

  1. 合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の集団、ここで、集団のうちの９６％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、
    を含む、組成物。
  2. 集団の９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％より多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、請求項１に記載の組成物。
  3. 集団の１００％が、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、請求項１に記載の組成物。
  4. 集団中の合成幹細胞のうちの９０％より多くが、ＣＤ９０を共発現する、請求項１または請求項２に記載の組成物。
  5. 合成幹細胞の集団が、低酸素下においてＶＥＧＦを分泌することができ、これはＥＬＩＳＡにより測定される、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 合成幹細胞の集団が、Ｍｉに極性化したマクロファージと共培養した後で、ＩＬ－１ＲＡを分泌することができる、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 合成幹細胞の集団が、マクロファージ共培養物において、単離された生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞と比較して、ＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－１２／ＩＬ－２３ｐ４０の分泌の減少、ならびにＩＬ－１０分泌の増大を誘導する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 合成幹細胞の集団が、多能性分化能を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 合成幹細胞の集団が、３つ全ての胚葉、内胚葉、中胚葉および外胚葉に由来する細胞へと分化する能力を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 合成幹細胞の集団が、角膜上皮分化能力を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 合成幹細胞の集団が、単離された生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞と比較して、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ３を含む幹細胞マーカーの発現の増大を示す、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 合成幹細胞の集団が、単離された生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞と比較して、ＭＣＡＭ、ＣＲＩＧ１およびＡＴＸＮ１を含む間葉系間質細胞分化マーカーの発現の低下を示す、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 合成幹細胞の集団のうちの少なくとも５％が、外来遺伝子を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 合成幹細胞の集団のうちの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が、外来遺伝子を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 外来遺伝子が、組織特異的ホーミング因子、分泌型組織リモデリングタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ホルモンおよび神経伝達物質からなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１３または１４に記載の組成物。
  16. 合成幹細胞の集団のうちの少なくとも５％が、遺伝子の修飾を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 合成幹細胞の集団のうちの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が、遺伝子の修飾を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 合成幹細胞が、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイドヌクレアーゼおよび遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含む複合体を送達することにより修飾される、請求項１６または１７に記載の組成物。
  19. 修飾された遺伝子が、ＣＯＬ７ＡまたはＡＢＣＢ５＋細胞における欠損遺伝子からなる群より選択される遺伝子である、請求項１３または１４に記載の組成物。
  20. 細胞の集団を調製するための方法であって、以下：ヒト対象からの皮膚組織からの初代細胞を単離すること；初代細胞を、細胞が、６０％より高いコンフルエンスの混合細胞に達するために十分な子孫を生成するまで、培養培地中で培養し、混合細胞を収集し、収集した混合細胞を培養し、再収集し、および細胞を、細胞の集団が、少なくとも９９％が製造された合成細胞であり、１０％未満が初代の生理学的に存在する皮膚由来細胞である状態に達するまで、少なくとも５回の継代を通して培養すること；ならびにＡＢＣＢ５＋抗体を用いるＡＢＣＢ５陽性細胞の単離、を含む、前記方法。
  21. 少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６回の継代を通して、細胞を再収集および培養することを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 細胞の集団が、少なくとも９９．９９％が製造された合成細胞であり、０．０１％未満が初代の生理学的に存在する皮膚由来細胞である状態に達するまで、細胞を再収集および培養することを含む、請求項２０に記載の方法。
  23. 細胞の集団が、少なくとも９９．９９９５％が製造された合成細胞であり、０．０００５％未満が初代の生理学的に存在する皮膚由来細胞である状態に達するまで、細胞を再収集および培養することを含む、請求項２０に記載の方法。
  24. 細胞の集団が、少なくとも９９．９９９９９７％が製造された合成細胞であり、０．０００００３％未満が初代の生理学的に存在する皮膚由来細胞である状態に達するまで、細胞を再収集および培養することを含む、請求項２０に記載の方法。
  25. 単離ステップが、磁気ビーズに共役したＡＢＣＢ５抗体を含む、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 細胞が、基礎培地としてハムＦ－１０を用いて調製された培養培地中で培養される、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 細胞のコンフルエンスおよび細胞形態学が、各々の細胞増殖ステップにおいて評価される、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 最終培養と単離ステップとが、少なくとも３日間離れている、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 細胞が、ＥＤＴＡを用いて収集される、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。
  30. 組織の発生を誘導する方法であって、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、の分化した組織への分化を促進することを含む、前記方法。
  31. 同系移植を促進するための方法であって、同系移植片を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、を投与することを含む、前記方法。
  32. 末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）を処置するための方法であって、ＰＡＯＤを有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、を疾患を処置するための有効量において投与することを含む、前記方法。
  33. 慢性肝不全の急性増悪（ＡＯＣＬＦ）を処置するための方法であって、ＡＯＣＬＦを有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、を疾患を処置するための有効量において投与することを含む、前記方法。
  34. 角膜縁幹細胞欠損（ＬＳＣＤ）を処置するための方法であって、ＬＳＣＤを有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、を疾患を処置するための有効量において投与することを含む、前記方法。
  35. 角膜疾患を処置するための方法であって、角膜疾患を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、を疾患を処置するための有効量において投与することを含む、前記方法。
  36. 表皮水疱症（ＥＢ）を処置するための方法であって、ＥＢを有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、を疾患を処置するための有効量において投与することを含む、前記方法。
  37. 皮膚の創傷治癒のための方法であって、創傷を、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、と創傷の治癒を促進するための有効量において接触させることを含む、前記方法。
  38. 合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団が、マトリックスまたはスカフォールド上に播種される、請求項３７に記載の方法。
  39. マトリックスが、ポリマーのメッシュまたはスポンジ、ポリマーハイドロゲル、またはコラーゲンマトリックスである、請求項３８に記載の方法。
  40. 臓器移植を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、の同種移植片の生存を促進するための有効量を投与することを含む、方法。
  41. 自己免疫疾患を処置する方法であって、自己免疫疾患を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、の自己免疫疾患を処置するための有効量を投与することを含む、前記方法。
  42. 肝臓疾患を処置する方法であって、肝臓疾患を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、の肝臓疾患を処置するための有効量を投与することを含む、前記方法。
  43. 神経変性疾患を処置する方法であって、神経変性疾患を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くは、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、の神経変性疾患を処置するための有効量を投与することを含み、ここで、神経変性疾患は、宿主細胞に対する免疫応答に関連する、前記方法。
  44. 心血管疾患を処置する方法であって、心血管疾患を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、の心血管疾患を処置するための有効量を投与することを含み、ここで、心血管疾患は、組織リモデリングに関連する、前記方法。
  45. 腎臓疾患を処置する方法であって、腎臓疾患を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、の腎臓疾患を処置するための有効量を投与することを含む、前記方法。
  46. 炎症性障害を処置する方法であって、炎症性障害を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、の炎症性障害を処置するための有効量を投与することを含む、前記方法。
  47. 炎症性障害が、心血管疾患、虚血性脳卒中、アルツハイマー病および加齢からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. 筋骨格障害を処置する方法であって、炎症性障害を有する対象に、合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の単離集団、ここで、集団の９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％よりも多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、の筋骨格障害を処置するための有効量を投与することを含む、前記方法。
  49. 筋骨格障害が、遺伝性筋ジストロフィーである、請求項４８に記載の方法。
  50. 合成幹細胞の集団が、請求項１～１９のいずれか一項に記載の合成細胞である、請求項３０～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 細胞のリプログラミングのための方法であって、
    請求項１～１９のいずれか一項に記載の合成幹細胞の集団を、多能性による細胞のリプログラミングのための基質として用いること
    を含む、前記方法。
  52. 外来ＰＡＸ６遺伝子をさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の合成幹細胞の集団。
  53. 合成ＡＢＣＢ５＋幹細胞の集団、ここで、細胞の集団が、ＫＲＴ１２を発現する、
    を含む、組成物。
  54. 集団の９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．７％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９８％、９９．９９９％または９９．９９９９９７％より多くが、生理学的に存在する皮膚由来ＡＢＣＢ５陽性間葉系幹細胞のin vitroの子孫である、請求項５３に記載の方法。
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