JP2007521793A - 分娩後由来細胞類を使用する、神経組織の再生および修復 - Google Patents

Abstract

【解決手段】 分娩後臍帯および分娩後胎盤から由来する細胞群が開示される。前記分娩後由来細胞群を使用して、神経組織の再生または修復のための薬学的組成物と装置類と方法類である。
【選択図】 なし

Description

関連出願の相互参照
本明細書は、２００３年６月２７日出願の米国仮出願番号第６０／４８３，２６４号に対して優先権を主張するものであって、この参照によって、その全体の開示は本明細書に組み込まれる。他の関連する出願には、２００４年６月２５日出願の米国特許出願第［ＥＴＨ−５０７３ ＮＰ１］号明細書と、２００４年６月２５日出願の米国特許出願第［ＥＴＨ−５０７３ ＮＰ２］号明細書と、２００４年６月２５日出願の米国特許出願第［ＥＴＨ−５０７３ ＮＰ４］号明細書と、２００４年６月２５日出願の米国特許出願第［ＥＴＨ−５０７３ ＮＰ５］号明細書と、２００４年６月２５日出願の米国特許出願第［ＥＴＨ−５０７３ ＮＰ７］号明細書と、２００４年６月２５日出願の米国特許出願第［ＥＴＨ−５０７３ ＮＰ８］号明細書と、２００４年３月２４日出願の米国特許仮出願第６０／５５５，９０８［ＥＴＨ ５１２７］の、同一出願者の同時係属出願を含み、この参照によって、各出願の全体の開示は本明細書に組み込まれる。

本発明は、神経系疾患および神経障害のための、細胞に基づいた治療または再生治療に関する。具体的には、本発明は、分娩後由来細胞群を使用した、神経組織の再生または修復のための薬剤成分類と装置と方法を提供する。

種々の特許または他の出版物が、本明細書を通して引用される。これらの各出版物は、ここで参照することによって、その全体を開示に含める。

中枢神経系および末梢神経系の神経系疾患および他の障害は、その身体的影響だけでなく、その恒久性のため、個人が被り得る最も衰弱性の疾患の１つである。過去においては、脳や脊髄の損傷、または中枢神経系または末梢神経系の神経変性（例えば２〜３例を挙げると、パーキンソン病、アルツハイマー病、または多発性硬化症）の患者には、回復や治療の望みがほとんどなかった。

ニューロン群および神経系の他の細胞は成体内で成長できないため、神経損傷および神経変性の疾患は長らく回復不可能であると考えられていた。しかし、組織修復および再生のための幹細胞に基づく治療法が近年出現し、いくつかの神経変性病変および他の神経障害に対する有望な治療法を提供している。幹細胞は自己再生能があり、分化して種々の成熟神経細胞系統を発生することができる。そのような細胞の移植は、標的組織を再構成することによって、生理学的および解剖学的機能を修復するための臨床的手段として利用され得る。幹細胞技術の応用は広範で、組織工学と遺伝子治療デリバリー（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）と細胞治療（すなわち、生物学的治療薬物を生成するか、またはそれらを含む、生きた細胞または細胞成分を体外から供給することによって、標的部位にそのような生物学的治療薬物をデリバリーすること）を含む（概説に関しては、Ｔｒｅｓｃｏ，Ｐ．Ａ．ら、２０００，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４２：２〜３７を参照）。

幹細胞技術の治療での能力を現実化するための１つの障害は、十分な数の幹細胞を取得する困難さにあった。幹細胞の１つの源泉は、胚組織または胎児組織である。ヒトを含めた、いくつかの哺乳類種から、胚の幹細胞および前駆細胞が単離されており、数種のそのような細胞タイプは、自己再生と増殖の能力、並びにすべての神経細胞系統に十分に分化できる能力を有することが示されている。しかし、胚または胎児の源泉から幹細胞を取得することについては、多くの倫理上かつ道徳上の問題が挙げられており、複能性細胞または多能性細胞の他の源泉を特定することによって回避することが望ましい。

また、神経細胞の能力を有する幹細胞が、成体組織から単離されている。神経幹細胞は、成長中の脳および成体の神経系内に存在する。これらの細胞は増殖され、ニューロン群とアストロサイト群とオリゴデンドロサイト群に分化し得る。しかし、成体の神経幹細胞は稀であり、また浸襲性処置によってのみ取得でき、培養内で増殖する能力が、胚幹細胞に比べて限定されている可能性がある。

他の成体組織もまた、細胞に基づいた神経治療に有用な前駆細胞を産出し得る。例えば、骨髄と皮膚から由来する成体幹細胞は、培養内で増殖でき、いくつかの神経系統を含む、複数の系統を生じさせ得ることが最近報告されている。

臍帯や胎盤のような分娩後組織が、幹細胞の代わりの源泉として関心をもたれている。例えば、胎盤を潅流すること、または臍帯血または臍帯組織から収集することによって、幹細胞を回収する方法が記載されている。これらの方法からの幹細胞の調達での１つの限度は、取得される臍帯血の量や細胞数が不十分であること、並びに、これらの源泉から得られた細胞集団に不均一性があること、または特徴付けがないことであった。

このように、一連の神経細胞系統に分化する能力を有する細胞を十分に供給できる代替の源泉は、まだ大きな需要がある。そのような細胞群から成る実質的に均一な集団群の供給が、信頼性のあるものであり、十分に特徴付けられており、また十分な量があると、薬剤スクリーニングアッセイと、他の神経細胞群のｅｘ ｖｉｖｏ（生体外）またはｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）の栄養因子サポートと、ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）細胞に基づく治療を含む、神経修復および神経再生での様々な診断および治療の応用で有益であろう。

本発明は、神経系疾患および神経障害のための、細胞に基づいた治療または再生治療に適用され得る、薬剤成分および方法を提供する。具体的には、本発明の特色は、分娩後に由来する細胞を使用した、神経組織の再生または修復のための薬剤成分と装置と方法である。

本発明の１つの観点は、単離された分娩後に由来する細胞を特徴とし、これは、実質的に血液を含まない、ヒトの胎盤または臍帯の組織に由来するのもであって、前記細胞は培養中で自己再性能があり、また増殖することができ、神経表現型の細胞に分化する能力を有し、また前記細胞は成長にＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で成長し得る。さらにこの細胞は、以下の特徴群の１つ以上を有し、それらは、（ａ）培養内で少なくとも約４０回の倍加の能力、（ｂ）コーティングされた組織培養容器、またはコーティングされていない組織培養容器で接着、増殖するものであって、前記コーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを有する、（ｃ）組織因子とビメンチンとアルファ−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生、（ｄ）ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＰＤ−Ｌ２とＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、（ｅ）フローサイトメトリーで検出される、ＣＤ３１とＣＤ３４とＣＤ４５とＣＤ８０とＣＤ８６とＣＤ１４１とＣＤ１７８とＢ７−Ｈ２とＨＬＡ−ＧとＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの少なくとも１つの産生の欠如、（ｆ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞（ｉｌｅａｃ ｃｒｅｓｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ）であるヒト細胞に関連する遺伝子の発現が、以下をコードする少なくとも１つの遺伝子で増加し、それらの遺伝子が、インターロイキン８と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫成長刺激活性、アルファ）と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３と、腫瘍壊死因子と、アルファ誘導性タンパク質３と、Ｃ−タイプ・レクチンスーパーファミリーメンバー２と、ウィルムス腫瘍１と、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２と、レニンと、酸化低密度リポプロテイン受容体１と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１と、プロテインキナーゼＣゼータと、仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３と、卵巣癌で下方制御１（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ １）と、クローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３のヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子、である、（ｇ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞である、ヒト細胞に関連する遺伝子の発現が、以下をコードする少なくとも１つの遺伝子で減少し、それらの遺伝子は、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２と、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）と、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡと、ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２から）と、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）と、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓ ホメオボックス・ホモログ１（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、クリスタリン アルファＢと、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ 関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ２）と、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０ タンパク質と、ニューラリン（ｎｅｕｒａｌｉｎ）１の類似体と、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）と、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメインと、コレステロール２５ヒドロキシラーゼと、ｒｕｎｔ関連転写因子３と、インターロイキン１１受容体 アルファと、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ・エンハンサーと、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ホモログ７（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、仮想的遺伝子ＢＣ００８９６７と、コラーゲン タイプＶＩＩＩ アルファ１と、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ））と、イルコイ相同体タンパク質５と、ヘファエスチンと、インテグリン ベータ８と、シナプス小胞糖タンパク２と、神経芽細胞腫 腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １）と、インスリン様成長因子結合タンパク質２ ３６ｋＤａと、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４と、サイトカイン受容体様因子１と、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャネル サブファミリーＮ メンバー４と、インテグリン ベータ７と、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓ ホメオボックス・ホモログ２（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質と、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））と、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１と、初期成長応答３と、ディスタル・レス・ホメオボックス５と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３７３と、アルド・ケト還元酵素ファミリー１ メンバーＣ３（３−アルファ・ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩ）と、バイグリカンと、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、フィブロネクチン１と、プロエンケファリンと、インテグリン ベータ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン群を含む）と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ全長インサート ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２と、ＥｐｈＡ３と、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質と、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）と、仮想的タンパク質 ＦＬＪ１４０５４と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２から）と、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様と、ＡＥ結合タンパク質１と、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）と、ニューラリン１の類似体（ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｎｅｕｒａｌｉｎ １）と、Ｂ細胞転座遺伝子１（Ｂ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ １）と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２３１９１と、ＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１、であり、（ｈ）ＭＣＰ−１と、ＩＬ−６と、ＩＬ−８と、ＧＣＰ−２と、ＨＧＦと、ＫＧＦと、ＦＧＦと、ＨＢ−ＥＧＦと、ＢＤＮＦと、ＴＰＯと、ＭＩＰ１ａと、ＲＡＮＴＥＳと、ＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌、および（ｉ）ＥＬＩＳＡによる検出で、ＴＧＦ−ベータ２と、ＡＮＧ２と、ＰＤＧＦｂｂと、ＭＩＰ１ｂと、Ｉ３０９と、ＭＤＣと、ＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌がないこと、である。

特定の実施形態では、前記分娩後由来細胞は臍帯由来細胞である。他の実施形態では、前記分娩後由来細胞は胎盤由来細胞である。特定の実施形態では、前記細胞は以下のいずれかの細胞タイプの識別特徴群のすべてを有する。これらは、細胞タイプＰＬＡ０７１００３（Ｐ８）（ＡＴＣＣ受入番号：ＰＴＡ−６０７４）、細胞タイプＰＬＡ０７１００３（Ｐ１１）（ＡＴＣＣ受入番号：ＰＴＡ−６０７５）、細胞タイプＰＬＡ０７１００３（Ｐ１６）（ＡＴＣＣ受入番号：ＰＴＡ−６０７９）、細胞タイプＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）（ＡＴＣＣ受入番号：ＰＴＡ−６０６７）、または細胞タイプＵＭＢ０２２８０３（Ｐ１７）（ＡＴＣＣ受入番号：ＰＴＡ−６０６８）である。

特定の実施形態では、分娩後由来細胞群は、メタルプロテアーゼ活性と粘膜溶解活性と中性プロテアーゼ活性を含む、１若しくはそれ以上の酵素活性の存在下で単離される。好適には、前記細胞群は正常の核型を有し、この核型は、前記細胞群が培養で継代されるときに維持される。好適な実施形態では、前記分娩後由来細胞群は、フローサイトメトリーで検知すると、ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＦＤＧＦｒ−アルファとＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを含むが、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれをも含まない。

本発明の別の観点は、上記の前記分娩後由来細胞群を構成する細胞集団を特徴とする。１つの実施形態では、前記集団は、実質的に均一の集団の前記分娩後由来細胞群である。特定の実施形態では、前記集団は、クローン細胞系の前記分娩後由来細胞群である。別の実施形態では、前記集団は、前記分娩後由来細胞群および少なくとも１つの他の細胞タイプを含む、不均一な集団である。特定の実施形態では、前記の他の細胞タイプは、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、または他の複能性幹細胞または多能性幹細胞である。他の実施形態では、神経系統の方へ幹細胞の分化を刺激させる、１つ若しくはそれ以上の因子に、前記細胞集団を触れさせて培養する。

また、分娩後由来細胞群から調製された細胞溶解物も、本発明に従った特色である。前記細胞溶解物は、膜を豊富に含む１つの分画および１つの溶解性細胞分画に分離でき得る。本発明はまた、前記分娩後由来細胞によって生成される細胞外マトリックス、並びに、前記細胞が成長した馴化培地を特色とする。

本発明の別の観点は、神経変性の病状を有する患者を治療する方法を特色とし、前記方法には、前記神経変性病状を治療するのに有効な投与量で、前記患者に前述の分娩後由来細胞群を投与することが含まれる。ある種の実施形態では、前記神経変性病状は、急性神経変性病状（例えば、脳損傷、脊髄損傷、または末梢神経損傷）である。他の実施形態では、前記神経変性病状は、慢性または進行性の神経変性病状（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、腫瘍、多発性硬化症、または慢性末梢神経損傷）である。

１つの実施形態では、前記分娩後由来細胞群が、投与前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導されて神経系統細胞に分化する。他の実施形態では、前記細胞群を遺伝子操作して、前記神経変性病状の治療を促進する遺伝子産物を産生するようにする。

特定の実施形態では、前記細胞群は、少なくとも１つの他の細胞タイプ（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、または他の複能性幹細胞または多能性幹細胞）と共に投与される。これらの実施形態では、前記の他の細胞タイプは、前記分娩後由来細胞群と同時に、或いは、前記分娩後由来細胞群の、投与以前に、または投与以後に、投与され得る。同様に、これらの実施形態または他の実施形態で、前記細胞群は、少なくとも１つの他の薬剤（例えば、神経治療用の薬剤）、または別の有益な補助薬剤（例えば、抗炎症性薬剤、抗アポトーシス薬剤、酸化防止剤、または成長因子）と共に投与される。これらの実施形態では、前記の他の薬剤は、前記分娩後由来細胞群と同時に、或いは、前記分娩後由来細胞群の、投与以前に、または投与以後に、投与され得る。

特定の実施形態では、前記細胞は前記患者の中枢神経系または末梢神経系の、前もって決定された部位に投与される。前記細胞は、注射または輸液で投与されるか、または移植可能なデバイス内に封入されるか、前記細胞群を含むマトリックスまたは足場の移植によって投与される。

本発明の別の観点は、神経変性の病状を有する患者を治療するための薬剤成分を特色とし、前記薬剤成分には、薬理学的に許容される担体、および前述の分娩後由来細胞群が含まれる。治療される前記神経変性病状は、急性神経変性病状であってもよく、または慢性または進行性の病状であってもよい。

特定の実施形態では、前記薬剤成分は、前記成分の調製前に神経系統の細胞群へ分化するようにｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞群、または前記神経変性病状の治療を促進する遺伝子産物を産生するように遺伝子操作された細胞群、を含む。

特定の実施形態では、前記薬剤成分は、少なくとも１つの他の細胞タイプ（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、または他の複能性幹細胞または多能性幹細胞）を含む。これらの実施形態または他の実施形態で、前記薬剤成分は、少なくとも１つの他の薬剤（例えば、神経治療用の薬剤）、または別の有益な補助薬剤（例えば、抗炎症性薬剤、抗アポトーシス薬剤、酸化防止剤、または成長因子）を含む。

特定の実施形態では、前記薬剤成分は、注射または輸液によって投与するために調製される。別法では、前記薬剤成分は、前記細胞群が封入された移植可能なデバイス、または前記細胞群を含むマトリックスまたは足場を含み得る。

本発明の更に別の観点によると、神経変性病状を有する患者を治療するためのキットが提供される。前記キットには、薬理学的に許容される担体と前述の分娩後由来細胞群の集団と前記患者を治療する方法で前記キットを使用する説明書が含まれる。前記キットはさらに、少なくとも１つの試薬、および前記分娩後由来細胞群を培養するための説明書を含む。前記キットはまた、少なくとも１つの他の細胞タイプの集団、または神経変性病状を治療するための少なくとも１つの他の薬剤を含み得る。

本発明の別の観点によると、神経変性の病状を有する患者を治療するための方法が提供され、前記方法は、前記患者に投与すること、および前述の分娩後由来細胞群から作製された調製物を含む。そのような調製物は、前記分娩後由来細胞群の細胞溶解物（またはその分画）、前記分娩後由来細胞群の細胞外マトリックス、または前記分娩後由来細胞群が培養された馴化培地、を含み得る。別の観点では、本発明は薬剤成分を特色とし、そのような薬剤成分は、薬理学的に許容される担体、および前記分娩後由来細胞群から作られる調製物を含み、前記調製物は、前記分娩後由来細胞群の細胞溶解物（またはその分画）、前記分娩後由来細胞群の細胞外マトリックス、または前記分娩後由来細胞群が培養された馴化培地、であり得る。本発明のこの観点を実践するためのキットもまた、提供される。これらのキットには、薬理学的に許容される担体または他の薬剤や試薬の１つ若しくはそれ以上、細胞溶解物またはその分画、細胞外マトリックス、または、前記分娩後由来細胞群からの馴化培地、の１つ若しくはそれ以上、および前記キットの構成部品の使用説明書、を含み得る。

本発明の別の観点は、神経系統細胞群の生存、成長、または活性を増加させる方法を特徴とする。前記方法は、前記神経系統細胞群の前記の生存、成長、または活性を増加させるのに効果的な条件下で、本発明の前記分娩後由来細胞群と共に前記神経系統細胞群を共培養することを含む。前記方法を実践するためのキットもまた、提供される。前記キットは、前記分娩後由来細胞群、および、前記神経系統細胞群の前記の生存、成長、または活性を増加させるのに効果的な条件下で前記分娩後由来細胞群と共に前記神経系統細胞群を共培養するため説明書、を含む。

本発明の他の特色および有利性は、下記の詳細な説明および実施例から明らかであろう。

定義
本明細書および本請求項を通して使用される種々の用語は、下記のように定義する。

「幹細胞」は、未分化の細胞群であって、単一の細胞が、自己再生できる能力と、分化して子孫細胞群（自己再生する前駆細胞と、自己再生できない前駆細胞と、最終分化細胞を含む）を産生する能力によって定義される。幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、複数の胚葉（内胚葉と中胚葉と外胚葉）からの種々の細胞系統群の機能的な細胞に分化できる能力によっても特徴付けられ、並びに、移植後、複数の胚葉組織を生じさせること、および、胚盤胞に注入後にすべてではなくてもほとんどの組織に実質的に寄与すること、の能力によっても特徴付けられる。

幹細胞は、その発生能に従って、（１）全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）と、（２）多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）と、（３）複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）と、（４）オリゴポーテント（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）と、（５）単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）、として分類される。「全能性」細胞群は、すべての胚細胞タイプ群および胚体外タイプ群を生じさせることができる。「多能性」細胞群は、すべての胚細胞タイプ群を生じさせることができる。「複能性」細胞群は、細胞系統群のサブセットであるが特定の組織、器官、または生理的システム内のすべてを生じさせる細胞群を含む（例えば、造血幹細胞群（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）と血液細胞に限られたオリゴポーテント前駆細胞群と血液の正常成分である全細胞タイプ群および要素（例えば、血小板群）を含む子孫を生じ得る）。「オリゴポーテント」である細胞群は、複能性幹細胞群より限られたサブセットの細胞系統群を生じることができ、「単能性」である細胞群は１つの細胞系（例えば、精子形成幹細胞群）を生じさせることができる。

幹細胞はまた、それらが採取された源泉に基づいて分別される。「成体幹細胞」は一般的に、複数の分化した細胞タイプを含む組織内で見つけられる多能性未分化細胞である。前記成体幹細胞は自己再生し得る。通常の環境では、前記成体幹細胞は分化して、それが由来する前記組織の特定細胞タイプ群、および可能性として他の組織タイプ群を産出し得る。「胚幹細胞」は、胚胞期の胚の内部細胞塊からの多機能細胞である。「胎児」幹細胞は、胎児の組織または膜から由来する細胞である。「分娩後幹細胞」は、複能性細胞または多能性細胞であって、出産後に利用できる胚体外組織、すなわち胎盤および臍帯、から実質的に由来する。これらの細胞は、多能性幹細胞の特徴的な特色（急速な細胞増殖および多くの細胞系統に分化できる能力を含む）を有することが見つけられている。分娩後幹細胞は、血液由来（例えば、臍帯血から採取された細胞）または血液以外に由来（例えば、臍帯および胎盤の非血液組織から採取された細胞）であり得る。

「胚組織」は通常、胚に由来する組織として定義される（ヒトでは、胚は、受精から約６週間の発生までの期間を意味する）。「胎児組織」は、胎児に由来する組織を意味する（ヒトでは、胎児は、約６週間の発生から出産までの期間を意味する）。「胚体外組織」は、胚または胎児に随伴する組織であるが、胚または胎児に由来しない組織である。胚体外組織には、胚体外膜（絨毛膜と羊膜と卵黄と尿膜）と、臍帯と、胎盤（それ自体は、前記絨毛膜および母体側の基底脱落膜から形成される）が含まれる。

「分化」は、特殊化されていない（「コミットしていない」）細胞、またはそれほど特殊化されていない細胞が、特殊な細胞（例えば、神経細胞または筋肉細胞）の特色を獲得する過程である。「分化した」細胞は、細胞の系統内で、より特殊化した（「コミットした」）状態を取った細胞である。用語「コミットした」が、分化の過程に適用された場合、以下のような細胞を意味する。そのような細胞は、その分化経路を進み、通常の状況では、前記細胞が特定細胞タイプ、または細胞タイプ群のサブセットに分化し続け、通常の状況では、他の細胞タイプに分化したり、またはより分化していない細胞タイプに逆戻りすることができない。「脱分化」は、細胞が、細胞系統内で特殊化していない（コミットしていない）位置に逆戻りする過程を意味する。当明細書では、細胞の「系統」は、前記細胞の生来性、すなわち、前記細胞がどの細胞群から生じたのか、また前記細胞が何の細胞に成り得るか、を意味する。細胞の系統は、発生および分化の生来性の枠内に前記細胞を置く。

広範な意味では、「前駆細胞」は、その前駆細胞よりもっと分化した子孫を作る能力を有し、子孫の集団を補給する能力をまだ保持する、細胞である。その定義によって、幹細胞群自体もまた前駆細胞群であり、最終的に分化した細胞群にとっては、直前の前駆の細胞群も前駆細胞群である。以下の詳細な記述で、本発明の細胞群を参照する場合、この広範な定義の「前駆細胞」が使用される場合がある。狭い意味では、前駆細胞はしばしば、前記分化経路中の中間体である細胞として定義される。すなわち、前駆細胞は幹細胞から発生し、成熟した細胞タイプまたはサブセットの細胞タイプ群の産生段階の中間体である。このタイプの前駆細胞は一般的に、自己再生することができない。したがって、このタイプの細胞が当明細書で言及される場合は、「非再生前駆細胞」または「中間体前駆細胞（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）または中間体先駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）」として呼ばれるであろう。

本明細書で使用される「神経系統または神経発現型に分化する」の成句は、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の特定の神経発現型（すなわちニューロンまたはグリア細胞、後者のカテゴリーはアストロサイト群と、オリゴデンドロサイト群と、シュワン細胞群と、ミクログリア細胞群を含むがこれに限らない）に、部分的にまたは完全に、コミットした細胞を意味する。

本発明の前記細胞群は一般的に、「分娩後由来細胞群（ｐｏｓｔｐａｒｔｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ）」または「ＰＰＤＣ群」として呼ばれる。これらはまた時々、より特異的に「臍帯由来細胞群」または「胎盤由来細胞群」（「ＵＤＣ群またはＰＤＣ群」）として呼ばれる場合がある。さらに、前記細胞群は幹細胞群または前駆細胞群として記述されることもあり、後者の用語は広範な意味で使用される場合がある。用語「由来」は、前記細胞群がそれらの生物学的源泉から取得されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長されるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで操作されたこと（例えば、前記集団を増殖し、細胞株を作成するために成長培地で培養されること）を意味するために使用される。臍帯幹細胞群のｉｎ ｖｉｔｒｏでの操作、および本発明の臍帯由来細胞群のユニークな特徴は、以下に詳細に記載される。

種々の用語は、培養内の細胞を記述するために使用される。一般的に、「細胞培養」は、生物から取得され、制御された条件下で培養される細胞を意味する。「初代培養細胞」は、最初の継代培養の前の、生物（または複数の生物群）から直接採取された細胞、組織、または器官の培養である。細胞群が培養内で「増殖」されるとは、成長および／または分裂を促進する条件下で成長培地内に前記細胞群が置かれ、その結果、前記細胞群の集団が増加することである。細胞群が培養内で増殖されるとき、細胞増殖の速度は、細胞数で２倍になるのに必要な時間によって測定されることが時々あり、これは「倍加時間」と呼ばれる。

「細胞株」は、初代細胞培養の１回若しくはそれ以上の継代培養によって形成された、１集団の細胞群である。１回の継代培養は、１継代として呼ばれる。細胞群が継代培養されるとき、これらの細胞群は「継代された」と呼ばれる。特定の集団の細胞群、または細胞株、は時々、継代された回数によって呼ばれ、特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞集団は、「Ｐ１０」培養として呼ばれることがある。初代培養、すなわち組織から細胞群を単離した後の最初の培養、はＰ０と指定される。最初の継代培養後、前記細胞群は２番目の培養（Ｐ１または継代１）として記述される。前記の２番目の継代培養後、前記細胞群は３番目の培養（Ｐ２または継代２）として記述され、それ以降も同様に記述される。継代間に多数の集団倍加群がある可能性があり、したがって、培養の集団倍加群の数が継代数より大きいことは当業者が理解できるであろう。継代間の細胞群の増大（すなわち、集団倍加群の数）は、多くの因子群に依存し、それらの因子群には、限定するものではないが、播種密度と基材と培地と成長条件と継代の間の時間が含まれる。

「馴化培地」は、培地であって、その培地内で、特定の細胞、または特定の細胞集団が培養された後、除去されたことを特徴とする。細胞群が培地内で培養されたとき、これらの細胞群は、他の細胞群に栄養素の支持を提供し得る細胞性因子を分泌している可能性がある。そのような栄養素因子には、限定するものではないが、ホルモンとサイトカインと細胞外マトリクス（ＥＣＭ）とタンパク質と小胞と抗体と顆粒が含まれる。前記細胞性因子を含む前記培地が、前記馴化培地である。

一般的に、「栄養因子」は、細胞の生存性、成長、分化、増殖、および／または成熟を促進するか、または細胞の増加した活性を刺激するような物質として定義される。異なるタイプの細胞群の間で、栄養因子を介して細胞群の間での相互作用が起こり得る。栄養因子を介する、細胞間の相互作用は、基本的にすべての細胞タイプ群で見られ、特に、神経細胞タイプ群の間での重要な情報伝達手段である。栄養因子はまた、自己分泌の仕方で機能し得る。すなわち、細胞は、その細胞自体の生存性、成長、分化、増殖、および／または成熟に影響する栄養因子を産生し得る。

培養されている骨格動物の細胞群について言及するとき、用語「老化」（または「複製老化」または「細胞老化」）は、限界のある細胞培養に起因する特性、すなわち、前記細胞群が、有限数の集団倍加群（時々、「Ｈａｙｆｌｉｃｋの限界」と呼ばれる）を超えて成長できないこと、を意味する。細胞老化は最初、繊維芽様細胞群を用いて説明されていたが、培養内で成長することに成功したほとんどのヒト正常細胞タイプ群は、細胞性老化を起こす。異なる細胞タイプ群のｉｎ ｖｉｔｒｏでの寿命は異なるが、最大寿命は通常、１００未満の集団倍加群である（これは、培養内の全細胞群が老化になり、したがって前記培養が分裂できなくなる倍加数である）。老化は実際の時間に依存せず、むしろ前記培養の細胞分裂の回数、または集団倍加数によって測定される。このように、必須成長因子を取り除くことによって休止状態になった細胞群は、前記成長因子が再導入されると、成長と分裂を再開することができ、その後、同等の細胞群が連続的に成長するのと同じ倍加数を行える。同様に、細胞群が、種々の集団倍加数の後、液体窒素で冷凍され、その後、凍解し培養されると、前記細胞群は、冷凍されずに培養内に維持された細胞群と実質的に同一の倍加数を行う。老化細胞群は、死んだ細胞群または死につつある細胞群ではない。実際に老化細胞群はプログラム細胞死（アポトーシス）に抵抗性があり、３年間もの間、非分裂の状態に維持されている。これらの細胞群は非常に活動的であり、代謝的に活発であるが、分裂しない。老化細胞群の非分裂状態が、いずれの生物学的試薬、化学的試薬、またはウイルス試薬によって逆転され得ることはまだ発見されていない。

用語「神経変性病状（または障害）」は、中枢神経系または末梢神経系の、急性病状、慢性病状、障害、または、疾患を網羅する包括的な用語である。神経変性病状は年齢に関連する場合があり、或いは損傷や外傷から起こる場合があり、或いは特定の疾患または障害に関連する場合がある。急性の神経変性病状には、限定するものではないが、脳血管不全を含む神経性細胞死または神経細胞障害に関連する病状、巣性またはびまん性の脳外傷、びまん性脳損傷、脊髄損傷または末端神経外傷（例えば、物理的火傷、化学的火傷、深い切り傷、または手足の切断から起こる）が含まれる。急性神経変性障害の例には、脳虚血または脳梗塞（塞栓性閉塞および血栓性閉塞を含む）、急性虚血後の再かん流、周産期低酸素虚血性損傷、心停止、並びに、任意のタイプの頭蓋内出血（例えば、硬膜外と脳膜下とクモ膜下と脳室内）、および頭蓋内および脊椎内の病変群（例えば、挫傷と貫入と剪断と圧迫と裂傷）、並びにむち打ち症および揺さぶられっ子症候群、がある。慢性神経変性病状には、限定するものではないが、アルツハイマー病と、ピック病と、びまん性レーヴィ小体病と、進行性核上麻痺（スティール・リチャードソン症候群）と、多系統変性（シャイ−ドレーガー症候群）と、神経変性に伴う慢性てんかん性病状と、筋萎縮性側索硬化症を含む運動ニューロン疾患と、変性運動失調（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａｔａｘｉａｓ）と、皮質基底変性と、グアムのＡＬＳとパーキンソン痴呆複合と、亜急性硬化性全脳炎と、ハンチントン病と、パーキンソン病と、シヌクレインノパシー（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）（多系統萎縮症を含む）と、原発性進行性失語症と、線条体黒質変性症と、マチャド・ジョセフ病／脊髄小脳性運動失調タイプ３およびオリーブ核橋小脳変性症と、ジルドラツーレット病と、球麻痺および仮性球麻痺と、脊髄性筋萎縮症および脊髄延髄性筋萎縮症（ケネディ病）と、原発性側索硬化症と、家族性痙性対麻痺と、ウェルドニッヒ・ホフマン病と、クーゲルバーグ・ウェランダー病と、ティ−サックス病と、サンドホフ病と、家族性痙性病（ｆａｍｉｌｉａｌ ｓｐａｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）と、ヴォールファルト・クーゲルベルク・ヴェランデル病と、痙性対麻痺と、進行性多病巣性白質脳障害と、家族性自律神経異常症（ライリー・デイ症候群）と、プリオン病（限定するものではないが、クロイツフェルト・ヤコブ病と、ゲルストマン・シュトロイスラー・シィンカー病と、クールと、致死性家族性不眠症とを含む）と、脱髄疾患および障害（多発性硬化症、および白質ジストロフィなどの遺伝性疾患）とを含む。

他の神経変性病状には、ＣＮＳおよびＰＮＳに影響する腫瘍および他の腫瘍性病状を含む。その根本的な病気が（神経変性ではなくて）増殖性であっても、周辺の組織が悪化し得る。さらに、細胞治療を利用して、前記腫瘍部位にアポトーシス性分子または他の抗腫瘍性分子を送達し得る（例えば、そのような薬品を産生する遺伝的に修正された細胞群の送達）。

他の神経変性病状には、種々の神経障害、例えば、特に、多発性神経障害と、感覚性ニューロパシーと、運動神経障害と、感覚運動ニューロパシーと、感染関連ニューロパシーと、自律性ニューロパシーと、感覚自律性ニューロパシーと、脱髄性ニューロパシー（限定するものではないが、ギラン−バレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発根神経炎を含む）と、他の炎症性および免疫性のニューロパシーと、薬剤によって誘導されるニューロパシーと、薬理学的治療によって誘導されるニューロパシーと、毒素によって誘導されるニューロパシーと、外傷性神経症（限定するものではないが、圧迫、圧挫、裂傷、および分節性神経障害を含む）と、代謝性神経障害と、内分泌性ニューロパシーと、癌性ニューロパシー、などが含まれる。

他の神経変性病状には、認知症を含み、それは根底の病原にかかわらず、年齢に関連する認知症および他の認知症類を含み、また記憶喪失を伴う病状類を含み、それらには、アルツハイマー病に関連する認知症と、血管性認知症と、びまん性白質病（ビンスワンガー病）と、内分泌または代謝を源泉とする認知症と、頭外傷およびびまん性脳損傷の認知症と、拳闘家認知症および前頭葉認知症とを含む。

用語「神経変性病状の治療」は、当明細書で定義された神経変性病状の効果を改善すること、または、前記神経変性病状の進行を遅らせるか、停止するか、または逆転すること、または、前記神経変性病状の開始を遅らせるか、阻止することを意味する。

用語「有効な量」は、試薬または薬学的組成物（例えば、成長因子、分化薬剤、栄養因子、細胞集団、または他の薬剤）の濃度または量を意味し、それが、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞成長および／または分化、または当明細書に記述されたように神経変性病状を治療すること、を含む、目的の結果を生み出すのに効果的であることを特徴とする。成長因子類に関して、有効な量は、約１ナノグラム／ミリリットルから約１マイクログラム／ミリリットルの範囲であり得る。ｉｎ ｖｉｖｏで患者に投与されるＰＰＤＣ群に関しては、有効な量は数百またはそれ以下から数百万またはそれ以上までの範囲であり得る。特定の実施形態では、有効な量は、１０^３〜１０^１１の細胞群の範囲であってよく、より特異的には、少なくとも約１０^４の細胞群であり得る。投与される細胞数は、治療される障害の詳述によって異なるであろうことを理解されたい。そのような障害の詳述には、治療されるサイズまたは全容積／表面面積に限定するものではなく、投与部位から治療される領域までの近接性や医薬生物学者が精通した他の因子群が含まれる。

用語「有効な期間（または時間）」および「有効な条件」は、その目的の結果を達成するために薬剤または薬学的組成物に必要な、または好適な、期間、または他の制御可能な条件（例えば、温度、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法での湿度）を意味する。

用語「患者」または「被験者」は、当明細書で記載された前記薬学的組成物で治療される、または当明細書で記載された前記方法群にしたがって治療される、動物を意味し、これは哺乳類を含み、好適には人間群である。

用語「生物学的に適合する担体または培地」と同義的に使用され得る用語「薬理学的に許容される担体（または培地）」は、治療で投与される細胞群および他の薬剤と適合するだけでなく、適切な医学的判断の観点内で、妥当な寄与／リスク比で、過剰の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の合併症を伴わずに、人間群および動物の組織との接触しての使用に好適な、試薬、細胞群、化合物、物質、成分、および／または投薬形態を意味する。本明細書で詳細に記載されているように、本発明の使用に好適な、薬理学的に許容される担体には、液体と半固形物質（例えば、ゲル）と固体物質（例えば、細胞足場およびマトリックスと、チューブシートと、当分野で周知の、また当明細書で詳細に記述されている、その他のそのような物質）を含む。これらの半固形物質および固形物質は、身体中での分解に耐えられるように設計されてもよく（「非生体分解性」）、またはこれらは、身体内で分解するように設計することもできる（「生体分解性」）。生体分解性の物質はさらに、「生体再吸収性または生体吸収性」であってもよく、すなわち、これは、身体流動体で分解され吸収され得るか（水溶性移植物が１例である）、または、他の物質への変換、または天然の経路群を通して分解され除去されるかのいずれかで、分解され最終的には除去され得る。

細胞置換療法（ｃｅｌｌ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ）に関するいくつかの用語が、本明細書で使用される。用語群「自己移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、「自己移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「自家移植（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）」等は、細胞ドナーがまた、細胞置換療法の受容者であるような治療群を意味する。用語群「同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、「同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「同種移植（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）」等は、細胞ドナーが、細胞置換療法の受容者と同じ種であって、同一の個人でない場合の治療群を意味する。ドナーの細胞群が受容者と組織適合的に一致しているような細胞移植は時々、「同系移植」として呼ばれる。用語群「異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、「異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）」等は、前記細胞ドナーが、前記細胞置換療法の前記受容者とは異なる種であるような治療群を意味する。

記述
神経変性病状（急性と慢性と進行性の障害、および、広範に異なる原因を有する疾患を網羅する）は、特定群または脆弱な群の神経細胞群の機能障害または損失を、１つの共通の特色として有する。この共通性は、脆弱な神経組織または損傷神経組織の修復および再生のための似な治療アプローチの開発を可能にし、その１つが、細胞に基づく治療である。ここに記載される種々の実施形態で、本発明は、分娩後組織から由来する前駆細胞群および細胞集団群を利用する、神経修復および神経再生のための方法および薬剤成分を特色とする。本発明は任意の神経変性病状に適用できるが、治療または療法がこれまで困難であったか、または利用できなかった、いくつかの神経障害に特に適していると予測される。これらには、限定するものではないが、パーキンソン病と、アルツハイマー病と、ハンチントン病と、卒中と、筋萎縮性側索硬化症と、多発性硬化症と、脊髄損傷と、慢性末梢神経損傷（例えば、糖尿病性ニューロパシーに付随する疾患）が含まれる。

上記に概略されたように、本発明は、一般的に、その観点の１つで、単離した分娩後由来細胞群（ｐｏｓｔｐａｒｔｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ：ＰＰＤＣ）に向けられ、ＰＰＤＣ群は、実質的に血液を含まないようにされ、胎盤組織または臍帯組織に由来している。ＰＰＤＣ群は、培養内で自己再生して増殖することができ、神経細胞表現型の細胞群に分化する能力を有する。特定の実施形態は、そのような細胞群から成る集団群、前記細胞群またはそれらの成分や産物から成る薬剤成分、急性または慢性の神経変性病状を有する患者群を治療するために前記薬剤成分を使用する方法、を特色とする。前記分娩後由来細胞群は、培養内でのその成長の特性、すなわち、それらの細胞表面マーカーによって、それらの遺伝子発現によって、特定の生化学的栄養素を産生する能力によって、および、それらの免疫学的性質によって、特徴付けられている。

ＰＰＤＣ群の調製
当明細書に記載された方法に従うと、満期妊娠または早産のどちらかの終了後に、またはそのすぐ後に、例えば出産後の娩出後に、哺乳の胎盤および臍帯が回収される。前記分娩後組織は、滅菌済みの容器（例えば、フラスコ、ビーカー、培養ディシュ、または袋）で、出産場所からラボまで輸送され得る。前記容器には溶液または培地が含まれていてもよく、そのような溶液または培地には、限定するものではないが、食塩水（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、または移植用臓器輸送に使用される任意の溶液（例えば、ＵＷ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）液またはパーフルオロケミカル溶液）が含まれる。１つ若しくはそれ以上の抗生物質／抗真菌剤（例えば、限定するものではないが、ペニシリンとストレプトマイシンとアンホテリシンＢとゲンタマイシンとナイスタチン）が前記培地または前記緩衝液に加えられてもよい。前記分娩後組織は、ヘパリン含有溶液などの抗凝血剤溶液でリンスされ得る。ＰＰＤＣ群の抽出前に、前記組織を約４〜１０℃に保つことが好ましい。ＰＰＤＣ群の抽出前に、前記組織を凍結させないことがさらに好ましい。

好適には、ＰＰＤＣ群の単離は無菌環境で行われる。前記臍帯は、当技術分野で周知の方法で前記胎盤から単離され得る。別法では、前記臍帯および前記胎盤は分離させずに使用される。好適には、ＰＰＤＣ群の単離の前に前記分娩後組織から血液および残渣を除去する。例えば、前記分娩後組織が、緩衝溶液（例えば、限定するものではないが、リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄され得る。前記洗浄緩衝液はまた、１つ若しくはそれ以上の抗生物質／抗真菌剤（例えば、限定するものではないが、ペニシリンとストレプトマイシンとアンホテリシンＢとゲンタマイシンとナイスタチン）を含み得る。

胎盤全体、またはその断片や部分を含む分娩後組織は、機械力（刻み力とせん断力）によって離解される。本発明で好ましい実施形態では、前記単離処理はまた、酵素消化の過程を利用する。培養内で成長を促進するために、複雑な組織マトリックスから個々の細胞群を単離するために有用な多くの酵素が、当技術分野で周知である。消化の弱い酵素（例えば、デオキシリボヌクレアーゼおよび中性プロテアーゼであるディスパーゼ）から消化の強い酵素（例えば、パパインおよびトリプシン）の範囲まで、これらの酵素は市販されている。網羅するものではないが、これらに適合する酵素のリストには、粘膜溶解酵素活性と、メタロプロテアーゼ活性と、中性プロテアーゼと、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、またはエラスターゼ）と、デオキシリボヌクレアーゼとが含まれる。本発明で好ましい酵素活性は、メタロプロテアーゼと中性プロテアーゼと粘膜溶解活性剤から選択される。例えば、コラゲナーゼは、組織から種々の細胞群を単離するのに有用であることが知られている。デオキシリボヌクレアーゼは１本鎖ＤＮＡを消化でき、単離中に細胞群の塊化を最小限にできる。好適な方法は、例えば、コラゲナーゼおよびディスパーゼでの、またはコラゲナーゼとディスパーゼとヒアルロニダーゼでの、酵素処理を伴い、ある種の好適な実施形態で、前記分離段階でコラゲナーゼおよび前記中性プロテアーゼのディスパーゼの混合物が使用される場合にこのような方法が提供される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍからの少なくとも１つのコラゲナーゼ、および、前記プロテアーゼ活性とディスパーゼとサーモライシンのいずれかの存在下で消化を使用するこれらの方法が、より好適である。コラゲナーゼおよびディスパーゼの酵素活性の両方で消化を使用する方法は、さらにより好適である。コラゲナーゼおよびディスパーゼの活性に加えて、ヒアルロニダーゼ活性での消化を含む方法もまた、好適である。当業者は、種々の組織源泉から細胞群を単離するための多くのそのような酵素処理が当技術分野で知られていることを理解されるであろう。例えば、ＬＩＢＥＲＡＳＥ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅシリーズ（ロッシュ社）の酵素組み合わせ群は、前記の簡単な方法での使用に適している。酵素の他の源泉が知られている。当業者は、その天然源泉から直接そのような酵素を取得し得る。当業者はまた、十分に装備されており、新しい、または、追加の、酵素、または、酵素組み合わせの、本発明の前記細胞群を単離する際の有用性を査定し得る。好適な酵素処理は、０．５時間、１時間、１．５時間、または２時間、若しくはそれ以上である。他の好適な実施形態では、前記分離段階の前記酵素処理中に、前記組織が３７℃にインキュベートされる。

本発明のいくつかの実施形態では、分娩後組織は、前記組織の種々の側（例えば、前記胎盤の乳児側と、乳児／母側と、母側）を含む部分群に分けられる。これらの分けられた部分群は、その後、本明細書に記載された前記方法に従って、機械的分離および／または酵素的分離によって分離される。乳児系統または母性系統の細胞群は、当分野で周知のいずれかの手段、例えば、核型分析、または１つのＹ染色体に対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法，によって同定され得る。

単離細胞群、または、ＰＰＤＣ群が増殖して出てくる分娩後組織を使用して、細胞培養を開始、または播種し得る。単離細胞群は、滅菌された組織培養容器に移植されるが、これらの組織培養容器は、コーティングされていないか、または細胞外マトリックスまたはリガンド（例えば、ラミニンと、コラーゲン（天然、変性、またはクロスリンクされた）と、ゼラチンと、フィブロネクチンと、他の細胞外マトリックスタンパク質）でコーティングされている。ＰＰＤＣ群は、前記細胞群の成長を維持できる任意の培養培地で培養されるが、そのような培養培地には、限定されるものではないが、ＤＭＥＭ（高グルコースまたは低グルコース）と、規定化ＤＭＥＭと、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ ２０１と、イーグル基礎培地と、Ｈａｍ’ｓ Ｆ‐１０培地（Ｆ‐１０）と、Ｈａｍ’ｓ Ｆ‐１２培地（Ｆ‐１２）と、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ 改変ダルベッコ培地と、間葉系幹細胞成長用培地（ＭＳＣＧＭ）と、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、ＲＰＭＩ１６４０と、ＣＥＬＬ−ＧＲＯ−ＦＲＥＥなどが含まれる。前記培養培地には、１つ若しくはそれ以上の成分が追加され得るが、そのような成分には、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（好ましくは約２〜１５％（容量比））と、ウマ血清（ＥＳ）と、ヒト血清（ＨＳ）と、ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥまたは２−ＭＥ）（好ましくは約０．００１％（容量比））と、１つまたはそれ以上の成長因子（例えば、血小板由来増殖成長因子（ＰＤＧＦ）と、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）と、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）と、白血球阻害因子（ＬＩＦ）と、エリスロポエチンを含む）と、Ｌ−バリンを含めたアミノ酸と、微生物汚染を抑制するための１つ若しくはそれ以上の抗生物質および／または抗真菌剤（例えば、ペニシリンＧと、硫酸ストレプトマイシンと、アンホテリシンＢと、ゲンタマイシンと、ナイスタチン、１つだけ或いは組み合わせのいずれか）とが含まれる。好適には、前記培養培地は、成長培地（低グルコースＤＭＥＭと血清とＢＭＥと抗生物質）を含む。

前記細胞群は、細胞増殖を許容する密度で培養容器類内に播種される。好適な実施形態では、前記細胞群は、空気中に約０％から約５％（容積比）の範囲のＣＯ_２で培養される。いくつかの好適な実施形態では、前記細胞群は、空気中に約２％から約２５％の範囲のＯ_２で培養され、好ましくは空気中に約５％から約２０％の範囲のＯ_２で培養される。好適には、前記細胞群は約２５℃から約４０℃の範囲で培養され、より好適には３７℃で培養される。好適には、前記細胞群はインキュベーター内で培養される。前記培養容器内の前記培地は、静止状態にあるか、または、例えばバイオリアクターを使用して、攪拌され得る。好適には、ＰＰＤＣ群は、低い酸化ストレス下（例えば、グルタチオン、ビタミンＣ、カタラーゼ、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステインの添加）で成長される。本明細書で使用されている「低酸素ストレス」は、前記培養細胞群へのフリーラジカルの損傷が無いか最小限である状態を意味する。

最適の培養培地の選択方法と培地の調製と細胞培養テクニックは、当技術分野で周知であり、種々の情報源類に記載されているが、そのような情報源類には、Ｄｏｙｌｅら（編集者群）、１９９５、ＣＥＬＬ & ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ、チチェスター市、およびＨｏおよびＷａｎｇ（編集者群）、１９９１、ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＶＩＯＲＥＡＣＴＯＲＳ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、ボストン市、が含まれ、ここで参照することによって、それら全体を開示に含める。

前記単離細胞群または組織部分を、十分な期間培養すると、前記分娩後組織からの遊走または細胞分裂、またはその両方、の結果のいずれかとして、ＰＰＤＣ群が遊出する。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＰＤＣ群は継代されるか、または、ＰＰＤＣ群は、最初に使用されていたのと同一タイプまたは異なるタイプの新しい培地を含む、別の培養容器に移され、そこで前記細胞集団が有糸分裂で増殖し得る。本発明の細胞群は、継代０と老化の間のいずれの時点でも使用され得る。好適には、前記細胞群は約３回から約２５回の範囲で継代され、より好適には約４回から約１２回の範囲で継代され、好適には、１０回または１１回継代される。クローン系集団の細胞群が単離されたことを確認するために、クローニングおよび／またはサブクローニングが行われ得る。

本発明のいくつかの観点類では、分娩後組織に存在する異なる細胞タイプ群は、亜集団群に分画され、これらの亜集団群からＰＰＤＣ群が単離され得る。これは、細胞分離用の標準的テクニック類を使用して達成でき、そのようなテクニック類には、限定するものではないが、酵素処理で、分娩後組織をその構成細胞群に分離した後、特定の細胞タイプ群（例えば、限定するものではないが、形態学的マーカー群および／または生化学的マーカー群に基づいての選択）をクローニングし選択するテクニックと、望ましい細胞群の選択的増殖（正の選択）と、不要な細胞群の選択的破壊（負の選択）と、混合した集合体中で異なる細胞凝集力に基づく分離（例えば、大豆アグルチニンを使用して）と、凍結融解手順と、混合した集合体中の前記細胞群の異なる接着性と、濾過と、従来の遠心分離法およびゾーン遠心分離法と、遠心溶出法（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）（逆流遠心：ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｅａｍｉｎｇ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）と、単位重力分離法（ｕｎｉｔ ｇｒａｖｉｔｙ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）と、向流分配法と、電気泳動法と、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）とが含まれる。クローン選択および細胞分離の手法類の概説に関しては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９９４、ＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬＳ：Ａ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＢＡＳＩＣ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ社（ニューヨーク）を参照されたい。この文献は、この参照によってこの開示は本明細書に組み込まれる。

前記培養培地は必要に応じて交換され、例えば、これは、（例えば、ピペットを使って）培養ディシュから培地を注意深く吸引し、新しい培地を補給することによって行う。十分な数、または十分な密度の細胞群が前記培養ディシュに累積するまで、インキュベーションを続ける。元の外植組織部分群は除去されてもよく、残りの細胞群は、標準的なテクニック類を使用してトリプシン処理することによって、またはセルスクレーパーを使用して、除去され得る。トリプシン処理後、前記細胞群は収集され、新しい培地に移され、上記のようにインキュベートされる。いくつかの実施形態類では、トリプシン処理後約２４時間後に、浮遊細胞群を除去するために、前記培地は少なくとも１回交換される。培養内に残った細胞群はＰＰＤＣ群と考えられる。

ＰＰＤＣ群は低温保存され得る。従って、以下に詳細に記述される好適な実施形態では、自己移植（母親または子供のいずれか）のためのＰＰＤＣ群は、子供の出産後の適度な分娩後組織類から由来し、その後低温保存され、後に移植に前記ＰＰＤＣ群が必要な場合に利用することが可能である。

ＰＰＤＣ群の特徴
ＰＰＤＣ群を特徴付けることが可能である。これは、例えば、成長特性（例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化までの継代数）、核型分析（例えば、正常な核型、母性系統または乳児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学および／または免疫細胞化学（例えば、エピトープ群の検出）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ群、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲとリアルタイムＰＣＲと従来のＰＣＲ））、タンパク質配列、タンパク質分泌（例えば、血漿凝固アッセイまたはＰＤＣ馴化培地の分析（例えば、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって））、混合リンパ球反応（例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）群の刺激の指標として）および／または当分野で周知の他の方法、で行える。

胎盤組織から由来するＰＰＤＣ群の実施例類は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）に預けられており、以下のようにＡＴＣＣ受入れ番号が指定されている。（１）株表示 ＰＬＡ ０７１００３（Ｐ８）は、２００４年６月１５日に預けられ、受入れ番号ＰＴＡ−６０７４が指定された。（２）株表示 ＰＬＡ ０７１００３（Ｐ１１）は、２００４年６月１５日に預けられ、受入れ番号ＰＴＡ−６０７５が指定された。および、（３）株表示 ＰＬＡ ０７１００３（Ｐ１６）は、２００４年６月１６日に預けられ、受入れ番号ＰＴＡ−６０７９が指定された。臍帯組織から由来するＰＰＤＣ群の実施例類は、２００４年６月１０日にアメリカン タイプ カルチャー コレクションに預けられており、以下のようにＡＴＣＣ受入れ番号が指定されている。（１）株表示 ＵＭＢ ０２２８０３（Ｐ７）は、受入れ番号ＰＴＡ−６０６７が指定された。および、（２）株表示 ＵＭＢ ０２２８０３（Ｐ１７）は、受入れ番号ＰＴＡ−６０６８が指定された。

種々の実施形態では、前記ＰＰＤＣ群は、以下の成長特性群の１つ若しくはそれ以上を有する。それらの成長特性群は、（１）前記ＰＰＤＣ群は、培養内での成長にＬ−バリンを必要とする、（２）前記ＰＰＤＣ群は、約５％から少なくとも約２０％の範囲の酸素を含む大気内で成長することが可能である、（３）前記ＰＰＤＣ群は、老化に達する前に培養内で少なくとも約４０回の倍加する能力を有する、および（４）前記ＰＰＤＣ群は、コーティングされた組織培養容器またはコーティングされていない組織培養容器上に接着し増殖するが、ここで、前記のコーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含む、である。

ある種の実施形態では、前記ＰＰＤＣ群は正常の核型を有し、この核型は、前記細胞群が継代されるときに維持される。核型分析は、胎盤に由来する母性細胞群から乳児細胞群を同定し、区別するのに特に有用である。核型分析の方法類は、取得可能であり、当分野で周知である。

他の実施形態では、前記ＰＰＤＣ群はある種のタンパク質類の産生によって特徴付けられることが可能である。そのような特性は、（１）組織因子とビメンチンとアルファ−平滑筋アクチンの少なくとも１つの産生、および（２）ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＰＤ−Ｌ２とＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの細胞表面マーカー類の少なくとも１つの産生であり、これらはフローサイトメトリーで検知される。他の実施形態では、前記ＰＰＤＣ群は、フローサイトメトリーで検知されるところでは、ＣＤ３１とＣＤ３４とＣＤ４５とＣＤ８０とＣＤ８６とＣＤ１１７とＣＤ１４１とＣＤ１７８とＢ７−Ｈ２とＨＬＡ−ＧとＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの細胞表面マーカー類の少なくとも１つの産生の欠如によって特徴付けられ得る。組織因子とビメンチンとアルファ−平滑筋アクチンの少なくとも２つを産生する細胞群は、特に好適である。組織因子とビメンチンとアルファ−平滑筋アクチンの３つをすべて産生する細胞群は、より好適である。

他の実施形態では、前記ＰＰＤＣ群は遺伝子発現によって特徴付けられ得る。この遺伝子発現は、ヒトの細胞（繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞）に関連するものであって、インターロイキン８と、レチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）１と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫成長刺激活性、アルファ）と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３と、腫瘍壊死因子と、アルファ誘導性タンパク質３と、Ｃ−タイプレクチンスーパーファミリーメンバー２と、ウィルムス腫瘍１と、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２と、レニンと、酸化低密度リポプロテイン受容体１と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１と、プロテインキナーゼＣゼータと、仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３と、卵巣癌で下方制御１（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ １）と、クローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３のヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子、の少なくとも１つをコードする遺伝子で増加している。

さらに他の実施形態では、ＰＰＤＣ群は、遺伝子発現によって特徴付けられ、繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞である、ヒト細胞に関連するものであって、以下の少なくとも１つをコードする遺伝子で発現が減少している。それらは、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２と、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）と、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡと、ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２から）と、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）と、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓ ホメオボックス・ホモログ１（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、クリスタリン アルファＢと、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ 関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ２）と、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０ タンパク質と、ニューラリン（ｎｅｕｒａｌｉｎ）１の類似体と、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）と、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメインと、コレステロール２５ヒドロキシラーゼと、ｒｕｎｔ関連転写因子３と、インターロイキン１１受容体 アルファと、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ・エンハンサーと、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ホモログ７（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、仮想的遺伝子ＢＣ００８９６７と、コラーゲン タイプＶＩＩＩ アルファ１と、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ））と、イルコイ相同体タンパク質５と、ヘファエスチンと、インテグリン ベータ８と、シナプス小胞糖タンパク２と、神経芽細胞腫 腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １）と、インスリン様成長因子結合タンパク質２ ３６ｋＤａと、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４と、サイトカイン受容体様因子１と、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャネル サブファミリーＮ メンバー４と、インテグリン ベータ７と、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓ ホメオボックス・ホモログ２（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質と、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））と、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１と、初期成長応答３と、ディスタル・レス・ホメオボックス５と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３７３と、アルド・ケト還元酵素ファミリー１ メンバーＣ３（３−アルファ・ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩ）と、バイグリカンと、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、フィブロネクチン１と、プロエンケファリンと、インテグリン ベータ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン群を含む）と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ全長インサート ｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２と、ＥｐｈＡ３と、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質と、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）と、仮想的タンパク質 ＦＬＪ１４０５４と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡと、ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２から）と、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様と、ＡＥ結合タンパク質１と、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）である。

他の実施形態では、前記ＰＰＤＣ群は、ＭＣＰ−１とＩＬ−６とＩＬ−８とＧＣＰ−２とＨＧＦとＫＧＦとＦＧＦとＨＢ−ＥＧＦとＢＤＮＦとＴＰＯとＭＩＰ１ａとＲＡＮＴＥＳとＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌によって特徴付けられ得る。別の実施形態では、前記ＰＰＤＣ群は、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２とＡＮＧ２とＰＤＧＦｂｂとＭＩＰ１ｂとＩ３０９とＭＤＣとＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如によって特徴付けられ、これはＥＬＩＳＡで検出される。

好適な実施形態では、前記細胞群は、上記にリストした成長、タンパク質／表面マーカーの産生、遺伝子発現、または物質の分泌の特徴群の２つ若しくはそれ以上を有する。前記特徴群の３つ、４つ、５つ、若しくはそれ以上を有するこれらの細胞群は、より好適である。前記特徴群の６つ、７つ、８つ、若しくはそれ以上を有するＰＰＤＣ群は、更により好適である。上記の特徴群をすべて有するこれらの細胞群は、本発明で更により好適である。

上記の前記特徴群、より具体的には、前記細胞群が正常な核型群を有し、前記細胞群が継代と共に正常な核型群を維持し、さらに前記細胞群がマーカー群のＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの各々を発現し、前記細胞群が、前記のリストされたマーカー群に対応し、免疫学的に検出可能なタンパク質類を産生することを含む特徴群、を有する分娩後細胞群は、その観点類の幾つかの点で、本発明で使用に好適な細胞群に含まれる。上記の特徴群に加えて、マーカー群のＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれに対応するタンパク質類を産生しない前記細胞群は、更により好適であり、これは、フローサイトメトリーによって検出される。

細胞系群に従って分化し、種々の表現型に至る潜在能力を有するある種の細胞群は、不安定であり、そのため自然発生的に分化し得る。自然発生的に分化（例えば、神経細胞系群に従って）することのない細胞群が、本発明の使用では好適である。好適な細胞群は、成長培地で増殖されたときに、それらの表面上で産生される前記細胞マーカー類に関して実質的に安定しており、また種々の遺伝子類の前記発現パターン（例えば、アフィメトリクス社のジーンチップ（ＧＥＮＥＣＨＩＰ）を使用して決定される）に関して安定している。前記細胞群は、複数回の集団倍加の後、例えば、継代を越えてそれらの表面マーカー特徴群で、実質的に定常のままである。

しかし、ＰＰＤＣ群の１つの特徴は、ＰＰＤＣ群を分化誘導細胞培養条件におくことによって、これらの細胞群が神経系統表現型類への分化を意図的に誘導されることが可能であることである。これは、当分野で周知の１つ若しくはそれ以上の方法類によって達成され得る。例えば、本明細書で例示されるように、ＰＰＤＣ群は、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、インビトロジェン社）とＬ−グルタミンとペニシリン／ストレプトマイシンを含むニューロベーサル−Ａ（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ）培地（この組み合わせは、本明細書で、神経前駆細胞増殖（Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ：ＮＰＥ）培地と呼ばれる）中でラミニンでコーティングされたフラスコ群にプレーティングされ得る。ＮＰＥ培地には、更にｂＦＧＦおよび／またはＥＧＦが添加され得る。別法では、（１）ＰＰＤＣ群を神経前駆細胞群と共に共培養することによって、または（２）神経前駆細胞馴化培地内でＰＰＤＣ群を成長させることによって、ＰＰＤＣ群はｉｎ ｖｉｔｒｏで分化を誘導され得る。

前記ＰＰＤＣ群の分化は、伸長した突起群を伴う双極性の細胞形態によって実証され得る。それらの誘導された細胞集団群は、ネスチンの存在で陽性に染色され得る。分化したＰＰＤＣ群は、ネスチン、ＴｕＪ１（ベータＩＩＩチューブリン）、ＧＦＡＰ、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＡＢＡ、Ｏ４、および／またはＭＢＰの検出によって評価され得る。いくつかの実施形態では、ＰＰＤＣ群は、神経幹細胞のニューロスフェア群形成に特徴的である３次元体群の形成能力を示した。

ＰＰＤＣ集団群と、ＰＰＤＣの改変類と、ＰＰＤＣ成分類と、ＰＰＤＣ産物類
本発明の別の観点は、上記の前記ＰＰＤＣ群の集団群を特徴とする。いくつかのの実施形態では、前記細胞集団は不均一な集団である。本発明の不均一な細胞集団は、本発明のＰＰＤＣ群を、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％含み得る。本発明の前記の不均一な細胞集団群はさらに、例えば、神経前駆細胞群のような、幹細胞群または他の前駆細胞群を含んでもよく、または、さらに完全に分化した神経細胞群を含んでもよい。いくつかの実施形態では、前記集団は、実質的に均一であり、すなわち実質的にＰＰＤＣ群のみ（好適には、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上のＰＰＤＣ群）を含む。本発明の前記均一な細胞集団は、臍帯または胎盤に由来する細胞群を含み得る。臍帯由来細胞群の均一な集団群は、好適には、母性系統の細胞群を含まない。胎盤由来細胞群の均一な集団群は、乳児系統または母性系統であり得る。細胞集団の均一性は、当分野で周知の任意の方法（例えば、細胞選別（例えば、フローサイトメトリー）によって、または周知の方法類に従うクローン性増殖によって）によって達成され得る。したがって、好適な均一なＰＰＤＣ集団群は、クローン細胞株の分娩後由来細胞群を含み得る。非常に望ましい機能性を有する細胞クローンが単離された場合は、そのような集団群は特に有用である。

本明細書では、また、１つ若しくはそれ以上の因子類の存在下で、または条件下でインキュベートされた細胞集団群も提供されるが、ここで、そのような因子類または条件は、神経原性経路にそって幹細胞分化を刺激する。そのような因子類は当分野で周知であり、分化に適した条件の決定は、通常の実験で達成し得ることを当業者は理解できるであろう。そのような条件の最適化は、統計的な実験計画および分析によって達成が可能である。例えば、応答曲面法によって、複数の変数群（例えば、生物学的培養内で）を同時に最適化することができる。好適な因子類には、例えば成長因子類または栄養因子類などの因子類に限定するものではなく、脱メチル剤類、神経系統細胞群との共培養、または神経系統細胞の馴化培地内での培養、を含み、並びに、神経原性経路または神経系統に沿って幹細胞の分化を刺激するような当分野で周知の他の条件を含む（例えば、Ｌａｎｇ，Ｋ．Ｊ．Ｄ．ら、２００４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７６：１８４〜１９２；Ｊｏｈｅ，Ｋ．Ｋ．ら、１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．１０：３１２９〜３１４０；Ｇｏｔｔｌｅｉｂ，Ｄ．、２００２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：３８１〜４０７を参照）。

ＰＰＤＣ群は、また遺伝的に修正されて、例えば、神経治療的に有用な遺伝子産物類を産生したり、腫瘍を治療するための抗腫瘍薬類を産生するようにできる。遺伝的修正は、種々のベクター類の任意を使用して達成され得るが、そのようなベクター類には、限定するものではないが、組込みウイルスベクター類（例えば、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター）、組み込まれない複製ベクター類（例えば、乳頭腫ウイルスベクター類、ＳＶ４０ベクター類、アデノウイルスベクター類）、または複製−不完全ウイルスベクター類（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ）を含む。ＤＮＡを細胞群に導入するための他の方法類には、リポソーム群の使用、エレクトロポレーション、パーティクルガン、またはＤＮＡのダイレクト注入が含まれる。

好適には、宿主細胞群はＤＮＡで形質転換またはトランスフェクションされ、このような形質転換またはトランスフェクションは、１つ若しくはそれ以上の適度の発現コントロールエレメント類、例えば、数あるなかでも、プロモーター配列群と、エンハンサー配列群と、転写ターミネーター群と、ポリアデニル化部位群と、選択可能なマーカーによってコントロールされる、またはこれらと作動上で関連してコントロールされる。前記挿入遺伝子の発現を促進するために任意のプロモーターが使用され得る。例えば、ウイルスプロモーター類には、限定するものではないが、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０、乳頭腫ウイルス、ＥＢウイルス、またはエラスチン遺伝子プロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、興味のある遺伝子群の発現を制御するために使用される前記コントロールエレメント類は、その産物がｉｎ ｖｉｖｏで必要なときにのみ合成されるように、前記遺伝子の制御された発現を可能にする。もし一時的な発現が望ましい場合は、構成的プロモーター類は、好適には非組み込みベクターおよび／または複製不完全ベクター内で使用される。別法では、誘導可能なプロモーター類が、必要に応じて、前記挿入遺伝子の発現を促進するために使用され得る。誘導可能なプロモーター類には、限定するものではないが、メタロチオネインおよび熱ショックタンパク質群に付随するプロモーター類が含まれる。

外来ＤＮＡの導入後、改変された細胞群は強化培地で成長させ、その後、選択培地に切り替えることも可能である。前記外来ＤＮＡ内の前記選択可能マーカーは、前記選択への抵抗を与え、それによって、細胞群が、例えば、プラスミド上に、前記外来ＤＮＡを前記細胞群の染色体群上に安定的に組み込み、増殖巣群を形成することができる。そのような増殖巣群はクローン化され、細胞株群に増殖されることができる。この方法を有利に使用して、前記遺伝子産物を発現する細胞株群を作製することが可能である。

本発明の細胞群を遺伝的に操作して、移植部位で炎症または拒絶を促進する因子類の発現を「ノックアウト」または「ノックダウン」し得る。標的遺伝子の発現レベル群を下げるために、または標的遺伝子産物の活性レベルを下げるための、負調節の技術類を以下に考察する。本明細書で使用される「負調節（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」は、調節処置がない場合の標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性と比較して、前記標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性が低いことを意味する。ニューロンまたはグリア細胞に生来の遺伝子の発現は、いくつかの技術類を使用して、減らされること、または、ノックアウトされることが可能であり、そのような技術類には、例えば、相同的組み換え技術を使用して前記遺伝子を不活性化して発現を阻害することが含まれる。通常、前記タンパク質の重要な領域をコードするエキソン（または、その領域に対するエキソン５’）が、正の選択可能なマーカー（例えば、ｎｅｏ）によって妨害され、前記標的遺伝子からの正常なｍＲＮＡが産生されることを阻止し、その結果、前記遺伝子の不活性化となる。遺伝子はまた、遺伝子の部分的な欠失を作ることによって、または、遺伝子全体を欠失させることによって、不活性化され得る。前記標的遺伝子に相同の２つの領域をゲノム中で離れさせる作成物を使用することによって、その２つの領域の間の配列が欠失され得る（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：３０８４）。アンチセンスと、ＤＮＡｚｙｍｅ類と、リボザイム類と、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、前記標的遺伝子の発現を阻害する他のそのような分子類とを使用して、標的遺伝子活性を減らすことも可能である。例えば、主要組織適合遺伝子複合体群の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ分子群は、免疫応答に関して最も多用途であることが示されている。さらに、三重らせん分子群を利用して、標的遺伝子の活性のレベルを減らすことが可能である。これらのテクニック類は、Ｌ．Ｇ．Ｄａｖｉｓら（編集）１９９４、ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ & Ｌａｎｇｅ，コネチカット州ノーウォークに詳細に記載されている。

他の観点類では、本発明は、細胞溶解物類および細胞溶解性分画類を提供するが、これらは、ＰＰＤＣ群、ＰＰＤＣ群を含む不均一な細胞集団群、またはＰＰＤＣ群を含む均一な細胞集団群、並びに、遺伝的に修正されたＰＰＤＣ群またはその内の集団群、または神経原性経路に沿って分化するように刺激されたＰＰＤＣ群またはその内の集団群、から調製されたものである。そのような溶解物類およびそれらの分画類は多くの有用性がある。前記ＰＰＤＣ溶解物のｉｎ ｖｉｖｏ溶解性分画（すなわち、実質的に膜類のないもの）の使用は、有益な細胞内環境が、拒絶または悪影響を与える他の免疫学的応答類を最も起こしやすい前記細胞表面タンパク質類を大量に誘導せずに、患者で同種異型的に使用されることを可能にする。細胞群を溶解する方法類は当分野で周知であり、機械的崩壊、酵素的崩壊、化学的崩壊、またはこれらの組み合わせ群が含まれる。そのような細胞溶解物類は、成長培地中の細胞群から直接に調製され、そのため分泌された成長因子類などを含んでいてもよく、または、例えばＰＢＳまたは他の溶液で洗浄して、培地を含まない細胞群から調製してもよい。望ましい場合には、洗浄された細胞群は元来の細胞集団密度よりも高い濃度群で再懸濁され得る。

実施形態では、細胞全体の溶解物類が調製されるが、これは、すなわち、細胞崩壊の後に細胞分画群を分離せずに調製される。別の実施形態では、細胞膜の分画が、当分野で周知の通常の方法類（例えば、遠心、濾過、または同様の方法類）によって前記細胞群の溶解性分画から分離される。

分娩後由来細胞群の集団群から調製された、細胞溶解物類または細胞溶解性分画類は、そのまま使用されてもよく、または、例えば限外濾過または凍結乾燥によってさらに濃縮されてもよく、または乾燥させてもよく、または部分的に精製されてもよく、または、当分野で周知の、薬理学的に許容される担体類または希釈剤と組み合わせてもよく、または生体化合物のような他の化合物類（例えば、薬理学的に有用なタンパク質化合物類）と組み合わせてもよい。細胞溶解物類またはそれらの分画類は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで使用されてよく、またはそれのみで使用されるか、例えば自己の生細胞群または同系の生細胞群と共に使用され得る。ｉｎ ｖｉｖｏで導入される場合は、前記溶解物類は、治療部位に局所的に導入されてもよく、或いは、例えば、患者に必要な成長因子類を提供するために、離れた位置に導入されてもよい。

更に別の実施形態では、生物学的産物類を高収率で産生するために、ＰＰＤＣ群がｉｎ ｖｉｔｒｏで培養され得る。例えば、興味のある特定の生物学的産物（例えば、栄養因子）を生来、産生する細胞群、または遺伝的に操作されて特定の生物学的産物を産生するようになった細胞群のいずれかを、当明細書で記載された前記培養テクニック類を使用して、クローンとして増殖され得る。別法では、細胞群は、神経系統への分化を誘導する培地中で増殖され得る。いずれの場合でも、前記細胞によって産生され前記培地に分泌される生物学的産物類は、標準的分離テクニック類（例えば、２〜３の例を挙げるとすれば、分別タンパク質沈殿と、イオン交換クロマトグラフィーと、ゲル濾過クロマトグラフィーと、電気泳動と、ＨＰＬＣ）を使用して、前記馴化培地から容易に単離され得る。「バイオリアクター」を使用して、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ３次元培養などの、栄養補給のフロー法を活用することが可能である。基本的には、新鮮な培地が前記３次元培養を通るときに、前記生物学的産物が前記培養から洗浄され、上記のように、その流出液から単離され得る。

別法では、興味のある生物学的産物は前記細胞に留まっていてもよく、その収集には、上記のように、前記細胞が溶解される必要がある。前記生物学的産物は、上記のテクニック類の１つ若しくはそれ以上を使用して、精製され得る。

他の実施形態では、本発明は、以下に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの使用法のために、培養されたＰＰＤＣ群からの馴化培地を提供する。前記ＰＰＤＣの馴化培地を使用すると、拒絶または悪影響を与える他の免疫学的応答類を起こし得る無傷細胞群を導入せずに、前記ＰＰＤＣが分泌する有益な栄養因子類が、患者で同種異型的に使用されることを可能にする。馴化培地の調製は、培養培地で細胞群を培養して、前記培地から前記細胞群を除去して行った。

分娩後由来細胞群の集団群から調製された馴化培地は、そのまま使用されてもよく、または、例えば限外濾過または凍結乾燥によってさらに濃縮されてもよく、または乾燥させてもよく、または部分的に精製されてもよく、または、当分野で周知の、薬理学的に許容される担体類または希釈剤と組み合わせてもよく、または生体化合物のような他の化合物類（例えば、薬理学的に有用なタンパク質化合物類）と組み合わせてもよい。馴化培地は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで使用されてよく、またはそれのみで使用されるか、例えば自己の生細胞群または同系の生細胞群と共に使用され得る。ｉｎ ｖｉｖｏで導入される場合は、前記馴化培地は、治療部位に局所的に導入されてもよく、或いは、例えば、患者に必要な細胞成長因子類または栄養因子類を提供するために、離れた位置に導入されてもよい。

別の実施形態では、液体、固体、または半流動の培養基質上でＰＰＤＣ群を培養することによって産生される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が調製され、収集され、組織修復または組織交換を必要とする被験者に生細胞群を移植する代替として利用される。ＰＰＤＣ群は、本明細書の他の項で記載した３次元の骨格構造上でｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されるが、これは、所望の量のＥＣＭが前記骨格構造に分泌されるような条件下で行われる。新しい組織は除去され、前記ＥＣＭは、別の目的用に（例えば、注入可能な調製物として）処理された。これを達成するために、前記骨格構造上の細胞群は殺生され、すべての細胞性残渣が前記骨格構造から除去される。この処理はいくつかの異なる方法類で実行され得る。例えば、その生きた組織は、冷凍保存剤を含まない液体窒素で急速冷凍されてもよく、または前記組織は滅菌済み純水に浸して、浸透圧で前記細胞群を破裂させてもよい。

前記細胞群が殺生された後、細胞膜類は崩壊されてもよく、細胞性残渣類は中性洗剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＣＨＡＰＳ、または両性イオン界面活性剤）のリンスで処理して除去され得る。別法では、前記組織は、酵素による消化、および／または、細胞膜類を破壊し細胞内容物類の除去を可能にする試薬類による抽出、を受け得る。そのような酵素類の例には、限定するものではないが、ヒアルロニダーゼと、ディスパーゼと、タンパク質分解酵素類と、核酸分解酵素類が含まれる。洗剤類の例には、非イオン性洗剤類には、例えば、アルキルアリールポリエーテルアルコール（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００）と、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ローム・アンド・ハース社、ペンシルバニア州フィラデルフィア）と、ＢＲＩＪ−３５と、ポリエトキシエタノール・ラウリルエーテル（アトラスケミカル社、カリフォルニア州サンジエゴ）と、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０）と、ポリエトキシエタノール・ソルビタン・モノラウリル酸（ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｌａｕｒｅａｔｅ）（ローム・アンド・ハース社、ペンシルバニア州フィラデルフィア）と、ポリエチレン・ラウリルエーテル（ローム・アンド・ハース社）と、イオン性洗剤類（例えば、ドデシル硫酸ナトリウムと、硫酸化高級脂肪酸アルコール群と、分岐鎖または非分岐鎖に７〜２２の炭素原子群を含む、硫酸化アルカン群および硫酸化アルキルアレン類）とを含む。

前記ＥＣＭの収集は、種々の方法で達成することができ、これは、例えば、前記新組織が生体分解性または非生体分解性の３次元骨格構造上に形成されているかによって変わる。例えば、前記骨格構造が非生体分解性である場合は、前記ＥＣＭは、前記骨格構造を音波破砕、高圧ジェット水流、機械的削り、洗剤類または酵素類での温和な処理、または、これらの任意の組み合わせにさらすことによって除去され得る。

前記骨格構造が生体分解性である場合は、前記ＥＣＭは、例えば、前記骨格構造を溶液中で分解するか、溶解するようにさせて、収集され得る。別法では、前記生体分解性骨格構造を構成する材料が、前記骨格構造自体が前記ＥＣＭと共に注入可能であるような場合には、前記骨格構造および前記ＥＣＭは、その後の注入で、その全体として処理され得る。別法では、前記ＥＣＭは、非生体分解性骨格構造からＥＣＭを収集するための上記の方法類のいずれかによって、前記生体分解性骨格構造から除去され得る。好適には、すべての収集過程類は前記ＥＣＭを変性させないように計画される。

収集された後、前記ＥＣＭはさらに処理され得る。例えば、前記ＥＣＭは、例えば音波処理など当分野で周知のテクニック類を使用して、手術針が通れるように微粒子群にホモジナイズされ得る。必要ならば、前記ＥＣＭの成分類はガンマ照射によって架橋され得る。好適には、前記ＥＣＭを０，２５から２までのメガｒａｄの範囲で照射して、前記ＥＣＭを滅菌し架橋することが可能である。グルタルアルデヒドのような毒性の試薬類を用いて化学架橋は可能であるが、一般的には好適でない。

前記ＥＣＭにある種々のタイプのコラーゲンのようなタンパク質類の量および／または比は、本発明の前記細胞群によって産生される前記ＥＣＭを、１つの、若しくは、それ以上の他の細胞タイプ群のＥＣＭと混合することによって調節され得る。さらに、タンパク質類、成長因子類および／または薬品類のような生物学的に活性な物質類を前記ＥＣＭに組み入れることが可能である。典型的な生物学的に活性な物質類には、注入部位で治癒および組織修復を促進するＴＧＦ−ベータなどの組織成長因子類が含まれる。そのような追加の試薬類は、当明細書に記載された前記実施形態のいずれでも利用することができ、例えば、細胞溶解物類、溶解性細胞分画類、または、ＰＰＤＣ群によって産生される、さらに精製された成分類および産物類と共に利用できる。

ＰＰＤＣ群、ＰＰＤＣ成分類、またはＰＰＤＣ産物類を含む薬学的組成物
別の観点では、本発明は、神経変性病状類の治療のために種々の方法類でＰＰＤＣ群、ＰＰＤＣ集団群、ＰＰＤＣ群の成分類および産物類を利用する薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態は、生細胞群（ＰＰＤＣ群のみ、または他の細胞タイプ群と混合）を含む薬学的組成物を網羅する。他の実施形態は、ＰＰＤＣ細胞性成分類（例えば、細胞溶解物類、溶解性細胞分画類、馴化培地、ＥＣＭ、または前述のいずれかの成分類）、またはＰＰＤＣ産物類（例えば、ＰＰＤＣ群によって産生されるか、または遺伝的修正を通して産生される栄養因子類および他の生物学的因子類、ＰＰＤＣ培養からの馴化培地）を網羅する。いずれの場合でも、前記薬理成分類は、さらに他の活性試薬類（例えば、当分野で周知の、抗炎症剤類、抗アポトーシス薬剤類、酸化防止剤、成長因子類、神経栄養因子類、神経再生薬剤類、または神経保護薬剤類）を含み得る。

ＰＰＤＣ薬学的組成物に加えられ得る他の成分類の例には、限定するものではないが、２〜３の例を挙げるとすれば、（１）他の神経保護的薬剤類または神経有益性薬剤類、（２）選択された細胞外マトリックス成分類、例えば、当分野で知られる１つ若しくはそれ以上のタイプのコラーゲン、および／または、成長因子類、多血小板血漿、および薬剤（別法では、ＰＰＤＣ群は遺伝的に操作されて成長因子類を発現し産生し得る）、（３）抗アポトーシス薬剤類（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯ模倣剤、トロンボポエチン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子、カスパーゼ阻害剤類）、（４）抗炎症剤（例えば、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤類、ＴＧＦベータ阻害剤類、スタチン類、ＩＬ−６およびＩＬ−１の阻害剤類、ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ、ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ、および非ステロイド性抗炎症剤類（ＮＳＡＩＤＳ））（例えば、ＴＥＰＯＸＡＬＩＮ、ＴＯＬＭＥＴＩＮ、およびＳＵＰＲＯＦＥＮ）、（５）免疫抑制剤類または免疫調節剤、例えば、カルシニュリン阻害剤類、ｍＴＯＲ阻害剤類、抗増殖性物質類、コルチコステロイド類、および種々の抗体類、（６）酸化防止剤、例えばプロブコール、ビタミンＣ、ビタミンＥ、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、およびＮ−アセチルシステイン、および（６）局所麻酔薬類、が含まれる。

本発明の薬学的組成物には、薬理学的に許容される担体または培地と共に調製された、ＰＰＤＣ群、ＰＰＤＣ群の成分類、またはＰＰＤＣ群の産物類を含む。好適な、薬理学的に許容される担体類には、水、塩溶液（例えば、リンガー溶液）、アルコール類、オイル類、ゼラチン類、および炭水化物類（例えば、ラクトース、アミロース、またはデンプン）、脂肪酸エステル類、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニールピロリジン、が含まれる。そのような調製物類は滅菌されてもよく、また必要ならば、助剤、例えば、潤滑剤類、防腐剤類、安定剤類、湿潤剤類、乳化剤類、浸透圧に影響を与える塩類、バッファー類、および着色剤など、と混合されてもよい。本発明で使用に好適な薬理学的担体類は、当分野で周知であり、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン）およびＷＯ ９６／０５３０９に記載されている。

包括的ではないが、典型的には、ＰＰＤＣの成分類または産物類を含む薬理学的成分類であって、生細胞群でないものは、液体として（または、口からの送達が好適な場合には、固形の錠剤類、カプセル状などとして）調製される。薬剤類および生物学的分子類を標的神経組織への送達を達成させるために当分野で周知の許容される任意の経路によって投与するために、これらが調製されることが可能であり、そのような経路には、限定するものではないが、経口、経鼻、経眼、および静脈を含む非経口的を含む。非経口的投与の具体的な経路としては、限定するものではないが、筋内、皮下、腹腔内、脳内、心室内、脳室内、髄腔内、嚢内、脊髄内、および／または、脊髄周辺の投与経路（頭蓋内ニードル類または脊椎内ニードル類、および／または、ポンプ装置類の付いていない、または付いている、カテーテル類、による送達）が含まれる。

ＰＰＤＣの生細胞群を含む薬理学的成分類は、通常、液体類、半固形（例えば、ゲル類）、または固形（例えば、マトリックス類、足場類、神経組織の生体工学に好適な同等物類）として調製される。液体成分類の調製は、生細胞群の前記標的組織類への送達を達成するために許容される、当分野で周知の任意の経路によって投与されるために行われる。典型的には、これらの経路には、ＣＮＳまたはＰＮＳへの注射または輸液が含まれ、これらは、広範に、または神経疾患または神経困難の部位へ標的して行われ、投与経路としては、限定するものではないが、眼内、脳内、心室内、脳室内、髄腔内、嚢内、脊髄内、および／または、脊髄周辺の投与経路（頭蓋内ニードル類または脊椎内ニードル類、および／または、ポンプ装置類の付いていない、または付いている、カテーテル類、による送達）が含まれる。

半固形担体または固形担体内に生細胞群を含む薬学的組成物は、通常、神経損傷または神経困難の部位への外科的な移植用に調製される。液体成分類もまた、外科処置によって投与され得ることを理解されたい。具体的な実施形態では、半固形またか固形の薬学的組成物は、半透性のゲル類、格子類、細胞性足場類、および同等物を含んでもよく、これらは非生体分解性または生体分解性であり得る。例えば、ある種の実施形態では、その外因性細胞群を周辺から隔離して、前記細胞群が周辺の神経細胞群に生物学的分子類（例えば、神経栄養因子類）を分泌し、送達できるようにすることが望ましいか、または適切であり得る。これらの実施形態では、細胞群は、自立的な移植物類として調製されてもよく、そのような移植物類は、生きたＰＰＤＣ群、またはＰＰＤＣ群を含む細胞集団、を含み、非生体分解性で選択的に透過性の障壁によって囲まれており、ホスト組織から前記移植細胞群を物理的に分離する。そのような移植物類は、薬理学的に誘導される免疫抑制がなくても、免疫細胞群および高分子類が前記移植細胞群を殺すのを防護する能力があるため、「免疫防御性」と呼ばれることもある（そのような装置類および方法類の概説については、例えば、Ｐ．Ａ．Ｔｒｅｓｃｏら、２０００，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．４２：３〜２７を参照）。

他の実施形態では、異なる種類の、分解性のゲル類および網状組織類が本発明の前記薬学的組成物に利用される。例えば、持続放出の調製物類に特に好適な分解性物質類には、例えば、ポリ乳酸、乳酸／グリコール酸共重合体、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン等のような生体適合性のあるポリマー類が含まれる。薬剤送達手段での分解性ポリマー類の構造、選択、および使用は、Ａ．Ｄｏｍｂら、１９９２，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３：２７９など、いくつかの出版物で概説されている。

他の実施形態では、例えば、損傷したかまたは切断した脊髄、切断された手足の神経索のような、大規模な神経病変部の修復の場合には、生体分解性の、好適には、生体再吸収性または生体吸収性の、足場またはマトリックス内で、またはその表面上で、前記細胞群を送達することが望ましいか、または適切であり得る。これらの、典型的には３次元の生体材料類は、前記生細胞群を含み、このような前記生細胞群は前記足場に付着されるか、前記足場内に分散されるか、前記足場内に封入された細胞外マトリックスに組み込まれる。これらの移植物類が身体の前記標的地域に移植されると、前記移植物類はホスト組織に組み込まれるようになり、そこで、前記移植細胞群が徐々に定着するようになる（例えば、前述のＰ．Ａ．Ｔｒｅｓｃｏら、２０００を参照，またＤ．Ｗ．Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ．１２：１０７〜１７４を参照）。

本発明で使用され得る足場またはマトリックス（これらは、集合的に「骨格構造」として呼ばれることもある）の物質の例には、不織マット類、多孔性発泡体類、または自己集合するペプチド類が含まれる。不織マット類は、例えば、グリコール酸および乳酸の合成吸収性共重合体（ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ（エティコン（Ｅｔｈｉｃｏｎ）社、ニュージャージー州サマービル）の登録名で販売されている）から成る繊維群を用いて形成されることが可能である。例えば、ポリ（エプシロン−カプラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）共重合体から構成され、米国特許６，３５５，６９９号公報で考察された、フリーズドライまたは凍結乾燥のような工程群によって形成される発泡体類もまた利用され得る。自己集合するペプチド類（例えば、ＲＡＤ１６）のようなヒドロゲル類もまた利用され得る。ｉｎ ｓｉｔｕ（原位置で）形成する分解性の網状組織類もまた、本発明の使用に好適である（例えば、Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．ら、２００２，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ７８：１９９〜２０９、Ｗａｎｇ，Ｄ．ら、２００３，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４：３９６９〜３９８０、Ｈｅらへの米国特許公報２００２／００２２６７６、を参照）。これらの物質類は、注入に好適な流動体類として調製され、種々の手段類（例えば、温度、ｐＨ、光への曝露の変化）によって誘導され、ｉｎ ｓｉｔｕまたはｉｎ ｖｉｖｏで分解性のヒドロゲル網状組織類を形成し得る。

別の実施形態では、前記骨格構造はフェルトであり、そのようなフェルトは、生体吸収性の物質（例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬの共重合体類または混紡類、またはヒアルロン酸）から成るマルチフィラメント糸から構成され得る。前記糸は、クリンピング、裁断、カーディング、および穿刺から成る標準的繊維加工技術類を用いて、フェルトに加工される。別の実施形態では、細胞群は、複合構造群であり得る発泡体足場に播種される。

上記の実施形態の多くでは、前記骨格構造は、例えば、神経路の修復のために、分離した柱群を有する脊髄の形態のように、有用な形態に成形され得る（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＪＡら、２００２，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ５１：７４２〜５１）。さらに、ＰＰＤＣ群は、例えば、繊維芽細胞含有ＧＤＣ血管内コイル群を調製するために使用されるのに対応する仕方で、前もって成形された非分解性の、手術用装置類または移植装置類で培養され得る（Ｍａｒｘ，Ｗ．Ｆ．ら、２００１，Ａｍ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ．２２：３２３〜３３３）。

前記のマトリックス、足場、または装置は、細胞接着を向上するために、細胞を接種する前に処理され得る。例えば、接種の前に、ナイロン製マトリックス群は、そのナイロンをコーティングするために０．１モルの酢酸で処理され、ポリリシン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲン中でインキュベートされ得る。ポリスチレンは、硫酸を用いて同様に処理され得る。骨格構造の外部表面群もまた、細胞群の接着および成長、および組織の分化を改善するために改変することができ、それは、例えば、前記骨格構造をプラズマコーティングするか、１つ若しくはそれ以上のタンパク質類（例えば、コラーゲン類、弾性繊維類、細網繊維類）、糖タンパク質類、グリサミノグリカン類（例えば、ヘパリン硫酸塩、コンドロイチン４硫酸塩、コンドロイチン６硫酸塩、デルマタン硫酸塩、ケラチン硫酸塩）、細胞性マトリックス、および／または他の物質類（例えば、限定するものではないが、特に、ゼラチン、アルギン酸、寒天、アガロース、および植物ゴム類）の追加によって行える。

ＰＰＤＣ含有骨格構造群は、当分野で周知の方法類にしたがって調製される。例えば、細胞群は、培養容器内で、サブコンフルエントまたはコンフルエントまで自由に成長させ、前記培養から拾い上げて前記骨格構造に接種され得る。必要に応じて、前記細胞群の接種の前に、接種中に、または接種の後に、成長因子類を前記培養培地に加えて、分化および組織形成を誘導し得る。別法では、前記骨格構造群自体を改変することができ、その骨格構造群上の細胞群の成長が向上されるか、または前記移植の拒絶の危険性が下げられる。このようにして、１つ若しくはそれ以上の生物学的に活性な化合物類（例えば、限定するものではないが、抗炎症剤類、免疫抑制剤類、または成長因子類）が、局所的放出のために前記骨格構造に加えることが可能である。

ＰＰＤＣ群、ＰＰＤＣ成分類または産物類の使用法類
ＰＰＤＣ群、ＰＰＤＣ群を含む細胞集団群、または、ＰＰＤＣ群の成分類またはＰＰＤＣ群によって産生される産物類は、神経細胞群および神経組織群の修復および再生を支持し促進するための種々の方法類で使用され得る。そのような利用法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）、ｅｘ ｖｉｖｏ（生体外）、およびｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）の方法類を網羅する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの方法類：
１つの実施形態では、ＰＰＤＣ群は、薬理学的試薬類、成長因子類、調節因子類などの効力および細胞毒性のために広範な化合物をスクリーニングするためにｉｎ ｖｉｔｒｏで使用され得る。例えば、そのようなスクリーニングは、実質的に均一な集団群に行え、神経変性病状の治療のために、前記ＰＰＤＣ群と共に調製される、または前記ＰＰＤＣ群と同時投与される、候補化合物類の効力または毒性を査定し得る。別法では、そのようなスクリーニングは、新しい薬剤候補類の効率を評価する目的で、刺激されて神経細胞または神経前駆細胞に分化したＰＰＤＣ群に行え得る。この実施形態では、前記ＰＰＤＣ群はｉｎ ｖｉｔｒｏで維持され、検査される前記化合物に曝される。細胞毒性の能力を有する化合物の活性は、培養内の細胞を損傷するか、殺す能力によって測定され得る。これは、生体染色テクニック類によって容易に査定され得る。成長因子類または調製因子類の効果は、前記因子類に曝されていない細胞群に比較して、前記培養細胞群の数または頑健性を分析することによって査定され得る。これは、標準の細胞学的テクニック類および／または組織学的テクニック類を用いて達成することができ、タイプ特異的な細胞抗原類を特徴付ける抗体類を使用した免疫細胞化学テクニック類の使用が含まれる。

更に別の実施形態では、上記のように、ＰＰＤＣ群はｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されて生物学的産物類を産生させることが可能であるが、このような生物学的産物類は、前記細胞群が生来、産生するもの、神経系統群に分化するように誘導されたときに前記細胞群が産生するもの、または、遺伝子修正によって前記細胞群が産生するもののいずれかである。例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、およびＩＬ−８は、成長培地で成長された臍帯由来細胞群から分泌されていることが発見された。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ａ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＡＲＣ、エオタキシン、およびＩＬ−８が、成長培地で培養された胎盤由来ＰＰＤＣ群から分泌されていることが発見された（実施例群を参照）。これらの栄養因子類のいくつか、例えば、ＢＤＮＦおよびＩＬ−６、は神経再生で重要な複数の役割を果たしている。神経修復および神経再生で使用されるが、まだ検出されていないか、または検査されていない他の栄養因子類が、ＰＰＤＣ群によって産生されており、おそらく培地に分泌されている可能性が高い。

これに関して、本発明の別の実施形態は、馴化培地の産生のためにＰＰＤＣ群の使用を特色とし、これは、分化していないＰＰＤＣ群からか、または神経系統への分化を刺激する条件下でインキュベートされたＰＰＤＣ群からかのいずれかである。そのような馴化培地は、例えば、神経原性前駆細胞群のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの培養での使用、または、均一な集団群のＰＰＤＣ群、またはＰＰＤＣ群および神経前駆細胞群から成る不均一な集団群を含む移植された細胞群を支持するためにｉｎ ｖｉｖｏでの使用、を意図とする。

更に別の実施形態は、ＰＰＣＤ細胞溶解物類、それらの溶解性細胞分画類または成分類、または前記溶解物類のＥＣＭまたは成分類を種々の目的での使用を含む。上記したように、これらの成分類のいくつかは薬学的組成物で使用され得る。他の実施形態では、細胞溶解物またはＥＣＭは、物質類または装置類をコーティングまたは他の処理で使用されるが、これらは、そのような治療類の過程で接触される細胞群や組織類の治癒や生存性を促進するために、外科治療用、移植用、ｅｘ ｖｉｖｏの目的類で使用される。

実施例１３および実施例１５に記載されるように、ＰＰＤＣ群が成体神経前駆体細胞群との共培養で成長されたときに、前記ＰＰＤＣ群が、前記成体神経前駆体細胞群の生存性、成長、および分化を支持する能力を有することが実証された。したがって、別の実施形態では、ＰＰＤＣ群は、他の細胞群、特に神経細胞群および神経前駆細胞群、への栄養支持を提供するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの共培養で有利に使用される。共培養では、前記ＰＰＤＣ群および前記の望ましい他の細胞群が接触するような条件下で共培養することが望ましい可能性がある。これは、例えば、前記細胞群を不均一な集団の細胞群として培養培地内に、または好適な培養基質に、播種することによって達成し得る。別法では、前記ＰＰＤＣ群がまずコンフルエントまで成長され、これが、培養で、２番目の前記の望ましい細胞タイプの基質としての機能をすることが可能である。この後者の実施形態では、前記細胞群はさらに、物理的に分離させることが可能であり、これは、例えば膜または同様の装置によって可能であり、前記共培養期間の後、他の細胞タイプを取り除いて、別々に使用することが可能である。神経細胞タイプ群の増殖および分化を促進するために共培養でＰＰＤＣ群を使用することは、研究分野および臨床／治療の分野で適用性が見つけられる可能性がある。例えば、ＰＰＤＣ共培養は、例えば、基礎研究の目的群で、また薬剤スクリーニングアッセイ類での使用で、培養内の神経細胞群の成長および分化を促進するために利用され得る。ＰＰＤＣ共培養はまた、治療目的での後の投与のために、神経前駆細胞群のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖にも利用され得る。例えば、個人から神経前駆細胞群が収集され、ＰＰＤＣ群と共に共培養内でｅｘ ｖｉｖｏで増殖され、その後、前記個人（自己移植）または別の個人（同系移植または同種移植）に戻すことが可能である。これらの実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏでの増殖後に、前記ＰＰＤＣ群および神経前駆細胞群を含む細胞の混合集団が、治療の必要な患者に投与され得ることを理解されたい。別法では、自己移植が好適で望ましい場合には、前記の共培養の細胞集団群は培養内で物理的に分離されてもよく、前記患者への投与のために自己の神経前駆細胞群を取り出すことを可能にする。

ｉｎ ｖｉｖｏの方法類
実施例１６および実施例１７で説明されるように、ヒトでの効力の予測に関して受け入れられている動物モデルで、ＰＰＤＣ群が、その体に効果的に移植され、失われた神経機能を提供することが示された。これらの結果は、神経変性病状を治療するためにＰＰＤＣ群が細胞治療で使用されることを特徴とする、本発明の好適な実施形態を支持する。ＰＰＤＣ群が身体の標的神経部位に移植されると、ＰＰＤＣ群自体が１つ若しくはそれ以上の神経表現型類に分化することが可能であり、またはＰＰＤＣ群がｉｎ ｓｉｔｕの神経前駆細胞群および神経細胞群の栄養支持を提供することが可能であり、またはＰＰＤＣ群は、とりわけ、これらの方法の両方で有益な効果を果たす可能性がある。

ＰＰＤＣ群は、単独で投与されてもよく（例えば実質的に均一な集団群として）、または他の細胞群との混合物として投与されてもよい。上記のように、ＰＰＤＣ群は、マトリックスまたは足場として薬理的調製物に調製されて、または、従来の薬理学的に許容された担体類と共に投与され得る。ＰＰＤＣ群が他の細胞群と共に投与される場合は、前記ＰＰＤＣ群は、前記の他の細胞群と同時に投与されるか、或いは、順番に（前記の他の細胞群の前に、または後に）投与され得る。ＰＰＤＣ群と共に投与され得る細胞群には、限定するものではないが、ニューロン群、アストロサイト群、オリゴデンドロサイト群、神経前駆細胞群、神経幹細胞群、および／または、他の複能性または多能性の幹細胞群が含まれる。異なるタイプ類の細胞群は、投与の直前または少し前に前記ＰＰＤＣ群と混合されてもよく、またはそれらは投与前の期間中、一緒に共培養されてもよい。

前記ＰＰＤＣ群は、神経に有益な他の薬剤類または生物学的分子類と、または他の活性試薬類（例えば、当分野で周知の、抗炎症試薬類、抗アポトーシス試薬類、酸化防止剤、成長因子類、神経栄養因子類、または神経再生薬剤類または神経保護薬剤類）と共に投与され得る。ＰＰＤＣ群が他の試薬類と投与されるとき、それらは１つの薬学的組成物内に一緒に投与されてもよく、または別々の薬学的組成物で、他の試薬類と同時に、または順番に（他の試薬類の投与の前に、または後に）投与され得る。

ＰＰＤＣ群と共に投与され得る他の成分類の例には、限定するものではないが、２〜３の例を挙げるとすれば、（１）他の神経保護的薬剤類または神経有益性薬剤類、（２）選択された細胞外マトリックス成分類、例えば、当分野で知られる１つ若しくはそれ以上のタイプのコラーゲン、および／または、成長因子類、多血小板血漿、および薬剤（別法では、ＰＰＤＣ群は遺伝的に操作されて成長因子類を発現し産生し得る）、（３）抗アポトーシス薬剤類（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯ模倣剤、トロンボポエチン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子、カスパーゼ阻害剤類）、（４）抗炎症剤（例えば、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤類、ＴＧＦベータ阻害剤類、スタチン類、ＩＬ−６およびＩＬ−１の阻害剤類、ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ、ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ、および非ステロイド性抗炎症剤類（ＮＳＡＩＤＳ））（例えば、ＴＥＰＯＸＡＬＩＮ、ＴＯＬＭＥＴＩＮ、およびＳＵＰＲＯＦＥＮ）、（５）免疫抑制剤類または免疫調節剤、例えば、カルシニュリン阻害剤類、ｍＴＯＲ阻害剤類、抗増殖性物質類、コルチコステロイド類、および種々の抗体類、（６）酸化防止剤、例えばプロブコール、ビタミンＣ、ビタミンＥ、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、およびＮ−アセチルシステイン、および（６）局所麻酔薬類、が含まれる。

１実施形態では、ＰＰＤＣ群は、成長培地内で培養された非分化細胞群として投与される。別法では、ＰＰＤＣ群は、望ましい神経表現型への分化を刺激する条件に曝した後、投与することが可能であり、そのような望ましい神経表現型は、例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、またはニューロン、より特異的には、セロトニン作動性、ドーパミン作動性、コリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、またはグルタミン作動性の神経細胞群である（例えば、Ｉｓａｃｓｏｎ，Ｏ．、２００３．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）２：４１７〜４２４を参照）。

本発明の細胞群は、神経損傷または神経困難の部位に、手術的に移植されるか、注入されるか、送達されるか（例えば、カテーテルまたはシリンジを介して）、または、直接的にまたは非直接的に他の方法で投与され得る。本発明の前記細胞群、またはそれらの成分類の投与の経路としては、限定するものではないが、静脈、筋内、皮下、経鼻、脳内、心室内、脳室内、髄腔内、嚢内、脊髄内、および／または、脊髄周辺の投与経路（頭蓋内ニードル類または脊椎内ニードル類、および／または、ポンプ装置類の付いていない、または付いている、カテーテル類、による送達）が含まれる。

細胞群が半固形または固形の装置内で投与されるときは、身体の正確な位置への手術的移植が通常、適した投与手段である。しかし、神経前駆細胞群は、（例えば、放射状神経膠細胞を追うことによって、または化学信号類に応答することによって）神経系の挿入点から特定の位置まで広大な遊走を行うことが示されているため、液体または流動体の薬学的組成物は、ＣＮＳまたはＰＮＳ内のより一般的な位置に投与され得る（例えば、パーキンソン病や広範性の虚血性損傷の場合のように広範に影響を受けた全範囲）。

実際、神経幹細胞群のこの遊走能力は、悪性脳腫瘍類の治療で新しい手段を開いた。すなわち、これらの遊走腫瘍類の治療のために、治療の遺伝子群／遺伝子産物群を送達するために前駆細胞群を使用することである。例えば、神経幹細胞群は、げっ歯類成体の頭蓋内グリオーマ群にｉｎ ｖｉｖｏで移植されると、それら自体が、前記腫瘍床内で急速にまた広範に分布し、増殖し伸展する腫瘍細胞群と並んで遊走し、その一方で、外来遺伝子を安定的に発現し続ける（Ａｂｏｏｄｙ，Ｋ．ら、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１２８４６〜１２８５１）。ＰＰＤＣ群はもた、このタイプの使用に好適であると期待される。すなわち、アポトーシス薬剤または他の抗腫瘍薬剤（例えば、ＩＬ−１２（Ｅｈｔｅｓｈａｍ，Ｍ．ら、２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６２：５６５７〜５６６３）、または腫瘍壊死因子に関連するアポトーシス誘導性リガンド（Ｅｈｔｅｓｈａｍ，Ｍ．ら、２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６２：７１７０−７１７４））を産生するように遺伝的に修正されたＰＰＤＣ群が、悪性腫瘍（例えば、グリア芽細胞腫）の一般的部位に注入されるか、他の方法で投与され、その後前記ＰＰＤＣ群は、前記治療薬剤の局所的送達のために前記腫瘍細胞群に遊走し得る。

他の実施形態は、ＰＰＤＣ細胞性成分類（例えば、細胞溶解物類、またはそれらの成分類）、またはＰＰＤＣ産物類（例えば、ＰＰＤＣ群が生来、産生する栄養因子類および他の生物学的因子類、遺伝的修正を介してＰＰＤＣ群が産生する栄養因子類および他の生物学的因子類、またはＰＰＤＣ培養からの馴化培地）を含む薬剤成分類を投与することによって神経変性病状類を治療する方法類を網羅する。再び、これらの方法類はさらに、他の活性試薬類（例えば、成長因子類、神経栄養因子類、または当分野で周知の神経再生薬剤類または神経保護薬剤類）を投与することを含み得る。

ＰＰＤＣ群または当明細書に記載されたその他の薬学的組成物のいずれかを投与するための投薬形態類および処方計画類は、適切な診療能力に従って作成され、個々の患者の条件、例えば、神経変性病状の本質および程度、性別、体重、および一般的な医学的状態、および医師群に知られる他の因子群が考慮に入れられる。したがって、患者に投与される薬学的組成物の有効な投与量は、当分野で周知のこれらの考慮によって決定される。

ＣＮＳは、やや免疫特権的（ｉｍｍｕｎｏｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ）な組織であるため、ＰＰＤＣ群での細胞治療を開始する前に患者を免疫抑制することは必要でないか、または望ましくない可能性がある。さらに、実施例１１に説明されたように、ＰＰＤＣ群がリンパ球混合反応で同種ＰＢＭＣ群を刺激することは示されていない。したがって、同種ＰＰＤＣ群での移植、または、たとえ異種ＰＰＤＣ群の移植でも、いくつかの場合では許容され得る。

しかし、他の場合では、細胞治療を開始する前に患者を薬理的に免疫抑制することが望ましいか、または好適であり得る。これは、全身的なまたは局所的な免疫抑制剤類の使用によって達成され得るか、または、上記のように、封入された装置内で前記細胞群を送達することによって達成され得る。前記移植細胞群への免疫応答を減らすか、または除去するための、これらの方法類および他の方法類は当分野で周知である。別法として、上記のように、ＰＰＤＣ群は遺伝的に修正されて、それらの免疫原性を減らし得る。

生きた患者内での移植されたＰＰＤＣ群の生存性は、例えば、コンピューター断層撮影法（ＣＡＴまたはＣＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、またはポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）のような種々の撮影法の使用によって決定され得る。移植物の生存性の決定はまた、死後に神経組織を取り除いて、肉眼で検査するか、顕微鏡によって検査することによって行え得る。別法では、細胞群は、神経細胞群またはそれらの産物類（例えば、神経伝達物質類）に特異的な染色類で処理され得る。移植された細胞群はまた、ローダミン標識マイクロスフェア群、フルオレセイン標識マイクロスフェア群、ファーストブルー、鉄微粒子群、ビスベンザミド（ｂｉｓｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、または、ベータガラクトシダーゼまたはベータグルクロニダーゼのような遺伝的に誘導されるレポーター遺伝子産物群のような追跡用色素群を事前に取り込ませることによって同定され得る。

移植されたＰＰＤＣ群の、被験者の神経組織への機能的な融合は、損傷された、または病的な前記神経機能の回復を検査することによって評価され得る。そのような機能類には、限定するものではないが、運動機能、認知機能、感覚機能、および内分泌機能を含み、これらは、神経生物学者群および医師群に周知の手順に従っている。

ＰＰＤＣ群、ＰＰＤＣ成分類、またはＰＰＤＣ産物類を含むキット群および貯蔵所群
別の観点では、本発明は、上記のように、神経の再生および修復ための種々の方法類でＰＰＤＣ群、ＰＰＤＣ集団群、ＰＰＤＣ群の成分類および産物類を利用するキット類を提供する。神経変性病状類の治療または他の定期的な治療のために使用される場合は、前記キット群は、少なくともＰＰＤＣ群を含む、１つ若しくはそれ以上の細胞集団群、および薬理的に許容される担体（液体、半固形、または固形）を含み得る。前記キット群は、オプションとして、前記細胞群を投与する手段（例えば、注射によって）を含み得る。前記キット群はさらに、前記細胞群を使用するための使用説明書を含み得る。軍隊用のように野外病院での使用に調製されるキット群は、全手順の供給品類を含んでもよく、そのような供給品類には、組織足場類、手術用縫合糸類などが含まれ、前記細胞群は、急性な損傷群の修復と共に使用される。当明細書に記載されたアッセイ類およびｉｎ ｖｉｔｒｏ方法類のキット群は、（１）ＰＰＤＣ群、ＰＰＤＣ群の成分類、またはＰＰＤＣ群の産物類、（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法類を実践するための試薬類、（３）必要に応じて、他の細胞群または他の細胞集団群、および（４）ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法類を行うための使用説明書類、の１つ若しくはそれ以上を含み得る。

更に別の観点では、本発明は、本発明の組織群、細胞群、細胞成分類、および細胞集団群の貯蔵を提供する。上記で考察したように、前記細胞群は容易に冷凍保存される。したがって、本発明は貯蔵所に前記細胞群を冷凍保存する方法類を提供し、その方法類では、前記細胞群は、冷凍して保存され、前記細胞群の免疫学的性質、生化学性質、および遺伝的性質に基づいて前記細胞群の完全な特徴付けが付随される。前記冷凍細胞群は解凍され、増殖されて、前記手順の必要条件および前記患者の必要性によって、自家治療、同系治療、または同種治療に直接に使用され得る。好適には、各冷凍保存検体の情報はコンピューターに保存され、その情報は外科医、手順、および患者の必要に基づいて検索可能であり、前記細胞群または集団群の特徴に基づいて好適なマッチ群が見つけられる。好適には、本発明の前記細胞群は、成長され、望ましい細胞量まで増殖され、治療用細胞成分類は、マトリックスまたは支持体の存在下で、または非存在下で、別々に調製されるか、または共培養群として調製される。いくつかの応用群では、新鮮に調製された細胞群を使用することが好適であり得るが、残りの細胞群は冷凍保存され、前記細胞群を冷凍し、前記コンピューターに前記情報を入力し、前記検体群に前記コンピューター入力を関連付けることによって貯蔵され得る。免疫学的目的類のためにそのような細胞群の受容者を、源泉またはドナーにマッチすることが必要でない場合でも、前記貯蔵システムは、例えば、前記貯蔵細胞群の望ましい生化学的性質または遺伝的性質を治療の必要性類に一致することを容易にする。貯蔵された検体と前記の望ましい性質類が一致すると、前記検体が取り出され、治療用に調製される。当明細書で記載されたように調製された細胞溶解物類、ＥＣＭ、または細胞性成分類もまた、冷凍保存されるか、他の方法で保存されることができ（例えば、凍結乾燥）、本発明にしたがって貯蔵され得る。

以下の実施例群は、本発明を詳細に説明するのに提供される。これらは、本発明を例証することを意図しており、本発明を限定するものではない。

以下の実施例群および本明細書の他の部分で使用された場合、用語「成長培地」は一般的に、ＰＰＤＣ群の培養に満足な培地を意味する。具体的には、本発明の前記細胞群の培養に好適な１つの培地は、ダルベッコ改変必須培地（当明細書では「ＤＭＥＭ」とも略される）を含む。特に好適な培地は、低グルコースＤＭＥＭ（当明細書では「ＤＭＥＭ−ＬＧ」とも略される）（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）である。好適には、前記低グルコースＤＭＥＭは、１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（例えば、定義されたウシ胎仔血清、ハイクローン社、ユタ州ローガン）、抗生物質／抗真菌剤（好適には、５０〜１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、５０〜１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、および０〜０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド））、および０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）が添加される。以下の実施例群で使用される場合、「成長培地」は、１５％のウシ胎仔血清、および抗生物質／抗真菌剤（ペニシリン／ストレプトマイシンが含まれる場合は、好適には、それぞれ５０Ｕ／ミリリットルおよび５０マイクログラム／ミリリットルであり、ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシンＢが使用される場合は、好適には、それぞれ１００Ｕ／ミリリットル、１００マイクログラム／ミリリットル、および０．２５マイクログラム／ミリリットルである。）を含む低グルコースＤＭＥＭを指す。いくつかの場合では、異なる成長培地が使用されるか、または異なる添加類が提供されるが、これらは通常、成長培地への添加類として文章で示されている。

また、以下の実施例群に関係し、本明細書の他の部分で使用される用語「標準的成長条件」は５％ＣＯ^２を含む標準的大気中で、３７℃での細胞群の培養を意味する。前述の前記条件は培養に有用であるが、そのような条件は、細胞培養の分野で利用可能なオプション類を理解できるであろう当業者によって変更され得ることを理解されたい。

以下の略記群は、実施例群、および、当明細書および請求項群の他の部分で表れる場合がある。アンジオポイエチン２には「ＡＮＧ２」（または「Ａｎｇ２」）、抗体提示細胞群には「ＡＰＣ」、脳由来神経栄養因子には「ＢＤＮＦ」、塩基性繊維芽細胞成長因子には「ｂＦＧＦ」、「ｂｉｓ ｉｎ ｄｉｅ」（１日２回）にはｂｉｄ（ＢＩＤ）、サイトケラチン１８にはＣＫ１８、中枢神経系には「ＣＮＳ」、ケモカイン受容体リガンド３には「ＣＸＣリガンド３」、ダルベッコ改変必須培地には「ＤＭＥＭ」、低グルコースＤＭＥＭには「ＤＭＥＭ：ｌｇ」（または「ＤＭＥＭ：Ｌｇ」或いは「ＤＭＥＭ：ＬＧ」）、エチレンジアミン４酢酸には「ＥＤＴＡ」、上皮成長因子には「ＥＧＦ」（または「Ｅ」）、蛍光活性化細胞選別装置には「ＦＡＣＳ」、ウシ胎児血清には「ＦＢＳ」、繊維芽細胞成長因子には「ＦＧＦ」（または「Ｆ」）顆粒球走化性タンパク質２には「ＧＣＰ２」、グリア細胞繊維性酸性タンパクには「ＧＦＡＰ」、ヘパリン結合上皮成長因子には「ＨＢ−ＥＧＦ」、ヒト冠動脈内皮細胞には「ＨＣＡＥＣ」、肝細胞増殖因子には「ＨＧＦ」、ヒト間葉系幹細胞には「ｈＭＳＣ」、肝細胞特異的転写因子１には「ＨＮＦ−１アルファ」、ヒト臍帯静脈内皮細胞には「ＨＵＶＥＣ」、ケモカインかつＣＣＲ８受容体のリガンドには、「Ｉ３０９」、インスリン様成長因子１には「ＩＧＦ−１」、インターロイキン６には「ＩＬ−６」、インターロイキン８には「ＩＬ−８」、ケラチン１９には「Ｋ１９」、ケラチン８には「Ｋ８」、ケラチノサイト成長因子には「ＫＧＦ」、白血病抑制因子には「ＬＩＦ」、ミエリン塩基性タンパク質には「ＭＢＰ」、単球走化性タンパク質１には「ＭＣＰ−１」、マクロファージ由来ケモカインには「ＭＤＣ」、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファには「ＭＩＰ１アルファ」、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータには「ＭＩＰ１ベータ」、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）には「ＭＭＰ」、間葉系幹細胞群には「ＭＳＣ」、ヒト皮膚繊維芽細胞群には「ＮＨＤＦ」、神経前駆細胞増殖培地には「ＮＰＥ」、オリゴデンドロサイトまたはグリア分化のマーカーＯ４には「Ｏ４」、末梢血単核細胞には「ＰＢＭＣ」、リン酸緩衝生理食塩水には「ＰＢＳ」、血小板由来成長因子には「ＰＤＧＦｂｂ」、経口（ｐｅｒ ｏｓ）にはＰＯ、末梢神経系には「ＰＮＳ」、活性化で制御され、正常のＴ細胞が発現および分泌（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）には「Ｒａｎｔｅｓ（またはＲＡＮＴＥＳ）」、組み換えられたヒトの成長因子および分化因子には「ｒｈＧＤＦ−５」、皮下には、「ＳＣ」、ストローマ細胞由来因子１アルファには「ＳＤＦ−１アルファ」、ソニック・ヘッジホッグには「ＳＨＨ」、標準実施要領には「ＳＯＰ」、甲状腺および活性化調節ケモカインには「ＴＡＲＣ」、組織培養用プラスチック製には「ＴＣＰ」、組織培養用ポリスチレン製には「ＴＣＰＳ」、形質転換成長因子ベータ２には「ＴＧＦベータ２」、形質転換成長因子ベータ３には「ＴＧＦベータ３」、マトリックス・メタロプロテアーゼの組織阻害剤１には「ＴＩＭＰ１」、トロンボポエチンには「ＴＰＯ」、ＢＩＩＩチューブリンには「ＴｕＪ１」、血管内皮細胞増殖因子には「ＶＥＧＦ」、フォンウィルブラント因子には、「ｖＷＦ」、アルファ・フェトプロテインには「アルファＦＰ」、である。

分娩後組織から細胞群の樹立
この実施例は、胎盤組織および臍帯組織から分娩後由来細胞群の調製を説明する。分娩後の臍帯および胎盤は、満期妊娠または早産妊娠のいずれかの出産時に取得された。細胞群は、５人の別のドナー群の臍帯組織および胎盤組織から収集された。細胞単離の異なる方法類は、１）異なる表現型類を有する細胞群に分化する能力（幹細胞群に共通の特徴）、または２）他の細胞群および組織群に有用な栄養因子類を提供する能力、を有する細胞群を産出する能力に関してテストされた。

方法群および材料群
臍帯細胞の単離
臍帯群は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州フィラデルフィア市）から取得された。前記組織群は、正常の分娩後に取得された。細胞単離のプロトコールは、層流フード内で無菌操作で行われた。血液と残渣を除くため、前記臍帯は、抗真菌剤および抗生物質（１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ）の存在下でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）中で洗浄された。その後、前記組織群は、５０ミリリットルの培地（低グルコースＤＭＥＭまたは高グルコースＤＭＥＭ、インビトロジェン社）の存在下で１５０ｃｍ^２の組織培養プレート内で、細かいパルプ状に刻まれるまで機械的に分離された。この刻まれた組織群は、５０ミリリットルのコニカルチューブ群に移された（各チューブに約５グラムの組織）。その後、前記組織は、低グルコースＤＭＥＭ培地または高グルコースＤＭＥＭ培地内で消化され、各ＤＭＥＭは前述のような抗真菌剤と抗生物質を含んでいた。いくつかの実験では、コラゲナーゼおよびディスパーゼの酵素混合物が使用された（「Ｃ：Ｄ；」、低グルコースＤＭＥＭ培地中に、５００ユニット／ミリリットルのコラゲナーゼ（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）、５０ユニット／ミリリットルのディスパーゼ（インビトロジェン社））。他の実験群では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）が使用された（低グルコースＤＭＥＭ培地中に、５００ユニット／ミリリットルのコラゲナーゼ、５０ユニット／ミリリットルのディスパーゼ、５ユニット／ミリリットルのヒアルロニダーゼ（シグマ社））。前記組織、培地、および消化酵素類を含む前記コニカルチューブ群は、毎分２２５回転で、１つのオービタルシェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ社、ニューヨーク州ブルックリン）内で３７℃で２時間インキュベートした。

消化後、前記組織群は１５０Ｇで５分間遠心され、その上澄みが吸引された。その沈殿は、２０ミリリットルの成長培地（低グルコースＤＭＥＭ（インビトロジェン社）、１５％（容量比）のウシ胎仔血清（ＦＢ；定義されたウシ胎児血清；ロット番号：ＡＮＤ１８４７５；ハイクローン社、ユタ州ローガン）、０．００１％（容量比）の２−メルカプトエタノール（シグマ社）、１００ミリリットルにつき１ミリリットルの前述の抗真菌剤および抗生物質）に再懸濁された。この細胞懸濁液は、１つの７０マイクロメーターのナイロン製セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社）を通して濾過した。成長培地を含む５ミリリットルのリンス液がさらに、前記ストレーナーを通された。その後、この細胞懸濁液は、１つの４０マイクロメーターのナイロン製セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社）を通され、さらに５ミリリットルの成長培地でリンスされた。

この濾過液は成長培地中（全容量：５０ミリリットル）に再懸濁され、１５０Ｇで５分間遠心された。その上澄みが吸引され、前記細胞沈殿物は５０ミリリットルの新しい成長培地に再懸濁された。この過程を、もう２回繰り返した。

最終的な遠心で、その上澄みが吸引され、前記細胞群は５ミリリットルの新しい成長培地に再懸濁された。トリパンブルー染色を使用して、生細胞群の数が決定された。その後、細胞群は標準的条件下で培養された。

臍帯群から単離された前記細胞群は、前述のように、抗生物質／抗真菌剤を含む成長培地で、ゼラチンでコーティングされたＴ‐７５ ｃｍ^２のフラスコ群（コーニング社、ニューヨーク州コーニング市）に５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種された。２日後（種々の実験群では細胞群は２〜４日インキュベートされた）、使われた培地がフラスコから吸引された。細胞群は、残渣と血液由来細胞類を除くために、ＰＢＳで３回洗浄された。その後、細胞群に成長培地が補給され、コンフルエントになるまで成長させ、（継代０から約１０日で）継代１まで行われた。その後の継代群（継代１から継代２へ、以降も同様）では、細胞群は４〜５日でサブコンフルエント（７５〜８５％コンフルエント）に達した。これらの以降の継代群では、細胞群は５０００細胞／ｃｍ^２で播種された。細胞は、５％の二酸化炭素と大気中酸素を含む、湿度制御されたインキュベータ内で、３７℃で成長させた。

胎盤細胞の単離
胎盤組織は、ＮＤＲＩ（ペンシルバニア州フィラデルフィア市）から取得された。前記組織群は、妊娠に由来し、正常な手術分娩時に取得された。胎盤細胞群は、臍帯細胞の単離で記述されたのと同様に単離された。

以下の実施例は、胎盤組織からの母性由来細胞群および胎児由来細胞群の別々の集団群の単離に適用される。

細胞単離のプロトコールは、層流フード内で無菌操作で行われた。血液と残渣を除くため、前記胎盤組織は、抗真菌剤および抗生物質（上記と同様）の存在下でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）中で洗浄された。その後、前記胎盤組織は、３つの部分群、すなわち上部（乳児側）、正中部（混合した細胞単離の乳児側および母性側）、および底部（母側）、に分けられた。

これらの分けられた部分群は個々に、抗生物質／抗真菌剤を含むＰＢＳ中で数回洗浄され、さらに血液および残渣を除去した。その後、各部分は、５０ミリリットルのＤＭＥＭ／低グルコースの存在下で１５０ｃｍ^２の組織培養プレート群内で、細かいパルプ状に刻まれるまで機械的に分離された。前記のパルプ状組織は５０ミリリットルのコニカルチューブ群に移された。各チューブには、約５グラムの組織が含まれていた。前記組織は、抗生物質および抗真菌剤（１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ）、および消化酵素類を含む、低グルコースＤＭＥＭ培地または高グルコースＤＭＥＭ培地内で消化された。いくつかの実験では、コラゲナーゼおよびディスパーゼの酵素混合物（「Ｃ：Ｄ」）（低グルコースＤＭＥＭ培地中に、５００ユニット／ミリリットルのコラゲナーゼ（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）および５０ユニット／ミリリットルのディスパーゼ（インビトロジェン社）を含む）が使用された。他の実験群では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）が使用された（低グルコースＤＭＥＭ培地中に、５００ユニット／ミリリットルのコラゲナーゼ、５０ユニット／ミリリットルのディスパーゼ、５ユニット／ミリリットルのヒアルロニダーゼ（シグマ社））。前記組織、培地、および消化酵素類を含む前記コニカルチューブ群は、毎分２２５回転で、１つのオービタルシェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ社、ニューヨーク州ブルックリン）内で３７℃で２時間インキュベートされた。

消化後、前記組織群は１５０Ｇで５分間遠心され、その上澄みが吸引された。その沈殿物は、ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシンＢを含む、２０ミリリットルの成長培地に再懸濁された。この細胞懸濁液は、１つの７０マイクロメーターのナイロン製セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社）を通して濾過され、さらに５ミリリットルの成長培地でリンスされた。前記細胞懸濁液の全体は、１つの４０マイクロメーターのナイロン製セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社）を通して濾過され、その後、さらに５ミリリットルの成長培地がリンスとして濾過された。

この濾過液は成長培地中（全容量：５０ミリリットル）に再懸濁され、１５０Ｇで５分間遠心された。その上澄みが吸引され、その細胞沈殿物は５０ミリリットルの新しい成長培地に再懸濁された。この過程を、もう２回繰り返した。最終的な遠心の後、その上澄みが吸引され、前記細胞沈殿物は５ミリリットルの新しい成長培地に再懸濁された。トリパンブルー排除法を使用して、細胞数が決定された。その後、細胞群は標準的条件下で培養された。

ＬＩＢＥＲＡＳＥの細胞単離
細胞群は、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（ベーリンガーマンハイム社、インディアナ州インディアナポリス市）（２．５ミリグラム／ミリリットル、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ３、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、インディアナ州インディアナポリス市）およびヒアルロニダーゼ（５ユニット／ミリリットル、シグマ社）を含む低グルコースＤＭＥＭ培地中で臍帯組織群から単離された。前記組織の消化および前記細胞群の単離は、他のプロテアーゼ消化で記述されたと同様であり、Ｃ：ＤまたはＣ：Ｄ：Ｈ酵素混合物の代わりにＬＩＢＥＲＡＳＥ／ヒアルロニダーゼの混合物を使用した。ＬＩＢＥＲＡＳＥでの組織消化の結果、分娩後組織から細胞集団群が単離され、これらは容易に増殖した。

他の酵素組み合わせを使用した細胞単離
異なる酵素組み合わせを使用して、前記臍帯から細胞群を単離する手順類が比較された。消化に関して比較された酵素類には、i）コラゲナーゼ、ii）ディスパーゼ、iii）ヒアルロニダーゼ、iv）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ：Ｄ）、v）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）、vi）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）、およびvii）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）が含まれる。これらの異なる酵素消化条件を使用して、細胞単離の差異が観察された（表１−１）。

前記臍帯群内の残余血液から細胞群の単離
異なるアプローチによって臍帯から細胞集団群を単離する他の試みがなされた。一例では、血塊およびゲル状物質を取り除くために、臍帯は薄切りにされ、成長培地で洗浄された。血液、ゲル状物質、および成長培地の混合物は収集され、１５０Ｇで遠心された。その沈殿物は、成長培地に再懸濁され、ゼラチンでコーティングされたフラスコ群に播種された。これらの実験群から、容易に増殖した細胞集団が単離された。

臍帯血から細胞群の単離
細胞群はまた、ＮＤＲＩから取得された臍帯血からも単離された。ここで使用された単離プロトコールは、Ｈｏらによる国際特許出願ＵＳ０２２９９７１（Ｈｏ、Ｔ．Ｗ．ら、ＷＯ２００３０２５１４９ Ａ２）のプロトコールである。臍帯血（ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州フィラデルフィア市）の検体群（それぞれ、５０ミリリットルおよび１０．５ミリリットル）は、溶解バッファー（濾過滅菌、１．５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ミリモル炭酸水素カリウム、０．１ミリモルＥＤＴＡ、ｐＨ７．２に緩衝化（全成分はミズーリ州セントルイス市のシグマ社から購入））で混合された。臍帯血と溶解バッファーの比を１：２０にして、細胞群が溶解された。その結果得られた細胞懸濁液は５秒間ボルテックスにかけ、室温で２分間インキュベートした。前記溶解液は遠心された（２００Ｇで１０分間）。その細胞沈殿物は、１０％のウシ胎児血清（ハイクローン社、ユタ州ローガン）、４ミリモルのグルタミン（メディアテック社、バージニア州ハーンドン）、１００ミリリットル当たり１００ユニットのペニシリン、および１００ミリリットル当たり１００マイクログラムのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社、カリフォルニア州カールズバッド）を含む、完全最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ社、カリフォルニア州カールズバッド）に再懸濁された。前記懸濁細胞群は遠心（２００Ｇで１０分間）され、その上澄みが吸引され、その細胞沈殿物は完全培地で洗浄された。細胞群は、Ｔ７５フラスコ群（コーニング社、ニューヨーク州）、ラミニンでコーティングされたＴ７５フラスコ群またはフィブロネクチンでコーティングされたＴ１７５フラスコ群（両フラスコは、ベクトン・ディッキンソン、マサチューセッツ州ベッドフォードから取得）のいずれかに直接、播種された。

異なる酵素の組み合わせ群および成長条件を使用した、細胞群の単離
細胞集団群は異なる条件下で単離され、単離後すぐに種々の条件下で増殖できるかどうかを決定するために、細胞群は、０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）を含む、または含まない成長培地内で、上記の処置類にしたがってＣ：Ｄ：Ｈの酵素組み合わせを使って消化された。このように単離された胎盤由来細胞群は、種々の条件下で播種された。すべての細胞群は、ペニシリン／ストレプトマイシンの存在下で増殖された（表１−２）。

異なる酵素の組み合わせ群および成長条件を使用した、細胞群の単離
すべての条件で、細胞群は継代０および継代１の間で接着し、増殖した（表１−２）。５〜８、および１３〜１６の条件の細胞群は、播種後、継代４まで十分に増殖することが実証され、その時点で冷凍保存され、貯蔵された。

結果
異なる酵素組み合わせを使用した細胞単離
Ｃ：Ｄ：Ｈの組み合わせが、単離後の最も良好な細胞数を提供し、また、他の条件よりも、培養内でより多い世代数で増殖した細胞群を発生した（表１）。増殖可能な細胞集団は、コラゲナーゼまたはヒアルロニダーゼのみを使用した場合には得られなかった。この結果が、検査した前記コラーゲンに特異的であるかどうかを決定する試みはなされなかった。

異なる酵素の組み合わせ群および成長条件を使用した、細胞群の単離
酵素の消化および成長に関して検査されたすべての条件下で、継代０および継代１の間の細胞群は、良好に接着し増殖した（表２）。実験条件５〜８および１３〜１６の細胞群は、播種後４回の継代まで十分に増殖し、その時点で細胞群は冷凍保存された。すべての細胞群は更なる研究のために貯蔵された。

前記臍帯群内の残余血液から細胞群の単離
有核細胞群は急速に接着し、成長した。これらの細胞群はフローサイトメトリーで分析され、酵素消化によって得られた細胞群と類似していた。

臍帯血から細胞群の単離
前記調製物類は、赤血球群および血小板群を含んでいた。有核細胞群は最初の３週間、接着したり、分裂しなかった。前記培地は播種後３週間で交換され、接着し成長した細胞は観察されなかった。

要約
細胞集団群は、コラゲナーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（神経プロテアーゼ）、およびヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を分解する粘膜溶解性酵素）の前記酵素組み合わせを用いて、臍帯組織および胎盤組織から効率的に導き出し得る。ＢｌｅｎｄｚｙｍｅであるＬＩＢＥＲＡＳＥを使用してもよい。特に、細胞群を単離するために、コラゲナーゼ（４Ｗｕｎｓｃｈユニット／グラム）およびサーモライシン（１７１４カゼインユニット／グラム）であるＢｌｅｎｄｚｙｍｅ３もまた、ヒアルロニダーゼと共に使用した。これらの細胞群は、ゼラチンでコーティングされたプラスチック上で、成長培地内で培養されたとき、多くの継代にわたって容易に増殖した。

前記臍帯群内の残余血液からも、細胞群が単離されたが、臍帯血からは単離されなかった。前記組織群から洗浄された血塊群中の細胞は使用した条件下で接着し成長したが、このような細胞群の存在は、解剖分離の過程中に放出された細胞群のためである可能性がある。

分娩後由来細胞群の成長の特徴群
分娩後由来細胞群（ＰＰＤＣ群）の細胞増殖の潜在能力が、他の単離された幹細胞集団群と比較された。老化までの細胞増殖の過程は、Ｈａｙｆｌｉｃｋの限界（Ｈａｙｆｌｉｃｋ Ｌ．１９７４ａ、１９７４ｂ）と呼ばれる。分娩後由来細胞群は、十分な細胞数に容易に増殖することが可能であるため、治療用に非常に適している。

材料類および方法類
ゼラチンでコーティングされたフラスコ群
組織培養用のプラスチック製フラスコ群のコーティングは、１つのＴ７５フラスコ（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）に２％（ｗ／ｖ）のブタのゼラチン（タイプＢ：２２５ブルーム、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）を２０ミリリットル加え、室温で２０分間で行った。前記ゼラチン溶液を取り除いた後、１０ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）を加えて、次に吸引した。

ＰＰＤＣ群の増殖の潜在能力と他の細胞集団群との比較
成長増殖の潜在能力の比較に関して、以下の細胞集団群が使用された。それらは、i）間葉系幹細胞群（ＭＳＣ、ケンブレックス社、メリーランド州ウォーカーズビル）、ii）脂肪由来細胞群（米国特許第６５５５３７４ Ｂ１号公報、米国特許出願第ＵＳ２００４００５８４１２号）、iii）正常皮膚繊維芽細胞群（Ｃｃｃ−２５０９ ロット番号：９Ｆ０８４４、ケンブレックス社、メリーランド州ウオーカーズビル）、iv）臍由来細胞群、およびｖ）胎盤由来細胞群、である。細胞群は、ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシンＢを含む成長培地内で、ゼラチンでコーティングされたＴ７５フラスコ群に、５，０００細胞／ｃｍ^２で最初に播種された。この後の継代群では、細胞培養群は以下のように処理された。トリプシン処理後、トリパンブルー染色した後、生細胞群が計数された。細胞懸濁液（５０マイクロリットル）と、トリパンブルー液（５０ミリリットル、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）とが混ぜられた。生細胞数が、血球計算板を用いて推定された。

計数後、細胞群は、２５ミリリットルの新しい成長培地内で、ゼラチンでコーティングされたＴ７５フラスコ群に５，０００細胞／ｃｍ^２で播種された。細胞群は３７℃で標準的条件下で成長された。前記成長培地は１週間に２回交換された。細胞群は８５％コンフルエントに達したときに、継代され、この工程は前記細胞群が老化に達するまで繰り返された。

各継代時には、細胞群はトリプシン処理され、計数された。生細胞数、集団倍加時間［ｌｎ（最終的細胞数／初期細胞数）／ｌｎ ２］および倍加時間（培養内での時間／集団倍加時間）が計算された。最適の細胞増殖を決定する目的のために、その前の継代の全細胞数に各継代に対する増殖因子（すなわち、増殖因子＝最終的細胞数／初期細胞数）を掛け算することによって、継代あたりの全細胞数が決定された。

低密度の細胞バンク群の増殖潜在能力
異なるセットの条件を使用して、継代１０で保存された細胞群の増殖能力もまた検査された。正常な皮膚繊維芽細胞群（ｃｃ−２５０９ ロット番号：９Ｆ０８４４、ケンブレックス社、メリーランド州ウオーカーズビル）、臍帯由来細胞群、および胎盤由来細胞群が検査された。継代１０で前もって保存されていた、これらの細胞集団群は、５，０００細胞／ｃｍ^２で培養され、その時点まで各継代でコンフルエントまで増殖されていた。継代１０で細胞解凍後、細胞密度が細胞集団群に与える影響を決定した。細胞群は標準条件下で凍解し、トリパンブルー染色を使用して計数した。解凍された細胞群は、その後、上記のように抗生物質／抗真菌剤を含む低グルコースＤＭＥＭ成長培地内で１０００細胞／ｃｍ^２で播種された。細胞群は３７℃で標準的大気圧条件下で増殖された。成長培地は１週間に２回交換され、前記細胞群は約８５％コンフルエントに達すると継代された。細胞群は、老化まで（すなわち、前記細胞群が増殖できなくなるまで）、繰返し継代された。各継代時には、細胞群はトリプシン処理され、計数された。細胞数、集団倍加時間［ｌｎ（最終的細胞数／初期細胞数）／ｌｎ ２］および倍加時間（培養内での時間／集団倍加時間）。その前の継代の全細胞数に各継代に対する増殖因子（すなわち、増殖因子＝最終的細胞数／初期細胞数）を掛け算することによって、継代あたりの全細胞数が決定された。

最初に細胞播種されてからの、低密度でのＰＰＤＣ群の増殖
新しく単離されたＰＰＤＣ群の増殖潜在能力が、低密度の播種条件下で検査された。ＰＰＤＣ群は、当明細書で記述されたように調製された。細胞群は１０００細胞／ｃｍ^２で播種され、老化に至るまで上記の方法で継代された。細胞群は３７℃で標準的大気圧条件下で増殖された。前記成長培地は１週間に２回交換された。細胞群は約８５％コンフルエントに達すると継代された。各継代時には、細胞群はトリプシン処理され、トリパンブルー染色によって計数された。細胞数、集団倍加時間［ｌｎ（最終的細胞数／初期細胞数）／ｌｎ ２］および倍加時間（培養内での時間／集団倍加時間）が各継代に対し計算された。その前の継代の全細胞数に各継代に対する増殖因子（すなわち、増殖因子＝最終的細胞数／初期細胞数）を掛け算することによって、継代あたりの全細胞数が決定された。細胞群は、ゼラチンでコーティングされたフラスコ群およびゼラチンでコーティングされていないフラスコ群で成長された。

クローン細胞系乳児性胎盤由来細胞群の増殖
胎盤組織から乳児性細胞群の集団を増殖するためにクローニングが使用された。前記胎盤から３種類の異なる細胞集団群の（本明細書に記載されているような）単離に続いて、これらの細胞集団群は標準的成長条件下で増殖し、その後、前記の単離された細胞集団群の特定を明らかにするために核型分析された。前記細胞群は、一人の男児を分娩した一人の母親から単離されたため、中期染色体伸展を行って男性の染色体群および女性の染色体群の間で区別することは容易であった。これらの実験は、新生児側の細胞群は、核型が新生児表現型に陽性であり、中層の細胞群は、核型が新生児表現型および母性表現型の両方に陽性であり、母側の細胞群は、核型が母性表現型に陽性であった。

低酸素の培養条件での細胞群の増殖
低酸素の細胞培養条件は、特定の状況で細胞増殖を改善し得ることが実証されている（米国特許第２００４０００５７０４号公報）。ＰＰＤＣ群の細胞増殖が、細胞培養条件を変更することによって改善され得るかを決定するために、臍帯由来細胞群の培養群を低酸素条件で成長した。細胞群は、ゼラチンでコーティングされたフラスコ群で、成長培地内で５０００細胞／ｃｍ^２で播種された。細胞群まず、継代５まで標準の大気条件下で培養され、その時点で前記細胞群は低酸素培養条件（５％のＯ_２）に移された。

他の成長条件
他のプロトコールでは、細胞群は、コーティングされていないプレート群、コラーゲンでコーティングされたプレート群、フィブロネクチンでコーティングされたプレート群、ラミニンでコーティングされたプレート群、および細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされたプレート群で増殖された。培養は、これらの異なるマトリックス類上で十分に増殖することが実証されている。

結果
ＰＰＤＣ群の増殖の潜在能力と、他の幹細胞集団群および非幹細胞集団群との比較
臍帯由来細胞群および胎盤由来細胞群の両者は、４０回を上回る継代の回数、増殖し、６０日内に１×１０^１７を越える細胞数を生み出した。対照的に、ＭＳＣ群および繊維芽細胞群は、それぞれ２５日後未満および６０日後未満に老化した。脂肪由来細胞群は約６０日間増殖したが、４．５×１０^１２の全細胞数を産生した。このように、使用した実験条件下で分娩後由来細胞群が５０００細胞／ｃｍ^２で播種されたとき、前記細胞群は、同一の条件下で増殖された他の細胞タイプ類より、ずっと良好に増殖した（表２−１）。

低密度の細胞バンク群の増殖潜在能力
臍帯由来細胞群と胎盤由来細胞群と繊維芽細胞群は、１０回を上回る継代の回数、増殖し、６０日内に１×１０^１１を越える細胞数を生み出した（表２−２）。これらの条件下で６０日後に、前記繊維芽細胞群は老化になったが、前記臍帯由来細胞集合群および胎盤由来細胞集合群は８０日後に老化し、それぞれ５０回超の集団倍加および４０回超の集団倍加を完了した。

最初に細胞播種されてからの、低密度でのＰＰＤＣ群の増殖
ＰＰＤＣ群は、ゼラチンでコーティングされた、および、コーティングされていない、プレート群またはフラスコ群に低い密度（１，０００細胞／ｃｍ^２）で増殖された。これらの条件下でのこれらの細胞群の成長潜在能力は良好であった。前記細胞群は、対数成長で容易に増殖した。細胞増殖の割合は、胎盤由来細胞群が、ゼラチンでコーティングされたフラスコ群上で、成長培地内で５０００細胞／ｃｍ^２で播種されたときに観察された割合と同様であった。コーティングされていないフラスコ群、またはゼラチンでコーティングされたフラスコ群のどちらかでの培養の間で、細胞増殖に差は見られなかった。しかし、ゼラチンでコーティングされたフラスコ群上では、細胞群が表現型としてずっと小さく見え、コーティングされていないフラスコ群上では、より大きな細胞の表現型群が観察された。

乳児性または母性のクローン細胞系胎盤由来細胞群の増殖
乳児性または母性のクローン細胞系細胞集団は、前記胎盤の乳児側または母性側のそれぞれから単離された胎盤由来細胞群から増殖することができる。細胞群は順に希釈され、増殖のために、成長培地内で、ゼラチン・コーティングされたプレート群上に播種され、ゼラチン・コーティングされた９６ウェルプレート群内に各ウェルにつき１つの細胞で播種される。この最初のクローニングから、増殖クローン群が同定され、トリプシン処理され、成長培地内で、ゼラチン・コーティングされた１２ウェルプレート群上に再播種され、その後、成長培地内で、ゼラチン・コーティングされたＴ２５フラスコ群に５，０００細胞／ｃｍ^２で継代される。クローン系集団の細胞群が同定されたことを確認するために、サブクローニングが実施される。サブクローニング実験群では、細胞群はトリプシン処理され、各ウェルに０．５細胞の割合で再播種される。良好に成長する前記サブクローン群は、ゼラチン・コーティングされたＴ２５フラスコ群に、５，０００細胞 ｃｍ^２／フラスコで増殖される。細胞群は５，０００細胞 ｃｍ^２／フラスコで継代される。細胞の増殖を実証するために、クローンの成長特性がプロットされてもよい。核型分析は、前記クローンが乳児性または母性のいずれであるかを確認できる。

低酸素の培養条件での細胞群の増殖
低酸素条件下で細胞群は良好に増殖した。しかし、低酸素条件下での培養は、使用した条件下で、ＰＰＤＣ群の細胞増殖に重大な影響を与えなかったようであった。

要約
標準の大気酸素下で、ゼラチンでコーティングされたフラスコ群またはコーティングされていないフラスコ群で、成長培地内で、約５０００細胞／ｃｍ^２の密度で、単離された分娩後由来細胞群を成長させることを含む細胞増殖条件は、継代１１で大量数の細胞群を発生させるのに十分である。さらに、前記データは、より低い密度の培養条件（例えば、１０００細胞／ｃｍ^２）を用いると前記細胞群が容易に増殖され得ることを示唆している。低酸素条件での分娩後由来細胞の増殖もまた、細胞増殖を促進するが、これらの条件を成長に使用しても、細胞増殖の可能性に漸進的な改善はまだ観察されていない。現在のところ、標準の大気条件下で分娩後由来細胞群を培養することが、大量の細胞群を発生するのに望ましい。しかし、前記培養条件が変更されると、分娩後由来細胞の増殖も同様に変わる可能性がある。この対策を用いて、これらの細胞集団群の増殖能力および分化能力を向上することが可能である。

使用された条件下では、ＭＳＣおよび脂肪由来細胞群の増殖能力は限定されているが、分娩後由来細胞群は、大量の数まで容易に増殖する。

実施例２の参考文献
１）Ｈａｙｆｌｉｃｋ Ｌ．１９７４ａ．Ｊ Ａｍ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｓｏｃ．２２：１〜１２．
２）Ｈａｙｆｌｉｃｋ Ｌ．１９７４ｂ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ．１４：３７〜４５．
３）米国特許第２００４００５８４１２号公報
４）米国特許第２００４００４８３７２号公報
５）米国特許第２００４０００５７０４号公報

胎盤由来細胞群用の成長培地の評価
いくつかの細胞培養培地が、胎盤由来細胞群の成長を支える能力について評価された。正常レベル（２０％）の酸素および低レベル（５％）の酸素での胎盤由来細胞群の成長が、ＭＴＳ比色分析を使用して３日後に評価された。

方法類および材料類
継代８（Ｐ８）の胎盤由来細胞群は、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地内で、９６ウェルプレート群で、各ウェルに１×１０^３細胞群で播種された。８時間後、前記培地は以下に記載されるように交換され、細胞群は正常レベル（大気圧）の酸素または低レベル（５％、ｖ／ｖ）の酸素で、３７℃、５％のＣＯ^２で、４８時間インキュベートされた。ＭＴＳが前記培地（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、プロメガ社、ウイスコンシン州マジソン）に３時間加えられ、その吸収が、４９０ナノメートルで測定された（モレキュラーデバイス社、カリフォルニア州サニーベール）。

結果
ＭＴＳアッセイの標準曲線群は、吸収の増加、および細胞数の増加の間に線形相関を確立した。取得された吸収値群は、推定細胞数群に変換され、最初の播種と比較した変化（％）が計算された。

血清の効果
正常な酸素条件下で血清を培地に加えると、吸収に、つまり生細胞数に、再現性のある用量依存的な増加があった。ＭＳＣＧＭを完成するために血清を添加すると、吸収に用量依存的な吸収の減少が起こった。血清添加なしの培地では、細胞群は、ＣＥＬＬＧＲＯ−ＦＲＥＥと、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０と、ＤＭＥＭで認識できるほどしか成長しなかった。

酸素の効果
酸素を減らすと、成長培地と、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０と、ＭＳＣＧＭ内での細胞群の成長速度が増加したようであった。前記細胞群の最良の成長を起こす培地は、成長が減少する順番に、成長培地>ＭＳＣＧＭ>Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ＋１０％のＦＢＳ＝ＤＭＥＭ−Ｈ＋１０％のＦＢＳ＝Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％のＦＢＳ＝ＲＰＭＩ １６４０＋１０％のＦＢＳであった。

要約
胎盤由来細胞群は、正常の酸素または低酸素下で、種々の培養培地で成長し得る。胎盤由来細胞群の短期間の成長が、０％（ｖ／ｖ）と、２％（ｖ／ｖ）と、１０％（ｖ／ｖ）の血清を含む、１２種類の基本培地で、５％酸素または大気中酸素で決定された。一般的に、胎盤由来細胞群は、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０およびＣＥＬＬＧＲＯ−Ｆｒｅｅを除いては無血清の条件下ではそれほど成長しなかった。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０およびＣＥＬＬＧＲＯ−Ｆｒｅｅはまた、タンパク質をも含まない。これらの無血清の培地での成長は、１５％の血清を含む培地で観察される最大の成長の約２５〜３３％であった。

Ｄ−バリンを含む培地内での分娩後由来細胞群の成長
通常のＬ−バリンのイソ型の代わりにＤ−バリンを含む培地を使用して、培養内の繊維芽様細胞群の成長を選択的に阻害し得ることが報告されている（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ、２０００；Ｓｏｒｄｉｌｌｏら、１９８８）。分娩後由来細胞群がＤ−バリンを含む培地内で成長できるかどうか、以前には知られていなかった。

方法類および材料類
胎盤由来細胞群（Ｐ３）と、繊維芽細胞群（Ｐ９）と、臍帯由来細胞群（Ｐ５）は、ゼラチンでコーティングされたＴ７５フラスコ群（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）に５×１０^３細胞／ｃｍ^２で播種された。２４時間後、培地が取り除かれ、前記細胞群をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ギブコ社、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄し、残余の培地を取り除いた。前記培地は、改変成長培地（Ｄ−バリン（ギブコ、特別注文）、１５％（ｖ／ｖ）の透析済みウシ胎仔血清（ハイクローン社、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）のベータメルカプトエタノール（シグマ社）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ社）を含むＤＭＥＭ）に取り替えられた。

結果
Ｄ−バリンを含む培地に播種された、胎盤由来細胞群と、臍帯由来細胞群と、繊維芽細胞群は、透析済み血清を含む成長培地に播種された細胞群とは違って、増殖しなかった。繊維芽細胞群は形態的に変化し、サイズがより大きくなり、形態も変化していた。４週間後には、すべての細胞群が死んで、最終的には前記フラスコの表面から剥離した。これらの結果は、Ｄ−バリンを含む培地は、分娩後由来細胞群を選択的に増殖するのに適していないことを示している。

実施例４の参考文献
１）Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ Ｊ．２０００．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ．２４：１〜７．
２）Ｓｏｒｄｉｌｌｏ ＬＭ，Ｏｌｉｖｅｒ ＳＰ，Ａｋｅｒｓ ＲＭ．１９８８）．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ Ｒｅｐ．１２：３５５〜６４．

胎盤由来細胞群用の冷凍保存培地
胎盤由来細胞群の冷凍保存用の冷凍保存培地が評価された。

方法類および材料類
ゼラチンでコーティングされたＴ７５フラスコ内で成長培地で成長された胎盤由来細胞群はＰＢＳで洗浄され、１ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコ社）を使用してトリプシン処理された。前記トリプシン処理は、１０ミリリットルの成長培地を加えることによって停止された。前記細胞群は１５０Ｇで遠心され、その上澄みが取り除かれ、その細胞沈殿物は１ミリリットルの成長培地中に再懸濁された。１アリコートの細胞懸濁液（６０マイクロリットル）が取り除かれ、６０マイクロリットルのトリパンブルー液に加えられた。生細胞数が、血球計算板を用いて推定された。前記細胞懸濁液は、各アリコートが８８×１０^４の細胞を含むように、４つのアリコート群に分割された。前記細胞懸濁液は遠心され、１ミリリットルの以下の各培地に懸濁され、クライオバイアル群（ナルゲン社）に移された。

１．）成長培地＋１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ（Ｈｙｂｒｉｍａｘ、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）
２．）細胞凍結培地（ＤＭＳＯおよびメチルセルロースを含む、無血清）（Ｃ６２９５、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）
３．）無血清細胞凍結培地（Ｃ２６３９、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）
４．）細胞凍結培地（グリセロールを含む）（Ｃ６０３９、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）

前記細胞群は、１つの「Ｍｒ Ｆｒｏｓｔｙ」冷凍容器を、その製造業者の使用説明書（ナルゲン社、ニューヨーク州ロチェスター）に従って使用し、−８０℃の冷凍庫内で、一晩、約−１℃／分で冷却された。細胞群のバイアル群は、２日間液体窒素に移された後、３７℃の水槽内で急速に解凍された。前記細胞群は、１０ミリリットルの成長培地に加えられ遠心された後に、前記細胞の細胞数および生存能力が推定された。前記細胞が接着して増殖するかどうかを決定するために、前記細胞群は、ゼラチンでコーティングされたフラスコ群に５，０００細胞／ｃｍ^２で播種された。

結果
冷凍保存される前記細胞群の初期生存能力は、トリパンブルー染色によって、１００％であることが評価された。冷凍保存される前記細胞群の初期生存能力は、トリパンブルー染色によって、１００％であることが評価された。

Ｃ６２９５に関する生存能力については、細胞溶解のため、細胞数に比例する減少があった。４種類の溶液のすべてで冷凍保存された生存細胞群は、接着して分裂し、３日以内にコンフルエントの単層を形成した。推定された成長速度に認識可能な差はなかった。

要約
細胞群の冷凍保存は、細胞バンクまたは細胞製品の調製に利用できる１つの処理である。４種類の冷凍保存混合液類が、ヒトの胎盤由来細胞群を冷凍による損傷から防護する能力に関して比較された。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が、胎盤由来細胞群の冷凍保存で比較された培地類の中で好適な培地である。

分娩後由来細胞群の核型分析
細胞治療で使用される細胞株群は、好適には均一で、混在する細胞タイプを含まない。細胞治療で使用される細胞群は、正常の染色体数（４６）および構造を有するべきである。胎盤由来細胞株群および臍帯由来細胞株群が、均一であって、分娩後組織以外の源泉の細胞を含まないことを同定するために、細胞標本群の核型が分析された。

材料類および方法類
男子の新生児の分娩後組織からのＰＰＤＣ群が、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地で培養された。男子の新生児（Ｘ、Ｙ）からの分娩後組織が選択されたため、新生児由来細胞群および母性由来細胞群（Ｘ、Ｘ）の間の区別を可能にした。細胞群は、Ｔ２５フラスコ（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）内で、成長培地で５，０００細胞／ｃｍ^２で播種され、８０％のコンフルエントまで増殖された。細胞を含むＴ２５フラスコは、首部まで成長培地で満たされた。標本群は、臨床細胞遺伝学研究室まで配達業者によって配達された（両研究室の間の推定輸送時間は１時間である）。細胞群は、染色体の視覚化が最適である中期の間に分析された。中期にあった２０細胞の内、５つの細胞が、正常の均一な核型数（２）に関して分析された。２つの核型が観察された場合は、細胞標本は均一として特徴付けられた。２つ以上の核型が観察された場合は、細胞標本は不均一として特徴付けられた。不均一な核型数（４）が同定されたときは、追加の中期の細胞群がカウントされ分析された。

結果
染色体分析に送られた全細胞標本群は、正常の外観を示すと判断された。分析された１６細胞株の内の３株が、不均一な発現型（ＸＸおよびＸＹ）を示した。これは、新生児および母性の両方の源泉から由来する細胞群の存在を示す（表６−１）。胎盤−Ｎの組織から由来する細胞群は、胎盤の乳児側から単離された。継代０では、この細胞株は均一（ＸＹ）であるようであった。しかし、継代９で、前記細胞株は不均一（ＸＸ／ＸＹ）であった。これは、以前に検出できなかった、母性を源泉とする細胞群の存在を意味する。

要約
染色体分析は、胎盤由来細胞群および臍帯由来細胞群を同定し、その核型は、臨床細胞遺伝学研究室によって解釈されたところでは、正常のようであった。核型分析はまた、母性細胞群のない細胞株群を同定したが、これは、均一な核型によって決定された。

フローサイトメトリーによるヒト分娩後由来細胞表面マーカー類の評価
細胞表面タンパク質類、すなわち「マーカー類」、のフローサイトメトリーによる特徴付けを使用して、細胞株の同定が決定され得る。発現の一貫性は、複数のドナーから決定することができ、また異なる処理および培養の条件類に曝露された細胞群で決定され得る。胎盤および臍帯から単離された分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）株群は、（フローサイトメトリーによって）特徴付けられ、これらの細胞株群の同定のための特徴を提供する。

材料類および方法類
培地および培養容器類
細胞群は、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）内で培養された。細胞群は、血漿で処理された、Ｔ７５とＴ１５０とＴ２２５の組織培養フラスコ群（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）内でコンフルエントになるまで培養された。前記フラスコ群の成長表面は、２％（ｗ／ｖ）のゼラチン（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）を室温で２０分間インキュベートすることによって、ゼラチンでコーティングされた。

抗体染色およびフローサイトメトリー分析
フラスコ群内の接着細胞群は、ＰＢＳで洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡで剥がされた。細胞群は集められ、遠心され、細胞の濃度がミリリットル当たり１×１０^７になるように、３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含むＰＢＳ中に懸濁された。興味のある細胞表面マーカー（下記を参考）に対する抗体を、その製造業者の仕様類に従って、１００マイクロリットルの細胞懸濁液に加えられ、その混合液は、４℃で３０分間、暗室でインキュベートされた。インキュベートの後、細胞群はＰＢＳで洗浄され、結合していない抗体を除くために遠心された。細胞群は５００マイクロリットルのＰＢＳに再懸濁され、フローサイトメトリーで分析された。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置（ベクトン・ディッキンソン社、カリフォルニア州サンホゼ）で行われた。

以下の細胞表面マーカー類に対する抗体類が使用された。

胎盤および臍帯の比較
継代８で、胎盤由来細胞群が臍帯由来細胞群と比較された。

継代別の比較
胎盤由来細胞群および臍帯由来細胞群が、８と１５と２０の継代で分析された。

ドナー別の比較
ドナー群の中での差を比較するために、異なるドナー群からの胎盤由来細胞群が互いに比較され、また異なるドナー群からの臍帯由来細胞群が互いに比較された。

表面コーティングの比較
ゼラチンでコーティングされたフラスコ群上で培養された胎盤由来細胞群が、コーティングされていないフラスコ群上で培養された胎盤由来細胞群と比較された。ゼラチンでコーティングされたフラスコ群上で培養された臍帯由来細胞群が、コーティングされていないフラスコ群上で培養された臍帯由来細胞群と比較された。

消化酵素の比較
細胞群の単離および調製に使用された４種類の処理群が比較された。１）コラゲナーゼ、２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ、３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ、およびコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼ、で処理された、胎盤から単離された細胞群が比較された。

胎盤層の比較
胎盤組織の母側から由来する細胞群は、胎盤組織の絨毛域から由来する細胞群および胎盤の乳児側から由来する細胞群と比較された。

結果
胎盤と臍帯の比較
フローサイトメトリーで分析された胎盤由来細胞群および臍帯由来細胞群は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＦＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性の発現を示したが、これはＩｇＧのコントロールに比較して上昇した蛍光値群によって示された。これらの細胞群は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの検出可能な発現で陰性であったが、これはＩｇＧのコントロールに比較して蛍光値群によって示された。陽性のカーブ群の蛍光値群の変動群は説明が付けられた。前記の陽性カーブ群の平均（すなわち、ＣＤ１３）および範囲（すなわち、ＣＤ９０）がいくらかの変動を示したが、前記カーブ群は正常のようであり、均一な集団であることを確認した。両方のカーブ群は個々に、ＩｇＧコントロールより大きな値群を示した。

継代別の比較−胎盤由来細胞群
ＩｇＧのコントロールに比較して上昇した蛍光値群によって反映されたように、フローサイトメトリーで分析された、８と１５と２０の継代の胎盤由来細胞群はすべて、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＦＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現で陽性であった。これらの細胞群は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現で陰性であり、これらの発現はＩｇＧのコントロールと一致した蛍光値群を有していた。

継代別の比較−臍帯由来細胞群
フローサイトメトリーで分析された８と１５と２０の継代の臍帯由来細胞群はすべて、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＦＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、これはＩｇＧのコントロールに比較して上昇した蛍光によって示された。これらの細胞群は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱで陰性であったが、これはＩｇＧのコントロールと一致する蛍光値群によって示唆された。

ドナー別の比較−胎盤由来細胞群
別のドナー群から単離され、フローサイトメトリーで分析された胎盤由来細胞群はそれぞれ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＦＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、それらはＩｇＧのコントロールに比較して上昇した蛍光値を有していた。ＩｇＧのコントロールと一致した蛍光値によって示唆されたように、これらの細胞群は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現で陰性であった。

ドナー別の比較−臍帯由来細胞群
別のドナー群から単離され、フローサイトメトリーで分析された臍帯由来細胞群はそれぞれ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＦＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性の発現を示し、これらはＩｇＧの前記コントロールに比較して上昇した蛍光値群によって反映された。これらの細胞群は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現で陰性であり、ＩｇＧの前記コントロールと一致した蛍光値群を有していた。

ゼラチンでの表面コーティングの胎盤由来細胞群への影響
ゼラチンでコーティングされたフラスコ群、またはコーティングされていないフラスコ群上で増殖された胎盤由来細胞群が、フローサイトメトリーで分析され、すべてはＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＦＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現していたが、これらはＩｇＧの前記コントロールに比較して上昇した蛍光値群によって反映された。これらの細胞群は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現で陰性であったが、これは、ＩｇＧの前記コントロールと一致した蛍光値によって示された。

ゼラチンでの表面コーティングの臍帯由来細胞群への影響
ゼラチンでコーティングされたフラスコ群、またはコーティングされていないフラスコ群上で増殖された臍帯由来細胞群が、フローサイトメトリーで分析され、すべてはＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＦＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現で陽性であったが、これらはＩｇＧの前記コントロールに比較して上昇した蛍光値群を有していた。これらの細胞群は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現で陰性であり、ＩｇＧの前記コントロールと一致した蛍光値群を有していた。

前記細胞群の調製に使用される酵素消化処理の、前記細胞表面マーカーのプロフィールへの効果
種々の消化酵素類を用いて単離された胎盤由来細胞群が、フローサイトメトリーで分析され、すべてはＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＦＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現したが、これは、ＩｇＧの前記コントロールに比較して上昇した蛍光値群によって示された。ＩｇＧの前記コントロールと一致した蛍光値によって示されたように、これらの細胞群は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現で陰性であった。

胎盤層の比較
前記胎盤の母性層、絨毛層、乳児側層から単離された細胞群が、それぞれ、フローサイトメトリーで分析され、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＦＤＧＦｒ−アルファ、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性の発現を示したが、これはＩｇＧの前記コントロールに比較して上昇した蛍光値群によって示された。ＩｇＧの前記コントロールと一致した蛍光値によって示されたように、これらの細胞群は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現で陰性であった。

要約
フローサイトメトリーによる胎盤由来細胞群および臍帯由来細胞群の分析は、これらの細胞株群の特定性を確立した。胎盤由来細胞群および臍帯由来細胞群は、ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＦＤＧＦｒ−アルファとＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに対し陽性であり、ＣＤ３１とＣＤ３４とＣＤ４５とＣＤ１１７とＣＤ１４１とＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに対し陰性である。この特定性は、ドナー、継代、培養容器の表面コーティング、消化酵素、および胎盤層を含む変数群の変動の間で一貫性があった。個々の蛍光値のヒストグラムカーブ群の平均群および範囲群での程度の変動が観察されたが、検査された、すべての条件下でのすべての陽性カーブ群は正常であり、前記ＩｇＧコントロールより高い蛍光値群を発現し、したがって前記細胞群は、前記マーカー類の陽性の発現を有する均一な集団を含むことを確証した。

分娩後組織発現型類の免疫組織化学的特徴付け
ヒトの分娩後組織類、すなわち臍帯および胎盤、の中に見つけられる細胞群の発現型類が免疫組織化学によって分析された。

方法類および材料類
組織の調製
ヒトの臍帯組織および胎盤組織は、収集され、４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒドで一晩、４℃で固定された。次のエピトープ群に対する抗体類を用いて免疫組織化学が行われた。それらは、ビメンチン（１：５００、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）、デスミン（１：１５０、ウサギに対する抗体、シグマ社、または１：３００、マウスに対する抗体、ケミコン社、カリフォルニア州テメキュラ）、アルファ−平滑筋アクチン（ＳＭＡ、１：４００、シグマ社）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８、１：４００、シグマ社）、フォンウィルブラント因子（ｖＷＦ、１：２００、シグマ社）、およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４、クラスＩＩＩ、１：１００、ダコサイトメーション社、カリフォルニア州カーピンテリア）、である。さらに、以下のマーカー類がテストされた。それらは、抗ヒトＧＲＯａｌｐｈａ−ＰＥ（１：１００、ベクトン・ディッキンソン、ニュージャージー州フランクリンレークス）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００、サンタクルーズ・バイオテック社、カリフォルニア州サンタクルーズ）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、１：１００、サンタクルーズ・バイオテック社）、および抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００、サンタクルーズ・バイオテック社）である。固定された標本群は、外科用メスで切り取られ、エタノールを含むドライアイス槽の上でＯＣＴ包埋剤（Ｔｉｓｓｕｅ-Ｔｅｃ ＯＣＴ；サクラ、カリフォルニア州トーランス）内に置かれた。凍結ブロック群は、標準的クライオスタット（ライカマイクロシステムズ社）を用いて切片（１０μｍの厚さ）に切られ、染色するためにガラススライド群上に載せられた。

免疫組織化学
免疫組織化学は、以前の研究（例えば、Ｍｅｓｓｉｎａら、２００３，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８４：８１６〜８２９）に類似した方法で行われた。組織切片群はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）のヤギ血清（ケミコン社、カリフォルニア州テメキュラ）、および０．３％（ｖ／ｖ）のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、シグマ社）を含むタンパク質ブロッキング溶液に１時間に曝し、細胞内抗原類にアクセスできるようにした。興味のある前記エピトープが細胞表面上に位置するであろう場合（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１）は、エピトープの損失を避けるために、トライトンが前記手順の全ステップで省略された。さらに、前記１次抗体がヤギに対して作られた場合（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）は、前記手順を通してヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）のロバ血清が使用された。ブロッキング溶液に希釈された１次抗体類は、室温で４時間、前記切片に適用された。１次抗体溶液が取り除かれ、培養群はＰＢＳで洗浄してから、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０、モレキュラー・プローブス社、オレゴン州ユージーン）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０、モレキュラー・プローブス社）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０、サンタクルーズ・バイオテック社）と共にブロッキング剤を含む２次抗体溶液が適用された（室温、１時間）。培養群は洗浄され、細胞核を視覚化するために、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（モレキュラー・プローブス社）が１０分間適用された。

免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡（オリンパス、ニューヨーク州メルビル）上で適切な蛍光フィルタを使用して、蛍光を視覚化した。陽性の染色は、コントロール染色より高い蛍光信号によって表される。代表的な画像群が、ディジタルカラービデオカメラおよびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（メディアサイバネティクス社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて保存された。三色染色の標本群では、１回に１つの励起フィルタのみを使用して各画像が取られた。その後、アドビ・フォトショップのソフトウェア（アドビ社、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて、重ねたモンタージュが作製された。

結果
臍帯の特徴付け
ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、およびＣＤ３４のマーカー類は、臍帯内に見つけられる細胞群の一部の細胞群で発現されていた。特に、ｖＷＦおよびＣＤ３４の発現は、前記臍帯内に含まれる血管群に限られていた。ＣＤ３４＋細胞群は、最も内側の層（内腔側）にあった。ビメンチンの発現は、前記臍帯のマトリックスおよび血管群に見つけられた。ＳＭＡは、前記マトリックスと、動脈および静脈の外壁群に限られていたが、前記血管群自体には含まれていなかった。ＣＫ１８およびデスミンは前記血管群内にのみ観察され、デスミンは中層と外層に限られていた。

胎盤の特徴付け
ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、およびＣＤ３４はすべて、胎盤内に見つけられ、領域的に特異的であった。

ＧＲＯａｌｐｈａ、ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、およびＮＯＧＯ−Ａの組織発現
これらのマーカー類のいずれも、臍帯組織または胎盤組織内で観察されなかった。

要約
ビメンチン、デスミン、アルファ−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォンウィルブラント因子、およびＣＤ３４は、ヒトの臍帯および胎盤内の細胞群で発現されている。

オリゴヌクレオチド・アレイ群を用いた分娩後組織由来細胞群の分析
アフィメトリクス社のＧＥＮＥＣＨＩＰアレイ群を使用して、臍帯由来細胞群および胎盤由来細胞群の遺伝子発現プロフィール群が、繊維芽細胞群およびヒトの間葉系幹細胞群と、ヒト骨髄から由来する別の細胞株とで比較された。この分析は、前記分娩後由来細胞群の特徴付けを提供し、これらの細胞群に対するユニークな分子マーカー類を同定した。

材料類および方法類
細胞群の単離および培養
ヒトの臍帯群および胎盤は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ、ペンシルバニア州フィラデルフィア市）から、患者の承諾を得て、正常の満期出産から取得された。実施例１に記載されたように、これらの組織類は受け取られ、細胞群が単離された。細胞群は、ゼラチンでコーティングされた組織培養プラスチック製フラスコ群で、成長培地（低グルコースＤＭＥＭを使用）内で培養された。前記細胞は、５％のＣＯ_２下で３７℃でインキュベートされた。

ヒトの皮膚繊維芽細胞群は、ケンブレックス社（メリーランド州ウオーカーズビル、ロット番号：９Ｆ０８４４）およびＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）から購入された。両方の細胞株は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ハイクローン社）およびペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２の培地（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）内で培養された。前記細胞群は、標準的な組織処理されたプラスチック上で成長された。

ヒトの間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）群は、ケンブレックス社（メリーランド州ウオーカーズビル、ロット番号：２Ｆ１６５５と２Ｆ１６５６と２Ｆ１６５７）から購入され、ＭＳＣＧＭ培地（ケンブレックス社）内で前記製造業者の仕様群に従って培養された。前記細胞群は、５％のＣＯ_２下で３７℃で、標準的な組織培養のプラスチック上で成長された。

ヒトの腸骨稜骨髄は、患者の承諾を得て、ＮＤＲＩから受け取った。前記骨髄は、Ｈｏら（ＷＯ０３／０２５１４９）によって概説された方法に従って処理された。前記骨髄は溶解バッファー（１５５ｍＭのＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ_３、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）と混合されたが、これは、前記骨髄と前記溶解バッファーが１：２０の比で混合された。前記細胞懸濁液はボルテックスにかけられ、室温で２分間インキュベートされ、５００Ｇで１０分間遠心された。その上澄みは廃棄され、その細胞沈殿物は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清および４ｍＭのグルタミンを添加された最小必須培地−アルファ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ−ａｌｐｈａ）（インビトロジェン社）に再懸濁された。前記細胞群は再び遠心され、その細胞沈殿物は新鮮な培地に再懸濁された。トリパンブルー排除法（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）を使用して、生存可能な単核細胞が計数された。前記単核細胞群は、５×１０^４細胞／ｃｍ^２で、組織培養のプラスチック製フラスコ群上に播種された。前記細胞群は、標準大気のＯ_２、または５％のＯ_２のいずれかで、５％のＣＯ_２下で３７℃でインキュベートされた。細胞群は、培地を交換せずに５日間培養された。培地および非接着細胞群は、５日の培養後、取り除かれた。その接着細胞群は培養内で維持された。

ｍＲＮＡの単離およびＧＥＮＥＣＨＩＰ分析
活動的に成長している培養の細胞群が、冷やしたＰＢＳ中で、セルスクレーパーを用いて、前記フラスコ群から取り除かれた。前記細胞群は、３００Ｇで５分間遠心され、その上澄みが除かれ、その細胞は新鮮なＰＢＳ中に再懸濁され、再び遠心された。その上澄みが取り除かれ、その細胞沈殿物はすぐに冷凍され、−８０℃で保存された。細胞性ｍＲＮＡが抽出され、ｃＤＮＡに転写され、このｃＤＮＡはｃＲＮＡおよびビオチン標識に転写された。前記ビオチン標識ｃＲＮＡは、ＨＧ−Ｕ１３３Ａ−ＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイ（アフィメトリクス社、カリフォルニア州サンタクララ）とハイブリッドされた。前記ハイブリッドおよびデータ収集は、前記製造業者の仕様群に従って行われた。分析は、「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピューターソフトウェア（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｗｗｗ−ｓｔａｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｔｉｂｓ／ＳＡＭ；Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．ら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：５１１６〜５１２１）を用いて行われた。

結果
１４の異なる細胞集団群が分析された。表９−１に、継代データ、培養基質、および培養培地と共に細胞群がリストされている。

前記データは主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）によって評価され、前記細胞群で差次的に発現された２９０の遺伝子群が分析された。この分析は、前記集団群の間の類似性の相対比較を可能にする。表９−２は、細胞の対群の比較で計算されたユークリッド距離群を示す。前記ユークリッド距離群は、前記細胞群の比較に基づいていたが、この比較は前記細胞タイプ群の間で差次的に発現された２９０の遺伝子群に基づく。前記ユークリッド距離群は、前記２９０遺伝子群の発現の間の類似性に逆比例する（すなわち、その距離が長いほど、類似性は少ない）。

表９−３、表９−４、および表９−５は、胎盤由来細胞群で増加した遺伝子発現（表９−３）、臍帯由来細胞群で増加した遺伝子発現（表９−４）、および、胎盤由来細胞群および臍帯由来細胞群で減少した遺伝子発現（表９−５）を示す。「プローブセットＩＤ」と題された列は、前記チップ上の特定の部位に位置する、いくつかのオリゴヌクレオチドプローブ群のセット群に対する、製造業者の同定コードを意味するが、これらのオリゴヌクレオチドプローブ群は、命名された遺伝子（「遺伝子名」列）にハイブリッドし、このような遺伝子はＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）データ−ベース内の特定の受入れ番号（「ＮＣＢＩ受入れ番号」列）に見つけられる配列を含む。

表９−６、表９−７、および表９−８は、ヒト繊維芽細胞群で増加した遺伝子発現（表９−６）、ＩＣＢＭ細胞群で増加した遺伝子発現（表９−７）、および、ＭＳＣ群で増加した遺伝子発現（表９−８）を示す。

要約
この検査は、臍帯および胎盤に由来する分娩後細胞群の分子的特徴付けを提供するために行われた。この分析には、３種類の異なる臍帯群、および３種類の異なる胎盤群から由来する細胞群が含まれた。この検査にはまた、異なる２株群の皮膚繊維芽細胞群、３株の間葉系幹細胞群、および３株の腸骨稜骨髄細胞群が含まれた。これらの細胞群によって発現されたｍＲＮＡは、２２，０００の遺伝子群に対するプローブ群を含むオリゴヌクレオチドアレイを用いて分析された。結果は、５種類の異なる細胞タイプ群で２９０の遺伝子群が差次的に発現されている。これらの遺伝子群には、前記胎盤由来細胞群で特異的に増加されている１０の遺伝子と、前記臍帯由来細胞群で特異的に増加した７つの遺伝子群が含まれる。５４の遺伝子群は、他の細胞タイプ群と比較して、胎盤および臍帯で特異的に低いレベルの発現を有することが発見された。選択された遺伝子群の発現はＰＣＲによって確認されている（以下の実施例を参照）。これらの結果群は、前記分娩後由来細胞群が、例えば、骨髄由来細胞群および繊維芽細胞群と比較して、特有の遺伝子発現プロフィールを有することを実証している。

分娩後由来細胞群の細胞マーカー類
上記の実施例では、ヒトの胎盤およびヒトの臍帯から由来する細胞類での類似性および差が、その遺伝子発現を他の源泉類から由来する細胞群の遺伝子発現と比較すること（オリゴヌクレオチドアレイを用いて）によって評価された。６つの「シグネチャ」遺伝子群が同定された。それらは、酸化ＬＤＬ受容体１、インターロイキン１、レニン、レチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）、ケモカイン受容体リガンド３（ＣＸＣリガンド３）、および顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）である。これらの「シグネチャ」遺伝子群は、分娩後由来細胞群で比較的高レベルで発現された。

この実施例で記載される手順類は、前記マイクロアレイのデータを確かめるために、遺伝子発現とタンパク質発現の一致／不一致を見つけるために、また、胎盤由来細胞群および臍帯由来細胞群に対するユニークな識別体類の検出用に一連の信頼性のおける分析を確立するために、行われた。

方法類および材料類
細胞群
胎盤由来細胞群（３つの単離体群、主に新生児系（核型分析によって同定）の１つの単離体を含む）、臍帯由来細胞群（４つの単離体群）、および正常のヒト皮膚繊維芽細胞群（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＮＨＤＦ、新生児および成人）が、ゼラチンでコーティングされたＴ７５フラスコで、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地内で成長された。間葉系幹細胞群（ＭＳＣ）は、間葉系幹細胞成長培地キット（ＭＳＣＧＭ、ケンブレックス社、メリーランド州ウオーカーズビル）で成長された。

ＩＬ−８のプロトコールでは、細胞群は液体窒素から解凍され、ゼラチンでコーティングされたフラスコ群に５，０００細胞群／ｃｍ^２でプレーティングされ、成長培地内で４８時間成長され、その後、１０ミリリットルの血清飢餓培地［低グルコースＤＭＥＭ（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）、および０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（シグマ、ミズーリ州セントルイス）］でさらに８時間成長された。この処置後、ＲＮＡが抽出され、細胞の残渣を除くためにその上澄みが１５０Ｇで５分間遠心された。ＥＬＩＳＡ分析用に上澄みが−８０℃で冷凍された。

ＥＬＩＳＡアッセイ用の細胞培養
胎盤および臍帯からの分娩後由来細胞群、並びにヒト新生児の包皮から由来するヒト繊維芽細胞群は、ゼラチンでコーティングされたＴ７５フラスコ群上で成長培地で培養された。細胞群は、継代１１で液体窒素で冷凍保存された。細胞群は解凍され、１５ミリリットル遠心管に移された。１５０Ｇで５分間遠心された後、その上澄みが廃棄された。細胞群は４ミリリットルの培養培地に再懸濁され、計数された。細胞群は、１５ミリリットルの成長培地を含む７５ｃｍ^２フラスコで、３７５，０００細胞／フラスコの密度で２４時間成長された。前記培地は血清飢餓培地に８時間取り替えられた。血清飢餓培地はインキュベートの終了時に収集され、１４，０００Ｇで５分間遠心された（−２０℃で保管）。

各フラスコ内の細胞数を推定するために、各フラスコに２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコ社、カリフォルニア州カールズバッド）が加えられた。細胞群が前記フラスコから剥がれた後、トリプシン活性は８ミリリットルの成長培地で無効化された。細胞群は１５ミリリットルの遠心管に移され、１５０Ｇで５分間、遠心された。その上澄みが除去され、１ミリリットルの成長培地を各遠心管に加えて前記細胞群が再懸濁された。血球計算板を用いて細胞数が推定された。

ＥＬＩＳＡアッセイ
前記細胞群が血清飢餓培地に分泌したＩＬ−８量は、ＥＬＩＳＡアッセイ群（Ｒ&Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）で分析された。すべてのアッセイ群は、前記製造業者が提供した使用説明書に従って行われた。

総ＲＮＡの単離
ＲＮＡはコンフルエントの分娩後由来細胞群および繊維芽細胞群から抽出された。またＩＬ−８発現用ＲＮＡは上記のように処理された細胞群から抽出された。細胞群は、ベータメルカプトエタノールを含む３５０マイクロリットルのバッファーＲＬＴで溶解されたが、これは前記製造会社（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）の使用説明書に従って行われた。ＲＮＡは、製造会社（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）の使用説明書に従って抽出され、デオキシリボヌクレアーゼ処理（２．７ユニット／サンプル）（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）された。ＲＮＡは５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で溶出され、−８０℃で保管された。

逆転写
ＲＮＡはまた、ヒトの胎盤および臍帯からも抽出された。組織（３０ミリグラム）は、２−メルカプトエタノールを含む、７００マイクロリットルのバッファーＲＬＴに懸濁された。標本類は機械的にホモジナイズされ、ＲＮＡ抽出は製造会社の仕様に従って行われた。ＲＮＡは５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水で抽出され、−８０℃で保管された。ＲＮＡは、２５℃で１０分間と、３７℃で６０分間と、９５℃で１０分間、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬類（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）でランダム六量体群を用いて逆転写された。標本群は−２０℃で保管された。

ｃＤＮＡマイクロアレイによって、分娩後由来細胞群内でユニークに制御されていると同定された遺伝子群（シグネチャ遺伝子群−酸化ＬＤＬ受容体、インターロイキン−８、レニン、およびレチキュロンを含む）は、リアルタイムＰＣＲおよび従来のＰＣＲを用いてさらに検査された。

リアルタイムＰＣＲ
ＰＣＲは、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ^ＴＭ遺伝子発現製品群を用いてｃＤＮＡ標本群に行われた。それらは、酸化ＬＤＬ受容体（Ｈｓ００２３４０２８）、レニン（Ｈｓ００１６６９１５）、レチキュロン（Ｈｓ００３８２５１５）、ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）、ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）、ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）である。ＧＡＰＤＨ（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）がｃＤＮＡとＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスと混合され、これは製造業者の使用説明書（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）従って、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００ ＳＤＳソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）付きの７０００シークエンス・ディテクション・システムを用いて行われた。熱サイクル条件は、最初５０℃で２分間および９５℃で１０分間、その後、４０回の、９５℃で１５秒および６０℃で１分間であった。ＰＣＲデータは製造会社の仕様（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００シークエンス・ディテクション・システム用のアプライドバイオシステムズからのユーザー用広報Ｎｏ．２）に従って分析された。

従来のＰＣＲ
従来のＰＣＲは、前記リアルタイムＰＣＲからの結果群を確認するために、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社、米国マサチューセッツ州ボストン）を用いて行われた。ＰＣＲは、２マイクロリットルのｃＤＮＡ溶液、１×ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄユニバーサルミックスＰＣＲ反応バッファー（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）および９４℃で５分間の初期の変性を用いて行われた。増殖は各プライマーセットで最適化された。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、およびレチキュロンには、９４℃で１５秒、５５℃で１５秒間、および７２℃で３０秒間、を３０回。レニンには、９４℃で１５秒、５３℃で１５秒間、および７２℃で３０秒間、を３８回。酸化ＬＤＬ受容体およびＧＡＰＤＨには、９４℃で１５秒、５５℃で１５秒間、および７２℃で３０秒間、を３３回。表１に増殖に使用されたプライマー類がリストされている。最終的なＰＣＲ反応でのプライマー濃度は、ＧＡＰＤＨ以外は１マイクロモルであった。ＧＡＰＤＨは０．５マイクロモルであった。ＧＡＰＤＨプライマー群は、製造業者のＴａｑＭａｎプローブが最終的なＰＣＲ反応に加えられなかった以外は、前記リアルタイムＰＣＲと同一であった。標本群は２％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで泳動され、エチジウムブロマイド（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）で染色された。焦点長ポラロイドカメラ（ＶＷＲインターナショナル、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）を用いて、６６７ユニバーサル・ツインパック・フィルム（ＶＷＲインターナショナル、ニュージャージー州サウスプレーンフィールド）を用いて、画像群が取られた。

免疫蛍光
ＰＰＤＣ群は、４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス）で、室温で１０分間固定された。継代０（Ｐ０）（単離後直接に）および継代１１（Ｐ１１）にある、臍帯由来細胞群および胎盤由来細胞群のそれぞれの１単離株（２単離体の胎盤由来細胞、２単離体の臍帯由来細胞）、および繊維芽細胞群（Ｐ１１）が使用された。次のエピトープ群に対する抗体類を用いて免疫細胞化学が行われた。それらは、ビメンチン（１：５００、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）、デスミン（１：１５０、シグマ社、ウサギに対する抗体、または１：３００、ケミコン社、カリフォルニア州テメキュラ、マウスに対する抗体）、アルファ−平滑筋アクチン（ＳＭＡ、１：４００、シグマ社）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８、１：４００、シグマ社）、フォンウィルブラント因子（ｖＷＦ、１：２００、シグマ社）、およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４、クラスＩＩＩ、１：１００、ダコサイトメーション社、カリフォルニア州カーピンテリア）、である。さらに、以下のマーカー類が継代１１の分娩由来細胞群にテストされた。それらは、抗ヒトＧＲＯａｌｐｈａ−ＰＥ（１：１００、ベクトン・ディッキンソン、ニュージャージー州フランクリンレークス）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００、サンタクルーズ・バイオテック社、カリフォルニア州サンタクルーズ）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、１：１００、サンタクルーズ・バイオテック社）、および抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００、サンタクルーズ・バイオテック社）である。

培養群はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）のヤギ血清（ケミコン社、カリフォルニア州テメキュラ）、および０．３％（ｖ／ｖ）のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）を含むタンパク質ブロッキング溶液に３０分に曝し、細胞内抗原類にアクセスできるようにした。興味のある前記エピトープが細胞表面上に位置した場合（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１）は、エピトープの損失を避けるために、トライトンＸ−１００が前記手順の全ステップで省略された。さらに、前記１次抗体がヤギに対して作られた場合（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）は、前記手順を通してヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）のロバ血清が使用された。ブロッキング溶液に希釈された１次抗体類は、室温で１時間、前記培養に適用された。前記１次抗体溶液が取り除かれ、前記培養群がＰＢＳで洗浄されてから、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０、モレキュラー・プローブス社、オレゴン州ユージーン）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０、モレキュラー・プローブス社）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０、サンタクルーズ・バイオテック社）と共にブロッキング剤を含む２次抗体溶液類が適用された（室温、１時間）。培養群は洗浄され、細胞核を視覚化するために、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（モレキュラー・プローブス社）が１０分間適用された。

免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡（オリンパス、ニューヨーク市メルビル）上で適切な蛍光フィルタを使用して、蛍光を視覚化した。すべての場合で、陽性の染色は、コントロール染色より高い蛍光信号によって表されるが、ここで、１次抗体溶液の適用を除いては、上記に概略した全手順に従った。代表的な画像群が、ディジタルカラービデオカメラおよびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（メディアサイバネティクス社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて保存された。三色染色の標本群では、１回に１つの励起フィルタのみを使用して各画像が取られた。その後、アドビ・フォトショップのソフトウェア（アドビ社、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて、重ねたモンタージュが作製された。

ＦＡＣＳ分析用の細胞群の調製
フラスコ群内の接着細胞群は、リン酸緩衝生理食塩（ＰＢＳ）（ギブコ社、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコ社、カリフォルニア州カールズバッド）で剥がされた。細胞群は集められ、遠心され、細胞の濃度がミリリットル当たり１×１０^７になるように、３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含むＰＢＳ中に懸濁された。１００マイクロリットルのアリコート群がコニカルチューブ群に移された。細胞内抗原類のために染色される細胞群は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー（ＢＤファーミンゲン、カリフォルニア州サンジエゴ）で透過処理された。製造会社の仕様にしたがって抗体がアリコート群に加えられ、前記細胞群は暗所に４℃で３０分間インキュベートされた。インキュベートの後、細胞群はＰＢＳで洗浄され、余分の抗体を除くために遠心された。２次抗体を必要とする細胞群は、１００マイクロリットルの３％のＦＢＳに再懸濁された。製造会社の仕様にしたがって２次抗体が加えられ、前記細胞群は暗所に４℃で３０分間インキュベートされた。インキュベートの後、細胞群はＰＢＳで洗浄され、余分の２次抗体を除くために遠心された。洗浄された細胞群は０．５ミリリットルのＰＢＳに再懸濁され、フローサイトメトリーで分析された。以下の抗体類が使用された。それらは、酸化ＬＤＬ受容体１（ｓｃ−５８１３、サンタクルーズ・バイオテック社）、ＧＲＯａ（５５５０４２、ＢＤファーミンゲン、マサチューセッツ州ベッドフォード）、マウスＩｇＧ１ カッパ（Ｐ−４６８５とＭ−５２８４、シグマ社）、ヤギＩｇＧに対するロバ抗体（ｓｃ−３７４３、サンタクルーズ・バイオテック社）、である。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社、カリフォルニア州サンホゼ）で行われた。

結果
ヒト胎盤に由来する細胞群、成人および新生児の繊維芽細胞群、および間葉系幹細胞群（ＭＳＣ）からのｃＤＮＡで行われた選択「シグネチャ」遺伝子群に対するリアルタイムＰＣＲの結果群は、酸化ＬＤＬ受容体およびレニンの両者が、他の細胞群に比べ前記胎盤由来細胞群で高レベルに発現されていたことを示す。リアルタイムＰＣＲから得られたデータは、ΔΔＣＴ法で分析され、対数目盛で表された。レチキュロンおよび酸化ＬＤＬ受容体の発現レベルは、他の細胞群に比べ臍帯由来細胞群で高かった。ＣＸＣリガンド３およびＧＣＰ−２の発現レベルでは、分娩後由来細胞群およびコントロール群の間で有意な差は見つけられなかった。リアルタイムＰＣＲの結果群は従来のＰＣＲにより確認された。ＰＣＲ産物群のシークエンシングはさらに、これらの観察結果を正当化した。ＣＸＣリガンド３の発現レベルは、上記に列挙した従来のＰＣＲ ＣＸＣリガンド３プライマー群を使用したコントロール群と分娩後由来細胞群の間で有意な差は見つけられなかった。

分娩後でサイトカイン、ＩＬ−８の産生が、成長培地で培養された分娩後由来細胞群および血清飢餓の分娩後由来細胞群の両方で上昇していた。リアルタイムＰＣＲのデータはすべて、従来のＰＣＲおよびＰＣＲ産物群のシークエンシングによって正当化された。

無血清培地で成長された細胞群の上澄みがＩＬ−８の存在に関して検査されたとき、最も高い量は、臍帯細胞群、および胎盤細胞群のいくつかの単離体群から由来する培地内に検出された（表１０−１）。ＩＬ−８は、ヒト皮膚繊維芽細胞群から由来する培地には検出されなかった。

胎盤由来細胞群はまた、酸化ＬＤＬ受容体、ＧＣＰ−２、およびＧＲＯアルファの産生についてＦＡＣＳ分析によって検査された。テストされた細胞群はＧＣＰ−２に陽性であった。酸化ＬＤＬ受容体およびＧＲＯはこの方法では検出されなかった。

胎盤由来細胞群はまた、選択されたタンパク質類の産生について、免疫細胞化学分析によって検査された。単離後すぐに（継代０）、ヒト胎盤から由来する細胞群が４％パラホルムアルデヒドで固定され、６種類のタンパク質類（フォンウィルブラント因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、アルファ平滑筋アクチン、ビメンチン）に対する抗体類に曝された。細胞群は、アルファ平滑筋アクチンおよびビメンチンに対し陽性に染色された。このパターンは継代１１まで保たれた。継代０では２〜３の細胞群（５％未満）のみがサイトケラチン１８に陽性に染色された。

ヒト臍帯から由来する細胞群が継代０で、選択されたタンパク質類の産生について、免疫細胞化学分析によって検査された。単離後すぐに（継代０）、細胞群は４％パラホルムアルデヒドで固定され、６種類のタンパク質類（フォンウィルブラント因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、アルファ平滑筋アクチン、ビメンチン）に対する抗体類に曝された。臍帯由来細胞群は、アルファ平滑筋アクチンおよびビメンチンに対し陽性であり、その染色パターンは継代１１まで一貫していた。

要約
マイクロアレイおよびＰＣＲ（リアルタイムおよび従来の両方）で測定された遺伝子発現レベル群の間での一致性が、４つの遺伝子、酸化ＬＤＬ受容体１、レニン、レチキュロン、およびＩＬ−８で確立された。これらの遺伝子群の発現は、ＰＰＤＣ群のｍＲＮＡレベルで差次的に調節されており、ＩＬ−８はタンパク質レベルでも差次的に調節されていた。酸化ＬＤＬ受容体の存在は、胎盤から由来する細胞群では、ＦＡＣＳ分析によるタンパク質レベルで検出されなかった。ＧＣＰ−２およびＣＸＣリガンド３の差次的発現は、ｍＲＮＡレベルで確認できなかったが、ＧＣＰ−２は胎盤由来細胞群で、ＦＡＣＳ分析によるタンパク質レベルで検出された。この結果は、前記マイクロアレイ実験から最初得られたデータに反映されないが、これは前記方法群の感度の差による可能性がある。

単離後すぐに（継代０）、ヒト胎盤から由来する細胞群は、アルファ平滑筋アクチンおよびビメンチンの両方に陽性に染色された。このパターンはまた、継代１１の細胞群でも観察された。これらの結果群は、ビメンチンおよびアルファ平滑筋アクチンの発現が、成長培地で、およびこれらの処理群で利用された条件下で、継代と共に細胞群内で保たれている可能性があることを示唆する。ヒト臍帯から由来する細胞群が継代０で、ビメンチンおよびアルファ平滑筋アクチンの発現について検査され、両方で陽性であった。この染色パターンは継代１１まで保たれていた。

分娩後由来細胞群のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫学的評価
分娩後由来細胞群（ＰＰＤＣ）が、ｉｎ ｖｉｖｏ移植の際に誘導するであろう免疫学的応答を予測する試みとして、これらの細胞群の免疫学的特徴群がｉｎ ｖｉｔｒｏで評価された。ＰＰＤＣ群は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の存在下でフローサイトメトリーで分析された。これらのタンパク質群は、抗原提示細胞群（ＡＰＣ）によって発現され、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞群の直接の刺激に必要である（Ａｂｂａｓ & Ｌｉｃｈｔｍａｎ、ＣＥＬＬＵＬＡＲＣ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第５版（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ（フィラデルフィア）、１７１ページ）。前記細胞株群はまた、ＨＬＡ−Ｇ（前述のＡｂｂａｓ & Ｌｉｃｈｔｍａｎ、２００３）、ＣＤ１７８（Ｃｏｕｍａｎｓら、（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２４，１８５〜１９６）、およびＰＤ−Ｌ２（前述のＡｂｂａｓ & Ｌｉｃｈｔｍａｎ、２００３、Ｂｒｏｗｎら、（２００３）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０，１２５７〜１２６６）の発現についてフローサイトメトリーによって分析された。胎盤組織類内に存在する細胞群による、これらのタンパク質類の発現は、ｉｎ ｕｔｅｒｏ（胎内）で胎盤組織類の免疫特権的（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ）ステータスを仲介すると考えられる。胎盤由来細胞株群および臍帯由来細胞株群がｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を誘導する程度を推定するために、前記細胞株群が一方向（ｏｎｅ−ｗａｙ）法のリンパ球混合反応（ＭＲＬ）で検査された。

材料類および方法類
細胞の培養
細胞群は、２％ゼラチン（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）でコーティングされたＴ７５フラスコ群（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）で、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地にコンフルエントまで培養された。

抗体染色
細胞群は、リン酸緩衝生理食塩（ＰＢＳ）（ギブコ社、カリフォルニア州カールズバッド）で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ（ギブコ社、カリフォルニア州カールズバッド）で剥がされた。細胞群は集められ、遠心され、細胞の濃度がミリリットル当たり１×１０^７になるように、３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含むＰＢＳ中に再懸濁された。製造会社の仕様にしたがって、抗体（表１１−１）が１００マイクロリットルの細胞懸濁液に加えられ、暗所に４℃で３０分間インキュベートされた。インキュベートの後、細胞群はＰＢＳで洗浄され、結合していない抗体を除くために遠心された。細胞群は５００マイクロリットルのＰＢＳに再懸濁され、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置（ベクトン・ディッキンソン社、カリフォルニア州サンホゼ）を用いてフローサイトメトリー分析が行われた。

リンパ球混合反応
細胞株Ａとしてラベルされた継代１０の臍帯由来細胞群、および、細胞株Ｂとしてラベルされた継代１１の胎盤由来細胞群の冷凍保存されたバイアル群がドライアイス上に置かれて、ＣＴＢＲ（ケベック州Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ）に送られ、ＣＴＢＲ ＳＯＰ Ｎｏ．ＣＡＣ−０３１を用いてリンパ球混合反応を行った。末梢血単核細胞群（ＰＢＭＣ）は複数の男女ドナー志願者から収集された。刺激性（ドナー）同種異型ＰＢＭＣ、自己ＰＢＭＣ、および分娩後細胞株類はマイトマイシンＣで処理された。自己細胞群およびマイトマイシンＣ処理済み刺激性細胞群が、応答性（受容者）ＰＢＭＣ群に加えられ、４日間培養された。インキュベーション後、［^３Ｈ］チミジンが各標本に加えられ、１８時間培養された。前記細胞群の収集後、放射性標識されたＤＮＡが抽出され、［^３Ｈ］チミジンの取り込みがシンチレーションカウンタを用いて測定された。

同種異型に対する刺激係数（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｄｏｎｏｒ：ＳＩＡＤ）が、受容者の平均増殖にマイトマイシンＣ処理済み同種異型ドナーを加えて、前記受容者のベースライン増殖で割って計算された。ＰＰＤＣ群の刺激係数は、受容者の平均増殖にマイトマイシンＣ処理済み分娩後細胞株を加えて、前記受容者のベースライン増殖で割って計算された。

結果
リンパ球混合反応−胎盤由来細胞群
１人の同種異型のドナーを同定するために、７人のドナー志願者の血液がスクリーニングされた。その１人のドナーは、他の６人のドナーの血液とのリンパ球混合反応で強い増殖応答を示すはずである。このドナーが同種異型の陽性コントロールドナーとして選択された。残りの６人の血液ドナーは受容体群として選択された。前記の同種異型の陽性コントロールドナーおよび胎盤由来細胞株群は、マイトマイシンＣで処理され、前記の６人の個々の同種異型受容体群とリンパ球混合反応で培養された。反応は、２つの細胞培養プレート（ｔｗｏ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓ）を用い、各プレートに３つの受容体を入れて、３回の多重検査で行われた（表１１−２）。平均の刺激計数は１．３（プレート２）から３（プレート１）の範囲であり、前記の同種異型ドナーの陽性コントロール群は４６．２５（プレート２）から２７９（プレート１）までの範囲であった（表１１−３）。

リンパ球混合反応−臍帯由来細胞群
１人の同種異型のドナーを同定するために、６人のドナー志願者の血液がスクリーニングされた。その１人のドナーは、他の５人のドナーの血液とのリンパ球混合反応で強い増殖応答を示すはずである。このドナーが同種異型の陽性コントロールドナーとして選択された。残りの５人の血液ドナーは受容体群として選択された。前記の同種異型の陽性コントロールドナーおよび胎盤細胞株群は、マイトマイシンＣで処理され、前記の５人の個々の同種異型受容体群とリンパ球混合反応で培養された。反応は、２つの細胞培養プレートを用い、各プレートに３つの受容体を入れて、３回の多重検査で行われた（表１１−４）。平均の刺激計数は６．５（プレート１）から９（プレート２）の範囲であり、前記の同種異型ドナーの陽性コントロール群は４２．７５（プレート１）から７０（プレート２）までの範囲であった（表１１−５）。

抗原提示細胞マーカー類−胎盤由来細胞群
フローサイトメトリーで分析された胎盤由来細胞群のヒストグラム群は、前記ＩｇＧコントロールと一致する蛍光値によって示されるように、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の陰性の発現を示し、前記胎盤細胞株群がＣＤ４^＋Ｔ細胞群を直接刺激するのに必要な細胞表面分子群を欠くことを示唆している。

免疫調節マーカー類−胎盤由来細胞群
フローサイトメトリーで分析された胎盤由来細胞群のヒストグラム群は、前記ＩｇＧコントロールに比較して増加した蛍光値によって示されるように、ＰＤ−Ｌ２の陽性の発現を示し、前記ＩｇＧコントロールと一致する蛍光値によって示されるように、ＣＤ１７８およびＨＬＡ−Ｇの陰性の発現を示す。

抗原提示細胞マーカー類−臍帯由来細胞群
フローサイトメトリーで分析された臍帯由来細胞群のヒストグラム群は、前記ＩｇＧコントロールと一致する蛍光値によって示されるように、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の陰性の発現を示し、前記臍帯細胞株群がＣＤ４^＋Ｔ細胞群を直接刺激するのに必要な細胞表面分子群を欠くことを示唆している。

免疫調節細胞マーカー類−臍帯由来細胞群フローサイトメトリーで分析された臍帯由来細胞群のヒストグラム群は、前記ＩｇＧコントロールに比較して増加した蛍光値によって示されるように、ＰＤ−Ｌ２の陽性の発現を示し、前記ＩｇＧコントロールと一致する蛍光値によって示されるように、ＣＤ１７８およびＨＬＡ−Ｇの陰性の発現を示す。

要約
胎盤由来細胞株群で行われたリンパ球混合反応では、平均刺激係数は１．３から３までの範囲にあり、前記同種異型陽性コントロール群の平均刺激係数は４６．２５から２７９までの範囲にあった。臍帯由来細胞株群で行われたリンパ球混合反応では、平均刺激係数は６．５から９までの範囲にあり、前記同種異型陽性コントロール群の平均刺激係数は４２．７５から７０までの範囲にあった。胎盤由来細胞株群および臍帯由来細胞株群は、フローサイトメトリーで測定されたように、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の刺激タンパク質類の発現で陰性であった。胎盤由来細胞株群および臍帯由来細胞株群は、フローサイトメトリーで測定されたように、免疫調節性タンパク質類のＨＬＡ−ＧおよびＣＤ１７８の発現で陰性であり、ＰＤ−Ｌ２の発現で陽性であった。同種異型ドナーのＰＢＭＣ群は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２を発現する抗原提示細胞群を含み、それらによって、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞群の刺激を可能にする。胎盤由来細胞株群および臍帯由来細胞株群に、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞群を直接に刺激するために必要な抗原提示の細胞表面分子類がないこと、および免疫調節製タンパク質であるＰＤ−Ｌ２が存在することは、同種異型コントロール群に比較して、ＭＬＲでこれらの細胞群が示した低い刺激係数を説明し得る。

分娩後由来細胞群による栄養因子類の分泌
臍帯由来細胞群および胎盤由来細胞群からの選択栄養因子類の分泌が測定された。検出に選択された因子類には、（１）血管形成活性を有することが知られる因子類、例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎら、（１９９７）Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２１２：２１５〜２６）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏら、（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９６；３４〜４０）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｌｉら、（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３３６９〜７６）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓら、（２００４）Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７７：８１２〜８）、マトリックス・メタロプロテアーゼ１（ＴＩＭＰ１）、アンジオポイエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ストローマ細胞由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１アルファ）、（２）神経栄養活性／神経保護的活性を有することが知られる因子類、例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇら、（２００３）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５８；３１９〜３３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、形質転換成長因子ベータ２（ＴＧＦベータ２）、および（３）ケモカイン活性を有することが知られる因子類、例えば、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ（ＭＩＰ１ｂ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ：調節された活性、正常Ｔ細胞発現および分泌）、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ（ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ：胸腺および活性制御ケモカイン）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ＩＬ−８が含まれる。

方法類および材料類
細胞の培養
胎盤および臍帯からのＰＰＤＣ群、並びにヒト新生児の包皮から由来するヒト繊維芽細胞群は、ゼラチンでコーティングされたＴ７５フラスコ群上で、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む成長培地で培養された。細胞群は継代１１で冷凍保存され、液体窒素中に保管された。前記細胞群を解凍した後、成長培地が前記細胞群に加えられ、１５ミリリットルの遠心管に移され、前記細胞群が１５０Ｇで５分間遠心された。その上澄みが廃棄され、その細胞沈殿物は４ミリリットルの成長培地に再懸濁され、細胞群が計数された。細胞群は、１５ミリリットルの成長培地を含む７５ｃｍ^２フラスコにつき３７５，０００細胞の割合で播種され、２４時間培養された。前記培地は、８時間の間、無血清培地（低グルコースＤＭＥＭ（ギブコ社）、０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（シグマ社）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ社））に取り替えられた。インキュベートの終了時に１４，０００Ｇで５分間遠心することによって、無血清の馴化培地が収集され、−２０℃で保管された。各フラスコにある細胞数を推定するために、細胞群はＰＢＳで洗浄され、２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞群を剥がした。トリプシン活性は、８ミリリットルの成長培地を加えることで阻害された。細胞群は１５０Ｇで５分間、遠心された。その上澄みが除され、細胞群は１ミリリットルの成長培地に再懸濁された。血球計算板を用いて細胞数が推定された。

ＥＬＩＳＡアッセイ
細胞は、５％の二酸化炭素と大気中酸素下で３７℃で増殖させた。胎盤由来細胞群（バッチ番号：１０１５０３）はまた、５％の酸素またはベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）の存在下で増殖された。各細胞標本によって産生されるＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１アルファ、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、およびＴＧＦ−ベータ２の量が、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ&Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）によって測定された。すべてのアッセイ群は、前記製造業者の使用説明書に従って行われた。

サーチライト（ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ）マルチプレックスＥＬＩＳＡアッセイ
ケモカイン類（ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、エオタキシン、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、および血管形成因子類（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦ）は、サーチライト・プロテオームアレイ群（ピアス・バイオテクノロジー社）を用いて測定された。前記プロテオームアレイ群は、ウェル当たり２〜１６のタンパク質類の定量的測定用のマルチプレックスのサンドイッチＥＬＩＳＡである。前記アレイ群は、９６ウェルプレートの各ウェルに２×２、３×３、または４×４のパターンの４〜１６の異なる捕捉用抗体類をスポットすることによって作製される。サンドイッチＥＬＩＳＡ処置の後に、前記プレートの各ウェル内の各スポットで発生される化学発光信号を捕獲するために、全体のプレートの画像を取得する。各スポット内で発生する信号量は、本来の標準または標本内の標的タンパク質の量に比例する。

結果
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＭＣＰ−１およびＩＬ−６は、胎盤由来細胞群、臍帯由来細胞群、および皮膚繊維芽細胞群によって分泌されていた（表１２−１）。ＳＤＦ−１アルファは、５％Ｏ_２で培養された胎盤由来細胞群、および繊維芽細胞群によって分泌された。ＧＣＰ−２およびＩＬ−８は、臍帯由来細胞群によって、および、ＢＭＥまたは５％のＯ_２の存在下で培養された胎盤由来細胞群によって、分泌されていた。ＧＣＰ−２はまた、ヒト繊維芽細胞群によって分泌されていた。ＴＧＦ−ベータ２はＥＬＩＳＡアッセイによって検出されなかった。

サーチライト（ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ）マルチプレックスＥＬＩＳＡアッセイ
ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、およびＩＬ−８が、臍帯由来細胞群から分泌されていた（表１２−２および１２−３）。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ａ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＡＲＣ、エオタキシン、およびＩＬ−８が、胎盤由来細胞群から分泌されていた（表１２−２および１２−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、またはＰＤＧＦ−ｂｂは検出されなかった。

要約
臍帯由来細胞群および胎盤由来細胞群はいくつかの栄養因子類を分泌していた。これらの栄養因子類のいくつか、例えば、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−８、は血管形成で重要な複数の役割を果たしている。他の栄養因子類、例えば、ＢＤＮＦおよびＩＬ−６、は神経再生で重要な複数の役割を果たしている。

短期間における分娩後由来細胞群の神経分化
胎盤由来細胞群および臍帯由来細胞群（集合的に、分娩後由来細胞群またはＰＰＤＣ群）が神経系統細胞群に分化する能力について、検査された。

方法類および材料類
分娩後細胞群の単離および増殖
胎盤組織群および臍帯組織群からのＰＰＤＣ群は、実施例１に記載されたように、単離され、増殖された。

改変Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコール
（Ａ）このアッセイは、骨髄間質細胞群の神経系誘導の能力を検査するために本来行われたアッセイから適応された。臍帯由来細胞群（０２２８０３）Ｐ４および胎盤由来細胞群（０４２２０３）Ｐ３が解凍され、５，０００細胞／ｃｍ^２で成長培地で、サブコンフルエント（７５％）に達するまで増殖された。細胞群はトリプシン処理され、ＴｉｔｒｅｔｅｋＩＩスライドグラス（ＶＷＲインターナショナル、コネチカット州ブリストル）の各ウェルごとに６，０００細胞群で播種された。コントロール群として、間葉系幹細胞（Ｐ３、１Ｆ２１５５、ケンブレックス社、メリーランド州ウオーカーズビル）、骨芽細胞（Ｐ５、ＣＣ２５３８、ケンブレックス社）、脂肪由来細胞（アーテセル（Ａｒｔｅｃｅｌ）社、ＵＳ６５５５３７４ Ｂ１）（Ｐ６、ドナー２）およびヒト新生児皮膚繊維芽細胞（Ｐ６、ＣＣ２５０９、ケンブレックス社）もまた、同一の条件下で播種された。

すべての細胞はまず、１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ハイクローン社、ユタ州ローガン）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットル、ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ロックヒル）、上皮成長因子（ＥＧＦ、２０ナノグラム／ミリリットル、ペプロテック）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２の培地（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）内で４日間増殖された。４日後、細胞群はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、インビトロジェン）でリンスされ、次にＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシンで２４時間培養された。２４時間後、細胞群はＰＢＳでリンスされた。その後、細胞群は誘導培地で１〜６時間培養されたが、そのような誘導培地は、２００ｍＭのヒドロキシアニソール、１０μＭの塩化カリウム、５ミリグラム／ミリリットルのインスリン、１０μＭのホルスコリン、４μＭのバルプロ酸、および２μＭのヒドロコーチゾンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（無血清）から成る（すべての化学試薬はシグマ社、ミズーリ州セントルイス、から取得）。その後、細胞群は、氷冷された１００％メタノールで固定され、ヒトのネスチンタンパク質の発現を査定するために、免疫細胞化学が行われた（方法については以下を参照）。

（Ｂ）ＰＰＤＣ群（臍帯（０２２８０３）Ｐ１１、胎盤（０４２２０３）Ｐ１１）およびヒト成人皮膚繊維芽細胞群（１Ｆ１８５３、Ｐ１１）が解凍され、５，０００細胞／ｃｍ^２で成長培地で、サブコンフルエント（７５％）に達するまで増殖された。細胞群はその後、トリプシン処理され、（Ａ）と同様の密度で播種されたが、これは、（１）２４ウェル組織培養用表面処理されたプレート群（ＴＣＰ，ファルコンブランド、ＶＷＲインターナショナル）、（２）ＴＣＰウェル群＋室温で１時間、２％（ｗ／ｖ）のゼラチンで吸着処理、または（３）ＴＣＰウェル群＋２０μｇ／ミリリットルのマウスラミニンで吸着処理（３７℃で最低２時間吸着、インビトロジェン社）に播種された。
（Ａ）と全く同様に、細胞群はまず、前述のタイムフレームで、増殖され、培地が交換された。１組の培養群が、５日目に以前と同様に固定され、また６時間目に、氷冷された４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（シグマ社）で、室温で１０分間固定された。２番目の組の培養群では、培地が除かれ、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、インビトロジェン社）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン社）を含むニューロベーサル−Ａ培地（インビトロジェン）から成る神経前駆細胞増殖培地（ＮＰＥ）に切り替えられた。ＮＰＥ培地にはさらに、レチン酸（ＲＡ、１μＭ、シグマ社）が加えられた。この培地は４日後に除かれ、培養群は、氷冷された４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（シグマ社）で室温で１０分間固定され、ネスチン、ＧＦＡＰ、およびＴｕＪ１タンパク質の発現に関して染色された（表Ｎ１−１を参照）。

２段階の分化プロトコール
ＰＰＤＣ群（臍帯（０４２２０３）Ｐ１１、胎盤（０２２８０３）Ｐ１１）およびヒト成人皮膚繊維芽細胞群（Ｐ１１、１Ｆ１８５３、ケンブレックス）が解凍され、５，０００細胞／ｃｍ^２で成長培地で、サブコンフルエント（７５％）に達するまで増殖された。その後、細胞群はトリプシン処理され、ｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、ペプロテック社、ニュージャージー州ロックヒル）およびＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、ペプロテック社）を添加したＮＰＥ培地の存在下［この全培地成分は、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅと呼ぶ］で、２，０００細胞群／ｃｍ^２で、ラミニン（ＢＤバイオサイエンスズ社、ニュージャージー州フランクリンレーク）でコーティングされた２４ウェルプレート群に播種された。同時に、海馬から単離されたラット成体神経前駆細胞群（Ｐ４、（０６２６０３））もまた、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ培地内で、ラミニンでコーティングされた２４ウェルプレート上にプレーティングされた。すべての培養群は、６日間、そのような条件下で維持され（細胞群は、その期間中１回栄養補給された。）、その時点で、培地は、表Ｎ１−２にリストされた分化条件下に切り替えられ、さらに７日間維持された。培養群は、氷冷された４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（シグマ社）で室温で１０分間固定され、ヒトまたはラットのネスチン、ＧＦＡＰ、およびＴｕＪ１タンパク質の発現に関して染色された。

複数成長因子プロトコール
臍帯由来細胞群（Ｐ１１、（０４２２０３））が解凍され、５，０００細胞／ｃｍ^２で成長培地で、サブコンフルエント（７５％）まで増殖された。その後、細胞群はトリプシン処理され、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）の存在下で、２，０００細胞群／ｃｍ^２で、ラミニンでコーティングされた２４ウェルプレート群に播種された。さらに、いくつかのウェル群はＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ＋２％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳを含んでいた。４日間の「分化前」条件の後、すべての培地が除かれ、標本群は、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ、２００ナノグラム／ミリリットル、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）、ＦＧＦ８（１００ナノグラム／ミリリットル、ペプロテック社）、ＢＤＮＦ（４０ナノグラム／ミリリットル、シグマ社）、ＧＤＮＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、シグマ社）、およびレチン酸（１μＭ、シグマ社）が添加されたＮＰＥ培地に切り替えられた。培地の交換後７日後に、培養群は、氷冷された４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（シグマ社）で室温で１０分間固定され、ヒトのネスチン、ＧＦＡＰ、ＴｕＪ１、デスミン、およびアルファ平滑筋アクチンの発現に関して染色された。

神経前駆細胞の共培養プロトコール
成体ラット海馬前駆細胞群（０６２６０３）は、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）の存在下で、ラミニンでコーティングされた２４ウェルのシャーレ群（ＢＤバイオサイエンスズ社）に、ニューロスフェアとして、または単一の細胞群（１０，０００細胞群／ウェル）としてプレーティングされた。

別に、臍帯由来細胞群（０４２２０３）Ｐ１１および胎盤由来細胞群（０２２８０３）Ｐ１１が解凍され、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）に、５，０００細胞／ｃｍ^２で、４８時間の期間中、増殖された。その後、細胞群はトリプシン処理され、神経前駆細胞群の存在する培養群の上に２，５００細胞群／ウェルで播種された。その時に、存在する培地は新鮮な培地に交換された。４日後に、培養群は、氷冷された４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（シグマ社）で室温で１０分間固定され、ヒトの核タンパク（ｈＮｕｃ、ケミコン社）（上記の表ＮＵ１−１）で染色して、ＰＰＤＣ群を同定した。

免疫細胞化学
免疫細胞化学は、表ＮＵ１−１にリストされた前記抗体類を使用して行われた。培養群はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）のヤギ血清（ケミコン社、カリフォルニア州テメキュラ）、および０．３％（ｖ／ｖ）のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、シグマ社）を含むタンパク質ブロッキング溶液に３０分に曝し、細胞内抗原類にアクセスできるようにした。ブロッキング溶液に希釈された１次抗体類は、室温で１時間、前記培養に適用された。次に、１次抗体溶液が取り除かれ、培養群をＰＢＳで洗浄してから、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０、モレキュラー・プローブス社、オレゴン州ユージーン）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０、モレキュラー・プローブス社）と共にブロッキング剤を含む２次抗体溶液が適用された（室温、１時間）。培養群は洗浄され、細胞核を視覚化するために、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（モレキュラー・プローブス社）が１０分間適用された。

免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡（オリンパス、ニューヨーク市メルビル）上で適切な蛍光フィルタを使用して、蛍光を視覚化した。すべての場合で、コントロール染色より高い蛍光信号によって表される、陽性の染色は、１次抗体溶液の適用を除いては、上記に概略した全手順に従った。代表的な画像群が、ディジタルカラービデオカメラおよびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（メディアサイバネティクス社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて保存された。三色染色の標本群では、１回に１つの励起フィルタのみを使用して各画像が取られた。その後、アドビ・フォトショップのソフトウェア（アドビ社、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて、重ねたモンタージュが作製された。

結果
Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコール
（Ａ）この神経誘導性成分内でインキュベートすると、すべての細胞タイプ群は、伸長した突起群を伴う双極性の形態類を有する細胞群に変形した。他の大きな非双極性の形態類もまた、観察された。さらに、これらの誘導された細胞集団群は、複能性神経幹細胞群および神経前駆細胞群のマーカーであるネスチンに陽性に染色された。

（Ｂ）組織培養用プラスチック製（ＴＣＰ）ディシュ群上で繰返し行われたとき、ラミニンが前記培養表面に前もって吸着されていない場合は、ネスチンの発現は観察されなかった。ネスチンを発現する細胞群が、その後、成熟したニューロン群を発生させ得るかどうかを更に評価するために、ＰＰＤＣ群および繊維芽細胞群がＮＰＥ＋ＲＡ（１μＭ）に曝された。ＲＡは、神経幹細胞群および前駆細胞群の、そのような細胞群への分化を誘導させることが知られる培地成分である（２、３、４）。細胞群は、未成熟ニューロン群および成熟ニューロン群のマーカーであるＴｕＪ１、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ、およびネスチンで染色された。いかなる条件下でもＴｕＪ１は検出されず、神経性細胞の形態を有する細胞群も観察されなかった。これは、ニューロン群が前記短期間で発生されなかったことを示唆する。さらに、免疫細胞化学で決定されたところによると、ネスチンおよびＧＦＡＰは、もはやＰＰＤＣ群によって発現されていなかった。

２段階の分化
臍帯および胎盤のＰＰＤＣ単離群（並びに、陰性および陽性のコントロール細胞タイプ群として、それぞれヒト繊維芽細胞群およびげっ歯類の神経前駆細胞群）が、ラミニン（神経促進）コーティングされたディシュ群にプレーティングされ、神経前駆細胞群がニューロン群およびアストロサイト群に分化するのを促進することが知られている１３の異なる成長条件群（および２つのコントロール条件群）に曝された。さらに、ＧＤＦ５およびＢＭＰ７のＰＰＤＣの分化への影響を検査するために、２つの条件が加えられた。一般的に、２段階の分化アプローチが取られ、前記細胞群はまず、６日間、神経前駆細胞群増殖条件に置かれ、その後、７日間、完全な分化条件に置かれた。形態的には、臍帯由来細胞群および胎盤由来細胞群は、この過程の期間を通じて、細胞形態で根本的な変化群を示した。しかし、神経性細胞またはアストロサイトの形態の細胞群は、神経前駆細胞群のプレーティングされた条件のコントロールを除いては観察されなかった。ヒトのネスチン、ＴｕＪ１、およびＧＦＡＰに対して陰性であった免疫細胞化学は、前記形態学的観察を確認した。

複数の成長因子類
種々の神経分化薬剤類に１週間曝された後、細胞群は神経前駆細胞群（ヒトのネスチン）、ニューロン群（ＴｕＪ１）、およびアストロサイト群（ＧＦＡＰ）を示すマーカー類で染色された。最初の段階で無血清培地で成長された細胞群は、血清を含む（２％または１０％）培地の細胞群より異なる形態を有していたが、これは潜在的な神経分化を示す。特に、臍帯由来細胞群をＥＧＦおよびｂＦＧＦに曝し、その後、ＳＨＨ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびレチン酸に曝す２段階処置の後に、細胞群は、培養されたアストロサイト群の形態に似た、長く伸長した突起群を示した。２％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳが分化の第１段階に含まれたときには、細胞数が増し、細胞形態は、高密度のコントロール培養群と変わらなかった。潜在的な神経分化は、ヒトのネスチン、ＴｕＪ１、またはＧＦＡＰに対する免疫細胞化学分析によって明らかにならなかった。

神経前駆細胞およびＰＰＤＣの共培養
ＰＰＤＣ群が、神経増殖条件（ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ）に２日前に播種されたラットの神経前駆細胞群の培養群の上にプレーティングされた。プレーティングされたＰＰＤＣ群の肉眼の確認は、これらの細胞群が単一の細胞群としてプレーティングされたことを立証したが、プレーティング後４日目（合計６日目）に行ったヒトに特異的な核染色（ｈＮｕｃ）は、ＰＰＤＣ群が丸くなりがちで、前記神経前駆細胞群と接触を避ける傾向があった。さらに、ＰＰＤＣ群が接着している場合は、これらの細胞群は伸展し、ラット源泉である分化したニューロン群によって神経支配されているようであり、これは、前記ＰＰＤＣ群が筋細胞群に分化した可能性があることを示唆する。この観察は、位相差顕微鏡下の形態に基づいていた。別の観察では、大きな細胞体群（神経前駆細胞群より大きい）は通常、神経前駆細胞群に似た形態を有しており、複数の方向に細い突起群が出ていた。ＨＮｕｃ染色（前記細胞の核の半分に見られた）は、いくつかの場合には、これらのヒト細胞群はラット前駆細胞群と融合し、前記ラット前駆細胞群の表現型を示していた可能性があったことを示唆していた。神経前駆細胞群のみを含むコントロールウェル群では、臍帯ＰＰＤＣ群または胎盤ＰＰＤＣ群を含む共培養のウェル群に比べて、前駆細胞群および明らかに分化した細胞群の合計が少なかったが、これは、臍帯由来細胞群および胎盤由来細胞群が、ケモカイン類およびサイトカイン類の放出によって、または接触を仲介とする効果類によって、のいずれかで、神経前駆細胞群の分化および振る舞いに影響を与えたことを示す。

要約
ＰＰＤＣ群が神経系統細胞群に分化する短期間の能力を決定するために、複数のプロトコール群が行われた。これらには、複能性神経幹細胞群および前駆細胞群、未成熟ニューロン群および成熟ニューロン群、およびアストロサイト群のそれぞれに関連するタンパク質である、ネスチン、ＴｕＪ１、およびＧＦＡＰに対する免疫細胞化学と組み合わせた、形態の位相差画像法が含まれた。これらの短期間プロトコール群のいくつかの場合に、神経分化が起こったことを示唆する証拠が観察された。

神経前駆細胞群とのＰＰＤＣ群の共培養群で、いくつかの顕著な観察結果が得られた。ヒトＰＰＤＣ群を異種細胞タイプと共に使用する、このアプローチは、これらの培養群で各細胞の源泉の絶対的な決定を可能にした。まず、いくつかの細胞群がこれらの培養群で観察されたが、それらの細胞質は増大し、神経突起様突起群が前記細胞体から伸展し、しかし前記細胞体の半分のみがｈＮｕｃタンパク質で標識されていた。それらの細胞群は、神経系統細胞群に分化したヒトＰＰＤＣ群であった可能性があり、または前記細胞群は、神経前駆細胞群と融合したＰＰＤＣ群であった可能性もある。第２に、神経前駆細胞群は、或る程度、ＰＰＤＣ群に突起群を伸長していたようであり、これは、前記神経前駆細胞群がニューロン群に分化し、前記ＰＰＤＣ群を神経支配したことを示す。第３に、神経前駆細胞群およびＰＰＤＣ群の培養群は、ラット源泉の細胞群がより多くあり、神経前駆細胞群のみのコントロール培養群より分化の量が大きかった。さらにこれは、プレーティングされたＰＰＤＣ群が、溶性因子類を提供するか、または接触依存性の機構類を提供し、これらが神経前駆細胞群の生存性、増殖、および／または分化を刺激したことを示す。

実施例１３の参考文献
（１）Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．ら、（２０００）．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ．６１（４）：３６４〜７０．
（２）Ｊａｎｇ，Ｙ．Ｋ．ら、（２００４）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７５（４）：５７３〜８４．
（３）Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ，Ｅ．Ｍ．ら、（１９８３）．Ｍｏｌ Ｃｅｌ Ｂｉｏｌ．３（１２）：２２７１〜９．
（４）Ｍａｙｅｒ−Ｐｒｏｓｃｈｅｌ，Ｍ．ら、（１９９７）．Ｎｅｕｒｏｎ．１９（４）：７７３〜８５

長期間における分娩後由来細胞群の神経分化
胎盤由来細胞群および臍帯由来細胞群（集合的に、分娩後由来細胞群またはＰＰＤＣ群）が長期的に神経系統細胞群に分化する能力について、評価された。

方法類および材料類
ＰＰＤＣ群の単離および増殖
ＰＰＤＣ群は、以前の実施例群に記載されたように、単離され、増殖された。

ＰＰＤＣ細胞の解凍およびプレーティング
前もって成長培地で成長されていたＰＰＤＣ群（臍帯（０２２８０３）Ｐ１１、（０４２２０３）Ｐ１１、（０７１００３）Ｐ１２、胎盤（１０１５０３）Ｐ７）の冷凍アリコート群が解凍され、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、インビトロジェン社）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（１０ミリリットル）を含むニューロベーサル−Ａ（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ）（この組み合わせは、本明細書で、神経前駆細胞増殖（Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ：ＮＰＥ）培地と呼ぶ）培地中で、ラミニン（ＢＤ、ニュージャージー州フランクリンレーク）でコーティングされたＴ７５フラスコ群に５，０００細胞／ｃｍ^２でプレーティングされた。ＮＰＥ培地はさらにｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、ペプロテック、ニュージャージー州ロッキーヒル）およびＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、ペプロテック、ニュージャージー州ロッキーヒル）が添加された（本明細書で「ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ」と呼ばれる）。

コントロール細胞のプレーティング
さらに、ヒト成人皮膚繊維芽細胞（Ｐ１１、ケンブレックス社、メリーランド州ウオーカーズビル）および間葉系幹細胞（Ｐ５、ケンブレックス社）が解凍され、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ内で、ラミニンでコーティングされたＴ７５フラスコ群に同一の細胞播種密度でプレーティングされた。更なるコントロールとして、繊維芽細胞群、臍帯ＰＰＤＣ群、および胎盤ＰＰＤＣ群が、成長培地で、すべての培養で指定された期間、成長された。

細胞の増殖
すべての培養群からの培地は、１週間に１回新鮮な培地と取り替えられ、細胞群の増殖が観察された。一般的には、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ内での成長が限られているため、各培養は１ヶ月の期間に１回継代された。

免疫細胞化学
１ヶ月の期間後、すべてのフラスコ群は、４％（ｗ／ｖ）の冷やしたパラホルムアルデヒド（シグマ）で、室温で１０分間固定された。免疫細胞化学は、ＴｕＪ１（ＢＩＩＩチューブリン、１：５００、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）およびＧＦＡＰ（グリア細胞繊維性酸性タンパク、１：２０００、ダコサイトメーション社、カリフォルニア州カーピンテリア）に対する抗体類を用いて行われた。簡潔に述べると、培養群はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）のヤギ血清（ケミコン社、カリフォルニア州テメキュラ）、および０．３％（ｖ／ｖ）のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、シグマ社）を含むタンパク質ブロッキング溶液に３０分に曝し、細胞内抗原類にアクセスできるようにした。ブロッキング溶液に希釈された１次抗体類は、室温で１時間、前記培養に適用された。次に、１次抗体溶液が取り除かれ、培養群をＰＢＳで洗浄してから、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０、モレキュラー・プローブス社、オレゴン州ユージーン）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０、モレキュラー・プローブス社）と共にブロッキング剤を含む２次抗体溶液が適用された（室温、１時間）。培養群は洗浄され、細胞核を視覚化するために、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（モレキュラー・プローブス社）が１０分間適用された。

免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡（オリンパス、ニューヨーク市メルビル）上で適切な蛍光フィルタを使用して、蛍光を視覚化した。すべての場合で、コントロール染色より高い蛍光信号によって表される、陽性の染色は、１次抗体溶液の適用を除いては、上記に概略した全手順に従った。代表的な画像群が、ディジタルカラービデオカメラおよびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（メディアサイバネティクス社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて保存された。三色染色の標本群では、１回に１つの励起フィルタのみを使用して各画像が取られた。その後、アドビ・フォトショップのソフトウェア（アドビ社、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて、重ねたモンタージュが作製された。

結果
ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地はＰＰＤＣ群の増殖を遅くし、それらの形態を変える
プレーティング後すぐに、サブセットのＰＰＤＣ群が、ラミニンでコーティングされた培養フラスコ群に接着した。この理由は、冷凍／解凍の過程の結果としての、または新規の成長培地のための、細胞死であった。接着した細胞群は、成長培地で観察された形態とは異なる形態を取っていた。

コンフルエント時に、培養群は継代され、成長が観察された。継代を生存したこれらの細胞群では増殖がほとんど起こらなかった。この時点では、伸展した形態をもたず、位相差で明るい特徴を有する、非常に少数の細胞群が、臍帯由来細胞群の培養群で現れ始めた。前記フラスコ群のこれらの範囲は、長期にわたって観察された。これらの少数の細胞群から、その長軸に沿って軸索瘤群を伴う分岐過程が始まった。この特徴は、前述のＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋神経前駆細胞群、およびＴｕＪ１＋脳および脊髄から由来する未成熟なニューロン群に非常に類似している。時間と共に、これらの細胞群がより多数になるが、クローン群にのみ見つけられた。

臍帯由来細胞群のクローン群は神経タンパク質類を発現する
培養群は、解凍／プレーティングの後、１ヶ月で固定され、前記神経タンパク質であるＴｕＪ１およびＧＦＡＰ（アストロサイト群に見つけられる中間フィラメント）に対して染色された。成長培地で成長されたすべてのコントロール培養群、および、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦで成長されたヒト繊維芽細胞群およびＭＳＣ群は、ＴｕＪ１−／ＧＦＡＰ−であることが発見されたが、ＴｕＪ１は臍帯および胎盤のＰＰＤＣ群で検出された。発現は、神経細胞様の形態類を有する細胞群、および、そのような形態類を有しない細胞群で観察された。ＧＦＡＰの発現は、どちらの培養でも観察されなかった。ＴｕＪ１を発現し、神経細胞様の形態類を有する細胞群の割合は、全集団の１％以下であった（ｎ＝３の検査された臍帯由来細胞単離群）。定量化はされなかったが、神経細胞の形態類を有しない、ＴｕＪ１＋の細胞群の割合は、胎盤由来細胞培養群より臍帯由来細胞培養群で高かった。成長培地内で年齢の一致するコントロール群はＴｕＪ１を発現しなかったため、これらの結果群は特異的であるらしい。

要約
臍帯由来細胞群から分化したニューロン群（ＴｕＪ１の発現およびニューロンの形態に基づく）を発生する方法類が開発された。１ヶ月以前では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｕＪ１の発現は検査されなかったが、少なくとも少数集団の臍帯由来細胞群が、分化せずに、または、Ｌ−グルタミンと塩基性ＦＧＦとＥＧＦを添加した最小培地に１ヶ月曝された後の長期間誘導に沿って、ニューロン群を生じ得ることは明らかである。

実施例１４の参考文献
（１）Ｍａｙｅｒ−Ｐｒｏｓｃｈｅｌ，Ｍ．ら、（１９９７）．Ｎｅｕｒｏｎ．１９（４）：７７３〜８５
（２）Ｙａｎｇ，Ｈ．ら、（２０００）．ＰＮＡＳ．９７（２４）：１３３６６〜７１

神経前駆細胞の支持のためのＰＰＤＣ栄養因子類
非接触依存性（栄養性）のメカニズム群を介して、臍帯由来細胞群および胎盤由来細胞群（集合的に、分娩後由来細胞群またはＰＰＤＣ群）が、成体の神経幹細胞および神経前駆細胞の生存性および分化におよぼす影響を検査した。

方法類および材料類
成体の神経幹細胞および神経前駆細胞の単離
Ｆｉｓｈｅｒ ３４４成体ネズミ群は、ＣＯ^２で窒息させて、その後、頚椎脱臼させて犠牲にされた。骨鉗子群を用いて脳群全体が無傷で除かれ、海馬組織が、脳の運動領域および体性感覚領域の後方の冠状切開群（ｃｏｒｏｎａｌ ｉｎｃｉｓｉｏｎｓ）に基づいて解離された（Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．& Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．１９９７．Ｔｈｅ Ｒａｔ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）。組織は、Ｂ２７（Ｂ２７添加物、インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）とＬ−グルタミン（４ｍＭ、インビトロジェン）とペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン）とを含むニューロベーサル−Ａ培地（インビトロジェン）（この組み合わせは、当明細書で神経前駆細胞増殖（Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ：ＮＰＥ）培地と呼ばれる）中で洗浄された。ＮＰＥ培地はさらにｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、ペプロテック、ニュージャージー州ロッキーヒル）およびＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、ペプロテック、ニュージャージー州ロッキーヒル）が添加された（本明細書で「ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ」と呼ばれる）。

洗浄後、覆っている髄膜類が除かれ、前記組織が外科用メスで刻まれた。刻まれた組織が収集され、トリプシン／ＥＤＴＡ（インビトロジェン）が全容量の７５％加えられた。デオキシリボヌクレアーゼ（８ミリリットルの全容量につき１００マイクロリットル、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）も加えられた。次に、前記組織／培地が、順に、１８ゲージの注射針、２０ゲージの注射針、最後に２５ゲージの注射針にそれぞれ一回づつ通された（すべての注射針群は、ベクトン・ディッキンソン、ニュージャージー州フランクリンレークスから取得された）。前記混合液は、２５０Ｇで３分間遠心され、その上澄みが除かれ、新鮮なＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦが加えられ、前記沈殿物が再懸濁された。その結果得られる細胞懸濁液は、４０マイクロメーターのセルストレーナー（ベクトン・ディッキンソン）に通され、ラミニンでコーティングされたＴ７５フラスコ群（ベクトン・ディッキンソン）、または低クラスター２４ウェルプレート群（ベクトン・ディッキンソン）にプレーティングされ、概要された検査群のために十分な細胞数が得られるまでＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地で成長された。

ＰＰＤＣプレーティング
成長培地で前もって成長された分娩後由来細胞群（臍帯（０２２８０３）Ｐ１２、（０４２１０３）Ｐ１２、（０７１００３）Ｐ１２、胎盤（０４２２０３）Ｐ１２）は、５，０００細胞／トランスウェルインサート（２４ウェルプレート用の大きさ）でプレーティングされ、インサート群内で、成長培地で一週間の期間成長され、コンフルエントを達成した。

成体の神経前駆細胞のプレーティング
ニューロスフェアとして、または単一の細胞群として成長された神経前駆細胞群が、約２，０００細胞／ウェルの密度で、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ内で、ラミニンでコーティングされた２４ウェルプレート群上に、１日の期間、播種され、細胞の接着を促進させた。１日後、分娩後細胞群を含むトランスウェルインサート群は、以下のスキームで加えられた。

（１）トランスウェル（成長培地内の臍帯由来細胞群、２００マイクロリットル）＋神経前駆細胞群（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（２）トランスウェル（成長培地内の胎盤由来細胞群、２００マイクロリットル）＋神経前駆細胞群（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（３）トランスウェル（成長培地内の成人ヒト皮膚繊維芽細胞群［１Ｆ１８５３、ケンブレックス、メリーランド州ウオーカーズビル］Ｐ１２、２００マイクロリットル）＋神経前駆細胞群（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（４）コントロール：神経前駆細胞群のみ（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
（５）コントロール：神経前駆細胞群のみ（ＮＰＥのみ、１ミリリットル）

免疫細胞化学
共培養で７日後、すべて条件群は、４％（ｗ／ｖ）の冷やしたパラホルムアルデヒド（シグマ）で、室温で１０分間固定された。免疫細胞化学は、表１５−１にリストされた前記エピトープ類に対する抗体類を使用して行われた。簡潔に述べると、培養群はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＰＢＳと４％（ｖ／ｖ）のヤギ血清（ケミコン社、カリフォルニア州テメキュラ）と０．３％（ｖ／ｖ）のトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、シグマ社）を含むタンパク質ブロッキング溶液に３０分間曝し、細胞内抗原類にアクセスできるようにした。ブロッキング溶液に希釈された１次抗体類は、室温で１時間、前記培養に適用された。次に、１次抗体溶液が取り除かれ、培養群をＰＢＳで洗浄してから、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０、モレキュラー・プローブス社、オレゴン州ユージーン）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０、モレキュラー・プローブス社）と共にブロッキング剤を含む２次抗体溶液が適用された（室温、１時間）。培養群は洗浄され、細胞核を視覚化するために、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（モレキュラー・プローブス社）が１０分間適用された。

免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡（オリンパス、ニューヨーク州メルビル）上で適切な蛍光フィルタを使用して、蛍光を視覚化した。すべての場合で、コントロール染色より高い蛍光信号によって表される、陽性の染色は、１次抗体溶液の適用を除いては、上記に概略した全手順に従った。代表的な画像群が、ディジタルカラービデオカメラおよびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（メディアサイバネティクス社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて保存された。三色染色の標本群では、１回に１つの励起フィルタのみを使用して各画像が取られた。その後、アドビ・フォトショップのソフトウェア（アドビ社、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて、重ねたモンタージュが作製された。

神経前駆細胞の分化の定量的分析
海馬の神経前駆細胞の分化の定量的分析が検査された。各条件につき、最小１０００の細胞が計数され、それより少ない場合は、その条件で観察された全細胞数が計数された。与えられた染色に対し陽性の細胞群の割合は、陽性の細胞数を、ＤＡＰＩ（核）染色で決定された全細胞数で割って評価された。

質量分析および２次元ゲル電気泳動
共培養の結果としてのユニークな分泌因子類を同定するために、培養固定の前に取られた馴化培地の検体群が−８０℃で一晩冷凍された。その後、検体群は限外濾過回転装置群（分子量カットオフ：３０ｋＤ）に適用された。保持液は、免疫親和性クロマトグラフィー（抗ヒトアルブミン、ＩｇＹ）にかけられた（免疫親和性が前記検体群からアルブミンを除去しなかった）。濾過物はＭＡＬＤＬによって分析された。前記通過物は、シバクロンブルー（Ｃｉｂａｃｈｒｏｎ Ｂｌｕｅ）親和性クロマトグラフィーにかけられた。検体群はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２次元電気泳動によって分析された。

結果
ＰＰＤＣ共培養は成体神経前駆細胞の分化を刺激する
臍帯由来細胞群または胎盤由来細胞群との培養後、成体ラット海馬から由来し、共培養された神経前駆細胞群は、中枢神経系の３種類のすべての主要系統群に沿っての有意な分化を示した。この効果は、共培養で５日後にはっきりと観察され、多くの細胞群は複雑な突起群を出し。分裂する前駆細胞群の特徴である、位相差で明るい特徴（ｐｈａｓｅ ｂｒｉｇｈｔ ｆｅａｔｕｒｅｓ）を失っていた。逆に、ｂＦＧＦおよびＥＧＦの非存在下でそれだけで成長された神経前駆細胞群は健康的でないように見え、生存性も限定されていた。

前記処置の終了後に、培養群は、未分化幹細胞群および前駆細胞群を示すマーカー（ネスチン）と、未成熟ニューロン群および成熟ニューロン群を示すマーカー（ＴｕＪ１）と、アストロサイトを示すマーカー（ＧＦＡＰ）と、成熟したオリゴデンドロサイトとを示すマーカー（ＭＢＰ）で染色された。３種類のすべて系統に沿っての分化が確認されたが、コントロール条件群は、大多数の細胞群でのネスチン陽性の保持によって明らかなように、有意な分化を示さなかった。臍帯由来細胞群および胎盤由来細胞群の両方が細胞分化を誘導したが、３種類の系統のすべてで、臍帯由来細胞との共培養よりも胎盤由来細胞との共培養で、分化の程度が低かった。

臍帯由来細胞群との共培養後の分化した神経前駆細胞群の割合が定量化された（表１５−２）。臍帯由来細胞群は、成熟したオリゴデンドロサイト（ＭＢＰ）の数を有意に向上した（２４％対０％（両方のコントロール条件群））。さらに、共培養は、ＧＦＡＰ＋のアストロサイトおよびＴｕＪ１＋のニューロンの培養内での数を増加させた（それぞれ、４７．２％および８．７％）。これらの結果群はネスチンの染色によって確認され、前駆細胞の状態が共培養後に失われたことを示唆した（１３．４％対７１．４％（コントロール条件４））。

分化はまた、ヒト成人繊維芽細胞群によって影響を受けるように見えたが、そのような細胞群は、成熟したオリゴデンドロサイト群の分化を促進することができず、また大量な量のニューロン群を発生することもできなかった。定量化されなかったが、繊維芽細胞群は神経前駆細胞群の生存性を向上するようであった。

ユニークな化合物類の同定
臍帯由来との共培養および胎盤由来との共培養からの馴化培地が、好適なコントロール群（ＮＰＥ培地±１．７％血清、繊維芽細胞群との共培養からの培地）と共に、それらの差異について検査された。潜在的にユニークな化合物類が同定され、それらの個々の２Ｄゲル群から切り取られた。

要約
成人神経前駆細胞群と、臍帯ＰＰＤＣ群または胎盤ＰＰＤＣ群との共培養によって、これらの細胞群の分化が起こった。この実施例で示された結果群は、臍帯由来細胞群との共培養後の成人神経前駆細胞群の分化が特に著しい。特に、有意な割合の成熟オリゴデンドロサイト群が、臍帯由来細胞群との共培養内で発生された。前記臍帯由来細胞群および前記神経前駆細胞群の間で接触がなかったことから考えると、この結果は、前記臍帯由来細胞群からの溶性因子類の機能であるらしい（栄養作用）。

いくつかの他の観察結果が見られた。第１に、ＥＧＦおよびｂＦＧＦが除かれた場合のコントロールでは非常に少数の細胞群しかなかった。ほとんどの細胞群が死亡し、平均で各ウェルに約１００以下の細胞群であった。第２に、ＥＧＦおよびｂＦＧＦが初めから終わりまで培地内に保持された前記コントロール条件は、通常、増殖培地であるため、ほとんど分化がないであろうと予想されている。約７０％の前記細胞群はその前駆細胞の状態（ネスチン＋）を保っていることが観察されたが、約３０％はＧＦＡＰ＋（アストロサイトの徴候）であった。これは、前記処置中にそのような大幅な増殖が起こったため、前駆細胞群の間の接触がこの分化を誘導したためであり得る（Ｓｏｎｇ，Ｈ．ら、２００２．Ｎａｔｕｒｅ ４１７：２９〜３２）。

分娩後由来細胞群の移植
前記分娩後臍帯および前記分娩後胎盤から由来する細胞群は、再生治療類に有用である。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに、生体分解性の物質と共に移植された分娩後由来細胞群（ＰＰＤＣ群）が産生した組織が評価された。評価された前記物質類は、不織布バイクリルと３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体とＲＡＤ１６自己集合ペプチドヒドロゲルであった。

方法類および材料類
細胞の培養
胎盤由来細胞群および臍帯由来細胞群は、成長培地（低グルコースＤＭＥＭ（ギブコ、カリフォルニア州カールズバッド）、１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（カタログ番号ＳＨ３００７０．０３、ハイクローン社、ユタ州ローガン）、０．００１％（ｖ／ｖ）のベータメルカプトエタノール（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ社））中で、ゼラチンでコーティングされたフラスコで成長された。

検体の調製
１００万の生細胞群は、直径５ｍｍで２．２５ｍｍの厚さの不織布バイクリル・足場（６４．３３ミリグラム／ｃｃ、ロット番号：３５４７−４７−１）または直径５ｍｍの３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体（ロット番号：３４５１−５３）上に、１５マイクロリットルの成長培地内に播種された。細胞群は接着するまで２時間置かれ、前記足場を覆うために成長培地がさらに加えられた。細胞群は足場上で一晩、成長された。細胞のない足場もまた培地にインキュベートされた。

ＲＡＤ１６自己集合ペプチド類（３Ｄマトリックス、マサチューセッツケンブリッジ、物質移動合意書に従って）は、滅菌された１％（ｗ／ｖ）の水溶液として取得され、これは、使用直前に、１０％（ｗ／ｖ）蔗糖（シグマ、ミズーリ州セントルイス）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ、ギブコ）中の１×１０^６の細胞群と１：１で混合された。ＲＡＤ１６ハイドロゲル中の細胞群の最終的濃度は、１×１０^６細胞／１００マイクロリットルであった。

検査物質（Ｎ＝４／Ｒｘ）
１．不織布バイクリル＋１×１０^６臍帯由来細胞群
２．３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体＋１×１０^６臍帯由来細胞群
３．ＲＡＤ１６自己集合ペプチド＋１×１０^６臍帯由来細胞群
４．不織布バイクリル＋１×１０^６胎盤由来細胞群
５．３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体＋１×１０^６胎盤由来細胞群
６．ＲＡＤ１６自己集合ペプチド＋１×１０^６胎盤由来細胞群
７．３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体
８．不織布バイクリル

動物の準備
動物類は、米国動物保護法の現在の必要条件にしたがって扱われ、維持された。前記公法の順守は、米国動物保護法の規制（９ ＣＦＲ）を忠実に守り、動物実験指針（ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）、第７版で公表された現在の基準を確認することによって、達成された。

マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）／Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ／オス（ハーラン・スプラグ・ドーレイ社、インディアナ州インディアナポリス）、生後５週間ＳＣＩＤマウス群のすべての取り扱いは、フードの下で行われた。前記マウス群は個々の体重が測定され、６０ミリグラム／ｋｇのＫＥＴＡＳＥＴ（塩酸ケタミン、アヴェコ（Ａｖｅｃｏ）社、アイオワ州フォートドッジ）および１０ミリグラム／ｋｇのＲＯＭＰＵＮ（キシラジン、モーベイ（Ｍｏｂａｙ）社、カンザス州ショウニー（Ｓｈａｗｎｅｅ））および生理的食塩水の混合液の腹腔内注入で麻酔された。麻酔の導入後、背側の頚部から背側の腰仙部までの背部全体の毛が、動物用電気バリカンを用いて刈り取られた。その後、この部分は酢酸クロルヘキシジンでこすられ、アルコールでリンスされ、乾燥され、１％の市販のヨードのヨードフォア水溶液で塗られた。麻酔期間中に組織が乾燥しないように、眼軟膏が眼に塗布された。

皮下移植テクニック
それぞれが約１．０ｃｍの長さの、４つの皮膚切開が、前記マウス群の背に作られた。２つの上方部位は、背側外側の胸部上で、肩甲骨の触診的下方縁から約５ｍｍ尾側の位置で、横に位置しており、１つの切開が背柱の左側に、もう１つの切開が右側に行われた。別の２つは、触診的腸骨稜から約５ｍｍ尾側で、尾側の仙腰椎レベルの殿筋部位上に、横に位置しており、１つの切開が正中線の左側に、もう１つの切開が右側に行われた。移植物群は、実験の計画にしたがって、これらの部位群に無作為に置かれた。皮膚が、その下にある結合組織から分離され、小さいポケットが作られ、前記切開部から約１ｃｍ尾側に前記移植物が置かれた（ＲＡＤ１６の場合は注入された）。好適な検査物質が前記皮膚下空間に移植された。前記皮膚切開部は金属クリップ群で閉じられた。

動物飼育設備
マウス群は、前記検査期間中を通して、マイクロアイソレーター・ケージ群内で、６４〜７９°Ｆの温度範囲、３０％から７０％までの相対的湿度で、個々に飼育され、約１２時間の昼／１２時間の夜の照明サイクルで維持された。温度および相対湿度は、最大限可能な限り、記述された範囲内に維持された。餌は、放射線照射されたＰｉｃｏ Ｍｏｕｓｅ Ｃｈｏｗ ５０５８（ピューリナ社）から成り、水は無制限に与えた。

マウス群は、二酸化炭素の吸入によって、計画された期間後に安楽死させた。前記の皮膚下移植部位群はその上の皮膚と共に切り取られ、組織学のために冷凍された。

組織学
移植物の付いた摘出皮膚は、１０％の中性に緩衝化されたホルマリン（リチャード−アラン、ミシガン州カラマズー）で固定された。覆っている組織および隣接組織の付いた検体群は中央部で二等分され、パラフィンで処理され、通常の方法類を用いて切断表面に埋め込まれた。５ミクロンの組織切片群がミクロトームで取得され、通常の方法類を用いてヘマトキシリンおよびエオシン（ポリ・サイエンティフィック、ニューヨーク州ベイショア）で染色された。

結果
３０日後に、ＳＣＩＤマウスの皮下に移植された発泡体群への組織の成長は最小限であった（細胞なし）。対照的に、臍帯由来細胞群または胎盤由来細胞群で移植された発泡体群には広範な組織の充填があった。ある程度の組織の成長は、不織布バイクリルの足場群に観察された。臍帯由来細胞群または胎盤由来細胞群が播種された不織布の足場群は、マトリックスの沈殿および成熟した血管群の増加を示した。

要約
合成吸収性の不織布／発泡体の円板群（５．０ｍｍ直径×１．０ｍｍ厚さ）または自己集合のペプチドヒドロゲルが、ヒトの臍帯または胎盤のどちらかから由来する細胞群で播種され、ＳＣＩＤマウス群の脊椎部分の両側に皮下に移植された。その結果群は、分娩後由来細胞群は、生体分解性足場群に良質の組織形成を劇的に増加させ得ることを実証した。

分娩後由来細胞群の神経修復での使用
網膜神経節細胞（ＲＧＣ）病変群が、哺乳類成体ＣＮＳでの種々の修復の方策のモデル群として広範に使用されている。げっ歯類成体のＲＧＣの軸索群の球後部分が、不成功の発芽（Ｚｅｎｇ ら、１９９５）および親細胞集団の進行的死亡（Ｖｉｌｌｅｇａｓ−Ｐｅｒｅｚら、１９９３）に至ることが実証されている。多くの研究は、軸索切断されたＲＧＣの生存性およびそれらの軸索群の再生への種々の外因性因子類および内因性因子群の刺激的効果類を実証している（ＹｉｐおよびＳｏ，２０００、Ｆｉｓｃｈｅｒら、２００１）。さらに、他の複数の研究は、細胞移植が、切断された神経軸索群の再生を促進するために用いられ得ることを実証している（Ｌｉら、２００３、Ｒａｍｏｎ−Ｃｕｅｔｏら、２０００）。このように、これらの研究および他の研究は、脊髄、末梢神経群、陰部神経群、視神経群が冒される神経障害の治療、または、神経損傷が起こり得る損傷による他の疾患類／外傷を治療するために、細胞に基づく治療が利用されうることを実証している。

自己集合ペプチド群（ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）、米国特許第５，６７０，４８３号および第５，９５５，３４３号、米国／ＰＣＴ出願番号第ＵＳ２００２／０１６０４７１号、第ＷＯ０２／０６２９６９号）は、細胞群を３次元で封入するための、２次元のコーティング内に細胞群をプレーティングするための、細胞接着用の足場として、または、懸濁培養群でのマイクロキャリア群として、働くように開発されている。３次元の細胞培養は、天然の再現性および細胞の信号の問題類を有する動物由来の物質類（マウスの肉腫抽出物）、または天然のＥＣＭの物理学的ナノメートルスケールおよび化学的特性類を模倣しない、より大きな合成足場類のどちらかを必要とした。ＲＡＤ１６（ＮＨ２−（ＲＡＤＡ）_３−ＣＯＯＨ）およびＫＬＤ（ＮＨ２−（ＫＬＤＬ）_３−ＣＯＯＨ）は、小さい（ＲＡＤ１６は５ナノメートルである）オリゴペプチド断片群で合成され、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に類似のスケールでナノファイバー群に自己集合する（３Ｄマトリックス社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）。前記自己集合は、培養培地内に見つけられる一価陽イオン群または二価陽イオン群によって、または生理学的環境によって、開始される。この実施例に記載された前記プロトコールでは、ＲＡＤ１６は、分娩後細胞群の眼の異常への移植用のマイクロキャリアとして使用された。この実施例では、分娩後由来細胞群（ＰＰＤＣ群）の移植が、成体ラットの視神経の軸索再生モデルで効力を提供し得ることが実証される。

方法類および材料類
細胞群
ヒト成人のＰＰＤＣ群（臍帯および胎盤）、および繊維芽細胞群（継代１０）の培養群が、１回の継代で増殖された。すべての細胞群は、まず、１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）を含む成長培地内で、ゼラチンでコーティングされたＴ７５フラスコ群に、５，０００細胞／ｃｍ^２で播種された。継代１１で、細胞群はトリプシン処理され、生存性がトリパンブルー染色によって決定された。簡潔に述べると、５０マイクロリットルの細胞懸濁液が、５０マイクロリットルの０．０４％（ｗ／ｖ）トリパンブルー液（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）と混ぜられ、血球計算板を用いて生細胞群数が推定された。その後、細胞群は、添加物を含まないＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）内で３回洗浄された。その後、細胞群は、製造会社の推奨の通り、緩衝化され等張化された２５マイクロリットルのＲＡＤ−１６（３ＤＭ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）中に２００，０００細胞群の濃度で懸濁された。１００マイクロリットルの、添加物を含まないＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地が、上記の細胞／マトリックス懸濁液に加えられ、使用までそれを湿った状態に保った。これらの細胞／マトリックス培養群は、移植が起こるまで標準の大気条件に維持された。移植の時点で、過剰な培地が除かれた。

動物群および外科処置
ロングエバンスのメスのラット群（２２０〜２４０グラムの体重）が使用された。腹腔内でトリブロモエタノールの麻酔下（２０ミリグラム／１００グラムの体重）で、視神経が露出され、視神経髄が視神経円板から約２ミリメートルのところで眼窩内で切開され、前記神経が前記髄から持ち上げられ、細いはさみで完全に横に切断することを可能にした（Ｌｉら、２００３）。切断の完全性は、近位断端および遠位断端の完全な分離を視覚的に観察することで確認された。コントロールグループは、移植されなかった障害ラット群から成る。移植ラット群では、１つのマイクロピンセットを用いて、ＲＡＤ−１６に播種された培養分娩後細胞群が、前記近位断端および前記遠位断端の間に挿入された。ＲＡＤ−１６中の約７５，０００細胞群が、切断された視神経に移植された。１つの細いマイクロピンセットを用いて、細胞／マトリックスが前記切断部に塗布された。切断された視神経の髄は、１０／０ブラック・モノフィラメント・ナイロン（エチコン社、英国エジンバラ）で閉じられた。このように、前記間隙は、前記神経の前記切断近位端および前記切断遠位端が互いに近づくように引っ張って閉じられた。

細胞の注入群が行われた後、動物群は、移植後１０日間の間、デキサメタゾン（２ミリグラム／キログラム）で注入された。この検査の期間中、動物群は、移植の２日前から前記検査の終了時まで、経口的なシクロスポリンＡ（２１０ミリグラム／飲料水リットル、その結果の血液内濃度：２５０〜３００μグラム／リットル）（ベッドフォード・ラブズ、オハイオ州ベッドフォード）の飲み水で維持された。食物と水は無制限に利用可能であった。動物群は、移植後３０日または６０日に犠牲にされた。

ＣＴＢの適用
動物群が犠牲にされる３日前に、麻酔下で、３０〜５０ミリメートルの先端を有するガラスマイクロピペットが、前記レンズの後ろに前記強膜を通して、接線方向に挿入され、１％逆行性トレーサーコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）水溶液（リストバイオロジック（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）、カリフォルニア州カンベル）の２アリコート分（各アリコートは４〜５マイクロリットル）がガラス体に注入された。動物群は、固定液で潅流され、視神経群が１時間の同一の固定液中で、収集された。前記視神経群は、一晩蔗糖中に移された。２０マイクロメートルの凍結切片群は、０．１モルのグリシンに３０分間インキュベートされ、２．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ベーリンガーマンハイム、ドイツ、マンハイム）および０．５％トライトンＸ−１００（シグマ、ミズーリ州セントルイス）を含むＰＢＳ溶液でブロックされた後、ＰＢＳ中に２％の正常のウサギ血清（ＮＲＳ）（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）と２．５％ＢＳＡと２％トライトンＸ−１００（シグマ、ミズーリ州セントルイス）を含むＰＢＳに、１：４０００で希釈されたヤギ抗ＣＴＢ抗体（リストバイロジック、カリフォルニア州カンベル）を含む溶液でブロックされ、ＰＢＳ中に２％トライトンＸ−１００で、１：２００で希釈されたビオチン化ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州バーリンガム）中に、室温で２時間インキュベートされた。これは、その後、ＰＢＳ中で１：２００希釈のストレプトアビジン・グリーン（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４３８、モレキュラープローブズ、オレゴン州ユージーン）中で、室温で２時間、染色された。染色された切片群は、その後、ＰＢＳ中で洗浄され、共焦点顕微鏡のためにプロピジウムヨウ化物で対比染色された。

組織学用調製
簡潔に述べると、ＣＴＢ注射の５日後、ラット群は４％ホルムアルデヒドで潅流された。ラット群は４立方センチメートルのウレタンが与えられ、次にＰＢＳ（０．１モル）で潅流され、その後４％のパラホルムアルデヒドで潅流された。脊髄が切断され、頭から骨が除かれて、小隆起を露出した。前記小隆起が取り除かれて、４％パラホルムアルデヒド中に置かれた。前記眼の外側に沿ってできるだけ後方まで切断して、前記眼を取り除いた。前記眼の下側に横たわる前記視神経を切断しないように注意が払われた。前記眼が取り除かれ、筋肉が切断され、前記視神経が露出された。その後、これは４％パラホルムアルデヒド中に置かれた。

結果
病変部群のみ
前記視神経の管後方（ｒｅｔｒｏｔｕｂｕｌａｒ）の切断の１ヶ月後に、いくつかのＣＴＢ標識の軸索群が、前記網膜に付着した神経部分で同定された。前記切断部の近くの２００マイクロメートル内に、軸索が、主軸に直角にいくつかの副軸索群を出し、前記切断面に神経腫様（ｎｅｕｒｏｍａｔｏｕｓ）としての末端化が発見された。前記近位断端および前記遠位断端の間のこの切断部では、前記間隙は、２〜３ミリメートル断片の血管新生化結合組織によって進行的に橋渡しされていることが観察されたが、軸索がこの橋渡し部分に進行するのは見られなかった。したがって、病変のみを受容した動物群では、軸索成長が前記遠位断端に到達することは観察されなかった。

ＲＡＤ−１６移植
前記切断部へのＲＡＤ−１６の移植後、血管新生化結合組織の内部への可視的な成長が観察された。しかし、前記近位断端および前記遠位断端の間で、軸索の内部への成長は観察されなかった。ＲＡＤ−１６の適用のみは、この状況での軸索再生を誘導するには不十分であることが、前記結果群から実証される。

分娩後由来細胞群の移植
分娩後由来細胞群の前記切断視神経への移植は、視神経の再成長を刺激した。繊維芽細胞群が移植された条件では、いくつかの再成長がまた観察されたが、前記の移植胎盤由来細胞群で観察された前記再成長に比較すると、これは最小限であった。視神経の再成長は、胎盤由来細胞群で移植された動物群の４／５で観察され、成人皮膚繊維芽細胞群で移植された動物の３／６で観察され、臍帯由来細胞群で移植された動物の１／４で観察された。再成長が観察された状況類では、ＣＴＢ標識によって、網膜神経節細胞の軸索群の再生が確認された。これらの軸索は前記移植部分を貫通していることが実証された。グリア瘢痕のレベルを決定するために、ＧＦＡＰ標識もまた行われた。ＧＦＡＰ発現は、前記近位断端で高く、前記の再神経化された移植片内に或る程度の免疫染色が観察された。

要約
これらの結果群は、移植されたヒト成人の分娩後由来細胞群が、切断された網膜神経節細胞軸索群の再生を刺激して、導くことができることを実証する。

実施例１７の参考文献
１）Ｚｅｎｇ ＢＹ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＰＮ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ｇ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ＡＲ．１９９５．Ｊ．Ａｎａｔ．１８６：４９５〜５０８
２）Ｖｉｌｌｅｇａｓ−Ｐｅｒｅｚ ＭＰ，Ｖｉｄａｌ−Ｓａｎｚ Ｍ，Ｂｒａｙ ＧＭ，Ａｇｕａｙｏ ＡＪ．１９８８．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：２６５〜８０
３）Ｙｉｐ ＨＫ，Ｓｏ ＫＦ．２０００．Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１９：５５９〜７５
４）Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｄ，Ｈｅｉｄｕｓｃｈｋａ Ｐ，Ｔｈａｎｏｓ Ｓ．２００１．Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．１７２：２５７〜７２
５）Ｒａｍｏｎ−Ｃｕｅｔｏ Ａ，Ｃｏｒｄｅｒｏ ＭＩ，Ｓａｎｔｏｓ−Ｂｅｎｉｔｏ ＦＦ，Ａｖｉｌａ Ｊ．２０００．Ｎｅｕｒｏｎ ２５：４２５〜３５

本発明は、以上に記述された、また例示された前記実施形態に限定されるものではない。本発明は、添付の請求項群の範囲内での改変および修正が可能である。

Claims (49)

1. 実質的に血液を含まないヒト胎盤またはヒト臍帯の組織に由来する細胞を有する、単離された分娩後由来細胞であって、この細胞は培養中で自己再性および増殖をすることができ、かつ神経表現型の細胞に分化する能力を有し；前記細胞は成長にＬ−バリンを必要としかつ少なくとも約５％の酸素中で成長することができ；
   以下の特徴群、
   ａ）培養内で少なくとも約４０回の倍加の能力、
   ｂ）コーティングされた組織培養容器、またはコーティングされていない組織培養容器、に接着し増殖し、前記コーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含むこと、
   ｃ）組織因子とビメンチンとα−平滑筋アクチンの少なくとも１つを産生すること、
   ｄ）ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＰＤ−Ｌ２とＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
   ｅ）フローサイトメトリーで検知すると、ＣＤ３１とＣＤ３４とＣＤ４５とＣＤ８０とＣＤ８６とＣＤ１１７とＣＤ１４１とＣＤ１７８とＢ７−Ｈ２とＨＬＡ−ＧとＨＬＡ−ＤＲとＨＬＡ−ＤＰとＨＬＡ−ＤＱの少なくとも１つの産生の欠如、
   ｆ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるヒト細胞に関連する、遺伝子の発現が、インターロイキン８とレチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）１とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫成長刺激活性、アルファ）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３と腫瘍壊死因子とアルファ誘導性タンパク質３とＣ−タイプレクチンスーパーファミリーメンバー２とウィルムス腫瘍１とアルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２とレニンと酸化低密度リポプロテイン受容体１とヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１とプロテインキナーゼＣゼータと仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３と卵巣癌で下方制御１（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ １）とクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３のヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子をコードする少なくとも１つの遺伝子に対し増加していること、
   ｇ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるヒト細胞に関連する、遺伝子の発現が、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２と、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）と、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２から）と、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）と、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓ ホメオボックス・ホモログ１（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、クリスタリンアルファＢと、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ 関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ２）と、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質と、ニューラリン（ｎｅｕｒａｌｉｎ）１の類似体と、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）と、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメインと、コレステロール２５ヒドロキシラーゼと、ｒｕｎｔ関連転写因子３と、インターロイキン１１受容体アルファと、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ・エンハンサーと、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ホモログ７（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、仮想的遺伝子ＢＣ００８９６７と、コラーゲンタイプＶＩＩＩアルファ１と、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ））と、イルコイ相同体タンパク質５と、ヘファエスチンと、インテグリンベータ８と、シナプス小胞糖タンパク２と、神経芽細胞腫 腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １）と、インスリン様成長因子結合タンパク質２ ３６ｋＤａと、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４と、サイトカイン受容体様因子１と、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャネル サブファミリーＮ メンバー４と、インテグリン ベータ７と、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓホメオボックス・ホモログ２（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質と、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））と、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１と、初期成長応答３と、ディスタル・レス・ホメオボックス５と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３７３と、アルド・ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−アルファ・ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩ）と、バイグリカンと、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、フィブロネクチン１と、プロエンケファリンと、インテグリンベータ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン群を含む）と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２と、ＥｐｈＡ３と、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質と、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）と、仮想的タンパク質 ＦＬＪ１４０５４と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２から）と、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様と、ＡＥ結合タンパク質１と、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）と、ニューラリン１の類似体と、Ｂ細胞転座遺伝子１と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２３１９１と、ＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１とをコードする、少なくとも１つの遺伝子に対し減少していること、
   ｈ）ＭＣＰ−１とＩＬ−６とＩＬ−８とＧＣＰ−２とＨＧＦとＫＧＦとＦＧＦとＨＢ−ＥＧＦとＢＤＮＦとＴＰＯとＭＩＰ１ａとＲＡＮＴＥＳとＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌、
   ｉ）ＥＬＩＳＡで検出されるところの、ＴＧＦ−ベータ２とＡＮＧ２とＰＤＧＦｂｂとＭＩＰ１ｂとＩ３０９とＭＤＣとＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如、
   の内の、少なくとも１つの特徴を含むものである
   前記細胞。
2. メタルプロテアーゼ活性と粘膜溶解活性と中性プロテアーゼ活性を含む１つ若しくはそれ以上の酵素活性の存在下で単離される、請求項１の前記分娩後由来細胞。
3. 正常な核型を有する、請求項６の前記分娩後由来細胞。
4. フローサイトメトリーで検知されると、ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを含むが、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれをも含まない、請求項９の前記分娩後由来細胞。
5. 請求項１の前記分娩後由来細胞群を含む、細胞集団。
6. 請求項５の前記細胞集団において、この細胞集団は、前記分娩後由来細胞群の実質的に均一の集団である。
7. 請求項６の前記細胞集団において、分娩後由来細胞群のクローン細胞株を含む細胞集団。
8. 請求項５の前記細胞集団において、前記細胞集団は、前記分娩後由来細胞群および少なくとも１つの他の細胞タイプを含む、不均一な集団である。
9. 請求項８の前記細胞集団であって、前記の少なくとも１つの他の細胞タイプは、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、他の複能性幹細胞、または他の多能性幹細胞である。
10. 請求項５の前記細胞集団から調製された細胞溶解物。
11. 請求項１０の前記細胞溶解物から調製された溶解性細胞分画。
12. 請求項５の前記細胞集団から調製された細胞外マトリックス。
13. 請求項５の前記細胞集団において、幹細胞の分化を神経系統または上皮系統の方へ刺激させる１つ若しくはそれ以上の因子に接触させて培養されるものである。
14. 神経変性病状を有する患者を治療する方法であって、前記方法は、前記神経変性病状を治療するのに有効な量で、分娩後由来細胞群を前記患者に投与することを含み、ここで、前記分娩後由来細胞群は、実質的に血液を含まないヒト胎盤またはヒト臍帯の組織に由来することを特徴とし、前記細胞は培養中で自己再性および増殖をすることができ、少なくとも１つの神経表現型の細胞群に分化する能力を有し、また前記細胞は成長にＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で成長することができ、また前記細胞はさらに、以下の特徴群の少なくとも１つを含み、それらは
    ａ）培養内で少なくとも約４０回の倍加の能力、
    ｂ）コーティングされた組織培養容器、またはコーティングされていない組織培養容器、に接着し増殖するが、前記のコーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含むこと、
    ｃ）組織因子とビメンチンとα−平滑筋アクチンの少なくとも１つを産生すること、
    ｄ）ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＰＤ−Ｌ２とＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
    ｅ）フローサイトメトリーで検知すると、ＣＤ３１とＣＤ３４とＣＤ４５とＣＤ８０とＣＤ８６とＣＤ１１７とＣＤ１４１とＣＤ１７８とＢ７−Ｈ２とＨＬＡ−ＧとＨＬＡ−ＤＲとＨＬＡ−ＤＰとＨＬＡ−ＤＱの少なくとも１つの産生の欠如、
    ｆ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるヒト細胞に関連する、遺伝子の発現が、インターロイキン８とレチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）１とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫成長刺激活性、アルファ）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３と腫瘍壊死因子とアルファ誘導性タンパク質３とＣ−タイプレクチンスーパーファミリーメンバー２とウィルムス腫瘍１とアルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２とレニンと酸化低密度リポプロテイン受容体１とヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１とプロテインキナーゼＣゼータと仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３と卵巣癌で下方制御１（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ １）とクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３のヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子をコード化する少なくとも１つの遺伝子に対し増加していること、
    ｇ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるヒト細胞に関連する、遺伝子の発現が、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２と、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）と、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２から）と、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）と、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓ ホメオボックス・ホモログ１（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、クリスタリンアルファＢと、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ 関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ２）と、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質と、ニューラリン（ｎｅｕｒａｌｉｎ）１の類似体と、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）と、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメインと、コレステロール２５ヒドロキシラーゼと、ｒｕｎｔ関連転写因子３と、インターロイキン１１受容体アルファと、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ・エンハンサーと、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ホモログ７（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、仮想的遺伝子ＢＣ００８９６７と、コラーゲンタイプＶＩＩＩアルファ１と、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ））と、イルコイ相同体タンパク質５と、ヘファエスチンと、インテグリンベータ８と、シナプス小胞糖タンパク２と、神経芽細胞腫 腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １）と、インスリン様成長因子結合タンパク質２ ３６ｋＤａと、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４と、サイトカイン受容体様因子１と、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャネルサブファミリーＮ メンバー４と、インテグリン ベータ７と、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓホメオボックス・ホモログ２（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質と、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））と、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１と、初期成長応答３と、ディスタル・レス・ホメオボックス５と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３７３と、アルド・ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−アルファ・ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩ）と、バイグリカンと、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、フィブロネクチン１と、プロエンケファリンと、インテグリンベータ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン群を含む）と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２と、ＥｐｈＡ３と、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質と、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）と、仮想的タンパク質 ＦＬＪ１４０５４と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２から）と、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様と、ＡＥ結合タンパク質１と、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）と、ニューラリン１の類似体と、Ｂ細胞転座遺伝子１と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２３１９１と、ＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１を、コード化する少なくとも１つの遺伝子に対し減少していること、
    ｈ）ＭＣＰ−１とＩＬ−６とＩＬ−８とＧＣＰ−２とＨＧＦとＫＧＦとＦＧＦとＨＢ−ＥＧＦとＢＤＮＦとＴＰＯとＭＩＰ１ａとＲＡＮＴＥＳとＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌、
    ｉ）ＥＬＩＳＡで検出されるところの、ＴＧＦ−ベータ２とＡＮＧ２とＰＤＧＦｂｂとＭＩＰ１ｂとＩ３０９とＭＤＣとＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如、
    である前記方法。
15. 前記神経変性病状が急性神経変性病状である、請求項１４の方法。
16. 前記急性神経変性病状が脳損傷、脊髄損傷、または末梢神経損傷である、請求項１５の前記方法。
17. 前記神経変性病状が慢性神経変性病状、または進行性神経変性病状である、請求項１４の前記方法。
18. 前記慢性神経変性病状または前記進行性神経変性病状が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、腫瘍、多発性硬化症、または慢性末梢神経損傷である、請求項１７の前記方法。
19. 投与前に、前記細胞群がｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導されて、神経系統細胞群に分化する、請求項１４の前記方法。
20. 前記細胞群を遺伝子操作して、前記神経変性病状の治療を促進する遺伝子産物を産生するようにする、請求項１４の前記方法。
21. 前記細胞群が少なくとも１つの他の細胞タイプと共に投与される、請求項１４の前記方法。
22. 前記の他の細胞タイプが、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、または、他の複能性幹細胞または多能性幹細胞である、請求項２１の前記方法。
23. 前記の少なくとも１つの他の細胞タイプが、前記分娩後由来細胞群と同時に投与されるか、前記分娩後由来細胞群の投与以前に投与されるか、または前記分娩後由来細胞群の投与以後に投与される、請求項２１の前記方法。
24. 前記細胞群が少なくとも１つの他の薬剤と共に投与される、請求項１４の前記方法。
25. 前記の少なくとも１つの他の薬剤が、前記分娩後由来細胞群と同時に投与されるか、前記分娩後由来細胞群の投与以前に投与されるか、または前記分娩後由来細胞群の投与以後に投与される、請求項２４の前記方法。
26. 前記細胞群が、前記患者の中枢神経系または末梢神経系の前もって決定された部位に投与される、請求項１４の前記方法。
27. 前記細胞群が注入または輸液によって投与される、請求項１４の前記方法。
28. 前記細胞群が移植可能な装置内に封入されて投与される、請求項１４の前記方法。
29. 前記細胞群が、前記細胞群を含むマトリックスまたは足場の移植によって投与される、請求項１４の前記方法。
30. 神経変性病状を有する患者を治療するための薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は、薬理学的に許容される担体、および、前記神経変性病状を治療するのに有効な量の分娩後由来細胞群を含むものであって、ここで前記分娩後由来細胞群は実質的に血液を含まないヒト胎盤またはヒト臍帯の組織に由来することを特徴とし、前記細胞群は培養中で自己再性および増殖をすることができ、少なくとも１つの神経表現型の細胞群に分化する能力を有することを特徴とし、前記細胞群は成長にＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で成長することができるものであって、前記細胞はさらに、以下の特徴群、
    ａ）培養内で少なくとも約４０回の倍加の能力、
    ｂ）コーティングされた組織培養容器、またはコーティングされていない組織培養容器、に接着し増殖するが、前記のコーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含むこと、
    ｃ）組織因子とビメンチンとα−平滑筋アクチンの少なくとも１つを産生すること、
    ｄ）ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＰＤ−Ｌ２とＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
    ｅ）フローサイトメトリーで検知すると、ＣＤ３１とＣＤ３４とＣＤ４５とＣＤ８０とＣＤ８６とＣＤ１１７とＣＤ１４１とＣＤ１７８とＢ７−Ｈ２とＨＬＡ−ＧとＨＬＡ−ＤＲとＨＬＡ−ＤＰとＨＬＡ−ＤＱの少なくとも１つの産生の欠如、
    ｆ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるヒト細胞に関連する、遺伝子の発現が、インターロイキン８とレチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）１とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫成長刺激活性、アルファ）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３と腫瘍壊死因子とアルファ誘導性タンパク質３とＣ−タイプレクチンスーパーファミリーメンバー２とウィルムス腫瘍１とアルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２とレニンと酸化低密度リポプロテイン受容体１とヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１とプロテインキナーゼＣゼータと仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３と卵巣癌で下方制御１（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ １）とクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３のヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子、をコードする少なくとも１つの遺伝子に対し増加していること、
    ｇ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるヒト細胞に関連する、遺伝子の発現が、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２と、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）と、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２から）と、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）と、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓ ホメオボックス・ホモログ１（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、クリスタリンアルファＢと、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ 関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ２）と、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質と、ニューラリン（ｎｅｕｒａｌｉｎ）１の類似体と、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）と、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメインと、コレステロール２５ヒドロキシラーゼと、ｒｕｎｔ関連転写因子３と、インターロイキン１１受容体アルファと、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ・エンハンサーと、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ホモログ７（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、仮想的遺伝子ＢＣ００８９６７と、コラーゲンタイプＶＩＩＩアルファ１と、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ））と、イルコイ相同体タンパク質５と、ヘファエスチンと、インテグリンベータ８と、シナプス小胞糖タンパク２と、神経芽細胞腫 腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １）と、インスリン様成長因子結合タンパク質２ ３６ｋＤａと、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４と、サイトカイン受容体様因子１と、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャネルサブファミリーＮ メンバー４と、インテグリン ベータ７と、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓホメオボックス・ホモログ２（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質と、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））と、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１と、初期成長応答３と、ディスタル・レス・ホメオボックス５と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３７３と、アルド・ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−アルファ・ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩ）と、バイグリカンと、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、フィブロネクチン１と、プロエンケファリンと、インテグリンベータ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン群を含む）と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２と、ＥｐｈＡ３と、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質と、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）と、仮想的タンパク質 ＦＬＪ１４０５４と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２から）と、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様と、ＡＥ結合タンパク質１と、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）と、ニューラリン１の類似体と、Ｂ細胞転座遺伝子１と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２３１９１と、ＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１を、コードする少なくとも１つの遺伝子に対し減少していること、
    ｈ）ＭＣＰ−１とＩＬ−６とＩＬ−８とＧＣＰ−２とＨＧＦとＫＧＦとＦＧＦとＨＢ−ＥＧＦとＢＤＮＦとＴＰＯとＭＩＰ１ａとＲＡＮＴＥＳとＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌、
    ｉ）ＥＬＩＳＡで検出されるところの、ＴＧＦ−ベータ２とＡＮＧ２とＰＤＧＦｂｂとＭＩＰ１ｂとＩ３０９とＭＤＣとＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如、
    の少なくとも１つを含むものである前記薬学的組成物。
31. 前記神経変性病状が急性神経変性病状である、請求項３０の前記薬学的組成物。
32. 前記神経変性病状が慢性神経変性病状、または進行性神経変性病状である、請求項３０の前記薬学的組成物。
33. 前記成分の調製前に、前記細胞群がｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導されて、神経系統細胞群に分化する、請求項３０の前記薬学的組成物。
34. 前記細胞群を遺伝子操作して、前記神経変性病状の治療を促進する遺伝子産物を産生するようにする、請求項３３の前記薬学的組成物。
35. 少なくとも１つの他の細胞タイプを含む、請求項３０の前記薬学的組成物。
36. 前記の他の細胞タイプが、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、または、他の複能性幹細胞または多能性幹細胞である、請求項３５の前記薬学的組成物。
37. 少なくとも１つの他の薬剤を含む、請求項３０の前記薬学的組成物。
38. 注射または輸液によって投与するために調製される、請求項３０の前記薬学的組成物。
39. 前記細胞群が移植可能な装置内に封入される、請求項３０の前記薬学的組成物。
40. 前記細胞群がマトリックスまたは足場に含まれる、請求項３０の前記薬学的組成物。
41. 神経変性病状を有する患者を治療するためのキットであって、前記キットは、薬理学的に許容される担体と、分娩後由来細胞群の集団と、前記患者を治療する方法で前記キットを使用するための使用説明書類を含むものであって、ここで前記分娩後由来細胞群は実質的に血液を含まないヒト胎盤またはヒト臍帯の組織に由来することを特徴とし、前記細胞群は培養中で自己再性および増殖をすることができ、少なくとも１つの神経表現型の細胞群に分化する能力を有することを特徴とし、前記細胞群は成長にＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で成長することができることを特徴とし、前記細胞はさらに、以下の特徴群の少なくとも１つを含むことを特徴とし、それらは、
    ａ）培養内で少なくとも約４０回の倍加の能力、
    ｂ）コーティングされた組織培養容器、またはコーティングされていない組織培養容器、に接着し増殖するが、前記のコーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含むこと、
    ｃ）組織因子とビメンチンとα−平滑筋アクチンの少なくとも１つを産生すること、
    ｄ）ＣＤ１０とＣＤ１３とＣＤ４４とＣＤ７３とＣＤ９０とＰＤＧＦｒ−アルファとＰＤ−Ｌ２とＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの少なくとも１つの産生、
    ｅ）フローサイトメトリーで検知すると、ＣＤ３１とＣＤ３４とＣＤ４５とＣＤ８０とＣＤ８６とＣＤ１１７とＣＤ１４１とＣＤ１７８とＢ７−Ｈ２とＨＬＡ−ＧとＨＬＡ−ＤＲとＨＬＡ−ＤＰとＨＬＡ−ＤＱの少なくとも１つの産生の欠如、
    ｆ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるヒト細胞に関連する、遺伝子の発現が、インターロイキン８とレチキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）１とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫成長刺激活性、アルファ）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）とケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３と腫瘍壊死因子とアルファ誘導性タンパク質３とＣ−タイプレクチンスーパーファミリーメンバー２とウィルムス腫瘍１とアルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２とレニンと酸化低密度リポプロテイン受容体１とヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１とプロテインキナーゼＣゼータと仮想的タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３と卵巣癌で下方制御１（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ １）とクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３のヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）遺伝子、をコードする少なくとも１つの遺伝子に対し増加していること、
    ｇ）繊維芽細胞、間葉系幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞のいずれかであるヒト細胞に関連する、遺伝子の発現が、低身長感受性（ｓｈｏｒｔ ｓｔａｔｕｒｅ）ホメオボックス２と、熱ショック２７ｋＤａタンパク質２と、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）と、エラスチン（大動脈弁上狭窄、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群）と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２から）と、間葉ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）と、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓ ホメオボックス・ホモログ１（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、クリスタリンアルファＢと、形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ 関連アクチベータ２（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ２）と、ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質と、ニューラリン（ｎｅｕｒａｌｉｎ）１の類似体と、テトラネクチン（プラスミノゲン結合タンパク質）と、ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）およびシステインリッチドメインと、コレステロール２５ヒドロキシラーゼと、ｒｕｎｔ関連転写因子３と、インターロイキン１１受容体アルファと、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ・エンハンサーと、縮合（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ホモログ７（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、仮想的遺伝子ＢＣ００８９６７と、コラーゲンタイプＶＩＩＩアルファ１と、テネイシンＣ（ヘキサブラチオン（ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ））と、イルコイ相同体タンパク質５と、ヘファエスチンと、インテグリンベータ８と、シナプス小胞糖タンパク２と、神経芽細胞腫 腫瘍原性の抑制１（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ １）と、インスリン様成長因子結合タンパク質２ ３６ｋＤａと、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４と、サイトカイン受容体様因子１と、カリウム中間体／低透過性カルシウム活性化チャネルサブファミリーＮ メンバー４と、インテグリン ベータ７と、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓホメオボックス・ホモログ２（ショウジョウバエ：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）と、ＫＩＡＡ１０３４タンパク質と、小胞関連膜タンパク５（ミオブレビン（ｍｙｏｂｒｅｖｉｎ））と、ＥＧＦ含有フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）様細胞外マトリックスタンパク質１と、初期成長応答３と、ディスタル・レス・ホメオボックス５と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２０３７３と、アルド・ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３−アルファ・ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ、タイプＩＩ）と、バイグリカンと、ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を含む転写コアクチベータと、フィブロネクチン１と、プロエンケファリンと、インテグリンベータ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン群を含む）と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２と、ＥｐｈＡ３と、ＫＩＡＡ０３６７タンパク質と、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）と、仮想的タンパク質 ＦＬＪ１４０５４と、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍＲＮＡ ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２から）と、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様と、ＡＥ結合タンパク質１と、シトクロムｃ酸化酵素サブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）と、ニューラリン１の類似体と、Ｂ細胞転座遺伝子１と、仮想的タンパク質ＦＬＪ２３１９１と、ＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１を、コードする少なくとも１つの遺伝子に対し減少していること、
    ｈ）ＭＣＰ−１とＩＬ−６とＩＬ−８とＧＣＰ−２とＨＧＦとＫＧＦとＦＧＦとＨＢ−ＥＧＦとＢＤＮＦとＴＰＯとＭＩＰ１ａとＲＡＮＴＥＳとＴＩＭＰ１の少なくとも１つの分泌、
    ｉ）ＥＬＩＳＡで検出されるところの、ＴＧＦ−ベータ２とＡＮＧ２とＰＤＧＦｂｂとＭＩＰ１ｂとＩ３０９とＭＤＣとＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如、
    である前記キット。
42. 請求項４１の前記キットにおいて、この前記キットはさらに、少なくとも１つの試薬、および前記分娩後由来細胞群を培養するための使用説明書類を含む。
43. 請求項４１の前記キットにおいて、この前記キットはさらに、少なくとも１つの他の細胞タイプの集団を含む。
44. 請求項４１の前記キットにおいて、この前記キットはさらに、神経変性病状を治療するための少なくとも１つの他の試薬を含む。
45. 神経変性病状を有する患者を治療する方法であって、前記方法は、前記患者に投与すること、および、前記神経変性病状を治療するのに効果的な量で、請求項１の前記分娩後由来細胞群から作成された調製物を含み、ここで、前記調製物は、前記分娩後由来細胞群の細胞溶解物、前記分娩後由来細胞群の細胞外マトリックス、または前記分娩後由来細胞群が培養された馴化培地を含む。
46. 神経変性病状を有する患者を治療する薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は、薬理学的に許容される担体、および、請求項１の前記分娩後由来細胞群から作成された調製物を含み、ここで、前記調製物は、前記分娩後由来細胞群の細胞溶解物、前記分娩後由来細胞群の細胞外マトリックス、または前記分娩後由来細胞群が培養された馴化培地を含む。
47. 神経変性病状を有する患者を治療するためのキットであって、前記キットは、薬理学的に許容される担体、および、請求項１の前記分娩後由来細胞群から作成された調製物を含み、ここで、前記調製物は、前記分娩後由来細胞群の細胞溶解物、前記分娩後由来細胞群の細胞外マトリックス、または前記分娩後由来細胞群が成長された馴化培地と、前記神経変性病状の治療のために前記キット構成品群を使用するための使用説明書類とを含む。
48. 神経系統細胞群の前記の生存、成長、または活性を増加させるための方法にあって、前記方法が、前記神経系統細胞群の生存、成長、または活性を増加させるために有効な条件下で、請求項１の前記分娩後由来細胞群と共に前記神経系統細胞群を共培養することを含む。
49. 神経系統細胞群の前記の生存、成長、または活性を増加させるためのキットであって、前記キットが、請求項１の前記分娩後由来細胞群と、前記神経系統細胞群の生存、成長、または活性を増加させるために有効な条件下で、前記分娩後由来細胞群と共に前記神経系統細胞群を共培養するための説明書類を含む。