TWI440719B - 培養細胞的評估方法 - Google Patents

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Description

培養細胞的評估方法
本申請案是主張2009年1月23日提出的日本國專利申請案2009-013385號的優先權，並將其合併於本案中。
本發明是於培養細胞的評估方法中，特別關於經培養的骨形成性細胞的新評估方法。
目前對於謀求受損生體組織的再生之再生醫療的實現有需求。再生醫療是使用細胞、生體材料、細胞成長因子，將以生體本來具有的治癒能力無法回復的生體組織，造出與原來組織同樣的形態或功能的醫療技術。
在再生醫療上，一般是使用間葉系幹細胞。已知間葉系幹細胞能夠分化誘導成為脂肪細胞或成骨細胞等各種細胞，但事先判斷所得細胞是否有目的之功能，是很困難的。
又，在骨的再生醫療上，使用源於骨髓的間葉系幹細胞為中心，此外也有使用源於脂肪的幹細胞、源於骨膜的幹細胞、源於滑膜的幹細胞等的報告。其中尤以源於骨髓的間葉系幹細胞、或骨髓間質細胞，因其採取比較容易，並有極高的骨形成能，現在幾乎全部的骨再生臨床應用上都使用它。
但是，由以往本發明者等的報告，已明暸使用源於人類的骨形成性細胞，細胞的個體差異很大。又，已知骨形成能因培養而會迅速消失。因此，實際上移植的細胞是否有骨形成能的檢討，是很重要，但也闡明了截至目前所報告的方法不夠充分。尤其是以往是使用鹼性磷酸酯酶活性(ALP活性)(專利文獻1)、骨系標識的基因表現(非專利文獻1)等。ALP活性對骨形成性細胞雖是有用的評估法，但只用它來定義骨形成性細胞有困難。又，骨系標記的基因表現也是有用的評估法，但由本發明者等的研究結果發現，其表現的個體差異大，要用做評估法時也有困難的情況。尤其是對於個體差異大的源於人的細胞的評估，只有一個基準是不夠的，應組合多數的評估法而提高信賴性是很重要的，但以往沒有這種評估法的報告。
骨形成性細胞是定義為成骨細胞等於骨形成上必需的細胞，但在此處則特別定義為能異位性(heterotopic)做骨形成的細胞為骨形成性細胞。異位性就是在本來沒有骨的地方形成骨的能力。異位性的骨形成能可藉由例如與保持人細胞的承載體一起移植於免疫不全動物的皮下而做檢證。實際上能夠期望骨再生的部位是骨的附近，但因有需要對沒有骨的部分進行骨再生，本來骨再生上必要的能力，應該是這個異位性的骨形成能為最合適的評估法。但是，以往沒有由這種觀點所製成的細胞的評估方法。
[專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開2005-58225號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Nishimura et al.,J Bone Miner Metab. 26,203-212
即，為了藉由移植進行骨形成，就要經過如第1圖所示的製程。如第1圖所示，將移植材料，例如將模擬骨顆粒與骨形成性細胞放在一起，在移植部位由破骨細胞將模擬骨顆粒分解，另一方面由成骨細胞等而使其再生真性骨。這時，骨形成性細胞在移植材料中的數目當然是重要的因子，但另一方面有維持恰當的骨形成能為重要。假設這些骨形成性細胞的數目少，或使用骨形成能已經劣化的細胞時，不會有恰當的骨形成，實際上骨形成的確認需要相當長的時間。如果，沒有進行恰當的骨形成時，就需要再次進行間葉系幹細胞的採取、培養到移植手術及再生確認，不只是浪費幾個月的期間，要重做造成患者負擔的移植手術等處置。因此，要準確地評估培養細胞的功能是重要的。
另一方面，在細胞的培養中既使進行骨形成能的判定，在分化衍生中的檢查需要的時間達數週之久，所以不能輕易地重做。
但是以往所進行的目的細胞，例如是否為骨形成性細胞的評估，是如前所述以單一判定手法而實施的，將評估基準提高，移植後的再生率雖可提高某種程度，也可能將本來可以使用的培養細胞判定為不適用；另一方面若將評估基準降低，則可能有將無骨形成能的培養細胞用於移植的結果。再者，由本發明者等的研究，闡明了在人細胞幾乎全部的檢查值在個體間的差異大，只用一定基準值，或單一種判定基準就做正確判斷有困難，要做現實性的判定都有困難。
本發明是有鑑於上述課題而實施的，以提供能夠信賴地判定是否為目的細胞之評估方法為目的。本發明的評估方法，可合適使用於骨形成性細胞，而人細胞具有的差異性問題，是在骨形成性細胞以外，對於在再生醫療及細胞治療的對象細胞廣泛存在的共通的問題。因此本發明的效果不只是對骨形成性細胞，對廣泛使用人細胞的細胞治療上，提供有效的評估方法，以資判定所得細胞是否為目的細胞，以及是否具有在治療上必要的功能。
為了解決前述課題本發明者等精心研究結果發現，為了由培養細胞判定是否為目的細胞，測定培養細胞的複數檢查值或指標，將其組合而可製成可信賴的評估方法。又，對於骨形成性細胞(骨形成(+)細胞)則發現，由開發如第2圖所示的骨形成能檢查手法，在移植手術前做恰當且高精度的進行移植後骨形成能否進行恰當的預測、評估，可製成有用的骨形成性細胞的評估方法，而完成了本發明。
即本發明的培養細胞的評估方法，是為了由培養細胞判定目的細胞，測定培養細胞的複數檢查值或指標，將其組合，而以高精度預測、判定細胞的功能的評估方法，不只是對於個別的檢查值指定一定的適合範圍，對於適應範圍外的試樣，也可參照其他檢查值或指標，而可判定其為目的細胞為特徵。
又，本發明的經培養的骨形成性細胞的評估方法，是在具有1次判定基準、2次判定基準與3次判定基準的評估方法中，經過1次判定的細胞再進行2次判定而判定骨形成(+)細胞，將難於判定是否為骨形成(+)細胞的細胞，再進行3次判定是否為骨形成(+)為特徵。
在前述1次判定中，判定基準為ALP活性(鹼性磷酸酯酶活性)、ALP指數(分化誘導群的ALP活性/非分化誘導群的ALP活性)、細胞增殖能(分化誘導後的細胞數/初期播種細胞數)之任一者是否滿足1次判定基準值以上為恰當。
在前述2次判定中，判定基準為：ALP活性、ALP指數、細胞增殖能是否全部滿足2次判定的基準值以上，將滿足1次判定、2次判定兩基準的細胞判定為骨形成(+)細胞，未滿足1次判定基準但在2次判定中滿足基準的細胞就移到3次判定基準，未滿足2次判定的基準的細胞則判定為骨形成(-)細胞為恰當。
在前述3次判定中，判定基準為是否滿足流式細胞術(Flow Cytometry)之表面抗原(HLA-DR)解析、TRAP染色、茜素紅染色(alizarin red stain)的任一種基準，滿足這個基準的細胞判定為骨形成(+)細胞、未滿足的細胞判定為骨形成(-)細胞為恰當。
在前述1次判定中，基準值為骨形成(-)細胞的各(平均值+2SD)為恰當。
在前述2次判定中，基準值為骨形成(+)細胞的各(平均值-2SD)或骨形成(+)細胞的各測定值的下限值為恰當。
在前述3次判定中，表面抗原(HLA-DR)解析的基準，為所測定的HLA-DR陽性細胞在約6%以上為恰當。
在前述1次判定中，ALP活性的基準值為約166單位(μmol p-nitrophenol/min/μg protein)為恰當。
在前述1次判定中，ALP指數的基準值為約3.95為特徵的經培養的骨形成性細胞的評估方法。
在前述1次判定中，細胞增殖能的基準值為約9.7為恰當。
在前述2次判定中，ALP活性的基準值為約6.7單位((μmol p-nitrophenol produced/min/μg protein)為恰當。
在前述2次判定中，ALP指數的基準值為約1.01為恰當。
在前述2次判定中，細胞增殖能的基準值為約5.6為恰當。
本發明的骨形成性細胞的評估方法中，做為判定基準所用的ALP活性，是在骨形成性細胞、例如在成骨細胞、可看到高的活性。分化誘導後的ALP活性低時，則有可能不含骨形成性細胞，或細胞不具有骨形成能，但由本發明者等的研究，分化誘導群與非分化誘導群的ALP活性比率的ALP指數升高時，表示是有骨形成性細胞，並有骨形成能的情況。另一方面，ALP活性夠高的話，骨形成性細胞的分化誘導良好的可能性極高。但就算ALP活性高，但細胞增殖能消失的話，就不能期望在骨移植後有充分的骨形成。
於是，在本發明的評估方法中，也實施細胞增殖能的評估。
將上述3種評估(ALP活性、ALP指數、細胞增殖能)組合起來，對於很難判斷骨形成性細胞之有無的群組，則需要更慎重的評估。本發明者等對於這種群組再以流式細胞術之表面抗原(HLA-DR)解析、TRAP染色、茜素紅染色的結果，以具有任一者為陽性(流式細胞術表面抗原HLA-DR分劃部分陽性、TRAP染色陽性、茜素紅染色陽性)輔助性地判斷為有骨形成性細胞，而可對於幾乎全部有個體差異的試樣給予妥當的根據。
此HLA-DR陽性細胞與骨形成能的直接關係雖不清楚，但本發明者等所確認的是，HLA-DR活性與骨形成能顯示明確的相關。又，TRAP染色(酒石酸耐性酸性磷酸酯酶染色)是被當做破骨細胞標識而使用，但由於破骨前驅細胞成熟為破骨細胞必需與成骨細胞(骨成形性細胞)的互動，因而咸信可當做幹細胞分化成為骨形成性細胞的過程的間接性指標。又，茜素紅染色表示體外(in vitro)石灰化能，染色鈣的沉積。本發明者等所確認的是，顯示骨形成能的細胞為茜素紅陽性，在多數細胞喪失骨形成能的繼代培養多次後的細胞則為染色陰性。
如此，在本發明中，以比較簡易且明確的手法之藉由ALP活性評估、ALP指數、細胞增殖能判定，明確地選擇具有骨形成能者與不具有骨形成能者，對於這些評估不明確的群組則進行HLA-DR解析、TRAP染色、茜素紅染色，而防止將可充分期待骨形成能卻被判定為「無骨形成能」而遭廢棄。
根據本發明，可提供對於目的細胞的種類及功能因個體差異而難以一定的基準判斷的評估方法。又，在進行骨形成性細胞的評估時，對於培養細胞的骨形成能，幾乎可確實評估，可提供使用細胞的治療上必需的有關評估的方法。
以下說明本發明的合適的實施形態。以下以目的細胞為骨形成性細胞之情況為例進行說明。首先，對於本發明的骨形成性細胞的評估方法可有效應用於治療的顆粒型培養骨的製造方法，以第3圖加以說明。顆粒型培養骨，是經過骨髓液的採取、源於骨髓的間葉系幹細胞的培養、間葉系幹細胞的播種、分化誘導成為培養類成骨細胞的細胞而製造。
又，下面的步驟，是表示使用源於骨髓細胞的形態，但本發明的評估方法，對骨髓以外，從骨膜、脂肪、末梢血等分離培養，以同樣的方法分化誘導成為培養類成骨細胞的細胞所製作的顆粒型培養骨，也可合適使用。
．骨髓液的採取
骨髓液是在手術約一個月前採取。首先，在骨髓液採取部進行局部麻醉，由後上腸骨稜無菌地吸取而回收。
．源於骨髓之間葉系幹細胞的培養
以細胞培養用培養基稀釋4倍的骨髓液10播種於細胞培養用燒瓶12中，如第3圖(A)開始培養，在培養開始後第4天更換全部培養基。又，對於細胞培養用培養基，在1次培養、分化培養均可使用添加血清的αMEM或無血清培養基的任一者。
在培養過程中，在每次培養基更換時觀察確認無一般細菌及真菌的感染(有感染時培養基為混濁)，並在培養開始時、分化誘導前及培養類成骨細胞的細胞的回收時，以無菌試驗(是否滿足日本藥局方的基準)確認。
之後，每週更換全量培養基兩次。繼代的時間，是視細胞的狀態而判斷，在培養開始約21至28日後實施。繼代時計測活細胞數。
．間葉系幹細胞的播種
繼代如下述方式進行。將燒瓶中的培養基吸取後，以Dulbecco’s磷酸緩衝液(Dulbecco’s phosphate buffered saline,D-PBS)洗淨之後，將D-PBS吸取，加入細胞剝離劑，在37℃培養10分鐘。確認細胞剝離之後，加入D-PBS或培養基而回收細胞後離心。再懸浮於培養基 中而計測細胞數。計測後，在如第3圖(B)所示的預先放入多孔質模擬骨顆粒14的深底容器16中，放入所培養的骨髓液10。將骨髓液10放入於含有模擬骨顆粒14的深底容器16時，如第3圖(C)所示，骨髓液10及模擬骨顆粒14會浮在上面。
．分化誘導成培養類成骨細胞的細胞
在多孔質模擬骨顆粒14上播種細胞後靜置一夜，使細胞恢復功能。在1日之後，如第3圖(D)所示，參與骨形成的細胞等的細胞及多孔質模擬骨顆粒14沉在深底容器16的下部。確認此事後，將培養基更換為分化誘導培養基。分化誘導期間為1至3週，每週更換培養基2次左右。分化誘導進行，則如第3圖(E)所示，在模擬骨顆粒14周圍附著的培養類成骨細胞的細胞的形態起變化，分泌骨基質蛋白，長成一塊。
另一方面，為了與此過程平行評估而將細胞在12孔培養皿中播種。每孔播種細胞數為2×104 。
以下將本發明的骨形成性細胞的評估方法以第2圖的流程圖說明。如第2圖所示，骨形成性細胞要以1次判定基準、2次判定基準、3次判定基準做判定。又，第2圖的括弧內的比率是對原始細胞的比率。但這些比率是一例而已，並不受特別限定，會因所選擇的細胞而有不同。
[1次判定基準]
1次判定，是根據ALP活性、ALP指數、細胞增殖能而實施。在1次判定中，超過前述3種評估方法之任一基準值時，細胞被決定為1次判定基準(○)，所有基準值都不超過時，細胞被決定為1次判定基準(×)。
[2次判定基準]
2次判定基準也是與1次判定基準，根據ALP活性、ALP指數、細胞增殖能而實施。但如在下面所示，這些評估基準值是與1次判定不同。
1次判定基準(○)細胞在2次判定中，如在前述3種評估方法中超過全部基準值時，細胞被判定為骨形成(+)細胞，如有未超過任一基準值時，細胞被判定為骨形成(-)細胞。
1次判定基準(×)細胞在2次判定中，如滿足所有前述3種評估方法時，細胞被移送於3次判定基準，如有未超過任一基準值時，細胞被判定為骨形成(-)細胞。
[3次判定基準]
3次判定，是根據流式細胞術之表面抗原解析、TRAP染色、茜素紅染色而進行。
在3次判定基準中，有任一者為陽性時，細胞被判定為骨形成(+)細胞，全部為陰性時，細胞被判定為骨形成(-)細胞。
在本發明的骨形成性細胞的評估方法，是如此組合複數的判定基準而判定是否為骨形成(+)細胞。組合這些方法的重要性如下。
如前述，在以往的骨形成能的確認中，也使用ALP活性。但如第4圖所示，具有骨形成能的細胞的ALP活性的分布與不具有骨形成能的細胞接近，要設定明確的界線很困難。設定低則會有多量不具有骨形成能的細胞混入，設定高則會排除具有骨形成能的細胞。
實際上使用ALP活性為判定基準時，可考慮例如將顯示骨形成的細胞的ALP活性的平均值-2SD設定為界線。假設ALP活性值為常態分布時，實際上應可回收具有骨形成能細胞的95.45%，但查看第4圖，在其另一方面也有可能回收了不具有骨形成能的細胞的大部分。
又，也可考慮設定骨形成(+)細胞的下限值。但，查看第4圖，在骨形成(+)細胞的下限值以上，也有多數的不具有骨形成能的細胞存在。
如前述，由本發明者等報告ALP指數在骨形成能的判定上的有用性。但查看第5圖，具有骨形成能的細胞的ALP指數的分布與不具有骨形成能的細胞接近，要設定明確的界線有困難。
又，在以往的骨形成能的判定上沒有使用，但由本發明者等闡明細胞增殖能中尤其是在分化誘導時的增殖能與骨形成能有關係。但查看第6圖，具有骨形成能的細胞的細胞增殖能的分布與不具有骨形成能的細胞接近，要設定明確的界線有困難。
由以上所述，可知由以往所用的指標或其單純的組合，對於骨形成(+)細胞的恰當的判定有困難。
因此，本發明者等，由於上述判定方法中骨形成(+)細胞與骨形成(-)細胞的數據重疊部分多，所以在開始就設定只能回收骨形成(+)細胞的嚴格的基準(1次判定基準)。
但，由於在1次判定基準中沒有被選擇的部分含有多量骨形成(+)細胞，所以用2次判定基準及3次判定基準而加以彌補。
又，在滿足1次判定基準的細胞中，也有含少量骨形成(-)細胞的可能性。因此，對這些細胞也實施2次判定基準。
如此，本發明的骨形成性細胞的評估方法中，要實施1次判定至3次判定，而其結果所判定的骨形成(+)細胞，由本發明者等證明約為100%骨形成(+)細胞。
其次詳細說明1次判定及2次判定所用的基準。首先，詳細說明基準值、評估方法(ALP活性、ALP指數、細胞增殖能)。
在本發明中，將1次判定的基準值設定為骨形成(-)細胞的各(平均值+2SD)。此時，假設樣本的數據做常態分布時，誤將不具有骨形成能的細胞含入的或然率為(100-95.45)/2=2.275%。
又，2次判定的基準值設定為骨形成(+)細胞的各(平均值-2SD)或骨形成(+)細胞的各測定值的下限值。
上述的基準值可能因採取細胞的病患的母集團(性別、年齡、人種)而變化。亦即，基準值要選擇適合於病患的恰當的值為重要。因此以下所示的基準值，是由本發明者等所採取的病患的細胞所決定的，但並不受這些的限定。也可以由更多的數據，更嚴密地設定此數值。
又，以下所示2次判定的具體基準值，雖列舉以骨形成(+)細胞的各測定值為例，但使用骨形成(+)細胞的各(平均值-2SD)也可得到妥當的結果。
‧ALP活性
ALP活性的測定，可使用例如對硝基苯磷酸酯錠劑組(p-nitrophenylphosphate tablet set,Sigma-Aldrich公司製)與細胞計數套組的WST-8(同仁化學研究所公司製)。
下面，揭示以前述製品進行ALP活性測定時的測定方法。首先將WST-8溶液每孔加100μl。在二氧化碳培養箱中進行呈色反應1至4小時後，以微量盤判讀儀(microplate reader)測定吸光度。WST-8分析後，溶解萃取細胞膜蛋白，在該溶解液中加入對硝基苯磷酸酯溶液，在室溫靜置10分鐘後，以NaOH停止反應，測定對硝基酚(由ALP分解對硝基苯磷酸酯的產物)的吸光度。ALP活性是以每單位時間對硝基酚莫耳數/蛋白質的質量(μmol p-nitrophenol produced/min/μg protein)表示。也可用對硝基酚吸光度(OD；405nm)/WST-8吸光度(OD；450nm)表示。
第7圖顯示ALP活性測定結果之例。
骨形成(-)細胞的ALP活性平均值+2SD是2.31{對硝基酚吸光度(OD;405nm)/WST-8吸光度(OD;450nm)}。此值相當於166單位(μmol p-nitrophenol produced/min/μg protein)。因此，本發明者等將ALP活性的1次判定的基準值設定為約166單位(μmol p-nitrophenol produced/min/μg protein)。亦即，ALP活性的1次判定的基準值為166±5單位(μmol p-nitrophenol produced/min/μg protein)為恰當。
換算為每1個細胞的ALP活性的單位(μmol p-nitrophenol produced/min/μg protein)的換算公式，是由本發明者等所求出來的。
骨形成(+)細胞的ALP活性測定值的下限值是0.93{對硝基酚吸光度(OD；405nm)/WST-8吸光度(OD；450nm)}。此值相當於67單位(μmol p-nitrophenol produced/min/μg protein)。因此，本發明者等將ALP活性的2次判定的基準值設定為約67單位(μmol p-nitrophenol produced/min/μg protein)。即，ALP活性的2次判定的基準值為67±5單位(μmol p-nitrophenol produced/min/μg protein)為恰當。
．ALP指數
ALP指數，是分別測定添加分化誘導培養基的細胞(分化誘導群)與當做對照群而添加通常的培養基的細胞(非分化誘導群)的ALP活性，而以(分化誘導群的ALP活性/非分化誘導群的ALP活性)算出。
骨形成(-)細胞的ALP指數平均值+2SD為3.95。因此，本發明者等將ALP指數的1次判定的基準值設定為約 3.95。即，ALP指數的1次判定的基準值為3.95±0.15為恰當。
又，骨形成(+)細胞的ALP指數測定值的下限值為1.01。引此，本發明者等將ALP指數的2次判定的基準值設定為約1.01。即，ALP指數的2次判定的基準值為1.01±0.15為恰當。
．細胞增殖能
細胞增殖能，是可由培養前後的細胞數的比率，即以(分化誘導後的細胞數/初期播種細胞數)求得。實際上是由分化誘導期間終了後測定細胞數而得，但也可固定播種細胞數，而以(回收細胞數/播種細胞數)算出。此處，是將細胞增殖能定義為分化誘導期間的細胞增殖率。又，也可例如以前述細胞計數計套組(WST-8)的OD值之比做判定。亦即，進行前述的呈色反應後，測定在450nm的吸光度(OD值)，以分化誘導前的細胞數之WST-8的OD值相除而求得分化誘導中的細胞增殖率。又本發明的細胞增殖能判定可適用於1繼代至4繼代。
第8圖顯示細胞增殖能測定結果之例。
骨形成(-)細胞的增殖平均值+2SD為9.7。因此本發明者等將細胞增殖能的1次判定的基準值設定為約9.7。即，細胞增殖能的1次判定的基準值為9.7±0.3為恰當。
又，骨形成(+)細胞的增殖能測定值的下限值為5.6。因此本發明者等將細胞增殖能的2次判定的基準值設定為約5.6。亦即，細胞增殖能的2次判定的基準值為5.6±0.3為恰當。
其次詳細說明3次判定所用的基準、評估方法(流式細胞術之表面抗原(HLA-DR)解析、TRAP染色、茜素紅染色)。
在本發明中，3次判定的基準設定為表面抗原(HLA-DR)陽性細胞佔6%以上，TRAP陽性、茜素紅陽性。
‧以流式細胞術之表面抗原解析
6色流式細胞術分析可用既有的流式細胞儀，在此處使用的是FACS Aria流式細胞儀(BDIS公司製)。
抗體是使用了下述物質：異硫氰酸螢光素複合物(FITC-,fluorescein isothiocyanate complex)、藻紅蛋白複合物(PE-,phycoerythrin complex)、甲藻素葉綠素蛋白複合物(PerCP-Cy5.5-,peridinin chlorophyll protein complex)、別藻藍蛋白複合物(APC-,allophycocyanin complex)、Alexa Fluor 405複合物。
又，上述複合物之外，做為抗體也使用了抗HLA-ABC、HLA-DR、CD3、CD14、CD19、CD34、CD73、CD90、CD106、CD146、小鼠-IgG1k、小鼠-IgM的生物素化(biotinylated)抗體(均為BD Pharmingen公司製)、抗CD10及CD29的生物素化抗體(Dako公司製)、抗CD45的生物素化抗體(Invitrogen公司製)。也使用了將FITC以共價鍵結的CD105抗體(Immunotech公司製)。前述的生物素化抗體是以Streptavidin(鏈黴卵白素)-Pacific Blue(Invitrogen公司製)或Streptavidin-PerCP-Cy5.5(BD Pharmingen公司製)複合物檢測。
STRO-1抗體(R&D Systems公司製)是以PE-結合抗小鼠-IgM檢測。又，使用碘化丙啶(propidium iodide,同仁化學研究所公司製)於死細胞的檢測。
使用前述數十種類的抗體進行流式細胞術的表面抗原解析。本發明者等檢討的結果，發現源於骨髓的間葉系幹細胞中，雖使用相同手法培養，具有骨形成能的細胞有可獲得的時候或不可獲得的時候，在抗HLA-DR的抗體以外的抗體的表現上，有骨形成能的細胞與沒有的細胞間沒有差異出現。但唯有抗HLA-DR的抗體表現有顯著的差異。因此，在本發明中的表面抗原解析上的抗體，是使用抗HLA-DR的生物素化抗體。
下面揭示本發明使用恰當的抗HLA-DR的生物素化抗體時的表面抗原解析方法。繼代數0及3的細胞，是以胰酶-EDTA(Trypsin-EDTA)檢測，將1×106 細胞懸浮於50μl的冰冷磷酸緩衝生理食鹽水(PBS；日水製藥公司製)中。其次，細胞與抗HLA-DR的生物素化抗體在冰上培養20分鐘。之後，洗淨細胞，與streptavidin複合物在冰上培養20分鐘。最後，洗淨細胞，再懸浮於200μl的冰冷的PBS中，以prodidium iodide染色，以流式細胞儀分析。數據的分析是以FlowJo軟體(TreeStar公司製)進行。
第9圖表示流式細胞術之表面抗原解析結果。第9圖的X軸、Y軸表示對於不同的抗體(分別為HLA-DR及CD14)的反應。右下的數值是Y軸的抗體(CD14)陰性，X軸的抗體(HLA-DR)陽性的劃分部分。
如第9圖(A)所示，所測定的HLA-DR陽性細胞在6%以上時，可判定為含骨形成(+)細胞劃分部分。但，如第9圖(B)所示，所測定的HLAS-DR陽性細胞未達6%時，可判定為不含骨形成(+)細胞的可能性高的劃分部分。
這個HLA-DR陽性細胞的6%的下限值，是本發明者等由許多受驗者發現的經驗性決定值，但本發明並不受這個數據的限制。亦即，由更多試樣的數據、可將此數值更嚴密設定，這時，具體而言，可由形成骨的細胞的平均值減去2SD等的值，與未形成骨的細胞的平均值加上2SD等的值中，以較高值做為其近似值。
‧TRAP染色
TRAP染色是，例如，可使用固定液為含有50mM酒石酸緩衝液(pH 5.0,發色基質30mg/vial)的TRAP染色套件(和光純薬工業公司製)。下面揭示以前述TRAP染色套組時的TRAP染色評估方法。
首先，將D-PB在水浴中加溫，以α-MEM中含有10%血清、1%盤尼西林鏈黴素、1%兩性黴素B(amphotericin B)與地賽米松(dexamethasone)、β甘油磷酸酯、抗壞血酸的分化誘導培養基進行培養。
要得到更嚴密性時，在上述的培養基以外，使用Osteo Clast precursor Basal Medium M-CSF(-)、RANKL(-)、Osteo Clast precursor Basal Medium M-CSF(+)、RANKL(+)，而比較結果為理想。
其次將在培養中的96孔盤的培養基移除，每孔加250μl/well的D-PBS洗淨，移除D-PBS。其次每孔加TRAP染色套組的固定液50μl/well，固定5分鐘。5分鐘後，移除固定液，每孔加蒸餾水250μl/well而洗淨，移除蒸留水。以蒸餾水的洗淨重複3次。在移除第3次的蒸餾水之前，關調清淨台(clean bench)的電，在TRAP染色套組的發色基質加入50mM含有酒石酸的緩衝液5ml，以震盪混合器(voltex mixer)混合，調製發色基質。發色基質的調製後，移除蒸餾水而每孔加入發色基質100μl/well，在CO2 5%、37℃(濕度95%rH以上)培養1小時。培養後，移除發色基質，每孔加入蒸餾水250μl/well洗淨，移除蒸餾水。以蒸餾水的洗淨重複2次。洗淨後，每孔加入蒸餾水50μl/well在顯微鏡下檢視有無染色的細胞，進行細胞相片的拍攝。
如第10圖(A)所示，所測定的TRAP染色為陽性時，可判定為含有骨形成(+)細胞的劃分部分。
但，如第10圖(B)所示，所測定的TRAP染色為陰性時，則判定為不含骨形成(+)細胞的可能性高的劃分部分。
‧茜素紅染色
為了進行茜素紅染色，將細胞以2.0×104 /well的密度播種於12孔皿。隔日，更換為分化誘導培養基，之後每週更換培養基2次，進行分化誘導3週。
其次，將培養基吸取，將細胞以D-PBS洗淨2次。之後，以固定液(70%乙醇)在-20℃固定細胞1小時。將固定液吸取，以蒸餾水洗淨2次。
其次，加入茜素紅S溶液(40mM,pH 4.2)，在室溫進行染色10分鐘。pH以25%氨水調整。吸取染色液，將細胞以蒸餾水洗淨到非專一性染色完全消失為止。之後，進行拍攝巨視及顯微鏡照相。
第11圖顯示茜紅素染色結果。又，左側是沒有進行分化誘導的試樣(對照)，右側是進行分化誘導後的試樣。
如第11圖(A)所示，所測定的茜素紅染色為陽性時，可判定為含有骨形成(+)細胞的劃分部分。
但如第11圖所示，所測定的茜素紅染色為陰性時，則判定為不含骨形成(+)細胞的可能性高的劃分部分。
在本發明的培養細胞的評估方法中，設定複數的檢查值、或對指標的適應順序、設定判定基礎之後，將其流程化，而不論有無經驗均可以高精度判定細胞的骨形成能為恰當。特別是含有至少3種以上的檢查值、指標，由其組合而能以統計學上的根據，以高精度預測、判定細胞的功能為恰當。在本發明中，對於有差異性的人細胞進行複數的檢查、指標流程化而評估，使差異的影響可以改善至在臨床上不會有問題的程度。
又，在本發明的培養細胞的評估方法中，對於個別的檢查值，雖可包含在適應範圍內的試樣，也由參照其他指標而會有判定為非目的細胞的情況。
10．．．骨髓液
12．．．細胞培養用燒瓶
14．．．多孔質模擬骨顆粒
16．．．深底容器
第1圖為骨形成能檢查排程。
第2圖為本發明的骨形成性細胞的評估方法的流程示意圖。
第3圖(A)至(E)為本發明恰當適用的骨形成性細胞的培養步驟、分化誘導步驟的說明圖。
第4圖為人培養類成骨細胞的細胞的ALP活性的分布圖。
第5圖為人培養類成骨細胞的細胞的ALP指數的分布圖。
第6圖為人培養類成骨細胞的細胞的增殖能的分布圖。
第7圖為ALP活性測定結果。
第8圖為細胞增殖能測定結果。
第9圖(A)及(B)為流式細胞術之表面抗原解析結果。
第10圖(A)及(B)為TRAP染色測定結果。
第11圖(A)及(B)為茜素紅染色結果。
無元件符號說明

Claims (7)

  1. 一種經培養的骨形成性細胞的評估方法，其特徵為：在具有1次判定基準、2次判定基準、3次判定基準的培養細胞的評估方法中，經過1次判定的細胞，再進行2次判定而判定骨形成(+)細胞，難於判定是否為骨形成(+)細胞的細胞，則再進行3次判定而判定骨形成(+)細胞，其中，前述1次判定中，判定基準為是否滿足ALP活性(鹼性磷酸酯酶活性)、ALP指數(分化誘導群的ALP活性/非分化誘導群的ALP活性)、細胞增殖能(分化誘導後的細胞數/初期播種細胞數)之任一者1次判定基準值以上，且各基準值為骨形成(-)細胞之各(平均值+2SD)；前述2次判定中，判定基準為是否滿足ALP活性、ALP指數、細胞增殖能全部在2次判定基準以上，且各基準值為骨形成(+)細胞之各(平均值-2SD)或骨形成(+)細胞的各測定值的下限值，而將滿足1次判定、2次判定兩基準的細胞判定為骨形成(+)細胞，在1次判定中未滿足基準，但在2次判定中滿足基準的細胞則移到3次判定，在2次判定中未滿足基準的細胞則判定為骨形成(-)細胞； 前述3次判定中，判定基準為是否滿足流式細胞術之表面抗原(HLA-DR)解析、TRAP染色、茜素紅染色的任一基準，而將滿足此基準的細胞判定為骨形成(+)細胞，未滿足的細胞判定為骨形成(-)細胞，且表面抗原(HLA-DR)解析的基準為，所測定的HLA-DR陽性細胞在約6%以上。
  2. 一種經培養的骨形成性細胞的評估方法，其特徵為：在申請專利範圍第1項所記載的1次判定中，ALP活性的基準值為約166單位(μmol p-nitrophenol production/min/μg protein)。
  3. 一種經培養的骨形成性細胞的評估方法，其特徵為：在申請專利範圍第1項所記載的1次判定中，ALP指數的基準值為約3.95。
  4. 一種經培養的骨形成性細胞的評估方法，其特徵為：在申請專利範圍第1項所記載的1次判定中，細胞增殖能的基準值為約9.7。
  5. 一種經培養的骨形成性細胞的評估方法，其特徵為：在申請專利範圍第1項所記載的2次判定中，ALP活性的基準值為約67單位(μmol p-nitrophenol production/min/μg protein)。
  6. 一種經培養的骨形成性細胞的評估方法，其特徵為：在申請專利範圍第1項所記載的2次判定中，ALP指數的基準值為約1.01。
  7. 一種經培養的骨形成性細胞的評估方法，其特徵為： 在申請專利範圍第1項所記載的2次判定中，細胞增殖能的基準值為約5.6。
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