JP2020173265A - 間葉系幹細胞調製物の純度を評価するための方法。 - Google Patents
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Abstract
Description
SDF−1αの発現レベルが最大で100pg/ml、好ましくは最大で50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1pg/ml、である;および/または
VEGFの発現レベルが細胞培養培地中で少なくとも200pg/ml、好ましくは少なくとも250、260、270、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289または290pg/ml、である
場合に実質的に純粋であり、ここで前記細胞調製物は、発現レベルの測定の前に低酸素条件(好ましくは約0.1%のO2)および高濃度のグルコース(好ましくは約4.5g/lのグルコース)で培養される。
SDF−1αの発現レベルが最大で100pg/ml、好ましくは最大で50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1pg/ml、である;および/または
VEGFの発現レベルが細胞培養培地中で少なくとも90pg/ml、好ましくは少なくとも95、100、105、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119または120pg/ml、である
場合に実質的に純粋であり、ここで前記細胞調製物は、発現レベルの測定の前に組織酸素分圧(好ましくは約5%のO2)および高濃度のグルコース(好ましくは約4.5g/lのグルコース)で培養される。
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
本発明は、間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞調製物(例えば、MSCを含む細胞の組成物)の純度を評価、判断および/またはモニタリングするための方法(好ましくはインビトロの方法)に関し、ここで前記方法は、前記細胞調製物によって発現される少なくとも1種の増殖因子の発現レベルを決定または測定することを含む。一実施形態において、MSCは、脂肪細胞由来間葉系幹細胞(ASC)である。
(a)間葉系幹細胞を含む細胞調製物を培養する工程、
(b)必要に応じて培養条件を変更する工程、および
(c)少なくとも1種の増殖因子(好ましくはSDF−1αおよび/またはVEGF)の発現レベルを定量化する工程。
(a)間葉系幹細胞(好ましくは脂肪幹細胞)を含む細胞調製物を培養する工程、
(b)必要に応じて培養条件(好ましくはO2分圧)を変更する工程、および
(c)SDF−1αおよび/またはVEGFの発現レベルを定量化する工程。
(a)間葉系幹細胞(好ましくは脂肪幹細胞)を含む細胞調製物を培養する工程、
(b)必要に応じて培養条件(好ましくはO2分圧)を変更する工程、および
(c)SDF−1αの発現レベルを定量化する工程。
(a)間葉系幹細胞(好ましくは脂肪幹細胞)を含む細胞調製物を培養する工程、
(b)必要に応じて培養条件(好ましくはO2分圧)を変更する工程、および
(c)SDF−1αおよびVEGFの発現レベルを定量化する工程。
最大で50pg/ml、好ましくは最大で40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1pg/ml、というSDF−1αの発現レベル;および
少なくとも200pg/ml、好ましくは少なくとも250、260、270、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289または290pg/ml、というVEGFの発現レベル
を提示する場合に実質的に純粋である。
最大で50pg/ml、好ましくは最大で40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1pg/ml、というSDF−1αの発現レベル;および
少なくとも90pg/ml、好ましくは少なくとも95、100、105、110、111、112、113、114、115、116、117、188、119または120pg/ml、というVEGFの発現レベル
を提示する場合に実質的に純粋である。
最大で100pg/ml、好ましくは最大で50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1pg/ml、というSDF−1αの発現レベル;および
少なくとも160pg/ml、好ましくは少なくとも161、162、163、164、165、166、167、168または169pg/ml、より好ましくは少なくとも170pg/ml、というVEGFの発現レベル
を提示する場合に実質的に純粋である。
(a)間葉系幹細胞を含む細胞調製物を培養する工程、
(b)必要に応じて培養条件を変更する工程、および
(c)細胞培養上清中の少なくとも1種の増殖因子(好ましくはSDF−1αおよび/またはVEGF)の分泌を定量化する工程。
(a)間葉系幹細胞(好ましくは脂肪幹細胞)を含む細胞調製物を培養する工程、
(b)必要に応じて培養条件(好ましくはO2分圧)を変更する工程、および
(c)細胞培養上清中のSDF−1αおよび/またはVEGFの分泌を定量化する工程。
(a)間葉系幹細胞(好ましくは脂肪幹細胞)を含む細胞調製物を培養する工程、
(b)必要に応じて培養条件(好ましくはO2分圧)を変更する工程、および
(c)細胞培養上清中のSDF−1αの分泌を定量化する工程。
(a)間葉系幹細胞(好ましくは脂肪幹細胞)を含む細胞調製物を培養する工程、
(b)必要に応じて培養条件(好ましくはO2分圧)を変更する工程、および
(c)細胞培養上清中のSDF−1αおよびVEGFの分泌を定量化する工程。
(a)間葉系幹細胞を含む細胞調製物を培養する工程、
(b)必要に応じて培養条件を変更する工程、
(c)少なくとも1種の増殖因子(好ましくはSDF−1αおよび/またはVEGF)の発現を定量化する工程、および
(d)工程(c)で測定された発現レベルを参照発現レベルと比較する工程。
(a)間葉系幹細胞(好ましくは脂肪幹細胞)を含む細胞調製物を培養する工程、
(b)必要に応じて培養条件(好ましくはO2分圧)を変更する工程、
(c)SDF−1αおよび/またはVEGFの発現レベルを定量化する工程、および
(d)工程(c)で測定された発現レベルを、MSCと同じ条件で培養された参照用細胞集団のSDF−1αおよび/またはVEGFの発現レベルと比較する工程。
(a)間葉系幹細胞(好ましくは脂肪幹細胞)を含む細胞調製物を培養する工程、
(b)必要に応じて培養条件(好ましくはO2分圧)を変更する工程、
(c)SDF−1αおよびVEGFの発現レベルを定量化する工程、および
(d)工程(c)で測定された発現レベルを、MSCと同じ条件で培養された参照用細胞集団のSDF−1αおよびVEGFの発現レベルと比較する工程。
材料および方法
この研究は、ベルギー保健省のガイドラインに従って実施された。全ての手順は、組織の調達および臨床研究に関してthe Ethical Committee of the Medical Faculty(Universite Catholique de Louvain)により承認された(B40320108280)。別段の記載がない限り、材料は全て、Lonza(Verviers、スイス)、Sigma−Aldrich(St.Louis,MO,USA)またはInvitrogen(Carlsbad,CA,USA)から入手した。
インフォームドコンセントおよび血清学的スクリーニングの後に、待機的美容整形手術を受けている8人の患者(表1)においてヒトの脂肪(平均:7.4g)および真皮(平均:1.5cm2)の組織を、それぞれ、Coleman技術を用いた脂肪吸引、および皮膚生検により、まとめて採取した。脂肪組織および皮膚のサンプルは、脂肪由来幹細胞(ASC)および皮膚線維芽細胞(DF)の単離の前に4℃にて最長で60分間、無菌状態で維持した。
継代4において、蛍光活性化細胞選別(FACScan;BD Biosciences,San Jose,CA)によって標準的な細胞表面マーカー(CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、stro−1、CD106、CD146、CD166、CD19、CD31、CD11b、CD79α、CD13、HLA−DR、CD14、CD34)[Dominici et al.,Cytotherapy.2006;8(4):315−317;Bourin et al.,Cytotherapy.2013;15:641−648]についてASCおよびDFを特徴付けした。
骨形成系統への分化能力を評価するために、継代4で特定の培地においてASCおよびDFを試験した。細胞を特定の分化培地(デキサメタゾン(1μM)、アスコルビン酸ナトリウム(50μg/ml)およびジヒドロリン酸ナトリウム(36mg/ml)を補充した増殖培地)[Qu et al.,In Vitro Cell Dev Biol Anim.2007;43:95−100]において3週間培養した後、アリザリンレッド染色によって分化を評価した。骨形成分化は、ホルマリン固定の後にリン酸カルシウムをアリザリンレッドで染色することによって確認した。さらに、骨の表現型を確認するためにオステオカルシンの免疫組織化学を実施した。
細胞の増殖能力は、Click−iT(登録商標) EdU Alexa Fluor(登録商標) 488 Flow Cytometry Assay Kit(Life Technology,Waltham,MA,USA)を用いた5−エチニル−2’−デオキシウリジンの組み込みによる直接的なDNA合成の測定によって試験した。21.5cm2の培養皿に5000細胞/cm2の密度でASC(n=3)およびDF(n=3)を播種し、10%FBS、21%O2で24時間培養した。次いで、増殖培地を、FBSを含まない増殖培地で24時間置き換えることによって細胞の増殖を停止させた。最後に、特定の条件(1%FBSまたは5%FBSを補充した増殖培地において0.1%O2、5%O2および21%O2)下に細胞を48時間置き、EdU(5−エチニル−2’−デオキシウリジン;チミジンのヌクレオシド類似体であり、活性状態のDNA合成中にDNAに組み込まれる)を添加した。Alexa Fluor(登録商標) 488での顕色の後、フローサイトメトリー(FACScan;BD Biosciences,San Jose,CA)によって陽性細胞を計数した。
トリプシン処理の後、細胞(継代3の後)を計数して5段階の希釈物(100%ASC+0%DF;75%ASC+25%DF;50%ASC+50%DF;25%ASC+75%DF;および0%ASC+100%DF)を取得し、高度に低酸素の環境および組織酸素分圧にそれぞれ相当する0.1%O2および5%O2での低酸素チャンバー(Modular Incubator Chamber MIC−101;Billups−Rothenberg,Del Mar,CA,USA)内におけるインキュベーションのために、細胞が約80%〜95%のコンフルエンスをもたらす密度となるように12ウェル培養プレートに3連で播種した。(各希釈物および各酸素分圧について)細胞を正常血糖(1g/L)または高血糖(4.5g/L)の増殖培地に曝露させた。これらの制御された条件において24時間インキュベーションした後、細胞培養上清を個別に回収し、酵素結合免疫吸着測定法による、さらなる増殖因子の定量化(VEGF、HGF、IGF−1、SDF−1αおよび塩基性FGF;Quantikine ELISA kit(R&D System,Minneapolis,MN,USA)による)のために−20℃で保存した。3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム溶液(MTS;Promega,Leiden、オランダ)アッセイによって、低酸素ストレスの直後に細胞の生存能を評価した。低酸素/血糖ストレス試験および増殖因子の定量化は、それぞれ3連および2連で実施した。結果は、ミリメートルあたりのピコグラムで表される。
1標本コルモゴロフ検定およびQ−Qプロットを用いて値の正規分布を評価した。(正規分布を有する)群同士の間の統計学的に有意な差は、対応t検定、およびボンフェローニ事後検定を用いた一元配置分散分析によって試験した。統計検定は、PASW 18(SPSS;IBM,New York,NY,USA)を用いて実施した;p<0.05を有意とみなした。
表面マーカーのプロファイルは、2種の細胞集団の間の区別を可能にしない(表2)。
Claims (14)
- 間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞調製物の純度を評価、判断および/またはモニタリングするためのインビトロの方法であって、前記方法は、前記細胞調製物によって発現される少なくとも1種の増殖因子の発現レベルを測定することを含み、前記少なくとも1種の増殖因子はSDF−1αおよび/またはVEGFである、方法。
- 前記方法が、測定された発現レベルを参照発現レベルと比較することをさらに含む、請求項1に記載のインビトロの方法。
- 前記間葉系幹細胞が、脂肪組織、骨髄、臍帯血、羊水、ワルトン膠質、胎盤、末梢血、ファロピウス管、角膜実質、肺、筋肉および胎仔肝臓を含む群から選択される組織から単離される、請求項1または2のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
- 前記間葉系幹細胞が脂肪幹細胞(ASC)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
- 前記発現レベルが、タンパク質レベルで評価され、好ましくは、細胞培養上清中に分泌された前記少なくとも1種の増殖因子の検出および/または定量化によって評価される、請求項1〜4のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
- 前記発現レベルが、RNAレベルで評価され、好ましくは、RT−PCR、RT−qPCR、ノーザンブロットおよび/またはハイブリダイゼーション技術によって評価される、請求項1〜4のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
- 前記細胞調製物は、SDF−1αの発現レベルが最大で100pg/ml、好ましくは最大で50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1pg/ml、である場合に実質的に純粋である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
- 前記細胞調製物は、
SDF−1αの発現レベルが最大で100pg/ml、好ましくは最大で50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1pg/ml、である;および/または
VEGFの発現レベルが細胞培養培地中で少なくとも200pg/ml、好ましくは少なくとも250、260、270、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289または290pg/ml、である
場合に実質的に純粋であり、
前記細胞調製物は、発現レベルの測定の前に低酸素条件、好ましくは約0.1%のO2、および高濃度のグルコース、好ましくは約4.5g/lのグルコース、で培養される、
請求項1〜7のいずれか1項に記載のインビトロの方法。 - 前記細胞調製物は、
SDF−1αの発現レベルが最大で100pg/ml、好ましくは最大で50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1pg/ml、である;および/または
VEGFの発現レベルが細胞培養培地中で少なくとも90pg/ml、好ましくは少なくとも95、100、105、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119または120pg/ml、である
場合に実質的に純粋であり、
前記細胞調製物は、発現レベルの測定の前に組織酸素分圧、好ましくは約5%のO2、および高濃度のグルコース、好ましくは約4.5g/lのグルコース、で培養される、
請求項1〜7のいずれか1項に記載のインビトロの方法。 - 前記方法は、間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞調製物の品質または純度を評価するためのものであり、
前記MSCを含む細胞調製物は、再生医療においてMSCを利用した細胞治療用製品として使用されることになる、
請求項1〜9のいずれか1項に記載のインビトロの方法。 - 間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞調製物、特に再生医療においてMSCを利用した細胞治療用製品として使用されることになるMSCを含む細胞調製物、の品質のバイオマーカーとしての増殖因子、好ましくはSDF−1αおよび/またはVEGF、の使用。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のインビトロの方法によって識別された細胞集団。
- 実質的に純粋な間葉系幹細胞集団、好ましくは脂肪幹細胞集団、であって、
前記細胞調製物は、SDF−1αの発現レベルが最大で100pg/ml、好ましくは最大で50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1pg/ml、である場合に実質的に純粋である、
細胞集団。 - 請求項1〜10のいずれか1項に記載のインビトロの方法を実施するためのキットであって、
前記キットは、少なくとも1種の増殖因子の発現レベルを決定または測定するための手段を含み、任意選択で、前記少なくとも1種の増殖因子の発現レベルと比較するための参照をさらに含んでもよい、
キット。
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