PL241520B1 - Zastosowanie panelu genów do określania potencjału teratogennego komórek mezenchymalnych i pochodzenia perinatalnego - Google Patents

Zastosowanie panelu genów do określania potencjału teratogennego komórek mezenchymalnych i pochodzenia perinatalnego Download PDF

Info

Publication number
PL241520B1
PL241520B1 PL433374A PL43337420A PL241520B1 PL 241520 B1 PL241520 B1 PL 241520B1 PL 433374 A PL433374 A PL 433374A PL 43337420 A PL43337420 A PL 43337420A PL 241520 B1 PL241520 B1 PL 241520B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
msc
cells
genes
mesenchymal
expression
Prior art date
Application number
PL433374A
Other languages
English (en)
Other versions
PL433374A1 (pl
Inventor
Tomasz OŁDAK
Tomasz Ołdak
Tomasz KOLANOWSKI
Tomasz Kolanowski
Igor STEPANIEC
Igor Stepaniec
Original Assignee
Polski Bank Komorek Macierzystych Spolka Akcyjna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Polski Bank Komorek Macierzystych Spolka Akcyjna filed Critical Polski Bank Komorek Macierzystych Spolka Akcyjna
Priority to PL433374A priority Critical patent/PL241520B1/pl
Priority to PCT/IB2021/052521 priority patent/WO2021191853A1/en
Priority to EP21726182.5A priority patent/EP4127239A1/en
Publication of PL433374A1 publication Critical patent/PL433374A1/pl
Publication of PL241520B1 publication Critical patent/PL241520B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/142—Toxicological screening, e.g. expression profiles which identify toxicity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest zestaw genów zawierający co najmniej jeden panel genów wybrany z: CDKN2A, CDH20, HAND2, PDGFR-a; lub ALOX15, CDH9, DRD4, ESM1, HEY1, NKX2-5; lub FUT3, PROM1, COL2A1, FOXA1, MYO3B; lub CLDN1, CPLX2, EOMES, FOXA2, HNF1B, HNF4A, LEFTY1, POU4F1; lub TDGF1, DNMT3B, IDO1, NANOG POUF5F1, SOX2; do zastosowania przy określaniu potencjału teratogennego populacji komórek mezenchymalnych (MSC) lub populacje komórek perinatalnych.

Description

PL 241 520 B1
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy zastosowania panelu genów do określania potencjału teratogennego komórek mezenchymalnych i pochodzenia perinatalnego. Konkretniej, wynalazek dotyczy zastosowania genów do określenia potencjału komórek mezenchymalnych i pochodzenia perinatalnego do transformacji w komórki nowotworowej, w celu zwiększenia bezpieczeństwa preparatów opartych na komórkach mezenchymalnych i pochodzenia perinatalnego.
Komórki mezenchymalne (ang. mesenchymal stem cells - MSC lub mesenchymal stromal cells) są multipotencjalnymi, komórkami niehematopoetycznymi obecnymi w wielu tkankach organizmu, zdolnymi do samoodnowy i mającymi możliwość przekształcenia się w różnorodne typy dojrzałych komórek, między innymi w komórki tłuszczowe, kostne, chrzęstne, mięśniowe czy też nerwowe. Istnieje wiele źródeł, z których można wyizolować MSC: szpik kostny, tkanka tłuszczowa, płyn maziowy, opona twarda, skóra, a także z tkanek prenatalnych jak: galareta Whartona, krew pępowinowa czy też łożysko i błony płodowe. Pomimo szerokiego spektrum obecności tych komórek w organizmach, ze względów użytkowych, do potencjalnych zastosowań w terapiach klinicznych aktualnie wykorzystywane są przede wszystkim komórki pochodzące z tkanek płodowych (przede wszystkim galarety Whartona i krwi pępowinowej), ze szpiku kostnego oraz tkanki tłuszczowej. Odkryto jednak, że poszczególne populacje nieznacznie się od siebie różnią co jest wynikiem wpływu mikrośrodowiska, z którego je pozyskano. W badaniach naukowych i klinicznych, najczęściej stosowanymi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi są te pochodzące ze szpiku, tkanki tłuszczowej i galarety Whartona. Z perspektywy zastosowania, najkorzystniejsze wydają się być MSC pozyskane z galarety Whartona, ponieważ ilość uzyskiwanych komórek z galarety Whartona przewyższa inne rezerwuary komórek macierzystych w dorosłym organizmie przy jednoczesnym braku jakiejkolwiek inwazyjności samego zabiegu (produkt pozyskiwany jest zasadniczo z odpadu medycznego jakim jest sznur pępowinowy), jak i uzyskiwaniu stosunkowo homogennej frakcji komórek macierzystych. Wykorzystanie komórek ze sznura pępowiny jest też znacznie bardziej akceptowalne etycznie w porównaniu np. z embrionalnymi komórkami macierzystymi.
Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie terapii komórkowej, inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej opisują MSC jako potencjalne produkty biologiczne właśnie ze względu na ich zdolność do samoodnowy i różnicowania. MSC mają dobrze udokumentowane właściwości immunomodulacyjne i regeneracyjne, co nadaje im silny potencjał terapeutyczny. Już teraz MSC są szeroko stosowane w terapiach. Komercyjnie dostępnymi preparatami leczniczymi opartymi na komórkach macierzystych są aktualnie: cartistem (allogeniczne komórki MSC zarejestrowane w EU w leczeniu zwyrodnienia stawów), prochymal (allogeniczne komórki MSC ze szpiku zarejestrowane w Japonii, Nowej Zelandii i Kanadzie w leczeniu GvHD), darvadstrocel (allogeniczne komórki z tkanki tłuszczowej zarejestrowane m.in. w EU w leczeniu przetok okołoodbytniczych). Nie można tutaj także zapomnieć o standardowych, od 1989 roku w Polsce, terapiach z wykorzystaniem krwiotwórczych komórek macierzystych w hematologii, leczenia ciężko gojących się ran i oparzeń czy przeszczepie komórek macierzystych rąbka rogówki. Dodatkowo prowadzone są setki badań klinicznych (263, dane na podstawie clinicaltrails.gov) wykorzystujących MSC w terapiach eksperymentalnych.
W związku z głębokim zainteresowaniem ich potencjalnymi zastosowaniami w wielu dziedzinach medycyny, komórki MSC są szeroko badane w celu oceny zarówno ich żywotności, skuteczności jak i bezpieczeństwa. Nieliczne, choć szeroko komentowane doniesienia nt. potencjalnego działania teratogennego MSC (które w większości okazały się błędne i podyktowane zakażeniami krzyżowymi hodowanymi w sąsiedztwie liniami nowotworowymi) doprowadziły do standaryzacji sposobów oceny populacji MSC, które mają być zastosowane we wspomnianych terapiach.
Czystość podawanych populacji MSC jest kluczowe dla pacjenta. Obecnie stosuje się standardowo zestaw podstawowych sposobów dotyczących rozpoznawania komórek MSC ustalonych w 2006 roku przez ISCT (Horwitz E. i wsp., „Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.”; Cytotherapy. 2006; 8(4): 315-7.) opartych w dużej mierze o kryterium analizy markerów powierzchniowych, ocenie morfologii, różnicowania i zdolności komórek MSC do przytwierdzania się do płaskich powierzchni szklanych i plastikowych. Są to jednak techniki o ograniczonej specyficzności, gwarantujące jedynie zgrubną ocenę populacji.
Ocena MSC względem morfologii i zdolności do przytwierdzania do powierzchni plastikowych jest sposobem nieprecyzyjnym, bowiem wyizolowano dziesiątki różnych linii komórkowych, które posiadają tą samą zdolność. Z drugiej strony, sposób badania różnicowania komórek jest czasochłonny. Czas
PL 241 520 B1 potrzebny na prawidłową ocenę multipotencji wymaga według procedur przynajmniej trzech tygodni samych hodowli. Proponowany sposób molekularny zajmuje mniej niż 5% tego czasu.
Ocena markerów powierzchniowych CD jako najbardziej dokładny z zaproponowanych sposobów stanowi precyzyjny sposób oznaczenia komórek MSC, lecz w praktyce nie jest wolny od wad. Przede wszystkim, bazuje ona na odczycie markerów powierzchniowych. W związku z czym, w zależności od czasu hodowli, metodologii i czasu odklejania komórek od powierzchni oraz agresywności wykorzystanych w tym celu odczynników, wyniki między kolejnymi eksperymentami mogą być różne. Wynika to z podatności komórek na uszkodzenia błony komórkowej i idącej za tym zniszczeniem konformacji analizowanych białek powierzchniowych.
Badania ekspresji genów wewnątrzjądrowych i komórkowych w ramach proponowanych zagadnień molekularnych wolne są w dużej mierze od omawianego problemu jako, że warunki odklejania nie wpływają na zmianę ekspresji genów. Ponadto, badania ekspresji charakteryzują się znacznie wyższą dokładnością wyników (kilkaset razy), m.in. również dzięki wybranym genom, wytypowanym ze względu na ich jakościowe (selekcja negatywna bądź pozytywna) lub wybitnie odmienne ilościowe różnice ekspresji. Dodatkowo, w badaniach molekularnych nie występuje czynnik zależności od wykorzystanych fluorochromów sprzężonych z tymi samymi przeciwciałami, wprowadzający dodatkowe zaburzenia i obniżenie czułości testów cytometrycznych. Ponadto, różnice wynikają z różnic funkcjonalnych między badanymi genami - w przypadku markerów powierzchniowych badamy jedynie zewnętrzną powłokę, przybliżoną wypadkową mechanizmów mających miejsce wewnątrz komórki. W przypadku analiz molekularnych badaniu poddawany jest dowolny gen, często czynnik transkrypcyjny działający na początku ścieżki sygnałowej, stąd badanie nawet pod względem biologicznym jest bardziej czułe i umożliwia szybszą analizę zmian zanim jeszcze zaistnieją (jeśli w ogóle) na błonie komórkowej.
Dodatkowo, sposoby cytometryczne i ustawienia urządzeń między kolejnymi pomiarami są w znacznie większym stopniu podatne na rozbieżności jakościowe wpływające na wyniki ostateczne w stosunku do badań z wykorzystaniem RT-PCR, co wraz z wpływem hodowli i różnicami międzyosobniczymi zdecydowanie świadczy na korzyść sugerowanego sposobu molekularnego.
Podsumowując, RT-PCR zapewnia powtarzalne i stabilne dane ze względu na wykorzystanie referencji i wyników w formie relatywnej ekspresji badanych genów.
Twórcy dodatkowo wnoszą na podstawie udokumentowanych przez liczne grupy badawcze daleko idące podobieństwo między populacjami komórek MSC pochodzącymi z różnych części sznura pępowiny [Nagamura-Inoue, T., & He, H. (2014); Mennan et al. (2013)] jak i z innych tkanek perinatalnych (łożysko, błony płodowe, kosmki Villego) [Bieback, K., & Brinkmann, I. (2010); Kwon, A. et al. (2016). Zbadane podobieństwa występują zarówno na poziomie morfologicznym, fenotypowym (w tym obecność charakterystycznych markerów powierzchniowych) [Wu, M., (2018); Schmelzer, E. et al. (2019), jak i molekularnym. W związku z czym twórcy wychodzą z hipotezą, jakoby stworzona seria paneli mogłaby być z powodzeniem wykorzystywana przy analizie molekularnej komórek MSC pochodzących również z innych tkanek perinatalnych. Dotychczas zebrane informacje naukowe na ten temat wskazują jedynie na różnice osobnicze między wskazanymi populacjami oraz różnice nie wpływające na ich ogólną charakterystykę. Co ważne nie dotyczą one tak istotnych dla parametrów jak na przykład poziom ekspresji genów odpowiadających za pluripotencję [Heo, J. (2016)], czy sugerowanych markerów linii MSC.
W związku z brakiem metody molekularnej, służącej do charakterystyki populacji komórek MSC, istnieje silna potrzeba rynkowa stworzenia nowych narzędzi diagnostycznych, które są bardziej czułe i mniej kosztowne. Niniejszy wynalazek wychodzi naprzeciw tym oczekiwaniom. W stworzonym przez twórców panelu odróżniającym komórki MSC i pochodzenia perinatalnego od innych linii, dzięki oparciu się na sposobach stricte molekularnych i bazujących na ekspresji genów wewnątrzkomórkowych możliwa jest, pod pewnymi warunkami, całkowita rezygnacja z odwoływania się do standardowo stosowanych w tym celu paneli markerów zaaprobowanych przez ISCT. Opracowany przez twórców protokół z powodzeniem może być wykorzystywany celem dyferencjacji profilu ekspresji na poziomie molekularnym linii MSC pochodzenia perinatalnego (zarówno dzięki pozytywnej jak i negatywnej selekcji) od ludzkich komórek pluripotencjalnych (hIPSC), bądź wybranych linii nowotworowych z 3 różnych listków zarodkowych.
Przedmiotem wynalazku jest zestaw genów zawierający co najmniej jeden panel genów wybrany z: CDKN2A, CDH20, HAND2, PDGFR-a; lub ALOX15, CDH9, DRD4, ESM1, HEY1, NKX2-5; lub FUT3, PROM1, COL2A1, FOXA1, MYO3B; lub CLDN1, CPLX2, EOMES, FOXA2, HNF1B, HNF4A, LEFTY1, POU4F1; lub TDGF1, DNMT3B, IDO1, NANOG, POUF5F1, SOX2; do zastosowania przy określaniu
PL 241 520 Β1 potencjału pluripotencjalnego oraz teratogennego populacji komórek mezenchymalnych (MSC) lub populacji komórek perinatalnych.
Korzystnie ekspresja względna genów jest taka jak zdefiniowano w tabeli 1 poniżej.
Tabela 1
Panel MSC
Komórki mezenchymalne
Średnia Limit górny Limit dolny
CDKN2A 0,276782 0,74693193 -0,1933675
CDH20 0,00000133 0,59520569 -0,59520303
HAND2 0,00000067 0,93083439 -0,93083305
PDGFR-a 0,00000033 0,56526711 0,56526645
Panel mezodermalny
Komórki mezenchymalne
Średnia Limit górny Limit dolny
ALOX15 -13,2877 -13,2877 -13,2877
CDH9 -13,2877 -13,2877 -13,2877
DRD4 -4,830933333 -1,496046487 -8,16582018
ESM1 -10,22175333 -4,125969491 -16,31753718
HEY1 -5,921546667 -2,539275723 -9,30381761
ΝΚΧ2-5 -13,2877 -13,2877 -13,2877
Panel ektodcrmalny
Komórki mezenchymalne
Średnia Limit górny Limit dolny
FUT3 -8,5153394 -7,32877344 -9,70190536
PROM1 -10,56369137 -9,517693915 -11,60968882
COL2A1 -6,679386333 -4,23336814 -9,125404527
FOXA1 -13,287704 -13,28768679 -13,28772121
MYO3B -8,469624967 -3,212540439 -13,72670949
Panel endodermalny
Komórki mezenchymalne
Średnia Limit górny Limit dolny
CLDN1 -6,3507995 -5,851336008 -6,850262992
CPLX2 -11,27073493 -2,592381331 -19,94908854
EOMES -6,882221067 -5,895937843 -7,86850429
FOXA2 -12,25855397 7,830469301 16,68663863
HNF1B -13,16153773 -12,61867864 -13,70439683
HNF4A -12,75938743 -10,48621525 -15,03255962
LEFTY1 -5,762675093 -2,538457374 -8,986892812
POU4F1 -8,737085767 -7,245232249 -10,22893928
Panel pluripotencji
Komórki mezenchymalne
Średnia Limit górny Limit dolny
TDGF1 -13,2877 -13,2877 -13,2877
DNMT3B -10,08215333 -8,793605964 -11,3707007
IDO1 -12,95436667 -11,52014909 -14,38858424
NANOG -11,04686 -8,720450358 -13,37326964
POU5F1 -11,4947 -10,14265513 -12,84674487
SOX2 -13,24186667 -13,04466175 -13,43907158
PL 241 520 B1
Korzystnie komórki mezenchymalne pochodzą ze sznura pępowinowego, ze szpiku kostnego lub tkanek tłuszczowych, korzystniej komórki mezenchymalne pochodzą z Galarety Whartona.
Korzystnie geny CDKN2A, CDH20, HAND2, PDGFR-a, stanowią podzestaw genów wskazujący charakterystyczny profil ekspresji populacji komórek mezenchymalnych.
Korzystnie geny ALOX15, CDH9, DRD4, ESM1, HEY1, NKX2-5 stanowią podzestaw genów wskazujący na brak potencjału teratogennego w kierunku nowotworów linii mezodermalnej populacji MSC.
Korzystnie geny FUT3, PROM1, COL2A1, FOXA1, MYO3B stanowią podzestaw genów wskazujący na brak potencjału teratogennego w kierunku nowotworów linii ektodermalnej populacji MSC.
Korzystnie geny CLDN1, CPLX2, FOXA2, HNF1B, HNF4A, LEFTY1, POU4F1 stanowią podzestaw genów wskazujący na brak potencjału teratogennego w kierunku nowotworów linii endodermalnej populacji MSC.
Korzystnie geny TDGF1, DNMT3B, IDO1, NANOG, POUF5F1, SOX2 stanowią podzestaw genów wskazujący na brak potencjału teratogennego w kierunku nowotworów innego pochodzenia populacji MSC.
Zgłaszający jako pierwszy wychodzi naprzeciw potrzebie dokładnej analizy komórek MSC i pochodzenia perinatalnego pod kątem odróżnienia ich od linii mających zdolność do pluripotencji, nowotworzenia jak i pochodzących z odmiennych listków zarodkowych.
Ekspresje genów obliczano na podstawie logarytmu o podstawie 2 z ekspresji względnej dla komórek mezenchymalnych w stosunku do średniej ekspresji dla populacji kontrolnej komórek o odpowiedniej charakterystyce (komórek mezenchymalnych, nowotworowych mezodermalnych, nowotworowych ektodermalnych, nowotworowych endodermalnych lub pluripotencjalnych), będących dla danego panelu populacją kontrolną, normalizowanej dla genów referencyjnych: GAPDH, HPRT i ACTB jak i zawiera się w przedziale istotności CI = 95%.
Korzystne cechy wynalazku zostały zilustrowane za pomocą poniższych figur, uzupełniających informacje zawarte w przykładach wykonania.
Opis figur
Fig. 1 przedstawia porównanie ekspresji genów w panelu ekspresji charakterystycznym dla WJ-MSC, wyselekcjonowanych w stosunku do komórek iPS i przedstawicielami linii nowotworowych: ektodermalnej (ZR-75-30, A-375), mezodermalnej (HT-1080, MCF-7) i endodermalnej (NCI-H727, A-375). Przedstawiono selekcję pozytywną badanych linii komórek mezenchymalnych (kontrola MSC) w stosunku do pozostałych linii badanych (nowotworowych i ludzkich iPS).
Fig. 2 przedstawia porównanie ekspresji genów charakterystycznych dla linii nowotworów pochodzenia mezodermalnego, wyselekcjonowanych w stosunku do pozostałych populacji badanych. Dla przejrzystości wykres obejmuje jedynie ekspresję dla linii komórek mezenchymalnych (MSC) oraz zakres ekspresji dla nowotworów mezodermalnych (linie HT-1080, MCF-7).
Fig. 3 przedstawia porównanie ekspresji genów charakterystycznych dla linii nowotworów pochodzenia ektodermalnego, wyselekcjonowanych w stosunku do pozostałych populacji badanych. Dla przejrzystości wykres obejmuje jedynie ekspresję dla linii komórek mezenchymalnych (MSC) oraz zakres ekspresji dla nowotworów ektodermalnych (linie ZR-75-30, A-375).
Fig. 4 przedstawia porównanie ekspresji genów charakterystycznych dla linii nowotworów pochodzenia endodermalnego, wyselekcjonowanych w stosunku do pozostałych populacji badanych. Dla przejrzystości wykres obejmuje jedynie ekspresję dla linii komórek mezenchymalnych (MSC) oraz zakres ekspresji dla nowotworów endodermalnych (linie NCI-H727, A-549).
Fig. 5 przedstawia porównanie ekspresji genów charakterystycznych dla linii komórek pluripotencjalnych człowieka, wyselekcjonowanych w stosunku do pozostałych populacji badanych. Dla przejrzystości wykres obejmuje jedynie ekspresję dla linii komórek mezenchymalnych (MSC) oraz zakres ekspresji dla komórek iPS.
Przykłady wykonania
Materiały i sposoby
Procedura 1 - Odklejanie komórek i przygotowanie do dalszych procedur
Urządzenia i materiały • Komora laminarna • Mikroskop odwrócony • Inkubator
PL 241 520 B1 • Wirówka • Naczynie hodowlane z komórkami MSC • Pipetki Pasteura 3 ml firmy Medlab • Sterylne falkony 15 / 50 ml firmy Corning • Klercide 70/30 firmy Ecolab • Chusteczki sterilesorb firmy Contec
Odczynniki • Kompletne podłoże hodowlane MSC NutriStem firmy Biological Industries • Albumina ludzka firmy CSL Behring GmbH • Tryple Select (IX) firmy Life technologies • Jałowy roztwór soli fizjologicznej firmy Fresenius Kabi • Roztwór Antibiotic-Antimycotic solution firmy Gibco
Szczegółowy opis procedury:
1. Po 4 dniach od ostatniego pasażu (p2) komórek MSC (jeśli konfluencja wynosiła około 80%) w inkubatorze - 37°C, 5% CO2 w kompletnym podłożu hodowlanym - NutriStem™, z naczynia hodowlanego usunąć nadsącz.
2. Przepłukać naczynie hodowlane roztworem soli fizjologicznej.
3. Do naczynia hodowlanego wlać roztwór enzymu Tryple (1X) w ilości 1 ml / 75 cm2 powierzchni hodowlanej.
4. Zamknąć naczynie hodowlane, delikatnie wymieszać tak aby na każdym piętrze wyrównał się poziom płynów i umieścić w inkubatorze na 5 minut (37°C, 5% CO2).
5. Po upływie tego czasu skontrolować pod mikroskopem odwróconym czy komórki zmieniły kształt na kulisty i odkleiły się od podłoża.
6. Jeśli komórki nie odkleiły się, naczynia hodowlane wstawić ponownie do inkubatora i skontrolować po kolejnych 5 minutach.
7. Ponownie skontrolować naczynie hodowlane z komórkami pod mikroskopem.
8. Jeśli komórki odkleiły się, naczynie hodowlane umieścić pod komorą laminarną.
9. Zablokować enzym poprzez dodanie do naczynia hodowlanego roztworu 5% albuminy w ilości 5:1 w stosunku do dodanej objętości Tryple (1X).
10. Zlać zawartość naczynia do sterylnych plastikowych falkonów.
11. Przepłukać naczynie hodowlane roztworem soli fizjologicznej, tak aby opłukać dno butelki i zebrać pozostałą ilość komórek.
12. Zlać ponownie zawartość naczynia hodowlanego do sterylnych falkonów.
13. Wirować zawieszone komórki w wirówce (7 minut, 300 RCF, RT).
14. Zwirowane komórki policzyć na urządzeniu ADAM MC 2.0 i oszacować żywotność.
15. Zawiesić w podłożu hodowlanym w objętości zależnej od dalszych procedur.
Procedura 2 - Izolacja całkowitego RNA z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC); Oczyszczanie, pomiar stężenia oraz kontrola jakości RNA
Urządzenia i materiały:
• Pipety jednokanałowe • Wirówka • Thermomixer C • Vortex • Sterylne probówki typu RNase-free • Sterylne tipsy z filtrami • RNase ZAP (Ambion, AM9780) • Sterylne igły 20G (0,9 mm) typu RNase-free • Sterylne strzykawki typu RNase-free
Reagenty:
• Woda wolna od RNaz • Zestaw do izolacji RNA: Qiagen RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, #74104) • Liofilizowana DNaza I wraz z buforem do odtwarzania (1500 U) (Qiagen, #79254) • 2M ditiotreitol (DTT) • 70% etanol (klasy molekularnej, wolny od RNaz) • 100% etanol (klasy molekularnej, wolny od RNaz)
PL 241 520 B1
Szczegółowy opis procedury:
1. Komórki (nie więcej niż 5x106) żwirować [5 minut, RT, 1500 rpm] i usunąć supernatant.
2. Do osadu komórkowego dodać 350 μl buforu RLT z DTT.
3. W celu homogenizacji mieszaninę dokładnie wymieszać przez worteksowanie lub pipetowanie.
4. Lizat komórkowy poddać dodatkowej homogenizacji przez pipetowanie lub z wykorzystaniem igły 20G i strzykawki wolnej od RNaz (lizat przepipetować przynajmniej 5 razy).
5. Worteksować 1 min.
6. Dodać 350 μl 70% etanolu i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Nie wirować.
7. Przenieść 700 μl próby (razem z osadem jeżeli powstał) do kolumny RNeasy (RNeasy spin column z zestawu Qiagen RNeasy Plus Mini Kit) w 2 ml probówce odbierającej.
8. Żwirować 30-60 sek. z prędkością > 8000 x g (> 10,000 rpm).
9. Wyjąć minikolumnę, usunąć przesącz (flow-through) i powtórnie umieścić minikolumnę w probówce odbierającej.
10. Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny. Zamknąć i wirować 30 sek. z prędkością > 8000 x g (> 10,000 rpm).
11. Usunąć przesącz zgodnie z etapem 10.
12. Dodać bezpośrednio na złoże kolumny 80 μl mieszaniny z DNazą I. Inkubować w temperaturze pokojowej 15 min.
13. Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny (RNeasy spin column). Zamknąć i wirować 30 sek. z prędkością > 8000 x g (> 10,000 rpm).
14. Usunąć przesącz zgodnie z etapem 10.
15. Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny (RNeasy spin column). Zamknąć i wirować 30 sek. z prędkością > 8000 x g (> 10,000 rpm).
16. Usunąć przesącz zgodnie z etapem 10.
17. Dodać 500 μl buforu RPE. Zamknąć i wirować 2 min z prędkością > 8000 x g (> 10,000 rpm).
18. Przenieść kolumnę (RNeasy spin column) do nowej 2 ml probówki odbierającej. Delikatnie zamknąć i zwirować z maksymalną prędkością 1 min.
19. Przenieść kolumnę (RNeasy spin column) do 1,5 ml probówki typu RNase free.
20. Dodać bezpośrednio na złoże kolumny 30-50 μl wody wolnej od RNaz. Zamknąć i inkubować 10 min w temperaturze pokojowej.
21. Wirować 1 min z prędkością > 8000 x g (> 10,000 rpm).
22. Przesącz poddać dalszym analizom lub zamrozić w -80°C.
Procedura 3 - Pomiar stężenia oraz ocena jakościowa całkowitego RNA
Urządzenia i materiały:
• Pipeta jednokanałowa 0,5-10 μl • Komora UV • Spektrofotometr UV-VIS BioDrop KAP61 • Vortex • Sterylne probówki typu RNase-free (0,2, 0,5 i 1,5 ml) • Sterylne tipsy typu RNase-free z filtrami, 10 μl • RNase ZAP (Ambion, AM9780)
Reagenty:
• Woda wolna od RNaz
Szczegółowy opis procedury:
1. Próbki RNA rozmrozić i trzymać na lodzie. Przenieść probówki z RNA do spektrofotometru BioDrop.
2. Próbki umieścić pod komorą. Włączyć spektrofotometr.
3. Przed pomiarem stężenia, próbki RNA zworteksować.
4. Port pomiarowy BioDrop wyczyścić przed pomiarem.
5. Skalibrować BioDrop względem próbki referencyjnej (woda wolna od RNaz).
6. Pomiar wykonywać z zadanymi parametrami BioDrop, tj.:
• Pathlength: μLite 0.5 mm • Dilution Factor: 1.000
PL 241 520 B1 • Background: On • Units: ng/μΙ • Factor: 50.00
7. Pomiar dla każdej próbki wykonać w 2 powtórzeniach.
8. Pomiar stężenia RNA dokonuje się z użyciem spektrofotometru przy długości fali
A260 nm. Wartość współczynnika A260/A280 nm powinna wynosić 1,9-2,1; wartość dla A230/A260 nm powinna wynosić powyżej 1,8. Wartości te wskazują na odpowiedni stopień czystości RNA.
Procedura 4 - Analiza jakości i integralności RNA na żelu agarozowym
Urządzenia i materiały:
• Pipety jednokanałowe (0,5-10 ul, 2-20 ul, 20-200 ul, 100-1000 ul) • Mikrowirówka z funkcją chłodzenia wraz z odpowiednimi rotorami i adapterami • Thermomixer C, termoblok lub sucha łaźnia • Vortex • Autoklaw • Mikrofalówka • System go elektroforezy na żelu agarozowym Sub-Cell (Mini lub wide Mini) (Bio-rad) • Transilluminator UV lub Chemidoc XRS+ (Bio-rad) • Sterylne probówki typu RNase-free, 0,2 ml • Sterylne tipsy typu RNase-free z filtrami, 10 μl, 200 μl, 1000 μl • RNase ZAP (Ambion, AM9780)
Reagenty:
• Woda wolna od RNaz (wybitnie czysta) • DEPC (roztwór) • Woda DEPC • Sproszkowany agar (klasa molekularna) • Bufor TAE (Tris-octan-EDTA) 50X (zatężony) • Midori Green Advance (ABO) • Drabinka RiboRuler High range RNA (#SM1821, Thermo Fisher Scientific) • Barwnik obciążający dla RNA 2X (95% formamid, 0,025% SDS, 0,025% bromofenol blue, 0,025% cyjan ksylenowy FF, 0,025% bromek etydyny, 0,5 mM EDTA).
Szczegółowy opis procedury:
1. Odważyć wymaganą ilość agaru klasy molekularnej (w zależności od wielkości żelu i stężenia). Aby otrzymać zalecany żel 1% należy odważyć 1,5 g agaru na 100 ml buforu TAE 1X.
2. Przenieść sproszkowany agar do sterylnej, szklanej butelki typu RNase-free.
3. W zależności od ilości próbek przygotować 50 - 100 ml buforu TE 1X w wodzie DEPC (1 ml zatężonego buforu TAE 50X do 99 ml wody DEPC).
4. Ręcznie wymieszać sproszkowany agar z buforem.
5. Agar rozpuścić w buforze stosując podgrzewanie z wykorzystaniem urządzenia mikrofalowego (moc 360 W).
6. Roztwór schłodzić do około 60°C.
7. Dodać do rozpuszczonej agarozy Midori Green Advance (5 μl / 100 ml). Delikatnie zamieszać roztwór, a następnie wylać żel do przygotowanych sanek z grzebieniem.
8. Zostawić na 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej do zestalenia.
9. Umieścić Sub-Cell na lodzie. Wypoziomować. Wypełnić buforem TAE 1X (w wodzie DEPC).
10. Po zestaleniu żel przenieść do Sub-Cell na lodzie.
11. Zalać żel buforem TAE 1X (na 2-5 mm powyżej górnej granicy żelu).
12. Rozpuść drabinkę High range RNA i barwnik obciążający 2X na lodzie.
13. Wymieszać zawartość probówek poprzez powolne pipetowanie lub worteksowanie celem zapewnienia równomiernego rozkładu reagentów wewnątrz fiolek.
14. Przygotować drabinkę z następujących składników:
a. 2 μl barwnika obciążającego 2X,
b. 2 μl drabinki RiboRuler High Range RNA.
PL 241 520 B1
c. 2 μl wody wolnej od RNaz
15. Zworteksować próbkę i szybko żwirować.
16. Podgrzewać przez 10 minut w 70°C w suchej łaźni lub termobloku.
17. Natychmiast przenieść do lodu i chłodzić przez 3 minuty. Po tym natychmiast zaaplikować próbkę na żel.
Przygotowanie i analiza próbek RNA:
1. Rozpuścić próbki RNA na lodzie.
2. Wymieszać zawartość probówek poprzez powolne pipetowanie lub worteksowanie celem zapewnienia równomiernego rozkładu reagentów wewnątrz fiolek.
3. Połączyć próbki RNA (przynajmniej 100 ng) z barwnikiem obciążający 2X w proporcji 1:1 objętościowo.
4. Zworteksować próbkę i szybko zwirować (w 4°C).
5. Podgrzewać przez 10 minut w 70°C w suchej łaźni lub termobloku.
6. Natychmiast przenieść do lodu i chłodzić przez 3 minuty. Po tym natychmiast zaaplikować próbkę na żel.
7. Umieścić przygotowane w poprzednich krokach próbki RNA i drabinkę RiboRuler High Range RNA w dokłach żelu i wykonywać elektroforezę przez ok. 45 minut, póki bromofenol zawarty w obciążniku (ciemny niebieski barwnik) nie przemigruje 2/3 żelu. Jeśli próbki nie rozciągnęły się wystarczająco przedłużyć elektroforezę o kolejne 15 minut.
8. Zwizualizować próbki przy użyciu transiluminatora UV
Procedura 5 - Analiza jakości i integralności DNA na żelu agarozowym
Urządzenia i materiały:
• Pipety jednokanałowe • Stojak chłodzący (4°C) na probówki 0,2 ml • Mikrowirówka z funkcją chłodzenia wraz z odpowiednimi rotorami i adapterami • Thermomixer C • Vortex • Autoklaw • Mikrofalówka • System go elektroforezy na żelu agarozowym Sub-Cell (Mini lub wide Mini) (Bio-rad) • Transilluminator UV lub Chemidoc XRS+ (Bio-rad) • Sterylne probówki typu DNase-free, 0,2 ml • Sterylne tipsy typu DNase-free z filtrami, 10 μl, 200 μl, 1000 μl • DNase ZAP (Ambion, AM9780)
Reagenty:
• Woda wolna od nukleazy (wybitnie czysta) • Woda autoklawowana • Sproszkowany agar (klasa molekularna) • Bufor TAE 50X (zatężony) • Midori Green Advance (ABO) • Drabinka GeneRuler 1 kb DNA (Thermo Fisher Scientific) • Drabinka GeneRuler 50 bp DNA (Thermo Fisher Scientific) • Barwnik obciążający TriTrack 6X (10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,03% bromofenol blue, 0,03% cyjan ksylenowy FF, 0,15% orange G, 60% glicerol i 60 mM EDTA).
Szczegółowy opis procedury:
1. Wykonać etapy 1-8 zgodnie z Procedurą 1.
2. Umieścić Sub-Cell na lodzie. Wypoziomować. Wypełnić do kreski buforem TAE 1X (w wodzie autoklawowanej).
3. Po zestaleniu żel przenieść do Sub-Cell na lodzie.
4. Zalać żel buforem TAE 1X (na 2-5 mm powyżej górnej granicy żelu).
5. Rozpuść drabinkę GeneRuler i barwnik obciążający TriTrack 6X na lodzie.
6. Wymieszać zawartość probówek poprzez powolne pipetowanie lub worteksowanie celem zapewnienia równomiernego rozkładu reagentów wewnątrz fiolek.
7. Przygotować drabinkę z następujących składników:
a. 1 μl barwnika obciążającego TriTrack 6X,
PL 241 520 B1
b. 1 μl drabinki GeneRuler odpowiednio 1 kb lub 50 kb, c. 4 μl wody wolnej od nukleazy.
8. Zworteksować próbkę i szybko żwirować.
9. Podgrzewać przez 10 minut w 70°C w suchej łaźni lub termobloku.
10. Natychmiast przenieść do lodu i chłodzić przez 3 minuty. Po tym natychmiast zaaplikować próbkę na żel.
Przygotowanie i analiza próbek DNA:
1. Rozpuścić próbki DNA na lodzie.
2. Wymieszać zawartość probówek poprzez powolne pipetowanie lub worteksowanie celem zapewnienia równomiernego rozkładu reagentów wewnątrz fiolek.
3. Połączyć próbki DNA (przynajmniej 500 ng) z wodą i barwnikiem obciążający TriTrack 6X w proporcji 1:4:1 objętościowo.
4. Zworteksować próbkę i szybko zwirować (4°C).
5. Natychmiast przenieść do lodu i pozostawić do momentu aplikacji próbki na żel.
6. Umieścić przygotowane w poprzednich krokach próbki DNA i odpowiednią drabinkę GeneRuler w dokłach żelu i wykonywać elektroforezę przez ok. 45 minut, póki orange G zawarty w obciążniku (pomarańczowy barwnik) nie przemigruje 2/3 żelu. Jeśli próbki nie rozciągnęły się wystarczająco przedłużyć elektroforezę o kolejne 15 minut.
7. Zwizualizować próbki przy użyciu transiluminatora UV.
Procedura 6 - Odwrotna transkrypcja
Do przeprowadzenia reakcji RT-PCR zastosowano zestaw RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) wraz z jego reagentami. Reakcję prowadzono według standardowych protokołów dla termocyklera C1000 oraz w zgodzie z zaleceniami producenta RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit. Uzyskane próbki cDNA zabezpieczano umieszczając w zamrażarce -80°C.
Procedura 7 - Reakcja aplifikacji PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR)
Reagenty • Woda wolna od nukleaz • Bufor 2x POWERUP SYBR® Universal Master Mix (Thermo Fisher Scientific) • Przedni starter 100 μM stock • Odwrócony starter 100 μM stock • Matryca cDNA
Do przeprowadzenia reakcji qPCR zastosowano termocykler Thermal Cycler C1000 z nakładką CFX-96. Startery rozcieńczono w stosunku 1:10 i 1:25 w wodzie wolnej od nukleaz. Reakcję prowadzono w trzech powtórzeniach technicznych na próbkę według standardowych protokołów dla termocyklera oraz producenta POWERUP SYBR®, które są znane w dziedzinie, z zastosowaniem następujących warunków reakcji: aktywacja UDG [50°C przez 2 minuty], aktywacja polimerazy [95°C przez 2 minuty], 40 następujących po sobie cykli denaturacji i wydłużania [95°C przez 15 sekund i 60°C przez 1 minutę]. Dodatkowo do każdej badanej próby dodano etap sprawdzający krzywą topnienia badanych genów.
Procedura 8 - Projektowanie starterów
Wszystkie startery do analiz PCR zaprojektowano zgodnie ze standardowymi procedurami znanymi w dziedzinie z wykorzystaniem oprogramowani NCBI primer BLAST, NetPrimer oraz NCBI Gene base.
Przykłady wykonania
P r z y k ł a d 1
Charakterystyka molekularna ludzkich Mezenchymalnych Komórek Stromy MSC
Hodowane linie komórek WJ-MSC pochodzące z galarety Whartona (n=13) zebrano na wczesnych i późnych pasażach (odpowiednio p3 i p10) zachowując standardy zawarte w procedurze 1 i poddano procedurze izolacji RNA zgodnie z procedurą 2. Uzyskany materiał genetyczny zmierzono pod kątem, czystości, jakości i integralności w zgodzie z zaleceniami przedstawionymi w procedurach 3 i 4. Wyizolowany materiał genetyczny wykorzystano w celach porównawczych z komercyjnie dostępnym RNA linii pluripotencjalnej IPS, oraz sześcioma komercyjnymi (ATCC, Sigma Aldrich) liniami nowotworowymi (ZR-75-30, A-375, HT-1080, A-549, MCF-7, NCI-H727) o różnym pochodzeniu zarodkowym (badacze wybrali po dwie linie na każdy listek zarodkowy uprzednio prześledziwszy ich pochodzenie bazując na szczegółowych opisach linii od producenta).
PL 241 520 B1
Upewniwszy się odnośnie wysokiej jakości pozyskanego materiału poddano RNA procedurze odwrotnej transkrypcji zgodnie z procedurą 6. Uzyskane tym sposobem jednoniciowe cDNA całkowicie wolne od genomowego DNA (zgodnie z procedurą 5) wykorzystano do amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym (zgodnie z procedurą 7) wykorzystując między innymi zestawy starterów zaprojektowanych na bazie informacji zawartych w procedurze 8 i kalibrując je w oparciu o krzywe standardowe. Na podstawie szeroko zakrojonego screeningu literatury z dziedziny cytologii i onkologii odnaleziono i przeanalizowano szereg pojedynczych i potencjalnie specyficznych markerów dla danych populacji służących określeniu charakteru hodowanych komórek. Na podstawie skumulowanych danych wybrano ostatecznie 8 genów (PROM1, CDKN2A, FUT3, TDGF1, HER2, SOX9, B4GALNT1, TWIST1), które wykorzystano do odróżnienia populacji, a także zdecydowano się na poszerzenie badania o zestaw genów zawierających się w ramach hPSC Scorecard™ (dodatkowy profil 89 genów). Tworząc eksperyment bazujący na RT-PCR każdorazowo wykorzystywano dwa geny referencyjne (standardowo GAPDH i HPRT, a w przypadku płytek predefiniowanych GAPDH i ACTB). Na płytkach umieszczano kontrole czystości odczynników (- NTC), kontrole RNA, a także użyto referencyjnej próby MSC do kalibracji między płytkowej.
Zebrane dane w formie wielopłytkowego eksperymentu analizowano przy zastosowaniu komercyjnego oprogramowania Maestro 1.1. Wyniki eksperymentów w formie wyselekcjonowanych ze zbioru genów podzielono na sześć zestawów paneli nowotworowych (MSC, pluripotencji, niespecyficzne nowotworowe i panele charakterystyczne dla wszystkich trzech listków zarodkowych: endodermy, mezodermy i ektodermy) odróżniających populacje MSC od linii pluripotencjalnych przy wykorzystaniu wspomnianych predefiniowanych płytek jak i własnoręcznie zaprojektowanych starterów.
W poszczególnych panelach każdorazowo normalizowano uzyskane wyniki relatywnej ekspresji poszczególnych genów (liczonych metodą „2'AACT” zaaprobowaną przez środowisko naukowe i zaproponowaną w 2001 przez grupę badawczą profesora Livak w artykule pt.: ”Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 2'MCT Method”) względem próby kontrolnej (w zależności od panelu były to odpowiednio: linia MSC pochodząca z banku komórek PBKM, oraz komercyjne linie IPS, ZR-75-30, A-375, HT-1080, MCF-7, A-549 i NCI-H727), a także wykorzystano algorytm wbudowany w program Maestro 1.1 celem kalibracji i zniwelowania potencjalnych różnic w odczycie między poszczególnymi płytkami.
Poniżej zaprezentowano ostateczny zbiór genów w ramach każdego z proponowanych przez twórców paneli:
• Panel MSC (CDKN2A, CDH20, HAND2, PDGFR-α) • Panel mezodermalny (ALOX15, CDH9, DRD4, ESM1, HEY1, NKX2-5) • Panel ektodermalny (FUT3, PROM1, COL2A1, FOXA1, MYO3B) • Panel endodermalny (CLDN1, CPLX2, EOMES, FOXA2, HNF1B, HNF4A, LEFTY1, POU4F1) • Panel pluripotencjalny (TDGF1, DNMT3B, IDO1, NANOG, POUF5F1, SOX2)
Uzyskane wyniki w postaci znormalizowanej ekspresji wytypowanych genów względem kontrolnych grup biologicznych (uśredniona ekspresja tych genów z linii MSC, linii IPS, linii nowotworowych endodermalnych, mezodermalnych i ektodermalnych) eksportowano do oddzielnego arkusza, a następnie każdorazowo logarytmowano (logarytm o podstawie 2). Zabieg ten był niezbędny, aby uzyskać symetryczne rozkłady prób. Wynikające z analizy odchylenia przedstawiono na wykresach w formie słupków odchyleń gdzie ich końce znajdują się na wartościach ekspresji maksymalnych i minimalnych uzyskanych dla danego genu w grupie biologicznej. Następnie obliczono przedziały istotności CI = 95% dla każdego genu i biologicznej grupy kontrolnej w danym panelu.
W związku z powyższym wartość na osi Y „zero” stanowi punkt wyjściowy dla oceny krotności różnicy w ekspresji genów między kontrolną grupą biologiczną, a pozostałymi badanymi liniami. Ostatnim zabiegiem było wyliczenie na podstawie uzyskanych wartości ekspresji poszczególnych genów w panelach przedziałów ufności dla badanych linii MSC. Tym sposobem uzyskano zakresy (krotności ekspresji genów), które są charakterystyczne dla badanych linii MSC. Twórcy wysnuwają także hipotezę, że komórki MSC ze wszystkich populacji tkanek perinatalnych będą zachowywały się identycznie w przedstawionych warunkach.
P r z y k ł a d 2 - Panel charakterystyczny dla populacji komórek MSC
W stworzonym przez twórców panelu odróżniającym komórki MSC od innych linii w tym linii pluripotencjalnej IPS i 6 linii nowotworowych (po dwie charakterystyczne dla poszczególnych listków zarodkowych) porównano średnią ekspresję grupy biologicznej MSC (n=13 i n=3) z pozostałymi liniami.
PL 241 520 Β1
W tym celu analizowano wartości relatywnej ekspresji wyliczonej na podstawie zaaprobowanej metody „2-AACT” poszczególnych genów w stosunku do linii MSC. Twórcy poszukiwali genów, których ekspresja wyliczona na podstawie grupy biologicznej MSC z 95% przedziałem istotności nie pokrywa się z ekspresją pozostałych badanych linii, a tym samym sugeruje, że są one potencjalnymi, charakterystycznymi markerami badanych komórek MSC. Screening przeszło 97 genów wykazał obecność 4 takich genów (CDKN2A, CDH20, HAND2, PDGFR-α). Czytelne, graficzne przedstawienie wyników wymagało zlogarytmowania (logarytm o podstawie 2) uzyskanych wartości relatywnej ekspresji badanych prób (znormalizowaną względem genów referencyjnych: ACTB, GAPDH i HPRT) w związku z czym wartość na osi Y „zero” stanowi punkt wyjściowy dla oceny krotności różnicy w ekspresji genów między grupą biologiczną MSC będącą dla tego panelu populacją kontrolną, a pozostałymi badanymi liniami.
Na podstawie uzyskanych wartości twórcy wyznaczyli zakresy ekspresji genów świadczące o dużej zbieżności do populacji MSC (tabela 2).
Tabela 2
Panel MSC log2(Aeks presji MSC)
Geny Średnia Górny limit Dolny limit
CDKN2A 0,276782 0,74693193 -0,1933675
CDH20 0,00000133 0,59520569 -0,59520303
HAND2 0,00000067 0,93083439 -0,93083305
PDGFR-a 0,00000033 0,56526711 -0,56526645
Opracowany przez twórców panel genów (Fig. 1) charakterystycznych dla populacji MSC może być z powodzeniem stosowany do dyferencjacji profilu ekspresji na poziomie molekularnym linii MSC (dzięki pozytywnej selekcji) od komórek od ludzkich komórek pluripotencjalnych (hIPSC), bądź linii nowotworowych z 3 różnych listków zarodkowych uwzględniający przedział istotności Cl = 95%.
Przykład 3 - Panel charakterystyczny dla linii nowotworowych komórek ektodermalnych
Następnie twórcy skupili się na selekcji grup genów umożliwiających bezbłędne odróżnienie na poziomie molekularnym linii komórek MSC od wybranych linii nowotworowych. Na podstawie szerokiego screeningu literatury przedmiotu wytypowano listę genów regularnie nadeksprymowanych w komórkach nowotworowych. Zdając sobie sprawę z faktu, że jak dotąd nie znaleziono charakterystycznych markerów nowotworowych eksprymowanych w 100% komórek nowotworowych twórcy zdecydowali się poszerzyć panele selekcyjne o geny charakterystyczne dla poszczególnych listków zarodkowych (ektoderma, mezoderma i endoderma) z których wywodziły się wybrane linie nowotworowe. Oczywistym jest, że komórki MSC wywodzące się z mezodermy nie powinny eksprymować genów typowych dla linii wywodzących się z pozostałych listków co też postanowiono jednoznacznie dowieść. Ponownie ekspresję genów obliczano na podstawie logarytmu o podstawie 2 z ekspresji względnej dla komórek mezenchymalnych stromy w stosunku do średniej ekspresji dla populacji kontrolnej komórek nowotworowych ektodermalnych będących dla danego panelu (Fig. 2) populacją kontrolną, normalizowaną do genów referencyjnych: GAPDH, HPRT i ACTB. Wykresy przedstawione na (Fig. 2) uwzględniają się w przedziale istotności Cl = 95%.
Wytypowane przez twórców markery nowotworowe (FUT3 i PROM1) w najwyższym stopniu odróżniały się swoją ekspresją od badanych prób MSC i z tego też względu uwzględniono je w tym konkretnym panelu. Jednakowoż każda do tej pory badana linia nowotworowa miała znacznie wzmożoną ekspresję tych genów w stosunku do grupy biologicznej MSC. Pozostałe geny jak COL2A1, FOXA1 i MYO3B są genami standardowo eksprymowanymi w komórkach wywodzących się z zarodkowego listka ektodermalnego stąd też ich ekspresja w próbach MSC jest wielokrotnie słabsza w stosunku do kontrolnych linii nowotworowych. Na podstawie zebranych danych twórcy wyznaczyli graniczne zakresy ekspresji genów świadczące o dużej zbieżności do populacji MSC (tabela 3).
PL 241 520 Β1
Tabela 3
Panel ektodermalny log2(Aekspresji MSC)
Górny
Geny Średnia limit Dolny limit
FUT3 -8,51534 -7,3287734 -9,70190536
PROM1 -10,5637 -9,5176939 -11,6096888
COL2A1 -6,67939 -4,2333681 -9,12540453
FOXA1 -13,2877 -13,287687 -13,2877212
MYO3B -8,46962 -3,2125404 -13,7267095
Opracowany przez twórców panel genów (Fig. 2) charakterystycznych dla nowotworowych linii ektodermalnych może być z powodzeniem stosowany do dyferencjacji profilu ekspresji na poziomie molekularnym linii MSC (dzięki negatywnej selekcji) od ludzkich linii nowotworowych wywodzących się z ektodermalnego listka zarodkowego uwzględniający przedział istotności Cl = 95%.
Przykład 4 - Panel charakterystyczny dla linii nowotworowych komórek mezodermalnych
Kolejny stworzony przez twórców panel selekcyjny umożliwił odróżnienie na podstawie ekspresji genów charakterystycznych dla linii nowotworowej pochodzenia mezodermalnego, wyselekcjonowanych w stosunku do grupy biologicznej MSC. Wytypowane przez twórców markery (ALOX15, CDH9, DRD4, ESM1, HEY1 i ΝΚΧ2-5) w najwyższym stopniu odróżniały się swoją ekspresją od badanych prób MSC pozostając jednocześnie genami charakterystycznymi dla mezodermy (wspólnej linii zarówno dla komórek MSC jak i wytypowanych linii nowotworowych wywodzących się z mezodermalnego listka zarodkowego) i z tego też względu uwzględniono je w tym konkretnym panelu. Pomimo zbieżności wynikającej z wspólnego pochodzenia próby MSC nie wykazywały ekspresji genów ALOX15, CDH9 i ΝΚΧ2-5, w przypadku pozostałych badanych genów i ekspresja pozostawała wielokrotnie niższa w porównaniu do uśrednionej ekspresji nowotworowych linii kontrolnych.
Na podstawie zebranych danych twórcy wyznaczyli graniczne zakresy ekspresji genów świadczące o dużej zbieżności do populacji MSC (tabela 4).
Tabela 4
Panel mezodermalny logi(Aekspresji MSC)
Geny Średnia Górny limit Dolny limit
ALOX15 -13,2877 -13,2877 -13,2877
CDH9 -13,2877 -13,2877 -13,2877
DRD4 -4,830933 -1,4960465 -8,16582018
ESM1 -10,22175 -4,1259695 -16,3175372
HEY1 -5,921547 -2,5392757 -9,30381761
ΝΚΧ2-5 -13,2877 -13,2877 -13.2877
PL 241 520 Β1
Opracowany przez twórców panel genów (Fig. 3) charakterystycznych dla nowotworowych linii mezodermalnych może być z powodzeniem stosowany do dyferencjacji profilu ekspresji na poziomie molekularnym linii MSC (dzięki negatywnej selekcji) od ludzkich linii nowotworowych wywodzących się z mezodermalnego listka zarodkowego uwzględniający przedział istotności Cl = 95%.
Przykład 5 - Panel charakterystyczny dla linii nowotworowych komórek endodermalnych
Domykający grupę paneli selekcyjnych związanych z genami charakterystycznymi dla listków zarodkowych - panel endodermalny (Fig. 4) umożliwił odróżnienie populacji na podstawie ekspresji genów charakterystycznych dla linii nowotworowej pochodzenia endodermalnego, wyselekcjonowanych w stosunku do grupy biologicznej MSC. Wytypowane przez twórców markery (CLDN1, CPLX2, EOMES, FOXA2, HF1B, HNF4A, LEFTY1 i POU4F1) w najwyższym stopniu odróżniały się swoją ekspresją od badanych prób MSC pozostając jednocześnie genami charakterystycznymi dla endodermy (charakterystycznej dla wytypowanych linii nowotworowych wywodzących się z endodermalnego listka zarodkowego) i z tego też względu uwzględniono je w tym konkretnym panelu.
Na podstawie zebranych danych twórcy wyznaczyli graniczne zakresy ekspresji genów świadczące o dużej zbieżności do populacji MSC (tabela 5).
Tabela 5
Panel endodermalny log2(Aekspresji MSC) Geny Średnia Górny limit Dolny limit
CLDN1 -6,3508 -5,85133601 -6,850263
CPLX2 -11,27073-2,59238133 -19,949089
EOMES -6,882221 -5,89593784 -7,8685043
FOXA2 -12,25855-7,8304693 -16,686639
GATA4 -5,9733981,288903567 -13,235699
HNF1B -13,16154-12,6186786 -13,704397
HNF4A -12,75939-10,4862152 -15,03256
LEFTY1-5,762675 -2,53845737 -8,9868928
POU4F1 -8,737086 -7,24523225 -10,228939
Opracowany przez twórców panel genów (Fig. 4) charakterystycznych dla nowotworowych linii endodermalnych może być z powodzeniem stosowany do dyferencjacji profilu ekspresji na poziomie molekularnym linii MSC (dzięki negatywnej selekcji) od ludzkich linii nowotworowych wywodzących się z endodermalnego listka zarodkowego uwzględniający przedział istotności Cl = 95%.
Przykład 6 - Panel charakterystyczny dla populacji komórek pluripotencjalnych
Ostatni z sugerowanych przez twórców paneli (Fig. 5) może być z powodzeniem wykorzystany jako wskaźnik potencjału pluripotencji badanych komórek. Spośród wszystkich wyselekcjonowanych genów wybrano ostatecznie sześć zwyczajowo uznawanych za geny silnie powiązane z proliferacją i utrzymaniem stanu niezróżnicowanego komórek. Należą do nich: TDGF1, DMNT3B, IDO1, NANOG, POU5F1 i SOX2. Założenie tworzonego panelu miało jednakże na celu udowodnienie, że badane populacje MSC nie wykazują właściwości pluripotencjalnych, a tym samym mogą być bezpiecznie wykorzystywane jako bezpieczny produkt ATMP w terapiach. Przedstawione wyniki wyraźnie wykluczają możliwość do spontanicznego i nieskończonego namnażania się w organizmach jak i transformacji nowotworowej zależnej od ekspresji genów pluripotencji (tabela 6).
PL 241 520 Β1
Tabela 6
Panel pluripotencji
log2(Aeksp resji MSC)
Geny Górny Dolny Średnia limit limit
TDGF1 -13,2877 -13,2877 -13,2877
DNMT3B -10,0822 8,793606 -11,370701
IDO1 -12,9544 -11,520149 -14,388584
NANOG -11,0469 -8,7204504 -13,37327
POU5F1 -11,4947 -10,142655 -12,846745
SOX2 -13,2419 -13,044662 -13,439072
Stworzony panel pluripotencji wykazał iż wszystkie badane populacje komórek MSC wykazują minimalną (setki razy niższą niż w komórkach IPS) lub całkowity brak ekspresji (jak wykazano na przykładzie genów TDGF1 i SOX2) wybranych genów pluripotencji uwzględniający przedział istotności Cl = 95%. Ponadto linie nowotworowe w przypadku genów DNMT3B, POU5F1 i SOX2 charakteryzowały się wyraźnie silniejszą ekspresją niż interesujące twórców linie MSC tym samym dając dodatkowe dowody na brak potencjału teratogennego komórek mezenchymalnych.
Przykład 7 - Teoretyczny - Panele charakterystyczne dla populacji komórek MSC pochodzących z odmiennych tkanek perinatalnych
Na sam koniec twórcy proponują dodatkowy zestaw paneli genowych dla populacji komórek MSC pochodzących z pozostałych tkanek perinatalnych w tym: łożysko, kosmki Villego, błony płodowe, płyn owodniowy. Zbiór paneli jest identyczny z już przedstawionymi i zawiera geny według paneli jak poniżej:
• Panel MSC (CDKN2A, CDH20, HAND2, PDGFR-a) • Panel mezodermalny (ALOX15, CDH9, DRD4, ESM1, HEY1, ΝΚΧ2-5) • Panel ektodermalny (FUT3, PROM 1, COL2A1, FOXA1, MYO3B) • Panel endodermalny (CLDN1, CPLX2, EOMES, FOXA2, HNF1B, HNF4A, LEFTY1, POU4F1) • Panel pluripotencjalny (TDGF1, DNMT3B, IDO1, NANOG, POUF5F1, SOX2)
Poniżej znajduje się sugerowany przez twórców całościowy opis procedury mający na celu przeprowadzenie doświadczenia, a tym samym potwierdzenie hipotezy badawczej.
I tak do badań porównawczych sugerowane jest zastosowanie po trzy (n=3) świeże linie komórek MSC (trzy powtórzenia biologiczne) wywodzących się z pozostałych tkanek perinatalnych. Komórki MSC należy zebrać na wczesnym pasażu (p3) zachowując standardy zawarte w procedurze 1 i poddać procedurze izolacji RNA zgodnie z procedurą 2. Uzyskany materiał genetyczny zmierzyć pod kątem, czystości, jakości i integralności w zgodzie z zaleceniami przedstawionymi w procedurach 3 i 4. Wyizolowany materiał genetyczny wykorzystać w celach porównawczych z komercyjnie dostępnym RNA linii pluripotencjalnej IPS, oraz sześcioma komercyjnymi (ATCC, Sigma Aldrich) liniami nowotworowymi (ZR-75-30, A-375, HT-1080, A-549, MCF-7, NCI-H727) o udowodnionym różnym pochodzeniu zarodkowym. Upewniwszy się odnośnie wysokiej jakości pozyskanego materiału poddać RNA procedurze odwrotnej transkrypcji zgodnie z procedurą (zgodnie z procedurą 6). Uzyskane tym sposobem jednoniciowe cDNA całkowicie wolne od genomowego DNA (zgodnie z procedurą 5) wykorzystać do amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym (zgodnie z procedurą 7) wykorzystując między innymi zestawy starterów zaprojektowanych na bazie informacji zawartych w procedurze 8 dotyczące następujących genów: (PROM1, CDKN2A, FUT3, TDGF1, HER2, SOX9, B4GALNT1, TWIST 1), a także zestawy genów zawierających się w ramach hPSC Scorecard™ (dodatkowy profil 89 genów). Bazując na poprzednich eksperymentach należy dalej wykorzystywać po dwa geny referencyjne (GAPDH i HPRT) oraz (GAPDH

Claims (3)

  1. PL 241 520 B1 i ACTB w przypadku płytek predefiniowanych) jak i umieszczać na płytkach kontrole czystości odczynników (- NTC), kontrole RNA, oraz referencyjne próby MSC (na genach GAPDH i HPRT) do kalibracji między płytkowej. Ostatecznie należy zebrać wszystkie pozyskane dane w formie wielopłytkowego eksperymentu i analizować przy zastosowaniu komercyjnego oprogramowania Maestro 1.1.
    Wyniki eksperymentów w formie uprzednio wyselekcjonowanych ze zbioru genów podzielić ponownie na pięć zestawów paneli różnicujących (MSC, pluripotencji oraz panele charakterystyczne dla wszystkich trzech listków zarodkowych: endodermy, mezodermy i ektodermy) odróżniających populacje MSC od linii pluripotencjalnych i teratogennych przy wykorzystaniu wspomnianych predefiniowanych płytek jak i własnoręcznie zaprojektowanych starterów. Relatywną ekspresję wyliczać względem biologicznych grup kontrolnych (w zależności od panelu były to odpowiednio: linie MSC pochodzące z banku komórek PBKM, oraz komercyjne linie IPS, ZR-75-30 i A-375, HT-1080 i MCF-7, A-549 i NCI-H727) mając na uwadze wartości ekspresji uzyskane z komórek MSC pozyskanych z pozostałych tkanek perinatalnych i końcowo porównując je do wyznaczonych w poprzednich przykładach granicznych zakresów ekspresji genów świadczące o dużej zbieżności do populacji MSC z sznura pępowiny.
    Niniejsze doświadczenie może być z takim samym rezultatem zastosowane przy określaniu potencjału teratogennego i właściwości pluripotencjalnych populacji komórek mezenchymalnych z sznura pępowiny jak i populacji komórek pochodzących z innych tkanek perinatalnych wymiennie. Twórcy na podstawie szerokiego przeglądu literatury naukowej są pewni odnośnie ich olbrzymiego podobieństwa w szczególności w kontekście ich pierwotnej natury komórek wywodzących się z linii mezenchymalnej, a zaobserwowane w badaniach różnice nie spowodują uzyskanie odmiennych wyników na panelach związanych z tak podstawowymi kwestiami jak zdolność pluripotencji, czy pochodzenie zarodkowe.
    Przykładowa literatura potwierdzająca podobieństwo między populacjami komórek mezenchymalnych ze sznura pępowinowego i populacji komórek pochodzących z innych tkanek perinatalnych to:
    • Nagamura-Inoue, T., & He, H. (2014). Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: their advantages and potential clinical utility. World journal of stem cells, 6(2), 195.
    • Mennan, C., Wright, K., Bhattacharjee, A., Balain, B., Richardson, J., & Roberts, S. (2013). Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed research international, 2013.
    • Bieback, K., & Brinkmann, I. (2010). Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy. World journal of stem cells, 2(4), 81.
    • Kwon, A., Kim, Y., Kim, M., Kim, J., Choi, H., Jekarl, D. W., ... & Park, I. Y. (2016). Tissuespecific differentiation potency of mesenchymal stromal cells from perinatal tissues. Scientific reports, 6(1), 1-11.
    • Wu, M., Zhang, R., Zou, Q., Chen, Y., Zhou, M., Li, X.,... & Chen, Q. (2018). Comparison of the biological characteristics of mesenchymal stem cells derived from the human placenta and umbilical cord. Scientific reports, 8(1), 1-9.
    • Schmelzer, E., McKeel, D. T., & Gerlach, J. C. (2019). Characterization of human mesenchymal stem cells from different tissues and their membrane encasement for prospective transplantation therapies. BioMed research international, 2019.
    • Heo, J. S., Choi, Y., Kim, H. S., & Kim, H. O. (2016). Comparison of molecular profiles of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, umbilical cord blood, placenta and adipose tissue. International journal of molecular medicine, 37(1), 115-125.
    Zastrzeżenia patentowe
    1. Zestaw genów zawierający co najmniej jeden panel genów wybrany z: CDKN2A, CDH20, HAND2, PDGFR-a; lub ALOX15, CDH9, DRD4, ESM1, HEY1, NKX2-5; lub FUT3, PROM1, COL2A1, FOXA1, MYO3B; lub CLDN1, CPLX2, EOMES, FOXA2, HNF1B, HNF4A, LEFTY1, POU4F1; lub TDGF1, DNMT3B, IDO1, NANOG, POUF5F1, SOX2; do zastosowania przy określaniu potencjału teratogennego populacji komórek mezenchymalnych (MSC) lub populacje komórek perinatalnych.
  2. 2. Zestaw genów do zastosowania według zastrz. 1, przy czym ekspresja względna genów jest taka jak zdefiniowano w tabeli 1.
  3. 3. Zestaw genów do zastosowania według zastrz. 1 albo 2, przy czym komórki mezenchymalne pochodzą ze sznura pępowinowego, ze szpiku kostnego lub tkanek tłuszczowych.
PL433374A 2020-03-27 2020-03-27 Zastosowanie panelu genów do określania potencjału teratogennego komórek mezenchymalnych i pochodzenia perinatalnego PL241520B1 (pl)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL433374A PL241520B1 (pl) 2020-03-27 2020-03-27 Zastosowanie panelu genów do określania potencjału teratogennego komórek mezenchymalnych i pochodzenia perinatalnego
PCT/IB2021/052521 WO2021191853A1 (en) 2020-03-27 2021-03-26 The use of a gene panel to determine the teratogenic potential of mesenchymal and perinatal tissue-derived cells
EP21726182.5A EP4127239A1 (en) 2020-03-27 2021-03-26 The use of a gene panel to determine the teratogenic potential of mesenchymal and perinatal tissue-derived cells

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL433374A PL241520B1 (pl) 2020-03-27 2020-03-27 Zastosowanie panelu genów do określania potencjału teratogennego komórek mezenchymalnych i pochodzenia perinatalnego

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL433374A1 PL433374A1 (pl) 2021-10-04
PL241520B1 true PL241520B1 (pl) 2022-10-17

Family

ID=75954148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL433374A PL241520B1 (pl) 2020-03-27 2020-03-27 Zastosowanie panelu genów do określania potencjału teratogennego komórek mezenchymalnych i pochodzenia perinatalnego

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4127239A1 (pl)
PL (1) PL241520B1 (pl)
WO (1) WO2021191853A1 (pl)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023052820A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Polski Bank Komórek Macierzystych S.A. Expression analysis of a specific gene pool to determine whether the population of adipose tissue-derived mesenchymal cells (at-msc) selected for clinical application can undergo a transformation into neoplastic cells

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE488588T1 (de) * 2003-03-10 2010-12-15 Japan Science & Tech Agency Verfahren zur kennzeichnung mesenchymaler stammzellen unter verwendung verschiedener marker
KR100888924B1 (ko) * 2007-06-04 2009-03-16 주식회사 제이비줄기세포연구소 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포 분별방법
WO2015086052A1 (en) * 2013-12-10 2015-06-18 Swiss Stem Cell Foundation Culture media for in vitro differentiation of cardiomiocytes from adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and method to select them
EP3091084A1 (en) * 2015-05-08 2016-11-09 Université Catholique De Louvain Methods for assessing the purity of a mesenchymal stem cells preparation

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021191853A1 (en) 2021-09-30
PL433374A1 (pl) 2021-10-04
EP4127239A1 (en) 2023-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Du et al. Stem cells and female reproduction
Geyh et al. Insufficient stromal support in MDS results from molecular and functional deficits of mesenchymal stromal cells
Kim et al. Passage-dependent accumulation of somatic mutations in mesenchymal stromal cells during in vitro culture revealed by whole genome sequencing
Lee et al. Effects of serial passage on the characteristics and chondrogenic differentiation of canine umbilical cord matrix derived mesenchymal stem cells
Ohanna et al. Secretome from senescent melanoma engages the STAT3 pathway to favor reprogramming of naive melanoma towards a tumor-initiating cell phenotype
Hoang et al. Standardized xeno-and serum-free culture platform enables large-scale expansion of high-quality mesenchymal stem/stromal cells from perinatal and adult tissue sources
Fathi et al. Mesenchymal stem cells promote caspase-3 expression of SH-SY5Y neuroblastoma cells via reducing telomerase activity and telomere length
Fusco et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours
Ryan et al. Unravelling the pluripotency paradox in fetal and placental mesenchymal stem cells: Oct-4 expression and the case of the emperor’s new clothes
Vymetalova et al. Large-scale automated hollow-fiber bioreactor expansion of umbilical cord-derived human mesenchymal stromal cells for neurological disorders
Tancharoen et al. Human platelet lysate as an alternative to fetal bovine serum for culture and endothelial differentiation of human amniotic fluid mesenchymal stem cells
Pakzad et al. A roadmap for the production of a GMP-compatible cell bank of allogeneic bone marrow-derived clonal mesenchymal stromal cells for cell therapy applications
Dissanayake et al. Oviduct as a sensor of embryo quality: deciphering the extracellular vesicle (EV)-mediated embryo-maternal dialogue
PL241520B1 (pl) Zastosowanie panelu genów do określania potencjału teratogennego komórek mezenchymalnych i pochodzenia perinatalnego
Sahoo et al. Isolation, culture, characterization, and osteogenic differentiation of canine endometrial mesenchymal stem cell
CN109694852B (zh) 一种人胶质瘤原代细胞及其体外分离培养方法和应用
Xiao et al. Effects of ginsenoside Rg1 on proliferation and directed differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into neural stem cells
Gedye et al. Isolation and characterization of cancer stem cells in vitro
Rosner et al. Fetomaternal microchimerism and genetic diagnosis: On the origins of fetal cells and cell-free fetal DNA in the pregnant woman
WO2023052820A1 (en) Expression analysis of a specific gene pool to determine whether the population of adipose tissue-derived mesenchymal cells (at-msc) selected for clinical application can undergo a transformation into neoplastic cells
CA3200368A1 (en) Method for preimplantation genetic screening of embryos
Hoseini et al. Comparison of chromosomal instability of human amniocytes in primary and long-term cultures in AmnioMAX II and DMEM media: A cross-sectional study
Amendola et al. Human placenta-derived neurospheres are susceptible to transformation after extensive in vitro expansion
Mazzella et al. Regulation of self-renewal and senescence in primitive mesenchymal stem cells by Wnt and TGFβ signaling
Scharler et al. Extra-hematopoietic immunomodulatory role of the SCID-susceptibility gene DOCK-2 identified by stepwise maturation of human iPSCs into clonogenic mesodermal stromal progenitors