KR100888924B1

KR100888924B1 - 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포 분별방법

Info

Publication number: KR100888924B1
Application number: KR1020070054423A
Authority: KR
Inventors: 송창훈; 김지영; 오교녀
Original assignee: 주식회사 제이비줄기세포연구소
Priority date: 2007-06-04
Filing date: 2007-06-04
Publication date: 2009-03-16
Also published as: KR20080106686A

Abstract

본 발명은 형태학적으로 유사한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 분별할 수 있는 특이 마커로써 섬유아세포에서 특이적으로 G-CSF (granulocyte colony-stimulating factors)가 발현됨을 확인하고, 분자생물학적 기법인 역전사 중합 효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 이용하여 섬유아세포에서만 특이적으로 G-CSF가 발현됨을 확인함으로써 형태학적으로 유사한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 손쉽게 분별할 수 있다.

중간엽 줄기세포, 섬유아세포, 역전사 중합 효소 연쇄반응, G-CSF

Description

인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포 분별방법{A distinguishing method of fibroblast from mesenchymal stem cell derived from human umbilical cord blood}

도 1a는 형태학적으로 유사한 인간 제대혈 유래 중간엽줄기세포와 섬유아세포를 선별하기 위한 특이적인 마커를 발굴하기 위하여 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors)의 특이적인 프라이머를 제작하여 분자생물학적 기법인 역전사 중합 효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행한 결과 특이적으로 섬유아세포에서만 G-CSF가 발현됨을 확인할 수 있다. NS: 비특이적 띠(non-specific band)

도 1b는 대조군으로서 항상 발현되는 유전자(house keeping gene) 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소("GAPDH")의 발현을 조사한 결과이다. Cambrex사의 섬유아세포-성인 (cat. NO : cc-2611)과 섬유아세포-신생아(cat. NO : cc-2609) 및 출원인 (주)제이비줄기세포연구소에서 분리한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC-401, UCB-MSC-490, UCB-MSC-692, UCB-MSC-693, UCB-MSC-780, UCB-MSC-811)를 실험에 사용하였다.

도 2a는 G-CSF와 같은 조혈모세포 성장인자인 GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor)의 특이적인 프라이머를 제작하여 분자생물 학적 기법인 역전사 중합 효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행한 결과 섬유아세포에서만 발현되는 G-CSF와는 달리 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서도 발현됨을 확인할 수 있다. 도 2b는 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 (GAPDH)의 발현에 대한 것으로 항상 발현되는 유전자 (house keeping gene)를 대조군으로 사용한 것이다. Cambrex사의 섬유아세포-성인(cat. NO : cc-2611)과 섬유아세포-신생아(cat. NO : cc-2609) 및 출원인 (주)제이비줄기세포연구소에서 분리한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 (UCB-MSC-401, UCB-MSC-490, UCB-MSC-811)를 실험에 사용하였다.

도 3은 G-CSF 발현 변화를 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다.

도 4는 섬유아세포와 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 현미경 사진이다.

hUCB-MSC: 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포

도 5는 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBM-MSC, 녹색 막대), 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(hUCB-MSC, 빨간색 막대)와 인간 피부 유래 섬유아세포(신생아)(HDF-N, 노란색 막대)에서 CD74를 비롯한 세포 표면(cell surface) 마커에 대하여 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 유세포 분석기(fluorescence activated cell sorter; 이하 "FACS"와 혼용함)를 이용한 인간 섬유아세포의 표면항원측정 결과이다.

도 7은 FACS를 이용한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 표면항원측정 결과이다.

도 8은 본 발명의 방법으로 분별된 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포로부터 지방세포 분화실험을 한 결과 사진이다.

도 9는 본 발명의 방법으로 분별된 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포로부터 신경세포 분화실험을 한 결과 사진이다.

도 10은 본 발명의 방법으로 분별된 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포로부터 골세포 분화실험을 한 결과 사진이다.

본 발명은 형태학적으로 유사한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 분별할 수 있는 특이 마커로써 섬유아세포에서 특이적으로 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors)가 발현됨을 확인하고, 분자생물학적 기법인 역전사 중합 효소 연쇄반응(Reverse Transcriptase-Polymerization Chain Reaction; 이하 "RT-PCR"과 혼용함)을 이용하여 섬유아세포에서만 특이적으로 G-CSF가 발현됨을 확인함으로써 형태학적으로 유사한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 손쉽게 분별할 수 있다.

중간엽 줄기세포는 척수손상 및 뇌허혈성 손상 등에서 손상된 조직의 재생을 위하여 치료제로 활용할 수 있는데, 중간엽 줄기세포를 임상적으로 활용하고자 할 때 중간엽 줄기세포 확인이 가능하여야 한다. 즉, 형태적으로나 기능적으로 중간엽 줄기세포라는 확인이 이루어져야만 세포치료제로 사용이 가능하다. 그런데, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 비롯한 중간엽 줄기세포는 형태학적으로 섬유아세 포와 감별이 어려우며, 기존의 세포특성화 과정인 유세포 분석기를 이용한 표지물질의 확인과정을 통해서도 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포의 감별은 어려운 실정이다.

줄기세포란 증식 (proliferation), 자가재생 (self-renewal) 및 많은 수의 전구세포 (progenitor cell)를 만들어 낼 수 있는 능력을 지닌 미분화된 세포이다 (McKar, Science. 1997, Scheffler et al., Neurosci., 1999). 인간 중간엽 줄기세포 (MSCs)는 섬유아세포 (fibroblast)의 형태를 지니는 세포로 강한 증식능력을 나타내며, 골모세포(Osteoblast), 지방세포(adipocyte), 연골모세포(Chondroblast), 근육모세포(myoblast)와 신경계통으로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포로 인간 제대혈, 결합조직, 피부, 관절 활액, 지방, 태반 및 치아에서도 분리되는 세포로 가장 흔히 이용되는 조직은 골수이다(Sethe, et al., Trends Neurosci., 1999, Colter, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA., 2001, Caplan, J. Orthop . Res., 1991, Zuk et al., Mol. Biol. Cell., 2002, Hou, et al., Int J Hematol., 2003, Lee, et al., Int . J. Hematol., 2005, Fukuchi, et al., Stem Cells. 2004, Anker, et al., Stem Cells. 2004, Toma, Stem Cells., 2005). 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 전구세포(mesenchymal progenitor cell; MPC)는 비혈구 세포로서, 자기 재생이 가능하고, 다양한 조직으로 분화할 수 있는 세포이며 그로 인해 중간엽 줄기세포의 기전 및 생리에 관한 연구뿐만 아니라 이를 응용하여 치료제로서 적용하려는 연구가 최근 많이 이루어지고 있고, 또한 주목을 받고 있다. 그러나 이러한 중간엽 줄기세포와 전구세포는 섬유 아세포(fibroblast)의 형태와 유사함이 보고되어 있다(Pittenger et al., Science. 1999, Sudo et al., Stem Cells. 2007. in press, Siamak, et al., Circulation 2003). 따라서, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포는 형태학적으로 유사하므로 순수한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포만을 분리하기 위해서는 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 구별할 수 있는 특이 마커(specific marker)에 관한 정보가 필수적이다.

그러나, 현재까지 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포나 섬유아세포에 대한 명확한 마커가 없으며 골수 세포의 경우 약 0.001~0.01% 비율로 존재하는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 분리한 후 배양시 배양 용기 바닥에 유사 섬유아세포 형태(fibroblast-like)로 부착하여 증식하고, FACS에 의해 분석하였을 때 중간엽 줄기세포의 세포 표면 인자는 SH2, SH3, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a, CD124로 알려져 있고, 조혈모세포(hematopoietic stem cell)의 세포 표면 인자인 CD14, CD34, CD45 등은 발현되지 않음이 보고되었으나(pittenger et al, Diabetes Care. 1999), 아직까지 중간엽 줄기세포만을 순수하게 분리할 수 있는 특이적이고 보편적인 마커는 알려져 있지 않다.

인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 구분하기 위하여 형광물질 부착 항체(fluoresence conjugated antibody)를 이용하여 유세포 분석기로 분석한 결과, 중간엽 줄기세포의 표지자로 널리 알려진 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 및 HLA-ABC는 본 발명자들에 의해 분리된 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포에서 모두 양성을 나타내었다. 따라서, 세포 표면 마커(cell surface marker)에 대한 특이적 단일 항체의 개발 연구만으로는 형태학적으로 유사한 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 구분하기가 매우 어렵다.

또한, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 세포치료제의 특성상 임상적으로 신속하게 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 분별해야 하는 문제가 있는데, 기존의 분별법인 FACS 분석이나 분화유도 방법은 보다 많은 시간이 소요되므로 신속하고 정확한 분별 방법이 절실히 요구되는 실정이다.

중간엽 줄기세포는 근육조직, 지방조직, 연골조직, 뼈조직 등의 근간이 되는 세포들로 분화가 가능하고, 현재 각각의 분화능력과 조절에 관한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.

중간엽 줄기세포로부터 시험관 내에서 골세포(osteoblast)로의 분화는 단층 배양 상태에서 10% 우태아 혈청이 함유된 기본 배양액에 덱사메타손(dexamethasone), 아스코빅산(ascorbic acid), β-인산글리세롤(β-glycerolphosphate)을 첨가하여 유도된다. 골세포로의 분화는 증식 (proliferation), 기질 형성 (matrix maturation), 무기질 침착(mineralization)의 세 과정으로 진행되는데, 증식기에 나타나는 표지로서는 DNA 양의 증가, c-fos, c-myc 등이 있으며, 기질 형성기에는 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase)와 콜라겐 타입Ｉ(collagen type I)이 발현되며, 무기질 침착기에는 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오클라신(osteoclacin), 무기질화된 작은 덩어리(mineralized nodule) 등이 특이적으로 나타나는 표지들이다. 상기 여러 가지 표 지들 중 골형성(osteogenesis)을 증명하기 위하여 가장 많이 쓰이는 것은 첫째, 알칼라인 포스파테이즈의 활성도를 염색이나 생화학적 방법으로 측정하는 것, 둘째, 오스테오클라신의 발현을 mRNA나 단백질 단위에서 측정하는 것이다. 특히 사람 중간엽 줄기세포에서 오스테오클라신의 발현은 비타민 D에 의하여 유도된다. 셋째, 하이드록시아파타이트(hydroxyaptite)에 의하여 형성되는 무기질화된 작은 덩어리를 관찰하는 것인데, 이를 위해서는 유기 또는 무기 인산을 배양액에 첨가하여야 하며, 본 코사(von Kossa) 염색에 의하여 확인할 수 있다.

인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포로부터 시험관 내에서의 연골세포 분화(chondrogenic differentiation)는 관절 연골로부터 분리된 연골 세포를 배양시 단층 배양 상태에서는 연골 세포 고유의 표현형을 잃어버리고 탈분화되는 것을 관찰할 수 있으며, 탈분화된 연골 세포를 단층 배양이 아닌 삼차원적 배양법으로 바꾸어주면 연골 세포의 표현형이 재발현되는 현상을 관찰할 수 있다. 연골 세포로의 분화는 조직학적으로 사프라닌(safranin)이나 알시안 블루(alcian blue)와 같은 이염(metachromatic) 염색법으로 세포외 기질 중 GAG(glycosaminoglycan) 성분을 관찰하고, 특히 연골 세포 표현형의 대표적 마커인 콜라겐 타입 II의 발현을 관찰하므로 확인할 수 있다.

인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포로부터 지방 세포로의 분화 유도는 중간엽 줄기세포의 증식이 이루어지고 있는 상태에서는 결코 지방 세포로 분화되지 않기 때문에 지방 세포로의 분화는 컨플루언트(confluent)한 단층 배양에서 유도되어야 한다. 먼저 10% 혈청, 덱사메타손, 3-아이소부틸-1-메틸잔틴(methylxanthine; IBMX), 인슐린, 인도메타신 등이 첨가된 분화 유도 배지로 2~3일간 배양시 세포질에서 작은 지질 액포(lipid vacuole)가 나타나기 시작한다. 이후 IBMX와 인도메타신이 제거된 세포배양 배지로 바꾸어 주면 지질 액포는 점점 커지고 합쳐지면서 전형적인 지방 세포의 모습을 보이게 된다. 지방 세포로의 분화를 확인하는 방법은 오일 레드 O(Oil red O) 염색법을 이용하거나, 지방 세포의 특이 마커인 aP₂(fatty acid binding protein)의 발현을 관찰하는 것, 그리고 지방 세포로 분화하는데 마스터 유전자(master gene)로 알려진 PPAR(peroxisome proliferatior-activated receptor) 유전자(α,γ,δ)들의 발현을 RT-PCR 등으로 관찰하는 방법이 있다. 그 외 지방 세포에서 증가하는 효소인 글리세롤-3-인산 탈수소효소 활성을 화학적으로 측정하는 방법도 있다.

이상과 같이 지금까지는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 분화 이전에 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 형태학적으로 유사한 섬유아세포를 선별할 수 있는 확실하고 신속 정확한 방법은 없으며, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 세포 치료제 개발을 위해서는 먼저 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 구별할 수 있는 특이적 마커 개발이 절실하게 필요한 실정이다.

따라서, 본 발명은 형태학적으로 유사한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 좀더 신속하고 과학적으로 확인할 수 있는 마커를 제공하려는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 마커를 이용하여 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 분별하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 마커의 존재 여부를 확인할 수 있는 키트를 제공하려는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 구분할 수 있는 마커를 찾던 중 G-CSF가 섬유아세포에서만 발현됨을 확인하여 본 발명에 이르게 되었다.

G-CSF(Granulocyte colony stimulating factor)는 단핵구, 대식세포(macrophage), 혈관내피세포, 섬유모세포, 골수간질세포 및 호중구 등에 의하여 생산되는 과립구전구세포의 증식·분화, 그리고 마지막 단계에서의 활성화 즉, 탐식기능 향상, 호흡폭발(respiratory burst)과 관련된 세포대사 야기, 항체 의존성 세포독성 등을 특이적으로 자극하는 조혈인자로 보고되어 있다(Nagata, 1994 The Cytokine Handbook. 2nd ed. Thompson, A. Academic Press, London). 이러한 G-CSF 는 GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor) 등과 같은 조혈성장인자(haematopoietic growth factors family)에 속하는 분자량 19,000dalton의 당단백으로, 활성화된 대식세포(macrophage), 내피세포 (endothelial cell)와 섬유아세포(fibroblast)에서 분비되며, 활성화된 T 세포, 대식세포, 혈관 내피세포(vascular endothelial cells), 섬유아세포에 의해 만들어져, 과립구(granulocytes)가 될 세포들에 작용한다(Nicola, J. Biol . Chem., 1983).

이러한 G-CSF의 주된 생리학적 기능은 항체의존성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity)을 향상시키고, 조혈계 세포들의 형성을 자극하며, 이들 세포가 과립세포로 분화되도록 자극하고, 호중구 과립세포의 기능과 분화를 촉진시킨다(Nagata, et al., Nature, 1986).

본 발명은 형태학적으로 섬유아세포 유사 세포인 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 분별할 수 있는 G-CSF의 유전자를 분자생물학적 기법인 역전사 중합 효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 이용하여 증폭함으로써 손쉽게 확인할 수 있는 분별 방법에 관한 것이다.

본 발명의 마커 유전자인 G-CSF의 발현은 G-CSF 유전자 또는 그 단편에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 센스 프라이머 및/또는 안티센스 프라이머를 이용하여 공지의 방법을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR 등의 방법으로 측정 가능하다. 이러한 프라이머는 마커 유전자의 DNA 영역 중에서 단백질을 코딩하는 DNA 영역의 일부 또는 전부의 배열이 함유되;고 적어도 15bp 길이, 바람직하게는 15~25bp의 DNA이어야 한다. 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 2의 프라이머들을 사용할 수 있다. 본 발명에서 상보적이란 적어도 15개의 연속 염기배열에서 완전히 상보적인 배열인 경우로 제한하지 않고 염기 서열상에서 70%, 바람직하게는 80% 이상의 상동성이 있으면 된다. 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 널리 알려진 바와 같이, 70% 이상의 상동성을 가지면 안정적인 이중쇄 구조를 형성하여 PCR 반응을 진행할 수 있기 때문이다.

또한, 본 발명의 마커 유전자의 발현은 마커 유전자(G-CSF) 또는 그 단편을 프로브(probe)로 사용한 공지의 혼성화 반응을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면 노던 하이브리다이제이션("Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52), 인시츄 하이브리다이제이션(Jacquemier 등, Bull Cancer 90: 31-8, 2003) 또는 마이크로어레이(Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003) 등의 방법으로 측정할 수 있다. 프로브는 마커 유전자의 염기 서열을 함유한 통상 200bp~500bp이며 바람직하게는 400bp~500bp의 길이를 가진다. 염기 서열은 마커 유전자의 염기 서열과 각각 70% 이상의 유사성을 가지면 된다. 본 발명의 마커 유전자의 프로브는 마커 유전자의 센스 프라이머 및/또는 안티센스 프라이머를 이용한 PCR 등의 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명은 분별하고자 하는 세포에 대하여 항 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors) 항체를 이용하여 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors)의 존재를 확인하여 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 분별하는 방법에 관한 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 분별하고자 하는 세포로부터 단백질을 추출한 후 항 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors) 항체를 이용하여 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors)의 존재를 확인하여 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 분별하는 방법에 관한 것이다.

상기 마커 유전자의 발현 양은 G-CSF 단백질의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. 상기 방법에서 단백질은 G-CSF에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 통상적인 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 및 면역침강법 등에 의해 정량화될 수 있다.

본 발명의 마커 유전자에 대한 항체는 G-CSF 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 G-CSF 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩타이드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩타이드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.12-11.13), 모노클로날 항체(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.4-11.11) 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 폴리클로날 항 체의 일부, 모노클로날 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체(Methods in Enzymology 203, 99-121 (1991)등의 특수항체도 포함된다.

또한 본 발명의 섬유아세포 분별용 키트는 상기 마커 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머 또는 프로브 이외에 RNA 또는 폴리 (A)⁺ RNA 분리 시약을 더 포함할 수 있으며, 마이크로어레이를 통하여 발현량을 조사하는 경우에는 마커 유전자의 고형지지체를 포함한다.

또한, 본 발명은 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors)에 대한 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 프로브로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 1종 이상을 포함하여 구성되며, G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors) 유전자의 발현을 확인할 수 있는 섬유아세포 분별용 키트에 관한 것이다.

나아가, 본 발명은 항 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors) 항체를 포함하여 구성되며, G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors)의 존재를 확인할 수 있는 섬유아세포 분별용 키트에 관한 것이다.

아래에서는 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 자명하다.

실시예 1: 섬유아세포의 선별 및 배양

(1) 섬유아세포의 배양: 섬유아세포는 cambrex사에서 섬유아세포-성인(cat. NO : cc-2611)과 섬유아세포-신생아(cat. NO : cc-2609)를 구입하여 실험에 사용하였다. 분양받은 세포는 5% CO₂가 함유된 37℃ 배양기에서 DMEM (Dubecco's modified eagle medium)-low glucose를 이용하여 계대 배양하여 실험에 이용하였다.

실시예 2: 인간 제대혈 채집 및 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 분리, 배양

(1) 인간 제대혈 채집

인간 제대혈은 산모의 동의하에 출산 직전의 태반으로부터 채집하였다. 44.8㎖의 응집방지제(anticoagulant)를 포함하는 백(녹십자, 한국)을 사용하였다. 채집 후 24시간 내에 인간 제대혈을 사용하였다.

(2) 인간 제대혈로부터 중간엽 줄기세포의 분리와 배양

인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 다음과 같은 방법으로 분리하였다[STEM CELLS, 2004, 22, 625-634]. 간단히 설명하면, 단핵 세포들을 분리하기 위하여 각 인간 제대혈 유닛은 5% CPD-A(Sigma)를 함유한 PBS로 1:1 희석하였고, Ficoll-Hypaque 용액(Amersham, Germany) 상에 조심스럽게 로딩하였다. 23,000rpm으로 30분간 실온에서 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation)한 후, 단핵 세포들은 층간(interphase)에서 수집하여 PBS/5% CPD-A로 두 번 세척하였다. 제대혈 유래 단핵 세포들은 MSCGM 배지(Cambrex Bioscience, Notiingham, UK)가 있는 6-웰 플레이트(Falcon, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)에 10⁶cells/㎠의 밀도로 시딩하였다. 5% CO₂가 함유된 37℃의 습한 환경에서 오버나잇 배양한 후 부착되지 않은 세포들은 제거되고 신선한 배지를 웰에 가하였다. 배양 상태를 유지하면서, 남아있는 미부착 세포들은 7일마다 배지를 교체하여 제거하였다. 배양한 웰은 부착 세포의 성장한 콜로니(developing colonies)를 얻기 위하여 계속하여 스크리닝하였다. 세포들은 0.05% trypsin/EDTA(Invitrogens)에서 5분간 배양하여 분리시키고, 하비스트하고, 1계대 및 그 이후의 세포로서 5,000cells/㎠ 밀도로 교체해 주었다.

실시예 3: 역전사 -중합효소 연쇄반응( RT - PCR )을 이용한 G- CSF 의 발현 확인

6-웰 플레이트 내에서 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 및 섬유아세포를 수확한 다음, 이지블루 키트(iNtRON, 한국)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA 1㎍으로부터 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 키트(BIONEER, 한국)를 이용하여, 제조자의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였다. G-CSF에 특이적인 올리고머를 사용하여, cDNA를 증폭시켰다. 증폭반응에 사용한 서열과 사이즈는 다음과 같다. G-CSF(335bp) 센스 프라이머: 5'-agcttcctgctcaagtgcttagag-3'(서열번호 1); 안티센스 프라이머: 5'-ttcttccatctgctgccagatggt-3'(서열번호 2); GAPDH(300bp, 대조 군) 센스 프라이머: 5'- agccacatcgctcagacacc- 3'(서열번호 3); 안티센스 프라이머: 5'-gtactcagcgccagcatcg-3'(서열번호 4). 증폭반응에 사용한 온도조건은 다음과 같다[분리(denaturation) 94℃, 1분, 혼성(annealing) 50℃, 1분, 연장(elongation) 72℃, 1분]. 이와 같은 사이클을 총 32회 반복해서 증폭 반응을 실시하여 2% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동(electrophoresis)하고 G-CSF 및 GAPDH의 발현을 UV 하에서 확인하였다.

그 결과는 표 1 및 도 1과 같다. 즉, 표 1에서 알 수 있듯이 섬유아세포-성인(cat. NO : cc-2611),섬유아세포-신생아(cat. NO : cc-2609), 출원인 (주)제이비줄기세포연구소의 양막(amniotic membrane)에서 분리한 섬유아세포, 내막(endometrium)에서 분리한 섬유아세포, 태반(placenta membrane)에서 분리한 섬유아세포에서는 G-CSF가 발현됨을 확인하였으나, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인 UCB-MSC 401, UCB-MSC 490, UCB-MSC 693, UCB-MSC 780, UCB-MSC 811, UCB-MSC 976 및 UCB-MSC 978에서는 G-CSF가 발현되지 않음을 확인하였다. 또한, 도 1에서 알 수 있듯이 대조군으로 사용한 GAPDH는 섬유아세포나 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 모두 관찰할 수 있었고(b), 반면 G-CSF(335bp)는 섬유아세포에서만 발현되고 중간엽 줄기세포에서는 발현되지 않았음을 확인하였다(a).

분류	종류	G-CSF 발현 여부
Fibroblasts	HDF-Adult	+
	HDF-Neonatal	+
	Amniotic membrane	+
	Endometrium	+
	Placenta (membrane)	+
hUCB-MSC	hUCB-06-00401	-
	hUCB-06-00490	-
	hUCB-06-00692	-
	hUCB-06-00780	-
	hUCB-06-00811	-
	hUCB-07-00976	-
	hUCB-07-00978	-

(+)는 G-CSF 발현, (-)는 G-CSF 미발현

실시예 4. 웨스턴 블랏을 이용한 G- CSF 발현 변화 조사

10cm 배양접시 내에서 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 및 섬유아세포를 수확한 다음, 세포 용해액[cell lysis buffer; Intron (cat.No 17081)]을 이용하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질의 정량은 브레드포드 용액[bradford solution; Intron (cat.NO 21011)]을 사용하였으며, 정량한 단백질을 이용하여 G-CSF 발현을 조사하기 위하여 웨스턴 블랏(Western blot)을 수행하여 확인하였다. 그 결과는 도 3과 같다. 도 3을 통해 알 수 있듯이, 대조군으로 사용한 β-액틴은 섬유아세포나 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 모두 관찰할 수 있었고(b), 반면 G-CSF(20kDa)는 섬유아세포에서만 발현되고 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서는 발현되지 않았음을 확인하였다(a).

실시예 5. FACS 분석

G-CSF가 발현되지 않은 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 분별한 후 계대배양을 진행하였다. 계대배양이 진행된 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 중에서 증식 및 배양상태가 양호한 P4에서 P8사이의 세포를 선별하여 유세포 분석기를 이용하여, 표면 항원의 발현 여부를 검사하였다.

FACS 분석을 위한 항원 단백질은 조혈모 줄기세포의 항원인 CD14, CD34, CD45와 간엽 줄기세포의 대표 항원인 CD73, CD90, CD105 등을 주로 확인하며 이 밖에도 HLA type I, II와 인테그린(CD29)이나, CAM(CD44), CD74, CD106 등을 이용하였다.

실시예 6. 분별된 중간엽 줄기세포 분화 유도

6-1) 지방세포 분화: 지방세포 분화용 전용배지(AM)에서 2주 내지 3주간 분화 유도시킨 간엽 줄기세포를 Oil red O 염색법을 이용하여 지방분화 정도 즉, 지방 소포(lipid vesicle) 생성을 확인하였다. 지방세포 분화용 전용배지(AM)는 0.5mM 아이소부틸-메틸잔틴(isobutyl-methylxanthine; IBMX), 1uM 덱사메타손(dexamethasone), 10uM 인슐린, 200uM 인도메타신이 함유된 10% FBS/DMEM-HG이다.

6-2) 신경세포 분화: 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포로부터 시험관 내에서 신경세포로의 분화를 위하여 10% Fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine과 1X Antibiotic-antimycotic이 함유된 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)-low glucose를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(2.5 × 10⁵cells/ml)를 6-웰 플레이트에 배양하였다. 세포가 confluence에 도달하면 첫째 날에 1차 분화를 위하여 Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) 배지에 5ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF), 0.5 μ㏖/L retinoic acid 그리고 1m㏖/L 2-mercaptoethanol을 처리하고 3일 동안 배양하였다. 3일 동안 배양한 배지를 제거 후 phosphate buffered saline (PBS)로 2번 세척하고 2차 분화를 위하여 IMEM 배지로 갈아주고 1μ㏖/L cyclic adenosine monophosphate (cAMP)를 처리하고 3일 동안 배양하였다. 3일 동안 배양한 배지를 제거 후 PBS로 2번 세척하고 3차 분화를 위하여 IMEM 배지로 갈아주고 10 μ㏖/L hydrocortison과 1m㏖/L cAMP를 처리한 후 3일 동안 배양한다. 3일 동안 배양한 배지를 제거 후 PBS로 2번 세척하고 4차 마지막 분화를 위하여 20 ng/ml acidic fibroblast growth factor (aFGF), 10 ng/ml sonic hedgehog (SHH), 10 ng/ml brain-derived growth factor (BDNF), 10 ng/ml nerve growth factor (NGF), 25 ng/ml vitronectin, 0.1 m㏖/L IBMX, 10 μ㏖/L forskolin 그리고 20 n㏖/L PMA을 처리하여 신경분화를 유도하였다.

신경분화 마커로는 네스틴(nestin), GFAP(fibrillary acidic protein), MAP2(microtuble-associated protein)을 이용한다.

6-3) 골세포 분화: 골세포 분화용 전용배지(OM)에서 2주 내지 3주간 분화유도시킨 중간엽 줄기세포를 von Kossa 염색법(calcium mineralization)을 이용하여 골 분화 정도를 확인하였다.

골세포 분화용 전용배지(OM)의 조성은 0.1uM 덱사메타손(dexamethasone), 50uM 아스코르베이트 2-인산(ascorbate-2-phosphate), 10mM 베타 글리세롤 인산(beta-glycerol phosphate)이 함유된 10% FBS/DMEM-LG이다.

지방분화 배지에서 3주 동안 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 배양하여 지방세포로의 분화를 유도하고, Oil red O 염색법을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 도 7과 같이 본 발명의 방법으로 분별된 중간엽 줄기세포가 지방세포로 분화된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화한 신경세포는 도 8에 나타내었다. 형태학적 모습을 보면 핵이 커지고 엑손이 형성됨을 확인하였다. 상기 결과로부터 본 발명의 방법으로 분별된 중간엽 줄기세포가 신경세포로 분화됨을 확인할 수 있었다.

또한, 골형성 세포 분화 배지에서 3주 동안 본 발명의 방법으로 분별된 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 배양하여 골형성 세포로의 분화를 유도하고, von Kossa 염색법을 이용하여 분석하였다. 그 결과 도 9와 같이 칼슘이 축적됨을 확인하여 중간엽 줄기세포가 골형성 세포로 분화된 것을 확인할 수 있었다.

비교예 1: RT - PCR 를 이용한 GM - CSF mRNA 발현에 대한 영향 조사

G-CSF와 같이 조혈모세포 성장인자인 GM-CSF(286bp) 센스 프라이머: 5'-gtctcctgaacctgagtagagaca-3'(서열번호 5); 안티센스 프라이머: 5'-aaggggatgacaagcagaaagtcc-3'(서열번호 6)이며, 증폭반응에 사용한 온도조건은 다음과 같다[분리(denaturation)-94℃, 45분, 혼성(annealing)-55℃, 45분, 연장(elongation)-72℃, 45분]. 상기 사이클을 총 35회 반복해서 증폭 반응을 실시하였다. 다른 조건은 상기 실시예 3과 동일하게 실시하였다. 증폭 반응을 실시하여 2% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동(electrophoresis)하고 GM-CSF 및 GAPDH의 발현을 UV 하에서 확인하였다.

결과는 도 2에 나타내었다. GAPDH와 마찬가지로, GM-CSF는 섬유아세포와 중간엽 줄기세포 모두에서 발현되었다.

상기와 같이, 본 발명에서 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 분별하는 G-CSF 유전자는 섬유아세포에 특이한 마커로서, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발을 위한 제 1단계인 세포 선별과정에서 좀더 신속하고 과학적으로 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 분리할 수 있게 되었다.

<110> JB STEM CELL INSTITUTE, INC. <120> A DISTINGUISHING METHOD OF FIBROBLAST FROM MESENCHYMAL STEM CELL DERIVED FROM HUMAN UMBILICAL CORD BLOOD <130> 0705-JB-001 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of granulocyte colony-stimulating factor <400> 1 agcttcctgc tcaagtgctt agag 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of granulocyte colony-stimuating factor <400> 2 ttcttccatc tgctgccaga tggt 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of glyceraldehyde phosphate dehydrogenase <400> 3 agccacatcg ctcagacacc 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of glyceraldehyde phosphate dehydrogenase <400> 4 gtactcagcg ccagcatcg 19 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of granulocyte macrophage colony-stimulating factor <400> 5 gtctcctgaa cctgagtaga gaca 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of granulocyte macrophage colony-stimuating factor <400> 6 aaggggatga caagcagaaa gtcc 24

Claims

역전사 중합 효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors) 유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함하며, G-CSF 유전자가 발현되는 것을 섬유아세포로 판정하는 것을 특징으로 하는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 분별하는 방법.
분별하고자 하는 세포에 대하여 항 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors) 항체를 이용하여 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors)의 존재를 확인하여 G-CSF가 존재하는 것을 섬유아세포로 판정하는 것을 특징으로 하는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 분별하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 분별하고자 하는 세포로부터 단백질을 추출한 후 항 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors) 항체를 이용하여 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors)의 존재를 확인하여 G-CSF가 존재하는 것을 섬유아세포로 판정하는 것을 특징으로 하는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포를 분별하는 방법.
G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors) 유전자, G-CSF 유전자에 대한 센스 프라이머, G-CSF 유전자에 대한 안티센스 프라이머 및 G-CSF 유전자에 대한 프로브로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 1종 이상을 포함하여 구성되며, G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors) 유전자의 발현을 확인하여 G-CSF 유전자가 발현되는 것을 섬유아세포로 판정하는 것을 특징으로 하는, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포의 혼합물 중 섬유아세포를 분별하는 용도의 키트.
항 G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors) 항체를 포함하여 구성되며, G-CSF(granulocyte colony-stimulating factors)의 존재를 확인하여 G-CSF가 존재하는 것을 섬유아세포로 판정하는 것을 특징으로 하는, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 섬유아세포의 혼합물 중 섬유아세포를 분별하는 용도의 키트.