JP2005253442A - 発現プロファイルが人間の歯髄幹細胞と間葉幹細胞の間で異なる遺伝子のグループ - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明の目的は，歯原性細胞と骨原性細胞の代表群としてのヒトの歯髄幹細胞(hSPSCs)および間葉幹細胞(hMSCs)間の遺伝子発現プロファイルとクラスタ解析を明らかにし，発現プロファイルが人間の歯髄幹細胞および間葉幹細胞間で異なる遺伝子のグループを特定することである。
【解決手段】 本発明は，発現レベルが，骨に分化し，DMP1，DSPPおよびALPを発現するよう誘導されたヒトの歯髄幹細胞内でヒトの間葉幹細胞と比較して変化する，明細書の表II，IIIまたはVIに列挙されている遺伝子のグループを提供する。
【選択図】 なし

Description

本発明は，発現プロファイルが，人間の歯髄幹細胞と間葉幹細胞の間で異なる遺伝子のグループ，およびこれら遺伝子を用いる歯胚の再生法に関するものである。

種々の幹細胞群は，それが初めに誘導された組織のすべてまたは一部を再生する能力で特定されている(非特許文献1)。最近，象牙芽細胞に発育する能力がある，象牙質の無機物化された基質を形成する，人間の歯髄幹細胞(DPSCs)群が特定された(非特許文献2，3)。生体内で，人の成人の歯は生え変わらず，骨髄や骨の再生能力とは対照的に歯髄構造を修復する能力が限定されていることを示している。従って，DPSC群を収容する成人歯髄組織の機能上の有意性は不明のままである。また，歯髄内のDPSCの正確な起源と場所の決定は今後の課題であるが，生体内で象牙質/歯髄様複合体を形成するその能力は，免疫不全動物への移植後の，骨髄間質幹細胞(BMSSCs)，「間葉幹細胞(MSCs)」の骨形成能力に類似している(非特許文献2，4，5)。異所性の層板骨の形成のほかに，MSC移植では，造血および脂質生成要素を含む血管新生骨髄器官がしばしば派生しており，これは対応するDPSC移植では決して観察されない特徴である(非特許文献2)。

歯形成および骨形成の前駆細胞は，それらの個体発生においてはまったく異なる(非特許文献6)にもかかわらず，骨および象牙質の細胞外基質に共通に存在する各種蛋白質の発現に関して，両群とも顕著な類似性を示している(非特許文献2)。唾液腺燐蛋白質(DSPP)は，象牙芽細胞特有の遺伝子で，二つの蛋白質(象牙質の唾液腺蛋白質および象牙質の燐蛋白質)をコード化し，両者とも初期の象牙質形成に関係し，骨には存在しない(非特許文献7，8)。象牙質基質蛋白-1(DMP-1)は，もう一つの象牙芽細胞特有の遺伝子であり象牙質の生体内ミネラル化にみられる酸性燐蛋白質である(非特許文献9)。従ってまず我々は，DSPPおよびDMP-1および骨形成に関係した遺伝子，アルカリ・フォスファターゼの発現を，両細胞の特性を確認するため両細胞で，RNAサンプル内の特定のmRNAsを定量的に検出することを可能とする，リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(PT-PCR)を用いて調べた。機能的に活性な象牙質細胞と骨芽細胞は，形態学，生化学および分子的な基準に基づく一連の過渡的段階を経てそれぞれの前駆細胞群から発生すると考えられる(非特許資文献10，11，12)。しかし，象牙質または骨の最終的な形成に至る仮想的前駆細胞群の分化に寄与する正確な分子の役割についてはほとんど知られていない。人間のDPSCおよびMSCの特徴をさらに解明するため，我々はcDNAマイクロアレイ技術とクラスタ化分析によりそれらの遺伝子発現プロファイルを分析することを選んだ。我々はまた，これら二つの幹細胞群間の遺伝子発生のパターンを比較するため，クラスタ化アルゴリズムによる機能的分析法も評価した。

DNAマイクロアレイは，単一検定で数万の異なる配列を定量測定する手段を提供する。マイクロアレイの最も普及した使用法は，発現プロファイリング(非特許文献13，14)で，これは遺伝子機能の解明(非特許文献15，16)，薬物評価(非特許文献16~18)，パスウェイ解析(非特許文献19)，および臨床サンプルの分類(非特許文献20，21)を含む多くのが見出されている。マイクロアレイハイブリダイゼーションからの全ゲノムの発現データのクラスター解析方式は，遺伝子発現パターンにおける類似性に従って遺伝子を配列する標準統計アルゴリズムを用いて記述される。従って，それは各データ点を元の実験結果を定量的および定性的に反映する色で示すことにより，クラスタ化法と一次データのグラフィックな表現を組み合わせている。出力はグラフィカルに表示され，生物学者に直感的に分かりやすい形でクラスタ化および基礎となる発現データを同時に伝えている。対の類似性関数で評価された遺伝子間の関係が，枝の長さが遺伝子間の類似性の程度を反映するツリーによって示される。性格付けが十分でない既知機能の遺伝子，または新しい遺伝子の共発現により，現在情報が得られていない多くの遺伝子の機能を解明する簡単な手段がえられる。また，計算されたツリーは，類似の発現パターンを持った遺伝子または遺伝子グループが隣接するよう，元のデータテーブルで遺伝子を並べかえるために用いることができる。整理されたテーブルは，ついで上記のように遺伝子間の関係を示すツリーの表現で，グラフィッカルに表示できる。この研究で我々は，12,814個の遺伝子からなるAgilentヒト遺伝子マイクロアレイ法を用い，マイクロアレイはQuantArrayソフトウエアを用いて解析された。遺伝子発現レベルのプロファイリング解析は極めて有益な情報をもたらす。組織化目的で，蛋白をコード化する機能に基づいて遺伝子をプロファイリングするため，我々は既存の機能分類を用いた(非特許文献22)。

Vacanti等は，成長調節要因と生体適合性の足場と，分離された細胞から形成される構造物を用いた新しい組織の形態生成を含む，組織工学と呼ばれる固体器官移植の新しい技術を述べている(非特許文献23)。総合して，我々は同じ様に無機質化された組織に関係する二つの異なる前駆細胞群の遺伝子発現パターンを記述し，象牙質と骨の成長にみられる多くの遺伝子の機能的な役割をさらに解明するための基礎を提供する。将来，我々は遺伝子技術と組織工学法を用いてMSCの代わりに，自己再生能力と多重系列分可能を含む，幹細胞のような性質を持ったDPSCを用いることができるかもしれない。

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本発明の一つの目的は，象牙質前駆細胞および骨前駆細胞の代表群としてヒト歯髄幹細胞(hDPSCs)と間葉幹細胞(hMSCs)間で，遺伝子発現プロファイルを明らかにし，また，クラスタ分析を行い発現プロファイルがヒト歯髄幹細胞と間葉幹細胞間で異なる遺伝子のグループを特定することである。本発明のもう一つの目的は，これらの遺伝子を用いて歯胚を再生する方法を提供することである。

本発明は，骨に分化するよう誘導され，DMP1，DSPPおよびALPを発現するヒト歯髄幹細胞内でヒト間葉幹細胞と比較して発現レベルの増加する明細書の表IIに列挙されている遺伝子グループを提供する。

本発明はさらに，骨に分化するよう誘導され，DMP1，DSPPおよびALPを発現するヒト歯髄幹細胞内でヒト間葉幹細胞と比較して発現レベルが減少する，明細書の表IIIに列挙されている遺伝子グループを提供する。

本発明はさらに，骨に分化するよう誘導され，DMP1，DSPPおよびALPを発現するヒト歯髄幹細胞内でヒト間葉幹細胞と比較して発現レベルが変化する，明細書の表VIに列挙されている遺伝子グループを提供する。

本発明はさらに，上記に列挙される遺伝子グループの少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを分析することからなる，細胞から歯胚への再生能力を評価する方法を提供する。

本発明はさらに，歯胚を構成する細胞に分化するよう細胞を誘導するため，明細書の表II，IIIまたはVIに列挙されている遺伝子，またはそのアンチセンス遺伝子をヒト歯髄幹細胞へ導入することからなる歯胚を再生する方法を提供する。

本発明はさらに，歯胚を構成する細胞に分化するよう細胞を誘導するため，明細書の表II，IIIまたはVIに列挙されている遺伝子の発現レベルを変更できる物質または刺激をヒト歯髄幹細胞へ導入または印加することからなる，歯胚を再生する方法を提供する。

本発明により，象牙質前駆細胞および骨前駆細胞の代表群としてのヒト歯髄幹細胞(hDPSCs)および間質幹細胞(hMSCs)間の遺伝子発現プロファイルおよびクラスタ解析が明確にされ，発現プロファイルがヒト歯髄幹細胞と間葉幹細胞間で異なる遺伝子のグループが特定された。本発明の遺伝子グループを歯髄幹細胞と間葉幹細胞と共に使用することにより，歯胚，歯髄，象牙質または骨のような硬い組織を再生できる。

本発明者は，象牙質前駆細胞と骨前駆細胞それぞれの代表群として，ヒト歯髄幹細胞(hDPSCs)と間葉幹細胞(hMSCs)間の遺伝子発現プロファイルとクラスタ解析を検討した。まず本発明者は，全RNA内のリアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いて，一次培養からアルカリホスファターゼ(ALP)活性，象牙質基質蛋白1(DMP1)，象牙質燐唾液蛋白(DSPP)の差異的な発現を確認した。骨誘導の後に24日の培養時間で，これら遺伝子の高い発現が，hDSPCsおよびhMSCsで見出された。また全RNAは，逆転写されてcDNAプローブを生成し，ついで12,814遺伝子からなるAgilentヒト遺伝子マイクロアレイシステムでハイブリダイズされた。マイクロアレイは，QuantArrayソフトウエアを用いて分析された。

遺伝子発現データのクラスタ化により，既知の類似機能をもつ同様に効率的な遺伝子として分類されることがhDPSCsおよびhMSsCで見出された。このように，ゲノムワイドな発現実験で見られるパターンは，細胞外基質成分(コラーゲンタイプVII，XIII，XVII，基質グラ蛋白質，骨唾液蛋白質，基質メタロプロテナーゼ，アネキシン，トロンボスポンディン)，細胞接着分子(インテグリンα2，7，11，β2)，増殖因子(IGF-I，II，IL-8，11，TNF-α，BMP-2，4)をコード化する，いくつかの遺伝子の性質の表示として解釈でき，転写調節因子(Jun-B)は，骨芽細胞および象牙芽細胞の成長と機能に関係していることが報告されている。また，性格付けが不十分な既知機能の遺伝子または新しい遺伝子の共発現により，情報が現在得られていない多くの遺伝子の機能を獲得する簡単な手段がえられる。遺伝子発現の相違の機能解析およびクラスター解析により，上方に発現調節された遺伝子の全体的な発現の状態を，細胞間シグナリングまたは細胞間通信または代謝関連であると特徴づけできることが明らかになった。

本発明は，無機質化した組織に関係する二つの異なる前駆細胞群の遺伝子発現パターンを提供し，また象牙質または骨の発育に見られるこれら遺伝子の多くについて機能的役割をさらに解明するための基礎を提供する。本発明を利用して，遺伝子技術を用いてhMSCsの代わりに，自己再生能力と多重系列分化能を含む，幹細胞様の特質を持つ，hDPSCsを使用できるようになる。
本発明は下記の実施例で説明されるが，本発明の範囲はこれらの例に限られない。

（A)実験手順
(1) 材料と細胞培養
名古屋大学病院，再生歯科・口腔顎顔面外科で，患者への告知に基づく同意のもと，正常なヒト埋伏第3臼歯が成人(16〜24歳)から集められた。歯の表面が清掃され，消毒された歯科フィッシャーバーを用いて，セメント質とエナメル質の接合点の周りを切断し，歯髄チャンバーを露出させた。歯髄組織を歯冠と歯根から丁寧に分離し，体外培養を行った。

間葉幹細胞(MSCs)は，既報の方法(Pittenger, M. F., Mackay, A. M., Beck, C. B., Jaiswal, R. K., Douglas, R., Mosca, J. D., Moorman, M. A., Simonetti, D. W., Craig, S., and Marshak, D. R. (1999) Science 248, 143-147 Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells)に従って処理され、同じ患者の骨髄吸引液からえられた。手短にいえば，基本培地，低グルコースDMEMおよび増殖サプリメント物(間葉細胞増殖サプリメント50ml，200mM L-グルタミン10ml，ペニシリン25単位とストレプトマイシン25μgを含むペニシリン・ストレプトマイシン混合物0.5ml)がBioWhittaker Inc. (Walkersville, MD)から購入された。骨形成を誘導する三つのサプリメント，デキサメサゾン(Dex)，ナトリウムβ・グリセロ燐酸塩(β-GP)およL-アスコルビン酸2燐酸塩(AsAP)が，Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)から購入された。細胞は，37oCで95%の空気と5%のCO₂を含む加湿された雰囲気で培養された。我々は，対照用培地の0.2ml/cm²内に3.1×10³細胞/cm²の密度でMSCを播種した。

口腔粘膜(手術中に取れた余分の組織)が，名古屋大学病院で処置された同じ患者から得られた。細胞は，Ueda等(上田, M., Hata, K., Horie, K., Torii, S. (1995) Ann Plast Surg 35:498-504 The potential of oral mucosal cells for cultured epithelium: A preliminary report)の方法で分離された。培地は同様に調整された培地が使用された。

(2) リアルタイムRT-PCR分析
リアルタイムRT-PCR分析が，既報の方法(Gibson, U. E. M., Heid, C. A., and Williams, A. (1996) Genome Res 6:995-1001: Novel method for real time quantitative RT-PCR; and Heid, C. A., Stevens, J., Williams, P.M. (1996) Genome Res 6: 986-994 Real time quantitative PCR)に従って行われた。手短にいえば，遺伝子特異的なPCRのオリゴノクレチオドのプライマー対内で，5' 端をレポーター蛍光色素(FAM)で，また3' 端を消光剤蛍光色素(TAMURA)でラベル化したオリゴノクレチオド・プローブが設計された。プローブが無傷であればレポーター色素発光が消される。PCRサイクルの延長期の間，DNAポリメラーゼの核酸分解酵素活性は対合プローブを解裂させ，レポーター色素をプローブから解放する。PCR増幅中に発生する蛍光の強度は，反応管内で直接シーケンス検出器によってモニターされた(「リアルタイム」)。コンピュータアルゴリズムが，レポーター色素の発光の量を消光色素の発光と比較し，基線の標準偏差の10倍に信号が達したときの閾値サイクル数(C_T)を計算し，これからテストされた各種遺伝子の様々なmRNAの量がえられた(Gibson, U. E. M., Heid, C. A., and Williams, A. (1996) Genome Res 6:995-1001: Novel method for real time quantitative RT-PCR)。

全RNAサンプル(各200ng)が，50μl RT-PCR反応（PCR-Access，Promega）に加えられた。「反応マスター混合物」が，Gibson et al (Gibson, U. E. M., Heid, C. A., and Williams, A. (1996) Genome Res 6:995-1001: Novel method for real time quantitative RT-PCR)の方法に従い，1×鳥類骨髄芽球症ビールスTfl反応バッファー，0.2mM dNTP_s，1.5mM MgSO₄，0.1単位/mlの鳥類骨髄芽球症ビールス逆転写酵素，0.1単位/μl Tfl DNAポリメラーゼ，250nM濃度のプライマー，および200nM濃度の対応プローブの最終濃度を与えるよう，製造業者のプロトコルに従って調製された。DMP1，DSPP，ALP のmRNAのリアルタイムPCR分析用のプライマーとプローブは，Oligo Ver.4.0プログラム(National Bioscience，Plymouth，MN)により，Heid et al (Heid, C. A., Stevens, J., Williams, P.M. (1996) Genome Res 6: 986-994 Real time quantitative PCR)の方法に従って設計された。使用された全オリゴヌクレオチドのシーケンスを表Iに示す。

DMP1 mRNA分析では，プライマー105FおよびDMP1 214Rが使用され，プローブはDMP1 140TaqMan FPであった。DSPP mRNA分析では，プライマーDSPP 163FおよびDSPP 307Rが使用され，プローブはDSPP 283 TaqMan FPであった。ALP mRNA分析では，プライマーALP 783FおよびALP 822Rが使用され，プローブはALP 913TaqMan FPであった。GAPDHプライマーおよびプローブ(TaqMan GAPDH検出試薬)は，Perkin-ElmerおよびApplied Biosystems (Foster city, CA)から購入した。RT-PCR反応および結果のレポーター蛍光色素発光の相対的な増加は，リアルタイムで7000シーケンス検出器(Perkin-Elmer)によりモニターされた。信号はシーケンス検出器1.0プログラム(Perkin-Elmer)により分析された。PCRの条件は以下の通り：2分間50oCで1サイクル，60oCで30分間1サイクル，95oCで5分間1サイクル，95oCで20秒間50サイクル，および60oCで1分間である。

1サンプルでの各mRNAの相対量は，それぞれの標準カーブを計算して得られた。各mRNAの標準カーブは，異なる濃度(4000ng, 2000ng, 1000ng, 500ng, 250ng, 125ng, 62.5ng)のヒト骨髄t-RNA(Clontech, Palo Alto, CA, USA)を用いて得られた。異なるサンプル間の各mRNAの相対量の比較は，各mRNAの相対量を各サンプルでのGAPDH mRANのそれで割って得られたファクターにより行われ，この研究では発現係数と命名された。

(3) cDNAマイクロアレイ分析および階層クラスタ化
主要なヒトMSCsおよびDPSCsの遺伝子発現が，12,814の cDNAsをもつマイクロアレイを用いて調べられた。5μgの全RNAが生体外の転写反応(Luo, L. Salunga, R. C., Guo, H., Bittner, A., Joy, K. C., Galindo, J. E., Xiao, H., Rogers, K. E., Wan, J. S., Jackson, M. R., and Erlander, M. G. (1999) Nat. Med. 5, 117-122 Gene expression profiles of laser-captured adjacent neuronal subtypes)を用いて増幅された。増幅されたRNA(6μg)は，ランダム六量体とアミノアリル-dUTPを用いて逆転写された。合成されたcDNAは，色素(NHS-ester Cy3またはCy5, Amersham)との反応 (Hughes, T. R., Mao, M., Jones, A. R., Burchard, J., Marton, M. J., Shannon, K. W., Lefkowitz, S. M., Ziman, M., Schelter, J. M., Meyer, M. R., Kobayashi, S., Davis, C., Dai, H., He, Y. D., Stephaniants, S. B., Cavet, G., Walker, W. L., West, A., Coffey, E., Shoemaker, D. D., Stoughton, R., Blanchard, A. P., Friend, S. H., and Linsley, P. S. (2001) Nat. Biotechnol. 19, 342-347 Expression profiling using microarrays fabricated by an ink-jet oligonucleotide synthesizer)でラベルされた。ラベル付けされたcDNAは，DNAマイクロアレイ(Agilent Human 1)に適用され，65oCで17時間対合された。洗浄した後，マイクロアレイはScanArray 5000でスキャンされ，画像がQuantArrayソフトウエア(Packard)を用いて解析された。各点の信号強度は，負の対照試料の強度を差し引いて較正された。

ここで調べられた現象に関係のある遺伝子に集中するため，発現ベクトルの角度分離の測定に基づいた階層クラスタ化アルゴリズムが用いられた。このアルゴリズムの目的は，全要素を単一のツリーに結合する樹状図を計算することである。クラスタ化する前に，蛍光強度比(Cy5/Cy3)が各遺伝子について対数変換された。ユークリッド距離(D)が1/exp(D)に変換され，類似性の尺度として使用された。n遺伝子のどのセットについても，対角線上半分の類似性マトリクスが，この尺度を用いて計算され，すべての遺伝子対についての類似性のスコアを含む(最も類似している遺伝子対を示す)最高値を特定するため，マトリクスがスキャンされる。これら二つの遺伝子を結合するノードが作成され，遺伝子発現プロファイルには要素が付加された(無い値は除かれ，二つの結合された要素は，それらが含む遺伝子の数で重み付けされた)。類似性マトリクスは，二つの結合された要素をこの新しいノード置き換えることで更新され，処理はただ一つの要素が残るまでn-1回繰り返された。手短にいえば，算術平均を用いる非加重対グループ法(UPGMA)に基づく遺伝子の階層クラスタ化が行われた(Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., and Botstein, D. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14863-14868 Cluster analysis and display of genome −wide expression patterns)。任意の順序付けを用いて表示が行われ，最初のデータテーブルが，測定された蛍光比に基づいて各遺伝子に色付けしてグラフィックに示された。対数比0(比1.0−遺伝子変化なし)で遺伝子は黄色に色付けされれ，正の対数比が増すと赤の強度が増し，負の対数比が増すと青の強度が増す。樹状図表示が色づけされたテーブルに追加されて，テーブル内の遺伝子間の計算された関係の性質を示す。クラスタ解析の後，我々はNCBI LocusLink ( HYPERLINK "http://www.ncbi.nih.gov/LocusLink/" http://www.ncbi.nih.gov/LocusLink/のホームページで入手できる)を参照して，分析ソフトウエア(Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., and Botstein, D. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14863-14868 Cluster analysis and display of genome −wide expression patterns)を用いてクラスタ内の遺伝子間の機能的な関係を求めた。これらの結果は，クラスタ化アルゴリズムが，遺伝子の発現プロファイルによって，協調的に調節される遺伝子をうまく特定できることを示している。このように，我々は，機能的に分類された遺伝子について発現プロファイルのクラスタ化解析をさらに行って，発現プロファイルとその機能の関連を調べた。NCBI LocusLink (表V参照)の各機能的カテゴリーで，有意に上方または下方に発現調節された遺伝子が，同じクラスタ化法で分析された。クラスタ解析は，細胞機能および各サンプル内のいくつかの遺伝子について転写調節機構を理解する新しい見通しを与えた。

(B)結果
(1) 調製または骨誘導培地により成長した場合のhMSCs，hDPSCsおよびhOMCs(口腔粘膜細胞)の形態学的観察
まず我々は，調製(hMSCs, hDMCs)または骨誘導培地でhMSCsまたはhDPSCsから分化したこれら細胞の形態学上の変化を位相差顕微鏡法により調べた。骨誘導培地で成長したhMSCs(I)またはhDPSCs(I)は，形態変化を示した。これに反して，調製培地で成長したhMSCs，hDPSCsまたはhOMCsは紡錘状をしており，これら細胞は同じ形であった。一方，骨誘導培地でのhMSCs(I)は，培地内のhDPSCs(I)より凝縮された形を示した。

(2) 調製または骨誘導培地で培養されたhMSCs，hDPSCsおよびhOMCsのALP, DMP1およびDSPP遺伝子発現
RT-PCR分析を用いて我々は，hMSCs, hDPSCsおよびhOMC内の，骨形成関連遺伝子のmRNAs，ALP，象牙芽細胞に特異的な遺伝子，DMP1，DMPPの相対量を測定した。誘導培地内のhMSCs(I)またはhDPSCs(I)のALP, DMP1およびDSPP mRNAsは，特に18日後に時間に依存して増加したが，調製培地内のhMSCs，hDPSCsおよびhOMCsの発現量は見られなかった(図2A, B, C)。

最大発現が観察された24日目の発現係数の比較は，誘導培地内のhDPSCs(I)のALP, DMP1およびDSPP mRNAの相対量が，誘導培地内のhMSCs(I)のそれの約1.8，1.1，2.6倍，hOMCsの約11.1，9.8，21.1倍，調製培地内のmRNAのそれの約10.8，3.83，32.2倍であることを示した。従って，hDPCs(I)の誘導培地内の象牙芽細胞物量的遺伝子，DMP1およびDSPP,の発現は，hMSCsのそれより高い値を示した。そこで我々は，特にhDPSCs(I)およびhMPCs間の関係に注意し，発現プロファイルを調べた。

これらの相違は，hDPSCs，hMSCsおよびhOMCs内のALP, DMP1，およびDSPP遺伝子発現が，お互いに異なる細胞起源に特有の別々の方法で調節されたことを示唆している。

(3) hDPSCsおよびhMSCsの遺伝子発現プロファイル
我々は，cDNAマイクロアレイ技術を利用し，正常なhDPSCおよびhMSCsを代表する複数の遺伝子の発現プロファイルを比較した。ラベル化されたcDNAプローブが，初代培養から分離された全RNA抽出物から生成され，ついで対合された。アレイは，ScnArray 5000 (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Shelton CT, USA)を用いてスキャンされた。遺伝子強度値は対照遺伝子を用いて規格化された。対合された各点についてのカラーコード指定(hDPSCsは赤；hMSCsは緑)に基づいて，hDPSCsおよびhMSCs発現プロファイルま直接比較が行われた(図3)。図4に，hDPSCsまたはhMSCs内の12,814遺伝子の差分発現のプロットを示す。この実験で我々は，有意な遺伝子発現の変化を，信号密度で2倍以上の変化と定義した。hMSCsと比較して2倍以上に上方調節されたhDPSCs(I)内の遺伝子数は，，614であった(表II, IV)。一方，hDPSCs(I)内で1/2以下に下方調節された遺伝子数は296であった(表III, IV)。我々は，有意に上方または下方調節された遺伝子を，NCBI LocusLinkに従っていくつかの機能カテゴリーに分類した。hMSCsと比較して数が2倍以上または1/2以下に調節された遺伝子hMSCs (I), hDPSCs, hDPSCs (I)内の，ほとんどすべてのカテゴリーで見出された(表IV)。

細胞外基質成分(コラーゲンタイプVII, VIII, VVII，基質グラ蛋白質，骨シアロ蛋白質，基質メタロプロティナーゼ，アネキシン，トロンボスポンジン)，細胞接着分子(インテグリンα2，7，11，β2)，増殖因子(IDF-I，II，IL-8，11，TNF-α，BMP-2，4)および転写調節因子(Jun-B)をコードするいくつかの遺伝子は，骨芽細胞および象牙芽細胞の成長および機能と既に関連付けられている(表II，III)。

(4) クラスタ化解析
Eisen等のクラスタ化アルゴリズム(Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., and Botstein, D. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14863-14868 Cluster analysis and display of genome −wide expression patterns)を用いてクラスタを確定した。このアルゴリズムは，すべてのデータを仕分けして，各実験で最も類似して行動する遺伝子の対を見出し，ついで他の遺伝子を最初の対に漸次追加して見かけ上に共通して調節された遺伝子のクラスタを形成する。また我々は，このクラスタ化法を2セットのデータ，ｈDPSCｓおよびhMSCs間の遺伝子プロファイルに適用した。図5のクラスタ化された画像の著しい性質は，類似の発現パターンを共有する遺伝子グループを示すカラーの連続した領域である。また図5の主要な特徴は，このような画像で見て，関心パターンを特定し，詳細な発現パターンとこれらパターンに寄与している遺伝子の属性へ容易にズームインできることである。我々は，一つ以上のアレイ要素で表現される遺伝子または高度な配列同一性を持った遺伝子が，お互いに直ぐ隣りに，または直ぐ近所にクラスタ化されていることを見出した。さらに，クラスタ化された遺伝子のより大きなグループを調べると，これら遺伝子が発現パターンを共有する傾向があるという，より著しい結果が見出された(図5A)。

特に劇的な例は，組織培養細胞の，骨誘導培地後に調製培地への反応により，hDPSCs(I)およびhMSCs(I)で未分化hMSCsと比較して，上方調節された166遺伝子の，広大なクラスタである(図5B-aに示す)。

図5B-b，c，d，e，f，g，h，iに示すクラスタは，53，145，23，233，9，58，6および11遺伝子を含み，各遺伝子は以下の表現を示した；図5B-bはhDPSCs(I)およびhDPSCsで下方調節されていることを表し，図5-cはhDPSCs(I)で上方調節されていることを表し，特にその誘導された遺伝子(109の内の37または34)のほぼ1/4が細胞間シグナルまたは細胞間通信または代謝に関係しており(表IV)，図5B-dはhDPSCs(I)およびhDPSCsで下方調節されていることを表し，図5B-eは未分化hMSCsと比較して特にhDPSCsで上方調節されていることを表し，図5B-fはhMSCs(I)で上方調節されているがその他の細胞では下方調節された領域にあり，図5B-gは未分化hMSCsと比較して上方調節されていることを表し，図5B-hはすべての細胞で下方調節されていることを表し，図5B-iは，hMSCsと比較して，hDPSCs(I), hDSPCsおよびhMSCs(I)で上方調節されていることを表している。

(5) クラスタ化解析での機能的な遺伝子分類
差分発現を示した遺伝子の多くは，既知の機能の蛋白質をコード化しているが，新規または既知のESTsを含むその他は未知の機能を持った遺伝子に相当する。遺伝子は，既知確立された分類(Pruitt, K. D., Katz, K. S., Sicotte, H., Maglott, D. R. (2000) Trends Genet 16, 44-47 Introducing RefSeq and LocusLink: curated human genome resources at the NCBI)の修正版に基づい分類された。分類は，六つの大機能区分と，大区分内のいくつかの小機能区分から構成された。本研究で観察された遺伝子は，エンコードされた蛋白質の機能が十分に確立している場合には単一の大分類となるように計画された。表Vに示すように，109遺伝子がC区分に既知機能遺伝子として分類され；36遺伝子(ESTsを含む)がリストになく，hMSCsと比較してhDPSCs(I)での発現した遺伝子の約34%が細胞間シグナリングまたは細胞間通信または代謝のb区分に分類された。

(C) 検討
本研究で我々は，cDNAマイクロアレイ・システムおよびクラスタ化アルゴリズムを用いてhDPSCsおよびhMSCs間の代表的遺伝子発現プロファイルを比較した。Shi等は，DPSCsおよびBMSSCsの4000個のヒト遺伝子について遺伝子発現プロファイルを比較したが，彼らはコラーゲン・タイプIIIおよびIV，非コラーゲン細胞外基質成分(オステオポンチン，オステオネクチン，基質グラ蛋白質，デコリン，ビグリカン，およびアルカリ・フォスファターゼ)およびいくつかの細胞接着分子のような，cDNAマイクロアレイで類似遺伝子発現プロファイルを示す少数の遺伝子について検討しただけである(Shi, S., Robey, P. G., and Gronth, S. (2001) Bone 29, 532-539 Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis)。しかし，これらの遺伝子は十分知られており，我々もこれら遺伝子のいくつかの発現を見つけることができた(Ozawa, R., Yamada, Y., Nagasaka, T., and Ueda, M. (2003) Int. J. Oral-Med. Sci. 1, 148-155 A comparison of osteogenesis-related gene expression of mesenchymal stem cells during the osteoblastic differentiation induced Type-I collagen and/or fibronectin)。この実験では，細胞外基質成分をコード化するいくつかの遺伝子(コラーゲン・タイプVII，XIII，XVII，基質グラ蛋白質，骨シアロ蛋白質，基質メタロプロティナーゼ，アネキシン，トロンボスボンディン)，細胞接着分子(インテグリンα2，7，11，β2)，骨形成および無機質化骨基質形成の強力なプロモーターと考えられまた歯の形態形成にも含まれる(Heikin…)増殖因子(IGF-I，II，IL-8，11，TNF-α，BMP-2，4) (Ducy, P., and Karsenty, G. (2000) Kidney Int. 57, 2207-2214 The family of bone morphogenetic proteins; and McCarthy, T. L., Ji, C., Centrella, M. (2000) Crit. Rev. Oral Biol. Med. 11, 409-422 Links among growth factors, hormones, and nuclear factors with essential roles in bone formation)，(Heikinheimo, K., Begue-Kirn, C., Ritvos, O., Tuuri, T., and Ruch, J. V. (1998) Eur. J. Oral Sci. 106, 167-173. Activin and bone morphogenetic protein (BMP) signalling during tooth development) またホメオボックス転写因子(Msx1)，AP-1複合転写因子を構成する転写調節因子(Jun-B)が含まれ，これらは既に骨芽細胞および象牙芽細胞の発生と機能に関連付けられている(表II, III)。これらの遺伝子は，TGF-βスーパーファミリーメンバーにより調節され，初期の骨および歯の発生において重要な誘導因子である(Thesleff, I., and Aberg, T. (1999) Bone 25, 123-125. Molecular regulation of tooth development)。これら遺伝子のいくつかは，骨形成および歯形成の過程を支配するマスター制御遺伝子の発現を調節することによりある程度作動できる。Shi等は，Jun-BがDPSCsおよびBMSSCsの両者において低レベルで発現したと述べているが，我々の実験では，それは高レベルであった。これは，彼らは同じ患者からサンプルを集めることができなかったが，我々は同じ個人の遺伝子情報によったためであると考えられ，遺伝子情報を集めるにはこれが重要であると思われる。また，興味深いことに，Msx1はhMSCsに比較してhDPSCs(I)により高レベルに発現している。Msx1は歯の形態形成中に分化シグナルを調節する重要な転写因子である(Thesleff, I., and Aberg, T. (1999) Bone 25, 123-125. Molecular regulation of tooth development; and Chen, Y., Bei, M., Woo, I., Satokata, I., and Maas, R. (1996) Development 122, 3035-3044. Msx1 controls inductive signaling in mammalian tooth morphogenesis)。Msx1が不足したマウスおよびヒトMsx1の突然変異体は，口蓋裂、頭蓋顔面、骨の異常および歯成長の異常を示す(Satokata, I., and Maas, R. (1994) Nat Genet 6, 348-356. Msx1 deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development; and van den Boogaard, M. J., Dorland, M., Beemer, F. A., and van Amstel, H. K. (2000) Nat Genet 24, 342-343. Msx1 mutation is associated with orofacial clefting and tooth agensis in humans)。全体として，これら研究は歯の発生における分子パスウェイが骨形成に影響を与える分子パスウェイに類似していることを示しているのかもしれない。これは，hDPSCsおよびhMSCが，胚発生時異なる起源に由来する異なる解剖学的場所から分離されたにもかかわらず，hDPSCsおよびhMSCsが生体外で類似の遺伝子発現プロファイルを示すという本研究の所見と矛盾しない。

また彼らは，マイクロアレイ分析を用いて特定されたこれらの発現遺伝子の機能的な役割さえ研究しなかった。そこで今回は，より多くの遺伝子プロファイルを調べるため，我々はマイクロアレイに基づく遺伝子探索とクラスタ化アルゴリズムを用いた。
マイクロアレイに基づく遺伝子探索および他のハイスループットなアプローチ(ゲノミクスからコンビナトリアルケミストリーまでの)が，生物学および化学で，特にhMSCsおよびhDSPCs間の関係についてのように情報が少ない場合，ますます重要になってきている。結果として我々は，これらのアプローチが作り出す定量的測定値の大量の表に含まれる情報を「見る」我々の能力を開発する必要がある。この問題に対する我々のアプローチは，以下のように一般化できる。先ず我々は，データに固有の順序に基づく常識的なアプローチを用いてデータを組織化する。次に，数値データの大きな表を探索し検索することの律速段階がささいなこと，即ち数字を読むことにある(人間の脳は，数字を読んで定量的データを理解することに十分に適合していない)ことを認識し，従って我々は数字ではなく自然なカラースケールを用いて表内の定量的な値を表す。この代替案としてのコード化は，すべての定量的な情報を保存するが，それは我々の脳に情報を「数字読取り」チャンネルより広い帯域のチャンネルで伝える。

複雑なデータセットを見る自然な方法は，先ず大規模な特徴をスキャンして概観し，ついで関心のある細部に集中することである。我々がここで述べたアプローチの最も価値のある特徴として見出したものは，この自然で直感的なプロセスをゲノムのデータセットに適用できるということである。このアプローチは，データを収集するため使用される特別な方法または遺伝子発現データにさえ固有の特殊性のない一般的なものである。従って，非常に類似したアプローチを別の種類の非常に大きなデータセットに適用できると思われる。各々の場合，データ内の固有の構造を明らかにするための，代わりのアルゴリズムと計算方法を見出す必要があり，又同等に重要なこととして，定量的情報を効果的に伝える密度の高い自然な視覚的表現を見つける必要がある。我々は，我々が用いた特殊なクラスタ化アルゴリズムが手で選んだ代表またはコンピュータで生成された発現プロファイルに基いた現在得られる最良かつ，管理されたクラスタ化法と認識している(Chu, S., Derisi, J., Eisen, M., Mulholland, J., Botstein, D., Brown, P. O., and Herskowitz, I. (1998) Science. 282, 699-705 The transcriptional program of sporulation in budding yeast)。これらの非常に簡単なアプローチの成功は，機能ゲノムデータの押し寄せる洪水に立ち向かう自信を我々に与えている。

ここに示した例は，これらの方法を特に役立たせる遺伝子発現の特徴，すなわち遺伝子が機能区分に組織化されるという発現データの傾向を示している。勿論，共に発現する遺伝子が共通な機能を有することは非常に驚くことではない。それにも拘らず，比較的少なくかつ冗長な条件の集合の中で遺伝子発現パターンが遺伝子を機能区分に分離するのに十分である程度は驚くべきものである。より多くの多様な条件の追加は，これらの観察を補強できるだけと思われる。ここに述べたクラスタ化解析が人間の12,814遺伝子のすべてに適用される場合，機能的に関連した遺伝子のクラスタは維持されるが，クラスタは通常，性格付けされていない遺伝子の追加で拡張される。ここでの我々の観察を基にすると，遺伝子の多くが共通の機能を有するのはたぶん確実である。生物学的な必要性には基づかないが，発現パターンの類似性が，少なくともゲノムスケールの機能を暫定的にわり当てるための最も容易な手段かもしれない。

クラスタ(図5B，クラスタcおよび図6)は，MSCsに比較して，hDPSCs(I)で上方調節され，特にMSCs(I)で下方調節された遺伝子を含む。図5Bのクラスタcおよび図6に属する遺伝子は，表VIにリストされている。

このクラスタcにおける顕著な特徴は，細胞信号または細胞通信または代謝について遺伝子が協調して調節している点あった。細胞信号また細胞通信に関係する145遺伝子のうち37の発現レベルは，hMSCsに比較して，特にDPSCsで2倍以上に上方調節されていた。このクラスタKCNJ15内の遺伝子は，多くの哺乳類の細胞に存在するカリウムチャンネルで，広範囲の生理学上の反応に関係している。この遺伝子でエンコードされた蛋白は，必須の膜組込み蛋白質で，内向き調製型カリウムチャンネルである。コード化された蛋白には，カリウムが細胞から流出でなく流入できるようにするより大きな傾向がある。またエンコードされたIL 11は，サイトカインのgp130ファミリーのメンバーである。これらサイトカインは，そのすべてが少なくとも膜内外信号レセプタIL6ST(gpl130)の1分子を含む多重サブユニットレセプタ複合体の集合を駆動する。このサイトカインは，免疫グロブリンを生成するB細胞に対するT細胞依存性の成長を刺激することが示されている。また，造血幹細胞および巨核球原始細胞の分芽増殖を促進することが見出されている。PTHLHは，副甲状腺関連蛋白質で，そのレセプタ，PTHR1(MIM 168468)を介したシグナルにより軟骨内での骨の生成と乳腺と歯の形成中の上皮と間葉の相互作用を調節する。PTHRPは，悪性の体液性高カルシウム血症の大部分の場合にその原因となっている。この遺伝子は，骨および歯での発現をhMSCsおよびhDPSCsへ関係付けているかもしれない。TNFSF11は，腫瘍壊死因子(TNF)サイトカイン・ファミリのメンバーをエンコードしており，破骨細胞形成阻害因子のリガンドで破骨細胞の分化と活性化の主因子として機能する。この蛋白質は，樹状の細胞生存要因であることが示されており，T細胞依存性の免疫反応の調節に関係している。T細胞の活性化が，この遺伝子の発現を誘発し，また，破骨細胞の増殖と骨損失をもたらすことが報告されている。SRCキナーゼと腫瘍壊死因子レセプタ関連因子(TRAF)6を含むシグナル複合体を通して，抗アポトーシス・キナーゼAKT/PKTを活性化することが示された。この蛋白質は，この蛋白質がアポトーシスの調節の役割を持つかもしれないことを示す，マウスにおいて関連遺伝子を阻害すると重症の骨石化症や破骨細胞の欠如が引き起こされた。欠陥マウスは，TおよびBリンパ球の早期の分化で欠陥を示し，妊娠中にロブロ歯槽乳房構造の形成ができなかった。二つの交互にスプライシングされた転写変異体が見出された。IGF1Rは，高い親和性をもつレセプタ結合型インシュリン様増殖因子である。これは，チロシン・キナーゼ活性を持つ。インシュリン様増殖因子Iレセプタは，転換事象で重要な役割を演じる。SNAI1，はショウジョウバエの胎生プロテインスネイルで，中胚葉内で外胚葉遺伝子の発現を下方に調節するジンクフィンガー転写制御因子である。この遺伝子によってコード化された核蛋白質は，ショウジョウバエ・スネイル蛋白質と構造が類似し，成長する胎児内の中胚葉形成にとって重要であると考えられる。

各種代謝に関係する遺伝子が，これらクラスタに見られた。例えば，PTPRUまたはPTPRDは，蛋白質チロシン・ホスファターゼ(PTP)ファミリーのメンバーをコード化し，細胞の成長，分化，および有糸分裂周期を含む各種の細胞過程を調節する信号分子として知られている。このPTPは，細胞外領域，単一の膜貫通領域，および二つの直列の細胞内触媒領域を有し，従ってレセプタPTPを代表する。細胞外領域は，メプリン-A5抗原-PTP(MAM)領域，Ig様およびフィブロネクチン型III型の様の反復を含んでいる。このPTPは，細胞-細胞間認識および接着の役割を果たしていると考えられた。DUSP5がエンコードしている物は，両特異性蛋白質ホスファターゼサブファミリーのメンバーである。これらホスファターゼは，ホスホセリン/トレオニンおよびホスホチロシン残留物を脱燐酸化することによりそれらの標的キナーゼを非活性化する。これらは，細胞分裂増殖と分化に関係した，分裂促進因子活性化蛋白質(MAP)キナーゼのスーパーファミリー(MAPK/ERK, SAPK/JNK, p38)のメンバーを負に調節する。両特異性ホスファターゼのファミリーの別のメンバーは，各種MAPキナーゼに対する異なる基特異性，異なる組織分布および細胞内の局在，および細胞外刺激に対する異なるモードの発現誘導可能性を示す。この遺伝子生成物は，ERK1を不活性化し，各種組織で発現し，核に局在する。さらに我々は，フィブロネクチン，ラミニン，コラーゲンIII，IV，IXおよびX，および軟骨プロテオグリカンを劣化させ，創傷修復，アテローム動脈硬化症の進行に関係があると考えられる酵素をコード化するいくつかの遺伝子MMP3(基質メタロプロティナーゼ3)を見出した。MMPファミリーの蛋白質は，疾病過種にばかりでなく胚発育，再生，組織のリモデリングのような正常な生理学上の過程での細胞外基質の破壊，にも関係していた。多くのMMPは，細胞外プロティナーゼにより分裂させられたときに活性化する，不活性な前蛋白質として分泌される。この遺伝子は，染色体11q22.3にあるMMP遺伝子のクラスタの一部である。

最後に，同時に発現する遺伝子の機能が一致していることは，図5に示すような画像に見られる幅の広いパターンに生物学的な重要性を与えている。例えば，図5に示すhDSPCsのhMSCsとの相違の表示は，単に遺伝子およびそれらに関連する発現パターンをリストしたものではなく，任意の構造を示したものでもなく，むしろ細胞を状態の包括的な表示としたものである。また我々は，歯および骨形成幹細胞群の分子指紋の解明と比較のためのcDNAマイクロアレイ技術の応用について説明した。しかし，さらなる検討がこの現象を明らかにするため必要である。また，cDNAマイクロアレイ技術は，細胞分化中の各種過渡的段階でのhDPSCsおよびhMSCsの遺伝子発現パターンをさらに研究するため使用でき，hDPSCsおよびhMSCsが成熟した象牙芽細胞と骨芽細胞を経てそれぞれいよいよ象牙質と骨へと発育していく過程に関連する重要な分子経路を同定するユニークな機会を提供している。

図1は，調製培地または歯誘導培地での，24日目のhMSCs，hDPSCsおよびhOMCsの位相差顕微鏡像を示す。調製培地で培養された24日目のhMSCs(A)，hDPSCs(C)およびhOMCs(E)，および骨誘導培地で培養された24日目のhMSCs(B)およびhDPSCs(D)。元の拡大率は40倍である。 図２は，調製または誘導培地でのhMSCs，hDPSCsおよびhOMCsのALP(A)，DMP1(B)およびDSPP(C)遺伝子発現を示す。調製培地でhMSCs(■)，骨誘導培地でhMSCs(○)，調製培地でhDPSCs(▲)，骨誘導培地でhMSCs(●)およびhOMCs(□)が培養された。6，12，18および24日後に，細胞が溶解され，全DNAが抽出された。同量の全DNA(200ng)がリアルタイムRT-PCR分析にかけられ，各サンプルでALP，DMP1，DSPPおよびGAPDHのmRNAs相対量が，実験手順で説明したように，それらの標準カーブを計算することにより正確に定量された。縦軸の各mRNAの発現係数は，各遺伝子発現の定量比較が異なるサンプル間でできるよう，各サンプルで，各mRNA(ALP，DMP1およびDSPP)の絶対量をGAPDH mRNAの絶対量で割って計算された。各点は，五つの独立した実験から得られた平均値であり、ばらつきは10%以下である。 図３は，hDPSCs(I)およびhMSCsでの遺伝子発現のマイクロアレイ分析を示す。cDNAマイクロアレイをスキャンした画像。マイクロアレイは，対合され，ScanArray 5000を用いてスキャンされた。個々の対合された点についてカラーコード指定(hDPSCsは赤；hMSCsは緑)に基づいて，直接比較がhDPSCs(I)およびhMSCsの発現プロファイル間で行われた。 図４は，高(A, C, E, G)ゲインおよび低(B, D, F, H)ゲインのhDSPCsまたはhMSCsの遺伝子発現の全体比較を示す。各点は，マイクロアレイ上の一つの単一要素のCy3とCy5蛍光強度に対応している。点プロットは，hMSCsおよびhMSCs(I)間の高ゲイン(A)または低ゲイン(B)，hMSCsおよびhDPSCs間の高ゲイン(C)または低ゲイン(D)，hMSCsおよhDPSCs(I)間の高ゲイン(E)または低ゲイン(F)，hDPSCs(I;24日)およびhDPSCs(I;18日)間の高ゲイン(G)または低ゲイン(H)を示している。 図５は，階層クラスタ化解析による発現変化の全体像を示す。有意に上方または下方調節された遺伝子は，「実験手順」で説明したクラスタ化法によって解析された。黄色は各サンプル間で有意な変化がないことを示し；赤および青は各細胞で多かれ少なかれ変化のある転写を示す。カラーの強度は，増加または減少に比例し，最大強度はカラースケール(最下部)に示すように15倍の増加または減少に相当する。マイクロアレイデータ解析ソフトウエアで与えられるクラスタのアノテーションは，クラスタa, b, c, d, e, f, g, hおよびi について右側に示されている(B)。 図６は，hMSCsに比較してhDPSCs(I)で上方調節された区分に分類された遺伝子の発現プロファイルを示す。図5B-cの区分に分類された，有意に上方または下方調節された遺伝子(145遺伝子)が，クラスタ化法で解析された。解析から得られた結果が，図5に示した結果と同じ方法で示されている。これらクラスタに分類された遺伝子は，右側の列にリストされている。

Claims (6)

1. 骨に分化するよう誘導され，DMP1，DSPPおよびALPを発現する人間の歯髄幹細胞でヒトの間葉幹細胞と比較して，発現レベルが増加する，明細書の表IIに列挙された遺伝子のグループ。
2. 骨に分化するよう誘導され，DMP1，DSPPおよびALPを発現する人間の歯髄幹細胞でヒトの間葉幹細胞と比較して，発現レベルが減少する，明細書の表IIIに列挙された遺伝子のグループ。
3. 骨に分化するよう誘導され，DMP1，DSPPおよびALPを発現するヒトの歯髄幹細胞でヒトの間葉幹細胞と比較して，発現レベルが変化する，明細書の表VIに列挙された遺伝子のグループ
   。
4. 請求項１〜３のどれかに列挙された遺伝子のグループ内の少なくとも1遺伝子の発現レベルを解析することを含む，細胞から歯胚への再生能力を評価する方法。
5. 明細書の表II，IIIまたはVIに列挙された遺伝子またはそのアンチセンス遺伝子を，歯胚を構成する細胞に分化するように細胞を誘導するため，ヒト歯髄幹細胞に導入することを含む，歯胚を再生する方法。
6. 歯胚を構成する細胞に分化するように細胞を誘導するため，ヒト歯髄幹細胞に明細書の表II，IIIまたはVIに列挙された遺伝子の発現レベルを変えることができる物質または刺激を導入または添加することからなる歯胚を再生する方法。