DE69232615T2

DE69232615T2 - Zusammensetzungen zur verhütung und/oder behandlung von pathologischen prozessen

Info

Publication number: DE69232615T2
Application number: DE69232615T
Authority: DE
Inventors: Irun R Cohen; Rami Herskovitz; Ofer Lider
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1991-05-02
Filing date: 1992-05-01
Publication date: 2003-01-30
Anticipated expiration: 2012-05-02
Also published as: FI934849A; NO933942L; US5908837A; US5474987A; FI934849A0; US5686431A; WO1992019249A1; BR9205961A; HU9303110D0; ATE217796T1; SK120193A3; DE69232615D1; CZ232593A3; JPH06507635A; EP0583360A4; HUT67136A; EP0583360A1; NO933942D0; CA2102207A1; AU1913192A

Description

1. Erfindungsgebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verhütung und/oder Behandlung von pathologischen Prozessen, welche die Induktion der Sekretion von Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) beinhalten, wobei die Zusammensetzungen eine wirksame, niedrige Dosis von niedrigmolekulargewichtigem Heparin (LMWH) enthalten, das in Intervallen von fünf bis acht Tagen zu verabreichen ist.
Die erfindungsgemäß zu verwendenden LMWH weisen ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 3.000 bis etwa 6.000 auf und hemmen die TNF-α-Sekretion ruhender T-Zellen und/oder Makrophagen in-vitro als Reaktion auf die Aktivierung durch T-Zell-spezifische Antigene, T-Zell-Mitogene, Makrophagen-Aktivatoren, geschädigte extrazelluläre Matrix (dECM), Fibronektin, Laminin oder andere ECM-Komponenten.
TNF-α, ein von Monozyten (Makrophagen) und T-Lymphozyten erzeugtes Zytokin, stellt ein Schlüsselelement in der Kaskade von Faktoren, welche die entzündliche Reaktion hervorrufen, dar und besitzt als ein bedeutender Orchestrator von Krankheitszuständen eine Vielzahl von pleiotropen Wirkungen (B. Beutler und A. Cerami, Ann. Rev. Immunol. (19989) 7: 625-655).
Die biologischen Wirkungen von TNF-α sind abhängig von seiner Konzentration und von dem Ort der Produktion: bei niedrigen Konzentrationen kann TNF-α erwünschte homöostatische sowie Verteidigungsfunktionen hervorrufen, jedoch kann TNF-α bei hohen Konzentrationen, systemisch oder in bestimmten Geweben, in einen Synergismus mit anderen Zytokinen, insbesondere Interleukin-1 (IL-1) treten und so viele inflammatorische Reaktionen verschlimmern.
Bei den nachfolgenden Aktivitäten wurde gezeigt, dass diese durch TNF-α (zusammen mit IL-1) induziert werden: Fieber, Slow-Wave-Schlaf, hämodynamischen Schock, erhöhte Produktion von Akut-Phase-Proteinen, verminderte Produktion von Albumin, Aktivierung von Gefäßendothelzellen, erhöhte Expression von Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC)- Molekülen, verminderte Lipoproteinlipase, vermindertes Zytochrom P450, vermindertes Zink und Eisen im Plasma, Fibroblastproliferation, erhöhte Synovialzellenkollagenase, erhöhte Zyklooxigenase-Aktivität, Aktivierung von T-Zellen und B-Zellen und Induktion der Sekretion der Zytokine, des TNF-α selbst, des IL-1 und IL-6.
Wie TNF-α wirkt ist nicht im Detail bekannt, jedoch wird von vielen seiner Wirkungen angenommen, dass diese mit der Fähigkeit von TNF-α, die Produktion von Prostaglandinen und Leukotrienen aus Arachidonsäure der Zellmembran zu stimulieren, in Zusammenhang stehen.
TNF-α wurde, als Folge seiner pleiotropen Wirkungen, mit einer Vielzahl von pathologischen Zuständen in vielen verschiedenen Organen des Körpers in Verbindung gebracht. In Blutgefäßen begünstigt TNF-α hämorrhagischen Schock, reguliert Endothelzellen-Thrombomodulin nach unten und verstärkt eine Prokoagulator-Aktivität. Er bewirkt die Anheftung von weißen Blutzellen und wahrscheinlich von Thrombozyten an die Wände von Blutgefäßen, und begünstigt somit möglicherweise Prozesse, die zu Atherosklerose wie auch zu Vaskulitis führen.
TNF-α aktiviert Blutzellen und verursacht die Anlagerung von neutrophilen Leukozyten, eosinophilen Leukozyten, Monocyten/Macrophagen und T- und B-Lymphozyten. Durch Induktion von IL-6 und IL-8 verstärkt TNF-α die Chemotaxis von inflammatorischen Zellen und deren Penetration in Gewebe. Somit spielt TNF-α eine Rolle bei Gewebeschäden im Zusammenhang mit Autoimmunkrankheiten, Allergien und Transplantatabstoßung.
TNF-α wurde auch Kachektin genannt, da er die metabolischen Aktivitäten von Fettzellen moduliert und zur Auszehrung und Kachexie, die Krebs, chronische Infektionen, chronisches Herzversagen und chronische Entzündungen begleiten, beiträgt. TNF-α spielt möglicherweise auch eine Rolle bei der Anorexia nervosa durch Hemmung des Appetits, während er gleichzeitig die Auszehrung von Fettgewebe fördert.
TNF-α weist metabolische Wirkungen auf Skelett- und Herzmuskulatur auf. Er hat außerdem deutliche Auswirkungen auf die Leber: er unterdrückt den Albumin- und Zytochrom-P450- Metabolismus und erhöht die Produktion von Fibrinogen, αI-saurem-Glykoproteid und anderer Akutphasen-Proteine. Er kann auch Nekrose des Darms verursachen.
Im zentralen Nervensystem überwindet TNF-α die Blut/Gehirn- Schranke und ruft Fieber, vermehrten Schlafund Anorexie hervor. Erhöhte TNF-α-Konzentration ist mit multipler Sklerose assoziiert. Er verursacht akute Nebennierenblutung und beeinflusst die Produktion von Steroidhormonen, erhöht Kollagenase und PGE-2 in der Haut und verursacht den Abbau von Knochen und Knorpel durch Aktivierung von Osteoklasten.
Zusammengefaßt: TNF-α ist an der Pathogenese vieler unerwünschter imflammatorischer Zustände in Zusammenhang mit Autoimmunkrankheiten, Transplantatabstoßung, Vaskulitis und Atherosklerose. Er spielt möglicherweise eine Rolle bei Herzversagen, der Reaktion auf Krebs und bei Anorexia Nervosa. Aus diesen Gründen wurde nach Wegen gesucht, die Sekretion von TNF-α als ein Mittel zur Kontrolle einer Vielzahl von Krankheiten zu regulieren.
Die Hauptaufgabe des Immunsystems besteht im Schutz des Individuums gegen eine Infektion durch fremde Eindringlinge wie Mikroorganismen. Es kann jedoch auch die eigenen Gewebe eines Individuums angreifen, was zu pathologischen Zuständen, bekannt als Autoimmunkrankheiten, führt. Die aggressiven Reaktionen des Immunsystems eines Individuums gegen Gewebe, die von anderen Individuen stammen, sind der Grund für die unerwünschten Abstoßungen transplantierter Organe. Hyperreaktivität des Systems gegen fremde Substanzen verursacht Allergien mit Symptomen wie Asthma, Rhinitis und Ekzemen.
Die Zellen, die diese Reaktionen bewältigen sind die Lymphozyten, in erster Linie die aktivierten T-Lymphozyten, und die pathologische entzündliche Reaktion, die sie steuern, hängt von ihrer Fähigkeit ab, durch die Wände von Blutgefäßen zu ihrem Zielgewebe hin und zurück zu wandern. Somit kann eine Verminderung der Fähigkeit von Lymphozyten, an Blutgefäßwänden zu haften und diese zu durchdringen, einen Autoimmunangriff, Transplantatabstoßung und Allergie möglicherweise verhindern. Dies würde ein neues therapeutisches Prinzip darstellen, das wahrscheinlich im Vergleich zu den heute angewandten Therapien zu besserer Wirksamkeit und verminderten Nebenwirkungen führt.
Atherosklerose und Vaskulitis sind chronische und akute Beispiele pathologischer Gefäßentzündung. Atherosklerose beinhaltet Verdickung und Steifigkeit der Gefäßinnenhaut der Arterien, was zu Herzkranzgefäßerkrankungen, Myocardinfarkten, Hirninfarkt und periphären Gefäßkrankheiten führt, und sie stellt eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität in der westlichen Welt dar. In pathologischer Hinsicht entwickelt sich Atherosklerose langsam und chronisch als eine Schädigung, die durch fettige und kalkhaltige Ablagerungen verursacht wird. Die Fasergewebsproliferation führt letztendlich zu einem akuten Zustand, bei dem eine plötzliche Okklusion des Lumen der Blutgefäße verursacht wird.
Es wurde gezeigt, dass TNF-α die Replikation des Humanimmundeffizienzvirus (HIV) in vitro erleichtert und verstärkt (Matsuyama, T, et al., J. Virol. (1989) 93(6): 2504-2509; Michihiko, S. et al.; Lancet (1989) 1(8648): 1206-1207) sowie die HIV-1-Gen-Expression stimuliert, wodurch er wahrscheinlich die Entwicklung von klinischem AIDS bei Individuen, die latent mit HIV-1 infiziert sind, auslöst (Okamoto, T. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses (1989) 5(2): 131- 138).
Heparin ist ein Glykosaminoglukan - ein polyanionisches sulfatiertes Polysaccharid -, dass klinisch als antithrombotisches Mittel zur Verhütung von Blutgerinnung verwendet wird. Bei Tiermodellen hat sich gezeigt, dass Heparin die Fähigkeit von Autoimmun-T-Lymphozyten, ihr Zielorgan zu erreichen vermindert (Lider, O. et al., Eur. J. Immunol. (1990) 20: 493-499). Es zeigte sich ebenfalls, dass Heparin experimentelle Autoimmunkrankheiten bei Ratten unterdrückt und das Überleben eines allogenen Transplantats in einem Modell der Hauttransplantation bei Mäusen verlängert, wenn es in niedrigen Dosen (5 ug für Mäuse und 20 ug für Ratten) einmal täglich injiziert eingesetzt wurde (Lider, O.et al., J. Clin. Invest. (1989) 83: 752-756).
Es wird angenommen, dass die Mechanismen hinter den beobachteten Wirkungen die Hemmung der durch T-Lymphozyten erfolgenden Freisetzung von für die Penetration der Gefäßwand erforderlichen Enzymen oder eines erforderlichen Enzyms beinhaltet, vor allen Dingen des Enzyms Heparanase, das spezifisch den Glykosaminoglukan-Teil der subendothelialen extrazellulären Matrix (ECM) angreift, welche Blutgefäße auskleidet (Naparstek, Y. et al., Nature (1984) 310: 241- 243). Die Expression der Heparanaseenzyme steht in Zusammenhang mit der Fähigkeit der Autoimmun-T-Lymphozyten, Blutgefäßwände zu penetrieren und das Gehirn bei der Modellkrankheit experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) anzugreifen.
Die europäische Patentanmeldung EP 0114589 (Folkman et al.) beschreibt eine Zusammensetzung zur Hemmung der Angiogenese bei Säugetieren, in der die Wirkstoffe im Wesentlichen aus (1) Heparin oder einem Heparin-Fragment, das ein Hexasaccharid oder größer ist, und (2) Cortison oder Hydrocortison oder dem 11-α-Isomer von Hydrocortison bestehen. Gemäß der Offenbarung ist Heparin alleine oder Cortison alleine unwirksam; nur die Kombination beider erzielt die gewünschten Wirkungen. Zwar existiert in der Literatur kein Beweis dafür, dass eine Verbindung zwischen Angiongenese und Autoimmunkrankheiten besteht, doch stellt die Beschreibung auf Seite 5 der Patentanmeldung eine Verbindung zwischen Angiogenese und Psoriasis und Arthritis her, wobei auf die Verwendung von hohen Dosen von 25.000 Einheiten bis 47.000 Einheiten Heparin täglich hingewiesen wird.
Horvath, J. E, et al., Aust. N. Z. J. Med. (1975) 5(6): 537-539 beschreibt die Wirkung von noch nicht antikoagulierenden Dosen von subkutanem Heparin auf frühe Nierentransplantat- Funktion. Die tägliche Dosis ist hoch (5000 U) und die Studie kommt zu dem Schluss, dass Heparin in noch nicht antikoagulierenden Dosen keine Auswirkung auf die frühe Transplantatfunktion oder das Transplantatüberleben hat und dass es mit erhöhten hämorrhagischen Komplikationen in Verbindung stehen könnte.
Toivanen, M. L. et al., Meth. and Find. Exp. Clin. Parmacol. (1982) 4(6): 359-363 untersuchte die Wirkung von Heparin in hohen Dosen (1000 U/Ratte) für die Hemmung von Adjuvant- Arthritis in Ratten und fand, dass Heparin die Schwere der Adjuvant-Arthritis bei den Ratten erhöhte.
PCT Patent: Anmeldung PCT/AU88/00017, veröffentlicht unter Nr. WO88/05301 (Parish et al.) beschreibt sulfatierte Polysaccharide, die die Endoglycosylase-Aktivität, wie z. B. die Heparanase-Aktivität, blockieren oder hemmen, zur Verwendung als antimetastatische und anti-inflammatorische Mittel. Bei Heparin und Heparin-Derivaten, wie perjodatoxidierte, reduzierte Heparine, die vernachlässigbare antikoagulierende Aktivität aufwiesen, zeigte sich, dass diese antimetastatische und anti-inflammatorische Aktivität besaßen, wenn sie in Dosen innerhalb eines Bereichs von täglich 1,6-6,6 mg pro Ratte eingesetzt wurden, wobei die Verabreichung durch Dauerinfusion (entsprechend 75-308 mg täglich für einen erwachsenen menschlichen Patienten) erfolgte.
WO-A-9001501 offenbart von Heparin hergeleitete Oligosaccharide mit reduzierter antikoagulierender Aktivität, welche in einem in-vitro-Assay die Komplement-Aktivität über den alternativen Weg zum Teil hemmten. Die Autoren spekulierten, dass eine Substanz, die das Komplementkaskadensystem hemmt, von therapeutischem Nutzen bei der Behandlung bestimmter Immunerkrankungen sein könnte.
Sy et al., Cellular Immunol. (1983) 82: 23-32 offenbart eine anti-inflammatorische Wirkung von Heparin von ganzer Länger, daß entsprechend antikoagulierender Aktivität durch Affinitätschromatographie auf einer Sepharose-Antithrombin- Säule fraktioniert wurde. Es wurde berichtet, dass die nicht antikoagulierende Fraktion des Heparin von ganzer Länge experimentelle DTH-Reaktionen hemmte.
WO-A-9003791 offenbart in-vitro-Experimente, bei denen niedrigmolekulares Heparin in Konzentrationen von 0,03 mg/ml bis 1,0 mg/ml, wie dort berichtet, die Transkriptase und Multiplikation von HIV hemmte.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung, die ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (LMWH) enthält, für die Herstellung eines Medikamentes gegen einen pathologischen Prozess, bei dem die Induktion der Sekretion von TNF-α beteiligt ist, wobei das Medikament weniger als 5 mg des LMWH pro Dosis für die Behandlung eines menschlichen Patienten enthält und bei einer Verabreichung in Intervallen von 5-8 Tagen wirksam ist.
Spezifische Ausführungsformen entsprechen den abhängigen Ansprüchen 2-14.
Entsprechend der Anwendung der Erfindung ist LMWH in der Lage, in vitro die TNF-α-Sekretion von ruhenden T-Zellen und/oder Makrophagen als Reaktion auf T-Zell-spezifische Antigene, Mitogene, Makrophagen-Aktivatoren, gestörte extrazelluläre Matrix (dECM), Laminin, Fibronektin, oder andere ECM-Komponenten zu hemmen.
Bei einer bestimmten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das LMWH der pharmazeutischen Zusammensetzung ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 3.000 bis etwa 6.000 auf und kann darüber hinaus jeden fünften und siebten Tag verabreicht werden.
Es ist ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen, die in Intervallen von etwa 5-8 Tagen zu verabreichen sind, zur Verhütung und/oder Behandlung von pathologischen Prozessen, bei welchen die Induktion von TNF-α-Sekretion beteiligt ist, bereitzustellen, welche einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein niedrigmolekulargewichtiges Heparin (LMWH) umfasst, wobei das Heparin in niedriger wirksamer Dosis vorliegt und in der Lage ist, experimentelle verzögerte Hypersensitivitäts(DTH)-Reaktionen auf ein appliziertes Antigen zu hemmen, was sich in der Reduktion der Induration zeigte, die nach der Applikation des Antigens an die Haut, fünf bis sieben Tage nach der Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung beobachtet wurde, im Vergleich zu der Induration, die nach der Applikation des Antigens an die Haut in Abwesenheit oder nach Erholung von der Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung beobachtet wurde. Beispiele des angewendeten Antigens umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, Tetanus, Myelin basisches Protein, gereinigtes Proteinderivat, Oxazolon und dergleichen.
Es ist des Weiteren ein Ziel der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die in jeder Art und Weise verabreicht werden können, die durch die spezifische, zur Verfügung stehende Applikation vorgegeben wird, wobei die Applikationen enterale Verabreichung (einschließlich oraler Verabreichung) oder parenterale Verabreichung (einschließlich topischer Verabreichung oder Inhalation mit Hilfe von Aerosolen) umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung subkutan oder intravenös verabreicht.
Die vorliegende Erfindung ist daher z. B. nützlich für die Verzögerung oder Verhütung der Abstoßung von allogenen Transplantaten und die Behandlung oder Verhütung einer Vielzahl von pathologischen Prozessen, wie z. B. denjenigen, die mit Autoimmunkrankheiten, Allergien, entzündlichen Krankheiten (insbesondere entzündliche Darmerkrankung) oder erworbenem Immunmangelsyndrom (AIDS) in Zusammenhang stehen. Die vorliegenden Erfindung findet außerdem nützliche Anwendung bei der Behandlung von Diabetes Typ I, Paradontose, Uveitis, rheumatischen Erkrankungen (insbesondere rheumatoider Arthritis), Atherosklerose, Vaskulitis oder multiple Sklerose.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten niedrige, wirksame Dosen des verschriebenen LMWH und enthalten in der Regel eine einzelne niedrige Dosiseinheit von weniger als 5 mg LMWH, vorzugsweise von etwa 0,3 bis etwa 3 mg, und besonders bevorzugt eine einzelne, niedrige Dosiseinheit von 1 bis 1,5 mg.
Die vorliegende Erfindung erwägt ebenfalls ganz allgemein ein Verfahren zur Anwendung eines niedrigmolekulargewichtigen Heparins (LMWH), das in der Lage ist, in vitro die TNF- cc-Sekretion ruhender T-Zellen und/oder Makrophagen als Reaktion auf T-Zell-spezifische Antigene, Mitogene, Makrophagen-Aktivatoren, gestörte extrazelluläre Matrix (dECM), Laminin, Fibronektin, oder andere ECM-Komponenten zu hemmen, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die in Intervallen von etwa 5-8 Tagen zur Verhütung und/oder Behandlung von pathologischen Prozessen, bei welchen die Induktion von TNF-α-Sekretion beteiligt ist, wobei das Verfahren die Kombination einer niedrigen, wirksamen Dosis des LMWH mit einem pharmazeutischen Träger umfasst.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Behandlung eines Patienten, der an einem pathologischen Prozess leidet, bei welchem die Induktion der TNF-α-Sekretion beteiligt ist, wobei das Verfahren die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie oben beschrieben, in Intervallen von etwa 5-8 Tagen umfasst.
Weitere Ziele der Erfindung ergeben sich für den Fachmann durch das Studium der nachfolgenden Beschreibung, welche die detaillierte Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der Erfindung enthält.

4. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Gemäß dar vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die Behandlung mit niedrigmolekulargewichtigen Heparinen (LMWHs) die Fähigkeit von T-Zellen und Makrophagen zur Sekretion von TNF-α hemmte. Der funktionale Ausdruck dieser Wirkung zeigt sich in der Hemmung der Hypersensitivitäts(DTH)-Reaktion - einer entzündlichen Reaktion ausgelöst von Zellen wie Makrophagen und anderen inflammatorischen Zellen - bei Mäusen und Menschen. Durch die Behandlung mit LMWHs in Dosen, die sich auf die TNF-α-Produktion auswirkten, konnte auch ein Modell der Autoimmunarthritis, die sogenannte Adjuvant-Arthritis (AA), gehemmt werden. LMWH- Behandlung verlängerte außerdem das Überleben von allogenen Herztransplantaten bei Ratten und beseitigte insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM) in NOD-Mäusen. Darüber hinaus verhinderte die Behandlung mit LMWHs die Induktion der TNF-α-Produktion durch T-Zellen und Makrophagen als Reaktion auf den Stimulus durch geschädigte subendotheliale extrazelluläre Matrix (ECM). Da TNF-α am Ort einer Gefäßverletzung wahrscheinlich eine Rolle bei dem Prozess der Atherosclerose spielt, wird die Hemmung von TNF-α am Ort der geschädigten subendothelialen ECM den pathogenen Prozeß der Atherosklerose mildern. Ein höchst überraschender Aspekt der Behandlung mit LMWHs besteht darin, dass diese Behandlung dann am wirksamsten ist, wenn die Verabreichung in niedrigen Dosierungen in wöchentlichen Intervallen erfolgt. Hohe Dosen von LMWHs oder täglich verabreichte Dosen von LMWHs haben keine Wirksamkeit im Hinblick auf die Hemmung der TNF-α-Sekretion oder von Immunreaktionen.
Niedrigmolekulargewichtige Heparine, die durch Fraktionierung oder gesteuerte Depolymerisation von Heparinen erzeugt wurden, zeigen im Vergleich zu Heparin verbesserte antithrombotische Wirkung aber auch verschiedene pharmakokinetische Eigenschaften: die Halbwertszeit ist doppelt so hoch und die biologische Verfügbarkeit ist höher in Bezug auf ihre antikoagulierende Wirkung nach subkutaner Injektion (Bratt, G. et al. Thrombosis and Haemostasis (1985) 53: 208; Bone, B. et al. Thrombosis Research (1987) 46: 845).
Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, dass LMWHs, die in noch nicht antikoagulierenden Dosen in mehreren Tagesintervallen verabreicht werden, bei der Verhütung und/oder der Behandlung pathologischer Prozesse, bei welchen die Induktion von TNF-α beteiligt ist, wirksam sind.
Die gemäß der Erfindung zu verwendenden LMWHs sind von LMWHs mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 3000-6000, wie z. B. den in dem europäischen Patent EP 0014184 offenbarten LMWHs, hergeleitet. Einige LMWHs sind unter verschiedenen Markennamen, z. B. Fragmin®, Fraxiparin®, Fraxiparine®, Lovenox®/Clexane®, kommerziell erhältlich. LMWHs können auf mehrere, unterschiedliche Arten hergestellt werden: Anreicherung durch Fraktionierung durch Ethanol und/oder molekulares Sieben, z. B. Gelfiltration oder Membranfiltration des in Standard-Heparin vorliegenden LMWH und gesteuerte chemische (durch salpetrige Säure, β- Eliminierung oder Perjodatoxidation) oder enzymatische (durch Heparinase) Depolymerisation. Die Bedingungen für die Depolymerisierung können sorgsam gesteuert werden, um Produkte mit gewünschten Molekulargewichten zu erhalten. Üblicherweise kommt hier die Salpetrigsäure-Depolymerisation zum Einsatz. Ebenfalls verwendet wird die Depolymerisation des Benzilesters von Heparin durch β-Eliminierung, durch welche die gleiche Art von Fragmenten erhalten wird, wie bei der enzymatischen Depolymerisation unter Verwendung von Heparinase. LMWH, das eine niedrige antikoagulierende Aktivität aufweist und seine grundlegende chemische Struktur beibehält, kann durch Depolymerisation unter Einsatz von Perjodatoxidation oder durch Entfernen der Antithrombin-bindenden Fraktion von mittels anderer Verfahren hergestelltem LMWH erzeugt werden, wobei für die Adsorption immobilisiertes Antithrombin verwendet wird.
Fragmin® ist ein niedrigmolekulargewichtiges Heparin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht innerhalb einer Bandbreite von 4000-6000 Dalton, das durch gesteuerte Salpetrigsäure-Depolymerisation von Natriumheparin aus Intestinalmukosa des Schweins hergestellt wird. Es wird unter dem Namen Fragmin® von Kabi Pharmacia, Schweden, zur Verwendung als antithrombotisches Mittel in Kochsalzlösungen für Injektion in Einzeldosis-Spritzen von 2500 IU/0,2 ml und 5000 IU/0,2 ml, entsprechend etwa 16 mg bzw. 32 mg hergestellt.
Fraxiparin® und Fraxiparine® sind LMWH mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 4500 Dalton, die durch Fraktionierung bzw. gesteuerte Salpetrigsäure- Depolymerisation von Calciumheparin aus Intestinalmukosa vom Schwein hergestellt werden. Es wird von Sanofi (Choay Laboratories) zur Verwendung als antithrombotisches Mittel in Einzeldosen hergestellt, die ca. 36 mg enthalten, entsprechend 3075 IU/0,3 ml Wasser.
Lovenox® (Enoxaparin/e) ein LMWH-Fragment, dass, unter Einsatz von β-Eliminierung, durch Depolymerisation von Natriumheparin aus Darmschleimhaut vom Schwein gewonnen wird, wird von Pharmuka SF, Frankreich hergestellt und von Rhone- Poulenc unter den Namen Clexane® und Lovenox® vertrieben zur Verwendung als antithrombotisches Mittel in Einzeldosis-Spritzen, enthaltend 20 mg/0,2 ml und 40 mg/0,4 ml Wasser.
Wie in der vorliegenden Anmeldung gezeigt, stellen die beschriebenen neuen Eigenschaften der LMWHs eine Gemeinsamkeit aller LMWHs dar, unabhängig vom Herstellungsprozess, den strukturellen Unterschieden (solche die durch die Depolymerisation entstehen, oder solche, die von den Unterschieden des als Rohmaterial verwendeten Heparins abhängen) oder der antikoagulierenden Aktivität, vorausgesetzt dass das verwendete LMWH in der Lage ist, die TNF-α-Sekretion in vitro der ruhenden T-Zellen und/oder Makrophagen als Reaktion auf den Kontakt mit spezifischen Antigenen, Mitogenen, gestörter ECM oder ihren Proteinbestandteilen wie z. B. Fibronektin oder Laminin zu hemmen.
Ein anderer Test, der für die Identifizierung der für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wirksamen LMWHs nützlich ist, besteht in der Inhibition von experimentellen verzögerten Hypersensitivitäts(DTH)-Hautreaktionen - einer T- Lymphozyten-abhängigen Reaktion - auf eine Vielzahl von Antigenen (z. B. Tetanus-Antigen, Myelin basisches Protein (MBP), gereinigtes Proteinderivat (PPD) und Oxazolon. Die LMWHs hemmen außerdem die T-Zellen-Anlagerung an ECM und ihren Proteinkomponenten.
Die erfindungsgemäß wirksamen LMWHs werden in pharmazeutische Zusammensetzungen, z. B. als wäßrige Lösungen, die möglicherweise Natriumchlorid, Stabilisatoren oder andere geeignete, nicht-aktive Inhaltsstoffe enthalten, eingearbeitet. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist durch Injektion, subkutan oder intravenös, jedoch ist jede andere geeignete Verabreichungsart in der Erfindung eingeschlossen.
Erfindungsgemäß wird das LMWH in Intervallen von fünf bis acht Tagen, vorzugsweise einmal pro Woche verabreicht.
Die erfindungsgemäß verhinderbaren oder behandelbaren Störungen sind sämtlich Störungen, die mit pathologischen Prozessen verbunden sind, bei welchen die Induktion der TNF-α- Sekretion beteiligt ist; diese umfassen Atherosklerose und Vaskulitis sowie damit im Zusammenhang stehende pathologische Prozesse; Autoimmunkrankheiten, z. B. rheumatoide Arthritis, Diabetes Typ I (IDDM); Allergie; Transplantatabstoßung; akute und chronische entzündliche Erkrankungen, z. B. Uveitis, Darmentzündung; Anorexia nervosa; hämorrhagischer Schock verursacht durch Septikämie, und opportunistische Infektionen bei durch AIDS immunbeeinträchtigten Individuen. Bei AIDS unterdrücken die LMWHs die Replikation von HIV und/oder verbessern die Resistenz gegen opportunistische Infektionen, wodurch sie die Entwicklung AIDS-bezogener Krankheitszustände (ARC) verhindern.
Erfindungsgemäß wurde beobachtet, dass LMWHs einen engen Wirkdosisbereich aufweisen können und dass verschiedene Zubereitungen von LMWHs verschiedene optimale biologische Wirkungen zeigen können. Es war daher erforderlich, eine Dosiseinheit für LMWH-Zubereitungen festzulegen, die gemäß der Erfindung zu verwenden ist, wobei diese Dosiseinheit auf einem Bioassay der Hemmung von TNF-α-Sekretion von Milzzellen mit LMWH behandelter Mäuse oder durch Hemmung der DTH-Reaktivität durch das LMWH beruht. Es wurde gefunden, dass die Fähigkeit einer bestimmten LMWH-Dosis, die TNF-α-Sekretion zu hemmen, positiv mit seiner Fähigkeit, die Reaktion vom Typ der verzögerten Überempfindlichkeitsreaktion (DTH) zu inhibieren, korreliert. Diese, durch Zellen vermittelte entzündliche Reaktion in vivo ist von Bedeutung, da sie einen Ausdruck der an Autoimmunkrankheiten, Transplantatabstoßung, einigen Arten der Blutgefäßentzündung und Allergie beteiligten Prozesse darstellt.
Gemäß der Erfindung wurde daher festgestellt, dass die niedrigste Dosis von LMWH pro kg, welche die Hemmung der TNF-α-Produktion oder die Hemmung der DTH-Reaktivität um wenigstens 50% bewirkt, aus 12 mausinhibitorischen Einheiten pro kg (12 u/kg) besteht. Aufgrund der Unterschiede, die in der Oberfläche und dem Metabolismus zwischen Mäusen und Menschen bestehen, sollten Menschen mit einer niedrigeren Dosis LMWH behandelt werden; es wurde festgestellt, daß 12 u/kg bei Mäusen 1 u/kg bei Menschen entspricht. Beispielsweise ist die Dosis der Fragmin®-Charge 38609, die wirksam sowohl die TNF-α-Sekretion als auch die DTH- Reaktivität hemmt, 5 ug pro Maus, die wöchentlich verabreicht werden. Da jede Maus etwa 25 g wiegt, beträgt die Dosis von Fragmin® 38609, die das Äquivalent zu 12 u/kg darstellt, 200 ug/kg Maus. Die Dosis von 1 u/kg, die für Menschen geeignet ist, beträgt daher 200 ug/kg: 12 = 16,67 ug/kg. Ein Mensch, der etwa 70 kg wiegt, würde demnach mit einer Dosis von etwa 1,2 mg behandelt, die in einer Einzeldosis subkutan einmal alle 7 Tage verabreicht wird. Da menschliche Individuen biologisch variieren, kann die optimale Dosis eine andere als 1.2 mg sein und wird unter 5 mg liegen, insbesondere innerhalb eines Bereichs von 0.3 bis 3 mg.
Die LMWH-Dosis, die bei Ratten wirksam sein sollte, kann von der Tatsache hergeleitet werden, dass die LMWH-Dosis pro kg Ratte die Hälfte der Dosis pro kg Maus beträgt, d. h. 6 u/kg. Wenn beispielsweise 12 u der Fragmin®-Charge 38609 200 ug/kg sind, dann sollte die für Ratten geeignete 6 u- Dosis 100 ug/kg oder 20 ug pro 200 g Ratte sein, die einmal wöchentlich verabreicht wird.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand nicht beschränkender Beispiele erläutert.

5. Beispiele

5.1. Beispiel 1: Bioassay der Inhibition der TNF-α-Sekretion

Überstände von Milzzellen, kultiviert in An- oder Abwesenheit von LMWH, oder Milzzellen, die von Mäusen erhalten wurden, die mit LMWH in vivo behandelt oder nicht behandelt wurden, werden auf ihre Fähigkeit zur TNF-α-Sekretion getestet. Der TNF-α-Bioassay basiert auf der zytotoxischen Wirkung von TNF-α auf Zycloheximid(CHI)-sensitisierte Zellen und ihrer Quantifizierung durch den Neutralrotaufnahmeassay, wie durch Wallach D., J. Immunology (1984) 132: 2464-2469 beschrieben. Kurz gesagt wird die Tötung der CHI-sensitisierten HeLa-Zellen durch TNF-α, der in den Überständen der Zellen vorliegt, gemessen, wobei die Konzentration von TNF-α in den überständen durch Vergleich mit Titrationskurven von exogen hinzugefügtem TNF-α bestimmt wird. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch Inkubation mit Neutralrot für zwei Stunden, Abwaschen überschüssigen Farbstoffs, Extraktion des von den Zellen aufgenommenen Neutralrot mit Sorenson-Zitratpuffer-Ethanol-Mischung und kolorimetrische Quantifizierung des Neutralrot bei 570 nm mit einem Micro-ELISA Autoreader, ermittelt.
Zellen von mit LMWH behandelten Mäusen werden wie folgt erhalten: weibliche Mäuse des BALB/c-Stamms (25 g, 2 Monate alt), und zwar wenigstens 5 Mäuse pro Gruppe, werden subkutan mit verschiedenen LMWH-Dosen injiziert, gewöhnlich im Bereich von 0,5 bis 20 ug pro Maus. Fünf Tage später werden die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet, die Milzen werden entfernt und Suspensionen von Milzzellen, denen die Erythrozyten entzogen worden, werden auf die Produktion von TNF-α als Reaktion auf die Induktion durch dECM, Concanavalin A (Con A) oder Lipopolysaccharid (LPS) getestet.

5.2. Beispiel 2: Bioassay der Inhibition der DTH- Reaktivität

Gruppen von Mäusen werden auf der rasierten Abdominalhaut mit 100 ul aus 3% Oxazolon (OX) in Azeton/Olivenöl (4 : 1; v : v) sensitisiert. DTH-Sensitivität wird 5 Tage später wie folgt ermittelt: Mäuse werden mit 20 ul aus 0,5% OX (10 ul auf jeder Seite des Ohres) in Aceton/Olivenöl gereizt. Eine konstante Fläche des Ohres wird unmittelbar vor der Reizung vermessen sowie 24 und 48 h später, dies geschieht mit einem Mitutoyo Ingeneur-Mikrometer, Die Person, die die Messung der Ohrschwellung vornimmt, kennt die Identität der Mäusegruppen nicht. Die Zunahme (Δ) der Ohrschwellung wird als das Mittel in Einheiten von 10&supmin;² mm oder 10&supmin;&sup4; Zoll (±SE), abhängig vom verwendeten Mikrometer, gemessen. Die prozentuale Hemmung (Inhibition) wird wie folgt berechnet:
Mäuse werden mit LMWH wie in Beispiel 1 behandelt, sie werden einen Tag vor der primären Sensibilisierung auf OX injiziert. Am fünften Tag nach der Sensibilisierung auf OX werden die Mäuse gereizt, um eine DTH-Reaktion zu induzieren, wie oben beschrieben.
Die positive Kontrolle ist die DTH-Reaktion, die bei immunisierten Mäusen ohne Behandlung mit LMWH festgestellt wird. Die negative Kontrolle ist die Hintergrundschwellung, die durch das Antigen in immunisierten Mäusen erzeugt wird.

5.3 Beispiel 3: Induktion von TNF-α-Sekretion durch T-Zellen und Makrophagen in vitro

Microtiterplatten wurden folgendermaßen vorbereitet: Fibronectin (FN) oder Laminin (LN) (Sigma) wurden in einer Konzentration von 1 ug/50 ul PBS pro Mulde auf flachbödige 96- Mulden-Platten (Costar) gegeben und nach 16 h entfernt. Verbleibende Bindungsstellen wurden mit BSA/PBS (10 mg/ml), das den Mulden für eine Dauer von 2 h zugegeben wurde und dann ausgewaschen wurde, blockiert. ECM-beschichtete Mulden wurden wie folgt vorbereitet: korneale Endothelialzellen vom Rind wurden in flachbödigen 96-Mulden-Platten kultiviert. Die konfluenten Schichten aus Endothelzellen wurden aufgelöst und die ECM wurde intakt und frei von Zellbruchstücken gelassen (Gospodarowicz, D. et al. J. Biol. Chem. (1978) 253: 3736). Geschädigte ECM (dECM) wurde durch dreimaliges sanftes Kratzen der ECM mit einer 27 G-Spritzenkanüle erhalten und die exponierten Stellen wurden anschließend mit BSA/PBS beschichtet. Ruhende geklonte Ratten-CD4&spplus;-T-Zellen, bezeichnet als K1, die Myelin basisches Protein (MBP) erkennen, wurden in Kultur vermehrt und gehalten und in die Mulden gegeben, 10&sup5; Zellen pro Mulde mit oder ohne 3 · 10&sup5; syngenische Milzmakrophagen, in 100 ul pro Mulde RPMI 1640 (Gibco) ergänzt mit 1% BSA und Antibiotika. Die Milzmakrophagen wurden durch Entfernen der T- und B-Zellen unter Verwendung spezifischer monoklonaler Antikörper (mAB) gereinigt. Wo angegeben, wurden anti-Maus TNF-α mAB (Genzyme, verdünnt 1/300) in die Mulden gegeben. MBP (100 ug/ml), Con A (2.5 ug/ml), LPS (1 ug/ml) wurden den Mulden zugegeben wo angegeben. Die Platten wurden bei 37ºC in einem befeuchteten Inkubator 3 h lang inkubiert. Anschließend wurde der Inhalt der Mulden (4 Mulden pro Versuchsgruppe) gesammelt, zentrifugiert und die Medien wie in Beispiel 1 auf TNF-α-Sekretion getestet: Überstände kultivierter Makorphagen und Lymphozyten wurden zu HeLa- Zellkulturen gegeben, die für die Tötung durch TNF-α empfänglich sind; der Tod dieser Zellen in Anwesentheit der Testmedien wurde im Vergleich mit Titrationskurven von exogen hinzugefügtem TNF-α kalibriert. Der Zelltot wird durch die Freisetzung von Neutralrot-Farbstoff aus den präinkubierten HeLa-Zellen untersucht. Die hier dargestellten Ergebnisse repräsentieren Daten aus insgesamt 6 Experimenten, die im wesentlichen ähnliche Ergebnisse erbrachten.
Tabelle 1 zeigt, dass zusammen kultivierte T-Zellen und Makrophagen zur Sekretion von TNF-α veranlasst werden können, und zwar durch Kontakt mit dem spezifischen Antigen MBP (Gruppe 4), dem Mitogen Con A (Gruppe 6) oder LPS (Gruppe 8). Jedoch wurde die TNF-α-Sekretion, in Abwesenheit eines antigenen oder mitogenen Stimulus, auch durch geschädigte extrazelluläre Matrix (dECM; Gruppe 10) oder die ECM-Komponenten Fibronektin (FN; Gruppe 12) oder Laminin (LN; Gruppe 14) induziert. Intakte ECM war ein schwacher Induktor von TNF-α (Gruppe 16). Tabelle 1.

5.4 Beispiel 4: Regulierung von TNF-α-Sekretion durch LMWHs

T-Zellen und akzessorische Zellkulturen wurden wie in Beispiel 3 vorbereitet. LMWH wurde zu Beginn der Zellkultivierung in die Mulden gegeben. Die TNF-α-Niveaus wurden nach 3 h Inkubation untersucht.
Tabelle 2 zeigt, dass die Anwesenheit von LMWH (Fragmin® Charge 38609) in vitro eine Hemmung dar Induktion der durch das spezifische Antigen (MBP; Gruppe 4), Mitogena (Con A und LPS; Gruppen 6 und 8), dECM oder ECM-Komponenten (Gruppen 10, 12 und 14) induzierten TNF-α-Sekretion bewirkte. Da die durch dECM induzierte TNF-α-Sekretion wahrscheinlich eine Rolle bei der Atherosklerose spielt, wird die Hemmung con TNF-α durch LMWH bei Atherosklerose nützlich sein. Tabelle 2.

5.5 Beispiel 5

Um die Wirkung von LMWH, das Mäusen in vivo verabreicht wurde, auf die Sekretion von TNF-α durch Milzzellen in vitro zu untersuchen, wurde der folgende Versuch durchgeführt. BALB/c-Mäuse, 5 pro Gruppe, wurden mit verschiedenen Dosen LMWH (Fragmin® Charge 38609), verdünnt in Kochsalzlösung und subkutan injiziert, behandelt. Nach einer Woche wurden die Tiere getötet und ihre Milzzellen, frei von Erythrozyten, auf ihre Fähigkeit zur Sekretion von TNF-α als Reaktion auf Kontrollmulden ohne dECM (A) oder auf mit dECM (B) beschichtete Mulden untersucht. Die Messung der Höhe der TNF-α-Sekretion erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt und zeigen, dass eine Injektion von 5 ug LMWH, 7 Tage vorher einmal verabreicht, die durch dECM induzierte TNF-α- Sekretion hemmte. Höhere oder niedrigere Dosen von LMWH waren weniger wirksam. Somit war eine optimale Dosis von LMWH, die in vivo eine Woche vorher verabreicht wurde, wirksam. Tabelle 3.
Tabelle 4 zeigt, dass in vivo eine 5-ug-Dosis in vivo des LMWH Fragmin® Charge 38609 ebenfalls inhibierend auf die durch LPS induzierte TNF-α-Sekretion wirkte. BALB/c-Mäuse (4 Mäuse pro Versuchsgruppe) wurden mit den angegebenen Mengen LMWH, verdünnt in Kochsalzlösung und subkutan injiziert, behandelt. Nach einer Woche wurden die Mäuse intraperitoneal mit 10 mg LPS injiziert, 4 Stunden später getötet und ihre Milzzellen, frei von Erythrozyten, wurden anschließend in mit dECM beschichteten Mulden 3 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator kultiviert. Die Höhe des als Reaktion auf die dECM ausgeschiedenen TNF-α wurde in den Überständen der Kulturen gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4.

5.6 Beispiel 6

Zur Untersuchung der Wirkung von unterschiedlichen LMWHs auf die Hemmung der TNF-α-Sekretion und auf DTH-Antworten wurden Mäuse mit dem angegebenen LMWH, subkutan in verschiedenen Dosen verabreicht, behandelt. Nach einer Woche wurden einige der Mäuse getötet und die Induktion der TNF- α-Sekretion als Antwort auf Con-A-Aktivierung in vitro wurde gemessen. Die verbleibenden Mäuse wurden auf Ihre Fähigkeit, auf das Antigen Oxazolon zu reagieren, untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 als prozentuale Inhibition, verglichen mit den Reaktionen bei nicht mit LMWH behandelten Mäusen, ausgedrückt.
Das Studium der in Tabelle 5 dargestellten Resultate führt zu den folgenden zwei Schlüssen:
1. Verschiedene Chargen von LMWH, jede durch ähnliche antithrombotische Wirkung (Faktor-X-Assay) kalibriert, weisen unterschiedliche optimale Dosen für die Inhibition von TNF-α-Sekretion auf. Darüber hinaus gibt es Zubereitungen von LMWH, wie z. B. Clexane® Charge 4096, die bei keiner der ausprobierten Dosen eine hemmende Wirkung auf TNF-α-Sekretion haben. Es kann daher geschlossen werden, dass die antithrombotische Wirkung einer LMWH-Zubereitung nicht mit dem Potential der LMWH-Zubereitung zur Inhibierung der TNF-α- Sekretion in Zusammenhang steht. Die beiden unterschiedlichen Biosassays werden durch unterschiedliche Faktoren bewirkt, die in den Zubereitungen vorliegen.
2. Die Fähigkeit einer bestimmten Dosis von LMWH zur Hemmung der TNF-α-Sekretion korreliert in positiver Weise mit ihrer Fähigkeit zur Hemmung der DTH-Reaktion, und die Dosis einer LMWH-Zubereitung, die für die Hemmung der TNF-α-Sekretion optimal wirksam ist, ist ebenfalls optimal wirksam für die Hemmung der DTH-Reaktion. Tabelle 5.

5.7 Beispiel 7: Behandlung von Adiuvant-Arthritis (AA) bei Ratten mit niedrigen Dosen von LMWH

Adjuvant-Arthritis ist eine experimentelle Krankheit, die bei einigen Rattenstämuen durch Immunisieren der Ratten gegen Antigene des Mycobacterium tuberculosis induziert werden kann (Pearson, C. M. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1956) 91: 91). Diese experimentelle Krankheit wird als Modell der humanen rheumatoiden Arthritis angesehen (Pearson, C. M., Arthritis Rheum. (1964) 7: 80). Die Arthritis scheint durch T-Lymphozyten verursacht zu werden, die ein Antigen von M. tuberkulosis, welches mit Strukturen in den Gelenkgeweben kreuzreagiert, erkennen (Cohen, I. R., et al., Arthritis Rheum. (1985) 28: 841).
Lewis-Ratten wurden mit M. tuberculosis (1 mg) in Öl immunisiert, um Adjuvant-Arthritis zu induzieren (Pearson, C. M., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1956) 91: 91). Fünf Tage später wurden die Ratten wie angegeben subkutan mit den Dosen von LMWH und/oder Heparin inokuliert und die Entwicklung von Arthritis auf einer Skala von 0-16 wie beschrieben bewertet (Holoshitz, Y., et al., Science (1983) 219: 56). Alle Versuche wurden mit Fragmin®, Charge 38609 durchgeführt.
Um die Dosisreaktion auf Fragmin® (Fig. 1) zu untersuchen, wurden Ratten, zur Induktion von AA immunisiert, wöchentlich subkutan mit 0,5 ug (o), 1 ug ( ), 2 ug ( ), 10 ug ( ), 15 ug ( ), 20 ug ( ); 30 ug ( ), 40 ug (x) und PBS- Kontrolle ( ) injiziert, beginnend mit dem 5. Tag nach der Injektion. Die Dosis zeigte maximale Wirksamkeit für die Hemmung von Arthritis.
Die Wirkung der 20-ug-Dosis Fragmin® auf den Verlauf von AA ist in Fig. 2 dargestellt: PBS-Kontrolle ( ); einmalige Behandlung am 5. Tag ( ); täglich ( ); jeden 5. Tag (o); wöchentlich ( ). Wie gezeigt, wird durch die Verabreichung von Fragmin®, sowohl in Intervallen von 5 Tagen wie auch von 7 Tagen, Arthritis inhibiert.
Fig. 3 zeigt die Wirkung wöchentlicher Verabreichung von Fragmin® (Charge 38609), im Vergleich mit Standard-Heparin, auf AA. Lewis-Ratten wurden immunisiert, um AA zu induzieren. Beginnend mit Tag 5 wurden die Ratten subkutan in wöchentlichen Intervallen mit einer 20 ug-Dosis Fragmin® ( ), Heparin (o) oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Kontrolle ( ) inokuliert. Die Ergebnisse zeigen einen dramatischen Unterschied in der Wirksamkeit zwischen Fragmin® und Heparin: Fragmin® hemmte die Arthritis vollständig, während Heparin keine hemmende Wirkung zeigte.
Keine hemmende Wirkung auf AA wurde auch bei täglicher Verabreichung einer 20-ug-Dosis von LMWH festgestellt, obwohl überraschenderweise die hemmende Wirkung von Heparin stärker war als die von Fragmin® bei täglicher Verabreichung, wie in Fig. 4 (Fragmin® (Charge 38609) ( ), Heparin (o), PBS-Kontrolle ( )) gezeigt.
Eine ähnliche hemmende Wirkung wurde bei mehreren anderen LMWHs festgestellt, die - zur Induktion von AA immunisierten - Lewis-Ratten verabreicht wurden. Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Injektion einer 20-ug-Dosis Fraxiparin® (täglich ( ); wöchentlich ( )); Fraxiparine® (täglich ( ); wöchentlich ( )), Lovenox®/Clexane® (täglich ( ); wöchentlich (o)) und einer PBS-Kontrolle (x). Alle drei LMWHs verschiedener Art und Quellen zeigten eine deutliche Hemmung der Arthritis, wenn sie wöchentlich, jedoch nicht täglich, verabreicht wurden.

5.8. Beispiel 8: Behandlung mit LMWH verhindert die Abstoßung allogener Translantate

Wistar-Ratten wurden einer allogenen BN-Herztransplantation unterzogen (Ono, K. and Linsay, E. S., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1969) 45: 225-229). Beginnend mit dem Tag vor der Transplantation wurden die Ratten subkutan in 7-Tage- Intervallen mit 20 ug Fragmin® oder PBS-Kontrolle (Fig. 6, bzw. ) injiziert und ihr Überleben bewertet. Der Tag der Abstoßung wurde festgelegt als der Tag, an dem das Schlagen der Herzen aufhörte, was durch Abtasten des Bauchs untersucht wurde. Fig. 6 zeigt, dass bei den mit der wöchentlichen Dosis von LMWH behandelten Ratten eine deutlich höhere Anzahl der allogenen Herztransplantate überlebte.

5.9. Beispiel 9: Biologische Wirkung von LMWH auf insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM) bei NOD-Mäusen

Mäuse des NOD-Stamms entwickeln spontan eine Form des insulinabhängigen Diabetes mellitus Typ I (IDDM), der das akzeptiertes Modell für humanen IDDM ist (Castano, L. und Eisenbarth, G. S., Annu. Rev. Immunol. (1990) 8: 647-679). Die Krankheit beginnt im Alter von 4-5 Wochen durch Auftreten einer Entzündung der Insulae pancreatis, Insulitis. Die Insulitis schädigt in progressiver Weise die Insulinproduzierenden Beta-Zellen, die für Schädigungen durch TNF- empfindlich sind. Im Alter von etwa 4-5 Monaten sind eine genügen große Anzahl von Beta-Zellen zerstört, so dass der Diabetes offen ausbricht.
Um zu untersuchen, ob Behandlung mit LMWH den IDDM-Prozess beeinflusst, wurde eine Gruppe von 10 weiblichen NOD-Mäusen mit wöchentlichen subkutanen Injektionen von Fragmin® (Charge 38609), 5 ug pro Maus, behandelt - der Dosis die als 12 Mauseinheiten pro kg darstellend bestimmt wurde. Eine Gruppe von 10 Kontrollmäusen wurde mit Injektionen von Kochsalzlösung behandelt. Im Alter von 5 Monaten wurden alle Mäuse ausgeblutet, um die Entwicklung von IDDM zu ermitteln, hierbei wurde ein Standardverfahren angewandt (Elias, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1990) 87: 1576- 1580). Fig. 7 zeigt, dass die Kontrollmäuse ("kein Fragmin") anormalen Blutzucker (400 mg/dl) aufwiesen. Im Gegensatz dazu wiesen dis mit LMWH behandelten Mäuse einen normalen Blutzucker (100 mg/dl) auf. Durch die Behandlung mit LMWH kann somit der IDDM-Prozeß tatsächlich geheilt werden.

5.1.0 Beispiel 10: LMWB-Behandlung humaner DTH

Fig. 8 zeigt einen Versuch, in dem ein 40jähriger männlicher Freiwilliger, mit einem Gewicht von 85 kg, auf DTH- Reaktivität auf Tetanus-Antigen (Merieux-Hauttestapplikator) untersucht wurde. Etwa 18 mm Induration wurden nach 24 und 48 Stunden gemessen. Der Freiwillige erhielt dann eine subkutane Injedktion von Fragmin® (Charge 38609) 3 mg. Fünf Tage später wurde der Freiwillige wiederum auf seine DTH-Reaktion auf Tetanus getestet: die Induration war auf 5 mm gehemmt. Der Freiwillige wurde 3 Wochen später ("Erholung") wieder auf DTH getestet, und der Test zeigte eine positive Reaktivität (23 mm Induration nach 24 und 48 Stunden). Der Freiwillige wurde dann mit Fragmin® wie vorher behandelt und die DTH-Reaktivität wiederum 7 Tage später ("7 Tage nachher") gemessen. DTH war wieder auf etwa 5 mm Induration gehemmt. Eine Erholung der DTH wurde wiederum 3 Wochen später festgestellt. Demzufolge ist LMWH in einer Dosis von weniger als 5 mg in Behandlungsintervallen von 5 bis 7 Tagen in der Lage, DTH beim Menschen zu hemmen.

Claims

1. Verwendung einer Zusammensetzung, die ein niedermolekulargewichtiges Heparin (LMWH) enthält, zur Herstellung eines Medikaments gegen einen pathologischen Prozeß, der die Induktion der Sekretion von TNF-α beinhaltet, wobei das genannte Medikament weniger als 5 mg des genannten LMWH pro Dosis für die Behandlung eines menschlichen Patienten enthält und für eine Verabreichung in Intervallen von 5 bis 8 Tagen wirksam ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament für eine Verabreichung an jedem fünften Tag wirksam ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament für eine Verabreichung an jedem siebten Tag wirksam ist.

4. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikaments gegen Allergie, entzündliche Darmerkrankung, rheumatoide Arthritis, Fremdtransplantatabstoßung, Diabetes Typ I, Periodontitis, Multiple Sklerose, Atherosklerose oder Vaskulitis.

5. Verwendung nach Anspruch 4 zur Herstellung eines Medikaments gegen Allergie, die sich als Asthma, Rhinitis oder Ekzem manifestiert.

6. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei der der pathologische Prozeß eine Fremdtransplantatabstoßung, eine Allergie, Autoimmunerkrankung oder entzündliche Erkrankung ist.

7. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei der der pathologische Prozeß AIDS ist.

8. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei der der pathologische Prozeß Diabetes Typ I, Periodontitis, eine entzündliche Darmerkrankung, Uveitis, rheumatische Erkrankung, Multiple Sklerose, Atherosklerose oder vaskulitis ist.

9. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei der der pathologische Prozeß rheumatoide Arthritis ist.

10. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte LMWH ein mittleres Molekulargewicht von 3.000 bis 6.000 aufweist.

11. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament für eine subkutane oder intravenöse Verabreichung geeignet ist.

12. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, bei der eine Einzeldosis des Medikaments weniger als 3 mg des genannten LMWH enthält.

13. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, bei der eine Einzeldosis des Medikaments zur Behandlung eines erwachsenen Menschen weniger als 3 mg des genannten LMWH enthält.

14. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, bei der eine Einzeldosis des Medikaments von 0,3 bis 3 mg des genannten LMWH enthält.

15. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, bei der eine Einzeldosis des Medikaments zur Behandlung eines erwachsenen Menschen von 0,3 bis 3 mg des genannten LMWH enthält.

16. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, bei der eine Einzeldosis von 1 bis 1,5 mg des genannten LMWH enthält.