CN105106239A - 使用产后衍生细胞治疗外周血管疾病 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用产后衍生细胞治疗外周血管疾病。本发明公开了这样的组合物和方法，它们使用衍自产后组织如脐带和胎盘的细胞，以刺激和支持外周血管疾病患者的血管发生，改善其血流，再生、修复和改善其被外周局部缺血事件损害的骨骼肌，并保护其骨骼肌免受局部缺血损害。

Description

使用产后衍生细胞治疗外周血管疾病

本申请是申请日为2006年12月28日，申请号为200680053495.8(国际申请号为PCT/US2006/062667)，发明名称为“使用产后衍生细胞治疗外周血管疾病”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2005年12月28日提交的美国临时专利申请第60/754,366号的权利，该临时专利申请的内容通过引用整体结合到本文中。

发明领域

本发明涉及针对外周血管疾病患者特别是外周缺血患者的基于细胞的疗法或再生疗法的领域。具体的说，本发明提供具有以下能力的衍自产后组织的细胞：刺激和支持血管发生，改善血流，再生、修复和改善受外周缺血事件损害的骨骼肌，和保护骨骼肌免受缺血损害。

发明背景

本说明书通篇引用到各种出版物，包括专利、公布的申请、技术文章和学术文章。这些被引用的出版物每一个都通过引用整体结合到本文中。

外周血管疾病(PVD)可因血管特别是肢体和在心脏的远端的区域的血管的动脉硬化闭塞症而引起，导致血流减少和闭塞(occlusion)处周围和下游的组织的氧灌注不足。PVD常出现在髂血管、股血管和腿弯部血管及锁骨下血管，它的影响可被血栓症、栓子或创伤加剧。据估计，在美国大约有800万到1200万人受到PVD的折磨，特别是老年人口和糖尿病患者。

PVD的常见症状包括上下肢和末端(extremities)的痉挛、麻痹、虚弱、肌肉疲劳、四肢和末端的疼痛、四肢和末端的低温、末端的变色、皮肤干燥或剥落及高血压。最常见的症状是跛行或者闭塞的血管下游的肌肉的疼痛感、抽紧感和疲劳感，这些感觉在一些形式的锻炼如步行过程中出现，但休息一段时间后自行消除。

在病理生理学上，闭塞的血管会引起梗阻(obstruction)部位和梗阻部位的远端的组织的局部缺血。这种局部缺血通常称为外周缺血，意思是它发生在心脏的远端的部位。局部缺血的严重性因梗阻的大小和数量、梗阻是否接近肌肉或器官及是否有足够的多余血管系统而异。在较为严重的情况中，局部缺血会导致受影响组织的死亡，可导致受影响肢体的截肢乃至患者的死亡。

PVD的更为严重病情目前的治疗方法包括化疗方案、血管成形术、固定模插入(insertionofstents)、重建外科手术(reconstructivesurgery)、旁路移植、受影响组织的切除术或者截肢术。可惜的是，对于许多患者来说，这些介入方法成功率有限，且许多患者会经历到病症或症状的恶化。

目前，人们有兴趣使用能分裂和分化的干细胞或者来自其他来源的肌肉细胞(包括平滑肌细胞和骨骼肌细胞)来帮助组织损害的修复或逆转。干细胞的移植可用作临床工具来重构靶组织，从而恢复生理和解剖机能。干细胞技术的应用是广泛的，包括组织工程、基因疗法递送和细胞疗法，后者也就是通过外源供应能产生或含有生物治疗剂的活细胞或细胞成分将这些生物治疗剂递送到靶部位(有关综述参见Tresco，P.A.etal，(2000)AdvancedDrugDeliveryReviews42：2-37)。干细胞的鉴定已刺激了旨在选择性产生供再生医学用的特异性细胞类型的研究。

干细胞技术治疗潜力的实现的一个阻碍一直是获得足够数量的干细胞有困难。胚胎组织或胎儿组织是干细胞的一个来源。已从多种哺乳动物物种(包括人类)分离了胚胎干细胞和祖细胞，有几种这种细胞类型已被证实能够自我更新和扩展以及分化成多种不同的细胞谱系。但从胚胎或胎儿来源衍生干细胞已引起了许多伦理和道德问题，这些问题需要通过鉴定其它来源的多能(multipotent)或多潜能(pluripotent)细胞来进行避免。

产后组织如脐带和胎盘作为干细胞的另选来源已引起人们兴趣。例如，已描述了通过胎盘的灌注或从脐带血或组织进行的收集来回收干细胞的方法。从这些方法获取干细胞的限制因素一直是所获得的脐带血体积或细胞数量不足，还有从这些来源获得的细胞群体存在异质性或缺乏表征。

具有分化成一批(anarrayof)骨骼肌谱系、周细胞谱系或血管谱系的能力的基本上均质的这种细胞群体，如能得到可靠的、良好表征的和充裕的供应，在以下各种诊断性和治疗性应用中将会是有利的：骨骼肌修复、再生和改善，血管发生的刺激和/或支持，和外周缺血事件后血流的改善，特别是在PVD患者中。

发明概述

本发明的一个方面涉及用于治疗患有外周血管疾病的患者的方法，所述方法包括将产后衍生细胞以能有效治疗外周血管疾病的量给予该患者，其中所述产后衍生细胞衍自基本上没有血液的人胎盘或脐带组织；其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩展，和具有分化成至少骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮表型的细胞的潜力；其中所述细胞需要L-缬氨酸用于生长并能在至少约5％氧中生长；其中所述细胞还包含以下特征中的至少一个：a)在培养中倍增至少约40次的潜力；b)在包被或未包被的组织培养容器上的贴壁和扩展，其中包被组织培养容器包含明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的包被层；c)组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的至少一个的产生；d)CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A，B，C中的至少一个的产生；e)CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR，DP，DQ中的至少一个的产生的缺乏，这通过流式细胞术来检测；f)相对于成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞这些人细胞而言，至少一个编码以下物质的基因的基因表达提高：白细胞介素8；网硬蛋白(reticulon)1；趋化因子(C-X-C模体)配体1(黑素瘤生长刺激活性，α)；趋化因子(C-X-C模体)配体6(粒细胞趋化蛋白2)；趋化因子(C-X-C模体)配体3；肿瘤坏死因子，α诱导蛋白3；C型凝集素超家族成员2；Wilms肿瘤1；醛脱氢酶1家族成员A2；肾素；氧化低密度脂蛋白受体1；人类(Homosapiens)克隆IMAGE：4179671；蛋白激酶Cζ；假拟蛋白DKFZp564F013；在卵巢癌1中下调；和来自克隆DKFZp547k1113的人类基因；g)相对于成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞这些人细胞而言，至少一个编码以下物质的基因的基因表达减少：矮身材同源框2；热激27kDa蛋白2；趋化因子(C-X-C模体)配体12(基质细胞衍生因子1)；弹性蛋白(主动脉瓣上狭窄、Williams-Beure综合征)；人类mRNA；cDNADKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022)；间充质同源框2(生长停滞特异性同源框)；sineoculis同源框同源物1(果蝇)；晶状体蛋白，αB；形态发生2的凌乱缔合激活剂；DKFZP586B2420蛋白；类似于neuralin1；四连蛋白(纤溶酶原结合蛋白)；src同源性3(SH3)和半胱氨酸富集域；胆固醇25-羟化酶；矮子相关转录因子-3；白细胞介素11受体，α；前胶原C肽链内切酶增强子；卷曲同源物7(果蝇)；假拟基因BC008967；胶原，VIII型，α1；生腱蛋白C(结合腕蛋白(hexabrachion))；易洛魁族人同源框蛋白5；hephaestin；整联蛋白，β8；突触小泡糖蛋白2；成神经细胞瘤，致瘤性1的抑制；胰岛素样生长因子结合蛋白2，36kDa；人类cDNAFLJ12280fis，克隆MAMMA1001744；细胞因子受体样因子1；钾中等/小电导率钙激活通道，亚家族N，成员4；整联蛋白，β7；带PDZ结合模体的转录共激活剂(TAZ)；sineoculis同源框同源物2(果蝇)；KIAA1034蛋白；小泡相关膜蛋白5(肌短蛋白)；含EGF纤蛋白样胞外基质蛋白1；早期生长应答3；distal-less同源框5；假拟蛋白FLJ20373；醛-酮还原酶家族1，成员C3(3-α羟基类固醇脱氢酶，II型)；双糖链蛋白聚糖；带PDZ结合模体的转录共激活剂(TAZ)；纤连蛋白1；脑啡肽原；整联蛋白，β样1(带EGF样重复结构域)；人类mRNA全长插入cDNA克隆EUROIMAGE1968422；EphA3；KIAA0367蛋白；钠尿肽受体C/鸟苷酸环化酶C(心房钠尿肽受体C)；假拟蛋白FLJ14054；人类mRNA；cDNADKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222)；BCL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3样；AE结合蛋白1；细胞色素c氧化酶亚单位VIIa多肽1(肌肉)；类似于neuralin1；B细胞易位基因1；假拟蛋白FLJ23191和DKFZp586L151；h)MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1中的至少一个的分泌；i)TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC和VEGF中的至少一个的分泌的缺乏，这通过ELISA来检测。

在一个具体的实施方案中，外周血管疾病是外周缺血。在某些实施方案中，所述细胞在体外被诱导分化成骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮谱系细胞后再进行给予。在另一个实施方案中，对所述细胞进行遗传工程改造以产生能促进外周血管疾病的治疗的基因产物。

在所述方法的一些实施方案中，将所述细胞与至少一种其他细胞类型一起给予，该其他细胞类型可包括骨骼肌细胞、骨骼肌祖细胞、血管平滑肌细胞、血管平滑肌祖细胞、周细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞或者其他多潜能(multipotent)或多能(pluripotent)干细胞。该其他细胞类型可以在给予产后衍生细胞的同时或之前或之后给予。

在其他实施方案中，将所述细胞与至少一种其他药物一起给予，该其他药物可以是例如抗血栓形成剂、抗炎剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、促生血管剂或抗细胞凋亡剂。该其他药物可以在给予产后衍生细胞的同时或之前或之后给予。

所述细胞优选在外周缺血的部位或在该部位的近端给予，但也可在外周缺血的远端的部位给予。它们可通过注射、输注、植入患者体内的装置来给予，或者通过含有它们的基质(matrix)或支架(scaffold)的植入来给予。所述细胞可对患者的骨骼肌、血管平滑肌或血管内皮施加营养作用如增殖。所述细胞可诱导骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、骨骼肌祖细胞、周细胞、血管平滑肌祖细胞或血管内皮祖细胞迁移到外周血管疾病如外周缺血的(一个或多个)部位。

本发明的另一个方面涉及用以治疗外周血管疾病患者的药物组合物和药盒，所述药物组合物和药盒包含药物可接受的载体和上述产后衍生细胞或从这种产后衍生细胞制备的制品(preparation)。在一些优选的实施方案中，所述制品包含FGF和HGF。所述药物组合物和药盒被设计和/或配制用来实施上述本发明方法。

根据本发明的另一个方面，上述方法可用从所述产后衍生细胞制备的制品来实施，其中所述制品包含所述产后衍生细胞的细胞裂解物、所述产后衍生细胞的胞外基质或生长所述产后衍生细胞的条件培养基。优选的是这种制品包含FGF和HGF。

本发明的其他方面涉及含有包含所述产后衍生细胞的细胞裂解物、胞外基质或条件培养基的制品的药物组合物和药盒。

参阅下文的发明详述和实施例，将会理解本发明的其他特征和优点。

附图简述

图1显示hUTC批次120304、MSCs和成纤维细胞对内皮细胞的增殖的作用。内皮细胞以5000个细胞/cm²(10,000个细胞/孔)的密度接种到24孔组织培养皿的底部上，hUTC批次120304、MSCs或成纤维细胞以5000个细胞/cm²(1,650个细胞/嵌块(insert))的密度接种在转孔嵌块的内部，细胞是在共培养培养基(Hayflick80％+EGM-2MV20％或Hayflick50％+EGM-2MV50％)中。共培养7天后，收获细胞，用仪器计数。还将内皮细胞保持在EGM-2MV中作为阳性对照。A，HUVECs。B，HCAECs。C，HIAECs。

图2显示hUTC批次120304和中和性抗体对内皮细胞的增殖的作用。HUVECs或HCAECs以5000个细胞/cm²(10,000个细胞/孔)的密度接种到24孔组织培养皿的底部上，hUTC批次120304以5000个细胞/cm²(1,650个细胞/嵌块)的密度接种在转孔嵌块的内部，细胞是在共培养培养基(Hayflick50％+EGM-2MV50％)中。此时还加入抗FGF(7μg/ml)、HGF(1μg/ml)或VEGF(1μg/ml)的中和性抗体。共培养7天后，收获细胞，用仪器计数。还将内皮细胞保持在EGM-2MV培养基中作为阳性对照。显示了用生长因子单独处理和用生长因子加中和性抗体处理的细胞。A，HUVECs.。B，HCAECs。

图3显示hUTC批次120304细胞裂解物和中和性抗体对HUVECs的增殖的作用。HUVECs以在EGM-2MV培养基中5000个细胞/cm²(10,000个细胞/孔)的密度接种到24孔组织培养皿的底部上，保持8小时。然后将细胞在0.5ml含0.5％FBS和不含生长因子的EGM-2MV培养基中温育过夜，进行血清饥饿处理。之后，加入FBS、新制备的hUTC批次120304细胞裂解物和抗FGF(7μg/ml)或HGF(1μg/ml)的中和性抗体。培养4天后，收获细胞，用仪器计数。浅灰色柱条为培养基对照。中灰色柱条为与含62.5μg蛋白质的裂解物温育的HUVECs。深灰色柱条为与含125μg蛋白质的裂解物温育的HUVECs。

图4显示hUTCs和MSCs对内皮细胞的迁移的作用。HUVECs或HCAECs以5000个细胞/cm²(23,000个细胞/嵌块)的密度接种在转孔嵌块的内部，hUTC批次120304或MSCs以5000个细胞/cm²(48,000个细胞/孔)的密度接种到6孔组织培养皿的底部上，细胞是在在共培养培养基(Hayflick50％+EGM-2MV50％)中。共培养7天后，收获在转孔嵌块的底面上的细胞，用仪器计数。还将内皮细胞保持在EGM-2MV培养基中作为对照。A，HUVECs。B，HCAECs。

图5显示hUTC批次120304和中和性抗体对内皮细胞的迁移的作用。HUVECs或HCAECs以5000个细胞/cm²(23,000个细胞/嵌块)的密度接种在转孔嵌块的内部，hUTC批次120304以5000个细胞/cm²(48,000个细胞/孔)的密度接种到6孔组织培养皿的底部上，细胞是在在共培养培养基(Hayflick50％+EGM-2MV50％)中。此时还加入抗FGF(7μg/ml)或HGF(1μg/ml)的中和性抗体。共培养7天后，收获在转孔嵌块的底面上的细胞，用仪器计数。还将内皮细胞保持在EGM-2MV培养基中作为对照。A，HUVECs。B，HCAECs。

发明详述

在本说明书和权利要求书中使用到各种术语。这些术语采用其在本领域的普通含义，除非另有规定。其他专门定义的术语要按与本文提供的定义相一致的方式来解释。

干细胞是以单个细胞同时具有自我更新和分化产生后代细胞的能力为特征的未分化细胞，包括自我更新的祖细胞、非自我更新的祖细胞和末端分化细胞。干细胞还以其以下能力为特征：从多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成各种细胞谱系的功能细胞的能力，在移植后产生具多个胚层的组织的能力，和在注射到胚泡后实质上促成大多数的组织(如果不是实质上促成所有的组织的话)的能力。

干细胞根据它们的发育潜力分为以下几类：(1)全能细胞(totipotent)；(2)多能细胞(pluripotent)；(3)多潜能细胞(multipotent)；(4)寡能细胞(oligopotent)和(5)单能细胞(unipotent)。全能细胞能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型。多能细胞能够产生所有的胚胎细胞类型。多潜能细胞包括能够产生细胞谱系的子集(subset)，但都在特定的组织、器官或生理系统当中的那些细胞。例如，造血干细胞(HSC)能产生包括以下的后代：HSC(自我更新)、局限于血细胞的寡能祖细胞及所有为血液的正常组分的细胞类型和成分(例如血小板)。寡能细胞能比多潜能干细胞产生更局限的细胞谱系子集。单能细胞能够产生单一细胞谱系(例如精子发生干细胞)。

干细胞还根据它们的获取来源来分类。成人干细胞通常是见于包含多个分化细胞类型的组织中的多潜能未分化细胞。成人干细胞能自我更新。在正常的情况下，它还能分化产生其来源组织的特化细胞类型，或许还产生其他组织类型的特化细胞类型。胚胎干细胞是来自胚泡阶段的胚胎的内细胞团(innercellmass)的多能细胞。胎儿干细胞是来源于胎儿组织或膜的干细胞。产后干细胞是基本上来源于分娩后可得到的胚胎外组织即胎盘和脐带的多潜能细胞或多能细胞。已发现这些细胞具有多能干细胞所特有的特征，包括快速增殖和有分化成许多细胞谱系的潜力。产后干细胞可以是衍自血液(例如从脐带血获得)，或者是非衍自血液(例如从脐带的非血液组织和胎盘获得)。

胚胎组织通常定义为来源于胚胎(在人类中是指从授精到发育约六个星期的时期)的组织。胎儿组织是指来源于胎儿的组织，胎儿在人类中是指从发育约六个星期到分娩的时期。胚胎外组织是与胚胎或胎儿有关、但不来源于胚胎或胎儿的组织。胚胎外组织包括胚胎外膜(绒毛膜、羊膜、卵黄囊和尿囊)、脐带和胎盘(它本身从绒毛膜和母体基蜕膜形成)。

分化是非特化的(“非定向的”)细胞或特化程度较低的细胞获得特化细胞(例如神经细胞或肌细胞)的特征的过程。分化细胞是在细胞的谱系当中占有了较为特化的(“定向的”)状态的细胞。术语定向当应用到分化的过程时是指在分化途径中进行到这样的程度的细胞，在该程度下，它在正常情况下会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常情况下不能分化成别的细胞类型或者回复到分化程度较低的细胞类型。去分化是指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)程度较低的状态的过程。本文所用的细胞的谱系定义某细胞的遗传，也就是说它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。某细胞的谱系将确定细胞在发育和分化的遗传体系(hereditaryscheme)当中的位置。

在广义上，祖细胞是具有产生比它本身更为分化的后代的能力、但仍保持补充祖细胞库的能力的细胞。按这个定义，干细胞本身也是祖细胞，末端分化细胞的更为直接的前体同样是祖细胞。当提到本发明的细胞时，可使用祖细胞的这个广泛定义，这在下文中有更详细的描述。在狭义上，祖细胞往往定义为在分化途径中处于中间地位的细胞，也就是说它从干细胞产生，在成熟细胞类型和细胞类型子集的产生中处于中间地位。这种类型的祖细胞通常不能够自我更新。因此，如果在本文中提到这种类型的细胞，它会被称为非更新祖细胞或者称为中间祖细胞或前体细胞。

本文所用的词语分化成中胚层谱系、外胚层谱系或内胚层谱系是指分别变得定向于特定的中胚层谱系、外胚层谱系或内胚层谱系的细胞。分化成中胚层谱系或产生特定中胚层细胞的细胞的实例包括但不限于生脂细胞、生软骨细胞、生心脏细胞、生真皮细胞、造血细胞、成血管细胞、生肌细胞、生肾细胞、生泌尿生殖道细胞、生骨细胞、生心包细胞或基质细胞。分化成外胚层谱系的细胞的实例包括但不限于表皮细胞、生神经细胞和生神经胶质细胞。分化成内胚层谱系的细胞的实例包括但不限于生胸膜细胞、生肝细胞、产生肠内膜的细胞和产生胰腺和内脏的细胞。

本发明所用的细胞通常称为产后细胞或产后衍生细胞(PPDCs)。它们有时候还可更具体地称为脐带衍生细胞(UDCs)或胎盘衍生细胞(PDCs)。另外，细胞还可被描述为干细胞或祖细胞，后一术语以广义使用。术语衍生用来表示细胞已从它们的生物来源获得并进行了生长或以别的方式进行了体外操纵(例如在生长培养基中培养以扩展群体和/或产生细胞系)。脐带干细胞的体外操纵和本发明的脐带衍生细胞的独特特征在下文中作详细描述。

周细胞，在本领域中也称Rouget细胞或壁细胞，是指这样的细胞，它们通常被发现内嵌在血液微血管的基膜当中(ArmulikAetal.(2005)Circ.Res.97：512-23)，据认为在以下方面等起到作用：与内皮细胞的通讯/信号转导、血管收缩、血管舒张、血流调节、血管系统形成和发育、血管发生及内皮分化和生长停滞(BergersGetal.(2005)Neuro-Oncology7：452-64)。

有各种术语用来描述培养中的细胞。细胞培养物通常指取自活生物和在控制条件下生长的细胞(“在培养中的”或“培养的”)。原代细胞培养物是第一次亚培养之前的直接取自生物的细胞、组织或器官的培养物。当将细胞在能促进细胞生长和/或分裂的条件下放在生长培养基中时，细胞在培养中扩展，产生更大的细胞群体。当细胞在培养中扩展时，细胞增殖的速度有时通过细胞数量倍增所需的时间量来测量。这称为倍增时间。

细胞系是由原代细胞培养物的一次或多次亚培养形成的细胞群体。每轮亚培养称为传代。当细胞被亚培养时，它们被称为已被传代。细胞的具体群体或细胞系有时由它们被传代的次数来指称或表征。例如，已被传代十次的培养的细胞群体可称为P10培养物。原代培养物，即细胞从组织分离后的第一次培养物，指定为P0。在第一次亚培养后，细胞被描述为二代培养物(P1或传代1)。第二次亚培养后，细胞变成三代培养物(P2或传代2)，依此类推。本领域技术人员会认识到，在传代期间可能有许多次群体倍增；因此培养物的群体倍增次数大于传代次数。细胞在各次传代之间的期间的扩展(即群体倍增的次数)取决于多个因素，包括但不限于接种密度、底物、培养基、生长条件和各次传代之间的时间。

条件培养基是特定的细胞或细胞群体已在其中进行了培养且然后细胞被除去的培养基。当细胞在培养基指培养时，它们会分泌出能给其他细胞提供营养支持的细胞因子(cellularfactor)。这种营养因子包括但不限于激素、细胞因子(cytokine)、胞外基质(ECM)、蛋白质、囊泡、抗体和颗粒体。含有细胞因子(cellularfactor)的培养基是条件培养基。

通常，营养因子定义为能促进细胞的生存、生长、增殖和/或成熟或者刺激细胞活性增加的物质。

术语衰老(还有复制衰老或细胞衰老)当指培养的脊椎动物细胞时，是指可归因于有限细胞培养的特性；这个特性也就是它们不能够生长超出有限的群体倍增次数(有时称为Hayflick极限)。虽然细胞衰老首先是用成纤维细胞样细胞描述的，但大多数的能在培养中成功生长的正常人细胞类型都经历细胞衰老。不同细胞类型的体外寿命是不同的，但最大寿命通常小于100次群体倍增(这是培养物中的所有细胞变得衰老从而使得培养物不能够分裂的倍增次数)。衰老并不取决于计时时间(chronologicaltime)，而是由培养物已经历的细胞分裂次数或群体倍增次数来测量。因此，因除去必需生长因子而变得静息的细胞当再引入生长因子时能够恢复生长和分裂，然后进行与连续生长的等同细胞相同的倍增次数。同样，当细胞在多次群体倍增后在液氮中冷冻并然后进行解冻和培养时，它们会进行与在培养中保持未冷冻的细胞基本上相同的倍增次数。衰老细胞不是已死或垂死的细胞；它们实际上能抵抗程序性细胞死亡(细胞凋亡)，且已被维持在它们的非分裂状态达3年之久。这些细胞很好地活着，代谢上很活跃，但它们不分裂。尚未发现衰老细胞的非分裂状态可通过任何生物的、化学的或病毒的物质进行逆转。

本文所用的术语生长培养基通常指足够用于培养产后衍生细胞的培养基。具体的说，一种目前优选的用于培养本发明细胞的培养基包括Dulbecco改进的必需培养基(DMEM)。特别优选的是低葡萄糖DMEM(DMEM-LG)(Invitrogen，Carlsbad，CA)。DMEM-LG优选补充有血清，最优选补充有胎牛血清或人血清。通常，加入15％(v/v)胎牛血清(例如确定成分的(defined)胎牛血清，Hyclone，LoganUT)，以及抗生素/抗真菌素((优选100单位/毫升青霉素、100毫克/毫升链霉素和0.25微克/毫升两性霉素B；Invitrogen，Carlsbad，CA))和0.001％(v/v)2-巯基乙醇(Sigma，St.LouisMO)。在一些情况中，使用不同的生长培养基，或者提供不同的补充物，这些补充物通常在教科书中被指出为生长培养基的补充物。在某些化学上确定成分的培养基(chemically-definedmedia)中，细胞可在完全不存在血清下生长。在这种情况下，细胞可能需要某些生长因子，可将这些生长因子加到培养基中来支持和维持细胞。目前优选的为在无血清培养基上生长而加入的因子包括bFGF、EGF、IGF-I和PDGF中的一个或多个。在更为优选的实施方案中，向无血清或化学上确定成分的培养基加入其中两种、三种或所有四种因子。在其他实施方案中，向无血清培养基加入LIF以支持或改善细胞的生长。

本文所用的同样与本发明有关的术语标准生长条件是指在包含5％CO₂的标准气氛下37℃下培养细胞。相对湿度维持在约100％。虽然前述条件可用于进行培养，但应认识到技术人员能够对这种条件加以改变，因为技术人员会知道本领域中可供进行培养细胞的可选条件。

术语有效量是指能有效实现特定的生物学结果的本文所述化合物、材料或组合物的浓度或数量。这种结果包括但不限于骨骼组织的再生、修复或改善，血流的改善和/或外周缺血患者中的血管发生的刺激和/或支持。这种有效活性可例如通过将本发明的细胞和/或组合物给予外周缺血患者来达到。对于体内给予患者的PPDCs，有效量可从少至几百个或更少到多至几百万个或更多。在具体的实施方案中，有效量可为10³-10¹¹个，更具体的说至少约10⁴个细胞。应认识到，待给予的细胞数量要根据待治疗的疾病的具体情况而变，这些具体情况包括但不限于待治疗的大小或总体积/表面积、给药部位与待治疗区域的位置的接近程度，以及医学生物技术人员熟知的其他因素。

术语治疗(名词或动词)是指损伤、病理或病症的减轻或改善上的任何成功或成功标志，包括任何客观或主观的参数如症状的消除、免除、减少，或者使损伤、病理或病症更可被患者耐受，减慢衰退或衰落的速度，使衰退的终点没那么使人虚弱，改善受试者的身体或精神康乐或者延长存活时间长度。症状的治疗或改善可基于客观或主观的参数；包括身体检查、神经学检查和/或精神病学评估的结果。

术语有效期(或时间)和有效条件是指某药物或药物组合物实现其预定结果所必需或优选的时间长度或其他可控制条件(例如对于体外方法来说温度、湿度)。

术语患者或受试者在本文中可互用，指的是用本文描述的药物或治疗性组合物或者按照本文描述的方法治疗的动物，优选哺乳动物，更优选人类。

局部缺血是指由血管系统的任何收缩或梗阻引起的向任何身体器官、组织或部分的血液供应的任何下降或停止。局部缺血发作(ischemicepisode)或局部缺血事件(ischemicevent)在本文指可互用，指的是短暂时间或持久时间的局部缺血。外周局部缺血是指由血管系统的任何收缩或梗阻引起的向心脏除外的任何身体器官、组织或部分的血液供应的任何下降或停止。外周血管疾病是指心脏和大脑外部的血管的疾病。它通常涉及到将血液携带到末端的血管的窄化，是由两种类型的循环疾病产生，即(1)功能性外周血管疾病，它涉及到能使血管窄化的短期痉挛；和(2)器官性外周血管疾病，它涉及到血管中的例如由炎症或脂肪堵塞引起的结构变化。

术语药物可接受的载体或介质可与术语生物相容的载体或介质互用，是指这样的试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型，它们不仅与待治疗性给予的细胞和其他药物相容，而且在可靠的医疗判断范围内还适合用于与人或动物的组织相接触而又没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的效益/风险比相称的其他并发症。适用于本发明的药物可接受的载体包括液体、半固体(例如凝胶)和固体材料(例如细胞支架和基质、管材片材和本领域所公知的和本文所更详细描述的其他这种材料)，这在本文会更详细描述到。这些半固体和固体材料可设计成能在身体当中抵抗降解(非生物可降解的)，或者它们可设计成在能身体当中降解(生物可降解的、生物可侵蚀的)。生物可降解材料还可以是生物可再吸收的或生物可吸收的，即它可以溶解和吸收到体液中(水溶性植入物是一个实例)，或者通过转化成其他材料或分解并经由天然途径排除而发生降解并最终从身体排除。一旦植入到身体中，生物降解速度可根据所需的释放速度来改变。基质如有需要还可充当临时支架，直到被新生长的骨骼肌、周细胞、血管平滑肌或血管内皮组织代替。因此，在一个实施方案中，基质能提供与产后衍生细胞一起使用的其他药物的缓释，且可为患者的发育中的组织生长提供结构。在其他实施方案中，基质仅仅是为发育中的组织提供临时支架。基质可以为颗粒形式(直径大于10微米的大颗粒和直径小于10微米的小颗粒)，或者可以为结构上稳定的三维植入物(例如支架)的形式。植入物可以是例如立方体、圆柱体、管体、块体、膜体、片体或适当的解剖学形式。

本文使用到几个涉及细胞或组织移植的术语。术语自体同源转移(autologoustransfer)、自体同源移植(autologoustransplantation)、同体移植(autograft)等是指其中移植供体也是移植受体的移植。术语同种异基因转移(allogeneictransfer)、同种异基因移植(allogeneictransplantation)、同种异体移植(allograft)等是指其中移植供体与移植受体同物种但不是该受体的移植。其中供体细胞已与受体进行了组织相容性匹配的细胞移植有时称为同基因转移(syngeneictransfer)。术语异种转移(xenogeneictransfer)、异种移植(xenogeneictransplantation)、异种移植(xenograft)等是指其中移植供体与移植受体不同物种的移植。

在本文描述的各种实施方案中，本发明涉及采用衍自产后组织特别是脐带组织的祖细胞和细胞群体来治疗外周血管疾病的方法和药物组合物。这些方法和药物组合物设计来刺激和支持血管发生，改善血流，再生、修复和改善受外周缺血事件损害的骨骼肌，和/或保护骨骼肌免受缺血损害。用于本发明药物制品和方法的细胞、细胞群体和包含细胞裂解物、条件培养基等的制品，在美国专利公开说明书2005/0058631和2005/0054098中及在下文中有详细描述。

根据本文描述的方法，哺乳动物胎盘或脐带是在足月妊娠或不足月妊娠终止时或终止不久后，例如在胎娩出后或在分娩后，来进行回收。产后组织可放在无菌容器如烧瓶、烧饼、培养皿或袋子中从分娩场所运输到实验室。容器可具有溶液或培养基，包括但不限于盐溶液如Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(也称Dulbecco极限必需培养基)或磷酸缓冲盐水(PBS)，或者任何用于移植用器官的运输的溶液如威斯康星大学溶液或全氟化合物溶液。可向培养基或缓冲液中加入一种或多种抗生素和/或抗真菌剂，如但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。产后组织可用抗凝结溶液如含肝素溶液进行清洗。优选的是组织在提取PPDCs之前保持在约4-10℃。甚至更优选的是组织在提取PPDCs之前不进行冷冻。

PPDCs的分离优选在无菌环境中进行。脐带可用本领域公知的方法与胎盘分离。或者，脐带和胎盘不经分离而使用。在分离PPDCs之前优选将血液和碎片从产后组织中除去。例如，产后组织可用包括但不限于磷酸缓冲盐水的缓冲溶液进行洗涤。洗涤缓冲液还可包含一种或多种抗真菌剂和/或抗生素，如但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。

包含完整胎盘或其片段或切片的产后组织通过机械力(绞切力或剪切力)进行分解。在目前优选的实施方案中，分离程序还采用到酶促消化方法。本领域已知有许多酶可用于从复杂的组织基质分离单个细胞，以有利于在培养中生长。消化酶从弱消化性酶类(例如脱氧核糖核酸酶和中性蛋白酶、分散酶)到强消化性酶类(例如木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)者有，且可市售获得。与本发明相容的酶类的非穷举名录包括黏液溶解酶活性、金属蛋白酶、中性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶)和脱氧核糖核酸酶。目前优选的是选自金属蛋白酶、中性蛋白酶和黏液溶解酶活性的酶活性。例如，胶原酶已知可用于从组织分离各种细胞。脱氧核糖核酸酶能消化单链DNA和能使分离过程中的细胞结团减至最低。优选的方法涉及到用例如胶原酶和分散酶或者胶原酶、分散酶和透明质酸酶进行酶促处理。在某些实施方案中，在解离步骤中使用胶原酶和中性蛋白酶分散酶的混合物。更为具体的实施方案采取在至少一种来自溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)的胶原酶及蛋白酶活性、分散酶和嗜热菌蛋白酶中的任一种存在下进行的消化。另外其他的实施方案采取用胶原酶和分散酶两种酶活性进行的消化。还采用到的是除胶原酶和分散酶活性外还包括用透明质酸酶活性进行消化的方法。技术人员会认识到，许多这种用以从各种组织来源分离细胞的酶处理法是本领域公知的。例如，以商标LIBERASE(Roche，Indianapolis，IN)出售的组织解离用酶混合物适合在本发明中使用。其他的酶来源也是公知的，技术人员也可从这种酶的天然来源直接获得它们。技术人员还有良好的设备来评估新的或另外的酶或酶组合在分离本发明细胞方面的用途。优选的酶处理持续0.5、1、1.5或2小时或更长时间。在其他优选的实施方案中，将组织在分离步骤的酶处理过程中37℃下进行温育。

在本发明的一些实施方案中，将产后组织分离成包含组织的各个方面(aspect)的切片，所述各个方面例如是胎盘的新生儿方面、新生儿/母体方面和母体方面。分离到的切片然后按照本文描述的方法通过机械和/或酶解离法进行解离。新生儿或母体谱系的细胞可通过任何本领域公知的方法进行鉴定，例如通过针对Y染色体的核型分析或原位杂交来鉴定。

PPDCs从中衍生的分离的细胞或者产后组织可用来引发或接种细胞培养物。将分离的细胞转移到无菌组织培养容器中，该容器没有包被或包被有胞外基质或配体如层粘连蛋白、胶原(天然的、变性的或交联的)、明胶、纤连蛋白和其他胞外基质蛋白。将PPDCs在任何能够维持细胞的生长的培养基中培养，所述培养基例如但不限于DMEM(高葡萄糖或的葡萄糖)、高级DMEM、DMEM/MCDB201、Eagle基础培养基、Ham’sF10培养基(F10)、Ham’sF-12培养基(F12)、Iscove改良的Dulbecco培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI1640和以商标CELL-GRO-FREE(Mediatch，Inc.，Herndon，VA)出售的无血清/介质培养基(serum/mediafreemedium)。培养基可补充有一种或多种成分，包括例如胎牛血清(FBS)，优选约2-15％(v/v)；马血清(ES)；人血清(HS)；β-巯基乙醇(BME或2-ME)，优选约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)和促红细胞生成素(EPO)；氨基酸，包括L-缬氨酸；和一种或多种抗生素和/或抗真菌剂以控制微生物污染，如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，这些成分可单独或组合补充。培养基优选包含下文实施例中所定义的生长培养基。

将细胞以能让细胞生长的密度接种在培养容器中。在一个优选的实施方案中，细胞在空气中约0至约5％(体积)CO₂下进行培养。在一些优选的实施方案中，细胞在空气中约2至约25％(体积)O₂下进行培养，优选在空气中约5至约20％(体积)O₂下进行培养。细胞优选在约25至约40℃的温度下进行培养，更优选在37℃下进行培养。细胞优选在培养箱中进行培养。培养容器中的培养基可以是静止的或搅动的，或者例如用生物反应器进行搅动。PPDCs优选在低氧化应激(例如添加有谷胱甘肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸)下生长。本文所用的“低氧化应激”是指没有对培养的细胞的自由基损害或损害极小的条件。

最适培养基选择方法、培养基制备和细胞培养技术是本领域公知的，在多个资料中有描述，包括Doyleetal.，(eds.)，1995，CELL&TISSUECULTURE：LABORATORYPROCEDURES，JohnWiley&Sons，Chichester；和HoandWang(eds.)，1991，ANIMALCELLBIOREACTORS，Butterworth-Heinemann，Boston，这些文献通过引用结合到本文中。

将分离的细胞或组织片段培养足够的时间后，由于从产后组织的迁移或细胞分裂或同时有这两种情况，PPDCs会已生长出来。在本发明的一些实施方案中，将PPDCs传代或者转移到含有新鲜培养基的另一培养容器中，该新鲜培养基与最初使用的培养基同类型或不同类型，在该另一培养容器中细胞群体可进行有丝分裂扩展。本发明的细胞可在第0代到衰老之间的任何时间点使用。细胞优选传代约3至约25次，更优选传代约4至约12次，最优选传代10或11次。可进行克隆和/或亚克隆，以证实细胞的克隆群体得到了分离。

在本发明的一些方面，将产后组织中存在的不同细胞类型分级成各个亚群，从该亚群可分离PPDCs。分级或选择可用标准的细胞分离技术来完成，这些技术包括但不限于：进行酶促处理以使产后组织解离成其组成细胞，然后对特定的细胞类型进行克隆和选择，包括但不限于基于形态学和/或生物化学标志的选择；选择性生长所需的细胞(正选择)，选择性破坏不需要的细胞(负选择)；基于混合群体中例如与大豆凝集素的差异细胞凝集性的分离；冷冻-解冻程序；混合群体中的细胞的差异黏附特性；过滤；常规离心和区带离心；离心淘洗(逆流离心)；单位重力分离(unitgravityseparation)；逆流分配；电泳和荧光激活细胞分选。有关克隆选择和细胞分离技术的综述参见Freshney，1994，CULTUREOFANIMALCELLS：AMANUALOFBASICTECHNIQUES，3rdEd.，Wiley-Liss，Inc.，NewYork，这篇文献通过引用结合到本文中。

培养基按需进行更换，例如通过用例如移液管小心从培养皿吸出培养基，并用新鲜培养基补充。温育继续进行到培养皿中积累了足够的细胞数或细胞密度为止。可将原始的外植组织切片除去，用标准的技术或用细胞刮棒将剩余的细胞进行胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化后，收集细胞，移到新鲜培养基，如上进行温育。在一些实施方案中，在胰蛋白酶消化后大约24小时至少更换培养基一次，以除去任何飘浮的细胞。剩余在培养物中的细胞认为是PPDCs。

PPDCs可进行冷藏。因此，在下文更详细描述的优选实施方案中，可在孩子出生后从适当的产后组织得到自体同源转移用的PPDCs(供母亲或孩子用)，然后冷藏，以便在以后需要它们进行移植时可以进行使用。

PPDCs可通过以下方面进行表征：生长特征(例如群体倍增能力、倍增时间、传代到衰老)、核型分析(例如正常核型；母体或新生儿谱系)、流式细胞术(例如FACS分析)、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如用于检测表位)、基因表达概况分析(例如基因芯片阵列；聚合酶链反应(例如反转录酶PCR、实时PCR和常规PCR))、蛋白质阵列、蛋白质分泌(例如通过血浆凝固测定或PDC-条件培养基的分析，例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA))、混合淋巴细胞反应(例如作为PBMCs的刺激的度量)和/或其他本领域公知的方法。

衍自胎盘组织的PPDCs的实例保藏在美国模式培养物保藏所(ATCC，Manassas，VA)，分配ATCC检索号如下：(1)品系标号PLA071003(P8)在2004年6月15日保藏，分配检索号PTA-6074；(2)品系标号PLA071003(P11)在2004年6月15日保藏，分配检索号PTA-6075；(3)品系标号PLA071003(P16)在2004年6月16日保藏，分配检索号PTA-6079。衍自脐带组织的PPDCs的实例在2004年6月10日保藏在美国模式培养物保藏所，分配ATCC检索号如下：(1)品系标号UMB022803(P7)分配检索号PTA-6067；(2)品系标号UMB022803(P17)分配检索号PTA-6068。

在各个实施方案中，PPDCs具有以下生长特征中的一个或多个：(1)它们需要L-缬氨酸用于在培养中生长；(2)它们能够在含有约5％到至少约20％的氧的气氛中生长；(3)它们具有在达到衰老之前在培养中倍增至少约40次的潜力；和(4)它们能在包被或未包被的组织培养容器上贴壁和扩展，其中包被的组织培养容器包含明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的包被层。

在某些实施方案中，PPDCs具有正常的核型，该核型随着细胞的传代得到保持。核型分析对于鉴定和区别衍自胎盘的新生儿细胞和母体细胞特别有用。核型分析的方法是本领域技术人员可获得和公知的。

在其他实施方案中，PPDCs可由某些蛋白质的产生来表征，包括：(1)组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的至少一个的产生；(2)CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A，B，C细胞表面标志中的至少一个的产生(通过流式细胞术检测)。在其他实施方案中，PPDCs可由CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR，DP，DQ细胞表面标志中的至少一个的产生的缺乏((通过流式细胞术检测)来表征。特别优选的是能产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的至少两个的细胞。更优选的是蛋白质组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白这三个都能产生的细胞。

在其他实施方案中，PPDCs可通过基因表达来表征，即相对于成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞这些人细胞而言，编码以下物质中的至少一个的基因的基因表达提高：白细胞介素8；网硬蛋白1；趋化因子(C-X-C模体)配体1(黑素瘤生长刺激活性，α)；趋化因子(C-X-C模体)配体6(粒细胞趋化蛋白2)；趋化因子(C-X-C模体)配体3；肿瘤坏死因子，α诱导蛋白3；C型凝集素超家族成员2；Wilms肿瘤1；醛脱氢酶1家族成员A2；肾素；氧化低密度脂蛋白受体1；人类(Homosapiens)克隆IMAGE：4179671；蛋白激酶Cζ；假拟蛋白DKFZp564F013；在卵巢癌1中下调；和来自克隆DKFZp547k1113的人类基因。

在又另一个实施方案中，PPDCs可通过基因表达来表征，即相对于成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞这些人细胞而言，编码以下物质中的至少一个的基因的基因表达减少：矮身材同源框2；热激27kDa蛋白2；趋化因子(C-X-C模体)配体12(基质细胞衍生因子1)；弹性蛋白(主动脉瓣上狭窄、Williams-Beure综合征)；人类mRNA；cDNADKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022)；间充质同源框2(生长停滞特异性同源框)；sineoculis同源框同源物1(果蝇)；晶状体蛋白，αB；形态发生2的凌乱缔合激活剂(disheveledassociatedactivator)；DKFZP586B2420蛋白；类似于neuralin1；四连蛋白(纤溶酶原结合蛋白)；src同源性3(SH3)和半胱氨酸富集域；胆固醇25-羟化酶；矮子相关转录因子-3；白细胞介素11受体，α；前胶原C肽链内切酶增强子；卷曲同源物7(果蝇)；假拟基因BC008967；胶原，VIII型，α1；生腱蛋白C(结合腕蛋白)；易洛魁族人同源框蛋白5；hephaestin；整联蛋白，β8；突触小泡糖蛋白2；成神经细胞瘤，致瘤性1的抑制；胰岛素样生长因子结合蛋白2，36kDa；人类cDNAFLJ12280fis，克隆MAMMA1001744；细胞因子受体样因子1；钾中等/小电导率钙激活通道，亚家族N，成员4；整联蛋白，β7；带PDZ结合模体的转录共激活剂(TAZ)；sineoculis同源框同源物2(果蝇)；KIAA1034蛋白；小泡相关膜蛋白5(肌短蛋白)；含EGF纤蛋白样胞外基质蛋白1；早期生长应答3；distal-less同源框5；假拟蛋白FLJ20373；醛-酮还原酶家族1，成员C3(3-α羟基类固醇脱氢酶，II型)；双糖链蛋白聚糖；带PDZ结合模体的转录共激活剂(TAZ)；纤连蛋白1；脑啡肽原；整联蛋白，β样1(带EGF样重复结构域)；人类mRNA全长插入cDNA克隆EUROIMAGE1968422；EphA3；KIAA0367蛋白；钠尿肽受体C/鸟苷酸环化酶C(心房钠尿肽受体C)；假拟蛋白FLJ14054；人类mRNA；cDNADKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222)；BCL2/腺病毒EIB19kDa相互作用蛋白3样；AE结合蛋白1；细胞色素c氧化酶亚单位VIIa多肽1(肌肉)。

在其他实施方案中，PPDCs可由MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES、andTIMP1中的至少一个的分泌来表征。在一些实施方案中，PPDCs可由TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC和VEGF中的至少一个的分泌的缺乏(通过ELISA检测)来表征。

在一些优选的实施方案中，PPDCs衍自基本上没有血液的脐带组织，能够在培养中自我更新和扩展，需要L-缬氨酸用于生长，能在至少约5％氧中生长，且包含至少以下特征之一：在培养中倍增至少约40次的潜力；在包含明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的包被层的包被或未包被的组织培养容器上的贴壁和扩展；波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的产生；CD10、CD13、CD44、CD73和CD90的产生；和基因表达，即相对于成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞这些人细胞而言，编码白细胞介素8和网硬蛋白1的基因的基因表达提高。在一些实施方案中，这种PPDCs不产生CD45和CD117。本段落中描述的PPDCs可在用来治疗患有外周血管疾病的患者的方法中使用，可在用来治疗外周血管疾病的药物组合物中使用，例如其中这种组合物包含具有这些特征的细胞和药物可接受载体，和可在用来制备、使用和实施本文所述的和例证的这种方法和药物组合物的药盒中使用。另外，本段落中描述的PPDCs可用来产生条件细胞培养基，或者用来制备诸如细胞提取物和亚细胞级份的制品，该制品可用来制备、使用和实施本文所述的和例证的这种方法和药物组合物。

在优选的实施方案中，细胞包含以上所列的生长、蛋白质/表面标志产生、基因表达或物质分泌特性中的两个或多个。更优选的是包含三个、四个、五个或更多个特性的细胞。还更优选的是包含六个、七个、八个或更多个特性的PPDCs。目前还更优选的是包含所有上述特征的细胞。

在目前优选在本发明的几个方面中使用的细胞当中，有具有上述特征的产后细胞，更具体的说是这些特征：其中细胞具有正常的核型和能随传代保持正常核型，此外其中细胞能表达标志CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A，B，C中的每一个，其中细胞能产生对应于所列标志的免疫学上可检测的蛋白质。还更优选的是这样的细胞，它们除了前述情况外，不会产生对应于标志CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR，DP，DQ中的任何一个的蛋白质(通过流式细胞术检测)。

某些具有沿着谱系分化而导致产生各种表现型的潜力的细胞是不稳定的，因此会自发分化。目前优选用于本发明的是不会例如沿着成肌细胞、骨骼肌、血管平滑肌、周细胞、成血管细胞系、生血管细胞系(angiogeniclines)、生血管细胞系(vasculogeniclines)或血管内皮细胞系自发分化的细胞。优选的细胞当在生长培养基中生长时，就其表面上产生的细胞标志而言和就各种基因的表达模式而言基本上是稳定的，这些例如是使用以商标GENECHIP(Affymetrix，Inc.，SantaClara，CA)出售的医疗诊断试验进行测定的。经过多次群体倍增，细胞例如在传代过程中其表面标志特性方面仍保持基本恒定。

本发明的另一个方面描述了上述的PPDCs群体的用途。在一些实施方案中，细胞群体是异质的(heterogeneous)。本发明的异质细胞群体可包含至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的本发明PPDCs。本发明的异质细胞群体还可包含干细胞或其他祖细胞，如成肌细胞或其他肌肉祖细胞、成血管细胞或血管前体细胞，或者它还可包含完全分化的骨骼肌细胞、平滑肌细胞、周细胞或血管内皮细胞。在一些实施方案中，群体基本上是同质的(homogeneous)，也就是说基本上只包含PPDCs(优选至少约96％、97％、98％、99％或更多的PPDCs)。本发明的同质细胞群体可包含脐带或胎盘衍生的细胞。脐带衍生细胞的同质群体优选没有母体谱系的细胞。胎盘衍生细胞的同质群体可为新生儿谱系或母体谱系。细胞群体的同质性可通过任何本领域公知的方法实现，例如通过细胞分选(例如流式细胞术)或者通过按已知方法进行克隆扩展实现。因此，优选的同质PPDC群体可包含产后衍生细胞的克隆细胞系。当分离到具有高度适需的功能性的细胞克隆时，这种群体特别有用。

本发明还提供在一种或多种因子存在下或者在能刺激干细胞沿着血管平滑肌、血管内皮、周细胞或骨骼肌途径分化的条件下温育的细胞群体的用途。这种因子是本领域公知的，且技术人员会认识到，分化的合适条件的确定可用常规实验来完成。这种条件的优化可通过统计学实验设计和分析来完成，例如响应表面方法能允许对例如生物培养物中的多个变量同时进行优化。目前优选的因子包括但不限于生长因子或营养因子、趋化因子、细胞因子、细胞产物、脱甲基化剂和现在知道或以后确定能刺激例如干细胞沿着生血管(angiogenic)、成血管(hemangiogenic)、生血管(vasculogenic)、骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮途径或谱系的分化的其他刺激剂。

PPDCs还可进行遗传修饰，以产生治疗上有用的基因产物，产生能促进或支持另外的血管形成或生长的生血管剂，或者产生能将内皮祖细胞募集到局部缺血损害区域的因子。内皮祖细胞能促进血管生成(vasculogenesis)和血液流动，特别是在局部缺血事件之后(UrbichCandDimmelerS(2004)Circ.Res.95：343-53)。在内皮细胞募集中起到作用的因子包括但不限于VEGF、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、促红细胞生成素(EPO)、G-CSF、抑制素、strogen、PPARγ、CXCR4、FGF和HGF。遗传修饰可使用多种载体中的任何一种来实现，所述载体包括但不限于整合病毒载体，例如反转录病毒载体或腺伴随病毒载体；非整合复制性载体，例如乳头状瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体；或者复制缺陷病毒载体。其他将DNA引入到细胞中的方法包括使用脂质体、电穿孔、颗粒枪或通过直接DNA注射。

宿主细胞优选用这样的DNA转化或转染，该DNA受控于或有效缔合着一种或多种适当的表达控制元件如启动子或增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等以及可选择标志。任何启动子都可用来驱动插入的基因的表达。例如，病毒启动子包括但不限于CMV启动子/增强子、SV40、乳头瘤病毒、Epstein-Barr病毒或弹性蛋白基因启动子。在一些实施方案中，用来控制目的基因的表达的控制元件能使基因得以进行受调节表达，使得产物只有当在体内需要时才被合成。如果需要瞬时表达，优选将组成型启动子用于非整合和/或复制缺陷载体中。或者，可使用可诱导型启动子来在需要时驱动插入的基因的表达。可诱导型启动子包括但不限于与金属硫蛋白和热激蛋白有关的启动子。

在引入了外来DNA后，可让工程改造过的细胞在富集培养基中生长，然后转到选择性培养基。外来DNA中的选择性标志赋予对选择的抗性，能让细胞将例如在质粒上的外来DNA稳定整合到它们的染色体中并生长形成灶(foci)，而后者可进行克隆和扩展成细胞系。这个方法可有利地用来对能表达基因产物的细胞系进行工程改造。

本发明的细胞可进行遗传工程改造以“敲除(knockout)”或“敲减(knockdown)”能促进在植入部位的炎症或排斥的因子的表达。以下论述用以降低靶基因表达水平或靶基因产物活性水平的负调节技术。本文所用的“负调节”是指相对于在调节处理不存在下的靶基因产物的水平和/或活性而言，靶基因产物的水平和/或活性的下降。骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞、周细胞、血管内皮细胞或它们的祖细胞固有的基因的表达，可用多种技术进行降低或敲除，包括例如通过用同源重组技术使基因失活来抑制表达。通常，编码蛋白质的重要区域的外显子(或该区域的上游的外显子)被阳性选择性标志例如neo所间断，从而防止正常mRNA从靶基因的产生，导致该基因的失活。基因还可通过在基因的一部分中产生缺失或者通过缺失整个基因来失活。通过使用具有与靶基因有同源性的、在基因组中离得很远的两个区域的构建物，可使间插该两个区域的序列缺失(Mombaertsetal.，1991，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88：3084-3087)。反义序列、DNA酶、核酶、小干扰RNA(siRNA)和其他这种能抑制靶基因的表达的分子也可用来降低靶基因活性的水平。例如，已证实能抑制主要组织相容性基因复合物(HLA)的表达的反义RNA分子在免疫应答方面是最为通用的。还另外，可利用三螺旋分子来降低靶基因活性的水平。这些技术由L.G.Davisetal.(eds)，1994，BASICMETHODSINMOLECULARBIOLOGY，2nded.，Appleton&Lange，Norwalk，CN详细描述。

在其他方面，本发明利用到从PPDCs制备的细胞裂解物和细胞可溶性级份，或者包含PPDCs的异质或同质细胞群体，以及已进行遗传修饰或已进行刺激以沿着骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮途径分化的PPDCs或其群体。这种裂解物及其级份具有许多用途。PPDC裂解物可溶性级份(即基本上没有膜)在体内的使用，例如能让有益的胞内环境以同种异基因方式(allogeneically)在患者中得到使用，而不会引入明显数量的很可能会引发排斥或其他不利免疫应答的细胞表面蛋白。裂解细胞的方法是本领域公知的，包括各种方式的机械破坏、酶破坏或化学破坏或它们的组合。这种细胞裂解物可从直接在其生长培养基中的细胞制备，因此含有分泌的生长因子等，或者可从在例如PBS或其他溶液中洗涤而没有了培养基的细胞制备。洗涤过的细胞可以大于原始群体密度的浓度进行再悬浮，如果这优选的话。

在一个实施方案中，例如通过破坏细胞而又不随后将细胞级份分离来制备完全细胞裂解物。在另一个实施方案中，通过本领域公知的常规方法例如离心、过滤或类似的方法，使细胞膜级份与细胞的可溶性级份相分离。

从产后衍生细胞的群体制备的细胞裂解物或细胞可溶性级份，可以原样使用，可通过例如超滤或冻干进行进一步浓缩，乃至可进行干燥，可进行部分纯化，可与本领域公知的药物可接受载体或稀释剂进行组合，或者与其他化合物如生物制剂例如药物上有用的蛋白质组合物进行组合。细胞裂解物或其级份可在体外或体内使用，可单独使用或例如与自体同源或同基因的活细胞一起使用。裂解物如果是在体内引入，可在治疗部位局部引入或者在远端引入，以给患者提供例如所需的细胞生长因子。

在又一个实施方案中，可在体外培养PPDCs以高产率生产生物产物。能天然产生特定的目的生物产物(例如营养因子)或已进行过遗传工程改造以产生生物产物的PPDCs，可用本文所述的培养技术进行克隆扩展。或者，可将细胞在能诱导分化成骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮谱系的培养基中扩展。在每种情况中，由细胞产生和分泌到培养基中的生物产物都可容易地用标准的分离技术从条件培养基分离，所述分离技术例如示差蛋白沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、电泳和HPLC，此为几个例子。可使用“生物反应器”来利用流动方法供养例如体外三维培养物。基本上来说，随着新鲜培养基被通过三维培养物，生物产物被洗出培养物，然后可如上所述从流出物分离。

或者，目的生物产物可保留在细胞当中，因此它的收集可能如上所述需要将细胞裂解。生物产物然后可用任何一种或多种以上所列的技术进行纯化。

在其他实施方案中，本发明利用到得自培养的PPDCs的条件培养基进行下文所述的体外或体内使用。PPDC条件培养基的使用，能让PPDCs分泌的有益营养因子以同种异基因方式(allogeneically)在患者中得到使用，而不会引入可能会引发排斥或其他不利免疫应答的完整细胞。条件培养基是通过在培养基中培养细胞后从培养基除去细胞来制备的。

从产后衍生细胞的群体制备的条件培养基，可以原样使用，可通过例如超滤或冻干进行进一步浓缩，乃至可进行干燥，可进行部分纯化，可与本领域公知的药物可接受载体或稀释剂进行组合，或者与其他化合物如生物制剂例如药物上有用的蛋白质组合物进行组合。条件培养基可在体外或体内使用，可单独使用或例如与自体同源或同基因的活细胞一起使用。条件培养基如果是在体内引入，可在治疗部位局部引入或者在远端引入，以给患者提供例如所需的细胞生长因子。

在另一个实施方案中，将通过在液体、固体或半固体基材上培养PPDCs产生的胞外基质(ECM)进行制备、收集，并作为对将活细胞植入到需要组织修复或置换的受试者中的替代进行使用。将PPDCs在本文别处描述的三维骨架(framework)上在能使得所需量的ECM被分泌到骨架上的条件下进行体外培养。将构成新组织的细胞除去，ECM加工成例如可注射制品供往后使用。为实现这一点，将骨架上的细胞杀死，从支架除去任何细胞碎片。这个方法可按多种不同方式进行。例如，可将活组织在没有冷冻保护剂下在液氮中快速冷冻，或者可将组织浸入无菌蒸馏水中，使得因渗透压破裂。

一旦细胞已被杀死，可将细胞膜破坏，通过用温和的去污剂清洗处理(如EDTA、CHAPS或两性离子去污剂)除去细胞碎片。或者，可将组织进行酶促消化和/或用能分解细胞膜和让细胞内容物得以除去的试剂进行提取。这种酶的实例包括但不限于透明质酸酶、分散酶、蛋白酶和核酸酶。去污剂的实例包括非离子型去污剂如烷基芳基聚醚醇(TRITONX-100)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(RohmandHaas，Philadelphia，PA)、BRIJ-35、聚乙氧基乙醇月桂醚(AtlasChemicalCo.，SanDiego，CA)、聚山梨醇酯20(TWEEN20)、聚乙氧基乙醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(RohmandHaas，Philadelphia，PA)、聚乙烯月桂醚(RohmandHaas，Philadelphia，PA)；和离子型去污剂如十二烷基硫酸钠、硫酸化高级脂肪醇、磺酸化烷烃和在支链或非支链中含有7-22个碳原子的磺酸化烷基芳烃。

ECM的收集可按多种方式来完成，这至少部分上取决于新组织是否已在生物可降解或非生物可降解(在金属的情况中)的三维骨架上形成。例如，如果骨架是非生物可降解的，可通过使骨架经历超声处理、高压水射流、机械刮擦或用去污剂或酶进行的温和处理或者以上方法的任何组合，来移取ECM。

如果骨架是生物可降解的，ECM可例如通过让支架在溶液中降解或溶解来收集。或者，如果生物可降解的骨架是由自身能随ECM一起进行注射的材料所组成，则骨架和ECM可进行整体加工以供随后注射用。或者，可通过上述的用以从非生物可降解骨架收集ECM的方法中的任何一种，从生物可降解骨架移取ECM。所有的收集方法都优选设计成不会使ECM变性。

ECM收集后可进行进一步的加工。例如，ECM可用本领域公知的技术如超声处理均化成微细颗粒，使得它能通过手术针。ECM的各成分如有需要还可通过γ辐射进行交联。优选地，ECM可以以0.25-2百万拉德(megarads)进行辐射，以将ECM灭菌和交联。使用有毒性的物质如戊二醛进行的化学交联也是可以接受的，但通常不优选。

ECM中存在的蛋白质如各种类型的胶原的数量和/或比例，可通过将本发明细胞产生的ECM与一种或多种其他细胞类型的ECM混合来进行调整。另外，可将生物活性物质如蛋白质、生长因子和/或药物掺入到ECM中。示例性的生物活性物质包括能促进康复和注射部位的组织修复的生长因子如TGF-β等。这种另外的物质可在任何一个上文所述实施方案中使用，例如与完全细胞裂解物、可溶性细胞级份或者进一步纯化的成分和PPDCs产生的产物一起使用。

在另一个方面，本发明提供利用PPDCs、PPDC群体、成分和PPDCs的产物的药物组合物于治疗由外周局部缺血发作引起的损失或损害的各种方法中。某些实施方案涵盖包含活细胞(单独的PPDCs或与其他细胞类型混合)的药物组合物。其他的实施方案涵盖包含PPDC细胞成分(例如细胞裂解物、可溶性细胞级份、条件培养基、ECM或任何前述者的成分)或产物(例如由PPDCs天然产生或通过遗传修饰产生的营养因子和其他生物因子、PPDC培养物的条件培养基)的药物组合物。在任一情况中，药物组合物都可还包含本领域公知的其他活性物质，如抗炎剂、抗细胞凋亡剂、抗氧化剂、生长因子、肌肉营养因子或肌肉再生或肌肉保护药物。

可加到PPDC药物组合物中的其他成分的实例包括但不限于：(1)其他肌肉有益性或肌肉保护性药物，或者血管有益性或血管保护性药物；(2)挑选的胞外基质成分，如一种或多种类型的本领域公知胶原，和/或生长因子、富含血小板的血浆和药物(或者，PPDCs可进行遗传工程改造以表达和产生生长因子)；(3)抗细胞凋亡剂(例如促红细胞生产素(EPO)、EPO模拟抗体、血小板生成素、胰岛素样生长因子(IGF)-I、IGF-II、肝细胞生长因子、胱冬酶抑制剂)；(4)抗炎化合物(例如p38MAP激酶抑制剂、TGF-β抑制剂、抑制素、IL-6和IL-1抑制剂、吡嘧司特、曲尼司特、Remicade(Centocor，Inc.，Malvern，PA)、西罗莫司和非甾体抗炎药(NSAIDS)(如替泊沙林、托美丁和Suprafen)；(5)免疫抑制剂或免疫调节剂，如钙调磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗增殖剂、皮质类固醇和各种抗体；(6)抗氧化剂如普罗布考、维生素C和E、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸；(6)局部麻醉剂；(7)营养因子如Agrin、VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、NEGF-1、NEGF-2、PDGF、GDF、IGF1、IGF2、EGF和FGF；和(8)在将内皮祖细胞募集和掺入到局部缺血组织中起到作用的因子，如VEGF、SDF-1、EPO、G-CSF、抑制素、雌激素、PPARγ和CXCR4，仅举数例。

本发明的药物组合物包含与药物可接受载体或介质一起配制的PPDCs及其成分或产物，包括从PPDCs制得的制品在内。合适的药物可接受载体包括水、盐溶液(如林格溶液)、醇类、油类、明胶、聚乙烯吡咯烷、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯和羟甲基纤维素。这种制品可进行灭菌，且如有需要可与诸如以下的助剂混合：润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用以干扰渗透压的盐类、缓冲剂和着色剂。适用于本发明的药物载体是本领域公知的，在例如PharmaceuticalSciences(17^thEd.，MackPub.Co.，Easton，PA)和WO96/05309中有描述。

通常但并非排他地，包含PPDC成分或产物但没有活细胞的药物组合物配制成液体剂(或者当口服递送适宜时配制成固体片剂、胶囊剂等)。这些可配制成通过本领域公知能实现药物和生物分子向靶骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮组织的递送的任何可接受途径给药，包括但不限于口服、鼻内、眼内和胃肠外(包括静脉内)途径。胃肠外给药的具体途径包括但不限于肌肉内、皮下、腹膜内、鞘内、池内(intracisternal)途径，或者通过带针头注射器或者带或不带泵装置的导管。

包含PPDC活细胞的药物组合物通常配制成液体剂、半固体剂(例如凝胶剂)或固体剂(例如血管和平滑肌组织工程适用的基质、支架等)。液体组合物配制成通过本领域公知能实现活细胞向靶血管或平滑肌组织的递送的任何合适途径给药。通常，这些包括以扩散的方式或者以靶向外周局部缺血损伤(injury)、损害(damage)或损坏(distress)的部位的方式进行的注射或输注，注射或输注是通过包括但不限于经由带针头的注射器和/或带或不带泵装置的导管进行的肌肉内、静脉内或动脉内递送的给药途径来进行。

在半固体或固体载体中包含活细胞的药物组合物，通常配制成供在局部缺血损伤、损害或损坏的部位进行外科手术植入。应认识到，液体组合物还可通过外科手术程序进行给予。在具体的实施方案中，半固体或固体药物组合物可包含半可渗透凝胶、网格(lattice)、细胞支架等，它们可以是非生物可降解的或者是生物可降解的。例如，在某些实施方案中，可能需要或适宜将外生细胞与它们的周围环境隔开，但仍使细胞能够分泌和递送生物分子(例如肌肉营养因子、血管营养因子或内皮祖细胞募集因子)到周围的骨骼肌或血管细胞。在这些实施方案中，可将细胞配制成自主植入物(autonomousimplant)，该自主植入物包含着被能使移植细胞与宿主组织物理上分开的非可降解选择性渗透屏障所包围的活PPDCs或包含PPDCs的细胞群体。这种植入物有时称为“具有免疫保护性”，因为它们具有防止免疫细胞和大分子在药理学上诱导的免疫抑制不存在下杀死移植细胞的能力(有关这种装置和方法的综述参见例如P.A.Trescoetal.，(2000)Adv.DrugDeliveryRev.42：3-27)。

在一个实施方案中，将不同种类的可降解凝胶和网络(network)用于本发明的药物组合物。例如，特别适合于缓释制剂的可降解材料包括生物相容性聚合物，如聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、甲基纤维素、透明质酸、胶原等。可降解聚合物的结构、选择和在药物递送介质中的用途在几个出版物中已有综述，包括A.Dombetal.，1992，PolymersforAdvancedTechnologies3：279-292。

在其他的实施方案中，可能需要或适宜将细胞在生物可降解的、优选生物可再吸收或生物可吸收的支架或基质上或者在该支架或基质中进行递送。这些通常三维的生物材料含有贴附到支架、分散在支架当中或者掺入到包埋在支架中的胞外基质中的活细胞。这些植入物一旦植入到身体的靶区域，就变得与宿主组织成为一体，其中移植细胞逐渐建立起来(参见例如Tresco，PA，etal.(2000)出处同上；令参见Hutmacher，DW(2001)J.Biomater.Sci.PolymerEdn.12：107-174)。

生物相容性基质可由天然的、修饰过的天然的或合成的生物可降解聚合物组成，这些聚合物包括均聚物、均聚物和嵌段聚合物以及它们的组合。要指出的是，聚合物通常是根据合成它的单体来命名的。

合适的生物可降解聚合物或聚合物类别的实例包括血纤蛋白、胶原、弹性蛋白、明胶、玻连蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、凝血酶、聚氨基酸、氧化纤维素、原弹性蛋白、丝绸、核糖核酸、脱氧核糖核酸；蛋白质、多核苷酸、再生的(reconstituted)基膜基质、淀粉、葡聚糖、海藻酸盐、透明质酸盐(hyaluron)、几丁质、壳聚糖、琼脂糖、多糖、透明质酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇、去纤维化组织(decellularizedtissue)、自装配肽、多肽、糖胺聚糖、它们的衍生物和混合物。对于乙醇酸和乳酸，通常制备出中间环二聚体并加以纯化后再进行聚合。这些中间二聚体分别称为乙交酯和丙交酯。其他有用的生物可降解聚合物或聚合物类别包括但不限于脂族聚酯、聚草酸亚烷酯(poly(alkyleneoxalate))、酪氨酸衍生聚碳酸酯、聚亚氨基碳酸酯、聚原酸酯、polyoxaester、聚酰胺酯、含有胺基团的polyoxaester、聚富马酸丙烯酯(poly(propylenefumarate))、聚对二氧环己酮、聚碳酸酯、聚草酸酯、聚α-羟酸、聚酯、聚氨酯、聚酯型聚氨酯、聚醚型聚氨酯、聚酐、聚乙酸酯、聚已酸内酯、聚原酸酯、聚氨基酸、聚酰胺及它们的掺合物和共聚物。另外有用的生物可降解聚合物包括但不限于L-和D-乳酸的立体聚合物、双(对羧基苯氧基)丙烷和癸二酸的共聚物、癸二酸共聚物、己内酯共聚物、聚乳酸/聚乙醇酸/聚乙二醇共聚物、聚氨酯和聚乳酸的共聚物、α-氨基酸共聚物、α-氨基酸共聚物和己酸的共聚物、α-谷氨酸苄酯和聚乙二醇的共聚物、琥珀酸酯和聚乙二醇的共聚物、聚磷腈、聚羟基烷酸酯和它们的混合物。还设想到了二元系统和三元系统。

一般来说，适用作基质的生物可降解聚合物宜进行成形，使得它具有适合于预定应用的机械特性，在组织已向内生长(in-grown)和愈合前保持足够完整，不会引起炎性或毒性应答，在完成其用途后在身体中被代谢掉，容易加工成所需要形成的最终产品，显示可接受的货架期和容易进行灭菌。

在本发明的一个方面，用来形成基质的生物相容性聚合物为水凝胶的形式。一般来说，水凝胶是能吸收超过它们重量的20％的水、同时又能保持独特的三维结构的交联高分子材料。这个定义包括会在含水环境中膨胀的干交联聚合物，也包括水膨胀性材料。有许多亲水性聚合物可进行交联以产生水凝胶，无论该聚合物是生物来源的、半合成的还是完全合成的。水凝胶可从合成的高分子材料生产。这种合成的聚合物可适应于多种特性和可预测的批次间一致性，代表了通常无需关心免疫原性的材料的可靠来源。基质可包括从自装配肽形成的水凝胶，如在美国专利第5,670,483号和第5,955,343号、美国专利申请第2002/0160471号、PCT申请第WO02/062969号中所论述的那些水凝胶。

使水凝胶在药物递送应用中具有价值的特性包括平衡膨胀度、吸收动力学、溶质渗透性和它们的体内性能特性。对化合物的渗透性部分上取决于膨胀程度或水含量和生物降解速度。由于凝胶的机械强度与膨胀程度成正比地下降，还落入本发明的设想的是可将水凝胶附着于基材，使得复合系统能增强机械强度。在一些实施方案中，可将水凝胶注入多孔基材当中，从而在得到基材的机械强度的同时又得到水凝胶的有用递送特性。

可用于本发明的支架或基质(有时统称为“骨架”)的非限制性实例，包括纺织品结构如织物(weave)、编织物(knit)、编织物(braid)、非织造物(non-woven)和翘曲编织物(warpedknit)；多孔泡沫塑料、半多孔泡沫塑料、打孔膜或片材、微颗粒、珠粒(bead)和球体以及作为以上结构的组合的复合结构。非织造垫(nonwovenmat)可例如用由乙醇酸和乳酸(PGA/PLA)的合成可吸收共聚物构成的、以商标VICRYL缝线(Ethicon，Inc.，Somerville，NJ)出售的纤维来形成。由例如通过美国专利第6,355,699号中所述的诸如冷冻干燥或冻干的方法形成的聚ε-己内酯/聚乙醇酸(PCL/PGA)共聚物所构成的泡沫塑料，也可以使用。也可使用诸如自组装肽(例如RAD16)的水凝胶。原位形成的可降解网络也适用于本发明(参见例如Anseth，KSetal.(2002)J.ControlledRelease78：199-209；Wang，D.etal.，(2003)Biomaterials24：3969-3980；He等的美国专利公开说明书第2002/0022676号)。这些原位形成材料配制成适合注射的流体，然后可通过多种方法诱导形成水凝胶，所述如改变温度、pH和原位或体内光暴露。

在另一个实施方案中，骨架是毡制品，其可由从生物可吸收材料如PGA、PLA、PCL共聚物或掺合物或者透明质酸制成的复丝所构成。复丝可用由卷边(crimping)、切断(cutting)、梳理成网(carding)和针刺(needling)组成的标准纺织品加工技术制成毡制品。在另一个实施方案中，将细胞接种到可能为复合结构的泡沫塑料支架中。

在许多上述实施方案中，可将骨架模制成有用的形状，如血管的形状。此外还要认识到，可将PPDCs在预形成的非可降解的手术装置或可植入装置上培养，培养的方式例如对应于例如用以制备含成纤维细胞的GDC血管内线圈(endovascularcoil)的方式(Marx，WFetal.，(2001)Am.J.Neuroradiol.22：323-333)。

基质、支架或装置可进行处理后再接种细胞，以增强细胞贴附。例如，在接种前，可将尼龙基质用0.1摩尔的乙酸处理并在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中温育以包被尼龙。聚苯乙烯可类似地用硫酸进行处理。骨架的外表面还可进行修饰，以改善细胞的贴附或生长和组织的分化，修饰的方法例如是对骨架进行血浆包被，或者加入一种或多种蛋白质(例如胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如硫酸肝素、软骨素-4-硫酸、软骨素-6-硫酸、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白)、遗传材料如细胞因子和生长因子、细胞基质和/或其他材料，包括但不限于明胶、海藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶，还有其他能影响细胞存活和分化的因子。

含PPDC的骨架按照本领域公知的方法进行制备。例如，可将细胞在培养容器中自由生长至亚铺满或铺满，从培养物中挑出接种到骨架上。如有需要，可将生长因子在细胞接种之前、接种过程中或接种之后加到培养基中，以引发分化和组织形成。或者，可将骨架本身进行修饰，使得细胞在其上的生长得到增强，或者使得移植物的排斥风险得到降低。因此，可将一种或多种生物活性化合物加到骨架进行局部释放，所述化合物包括但不限于抗炎化合物、免疫抑制剂或生长因子。

PPDCs、PPDCs的部分、或者包含PPDCs的细胞群体、或者PPDCs的成分或PPDCs产生的产物可按多种方式进行使用，以支持和促进骨骼肌细胞和组织的修饰、再生和改善，改善血流，和刺激和/或支持血管发生，特别是在外周血管疾病患者中。这种用途涵盖体外(invitro)、先体外后体内(exvivo)和体内(invivo)方法。

在一个实施方案中，如上所述，可在体外培养PPDCs以产生出这样的生物产物，它们是由该细胞天然产生的，或者是由该细胞当被诱导分化成骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮谱系时产生的，或者是由该细胞通过遗传修饰产生的。例如，发现TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8从在生长培养基中生长的脐带衍生细胞分泌。发现TIMP1、TPO、KGF、HGF、HBEGF、BDNF、MIP1a、MCP-1、RANTES、TARC、Eotaxin和IL-8从在生长培养基中培养的胎盘衍生PPDCs分泌(参见实施例)。另外，用于内皮祖细胞募集的因子如VEGF、SDF-1、EPO、G-CSF、抑制素、雌激素、PPARγ和CXCR4可从PPDCs产生和可分泌到生长培养基中。其他尚未检测出或未验证过的、可用于骨骼肌或血管修复和再生的因子，很可能是由PPDCs产生和可能被分泌到培养基中。

在这点上，本发明的另一个实施方案描述了PPDCs用于产生条件培养基的用途，该产生是从未分化的PPDCs产生，或者是从在能刺激分化成骨骼肌或血管谱系的条件下温育的PPDCs产生。这种条件培养基被设想用于骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮祖细胞的体外或先体外后体内培养，或者被设想在体内使用，以支持包含有PPDCs的同质群体或包含PPDCs的异质群体的移植细胞和骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮祖细胞，或者以将内皮祖细胞募集到例如局部缺血损伤的部位。

又一个实施方案包括PPDC细胞裂解物、可溶性细胞级份或其成分、或者ECM或其成分用于多种目的的用途。如前所述，一些这些成分可用于药物组合物中。在其他实施方案中，细胞裂解物或ECM用来包被或以别的方式处理待进行外科手术使用的物质或装置，或者用以进行植入，或者用于先体外后体内目的，以促进在这种处理的过程中接触到的细胞或组织的愈合或存活。在一些优选的实施方案中，这种从PPDCs制备的制品包含FGF和HGF。

在另一个实施方案中，将PPDCs有利地用于体外共培养物中，以给其他细胞特别是骨骼肌细胞、骨骼肌祖细胞、血管平滑肌细胞、血管平滑肌祖细胞、周细胞、血管内皮细胞或血管内皮祖细胞提供营养支持。在一些优选的实施方案中，营养支持是细胞的增殖。对于共培养，宜将PPDCs和所需的其他细胞在两种细胞类型处于接触状态的条件下进行共培养。这可例如通过将所述细胞作为异质细胞群体接种在培养基中或接种到合适的培养基材上来实现。或者，可首先使PPDCs生长至铺满，然后它会充当培养物中的另一所需细胞类型的基材。在这后一实施方案中，细胞可例如通过膜或类似装置进行进一步的物理分离，使得在共培养期后其他细胞类型可被移取和单独使用。PPDCs在共培养中促进骨骼肌或血管细胞类型的扩展和分化的用途，可在研究和在临床/治疗领域中得到应用。例如，可例如为了基础研究目的或者为了在药物筛选测定中使用，将PPDC共培养用来促进培养中的骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮细胞的生长和分化。PPDC共培养还可用来对骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮祖细胞进行先体外后体内扩展，以供以后为了治疗目的进行给予。例如，可从个人收获骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮祖细胞，与PPDCs一起进行先体外后体内共培养扩展，然后送回到该个人(自体同源转移)或另一个个人(同基因或异基因转移)。在这些实施方案中，应认识到，在先体外后体内扩展后，可将包含PPDCs和骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮祖细胞的混合细胞群体给予需要治疗的患者。或者，在适宜或需要自体同源转移的情况中，可将共培养的细胞群体在培养中进行物理分离，使得能够将自体同源骨骼肌、血管平滑肌或血管内皮祖细胞移取出来给予患者。

如美国专利公开说明书第2005/0058631、第2005/0054098号和第2005/0058630号所述，在公认的动物模型中已证实PPDCs能被有效移植到身体中，能改善血流和减少组织坏死。这些发现连同本发明得出的发现支持了本发明的优选实施方案，其中PPDCs在细胞疗法中是通过修复或再生外周血管疾病患者的骨骼肌和/或血管组织，或者通过改善外周血管疾病患者的血流或刺激和/或支持血管发生，来用于治疗局部缺血损伤或损害。在一个实施方案中，将PPDCs移植到身体中的靶部位，特别是在局部缺血发作部位或接近该部位处，其中PPDCs可分化成骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮表现型中的一个或多个，PPDCs能给骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞、周细胞或血管内皮细胞祖细胞和/或骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞、周细胞或血管内皮细胞原位提供营养支持，PPDCs能产生因子来将内皮祖细胞募集到局部缺血部位，或者PPDCs能以这些方式中的两种或多种施加有益作用，凡此等等。PPDCs分泌的营养因子包括但不限于GFGFm、IL-6、IL-8、HGF、IGF-1、TPO等。PPDCs能帮助募集血管祖细胞如成血管细胞以刺激新血管形成。

PPDCs能在它们所给予到的患者的身体中施加营养作用。例如，PPDCs能对骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、周细胞或者它们的祖细胞施加营养作用。在一些优选的实施方案中，营养作用是这种细胞的增殖。PPDCs还可诱导它们所给予到的患者的身体中的细胞的迁移。这种迁移能促进外周血管疾病如外周局部缺血的修复、再生和治疗。例如，给予到外周血管疾病部位或靠近该部位处的PPDCs能诱导细胞迁移到外周血管疾病的部位，以修复、再生或以别的方式治疗患病组织及其周围环境。这样给予的PPDCs能诱导骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、周细胞或者它们的祖细胞的迁移。在优选的实施方案中，PPDCs能诱导血管内皮细胞和/或血管内皮祖细胞迁移到外周血管疾病的部位或者至少靠近该部位处。在一些实施方案中，迁移是由FGF和/或HGF特别是PPDCs表达的FGF和HGF诱导或支持。从PPDCs制得的制品，包括细胞裂解物、亚细胞级份等在内，也可用来治疗外周血管疾病。可将这种制品与药物可接受的载体(如本文所描述和例示的那些载体)一起配制，并以能有效治疗外周血管疾病的量给予患者。在优选的实施方案中，从PPDCs制得的制品包含FGF和HGF。

本发明的具体实施方案涉及血管的直接修复、再生、置换或者对血管的修复、再生或置换的支持，以治疗外周局部缺血损伤或损害。

PPDCs可单独给予(例如作为基本上同质的群体)，或者作为与其他细胞的混合物来给予。如上所述，PPDCs可与基质或支架或者与常规的药物可接受载体一起配制在药物制品中进行给予。在PPDCs与其他细胞一起给予的情况中，它们可与其他细胞同时或序贯(在其他细胞之前或之后)给予。可与PPDCs联合给予的细胞包括但不限于肌细胞、骨骼肌细胞、骨骼肌祖细胞、血管平滑肌细胞、血管平滑肌祖细胞、周细胞、血管内皮细胞或血管内皮祖细胞和/或其他多潜能或多能干细胞。不同类型的细胞可在给予的当时或临给予前与PPDCs混合，或者它们可一起共培养一段时间后再给予。

PPDCs可与其他有益的药物或生物分子或者其他活性药物一起给予，所述活性药物例如本领域公知的抗炎剂、抗细胞凋亡剂、抗氧化剂、生长因子、生血管因子或者肌肉再生或肌肉保护药物。当PPDCs与其他药物一起给予时，它们可在单一药物组合物中一起给予，或者在单独的药物组合物中与其他药物同时或序贯(在给予其他药物之前或之后)给予。该其他药物可以是这样的治疗方案的一部分，该治疗方案是在移植前开始并继续进行到整个恢复过程，或者可以在移植时开始，乃至可在移植后开始，这由本领域医师认为适当而定。

可与PPDCs一起给予的其他成分的实例包括但不限于：(1)其他生血管因子、生血管药物或者肌肉再生或肌肉保护因子或药物；(2)挑选的胞外基质成分，如一种或多种类型的本领域公知胶原，和/或生长因子、富含血小板的血浆和药物(或者，PPDCs可进行遗传工程改造以表达和产生生长因子)；(3)抗细胞凋亡剂(例如促红细胞生产素(EPO)、EPO模拟抗体、血小板生成素、胰岛素样生长因子(IGF)-I、IGF-II、肝细胞生长因子、胱冬酶抑制剂)；(4)抗炎化合物(例如p38MAP激酶抑制剂、TGF-β抑制剂、抑制素、IL-6和IL-1抑制剂、吡嘧司特、曲尼司特、REMICADE(Centocor，Inc.，Malvern，PA)、西罗莫司和非甾体抗炎药(NSAIDS)(如替泊沙林、托美丁和Suprafen)；(5)免疫抑制剂或免疫调节剂，如钙调磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗增殖剂、皮质类固醇和各种抗体；(6)抗氧化剂如普罗布考、维生素C和E、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸和(6)局部麻醉剂，仅举数例。

在一个实施方案中，PPDCs作为未分化细胞给予，即作为在生长培养基中培养的细胞给予。或者，PPDCs可在培养中暴露于能刺激向所需的骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮表现型的分化的条件后给予。

本发明的细胞可进行外科手术植入、注射、递送(例如通过导管、注射器、分流器(shunt)、固定模(stent)、微导管或泵)，或者以别的方式直接或间接给予局部缺血损伤、损害或损坏部位。本发明细胞或其组合物的给予途径包括但不限于静脉内、肌肉内、皮下、鼻内、鞘内、池内途径，或者通过带针头的注射器或者带或不带泵装置的导管。

当细胞在半固体或固体装置中给予时，向身体中的精确部位的外科手术植入通常是合适的给予方法。但是，液体或流体药物组合物可通过血液给予到或直接给予到受影响的肌肉组织(例如遍及受弥漫影响的区域，如对弥漫性局部缺血损伤来说是这样的情况)。PPDCs的迁移可由化学信号、生长因子或钙蛋白酶进行指导。

产后衍生细胞或包含产后衍生细胞的组合物和/或基质可通过大导管、内导管插入术(intracatheterization)或通过微型泵递送到所述部位。介质、赋形剂或载体可以是任何已知对于给予患者来说是药物可接受的那些介质、赋形剂或载体，所述给予特别是在要诱导细胞分化的部位的局部给予。实例包括液体介质，例如Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、无菌盐水、无菌磷酸缓冲盐水、Leibovitz培养基(L15，Invitrogen，Carlsbad，CA)、右旋葡萄糖(无菌水中)和任何其他生理上可接受的液体。

其他实施方案涵盖通过给予这样的治疗用组合物来治疗外周局部缺血损伤或损害的方法，该治疗用组合物包含药物可接受的载体和PPDC细胞成分(例如细胞裂解物或其成分)或产物(例如由PPDCs天然产生或通过遗传修饰产生的营养因子或其他生物因子、来自PPDC培养物的条件培养基)或者PPDC生长培养基或从生长培养基纯化的产物。在一个优选的实施方案中，生物因子是FGF和HGF。这些方法还可包括给予本领域公知的其他活性药物，如生长因子、生血管因子或者肌肉再生或肌肉保护药物。

用以给予PPDCs和本文描述的任何其他治疗用组合物或药物组合物的剂型和方案，是按照良好医疗规范来进行开发，开发时要考虑个体患者的情况，例如外周局部缺血事件所致损伤或损害的性质和程度、年龄、性别、体重和一般医学状况，以及执业医生公知的其他因素。因此，要给予患者的药物组合物的有效量是由本领域公知的这些考虑因素来确定。

已证实PPDCs在混合淋巴细胞反应中不能刺激异基因PBMCs。因此，在一些情况中用异基因乃至异种PPDCs进行的移植是可以容忍的。在一些实施方案中，PPDCs本身能提供免疫抑制作用，从而防止宿主对移植的PPDCs的排斥。在这种情况中，可能不需要在细胞治疗过程中进行药理学免疫抑制。

但是，在其他情况中，可能需要或适宜在开始细胞疗法前对患者进行药理学免疫抑制。这可通过使用系统性或局部性免疫抑制剂来实现，或者可通过如上所述在包囊的装置(encapsulateddevice)中递送细胞来实现。这些和其他的用以减少或消除对移植的细胞的免疫应答的方法是本领域公知的。或者可如上所述对PPDCs进行遗传修饰，以减少它们的免疫原性。

移植的PPDCs在活着的患者中的存活情况可通过使用多种扫描技术来测定，所述技术例如计算机化轴向分层造影(CAT或CT)扫描、磁共振成像(MRI)或正电子发射断层显像(PET)扫描。移植存活情况的测定也可通过死后进行，做法是除去骨骼肌或血管组织，并进行目测检查或通过显微镜检查。或者，可用对骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞、周细胞或血管内皮细胞特异的着色剂处理细胞。移植细胞还可通过预先掺入示踪染料进行鉴定，所述染料例如罗丹明或荧光素标记的微球体、坚牢蓝、铁微颗粒、双苯甲酰胺或遗传引入的报道基因产物如β-半乳糖苷酶或β-葡糖醛酸酶。

在另一个方面，本发明提供这样的药盒，该药盒能将PPDCs、PPDC群体、PPDCs成分和产物应用在各种方法中以如上所述刺激和/或支持血管发生，改善血流，再生、修复和改善因外周局部缺血事件损伤或损害的骨骼肌。在用于由局部缺血事件造成的损害或损伤的治疗或其他预定的治疗的情况中，药盒可包括一种或多种细胞群体和药物可接受的载体(液体、半固体或固体)，所述细胞群体包括至少PPDCs。药盒还任选包括例如通过注射来给予细胞的工具。药盒另外可包括有关细胞的使用的说明书。制备成供野战医院使用如军事使用的药盒，可包括全程序供应品，这些供应品包括组织支架、外科手术缝线等，在这种情况中细胞要结合急性损伤的修复进行使用。用于本文所述的测定和体外方法的药盒可含有以下四项中的一项或多项：(1)PPDCs或PPDCs的成分或产物，(2)实施体外方法的试剂，(3)适当时，其他细胞或细胞群体，和(4)执行体外方法的说明书。

以下实施例更详细地描述本发明。这些实施例旨在进一步说明而不是限制本文描述的本发明各个方面。

实施例1

脐带衍生的产后细胞在鼠后肢外周局部缺血模型中的功效

材料和方法

脐带细胞培养和分离脐带衍生细胞(UDCs)按美国专利公开说明书2005/0058631或2005/0054098进行制备。细胞培养至传代10或11次(大约20-25次群体倍增)，然后冷冻保藏。

局部缺血模型处理组：

1.PBS，阴性对照

2.血管内皮生长因子(pVEGF)的表达质粒，阳性对照

3.细胞系#1细胞，共5x10⁵个细胞

4.细胞系#1细胞，共1x10⁶个细胞

5.细胞系#2细胞，共1x10⁶个细胞

6.细胞系#1细胞，培养的，共1x10⁶个细胞

细胞系1：U120304p10，

细胞系2：U072804Ap11

注射用样品制备细胞在临注射前进行解冻(组3-5)，或者培养24-30小时(组6)。对细胞进行计数，并通过台盼蓝染色和用血细胞计数器计数测定存活率。将整个剂量的细胞或质粒(100μg)重悬在100μlPBS中，装入带27号注射针头的300μl结核菌素注射器以供注射到小鼠中。

外科手术在第0天，通过外科手术进行单侧结扎和切除左侧髂股动脉在无胸腺裸鼠中引起急性后肢局部缺血。将小鼠分成6组，每组至少n＝8，供用UDCs或对照进行处理。对于组1-5，小鼠是随机分配到各处理组。由于组6是在研究中较晚加入的，因此没有进行随机化。另外，由于时间安排上的冲突，不能与最初的研究同时进行microCT/PET。这个分析是在21天研究完成后征集的一组8只另外的动物(4只对照和4只培养细胞1)上进行的。

细胞注射外科手术一天后，将小鼠麻醉以对脚底区域进行激光多普勒影像分析。在小鼠仍处在麻醉中时，将细胞注射到左肢(局部缺血)的5个部位：(1)20μl注射到胫骨前肌；(2)2x20μl注射到腓肠肌；和(3)2x20μl注射到四头肌束的股直肌。

分析在第1、4、8、14和21天进行激光多普勒影像分析。在第21天，将小鼠处死，切除胫骨前肌(TA)、腓肠肌和四头肌，低温固定以进行薄层切片和用CD31抗体进行免疫组织化学染色。在第8天使用氟甲烷气体进行MicroCT/PET分析，以确定肌肉的灌注状态。之后立即将这些小鼠处死，后肢肌肉进行加工以在低温固定的薄层切片上进行CD31免疫组织化学分析。

排除标准在注射前，将在外科手术后1天显示严重的脚趾坏死的小鼠排除出研究。小鼠在研究中的任何时间如出现严重坏死(例如足部全部坏死)或者经历严重的体重减少或另外显示极端痛苦的迹象，也都被排除掉。

结果

这些实验的目标是测定UDCs在啮齿动物后肢局部缺血模型中是否能保护组织免受损伤。这个模型是通过在股动脉血流中造成损伤和在损伤后大约24小时在该区域注射细胞进行的。结果是通过估计这些动物的肢体的灌注情况并将这一情况与没有注射的对侧肢体进行比较来进行评估。在研究结束时还从这些动物收集组织，以评估动物的血管系统和损伤情况。这个研究也是用人细胞在裸鼠中进行，以避免植入的细胞的异种排斥。

图1给出的结果显示UDCs给小鼠赋予了好处，因为在第4天和第8天用培养的细胞处理的动物中灌注情况有改善，而在第8天用临注射前解冻的120304细胞处理的动物中血流也有改善。细胞072804A在任何时间点都不显示益处，这提示这两批细胞存在差异。一般地，动物随着时间的推移显示出改善，这表明这个品系的动物具有一定程度的天然修复能力。这些动物也相对较年轻，这可能是它们天生再生能力方面的一个因素。

在研究结束时收集TA肌肉，用抗CD31抗体探测切片以检测血管内皮细胞。代表性的结果在图2中显示。结果表明，PBS对照动物在局部缺血肢体中呈现严重的坏死和有限的血管系统(例如小鼠#26和#43)，而UDC处理的肢体显示较高的CD31染色相对水平和降低的坏死水平。结果还提示，与对照(PBS对照，在一些情况中，正常的(未损伤的)肢体)相比，用培养的UDCs处理的动物显示出血管系统有改善。在局部缺血但经过处理的肢体中，与正常肢体相比，观察到CD31染色增加。用VEGF质粒和Umb072804A处理的动物显示与PBS对照相似的结果。

总结

这些结果提供证据证明脐带衍生细胞在啮齿动物后肢局部缺血模型中能有效改善血流和减少组织坏死。研究包括了在临注射前进行解冻的两批不同的脐带细胞，结果提示在两批之间可能存在差异。还将似乎具有一些活性的细胞在注射前培养大约48小时并纳入另一处理组。这些细胞似乎最为有效，这提示培养能改变细胞的活性谱(activityprofile)。组织学结果还提供了证据证明处理能提供保护作用。该结果没有提供UDCs施加其作用的机制方面的足够信息。虽然不想受任何具体理论或作用机制的局限，但还是认为细胞可能是通过刺激新血管的生长或者保护肌肉组织免于进一步被损害(例如通过防止出现细胞凋亡或通过募集内源活性物质)来施加它们的作用。有必要进行另外的研究来探明精确的作用机制。

参考文献

1)Rehman，J.etal.(2004)Circulation109：1292-1298

实施例2

内皮网络形成测定

血管发生或者新血管系统的形成，是新组织的生长所必需的。血管发生的诱导在许多病理状况中是重要的治疗目标。为在体外测定中鉴定产后衍生细胞的潜在生血管活性，遵循了这样的确立方法：将内皮细胞接种到包被生物细胞培养底物的培养板上，该底物商标为MATRIGEL(BDDiscoveryLabware，Bedford，MA)，是一种基膜提取物(NicosiaandOttinetti(1990)InVitroCellDev.Biol.26(2)：119-28)。用生血管因子处理MATRIGEL(BDDiscoveryLabware，Bedford，MA)上的内皮细胞会刺激细胞形成类似于毛细血管的网络。这是测试血管形成的刺激剂和抑制剂的通用体外测定法(Itoetal.(1996)Int.J.Cancer67(1)：148-52)。实验利用了产后衍生细胞接种到培养孔嵌块(insert)的这种共培养系统。这些渗透性嵌块能使内皮细胞和产后衍生细胞培养基之间得以进行培养基成分的被动交换。

材料和方法

细胞培养

产后组织衍生的细胞接受了人脐带和胎盘，并如前所述(实施例1)分离细胞。将细胞在明胶包被的组织培养塑料瓶的生长培养基(Dulbecco改良必需培养基(DMEM；Invitrogen，Carlsbad，CA)、15％(v/v)胎牛血清(Hyclone，LoganUT))、100单位/毫升青霉素、100毫克/毫升链霉素(Invitrogen)和0.001％(v/v)2-巯基乙醇(Sigma，St.LouisMO))中进行培养。将培养物在5％CO₂、37℃下进行温育。用于实验的细胞处在第4次传代到第12次传代之间。

将生长活跃的产后细胞用胰蛋白酶处理，计数，接种到COSTARTRANSWELL6.5毫米直径组织培养嵌块(Corning，Corning，NY)上，每嵌块15,000个细胞。将细胞在嵌块上在生长培养基中在标准的生长条件下37℃培养48-72小时。

人间充质干细胞(hMSC)hMSCs购自Cambrex(Walkersville，MD)，在MSCGM(Cambrex)中进行培养。培养物是在标准的生长条件下进行温育。

将生长活跃的MSCs用胰蛋白酶处理，计数，接种到COSTARTRANSWELL6.5毫米直径组织培养嵌块(Corning，Corning，NY)上，每嵌块15,000个细胞。将细胞在嵌块上在生长培养基中在标准的生长条件下培养48-72小时。

人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)HUVEC获自Cambrex(Walkersville，MD)。将细胞在EBM或EGM内皮细胞培养基(Cambrex)中分别进行培养生长。细胞是在标准的组织培养塑料上在标准的生长条件下进行生长。用于测定的细胞处在第4次传代到第10次传代之间。

人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)HCAEC购自CambrexIncorporated(Walkersville，MD)。这些细胞也是在EBM或EGM培养基配方中分别进行培养保持。细胞是在标准的组织培养塑料上在标准的生长条件下进行生长。用于实验的细胞处在第4次传代到第8次传代之间。

内皮网络形成(MATRIGEL)测定按照生产商的说明书将培养板包被上MATRIGEL(BDDiscoveryLabware，Bedford，MA)。简单的说，将MATRIGEL(BDDiscoveryLabware，Bedford，MA)在4℃下解冻，分成大约250微升的等分试样，均匀分配到冷冻的24孔培养板(Corning)的每个孔上。然后将板在37℃下温育30分钟，以让材料固化。将生长活跃的内皮细胞培养物用胰蛋白酶处理并计数。将细胞通过离心、重悬和抽吸上清液在含2％FBS的生长培养基中洗涤两次。将细胞接种到包被的孔上，每孔20,000个细胞，在大约0.5毫升的含2％(v/v)FBS的生长培养基中。然后让细胞温育大约30分钟，以让细胞定植下来。

然后用10纳摩尔的人bFGF(Peprotech，RockyHill，NJ)或10纳摩尔的人VEGF(Peprotech，RockyHill，NJ)处理内皮细胞培养物，用作内皮细胞应答的阳性对照。将接种有产后衍生细胞的转孔(Transwell)嵌块加到适当的孔中，嵌块室(insertchamber)中有含2％FBS的生长培养基。将培养物在5％CO₂、37℃下温育大约24小时。将孔板从培养箱取出，用倒置显微镜(Olympus，Melville，NY)收集内皮细胞培养物的影像。

结果

在与胎盘衍生细胞或与脐带衍生细胞的共培养系统中，HUVEC形成了细胞网络(数据未显示)。HUVEC细胞在含hMSCs和含10纳摩尔bFGF的共培养实验中形成了有限的细胞网络(未显示)。不经任何处理的HUVEC细胞极少或没有显示网络形成(数据未显示)。这些结果提示产后衍生细胞释放了能刺激HUVEC的生血管因子。

在与胎盘衍生细胞或与脐带衍生细胞的共培养系统中，CAECs形成了细胞网络(数据未显示)。

表2-1显示了生长培养基中产后衍生细胞释放的已知生血管因子的水平。产后衍生细胞如上所述接种到嵌块上。细胞在嵌块上在大气氧中37℃培养48小时，然后转换到2％FBS培养基并返回37℃保持24小时。移取培养基，立即在-80℃冷冻保藏，通过SEARCHLIGHTmultiplexELISA测定(PierceChemicalCompany，Rockford，IL)进行分析。显示的结果是两次重复测定的平均值。结果显示产后衍生细胞没有释放出可检测水平的血小板衍生生长因子-bb(PDGF-bb)或肝素结合表皮生长因子(HBEGF)。细胞的确释放出金属蛋白酶-1(TIMP-1)、促血管生成素2(ANG2)、血小板生成素(TPO)、角质形成细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的可测量数量的组织抑制剂。

表2-1.从产后衍生细胞释放的潜在生血管因子

产后衍生细胞在大气氧中在含2％FBS的培养基中培养24小时。移取培养基，通过SEARCHLIGHTmultiplexELISA测定(Pierce)进行测定。结果是两次重复分析的平均值。数值为培养基中的浓度，以皮克/毫升培养基记录。Plac：胎盘衍生细胞；Umbcord：脐带衍生细胞。

表2-2显示了产后衍生细胞释放的已知生血管因子的水平。产后衍生细胞如上所述接种到嵌块上。细胞在嵌块上在培养基中在5％氧下培养48小时，然后转换到2％FBS培养基并返回5％O₂温育24小时。移取培养基，立即在-80℃冷冻保藏，通过SEARCHLIGHTmultiplexELISA测定(PierceChemicalCompany，Rockford，IL)进行分析。显示的结果是两次重复测定的平均值。结果显示产后衍生细胞没有释放出可检测水平的血小板衍生生长因子-bb(PDGF-BB)或肝素结合表皮生长因子(HBEGF)。细胞的确释放出金属蛋白酶-1(TIMP-1)、促血管生成素2(ANG2)、血小板生成素(TPO)、角质形成细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的可测量数量的组织抑制剂。

表2-2.从产后衍生细胞释放的潜在生血管因子

产后衍生细胞在5％氧中在含2％FBS的培养基中培养24小时。移取培养基，通过SEARCHLIGHTmultiplexELISA测定(Pierce)进行测定。结果是两次重复分析的平均值。数值为培养基中的浓度，以皮克/毫升培养基记录。Plac：胎盘衍生细胞；Umbcord：脐带衍生细胞。

总结

结果表明产后衍生细胞在体外MATRIGEL(BDDiscoveryLabware，Bedford，MA)测定中能刺激人脐带静脉和冠状动脉内皮细胞形成网络。这个作用类似于已知的生血管因子在这个测定系统中所见到的作用。这些结果提示产后衍生细胞可用于在体内刺激血管发生。

实施例3

hUTCs对内皮细胞的体外增殖和迁移的作用

进行了研究，以确定人脐带组织衍生的细胞(hUTCs)对内皮细胞体外增殖和迁移的作用。这些作用是通过将hUTCs与内皮细胞共培养和通过将人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)的培养物与hUTC裂解物进行温育来进行研究的。这里给出的结果显示，hUTCs能诱导内皮细胞的增殖和迁移的增加。此外，数据还提示这些作用部分上是由成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)介导的。

材料和方法

细胞培养

将批号为120304的冷藏人脐带组织衍生细胞(hUTCs)在传代8-9之间解冻，接种到包被明胶的瓶子，在Hayflick生长培养基(DMEM-低葡萄糖[Gibco，目录号11885-084]、15％v/v胎牛血清[FBS，Hyclone，目录号SH30070.03]、0.001％v/vβ-巯基乙醇[Sigma，目录号M7154]及50U/ml青霉素和50微克/ml链霉素[Gibco，目录号3810-74-0])中进行培养。对于这里所详述的研究，所用的细胞是在第10或11次传代。人脐带静脉内皮细胞(HUVECs，目录号C2517A)、人冠状动脉内皮细胞(HCAECs，目录号CC2585)和人髂动脉内皮细胞(HIAECs，目录号CC2545)获自Cambrex，在内皮生长培养基(EGM-2MV，目录号3202)中按照生产商的推荐进行培养。人间充质干细胞(MSCs，目录号PT-2501)也购自Cambrex，在间充质干细胞生长培养基(MSCGM，目录号PT-3001)中按照生产商的推荐进行保持。人真皮成纤维细胞(CCD9)获自ATCC，在含有10％FBS和1U/ml青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中进行保持。

对于常规传代，将细胞用磷酸缓冲盐水(PBS，Invitrogen，目录号14190)洗涤一次，并通过胰蛋白酶消化(0.25％trypsin-EDTA，Invitrogen，目录号25200-056)进行脱附(detach)。将细胞用仪器(GuavaTechnologies，Hayward，CA)进行计数，并以5000个细胞/cm²的密度接种。细胞常规地每3-4天传代一次。

生长因子和抗体

重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，目录号100-18B)和重组人肝细胞生长因子(HGF，目录号100-39)获自Peprotech，重组人血管内皮生长因子(VEGF，目录号293-VE)获自R&DSystems。抗bFGF抗体(目录号ab11937)、抗HGF抗体(目录号ab10678)和抗VEGF抗体(目录号ab9570)购自Abcam(Cambridge，MA)。

细胞裂解物的制备

细胞裂解物是从得自之前的生长物(grow-ups)的冷冻hUTC批次120304细胞沉淀制备。简单的说，将hUTC批次120304培养4天，通过胰蛋白酶消化进行收获，离心沉淀。然后用PBS洗涤细胞3次，以1x10⁷个细胞/ml重悬于PBS中。将1ml悬浮液等分试样放入1.5ml无菌硅化微量离心管中，在300rcf下离心5分钟。抽吸出PBS，将细胞沉淀保藏在-80℃备用。

为制备细胞裂解物，将装着细胞沉淀的管子浸入液氮(LN2)中保持60秒钟，然后立即浸入37℃水浴中保持60秒钟，或者直到解冻，但不超过3分钟。这个步骤重复3次。在这个步骤后，将冷冻-解冻的样品在13000rcf下4℃离心10分钟，然后放在冰上。小心移取上清液，转移到没用过的无菌硅化1.5ml管中。重复离心步骤3次，将所得的上清液集中。用QUICKSTART ^TMBradford蛋白质测定试剂盒(Bio-rad，目录号500-0201)的微测定方案测定蛋白质浓度。为研究细胞裂解物对HUVECs的增殖的作用，

细胞增殖的测量

收获细胞，以5000个细胞/cm²的浓度直接接种到指定的培养基配方中。对于共培养实验，使用24孔转孔(Corning目录号3413)，其中内皮细胞接种在孔的底部上(10,000个细胞/孔)，hUTCs、MSCs或成纤维细胞接种在转孔嵌块的内部(1650个细胞/转孔嵌块)。在指定的时间段，移取含hUTCs、MSCs或成纤维细胞的嵌块并弃去。通过加入90μl胰蛋白酶到每个孔中，收获内皮细胞。通过用移液管将细胞吸上吸下然后转移到清洁的96孔板，使细胞得以释放。通过加入90μl培养基抑制胰蛋白酶。加入20μl染色溶液(18μl培养基+1μlGUAVA Flex试剂+1μlDMSO)将细胞染色，并用仪器(GuavaTechnologies，Hayward，CA)进行定量。

对于有关hUTC批次120304细胞裂解物对HUVECs的增殖的作用的研究，将HUVECs以EGM-2MV培养基中10,000个细胞/孔的密度接种到24孔组织培养皿上，保持8小时。然后将细胞在0.5ml含0.5％FBS和不含生长因子的EGM-2MV培养基中温育过夜，进行血清饥饿处理。之后，加入FBS、新制备的含62.5μg和125μg蛋白的hUTC批次120304细胞裂解物和抗FGF(7μg/ml)或HGF(1μg/ml)的中和抗体。培养4天后，收获细胞，用仪器计数。

对于关于hUTC介导的内皮细胞增殖增加的潜在机制的研究，将抗FGF(7μg/ml)、HGF(1μg/ml)和VEGF(1μg/ml)的中和性抗体包括在HUVECs和HCAECs与hUTCs的共培养中。抗体在细胞开始接种时加到细胞培养基中。共培养7天后，收获细胞，用仪器计数。

细胞迁移的评估

为测量细胞迁移，使用6孔转孔(Corning目录号3428)装置(set-up)。将细胞以5000个细胞/cm²的密度直接接种到指定的培养基配方中。内皮细胞接种在转孔嵌块内部(23,000个细胞/转孔嵌块)，hUTC批次120304或MSCs接种到孔的底部(48,000个细胞/孔)。在共培养7天后通过计数转孔的底面上的细胞数量评估迁移情况。简单的说，将转孔转移到清洁的孔中，用PBS洗涤一次。向孔底部加入胰蛋白酶，来收集孔底面的细胞。加入完全生长培养基将胰蛋白酶抑制，离心收集细胞。然后将细胞重悬在25μl培养基中，其中取20μl用仪器获得细胞计数。

对于关于hUTC介导的内皮细胞迁移增加的潜在机制的研究，将抗FGF(7μg/ml)和HGF(1μg/ml)的中和性抗体包括在HUVECs和HCAECs与hUTC批次120304的共培养中。抗体在细胞开始接种时加到细胞培养基中。共培养7天后，收获转孔嵌块底面上的细胞，用仪器计数。

结果

hUTCs对内皮细胞增殖的作用

利用共培养系统研究hUTCs对内皮细胞增殖的作用。这是用转孔装置(set-up)来进行，其中内皮细胞接种在24孔组织培养皿的底部上，hUTCs接种在转孔嵌块的内部。在这些实验中，使用了两种不同的培养基配方(培养基组成在材料和方法中详述)：Hayfilck80％+EGM-2MV20％(H80)或Hayflick50％+EGM-2MV50％(H50)。共培养6天或7天后，移取转孔嵌块，通过胰蛋白酶消化收获内皮细胞，用仪器计数。

图1比较了hUTC批次120304对在H80上培养的和在H50上培养的内皮细胞的增殖的作用。保持在H50中的HUVECs的增殖高于保持在H80中的HUVECs(图1A)，而HCAECs和HIAECs在这些共培养培养基配方中显示相似的生长(图1B和图1C)。在两种培养基配方中，内皮细胞与hUTC批次120304的共培养导致7天后细胞数量显著增加。所有后面的对hUTCs和内皮细胞的共培养研究都在Hayflick50％+EGM-2MV50％(H50)培养基配方中进行。

还将MSCs和成纤维细胞与内皮细胞共培养进行测试，以确定其他细胞类型是否具有影响内皮细胞的增殖的能力。如图1A所示，共培养培养基(H50或H80)中的HUVECs和与MSCs或与成纤维细胞共培养的HUVECs在增殖上没有差异。HCAECs(图1B)和HIAECs(图1C)也同样，其中与hUTC批次120304的共培养导致细胞增殖增加，而在共培养培养基(H50或H80)中的细胞和与MSCs共培养的细胞之间没能观察到差异。

为研究hUTC介导的内皮细胞增殖增加的潜在机制，将抗FGF(7μg/ml)、HGF(1μg/ml)和VEGF(1μg/ml)的中和性抗体包括在HUVECs和HCAECs与hUTCs的共培养中。图2A和2B的结果显示，在HUVECs和HCAECs中，抗FGF和HGF的中和性抗体的加入减少了hUTC批次120304诱导的细胞数量的增加。在用于这些研究的浓度下，这些中和性抗体阻断了生长因子诱导的HUVECs的增殖(图2A)。值得指出的是，抗VEGF的中和性抗体对HUVECs(图2A)和HCAECs(图2B)与hUTC批次120304的共培养所诱导的细胞增殖没有显著的作用。在另外的研究中，hUTC批次120304的增殖不因抗FGF和VEGF的中和性抗体加入到培养基中而受到影响(数据未显示)。

hUTC批次120304细胞裂解物对HUVECs的增殖的作用

还进行了研究，以确定细胞裂解物对HUVECs的增殖的作用。将HUVECs以5000个细胞/cm²的密度接种到24孔板上的EGM-2MV培养基中，保持8小时。然后将细胞在0.5ml含0.5％胎牛血清(FBS)和不含生长因子的EGM-2MV培养基中温育过夜，进行血清饥饿处理。温育后，加入不同浓度的新鲜制备hUTC批次120304细胞裂解物。在一些情况中，FGF、HGF和中和性抗体也加入。培养4天后，收获HUVECs，用仪器计数。[0174]图3显示，细胞裂解物的加入导致HUVECs细胞数量与保持在低血清(0.5％FBS)中的细胞相比有增加，且细胞数量的增加与所加入的细胞裂解物的量成比例。较低浓度的所用细胞裂解物(62.5μg/ml)其导致的细胞数量可与在最佳培养基条件(10％FBS)下温育的细胞相比。此外，抗FGF或HGF的中和性抗体的加入缓和了由该两种不同浓度的细胞裂解物诱导的细胞数量的增加。这些结果和在HUVECs与hUTC批次120304的共培养中获得的结果相一致。

hUTCs对内皮细胞迁移的作用

内皮细胞的迁移是通过测定已移动穿过转孔膜(孔径＝8微米)的细胞的数量进行评估。将应答细胞即内皮细胞接种到6孔转孔嵌块上，hUTCs接种在孔的底部上。一段时间的共培养后，将转孔底面上的细胞收集并计数。图4A显示与hUTCs和MSCs共培养的HUVECs的迁移。hUTC批次120304诱导了HUVECs向转孔的底面的移动，而MSCs却没有(图4A)。在HCAECs上观察到相同的结果，其中与hUTC批次120304的共培养导致相对于培养基对照有更多的细胞迁移穿过转孔(图4B)。

采用抗FGF和HGF的中和性抗体，进一步测试hUTC批次120304对HUVECs和HCAECs的迁移行为的作用。如图5A所示，这些抗体减少了hUTC批次120304诱导的HUVECs迁移。在HCAECs与hUTC批次120304的共培养中，抗HGF的中和性抗体阻断了hUTC批次120304介导的细胞迁移增加，而抗FGF的中和性抗体却没有阻断(图5B)。

总结

这里概述的结果说明了hUTCs对内皮细胞体外增殖和迁移行为的作用。研究是用hUTC批次120304和内皮细胞的共培养或者内皮细胞与从hUTC批次120304制备的细胞裂解物的直接温育进行的。

对于增殖的研究，测试了hUTC批次120304的作用，来自不同血管床的三种内皮细胞类型周作应答细胞。与hUTCs的共培养导致内皮细胞增殖得到增强。与MSCs或成纤维细胞的共培养所导致的细胞数量与培养基对照相当。HUVECs对hUTC批次120304的增殖应答因抗FGF和HGF的抗体的加入而受到抑制，但不受抗VEGF的抗体的抑制。这暗示hUTC批次120304对增殖的诱导是由FGF和HGF介导的。值得指出的是，HUVECs与hUTC批次120304裂解物的温育反映了在共培养物上所观察到的作用。

迁移是通过计数在转孔的底面上的细胞的数量进行定量的，HUVECs和HCAECs都用作应答细胞。与增殖研究不同的是，这些细胞的迁移应答稍有不同。HUTC批次120304诱导了HUVECs和HCAECs的迁移。MSCs不诱导HUVECs的迁移，这提示了这一对hUTCs的应答的特异性。抗FGF和HGF抗体取消了hUTC批次120304对HUVECs的迁移的作用，而只有抗HGF抗体影响了HCAECs的迁移，这提示了两种内皮细胞类型之间的差异。

总之，这些数据表明hUTCs能诱导内皮细胞体外增殖和迁移。中和性抗体的使用暗示FGF和HGF牵涉到这些观察到的作用。但是，其他因素也可能涉及到内皮细胞的增殖和迁移行为。

本发明并不限于以上描述和例示的实施方案。在所附权利要求的范围内能够作出变化和修改。

Claims (30)

1.脐带组织衍生的细胞在制备用于治疗外周局部缺血的药物中的用途，其中所述脐带组织衍生的细胞衍生自基本上没有血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩展，具有分化的潜力，产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A，B，C，不产生CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DRPQ。

2.脐带组织衍生的细胞在制备用于外周局部缺血患者改善血流和减少组织坏死的药物中的用途，其中所述脐带组织衍生的细胞衍生自基本上没有血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩展，具有分化的潜力，产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A，B，C，不产生CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DRPQ。

3.权利要求1或2的用途，其中所述细胞在体外被诱导分化成骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮谱系细胞。

4.权利要求1至3中任一项的用途，其中所述细胞进行遗传工程改造以产生能促进外周血管疾病的治疗的基因产物。

5.权利要求1至4中任一项的用途，其中所述用途还包括至少一种其他细胞类型，所述其他细胞类型选自骨骼肌细胞、骨骼肌祖细胞、血管平滑肌细胞、血管平滑肌祖细胞、周细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞。

6.权利要求5的用途，其中所述至少一种其他细胞类型在给予脐带组织衍生的细胞的同时或之前或之后给予。

7.权利要求1至6中任一项的用途，其中所述用途还包括至少一种其他药物，所述药物选自抗血栓形成剂、抗炎剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、促生血管剂或抗细胞凋亡剂。

8.权利要求7的用途，其中所述药物在给予脐带组织衍生的细胞的同时或之前或之后给予。

9.权利要求1或2的用途，其中所述用途包括在外周局部缺血的部位给予细胞。

10.权利要求1或2的用途，其中所述脐带组织衍生的细胞通过注射、输注、植入患者体内的装置或者通过植入含有所述细胞的基质或支架来给予。

11.权利要求1或2的用途，其中所述细胞对患者的骨骼肌施加营养作用。

12.权利要求1或2的用途，其中所述细胞对患者的血管平滑肌施加营养作用。

13.权利要求12的用途，其中所述营养作用是血管平滑肌细胞的增殖。

14.权利要求1或2的用途，其中所述细胞对患者的血管内皮施加营养作用。

15.权利要求14的用途，其中所述营养作用是血管内皮细胞的增殖。

16.权利要求1或2的用途，其中所述细胞诱导血管内皮细胞迁移到外周局部缺血的部位。

17.权利要求1或2的用途，其中所述细胞诱导血管内皮祖细胞迁移到外周局部缺血的部位。

18.权利要求1或2的用途，其中所述细胞诱导血管平滑肌细胞迁移到外周局部缺血的部位。

19.权利要求1或2的用途，其中所述细胞诱导血管平滑肌祖细胞迁移到外周局部缺血的部位。

20.权利要求1或2的用途，其中所述细胞诱导周细胞迁移到外周血管疾病的部位。

21.一种药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗外周局部缺血，所述药物组合物包含药物可接受的载体和由脐带组织衍生的细胞制成的制品，其中所述脐带组织衍生的细胞衍生自基本上没有血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩展，具有分化的潜力，产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A，B，C，不产生CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DRPQ，其中所述制品包含脐带组织衍生的细胞的细胞裂解物、脐带组织衍生的细胞的胞外基质或其中生长了脐带组织衍生的细胞的条件培养基。

22.一种药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于外周局部缺血患者改善血流和减少组织坏死，所述药物组合物包含药物可接受的载体和由脐带组织衍生的细胞制成的制品，其中所述脐带组织衍生的细胞衍生自基本上没有血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩展，具有分化的潜力，产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A，B，C，不产生CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DRPQ，其中所述制品包含脐带组织衍生的细胞的细胞裂解物、脐带组织衍生的细胞的胞外基质或其中生长了脐带组织衍生的细胞的条件培养基。

23.权利要求21或22的用途，其中所述由脐带组织衍生的细胞制成的制品对血管内皮施加营养作用。

24.权利要求23的用途，其中所述营养作用是血管内皮细胞的增殖。

25.权利要求21或22的用途，其中所述由脐带组织衍生的细胞制成的制品诱导血管内皮细胞迁移到外周局部缺血的部位。

26.权利要求21或22的用途，其中所述由脐带组织衍生的细胞制成的制品诱导血管内皮祖细胞迁移到外周局部缺血的部位。

27.权利要求21或22的用途，其中所述由脐带组织衍生的细胞制成的制品诱导血管平滑肌细胞迁移到外周局部缺血的部位。

28.权利要求21或22的用途，其中所述由脐带组织衍生的细胞制成的制品诱导血管平滑肌祖细胞迁移到外周局部缺血的部位。

29.权利要求21至28的用途，其中所述组合物包含FGF和HGF。

30.脐带组织衍生的细胞在制备用于外周局部缺血患者减少组织坏死的药物中的用途，其中所述脐带组织衍生的细胞衍生自基本上没有血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩展，具有分化的潜力，产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A，B，C，不产生CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DRPQ。