CN104955464B

CN104955464B - 用于治疗和预防组织损伤和疾病的组合物和方法

Info

Publication number: CN104955464B
Application number: CN201380059307.2A
Authority: CN
Inventors: 戴尔·R·彼得森; 拉尔夫-海科·马特恩; 科里·威尔森-维斯; 凯文·L·欧哈施
Original assignee: MICROVASCULAR TISSUES Inc
Current assignee: MICROVASCULAR TISSUES Inc
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2020-02-28
Anticipated expiration: 2033-09-17
Also published as: HK1212380A1; EP3476410B1; US9713629B2; ES2899209T3; CA2885419A1; US20150231183A1; KR102270617B1; CN104955464A; ES2710921T3; KR20150061642A; JP2018065881A; WO2014047067A1; US20170360845A1; BR112015006055A2; AU2013318243B2; JP2015529687A; AU2019203555B2; US10729729B2; JP6755893B2; EP2898064B1

Abstract

本发明提供了包含多能细胞或微血管组织的新的组合物以及使用这些组合物治疗或预防同种异体个体的组织损伤或疾病的相关方法，其中所述细胞或组织经灭菌和/或处理以灭活病毒。

Description

用于治疗和预防组织损伤和疾病的组合物和方法

相关领域的描述

软组织如肌肉、腱、韧带和关节囊的损伤频繁发生。这样的损伤通常引起特征为疼痛、炎症和内部组织压力的组织功能异常，并且最终能够引起功能残疾。例如，虽然腱扭伤会自愈，腱的完全撕裂如果不经手术处理常常会导致残疾。甚至尽管进行了手术修复，跟腱(Achilles tendon)的约15％和两种腱旋转套修复术中的40％后来失败。此外，修复的腱很少恢复至损伤前的强度和功能水平。

组织修复通常包括几个阶段，包括开始的炎症反应及随后的细胞增殖和组织重建。组织修复的基本过程包括纤维组织形成和血管生成。炎症介质激活的成纤维细胞迁移至伤口处，增殖并铺设富含胶原的细胞外基质，同时受损的组织中的毛细血管朝受损区域生长以重建血流。在重建过程中，瘢痕组织被重新吸收并替换为更紧密的定向的胶原，以产生具有原组织的一些特征的组织。

概述

已开发出多种不同的有助于组织修复的治疗方法。这些方法包括为组织向内生长提供支持的物理结构如较好的缝线、骨锚定物和补丁或植入物。另外，多种生长因子已被用于改善组织生长和迁移至伤口位置，以及促进血管生成。例如，已有在临床前模型中使用生长因子如BMP-2、BMP-12、PDGF-BB和bFGF改善腱愈合的报导。

最近，已进行努力来使用干细胞来促进伤口愈合和组织再生。干细胞被认为能通过多种不同机制中的任意一种来介导伤口愈合，包括：调节炎症过程；迁移至受损的组织以及征募其他细胞，如组织生长所必需的内皮祖细胞；刺激修复细胞的增殖；通过形成瘢痕来支持组织重建；抑制细胞凋亡；以及分化为骨、软骨、腱或韧带组织。已有多项报导描述了使用干细胞治疗或产生许多不同的组织。这些工作中的许多集中于使用脂肪来源的干细胞和其他多能细胞，因为它们易于大量获取。然而，由于担心移植的同种异体细胞或组织可能会引发免疫反应并最终排斥，或者转移有害的病毒或其他病原体，该工作集中于使用自体细胞。然而，不幸的是，自体干细胞的使用较不方便。其需要两项不同的手术过程，伴有相关的疼痛、费用和发病率，并且还存在将组织运送至实验室用于处理相关的风险以及受伤患者的延迟治疗。

明显地，本领域需要用于治疗和修复组织损伤而不产生不期望的免疫反应的同种异体干细胞与其他多能细胞的新的治疗组合物。本发明满足了这一需求且提供了其他的优势。

因此，在本文的几个实施方案中提供了在组织的修复和/或再生中有用的新的组合物、方法、试剂盒和细胞群体。

在几个实施方案中，提供了包含分离的多能细胞或经处理的微血管组织，或者获自或来源于所述细胞或组织的细胞膜的组合物，其中所述组合物具有血管生成活性或抗炎活性，并且其中所述组合物经灭菌，和/或所述组合物中的病毒被灭活。在特定的实施方案中，细胞或组合物未经培养。在特定的实施方案中，组合物中存在的少于或等于50％或者少于或等于10％的细胞是活的。在特定的实施方案中，所述组合物中存在的细胞基本上都不是活的。在某些实施方案中，至少1％的所述细胞排斥台盼蓝。在特定的实施方案中，组合物被干燥、冻干或冻存。在相关的实施方案中，组合物，包括灭菌、干燥、冻干或冻存的组合物，在约室温下储藏至少1个月时保留有可测量的血管生成活性或抗炎活性。在某些实施方案中，组合物包含赋形剂。

在几个实施方案中，本文公开的组合物还包含可植入的支架或基质，其可为，例如来源于骨的植入物、生物纤维支架、多孔的可吸收聚合物、水凝胶、包含组织产品的油灰、或缝线。具体地，细胞、组织或细胞膜存在于所述可植入的支架或基质的面向骨、腱或皮肤的表面上。

在某些实施方案中，本发明的组合物经配制用于静脉内给药。然而，在其他实施方案中，可使用其他给药途径，包括直接给药(至组织表面或通过直接注射)、动脉内给药、全身给药等。

在几个实施方案中，所述细胞或组织获自哺乳动物供体，任选人。在一个实施方案中，在获取细胞或组织时供体为健康的哺乳动物。在某些实施方案中，所述细胞包含干细胞或祖细胞。

在几个实施方案中，提供了制备包含分离的多能细胞的组合物的方法，其中所述组合物具有血管生成活性或抗炎活性，所述方法包括：解离获自供体哺乳动物的组织样品以释放其中的多种多能细胞；使多种所释放的多能细胞与一种或多种其他组织组分分离，以制备包含分离的多能细胞的组合物；在灭菌之前或之后任选干燥、冻干或冻存所述组合物；在任选干燥、冻干或冻存组合物之前或之后将所述组合物灭菌和/或将组合物中存在的病毒灭活，其中经灭菌的组合物保留有可测量的血管生成活性或抗炎活性。在几个实施方案中，所述细胞或组合物未经培养。在某些实施方案中，所述方法任选还包括过滤所释放的细胞或组分，例如，其可在灭菌或干燥、冻干或冻存之前进行。在某些实施方案中，所述解离包括将组织样品与一种或多种蛋白酶接触。在特定的实施方案中，所述一种或多种蛋白酶不包括胶原酶。在某些实施方案中，所述一种或多种蛋白酶包括如下物质或由如下物质组成：1型胶原酶以及分散酶或嗜热菌蛋白酶；或者MMP2、MMP 14以及分散酶或嗜热菌蛋白酶。可使用这些蛋白酶(或其他功能等同物)的组合。在另外的实施方案中，解离或分离包括超声搅拌、过滤或使用密度梯度。在一个实施方案中，所述组织为脂肪来源的组织，并且所述超声搅拌、过滤或使用密度梯度使所释放的多能细胞与脂肪细胞分离。

在另外的实施方案中，提供了制备包含经处理的微血管组织的组合物的方法，其中所述组合物具有血管生成活性或抗炎活性，所述方法包括：解离获自供体哺乳动物的微血管组织样品，以制备包含所解离的微血管组织的组合物；从包含所解离的微血管组织的组合物中去除一种或多种组织组分；在灭菌之前或之后任选干燥、冻干或冻存所述组合物；以及在任选干燥、冻干或冻存之前或之后将所述组合物灭菌和/或将所述组合物中存在的病毒失活，其中经灭菌的组合物保留有可测量的血管生成活性或抗炎活性。在特定的实施方案中，所述细胞或组合物未经培养。在特定的实施方案中，所述方法还包括过滤所述组合物。在特定的实施方案中，所述解离包括将所述组织样品与一种或多种蛋白酶接触。在某些实施方案中，所述一种或多种蛋白酶不包括胶原酶。在某些实施方案中，所述一种或多种蛋白酶包括如下物质或由如下物质组成：1型胶原酶以及分散酶或嗜热菌蛋白酶；或者MMP2、MMP 14以及分散酶或嗜热菌蛋白酶。在某些实施方案中，所述解离或去除包括超声搅拌、过滤或使用密度梯度。在特定的实施方案中，所述微血管组织为脂肪来源的组织，并且所述超声搅拌、过滤或使用密度梯度从所述组合物去除脂肪细胞。

在另外的实施方案中，本发明提供了包含无菌、干燥组合物的不透水容器，其中所述组合物包含分离的多能细胞或经处理的微血管组织，或者包含所述细胞或组织或者获自所述细胞或组织的细胞膜，所述组合物具有血管生成活性或抗炎活性，所述组合物经灭菌和/或所述组合物中的病毒被灭活，并且所述组合物在约室温下储藏至少1个月时保留有可测量的血管生成活性或抗炎活性。在某些实施方案中，所述细胞或组合物未经培养。在特定的实施方案中，所述组合物中存在的少于或等于50％或者少于或等于10％的细胞是活的。在某些实施方案中，所述组合物中存在的细胞基本上都不是活的。在特定的实施方案中，至少1％的所述细胞排斥台盼蓝。在特定的实施方案中，所述组合物包含赋形剂。

在不透水容器的特定实施方案中，所述组合物还包含可植入的支架或基质。在特定的实施方案中，所述可植入的支架或基质为来源于骨的植入物、生物纤维支架、多孔的可吸收聚合物、水凝胶、包含组织产品的油灰、或缝线。在某些实施方案中，所述细胞、组织或细胞膜存在于所述可植入的支架或基质的面向骨、腱或皮肤的表面上。

在不透水容器的一个实施方案中，所述组合物经配制用于静脉内给药。

在本发明的不透水容器的特定实施方案中，所述细胞或组织获自哺乳动物供体，任选人。在特定的实施方案中，在获取所述细胞或组织时所述供体为健康的哺乳动物。在某些实施方案中，所述细胞包含干细胞或祖细胞。在某些实施方案中，所述容器为包含气密封口的小瓶。在多个实施方案中，所述容器存在于包含无菌内壁的密封包装中。

在另一个相关的实施方案中，本发明提供了治疗或预防哺乳动物的损伤或疾病，或者促进哺乳动物的组织再生的方法，包括将本发明的组合物或根据本发明的方法制备的组合物提供给所述哺乳动物。在特定的实施方案中，所述组合物经手术植入至哺乳动物中。在某些实施方案中，所述组合物被植入至所述哺乳动物的损伤或疾病位点中或其附近。在相关的实施方案中，所述组合物经静脉内提供给所述哺乳动物。在某些实施方案中，所述损伤存在于软组织中。在特定的实施方案中，所述损伤存在于腱、韧带、皮肤、骨、软骨、盘或微血管组织中。在特定的实施方案中，所述损伤或疾病为缺血性损伤、再灌注损伤、微血管损伤或炎症。在某些实施方案中，所述疾病为关节炎如骨关节炎或类风湿性关节炎。

在另外的实施方案中，提供了包含多能细胞和一种或多种血管壁和/或细胞外基质组分的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括包含多能细胞的灭菌组合物。在其他实施方案中，本发明包括包含排斥台盼蓝但不会增殖的多能细胞的组合物。在其他的实施方案中，本发明包括包含多能细胞和一种或多种血管壁细胞外基质组分的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括包含多能细胞的灭菌组合物。在其他实施方案中，本发明包括包含排斥台盼蓝但不会增殖的多能细胞的组合物。在相关的实施方案中，本发明包括包含排斥台盼蓝但不会增殖的灭菌多能细胞的组合物。在本发明的组合物的某些实施方案中，组合物中存在的至少50％或至少90％的细胞排斥台盼蓝但不会增殖。在某些实施方案中，所述组合物包含多能细胞。在一个实施方案中，组合物中存在的至少50％或至少90％的多能细胞排斥台盼蓝但不会增殖。在特定的实施方案中，组合物中存在的总细胞的少于或等于50％或者少于或等于10％是活的。在特定的实施方案中，所述组合物中存在的细胞基本上都不是活的。在任何本发明的组合物或方法的某些实施方案中，至少1％或至少5％，或者至少10％，或者至少20％、至少50％，或者至少90％的所述细胞排斥台盼蓝。

在另外的实施方案中，本发明包括包含多能细胞的两种或更多种组分的灭菌组合物。在某些实施方案中，所述组合物包含多能细胞的5种或更多种或者10种或更多种组分。在另一个相关的实施方案中，本发明包括包含来自多能细胞的细胞膜和蛋白的组合物。在特定的实施方案中，所述组合物不包含任何活细胞，或者不包含任何完整的细胞。

另外，本发明表明任何本发明的组合物均可用于治疗或预防个体的损伤或疾病，包括本文中描述的任何损伤或病况，其中所述多能细胞对所述个体为非自体的。

上文概述的且在下文有更详细描述的方法，描述了从业者采用的某些行为；然而，应理解它们也可包括由另一方指导那些行为。因此，诸如“给予微血管组织”的行为包括“指导给予微血管组织”。

附图说明

图1提供了实施例1中描述的研究的示意图。

图2显示了6个视野中估计的每100X细胞放大率的细胞计数。辐射之后和之前(对照)于缓冲液1&2中的BMA和BMB细胞被用于吸引CM-DiI标记的HUVEC细胞。通过对100X放大率下的6幅图(视野)的目测计数估计细胞计数。将计数平均并作图，如图所示。虚线表示阴性培养基对照的均值。该线上的细胞数表示由于BMA或BMB物质样品而增加的迁移。从上至下显示的标记对应于从左至右显示的每个时间点的柱。

图3显示了12、24和48小时的迁移时间中，在于缓冲液1中的BMA的存在下，标记的人内皮细胞的荧光显微镜图像。

图4显示了12、24和48小时的迁移时间中，在于缓冲液1中的BMB的存在下，标记的人内皮细胞的荧光显微镜图像。

图5显示了12、24和48小时的迁移时间中，在于缓冲液2中的BMA的存在下，标记的人内皮细胞的荧光显微镜图像。

图6显示了12、24和48小时的迁移时间中，在于缓冲液2中的BMB的存在下，标记的人内皮细胞的荧光显微镜图像。

图7显示了标记的人内皮细胞荧光显微镜图像。左侧的样品为未稀释的EZ-CPZ^TM，其代表缓冲液1&2，其中保存有细胞。EZ-CPZ^TM为低温保存培养基(Incell Corp.,SanAntonio,TX)。EZ-CPZ^TM被Incell Corp.描述为即用型无血清和无蛋白的低温保存培养基，其与细胞悬液1:1(v:v)轻轻混合。EZ-CPZ^TM支持多种细胞类型的高活力和重获活力(re-animation)，所述细胞包括：原代细胞培养物、淋巴细胞、杂交瘤、CHO、结肠、IBHK和癌细胞系。EZ-CPZ^TM含有产权配方的临床级组分、玻璃化低温保存剂，以及终浓度为5％的DMSO。EZ-CPZ^TM提供了对人和其他哺乳动物细胞的低温保护。右侧为EZ-CPZ和M3D^TM限定培养基(Incell Corp.,San Antonio,TX)的50:50混合物，所述培养基代表其中保存有经处理的微血管组织组合物物质的缓冲剂。M3D^TM被Incell Corp.描述为包含盐、氨基酸和糖但无生长因子或未确定组分如血清或提取物的限定培养基。在12和48小时时间点采集迁移的时间过程图像。

图8显示了荧光显微镜图像。将SVF细胞接种在48孔板中，并培养至约50％汇合度。用CMDiI染色BMA物质并冲洗。将50μl的BMA物质放在单孔的生长SVF细胞上。观察到了荧光，其中SVF细胞已摄取CMDiI染色的物质并将其掺入至它们自身的膜中。缓冲液1中的BMA物质描述于上排，并且缓冲液2中的BMA物质描述于下排。左侧的物质经辐射，并且右侧的物质(对照)未经辐射。

图9显示了荧光显微镜图像。将SVF细胞接种在48孔板中，并培养至约50％汇合度。用CMDiI染色BMB物质并冲洗。将50μl的BMA物质放在单孔的生长SVF细胞上。观察到了荧光，其中SVF细胞已摄取CMDiI染色物质并将其掺入至它们自身的膜中。缓冲剂1中的BMB物质描述于上排，并且缓冲液2中的BMB物质描述于下排。左侧的物质经辐射，并且右侧的物质(对照)未经辐射。

图10描述了与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)响应暴露于微血管组织的迁移相关的数据。在48hr计数穿过Transwell板的膜的HUVEC数目，并与培养基+EGF对照比较。

图11描述了给予冻干或灭菌的微血管组织后第0天及第7和14天，与股动脉横切后流向小鼠后肢的血流恢复相关的数据。

图12描述了单独的基质胶或联合冻干或灭菌的微血管组织注射后，与SCID小鼠中新的血管的生成相关的数据。

图13A-13C涉及植入微血管组织后骨的再生。图13A描述了给予有或无微血管组织的支架后，与强度、弹性系数和韧度(相比对照对侧骨)相关的数据。图13B描述了仅给予支架后关于骨再生的组织学数据。图13C描述了联合微血管组织给予支架后关于骨再生的组织学数据。

图14A-14H涉及植入微血管组织后的软骨再生。图14A显示了仅以支架处理的软骨的宏观图像，而图14B、14C和14D显示了与仅以支架处理软骨中诱导的的软骨缺陷的填充、蛋白聚糖截留和基质染色(分别地)相关的图像。图14E显示了以补充有微血管组织的支架处理的软骨的宏观图像，而图14F、14G和14H显示了与以补充有微血管组织的支架处理的软骨中诱导的软骨缺陷的填充、蛋白聚糖截留和基质染色(分别地)相关的图像。

图15A-15F涉及使用微血管组织修复磨损的腱。图15A和15B分别描述了磨损的和未处理的腱的马森三色染色或腱生蛋白免疫组织化学。图15C和15D分别描述了仅以支架处理的磨损的腱的马森三色染色或腱生蛋白免疫组织化学。图15E和15F分别描述了以补充有微血管组织的支架处理的磨损的腱的马森三色染色或腱生蛋白免疫组织化学。

详述

本发明部分基于开发新的用于处理微血管组织以制备包含分离的多能细胞或经处理的微血管组织，或者由所述细胞或组织组成的细胞膜的组合物的方法。在多个实施方案中，所述细胞或组织在这些过程中未经培养。有利地，所述组合物具有血管生成活性或抗炎活性。在几个实施方案中，所述组合物在该过程中经灭菌和/或所述组合物中的病毒被灭活，而所述组合物仍然显示意料不到的疗效。

通过本发明的方法制备的新的组合物提供了超过先前的经处理的微血管组织和多能细胞组合物的优势，包括与治疗或预防个体的损伤，例如软组织损伤相关的优势。这些优势包括(但不限于)：(1)将本发明的组合物用于个体的同种异体或异种治疗的能力；(2)本发明的组合物产生了减少的免疫反应和降低的排斥可能性；(3)本发明的组合物具有抗炎活性；(4)本发明的组合物具有血管生成活性；(5)本发明的组合物是无菌的，和/或未被有害的病毒污染；以及(6)本发明的组合物在使用前可被稳定储藏和/或准备好立即使用。简而言之，这些组合物方便地提供了活干细胞或多能细胞制剂常规上固有的所有作用机制，除了分化为组织之外。在以下描述中，描述了某些具体的细节以提供对本发明的不同实施方案的充分理解。然而，本领域技术人员理解本发明可在没有这些细节下实施。

定义

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。为了本发明的目的，以下术语定义如下。

词语“一个(a)”和“一个(an)”是指一个或多个，除非另有说明。

“约”是指与参照数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度差异多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在与术语“约”联合使用的数值的上下文中论述的任何实施方案中，具体而言，预期术语约可以省略。

除非上下文另有要求，在整个本说明书和权利要求中，词语“包括(comprise)”及其变形如“包括(comprises/comprising)”应理解为开放、包括性含义，即“包括但不限于”。

“由…组成”意在包括并且限于短语“由…组成”后的内容。因此，短语“由…组成”是指所列的元素为必需的或强制性的，并且不可以存在其他元素。

“基本上由…组成”是指包括该短语后所列的任何元素，并且限于不干扰或有助于本公开中针对所列的元素明确的活性或作用的其他元素。因此，短语“基本上由…组成”是指所列的元素为必需的或强制性的，但其他元素是可选的，并且基于它们是否影响所列的元素的活性或作用而可以存在或不存在。

在整个本说明书中提及“一个实施方案”或“实施方案”是指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书的不同地方中出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”并不一定都指相同的实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以任何合适的方式组合在一个或多个实施方案中。

如本文所用，术语“功能”和“功能的”等是指生物学、酶促或治疗功能。

“增加的”或“提升的”量通常为“统计上显著的”量，并且可包括本文所述的量或水平的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括其间的且大于1的所有整数和小数，例如2.1、2.2、2.3、2.4倍等)的增加。

“减少的”或“降低的”或“较少的”量通常为“统计上显著的”量，并且可包括本文所述的量或水平的约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括其间的且大于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8倍等)的降低。

“获自”是指样品如细胞或组织分离自或来源于特定来源，如期望的生物体或期望的生物体中的特定组织。

如本文所用，术语“分离的”，例如，结合多能细胞，是指从其天然环境去除的。例如，如果细胞与其天然环境中的一些或所有共存物质分开，则其为分离的。

如本文所用的术语“经处理的微血管组织”是指按本文所述解离的微血管组织。

如本文所用的术语“冻存”是指例如在低温下冷冻的多能细胞或经处理的微血管组织组合物。经处理的微血管组织及冻存的多能细胞和微血管组织组合物具有多种生物学特性，包括抗炎活性和血管生成活性。

“多能细胞”是指保留了分化为两种或更多种不同的特化细胞类型的能力的细胞。“多能细胞”包括干细胞和多能祖细胞。如本文所用，术语“多能细胞”是指在其被根据本文所述的方法灭菌或保藏前，细胞分化为两种或更多种不同的特化细胞类型的原始能力。多能细胞的实例包括但不限于间质干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞、内皮祖细胞、脂肪来源的干细胞和脐带干细胞。应理解在根据本文所述的方法灭菌或保藏后，多能细胞可丧失其生长或分化的能力。

“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于经美国食品和药品管理局批准可接受用于人或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。

“药物组合物”是指本发明的组合物和本领域通常接受用于递送治疗剂至哺乳动物如人的介质的制剂。这样的介质因此包括任何药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

如本文所用，除非上下文明确并非如此，“治疗(treatment)”和类似的词语如“治疗(treated)”、“治疗(treating)”等是指获得有利或所需的结果包括临床结果的方法。治疗任选可包括减少或改善损伤、疾病或病况的症状，或者延迟损伤、疾病或病况的进展。在一些实施方案中，给予本文所述的组合物治疗一种或多种这样的症状。

如本文所用，除非上下文明确并非如此，“预防(prevention)”和类似的词语如“预防(prevented)”、“预防(preventing)”等是指预防、抑制或减少损伤、疾病或病况的发作或复发可能性的方法。其还指预防、抑制或减少损伤、疾病或病况的一种或多种症状的发生或复发的可能性，或者任选地延迟损伤、疾病或病况的发作或复发，或者延迟损伤、疾病或病况的一种或多种症状的发生或复发的方法。如本文所用，“预防”及类似词语也包括降低损伤、疾病或病况的强度、影响、症状和/或负荷。

如本文所用，组合物的“有效量”或“治疗有效量”为足以影响期望的生物效应如有利的临床结果的量。

术语“自体转移”、“自体移植”等是指这样的治疗，其中组织供体也为从组织制备的组合物的受体。

术语“同种异体转移”、“同种异体移植”等是指这样的治疗，其中组织供体与从所述组织制备的组合物的受体为相同的物种，但为不同的个体。

术语“异种转移”、“异种移植”等是指这样的治疗，其中组织供体为不同于从所述组织制备的组合物的受体的物种。

制备干细胞和微血管组织组合物的方法

本发明的方面涉及处理血管如微血管、组织以制备包含多能细胞或其碎片的组合物的新的方法。在特定的实施方案中，所述组合物还包含一种或多种另外的组织组分。因此，术语“经处理的微血管组织组合物”是指本发明的组合物，其可以包含或可以不包含完整的多能细胞。在特定的实施方案中，本发明的微血管组织组合物不包含任何完整的多能细胞，或者不包含任何活的多能细胞，或者不包含任何活细胞。在某些实施方案中，本发明的微血管组织组合物包含多能细胞的碎片或细胞膜。本发明的“包含多能细胞的组合物”或“多能细胞组合物”可包含活的和/或死的多能细胞。

几个实施方案提供了用于制备多能细胞和微血管组织组合物，包括可用于治疗和预防多种损伤、疾病或病理状况如软组织损伤的那些的新的方法。在特定的实施方案中，本发明的方法包括将分离的多能细胞或微血管组织组合物灭菌，和/或将所述细胞或组织中的病毒灭活。令人吃惊且预期不到的是，发现这类灭菌的多能细胞和微血管组织组合物保留有期望的生物性能，包括可用于治疗或预防损伤、疾病和其他病理状况的性能。

可从任何哺乳动物组织，如获自哺乳动物如人、非人的灵长类、狗、猫或马的组织，制备本发明的多能细胞和微血管组织组合物。本发明的组合物可用于治疗自体、同种异体或异种个体。因此，组织可获自待治疗的个体，或来自不同的供体动物，其可为与待治疗的个体相同或不同的物种。在特定的实施方案中，所述组织获自与待治疗的个体如人或非人的哺乳动物供体相同的物种的同种异体供体。在特定的实施方案中，供体动物为健康的供体。

在多个实施方案中，从多种不同组织中的任何一种制备了多能细胞或微血管组织组合物。在特定的实施方案中，所述组织为非胚胎组织。例如，在特定的实施方案中，用于制备本发明的组合物的组织为血管组织或微血管组织，如脂肪组织、皮肤、骨、腱组织、产后组织(例如，脐带组织或胎盘组织)、骨髓或肌肉组织。

在某些实施方案中，可通过这样的方法制备本发明的组合物，其包括：解离组织样品以释放细胞和/或其他组织组分；使所释放的细胞和/或组织组分的至少一部分与一种或多种其他的组织组分分离；以及将所分离的细胞和/或组织组分灭菌，和/或处理所分离的细胞和/或组织组分以将其中的病毒灭活。在某些实施方案中，所分离的细胞和/或组织组分在灭菌或处理以灭活病毒之前、期间或之后经干燥、冻干、冷冻或冻存。在特定的实施方案中，所分离的细胞和/或组织组分在干燥、冻干、冷冻或冻存之后经灭菌或处理以灭活病毒。在相关的实施方案中，所分离的细胞和/或组织组分在与冷冻保护剂如保护细胞免受灭菌辐射的冷冻保护剂接触之后经灭菌或处理以灭活病毒。冷冻保护剂可通过稳定蛋白、淬灭自由基和抗氧化而保护细胞组分。可通过在辐射期间冷却组合物、从组合物去除氧(例如，干燥组合物和/或在真空下或惰性气氛中照射)，来进一步将损伤减至最小。

在相关的实施方案中，本发明的方法包括：解离获自供体哺乳动物的组织样品以释放其中的多种多能细胞；使多种所释放的多能细胞与一种或多种其他的组织组分分离以制备包含分离的多能细胞的组合物；以及将包含分离的多能细胞的组合物灭菌和/或将包含分离的多能细胞的组合物中存在的病毒灭活。在特定的实施方案中，包含多能细胞的组合物在灭菌或处理以灭活病毒之前、期间或之后经干燥、冻干、冷冻或冻存。在特定的实施方案中，所分离的细胞和/或组织组分在干燥、冻干、冷冻或冻存之后经灭菌或处理以灭活病毒。在相关的实施方案中，所分离的细胞和/或组织组分在与冷冻保护剂如保护细胞免于灭菌辐射的冷冻保护剂接触之后经灭菌或处理以灭活病毒。

在其他相关的实施方案中，本发明的方法包括：解离获自供体哺乳动物的组织样品以释放其中的多种组织组分；分离多种所释放的组织组分以制备包含一种或多种组织组分的组合物；以及将所述组合物灭菌和/或将组合物中存在的病毒灭活。在特定的实施方案中，所述组合物在灭菌或处理以灭活病毒之前、期间或之后经干燥、冻干、冷冻或冻存。在特定的实施方案中，所分离的细胞和/或组织组分在干燥、冻干、冷冻或冻存之后经灭菌或处理以灭活病毒。在相关的实施方案中，所分离的细胞和/或组织组分在与冷冻保护剂如保护细胞免于灭菌辐射的冷冻保护剂接触之后经灭菌或处理以灭活病毒。

在某些实施方案中，组织组分包含一种或多种多能细胞、分化的细胞、细胞外基质组分、生长因子、血管生成剂、抗炎剂、细胞因子、趋化因子和/或分化剂的组合物。细胞外基质组分包括但不限于细胞外基质蛋白，如各种胶原、纤连蛋白、玻连蛋白和血小板反应蛋白，以及本文所述的其他物质。

组织样品可通过多种不同的方法，包括手术、吸脂、组织活检或穿刺活检获自个体或供体。供体可为活的或死的，如刚死亡的。

可通过多种方法，包括机械和/或酶促处理解离组织。例如，可通过机械力(切力或剪力)、用单一的或组合的蛋白水解酶，如基质金属蛋白酶和/或中性蛋白酶如胶原酶、胰蛋白酶、分散酶、LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,Ind.)、透明质酸酶和/或胃蛋白酶的酶消化，或者机械和酶促方法的组合来解离组织。在特定的实施方案中，本发明的方法不采用胶原酶。

在某些实施方案中，酶消化方法采用酶的组合，如基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合。在特定的实施方案中，基质金属蛋白酶可为胶原酶，并且中性蛋白酶可为嗜热菌蛋白酶或分散酶。胶原酶可为1、2、3或4型(MMP 1、8、13、18)。在特定的实施方案中，酶消化方法采用基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和用于消化透明质酸的粘液溶解酶的组合，如胶原酶、分散酶和透明质酸酶的组合，或LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,Ind.)和透明质酸酶的组合。本领域已知的用于细胞解离的其他酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶、明胶酶或弹性酶，其可独立使用或与其他的酶如基质金属蛋白酶、粘液溶解酶和中性蛋白酶组合使用。在某些实施方案中，酶的组合包括1型胶原酶与分散酶或嗜热菌蛋白酶、释放酶和/或Vitacyte或由1型胶原酶与分散酶或嗜热菌蛋白酶、释放酶和/或Vitacyte组成。在某些实施方案中，酶的组合包括1型胶原酶与分散酶或嗜热菌蛋白酶、释放酶和/或Cizyme或由1型胶原酶与分散酶或嗜热菌蛋白酶、释放酶和/或Cizyme组成。在特定的实施方案中，胶原酶未单独或与一种或多种另外的酶组合使用。在某些实施方案中，使用了MMP 2和/或14而非MMP 1(单独地或在本文所述的任何组合中)。

组织或细胞与蛋白酶接触以实现解离的温度和时段是已知的，并且可被本领域技术人员容易地确定。可调整酶消化过程以增加或减少细胞解离。例如，如果需要更完全的细胞解离，可包含多于一种酶或者可增加消化时间。虽然不需要维持细胞活力，在一些实施方案中，通常可取的是，细胞膜通常保持完整以维持包含膜的附着和信号传导分子，即使在酶消化期间发生一些细胞溶解。因此，根据本发明的一个实施方案，诸如脂肪酶的酶的使用在这样的过程中可能是无用的。

可选地，或者除酶处理外，可使用非酶促方法解离组织。例如，可使用物理或化学方法，包括使用螯合剂、超声搅拌、超声波(例如，以溶解或去除脂肪细胞)或者机械细胞解离，来解离组织。

在其中组织为骨的特定实施方案中，骨在酶(或其他)处理前被脱矿以从胶原基质释放细胞。在特定的实施方案中，使用EDTA(与用溶剂将组织脱脂，然后通过酸去除骨盐形成对比)将骨脱矿。在某些实施方案中，处理组织如骨的方法不包括以下的一种或多种：溶剂抽提脂肪和/或细胞、冷冻碾磨以减小颗粒大小，和/或酸脱矿。

在组织解离后，可进一步处理所解离的组织，以使所需的组织组分如多能细胞(和/或其他需要的细胞或非细胞组织组分)与不需要的组织组分分离或分开。这些方法可用于，例如去除不需要的细胞或分子，如红细胞、脂肪细胞、其他分化的细胞或脂质。多种方法可用于从不需要的细胞或组织组分分离多能细胞和其他需要的组织组分，例如过滤(如20微米孔径的过滤器将通过多能细胞而截留许多脂肪细胞或肌肉细胞)、离心(脂肪细胞和脂肪漂浮，而多能细胞成团)，或密度梯度(可使用梯度来使红细胞成团以及以不同于不需要的细胞的水平悬浮多能细胞)。使用的特定的方法可部分基于待处理组织的来源。例如，如果组织来源为脂肪组织，解离的组织被任选地以相对小的力离心以从微血管组织的其他组分分离脂质、脂肪细胞和一些前脂肪细胞，而在从骨髓分离多能细胞时任选使用密度梯度。在其他实施方案中，肌肉细胞分离方案如使用密度梯度离心，可用于在酶消化后进一步处理肌肉组织以去除肌肉细胞和富集所需的细胞。

在某些实施方案中，还过滤本发明的组合物，例如，以去除团块。例如，在制备用于静脉内注射的组合物期间可以进行，例如以20-50微米孔径的过滤器过滤以去除大的团块，从而避免毛细血管堵塞。在特定的实施方案中，在解离之后和使用之前，例如，在解离之后和在冻干或灭菌之前进行过滤。

基于实施方案，多能细胞组合物和微血管组织组合物任选经冷冻或干燥以储藏或保藏，例如，干燥(如冷冻干燥或喷雾干燥)、冻存或冷冻。在保藏本发明的组合物时可使用任何合适的赋形剂，包括糖(例如海藻糖、甘露醇、蔗糖)、多元醇(例如，聚乙二醇)、醛、蛋白(例如，白蛋白)、氨基酸(例如，甘氨酸)、表面活性剂(例如，Tween 20)、DMSO，和/或高锰酸盐。在几个实施方案中，未使用赋形剂。

可通过几种方法保护细胞及其活性组分部分免受电离辐射损伤。抗氧化剂或自由基清除剂可能是非常有效的。用于冻干法的固定大分子如糖的试剂和干燥过程本身增加了破坏的链以其原始化学结构重组的可能性。去除水、空气和其他氧来源会减少蛋白或其他生物活性物质的氧化。在辐射期间冷冻组合物还降低了切割的分子不恰当重组的可能性。最后，赋形剂相比细胞或细胞中的活性分子的大得多的浓度意味着将存在较少的活性化合物切割，这仅仅是由于质量作用效应。

冷冻干燥(例如，冻干)通常包括4个步骤：预处理、冷冻、初次干燥和二次干燥。预处理可包括浓度调整或者添加一种或多种赋形剂。在预处理后，冷冻多能细胞或微血管组织组合物。冷冻步骤通常以仔细受控的方式进行(例如，以约-0.5℃/分钟至约-50℃/分钟的冷却速率)，以维持细胞结构，然而不需要维持细胞活力。在一些实施方案中，多能细胞或微血管组织组合物以约-10℃/分钟的冷却速率冷冻。可基于使用的特定细胞或组织和赋形剂调整冷却速率。可使用任何合适的方式，包括使用机械制冷和/或暴露包含组合物的容器至干冰或液氮，直到其达到适合冷冻干燥的温度，来冷冻多能细胞或微血管组织组合物。在初次干燥步骤中，调整温度和压力以提供适合造成来自多能细胞或微血管组织的水升华的条件。可调整具体温度和压力以接纳所用的赋形剂和/或细胞或微血管组织的浓度。在二次干燥步骤中，可进一步调整温度和压力以促进来自多能细胞或微血管组织的未冷冻的水的去除。二次干燥步骤后的最终水含量优选为约1％至约4％重量比(包括约1％至约2％，约2％至约3％，约3％至约4％，约4％至约5％，以及以上范围的重叠范围)，但可以调整以将保质期或生物活性最大化。

在一些实施方案中，多能细胞或微血管组织组合物经喷雾干燥。在喷雾干燥前，可类似待冷冻干燥的多能细胞或微血管组织组合物，预处理多能细胞或微血管组织组合物，使用按喷雾干燥而非冷冻干燥需要选择的赋形剂。在喷雾干燥期间，多能细胞或微血管组织被雾化为小滴并在干燥室中暴露至加热的空气。在一个实施方案中，赋形剂为在所用的温度下不融化的糖。在特定的实施方案中，赋形剂为抗氧化剂如BHA、BHT和没食子酸丙酯。

在一些实施方案中，多能细胞和微血管组织组合物未经干燥处理，但被冻存。冻存细胞和组织的方法是已知的。例如，细胞或微血管组织组合物可与一种或多种赋形剂或者冷冻保护剂(例如，DMSO、PEG、白蛋白或糖)混合，并以仔细受控的方式冷却。在一些实施方案中，在两个或更多个阶段中进行冷却，其中第一个阶段以受控的方式进行(例如，每分钟降低温度1℃)至中间温度(例如，-30℃)，第二个阶段在中间温度下转移细胞或组织至较冷的储藏温度(例如，-196℃)。

可在适合维持冻存状态的温度下(例如，约-30℃至-196℃)，储藏冻存的多能细胞和血管组织组合物。可在相比冻存的细胞、活细胞或新鲜组织更宽的多种条件下储藏冷冻干燥或喷雾干燥处理的细胞或微血管组织。储藏经处理的细胞或微血管组织的合适的温度包括约-100℃至约45℃的温度。在一些实施方案中，冷冻干燥或喷雾干燥处理的细胞或微血管组织可储藏在室温下。

在多个实施方案中，所提供的经处理的细胞或微血管组织的有效期为至少约1周、至少约1个月、至少约2个月、至少约6个月，或更长，同时保留一种或多种生物活性。在特定的实施方案中，所述组合物在储藏于约4℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约4个月、至少约6个月或至少1年时保留可测量的血管生成活性或抗炎活性。在本文所述的试剂盒和组合物的特定的实施方案中，所述组合物在储藏于约-20℃下至少约1个月、至少约2个月、至少约4个月、至少约6个月或至少约1年时保留可测量的血管生成活性或抗炎活性。在特定的实施方案中，当在体内或体外测定中测量时(包括本文所述的那些中的任何一种)，所述可测量的血管生成活性或抗炎活性为储藏前活性的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。

解离的组织或细胞和从中分离的其他组织组分，包括产生的组合物，任选被灭菌，例如以减少或消除微生物如细菌、病毒和真菌或朊病毒的污染。在特定的实施方案中，使用辐射将包含多能细胞和/或其他组织组分的组合物灭菌。灭菌的方法存在使用诸如电子束、X-射线、γ-射线或紫外辐射的辐射。在特定的实施方案中，通过将解离的组织或细胞和从中分离的其他组织组分暴露于约0.5至约5.0Mrad，或约1.0至约3.0Mrad，或约1.0Mrad，或约1.5Mrad，或约2.0Mrad，或约2.5Mrad，或约3.0Mrad，或约3.5Mrad，或约4.0Mrad，或约4.5Mrad，或约5.0Mrad范围剂量的γ辐射(或那些值间的任意量的γ辐射)，来进行灭菌。在特定的实施方案中，通过将解离的组织或细胞和从中分离的其他组织组分暴露于约0.5至约5.0Mrad，或约1.0至约3.0Mrad，或约1.0Mrad，或约1.5Mrad，或约2.0Mrad，或约2.5Mrad，或约3.0Mrad，或约3.5Mrad，或约4.0Mrad，或约4.5Mrad，或约5.0Mrad范围剂量的电子束辐射(或那些值之间的任意量的γ辐射)，来进行灭菌。通常易于测量组合物所暴露的辐射量。在特定的实施方案中，用于灭菌的电子束或γ辐射水平为约9至约30kGy，或约20至约30kGy，或约9至约17kGy(或那些值之间的任意量的辐射)。另外，解离的组织或细胞和从中分离的其他组织组分，可被处理以灭活病毒。灭活病毒的方法为本领域已知，包括使用辐射，如上文针对灭菌所述的。可使用其他灭活病毒的方法，包括酸或碱处理、漂白剂、醛或氧化乙烯溶液，或加热。应理解用于冻干或冷冻组合物的冷冻保护剂和其他赋形剂也可防止辐射。例如，糖和白蛋白(或其他稳定蛋白)以及低温保护细胞免受辐射损伤。因此，在特定的实施方案中，在冻干后进行灭菌和病毒灭活。

另外，因为活力不为用于治疗应用的经处理的或冻存的多能细胞或微血管组织组合物的适用性所需要，不需要调整保藏方法和储藏来维持活力。处理、灭菌或冻存之前活细胞在提供的多能细胞或微血管组织组合物中的百分比可多达100％。在处理、灭菌或冻存后，其可为小于约50％，例如小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％或小于约1％。在一些实施方案中，在处理、灭菌或冻存后，提供的经处理的多能细胞或微血管组织组合物不包含活细胞。在几个实施方案中，经处理或冻存的多能细胞或微血管组织组合物被用于例如软组织的治疗修复和/或再生。在另外的实施方案中，经处理或冻存的多能细胞或微血管组织组合物被用于硬组织的治疗修复和/或再生。

此外，为了减少微生物污染的可能性，可在组织获取或处理前针对预定的微生物名单(例如，HIV、HPV、EBV、TB等)筛选供体。可使用已知的技术，如使用聚合酶链式反应检测微生物核酸的存在或通过ELISA检测与特定微生物相关的分子的存在，来进行筛选。可根据本发明的一些实施方案将微生物污染的微血管组织排除使用。另外，可使用防腐或无菌技术制备经处理的或冻存的组织。

在特定的实施方案中，本发明的方法不包括培养所解离的细胞或微血管组织。

分离的干细胞和微血管组织组合物

本发明的方法产生独特的多能细胞和微血管组织组合物。在几个实施方案中，本文提供的多能细胞和微血管组织组合物包含经最低程度处理的、未经培养的细胞或未经培养的微血管组织(或其组分)，其可包含从解离(例如，通过酶消化)微血管组织(例如，脂肪、腱或肌肉组织)制备的干细胞和/或祖细胞的混合物。经处理的多能细胞和微血管组织组合物可包含另外的分子(例如，完整或片段化的细胞外基质分子或生长因子)。另外，基于实施方案，经处理的多能细胞和微血管组织组合物可包含多能细胞的碎片或膜。此外，经处理的微血管组织可以包含或可以不包含完整的多能细胞。

如上所述，本发明的方法可用于制备组合物，其包含单独的或与一种或多种另外的细胞类型和/或其他组分组合的多能细胞或经处理的微血管组织。

在特定的实施方案中，所述另外的细胞类型为基质、上皮或血液来源的细胞，包括但不限于成纤维细胞、包括滤泡外根鞘细胞的角质细胞、内皮细胞、周细胞、红细胞、单核细胞、包括浆细胞的淋巴细胞、中性粒细胞、血小板、肥大细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、肝细胞、神经细胞和神经胶质细胞、骨细胞以及成骨细胞。

在特定的实施方案中，所述另外的组织组分为细胞外基质组分。细胞外基质包括不同的组分如糖蛋白、蛋白聚糖、复合糖和其他分子。细胞外基质可包含多种不同蛋白中的任何一种，包括各种胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、玻连蛋白、血小板反应蛋白、腱生蛋白(细胞肌动蛋白)、巢蛋白(nidogen)、骨粘连蛋白(SPARC)、锚定蛋白CII、软骨粘连蛋白、连接蛋白、骨钙素、骨唾液蛋白、骨调素、表粘连蛋白(epinectin)、透明质蛋白(hyaluronectin)、类淀粉白蛋白P组分、原纤蛋白、分区蛋白(merosin)、s-层粘连蛋白、粗纤维调节素(undulin)、表皮整联配体蛋白(epilligrin)、僵蛋白(kalinin)、纤维蛋白、纤维蛋白原和HSP。

在相关的实施方案中，所述另外的组织组分包括生长因子、血管生成剂、抗炎剂、细胞因子或分化剂。例如，生长因子或血管生成剂可选自碱性成纤维细胞生长因子、其他的成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白、肝细胞生长因子、角质细胞生长因子、粒细胞巨噬细胞簇刺激因子、血小板来源的生长因子、转化生长因子β1和/或β3、血管内皮细胞生长因子。可使用的另外的生长因子和生长因子类型或家族包括表15中列出的那些中的任何一种，其也包括某些生长因子的代表性生物活性。

在特定的实施方案中，本发明的组合物不包含或基本上不包含脂肪组织、骨盐、肌肉细胞和/或血细胞，例如，这些细胞类型中的一种或多种或骨盐在处理期间被从组合物去除。这可增加组合物中与微血管相关的细胞的浓度。在特定的实施方案中，本发明的组合物包含DNA或大量的DNA，例如，在处理期间未从组合物去除DNA，例如，未对组织脱细胞，并且未洗除DNA。在特定的实施方案中，本发明的组合物为细胞和/或组织组分的水溶性悬液。在某些实施方案中，本发明的组合物单独不包含结构支架或基质，如皮或腱移植物。在特定的实施方案中，可使用微血管组织如皮肤、脐带或骨(其经处理以从基质释放细胞)制备本发明的组合物。

在特定的实施方案中，本发明的组合物具有一种或多种生物活性。例如，在某些实施方案中，组合物具有抗炎活性或血管生成活性。在某些相关的实施方案中，组合物促进血管形成或组织愈合。在几个实施方案中实现了这些效应的组合。

在某些实施方案中，本发明的组合物具有抗炎活性。在特定的实施方案中，暴露至本发明的组合物或与本发明的组合物接触的损伤的或患病的组织(例如，经历炎症反应的损伤的或患病的组织)，相比损伤的或患病的组织经类似处理但未暴露至本发明的组合物或未与本发明的组合物接触时，展现减少的炎症。在某些实施方案中，相比损伤的或患病的组织未暴露至本发明的组合物或未与本发明的组合物接触时的炎症的量，暴露至本发明的组合物或与本发明的组合物接触的组织中的炎症的量减少了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。可通过本领域可用的方式，包括例如经组织学观察时在受累组织中观察到的淋巴细胞数，来测量炎症。

在特定的实施方案中，本发明的组合物具有抗炎活性，其可在体外测定中测量。在某些实施方案中，在本发明的组合物的存在下，在体外测定中测得的炎症的量比在本发明的组合物不存在下或在对照组合物存在下在相同的测定中测得的炎症的量小至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在特定的实施方案中，体外测定为混合淋巴细胞反应。

在某些实施方案中，本发明的组合物具有血管生成活性。在特定的实施方案中，暴露于本发明的组合物或与本发明的组合物接触的损伤的或患病的组织(例如，经历炎症反应的损伤的或患病的组织)，相比损伤的或患病的组织经类似处理但未暴露至本发明的组合物或未与本发明的组合物接触时，展现增加的血管生成。在某些实施方案中，暴露至本发明的组合物或与本发明的组合物接触的组织中血管生成的量，相比损伤的或患病的组织未暴露至本发明的组合物或未与本发明的组合物接触时血管生成的量增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约300％、至少约400％或至少约500％。可通过本领域可用的方式，包括例如本文所述的下肢缺血模型，来测量血管生成。

在特定的实施方案中，本发明的组合物具有血管生成活性，其可以在体内或体外测定中测量。在某些实施方案中，在本发明的组合物存在下，在体外血管生成测定中测得的活性的量比在本发明的组合物不存在下或在对照组合物存在下在相同测定中测得的活性的量大至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约300％、至少约400％或至少约500％。在特定的实施方案中，体内测定为基质胶测定，如实施例4中所述。在特定的实施方案中，体外测定为本文所述的内皮细胞迁移测定。

在某些实施方案中，本发明的组合物促进损伤的或患病的组织的愈合；即，其具有组织愈合活性。如本文所用，组合物的“组织愈合活性”是相比经类似处理但未暴露至该组合物的相似组织，该组合物促进暴露至该组合物的损伤的或患病的组织(例如，硬或软组织)的改善的愈合(例如，修复或再生)的能力。可使用任何合适的方式测量改善的愈合，如完全愈合的时间、新组织生成的量、产生的愈合组织的强度或产生的愈合组织的功能。

由于以自体干细胞产生新的软组织的困难、同种异体和异种干细胞会被排斥的认知以及经灭菌或病毒灭活的细胞将具有降低的活力并因此具有降低的生物或治疗活性的先验信念，经灭菌或病毒灭活的同种异体和异种多能细胞与经处理的微血管组织组合物先前尚未被用于促进软组织如韧带和腱的修复。然而，本文描述的方法和组合物未必依赖于纯化的干细胞或细胞活力。相反，所提供的方法被用于制备包含细胞(包括非活细胞、间质干细胞和祖细胞)混合物，以及此类细胞分泌的其他分子(例如，细胞因子、生长因子、趋化性分子等)的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含活细胞和非活细胞的混合物。

在特定的实施方案中，本发明的组合物中存在的小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％或小于约5％的细胞是活的。在几个实施方案中，几乎所有的细胞都不是活的。如本文所用，术语“活的”应以其普通含义理解，并且还应指在合适的条件下培养时能够增殖的细胞，所述合适的条件例如，在所述条件下，相同的细胞或相同类型的细胞例如如果未按本文所述处理预期将会增殖。在其他实施方案中，所述组合物中存在的小于约2％或小于约1％的细胞是活的。在特定的实施方案中，组合物中存在的细胞都不是或基本上都不是活的。因此，术语“非活的”是指细胞在合适的条件下培养时不能够增殖，所述合适的条件例如，在所述条件下，相同的细胞例如未按本文所述处理预期将会增殖。

然而，在特定的实施方案中，本发明的组合物中的至少一些细胞排斥台盼蓝。在特定的实施方案中，组合物中存在的至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞排斥台盼蓝。

在某些实施方案中，本发明的组合物包含排斥台盼蓝但不是活的的细胞。在某些实施方案中，组合物中存在的至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约20％或至少约50％的细胞排斥台盼蓝但不是活的。

应理解，根据本发明，尽管本文所述的组合物中的细胞可能不是活的，并且在移植至个体中后可能不会长时间存活，但组合物引发了个体中的级联反应，其引起改善的愈合、减少的炎症或增加的血管生成。本文所述的多能细胞和经处理的微血管组织组合物不需要包含活的或完整干细胞来促进或诱导损伤的或患病的组织如软组织的愈合。另外，本发明的组合物可包含经处理的组织及其不同的组分，包括用于制备所述组合物的组织样品中存在的或与其相关的解离的组织、细胞如多能细胞(例如，干细胞)、细胞膜、细胞外基质组分和不同的生长因子、血管生成因子、抗炎剂、细胞因子、分化试剂等。

为了将本发明的组合物给予至有需要的个体的目的，所述组合物可被配制为药物组合物。本发明的药物组合物包含本发明的组合物以及药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂。本发明的组合物以足以产生有需要的个体的损伤、疾病或病症的治疗或预防的量，即以治疗有效量存在于药物组合物中。

药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂为本领域技术人员所熟悉。对于配制为液体溶液的组合物，可接受的载体和/或稀释剂包括盐水和无菌水，并且可任选包括抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和其他常见的添加剂。本发明的药物组合物通过将本发明的组合物与合适的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合而制备，并且可被配制成固体、半固体、液体或气态形式的制剂，如粉末、颗粒、溶液、注射剂、吸入剂、微球体和气溶胶。这些组合物还可包含分散剂和表面活性剂、粘合剂以及润滑剂。本领域技术人员还可以合适的方式，以及根据认可惯例，如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Gennaro,Ed.,MackPublishing Co.,Easton,PA1990中公开的那些，配制本发明的组合物。

给予本发明的药物组合物的途径包括但不限于局部、肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、经口、经鼻、移植、植入、注射、经导管递送、局部、经皮、吸入、肠胃外和鼻内。如本文所用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。另外，本发明的组合物可经手术植入、注射、递送(例如，通过导管或注射器)，或者直接或间接给予至需要修复或增加的位点。例如，可将本发明的组合物经手术引入至个体的损伤或疾病位点或其附近。在一些实施方案中，给药为静脉内的。药物组合物可经配制用于特定给药途径。在特定的实施方案中，所述方法为手术用于组织修复、静脉输注用于治疗缺血、注射入关节间隙以治疗疼痛和炎症、注射入伤口和注射入肌肉用于治疗外周血管疾病。

在某些实施方案中，本发明的组合物经配制用于静脉内给药。在某些实施方案中，经配制用于静脉内给药的组合物经过滤以减少可潜在阻碍毛细血管或其他血管的大颗粒或团块。在特定的实施方案中，经配制用于静脉内给药的组合物任选为等渗的，具有约5.0至约9.0范围的pH(例如约7.3)、约50至约600的渗透压，和/或小于或等于约600mOsm/L的渗透压，例如约290mOsm/L。

植入物、基质和支架

在某些实施方案中，本发明的组合物与植入物、基质或支架组合。基质可包括生物相容的支架、格架(lattices)、自组装结构等。这样的基质为基于细胞的治疗、手术修复、组织改造和伤口愈合领域已知。可以用本发明的组合物预处理(例如，种植、接种、接触)基质。在本发明的一些方面，组合物中存在的细胞和/或组织组分粘附至基质。在一些实施方案中，细胞容纳于基质内或桥接基质的间隙。在特定的实施方案中，细胞和/或其他组织组分与基质紧密结合，并且当用于治疗时，诱导或支持个体细胞的向内生长和/或血管生成。

可以本领域已知的任何方式将与本发明的组合物相关的基质或包含本发明的组合物的基质引入至个体身体，包括但不限于植入、注射、手术连接、与其他组织一起移植等。可在提供给或植入至个体中前，将本发明的组合物与植入物、基质或支架组合，或者可将本发明的组合物与个体中已经存在的植入物、基质或支架组合。植入物、基质或支架可提供这样的物理结构，其能将组合物保留在个体或其中的组织内的期望位置，保护个体中的组合物，和/或允许组合物以所需速率或在所需时间段内释放。

在几个实施方案中使用的基质可被配置为体内组织或器官的形状和/或大小。如本文所述，本发明的支架可为平的或管型的，或者可以包含其部分。本发明的支架可为多层的。

在特定的实施方案中，植入物、基质或支架为生物相容的植入物、基质或支架。植入物、基质或支架可包含固体或液体。植入物、基质或支架可为可生物降解的。在特定的实施方案中，植入物、基质或支架包括微珠或颗粒、来源于骨的植入物、生物纤维支架(例如，BioFiber^TM支架)、多孔的可吸收聚合物、水凝胶、包含组织产品的油灰、或缝线或可植入的医疗装置。植入物、基质或支架可为例如：胶原基质或生物相容的织物；整形植入物；多孔的柔性可植入支架；手术植入物；多孔的经包被的植入物；聚合物溶液；溶剂如DMSO、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和醇类；水凝胶；透明质酸或其他葡糖氨基葡聚糖或蛋白聚糖；胶原；纤维蛋白；凝血酶；血块；血小板；富含血小板血浆；脱矿的骨基质；自体细胞；和/或松质骨。

本发明的组合物可悬浮在水凝胶溶液中，例如，用于注射。合适的水凝胶的实例包括自组装的肽如RAD16。可选地，可在植入前允许包含细胞的水凝胶溶液硬化从而形成其中分散有细胞的基质。水凝胶可为有机聚合物(天然的或合成的)，其通过共价键、离子键或氢键交联从而产生能捕获水分子以形成凝胶的三维开放晶格结构。可用于形成水凝胶的物质的实例包括多糖如藻朊酸及其盐、肽、多聚膦嗪和聚丙烯酸酯(其经离子交联)，或嵌段聚合物如聚氧化乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物(其分别通过温度或pH交联)。

在特定的实施方案中，本发明的组合物与生物相容的植入物、基质或支架结合、本发明的组合物包含在生物相容的植入物、基质或支架中、本发明的组合物被施用至生物相容的植入物、基质或支架或，本发明的组合物包被生物相容的植入物、基质或支架。在特定的实施方案中，本发明的组合物被用于包被物质如柔性的生物相容的支架(例如，纺织或非纺织的纤维片状物或线状物)。经喷雾干燥处理的组合物特别适合包被包含微珠或颗粒的物质，而无需在包被前复原，因为可在喷雾干燥过程中完成包被。在某些实施方案中，所述组合物被嵌入在基质中或包被在基质上，所述基质如多孔基质和/或含有胶原的基质。在某些实施方案中，基质可为Conexa^TM复原的组织基质、BioFiber^TM支架或BioFiber^TM-CM支架(Tornier；Bloomington,MN)。

在某些实施方案中，本发明的组合物可与三维支架结合并被植入体内，其中所述组合物诱导框架上或框架中的细胞增殖并在体内形成替代组织。在框架上或框架中增殖的细胞可包括位于组合物中的细胞和/或植入了支架的个体的细胞。这样的三维框架可用于形成管状结构，如胃肠道和泌尿生殖道的那些以及血管；用于疝修复的组织；腱和韧带。在相关的实施方案中，本发明的组合物与三维框架结合。框架可被配置为所需的矫正结构的形状。

可用于本发明的支架的实例包括但不限于非织毡、多孔泡沫或自组装的肽，如美国专利第7,560,276号中所述，其通过引用整体并入本文中。可使用由合成的乙醇酸与乳酸的可吸收共聚物(PGA/PLA)(VICRYL；Ethicon,Inc.,Somerville,N.J.)或聚4-羟基丁酸酯(PHA,Tepha,Lexington,MA)组成的纤维形成非织毡。也可使用由例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物组成、通过诸如冷冻干燥或冻干的方法形成的泡沫，如美国专利第6,355,699号中所述。在一个实施方案中，框架为毡，其可由从生物可吸收的物质如PGA、PLA、PHA、PCL共聚物或混合物或者透明质酸制得的复丝组成。

试剂盒

本发明还包括试剂盒，其包含本发明的组合物，如药物组合物。所述组合物可单独包装于例如小瓶中，或者与其他产品如适于与经处理的或冻存的微血管组织组合的那些组合包装。当与另一物质一起包装时，经处理的或冻存的微血管组织可与其他物质分开包装或预混或结合在一起。在一些实施方案中，经处理的微血管组织被包装为生物相容性物质上的包被或与植入物、基质或支架结合。

在特定的实施方案中，本发明的试剂盒包含不透水容器，其包含本文所述的组合物。例如，在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含不透水容器，其包含无菌、干燥(例如冻干的)组合物，其中所述组合物包含分离的多能细胞或者经处理的微血管组织，或者由所述细胞或组织组成的细胞膜，其中所述细胞或组织未经培养，其中所述组合物具有血管生成活性或抗炎活性，其中所述组合物经灭菌和/或所述组合物中的病毒被灭活。

在本文所述的试剂盒和组合物的特定实施方案中，所述组合物在约室温下储藏至少1个月、至少2个月、至少4个月、至少6个月或至少1年时保留有可测量的血管生成活性或抗炎活性。在本文所述的试剂盒和组合物的特定实施方案中，所述组合物在约室温下储藏至少1个月、至少2个月、至少4个月、至少6个月或至少1年时保留有可测量的血管生成活性或抗炎活性。如本文所用，“室温”为约20℃至约25℃或约21℃的温度。在本文所述的试剂盒或组合物的特定实施方案中，所述组合物在约4℃下储藏至少约1个月、至少约2个月、至少约4个月、至少约6个月或至少约1年时保留有可测量的血管生成活性或抗炎活性。在本文所述的试剂盒和组合物的特定实施方案中，所述组合物在约-20℃下储藏至少约1个月、至少约2个月、至少约4个月、至少约6个月或至少约1年时保留有可测量的血管生成活性或抗炎活性。在特定的实施方案中，当在体内或体外测定(包括本文所述的那些中的任何一种)中测量时，所述可测量的血管生成活性或抗炎活性为储藏前活性的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。

在本发明的试剂盒和组合物的特定实施方案中，所述组合物中存在的少于或等于50％、少于或等于40％、少于或等于30％、少于或等于20％、少于或等于10％或者少于或等于5％的细胞是活的，所述组合物中存在的少于或等于2％的细胞是活的，或者所述组合物中存在的的细胞基本上都不是活的。在相关的实施方案中，至少1％的所述细胞排斥台盼蓝。在其他实施方案中，至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的所述细胞排斥台盼蓝。在某些实施方案中，至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的所述细胞排斥台盼蓝，但不是活的。

根据不同的实施方案中，本发明的试剂盒可包含药物组合物，其包含本发明的组合物和赋形剂。在一个实施方案中，药物组合物经配制用于静脉内给药。在其他实施方案中，本发明的试剂盒可包含本发明的组合物以及植入物、支架或基质，包括但不限于本文所述的那些中的任何一种。在具体的实施方案中，可植入的支架或基质为来源于骨的植入物、生物纤维支架、多孔的可吸收聚合物、水凝胶、包含组织产品的油灰、或缝线。在某些实施方案中，所述组合物的细胞、组织或细胞膜存在于所述可植入的支架或基质的面向骨、腱或皮肤的表面上。

在某些实施方案中，本发明的试剂盒包含在密封的容器中的灭菌和干燥(例如，冻干)的本发明的组合物。所述密封的容器可为耐湿的或不透水的，并且其可包含密封的允许进入容器内部的开口。在某些实施方案中，所述容器为包含气密封口的小瓶。在某些实施方案中，所述容器为泡罩包装，其可包含箔密封。在特定的实施方案中，密封的容器的内部为无菌的。因此，在使用前，使用者可接近容器的内部，添加液体至干燥的组合物以将其溶解或复原，然后提供或给予经复原的组合物至个体。在某些实施方案中，液体为无菌水或无菌溶液，如盐水，如磷酸缓冲盐水。

组合物以及植入物、基质和支架的应用

本发明的组合物以及包含所述组合物的植入物、基质和/或支架，可用于治疗或预防有需要的个体的损伤或疾病。在多个实施方案中，组合物可被直接提供或施用至有需要的组织或有需要的组织附近，例如有需要的组织周围的组织。有需要的个体包括具有可从本发明的组合物治疗获益的损伤或疾病，或者存在这样的损伤或疾病风险的个体。在特定的实施方案中，个体为哺乳动物如人，或其他哺乳动物如非人的灵长类、狗、猫或马。在某些实施方案中，个体具有降低的愈合能力，如糖尿病个体和接受化疗的个体。

在某些实施方案中，本发明的组合物被用于治疗或预防个体的不同组织或器官的损伤或疾病，包括但不限于软组织损伤或疾病、硬组织损伤或疾病、骨损伤或疾病、关节损伤或疾病、心脏组织损伤或疾病、脂肪组织损伤或疾病、软骨损伤或疾病，以及椎间盘损伤或疾病。

在某些实施方案中，本发明的组合物被用于治疗或预防软组织损伤。如本文所用的软组织通常是指见于整个身体中的骨外结构，并且包括但不限于软骨组织、半月板组织、韧带组织、腱组织、椎间盘组织、牙周组织、皮肤组织、血管组织、肌肉组织、筋膜组织、骨膜组织、眼组织、心包组织、肺组织、滑液组织、神经组织、脑组织、肾组织、骨髓、泌尿生殖组织、肠组织、肝组织、胰腺组织、脾组织、脂肪组织以及以上组织的组合。软组织损伤包括任何软组织如肌肉、韧带、腱、皮肤、纤维组织、脂肪、滑液膜、神经、血管和筋膜的破坏或损伤，其可发生于整个身体中。可从提供的经处理的微血管组织的软组织愈合活性获益的软组织损伤包括但不限于，诸如腱和/或韧带撕裂的损伤以及起因于缺血性事件的损伤。常见的软组织损伤可起因于扭伤、拉伤、起因于挫伤或特定软组织的过度使用的损伤。软组织损伤包括开放和封闭的软组织损伤。

可根据本发明的方法治疗或预防的软组织损伤、疾病和病况包括但不限于，血管、皮肤或肌肉骨骼组织的损伤。软组织病况包括，例如皮肤病况(例如，疤痕修复或治疗创伤性伤口、重度烧伤、皮肤溃疡(例如，褥疮(压力)溃疡、静脉性溃疡和糖尿病)，和手术伤口如与皮肤癌切除相关的那些)；血管病况(例如，血管疾病如外周动脉疾病、冠状动脉疾病、腹主动脉瘤、颈动脉疾病和静脉疾病；血管损伤；不恰当的血管发育)；影响声带的病况；外观病况(例如，涉及修复、增大或美化的那些)；肌肉疾病(例如，肌肉病变；重症肌无力；炎症、神经性和肌原性肌肉疾病；和肌肉萎缩症如杜氏肌营养不良、贝克肌营养不良、肌强直性营养不良、肢带型肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端肌营养不良和Emery-Dreifuss肌营养不良)；结缔组织如腱和韧带的病况，包括但不限于牙周韧带和前十字韧带；以及器官和/或筋膜(例如，膀胱、肠、骨盆底)的病况。软组织损伤的非常常见的一个实例为盆骨底的损伤。这是一种可能很严重的医学病况，其可在分娩时发生或由其并发症发生，可能引起膀胱阴道筋膜损伤如膀胱突出(其为一种膀胱成疝)。类似的医学病况包括脱肛(直肠形成疝)、肠疝(肠通过直肠阴道或膀胱阴道袋突出)，以及肠膀胱疝(双疝，其中膀胱和肠均突出)。

在多个实施方案中，本发明的组合物被用于治疗或预防多种疾病，包括但不限于与不良的炎症或免疫反应相关的疾病。这样的疾病的实例包括风湿性关节炎、骨关节炎和自身免疫性疾病和病症。另外，本发明的组合物可用于减少例如损伤部位的炎症，和/或减少免疫反应，例如，损伤诱导的免疫反应。类似地，本发明的组合物可被用于防止或减少移植排斥的可能性。

在特定的实施方案中，本发明的组合物被用于例如在损伤或组织损伤部位促进或刺激血管生成或血管再生。在特定的实施方案中，损伤与组织的缺血、低氧或再灌注损伤相关或导致组织的缺血、低氧或再灌注损伤。与可根据本发明治疗或预防的缺血、低氧或再灌注损伤相关或导致可根据本发明治疗或预防的缺血、低氧或再灌注损伤的损伤或疾病的实例，包括中风、心肌梗死和失血。可以本发明的组合物治疗以促进或刺激血管生成或血管再生的损伤或组织损伤的其他的实例包括移植或接肢。

本发明的组合物还可用于治疗或预防周围神经损伤、勃起障碍、肺动脉高压、多发性硬化和辐射灼伤。另外，它们可被用于诱导造血和/或伤口愈合。

在特定的实施方案中，本发明的组合物，例如经配制用于静脉内给药时，可用于治疗或预防急性心肌梗死、充血性心力衰竭、中风、外周血管疾病或慢性阻塞性肺病。

本发明的组合物可单独使用，或与一种或多种其他的治疗剂或治疗或预防损伤或疾病的方案组合使用。例如，在某些实施方案中，为了富集血液供应至损伤的组织和/或促进组织再生，本发明的组合物可与富血小板血浆组合使用。当与一种或多种其他的治疗剂或方案组合使用时，本发明的组合物可在以其他的治疗剂或方案治疗之前、同时或在重叠时段中，或之后提供或使用。

当与另一治疗剂联合使用时，本发明的组合物可与另一试剂分开提供，或者其也可存在于还包含另一治疗剂的药物组合物，如包含两种或更多种治疗剂(其中一种为本发明的组合物)的共制剂中。在特定的实施方案中，本发明的组合物和另外的治疗剂均与相同的植入物、基质或支架组合或结合。

本发明的组合物以治疗有效量给药，所述治疗有效量基于多种因素而变化，包括所用的具体组合物的活性；被给予本发明的组合物的个体的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；给药模式和时间；个体中组合物的排泄或分解速率；以及待治疗的损伤、疾病或病况的类型或严重程度。在某些实施方案中，治疗有效剂量由通过处理10⁴至10⁸个多能细胞及其相关ECM而获得的物质产生。

可通过以一次、两次或更多次剂量给予组合物来实施本发明的方法。例如，在某些实施方案中，组合物被作为单次剂量、多次剂量或重复剂量在一段时间内给药。

实施例

实施例1-微血管组织制备和表征

在本研究中，通过不同的方法制备了微血管组织然后测定。简言之，从器官供体获得了至少5-10lbs的皮下脂肪，并按如下进行处理：切碎组织；将其酶促解离；稀释(未淬灭)、旋转、倒入然后洗涤细胞团；重悬在冻干缓冲液中；并冻干。用于处理的基本条件如下：从组织供体经手术摘除脂肪组织。用剪刀切碎组织，37℃悬浮在具有0.2U/ml CIzyme AS(Vitacyte,Indianapolis,IN)的PBS中，缓慢搅动60min，然后洗涤3次并以2百万细胞/ml重悬在M3D中。将细胞悬液保持在室温下直到刚开始冻干，此时细胞被以EZ-CPZ^TM低温保存培养基(Incell Corp.,San Antonio,TX)按50:50稀释，装入小瓶，并加载至冻干托盘用于冷却。在处理过程中以及处理结束时分析样品。

在本研究中进行了10种处理方法。它们在表1中被命名为“A”至“J”。用于分析每种处理方法的测定方法列出在表1中，被命名为1、2、3、4、5，并且在表2中有详细描述。

表1.处理方法、描述和测定方法

表2.研究测定组

针对本研究进行了几项任务。它们被命名为A-D，且在下文中有进一步详细描述并概述在图1中。用于任务的具体实验室测定方法(M)被命名为M1、M2、M3、M4和M5(表2)。

任务A.计划和建立

订购材料、调整、建立和测试。

任务B.来源物质和通用方案

脂肪组织获自器官供体。皮下脂肪取自腹部、大腿和臀部。将五(5)至十(10)磅脂肪收获至ZTM^TM转运介质(Incell Corp.,San Antonio,TX)中。

收获组织，并在死亡12小时内通过多个步骤和实验室方法(表1和2；图1)初步处理。室温储藏12、24和48小时后使用基本条件处理十(10)g小份。使用绞肉机方法处理>5+磅以切碎组织，并用ZSolM^TM中的4X Blendzyme I(Vitacyte)酶浓度及4X酶浓度和步骤E 1/4消化体积的ZSolM^TM消化10gm小份。大部分样品以标准酶浓度和方法消化。

消化后，将样品在ZSolF^TM中冲洗，浓缩，倾倒，然后在ZSolF^TM中再洗涤2个旋转。将细胞以1:1细胞悬液重悬在EZ-CPZ^TM中作为10⁶个细胞/ml的冻干溶液散装产品，并冻干(步骤G)作为1mL小份体积。将冻干的小瓶暴露至γ和电子束辐射(步骤H、I、J)。储藏所有终产物，并测试代表性样品，并将选择的子集用于随后的动物研究。

任务C.测定

用于本研究的不同类型的测定(M1-M5)(表2)简单概述如下。

M1:筛选传染性疾病，包括在脂肪组织收获前未进行测试的供体。开发了用于组织获取的供体筛选和协议以最小化或消除根据标准评估的任何传染性疾病。基于个例进行了实际的附加试验和相关成本。进行了生物负载测定。

M2:针对细胞数和活力使用血细胞计数器(光学显微镜)和利用DAPI细胞核(荧光显微镜)染色的台盼蓝进行了细胞计数。细胞计数记录为一式双份读数。

M3:用于选定的生物标志物：CD33、CD34、CD44、CD45和IV型胶原的免疫表型分型。进行了悬浮细胞的即时免疫测定。在LabTek中培养出细胞然后染色，并采集代表性图像。

M4:在袋N＝2中对来自所接受组织的转运溶液的样品进行生物负载测定(并与处理后{最后的}冲洗物比较。使用EndoSafe PTS测定(Charles River)进行内毒素测试。进行标准USP培养微生物测试。任选进行ATP快速测试。

M5:冻干后,以及在不同的处理和辐射方案后，对分离的细胞样品进行功能生物测定。对ADSC、内皮细胞、成纤维细胞进行细胞穿过transwell的细胞迁移测定。进行基质胶测定以评估不同稀释、处理阶段和/或辐射的样品诱导的微血管形成。

任务D.数据分析

将观测读数和数据转移至Excel或Prism用于分析。对每个TPS和每种细胞类型的样品重复的均值+SD值制表和/或作图用于比较分析。

获自进行的初步实验的结果显示处理条件A、B和D之间存在很小的差异，3.5kg的脂肪组织以10⁶个细胞/小瓶产生1560小瓶的冻干产物。

实施例2-大鼠跟腱损伤的治疗

本研究证明本发明的微血管组织制剂可用于修复跟腱损伤。

32只雄性Sprague Dawley大鼠(在第1天为8周龄，并且在第1天为～250g)购自Harlan，并使其适应至少3天。按表3的研究设计中所概述的处理大鼠。

表3:研究设计

研究发生超过动物寿命约10天。动物第-3天到达，第-3至第1天适应，在第1天接受手术，并安排在第7天终止。

测试物质：

胶原包被的生物纤维支架

用无菌WFI复原经处理的微血管组织制剂A和B，并吸入至支架。经处理的微血管组织组合物A未经灭菌，并且经处理的微血管组织组合物B经电子束灭菌。

麻醉：在第1天手术前，将动物称重并经肌肉内注射盐酸氯胺酮100mg/mL(40-mg/kg)和甲苯噻嗪100mg/mL(5-10mg/kg)麻醉。

手术准备：在开始测试前1天将每只动物的右后肢剃毛。在第1天，用碘酮(betadine)和醇擦洗，并使用无菌外科技术覆盖来准备皮肤手术。

手术方案：在第1天，在即将植入前准备测试物质。通过毛细作用将移植物装载细胞。将两根5-0聚丙烯缝线放置在移植物中用于固定。将移植物放置在具有盐水的皮氏培养皿中，并覆盖直到使用。

从右后肢的近尾部(远端)胫骨至中间胫骨的水平制作直的横向皮肤切口。使用该方法，皮肤被切开并缩回，以允许从跟骨至其肌肉-腱连接横向暴露跟腱。进一步的切开被用于暴露和分离跟腱。在移植物测试物品放置前用小鼠拔牙钳轻度磨损暴露的跟腱。在通过跟骨的横向至中间方向制作单个0.5mm钻孔，以允许缝线通过用于移植物固定。用盐水灌洗植入区域以去除任何碎片并吸干。

从支撑介质移除移植物并沿跟腱的前面插入，其一端靠近跟骨。使用改进的Mason-Allen缝线方式将颅移植物固定缝线放在腓肠肌颅至肌肉-腱连接。然后使尾部移植物固定缝线通过跟骨中的钻孔并在中间位置与脚拉紧，并系紧。所有固定缝线共系有6个缝线结头。使用合适的缝线材料以分层方式封闭切口。

麻醉：在第1天从麻醉恢复后经皮下向动物给予丁丙诺啡(0.1-0.5mg/kg)。可根据疼痛需要任意给予另外的丁丙诺啡。

体重测量：在第1天手术前将动物随机称重，并每周一次直到研究结束，包括在终止前。(～9个时间点)

健康观察：在研究持续期间每天监测动物一次。(～7个时间点)

切口位点区域观察：从第2天至第7天每天记录切口位点的观察。

体温/湿度记录：记录每天室温和湿度测量。

终止和组织收集：在第7天，将动物安乐死，并通过从每只动物切除来收集植入测试或对照物体位点和周围的腱组织。所有收集的样品沿支架的中线分成两半，每半中包含一半的腱。将一半的收集的组织储藏在10％中性缓冲福尔马林中用于常规组织病理学和免疫组织化学评估。剩下的一半以解剖刀边缘剥下腱和过度生长的软组织，并将内部生长有组织的支架于<-70℃在液氮中快速冷冻用于基因表达分析。

还采集了随机挑选的2只动物/组的腱(取自对侧的跟)、皮肤(取自皮较少的区域)和肝切片作为染色对照，并储藏在10％中性缓冲福尔马林中用于免疫组织化学评估。在液氮中将每个对照组织的一部分快速冷冻用于PCR对照。(可将所有3个对照组织一起储藏在福尔马林中，并同样将冷冻部分储藏在一起)。

对组织进行组织学(H&E,马森三色染色法)、免疫组织化学(SMAD8和腱生蛋白)以及PCR(SMAD8、腱生蛋白、腱调蛋白(tenomodulin)和scleraxis)分析。

实施例3-小鼠缺血的治疗

本研究在鼠肢体缺血模型中证明了本发明的经处理的微血管组织组合物的效用。按先前所述(Jang J et al,Circulation 1999；Huang N et al,JOVE 2009)制作肢体缺血的鼠模型，并将其用于评估诱导后肢缺血后细胞制剂在促进血管生成中的效用。

14-16周龄的SCID小鼠经历手术诱导的后肢缺血。手术后，立即按下表4中所详述将经处理的微血管组织组合物或媒介物对照给予至动物。简而言之，在诱导后肢缺血后第0天将3种测试细胞物质(每种为0.5X10⁶个细胞)或媒介物对照经肌肉内注射至腓肠肌中。3种测试物质包括：经处理的微血管组织组合物(测试细胞-I)、通过电子束灭菌的经处理的微血管组织组合物(测试细胞-II)和通过γ-辐射灭菌的经处理的微血管组织组合物(测试细胞-III)。每3-4天评估肢体灌注的改善，总共为期14天。在14天后，将动物安乐死。将缺血性和对侧腓肠肌均外植，并进行组织学分析。

表4.研究方案

终点测试

通过激光多普勒成像在第0、3、7、11和14天评估血流。

在第14天将动物处死，并收获后肢组织，处理并储藏用于外植体研究。

实施例4-SCID小鼠中的血管形成

这些研究利用基质胶塞测定来证明本发明的微血管组织制剂在体内形成血管结构的能力。基质胶塞测定是体内真实血管形成的确定性测定。该测定包括利用基质胶经皮下将治疗细胞植入腹部区域中。在2周的过程中，基质胶中的细胞处于形成新生血管的有利环境中，其中的一些可与宿主血管汇合。

在该测定中，将0.5X 10⁶个细胞包埋在补充有200ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的0.5ml基质胶中，然后经皮下注射至SCID小鼠中。每只动物植入2个塞子。2周后，将塞子外植用于血管形成的组织学分析。为了将人与天然鼠血管区分开来，靶向内皮细胞(例如，CD31)的人特异性抗体被用于确定人特异性血管。如通过以血管成分进行的管腔结构组织学所证明的，人特异性血管的存在证明了功能内皮细胞。类似地，小鼠特异性内皮细胞抗体可被用于确定小鼠特异性血管。治疗细胞分泌旁分泌血管生成因子的能力造成鼠血管形成的相对增加。

对14-16周龄的SCID小鼠进行包含本发明的微血管组织制剂或媒介物对照的基质胶塞的植入，如下表5中如详述。

表5.研究方案

3种测试物质包括：经处理的微血管组织组合物(测试细胞-I)、通过电子束灭菌的经处理的微血管组织组合物(测试细胞-II)和通过γ-辐射灭菌的经处理的微血管组织组合物(测试细胞-III)。

实施例5-大鼠风湿性关节炎的治疗

本研究证明了本发明的微血管组织制剂在抑制与大鼠中7天建立的II型胶原关节炎相关的炎症、软骨破坏和骨吸收中的功效。

测试系统

动物数：44

物种/品系或品种：Lewis大鼠。

供应商：Charles River

到达时年龄/Wt：125-150g

性别：雌性

研究开始时的年龄范围：第一次免疫时至少125克。

驯化：到达时BBP驯化4-8天。

关养：3-5只/动物/笼

材料

测试物质(经处理的微血管组织组合物制剂)和合适的媒介物。用于稀释的去炎松和无菌盐水(BBP)、牛II型胶原(Elastin产品)、弗氏不完全佐剂(Difco)。

一般研究设计

以异氟烷将大鼠安乐死，并遍布背部远侧给予300μl弗氏不完全佐剂注射剂ID/SC中的牛II型胶原，在第0天每位点100μl，并在第6天时再次给予。

当两只后爪(膝盖通常具有与脚踝相似严重程度的疾病，但难以可靠测量，因此用脚踝测量代替膝盖以确定疾病起始)的疾病明显时在关节炎(研究第10天)的第1天进行随机分至每个组。这成为关节炎的第1天。具有关节炎的动物被随机分至处理组，其具有每个组的约平均脚踝卡尺测量。

仅在第1天对关节炎进行处理(IA，双侧至两个膝部)。处理了膝部，因为脚踝太小而不能注射。通过脚踝的卡尺测量监测处理的系统效应，并通过膝盖的组织病理检测测定处理的局部效应。从第0(基线)-7天每天采集脚踝卡尺测量。第0天使用一个脚踝采集基线脚踝卡尺测量，值被四舍五入至千分之一英寸。通过与大鼠的基于一系列体重的历史值比较将测量确定为临床正常的(0.260-0.264英寸)。然后将基线测量施用至两只脚踝，并且只要脚踝临床上正常具有所有脚踝骨的良好界定且无炎症证据，这些值随动物保持不变。

表6:研究组命名

3种测试物质包括：经处理的微血管组织组合物(TX-I)、通过电子束(TX-II)灭菌的经处理的微血管组织组合物和通过γ-辐射(TX-III)灭菌的经处理的微血管组织组合物。

疾病诱导

以异氟烷将驯化的动物麻醉并给予胶原注射(D0)。在第6天，将它们再次麻醉用于第二次胶原注射。通过制备于0.01N乙酸中的4mg/ml溶液来制备胶原。通过手动混合直到该物质的珠子在放入水中时保持其形式，而将等体积的胶原与弗氏不完全佐剂乳化。每只动物每时间跨度在背上的3个皮下位点(每位点100μl)接受300μl的混合物。

材料

测试物质和媒介物

测试物质媒介物：在注射当天制备干细胞制剂，去炎松(Vetalog, Ft.Dodge)。

测试物质和形成：于生理媒介物中的适于注射40μl/膝关节浓度的干细胞制剂。去炎松2mg/ml稀释于盐水中。

表7:研究日程

进行肝分期

在关节炎第1天(研究第10天)通过关节炎严重程度进行随机分配至每个组。在随机分组(第1天)后开始处理(双侧IA,40μl/关节)。每天采取体重和脚踝卡尺测量/分数。

人道处理：将根据兽医护理的Bolder BioPATH IACUC程序显示发病迹象，包括减少多于20％体重(在1周内)的动物从研究中去除，并通过CO₂吸入人道处死。

表8:肝阶段可递送物

尸检

在关节炎第7天通过放血将动物处死。

采集尸检数据，包括左和右后爪的重量，以及肝、脾和胸腺的重量。

采集的尸检样品包括小份的血清，以及左和右后爪和膝。

关节的处理/组织病理学评分

在固定后1-2天和随后在脱钙器中4-5天，将踝关节沿纵向切成两半，将膝部在额面切成两半，处理，包埋，切片并用甲苯胺蓝染色。

以II型胶原关节炎对大鼠关节的组织病理学评分方法

胶原关节炎脚踝和膝盖根据以下标准给出为针对炎症、血管翳形成和骨吸收的0-5的分数：

膝部和/或脚踝炎症

0＝正常

0.5＝最小病灶炎症

1＝滑膜/关节周围组织中炎性细胞的最小侵润。

2＝轻度侵润

3＝具中度水肿的中度侵润。

4＝具显著水肿显著侵润

5＝具严重水肿的严重侵润

当病灶处于急性至亚急性期时，具II型胶原关节炎的小鼠和大鼠中的炎症侵润由中性粒细胞和巨噬细胞以及较小数目的淋巴细胞组成。关节空间中的组织水肿和中性粒细胞渗出液在急性至亚急性期常见。随着炎症发展为慢性，单核炎症细胞(单核细胞、淋巴细胞)主导，并且成纤维细胞增殖，常常伴随异染性基质沉积，发生于滑膜和关节周围组织中。渗出液在关节空间中较不常见。除非在评论区中有指示，炎症类型为急性至亚急性。

脚踝血管翳

0＝正常

0.5＝软骨和软骨下骨中血管翳的最小侵润，仅影响边缘区和仅很少关节。

1＝软骨和软骨下骨中的血管翳的最小侵润，主要影响边缘区。

2＝轻度侵润(<1/4的边缘区胫骨或跗骨)

3＝中度侵润(1/4-1/3的边缘区胫骨或小跗骨受影响)

4＝显著侵润(1/2-3/4的边缘区胫骨或跗骨受影响)

5＝严重侵润(>3/4的边缘区胫骨或跗骨受影响，总体结构严重变形)

膝部血管翳

0＝正常

1＝软骨和软骨下骨中血管翳的最小侵润，约1-10％的软骨表面或软骨下骨受影响。

2＝轻度侵润(延伸至多达1/4的胫骨或股骨表面或软骨下表面上)，约11％-25％的软骨表面或软骨下骨受影响

3＝中度侵润(延伸至>1/4但<1/2的胫骨或股骨表面或软骨下表面上)，约26％-50％的软骨表面或软骨下骨受影响

4＝显著侵润(延伸至1/2-3/4的胫骨或股骨表面上)，约51％-75％的软骨表面或软骨下骨受影响

5＝严重侵润，约76％-100％的软骨表面或软骨下骨受影响

脚踝软骨损伤(着重于小跗骨)

0＝正常

0.5＝T蓝染色的最小增加，仅影响边缘区且仅影响一些关节

1＝甲苯胺蓝染色的最小至轻度减少，无明显软骨细胞减少或胶原破坏

2＝甲苯胺蓝染色的轻度减少，具有病症轻度的(表面)软骨细胞减少和/或胶原破坏

3＝甲苯胺蓝染色的中度减少，具有多病灶中度的(深度至中间区)软骨细胞减少和/或胶原破坏，较少跗骨被影响1/2-3/4深度，很少区域全层减少

4＝甲苯胺蓝染色显著减少，具有多病灶显著的(深度值较深区域)软骨细胞减少和/或胶原破坏，1或2个小跗骨表面具有全层减少的软骨

5＝甲苯胺蓝染色的严重弥散性减少，具有多病灶严重的(深度至趋势标记)软骨细胞减少和/或胶原破坏，影响多于2个软骨表面膝部软骨损伤

0＝正常

0.5＝T蓝染色的最小减少，仅影响边缘区

2＝甲苯胺蓝染色的轻度减少，具有病灶轻度的(表面)软骨细胞减少和/或胶原破坏，可具有很少小面积的50％深度的软骨受影响

3＝甲苯胺蓝染色的中度减少，具有多病灶至弥散性中度的(深度至中间区)软骨细胞减少和/或胶原破坏，可具有1-2个小面积的全层减少，影响小于1/4的表面总宽度和不大于25％的所有表面的总宽度

4＝甲苯胺蓝染色的显著减少，具有多病灶至弥散性显著的(深度至深区)软骨细胞减少和/或胶原破坏，或者1个表面具有接近其他的总减少和部分减少，总减少小于所有表面合并宽度的50％

5＝甲苯胺蓝染色的严重弥散性减少，股骨和/或胫骨上具有多病灶严重的(深度至趋势标记)破骨细胞减少和/或胶原破坏，总减少大于所有表面合并宽度的50％

脚踝骨吸收

0＝正常

0.5＝最小吸收仅影响边缘区且仅影响一些关节

1＝小面积的吸收，在低放大率下不容易变得明显，罕见破骨细胞

2＝轻度＝更多的吸收面积，在低放大率下不容易变得明显，破骨细胞更多，<1/4的边缘区胫骨或跗骨被吸收

3＝中度＝骨髓横隔和皮层骨的明显吸收，而无皮质的全层缺陷、一些骨髓横隔的减少、低放大率下病灶明显、破骨细胞更多、1/4-1/3的边缘区胫骨或跗骨受影响

4＝显著＝皮层骨的全层缺陷，常常伴随剩余皮层表面轮廓的变形、髓骨、众多破骨细胞、1/2-3/4的边缘区受影响的胫骨或跗骨的显著减少

5＝严重＝皮层骨的全层缺陷，常常伴随剩余皮层表面轮廓的变形、髓骨、众多破骨细胞、>3/4的边缘区受影响的胫骨或跗骨、总体结构的严重变型的显著减少

膝部骨吸收

0＝正常

0.5＝最小吸收仅影响边缘区

1＝最小＝较少区域的吸收，在低放大率下不容易变得明显，受影响的软骨下骨的约1-10％的总关节宽度

2＝轻度＝更多区域的吸收，明确减少软骨下骨，受影响的软骨下骨的约11-25％的总关节宽度

3＝中度＝受影响的软骨下骨的总关节宽度的约26-50％的软骨下骨的明显吸收

4＝显著＝受影响的软骨下骨的总关节宽度的软骨下骨的约51-75％的明显吸收

5＝严重＝由于受影响的软骨下骨的总关节宽度的约76-100％破坏，整个关节的变形

关节周围基质沉积(仅在相对于疾病对照，在任何处理组见到增加时得分)

0＝正常

1＝较弱的，多病灶异染性染色，无关节周围组织的过量扩增

2＝较暗的，弥散性异染性染色，无关节周围组织的过度扩增

3＝较暗的，弥散性异染性染色，关节周围组织的轻度扩增

4＝较暗的，弥散性异染性染色，关节周围组织的中度扩增

5＝较暗的，弥散性异染性染色，关节周围组织的严重扩增

统计分析

临床数据

使用学生t-检验或曼-惠特尼U检验(非参数的)分析数据。如果适用，在使用变异的单因素分析(单因素ANOVA)或克鲁斯卡尔-沃利斯检验(非参数的)以及合适的检验后多重比较的所有组中进一步分析数据。除非另有说明，仅对原始(未转化的)数据进行统计分析。统计检验作出了关于数据的正态分布和方差齐性的假设，并且如果检验造成违反这些假设则需要进一步分析。所有检验的显著性均设定为p<0.05。

使用下式计算爪重量和AUC的百分比抑制：

％抑制＝A-B/A X 100

A＝平均疾病对照–平均正常

B＝平均处理–平均正常

实施例6-山羊的骨空洞、软骨缺损和半月板损伤的治疗

本研究证明了本发明的微血管组织制剂在治疗骨空洞、软骨缺损和半月板病变中的效应。在本研究中，对于每只动物，在右后膝关节上操作，并产生了3处不同和分开的手术缺损。测试的每个右股骨将具有一个在股骨的横向上踝区产生的8mm直径x 20mm深的骨缺损、一个在滑车沟中产生的4x 7mm矩形x 2mm深的软骨缺损，和一个在内侧半月板的白-白区中产生的7mm长x 1-2mm宽的全层半月板缺损。将3只动物的处理组的每只具有的缺损以微血管组织制剂处理，而将对照组具有的缺损仅填充支架。在第8周时对山羊进行了评估，以评估和表征不同缺损位点的修复的组织。相比对照，预期处理缺损的总体和组织学结果将更优。

选择了山羊是因为相对较大的膝关节大小、易于操作、用于其它软骨、半月板和骨修复研究，并且类似于人中见到的反应。由于它们较大的关节大小、半月板修复生理学的相似性、膝(后膝关节)关节中的软骨厚度为1.5–2mm、类似于马和人，并且它们具有类似于人的松质骨和皮层骨(二级骨单位)，不同的山羊种类已被用于软骨研究。骨、软骨和半月板修复过程是非常复杂的过程，其不能在体外环境中进行模拟。动物模型是必需的，因为关节特别是受伤关节的生理学非常复杂并且不能够在实验室中重复。本研究中使用的动物概述在表9中。

表9.动物使用

在右股骨的横向上踝区产生一个单皮质上踝8mm直径x 20mm深缺损；在右股骨的横向滑车沟产生1个4x7mm x约2mm深矩形缺损，并在右内侧半月板产生1个约7mm长x 1-2mm宽全层缺损。物理检测每个膝部的拉扯(drawer)、动作范围(测角器)、肿胀、温度、捻发音、膝盖骨跟踪和外翻/内翻。以氯己定进行标准的手术擦洗，然后以70％酒精擦洗，然后以碘伏涂液擦洗。手术方法由从右股骨的远侧1/3至胫骨平台水平产生的弯曲的内侧皮肤切口组成。

确定了内侧韧带并以烧灼器制作骨-韧带连接足迹的轮廓。在足迹的中心，使用2.8mm钻头和螺丝攻产生螺孔用于韧带的重新连接。使用摆锯切割内侧韧带的结合的足迹，以允许其朝胫骨反射。打开关节囊，并将膝部弯曲，并横向旋转以暴露内侧半月板。将塑料保护标签放在内侧半月板下，并使用专门设计的椭圆穿孔，在半月板的白-白区产生全层缺损。然后用支架或支架+化合物处理缺损。将膝部拉直并用螺钉和垫圈将内侧韧带重新连接。

然后将膝部弯曲，并确定横向滑车沟的中点。用于软骨缺损的钻孔点被确定为横向滑车槽的临近边缘远侧20mm。利用6mm直径穿孔对软骨评分，并使用专门的仪器，在软骨表面产生6mm直径x约2mm深的缺损。然后用支架或支架+化合物处理该缺损。

在膝部仍然弯曲下，使用成卷的3mm直径的钻头(bit)在横向股骨踝的上踝区钻出20mm深度的导孔。将钻头垂直于关节线且平行于前面对其。然后将导孔扩大至8mm直径。冲洗骨缺损然后用支架或支架+化合物处理。

使用用于深层的1-0Vicryl和皮肤钉(staple)以3层封闭手术切口后，将改良的Thomas夹板施用至腿部以限制承重和活动。术后将玻璃纤维铸件(cast)和夹板保留最少14+2天。在这段时间内，动物将被保持在小围场中。

表10:每个缺损的处理分配

在术后第84+2天于III期麻醉下以氯化钾IV将动物安乐死。安乐死后，对膝关节大体评估，滑膜液大体评估颜色和粘度，并按表12中所述采集样品。打开关节，拍照，并按表13中所示对软骨位点表面评分。检查与缺损位点相对的有关节的表面的任何异常关节表面。对对照和经操作的膝关节进行总体评估。检查腿弯部淋巴结和滑膜的任何炎症。

表11:总体评估和样品采集

H＝组织学–仅右股骨:骨缺损、滑车缺损、内侧半月板

检查了对侧膝部的任何异常关节表面。进行了右膝关节的总形态评估以基于先前的表3中列出的评分标准确定软骨表面修复。切除了右腿节以从骨空洞区分离软骨缺损并放入合适标记的填充有10倍体积的10％中性缓冲福尔马林的容器中。对内侧半月板大体评估，收获并放入合适标记的填充有10倍体积的10％中性缓冲福尔马林的容器中。

表12:总体形态评估的评分标准

收集了滑膜液，评估体积、粘度(拉丝(String))、澄清度和颜色。合适时，使用总滑膜液评估的半定量评分，如表13中所示。

表13:滑膜液的描述和评分

总滑膜液分数为颜色、澄清度和拉丝分数的总和(0-8分)。

实施例7-使用经处理的大鼠微血管组织的细胞迁移测定

为了证明经处理的微血管组织组合物对细胞迁移的效应，开发了人内皮细胞迁移(经处理的微血管组织组合物的化学趋向)和脂肪来源的基质血管成分(SVF)细胞摄取标记的经处理的微血管组织组合物微泡(MV)的测定，并用作组合物的生物活性的量度。

选择这些研究的理由为：(1)经处理的微血管组织组合物可诱导血管修复增加；因此，内皮细胞迁移将是有效的度量标准；以及(2)MV释放和摄取是将存在于组织修复模型中的多种细胞类型中的重要活性；因此，具有对血管修复重要的细胞类型的SVF细胞群被用于测试MV摄取。

一般研究设计

为了评估经处理的微血管组织组合物对内皮细胞的趋化能力，将组合物样品放入transwell板的底部腔室中，并从12-48hr随时间监测以橘色-红色荧光亲脂性染料(CM-DiI)标记的内皮细胞的迁移。测定还包括100％的化学限定的低温保存培养基EZ-CPZ^TM(Incell Corp.,San Antonio,TX)和与M3D^TM(Incell Corp.,San Antonio,TX)培养基50/50混合的EZ-CPZ^TM作为基线对照。

进行了第二个研究以评估SVF细胞摄取冻干的经处理的微血管组织组合物。用CM-DiI孵育组合物以允许染料掺入至组合物样品的MV和细胞膜中。将标记的组合物样品冲洗，在培养基中稀释，然后放置在附着的SVF细胞的单层培养物上。在24hr摄取后，冲洗细胞，然后显现红色荧光染料的摄取。

材料和方法

M3D^TM是INCELL制造的化学限定培养基。在一些测定中，M3D^TM补充有抗生素(1XPSF:青霉素/链霉素/两性霉素抗生素/抗真菌剂；Invitrogen,Grand Island NY)。M3D:10培养基(INCELL)为补充有10％胎牛血清(FBS)和1X PSF的M3D^TM。EZ-CPZ^TM(Incell Corp.,San Antonio,TX)是化学限定的细胞低温保存培养基。EZ-CPZ^TM和EZ-CPZ^TM:M3D^TM(1:1；v/v)用作参照对照培养基。

CM-DiI为培养基的水性制剂中的“Cell

”荧光染料(Invitrogen/Molecular Probes)。其与亲脂性物质如细胞膜和MV结合，且能够通过荧光显微镜作为亮红色荧光显像。对于本研究，使用了EVOS倒置显微镜，其具有红色滤光器：530nm激发，593nm发射)。

第1代(p1)的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)获自INCELL Biorepository。用于MV摄取测定的人SVF p1细胞获自INCELL Biorepository。

所有细胞均培养在M3D:10^TM(Incell,San Antonio,TX)中。以CM-DiI将内皮细胞在37℃下孵育30分钟，然后用具1XPSF的M3D^TM冲洗。对细胞计数，并在一式三份的孔中将每孔相同数目的细胞施加至3微米孔径PET transwell室(Thermofisher；Waltham,MA)的上部腔室中，所述室中预加载有经处理的微血管组织组合物测试物质。

在48孔板中将用于吸附测定的SVF细胞培养至对数生长期。

经处理的微血管组织组合物

制备并测试了两种经处理的微血管组织组合物，即BMA和BMB。BMA样品为大鼠SVF细胞，并且BMB为大鼠骨髓单核细胞，每种都以10⁶个细胞/ml冻干。通过如下方法制备大鼠SVF细胞：用剪刀剪碎附睾脂肪垫直到没有物质直径大于1mm，然后洗涤并在37℃、缓慢搅拌下于PBS中的1U/ml CIzyme AS(Vitacyte,Indianapolis,IN)中孵育60min。将细胞洗涤两次并以10⁶个/ml重悬在冻干缓冲液中。大鼠骨髓细胞通过如下方法获得：以ACDA/PBS溶液冲洗股骨和胫骨并通过20ga针头重复吸入和吹出进行解离。然后在Ficoll梯度中分离骨髓细胞，用PBS+1％FBS洗涤两次，并重悬在缓冲液中。冻干后，BMA样品给出低于检测限(小于10,000)的细胞数，而BMB样品给出0.6-1.0百万的细胞数和10％-50％的活力(台盼蓝)，如表14中所述。

表14:BMA和BMB制剂的活力

所有样品均冷冻储藏在黑暗下1年，并以11kGy电子束辐射将测试样品灭菌。未辐射的对照样品未经灭菌。

标记的内皮细胞的Transwell迁移

在具有1X PSF的1ml UFDI水中复原冻干物质。在该总的样品中，将300μl放入3个孔中的每个的底部，并用200μl M3D添加至终体积500μl。将上部腔室设置为样品孔，并将相同数目的CM-DiI标记的HUVEC p2细胞放入每个孔中。37℃下孵育板，并在12、24和48小时时对孔成像。通过计数视野中的细胞检查图像来确定结果。

SVF细胞摄取标记的微囊泡

以CM-DiI孵育剩余的100μl冻干物质以标记存在的细胞膜。通过离心用M3D+1XPSF将物质洗涤3次。将接种至48孔板上用于吸收测定的SVF细胞培养至50％汇合度且具有在顶部分层的50μl CM-DiI标记的冻干物质。24小时时将一半的孔冲洗，覆盖上液体封闭剂并进行干燥；3天后将另一半冲洗，固定并封闭。检测图像以确定结果。

结果

标记的内皮细胞的Transwell迁移

对于所有孔，12小时时间点时在下部腔室中存在最小数目的细胞。参见图2和图3-7第一行，随时间进展，细胞开始迁移至下部腔室中。一些样品被更快地吸引至下部腔室。相比BMB，BMA样品更倾向于吸引细胞，如图2中所见。在测试样品中，BMA缓冲液2测试组在24小时时具有最少细胞数，但在48小时时间点时具有最高细胞数。总体说来，BMA样品比BMB样品工作的更好，缓冲液2相比缓冲液1展现诱导更高迁移率的趋势(但统计上不显著)。

测定的其他可见的效应为造成的BMA迁移辐射的约20％的减少趋势，然而BMB具有很少的效应，并且24和48小时时基本上为相同水平(差异为统计上不显著的)。

EZ-CPZ^TM培养基对照确实具有一些迁移，但相比BMA和BMB样品在时间进程上要晚一些且程度较少。这些结果明显表明，细胞不必为活的或针对组合物为自体的以诱导血管生成活性。

SVF细胞摄取标记的经处理的微血管组织组合物微囊泡

进行该测定以确定经处理的微血管组织组合物MV是否被运输至SVF(基质血管成分)细胞中。通过用CM-DiI标记每个小瓶中剩余的100μl经处理的微血管组织组合物物质进行测定，CM-DiI甚至在细胞本身死亡时仍能掺入至细胞膜中。将SVF细胞接种至具有M3D:10培养基的48孔板中，并允许粘附和生长直至它们为约50％汇合。将50μl标记的物质添加至孔中，并孵育6小时。用M3D^TM将孔冲洗3次，并以湿封片进行固定。图像表明细胞中的一些确实摄取物质，因为染料被转移至SVF细胞中，如图8和9中所示。

讨论

经受或未经受辐射的BMA和BMB冻干物质在本测定中用作至内皮细胞的化学引诱剂。辐射物质时观察到细胞迁移的轻微减少。缓冲剂1或2之间的差异可以忽略。

将BMA和BMB物质置于已生长的培养物顶部并孵育24小时时，BMA和BMB物质被活的SVF细胞摄取。

这些实验说明了几个重要的概念。尽管SVF样品显示巨大的细胞损失和冻干后无活力，它们比骨髓样品保留更多的生物活性，骨髓样品未显示细胞损失并显示10％-50％的活力。(SVF细胞损失可能由消化步骤期间过多的酶活性引起。)两种细胞制剂可稳定超过1年。灭菌未在本质上影响它们吸引内皮细胞的能力。

表15：与骨相关的生长因子、受体、激素、基因、转录因子

实施例8–微血管组织的体外和体内效应

如上文所述，不同的干细胞制剂在动物和临床研究中显示出对多种适应症的有益效果。在许多情况下，所给予的干细胞的存活相对不佳。因此，设计了本研究来解决，是否如关于上文几个实施方案中所述的，需要活的干细胞来实现与干细胞相关的一些(或所有的)治疗效益。本研究采用了微血管组织，其为干细胞和祖细胞的丰富来源，并根据上文公开的方法进行处理。

简而言之，通过切碎组织随后酶促消化切碎的组织来从人尸体脂肪组织分离微血管组织。然后将所消化的组织离心以去除脂肪，从而产生微血管组织。将微血管组织重悬在低温保存缓冲液(1:1混合的M3:DC和EZ-CPZ培养基，INCELL Corporation,San Antonio,TX)中，分装至小瓶中，并冻干或者冻干和辐射灭菌。

测定了得到的经处理的微血管组织的细胞数、活力、表型、CFU-F和在血管生成和骨模型中的生物活性。

结果

新鲜分离的、冻干和冻干/灭菌的微血管组织的细胞数和活力示出在表16中。每种制剂的表型示出在表17中。

表16

表17

细胞计数/细胞活力数据清楚地证明，基于微血管组织的处理，细胞数没有显著的变化(例如，基于DAPI DNA染色的细胞核摄取，无论是新鲜的、干燥的或干燥的和灭菌的，细胞计数大致相等)。然而，冻干的微血管组织显著降低微血管组织中的细胞排斥台盼蓝的能力。冻干诱导活细胞百分比的约70％的降低。暴露至辐射进一步降低活力，使得微血管组织中仅约2％的细胞是活的。此外，当分析功能性间充质干细胞(使用建立的集落形成单元-成纤维细胞(CFU-F)测定)时，在冻干活冻干/灭菌制剂中未检测到功能性间充质干细胞。

有趣的是，尽管细胞数未变并且活力降低，不同的处理方法改变了细胞的表型。如表17中所示，冻干/灭菌微血管组织中IV型胶原轻度增加(相比新鲜制剂)。该数据表明冻干/灭菌微血管组织可良好适于修复软组织，这至少部分是由于其增加的胶原密度。已测试了基于胶原的物质在组织改造中的应用，然而，本文中公开的微血管组织特别有用，因为该物质容易获取，并且具有增加的“干性(stemness)”(如下文所述)。确定的造血干细胞标志物CD31(造血干细胞)、CD34(骨髓/造血干细胞)、CD44(癌症干细胞样细胞)和CD45(造血干细胞)中的每种基本上都响应冻干和灭菌而上调。因此，尽管冻干/灭菌微血管组织中细胞活力的近乎完全降低，剩下的任何细胞都具有已知的由干细胞表达的标志物的增加的表达。因此，由于该增加的干性(和增加的干性诱导的间接效应，例如能促进修复、来自微血管组织的生长因子释放等的其他内源细胞的旁分泌募集)，冻干/灭菌微血管组织可能跟更适于组织再生。

评估了不同的微血管组织募集其他类型的细胞的能力。募集的细胞可通过多种机制促进受损或患病组织的修复或再生。例如，募集的内皮细胞可促进血管形成，从而改善血液供应，这可促进新的组织形成。募集的内源干细胞可启动级联事件，其促进新的组织生长和/或修复现存的受损组织。以DiI标记人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并放置在Transwell板顶部，在底部孔中具有不同类型的微血管组织。48小时后计数每种类型的微血管组织的穿过内部孔膜的HUVEC数目，并与作为对照的单独的培养基或补充有表皮生长因子(EGF)的培养基比较。图10示出了结果。检测到了HUVEC细胞响应于单独的培养基的很少的迁移。被确定为HUVEC迁移的诱导物的EGF，引起单独的培养基的约10倍的迁移。新鲜分离的微血管组织(图10中“消化的”)相比EGF诱导略少的迁移，并且冻干诱导甚至更少的迁移(但其仍大于单独的培养基)。出人意料的是，冻干/灭菌微血管组织相比EGF诱导近2倍的迁移，和相比单独的培养基近20倍的迁移。因此，干燥和灭菌的微血管组织显著增加了其体外募集细胞的能力。在几个实施方案中，该增加的能力至少部分提供了改善的体内组织修复和/或再生。

通过证明冻干/灭菌微血管组织对使得缺血的组织诱导更强和更快的血流恢复，证实了增加的体内修复。根据建立的方法对SCID小鼠进行单侧结扎并横切股动脉以重复缺血(一种引起严重组织损伤的疾病)。在第0、3和7天将以不同方式处理的微血管组织引入至缺血肢体，并通过激光多普勒在第0、7和14天对小鼠成像。如图11中所示，注射盐水的对照动物在7或14天后显示很少的血流恢复(缺血肢体以箭头指示)。相反，冻干微血管组织到第14天时引起血流至少部分的恢复。然而，冻干/灭菌微血管组织到第7天时引起血流大量增加，在第14天时血流大部分与对侧对照肢体不能区分开来。这些数据证实了体外迁移数据，并且表明在几个实施方案中，冻干/灭菌微血管组织可促进血流恢复。

在几个实施方案中，血流的恢复至少部分是由于形成了新的血管，包括小血管(例如，微血管)、中间血管和大直径血管(例如，为血液至组织的主要供应者的那些)。将基质胶(0.5mL)与盐水或微血管组织(人)混合以产生微血管组织植入物，经皮下将其注射至SCID小鼠中。14天后去除植入物，固定并用CD31荧光抗体染色。测量浸入植入物的血管的大小并利用显微镜计数。标准偏差为平均计数/视野的12％-30％。在每个处理步骤后测试2个剂量的组织。未发现人CD31+细胞。

图12概述了植入微血管组织植入物(具有不同细胞数的和以不同方式处理)后，与浸润不同血管大小相关的数据。基质胶引起每个视野约35根血管，其大多数为小血管。植入具有约50,000个细胞的冻干微血管组织产生增加的浸润，更有力地生成中间大小的血管。植入具有约500,000个细胞的冻干微血管组织引起更进一步的血管生成，大直径血管数目大量增加。植入具有约50,000个细胞的冻干/灭菌微血管组织造成血管数目相比对照增加，生成了一些大血管。植入具有约500,000个细胞的冻干/灭菌微血管组织引起大量的血管生成，相比对照大出两倍多。有趣的是，相比50,000个细胞剂量，虽然活力接近0，较大的细胞数产生大量的大直径血管。因此，给予冻干或冻干/灭菌的经处理的微血管组织看起来能增强大直径血管的形成。这些数据进一步支持了微血管组织促进血管迁移和/或血管形成的能力，这是修复组织的一个重要方面。此外，在几个实施方案中，不同大小血管的生成不仅确保了从循环系统的主要分支携带血液至目标组织的充足能力(大直径)，也确保了血液能够有效分布在整个目标组织中，甚至内部部分中(中间和小血管)。

总之，这些数据表明微血管组织具有体外和体内诱导血管生成的能力。因此，微血管组织是具有高度吸引力的机制，凭借其可基于其增加血管生成的能力来建立组织修复和/或再生，这将通过确保足够的血液供应和营养物/氧气流来促进和/或维持组织修复和/或再生。

另外，评估了微血管组织促进骨和软骨修复的能力。关于骨，在成熟山羊的干骺端远端钻孔制作8mm x 2cm临界大小的缺损。仅将组织支架(生物纤维,Tornier)紧紧卷起并插入至缺损中，或包含微血管组织(体积1ml,～10⁶个细胞)。通过添加1ml水至小瓶中来简单地装载细胞，简短涡旋，然后将内容物滴在支架上，并等待5min以结合。12周时对缺损进行耐压测试并脱钙用于组织学分析。

图13A-13C示出了与骨缺损修复相关的数据。图13A示出了修复的骨相比对侧对照的强度、弹性系数和韧度。仅使用支架造成受损的骨具有对照骨的约20％强度和弹性系数，以及对照骨的约50％的韧度。当支架补充有冻干/灭菌微血管组织时，强度、弹性系数和韧度中的每种相对于单独的支架均增加。因此，这些数据表明微血管组织的使用促进骨损伤的修复。图13B和13C示出了来自单独的支架处理的骨和以补充有微血管组织的支架处理的骨的代表性组织学。图13B(仅支架)示出了骨与放在缺损中的纤维支架之间的连接处的一些初步骨赘形成。这表明纤维支架构成了至少一些骨修复，这可通过图13A的数据证明。在图13C中，组织学表明冻干/灭菌微血管组织的添加引起支架边缘处的真实骨形成。因此，在相同的时间段内，微血管组织促进骨形成，而非脱钙前体成为骨。这表明微血管组织联合支架的使用可加速愈合过程。

关于软骨修复，在成熟山羊的中间滑车槽上的软骨中打孔产生4mmx 7mm临界大小的缺损。缺损为约1mm深，其比软骨略深。将单独的组织支架(生物纤维,Tornier)或补充有冻干/灭菌微血管组织(～10⁶个细胞)的组织支架放入缺损，并在每个角以7-0尼龙缝线固定住位置。3个月后，经组织学检查缺损。该数据示出在图14A-14H中。图14A-14D显示了来自单独的支架的数据，而图14E-14H示出了来自补充有微血管组织的支架的数据。图14A示出了先前受损的软骨上的支架的宏观视图，而图14E显示了补充有微血管组织的支架的相同视图。两个处理组显示了修复证据。图14B和14F示出了软骨的苏木精和伊红染色。包含微血管组织的支架的使用相比使用单独的支架显示了改善的边缘填充。图14C和14G示出了番红O染色，并揭示了以微血管组织处理的缺损中的较大程度的蛋白聚糖和截留。图14D和14H示出了缺损的甲苯胺蓝染色，且揭示在将微血管组织用于处理缺损时，新生成的软骨基质染色更像成熟软骨。这些数据与上述的骨实验一起，证明了微血管组织促进软骨修复。

还进行了实验来评估微血管组织修复腱的能力。暴露大鼠跟腱并用小鼠拔牙钳磨损。以相同的方式操作对照。一组大鼠仅以支架处理，而另一组以补充有冻干/灭菌微血管组织的支架处理。7天后处死大鼠用于qPCR、组织学和免疫组织化学分析。支架组在跟腱的前表面上接受4mmX 7mm生物纤维-CM支架。在微血管组织和处理组中将支架装载10⁶个微血管细胞。对照数据示出在图15A(马森三色染色)和15B(腱生蛋白的免疫组织化学)中。支架组的数据示出在图15C和15D中。马森三色染色(图15C)揭示支架中和支架周围的小的致密胶原袋，表明初步的腱修复。类似地，腱生蛋白的免疫组织化学染色(图15D)揭示腱和植入的支架之间的边缘处表达的增加，再次暗示缺损的初步修复。

微血管组织组的数据示出在图15E和15F中。马森三色染色(15E)揭示在支架中和支架周围大量形成致密胶原，表明缺损的大量修复。类似地，腱生蛋白的免疫组织化学染色揭示腱与植入的支架之间的广泛表达。这些数据也表明缺损的大量修复。

总之，这些实验中提供的数据确定了微血管组织不仅能够再生血管(这在建立和维护对目标组织的血液供应中起着重要作用)，而且还能够促进骨、软骨和腱的修复。在几个实施方案中，促进的血管生成至少部分地在微血管组织引起新的组织的生成和维护的能力中起作用。

本说明书提及的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文中，直至与本文描述相矛盾的程度。

预期可进行上文公开的实施方案的具体特征和方面的不同组合或亚组合，并且其仍然落入一个或多个本发明中。此外，本文公开的与实施方案相关的任何特定特征、方面、方法、性质、特点、质量、属性、元素等可用于本文所示的所有其他的实施方案中。因此，应理解所公开的实施方案的不同特性和方面可彼此组合或替代，以形成所公开的发明的不同模式。因此，预期本文公开的当前发明的范围不应被上述特别公开的实施方案限制。此外，虽然可对本发明进行不同的修改和形式改变，在附图中显示了其具体的实例，并且在本文中有详细描述。然而，应理解，本发明不限于公开的特定形式或方法，但相反，本发明包括落入描述的不同实施方案的精神和范围以及所附权利要求的所有修改、等同物和替代物。本文公开的任何方法不必以所述的顺序进行。本文公开的方法包括从业者采取的某些行为；然而，它们也可包括任何第三方对那些行为的明确或暗示的指导。例如，诸如“给予微血管组织”的行为包括“指导给予微血管组织”。本文公开的范围也包括任何和所有重叠、子范围以及以上的组合。诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”、“在…之间”等的语言包括所述的数字。术语前面的数字如“约(about/approximately)”包括所述的数字。例如，“约3mm”包括“3mm”。

Claims

1.组合物，其包含经处理的微血管组织，

其中所述经处理的微血管组织包含分离的多能细胞，或者获自或来源于多能细胞或来自所述微血管组织的细胞膜，

其中所述组合物具有血管生成活性或抗炎活性，并且

其中所述组合物经辐射灭菌，和/或所述组合物中的病毒被灭活。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述细胞或组织未经培养。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中存在的少于或等于50％的细胞是活的。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中存在的少于或等于10％的细胞是活的。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中存在的细胞不是活的。

6.如权利要求1所述的组合物，其中至少1％的所述细胞排斥台盼蓝。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物经干燥、冻干或冻存。

8.如权利要求7所述的组合物，其中所述组合物在室温下储藏至少1个月时保留可测量的血管生成活性或抗炎活性。

9.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含赋形剂。

10.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含可植入的支架。

11.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含可植入的基质。

12.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含来源于骨的植入物、生物纤维支架、多孔的可吸收聚合物、包含组织产品的油灰、或缝线。

13.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含水凝胶。

14.如权利要求10所述的组合物，其中细胞、组织或细胞膜存在于所述可植入的支架的面向骨、腱或皮肤的表面上。

15.如权利要求11所述的组合物，其中细胞、组织或细胞膜存在于所述可植入的基质的面向骨、腱或皮肤的表面上。

16.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物经配制用于静脉内给药。

17.如权利要求1所述的组合物，其中所述细胞或组织获自哺乳动物供体。

18.如权利要求1所述的组合物，其中所述细胞或组织获自人。

19.如权利要求17所述的组合物，其中在获取所述细胞或组织时，所述供体为健康的哺乳动物。

20.如权利要求1所述的组合物，其中所述细胞包含干细胞或祖细胞。

21.如权利要求1-20中任一项所述的组合物，其中通过将所述组合物暴露于辐射而将所述组合物灭菌。

22.制备包含分离的多能细胞的组合物的方法，其中所述组合物具有血管生成活性或抗炎活性，所述方法包括：

a.解离获自供体哺乳动物的微血管组织样品以释放其中的多种多能细胞；

b.使多种所释放的多能细胞与一种或多种其他的组织组分分离以制备包含分离的多能细胞的组合物；

c.任选干燥、冻干或冻存根据(b)或(d)制备的组合物；

d.对从(b)或(c)产生的组合物进行辐射灭菌，和/或将从(b)或(c)产生的组合物中存在的病毒灭活，

其中从(d)产生的组合物保留有可测量的血管生成活性或抗炎活性。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述细胞或组织未经培养。

24.如权利要求22所述的方法，还包括在(c)之前过滤所释放的细胞或组合物。

25.如权利要求22所述的方法，其中(a)所述的解离包括将所述组织样品与一种或多种蛋白酶接触。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶不包括胶原酶。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述蛋白酶包括如下物质或由如下物质组成：

1型胶原酶以及分散酶或嗜热菌蛋白酶；或者

MMP2、MMP 14以及分散酶或嗜热菌蛋白酶。

28.如权利要求22所述的方法，其中(a)所述的解离或(b)所述的分离包括超声搅拌、离心、过滤或使用密度梯度。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述组织为脂肪来源的组织、骨髓或骨、肌肉组织、脐带组织或羊膜组织，并且所述超声搅拌、过滤、离心或使用密度梯度使所述释放的多能细胞与脂肪细胞或者又一种其他的细胞或组织组分分离。

30.如权利要求28所述的方法，其中所述组织为脂肪来源的组织，并且使所述释放的多能细胞与脂肪细胞分离。

31.如权利要求28所述的方法，其中所述组织为肌肉组织、脐带组织或羊膜组织，并且所述超声搅拌、过滤、离心或使用密度梯度使所述释放的多能细胞与脂肪细胞或者又一种其他的细胞或组织组分分离。

32.制备包含经处理的微血管组织的组合物的方法，其中所述组合物具有血管生成活性或抗炎活性，所述方法包括：

a.解离获自供体哺乳动物的微血管组织样品以制备包含所解离的微血管组织的组合物；

b.从根据(a)制备的组合物去除一种或多种组织组分；

c.任选在(b)或(d)后干燥、冻干或冻存所述组合物；以及

d.在(b)或(c)后对所述组合物进行辐射灭菌，和/或在(b)或(c)后将所述组合物中存在的病毒灭活；

其中从(c)或(d)产生的组合物保留有可测量的血管生成活性或抗炎活性。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述细胞或组织未经培养。

34.如权利要求32所述的方法，还包括将所述组合物过滤。

35.如权利要求32所述的方法，其中(a)所述的解离包括将所述组织样品与一种或多种蛋白酶接触。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶不包括胶原酶。

37.如权利要求35所述的方法，其中所述蛋白酶包括如下物质或由如下物质组成：

1型胶原酶以及分散酶或嗜热菌蛋白酶；或者

MMP2、MMP 14以及分散酶或嗜热菌蛋白酶。

38.如权利要求32-37中任一项所述的方法，其中(a)所述的解离或(b)所述的去除包括超声搅拌、离心、过滤或使用密度梯度。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述微血管组织为脂肪来源的组织，并且所述超声搅拌、离心、过滤或使用密度梯度从根据(a)制备的组合物去除脂肪细胞。

40.包含无菌、干燥组合物的不透水容器，其中所述组合物包含分离的多能细胞或经处理的微血管组织，或者获自或来源于所述细胞或组织的细胞膜，其中所述组合物具有血管生成活性或抗炎活性，其中所述组合物经辐射灭菌，和/或所述组合物中的病毒被灭活，并且其中所述组合物在室温下储藏至少1个月时保留可测量的血管生成活性或抗炎活性。

41.如权利要求40所述的不透水容器，其中所述细胞或组织未经培养。

42.如权利要求40所述的不透水容器，其中所述组合物中存在的少于或等于50％的细胞是活的。

43.如权利要求42所述的不透水容器，其中所述组合物中存在的少于或等于10％的细胞是活的。

44.如权利要求43所述的不透水容器，其中所述组合物中存在的细胞不是活的。

45.如权利要求44所述的不透水容器，其中至少1％的所述细胞排斥台盼蓝。

46.如权利要求40所述的不透水容器，其中所述组合物包含赋形剂。

47.如权利要求40-46中任一项所述的不透水容器，其中所述组合物还包含可植入的支架。

48.如权利要求40-46中任一项所述的不透水容器，其中所述组合物还包含可植入的基质。

49.如权利要求40-46中任一项所述的不透水容器，其中所述组合物还包含来源于骨的植入物、生物纤维支架、多孔的可吸收聚合物、包含组织产品的油灰、或缝线。

50.如权利要求40-46中任一项所述的不透水容器，其中所述组合物还包含水凝胶。

51.如权利要求47所述的不透水容器，其中细胞、组织或细胞膜存在于所述可植入的支架的面向骨、腱或皮肤的表面上。

52.如权利要求48所述的不透水容器，其中细胞、组织或细胞膜存在于所述可植入的基质的面向骨、腱或皮肤的表面上。

53.如权利要求40-46中任一项所述的不透水容器，其中所述组合物经配制用于静脉内给药。

54.如权利要求40-46中任一项所述的不透水容器，其中所述细胞或组织获自哺乳动物供体。

55.如权利要求40-46中任一项所述的不透水容器，其中所述细胞或组织获自人。

56.如权利要求54所述的不透水容器，其中在获取所述细胞或组织时所述供体为健康的哺乳动物。

57.如权利要求40-46中任一项所述的不透水容器，其中所述细胞包含干细胞或祖细胞。

58.如权利要求40-46中任一项所述的不透水容器，其中所述容器为包含气密封口的小瓶。

59.如权利要求40-46中任一项所述的不透水容器，其中所述容器存在于包含无菌内壁的密封包装中。

60.权利要求1-20中任一项所述的组合物或通过权利要求22-39中任一项所述的方法制备的组合物在制备用于治疗或预防哺乳动物中的损伤或疾病或者促进哺乳动物中的组织再生的药物中的用途。

61.如权利要求60所述的用途，其中所述组合物经手术植入至所述哺乳动物中。

62.如权利要求61所述的用途，其中所述组合物被植入至或邻近所述哺乳动物中的损伤或疾病位点。

63.如权利要求60所述的用途，其中所述组合物经静脉内提供给所述哺乳动物。

64.如权利要求60-63中任一项所述的用途，其中所述损伤为软组织。

65.如权利要求60-63中任一项所述的用途，其中所述损伤存在于腱、韧带、皮肤、骨、椎间盘或微血管组织中。

66.如权利要求60-63中任一项所述的用途，其中所述损伤存在于软骨中。

67.如权利要求60-63中任一项所述的用途，其中所述损伤或疾病为缺血性损伤、再灌注损伤、微血管损伤或炎症。

68.如权利要求67所述的用途，其中所述疾病为关节炎。

69.干燥和辐射灭菌的微血管组织在制备用于修复个体的腱损伤的药物中的用途，其中微血管组织为所述经处理的微血管组织，

其中所述微血管组织具有血管生成活性或抗炎活性，并且

其中所述微血管组织经辐射灭菌，和/或所述微血管组织中的病毒被灭活。

70.如权利要求69所述的用途，其中所述干燥和辐射灭菌的微血管组织包含多能细胞。

71.如权利要求69-70中任一项所述的用途，其中所述药物具有血管生成活性或抗炎活性。

72.如权利要求70所述的用途，其中多能细胞对所述个体为同种异体的。

73.干燥和辐射灭菌的微血管组织在制备用于修复个体的韧带损伤的药物中的用途，其中微血管组织为所述经处理的微血管组织，

其中所述微血管组织具有血管生成活性或抗炎活性，并且

74.如权利要求73所述的用途，其中所述干燥和辐射灭菌的微血管组织包含多能细胞。

75.如权利要求73-74中任一项所述的用途，其中所述药物具有血管生成活性或抗炎活性。

76.如权利要求74所述的用途，其中多能细胞对所述个体为同种异体的。

77.干燥和辐射灭菌的微血管组织在制备用于修复个体的皮肤损伤的药物中的用途，其中微血管组织为所述经处理的微血管组织，

其中所述微血管组织具有血管生成活性或抗炎活性，并且

78.如权利要求77所述的用途，其中所述干燥和辐射灭菌的微血管组织包含多能细胞。

79.如权利要求77-78中任一项所述的用途，其中所述药物具有血管生成活性或抗炎活性。

80.如权利要求78所述的用途，其中多能细胞对所述个体为同种异体的。

81.干燥和辐射灭菌的微血管组织在制备用于修复个体的骨损伤的药物中的用途，其中微血管组织为所述经处理的微血管组织，

其中所述微血管组织具有血管生成活性或抗炎活性，并且

82.如权利要求81所述的用途，其中所述干燥和辐射灭菌的微血管组织包含多能细胞。

83.如权利要求81-82中任一项所述的用途，其中所述药物具有血管生成活性或抗炎活性。

84.如权利要求82所述的用途，其中多能细胞对所述个体为同种异体的。

85.干燥和辐射灭菌的微血管组织在制备用于修复个体的软骨损伤的药物中的用途，其中微血管组织为所述经处理的微血管组织，

其中所述微血管组织具有血管生成活性或抗炎活性，并且

86.如权利要求85所述的用途，其中所述干燥和辐射灭菌的微血管组织包含多能细胞。

87.如权利要求85-86中任一项所述的用途，其中所述药物具有血管生成活性或抗炎活性。

88.如权利要求86所述的用途，其中多能细胞对所述个体为同种异体的。

89.干燥和辐射灭菌的微血管组织在制备用于修复个体盘损伤的药物中的用途，其中微血管组织为所述经处理的微血管组织，

其中所述微血管组织具有血管生成活性或抗炎活性，并且

90.如权利要求89所述的用途，其中所述干燥和辐射灭菌的微血管组织包含多能细胞。

91.如权利要求89-90中任一项所述的用途，其中所述药物具有血管生成活性或抗炎活性。

92.如权利要求90所述的用途，其中多能细胞对所述个体为同种异体的。