JP5675595B2 - 組織マトリックスのエラスターゼ処理 - Google Patents
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Description
本明細書で用いられるように、「エラスターゼ処理(elastase treatment)」という用語は一般的には、組織のエラスターゼネットワークを破壊する方法で、組織サンプル(又は複数のサンプル)をエラスターゼに曝露し、このようにして1以上の組織サンプルの伸張性を低減することである。エラスターゼ処理は一般的には、組織サンプルが脱細胞化された後に随時(例えば、すぐ後、数時間後、又は数日後)行われる。上に示したように、それは脱細胞化し、次いで長期間(例えば、数週、数箇月、又は更に数年)保存、凍結、又は凍結乾燥された組織で行ってもよい。
240のアミノ酸残基の単鎖ポリペプチドであり、4のジスルフィド架橋を含む。広範な特異性を有し、Ile、Gly、Ala、Ser、Val、及びLeuといった小さな疎水性アミノ酸のカルボキシル側でタンパク質を開裂する。更にアミドとエステルとを加水分解する。ブタ膵臓のエラスターゼは、トリプシン、キモトリプシン、又はペプシンによって攻撃されない基質である、天然エラスチンを加水分解する能力においてプロテアーゼの中でも特有である。ダイズトリプシン阻害剤及びカリクレイン阻害剤を添加することによって、エラスチン分解活性ではなく、タンパク質分解活性が抑制される。
リソソームエラスターゼ、好中球エラスターゼ、多形核白血球エラスターゼ、セリンエラスターゼ、リソソームエラスターゼ、又は顆粒球エラスターゼとしても周知である。29KDaのセリンエンドプロテアーゼは4のジスルフィド結合を有する、238のアミノ酸の単鎖ペプチドであり、ブタ膵臓のエラスターゼと約43%の配列相同性を共有する。白血球エラスターゼは好適にはバリンのカルボキシル側で開裂し、それほどではないにせよ、アラニンの末端(すなわち、カルボキシル側)を更に開裂する。エラスチンの他に、白血球エラスターゼは:軟骨プロテオグリカンと;I、II、II及びIV型コラーゲンと;フィブロネクチンと;を開裂する。
MMP−12はマクロファージエラスターゼとしても周知である。ヒト白血球エラスターゼより広範な範囲の細胞で発現し、不活性酵素(チモーゲン)として分泌される。チモーゲンはプロペプチドドメインを除去することによって活性化される。MMP−12はエラスチン、IV型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ならびに、α1プロテイナーゼ阻害剤、α2抗プラスミン、及びプラスミノーゲン活性化因子阻害剤2を分解するが、間質コラーゲンを分解しない。
不溶性のエラスチン、コラーゲン、免疫グロブリン、血清α1プロテイナーゼ阻害剤、α2マクログロビン、ラミニン、及びフィブリンを加水分解するメタロプロテイナーゼである。
任意の特定の例で用いられるATM又はmATMの形態は適用すべき組織又は器官に依存する。
以下で別段に述べない限り、以下の実施例で用いられたATMはLifeCell社の固有の方法によって処理された。ATMを生成する方法は、この実施例において広範に記載され、個別の実験で用いられるATMの詳細は関連する実施例で提供される。以下の記載はヒト皮膚からのATMの生成に用いられるものである。
皮膚の表皮は、室温で8ないし32時間、ヒト皮膚用の脱表皮化溶液(1MのNaC1、体積濃度で0.5%のTritonX100、10mMのEDTA)において静かに攪拌して、組織サンプルをインキュベートすることによって除去された。表皮層は真皮から除去された。表皮は廃棄され、真皮は更なる処理のために保持された。
細胞成分を除去するために、真皮は脱細胞化溶液(体積濃度で2%のデオキシコール酸ナトリウム、10mMのEDTA、10mMのHEPES緩衝剤、pH7.8ないし8.2)を用いて5ないし60分間すすがれ、次いで、室温で12ないし30時間、その溶液において静かに攪拌してインキュベートした。
洗浄措置は前述の処理ステップを用いて、死細胞、細胞細片、及び残余の化学物質を洗い流すように作用する。脱細胞化した真皮は第1の洗浄溶液(体積濃度で0.5%のTritonX−100及び10mMのEDTAを含むリン酸緩衝食塩水(PBS))に移され、その後、室温で5ないし60分間、静かに攪拌してインキュベートされた。真皮はその後、第2の洗浄溶液(10mMのEDTAを含むPBS)において室温で静かに攪拌して3の連続洗浄を受けた。最初の2の洗浄は短く(各々15ないし60分)、3番目の洗浄は長かった(6ないし30時間)。
洗浄措置後、組織マトリックスは室温で5ないし24時間、体積濃度で15%のマルトデキストリンを含む抗凍結剤溶液に移した。インキュベーションの間、ATM及び溶液は攪拌された。
抗凍結剤のインキュベーション後、得られたATMは好適な大きさに切削され、凍結乾燥され、次いで多様な試験に用いられた。
組織サンプルの伸長性に対するエラスターゼ処理の効果が調査された。その調査に基づいて、組織サンプルの伸長性は、エラスターゼ処理への曝露の結果として減少する可能性があると結論づけた。更に、組織伸長性における変化は組織サンプルの群をエラスターゼ処理に曝露することによって低減できる。
エラスターゼ処理されたmATMの伸張性は処理されないATMの伸張性と比較された。この実施例においては、30の組織サンプル対が取得された。各々の組織サンプル対は、同一ドナーロットからの、1の処理されない組織サンプルと1のエラスターゼ処理された組織サンプルとを含んだ。総ての組織サンプルは上述のLifeCell社の固有の方法によって処理され、それと共に、組織の一部は組織洗浄(ステップ(iii))の後にエラスターゼ処理に曝露された。エラスターゼ処理は:0.25ユニット/mLのエラスターゼ溶液中に組織サンプルを配置するステップと;室温で約20ないし24時間、組織サンプル及びエラスターゼ溶液の混合物をインキュベートするステップと;を具えた。エラスターゼ処理後、組織サンプルは組織洗浄溶液で洗浄された。
多様なエラスターゼの濃度の有効性が試験された。0.1ユニット/ミリリットル程度に低いエラスターゼの濃度は皮膚組織サンプルの伸張性に影響を与えるのに十分であると定量された。
組織サンプルは、上に記載されているLifeCell社の固有の方法を用いて処理された。組織洗浄(ステップiii)後、エラスターゼ処理に曝露された。エラスターゼ処理の間、組織サンプルはそれぞれ、約0.1ユニット/ミリリットル又は約0.5ユニット/ミリリットルのエラスターゼの濃度を有するエラスターゼ溶液に曝露された。エラスターゼ溶液は、湿性の組織サンプル1グラムにつき約3ミリリットルの溶液で組織サンプルと混合された。エラスターゼの曝露は約18時間続いた。エラスターゼの曝露後、組織サンプルはトリスHCl緩衝剤ですすがれ、凍結乾燥溶液にインキュベートされ、凍結乾燥された。
エラスターゼ処理が組織サンプルの大きさに対して有する効果が調査された。この調査に基づいて、組織サンプルの大きさは、エラスターゼ処理への曝露の結果として増加する可能性があることが定量された。
33の組織サンプル対の寸法が定量された。各々の組織サンプル対は、同一ドナーロットからの、1の処理されない組織サンプルと1のエラスターゼ処理された組織サンプルとを含んだ。手短に言うと、33のドナーロットからの処理されないATMの物理的な寸法が測定され、各々のサンプルの面積(すなわち、長さ×幅)が定量された。処理されないATMはエラスターゼ処理を受け、エラスターゼ処理されたmATMを生じさせた。エラスターゼ処理されたmATMの同一の物理的な寸法が測定され、各々のエラスターゼ処理されたmATMの面積(すなわち、長さ×幅)が定量された。各々のATM及びmATMの対でそれぞれに計算された面積は、エラスターゼ処理への曝露の結果として、各々の組織がどの程度大きさが増加したかを定量するために比較された。
図6は、エラスターゼ処理されたmATM404に隣接する処理されないATM402の平面図である。
表1は、エラスターゼ処理前及びエラスターゼ処理後の異なるドナーロット由来の30の組織サンプル対の物理的寸法を示す。
組織におけるエラスチン含有量に対するエラスターゼ処理の効果が考察された。エラスチン含有量の分析は英国のBicolor社から入手可能なFASTIN(登録商標)Elastin Assayを用いて行われ、合成ポルフィリン(スルホン酸形態の5,10,15,20テトラフェニル−21,25ポルフィリン)を用いた特異的な染料結合と関連づけられる。
表2は、エラスターゼ処理前及びエラスターゼ処理後の30の異なる対のドナーロットによる組織サンプル中のエラスチン含有量を示す。エラスチン含有量はFASTIN(登録商標)Elastin Assayを用いて測定された。エラスターゼ処理前は、エラスチン含有量は約1.6重量パーセントないし約5.1重量パーセントの範囲であった。エラスターゼ処理後は、エラスチン含有量は約1.4重量パーセントないし約6.1重量パーセントの範囲であった。
組織サンプルの多様な引張り特性に対するエラスターゼ処理の効果が考察された。
本実施例においては、試験は30の対となるドナーロット由来の組織サンプルで行われた。各々の組織サンプル対は、同一ドナーロットからの、1の処理されない組織サンプルと1のエラスターゼ処理された組織サンプルとを含んだ。言い換えると、各々のドナーロットについて、エラスターゼ処理された組織サンプルと、処理されないサンプルとがある。各々の組織サンプルは、最大負荷、引張り応力、歪みの割合、及びヤング率を定量するために試験を受ける。それらの試験結果は表3にまとめられる。
2のドナーロット由来の組織サンプルは、上に記載されているLifeCell社の固有の方法によって処理された。組織洗浄(ステップ(iii))後、組織サンプルは複数の1センチメートル×7センチメートルの小片に切削された。これらの小片の一部はエラスターゼ処理に曝露された。
組織サンプルの組織診断に対するエラスターゼ処理の効果は更に考察された。
表5は組織サンプルの組織診断試験の結果を示す。列中の各行は試験された1の組織サンプルに対応する。表の第1列は、任意の名称の対応する組織サンプルのドナーロット番号を同定する。表の第2列は対応する組織サンプルがエラスターゼ処理に曝露されたかどうかを示す。項目名「エラスターゼなし」は、対応する組織サンプルが処理されていなかったことを示す一方、項目名「エラスターゼ」は、対応する組織サンプルがエラスターゼ処理に曝露されたことを示す。第1の12個の列におけるデータ及び第2の12個の列におけるデータは、同一群のドナーロット由来の組織サンプルに対応する。
評点 評価
1ないし2 孔がサンプルの0%ないし10%である
3ないし4 孔がサンプルの11%ないし25%である
5ないし6 孔がサンプルの26%ないし40%である
7ないし9 孔がサンプルの41%ないし60%である
10 孔がサンプルの60%を超える
評点 評価
1ないし2 損傷が試験された領域の0%ないし10%にある
3ないし4 損傷が試験された領域の11%ないし25%にある
5ないし6 損傷が試験された領域の26%ないし50%にある
7ないし8 損傷が試験された領域の51%ないし75%にある
9ないし10 損傷が試験された領域の76%ないし100%にある
評点 評価
0 標準的な二重層、明確に規定された血管網、明確な遷移
0ないし2 わずかにしか規定されない乳頭間隆起及び乳頭間突起の起伏
0ないし2 血管網を含む、表面の乳頭層における構造上の特徴の喪失
0ないし2 内側の乳頭層における構造上の特徴の喪失
0ないし2 乳頭層と網状層との間の遷移帯の損失
10 無定形の凝縮層を有する乳頭層の不存在又は置換
評点 評価
1 人工的な分離なし、線維構造は明確
3 急激な分離、いくつかの線維性制限
5 角を形成する分離、無定型のコラーゲン出現
図7は、実施例10における(及び、表5に示した)ドナーロットのうちの2つからの組織サンプル対に対する、例示的なVerhoeff染色を示す。上に示したように、各々の組織サンプル対は、1の処理されない組織サンプル(図7で「通常のALLODERM(登録商標)」として同定される)と、1のエラスターゼ処理された組織サンプル(図7で「エラスターゼ処理された」として同定される)とを含む。染色の暗い部分は組織のエラスチン構造を示す。各々の組織サンプル対については、エラスターゼ処理が組織サンプルの複合型エラスチン構造の実質的なフラグメント化又は破壊を生じないことをVerhoeff染色は示唆する。
図8は、実施例10における(及び、表5に示した)ドナーロットのうちの2つからの組織サンプル対に対する、Alcian blue染色の例を示す。各々の組織サンプル対は、1の処理されない組織サンプル(図8で「通常のALLODERM(登録商標)」として同定される)と、1のエラスターゼ処理された組織サンプル(図8で「エラスターゼ処理された」として同定される)とを含む。
[実施例13]
示差走査熱量測定(DSC)分析は、12の対となるドナーロットにおけるエラスターゼ処理後の組織サンプルの熱安定性の変化を調査するのに用いられた。表6は、多様なドナーロットからの組織サンプルに対する、摂氏(℃)単位で測定される変性開始温度(Onset Tm)と、乾燥重量1g当たりのジュール(J/gdw)単位で表わされる変性エンタルピーとを示す。変性は、例えば熱の印加による組織構造の変化のことである。変性開始温度は変性が生じ始める温度である。変性エンタルピーは組織のコラーゲン及び他のタンパク質を変性するのに必要なエネルギーの測定値である。
組織サンプルの酵素分解への感受性に対するエラスターゼ処理の効果が考察された。
組織サンプルのコラゲナーゼ分解への感受性に対するエラスターゼ処理の効果が考察された。15の異なるドナーロット由来の組織サンプル対が試験された。各々のサンプル対は、エラスターゼ処理を受けた1の組織サンプルと、エラスターゼ処理を受けていない1の組織サンプルとを含んだ。総ての組織サンプルはエラスターゼ処理後に抗凍結剤とともに凍結乾燥を受けた。試験は約6時間、組織サンプルをコラゲナーゼに曝露するステップを具えた。表7は試験の結果を含む。特に、表はコラゲナーゼ曝露後の残余する組織(「残余組織」)の割合(%)を示す。
組織サンプルのトリプシン分解への感受性に対するエラスターゼ処理の効果が更に考察された。更に、15の異なるドナーロット由来の組織サンプル対が試験された。各々のサンプル対は、エラスターゼ処理を受けた1の組織サンプルと、エラスターゼ処理を受けていない1の組織サンプルとを含んだ。総ての組織サンプルは抗凍結剤とともに凍結乾燥を受けた。試験はある設定期間、組織サンプルをトリプシンに曝露するステップを具えた。表8は試験の結果を含む。特に、表はトリプシン曝露後の残余する組織(「残余組織」)の割合(%)を示す。
別の実験は、経時的なエラスターゼ処理に対する組織サンプルの反応を考察するために行われた。
この実験においては、2の組織のドナーロット由来の組織サンプルが組織洗浄(ステップ(iii))まで、上述のLifeCell社の固有の方法によって処理された。組織はその後多数の3センチメートル×7センチメートルの小片に切削された。それらの小片の一部はトリスHCl緩衝剤ですすがれ、エラスターゼで処理された。その後、組織サンプルの寸法の変化が30時間の期間にわたって3時間おきに測定された。エラスターゼは全期間にわたって提供された。エラスターゼで処理されなかった対応する組織サンプルの寸法は更に測定された。これらの寸法は図10A及び10Bにおいて「コントロール」測定値として同定された
Claims (31)
- 真皮由来の無細胞マトリックス(ATM)から内殖又は移植用の修飾型無細胞マトリックス(mATM)を生成する方法であって、前記ATMをエラスターゼにある期間曝露するステップを具え、その曝露によって修飾型ATM(mATM)が生じ、張力量に起因する前記mATMの伸張率が、当該張力量に起因する前記ATMの伸張率以下であることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記エラスターゼが溶液中にあり、前記方法が、張力量の下で前記mATMの所望の伸張率を取得するために、前記溶液における前記曝露の時間及びエラスターゼの濃度を制御するステップを更に具えることを特徴とする方法。
- 請求項2に記載の方法において、前記mATMの所望の伸張率が14%ないし24%の範囲にあり、前記張力量が5ニュートン/cmであることを特徴とする方法。
- 請求項3に記載の方法において、前記mATMの所望の伸張率が19%であることを特徴とする方法。
- 請求項2に記載の方法において、前記エラスターゼの濃度が0.1ユニット/ミリリットルないし0.5ユニット/ミリリットルの範囲にあることを特徴とする方法。
- 請求項5に記載の方法において、前記エラスターゼの濃度が0.2ユニット/ミリリットルないし0.25ユニット/ミリリットルの範囲にあることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記期間が12時間ないし24時間の範囲にあることを特徴とする方法。
- 請求項7に記載の方法において、前記期間が18時間ないし24時間の範囲にあることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法が、前記ATMをエラスターゼに期間曝露する間に、前記ATMと前記溶液とを攪拌するステップを更に具えることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記ATMがヒト組織から生成されることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記ATMがヒト以外の哺乳類組織から生成されることを特徴とする方法。
- 請求項11に記載の方法において、前記ヒト以外の哺乳類組織がブタ組織であることを特徴とする方法。
- 請求項11に記載の方法において、前記ヒト以外の哺乳類組織がウシ組織であることを特徴とする方法。
- 請求項1の方法によって生成されることを特徴とする修飾型無細胞組織マトリックス。
- 内殖又は移植用の修飾型無細胞マトリックスを生成するために、真皮由来の無細胞組織マトリックスの群(ATMs)を処理する方法であって、等しい張力量が前記群中の前記ATMsの各々に印加される場合に、前記群中の前記ATMsの少なくとも一部が前記群中の他のATMsと異なる伸張率を有する方法において、当該方法が:前記群の1以上のATMsをエラスターゼにある期間曝露するステップであって、その曝露によって1以上の修飾型ATMs(mATMs)が生じるステップを具え、張力量に起因する前記mATMsのうちの1以上の伸張率が、同一の前記張力量に起因する対応するATMsの伸張率以下となることを特徴とする方法。
- 請求項15に記載の方法において、前記エラスターゼが、溶液中に提供され、エラスターゼの濃度を構成することを特徴とする方法。
- 請求項15に記載の方法において、前記mATMにわたる伸張率における変化は前記ATMにわたる伸張率における変化よりも小さいことを特徴とする方法。
- 請求項15に記載の方法において、前記mATMのうちの1以上の複数の伸張率は14%ないし24%の範囲にあり、前記張力量が5ニュートン/cmであることを特徴とする方法。
- 請求項15に記載の方法において、前記mATMのうちの1以上の複数の伸張率は19%であり、前記張力量が5ニュートン/cmであることを特徴とする方法。
- 請求項16に記載の方法において、前記エラスターゼの濃度が0.1ユニット/ミリリットルないし0.5ユニット/ミリリットルの範囲にあることを特徴とする方法。
- 請求項20に記載の方法において、前記エラスターゼの濃度が0.2ユニット/ミリリットルないし0.25ユニット/ミリリットルの範囲にあることを特徴とする方法。
- 請求項15に記載の方法において、前記期間が12ないし24時間の範囲にあることを特徴とする方法。
- 請求項22に記載の方法において、前記期間が18時間ないし24時間の範囲にあることを特徴とする方法。
- 請求項15に記載の方法が、前記群の1以上のATMをエラスターゼに期間曝露する間に、前記群の1以上のATMと前記溶液とを攪拌するステップを更に具えることを特徴とする方法。
- 請求項15に記載の方法において、前記ATMのうちの1以上がヒト組織から生成されることを特徴とする方法。
- 請求項15に記載の方法において、前記ATMのうちの1以上がヒト以外の哺乳類組織から生成されることを特徴とする方法。
- 請求項26に記載の方法において、前記ヒト以外の哺乳類組織がブタ組織であることを特徴とする方法。
- 請求項26に記載の方法において、前記ヒト以外の哺乳類組織がウシ組織であることを特徴とする方法。
- 請求項15に記載の方法によって修飾型無細胞組織の群を処理することによって作られた、修飾型無細胞組織マトリックス。
- 内殖又は移植用の修飾型無細胞組織マトリックス(mATM)であって、前記mATMが真皮由来の無細胞組織マトリックス(ATM)から生成される、修飾型無細胞組織マトリックスにおいて:破壊されたエラスチンネットワークと;コラーゲンマトリックス;とを含み、5ニュートン/cmの張力に起因する前記mATMの伸張率が14%ないし24%の範囲になるように前記エラスチンネットワークが十分に破壊され、前記コラーゲンマトリックスが無傷であることを特徴とするmATM。
- 請求項30に記載のmATMにおいて、前記コラーゲンマトリックスが架橋結合を含まないことを特徴とするmATM。
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