BR112013026200A2

BR112013026200A2 - método para preparar uma composição de matriz de tecido, e matriz de tecido

Info

Publication number: BR112013026200A2
Application number: BR112013026200A
Authority: BR
Inventors: Richter Bowley Melissa; Goel Raghav; Sun Wenquan
Original assignee: Lifecell Corp
Priority date: 2011-04-14
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2019-08-27
Also published as: US10828391B2; WO2012142419A1; US20120263763A1; AU2012242694A1; US9375513B2; CA2832838A1; US20160271295A1; US20180353644A1; CA2832838C; EP2696908B1; EP2696908A1; AU2012242694A8

Abstract

resumo método para preparar uma composição de matriz de tecido, matriz de tecido, preenchimento de tecido trata-se de métodos para produzir preenchimentos de tecido. em certas modalidades, o tecido é similar a floco e tem propriedades regenerativas.

Description

MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE MATRIZ DE TECIDO, E MATRIZ DE TECIDO

Este pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. $ 119 ao Pedido Provisório Número U.S. 61/475.378, que foi depositado em 14 de abril de 2011.

A presente revelação refere-se a preenchimentos de tecido e, mais particularmente, a métodos para preparar preenchimentos de tecido que têm um formato similar a floco e preenchimentos de tecido preparados de acordo com esses métodos.

Vários tipos de curativos de ferimento e preenchimentos de tecido mole são usados para regenerar, reparar ou de outro modo tratar tecidos ou órgãos doentes ou danificados. Tais materiais incluem géis à base de hialuronano, composições de colágeno solubilizadas e reticuladas, matrizes de tecido micronizadas e composições poliméricas sintéticas em hidrogel ou outras formas. Cada um desses materiais tem desvantagens potenciais se usados como preenchimentos de tecido mole em massa ou curativos de ferimentos profundos, incluindo adequabilidade limitada para ferimentos profundos, inabilidade de regeneração, tendência para aumentar a resposta inflamatória ou tendência à degradação mediante a exposição à radiação.

De acordo com certas modalidades, um método para preparar uma composição de matriz de tecido é fornecido. O método compreende selecionar uma matriz de tecido à base de colágeno, colocar em contato a matriz com uma solução crioprotetora, congelar a matriz e cortar a matriz, em que a temperatura da matriz de tecido está na faixa de -10 °C a -40 °C para a etapa de corte.

Em certas modalidades, um preenchimento de tecido é fornecido. O preenchimento compreende uma matriz de tecido à base de colágeno, em que a matriz foi colocada em contato com

2/35 uma solução crioprotetora e congelada em seguida e em que a matriz foi cortada a uma temperatura entre -10 °C e -40 °C após o congelamento.

Em certas modalidades, um método para preparar uma composição de matriz de tecido é fornecido. O método compreende selecionar uma matriz à base de colágeno, colocar em contato a matriz com uma solução crioprotetora, congelar a matriz, ajustar a temperatura da matriz de tecido e do crioprotetor entre -10 °C a -40 °C, cortar a matriz de tecido congelada, colocar a matriz de tecido cortada em um liquido para formar uma suspensão e secar por congelamento a suspensão.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um diagrama de um dispositivo de ralar para realizar métodos da presente revelação, de acordo com certas modalidades.

A Figura 2 é um diagrama de uma coluna de perfusão para produzir preenchimentos de tecido da presente revelação, de acordo com certas modalidades.

A Figura 3 é um fluxograma que sumariza as várias etapas que podem ser usadas para produzir preenchimentos de tecido, de acordo com certas modalidades do método revelado.

As Figuras 4A e 4B são fotografias que demonstram a morfologia de vários pedaços de tecido sob luz e microscópio SEM respectivamente, de acordo com certas modalidades, conforme descrito no Exemplo 1.

A Figura 5 é um gráfico que mostra a distribuição de tamanho de floco de tecido de acordo com certas modalidades, conforme descrito no Exemplo 1.

A Figura 6 é um gráfico que mostra as frações de massa de gelo e domínio de tecido amorfo como uma função de concentração de crioprotetor, de acordo com certas modalidades, conforme descrito no Exemplo 2.

3/35

A Figura 7 é um gráfico que mostra termogramas de flocos de tecido de acordo com certas modalidades, conforme descrito no Exemplo 4.

As Figuras 8A e 8B são gráficos que mostram a resistência de material de tecido processado, de acordo com certas modalidades, a digestão de colagenase e tripsina, respectivamente, conforme descrito no Exemplo 4.

A Figura 9A é uma fotografia de flocos de tecido reidratados, de acordo com certas modalidades e a Figura 9B é um esquema de uma almofada de testagem de pressão, conforme descrito no Exemplo 5.

As Figuras 10A e 10B são gráficos que mostram a distribuição de tamanho de largura e comprimento, respectivamente, de material de tecido processado, de acordo com certas modalidades, conforme descrito no Exemplo 6.

As Figuras 11A a 11D são fotografias de uma espuma de tecido mole, preparada de acordo com certas modalidades, conforme descrito no Exemplo 6.

As Figuras 12A a 12D mostram várias seções histológicas de várias matrizes de tecido após a implantação em um animal, de acordo com certas modalidades, conforme descrito no Exemplo 6.

DESCRIÇÃO DE CERTAS MODALIDADES EXEMPLIFICATIVAS

Será feita agora referência em detalhes a certas modalidades exemplificativas, de acordo com a presente revelação, certos exemplos das quais são ilustrados nos desenhos anexos. Sempre que possível, os mesmos números de referência serão usados por todos os desenhos para se referir às mesmas partes ou partes similares.

Neste pedido, o uso de singular inclui o plural a não ser que especificamente determinado de outro modo. Neste pedido, o uso de ou significa e/ou a não ser que determinado de outro modo. Além disso, o uso do termo que

4/35 inclui, assim como outras formas, tais como inclui e incluído, não é limitante. Qualquer faixa descrita no presente documento será entendida incluindo os pontos de extremidade e todos os valores entre os pontos de extremidade. Deve-se entender que os benefícios e vantagens descritos acima podem referir-se a uma modalidade ou podem referir-se a diversas modalidades. Onde apropriado, os aspectos de qualquer um dos exemplos e modalidades descritos acima pode ser combinado aos aspectos de qualquer um dos outros exemplos descritos para formar exemplos adicionais que têm propriedades comparáveis ou diferentes e são direcionados aos mesmos problemas ou problemas diferentes.

Os cabeçalhos de seção usados no presente documento são para propósitos organizacionais apenas e não devem ser entendidos como limitantes à matéria descrita. Todos os documentos ou porções de documentos citados neste pedido, incluindo, mas sem limitações, patentes, pedidos de patente, artigos, livros e pesquisas, são expressamente incorporados ao presente a título de referência em sua totalidade para qualquer propósito.

Conforme usado no presente documento, matriz de tecido será referido a material derivado de tecido animal que inclui uma matriz que contém colágeno. Tais matrizes de tecido podem incluir tecido intactos, tecidos que foram parcial ou completamente descelularizados ou matizes colágenas sintéticas (por exemplo, matrizes 3D formadas de tecidos suspensos ou de outro modo processados). Conforme descrito adicionalmente abaixo, as matrizes de tecido adequadas podem ser acelulares. Qualquer matriz de tecido adequada pode ser usada, dependendo do sítio de implantação pretendido, contanto que o tecido seja suscetível ao uso com os métodos descritos no presente documento.

A matriz de tecido similar a floco revelada no

5/35 presente documento possui diversas propriedades que tornam a mesma adequada ao uso como um preenchimento de tecido mole em massa ou curativo de ferimento profundo. A matriz de tecido similar a floco é regenerativa, permitindo a revascularização e repovoamento de células hospedeiras. O tamanho grande dos flocos de tecido individual, em relação às partículas de tecido micronizadas, impede a migração dos flocos nas áreas circundantes. A matriz de tecido similar a floco revelada no presente documento revelou ser mais estável e resistente á degradação enzimática em comparação às partículas de tecido micronizadas. A geometria dos flocos de tecido permite que os mesmos formem uma suspensão estável sem gelação ou separação de fase, o que torna os preenchimentos de tecido adequadas para preencher vãos grandes (dezenas a centenas de mililitros). Quando usada para formar uma suspensão que pode ser seca por congelamento, a suspensão de flocos de tecido pode conter canais interconectados relativamente grandes que permitem que os fluidos fluam livremente. Quando usados como curativos de ferimento e/ou sistemas de terapia de ferimento por pressão negativa, os canais podem ajudar a suportar a revascularização de repovoamento de células hospedeiras. Esses canais interconectados podem converter a pressão, tornando a matriz de tecido similar a floco mais suscetíveis ao tratamento de ferimentos profundos, enquanto também é compatível com terapia por pressão negativa.

De acordo com certas modalidades, um método para preparar uma composição de matriz de tecido é fornecido. O método compreende selecionar uma matriz de tecido à base de colágeno, colocar em contato a matriz com uma solução crioprotetora, congelar a matriz e cortar a matriz, em que a temperatura da matriz de tecido está na faixa de -10 °C a -40 °C para a etapa de corte. Em certas modalidades, um preenchimento de tecido é fornecido. O preenchimento

6/35 compreende uma matriz de tecido à base de colágeno, em que a matriz foi colocada em contato com uma solução crioprotetora e congelada em seguida e em que a matriz foi cortada após o congelamento a uma temperatura entre -10 °C e -40 °C. Em certas modalidades, um método adicional para preparar uma composição de matriz de tecido é fornecido. O método compreende selecionar uma matriz à base de colágeno, colocar em contato a matriz com uma solução crioprotetora, congelar a matriz, ajustar a temperatura da matriz de tecido e do crioprotetor entre -10 °C a -40 °C, cortar a matriz de tecido congelada, colocar a matriz de tecido cortada em um liquido para formar uma suspensão e secar por congelamento a suspensão. Em certas modalidades, uma matriz de tecido é fornecida. Adicionalmente, em várias modalidades, matrizes de tecido produzidas de acordo com os métodos descritos no presente documento são fornecidas.

Após uma matriz de tecido ter sido selecionada, uma solução crioprotetora pode ser usada para tratar a matriz de tecido antes do congelamento. A solução crioprotetora pode impedir danos ao tecido de danos como resultado de congelamento e/ou derretimento, pode reduzir a quantidade de água congelada no tecido através de desidratação osmótica e pode garantir a formação de uma matriz vítrea de temperatura abaixo de zero alta no tecido. O uso de um crioprotetor pode também ajudar a manter um saldo entre teor de gelo e tecido não congelado após o congelamento. Uma matriz de tecido congelada que contém muito gelo pode ser frágil e difícil de cortar. De modo contrário, a matriz de tecido congelada com gelo insuficiente é muito macio e aquece rapidamente durante o corte, tornando o mesmo difícil de cortar também. Assim, a concentração do crioprotetor na solução crioprotetora pode ser usada para controlar o teor de gelo e dureza da matriz congelada. Em algumas modalidades, o teor de gelo da matriz

7/35 congelada está na faixa de 40 a 60%.

Qualquer crioprotetor adequado pode ser usado na solução crioprotetora. Em certas modalidades, os crioprotetores adequados podem incluir maltodextrina, sacarose, polietilenoglicol (PEG) e polivinilpirrolidona (PVP) ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o crioprotetor compreende maltodextrina. Em algumas modalidades, a solução crioprotetora contém 5 a 50% (p/v) de maltodextrina. Em algumas modalidades, a solução contém 15 a 25% (p/v) de maltodextrina.

Após o tratamento com a solução crioprotetora, a matriz de tecido é então congelada. Em certas modalidades, a matriz de tecido é congelada a -80 °C. O congelamento pode ser realizado com o uso de um congelador a -80 °C. Antes do corte, a temperatura da matriz de tecido pode ser ajustada se necessário a uma temperatura na faixa de -10 °C a -40 °C para a etapa de corte. Essa faixa de temperatura pode ajudar a manter o saldo apropriado entre teor de gelo e tecido não congelado, que facilita o corte.

Após o ajuste da temperatura, o tecido pode ser cortado. Em algumas modalidades, o tecido é cortado em pedaços de formato e tamanho irregulares. Em algumas modalidades, o tamanho e formato irregulares dão ao tecido uma aparência similar a floco. Em algumas modalidades, o tecido cortado tem uma distribuição de tamanho selecionada. Em certas modalidades, o tecido cortado tem uma distribuição de tamanho na faixa de 0,2 a 5 mm em comprimento, 0,2 a 3 mm em largura e 0,2 a 0,3 mm em espessura. Quando hidratado, a maior parte do tecido cortado dentro dessa distribuição de tamanho pesa entre 0,5 e 2,0 mg. A distribuição de tamanho e formato irregular do tecido cortado facilitam a formação de canais interconectados grandes que permite que fluido corporal flua livremente quando o tecido cortado é colocado

8/35 em suspensão e assim auxilia a revascularização e repovoamento de células hospedeiras. Em alguns usos, o tamanho grande do tecido cortado, em relação às partículas de tecido micronizadas menores, impede a migração dos tecidos cortados para sítios anatômicos circundantes quando implantados ou colocados em ou sobre um ferimento. O tecido cortado que é maior que a distribuição de tamanho revelada pode ser também indesejável. Se o tecido cortado for muito grande, os pedaços individuais podem tomar muito espaço quando em suspensão e também impedem a formação de canais suficientemente grandes.

Vários métodos podem ser usados para cortar o tecido e ainda estar de acordo com o método revelado, contanto que o tecido seja cortado em pedaços de tamanho e formato irregulares. Por exemplo, a matriz de tecido pode ser cortada manualmente, com o uso de tesouras. Em algumas modalidades, cortar a matriz de tecido compreende ralar a matriz de tecido. Em algumas modalidades, um dispositivo de ralar é usado para realizar a etapa de ralar. Qualquer dispositivo de ralar pode ser usado em concordância com o método revelado, contanto que corte a matriz de tecido em pedaços de formato e tamanho irregulares. Em algumas modalidades, o dispositivo de ralar é um ralador, tal como um ralador MICROPLANE®. Em outras modalidades, o dispositivo de ralar é uma roda raladora.

Em certas modalidades, a etapa de corte pode ser automática. A automatização reduz a quantidade de tempo necessária para preparar o tecido cortado e facilita o corte de quantidades maiores de tecido. Em várias modalidades, um ou mais aspectos do processo de corte pode ser automático. Por exemplo, o próprio dispositivo de ralar pode ser automático de modo que o esforço manual não seja mais exigido para cortar a matriz de tecido. É também possível automatizar

9/35 a entrega da matriz de tecido ao dispositivo de corte. Além disso, é possível automatizar a remoção da matriz de tecido uma vez que a mesma tenha sido cortada. Um exemplo de um aparelho de corte automático é ilustrado na Figura 1. Conforme mostrado, o aparelho compreende uma roda raladora 101 que é encaixada com lâminas 102 para cortar uma matriz 107. Abaixo da roda raladora está uma bandeja de coleta 103. A roda raladora 101 e a bandeja de coleta são confinadas em uma unidade de alojamento 104, que protege o operador do contato direto com as lâminas 102. A unidade de alojamento 104 é encaixada com uma plataforma de carga 106. Nesse exemplo, a plataforma de carga 106 está inclinada de modo que quaisquer amostras carregadas na mesma se moverão em direção à roda raladora 101 por gravidade. A matriz de tecido 107 é colocada na plataforma de carga 106 e move-se em direção à roda raladora 101. As lâminas 102 da roda raladora 101 cortam a matriz de tecido 107 em flocos 108 que caem na bandeja de coleta 103 abaixo.

Em várias modalidades, os métodos revelados podem compreender ainda um processamento adicional antes ou após o corte. Por exemplo, em várias modalidades, os métodos revelados compreendem o uso de uma matriz de tecido acelular pré-processada, que é descrita em mais detalhes abaixo. Em outras modalidades, um tecido celular intacto pode ser usado, que pode ser adicionalmente processado para produzir uma matriz de tecido acelular adequada. O processamento adicional pode compreender descelularização, remoção de DNA e remoção de epítopos de a-gal ou outros antígenos. A descelularização, remoção de DNA e remoção de epítopos de a-gal são descritas em mais detalhes abaixo. O processamento adicional do tecido cortado pode incluir desinfetar a matriz de tecido. Em algumas modalidades, a matriz de tecido similar a floco é desinfetada com álcool isopropílico (IPA) (por exemplo, a

10/35 cerca de 70% de IPA).

O processamento dos flocos de tecido pode ser também suscetível à automação. A automação pode incluir qualquer processo que não exija a entrega e remoção manual das soluções que facilitam o processamento. A automação do processamento de tecido reduz o tempo gasto manualmente na substituição de soluções de processamento e minimiza o manuseio dos flocos de tecido pelo operador. Em algumas modalidades, a automação do processamento de tecido compreende o uso de uma coluna de perfusão de baixa pressão, fechada. A descelularização, remoção de DNA, remoção de antígeno de a-gal e a desinfecção podem ser todas realizadas dentro da coluna, o que permite o processamento de alto rendimento do tecido cortado. A matriz de tecido cortada é carregada na coluna e o ar é purgado da coluna. A descelularização, remoção de DNA, remoção de antígeno de agal e a desinfecção são atingidas por perfusão em etapas das soluções apropriadas em ou próximo à pressão atmosférica. Soluções de α-galactosidase, DNAse e detergente são descritas em mais detalhes abaixo.

Um exemplo de um sistema de processamento automático é mostrado na Figura 2. O sistema de processamento compreende um sistema de bombeamento de solução 201 em que várias soluções de processamento são colocadas. O sistema de bombeamento 201 envia uma solução apropriada através de tubulação 202 em uma coluna de perfusão fechada 204, que foi encaixada a uma entrada 203 e saída 205 de solução de processo. A solução apropriada então entra em contato com os flocos de tecido 108 dentro da coluna de perfusão 204 e então deixa a coluna 204 através da tubulação 202 conectada à saída de solução de processo 205 em uma extremidade e ao sistema de bombeamento de solução 201 na outra extremidade.

Os preenchimentos de tecido revelados podem ser

11/35 ainda tratados para produzir materiais assépticos ou estéreis. Dessa forma, em várias modalidades, os preenchimentos de tecido podem ser esterilizados após a preparação. Conforme usado no presente documento, um processo de esterilização pode incluir qualquer processo que reduza a biocarga em uma amostra, mas não é necessário tornar a amostra absolutamente estéril.

Certos processos exemplificativos incluem, mas sem limitações, um processo de irradiação gama, um processo de irradiação de feixe de elétrons, tratamento com óxido de etileno e tratamento com óxido de propileno. Os processos de esterilização adequados incluem, sem limitações, aqueles descritos, por exemplo, na Publicação de Patente η^Ω U.S. 2006/0073592A1, a Sun et al.; Patente η^Ω US 5.460.962 a Kemp; Publicação de Patente η^Ω U.S. 2008/0171092A1, a Cook et al. Em algumas modalidades, a esterilização é realizada em conjunto com a embalagem dos flocos, enquanto em outras modalidades, a esterilização pode ocorrer após a embalagem.

Após os flocos de tecido serem preparados pelos métodos revelados, os mesmos podem ser armazenados por algum tempo antes da implantação em ou sobre um paciente. Em certas modalidades, o preenchimento de tecido pode ser embalado em uma bolsa Tyvek para propósitos de armazenamento. O preenchimento de tecido pode ser ainda armazenado em estados diferentes. Em algumas modalidades, o preenchimento de tecido similar a floco é seco por congelamento após a preparação. Em certas modalidades, a secagem por congelamento do preenchimento de tecido similar a floco é realizada antes ou durante a embalagem. Em certas modalidades, os flocos de tecido são armazenados em um estado hidratado. Os flocos de tecido podem ser hidratados em várias soluções, por exemplo, uma solução de conservação aquosa.

As várias etapas descritas acima podem ser

12/35 combinadas, adicionadas, apagadas ou de outro modo modificadas conforme necessário. Por exemplo, se o material de partida for uma pele porcina, remover a epiderme e gordura subcutânea pode ser necessário antes do corte. No entanto, a remoção desses componentes não é exigida se o material de partida for uma matriz de tecido acelular. Ademais, se for usada pele porcina como o material de partida em vez de uma matriz de tecido acelular, processamento adicional pode ser necessário após o corte.

Um mesmo protocolo em concordância com os métodos revelados é fornecido na Figura 3, com o uso de peles porcinas como o material de partida. Os detalhes específicos em relação a cada etapa são fornecidos por toda a presente revelação. Peles porcinas frescas são coletadas com os pelos subsequentemente removidos 301. A epiderme e camadas de gordura subcutâneas são então removidas, deixando o tecido dérmico 302. O tecido dérmico é então incubado em uma solução crioprotetora antes do congelamento para manter o saldo apropriado entre teor de gelo e tecido amorfo durante o corte 303. Após a incubação na solução crioprotetora, o tecido é congelado, coloca a uma temperatura entre -10 °C e -40 °C e cortado em um tamanho e formato desejados. Os flocos são então incubados em uma solução apropriada para descelularizar o tecido 305. O tecido é então tratado com enzimas para remover DNA e epítopos de a-gal 30 6. Após o tratamento com enzima, os flocos são desinfetados com o uso de uma solução de IPA 307 e lavados em um tampão 308.

Após a lavagem, os flocos de tecido são embalados para armazenamento. A embalagem pode ser realizada em conjunto com a secagem por congelamento 309 ou com a esterilização 312. Se os flocos forem secos por congelamento em conjunto com a embalagem 309, os mesmos são então esterilizados 310, resultando em flocos secos por

13/35 congelamento estéreis 311. Alternativamente, se a embalagem e esterilização forem realizadas juntas 312, os flocos podem ser secos por congelamento em seguida 314, que também resulta em flocos secos por congelamento estéreis 311. Os flocos podem ser também hidratados após a etapa de embalagem e esterilização 312, resultando em flocos de tecido hidratados estéreis 313.

Os flocos revelados podem formar uma suspensão de baixa densidade, não geleificada, estável que pode ser usada de várias formas. Em certas modalidades, o preenchimento de tecido similar a floco pode ser usado como um preenchimento de tecido em massa para regeneração e reparo de tecido. Os métodos de tratamento que usam o preenchimento de tecido incluem selecionar um sitio anatômico para o tratamento e implante do preenchimento de tecido no sitio de tratamento. Os exemplos incluem a aplicação direta do material de tecido similar a floco em ferimentos profundos e vãos de tecido mole grandes que podem ocorrer durante certos tipos de cirurgias, tal como lumpectomias. O preenchimento de tecido pode ser também usado no tratamento de úlceras por pressão, úlceras de pé diabético ou defeitos de osso periosteal. O preenchimento de tecido pode ser também usado para reconstruir as características faciais assim como corrigir defeitos faciais, incluindo o tratamento de rugas, perda de pele ou atrofia de pele. Em outras modalidades, o material de tecido similar a floco pode ser usado como um carreador para a entrega controlada de outras substâncias bioativas. Os exemplos de substâncias bioativas incluem, mas sem limitações, agentes microbicidas, citocinas, fatores de crescimento e fármacos. As substâncias bioativas podem também incluir tecido não colágeno, tal como tecido adiposo ou células, incluindo células-tronco. Em certas modalidades, os flocos de tecido que foram secos por congelamento subsequentemente podem ser

14/35 hidratados em soluções que contêm substâncias bioativas e então aplicados aos sítios conforme necessário. Em outras modalidades, o preenchimento de tecido similar a floco pode ser aplicado como uma pasta fluida. Se uma suspensão aquosa de flocos de tecido for mesclada brevemente (30 a 300 segundos, por exemplo), a mesma torna-se uma pasta fluida fibrilar entrelaçada de modo frouxo que é fluivel para aplicação conveniente.

Em certas circunstâncias, uma espuma de tecido pode ser desejada. Dependendo dos procedimentos cirúrgicos e circunstâncias particulares de reparo de tecido, o uso de uma espuma de tecido pode ser apropriado. As espumas de tecido podem ser usadas para tratar ferimentos ou tecidos danificados que não são definidos por vãos com um limite particular. Por exemplo, poderíam ser usados adesivos ou suturas cirúrgicas para fixar uma espuma de tecido a tecidos ou órgãos. Em outros casos, os flocos de tecido podem ser mais desejáveis quando há uma necessidade de preencher vãos de qualquer formado, que são definidos por um limite particular. Por exemplo, flocos de tecido são adequados quando tumores são removidos por meio de procedimentos laparoscópicos ou criocirurgia, devido às pequenas aberturas que resultam. As espumas de tecido podem ser também feitas para ter tamanhos e formatos específicos, tais como folhas, esferas e cubos, para certas cirurgias bem definidas. Por exemplo, as folhas de espuma de tecido podem ser usadas para cobrir parcial ou completamente implantes cirúrgicos para reduzir o efeito dramático de interações iniciais entre implante/corpo e formação de cápsula potencialmente lenta. Ademais, as espumas de tecido podem ser usadas como componentes de sistemas de terapia de ferimento por pressão negativa, tal como o sistema VAC®, que produzido pela Kinetic Concepts, Inc. Tais sistemas podem ser usados para tratar uma

15/35 variedade de sítios de tecido e incluem, por exemplo, uma fonte de pressão negativa, tal como uma bomba e um ou mas materiais de tratamento, que normalmente incluem uma espuma porosa ou coletor. Os exemplos gerais de tais sistemas são descritos na Publicação de Patente Número U.S. 2010/0040687 Al, que foi depositada em 13 de agosto de 2009.

O uso dos flocos de tecido revelados facilita a preparação de espuma de tecido de diversas formas. Os flocos de tecido têm uma massa pequena, mas área de superfície grande, que facilita o processamento adicional e os flocos são suscetíveis à preparação de uma suspensão de fibra uniforme. Em contraste a usar fibras ou partículas de tecido micronizadas ou trituradas, é improvável que os flocos de tecido tornem-se gel ou torta durante a descelularização. Finalmente, o processo para preparar os flocos de tecido primeiramente adiciona uma camada adicional de redução de tamanho, que auxilia na preparação de uma suspensão uniforme.

Dessa forma, os métodos descritos no presente documento podem ser também usados para preparar uma espuma regenerativa com o uso do tecido cortado descrito acima como o material de partida. Conforme discutido acima, uma matriz de tecido é selecionada e um crioprotetor é usado para tratar a matriz de tecido antes do congelamento. A matriz de tecido é então congelada e cortada a uma temperatura na faixa de -10 °C a -40 °C após o congelamento. Como o anterior, uma matriz de tecido acelular pré-processada pode ser usada em conjunto com o método revelado. Em outras modalidades, a

matriz de tecido	pode ser	descelularizada	após o	corte
conforme descrito	acima.
A matriz	de tecido	cortada é então	colocada	em um

líquido para formar uma suspensão. Qualquer líquido adequado pode ser usado, contanto que o mesmo não interfira nas propriedades regenerativas da matriz de tecido. Em algumas

16/35 modalidades, a matriz de tecido cortada é colocada em uma solução aquosa. Após ser colocada na solução, a matriz de tecido pode ser misturada dentro da solução. Em várias modalidades, a solução é misturada até uma suspensão de tecido estável ser formada e/ou até a distribuição de tamanho de tecido alcançar um nível desejado. A mistura pode ser realizada por quaisquer meios adequados que atingem esses fins, tal como agitação, sacudidela ou centrifugação da matriz de tecido, uma vez que a mesma esteja na solução. Mescla também pode ser usada para misturar a matriz de tecido na solução. Em certas modalidades, um misturador é usado para misturar a matriz. A mistura pode ser também atingida com o uso de um jato de pressão, um dispositivo ultrassônico ou uma combinação dos dois. Por exemplo, após a descelularização, os flocos de tecido em solução podem passar através de um bocal pressurizado, em que os flocos de tecido são quebrados em fibras. Pode-se também colocar os flocos de tecido em solução em um campo ultrassônico para quebrar os flocos de tecido em uma suspensão de fibras. Um bocal sônico pode ser também usado, que combina ultrassom e pressão para quebrar os flocos de tecido em uma suspensão fibrosa. A consistência da suspensão pode ser controlada por quanta matriz de tecido cortada é adicionada ao líquido. Em algumas modalidades, a quantidade de matriz de tecido cortada no líquido está na faixa de 20 a 40% (p/v). Em certas modalidades, a quantidade de matriz de tecido cortada no líquido está é 25% (p/v).

Após a formação de uma suspensão, a suspensão de tecido é então seca por congelamento. A secagem por congelamento pode ser realizada sob condições assépticas para impedir a contaminação da matriz de tecido. A suspensão de tecido pode ser também colocada por alíquotas em um recipiente apropriado, de modo que mediante a secagem por congelamento, a matriz de tecido seja moldada no formado

17/35 desejado .

	0	processo de mistura	e secagem por congelamento
resulta	em	uma composição de	tecido em que filamentos
pequenos	de	tecido de várias dimensões são entrelaçados e

integrados entre si. Em algumas modalidades, a composição de tecido tem uma aparência similar a espuma. Devido aos pedaços entrelaçados de tecido pequeno, a composição de tecido contém macroporos interconectados, que permite o fluxo livre de fluido e ajudam a suportar a revascularização e repovoamento de células hospedeiras.

A espuma de tecido revelada no presente documento pode ser adicionalmente processada conforme necessário. A espuma de tecido pode ser desinfetada ou esterilizada conforme descrito acima. O material seco por congelamento pode também ser adicionalmente tratado para aumentar a resistência da espuma de tecido com o uso de calor e condições de vácuo. Sem ater-se a uma teoria, o reforço da espuma de tecido pode ocorrer através de incorporação física, reticulação bioquímica ou uma combinação dos dois. Fisicamente, a desidratação final resulta em tensão superficial, que impulsiona fragmentos de tecido mais próximos e forma ligações de hidrogênio entre os grupos hidroxila de fibras de colágeno adjacentes. Quimicamente, o tratamento resulta em formação de amida entre os grupos carboxila e amino, assim como esterificação e glicação de colágeno e outros grupos aminos de proteína de matriz extracelular. O calor aplicado à matriz de tecido não pode ser tão grande que cause a desnaturação das proteínas secas contidas na matriz de tecido. As proteínas secas na matriz de tecido tipicamente desnaturam entre 130 °C e 170 °C. Em uma modalidade, a resistência da espuma de tecido pode ser aumentada por tratamento do material seco por congelamento a uma temperatura acima de 30 °C, mas abaixo das temperaturas

18/35 de desnaturação listadas acima sob condições de vácuo. Em algumas modalidades, a resistência da espuma de tecido pode ser aumentada por tratamento do material seco por congelamento a aproximadamente 100 °C sob vácuo por 24 horas.

Após o processamento, a espuma de tecido pode ser armazenada por algum tempo antes do implanta em ou sobre um paciente. Em certas modalidades, a espuma de tecido pode ser embalada em uma bolsa Tyvek para propósitos de armazenamento. A própria espuma de tecido pode ser também armazenada em estados diferentes. Em algumas modalidades, a espuma de tecido é armazenada em seu estado já seco por congelamento. Em outras modalidades, a espuma de tecido é armazenada em um estado hidratado.

Matrizes de Tecido

Conforme observado acima, os métodos descritos no presente documento podem ser usados para produzir preenchimentos de tecido similar a floco com o uso de uma variedade de diferentes tipos de tecido, contanto que o tecido inclua uma matriz que contém colágeno suscetível ao uso com o métodos descritos acima. Tais matrizes de tecido podem incluir tecido intactos, tecidos que foram parcial ou completamente descelularizados ou matizes colágenas sintéticas (por exemplo, matrizes 3D formadas de tecidos suspensos ou de outro modo processados).

A matriz de tecido pode ser produzida de uma faixa de tipos de tecidos. Por exemplo, a matriz de tecido pode ser derivada de fáscia, tecido pericárdico, dura, tecido umbilical, tecido da placenta, tecido de válvula cardíaca, tecido de ligamento, tecido de tendão, tecido arterial, tecido venoso, tecido conectivo neural, tecido da bexiga urinária, tecido de ureter e tecido intestinal. Em outras modalidades, a matriz de tecido compreende uma matriz de tecido dérmica. Em certas modalidades, a matriz de tecido

19/35 compreende uma matriz dérmica porcina.

Em determinadas modalidades, os tecidos podem incluir um tecido mole de mamíferos. Por exemplo, em determinadas modalidades, o tecido pode incluir derme de mamíferos. Em determinadas modalidades, a derme pode ser separada da epiderme circundante e/ou outros tecidos, tal como a gordura subcutânea. Em determinadas modalidades, a amostra de tecido pode incluir submucosa do intestino delgado. Em determinadas modalidades, as amostras de tecido podem incluir fontes humanas ou não humanas. As fontes de tecido não humanas adequadas e exemplificativas incluem, porém sem limitação, porcos, ovelhas, cabras, coelhos, macacos e/ou outros mamíferos não humanos.

As matrizes de tecido podem ser implantadas em uma variedade de diferentes sítios anatômicos. Por exemplo, as matrizes de tecido podem ser implantadas ao redor de implantes de mama; ao redor ou substituindo estruturas vasculares; ao redor ou substituindo estruturas luminais (por exemplo, ureteres, nervos, tecidos linfáticos, estruturas gastrointestinais); sobre ou substituindo válvulas cardíacas, pericárdio ou outras estruturas cardíacas; dentro ou sobre materiais ósseos ou cartilaginosos (por exemplo, orelhas, narizes, superfícies articulares, ao redor de estruturas dentais ou ao longo de qualquer osso curto ou longo); e/ou cercando, revestindo, apoiando ou substituindo qualquer cavidade do corpo (por exemplo, bexiga, estômago).

As matrizes de tecido podem ser selecionadas para fornecer uma variedade de diferentes propriedades biológicas e mecânicas. Por exemplo, uma matriz de tecido acelular pode ser selecionada para permitir o crescimento interno de tecido e a remodelagem para assistir na regeneração do tecido normalmente encontrado no sítio em que a matriz é implantada. Por exemplo, uma matriz de tecido acelular, quando implantada

20/35 sobre ou dentro da faixa, pode ser selecionada para permitir a regeneração da faixa sem formação de cicatriz ou fibrose excessiva. Em determinadas modalidades, a matriz de tecido pode ser formada a partir de ALLODERM® ou STRATTICE™, que são matrizes dérmicas acelulares de humanos ou porcos, respectivamente. Alternativamente, outras matrizes dérmicas acelulares adequadas podem ser usadas, conforme descrito adicionalmente abaixo.

Em algumas modalidades, o material à base de colágeno compreende uma matriz de tecido acelular. Em determinadas modalidades, essas matrizes podem ser completamente descelularizadas para render matrizes de tecido acelular a serem usadas para pacientes. Por exemplo, vários tecidos, tal como tecido de pele, intestino, osso, cartilagem, nervo (por exemplo, fibras nervosas ou dura), tendões, ligamentos ou outros tecidos podem ser completamente descelularizados para produzir matrizes de tecido úteis para pacientes. Os processos adequados para produzir matrizes de tecido acelular são descritos abaixo.

Em geral, as etapas envolvidas na produção de uma matriz de tecido acelular incluem colher o tecido de um doador (por exemplo, um cadáver humano ou fonte animal) e a remoção de células sob condições que preservam a função biológica e estrutural. Em determinadas modalidades, o processo inclui o tratamento químico para estabilizar o tecido e evitar a degradação bioquímica e estrutural juntamente com ou antes da remoção de células. Em várias modalidades, a solução de estabilização interrompe e impede a degradação osmótica, hipóxica, autolítica e proteolítica, protege contra a contaminação microbiana e reduz os danos mecânicos que podem ocorrer com os tecidos que contêm, por exemplo, componentes de músculo liso (por exemplo, vasos sanguíneos). A solução de estabilização pode conter um tampão

21/35 apropriado, um ou mais antioxidantes, um ou mais agentes oncóticos, um ou mais antibióticos, um ou mais inibidores de protease e/ou um ou mais relaxantes de músculo liso.

O tecido é, então, colocado em uma solução de descelularização para remover células viáveis (por exemplo, células epiteliais, células endoteliais, células de músculo liso e fibroblastos) da matriz estrutural sem danificar a integridade biológica e estrutural da matriz de colágeno. A solução de descelularização pode conter um tampão adequado, sal, um antibiótico, um ou mais detergentes (por exemplo, TRITON X-100™, desoxicolato de sódio, monooleato de polioxietileno (20) sorbitano), um ou mais agentes para impedir a reticulação, um ou mais inibidores de protease e/ou uma ou mais enzimas. Em algumas modalidades, a solução de descelularização compreende TRITON X-100™ a 1% no meio RPMI com Gentamicina e EDTA a 25 mM (ácido etilenodiaminatetraacético). Em algumas modalidades, o tecido é incubado na solução de descelularização de um dia para o outro a 37 ²C com agitação suave a 90 rpm. Por exemplo, em algumas modalidades, desoxicolato de sódio a 2% é adicionado à solução de descelularização.

Após o processo de descelularização, a amostra de tecido é lavada de modo cuidadoso com soro fisiológico. Em algumas modalidades exemplificativas, por exemplo, quando o material xenogênico é usado, o tecido descelularizado é, então, tratado de um dia para o outro à temperatura ambiente com uma solução de desoxirribonuclease (DNase). Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tratada com uma solução de DNase preparada no tampão de DNase (HEPES a 20 mM (ácido 4(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico), CaCl₂ a 20 mM e MgCl₂ a 20 mM) . Opcionalmente, uma solução de antibiótico (por exemplo, Gentamicina) pode ser adicionada à solução de DNase. Qualquer tampão adequado pode ser usado contanto que o

22/35 tampão forneça uma atividade de DNase adequada.

Embora uma matriz de tecido acelular possa ser feita a partir das mesmas espécies que o receptor de enxerto de matriz de tecido acelular, espécies diferentes podem também servir como fontes de tecido. Assim, por exemplo, uma matriz de tecido acelular pode ser feita a partir de tecido de porco e implantada em um paciente humano. As espécies que servem como receptores da matriz de tecido acelular e doadores de tecidos ou órgãos para a produção da matriz de tecido acelular incluem, sem limitação, mamíferos, tais como humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos, babuínos ou chimpanzés), porcos, vacas, cavalos, cabras, ovelhas, cães, gatos, coelhos, porquinhos da índia, gerbilos, hamsters, ratos ou camundongos.

A eliminação dos epítopos de a-gal do material que contém colágeno pode diminuir a resposta imunológica contra o material que contém colágeno. O epítopo de a-gal é expresso em mamíferos não primatas e em macacos do Novo Mundo (macacos da América do Sul) assim como macromoléculas tais como proteoglicanos dos componentes extracelulares. U. Galili et al., J. Biol. Chem. 263: 17755 (1988). Esse epítopo é ausente em primatas do Velho Mundo (macacos da Ásia e África e símios) e humanos, entretanto. Os anticorpos Id. anti-gal são produzidos em humanos e primatas como um resultado de uma resposta imunológica a estruturas de carboidrato de epítopo de a-gal em bactérias gastrointestinais. U. Galili et ai., Infect. Immun. 56: 1730 (1988); R. M. Hamadeh et al., J. Clin. Invest. 89: 1223 (1992).

Visto que mamíferos não primatas (por exemplo, porcos) produzem epítopos de a-gal, xenotransplante de um material que contém colágeno desses mamíferos em primatas frequentemente resulta em ativação imunológica por causa de anticorpos de primata anti-Gal que se ligam a esses epítopos

23/35 no material que contém colágeno. U. Galili et al., Immunology Today 14: 480 (1993); M. Sandrin et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 11391 (1993); H. Good et al., Transplant. Proc. 24: 559 (1992); Β. H. Collins et al. , J. Immunol. 154: 5500 (1995) . Além do mais, um xenotransplante resulta em uma ativação maior do sistema imune para produzir quantidades aumentadas de anticorpos anti-gal com alta afinidade. Consequentemente, em algumas modalidades, quando animais que produzem epitopos de a-gal são usados como a fonte de tecido, a eliminação substancial de epitopos de a-gal de células e de componentes extracelulares do material que contém colágeno, e a prevenção de re-expressão de epitopos de a-gal celulares pode diminuir a resposta imunológica contra o material que contém colágeno associado a um anticorpo anti-gal que se liga a epitopos de a-gal.

Para remover epitopos de a-gal, após lavar o tecido completamente com soro fisiológico para remover a solução DNase, a amostra de tecido pode ser sujeita a um ou mais tratamentos enzimáticos para remover certos antígenos imunogênicos, se presentes na amostra. Em algumas modalidades, a amostra de tecido pode ser tratada com uma enzima α-galactosidase para eliminar epitopos de a-gal se presente no tecido. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tratada com α-galactosidase a uma concentração de 300 U/L preparada em 100 mM de tampão de fosfato em pH 6,0. Em outras modalidades, a concentração de α-galactosidase é aumentada para 400 U/L para uma remoção adequada dos epitopos de a-gal do tecido colhido. Qualquer tampão e concentração de enzima adequados podem ser usados contanto que uma remoção suficiente de antígenos seja alcançada.

De modo alternativo, em vez de tratar o tecido com enzimas, os animais que foram geneticamente modificados para faltar um ou mais epitopos antigênicos podem ser selecionados

24/35 como a fonte de tecido. Por exemplo, os animais (por exemplo, porcos) que foram geneticamente manipulados para faltar a parte a-galactose terminal podem ser selecionados como a fonte de tecido. Para descrições de animais apropriados, consultar o pedido de patente copendente de serial no U.S. 10/896.594 e o documento de patente no U.S. 6.166.288, cujas revelações são incorporadas no presente documento a titulo de referência em sua totalidade. Além disso, certos métodos exemplificativos para processar tecidos para produzir matrizes acelulares com ou sem quantidades reduzidas de partes de alfa-1,3-galactose ou sem as mesmas, são descritos em Xu, Hui. et al. , A Porcine-Derived Acellular Dermal Scaffold that Supports Soft Tissue Regeneration: Removal of Terminal Galactose-a-(1,3)-Galactose and Retention of Matrix Structure, Tissue Engineering, Volume 15, 1 a 13 (2009), que é incorporado a titulo de referência em sua totalidade.

Após a matriz de tecido acelular ser formada, células viáveis histocompatíveis podem opcionalmente ser semeadas na matriz de tecido acelular para produzir um enxerto que pode ser remodelado adicionalmente pelo hospedeiro. Em algumas modalidades, as células viáveis histocompatíveis podem ser adicionadas nas matrizes através de técnicas de cocultura de células in vitro padrão antes de um transplante ou através de um repovoamento in vivo após um transplante. Um repovoamento in vivo pode acontecer pelas próprias células do receptor que migram para a matriz de tecido acelular ou infundindo-se ou injetando-se células obtidas do receptor ou células histocompatíveis de outro doador para a matriz de tecido acelular in situ. Vários tipos de célula podem ser usados, inclusive células-tronco embrionárias, células-tronco adultas (por exemplo, célulastronco mesenquimais) e/ou células neuronais. Em várias modalidades, as células podem ser diretamente aplicadas na

25/35 porção interna da matriz de tecido acelular logo antes ou após um implante. Em certas modalidades, as células podem ser colocadas dentro da matriz de tecido acelular que será implantada e colocada em cultura antes de um implante.

Embora os parâmetros de processo geral para produção de matrizes de tecido acelular sejam descritos, uma variedade de materiais acelulares que contêm colágeno são disponíveis e os métodos para processar tais materiais para produzir enchimentos de tecido semelhantes a flocos podem ser usados com qualquer um dentre esses materiais. Por exemplo, inúmeros materiais de arcabouço biológico são descritos por Badylak et ai. e os métodos da presente revelação podem ser usados para produzir enchimentos de tecido semelhantes a flocos com o uso de qualquer dentre esses materiais ou quaisquer outros materiais similares. Badylak et ai., Extracellular Matrix as a Biological Scaffold Material: Structure and Function, Acta Biomaterialia (2008), doi:10.1016/j.actbio.2008.09.013.

Exemplo 1: Criopreservação e criocorte de derme porcina dividida

Peles porcinas frescas foram coletadas e o pelo foi removido. Um tecido de derme foi obtido das peles dividindose a camada epiderme e a camada de gordura subcutânea (hipoderme). A derme porcina foi limpa com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) da Dulbecco e incubada por 4 a 6 horas na solução crioprotetora que contém 50 mM de fosfato de sódio, 10 mM de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) e 35% (p/v) de maltodextrina (pH 7,0). As lâminas de derme tratadas com crioprotetor foram então congeladas em um congelador de 80 °C. O tecido de derme congelado foi ralado em flocos de tecido usando-se um ralador MICROPLANE® de tamanho médio (as aberturas de ralador têm aproximadamente 2,2 a 3,2 mm de largura e 0,2 mm de espessura).

26/35

Os flocos de tecido foram então lavadas por 10 a 15 minutos em PBS para remover o crioprotetor e então fixadas em 2% de solução de glutaraldeido. A morfologia dos flocos de tecido foi então observada com o uso de microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura (SEM). Para uma examinação sob miscroscopia de luz, as amostras de tecido foram coloridas com vermelho Sirius. Para uma examinação por SEM, as amostras de tecido foram desidratadas em etapas em soluções de etanol de concentração crescente (25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 98% e 100%) , secas com CO₂ supercritico em um secador de ponto critico e revestidas por crepitação com ouro. Os espécimes de tecido foram vistos sob alto vácuo e baixa tensão eletrônica (5 kV). Conforme mostrado nas Figuras 4A e 4B, a morfologia das peças cortadas foi observada como sendo semelhante a floco sob ambos os tipos de microscopia.

Para determinar a distribuição de tamanho (massa) dos flocos de tecido, as peças de tecido fixas por glutaraldeido foram lavadas em água destilada para remover um resíduo de glutaraldeido. O peso líquido de mais do que 200 peças de tecido foi determinado após secagem por mancha uma água de superfície com gaze cirúrgica. A Figura 5 mostra a distribuição de tamanho com base em massa dos flocos de tecido. Mais do que 70% dos fragmentos de tecido pesaram entre 0,5 e 2,0 mg, com um peso médio de 1,3 mg. Poucos pedaços de tecido pesaram acima de 4 mg. O tamanho de fragmento de tecido estava na faixa esperada após usar um

microplano médio	(2 a 3 mm de largura e 0,2	mm de espessura,
volume de tecido nominal de 0,8 a 1,8 mm³) . Exemplo 2: Controle de teor de	gelo em derme
porcina congelada A razão	apropriada entre gelo e	tecido de derme
congelado de fase	amorfa facilitar cortar lâminas de derme em
uma matriz de tec	ido semelhante a floco. As	lâminas de derme

27/35 congeladas que não foram tratadas em solução crioprotetora continham muito gelo, eram muito quebradiças e eram difíceis de cortar. Por outro lado, as lâminas de derme congeladas com baixo teor de gelo eram macias e esquentaram rapidamente durante um corte, o que também tornou as mesmas difíceis de cortar. O teor de gelo e a dureza das lâminas de derme congeladas foram controlados pré tratando-se as lâminas de derme em soluções crioprotetoras que reduziram uma formação de gelo enquanto facilitaram uma formação de uma matriz de tecido amorfa com uma alta temperatura de transição de vidro abaixo de zero.

A derme porcina dividida foi preparada conforme descrito no exemplo 1. Soluções de maltodextrina que contém 0% a 35% (p/v) de maltodextrina foram feitas com uma solução de tampão de fosfato (50 mM de fosfato de sódio, 10 mM de EDTA, pH 7,0) . As amostras de derme porcina dividida foram incubadas nas soluções crioprotetoras de um dia para o outro. Após uma incubação, um teor de água e de crioprotetor em amostras de tecido de derme foram determinados. Os teores de gelo de amostras de tecido congeladas foram determinados através de calorimetria de varredura diferencial de acordo com suas entalpias de fusão de gelo. A Figura 6 mostra as frações de massa de gelo e o domínio de tecido amorfo no tecido congelado pré-tratado em diferentes soluções crioprotetoras. Na ausência de maltodextrina (tampão de PBS sozinho), a derme porcina teve 75% (p/v) de água e 25% de massa seca. Mediante congelamento, -93% de água de derme cristalizou como gelo, resultando em uma fração de massa de 70% de gelo e uma fração de massa de 30% de domínio amorfo concentrado por congelamento (não congelado). As frações de volume correspondentes foram 77% e 23% para gelo e domínio não congelado, respectivamente. Com concentrações de maltodextrina crescentes, a fração de gelo de tecido de derme

28/35 porcina incubado diminuiu e a fração do domínio não congelado aumentou. Para dermes porcinas incubadas em 35% de solução de maltodextrina, as frações de massa de gelo e de domínio não congelado foram reduzidas para 34% e aumentadas para 66%, respectivamente (que correspondem a frações de volume de 42% e 58%, respectivamente). Uma formação de gelo reduzida se deu devido a tanto uma desidratação osmótica de tecido quanto uma penetração de maltodextrina na matriz extracelular do tecido de derme. Como um resultado de uma penetração de maltodextrina na matriz extracelular de derme, a temperatura de transição de vidro do domínio amorfo de derme congelada aumentou para -17 °C. Um tecido porcino tratado com 15 a 35% de soluções de maltodextrina pode ser facilmente ralado em flocos de tecido.

Exemplo 3: Processamento de flocos de tecido dérmico

Os flocos de tecido preparadas conforme descritos no exemplo 1 foram processados adicionalmente para remover componentes celulares e epítopos de a-galactosil. O processo incluiu as etapas a seguir: (i) limpar os crioprotetores, (ii) descelularização, (iü) tratamento por enzima, (iv) desinfecção, (v) liofilização, (vi) esterilização e (vii) embalagem secundária.

(i) Remoção de crioprotetores. Os flocos de tecido foram colocados em garrafas de centrifugação cuneiformes de 225 ml (~30 g/garrafa) . O material foi lavado com 150 ml de PBS estéril por cerca de 10 minutos. A suspensão de tecido foi centrifugada a 500 rpm por 3 minutos e o sobrenadante foi descartado. O pélete de tecido foi ressuspenso com 150 ml de água destilada estéril e centrifugado novamente a 500 rpm por 3 minutos para coletar os flocos de tecido.

(ii) Descelularização. O material de tecido sofreu descelularização em temperatura ambiente com agitação em 150

29/35 ml de 2% (p/v) de desoxicolato de sódio dissolvido em urn tampão HEPES de 10 mM com 10 mM de EDTA (pH 7,8). A solução de descelularização foi alterada após 1 hora através de centrifugação a 500 rpm por 3 minutos. Após uma solução fresca ser adicionada, o tecido material foi permitido a incubar por outras 4 horas. A solução de descelularização foi drenada após outra rodada de centrifugação.

(iii) Tratamento por enzima. Os flocos de tecido descelularizados foram lavados duas vezes por 30 minutos a um tempo com um tampão HEPES de 10 mM que contém EDTA a 5 mM (pH 7,3) . O tratamento por enzima foi executado por 4 horas em 150 ml de tampão HEPES com MgCfo a 2 mM, CaCÍ2 a 2 mM, 1 mg/1 de dornase alfa e 1 mg/1 de α-galactosidase. A solução de enzima foi drenada após a centrifugação a 500 rpm por 3 minutos.

(iv) Desinfecção. Os flocos de tecido tratados com enzima foram ressuspensos e lavados duas vezes com um tampão HEPES a 10 mM com EDTA a 5 mM. A primeira lavagem foi por 60 minutos e a segunda lavagem foi conduzida de um dia para o outro. Após a centrifugação, o material de tecido foi limpo com 100 ml de água destilada estéril por 30 minutos. Para algumas garrafas, 100 ml de solução de álcool isopropílico (IPA) (70% em p/v) foram adicionados a uma suspensão de tecido. Após cerca de 10 minutos, a suspensão foi centrifugada a 500 rpm por 3 minutos. A solução de IPA antiga foi drenada e solução de IPA fresca a 70% foi adicionada para ressuspender o material. O material foi tratado com IPA por pelo menos 4 a 6 horas antes de ser embalado em bolsas Tyvek para liofilização. Para outras garrafas, os flocos de tecido foram diretamente embalados em bolsas Tyvek para secagem por congelamento sem desinfecção com IPA.

(v) Liofilização. O material de tecido processado foi seco por congelamento. A secagem por congelamento

30/35 consistiu em 3 estágios. (a) resfriar o material da temperatura ambiente até -35 °C a aproximadamente 1 °C/minuto, então manutenção a -35 °C por 10 minutos; (b) elevar a -10 °C a aproximadamente 1 °C/minuto sob 40 mT, então manutenção por 16 horas; e (c) elevar a 20 °C a aproximadamente 1 °C/minuto sob 20 mT e então manutenção por 8 horas.

(vi) Esterilização. As amostras de tecido secas por congelamento que não foram desinfetadas com IPA foram esterilizadas com óxido de etileno (EO). A esterilização com EO incluiu (a) condicionar a 52 °C a 63 °C e 55 a 75% de Umidade Relativa por 30 a 45 minutos, (b) exposição de EO com uma concentração de gás de 600 ±50 mg/1 por 4 horas e (c) aeração a 38 a 54 °C por pelo menos 12 horas.

(vii) Embalagem secundária. As amostras tratadas por IPA foram embaladas imediatamente em bolsas folha a folha após a secagem por congelamento. As amostras tratadas com EO foram embaladas em bolsas de folha a folha após o tratamento com EO.

Os flocos de tecido processados foram acelulares.

Tanto os materiais	tratados	com IPA	quanto	os tratados	com EO
testados devem ser Exemplo	estéreis. 4: Estabilidade	de	Flocos de	Tecido
Processados A estabilidade	térmica	dos	flocos de	tecido
processados foi tesada com	o uso de	calorimetria de varredura

diferencial (DSC). Ambos os materiais tratados por IP quanto os tratados por EO foram reidratados em solução salina PBS (pH 7,5). As amostras foram varridas a uma taxa de aquecimento de 3 °C/min de 2 a 125 °C (DSC Q200, TA Instruments). Ambos os tecidos tratados por IPA quanto os tratados por EO tiveram um pico de temperatura baixa pequeno (aproximadamente 30 a 32 °C) . Conforme mostrado nas Figuras

31/35

7, a temperatura inicial dos picos de desnaturação de colágeno principais foi 53,3 ±0,2 °C e 58,0 ±0,2 °C (N=4) por flocos de tecido tratados com EO e flocos de tecido tratados com IPA, respectivamente. A temperatura inicial dos flocos de tecido tratados com IPA foi similar às amostras de derme fresca. Os dados indicaram que a esterilização com EO desestabiliza a matriz de tecido em comparação ao tratamento com IPA.

A suscetibilidade de flocos de tecido secos por congelamento processados à degradação por enzima foi testada com ensaios de colagenase e tripsina. As Figuras 8A e 8B mostram a resistência de material de tecido processado à digestão de colagenase e tripsina, respectivamente. Os flocos de tecido desinfetados com IPA resistiram à digestão de colagenase e tripsina razoavelmente bem. O material esterilizado com EO teve suscetibilidade aumentada à proteólise em comparação ao material desinfetado com IPA.

Exemplo 5: Adequabilidade de Flocos de Tecido para Permitir o Fluxo de Fluido e Conversão de Pressão

Mediante rehidratação, os flocos de tecido formam uma suspensão estável sem gelação ou separação de fase, permitindo que os flocos de tecido sejam usados para preencher vãos ou defeitos grandes (dezenas a centenas de mililitros). A suspensão de flocos de tecido contém canais interconectados grandes que permite que o fluido flua livremente e assim auxiliam na revascularização e repovoamento de células quando os flocos são usados como preenchimentos de tecido. A capacidade da suspensão de flocos de tecido de permitir o fluxo de fluidos e a conversão de diferenciais de pressão foi investigada. Os flocos de tecido reidratados foram colocados em malha Organza e difundidos sobre uma almofada de distribuição de pressão de 7,62 cm x 7,62 cm (3 x 3) com 36 portas de sensor, conforme mostrado

32/35 nas Figuras 9A e 9B. Um pedaço de GranuFoam™ (7,62 cm x 7,62 cm (3 x 3) e 3,81 cm (1,5) de espessura) foi colocado no topo do material de floco de tecido e um V.A.C.® de 15,24 cm x 15,24 cm (6 x 6) foi fixado à montagem de curativo juntamente com a almofada T.R.A.C.®. A montagem foi conectada à unidade de terapia V.A.C.® ATS para produzir uma pressão contínua a 16,67 KPa (125 mmHg) . Após 5 minutos de equilíbrio, a pressão negativa detectada nas 36 portes foi citada. Posteriormente, 4 das portas foram desconectadas dos sensores de pressão e conectadas a um reservatório de solução salina a 0,9% colorida para infusão a uma taxa de 500 ml por dia por meio de uma bomba peristáltica. A pressão nas 32 portas remanescentes foi então monitorada pelo tempo. A pressão média detectada foi aproximadamente 14,67 a 14,93 KPa (110 a 112 mmHg) . A pressão negativa era de 14,85 ±0,11 (111,4 ±0,9) (média ±SD), 14,68 ±0,18 (110,1 ±1,4) e 14,75 ±0,17 KPa (110,6 ±1,3 mmHg) após 1, 2 e 3 horas respectivamente. A consistência indicou que a pressão foi distribuída por igual através de toda a montagem de curativo e os canais interconectados foram capazes de converter os diferenciais de pressão bem.

Exemplo 6: Espuma de tecido Reconstrutivo Feita de Material de Tecido Similar a Floco

Uma matriz de tecido acelular derivada de derme porcina foi congelada a -80 °C e usada para produzir flocos de tecido assepticamente com um ralador de queijo MICROPLANE® de tamanho médio. Aproximadamente 50 g de amostra de tecido foram suspensos em 200 ml de água estéril e então misturados com o uso de um misturador RETSCH® a 4.000 rpm em intervalos de um minuto por um total de 5 ciclos. Conforme mostrado nas Figuras 10A e 10B, a mescla reduziu o tamanho do material de floco de tecido. Mesclar os flocos de tecido também resultou em uma suspensão de tecido estável e consistente. A suspensão

33/35 de tecido foi distribuída em placas de petri plásticas de 80 cm² em 25 ml de suspensão por placa e seca por congelamento assepticamente. O processo de secagem por congelamento incluiu o resfriamento controlado de uma suspensão de tecido da temperatura ambiente até -30 °C dentro de 60 minutos e secagem em uma pressão de câmara de 100 mT e a temperatura de prateleira de 20 °C por 24 horas.

O processo de mescla e secagem por congelamento resultou em pedaços de tecido pequenos de várias dimensões entrelaçados e integrados entre si, formando uma espuma de tecido mole com macroporos interconectados e extramatriz preservada de estruturas de tecido acelular, conforme mostrado nas Figuras 11A a 11D. A Figura 11A apresenta uma aparência grossa da espuma de tecido. A Figura 11B mostra os macroporos interconectados da espuma de tecido mole sob o microscópio SEM. A Figura 11C é um histograma da estrutura de matriz extracelular da espuma com o uso de uma mancha de hematoxilina e eosina. A Figura 11D é uma vista ampliada de uma seção encontrada dentro da Figura 11C. Conforme mostrado nas Figuras 11C e 11D, a matriz de tecido da espuma tem uma natureza filamentosa, fibrosa após a mescla e a secagem por congelamento. A espuma seca por congelamento assepticamente teve uma massa de tecido seco de 9,9 ±0,3% (p/v, N=5).

Parte do material de tecido seco por congelamento foi ainda tratado a aproximadamente 100 °C sob vácuo por 24 horas para aumentar a resistência da espuma de tecido. A medição calorimétrica detectou uma temperatura inicial de desnaturação de 62,2 ±0,1 °C e uma entalpia de desnaturação de 60,5 J/g de massa de tecido, indicando que não há desnaturação de colágeno de tecido.

Em um experimento separado com o uso do material seco por congelamento, a resposta in vivo de espuma de tecido reconstrutivo feita de material de tecido similar a floco foi

34/35 investigada com o uso de um modelo de rato atimico (Rattus norvegicus, rato nu) . Espécimes de tecido (10 mm x 10 mm e aproximadamente 3 mm de espessura) foram preparados a partir da espuma de tecido e reidratados em solução salina a 0,9%. Após a rehidratação, os espécimes de tecido foram então implantados de modo subcutâneo em ratos atimicos. Para cada rato, quatro incisões separadas foram feitas no lado direita e esquerdo das costas através da pele e paralelas à região lombar da coluna vertebral. Bolsos foram formados por dissecação cega no tecido subcutâneo em que o material de tecido foi introduzido. Dois espécimes implantados no lado direito da coluna vertebral e dois espécimes foram implantados na direita, com a pele fechada em seguida. Os animais sofreram eutanásia ou quatro ou oito semanas após a implantação. Os espécimes implantados com tecido mole adjacente fixado foram excisados e as amostras de tecido excisadas foram fixadas em formalina a 10% e processadas para avaliação histológica com o uso de manchas de hematoxilina e eosina. Lâminas histológicas foram avaliadas por microscópio para evidência de revascularização e repovoamento de células hospedeiras. Conforme mostrado na Figura 12, revascularização e repovoamento de células significativas foram observados em implantes de 4 semanas (Figuras 12A e 12B), enquanto espumas de tecido implantadas foram completamente repovoadas em 8 semanas (Figuras 12C e D) . Inflamação foi observada como sendo moderada em explantes de 4 semanas e branda em explantes de 8 semanas.

Outras modalidades da invenção serão aparentes àqueles versados na técnica a partir da consideração do relatório descritivo ou uma prática da invenção revelada no presente. Pretende-se que o relatório descritivo e os exemplos sejam considerados como exemplificativos apenas, com um escopo e espirito verdadeiros da invenção sendo indicados

35/35 pelas seguintes reivindicações.

Claims

caracterizado pela solução crioprotetora compreender uma solução de maltodextrina.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado pela solução compreender 5 a 50% (p/v) de maltodextrina.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7 ou 78, caracterizado pela solução compreender 15 a 25% (p/v) de maltodextrina.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por cortar a matriz de tecido compreender ralar a matriz de tecido.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo tecido cortado ter uma distribuição de tamanho na faixa de 0,
2 a 5 mm em comprimento, 0,2 a 3 mm em largura e 0,02 a 0,3 mm em espessura.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por compreender, ainda, expor a matriz de tecido a um desinfetante.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 a 13, caracterizado pelo desinfetante ser álcool isopropílico.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender, ainda, esterilizar a matriz de tecido.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por esterilizar a matriz de tecido compreender a aplicação de óxido de etileno, óxido de propileno, irradiação gama ou irradiação de feixe de elétrons à matriz de tecido.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender, ainda, misturar a suspensão de matriz de tecido antes da secagem por congelamento.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela etapa de mistura compreender, ainda, a
3/3 redução no tamanho da matriz de tecido.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela matriz de tecido formar filamentos entrelaçados durante a mistura e a secagem por congelamento.

20. MATRIZ DE TECIDO, caracterizada por ser preparada pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

21. MATRIZ DE TECIDO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por ser para uso no tratamento de um defeito de tecido.

22. MATRIZ DE TECIDO, 21, caracterizada pelo defeito

23. MATRIZ DE TECIDO, 21, caracterizada pelo defeito pressão.

24. MATRIZ DE TECIDO, 21, caracterizada pelo defeito diabético.

de acordo com a reivindicação de tecido ser uma lumpectomia.

de acordo com a reivindicação de tecido ser uma úlcera por de acordo com a reivindicação .e tecido ser uma úlcera de pé

25. MATRIZ DE TECIDO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo defeito de tecido ser um defeito do osso periosteal.

26. MATRIZ DE TECIDO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo defeito de tecido ser um defeito facial.

27. MATRIZ DE TECIDO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo defeito facial ser selecionado dentre uma ruga, perda de pele ou atrofia de pele.

28. MATRIZ DE TECIDO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 27, caracterizada por compreender, ainda, aplicar uma pressão negativa à matriz à base de colágeno durante o tratamento.