ES2710921T3

ES2710921T3 - Composiciones para tratar y prevenir lesión y enfermedad tisular

Info

Publication number: ES2710921T3
Application number: ES13839621T
Authority: ES
Inventors: Dale Peterson; Ralph-Heiko Mattern; Corey Wilson-Wirth; Kevin Ohashi
Original assignee: MICROVASCULAR TISSUES Inc
Current assignee: MICROVASCULAR TISSUES Inc
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2019-04-29
Anticipated expiration: 2033-09-17
Also published as: EP3476410B1; JP6755893B2; DK2898064T3; JP2018065881A; EP2898064A4; US20150231183A1; CA2885419A1; AU2013318243B2; EP2898064A1; US20170360845A1; AU2013318243A1; JP6456829B2; US9713629B2; WO2014047067A1; KR102270617B1; KR20150061642A; HK1212380A1; EP3476410A1; US10729729B2; JP2015529687A

Abstract

Una composición que comprende tejido microvascular procesado, en la que el tejido microvascular procesado comprende células multipotentes aisladas o una membrana celular obtenida a partir de o derivada de células multipotentes o del tejido microvascular, en la que la composición tiene actividad angiogénica o antiinflamatoria, en la que la composición se esteriliza mediante irradiación y los virus dentro de la composición se inactivan, y en la que la esterilización por irradiación se realiza por exposición de la composición a radiación gamma o radiación de haz electrónico a una dosificación en el intervalo de 0,5 Mrad a 5,0 Mrad.

Description

DESCRIPCION

Composiciones para tratar y prevenir lesion y enfermedad tisular

Antecedentes

Campo

La presente invencion se refiere a nuevas composiciones que comprenden celulas multipotentes y/o tejido microvascular como se define en las reivindicaciones, que se ha esterilizado y tratado para inactivar cualquier virus, y las composiciones para uso en el tratamiento o la prevencion de lesiones y enfermedades tisulares, tales como, por ejemplo, artritis.

Descripcion de la tecnica relacionada

Las lesiones en los tejidos blandos, tales como musculos, tendones, ligamentos y capsulas articulares, se producen con bastante frecuencia. Generalmente las lesiones de ese tipo dan como resultado una disfuncion tisular caracterizada por dolor, inflamacion y estres tisular interno, y en ultima instancia pueden dar como resultado una discapacidad funcional. Por ejemplo, mientras que los esguinces de los tendones se curaran de forma espontanea, los desgarros completos de un tendon a menudo conduciran a discapacidad si no se tratan de forma quirurgica. Incluso a pesar de la reparacion quirurgica, aproximadamente un 15% del tendon de Aquiles y un 40% de dos reparaciones de tendon del manguito rotador del tendon fallan posteriormente. Ademas, en raras ocasiones el tendon reparado vuelve a los niveles de fuerza y funcionalidad que teman antes de la lesion.

La reparacion tisular generalmente incluye varias fases, que incluyen una respuesta inflamatoria inicial seguida por la proliferacion celular y la remodelacion tisular. Los procesos fundamentales de reparacion tisular incluyen tanto fibroplasia como angiogenesis. Los fibroblastos activados por mediadores inflamatorios migran en la herida, proliferan y depositan una matriz extracelular rica en colageno, mientras que los capilares en el tejido danado crecen hacia la zona de reparacion para restablecer el flujo sangumeo. Durante el proceso de remodelacion, el tejido cicatricial se reabsorbe y se reemplaza con colageno orientado, mas denso, para producir tejido con algunas de las caractensticas del tejido original.

El documento US 2012/164113 Al desvela metodos para tratar tejido adiposo usando cavitacion ultrasonica para disociar las celulas grasas y los vasos sangumeos contenidos dentro del tejido adiposo y, por lo tanto, para obtener fracciones vasculares mesenquimales o estromales para uso en sujetos humanos. El documento WO 2012/024573 desvela una poblacion de celulas madre perivasculares purificadas (PSC) o celulas madre pluripotentes inducidas (iPS) y un sobrenadante de celulas madre libres a partir de la celula madre, una composicion que comprende cualquiera de estos, y un metodo de uso y fabricacion de los mismos. El documento laea: "Bioburden Radiation Sterilization of Tissue Allografts: Requirements for Validation and Routing Control A Code of Practice", 1 de enero de 2007, desvela la esterilizacion por radiacion de aloinjertos de tejido.

Sumario

Se ha desarrollado una diversidad de diferentes metodos terapeuticos para ayudar en la reparacion tisular. Estos incluyen estructuras ffsicas, tales como mejores suturas, anclajes oseos, y parches o implantes para proporcionar armazones para el crecimiento de tejidos. Ademas, se ha usado una diversidad de factores de crecimiento para mejorar el crecimiento del tejido y la migracion al sitio de la herida, asf como para estimular la angiogenesis. Por ejemplo, hay informes de mejona de la cicatrizacion del tendon usando factores de crecimiento tales como BMP-2, BMP-12, PDGF-BB y bFGF en modelos preclmicos.

Mas recientemente, se han realizado esfuerzos para usar celulas madre para estimular la cicatrizacion de heridas y la regeneracion tisular. Se cree que las celulas madre median en la cicatrizacion mediante cualquiera de una diversidad de diferentes mecanismos, que incluyen: modulacion del proceso inflamatorio; migracion al tejido danado y reclutamiento de otras celulas, tales como celulas precursoras endoteliales, necesarias para el crecimiento tisular; estimulacion de la proliferacion de celulas reparadoras; soporte para el remodelado de tejidos sobre la formacion de cicatrices; inhibicion de la apoptosis; y diferenciacion en tejido oseo, cartilaginoso, tendinoso, o ligamentoso. Ha habido una serie de informes que describen el uso de celulas madre para el tratamiento o la generacion de muchos tejidos diferentes. Gran parte de este trabajo se ha centrado en el uso de celulas madre obtenidas a partir de tejido adiposo y otras celulas multipotentes, porque se obtienen facilmente en grandes cantidades. Sin embargo, debido a la preocupacion de que las celulas o tejidos alogenicos trasplantados pueden invocar una respuesta inmunologica y por ultimo rechazo, o pueden transferir virus daninos u otros patogenos, este trabajo se ha centrado en el uso de celulas autologas. Desafortunadamente, sin embargo, el uso de celulas madre autologas es inconveniente. Requiere dos procedimientos quirurgicos distintos con dolor asociado, coste y morbilidad, y tambien existen riesgos asociados con el envfo del tejido a un laboratorio para su procesamiento y retrasos en el tratamiento del paciente lesionado.

Claramente, en la tecnica existe la necesidad de nuevas composiciones terapeuticas de celulas madre alogenicas y otras celulas multipotentes utiles para el tratamiento de reparacion de lesion tisular sin causar una respuesta inmunitaria no deseada. La presente invencion satisfacer esta necesidad y proporciona otras ventajas.

Por lo tanto, se proporcionan, en varias realizaciónes, nuevas composiciones y un recipiente impermeable a la humedad que comprende las composiciones que son utiles, tal como en la reparacion y/o regeneracion del tejido.

En varias realizaciónes, se proporcionan composiciones que comprenden tejido microvascular procesado, en las que el tejido microvascular procesado comprende celulas multipotentes aisladas o una membrana celular obtenida a partir de o derivada de dichas celulas multipotentes o tejido microvascular, en el que dicha composicion tiene actividad angiogenica o antiinflamatoria, en el que dicha composicion se esteriliza mediante irradiacion y los virus dentro de dicha composicion estan inactivados, y en las que la esterilizacion por irradiacion se realiza por exposicion de la composicion a radiacion gamma o radiacion de haz electronico a una dosificacion en el intervalo de 0,5 Mrad a 5,0 Mrad. En realizaciónes particulares, las celulas o composicion no se han cultivado. En realizaciónes particulares, una cantidad inferior o igual a un 50% o una cantidad inferior o igual a un 10% de las celulas presentes en la composicion son viables. En realizaciónes particulares, esencialmente ninguna de las celulas presentes en dicha composicion es viable. En ciertas realizaciónes, al menos un 1 % de dichas celulas excluye el azul de tripano. En realizaciónes particulares, la composicion se seca, se liofiliza o se crioconserva. En realizaciónes relacionadas, la composicion, que incluye la composicion esterilizada, seca, liofilizada, o crioconservada, mantiene una actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable cuando se almacena aproximadamente a temperatura ambiente durante al menos un mes. En ciertas realizaciónes, la composicion comprende un excipiente.

En varias realizaciónes, las composiciones que se desvelan en el presente documento comprenden adicionalmente un armazon o matriz implantable, que puede ser, por ejemplo, un implante obtenido a partir de hueso, un armazon de biofibra, un polfmero poroso reabsorbible, un hidrogel, un producto tisular que comprende una masilla, o una sutura. En particular, las celulas, tejido o membrana celular estan presentes en un hueso, tendon, o superficie colocada frente a la dermis de dicho armazon o matriz implantables.

En ciertas realizaciónes, una composicion de la presente invencion se fórmula para administracion intravenosa. Sin embargo, en realizaciónes adicionales se pueden usar otras vfas de administracion, incluyendo la administracion directa (ya sea en una superficie del tejido o mediante inyeccion directa), administracion intraarterial, administracion sistemica y similares.

En varias realizaciónes, las celulas o tejido se obtuvieron a partir de un donante mairnfero, opcionalmente un ser humano. En una realización, el donante era un mamffero sano en el momento en el que se obtuvieron las celulas o tejido. En ciertas realizaciónes, las celulas comprenden celulas madre o celulas precursoras.

Tambien se desvelan metodos para preparar una composicion que comprende celulas multipotentes aisladas, en el que dicha composicion tiene actividad angiogenica o antiinflamatoria, comprendiendo dicho metodo: disociar una muestra de tejido obtenida a partir de un mamffero donante para liberar una pluralidad de celulas multipotentes en la misma; separar una pluralidad de las celulas multipotentes liberadas de uno u otros componentes mas del tejido para producir una composicion que comprende celulas multipotentes aisladas; opcionalmente secando, liofilizando, o crioconservando la composicion antes o despues de la esterilizacion; esterilizar la composicion y/o inactivar el virus presente en la composicion, antes o despues del secado, liofilizacion o crioconservacion opcional de la composicion, en los que la composicion esterilizada mantiene una actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable. Las celulas o la composicion pueden no estar cultivadas. Opcionalmente el metodo comprende la filtracion de las celulas o la composicion liberadas, por ejemplo, que puede ser antes de la esterilizacion o secado, liofilizacion o crioconservacion. La disociacion puede comprender poner en contacto la muestra de tejido con una o mas proteasas. La una o mas proteasas puede no comprender colagenasa. La una o mas proteasas pueden comprender o consistir en: colagenasa de tipo 1 y dispasa o termolisina; o MMP2, MMP 14 y dispasa o termolisina. Se pueden usar combinaciones de estas proteasas (u otros equivalentes funcionales). La disociacion o separacion puede comprender agitacion ultrasonica, filtracion, o uso de un gradiente de densidad. El tejido puede ser tejido obtenido a partir de tejido adiposo, y la agitacion ultrasonica, filtracion o uso de un gradiente de densidad separar dichas celulas multipotentes liberadas de los adipocitos.

Tambien se desvelan metodos para preparar una composicion que comprende tejido microvascular procesado, en el que dicha composicion tiene actividad angiogenica o antiinflamatoria, comprendiendo dicho metodo: disociar una muestra de tejido microvascular obtenida a partir de un mamffero donante para producir una composicion que comprende tejido microvascular disociado; eliminar uno o mas componentes de tejido de la composicion que comprende tejido microvascular disociado; opcionalmente secando, liofilizando, o crioconservando la composicion antes o despues de la esterilizacion; y esterilizar la composicion y/o inactivar el virus presente en la composicion antes del secado, liofilizacion, o crioconservacion opcional, en los que la composicion esterilizada mantiene una actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable. Las celulas o la composicion pueden no estar cultivadas. El metodo puede comprender adicionalmente la filtracion de la composicion. La disociacion puede comprender poner en contacto la muestra de tejido con una o mas proteasas. La una o mas proteasas puede no comprender colagenasa. La una o mas proteasas pueden comprender o consisten en: colagenasa de tipo 1 y dispasa o termolisina; o MMP2, MMP 14 y dispasa o termolisina. La disociacion o eliminacion puede comprender agitacion ultrasonica, filtracion, o uso de un gradiente de densidad. El tejido microvascular puede ser tejido obtenido a partir de tejido adiposo, y dicha agitacion ultrasonica, filtracion o uso de un gradiente de densidad elimina los adipocitos de la composicion.

En una realización adicional, la presente invencion proporciona un recipiente impermeable a la humedad que comprende una composicion seca, esteril, en la que dicha composicion comprende tejido microvascular procesado, en la que el tejido microvascular procesado comprende celulas multipotentes aisladas o una membrana celular obtenida a partir de o derivada de dichas celulas multipotentes o tejido microvascular, dicha composicion tiene actividad angiogenica o antiinflamatoria, dicha composicion se esteriliza mediante irradiacion y los virus dentro de dicha composicion estan inactivados, en la que la esterilizacion por irradiacion se realiza por exposicion de la composicion a radiacion gamma o radiacion de haz electronico a una dosificacion en el intervalo de 0,5 Mrad a 5,0 Mrad y dicha composicion mantiene una actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable cuando se almacena aproximadamente a temperatura ambiente durante al menos un mes. En ciertas realizaciónes, las celulas o composicion no se han cultivado. En realizaciónes particulares, una cantidad inferior o igual a un 50 % o una cantidad inferior o igual a un 10% de las celulas presentes en dicha composicion son viables. En ciertas realizaciónes, esencialmente ninguna de las celulas presentes en dicha composicion es viable. En realizaciónes particulares, al menos un 1 % de dichas celulas excluye el azul de tripano. En realizaciónes particulares, la composicion comprende un excipiente.

En realizaciónes particulares del recipiente impermeable a la humedad, la composicion comprende adicionalmente un armazon o matriz implantable. En realizaciónes particulares, el armazon o matriz implantable es un implante obtenido a partir de hueso, un armazon de biofibra, un polfmero poroso reabsorbible, un hidrogel, un producto tisular que comprende una masilla, o una sutura. En ciertas realizaciónes, las celulas, tejido o membrana celular estan presentes en un hueso, tendon o superficie colocada frente a la dermis de dicho armazon o matriz implantable.

En una realización del recipiente impermeable a la humedad, la composicion se fórmula para administracion intravenosa.

En realizaciónes particulares del recipiente impermeable a la humedad de la invencion, las celulas o tejido se obtuvieron a partir de un donante mairnfero, opcionalmente un ser humano. En realizaciónes particulares, el donante era un mamffero sano en el momento en el que se obtuvieron las celulas o tejido. En ciertas realizaciónes, las celulas comprenden celulas madre o celulas precursoras. En ciertas realizaciónes, el recipiente es un vial que comprende un cierre sellado hermetico. En diversas realizaciónes, el recipiente esta presente dentro de un envase sellado hermeticamente que comprende un interior esteril.

En otra realización relacionada, la presente invencion se refiere a la composicion como se define en las reivindicaciones para uso en el tratamiento o la prevencion de una lesion o enfermedad, o para estimular la regeneracion tisular, en un mamffero. En realizaciónes particulares, la composicion se implanta por via quirurgica en el mamffero. En ciertas realizaciónes, la composicion se implanta dentro o aquella frente a un sitio de lesion o enfermedad en dicho mamffero. En realizaciónes relacionadas, la composicion se proporciona a dicho mamffero por via intravenosa. En ciertas realizaciónes, la lesion esta presente en un tejido blando. En realizaciónes particulares, la lesion esta presente en un tendon, un ligamento, piel, un hueso, un cartflago, un disco, o tejido microvascular. En realizaciónes particulares, la lesion o enfermedad es una lesion isquemica, una lesion por reperfusion, una lesion microvascular, o inflamacion. En ciertas realizaciónes, la enfermedad es artritis, tal como por ejemplo, osteoartritis o artritis reumatoide.

En el contexto de la presente invencion tambien se desvelan composiciones que comprenden celulas multipotentes y uno o mas componentes de la pared del recipiente y/o de la matriz extracelular. En el contexto de la presente invencion tambien se desvela una composicion esterilizada que comprende celulas multipotentes. En el contexto de la presente invencion tambien se encuentra una composicion que comprende celulas multipotentes que excluyen el azul de tripano pero que no proliferaran. En el contexto de la presente invencion tambien se encuentra una composicion que comprende celulas multipotentes y uno o mas componentes de la pared del recipiente y de la matriz extracelular. En el contexto de la presente invencion tambien se desvela una composicion esterilizada que comprende celulas multipotentes. En el contexto de la presente invencion tambien se encuentra una composicion que comprende celulas multipotentes que excluyen el azul de tripano pero que no proliferaran. En el contexto de la presente invencion tambien se encuentra una composicion que comprende celulas multipotentes esterilizadas que excluyen el azul de tripano pero que no proliferaran. En el contexto de la presente invencion tambien se desvelan composiciones, en las que al menos un 50 % o al menos un 90 % de las celulas presentes en la composicion excluyen el azul de tripano pero que no proliferaran. La composicion puede comprender celulas multipotentes. Al menos un 50 % o al menos un 90 % de las celulas multipotentes presentes en la composicion pueden excluir el azul de tripano pero que no proliferaran. Puede ser viable una cantidad inferior o igual a un 50 % o una cantidad inferior o igual a un 10 % de las celulas totales presentes en la composicion. Esencialmente ninguna de las celulas presentes en dicha composicion puede ser viable. Cualquiera de las composiciones o metodos que se desvelan en el contexto de la presente invencion, al menos un 1 % o al menos un 5 %, o al menos un 10 %, o al menos un 20 %, al menos un 50 %, o al menos un 90 % de dichas celulas excluye el azul de tripano.

En el contexto de la presente invencion tambien se desvela una composicion esterilizada que comprende dos o mas componentes de las celulas multipotentes. La composicion puede comprender cinco o mas o diez o mas componentes de las celulas multipotentes. En el contexto de la presente invencion tambien se encuentra una composicion que comprende membrana celular y protemas de celulas multipotentes. La composicion puede no comprender ninguna celula viable o no comprende ninguna celula intacta.

Ademas, las composiciones de la presente invencion son para uso en el tratamiento o la prevencion de una lesion o enfermedad en un mairnfero, incluyendo cualquiera de las lesiones o afecciones que se describen en el presente documento, en las que dichas celulas multipotentes no son autologas para dicho sujeto.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 proporciona un diagrama esquematico de los estudios que se describen en el Ejemplo 1.

La Figura 2 es un grafico que muestra los recuentos celulares calculados con un aumento de 100X de celulas en 6 campos. Las celulas BMA y BMB en los tampones 1 y 2 despues y antes de de irradiacion (Control) se usaron para atraer a las celulas HUVEC que se etiquetaron con CM-Dil. El recuento celular se calculo mediante un recuento visual de 6 imagenes (campos) con un aumento de 100X. Se hizo el promedio de los recuentos y se representaron como se muestra. Las lmeas de puntos representan el promedio los controles de medios negativos. Los indices celulares por encima de esa lmea representan un aumento de la liberacion debida a las muestras de material de BMA o BMB. Las etiquetas que se muestran de la parte superior a la inferior corresponden a las barras que se muestran de izquierda a derecha para cada punto temporal.

La Figura 3 muestra imagenes de microscopfa de fluorescencia de celulas endoteliales humanas etiquetadas en presencia de BMA en Tampon 1 durante un transcurso de tiempo de 12, 24 y 48 horas de transmigracion.

La Figura 4 muestra imagenes de microscopfa de fluorescencia de celulas endoteliales humanas etiquetadas en presencia de BMB en Tampon 1 durante un transcurso de tiempo de 12, 24 y 48 horas de transmigracion.

La Figura 5 muestra imagenes de microscopfa de fluorescencia de celulas endoteliales humanas etiquetadas en presencia de BMA en Tampon 2 durante un transcurso de tiempo de 12, 24 y 48 horas de transmigracion.

La Figura 6 muestra imagenes de microscopfa de fluorescencia de celulas endoteliales humanas etiquetadas en presencia de BMB en Tampon 2 durante un transcurso de tiempo de 12, 24 y 48 horas de transmigracion.

La Figura 7 muestra imagenes de microscopfa de fluorescencia de celulas endoteliales humanas etiquetadas. La muestra en la parte izquierda es EZ-CPZ™ sin diluir, que es representativo de los tampones 1 y 2 en los que se conservaron las celulas. EZ-CPZ™ es un medio de crioconservacion (Incell Corp., San Antonio, TX). Incell Corp. describe EZ-CPZ™ como un medio de crioconservacion sin suero y sin protema, listo para usar, que se mezclan ligeramente a 1:1 (v:v) con una suspension celular. EZ-CPZ™ soporta una viabilidad celebrada y reanimacion de una diversidad de tipos de celulas que incluyen: cultivos de celulas primarias, linfocitos, hibridoma, CHO, colon, IBHK y lmeas de celulas de cancer. EZ-CPZ™ contiene una formulacion patentada de componentes de calidad clmica, agentes de vitrificacion y crioconservacion, y una concentracion final de DMSO al 5 %. EZ-CPZ™ proporciona crioproteccion a celulas humanas y de otros marnfferos. En la parte derecha aparece una mezcla a 50:50 de EZ-CP^zy medio definido por M3D™ (Incell Corp., San Antonio, TX), que es representativo de los tampones en los que se conservara el material de la composicion de tejido microvascular procesado. Incell Corp. describe M3D™ como un medio definido que contiene sales, aminoacidos, y azucares, pero no factores de crecimiento o componentes indefinidos tales como suero o extractos. Se formaron imagenes del transcurso del tiempo de transmigracion en los puntos temporales de 12 y 48 horas.

La Figura 8 muestra imagenes de microscopfa de fluorescencia. Las celulas SVF se sembraron en placas en una placa de 48 pocillos y se cultivaron hasta una confluencia de aproximadamente un 50 %. El material de BMA se tino con CMDil y se aclaro. 50 pl del material de BMA se pusieron en un solo pocillo de celulas SVF en crecimiento. Se observa fluorescencia cuando las SVF han tomado el material tenido con CMDil y lo han incorporado en sus propias membranas. El material de BMA en el Tampon 1 se representa en la fila de la parte superior, y el material de BMA en el Tampon 2 se representa en la fila de la parte inferior. El material en la parte izquierda se irradio y el material en del lado derecho (Cont) no se irradio.

La Figura 9 muestra imagenes de microscopfa de fluorescencia. Las celulas SVF se sembraron en placas en una placa de 48 pocillos y se cultivaron hasta una confluencia de aproximadamente un 50 %. El material de BMB se tino con CMDil y se aclaro. 50 pl del material de BMA se pusieron en un solo pocillo de celulas SVF en crecimiento. Se observa fluorescencia cuando las SVF han tomado el material tenido con CMDil y lo han incorporado en sus propias membranas. El material de BMB en el Tampon 1 se representa en la fila de la parte superior, y el material de en el Tampon 2 se representa en la fila de la parte inferior. El material en la parte izquierda se irradio y el material en del lado derecho (Cont) no se irradio.

La Figura 10 representa datos relacionados con la migracion de celulas endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) como respuesta a exposicion a tejido microvascular. Se hizo el recuento del numero de celulas HUVEC que cruzan la membrana de una placa Transwell a las 48 horas y se comparo con los medios de cultivo controles de EGF.

La Figura 11 representa datos relacionados con el restablecimiento del flujo sangmneo a las patas traseras de ratones despues de seccion transversal de la arteria femoral el dfa 0, y los dfas 7 y 14 despues de la administracion de cualquiera de tejido microvascular liofilizado o esterilizado.

La Figura 12 representa datos relacionados con la generacion de nuevos vasos sangmneos en ratones SCID Despues de inyecciones con matrigel solo, o en combinacion con cualquiera de tejido microvascular liofilizado o esterilizado.

Las Figuras 13A-13C se refieren a la regeneracion de hueso despues del implante de tejido microvascular. La Figura 13A representar datos que se relacionan con la resistencia, modulo elastico, y dureza (en comparacion con el hueso contralateral de control) despues de la administracion de un armazon con o sin tejido microvascular. La Figura 13B representa datos histologicos con respecto a la regeneracion osea despues de la aplicacion del armazon solo. La Figura 13C representa datos histologicos con respecto a la regeneracion osea despues de la aplicacion del armazon en combinacion con tejido microvascular.

Las Figuras 14A-14H se refieren a la regeneracion de cartflago despues del implante de tejido microvascular. La Figura 14A muestra una imagen macroscopica de cartflago tratado solamente con el armazon, mientras que las Figuras 14B, 14C, y 14D muestran imagenes que se refieren al relleno de los defectos del cartflago inducidos, la retencion de proteoglicano y tincion de la matriz (respectivamente) en cartflago tratado con armazon solo. La Figura 14E muestra una imagen macroscopica de cartflago tratado con armazon suplementado con tejido microvascular, mientras que las Figuras 14F, 14G, y 14H muestra imagenes relacionadas con el relleno de los defectos del cartflago inducidos, la retencion de proteoglicano y tincion de la matriz (respectivamente) en cartflago tratado con armazon suplementado con tejido microvascular.

Las Figuras 15A-15F se refieren a la reparacion de tendon desgastado usando tejido microvascular. Las Figuras 15A y 15B representan, respectivamente, tincion con Tricromo de Masson o inmunohistoqmmica de Tenascina de tendon desgastado y sin tratar. Las Figuras 15C y 15D representan, respectivamente, tincion con Tricromo de Masson o inmunohistoqmmica de Tenascina de tendon desgastado tratados solamente con armazon. Las Figuras 15E y 15F representan, respectivamente, tincion con Tricromo de Masson o inmunohistoqmmica de Tenascina de tendon desgastado tratado con armazon suplementado con tejido microvascular.

Descripcion detallada

La presente invencion se basa en el desarrollo de nuevos metodos para procesar tejido microvascular para producir una composicion como se define en las reivindicaciones. En diversas realizaciónes, las celulas o tejido no se cultivan durante estos procedimientos. De forma ventajosa, la composicion tiene actividad angiogenica o antiinflamatoria. La composicion se esteriliza y los virus dentro de dicha composicion se inactivan durante los procedimientos, ademas la composicion aun presenta esta eficacia terapeutica inesperada.

Las nuevas composiciones producidas con los metodos que se desvelan en el presente documento ofrecen ventajas sobre el tejido microvascular procesado y composiciones de celulas multipotentes anteriores, incluyendo las ventajas asociadas con el tratamiento o prevencion de una lesion, por ejemplo, una lesion en tejido blando, en un sujeto. Estas ventajas incluyen (pero no se limitan a): (1) la capacidad para usar las composiciones de la presente invencion para el tratamiento alogenico o xenogenico de los sujetos; (2) las composiciones de la presente invencion producen una reduccion de la respuesta inmunitaria y una reduccion de la probabilidad de rechazo; (3) las composiciones de la presente invencion tienen actividad antiinflamatoria; (4) las composiciones de la presente invencion tienen actividad angiogenica; (5) las composiciones de la presente invencion son esteriles y no estan contaminadas con virus nocivos; y (6) las composiciones de la presente invencion se pueden almacenar de manera estable antes de su uso y/o estan listas para su uso inmediato. En resumen, estas composiciones proporcionan convenientemente todos los mecanismos de accion inherentes a las preparaciones de celulas madre o multipotentes viables, tradicionales, excepto para diferenciacion en tejidos. En la siguiente descripcion, se exponen ciertos detalles espedficos con el fin de proporcionar una comprension minuciosa de las diversas realizaciónes de la invencion.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que normalmente entienden las personas con experiencia en la materia a la que pertenece la invencion. Para los fines de la presente invencion, los siguientes terminos se definen a continuacion. Los terminos "un" y "uno" indican uno o mas, a menos que se indique espedficamente de otro modo.

Por "aproximadamente" se hace referencia a una cantidad, nivel, valor, numero, frecuencia, porcentaje, dimension, tamano, cantidad, peso o longitud que vana en tanto, un 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o un 1 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, numero, frecuencia, porcentaje, dimension, tamano, cantidad, peso o longitud de referencia. En cualquier realización que se discuta en el contexto de un valor usado en conjunto con el termino "aproximadamente", se contempla especialmente que se puede omitir el termino aproximadamente.

Al menos que el contexto lo requiera de otro modo, en toda la presente memoria descriptiva y reivindicaciones, el termino "comprender" y variaciones del mismo, tales como, "comprende" y "que comprende" se debe interpretar en un sentido inclusivo, abierto, es decir, como "que incluye, pero no se limita a".

Por "que consiste en" se hace referencia a que incluye, y se limita a, lo que sea que siga a la expresion "que consiste en". Por lo tanto, la expresion "que consiste en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, y que no puede estar presente ningun otro elemento.

Por “que consiste esencialmente en" se hace referencia a la inclusion de cualquier elemento mencionado en la expresion, ilimitado a otros elementos que no interfieran o contribuyan con la actividad coaccion especificada en la divulgacion de los elementos enumerados. Por lo tanto, la expresion "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden estar presentes o no dependiendo de si afectan o no a la actividad o accion de los elementos enumerados.

En la presente memoria descriptiva la referencia a "una realización" o "una realización" se refiere a que un elemento distintivo particular, estructura o caractenstica que se describe en relacion con la realización esta incluido en al menos una realización de la presente invencion. Por lo tanto, no necesariamente todas las apariciones de las expresiones "en una realización " o "en una realización" en diversos lugares en toda esta memoria descriptiva se refieren a la misma realización. Ademas, los elementos distintivos particulares, estructuras o caractensticas se pueden combinar de cualquier manera adecuada en una o mas realizaciónes.

Como se usa en el presente documento, los terminos "funcion" y "funcional", y similares, se refieren a una funcion biologica, enzimatica o terapeutica.

Una cantidad "aumentada" o "mejorada" generalmente es una cantidad "estadfsticamente significativa", y puede incluir un aumento que es 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, o 50 o mas veces (por ejemplo, 100, 500, 1000 veces) (incluyendo todos los numeros enteros y puntos decimales entre y por encima de 1, por ejemplo, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, etc.) una cantidad o nivel que se describe en el presente documento.

Una cantidad "disminuida" o "reducida" o "menor" generalmente es una cantidad "estadfsticamente significativa", y puede incluir una disminucion que es aproximadamente 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,61,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, o 50 o mas veces (por ejemplo, 100, 500, 1000 veces) (incluyendo todos los numeros enteros y puntos decimales entre y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7. 1,8, etc.) una cantidad o nivel que se describe en el presente documento.

Por "obtenida a partir de" se hace referencia a que una muestra tal como, por ejemplo, una celula o tejido, se afsla de, o se obtiene a partir de, una fuente en particular, tal como un organismo deseado o un tejido espedfico dentro de un organismo deseado.

Como se usa en el presente documento, el termino "aislada", por ejemplo, con respecto a una celula multipotente, se refiere a la eliminacion de su entorno natural. Por ejemplo, una cell se afsla si esta se separa de algunos o todos los materiales coexistentes en su entorno natural.

La expresion "tejido microvascular procesado", como se usa en el presente documento, se refiere a tejido microvascular que se disocia como se describe en el presente documento.

El termino "crioconservado", como se usa en el presente documento, se refiere a composiciones de celula multipotente o tejido microvascular procesado que se congelan, por ejemplo, a baja temperatura. El tejido microvascular procesado y la celula multipotente crioconservada y las composiciones de tejido microvascular tienen una diversidad de propiedades biologicas, que incluyen actividad antiinflamatoria y actividad angiogenica.

Las "celulas multipotentes" se refieren a celulas que mantienen la capacidad para diferenciarse en dos o mas tipos de celulas especializadas. Las "celulas multipotentes" incluyen celulas madre y celulas precursoras multipotentes. Como se usa en el presente documento, la expresion "celula multipotente" se refiere a una capacidad original de la celula para diferenciarse en dos o mas tipos de celulas especializadas diferentes antes de que se esterilicen o conserven de acuerdo con un metodo que se describe en el presente documento. Los ejemplos de celulas multipotentes incluyen, pero no se limitan a, celulas madre mesenquimales, celulas madre embrionarias, celulas madre neuronales, celulas precursoras endoteliales, celulas madre obtenidas a partir del tejido adiposo, y celulas madre del cordon umbilical. Se entiende que despues de esterilizacion o conservacion de acuerdo con los metodos que se describen en el presente documento, una celula multipotente puede perder su capacidad para crecer o diferenciarse.

"Vehmulo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable" incluye, pero no se limita, cualquier adyuvante, vehmulo, excipiente, sustancia de deslizamiento, agente edulcorante, diluyente, conservante, tinte/colorante, potenciador del sabor, tensioactivo, agente humectante, agente de dispersion, agente de suspension, estabilizante, agente isotonico, disolvente o agente emulsionante que ha sido aprobado por la Food and Drug Administration de Estados Unidos como aceptable para uso en seres humanos o animales domesticos.

Una "composicion farmaceutica" se refiere a una formulacion de una composicion de la invencion y un medio generalmente aceptado en la tecnica para la administracion de un agente terapeutico a mairnferos, por ejemplo, seres humanos. Un medio de ese tipo incluye cualquier por lo tanto vehmulo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo, "tratamiento", y terminos similares tales como "tratado", "tratar" etc., indica un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clmicos. El tratamiento puede implicar opcionalmente la reduccion comer fuera de los smtomas de una lesion, enfermedad o afeccion, o el retardo de la evolucion de la lesion, enfermedad o afeccion. La administracion de la composicion que se describe en el presente documento puede tratar, en algunas realizaciónes, uno o mas de tales smtomas.

Como se usa en el presente documento, a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo, "prevencion", y terminos similares tales como "prevenido", "prevenir" etc., indica un enfoque para obtener prevenir, inhibir o reducir la probabilidad del inicio o recurrencia de una lesion, enfermedad o afeccion. Tambien se refiere a prevencion, inhibicion o reduccion de la probabilidad de aparicion o recurrencia de uno o mas smtomas de una lesion, enfermedad o afeccion, u opcionalmente un enfoque para retrasar el inicio o recurrencia de una lesion, enfermedad o afeccion o para retrasar la aparicion o recurrencia de uno o mas smtomas de una enfermedad o afeccion por lesion. Como se usa en el presente documento, "prevencion" y terminos similares tambien incluye la reduccion de la intensidad, efecto, smtomas y/o carga de una lesion, enfermedad o afeccion.

Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapeuticamente eficaz" de una composicion es esa cantidad suficiente como para influir en un efecto biologico deseado, tal como, por ejemplo, resultados clmicos beneficiosos.

Las expresiones "transferencia autologa", "trasplante autologo", y similares se refieren a tratamientos en los que el donante de tejido es tambien el receptor de la composicion producida a partir del tejido.

Las expresiones "transferencia alogenica", "trasplante alogenica ", y similares se refieren a tratamientos en los que el donante de tejido es de la misma especie que el receptor de la composicion producida a partir del tejido, pero no es el mismo individuo.

Las expresiones "transferencia xenogenica", "trasplante xenogenico", y similares se refieren a tratamientos en los que el donante de tejido es de una especie diferente a la del receptor de la composicion producida a partir del tejido. Metodos para Producir Composiciones de Celulas Madre y de Tejido Microvascular

En el presente documento se desvelan nuevos metodos de procesamiento microvascular, tejido para producir una composicion que comprende celulas multipotentes o fragmentos de los mismos como se define en las reivindicaciones. En realizaciónes particulares, la composicion comprende adicionalmente uno o mas componentes tisulares adicionales. Por consiguiente, la expresion "composicion de tejido microvascular procesado" se refiere a composiciones de la presente invencion, que pueden comprender o no celulas multipotentes intactas. En realizaciónes particulares, una composicion de tejido microvascular de la presente invencion no comprende ninguna celula multipotente intacta o no comprende ninguna celula multipotente viva o no comprende ninguna celula viva. En ciertas realizaciónes, una composicion de tejido microvascular de la presente invencion comprende fragmentos o membranas celulares de celulas multipotentes. Una "composicion que comprende celulas multipotentes" o "composicion de celulas multipotentes" de la presente invencion puede comprender celulas multipotentes vivas y/o muertas.

En el presente documento se desvelan nuevos metodos para producir composiciones de tejido microvascular procesado como se define en las reivindicaciones, incluyendo los que son utiles en el tratamiento y prevencion de diversas lesiones, enfermedades o afecciones patologicas, por ejemplo, una lesion en tejido blanco. Los metodos incluyen la esterilizacion de la composicion e inactivacion de los picos virus dentro de dichas celulas o tejido. Es un hallazgo sorprendente e inesperado que las composiciones de tejido microvascular esterilizadas de ese tipo conserven propiedades biologicas deseables, incluyendo propiedades utiles para el tratamiento o prevencion de lesiones, enfermedades y otras afecciones patologicas.

Las composiciones de tejido microvascular de la presente invencion se pueden preparar a partir de cualquier tejido de mai^ero, por ejemplo, tejido obtenido a partir de un mairnfero, tal como un ser humano, un primate no humano, un perro, un gato o un caballo. Las composiciones de la presente invencion pueden ser para uso en el tratamiento de un mamffero autologo, alogenico o xenogenico. Por consiguiente, el tejido se puede obtener a partir del sujeto que se va a tratar, o de un animal donante diferente, que puede ser de la misma especie o de una especie diferente a la del sujeto que se va a tratar. En realizaciónes particulares, el tejido se obtiene a partir de un donante alogenico de la misma especie que el sujeto que se va a tratar, por ejemplo, un donante mamffero humano o no humano. En realizaciónes particulares, un animal donante es un donante sano.

En diversas publicaciones, las composiciones de tejido microvascular se preparan a partir de una serie de tejidos diferentes. El tejido es tejido no embrionario. Por ejemplo, en realizaciónes particulares, el tejido usado para preparar las composiciones de la presente invencion es un tejido vascular o microvascular, tal como, por ejemplo, tejido adiposo, piel, hueso, tejido de tendon, tejido postparto (por ejemplo, tejido del cordon umbilical o tejido placentario), medula osea, o tejido muscular.

En ciertas realizaciónes, las composiciones de la presente invencion se pueden preparar mediante un metodo que comprende: disociar una muestra de tejido para liberar celulas y/u otros componentes tisulares; separar al menos una parte de las celulas liberadas y/o componentes tisulares de uno u otros componentes mas del tejido; y esterilizar las celulas separadas y/o componentes tisulares y tratar las celulas separadas y/o componentes tisulares para inactivar los virus en la misma. En ciertas realizaciónes, las celulas separadas y/o componentes tisulares se secan, se liofilizan, se congelan, o se crioconservan antes, durante o despues de su esterilizacion y se trata para inactivar los virus. Las celulas separadas y/o componentes tisulares se esterilizan y se tratan para inactivar los virus despues de ser secados, liofilizados, congelados, o crioconservados. En realizaciónes relacionadas, las celulas separadas y/o componentes tisulares se esterilizan y se tratan para inactivar los virus despues de su puesta en contacto con un agente crioprotector, por ejemplo, un agente crioprotector que protege las celulas de la radiacion por la esterilizacion. Los agentes crioprotectores pueden proteger los componentes al estabilizar las protemas, interrumpir los radicales libres y resistir la oxidacion. El dano se puede minimizar aun mas al enfriar la composicion durante la radiacion, eliminando el oxfgeno de la composicion (por ejemplo, secando la composicion y/o irradiando en una atmosfera de vacfo o inerte).

Los metodos que se desvelan en el presente documento pueden comprender adicionalmente: disociar una muestra de tejido obtenida a partir de un mamffero donante para liberar una pluralidad de celulas multipotentes en la misma; separar una pluralidad de las celulas multipotentes liberadas de uno u otros componentes mas del tejido para producir una composicion que comprende celulas multipotentes aisladas; y esterilizar la composicion que comprende celulas multipotentes aisladas inactivar los virus presentes en la composicion que comprende celulas multipotentes aisladas. En realizaciónes particulares, la composicion que comprende celulas multipotentes se seca, se liofiliza, se congela, o se crioconservado antes, durante o despues de su esterilizacion y se trata para inactivar los virus. En realizaciónes particulares, las celulas separadas y/o los componentes del tejido se esterilizan y se tratan para inactivar los virus despues ser secados, liofilizados, congelados o crioconservados. En realizaciónes relacionadas, las celulas separadas y/o componentes tisulares se esterilizan y se tratan para inactivar los virus despues de su puesta en contacto con un agente crioprotector, por ejemplo, un agente crioprotector que protege las celulas de la radiacion por la esterilizacion.

Los metodos que se desvelan en el presente documento pueden comprender adicionalmente: disociar una muestra de tejido obtenida a partir de un mamffero donante para liberar una pluralidad de componentes del tejido en la misma; separar una pluralidad de componentes de tejido liberados para producir una composicion que comprende Uno o mas componentes tisulares; y esterilizar la composicion e inactiva los virus presentes en la composicion. En realizaciónes particulares, la composicion se seca, se liofiliza, se congela, o se crioconserva antes, durante o despues de su esterilizacion y se trata para inactivar los virus. En realizaciónes particulares, las celulas separadas y/o los componentes del tejido se esterilizan y se tratan para inactivar los virus despues ser secados, liofilizados, congelados o crioconservados. En realizaciónes relacionadas, las celulas separadas y/o componentes tisulares se esterilizan y se tratan para inactivar los virus despues de su puesta en contacto con un agente crioprotector, por ejemplo, un agente crioprotector que protege las celulas de la radiacion por la esterilizacion.

En ciertas realizaciónes, los componentes tisulares comprenden una o mas celulas multipotentes, celulas diferenciadas, componentes de la matriz extracelular, factores de crecimiento, agentes angiogenicos, agentes antiinflamatorios, citoquinas, quimioquinas, y/o agentes de diferenciacion. Los componentes de la matriz extracelular incluyen, pero no se limitan a, protemas de la matriz extracelular, tales como diversos colagenos, fibronectina, vitronectina y trombospondina, y otros que se describen en el presente documento.

Las muestras de tejido se pueden obtener a partir de un sujeto o donante mediante una diversidad de metodos diferentes, que incluyen cirugfa, lipoaspiracion, biopsia o biopsia con aguja. Un donante puede estar vivo o muerto, por ejemplo, recientemente fallecido.

El tejido se puede disociar mediante diversos metodos, incluyendo procesamiento tanto enzimatico y/o como mecanico. Por ejemplo, el tejido se puede disociar por fuerza mecanica (fuerzas de picado o de corte), digestion enzimatica con enzimas proteolfticas simples o combinatorias, tales como una matriz de metaloproteasa y/o proteasa neutra, por ejemplo, colagenasa, tripsina, dispasa, LIBERASE (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.), hialuronidasa, y/o pepsina, o una combinacion de metodos mecanicos y enzimaticos. En realizaciónes particulares, los metodos que se desvelan en el presente documento no emplean el uso de una colagenasa.

Los metodos de digestion enzimatica que se desvelan en el presente documento usan una combinacion de enzimas, tal como una combinacion de una metaloproteasa de matriz y una proteasa neutra. La metaloproteasa de matriz puede ser una colagenasa, y la proteasa neutra puede ser termolisina o dispasa. La colagenasa puede ser de tipo 1, 2, 3 o 4 (MMP 1, 8, 13, 18). Los metodos de digestion enzimatica pueden usar una combinacion de una metaloproteasa de matriz, una proteasa neutra y una enzima mucolttica para la digestion de acido hialuronico, tal como una combinacion de colagenasa, dispasa y hialuronidasa o una combinacion de LIBERASE (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis , Ind.) e hialuronidasa. Otras enzimas conocidas en la tecnica para la disociacion celular incluyen padolor, desoxiribonucleasas, serina proteasas, tales como tripsina, quimotripsina, gelatinasas o elastasa, que se pueden usar solas o en combinacion con otras enzimas tales como metaloproteasas de matriz, enzimas mucolfticas y proteasas neutras. Una combinacion de enzimas puede comprender o consistir en colagenasa de Tipo 1 con cualquiera de dispasa o termolisina, Liberase, y/o Vitacyte. A Una combinacion de enzimas puede comprender o consistir en colagenasa de Tipo 1 con dispasa o termolisina, Liberase, y/o Cizyme. No se puede usar una colagenasa, ya sea sola o en combinacion con uno o mas enzimas adicionales. MMP 2 y/o 14 se pueden usar en lugar de MMP 1 (solas o en cualquiera de las combinaciones que se describen en el presente documento).

La temperatura y el periodo de tiempo en los que los tejidos o las celulas estan en contacto con proteasas para conseguir la disociacion se conocen y los puede determinar facilmente alguien con experiencia en la materia. El proceso de digestion enzimatica se puede ajustar para aumentar o disminuir la disociacion celular. Por ejemplo, si se desea una disociacion celular mas completa, se puede incluir mas de una enzima o se puede aumentar el tiempo de digestion. Aunque no es necesario mantener la viabilidad celular, en algunas realizaciónes generalmente se desea que las membranas celulares permanezcan generalmente intactas para conservar las membranas que contienen moleculas de union y senalizacion, incluso si se produce alguna lisis celular durante la digestion enzimatica. Por lo tanto, el uso de enzimas tales como lipidasas puede no ser util en un proceso tal como se desvela en el presente documento.

Como alternativa, o ademas del tratamiento enzimatico, el tejido se puede disociar usando un metodo no enzimatico. Por ejemplo, el tejido se puede disociar usando medios ffsicos o qmmicos, incluyendo el uso de agentes quelantes, agitacion ultrasonica, ultrasonidos (por ejemplo, para someter a lisis o eliminar adipocitos), o disociacion celular mecanica.

En realizaciónes particulares en las que el tejido es hueso, el hueso se desmineraliza antes del procesamiento enzimatico (u otro) para liberar celulas de la matriz de colageno. En realizaciónes particulares, el hueso se desmineraliza usando EDTA (a diferencia de un disolvente para desgrasar el tejido seguido de acido para retirar los minerales oseos). Los metodos de procesamiento de tejido, por ejemplo, hueso, pueden no incluir uno o mas de los siguientes: extraccion con disolvente de grasas y/o o celulas, molienda criogenica para reducir el tamano de partfcula, y/o desmineralizacion acida.

Despues de la disociacion tisular, el tejido disociado se puede tratar adicionalmente para aislar o separar los componentes deseados del tejido, por ejemplo, celulas multipotentes (y/o u otros componentes deseados del tejido celular o no celular), de los componentes tisulares no deseados. Estos metodos se pueden usar, por ejemplo, para retirar celulas o moleculas no deseadas, tales como globulos rojos, adipocitos, otras celulas diferenciadas, o lfpidos. Se puede usar una diversidad de metodos para separar celulas multipotentes y otros componentes de tejido deseados de celulas o componentes de tejido no deseados, tal como, por ejemplo, filtracion (por ejemplo, un filtro de tamano de oro de 20 pm podna dejar pasar celulas multipotentes pero retener muchos adipocitos o celulas musculares), centrifugacion (los adipocitos y los lfpidos flotan, mientras que las celulas multipotentes sedimentan), o gradientes de densidad (los gradientes se pueden usar para sedimentar globulos rojos y para suspender celulas multipotentes a diferentes niveles que las celulas no deseadas). El metodo particular usado puede depender, en parte, de la fuente de tejido que se va a procesar. Por ejemplo, si la fuente de tejido es tejido adiposo, el tejido disociado se centrifuga opcionalmente con una fuerza relativamente baja para separar lfpidos, adipocitos y algunos preadipocitos de otros componentes del tejido microvascular, mientras que un gradiente de densidad se usa opcionalmente cuando se afslan celulas multipotentes de la medula osea. Los protocolos de aislamiento de celulas musculares, tales como el uso de centrifugacion con gradiente de densidad, se pueden usar para tratar adicionalmente el tejido muscular despues de digestion enzimatica para extraer las celulas musculares y enriquecer las celulas deseadas.

En ciertas realizaciónes, una composicion de la presente invencion tambien se filtra, por ejemplo, para retirar grupos de celulas. Por ejemplo, la filtracion, por ejemplo, con un filtro de tamano de poro de 20 a 50 micrometros, para retirar grandes grupos de celulas se puede realizar durante la preparacion de una composicion para inyeccion intravenosa, para evitar la coagulacion de los capilares. En realizaciónes particulares, la filtracion se realiza despues de la disociacion y antes de su uso, por ejemplo, despues de disociacion y antes de liofilizacion o esterilizacion.

Dependiendo de la realización, las composiciones de tejido microvascular opcionalmente se congelan o se secan para su almacenamiento o conservacion, por ejemplo, secadas (por ejemplo, liofilizadas o secadas por pulverizacion), crioconservadas, o congeladas. Cuando se conservan composiciones de la invencion se puede usar cualquier excipiente apropiado, incluyendo azucares (por ejemplo, trehalosa, manitol, sacarosa), polialcoholes (por ejemplo, polietilenglicol), aldetudos, protemas (por ejemplo, albumina), calcio (por ejemplo, glicina), tensioactivos (por ejemplo, Tween 20), DMSO, y/o permanganatos. En varias realizaciónes, no se usa excipiente.

Las celulas y sus componentes activos se pueden proteger en parte del dano por radiacion ionizante mediante varios metodos. Los antioxidantes o neutralizadores de radicales libres pueden ser muy eficaces. Los agentes que inmovilizan macromoleculas tales como los azucares usados en la liofilizacion y el propio proceso de secado aumentan las probabilidades de que las cadenas rotas se recombinen en su estructura qrnmica original. La eliminacion de agua, aire y otras fuentes de oxfgeno reducira la oxidacion de protemas u otras especies biologicamente activas. La congelacion de la composicion durante la radiacion tambien reduce las probabilidades de que las moleculas escindidas se recombinen de manera inapropiada. Por ultimo, la concentracion mucho mayor de excipientes que las celulas o las moleculas activas en las celulas se refiere a que habra menos escisiones de compuestos activos simplemente debido a los efectos de accion de la masa.

El secado por congelacion (por ejemplo, liofilizacion) generalmente implica cuatro etapas: tratamiento previo, congelacion, secado primario y secado secundario. El tratamiento previo puede incluir un ajuste de la concentracion o la adicion de uno o mas excipientes. Despues del tratamiento previo, la composicion de tejido microvascular se congela. La etapa de congelacion se realiza de manera cuidadosamente controlada (por ejemplo, a una tasa de enfriamiento entre aproximadamente -0,5 °C por minuto y aproximadamente -50 °C por minuto) para conservar la estructura celular, sin embargo, no es necesario conservar la viabilidad celular. En algunas realizaciónes, la composicion de tejido microvascular se congela a una tasa de enfriamiento de aproximadamente -10 °C por minuto. La tasa de enfriamiento se puede ajustar basandose en las celulas o el tejido en particular y los excipientes usados. La composicion de tejido microvascular se puede congelar usando cualquier medio apropiado, incluyendo el uso de refrigeracion mecanica y/o exposicion de un recipiente que la composicion a hielo seco o nitrogeno lfquido hasta que alcance una temperatura adecuada para la liofilizacion. Durante la etapa de secado primario, la temperatura y la presion se ajustan para proporcionar las condiciones adecuadas para provocar la sublimacion del agua de las celulas multipotentes o tejido microvascular. La temperatura y la presion espedficas se pueden ajustar para acomodar el excipiente usado y/o la concentracion de las celulas o tejido microvascular. Durante la etapa de secado secundario, la temperatura y la presion se pueden ajustar aun mas para facilitar la eliminacion del agua no congelada del tejido microvascular. El contenido final de agua despues del paso de secado secundario esta preferentemente entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 4 % en eso (incluyendo aproximadamente de un 1 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente 3 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente 4 % a aproximadamente un 5 %, e intervalos superpuestos de los mismos), pero se pueden ajustar para maximizar el periodo de almacenamiento o la actividad biologica.

En algunas realizaciónes, la composicion de tejido microvascular se seca por pulverizacion. Antes del secado por pulverizacion, la composicion de tejido microvascular se puede tratar previamente de manera similar a la composicion de celulas multipotentes o tejido microvascular que se va a liofilizar, con los excipientes siendo seleccionados si fuera apropiado para secado por utilizacion en lugar de liofilizacion. Durante el secado por pulverizacion, el tejido microvascular se atomiza en gotitas y se expone a aire caliente en una camara de secado. En una realización, un excipiente es un azucar que no se funde a las temperaturas usadas. En realizaciónes particulares, un excipiente es un antioxidante, como BHA, BHT y galato de propilo, por ejemplo.

En algunas realizaciónes, las composiciones de tejido microvascular no se procesan mediante secado, pero en su lugar se crioconservan. Se conocen metodos para crioconservar celulas. Por ejemplo, las composiciones de celulas o tejido microvascular se pueden mezclar con uno o mas excipientes o agentes crioprotectores (por ejemplo, DMSO, PEG, albumina, o azucar) y se pueden enfriar de una manera controlada con cuidado. En algunas realizaciónes, el enfriamiento se realiza en dos o mas etapas en el que la primera etapa se realiza de una manera controlada (por ejemplo, reduciendo la temperatura en 1 °C por minuto) hasta una temperatura intermedia (por ejemplo, -30 °C), con la segunda etapa siendo de transferencia de celulas o tejidos a la temperatura intermedia hasta una temperatura de almacenamiento mas fna (por ejemplo, -196 °C).

Las composiciones de celulas multipotentes y tejido vascular crioconservadas se pueden almacenar a una temperatura adecuada para mantener el estado crioconservado (por ejemplo, de aproximadamente -30 °C a -196 °C). Las celulas o tejido microvascular procesados liofilizados o secados por pulverizacion se pueden almacenar en una diversidad de condiciones mas amplia que las celulas crioconservadas, celulas vivas, o tejido recien extrafdo. Las temperaturas adecuadas para el almacenamiento de las celulas o tejido microvascular micro procesados incluyen temperaturas de aproximadamente -100 °C a aproximadamente 45 °C. En algunas realizaciónes, el tejido microvascular procesado liofilizado o secado por pulverizacion se puede almacenar a temperatura ambiente.

En diversas realizaciónes, el periodo de almacenamiento del tejido microvascular procesado proporcionado es al menos aproximadamente una semana, al menos aproximadamente un mes, al menos aproximadamente dos meses, al menos aproximadamente seis meses, o un periodo superior a la vez que se mantienen una o mas actividades biologicas. En realizaciónes particulares, la composicion mantiene una actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable cuando se almacena aproximadamente a 4 °C durante al menos aproximadamente un mes, al menos aproximadamente dos meses, al menos aproximadamente cuatro meses, al menos aproximadamente seis meses, o al menos un ano. En realizaciónes particulares de composiciones que se describen en el presente documento, la composicion mantiene una actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable cuando se almacena aproximadamente a -20 °C durante al menos aproximadamente un mes, al menos aproximadamente dos meses, al menos aproximadamente cuatro meses, al menos aproximadamente seis meses, o al menos aproximadamente un ano. En realizaciónes particulares, la actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable es al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 90 % de la actividad antes de su almacenamiento, cuando se mide en un ensayo in vivo o in vitro, incluyendo cualquiera de los que se describen en el presente documento.

El tejido disociado, o celulas y otros componentes tisulares aislados a partir del mismo, incluyendo las composiciones resultantes, se esterilizan, por ejemplo, para reducir o eliminar la contaminacion por microorganismos, tales como, por ejemplo, bacterias, virus, y hongos, o priones. Las composiciones que comprenden tejido microvascular procesado se esterilizan usando irradiacion, en las que la esterilizacion por irradiacion se realiza por exposicion de la composicion a radiacion gamma o radiacion de haz electronico a una dosificacion en el intervalo de 0,5 Mrad a 5,0 Mrad. Existen metodos de esterilizacion que usan radiacion tal como haces electronicos, rayos X, rayos gamma, o radiacion ultravioleta. En realizaciónes particulares, la esterilizacion se realiza mediante exposicion de tejido disociado, o celulas y otros componentes tisulares aislados a partir del mismo, to radiacion gamma a una dosificacion en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5,0 Mrad, o De aproximadamente 1,0 a aproximadamente 3,0 Mrad, o aproximadamente 1,0 Mrad, o aproximadamente 1,5 Mrad, o aproximadamente 2,0 Mrad, o aproximadamente 2,5 Mrad, o aproximadamente 3,0 Mrad, o aproximadamente 3.5 Mrad, o aproximadamente 4,0 Mrad, o aproximadamente 4,5 Mrad, o aproximadamente 5,0 Mrad (o cualquier cantidad de radiacion gamma entre esos valores). En realizaciónes particulares, la esterilizacion se realiza mediante exposicion de tejido disociado, o celulas y otros componentes tisulares aislados a partir del mismo, a radiacion de haz electronico a una dosificacion en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5,0 Mrad, o de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 3,0 Mrad, o aproximadamente 1,0 Mrad, o aproximadamente 1,5 Mrad, o aproximadamente 2,0 Mrad, o aproximadamente 2,5 Mrad, o aproximadamente 3,0 Mrad, o aproximadamente 3.5 Mrad, o aproximadamente 4,0 Mrad, o aproximadamente 4,5 Mrad, o aproximadamente 5,0 Mrad (o cualquier cantidad de radiacion gamma entre esos valores). A menudo es mas facil medir la cantidad de radiacion a la que se exponen las composiciones. En realizaciónes particulares, los niveles de radiacion por haces E o radiacion gamma A la esterilizacion son de aproximadamente 9 a aproximadamente 30 kGy, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 kGy, o de aproximadamente 9 a aproximadamente 17 kGy (o cualquier cantidad de radiacion entre esos valores). Ademas, el tejido disociado, o celulas y otros componentes tisulares aislados a partir del mismo, Se pueden tratar para inactivar virus. En la tecnica se conocen metodos para inactivar virus, incluyendo el uso de irradiacion, como se ha descrito anteriormente para esterilizacion. Se pueden usar otros metodos para inactivar virus, incluyendo tratamientos con acido o base, lixiviacion, soluciones de aldetndo u oxido de etileno, o calor. Se entiende que los agentes que crioprotectores y otros excipientes usados para liofilizar o congelar la composicion tambien pueden proteger contra la radiacion. Por ejemplo, azucares y albumina (u otras protemas estabilizantes) junto con la baja temperatura protegen a las celulas contra el dano por radiacion. Por consiguiente, en realizaciónes particulares, la esterilizacion o la inactivacion viral se realiza despues de la liofilizacion.

Ademas, dado que no se requiere viabilidad para idoneidad de las composiciones de celulas multipotentes o tejido microvascular procesadas y crioconservadas para uso terapeutico, no es necesario ajustar el proceso de conservacion y almacenamiento para mantener la viabilidad. El porcentaje de celulas viables en las composiciones de tejido microvascular proporcionadas antes del procesamiento, esterilizacion, o crioconservacion puede ser hasta un 100 %. Despues de procesamiento, esterilizacion, o crioconservacion, puede ser inferior a aproximadamente un 50 %, por ejemplo, inferior a aproximadamente un 40 %, inferior a aproximadamente un 30 %, inferior a aproximadamente un 20 %, inferior a aproximadamente un 10 %, o inferior a aproximadamente un 1 %. En algunas realizaciónes, la composicion de tejido microvascular procesado proporcionada no contiene celulas viables despues de procesamiento, esterilizacion, o crioconservacion. En varias realizaciónes, las composiciones de tejido microvascular procesado se usan en la reparacion y/o regeneracion terapeutica de, por ejemplo, tejido blando. En realizaciónes adicionales, las composiciones de tejido microvascular procesado se usan en la reparacion y/o regeneracion terapeutica de tejido duro.

Ademas, para reducir la probabilidad de contaminacion microbiana, los donantes se pueden identificar sistematicamente para un listado determinado previamente de organismos microbianos (por ejemplo, VIH, HPV, EBV, TB, etc.) antes de la obtencion o procesamiento. La identificacion sistematica se puede realizar usando tecnicas conocidas, tales como deteccion de la presencia de un acido nucleico microbiano usando reaccion en cadena de la polimerasa, o mediante deteccion de la presencia de una molecula asociada con un microbio particular por ELISA. El tejido microvascular contaminado con microbios can se puede excluir de su uso, de acuerdo con algunas realizaciónes de la presente invencion. Ademas, el tejido procesado o crioconservado se puede producir usando tecnicas asepticas o esteriles.

En realizaciónes particulares, los metodos que se desvelan en el presente documento no incluyen el cultivo de las celulas o tejido microvascular disociados.

Composiciones Aisladas de Celulas Madre y Tejido Microvascular

Los metodos que se desvelan en el presente documento producen composiciones de tejido microvascular unicas. Las composiciones de tejido microvascular que se proporcionan en el presente documento, en varias realizaciónes, celulas sin cultivar o tejido microvascular sin cultivar (o componentes de los mismos), mmimamente procesados, que pueden incluir una mezcla de celulas madre y/o precursores producidas a partir de la disociacion (por ejemplo, mediante digestion enzimatica) de un tejido microvascular (por ejemplo, tejido adiposo, tendon, o tejido muscular). Las composiciones de tejido microvascular procesado pueden incluir moleculas adicionales (por ejemplo, moleculas de la matriz extracelular completas o fragmentadas o factores de crecimiento). Ademas, las composiciones de tejido microvascular procesado pueden comprender, dependiendo de la realización, fragmentos o membranas de celulas multipotentes. Ademas, el tejido microvascular procesado puede comprender o no celulas multipotentes intactas. Como se ha indicado anteriormente, los metodos que se desvelan en el presente documento se pueden usar para preparar una composicion que comprende celulas multipotentes o tejido microvascular procesado, solos o en combinacion con uno o mas tipos de celulas y/u otros compuestos adicionales.

En realizaciónes particulares, el tipo de celula es celula del estroma, epitelial, o obtenida a partir de la sangre, que incluye, pero no se limita a, fibroblastos, queratinocitos incluyendo celulas de la vaina de la rafz externa folicular, celulas endoteliales, pericitos, globulos rojos, monocitos, linfocitos incluyendo celulas plasmaticas, neutrofilos, trombocitos, mastocitos, adipocitos, celulas musculares, hepatocitos, celulas nerviosas y de la neuroglia, osteocitos, y osteoblastos.

En realizaciónes particulares, el componente tisular adicional es un componente de la matriz extracelular. La matriz extracelular comprende diversos constituyentes tales como glicoprotemas, proteoglicanos, carbohidratos complejos y otras moleculas. La matriz extracelular puede comprender cualquiera de una serie de protemas diferentes, que incluyen diversos colagenos, elastina, fibronectina, laminina, proteoglicanos, vitronectina, trombospondina, tenascina (citoactina), entactina (nidogeno), osteonectina (SPARC), ancorina CII, condronectina, protema de union, osteocalcina, sialoprotema osea, osteopontina, epinectina, hialuronectina, componente P amiloide, fibrilina, merosina, s-laminina, undulina, epiligrina, kalinina, fibrina, fibrinogeno y HSP.

En realizaciónes relacionadas, el componente tisular adicional comprende un factor de crecimiento, un agente angiogenico, un agente antiinflamatorio, una citoquina o un agente de diferenciacion. Por ejemplo, un factor de crecimiento o un agente angiogenico se puede seleccionar entre el factor de crecimiento de fibroblastos basico, otros factores de crecimiento de fibroblastos, protemas morfogeneticas oseas, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de queratinocitos, factor estimulante de colonias de macrofagos de granulocitos, factor de crecimiento obtenido a partir de las plaquetas, factor de crecimiento transformante pi y/o p3, factor de crecimiento celular endotelial vascular. Los factores de crecimiento adicionales y las clases o familias de factores de crecimiento que se pueden usar incluyen cualquiera de los que se enumeran en la Tabla 15, que tambien incluye actividades biologicas representativas para ciertos factores de crecimiento.

En realizaciónes particulares, las composiciones de la presente invencion no contienen o esencialmente no contienen ningun tejido adiposo, mineral oseo, celulas musculares, y/o celulas sangumeas, por ejemplo, uno o mas de estos tipos de celulas o mineral oseo se retiran de la composicion durante el procesamiento. Esto puede aumentar la concentracion de celulas asociadas con la microvasculatura en la composicion. En realizaciónes particulares, las composiciones de la presente invencion comprenden ADN o una cantidad esencial de ADN, por ejemplo, el ADN no se elimino de la composicion durante el procesamiento, por ejemplo, el tejido no se descelularizo y tampoco se elimino el ADN mediante lavado. En realizaciónes particulares, una composicion de la presente invencion es una suspension soluble en agua de celulas y/o componentes tisulares. En ciertas realizaciónes, una composicion de la presente invencion, sola, no comprende un armazon estructural o matriz, tal como, por ejemplo, un injerto dermico o de tendon. En realizaciónes particulares, una composicion de la presente invencion se puede producir usando tejidos microvasculares tales como piel, cordon umbilical, o hueso, que se tratan para celulas libres de la matriz.

En realizaciónes particulares, una composicion de la presente invencion tiene una o mas actividades biologicas. La composicion de la presente invencion tiene actividad antiinflamatoria o angiogenica. En ciertas realizaciónes relacionadas, una composicion estimula la formacion de vasos sangumeos o la cicatrizacion del tejido. Las combinaciones de estos efectos se consiguen en varias realizaciónes.

En ciertas realizaciónes, una composicion de la presente invencion tiene actividad antiinflamatoria. En realizaciónes particulares, un tejido danado o enfermo (por ejemplo, un tejido danado o enfermo que esta experimentando una respuesta inflamatoria) que se expone a o que se pone en contacto con una composicion de la presente invencion presenta una reduccion de la inflamacion en comparacion con cuando el tejido lesionado o enfermo se trata del mismo modo pero no se expone a, o no se pone en contacto con la composicion de la presente invencion. En ciertas realizaciónes, la cantidad de inflamacion del tejido expuesto a, o que se pone en contacto con la composicion de la presente invencion se reduce en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 90 %, en comparacion con la cantidad de inflamacion cuando el tejido danado o enfermo no se expone a, o se pone en contacto con la composicion de la presente invencion. La inflamacion se puede medir con medios disponibles en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, el numero de linfocitos observados en el tejido afectado cuando se observa por via histologica.

En realizaciónes particulares, una composicion de la presente invencion tiene actividad antiinflamatoria que se puede medir en un ensayo in vitro. En ciertas realizaciónes, la cantidad de inflamacion medida en un ensayo in vitro en presencia de una composicion de la presente invencion es al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %), al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 90 % inferior a la cantidad de inflamacion medida en el mismo ensayo en ausencia de la composicion de la presente invencion o en presencia de una composicion de control. En realizaciónes particulares, el ensayo in vitro es una reaccion linfocitaria mixta.

En ciertas realizaciónes, una composicion de la presente invencion tiene actividad angiogenica. En realizaciónes particulares, un tejido danado o enfermo (por ejemplo, un tejido danado o enfermo que esta experimentando una respuesta inflamatoria) que se expone a o que se pone en contacto con una composicion de la presente invencion presenta un aumento de la angiogenesis en comparacion a cuando el tejido danado un enfermo Se trata del mismo modo pero no se expone a, o se pone en contacto con la composicion de la presente invencion. En ciertas realizaciónes, la cantidad de angiogenesis en el tejido expuesto a, o que se pone en contacto con la composicion de la presente invencion aumenta en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 100 %, al menos aproximadamente un 150 %, al menos aproximadamente un 200 %, al menos aproximadamente un 300 %, al menos aproximadamente un 400 %, o al menos aproximadamente un 500 %, en comparacion con la cantidad de angiogenesis cuando el tejido danado o enfermo no se expone a, o se pone en contacto con la composicion de la presente invencion. La angiogenesis se puede medir con medios disponibles en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, el modelo de isquemia de la pata trasera que se describe en el presente documento.

En realizaciónes particulares, una composicion de la presente invencion tiene actividad angiogenica que se puede medir en un ensayo in vivo o in vitro. En ciertas realizaciónes, la cantidad de actividad medida en un ensayo de angiogenesis in vitro en presencia de una composicion de la presente invencion es al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos un 90 aproximadamente %, al menos aproximadamente un 100 %, al menos aproximadamente un 150 %, al menos aproximadamente un 200 %, al menos aproximadamente un 300 %, al menos aproximadamente un 400 %, o al menos aproximadamente un 500 % superior a la cantidad de actividad medida en el mismo ensayo en ausencia de la composicion de la presente invencion o en presencia de una composicion de control. En realizaciónes particulares, el ensayo in vivo es un ensayo de matrigel, como se describe en el Ejemplo 4. En realizaciónes particulares, el ensayo in vitro es el ensayo de migracion de celulas endoteliales que se describe en el presente documento.

En ciertas realizaciónes, una composicion de la presente invencion estimula la cicatrizacion de un tejido danado o enfermo; es decir, tiene activacion depuracion tisular. Como se usa en el presente documento, la "actividad de cicatrizacion tisular" de una composicion es la capacidad de la composicion para facilitar una mejora de la cicatrizacion (por ejemplo, reparacion o regeneracion) de un tejido danado o enfermo (por ejemplo, un tejido duro o blando) expuesto a la composicion en comparacion con un tejido analogo tratado del mismo modo pero sin exposicion a la composicion. La mejora de la cicatrizacion se mide usando cualquier medio apropiado, tal como el tiempo para completar la cicatrizacion, cantidad de tejido nuevo generado, fuerza del tejido curado resultante, o funcionalidad del tejido curado resultante.

Las composiciones de celulas multipotentes y tejido microvascular procesado alogenicas y xenogenicas esterilizadas o inactivadas por virus no se han usado previamente para facilitar la reparacion de tejidos blandos tales como ligamentos y tendones, debido a la dificultad para producir nuevos tejidos blandos con celulas madre autologas, la percepcion de que las celulas madre alogenica las y xenogenicas seran rechazadas, y la creencia previa de que las celulas esterilizadas o inactivadas por virus tendran una viabilidad reducida y, por lo tanto, una actividad biologica o terapeutica reducida. Sin embargo, el proceso y composiciones que se describen en el presente documento no se basan necesariamente en celulas madre purificadas o en la viabilidad celular. Mas bien, el proceso proporcionado se usa para producir una composicion que contiene una mezcla de celulas, incluyendo celulas no viables, celulas madre mesenquimales y precursoras, y otras moleculas secretadas por tales celulas (por ejemplo, citoquinas, factores de crecimiento, moleculas quimiotacticas, y similares). En algunas realizaciónes, la composicion contiene una mezcla de celulas viables y no viables.

En realizaciónes particulares, menos de aproximadamente un aproximadamente 50 %, menos de aproximadamente un 40 %, menos de aproximadamente un 30 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 10%, o menos de aproximadamente un 5% de las celulas presentes en una composicion de la presente invencion son viables. En varias realizaciónes, esencialmente todas las celulas son labiales. Como se usa en el presente documento, al termino "viable" se le dara su significado habitual y a la referencia a una celula que es capaz de proliferar cuando se cultiva en condiciones apropiadas, por ejemplo, condiciones en las que se podna esperar que la misma celula o tipo de celula proliferaran, por ejemplo, si no se procesara como se describe en el presente documento. En otras realizaciónes, menos de aproximadamente un 2 % o menos de aproximadamente un 1 % de las celulas presentes en dicha composicion son viables. En realizaciónes particulares, ninguna o esencialmente ninguna de las celulas presentes en la composicion es viable. Por consiguiente, el termino "no viable' se refiere a que la celula no es capaz de proliferar cuando se cultiva en condiciones apropiadas, por ejemplo, condiciones en las que se podna esperar que la misma celula proliferara, por ejemplo, si no se procesara como se describe en el presente documento.

Sin embargo, en realizaciónes particulares, al menos algunas de las celulas dentro de una composicion de la presente invencion excluyen el azul de tripano. En realizaciónes particulares, al menos aproximadamente un 1 %, al menos aproximadamente un 2 %, al menos aproximadamente un 3 %, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 90 % de las celulas presentes en una composicion excluye el azul de tripano.

En ciertas realizaciónes, una composicion de la presente invencion comprende celulas que excluyen el azul de tripano pero no son viables. En ciertas realizaciónes, al menos aproximadamente un 1 %, al menos aproximadamente un 2%, al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20 %, o al menos aproximadamente un 50 % de las celulas presentes dentro de una composicion excluye el azul de tripano pero no son viables.

De acuerdo con la presente invencion se entiende que, aunque las celulas dentro de las composiciones que se describen en el presente documento pueden no ser viables y pueden no persistir mucho despues de su trasplante en un sujeto, las composiciones desencadenan una cascada de respuestas en el sujeto que conducen a una mejor cicatrizacion, reduccion de la inflamacion, o aumento de la angiogenesis. Las composiciones de celulas multipotentes y tejido microvascular procesado que se describen en el presente documento no necesitan incluir celulas madre viables o completas para simular o inducir la cicatrizacion de tejido lesionado o enfermo, tal como, por ejemplo, tejido blando. Ademas, las composiciones de la presente invencion pueden comprender tejido procesado y diversos componentes del mismo, incluidos tejido disociado, celulas, tales como celulas multipotentes (por ejemplo, celulas madre), membranas celulares, componentes de la matriz extracelular y diversos factores de crecimiento, factores angiogenicos, las antiinflamatorios, citoquinas, agentes de diferenciacion, etc., presentes dentro de o asociados con una muestra de tejido usada para preparar las composiciones.

Para los fines de administracion de una composicion de la invencion a un sujeto con necesidad de la misma, las composiciones se pueden formular como composiciones farmaceuticas. Las composiciones farmaceuticas que se desvelan en el presente documento comprenden una composicion de la presente invencion y un excipiente, vehnculo y/o diluyente farmaceuticamente aceptable. La composicion de la invencion esta presente en la composicion farmaceutica en una cantidad suficiente para llevar a cabo el tratamiento o la prevencion de una lesion, enfermedad o trastorno en un sujeto con necesidad de la misma, es decir, en una cantidad terapeuticamente eficaz.

Los excipientes, vehnculos y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables son familiares para las personas con experiencia en la materia. Para composiciones formuladas como soluciones lfquidas, los vetnculos y/o diluyentes aceptables incluyen solucion salina y agua esteril, y pueden incluir opcionalmente antioxidantes, tampones, agentes bacteriostaticos y otros aditivos comunes. Las composiciones farmaceuticas de la invencion se pueden preparar combinando una composicion de la invencion con un vetnculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable, y se pueden formular en preparaciones en forma solida, semisolida, lfquida o gaseosa, tales como polvos, granulos, soluciones, inyecciones, inhalantes, microesferas y aerosoles. Estas composiciones tambien pueden contener agentes dispersantes y tensioactivos, aglutinantes y lubricantes. Alguien con experiencia en la materia puede formular adicionalmente una composicion de la invencion de una manera apropiada, y de acuerdo con las practicas aceptadas, tales como las que se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1990.

Las vfas de administracion de las composiciones farmaceuticas que se desvelan en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, via topica, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutanea, oral, nasal, trasplante, implante, inyeccion, administracion a traves de un cateter, topica, transdermica, inhalacion, parenteral e intranasal. El termino parenteral como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutaneas, intravenosas, intramusculares, inyeccion intraesternal o tecnicas de infusion. Ademas, las composiciones de la invencion se pueden implantar de forma quirurgica, inyectar, administrar (por ejemplo, a traves de un cateter o jeringa), o se pueden administrar de manera directa o indirecta al sitio en necesidad de reparacion o aumento. Por ejemplo, las composiciones de la presente invencion se pueden introducir por via quirurgica en un sitio o adyacentes a un sitio de lesion o enfermedad en un sujeto. En algunas realizaciónes, la administracion es intravenosa. Las composiciones farmaceuticas se pueden formular para una via de administracion en particular. En realizaciónes particulares, el metodo es quirurgico para reparacion tisular, por via intravenosa para tratamiento de la isquemia, inyeccion en espacios articulares para el tratamiento del dolor e inflamacion, inyeccion en heridas e inyeccion en el musculo para el tratamiento de enfermedad vascular periferica.

En ciertas realizaciónes, una composicion de la presente invencion se fórmula para administracion intravenosa. Una composicion formulada para administracion intravenosa, en ciertas realizaciónes, se filtra para reducir partfculas o grumos de celulas grandes que podnan coagular potencialmente capilares u otros vasos sangumeos. En realizaciónes particulares, una composicion formulada para administracion intravenosa es opcionalmente isotonica, tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9,0 (por ejemplo, aproximadamente 7,3), una osmolaridad entre aproximadamente 50 y aproximadamente 600, y/o una osmolalidad menor o igual a aproximadamente 600 mOsm/l, por ejemplo, aproximadamente 290 mOsm/l.

Implantes, Matrices y Armazones

En ciertas realizaciónes, las composiciones de la presente invencion se combinan con un implante, matriz o armazon. Las matrices pueden incluir armazones biocompatibles, estructuras cristalinas, estructuras de autoensamblaje y similares. Las matrices de ese tipo se conocen en las tecnicas de terapia celular, reparacion quirurgica, ingeniena de tejidos y cicatrizacion de heridas. Las matrices se pueden tratar previamente (por ejemplo, sembrar, inocularse, poner en contacto con) con una composicion de la invencion. En algunos aspectos de la invencion, las celulas y/o componentes tisulares presentes dentro de la composicion se adhieren a la matriz. En algunas realizaciónes, las celulas estan contenidas dentro o en puentes de espacios intersticiales de la matriz. En realizaciónes particulares, las celulas y/u otros componentes tisulares estan en estrecha asociacion con la matriz y, cuando se usan terapeuticamente, inducen o soportan el crecimiento de las celulas y/o angiogenesis del sujeto.

Las matrices asociadas con o que comprenden composiciones de la presente invencion se pueden introducir en el cuerpo de un sujeto de cualquier manera conocida en la tecnica, que incluye, pero no se limita a, un implante, inyeccion, union quirurgica, trasplante con otro tejido, y similares. Una composicion de la presente invencion se puede combinar con un implante, matriz o armazon antes de su suministro o implante dentro de un sujeto, o una composicion de la presente invencion se puede combinar con un implante, matriz o armazon que ya esta presente dentro de un sujeto. Los implantes, matrices o armazones pueden proporcionar una estructura ffsica que retiene la composicion dentro de una ubicacion deseada dentro de un sujeto o tejido en la misma, protege la composicion dentro del sujeto, y/o permite la liberacion o la composicion a una tasa deseada o durante un periodo de tiempo deseado.

Las matrices usadas en varias realizaciónes se pueden configurar para la forma y/o tamano de un tejido u organo in vivo. Los armazones combinados con una composicion de la invencion pueden ser planos o tubulares o pueden comprender secciones de los mismos, como se describe en el presente documento. Los armazones combinados con una composicion de la invencion pueden tener multiples capas.

En realizaciónes particulares, el implante, matriz o armazon es un implante, matriz, o armazon biocompatible. El implante, matriz o armazon puede comprender un solido o lfquido. El implante, matriz o armazon pueden ser biodegradables. El implante, matriz o armazon, en realizaciónes particulares, comprende microperlas o partfculas, un implante obtenido a partir de hueso, un armazon de biofibra (por ejemplo, Armazon de BioFiber™), un polfmero poroso reabsorbible, un hidrogel, un producto tisular que comprende una masilla, o una sutura o un dispositivo medico implantable. El implante, matriz o armazon puede ser, por ejemplo: una matriz de colageno o un tejido biocompatible; un implante ortopedico; un armazon implantable flexible, poroso; un implante quirurgico; un implante revestido poroso; una solucion polimerica; disolventes tales como DMSO, N-metilpirrolidona (NMP) y alcoholes; un hidrogel; acido hialuronico u otros glicosaminoglicanos o proteoglicanos; colageno; fibrina; trombina; coagulo de sangre; plaquetas plasma rico en plaquetas; matriz osea desmineralizada; celulas autologas; y/o hueso esponjoso.

Las composiciones de la invencion se pueden suspender en una solucion de hidrogel, por ejemplo, para inyeccion. Los ejemplos de hidrogeles adecuados incluyen peptidos de autoensamblaje, tales como RAD 16. Como alternativa, la solucion de hidrogel que contiene las celulas se puede endurecer para formar una matriz con celulas dispersas en la misma antes del implante. El hidrogel puede ser un polfmero organico (natural o sintetico) que se reticula mediante enlaces covalentes, ionicos o de hidrogeno para crear una estructura tridimensional de estructura cristalina abierta que atrapa las moleculas de agua para formar un gel. Los ejemplos de materiales que se pueden usar para formar un hidrogel incluyen polisacaridos incluyen tales como alginato y sales del mismo, peptidos, polifosfazinas y poliacrilatos, que se le circulan por via ionica, o polfmeros de bloque como copolfmeros de bloque de oxido de polietileno-polipropilenglicol que se articulan mediante la temperatura o pH, respectivamente.

En realizaciónes particulares, una composicion de la presente invencion se asocia con, se encuentra dentro, se aplica a, o reviste un implante, matriz o armazon biologicamente compatible. En realizaciónes particulares, una composicion de la presente invencion se usa para revestir un material, tal como, por ejemplo, un armazon flexible biocompatible (por ejemplo, laminas o hilo tejido fabricado mediante tejido o no tejido). Las composiciones procesadas secadas por pulverizacion son particularmente adecuadas para revestir un material que comprende microperlas o partfculas sin requerir reconstitucion antes del revestimiento, ya que el revestimiento se puede realizar durante el proceso de secado por pulverizacion. En ciertas realizaciónes, la composicion esta embebida dentro o revestida en una matriz, por ejemplo, una matriz porosa y/o que contiene colageno. En ciertas realizaciónes, la matriz puede ser matriz de tejido reconstructivo Conexa™, Armazon de BioFiber™, o Armazon de BioFiber™-CM (Tornier; Bloomington, MN).

En ciertas realizaciónes, las composiciones de la invencion se pueden asociar con un armazon tridimensional y se pueden implantar in vivo, en las que la composicion induce proliferacion celular sobre o en el marco y forma un tejido de reemplazo in vivo. Las celulas que proliferan sobre lo en el marco pueden incluir celulas dentro de la composicion y/o celulas del sujeto en el que se implanta el armazon. Dicho marco tridimensional se puede usar para formar estructuras tubulares, tales como las de los tractos gastrointestinal y genitourinario, asf como los vasos sangumeos; tejidos para la reparacion de hernia; tendones y ligamentos. En relaciones relacionadas, las composiciones de la presente invencion se asocian con un marco tridimensional. El marco se configura en la forma de la estructura correctora deseada.

Los ejemplos de armazones que se pueden usar en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, materiales no tejidos, espumas porosas, o peptidos de autoensamblaje, como se describe, por ejemplo, en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.560.276. Los materiales no tejidos se pueden formar usando fibras compuestas de un copolfmero sintetico absorbible de los acidos glicolico y lactico (pGa /PLA) (VICRYL; Ethicon, Inc., Somerville, N.J.) o poli-4-hidroxibutirato (PHA, Tepha, Lexington, MA). Tambien se pueden usar espumas, compuestas de, por ejemplo, copolfmero de poli(epsilon-caprolactona)/poli(acido glicolico) (PCL/PGA), formadas por procesos tales como secado por congelacion, o liofilizacion, como se discute en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.355.699. En una realización, el armazon es un fieltro, que puede estar compuesto por un hilo de multiples filamentos hecho de un material bioabsorbible, por ejemplo, copolfmeros o mezclas de PGA, PLA, PHA, PCL, o acido hialuronico.

Kits

En el presente documento tambien se desvelan kits que comprenden una composicion, por ejemplo, una composicion farmaceutica, de la presente invencion. La composicion se puede envasar sola, por ejemplo, en un vial, o En combinacion con otros productos, tales como los adecuados para la combinacion con tejido microvascular procesado o crioconservado. Cuando se envasa con otro material, el tejido microvascular procesado o crioconservado se puede envasar por separado, o mezclar previamente o asociar con el otro material. El tejido microvascular procesado se puede envasar como un revestimiento sobre un material biocompatible, o se puede asociar con un implante, matriz o armazon.

Un kit de la presente invencion comprende un recipiente impermeable a la humedad que comprende una composicion como se define en las reivindicaciones. Un kit de la presente invencion comprende un recipiente impermeable a la humedad que comprende una composicion seca, esteril (por ejemplo, liofilizada) , en el que dicha composicion comprende tejido microvascular procesado, en el que el tejido microvascular procesado comprende celulas multipotentes aisladas o una membrana celular obtenida a partir de o derivada de dichas celulas o tejido, en el que dicha composicion tiene actividad angiogenica o antiinflamatoria, en el que dicha composicion se esteriliza mediante irradiacion y los virus dentro de dicha composicion estan inactivados, en el que dicha composicion mantiene una actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable cuando se almacena aproximadamente a temperatura ambiente durante al menos un mes, y en el que la esterilizacion por irradiacion se realiza por exposicion de la composicion a radiacion gamma o radiacion de haz electronico a una dosificacion en el intervalo de 0,5 Mrad a 5,0 Mrad. Preferentemente, dichas celulas o tejido no se han cultivado.

En realizaciónes particulares de kits y composiciones que se describen en el presente documento, la composicion mantiene una actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable cuando se almacena aproximadamente a temperatura ambiente durante al menos un mes, al menos dos meses, al menos cuatro meses, al menos seis meses, o al menos un ano. En realizaciónes particulares de kits y composiciones que se describen en el presente documento, la composicion mantiene una actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable cuando se almacena aproximadamente a temperatura ambiente durante al menos un mes, al menos dos meses, al menos cuatro meses, al menos seis meses, o al menos un ano. Como se usa en el presente documento, "temperatura ambiente" es una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 25 °C o aproximadamente 21 °C. En realizaciónes particulares de kits y composiciones que se describen en el presente documento, la composicion mantiene una actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable cuando se almacena aproximadamente a 4 °C durante al menos un mes, al menos aproximadamente dos meses, al menos aproximadamente cuatro meses, al menos aproximadamente seis meses, o al menos aproximadamente un ano. En realizaciónes particulares de kits y composiciones que se describen en el presente documento, la composicion mantiene una actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable cuando se almacena aproximadamente a -20 °C durante al menos aproximadamente un mes, al menos aproximadamente dos meses, al menos aproximadamente cuatro meses, al menos aproximadamente seis meses, o al menos aproximadamente un ano. En realizaciónes en particular, la actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable es al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 90 % de la actividad antes de su almacenamiento, cuando se mide en un ensayo in vivo o in vitro, incluyendo cualquiera de los que se describen en el presente documento.

En realizaciónes particulares de kits y composiciones de la presente invencion, una cantidad inferior o igual a un 50 %, una cantidad inferior o igual a un 40 %, una cantidad inferior o igual a un 30 %, una cantidad inferior o igual a un 20 %, una cantidad inferior o igual a un 10 %, o una cantidad inferior o igual a un 5 % de las celulas presentes en dicha composicion son viables, una cantidad inferior o igual a un 2 % de las celulas presentes en dicha composicion son viables, o esencialmente ninguna de las celulas presentes en dicha composicion son viables. En realizaciónes relacionadas, al menos un 1 % de dichas celulas excluye el azul de tripano. En otras realizaciónes, al menos aproximadamente un 2%, al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 90 % de dichas celulas excluye el azul de tripano. En ciertas realizaciónes, al menos aproximadamente un 1 %, al menos aproximadamente un 2%, al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 90 % de dichas celulas excluye el azul de tripano pero no son viables.

De acuerdo con diversas realizaciónes, un kit de la presente invencion puede comprender una composicion farmaceutica que comprende una composicion de la presente invencion y un excipiente. En una realización, la composicion farmaceutica se fórmula para administracion intravenosa. En otras realizaciónes, un kit de la presente invencion puede comprender una composicion de la presente invencion y un implante, armazon o matriz, que incluye, pero no se limitan a, cualquiera de los que se describen en el presente documento. En realizaciónes espedficas, el armazon o matriz implantable es un implante obtenido a partir de hueso, un armazon de biofibra, un polfmero poroso reabsorbible, un hidrogel, un producto tisular que comprende una masilla, o una sutura. En ciertas realizaciónes, celulas, tejido o membrana celular de dicha composicion estan presentes en un hueso, tendon o superficie colocada frente a la dermis de dicho armazon o matriz implantable.

En ciertas realizaciónes, un kit de la presente invencion comprende una composicion de la presente invencion esterilizada y seca (por ejemplo, liofilizada) en un recipiente cerrado hermeticamente. El recipiente cerrado hermeticamente puede ser resistente a la humedad o impermeable a la humedad, y puede contener una abertura sellada, que permite el acceso al interior del recipiente. En ciertas realizaciónes, el recipiente es un vial que comprende un cierre sellado hermetico. En ciertas realizaciónes, el recipiente es un paquete de blister, que puede comprender un sello de aluminio. En realizaciónes particulares, el interior del recipiente sellado es esteril. Por consiguiente, antes de su uso, el usuario puede acceder al interior del recipiente, anadir un lfquido a la composicion seca para disolverla o reconstituirla, recombinacion proporcionar o administrar la composicion reconstituida a un sujeto. En ciertas realizaciónes, el lfquido es agua esteril o una solucion esteril tal como solucion salina, por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato.

Usos de las Composiciones e Implantes, Matrices, y Armazones

Las composiciones de la presente invencion, y los implantes, matrices, y/o armazones que comprenden dichas composiciones, se pueden usar para tratar o prevenir una lesion o enfermedad en un mairnfero. En diversas realizaciónes, la composicion se puede proporcionar o aplicar directamente a un tejido que lo necesite o adyacente a un tejido que lo necesite, por ejemplo, a un tejido que rodea al tejido que lo necesita. Los sujetos que lo necesiten incluyen sujetos con una lesion o enfermedad, o que se encuentran en riesgo de sufrir una lesion o enfermedad que se podna beneficiar del tratamiento con una composicion de la presente invencion. En realizaciónes particulares, un sujeto es un marnffero, por ejemplo, un ser humano u otro mamffero, tal como un primate no humano, un perro, un gato o un caballo. En ciertas realizaciónes, un sujeto presento una reduccion de las capacidades de curacion, tal como un sujeto diabetico y un sujeto que se esta sometiendo a quimioterapia.

En ciertas realizaciónes, las composiciones de la presente invencion son para uso para tratar o prevenir lesiones o enfermedades de diversos tejidos u organos en un mamffero, que incluyen, pero no se limitara, lesion o enfermedad de tejido blando, lesion o enfermedad de tejido duro, lesion o enfermedad de hueso, lesion o enfermedad de articulacion, lesion o enfermedad del tejido cardiaco, lesion o enfermedad del tejido adiposo, lesion o enfermedad del cartflago y lesion o enfermedad de disco intervertebral.

En ciertas realizaciónes, las composiciones de la presente invencion se usan para tratar o prevenir una lesion en tejido blando. El tejido blando, como se usa en el presente documento, se refiere en general a estructuras extraesqueleticas que se encuentran en todo el cuerpo y que incluyen, pero no se limitan a, tejido de cartflago, tejido de menisco, tejido del ligamento, tejido del tendon, tejido del disco intervertebral, tejido periodontal, tejido cutaneo, tejido vascular, tejido muscular, tejido de fascia, tejido periostico, tejido ocular, tejido pericardico, tejido pulmonar, tejido sinovial, tejido nervioso, tejido cerebral, tejido renal, medula osea, tejido urogenital, tejido intestinal, tejido hepatico, tejido pancreatico, tejido esplenico, tejido adiposo, y combinaciones de los mismos. Las lesiones de tejidos blandos incluyen danos o lesiones a cualquier tejido blando, tal como por ejemplo, musculos, ligamentos, tendones, piel, tejido fibroso, grasa, membranas sinoviales, nervios, vasos sangumeos y fascia, que se pueden producir en todo el cuerpo. Las lesiones de tejidos blandos que se pueden beneficiar de la suave actividad de cicatrizacion tisular de los tejidos microvasculares procesados proporcionados incluyen, pero no se limitan a, lesiones tales como desgarros de tendones y/o ligamentos y lesiones resultantes de sucesos isquemicos. Las lesiones comunes de los tejidos blandos pueden ser debidas a un esguince, torcedura, una lesion que da como resultado una contusion, o el uso excesivo de un tejido blando en particular. Las lesiones de los tejidos blandos incluyen lesiones tanto abiertas como cerradas.

Las lesiones, enfermedades y afecciones de los tejidos blandos, que se pueden tratar o prevenir de acuerdo con los metodos de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, lesiones en tejido vascular, cutaneo o musculoesqueletico. Las afecciones de los tejidos blandos incluyen, por ejemplo, afecciones de la piel (por ejemplo, revision de cicatrices o tratamiento de heridas traumaticas, quemaduras graves, ulceras en la piel (por ejemplo, ulceras de decubito (presion), ulceras venosas y ulceras diabeticas) y heridas quirurgicas tales como las asociadas con la extirpacion de los canceres de piel); afeccion vascular (por ejemplo, enfermedad vascular tal como enfermedad arterial periferica, enfermedad arterial coronaria, aneurisma aortico abdominal, enfermedad carotfdea y enfermedad venosa; lesion vascular; desarrollo vascular inadecuado); afecciones que afectan a las cuerdas vocales; afecciones cosmeticas (por ejemplo, las que implican reparacion, aumento, o embellecimiento); enfermedades musculares (por ejemplo, miopatfas congenitas; miastenia grave; enfermedades musculares inflamatorias, neurogenicas y miogenicas; y distrofias musculares tales como distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia miotonica, distrofia muscular de la cintura y extremidades, distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia muscular congenita distrofias, distrofia muscular oculofarmgea, distrofia muscular distal y distrofia muscular de Emery-Dreifuss); afecciones de los tejidos conectivos, tales como los tendones y los ligamentos, que incluyen el ligamento periodontal y el ligamento cruzado anterior; y afecciones de los organos y/o fascia (por ejemplo, vejiga, intestino, suelo pelvico). Un ejemplo de una lesion de tejidos blandos bastante comun es el dano en el suelo pelvico. Esta es una afeccion medica potencialmente grave que se puede producir durante el parto o por complicaciones del mismo que pueden causar dano en la fascia vesicovaginal, tal como un cistocele, que es una hernia de la vejiga. Las afecciones medicas similares incluyen rectoceles (una hernia del recto), enteroceles (una protuberancia del intestino a traves de la bolsa rectovaginal o vesicovaginal) y enterocistoceles (una doble hernia en la que sobresalen la vejiga y el intestino).

En diversas realizaciónes, las composiciones de la presente invencion se usan para tratar o prevenir diversas enfermedades, e incluyen, pero no se limitan a, enfermedades asociadas con respuestas inflamatorias o inmunitarias no deseadas. Los ejemplos de las enfermedades de ese tipo incluyen artritis reumatoide, osteoartritis y enfermedades y trastornos autoinmunes. Ademas, las composiciones de la presente invencion se pueden usar para reducir la inflamacion, por ejemplo, en un sitio de lesion, y/o para reducir una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria inducida por una lesion. De forma analoga, las composiciones de la presente invencion se pueden usar para prevenir o reducir la probabilidad de rechazo del trasplante.

En realizaciónes particulares, las composiciones de la presente invencion son para uso para promover o estimular la angiogenesis o revascularizacion, por ejemplo, en un sitio de lesion o dano tisular. En realizaciónes particulares, la lesion se asocia o da como resultado isquemia, hipoxia o lesion por reperfusion en un tejido. Los ejemplos de lesiones o enfermedades asociadas con isquemia, hipoxia o lesion por reperfusion que pueden se pueden tratar o prevenir de acuerdo con la presente invencion incluyen apoplejfa, infarto de miocardio y perdida de sangre. Los ejemplos adicionales de lesiones o dano tisular que se pueden tratar con composiciones de la presente invencion para promover o estimular la angiogenesis o la revascularizacion incluyen trasplante o reinsercion de extremidades.

Las composiciones de la presente invencion tambien se pueden usar para tratar o prevenir el dano a los nervios perifericos, disfuncion erectil, hipertension pulmonar, esclerosis multiple y quemaduras por radiacion. Ademas, se pueden usar para inducir hematopoyesis y/o cicatrizacion de heridas.

En realizaciónes particulares, las composiciones de la presente invencion, por ejemplo, cuando se formulan para administracion intravenosa, se pueden usar para tratar o prevenir el infarto agudo de miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, apoplejfa, enfermedad vascular periferica o enfermedad pulmonar obstructiva cronica.

Las composiciones de la presente invencion pueden ser para uso solas o en combinacion con uno u otros agentes terapeuticos o procedimientos mas para tratar o prevenir una lesion o enfermedad. Por ejemplo, en ciertas realizaciónes, para enriquecer el suministro de sangre a un tejido danado y/o para estimular la regeneracion tisular, las composiciones de la presente invencion pueden ser para uso en combinacion con plasma rico en plaquetas. Cuando se usa en combinacion con uno u otros agentes terapeuticos o procedimientos mas, las composiciones de la presente invencion se pueden proporcionar o usar antes, durante el mismo periodo de tiempo o durante un periodo de tiempo superpuesto, o despues del, tratamiento con el otro agente o procedimiento terapeutico.

Cuando se usan en combinacion con otro agente terapeutico, una composicion de la presente invencion se puede proporcionar por separado del otro agente, o puede estar presente en una composicion farmaceutica que tambien contiene el otro agente terapeutico, por ejemplo, una coformulacion que comprende dos o mas agentes terapeuticos, uno de los cuales es la composicion de la presente invencion. En realizaciónes particulares, la composicion de la presente invencion y un agente terapeutico adicional ambos se combinan o se asocian con el mismo implante, matriz o armazon.

Las composiciones de la invencion se administra en una cantidad terapeuticamente eficaz, que variara dependiendo de una diversidad de factores que incluyen la actividad de la composicion espedfica usada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto al que se le administra la composicion de la invencion; el modo y tiempo de administracion; la tasa de secrecion o descomposicion de la composicion en el sujeto; y el tipo o gravedad de la lesion, enfermedad, o afeccion que se va a tratar. En ciertas realizaciónes, una dosis terapeuticamente eficaz resulta del material obtenido por el procesamiento de 104 a 108 celulas multipotentes y sus ECM asociadas.

Una composicion de la presente invencion para uso en el tratamiento o la prevencion de una lesion o enfermedad, o para estimular la regeneracion tisular en un mamffero se puede administrar en una, dos o mas dosis. Por ejemplo, en ciertas realizaciónes, una composicion para el uso se administra como una sola dosis, multiples dosis o en dosis repetidas durante un periodo de tiempo.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Preparacion Y Caracterizacion de Tejido Microvascular

En este estudio, el tejido microvascular se prepara a traves de diferentes procesos a continuacion se someten a ensayo. En resumen, al menos de 2,27 a 4,54 kg (de 5 a 10 lbs) de grasa subcutanea se obtiene de un donante de organos y se procesa como sigue a continuacion: trocear el tejido; disociado por via enzimatica; diluirlo (no interrumpirlo), centrifugar, decantana continuacion lavar el sedimento celular; volver a suspender en tampon de liofilizacion; y liofilizacion. Las condiciones de la sinusal hasta el procesamiento son las que siguen a continuacion: el tejido adiposo se recupera por via quirurgica a partir de un donante de tejido. El tejido se trocea con tijeras, se suspende en PBS con 0,2 U/ml de Clzyme AS (Vitacyte, Indianapolis, IN) a 37 °C con agitacion suave durante 60 min, a continuacion se lava tres veces y se vuelve a suspender en dos millones de celulas/ml en M3D. La suspension celular se mantiene a temperatura ambiente justo hasta antes de la liofilizacion, a continuacion las celulas se diluyen a 50:50 con medio de crioconservacion EZ-CPZ™ (Incell Corp., San Antonio, TX), se pone en viales, y se carga en las bandejas del aparato de liofilizacion para su enfriamiento. Las muestras se evaluan tanto durante el proceso como al final del proceso.

En este estudio se realizan 10 procesos. Se designaron como "A" a "J" en la Tabla 1. Los metodos de ensayo usados para analizar cada metodo del proceso se enumeran en la Tabla 1, designados como 1, 2, 3, 4, 5, y se detallan en la Tabla 2.

Tabla 1. Metodos del Proceso Descri ciones Metodos de Ensa o

Tabla 2. Gru os de Ensa o del Estudio

Para este estudio se realizaron varias tareas. Se denominaron A a D y se describen con detalles adicionales a continuacion y se destacan en la Figura 1. Los metodos de ensayo de laboratorio espedficos (M) usados en las Tareas se denominan M1, M2, M3, M4 y M5 (Tabla 2).

Tarea A. Planificacion y Preparacion

Encargar los materiales, coordinar, preparar y someter a ensayo.

Tarea B. Materiales de Fuente y Procedimientos Generales

El tejido graso se obtiene de un donante de organos. La grasa subcutanea se toma de abdomen, muslos y gluteos. Se extraen de 2,27 a 4,54 kg (cinco (5) a diez (10) libras) de grasa en medio de transporte ZTM™ (Incell Corp., San Antonio, TX).

El tejido se extrae y se procesa inicialmente a las 12 horas de la muerte a traves de diversas etapas y metodos de laboratorio (Tablas 1 y 2; Figura 1). Se procesan alfcuotas de diez (10) g usando condiciones basicas despues de 12, 24 y 48 horas de almacenamiento a temperatura ambiente. Los > 2,27 kg (> 5+ libras) se procesan usando un metodo de trituradora de carne para trocear tejido, y alfcuotas de 10 g se digieren con 4X la concentracion de enzima Blendzyme I (Vitacyte) en ZSolM™ y con 4X de concentracion de enzimas y 1/4 del volumen de digestion de ZSolM™ en la Etapa E. La mayor parte de la muestra se digiere con concentraciones y metodos enzimaticos convencionales.

Despues de digestion, las muestras se enjuagan en ZSolF™, se centrifugan, se decantan y a continuacion se lavan dos veces mas en ZSolF™. Las celulas se pueden suspender en suspension celular a 1:1 en EZ-CPZ™ como un producto en volumen de solucion de liofilizacion a 106 celulas/ml y se liofilizan (Etapa G) como volumenes de alfcuotas de 1 ml. Los viales liofilizados se someten a radiacion gamma y haz de E (Etapas H, I, J). Todo el producto final se almacena y las muestras representativas se someten a ensayo, y los subconjuntos seleccionados se usan en estudios con animales posteriores.

Tarea C. Ensayos

A continuacion se resumen brevemente los diversos tipos de ensayos (M1 a M5) usados en este estudio (Tabla 2). M1: Identificacion sistematica de donante para enfermedades infecciosas, incluyendo los ensayos que no se realizaron antes de la extraccion de tejido graso. La identificacion sistematica del donante y los acuerdos para la adquisicion de tejidos se desarrollan para minimizar o eliminar cualquier enfermedad infecciosa de acuerdo con las evaluaciones convencionales. Los ensayos adicionales reales y los costes asociados se realizan caso a caso. Se realizan ensayos de carga biologica.

M2: Los recuentos celulares se realizan usando un hemocitometro (microscopfa optica de luz) y tincion nuclear con Azul de Tripano con DAPI (microscopfa de fluorescencia) para el mdice y la viabilidad celular. Los recuentos celulares se registran como lecturas por duplicado.

M3: Inmunofenotipados para Biomarcadores seleccionados: CD33, CD34, CD44, CD45 y colageno de Tipo lV. Se realizan inmunoensayos inmediatos de celulas suspendidas. Las celulas se cultivan en LabTeks y a continuacion se tinen, y se toman fotos representativas.

M4: Los ensayos de carga biologica se realizan en muestras de las soluciones de transporte de los tejidos recibidos en la bolsa N = 2 (y se comparan con los enjuagues {ultimos} del procesamiento posterior. El ensayo de endotoxinas se realiza usando el Ensayo EndoSafe PTS (Charles River). Se realiza el ensayo microbiologico de cultivo de USP convencional. Opcionalmente se realiza el ensayo rapido de ATP.

M5: Los bioensayos funcionales se realizan en muestras de celulas aisladas, despues de la liofilizacion y despues de los diversos protocolos de procesamiento e irradiacion. Se realizan ensayos de migracion celular a traves de los pocillos Transwell para las ADSC, celulas endoteliales, fibroblastos. Los ensayos de Matrigel se realizan para evaluar la formacion de microvasos inducida por muestras en diversas diluciones, etapas de procesamiento y/o irradiacion.

Tarea D. Analisis de Datos

Las lecturas y los datos observacionales se transfieren a Excel o a Prism para analisis. Los valores medios de SD de replicados de la muestra para cada TPS y cada tipo celular se tabulan y/o se representan para analisis comparativos.

Los resultados obtenidos para experimentos preliminares que se realizaron mostraron poca diferencia entre las condiciones de procesamiento A, B y D con 3,5 kg de tejido adiposo que genera 1560 viales de producto liofilizado a 106 celulas por vial.

Ejemplo 2 - Tratamiento de Lesion del Tendon de Aquiles en Ratas

Este estudio demuestra que las preparaciones de tejido microvascular de la presente invencion se pueden usar para reparar lesiones en el tendon de Aquiles.

32 ratas Sprague Dawley macho (8 semanas de edad en el DfA 1 y ~250 g en el DfA 1) se adquieren en Harlan y se aclimatan durante al menos 3 dfas. Las ratas se tratan como se resume en el diseno del estudio de la Tabla 3.

Tabla 3: Diseno del Estudio

El estudio se produce durante aproximadamente 10 dfas de la vida del animal. El animal llega el d^ a -3, se aclimata del d^ a -3 al dfa 1, se somete a cirugfa del d^ a 1, y el sacrificio se programa para el dfa 7.

Articulos de ensayo:

Armazones de BioFibra revestidos con Colageno

Las preparaciones de tejido microvascular procesado A y B se reconstituyen con WFI esteril y se absorben en armazones. La composicion de tejido microvascular procesado A esta sin esterilizar, y la composicion de tejido microvascular procesado B se esteriliza con haz de E.

Anestesia: Antes de la cirugfa el Dfa 1, los animales se pesan y se anestesia con una inyeccion intramuscular de 100 mg/ml de clorhidrato de ketamina (40 mg/kg) y 100 mg/ml (5-10 mg/kg) de xilazina.

Preparacion Quirurgica: la extremidad posterior derecha de cada animal se rasura un dfa antes del inicio del ensayo. En el Dfa 1, la piel se prepara quirurgicamente con betadine y se hacen friegas con alcohol, y se cubre usando tecnicas quirurgicas asepticas.

Procedimiento quirurgico: En el Dfa 1, el artfculo de ensayo se prepara inmediatamente antes del implante. El injerto se carga con celulas mediante accion de mecha. Dos suturas de polipropileno de 5-0 se colocan en el injerto para la fijacion. El injerto se reserva en la placa de Petri con solucion salina y se cubre hasta su uso.

Se realiza una incision lateral, recta en la piel desde la tibia caudal (distal) de la extremidad trasera derecha hasta el nivel de la tibia media. Usando este metodo, la piel se disecciona y retrae para permitir una exposicion lateral del tendon de Aquiles desde la union calcanea a la musculotendinosa. Se usa una diseccion adicional para exponer y aislar el tendon de Aquiles. El tendon de Aquiles expuesto se erosiona ligeramente con pinzas de dientes de raton antes de la colocacion del artfculo de ensayo de injerto. Se realiza un solo orificio de 0,5 mm en la direccion lateral a medial a traves del Calcaneo para permitir el paso de la sutura para la fijacion del injerto. El area del implante se irriga con solucion salina para eliminar cualquier residuo y residuo seco coagulado.

El injerto se retira del medio de soporte y se inserta a lo largo de la superficie anterior del tendon de Aquiles con un extremo adyacente al calcaneo. La sutura de fijacion del injerto craneal se coloca en el craneal gastrocnemio a la union musculo-tendinosa usando un patron de sutura de Mason-Allen modificado. La sutura de fijacion del injerto caudal a continuacion se pasa a traves del orificio de perforacion en el calcaneo y se tensa con el pie en una posicion neutra y se ata. Se atan seis nudos de sutura para todas las suturas de fijacion. La incision se cierra de una manera en capas usando el material de sutura apropiado.

Analgesia: A los animales se les administra buprenorfina (0,1-0,5 mg/kg) por via subcutanea al recuperarse de la anestesia el Dfa 1. Si fuera necesario para el dolor se puede administrar buprenorfina adicional con discrecion.

Medicion del peso corporal: Los animales se pesan de forma aleatoria, antes de la cirugfa el Dfa 1 y una vez a la semana hasta el final del estudio, incluso antes del sacrificio. (~ 9 puntos temporales).

Observaciones de salud: Los animales se monitorizan una vez al dfa durante la duracion del estudio. (~ 7 puntos temporales).

Observaciones de la zona del sitio de incision: Las observaciones del sitio de la incision se registran diariamente desde el Dfa 2 hasta el Dfa 7.

Registros de Temperatura / Humedad: Las mediciones de temperatura ambiente y humedad se registran diariamente.

Sacrificio y Recogida de Tejidos: En el D^ a 7, los animales se someten a eutanasia y los sitios del artfculo de ensayo o de control implantados y el tejido tendinoso circundante se reconocen por escision de cada animal. Todas las muestras recogidas se dividen por la mitad a lo largo de la lmea media del armazon con la mitad del tendon incluido en cada mitad. La mitad del tejido recolectado se almacena en formalina tamponada neutra al 10 % para la evaluacion histopatologica e inmunohistoqmmica de rutina. La mitad restante se retira en tiras de tendon y tejido blando con un crecimiento excesivo con el borde de un bistun, y el armazon con tejido encarnado se congela instantaneamente a < -70 °C en nitrogeno lfquido para el analisis de la expresion genetica.

Las secciones de tendon (tomadas del tendon de Aquiles contralateral), piel (tomadas de una region con menos pelo) e fngado de 2 animales/grupo seleccionados de forma aleatoria tambien se recogen como controles de tincion y se almacenan en formalina tamponada neutra al 10 % para evaluacion inmunohistoqmmica. Una porcion de cada tejido de control se congela instantaneamente en nitrogeno lfquido para los controles de PCR. (Los tres tejidos de control se pueden almacenar juntos en formalina y las porciones congeladas tambien se pueden almacenar juntas del mismo modo).

Los tejidos se someten a analisis de histologfa (H&E, tricromo de Masson), inmunohistoqmmica (SMAD8 y tenascina) y PCR (SMAD8, tenascina, tenomodulina y escleraxis).

Ejemplo 3 - Tratamiento de Isquemia En Ratones

Este estudio demuestra los efectos de las composiciones tejido microvascular procesado de la presente invencion en un modelo murino de isquemia de extremidades. El modelo murino de isquemia de extremidades se crea como se ha descrito anteriormente (Jang J et al., Circulation 1999; Huang N et al., JOVE 2009), y se usa para evaluar los efectos de las preparaciones celulares para estimular la angiogenesis despues de la induccion de isquemia de extremidades posteriores.

Los ratones SCID de 14 a 16 semanas de edad se someten a isquemia de extremidades posteriores inducida quirurgicamente. Inmediatamente despues de la cirugfa, la composicion del tejido microvascular procesado o el control del vefnculo se administrara a los animales como se detalla en la Tabla 4 que sigue a continuacion. En resumen, se inyectan por via intramuscular tres artfculos de celulas de ensayo (cada uno a 0,5 X 106 celulas) o el control del vefnculo el dfa 0 despues de la induccion de isquemia de extremidades posteriores en el gastrocnemio. Los tres artfculos de ensayo incluyen: composicion de tejido microvascular procesado (Celulas de Ensayo - I), composicion de tejido microvascular procesado esterilizado por haz de E (Celulas de Ensayo - II), y composicion de tejido microvascular procesado esterilizado por radiacion gamma (Celulas de Ensayo - III). La mejora en la perfusion de la extremidad se evalua cada 3-4 dfas durante un total de 14 dfas. Despues de 14 dfas, los animales se sacrifican. Se hace un explante del gastrocnemio tanto isquemico como el contralateral y se someten a analisis histologico.

Tabla 4. Protocolo del Estudio

Ensayo de Punto Final

El flujo sangumeo se evalua mediante Formacion de Imagenes con Laser Doppler en los Dfas 0, 3, 7, 11 y 14. Los animales se sacrifican el Dfa 14, y el tejido de la extremidad posterior se recolecta, se procesa y se almacena para los estudios de explantes.

Ejemplo 4 - Formacion de Vasos En Ratones SCID

Estos estudios usan ensayos de tapon de matrigel para demostrar la capacidad de las preparaciones de tejido microvascular de la presente invencion para formar estructuras vasculares in vivo. El ensayo de tapon de matrigel es un ensayo definitivo de la formacion de vasos verdaderos in vivo. Este ensayo consiste en la implantacion de celulas terapeuticas con matrigel por via subcutanea en la region abdominal. Durante el transcurso de 2 semanas, las celulas dentro del matrigel estan en un ambiente favorable para formar neovasos, algunos de los cuales pueden formar anastomosis con vasos hospedadores.

En este ensayo, 0,5 X 106 celulas se embeben en 0,5 ml de matrigel suplementado con 200 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos basico y a continuacion se inyectan por via subcutanea en ratones SCID. En cada animal se implantan 2 tapones. Despues de 2 semanas, se hace un explante de los tapones para analisis histologico de formacion de vasos. Para distinguir los vasos murinos humanos de los nativos, se usan anticuerpos espedficos humanos dirigidos a las celulas endoteliales (por ejemplo, CD31) para identificar vasos espedficos para seres humanos. La presencia de vasos humanos espedficos, como se demuestra histologicamente por las estructuras luminales realizadas con elementos sangumeos, es demostrativa de celulas endoteliales funcionales. De forma analoga, los anticuerpos de celulas endoteliales espedficas de raton se pueden usar para identificar vasos espedficos de raton. La capacidad de las celulas terapeuticas para secretar factores angiogenicos paracrinos da como resultado un aumento relativo en la formacion de vasos murinos.

Los ratones SCID de 14-16 semanas de edad se someten al implante de tapones de matrigel que contienen preparaciones de tejido microvascular de la presente invencion o control de vehfculo, como se detalla en la Tabla 5 que sigue a continuacion

Tabla 5. Protocolo del Estudio

Los tres artfculos de ensayo incluyen: composicion de tejido microvascular procesado (Celulas de Ensayo - I), composicion de tejido microvascular procesado esterilizado por haz de E (Celulas de Ensayo - II), y composicion de tejido microvascular procesado esterilizada por radiacion gamma (Celulas de Ensayo - Ill).

Ejemplo 5 - Tratamiento de Artritis Reumatoide En Rata las

Este estudio demuestra la eficacia de las preparaciones de tejido microvascular de la presente invencion para inhibir la inflamacion, destruccion del cartflago y resorcion osea asociada con artritis por deficiencia de colageno de tipo II establecida de 7 dfas en ratas.

Sistema del Ensayo

Numero de animales: 44

Especies/Cepa o Raza: ratas Lewis

Distribuidor: Charles River

Edad/Peso en el momento de la Llegada: 125-150 g

Genero: Hembra

Intervalo de Edades al Inicio del Estudio: Al menos 125 gramos en el momento de la primera inmunizacion.

Aclimatacion: Aclimatadas durante 4-8 dfas despues de su llegada a BBP.

Alojamiento: 3-5/animales/jaula

Materiales

Artmulos de ensayo (Preparaciones de composicion de tejido microvascular procesado) y vetnculo apropiado. Triamcinolona y solucion salina esteril para dilucion (BBP), colageno bovino de Tipo II (Productos de Elastina), adyuvante incompleto de Freund (Difco).

Diseno General del Estudio

Las ratas se anestesiaron con Isoflurano y se les administraron 300 pl de colageno Bovino de Tipo II en inyecciones de adyuvante incompleto de Freund ID/SC diseminadas en la parte del lomo distal, 100 pl por sitio el Dfa 0 y de nuevo el Dfa 6).

La clasificacion de forma aleatoria en cada grupo se produce el dfa 1 de la artritis (dfa 10 del estudio) cuando la enfermedad es evidente en ambas patas traseras (las rodillas generalmente tendran una enfermedad similar a la de los tobillos, pero son diffciles de calibrar de manera confiable, por lo que la medida del tobillo es un sustituto de la rodilla para fines de determinar el inicio de la enfermedad). Esto se convierte en el dfa 1 de la artritis. Los animales con artritis se clasifican de forma aleatoria en grupos de tratamiento mediciones medias con calibre de tobillo para cada grupo.

El tratamiento (IA, bilateral en ambas rodillas) se produce solo en el dfa 1 de la artritis. Las rodillas se tratan, porque los tobillos son demasiado pequenos para inyectar. Los efectos sistemicos del tratamiento se controlan con medidas de calibre de los tobillos y los efectos locales del tratamiento se determinan mediante histopatologfa en las rodillas. Las medidas del calibre del tobillo se toman diariamente desde los dfas 0 (medida inicial) -7. Las mediciones iniciales del calibre del tobillo se toman el dfa 0 usando un tobillo con valores redondeados a 25,4 pm (una milesima de pulgada). Las mediciones se confirman como clmicamente normales (6,660-0,671 mm (0,260-0,264 in) en comparacion con los valores historicos para ratas basandose en un intervalo de pesos corporales. A continuacion las mediciones de medida inicial se aplican a ambos tobillos, y estos valores permanecen con el animal siempre y cuando el tobillo sea clmicamente normal, con una buena definicion de todos los huesos del tobillo y sin evidencia de inflamacion.

Tabla 6: Denominaciones de Gru o de Estudio

Los tres artmulos de ensayo incluyen: composicion de tejido microvascular procesado (TX-I), composicion de tejido microvascular procesado esterilizada con haz de E (TX-II), y composicion de tejido microvascular procesado esterilizada con radiacion gamma (TX-III).

Induccion de Enfermedad

Los animales aclimatados se anestesian con Isoflurano y se les administran inyecciones de colageno (DO). En el dfa 6, sean expresion de nuevo para la segunda inyeccion de colageno. El colageno preparando una solucion de 4 mg/ml en Acido acetico 0,01 N. Se emulsionan volumenes iguales de colageno y ayudante incompleto de Freund mezclando a mano hasta que una perla de este material mantiene su forma cuando se coloca en agua. Cada animal recibe 300 pl de la mezcla cada vez extendida sobre 3 sitios son cutaneos (100 pl por sitio) en el lomo.

Artteulo y Vehiculo

Artteulo y Vehteulo de Ensayo: Preparaciones de celulas madre preparadas el d^ a de la inyeccion, Triamcinolona (Vetalog, Ft. Dodge).

Artteulo y Formulacion de Ensayo: Preparaciones de celulas madre en vehteulo fisiologico a concentraciones apropiadas para inyeccion de 400 pl/articulacion de la rodilla. 2 mg/ml de Triamcinolona para su dilucion en solucion salina.

Tabla 7: Calendario del Estudio

Realizacion de la Fase en Vivo

La clasificacion aleatoria en cada grupo por su gravedad de artritis se realiza en el dfa 1 de artritis (dfa del estudio 10). El tratamiento (bilateral IA, 40 pl/articulacion) se inicia despues de la clasificacion aleatoria (dfa 1). Los pesos corporales y las medidas/puntuaciones del tobillo con calibre se toman diariamente.

Practica Humana: Los animales que muestran signos de morbidez de acuerdo con el Programa de Cuidados Veterinarios del IACUC de Bolder BioPATH, que incluye la perdida de mas de un 20 % de peso corporal (en una semana) se retiran del estudio y se sacrifican con humanidad mediante inhalacion de CO².

Tabla 8: A entes Administrables en Fase Viva

Necropsia

Los animales se sacrifican en el Dfa de Artritis 7 mediante exsanguinacion.

Los datos de necropsia se recogen, incluyendo el peso de las patas traseras tanto derecha como izquierda, y el peso del hngado, bazo y timo.

Las muestras de necropsia recogidas incluyen una alfcuota del suero terminal, y las patas traseras izquierda y derecha y rodillas.

Procesamiento de Articulaciones/Puntuacion Histopatologica

Despues de 1-2 dfas en fijador y despues de 4-5 d^as en descalcificado, las articulaciones del tobillo se cortan por la mitad longitudinalmente, las rodillas se cortan por la mitad en el plano frontal, se procesan, se embeben, se seccionan y se tinen con azul de toluidina.

Metodos de Puntuacion Histopatologica para Articulaciones de Ratas con Artritis por Deficiencia de Colageno de Tipo II

A los tobillos y rodillas artnticos de colageno se les dan puntuaciones de 0-5 para inflamacion, formacion de pannus y resorcion osea de acuerdo con los siguientes criterios:

Inflamacion de Rodilla y/o Tobillo

0 = Normal

0,5 = Inflamacion focal minima

1 = Infiltracion minima de celulas inflamatorias en tejido sinovial/periarticular.

2 = Infiltracion leve

3 = Infiltracion moderada con edema moderado.

4 = Infiltracion notable con edema notable

5 = Infiltracion grave con edema grave

El infiltrado inflamatorio en ratones y ratas con artritis por deficiencia de colageno de tipo II consiste en neutrofilos y macrofagos con numeros pequenos de linfocitos cuando las lesiones estan en la fase aguda o subaguda. El edema tisular y los ex soldados de neutrofilos dentro del espacio articular son comunes de la fase aguda a subaguda. A medida que la inflamacion evoluciona a cronica, las celulas inflamatorias mononucleares (monocitos, linfocitos) predominan y la proliferacion de fibroblastos, a menudo con deposicion de matriz metacromatica, se produce en el tejido sinovial y periarticular. El exudado es menos comun en el espacio articular. A menos que se indique en la zona de comentarios con el tipo de inflamacion es de aguda a subaguda.

Pannus en Tobillo

0 = Normal

0,5 = Infiltracion minima de pannus en cartflago y hueso subcondral,

afecta solo a zonas marginales y solo a pocas articulaciones.

1 = Infiltracion minima de pannus en cartflago y hueso subcondral,

afecta principalmente a zonas marginales.

2 = Infiltracion leve (< 1/4 de tibia o tarsos en zonas marginales)

3 = Infiltracion moderada (de 1/4 a 1/3 de tibia o tarsos pequenos afectados en

zonas marginales)

4 = Infiltracion notable (1/2-3/4 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales)

5 = Infiltracion grave (> 3/4 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales,

distorsion grave de la arquitectura global)

Pannus en Rodilla

0 = Normal

0,5 = Infiltracion minima de pannus en cartflago y hueso subcondral,

afecta solo a zonas marginales y solo a pocas articulaciones.

1 = Infiltracion minima de pannus en cartflago y hueso subcondral,

aproximadamente un 1-10 % de superficie de cartflago o hueso subcondral afectado.

2 = Infiltracion leve (se extiende hasta 1/4 de superficie o area o subcondral

de tibia o femur), aproximadamente 11-25 % de superficie de cartflago o hueso subcondral afectado

3 = Infiltracion moderada (se extiende sobre > 1/4 pero < 1/2 de superficie o

area o subcondral de tibia o femur) aproximadamente un 26-50 % de superficie de cartflago o hueso subcondral afectado

4 = Infiltracion notable (se extiende de 1/2 a 3/4 de superficie tibial o femoral) aproximadamente un 51-75 % de superficie de cartflago o hueso

subcondral afectado

5 = Infiltracion grave aproximadamente un 76-100 % de superficie de cartflago o hueso subcondral afectado

Dano en Cartflago del Tobillo (Enfasis en tarsos pequenos)

0 = Normal

0,5 = Disminucion minima en tincion con azul de T, afecta solo a zonas marginales y afecta solo a unas pocas articulaciones

1 = Perdida de tincion con azul de toluidina de minima a leve sin

perdida de condrocitos o alteracion de colageno evidente

2 = Perdida leve de tincion con azul de toluidina con perdida de condrocitos leve

focal (superficial) y/o alteracion de colageno

3 = Perdida moderada de tincion con azul de toluidina con perdida de condrocitos moderada multifocal (zona de profunda a media) y/o alteracion de colageno tarsos mas pequenos afectados a una profundidad de 1/2-3/4 con zonas raras de perdida de grosor total

4 = Perdida notable de tincion con azul de toluidina con perdida de condrocitos notable multifocal (zona de profundidad a profunda) y/o alteracion de colageno, 1 o 2 superficies pequenas de tarsos tienen perdida de grosor total de cartflago 5 = Perdida difusa grave de tincion con azul de toluidina con perdida de condrocitos grave multifocal (marca de profundidad a la parte baja) y/o alteracion de colageno que afecta a mas de 2 superficies de cartflago

Dano en Cartflago de la Rodilla

0 = Normal

1 = Perdida de tincion con azul de toluidina de mmima a leve sin

perdida de condrocitos o alteracion de colageno evidente

2 = Perdida leve de tincion con azul de toluidina con perdida de condrocitos

y/o leve focal (superficial) alteracion de colageno puede tener pocas zonas pequenas con un 50 % de profundidad de cartflago afectado

3 = Perdida moderada de tincion con azul de toluidina con perdida de condrocitos moderada de multifocal a difusa (zona de profunda a media) y/o alteracion de colageno, puede tener 1-2 zonas pequenas de perdida de grosor completo que afectan a menos de % del ancho total de una superficie y no mas de un 25 % del ancho total de todas las superficies 4 = Perdida notable de tincion con azul de toluidina con perdida de condrocitos notable

de multifocal a difusa (zona de profundidad a profunda) y/o alteracion de colageno, o 1 superficie con perdida casi total y perdida parcial en otros, perdida global total inferior a un 50 %de ancho de todas las superficies combinadas

5 = Perdida difusa grave de tincion con azul de toluidina con perdida de condrocitos grave multifocal (marca de profundidad a la parte baja) y/o alteracion de colageno tanto en femures y/o tibias, perdida global total superior a un 50 %de ancho de todas las superficies combinadas

Resorcion Osea del tobillo

0 = Normal

0,5 = Resorcion minima que afecta solo a zonas marginales y afecta solo a unas pocas articulaciones

1 = Zonas pequenas de resorcion, no rapidamente evidentes con un aumento bajo, osteoclastos escasos

2 = Leve = zonas de resorcion mas numerosas, no rapidamente evidentes con un aumento bajo, osteoclastos mas numerosos, < 1/4 de tibia o tarsos en zonas marginales reabsorbido 3 = Moderada = resorcion evidente de hueso trabecular de cavidad medular y cortical sin defectos de grosor total en el cortex, perdida de una cierta parte de la trabecula de la cavidad medular, lesion aparente con un aumento bajo, osteoclastos mas numerosos, de 1/4 a 1/3 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales

4 = Notable = Defectos de grosor total en el hueso cortical, a menudo con distorsion del perfil de la superficie cortical restante, perdida notable de hueso de la cavidad medular, numerosos osteoclastos, 1/2-3/4 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales

5 = Defectos de grosor total en el hueso cortical, a menudo con distorsion del perfil

de la superficie cortical restante, perdida notable de hueso de la cavidad medular, numerosos osteoclastos, > 3/4 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales, distorsion grave de la arquitectura global

Resorcion Osea de la Rodilla

0 = Normal

0,5 = Resorcion minima que afecta solo a zonas

1 = Minima = zonas pequenas de resorcion, no rapidamente evidentes con un aumento bajo, aproximadamente un 1-10 % del ancho total de la articulacion del hueso subcondral afectado

2 = Leve = zonas de resorcion mas numerosas, perdida definitiva de hueso subcondral, aproximadamente un 11-25 % del ancho total de la articulacion del hueso subcondral afectado

3 = Moderada = resorcion evidente de hueso subcondral aproximadamente un 26-50 %

del ancho total de la articulacion del hueso subcondral afectado

4 = Notable = resorcion evidente de hueso subcondral aproximadamente un 51-75 %

del ancho total de la articulacion del hueso subcondral afectado

5 = Grave = distorsion de toda la articulacion debido a la destruccion de aproximadamente un

76-100 % del ancho total de la articulacion del hueso subcondral afectado

Deposicion de la Matriz Periarticular (Solamente puntuada si se observa un aumento en cualquier grupo tratado con respecto a controles de enfermedad)

0 Normal

1 Tincion metacromatica multifocal, apenas visible, sin expansion excesiva de

tejido periarticular

2 Tincion metacromatica difusa, mas oscura, sin expansion excesiva de

tejido periarticular

3 Tincion metacromatica difusa, mas oscura, expansion leve de tejido

periarticular

4 Tincion metacromatica difusa, mas oscura, expansion moderada de

tejido periarticular

5 Tincion metacromatica difusa, mas oscura, expansion grave de

tejido periarticular

Analisis Estadistico

Datos clinicos

Los datos se analizan mediante un ensayo t de Student o un ensayo U de Mann-Whitney (no parametrico). Si fuera aplicable, los datos se analizan adicionalmente en todos los grupos mediante un analisis de varianza de una via (ANOVA de 1 via) o ensayo de Kruskal-Wallis (no para Mexico), junto con el ensayo posterior de comparacion multiple apropiado. A menos que se indique, el analisis estadistico se realiza solo en datos sin procesar (no transformados). Los ensayos estadfsticos hacen ciertas suposiciones con respecto a la normalidad de los datos y la homogeneidad de la varianza, y es posible que se requiera un analisis adicional si los ensayos dieran como resultado violaciones de estas suposiciones. La importancia de todos los ensayos se establece en p < 0,05.

El porcentaje de inhibicion del peso de la pata y el AUC se calcula usando la siguiente formula:

% de inhibicion =A - B/A X 100

A = Control Medio de Enfermedad - Normal Media

B = Tratado Media - Normal Media

Ejemplo 6 - Tratamiento de Espacios Oseos, Defectos de Cartilago y Lesiones de Menisco en Cabras Este estudio demuestra el efecto del tejido microvascular en la preparacion de la presente invencion en el tratamiento de huecos oseos, defectos de cartflago y lesiones de menisco. En este estudio, para cada animal, se opera la articulacion trasera derecha, y se crean 3 defectos quirurgicos distintos y separados. Cada femur derecho analizado tendra un defecto oseo de 8 mm de diametro por 20 mm de profundidad en la region epicondilar lateral del femur, un defecto de cartflago rectangular de 4 x 7 mm por 2 mm de profundidad creado en el surco troclear y uno de 7 mm de largo por 1-2 mm de defecto de menisco de grosor total de 2 mm de ancho creado en la zona blancablanca del menisco medial. El grupo de tratamiento de 3 animales tiene cada defecto tratado con la preparacion microvascular del tejido, mientras que el grupo de control tiene los defectos rellenados solo con el andamio. Las cabras se evaluan a las 8 semanas para evaluar y caracterizar el tejido reparado en los distintos sitios de defectos. Se espera que los defectos tratados sean superiores en apariencia general e histologica en comparacion con los controles.

La cabra se eligio debido al gran tamano relativo de la articulacion suprimida, la facilidad de manipulacion, uso en otros estudios de reparacion de cartflago, menisco y hueso, y similitud de respuesta a la que se observa en seres humanos. Para la investigacion del cartflago se han usado diversas especies de cabras debido al gran tamano de sus articulaciones, similitud de la fisiologfa de la reparacion del menisco, grosor del cartflago en la articulacion de la rodilla (Stifle) entre 1,5-2 mm, similar a los caballos y los seres humanos, y que poseen hueso esponjoso y cortical similar a los humanos (osteonal secundario). Los procesos de reparacion de hueso, cartflago y menisco son un proceso muy complejo que no se puede imitar en un entorno in vitro. Los modelos animales son necesarios ya que la fisiologfa de las articulaciones, especialmente las articulaciones lesionadas, es muy compleja y no se puede duplicar en el laboratorio. Los animales usados en este estudio se resumen en la Tabla 9.

Tabla 9. Uso en Animales

Un defecto unicortical de 8 mm de diametro por 20 mm de profundidad se crea en la region epicondilar lateral del femur derecho; se crea un defecto rectangular de 4 x 7 mm por aproximadamente 2 mm de profundidad en el surco troclear lateral del femur derecho, y se creara un defecto de grosor total de aproximadamente 7 mm de largo por 1-2 mm de ancho en el menisco medial derecho. Cada rodilla se examina ffsicamente examinada para cajon, rango de movimiento (goniometro), hinchazon, temperatura, crepitacion, seguimiento de la rotula y valgo/varo. Se realiza un lavado quirurgico convencional con clorohexidina seguido de alcohol al 70 % y seguido de una pintura de betadine. El enfoque quirurgico consiste en una incision medial curvada de la piel desde el tercio distal del femur derecho hasta el nivel de la meseta tibial.

El ligamento colateral medial se identifica y se hace un esbozo de la huella de union del ligamento oseo con precaucion. En el centro de la huella, una broca de 2,8 mm y una rosca se usa para crear un orificio de tornillo para volver a colocar el ligamento. Una sierra oscilante se usa para cortar la huella de fijacion del ligamento colateral medial, permitiendo que se refleje hacia la tibia. La capsula articular se abre y la rodilla se flexiona y gira lateralmente para exponer el menisco medial. Se coloca una lengueta protectora de plastico debajo del menisco medial y, mediante un punzon oval especialmente disenado, se realiza un defecto de espesor completo en la zona blanca-blanca del menisco. El defecto se trata con armazon o armazon compuesto. La rodilla se endereza y el ligamento colateral medial se vuelve a colocar con un tornillo y una arandela.

A continuacion la rodilla se flexiona y se identifica el punto medio del surco de la troclea lateral. El punto de perforacion para el defecto del cartflago se define como 20 mm distal al borde proximal del surco troclear lateral. El cartflago se puntua con un punzon de 6 mm de diametro, y usando instrumentos especializados, se realiza un defecto de 6 mm de diametro por un espesor aproximado de 2 mm en la superficie del cartflago. Este defecto se trata con armazon o armazon compuesto.

Con la rodilla aun flexionada, se usa una broca de 3 mm de diametro con collarm para perforar un orificio piloto en la region epicondilar del condilo femoral lateral hasta una profundidad de 20 mm. La broca se alinea de forma perpendicular a la lmea de union y paralela a la superficie anterior. Este agujero piloto se ensancha a un diametro de 8 mm. El defecto oseo se lavar abundantemente y a continuacion se trata con un armazon o armazon compuesto. Despues del cierre de la incision quirurgica en 3 capas usando Vicryl 1-0 para las capas profundas y grapas en la piel, se aplica una ferula de Thomas modificada a la pata para limitar el peso y el movimiento. El yeso y la ferula de fibra de vidrio permaneceran puestos durante un mmimo de 14 2 dfas despues de la operacion. Durante este tiempo los animales se mantendran en pequenas zonas de ejercicio.

T l 1 : A i n i n r mi n r f

Los animales se someten a eutanasia bajo anestesia en estadio III con Cloruro Potasico IV en los dfas 84 2, despues de la operacion. Despues de la eutanasia, las articulaciones suprimidas se evaluan ampliamente, el ftquido sinovial se evalua ampliamente para determinar el color y la viscosidad, y las muestras se recogen como se describe en la Tabla 12. Las articulaciones se abriran, se fotografiaran y la superficie de los sitios condrales se puntuaran como se indica en la Tabla 13 Las superficies de articulacion que se oponen a los sitios defectuosos se examinaran para detectar cualquier superficie anomala de la articulacion. La evaluacion general se realizara en las articulaciones de rodilla de control y operadas. Los ganglios linfaticos poplfteos y las membranas sinoviales se examinaran para detectar cualquier inflamacion.

T l 11: Ev l i n T l R i M r

H = histologfa - Solo femur derecho: defecto oseo, defecto troclear, menisco medio

La rodilla contralateral se examina para detectar cualquier superficie anomala de la articulacion. Se realizan evaluaciones morfologicas generales de las articulaciones de la rodilla derecha para determinar la reparacion de la superficie condral en funcion de los criterios de puntuacion anteriores que se enumeran en la Tabla 3. El femur derecho se corta para separar el defecto del cartftago de la region vada del hueso y se coloca en recipientes debidamente etiquetados y rellenos con un volumen de 10 veces de formalina tamponada a pH neutro al 10 por ciento. El menisco medial se evalua de manera general, se recoge y se coloca en recipientes debidamente etiquetados y llenos con un volumen de 10 veces de formalina tamponada a pH neutro al 10 por ciento.

T l 12: ri ri P n i n r Ev l i n M rf l i T l

El Ifquido sinovial se recoge, se evalua para volumen, viscosidad (rigidez), claridad y color. Si fuera apropiado, se aplica una puntuacion semicuantitativa de la evaluacion total del lfquido sinovial tal como se destaca en la Tabla 13.

Tabla 13: Descri cion Puntuacion ara Li uido Sinovial

La puntuacion total de lfquido sinovial es una suma de las puntuaciones de color, transparencia y rigidez (0-8 puntos).

Ejemplo 7 - Ensayos de Migracion Celular Usando Tejido Microvascular de Rata Procesado

Para demostrar el efecto de la composicion del tejido microvascular procesado en la migracion celular, los ensayos de migracion de celulas endoteliales humanas (quimioatraccion por las composiciones de tejido microvascular procesado) y absorcion de microvesfculas (MV) de la composicion de tejido microvascular procesado por la fraccion vascular estromal obtenida a partir de tejido adiposo (SVF) las desarrollaron y usaron como medidas de la actividad biologica de la composicion.

La razon para elegir estos estudios fue que: (1) la composicion de tejido microvascular procesado puede inducir aumentos en la reparacion vascular; por lo tanto, la migracion de celulas endoteliales podna ser una metrica valida; y (2) la liberacion y absorcion de MV es una actividad importante que se podna producir en multiples tipos de celulas en un modelo de reparacion de tejidos; por lo tanto, la poblacion de celulas SVF, que tiene tipos de celulas importantes para la reparacion vascular, se uso para sometera ensayo la absorcion de MV.

Diseno General del Estudio

Para evaluar la capacidad de quimioatraccion de la composicion de tejido microvascular procesado para celulas endoteliales, se colocaron muestras de la composicion en las camaras inferiores de las placas de Transwell, y se controlo la migracion de celulas endoteliales marcadas con un colorante lipofilo fluorescente de color naranja-rojo (CM-Dil) en el tiempo, de 12 a 48 horas. El ensayo tambien incluyo un medio de crioconservacion qmmicamente definido EZ-CPZ™ (incell Corp., San Antonio, TX) a un 100 % y como una mezcla a 50/50 de EZ-CPZ ™ con medio M3D™ (Incell Corp., San Antonio, TX ) como control de medida inicial.

Un segundo estudio se realizo para evaluar la absorcion de la composicion de tejido microvascular procesado por las celulas SVF. La composicion se incubo con CM-Dil para permitir que el colorante se incorporara en las mV y las membranas celulares de las muestras de la composicion. Las muestras de la composicion marcada se aclararon, se diluyeron en medio, a continuacion se colocaron sobre cultivos de monocapa de celulas SVF. Despues de 24 h de absorcion, las celulas se aclararon, a continuacion se visualizaron para absorcion de colorante de color rojo fluorescente.

Materiales y Metodos

M3D™ es un medio de cultivo qmmicamente definido fabricado por INCELL. En algunos ensayos, M3D™ se suplemento con antibioticos (1X PSF: antibiotico Pen/Estrep/Fungizona/antimicotico; Invitrogen, Grand Island NY). El medio M3D:10 (INCELL) fue M3D ™ suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1X PSF. EZ-CPZ ™ (Incell Corp., San Antonio, TX) es un medio de crioconservacion de celulas qmmicamente definido. EZ-CPZ™ y EZ-CPZ™: M3D™ (1:1; v/v) se usaron como medios de control de referencia.

CM-Dil es el colorante fluorescente "Cell Tracker®" en una formulacion acuosa para medio de cultivo (Invitrogen / Molecular Probes). Se asocia con materiales lipofilos tales como membranas celulares y las MV y se puede visualizar como fluorescencia de color rojo brillante mediante microscopfa de fluorescencia. Para este estudio, un microscopio invertido EVOS se uso con un filtro rojo: 530 nm de excitacion, 593 nm de emision).

Las celulas endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) en el pase 1 (p1) se recuperaron del Biorrepositorio de INCELL. Las celulas p1 de SVF humanas para los ensayos de absorcion de MV se recuperaron del Biorrepositorio de INCELL.

Todas las celulas se cultivaron en M3D: 10 ™ (Incell, San Antonio, TX). Las celulas endoteliales se incubaron con CM-Dil durante 30 minutos a 37 °C y a continuacion se enjuagaron con M3D ™ con 1XPSF. Se hizo el recuento de las celulas y un numero igual de celulas por pocillo se aplico a la camara superior de camaras Transwell de PET de tamano de poro de 3 micrometros (Thermofisher; Waltham, MA) cargada previamente con los materiales de ensayo de la composicion detejido microvascular procesado en pocillos por triplicado.

Las celulas SVF para el ensayo de adsorcion se cultivaron en placas de 48 pocillos en fase de crecimiento logantmico.

Composicion de Tejido Microvascular Procesado

Dos composiciones de tejido microvascular procesado se preparan y someten a ensayo, es decir, BMA y BMB. Las muestras de BMA eran celulas SVF de rata y BMB eran celulas mononucleares de medula osea, cada una liofilizada a 106 celulas/ml. Las celulas SVF de rata se prepararon picando almohadillas de grasa epididimales con tijeras hasta que no hubo trozos mayores de 1 mm de diametro, y a continuacion se lavaron y se incubaron en 1 U/ml de Clzyme As (Vitacyte, Indianapolis, IN) en PBS durante 60 min a 37 °C con agitacion suave. Las celulas se lavaron dos veces y se volvieron a suspender a 106/ml en tampones de liofilizacion. Las celulas de la medula osea de rata se obtuvieron mediante lavado abundante de los femures y las tibias con solucion de ACDA/PBS y se disocia mediante aspiracion y expulsion repetidas a traves de una aguja de calibre 20 ga. A continuacion las celulas de la medula osea se separaron en un gradiente de Ficoll, se lavaron con PBS FBS al 1% dos veces y se volvieron a suspender en tampones. Despues de la liofilizacion, las muestras de BMA dieron recuentos celulares por debajo del lfmite de deteccion (menos de 10.000), mientras que las muestras de BMB dieron recuentos celulares de 0,6 a 1,0 millones y viabilidades (azul de tripano) de un 10 a un 50 %, como se muestra en La tabla 14.

T l 14: Vi ili Pr r i n BMA BMB

Todas las muestras se almacenaron refrigeradas en la oscuridad durante un ano y las muestras de ensayo se esterilizaron con radiacion de haz de E de 11 kGy. Las muestras de control no irradiadas no se esterilizaron.

Migracion Transwell De Celulas Endoteliales Etiquetadas

El material liofilizado se reconstituyo en 1 ml de agua UFDI con 1X PSF. De esta muestra total, se pusieron 300 pl en el fondo de cada uno de los 3 pocillos y se llevaron a un volumen final de 500 pl con 200 pl de M3D. Las camaras superiores se colocaron en los pocillos de muestra y un numero igual de celulas HUVEC p2 etiquetadas con CM-Dil pusieron en cada uno. La placa se incubo a 37 °C, y se tomaron imagenes de los pocillos a las 12, 24 y 48 horas. Las imagenes se examinaron haciendo el recuento de las celulas en los campos para determinar los resultados. Absorcion de Microvesiculas Etiquetadas con Celulas SVF

Los 100 |jl restantes de material liofilizado se incubaron con CM-Dil para etiquetar las membranas celulares presentes. El material se lavo 3 veces con M3D 1XPSF por centrifugacion. Las celulas SVF sembradas en placas de 48 pocillos para el ensayo de absorcion se hicieron crecer hasta un 50 % de confluencia y 50 j l de CM-Dil material liofilizado etiquetado con CM-Dil en capas en la parte superior. La mitad de los pocillos se enjuagaron a las 24 horas, se revistieron con lfquido de montaje y se dejaron secar; la otra mitad se aclaro, se fijo y se monto despues de 3 dfas. Las imagenes se examinaron para determinar los resultados.

Resultados

Migracion Transwell De Celulas Endoteliales Etiquetadas

Para todos los pocillos, habfa un numero mmimo de celulas en la camara inferior en el punto temporal de 12 horas. Vease la Figura 2 y la primera fila de las Figuras 3-7 a medida que el tiempo avanzaba, las celulas comenzaron a migrar en la camara inferior. Algunas de las muestras se llevaron a la camara inferior mas rapidamente. Las muestras de BMA tendfan a atraer a las celulas mas que BMB como se observa en la Figura 2. El grupo de ensayo de Tampon BMA 2 tuvo el mdice celular mas bajo a las 24 horas, pero los recuentos celulares mas altos en el punto de tiempo de 48 horas entre las muestras de ensayo. En general, las muestras de BMA funcionaron mejor que las muestras de BMB con el tampon 2, ya que mostraron una tendencia (pero no estadfsticamente significativa) de induccion de mayor tasa de migracion que el tampon 1.

El otro efecto notable del ensayo fue la tendencia a una disminucion en la migracion de la irradiacion causada en BMA de aproximadamente un 20 %, mientras que BMB tuvo poco efecto y tema esencialmente el mismo nivel (la diferencia no era estadfsticamente significativa) a las 24 y 48 horas.

El control de medios EZ-CPZ™ tuvo cierta transmigracion pero solo mas tarde en el transcurso del tiempo y en menor grado que las muestras de BMA y BMB. Estos resultados demuestran de forma espectacular que las celulas no tienen que ser viables o autologas para que la composicion induzca una actividad angiogenica.

Absorcion de Microvesiculas de Composicion de Tejido Microvascular Procesado Etiquetado con Celulas SVF Este ensayo se realizo para determinar si las MV de la composicion de tejido microvascular procesado se transportaban en celulas SVF (fraccion vascular estromal). El ensayo se realizo mediante etiquetado de los 100 j l restantes del material de composicion tejido microvascular procesado en cada vial con CM-Dil, que se incorporan membranas celulares incluso si las propias celulas estan muertas. Las celulas SVF se sembraron en placas en una placa de 48 pocillos con medios M3D:10 y se permitio que se adhirieran y crecieran hasta que tuvieran una confluencia de aproximadamente un 50 %. Los 50 j l del material etiquetado se anadieron a los pocillos y se incubaron durante 6 horas. Los pocillos se enjuagaron 3 veces con M3D™ y se fijaron con montaje con humedad. Las imagenes mostraron que varias de las celulas efectivamente absorbfan el material a medida que el tinte se transfena a las celulas SVF tal como se observa en las Figuras 8 y 9.

Discusion

En este ensayo, el material liofilizado de BMA y BMB con o sin irradiacion actuo como agentes quimioatractores para las celulas endoteliales. Se observo una leve disminucion de la transmigracion celular cuando el material se irradio. La diferencia entre los tampones 1 o 2 fue insignificante.

El material de BMA y BMB se recogio mediante celulas SVF vivas cuando el material se puso en la parte superior de un cultivo que ya estaba creciendo y se incubo durante 24 horas.

Hay varios conceptos importantes ilustrados con estos experimentos. Aunque las muestras de SVF mostraron enormes perdidas celulares y no teman viabilidad despues de la liofilizacion, retuvieron mas actividad biologica que las muestras de medula osea, que no mostraron perdidas celulares y una viabilidad de un 10 a un 50 %. (La perdida de celulas SVF puede haber sido causada por una actividad enzimatica excesiva durante la etapa de digestion). Ambas preparaciones celulares se mantuvieron estables durante mas de un ano. La esterilizacion no afecto materialmente a su capacidad para atraer celulas endoteliales.

Tabla 15: Factores de Crecimiento, Receptores, Hormonas, Genes, Factores de Transcripcion Asociados con

Hueso

Ejemplo 8 - Efectos de Tejido Microvascular ^{In V itro e In V iv o}

Como se ha analizado anteriormente, diversas preparaciones de celulas madre han mostrado efectos beneficiosos en estudios clmicos y en animales para una diversidad de indicaciones. En muchos casos, la supervivencia de las celulas madre administradas es relativamente escasa. Por lo tanto, los estudios actuales se disenaron para abordar si, como se analiza en relacion con diversas realizaciónes anteriores, se necesitan celulas madre viables para conseguir algunos (o todos) de los beneficios terapeuticos asociados con las celulas madre. El presente estudio uso tejido microvascular, una rica fuente de celulas madre y precursoras, que se proceso de acuerdo con los metodos que se han descrito anteriormente.

En resumen, el tejido microvascular se aislo de tejido adiposo de cadaver humano prosperando el tejido y posteriormente haciendo digestion enzimatica del tejido troceado. El tejido digerido se centrifugo a continuacion para eliminar la grasa, dando como resultado tejido microvascular. El tejido microvascular se volvio a suspender en un tampon de crioconservacion (mezcla a 1:1 de medios M3:DC y EZ-CPZ, INCELL Corporation, San Antonio, TX), se distribuyo en viales y se liofilizo o tanto se liofilizo como se esterilizo con radiacion.

El tejido microvascular procesado resultante se sometio a ensayo para recuentos celulares, viabilidad, fenotipo, CFU-F, y bioactividad en angiogenesis y modelos ortopedicos.

Resultados

Los recuentos celulares y la viabilidad de tejido microvascular recien aislado, liofilizado y liofilizado/esterilizado se muestran en la Tabla 16. El fenotipo de cada preparacion se muestra en la Tabla 17.

Tabla 16

Tabla 17

Los datos del recuento celular/viabilidad celular demuestran claramente que no hay un cambio significativo en el numero de celulas basandose en el procesamiento del tejido microvascular (por ejemplo, ya sea recien obtenido, seco, seco y esterilizado, los recuentos celulares son aproximadamente equivalentes, basandose en la absorcion nuclear de la tincion de ADN con DAPI). Sin embargo, la liofilizacion del tejido microvascular reduce de forma significativa la capacidad de las celulas en el tejido microvascular para excluir el azul de tripano. La liofilizacion induce aproximadamente una reduccion de un 70 % en el porcentaje de celulas viables. La exposicion a la radiacion redujo adicionalmente la viabilidad, de modo que solo aproximadamente un 2 % de las celulas en el tejido microvascular eran viable. Ademas, cuando se analizaron para celulas madre mesenquimales funcionales (usando un ensayo establecido de unidad formadora de colonias - fibroblastos (CFU-F)), no se detectaron celulas madre mesenquimales funcionales en las preparaciones liofilizadas o liofilizadas/esterilizadas.

De manera interesante, a pesar del numero de celulas sin cambios y la reduccion de la viabilidad, los diversos metodos de procesamiento alteraron el fenotipo de las celulas. Como se muestra en la Tabla 17, el colageno de Tipo IV aumento de forma moderada (en comparacion con una preparacion recien preparada) en el tejido microvascular liofilizado/esterilizado. Estos datos sugieren que el tejido microvascular liofilizado/esterilizado puede ser muy adecuado para la reparacion de tejidos blandos, debido al menos en parte a su aumento de la densidad de colageno. Los materiales a base de colageno se han sometido a ensayo para su uso en ingeniena tisular, sin embargo, el tejido microvascular que se describe en el presente documento es particularmente ventajoso debido a la facil disponibilidad del material y el aumento de su "severidad" (que se discute a continuacion). Cada uno de los marcadores establecidos de celulas madre hematopoyeticas CD31 (celulas madre hematopoyeticas), CD34 (celulas madre de medula osea/hematopoyeticas), CD44 (celulas similares a celulas madre cancerosas) y CD45 (celulas madre hematopoyeticas) fueron esencialmente regulados de forma positiva como respuesta a la liofilizacion y a la esterilizacion. Por lo tanto, a pesar de una reduccion casi completa de la viabilidad de las celulas en tejido microvascular liofilizado/esterilizado, cualquier celula restante tiene un aumento de la expresion de marcadores conocidos por que son expresados por celulas madre. Como tal, el tejido microvascular liofilizado/esterilizado puede ser mas adecuado para regeneracion tisular debido a esta mayor severidad (y los efectos indirectos que induce la mayor severidad, por ejemplo, reclutamiento paracrino de otras celulas endogenas que mejoran la reparacion, liberacion de factores de crecimiento del tejido microvascular, etc.).

Los diversos tejidos microvasculares se evaluaron para su capacidad para reclutar otros tipos de celulas. El reclutamiento de celulas puede mejorar la reparacion o regeneracion de tejido danado o enfermo mediante una variedad de mecanismos. Por ejemplo, el reclutamiento de celulas endoteliales puede mejorar la formacion de vasos sangumeos, mejorando de ese modo el suministro de sangre que facilita la formacion de nuevos tejidos. El reclutamiento de celulas madre endogenas puede iniciar una cascada de sucesos que fomentan el crecimiento de tejido nuevo y/o reparacion del tejido danado existente. Las celulas endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se marcaron con Dil y se colocaron en la parte superior de las placas Transwell con varios tipos de tejido microvascular en los pocillos del fondo. Se hizo el recuento del numero de celulas HUVEC que atravesaron la membrana intra-pocillo para cada tipo de tejido microvascular despues de 48 horas y se comparo con el medio de cultivo solo o medios suplementados con factor de crecimiento epidermico (EGF) como controles. La Figura 10 representa los resultados. Se detecto poca migracion de celulas HUVEC como respuesta a los medios solos. El EGF, que se establece como un inductor de la migracion HUVEC dio como resultado una migracion aproximadamente 10 veces mayor que solo los medios. El tejido microvascular recien aislado ("digerido" en la Figura 10) indujo una migracion ligeramente menor que el EGF, y la fraccion liofilizada indujo una migracion incluso menor (aunque fue aun mayor que el medio solo). De forma inesperada, el tejido microvascular liofilizado/esterilizado indujo una migracion casi 2 veces mas elevada en comparacion con EGF, y casi 20 veces mas que el medio solo. Por lo tanto, el secado y la esterilizacion del tejido microvascular mejoran de forma significativa su capacidad para reclutar celulas in vitro. El aumento de la disponibilidad, en varias realizaciónes, proporciona, al menos en parte, un aumento de la reparacion y/o regeneracion tisular in vivo.

Ese aumento de la reparacion in vivo se corroboro al demostrar que el tejido microvascular liofilizado/esterilizado induce un restablecimiento mas robusto y rapido del flujo sangumeo al tejido que se convirtio en isquemico. Los ratones SCID se sometieron a ligadura unilateral y seccion transversal de la arteria femoral de acuerdo con metodos establecidos para replicar la isquemia (una afeccion que conduce a un dano tisular grave). El tejido microvascular se proceso de diversas maneras y se introdujo en la extremidad isquemica los d^as 0, 3 y 7, y se tomaran imagenes de los ratones con laser Doppler en los dfas 0, 7 y 14. Como se muestra en La Figura l l , los animales de control a los que se les inyecto solucion salina muestran poco restablecimiento del flujo sangumeo (la extremidad isquemica se designa con una flecha) despues de 7 o 14 dfas. Por el contrario, el tejido microvascular liofilizado dio como resultado un restablecimiento al menos parcial del flujo sangumeo en 14 dfas. Sin embargo, el tejido microvascular liofilizado/esterilizado dio como resultado aumentos significativos en el flujo sangumeo en 7 dfas, con el flujo sangumeo a los 14 dfas siendo en gran parte indistinguible de la extremidad de control contralateral. Estos datos corroboran los datos de migracion in vitro e indican que, en varias realizaciónes, el tejido microvascular liofilizado/esterilizado puede mejorar el restablecimiento del flujo sangumeo.

En varias realizaciónes, el restablecimiento del flujo sangumeo se debe, al menos en parte, a la formacion de nuevos vasos sangumeos, incluyendo los vasos pequenos (por ejemplo, microvasculatura), vasos medianos y vasos de gran diametro (por ejemplo, aquellos que son proveedores principales de sangre a un tejido). Matrigel (0,5 ml) se mezclo con solucion salina o tejido microvascular (humano) para generar un implante de tejido microvascular, que se inyecto por via subcutanea en ratones SCID. Despues de 14 dfas, los implantes se retiraron, se fijaron y se tineron con el anticuerpo fluorescente a-CD31. Los vasos sangumeos que se habfan infiltrado en los implantes se dimensionaron y se hizo su recuento con un microscopio. Las desviaciones estandar fueron un 12-30% del promedio de recuentos/campo. Se sometieron a ensayo 2 dosis de tejido despues de cada etapa de procesamiento. No se encontraron celulas CD31+ humanas.

La Figura 12 resume los datos relacionados con la infiltracion de diversos tamanos de vasos despues de los implantes de tejido microvascular que tienen varios numeros de celulas y que se procesaron de diferentes maneras. El Matrigel dio como resultado aproximadamente 35 vasos por campo, la mayona de los cuales eran pequenos. El implante de tejido microvascular liofilizado con aproximadamente 50.000 celulas proporciona un aumento de la infiltracion, con una generacion mas robusta de vasos de tamano mediano. El implante de tejido microvascular liofilizado con aproximadamente 500.000 celulas de como resultado una generacion de vasos aun mayor, con un aumento esencial en el numero de vasos de gran diametro. El implante de tejido microvascular liofilizado/esterilizado con aproximadamente 50.000 celulas dio como resultado un aumento en el numero de vasos en comparacion con el control, con cierta generacion de vasos grandes. El implante de tejido microvascular liofilizado/esterilizado con aproximadamente 500.000 celulas dio como resultado una generacion de vasos significativa, aproximadamente dos veces mayor que el control. De forma interesante, en comparacion con la dosis de 50.000 celulas, el numero de celulas mas grande, a pesar de la viabilidad de casi cero, proporciona un numero de vasos de diametro grande. Por lo tanto, parece que la administracion de tejido microvascular procesado, ya fuera liofilizado o liofilizado/esterilizado, estimula la formacion de vasos de mayor diametro. Estos datos respaldan aun mas la capacidad del tejido microvascular para aumentar la migracion y/o formacion de vasos sangumeos, que es un aspecto importante en la reparacion del tejido. Ademas, en varias realizaciónes, la generacion de vasos sangumeos de diversos tamanos garantiza que no solo haya una capacidad adecuada para transportar sangre desde las ramas principales del sistema circulatorio hasta el tejido diana (gran diametro), sino que la sangre se pueda distribuir de manera eficaz en todo el tejido diana, incluso a partes interiores (vasos medianos y pequenos).

Tomados en conjunto, estos datos indican que el tejido microvascular tiene la capacidad de inducir angiogenesis tanto in vitro como in vivo. Como tal, el tejido microvascular es un mecanismo muy atractivo mediante el cual se puede establecer reparacion y/o regeneracion tisular, basandose en su capacidad para mejorar la angiogenesis, lo que facilitara y/o mantendra la reparacion y/o regeneracion tisular al garantizar un suministro adecuado de sangre y flujo de nutrientes/oxigeno.

Ademas, el tejido microvascular se evaluo por su capacidad para mejorar la reparacion de hueso y cartflago. Con respecto a un hueso, se perforaron defectos de tamano cntico de 8 mm x 2 cm en la metafisis distal de cabras maduras. Los armazones tisulares (BIOFIBER, Tornier) se enrollaron firmemente y se insertaron solo en los defectos, incluyendo el tejido microvascular (volumen de 1 ml, ~106 celulas). Las celulas se cargaron simplemente anadiendo 1 ml de agua al vial, agitando brevemente, luego anadiendo mediante goteo el contenido en un armazon y esperando 5 min para que se uniera. A las 12 semanas, los defectos se sometieron a ensayos de compresion y se descalcificaron para histologfa.

Las Figuras 13A-13C muestran datos relacionados con la reparacion de defectos oseos. La Figura 13A muestra la resistencia, modulo elastico y dureza de hueso reparado en comparacion con el control contralateral. El uso del armazon solo dio como resultado el hueso danado con aproximadamente un 20 % de la resistencia y modulo elastico del puesto de control, y practicamente un 50 % de la dureza del hueso de control. Cuando el armazon se suplemento con un tejido microvascular liofilizado/esterilizado, cada uno de resistencia, modulo elastico y dureza aumento con respecto al armazon solo. Por lo tanto estos datos indican que el uso de tejido microvascular facilita la reparacion del dano al hueso. Las Figuras 13B y 13C, muestran histologfa representativa de huesos tratados con el armazon solo y huesos tratados con el armazon suplementado con tejido microvascular. La Figura 13B (armazon solo) muestra una cierta formacion inicial de osteofitos en la union entre el hueso y el armazon de fibra que se puso dentro del defecto. Esto sugiere que el armazon de fibra establece al menos una cierta reparacion del hueso, tal como se pone en evidencia con los datos de la Figura 13 A. En la Figura 13C, la histologfa sugiere que la adicion del tejido microvascular liofilizado/esterilizado dio como resultado una buena formacion de hueso en los bordes del armazon. Por lo tanto, dentro del mismo periodo de tiempo, tejido microvascular facilita la formacion de hueso, en lugar del precursor desmineralizado para hueso. Esto sugiere que el uso de tejido microvascular en conjunto con un armazon puede acelerar el proceso de curacion.

Con respecto a la reparacion del cartflago, se perforaron defectos de tamano cntico de 4 mm x 7 mm en el cartflago en el surco medular troclear de las cabras maduras. Los defectos teman aproximadamente 1 mm de profundidad, y es un poco mas profundo que el cartflago. Los armazones de tejido (BIOFIBER, Tornier) solos o suplementados con tejido microvascular liofilizado/esterilizado (~106 celulas) se ajustaron a los defectos y se mantuvieron en el lugar con una sutura de nailon 7-0 en cada esquina. Despues de 3 meses los defectos se examinaron histologicamente. Estos datos se muestran en las Figuras 14A-14H. Las Figuras 14A-14D muestran datos del armazon solo, mientras que las Figuras 14E-14H muestran datos del armazon suplementado con tejido microvascular. La Figura 14A muestra una vista macroscopica del Armazon sobre el cartflago previamente danado, mientras que la Figura 14E muestra la misma vista para el armazon suplementado con tejido microvascular. Ambos grupos de tratamiento mostraron evidencias de reparacion. Las Figuras 14B y 14F muestran tincion del cartflago con hematoxilina y eosina. El uso del armazon que incluye tejido microvascular mostro una mejora del relleno en los margenes de llenado en comparacion con el uso del armazon solo. Las Figuras 14C y 14G muestran tincion con safranina O, y desvelan un mayor grado de proteoglicanos y retencion en los defectos tratados con tejido microvascular. Las Figuras 14D y 14H muestran tincion de los defectos con azul de toluidina, y desvelan que la matriz de cartflago recien generada se tine mas como cartflago maduro cuando se uso tejido microvascular para tratar el defecto. En conjunto, estos datos, al igual que en los experimentos anteriores con huesos, confirmaron que el tejido microvascular facilita la reparacion del cartflago.

Tambien se realizaron experimentos para evaluar la capacidad del tejido microvascular para reparar el tendon. Los tendones de Aquiles de rata se expusieron y se erosionaron con pinzas con dientes de raton. Los controles fueron operados de la misma manera. Un grupo de ratas se trato con armazon solo y otro con armazon suplementado con tejido microvascular liofilizado/esterilizado. Las ratas se sacrificaron para qPCR, histologfa e inmunohistoqmmica despues de 7 dfas. El grupo de Armazon recibio un Armazon de BIOFIBER-CM de 4 mm X 7 mm en la superficie anterior del tendon Aquiles. El armazon se cargo con 106 celulas microvasculares en el tejido microvascular y en el grupo de tratamiento. Los datos de control se muestran en las Figuras 15A (tincion con tricromo de Masson) y 15B (inmunohistoqmmica con tenascina). Los datos para el grupo de armazon se muestran en las Figuras 15C y 15D. La tincion con tricromo de Masson (Figura 15C) desvelo pequenos bolsillos de colageno denso en y alrededor del armazon, lo que indica reparacion inicial del tendon. De forma analoga, la tincion inmunohistoqmmica con tenascina (Figura 15D) desvelo aumentos en la expresion en el margen entre el tendon y el armazon implantado, lo que nuevamente sugiere una reparacion inicial del defecto.

Los datos para el grupo microvascular del tejido se muestran en las Figuras 15E y 15F. La tincion con tricromo de Masson (15E) desvelo una formacion esencial de colageno denso en y alrededor del armazon, lo que indica una reparacion del defecto considerable. De forma analoga, la tincion inmunohistoqmmica con tenascina desvelo una amplia expresion entre el tendon y el armazon implantado. Estos datos tambien son indicativos de una reparacion significativa del defecto.

Tomados en conjunto, los datos presentados en estos experimentos establecen que el tejido microvascular es capaz, no solamente de angiogenesis (que desempena un papel importante en el establecimiento y mantenimiento del suministro sangmneo a un tejido diana), sino que tambien son capaces de aumentar la reparacion de hueso, cartflago, y tendon. En varias realizaciónes, el aumento de la angiogenesis, al menos en parte, desempene un papel en la capacidad del tejido microvascular para dar como resultado la generacion y mantenimiento de tejido nuevo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composicion que comprende tejido microvascular procesado,

en la que el tejido microvascular procesado comprende celulas multipotentes aisladas o una membrana celular obtenida a partir de o derivada de celulas multipotentes o del tejido microvascular,

en la que la composicion tiene actividad angiogenica o antiinflamatoria,

en la que la composicion se esteriliza mediante irradiacion y los virus dentro de la composicion se inactivan, y en la que la esterilizacion por irradiacion se realiza por exposicion de la composicion a radiacion gamma o radiacion de haz electronico a una dosificacion en el intervalo de 0,5 Mrad a 5,0 Mrad.

2. La composicion de la reivindicación 1, en la que las celulas o tejidos no se han cultivado.

3. La composicion de la reivindicación 1, en la que una cantidad inferior o igual a un 50 % de las celulas presentes en la composicion son viables.

4. La composicion de la reivindicación 1, en la que la composicion retiene una actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable cuando se almacena aproximadamente a temperatura ambiente durante al menos un mes.

5. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composicion se seca, se liofiliza o se crioconserva.

6. La composicion esterilizada de la reivindicación 1, en la que la composicion no comprende ninguna celula viable.

7. Un recipiente impermeable a la humedad que comprende la composicion de la reivindicacion 1, en el que la composicion retiene una actividad angiogenica o antiinflamatoria mensurable cuando se almacena aproximadamente a temperatura ambiente durante al menos un mes y en el que la composicion se seca.

8. El recipiente impermeable a la humedad de la reivindicación 7, en el que:

(a) las celulas o tejidos no se han cultivado; o

(b) una cantidad inferior o igual a un 50 % de las celulas presentes en la composicion son viables.

9. Una composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6 para uso en el tratamiento o la prevencion de una lesion o enfermedad, o para estimular la regeneracion tisular, en un mairnfero.

10. La composicion para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la composicion es adecuada para implante quirurgico en el marnffero.

11. La composicion para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la composicion es adecuada para administracion intravenosa al mamffero.

12. La composicion para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la composicion es adecuada para administracion topica.

13. La composicion para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la composicion es adecuada para tratamiento de una lesion y en la que la lesion esta presente en un tendon, un ligamento, piel, un hueso, un cartflago, un disco, o tejido microvascular.

14. La composicion para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la composicion es adecuada para tratamiento de una enfermedad y en la que la enfermedad es artritis.