ES2526523T3 - Andamio con base de fibrina, preparación y uso del mismo - Google Patents

Abstract

Un andamio con base de fibrina capaz de mantener una población de células introducidas en el andamio que comprende una concentración inicial de células de al menos 1 x 106 células/ml andamio de células madre mesenquimales (CMM) y/o células derivadas de tejido del cordón umbilical (CTU) donde el andamio se forma con un componente de fibrinógeno que comprende fibrinógeno con una concentración final superior a 17,5 mg/ml andamio, comprendiendo el andamio CTU, CMM introducidas o una combinación de las mismas en un rango de concentración inicial de 1 x 106 a 6 x 106 células/ml andamio, donde el andamio de fibrina está sustancialmente libre de inhibidores de proteasa añadidos, y donde el andamio que comprende CMM y/o CTU introducidas es para uso en el aumento de vascularización.

Description

Andamio con base de fibrina, preparación y uso del mismo

Campo de la invención

La invención se refiere a un andamio con base de fibrina adecuado para terapia celular

Antecedentes de la invención

En los últimos años se han desarrollado numerosas terapias utilizando una variedad de células madre, que son el elemento clave de una nueva especialidad emergente llamada medicina regenerativa. La medicina regenerativa tiene el potencial de emplear células madre de fuentes de embriones o de adultos para proporcionar terapias celulares de sustitución en condiciones genéticas, malignas y degenerativas.

Los estudios relacionados con la medicina regenerativa se han desarrollado en dos direcciones principales: estudios dirigidos hacia la regeneración de células o tejidos usando administración exógena de factores biológicos o químicos tales como factores del crecimiento para inducir regeneración endógena de un tejido o un órgano entero dañado (por ejemplo, uso de administración de FCEV para la inducción de nuevos vasos sanguíneos); y estudios sobre la reposición de tejido u órganos enteros dañados mediante células exógenas y trasplante de células madre (tales como trasplante de médula ósea), incluyendo células sembradas en varios andamios que mejoran el injerto de las células in vivo, la curación de heridas, y la reparación de la piel u órganos dañados por operaciones quirúrgicas (Hunt NC, Grover LM. Biotechnol Lett. 2010 Junio; 32(6):733-42; Spotniz WD. World J Surg. 2010 Abr; 34(4):632-4). En medicina regenerative, las “células” y el “andamio” se usan en combinación para la regeneración de un tejido. Típicamente, los materiales del andamio tienen dos características; son biocompatibles, por lo que los materiales no dañan un cuerpo vivo, y son bioabsorbibles, por lo que los materiales se descomponen y absorb3en en el cuerpo vivo cuando se forman nuevos tejidos vivos (Uibo R, Laidmäe I, Sawyer ES, Flanagan LA, Georges PC, Winer JP, Janmey PA. Biochim Biophys Acta. 2009 Mayo; 1793(5):924-30). Algunos materiales biológicos tienen ambas características y pueden usarse como andamio en regeneración de tejidos (Chajra H, Rousseau CF, Cortial D, Ronzière MC, Herbage D, Mallein-Gerein F, Freyria AM. Biomed Mater Eng. 2008; 18(1 Supl):S33-45).

Durante la inyección o trasplante de célula se pueden restauran de manera eficiente áreas de daños, pero se requiere la reconstrucción del daño severo del tejido dañado, por ejemplo el daño resultante de bloqueo vascular, una terapia extensiva con numerosas células endoteliales. La eficiencia de la terapia celular puede mejorar manteniendo células endoteliales en un sitio objetivo durante un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo. Se han presentado estudios sobre la retención de células dentro de marcos musculares que indican un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo de 4 días o más (Peirce SM, Skalak TC Microcirculation. 2003 Enero; 10(1):99111).

Timothy P. Martens, et al., Cell Transplant. 2009; 18(3) 297-304; Nakamuta JS et al., PloS One. 2009 Junio 23; 4(6):e6005, Christmas KL et al., J Am Coll Cardiol. 2004 Agosto 4; 44(3):654-60, y otros probaron que la implantación de células directamente en el músculo es ineficiente. Estos estudios demostraron que las células implantadas rápidamente se despejan del sitio de implantación o mueren aproximadamente 24 horas después de la implantación. Típicamente, las células usadas para implantación son células madre capaces de liberar factores de crecimiento/citoquinas beneficiosos. Sin embargo, en vista de lo anterior, la inyección de células directamente en el sitio de implantación no pueden permitir la liberación de factores de crecimiento y citoquinas en el sitio del implante durante un periodo prolongado de tiempo. Estos estudios también demostraron que la administración de células introducidas en polímeros de varios tipos puede ayudar en gran medida a retener las células en el sitio de implantación.

El despeje rápido de las células del sitio de implantación y/o muerte de las células puede atribuirse a uno o más de los siguientes factores: flujo sanguíneo o fluidos corporales que eliminan las células del sitio de implantación, escasez de nutrientes tales como factores de crecimiento, pH inadecuado, falta de oxígeno en el área herida, reacción inmune innata (complemento) y actividad de fagocitos del sistema inmune (Guo S, Dipietro, LA J Dent Res. 2010 Marzo; 89(3):219-29). El despeje rápido de células inyectadas estimuló el desarrollo de un andamio adecuado que puede fijar las células al sitio de inyección y mantener la viabilidad de las células durante los primeros días para que las células puedan efectuar su efecto trófico en el área isquémica, entre otros, liberando niveles beneficiosos de factores de crecimiento/citoquinas durante un periodo prolongado de tiempo. Cuando el área herida se cura y el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) está en proceso, un proceso que tarda de unos días a 2 semanas (Guo S, Dipietro LA J Dent Res. 2010 Marzo; 89(3):219-29), la habilidad de las células para liberar citoquinas de una manera prolongada localmente, por ejemplo, en el sitio de isquemia, es importante para una curación eficiente (Guo S, Dipietro LA J Dent Res. 2010 Marzo; 89(3):219-29).

Se han usado varios materiales biológicos como andamios celulares para implantación de células. Entre estos materiales están colágeno, gelatina, elastina, ácido hialurónico, alginato, quitosano y fibrina (Hunt NC, Grover LM Biotechnol Lett. 2010 Junio; 32(6):733-42).

El material de andamio que sostiene las células de manera ventajosa cumple varios criterios importantes.

Por ejemplo, el material es biocompatible, para no ser tóxico ni perjudicial, y no causar rechazo inmunológico. También, el material es biodegradable. De manera importante, el andamio tiene la habilidad de soportar, durante un periodo suficiente de tiempo, su degradación dentro del medio corporal. Por ejemplo, un periodo suficiente de tiempo es un tiempo que permite que las células dentro del andamio ejerzan una liberación prolongada y local de factores de crecimiento/citoquinas. El fibrinógeno es una proteína soluble encontrada en el plasma sanguíneo de todos los vertebrados. Cuando el fibrinógeno y el Factor XIII contactan mediante trombina, una enzima proteolítica, el fibrinógeno se convierte en monómeros de fibrina y el Factor XIII se activa con el Factor XIIIa. El Factor XIIIa después polimeriza el monómero de fibrina para formar un polímero red de fibrina estabilizada. Tal red es esencial en el proceso de curación de cierre de heridas y adhesión de tejidos. La red sirve como un material de adhesión física y como un andamio para células epiteliales o células inmunológicamente activas que migran a la herida y contribuyen a la regeneración y reparación de tejidos o a la defensa contra patógenos invasores. Finalmente, la red de fibrina se disuelve gradualmente por el cuerpo (un proceso llamado fibrinólisis en ocasiones).

Los selladores de fibrina se usan ampliamente en escenarios quirúrgicos para facilitar hemostasia y para reducir el sangrado operativo y post-operativos cuando otros métodos quirúrgicos mecánicos son inapropiados. Se usan por ejemplo durante cirugía de hígado tal como extirpación de hígado y cirugía de sustitución de rodilla y cadera. En el presente, el sellador de fibrina comercial se usa mucho en varios tipos de operaciones quirúrgicas para parar el sangrado. Además, se han presentado un gran número de técnica que emplean el uso de tal sellador de fibrina como un andamio biológico en medicina regenerativa (cell Transplantation, 7, 309-317, 1998; y Burn, 24, 621630, 1998).

Típicamente, los selladores de fibrina consisten en dos componentes derivados de plasma humano: por ejemplo, (a) un mezcla de fibrinógeno muy concentrada compuesta principalmente por fibrinógeno junto con cantidades catalítica de Factor XIII y (b) una trombina de alta potencia. Generalmente, el coágulo (o gel de fibrina) formado después de mezclar los dos componentes se adhiere correctamente a las superficies de la herida y el tejido, lo que lleva a un efecto adhesivo y hemostático (Patente de Estados Unidos Nº 7.241.603).

Los geles de fibrina han demostrado inducir crecimiento y diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales introducidas (CMM), dependiendo de la concentración de FC y trombina presentes en la matriz (Catelas et al., Tissue Eng 12:2385-2396, 2006).

Una publicación más reciente indica que las características de los hidrogeles de fibrina pueden optimizarse para mantener un tipo específico de células para la regeneración de un tejido deseado (Tamer et al., Tissue Eng 14: 1-17, 2008).

Por lo tanto, hay una necesidad no cubierta de un andamio con base de fibrina capaz de fijar un tipo específico de células en un sitio de implantación, por ejemplo, una región isquémica o cercana a un infarto, durante un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo para facilitar la formación de vasos sanguíneos.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a un andamio con base de fibrina capaz de mantener una población de células introducidas en el andamio que comprenden al menos 1 x 106 células/ml andamio de células madre mesenquimales (CMM) y/o células derivadas de tejido del cordón umbilical de mamíferos (CTU) donde el andamio se forma con un componente de fibrinógeno que comprende fibrinógeno con una concentración final superior a 17,5 mg/ml andamio.

El andamio comprende CTU, MSC introducidas o una combinación de las mismas en un rango de 1 x 106 células/ml a 6 x 106 células/ml andamio, donde el andamio con base de fibrina está sustancialmente libre de inhibidores de proteasa añadidos, y donde el andamio que comprende CMM y/o CTU introducidas es para uso en el aumento de la vascularización.

En otra realización de la invención, el componente de fibrinógeno se deriva de la sangre.

En otra realización más de la invención, el andamio está sustancialmente libre de plasmina y/o plasminógeno.

En otro aspecto, el producto es para su uso en un método para aumentar la vascularización en una región limitada de un sujeto que lo necesite que comprende la administración a la región o la formación en la región de un andamio de acuerdo con la invención que comprende CTU y/o CMM introducidas.

En una realización de la invención, la región es isquémica, dañada o comprende un tejido (o por ejemplo tejido muscular) u órgano trasplantado.

En otro aspecto, el producto es para su uso en un método para tratar una herida que comprende la administración o formación próxima a la herida de un andamio de acuerdo con la invención que comprende CTU y/o

MSC introducidas.

En una realización de la invención, el andamio es capaz de mantener las células en la región o próximas a la herida durante una periodo de tiempo terapéuticamente efectivo (por ejemplo, 4 días o más).

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para formar un andamio para uso en el aumento de la vascularización, comprendiendo dicho método las etapas de: proporcionar un componente de fibrinógeno; proporcionar un componente de enzima proteolítica que sea capaz de formar fibrina cuando reaccione con fibrinógeno; proporcionar una población de células que comprenden CMM y/o CTU; y mezclar el fibrinógeno, la enzima proteolítica y las células, donde el andamio formado comprende al menos 1 x 106 células/ml andamio CMM y/o CTU y donde el componente de fibrinógeno usado para formar el andamio está en una concentración final superior a 17,5 mg/ml andamio, donde la concentración de CTU y/o CMM está en el rango de 1 x 106 a 6 x 106 células/ml andamio, y los componentes están sustancialmente libres de inhibidores de proteasa añadidos.

En una realización más de la invención, el fibrinógeno se deriva de la sangre y está sustancialmente libre de plasmina y/o plasminógeno.

En un aspecto, la invención proporciona un kit para su uso en el aumento de la vascularización que comprende:

(i) al menos dos recipientes separados que comprenden componentes requeridos para formar un andamio de fibrina, el al menos un recipiente separado comprende un componente de fibrinógeno que tiene una concentración final de fibrinógeno superior a 17,5 mg/ml andamio formado, y el al menos segundo recipiente separado comprende un componente de enzima proteolítica que es capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinógeno; y (ii) CMM y/o CTU en una concentración de al menos 1 x 106 a 6 x 106 células/ml andamio formado, donde los componentes están sustancialmente libres de inhibidores de proteasa añadidos.

El andamio de acuerdo con la invención puede usarse para aumentar la vascularización en una región limitada y/o para tratar una herida.

Breve descripción de los dibujos

Las Figs. 1A-1E muestran imágenes de contraste de fases representativas de CEVUH en las diferentes concentraciones de fibrinógeno usadas para prepara el andamio de fibrina: 1 (A), 10 (B), 30 (C), 50 (D) o 70 (E) mg/ml (la concentración final de fibrinógeno después de la mezcla de los dos componentes fuer la mitad, esto es, 0,5, 5, 15, 25 o 35 mg/ml).

Las Figs. 2A-2E muestran imágenes de contraste de fases representativas de células derivadas de tejido del cordón umbilical humano (CTUh) en las diferentes concentraciones de fibrinógeno usadas para prepara el andamio de fibrina: 1 (A), 10 (B), 30 (C), 50 (D) o 70 (E) mg/ml (la concentración final de fibrinógeno después de la mezcla de los dos componentes fuer la mitad, esto es, 0,5, 5, 15, 25 o 35 mg/ml).

Las Figs. 3A-3E muestran imágenes de contraste de fases representativas de CMM en las diferentes concentraciones de fibrinógeno usadas para prepara el andamio de fibrina: 1 (A), 10 (B), 30 (C), 50 (D) o 70 (E) mg/ml (la concentración final de fibrinógeno después de la mezcla de los dos componentes fuer la mitad, esto es, 0,5, 5, 15, 25 o 35 mg/ml).

Las Figs. 4A-4C muestran imágenes de contraste de fases con microscopio representativas (obtenidas en un aumento X20) de procesos celulares (flecha rayada) y estructura de tipo vaso (flecha continua) de CTUh que crecieron dentro de un andamio de fibrina formado a partir de 50 mg/ml (25 mg/ml finales) de fibrinógeno y 20 UI/ml (10 UI/ml finales) de trombina. La figura se tomó después de 2 (B) y 6 (C) días de cultivo en el andamio. La Fig. 4A muestra una foto representativa de CTUh que creció en monocapa.

Las Figs. 5A-5C muestran el número medio de procesos celulares formados por campo (1000 x 1000 micrones) cuando CEVUH (A), CTUh (C), y CMM (B) se cultivaron en el andamio de fibrina fomraod al aumentar las concentraciones de fibrinógeno (1-70 mg/ml; 0,5-35 mg/ml finales).

Las Figs. 6A-6C muestran la longitud media de los procesos adquiridos en CEVUH (A), CTUh (C), y CMM

(B) se cultivaron en el andamio de fibrina formado al aumentar las concentraciones de fibrinógeno (1-70 mg/ml; 0,535 mg/ml finales).

Las Figs. 7A-7C muestran el nivel de concentración de dímero-D en el medio de CEVUH, CMM y CTU y cultivadas 1 (A) y 7 (B) días en andamio de fibrina formado al aumentar las concentraciones de fibrinógeno (y en andamio de fibrina sin células como control).

Las Figs. 9A-9D muestran el número de CMM presentes en el músculo inyectado después de 1 día (A, C) y 4 días (B, D) de inyección de fibrina + células {formadas con 17,5 mg/ml finales de fibrinógeno (A) (B)] o 25 mg/ml

finales de fibrinógeno (C) (D)} o inyección de solución salina + células. El número contado de células en la extremidad inyectada con fibrina + células o en la extremidad inyectada con solución salina + células se dividió entre el número de células contadas en la extremidad inyectada con solución salina + células el mismo día, para obtener una proporción de células en cada extremidad.

La Fig. 10 muestra el efecto de inhibidores de proteasa añadidos (ácido tranexámico o aprotinina) en la longevidad del coágulo de fibrina in vivo. Se analizaron tres composiciones diferentes de sellador de fibrina: grupo 1

–

sin inhibidor de proteasa añadido; grupo 2 – con ácido tranexámico; y grupo 3 – con aprotinina. Las tres composiciones se aplicaron a un defecto creado en una pared muscular abdominal de una rata. Los animales en los diferentes grupos se sacrificaron 1, 3, 5, 7, 9 y 11 días después del inicio del experimento y se midió el peso del coágulo.

La Fig. 11 muestra el efecto de inhibidores de proteasa añadidos (ácido tranexámico y aprotinina) en la longevidad del coágulo de fibrina in vivo. Se analizaron tres composiciones diferentes de sellador de fibrina: grupo 1

–

sin inhibidor de proteasa añadido; grupo 2 – con ácido tranexámico; y grupo 3 – con aprotinina. Las tres composiciones se aplicaron a un defecto creado en una pared muscular abdominal de una rata. Los animales en los diferentes grupos se sacrificaron 1, 3, 5, 7, 9 y 11 días después del inicio del experimento y se midió la cantidad de proteína coagulable.

Descripción detallada de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a un andamio con base de fibrina adecuado para terapia celular. El andamio de fibrina de la invención es capaz de mantener o fijar CTU y/o CMM introducidas en un sitio de implantación durante un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo. En particular, el andamio de fibrina de la invención que comprende las células introducidas es capa de facilitar la formación de vasos sanguíneos en un sitio de implantación dado de un sujeto. El andamio de fibrina de la invención está formado con un componente de fibrinógeno que comprende fibrinógeno con una concentración final superior a 17,5 mg/ml andamio. En particular, el andamio de fibrina de la invención es capaz de mantener una población de célula que comprende células madres mesenquimales (CMM) y/o células derivadas de tejido de cordón umbilical (CTU) sembradas en una concentración de al menos 1 x 106 células/ml andamio.

Sorprendentemente se descubrió de acuerdo con la presente invención que CMM y CTU requieren in vitro una concentración determinada de fibrinógeno con el fin de sostener la formación de un andamio de tejido tridimensional para obtener estructuras tridimensionales de tipo vaso. Más específicamente, se descubrió de acuerdo con la presente invención que CMM y UTC cultivadas in vitro necesitan una concentración de fibrinógeno final de al menos 15 mg/ml andamio mientras que en el caso de otros tipos de células, por ejemplo CEVUH o células madre CD34+ (véase WO2010/006219) pueden usarse concentraciones menores de fibrinógeno tales como 0,5 y 12,5 mg/ml andamio.

Sin estar ligado al mecanismo, parece que CTU y CMM tienen un alto nivel capacitivo de degradación de fibrina, en comparación con CEVUH, probablemente como resultado de un mayor nivel de actividad enzimática fibrinolítica en las células anteriores. De este modo, es beneficioso usar andamios con base de fibrina formados con algo contenido de fibrinógeno de hasta aproximadamente 50 mg/ml (concentración de fibrinógeno final) cuando se siembran CTU y/o CMM en los andamios, para obtener andamios de fibrina tridimensionales de larga duración.

También se descubrió que el rango de concentración inicial óptimo de siembra celular en el andamio de fibrina es más riguroso en CMM y CTU en comparación con otras células (por ejemplo, CEVUH) y es crucial para la habilidad de CMM Y CTU para crecer y proliferar en el andamio de fibrina.

En un escenario in vivo, se descubrió que un andamio de fibrina formado con un componente de fibrinógeno en una concentración superior a 35 mg/ml (17,5 mg/ml finales) permitió la formación de un andamio que fija las células al tejido muscular inyectado durante un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo y de este modo puede usarse ventajosamente en ingeniería de tejidos. Digno de mención, se descubrió que la adición de inhibidores de proteasa a andamios de fibrina solos no puede prolongar la longevidad del andamio in vivo incluso en ausencia de células introducidas. De este modo, cuando se usan andamios de fibrina que comprenden CTU y/o CMM cultivadas en un escenario in vivo se requiere una mayor concentración de fibrinógeno que en un escenario in vitro (superior a 17,5 mg/ml andamio para in vivo en comparación con al menos 15 mg/ml andamio para condiciones in vitro). Los términos “con base de fibrina” significan que el componente principal del andamio es fibrina pero otros componentes tales como componentes de sangre o plasma (por ejemplo, factores de crecimiento, factores de cascada de coagulación, albúmina, inmunoglobulinas, fibronectina, etc.) pueden estar presentes en el andamio también. El término “andamio” se refiere generalmente a una estructura red tridimensional que es capaz de mantener o fijar células introducidas durante un tiempo, por ejemplo, durante un periodo de aproximadamente 4 días

o más, por ejemplo, durante 5, 6, 7, 8, 9, 10 días o así, en el sitio de la implantación.

Los términos “capaz de sostener células”, “capaz de mantener células” o “capaz de fijar células” como aquí se usan indican la capacidad para sostener o retener las células en una localización específica deseada. A menudo,

estos términos también indican la capacidad de facilitar el crecimiento, proliferación y/o diferenciación de las células.

Los términos “andamio de fibrina”, “matriz de fibrina”, “sellador de fibrina”, “pegamento de fibrina” y “coágulo de fibrina” se usan aquí intercambiablemente y se refieren a una red tridimensional formada a partir de al menos un componente de fibrinógeno que comprende fibrinógeno y un componente de enzima proteolítica que es capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinógeno, por ejemplo, trombina y/o una solución obtenida de veneno se serpiente. En una realización de la invención, la enzima proteolítica es trombina. El andamio de fibrina de la invención se forma con al menos 17,5 mg/ml concentración final de fibrinógeno tal como fibrinógeno que tiene una concentración final de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 50 mg/ml andamio. En una realización de la invención, la concentración final de fibrinógeno es aproximadamente 25 mg/ml. En otra realización de la invención, la concentración final de fibrinógeno es aproximadamente 35 mg/ml. Como aquí se usan, los términos “concentración final” se refieren a la concentración de fibrinógeno después de combinar todos los componentes usados para formar el andamio.

Los componentes de fibrinógeno y/o trombina pueden prepararse a partir de una composición de sangre inicial. La composición de sangre puede ser sangre total o fracciones de sangre, esto es, una fracción de sangre total tal como plasma. El origen del fibrinógeno y trombina puede ser autólogo por lo que podrían fabricarse a partir de la propia sangre del paciente, de sangre agrupada o fracciones. También es posible que parte o todos los componentes de la proteína usados para formar el andamio se preparen mediante métodos recombinantes.

En una realización de la invención, el componente de fibrinógeno comprende un componente biológicamente activo (CBA) que es una solución de proteínas derivadas de plasma sanguíneo que además comprenden agentes anti-fibrinolíticos tales como ácido tranexámico y/o estabilizadores tales como arginina, lisina, sus sales farmacéuticamente aceptables o mezclas de los mismos. CBA puede derivarse de crioprecipitado, en particular crioprecipitado concentrado. El término “crioprecipitado” se refiere a un componente sanguíneo que se obtiene de plasma congelado preparado a partir de sangre total, plasma recuperado o de plasma fuente que se recoge mediante plasmaféresis. Un crioprecipitado puede obtenerse cuando plasma congelado se descongela lentamente en frío, típicamente a una temperatura de 0-4 ºC, dando como resultado la formación de precipitado que contiene fibrinógeno y factor XIII. El precipitado puede recogerse, por ejemplo, mediante centrifugación y disolverse en un tampón adecuado tal como un tampón que contenga 120 mM cloruro de sodio, 10 mM citrato disodio, 120 mM glicina, 95 mM hidrocloruro de arginina, 1 mM cloruro de calcio. La solución de CBA puede comprender factores adicionales tales como por ejemplo factor VIII, fibronectina, factor de von Willebrand (FvW), vitronectina, etc., por ejemplo, como se describe en US 6.121.232 y WO9833533. La composición del CBA puede comprender estabilizadores tales como ácido tranexámico e hidrocloruro de arginina. La cantidad de ácido tranexámico en la solución de CBA puede ser desde aproximadamente 80 a aproximadamente 110 mg/ml. La cantidad de arginina puede ser desde aproximadamente 15 a aproximadamente 25 mg/ml.

Opcionalmente, la solución se amortigua a un valor pH fisiológico compatible. El tampón puede estar compuesto por glicina, citrato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de calcio y agua para inyección como un vehículo. La glicina puede estar presente en la composición en la cantidad de desde aproximadamente 6 a aproximadamente 10 mg/ml, el citrato de sodio puede estar en el rango de desde aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mg/ml, el cloruro de sodio puede estar en el rango de desde 5 a aproximadamente 9 mg/ml y el cloruro de calcio puede estar en la concentración de aproximadamente 0,1-0,2 mg/ml.

En una realización de la invención, el componente de fibrinógeno se deriva de la sangre, por ejemplo, composición CBA. En otra realización de la invención, la concentración de plasminógeno y/o plasmina en el componente derivado de la sangre se reduce y el andamio de fibrina está sustancialmente libre de plasmina y/o plasminógeno. La eliminación de plasmina y plasminógeno del componente derivado de la sangre puede realizarse como se describe en US 7.125.569 y WO02095019.

“Un andamio de fibrina sustancialmente libre de plasmina y/o plasminógeno” se refiere, por ejemplo, a un andamio que comprende un nivel de plasminógeno y/o plasmina que es igual a o menor a 15 µg/ml.

La presente invención también proporciona un kit que comprende recipientes que comprenden (i) al menos dos recipientes separados requeridos para formar un andamio de fibrina, el al menos un recipiente separado comprende fibrinógeno que tiene una concentración final de fibrinógeno superior a 17,5 mg/ml andamio formado, y el al menos segundo componente separado comprende una c enzima proteolítica que es capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinógeno (por ejemplo, trombina); y (ii) células CMM y/o CT en una concentración de al menos 1 x 106 células/ml andamio formado. El kit también puede contener instrucciones para su uso por parte del médico, el profesional de atención sanitaria y/o el paciente. Los recipientes pueden ser viales o jeringas precargadas. Los componentes pueden proporcionarse en el kit como una solución o en una forma sólida, por ejemplo, como polvo liofilizado. El polvo liofilizado puede reconstituirse con transportadores. El recipiente puede ser de diferentes tamaño y contener diferentes volúmenes de los componentes, por ejemplo, los componentes pueden tener un volumen igual o inferior a 5 ml, por ejemplo, aproximadamente 3, 2, 1,5 o 1 ml. El kit también puede contener un vial separado del transportador. Los componentes pueden mezclarse en cualquier rango deseado de proporciones. Por ejemplo, cuando la concentración del fibrinógeno en la composición que comprende fibrinógeno es

aproximadamente 800-1200 UI/ml, los dos componentes pueden mezclarse en una proporción de 1:1. En una realización, la concentración de fibrinógeno en el componente que comprende fibrinógeno está en el rango de 50-90 mg/ml. Las células pueden incluirse en el recipiente de enzima proteolítica, en el recipiente de fibrinógeno y/o pueden estar en un recipiente separado. Opcionalmente, un dispositivo para aplicación también puede estar incluido en el kit. Los componentes y las células del kit pueden mantenerse congelados hasta su uso.

Los resultados obtenidos indican que la adición de inhibidor de proteasa tal como ácido tranexámico o aprotinina en la formulación de sellador de fibrina sustancialmente libre de plasmina y/o plasminógeno usada para preparar el andamio de acuerdo con la invención en un escenario in vivo no promovió una longevidad superior de coágulo en comparación con la formulación de sellador de fibrina sin ningún inhibidor de proteasa añadido. Por consiguiente, en una realización de la invención, el andamio de fibrina está sustancialmente libre de inhibidores de proteasa añadidos o agentes antifibrinolíticos, por ejemplo, ácido tranexámico, ácido épsilon aminocaproico (AECA)

o aprotinina. Por ejemplo, el componente de fibrinógeno usado para preparar el andamio de acuerdo con la invención no tiene más de aproximadamente 15 µg/ml ácido tranexámico o ácido épsilon aminocaproico (AECA), o no más de aproximadamente 5 UIK/ml aprotinina.

Los componentes derivados de la sangre típicamente se purifican de partículas infecciosas con el fin de minimizar el riesgo potencial que plantean los patógenos transmitidos por la sangre. El procedimiento de purificación puede realizarse mediante nanofiltración, tratamiento solvente/detergentes, tratamiento con calor tal como, aunque sin limitar, pasteurización, irradiación gamma o UVC (< 280 nm), por cualquier otro método conocido en la técnica o combinaciones de los mismos. Los términos “partícula infecciosa” se refieren a una partícula microscópica, tal como, aunque sin limitarse a, un microorganismo o un prión, que puede infectar o propagarse en células de un organismo biológico. Las partículas infecciosas pueden ser partículas virales. El procedimiento de inactivación viral puede realizarse añadiendo una molécula a la composición o fracción de sangre antes de y/o durante el procedimiento de purificación. Las moléculas añadidas y sus productos pueden eliminarse mediante gravitación, cromatografía de columna y cualquier otro método conocido en la técnica o combinaciones de los mismos.

La eliminación de partículas infecciosas puede realizarse mediante filtración o mediante métodos de absorción selectiva tales como afinidad, intercambio iónico o cromatografía hidrofóbica. Puede realizarse un procedimiento de inactivación viral de múltiples etapas. Por ejemplo, la composición puede someterse a un tratamiento con solvente/detergente, tratamiento con calor, cromatografía selectiva o nanofiltración.

Los términos “inactivación viral” se refieren a la situación en la que los virus se mantienen en la composición pero se vuelven no viables (por ejemplo, disolviendo su capa lípida), así como a la eliminación física de los virus de la composición (por ejemplo, mediante técnicas de exclusión de tamaño).

El “tratamiento con solvente/detergente (S/D)” típicamente se refiere a un proceso que inactiva los virus cubiertos con funda destruyendo su funda lípida. El tratamiento puede realizarse mediante la adición de detergentes (tales como Triton X-45, Triton X-100 o Tween 80) y solventes [tales como triI(n-butil) fosfato (TnBP), di-o trialquilfosfatos]. La combinación de solvente-detergente usada para desactivar virus cubiertos por lípido puede ser cualquier combinación de solvente-detergente conocida en la técnica tal como TnBP y Triton X-100; Tween 80 y colato de sodio y otras. La concentración de los disolventes y detergentes puede se aquella comúnmente usada en la técnica, por ejemplo <0,1% TnBP y >0,1% Triton X-100. Típicamente, las condiciones bajo las que el solventedetergentes desactiva los virus consiste en 10-100 mg/ml de solvente-detergente a un nivel pH que oscila entre 5 y 8, y una temperatura que oscila entre 2 y 37 ºC durante 30 minutos hasta 24 horas. Sin embargo, otras combinaciones de solvente-detergente y condiciones adecuadas serán aparentes para aquella persona versada en la técnica. La mayor parte del solvente-detergente usado en el tratamiento S/D puede eliminarse, por ejemplo, usando columnas de cromatografía talle como columna de cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH), por ejemplo, material de embalaje de sílice C-18 y SDR (eliminación solvente-detergente) HyperD; matrices de adsorción de proteína tales como marices de intercambio iónico; matrices de afinidad; y/o matrices de exclusión por tamaño.

“Tratamiento con calor” típicamente se refiere a un proceso por el que el calor destruya la funda de lípido y los virus sin funda. El “tratamiento con calor” es intercambiable con el término “pasteurización”.

El tratamiento de desactivación con calor puede realizarse a 60 ºC durante 10 horas. Pueden añadirse estabilizadores tales como sacarosa o glicina a la composición durante el tratamiento con calor.

La “nanofiltración” típicamente se refiere a un proceso por el que los virus con funda de lípido y sin funda se excluyen de la mezcla, por ejemplo, usando filtros especiales a escala nanómetro tales como Planova 20N, 35N y 75N; Viresolve/70™, Viresolve/180™.

La composición puede concentrarse mediante un proceso de ultra-filtración. La ultra-filtración puede ir seguida de una diafiltración para intercambiar el tampón. La concentración y diálisis mediante ultrafiltración y diafiltración, respectivamente, pueden realizarse en una etapa o como dos etapas separadas. La diafiltración puede realizarse contra cualquier solución que sea adecuada para administración en humanos.

Los términos “una población de células” se refiere a cualquier tipo de célula originado de cualquier linaje. “Un linaje” de una célula define de qué célula se originan y a que células puede dar origen. Ventajosamente, CTU y/o CMM pueden co-cultivarse con otros tipos de células usando el andamio de la invención. La población de célula que puede combinarse con el andamio de fibrina y CMM y/o UTC puede seleccionarse en base al uso terapéutico planeado. Por ejemplo, en el caso de que el andamio pretenda aumentar la vascularización en condición de isquemia crítica en extremidad para restablecer el flujo sanguíneo en un área afectada, la población celular seleccionada puede ser células musculares y/o célula que pueden originar células musculares. Los términos “célula introducidas en el andamio” se refieren, por ejemplo, a células sembradas o encapsulada en el andamio. Para la formación de céulas introducidas en el andamio, las células pueden incorporarse en un recipiente junto con el componente de fibrinógeno, en otro recipiente junto con el componente de enzima proteolítica o pueden estar en un tercer recipiente como un componente separado, por ejemplo, en un transportador aceptable que sea adecuado para las células y para la aplicación al cuerpo humano o animal. Así, cada uno de los componentes puede aplicarse al sitio o región en cualquier orden, por ejemplo, simultáneamente o uno después de otro y se forma un andamio de fibrina con células introducidas en el sitio o región donde los componentes se mezclan. El andamio de la invención que comprende células introducidas pueden formarse in vivo en la región deseada o ex vivo y después colocarse en la región. Ex vivo incluye cultivo celular in vitro en condiciones de crecimiento estándar útiles para cultivar las células, por ejemplo, un medio adecuado de crecimiento.

El andamio con base de fibrina de acuerdo con la invención es capaz de mantener células madre mesenquimales (CMM) o células derivas de tejido del cordón umbilical (CTU) en una concentración de al menos 1 x 106 células por ml andamio. En una realización de la invención, el andamio comprende células CTU y/o CMM introducidas en una concentración inicial de al menos 1 x 106 células por ml andamio, por ejemplo, una concentración inicial de 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106 por ml andamio y etcétera. En otra realización de la invención, el andamio con CTU y/o CMM introducidas comprende además otros tipos de células. “Una concentración inicial” con respecto a la concentración de CTU y/o CMM introducidas se refiere a la concentración de las células sembradas en el punto temporal en el que se forma el andamio. Sin embargo, la concentración celular puede aumentar conforme avanza el tiempo. Se mostró de acuerdo con la invención que CMM y CTU sembradas en un andamio de fibrina de acuerdo con la invención tienen una capacidad limitada para proliferar y crecer después de una cierta concentración celular y que la concentración celular óptima para la siembra inicial que puede apoyarse en el andamio de fibrina es de hasta 6 x 106 células por ml andamio. De este modo, en ciertas realizaciones de la invención, la concentración final de las CTU y/o CMM introducidas está en el rango de 1 x 106 a 6 x 106 células por ml andamio. En una realización de la invención, el andamio comprende CTU y CMM en el rango de 1 x 106 a 6 x 106 células por ml andamio. Como aquí se usan, los términos “células madre mesenquimales (CMM)” se refieren a célula que pueden dar lugar a un gran número de tipos de tejidos tales como hueso, cartílago, tejido adiposo, tejido conectivo, y vasos sanguinos y linfáticos, por ejemplo, células que pueden dar origen a nuevos vasos sanguíneos. Las CMM pueden ser células madre fetales encontradas en los órganos o fetos o células madre de adultos encontradas en adultos o individuos recién nacidos. Las CMM pueden derivarse de médula ósea (células madre mesenquimales derivadas de médula ósea) y/o de las venas del cordón umbilical (células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical). Las CMM pueden ser de cualquier origen mamífero, por ejemplo, de humano, rata, primate, porcino o similares.

Los términos “células derivadas de tejido del cordón umbilical (CTU” se refieren, por ejemplo, a células como las descritas en US07510873, US07413734, US07524489 y US07560276. Las CTU pueden ser de cualquier origen mamífero, por ejemplo, de humano, rata, primate, porcino o similares. En una realización de la invención, las CTU se deriva de ombligos humanos.

Las células pueden cultivarse en un medio de crecimiento in vitro y/o manipularse de otra manera antes de introducir las células en el andamio. El cultivo de células in vitro y el recuento celular son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology Capítulo 28 Mammalian Cell Culture). Las células usadas de acuerdo con la invención pueden ser autólogas, alogénicas y/o células xenogénicas. Los términos “células autólogas” se refieren a células originadas del mismo individuo en el que se volverán a implantar. Los términos “células alogénicas” se refieren a células originadas del cuerpo de un dónate de la misma especie. “Célula xenogénicas” son células aisladas de individuos de otra especie.

En una realización de la invención, las CMM y/o CTU que pueden apoyarse en el andamio de la invención no expresan el marcador CD34+, esto es son células CD34-. Las “células CD34+” son células inmaduras que expresan en su superficie el marcador CD34.

Los resultados obtenidos de acuerdo con la invención muestra que la inyección de CMM o CTU con un componente de trombina y un componente de fibrinógeno en una concentración final de 25 mg/ml en un sistema de modelo in vivo para evaluar la retención celular después de inyección de las células en un músculo de una extremidad dieron como resultado un amento significativos en la retención de células en la región inyectada, por ejemplo, un músculo de una extremidad, 4 días después de la implantación de las células en comparación con células inyectadas con solución salina. Estos resultados indican que el andamio de acuerdo con la invención puede usarse beneficiosamente para fijar las células a la región inyectada y prevenir su despeje del sitio de implantación, y por lo tanto puede usarse ventajosamente en ingeniería de tejidos.

Los términos “ingeniería de tejidos” se refieren típicamente a una combinación de factores bioquímicos y/o fisio-químicos adecuados y/o células para restablecer, sustituir, mantener y/o mejorar la función del tejido o de un órgano entero. Los términos “ingeniería de tejidos” a veces son sinónimos de los términos “terapia celular”.

Un andamio de acuerdo con la invención que comprende CTU y/o CMM introducidas puede usarse en ingeniería de tejidos para facilitar el desarrollo local de tejido de vasos sanguíneos, por ejemplo, para restablecer tejido perdido debido a trauma o enfermedad, para tratar heridas, para acelerar la curación, para restablecer, sustituir, mantener y/o mejorar la función del tejido o del órgano entero. De este modo, en otro aspecto, la invención proporciona un método para aumentar la vascularización en una región limitada de un sujeto que lo necesite que comprende la administración a la región o formación en la región de un andamio de acuerdo con la invención que comprende CTU y/o CMM introducidas.

Los términos “vascularización creciente” se refieren a la mejora de formación de vasos sanguíneos más allá de la que ocurriría de manera natural en un periodo de tiempo específico, por ejemplo 4 días. El término “vascularización” incluye el término “angiogénesis” y “neovascularización”. Neovascularización se refiere a la formación de red microvascular funcional. Típicamente, la angiogénesis se caracteriza principalmente por la protrusión y proliferación de brotes de vasos sanguíneos pre-existentes.

Los términos “región limitada” se refieren a un sitio localizado, por ejemplo, la región en la que el andamio se formó o administró en el cuerpo. Ventajosamente, el andamio de fibrina de acuerdo con la invención retiene las células en el sitio trasplantado y mantiene las células in situ durante un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo. “Un periodo de tipo terapéuticamente efectivo” puede ser aproximadamente 4 días o más tiempo. Los términos “región” y “sitio” se refieren a un área del cuerpo que incluye, aunque no se limita a, un tejido corporal o un órgano donde la vascularización es insuficiente y se necesita una formación mejorada de vasos sanguíneos. La región puede ser un área donde exista una estructura de vaso sanguíneo tal como hueso, músculo, piel o tejido de corazón, por ejemplo, un área vascular dañada. La región también puede ser un área avascular tal como el menisco de la rodilla, médula espinal, disco intervertebral o cualquier tejido de cartílago. La región también puede ser un área que comprende un tejido u órgano trasplantado donde se requiere vascularización para mantener la función del trasplante. En casos de trasplante de tejido u órgano, el andamio puede formarse o administrase en la región antes, después o junto con el trasplante. La región también puede ser un órgano cuya función puede mejorarse al aumentar la vascularización tales como los riñones. La región puede ser un tejido dañado o isquémico. En una realización de la invención, la región es un tejido muscular.

Los términos “tejido isquémico” se refieren a un suministro inadecuado de sangre a un órgano o tejidos del cuerpo, por ejemplo, debido a un reducido flujo sanguíneo al área del tejido, por ejemplo, a causa de un bloqueo de los vasos sanguíneos. La región isquémica puede estar situada en cualquier órgano o tejido del cuerpo tal como tejido cardiaco, tejido neurológico, tejido muscular o cualquier otro tejido que sufra una inadecuada circulación sanguínea.

La región puede ser una región dañada. El daño a la región puede estar causado por fracturas, lesión, cirugía, úlceras, quemaduras, necrosis, inflamación, extirpación quirúrgica de tejido o de otra manera pérdida de tejido, fibrosis, infección, hipoxia, isquemia, isquemia/reperfusión o cualquier otra injuria o carga a un órgano o un tejido del cuerpo. Una región o región dañada se refieren a un área que se beneficiará de una mayor formación de vasos sanguíneos.

Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un método para tratar una herida que comprende la administración o formación en la herida o próxima a la herida un andamio de acuerdo con la invención que comprende una población de células introducidas, por ejemplo, CTU y/o CMM.

El término “herida” se refiere a cualquier tejido o localización que necesite reparación y/o curación incluyendo, aunque sin limitar a, heridas resultantes de enfermedades, lesiones o cirugías. Por “próximo/a” se entiende un área localizada que está lo suficientemente cerca a la herida donde la aplicación del andamio con CTU y/o CMM introducidas de acuerdo con la invención dará como resultado una curación mejorada en comparación con el patrón natural de curación.

En una realización de la invención, las células se localizan en la región de la herida o próximas a la herida durante un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo. Ventajosamente, la generación o desarrollo de nuevos vasos sanguíneos en la región o próximas a la región dará como resultado una mayor circulación sanguínea más allá de la que ocurriría de manera natural. Los términos “periodo de tiempo terapéuticamente efectivo” se refieren a un periodo de tiempo que puede ser suficiente para permitir la formación de vasos sanguíneos en el sitio implantado. En una realización de la invención, el tiempo es aproximadamente 4 días o más.

La formación de vasos sanguíneos puede identificarse, por ejemplo, controlando cambios morfológicos de las células implantadas tales como la formación de estructura celular de tipo vaso como describe Skovseth et al., Methods in Molecular Biology 2007; 360:253-265. Cuando ciertos tipos de células tales como células endoteliales o células madre endoteliales crecen dentro de un andamio tridimensional tal como el andamio de polímero de fibrina y

bajo ciertas condiciones, el cuerpo celular adquiere extensiones de tipo lamelipodios y filopodios aquí llamados “procesos celulares”. Varios procesos celulares, ya sean del mismo cuerpo celular o de otro cuerpo celular, forman juntos una estructura de tipo vaso (Kaijzel et al., J. Thrombosis and Haemostasis 2006 4: 1975-1981). El número de los procesos celulares formados y la longitud de la estructura de tipo vaso adquirida pueden medirse en una región cuadrada definida para controlar el aumento en la vascularización.

“Un sujeto que lo necesite” puede ser un sujeto que tenga cualquier condición que pueda beneficiarse de una mayor flujo sanguíneo en una región o en proximidad a una herida. Un sujeto que lo necesite puede ser un sujeto que sufra de corazón hipóxico, por ejemplo, cuando los vasos al corazón se bloquean; gangrena; diabetes; isquemia incluyendo isquemia crítica de extremidades; flujo sanguíneo inadecuado; enfermedad de las arterias coronarias; ateroesclerosis; arterioesclerosis; aneurisma aórtica; y enfermedad cerebro-vascular. En una realización de la invención, el sujeto que lo necesita sufre isquemia crítica de extremidades. El andamio de la invención que comprende CTU y/o CMM introducidas también puede usarse para prevenir o reducir la probabilidad de un suceso de infarto de miocardio y expansión de infarto. El andamio de la invención que comprende CTU y/o CMM introducidas, con o sin otros tipos de células, puede usarse para tratar una herida o aumentar la vascularización directamente inyectando los componentes requeridos para formar el andamio de acuerdo con la invención y las células al sitio anatómico deseado o implantando un andamio pre-formado con CTU y/o CMM introducidas en el sitio anatómico. “Sitio anatómico” es, por ejemplo, un sito pre-seleccionado en un mamífero donde se requiere vascularización y/o cualquier tejido o localización que necesite reparación y/o curación. El término incluye los términos “región” y “herida”.

Ejemplos

Materiales y Métodos

Células y medios empleados

CMMh -células madre mesenquimales humanas, médula ósea de Lonza Cologen AG, Cat. Nº PT2501. CEVUH – células endoteliales de la vena umbilical humana de Compañía Invitrogen Cat. Nº C-003-5C. CTUh – células derivadas de tejido del cordón umbilical humano se describen en US07510873, US07413734; US07524489; US07560276 (Ethicon). Medio para CMM – Medio MCCBM + MSCGM SingleQuots (Lonza; Cat. Nº PT-3238 + PT-4105). Medio para CTUh – DMEM/1g-D-glucosa/L-glutamina/Piruvato + 15% SFB Cat. # 31885 Gibco. Medio para CEVUH – Medio EGM-2-MV (Lonza; Cat. Nº CC-4147).

Preparación del cultivo celular

Las células se descongelaron de nitrógeno líquido. Se añadieron un millón de células congeladas con 1 ml de medio (de acuerdo con el tipo de célula como se ha detallado anteriormente) y después de la congelación, se colocó en placas de cultivo de tejido. Después de 2 días de crecimiento en una incubadora (37 1C y 5% CO2), las células se usaron para los experimentos a continuación.

Recuento de procesos celulares y medición de longitud de procesos para controlar la formación de estructuras celulares de tipo vaso.

El control de la formación de estructuras morfológicas de tipo vaso es un ensayo ampliamente usado para seguir la inducción de angiogénesis por diferentes sustancias (Skovseth et al., “En ensayo CEVUH/Matrigel: un ensayo in vivo de angiogénesis humana adecuado para la validación de fármacos”. Methods Mol Biol. 2007; 360:253-268). Cuando cierto tipo de células tales como células endoteliales o células madre endoteliales (por ejemplo, CEVUH) crecen dentro de un andamio tridimensional (por ejemplo, andamio de polímero de fibrina) y bajo ciertas condiciones, el cuerpo celular adquiere extensiones de tipo lamelipodios y filopodios. Estas extensiones se llaman “procesos celulares”. Varios procesos celulares, ya sean del mismo cuerpo celular o de otro cuerpo celular, forman juntos una estructura de tipo vaso (Kaijzel et al., “Variantes fibrinógenos de peso molecular determinan el índice de angiogénesis en una matriz de fibrina in vitro e in vivo”. J. Thrombosis and Haemostasis 2006 4: 19751981). Las estructuras celulares de tipo vaso formadas en un pozo de cultivo de tejido se consideran manifiesto estándar de angiogénesis y se controlan en ensayos para seguir la inducción de angiogénesis.

El ensayo de angiogénesis incluye procesos celulares de recuento en el cultivo de tejido en una región cuadrada definida de 500 µm x 500 µm 6 días después del cultivo celular en un andamio de fibrina (preparado como se elabora más abajo). El ensayo también incluye la medición de la longitud de procesos. Las mediciones se realizaron usando un programa de ordenador (“Cell_A” Olympus 2009). La Fig. 4 muestra imágenes de contraste de fases con microscopio representativas (obtenidas en un aumento X20) de procesos celulares (flecha rayada) y estructura de tipo vaso (flecha continua) de CTUh que crecieron dentro de un andamio de fibrina formado a partir de 50 mg/ml (25 mg/ml finales) de fibrinógeno y 20 UI/ml (10 UI/ml finales) de trombina como se describe más abajo. La figura se tomó después de 2 (B) y 6 (C) días en cultivo. La Fig. 4A muestra una figura representativa de células que crecieron en monocapa. La figura se tomó después de 6 días en cultivo. Las mediciones del número de procesos celulares y su longitud para cada pozo se realizaron por duplicado (en dos áreas diferentes en el mismo pozo).

Cuantificación de los niveles de dímero-D en el medio

El siguiente ensayo se usó para analizar el índice de degradación de fibrina realizado por las células originadas de varios linajes. El dímero-D es un producto de degradación de fibrina que se forma cuando el polímero de fibrina se rompe por la plasmina enzimática. La degradación de fibrina se evaluó midiendo el nivel de dímero-D en el medio de varias células que crecieron en un andamio de fibrina. Se usaron diferentes concentraciones de fibrinógeno para formar el polímero de fibrina. Poa controlar la degradación de fibrina realizada por células, se sembraron diferentes tipos de células en un andamio de fibrina (como el descrito en el Ejemplo 1 más abajo) y el andamio se mantuvo en un medio de cultiov (el medio no cambio durante todo el periodo del experimento) durante hasta 7 días. Se tomó una muestra (20 µl) del medio 1 y 7 días después de la siembra de las células y se midió el nivel de dímero-D usando un kit Imuclone D-dimer ELISA (Cat. Nº 602) de acuerdo con el protocolo del fabricante. SE midió la concentración de dímero-D en el medio de andamio de fibrina preparado de la misma manera pero sin célula y los andamios de fibrina con células el día 1 se usaron como control.

Recuento de células en el andamio de fibrina

El siguiente ensayo se usó para cuantificar las células cultivadas en el andamio. Las células se introdujeron en andamios de fibrina formados dentro de una placa de 6 pozos como se especifica en el Ejemplo 6. Después de 1,5 días en cultivo se añadieron 3-4 mg (disueltos en 500 µl PBS) de tripsina por ml de medio en cada pozo (cada pozo contenía 4 ml de medio) y la placa se incubó a 37 ºC en una atmósfera humidificada de 5% CO2 durante 20-30 minutos hasta que el andamio de fibrina se degradó por completo. El contenido del pozo se transfirió a un tubo Eppendorf y se centrifugó en una microcentrífuga a 1000 g durante 4 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 22 ºC). El volumen de 4 ml de sobrenadante se descartó, y 1 ml de medio celular fresco que contenía 1 µg/ml solución de tinción Hoechst (33342 B2261-100 MG Sigma) en 0,04 ml de medio de crecimiento celular (de acuerdo con el tipo de célula) se añadió al gránulo celular y el gránulo se volvió a suspender. La suspensión celular anterior en el tubo de Eppendorf después se incubó a 37 ºC en una atmósfera humidificada de 5% CO2 durante 1 hora. Después, las células se lavaron mediante una re-suspensión suave de las células en 1 ml de PBS, se centrifugó a 1000 g a temperatura ambiente y el sobrenadante se descartó. El gránulo celular se volvió a suspender en 200 µl PBS, se transfirió a una placa con 96 pozos y la absorbancia se midió en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 350ex/450em n. Los resultados se presentan en unidades OD (una vez al día) en relación con OD de la concentración mínima de células (100 células/µl)

Ensayo de retención celular in vivo

El siguiente modelo se usó para explorar la habilidad del andamio de fibrina para retener las células trasplantadas en la región inyectada en un modelo animal.

Se usó un modelo de inyección celular en músculo de extremidad en ratón como un sistema de modelo in vivo para estudiar la retención celular después de la inyección de las células en el músculo de una extremidad (Terrovitis J et al., J Am Coll Cardiol. 2009 Oct 20; 54(17):1319-26).

Antes de la implantación, las células (CEVUY, CMM o CTUh) se tiñeron con DiI [una molécula fluorescente que se une a la membrana celular de células viables y puede verse por 570ex/610em nm (Molecular Probes, USA, Cat. Nº C7001)] de la siguiente manera: se incubaron aproximadamente 330.000 células con 2 µM de solución DiI en un volumen final de 150 µl de mido. El procedimiento de tinción dura 15 minutos y se especifica en el manual del fabricante. Después de la etapa de tinción, las células se lavaron una vez con PBS (mediante re-suspensión suave de las células en 1ml PBS, centrifugación a 1000 g a temperatura ambiente y descarte del sobrenadante) y las células teñidas se usaron para el procedimiento de inyección in vivo como el elaborado más abajo.

Ratones BalbC de 1-3 meses de edad se inyectaron directamente en el músculo abductor de la extremidad con 330.000 células teñidas (suspendidas en 150 µl de solución salina o en 150 µl de componentes selladores de fibrina [esto es, 75 µl de componente de trombina (20 UI/ml o 10 UI/ml concentración final después de mezclar los dos componentes) que contenía las células teñida y 75 µl de componente de fibrinógeno (35 o 50 mg/mol; 17,5 o 25 mg/ml concentración final de fibrinógeno después de mezclar los dos componentes). A cada ratón se le inyectó en una extremidad con células suspendidas en solución salina y en la otra extremidad con células mezcladas con los componentes selladores de fibrina. Cada inyección se realizó con una jeringa de 0,5 ml equipada con una aguja 26G. Los componentes de trombina + células y el componente de fibrinógeno se mezclaron juntos en un tubo Eppendorf usando una pipeta, la jeringa inmediatamente los sacó y se inyectaron en la extremidad antes de que se diera coagulación.

Los ratones se sacrificaron 1 o 4 días después de la inyección y el coágulo de fibrina (de la extremidad inyectad con células suspendidas en los componentes selladores de fibrina) o una pieza de músculo (de la extremidad inyectada con células suspendidas en solución salina) (0,2x0,2x0,2 cm) se extirpó del sitio de la inyección usando un escalpelo. Las piezas de coágulo de fibrina extirpadas o las piezas musculares extirpadas se digirieron enzimáticamente para producir una suspensión de células por 3 mg/ml de tripsina (solamente para

disociación de coágulo de fibrina) o 6 mg/ml de colagenasa (para disociación muscular – añadido para disociación muscular en ambos grupos analizados) (Sigma, Saint-Louis USA Cat. Nº T4665 y Cat. Nº C6079, respectivamente, disueltos en 400 µl medio DMEM) durante 2 horas a 37 ºC. Después, la suspensión de células se centrifugó y se volvió a suspender en PBS fresco (400 µl). Una muestra de 400 µl de suspensión celular de cada coágulo de fibrina digerido o tejido muscular se transfirió a una placa con 24 pozos, se añadió 2% paraformaldehído (Sigma, Saint-Louis USA Cat. # 47608) a cada pozo y las células se contaron bajo un microscopio fluorescente a una longitud de onda de 553ex/570em nm.

Ensayo de longevidad de coágulo en un escenario in vivo

El siguiente ensayo se usó para analizar el efecto de inhibidor de proteasa añadido en la longevidad del coágulo de fibrina en un escenario in vivo. Se usó el modelo de defecto de pared abdominal de rata. Se analizaron tres composiciones diferentes de pegamento de fibrina: EVICEL (Omrix Biopharmaceuticals Ltd.) sin ningún inhibidor de proteasa añadió (grupo número 1), EVICEL con la adición de 100 mg/ml de ácido tranexámico en el componente de trombina (grupo número 2) y EVICEL con la adición de 3.000 UIK/ml aprotinina en el componente de trombina (grupo número 3). Después de la adición de ácido tranexámico (Daiichi, Japón) o aprotinina (Sigma-Aldrich, USA Cat Nº A1153) la solución de trombina se filtró estéril.

El experimento se realizó en ratas machos Spargue-Dawley que pesaban 300-400 g y con edad de más de 9 meses (Lab. Harlan, Rehovot, Israel). Todos los animales fueron sometidos a inspección a su llegada y estuvieron continuamente bajo supervisión clínica durante el periodo experimental. La asignación de los grupos de tratamiento se realizó usando un procedimiento estratificado arbitrario. Los animales se guardaron en una jaula de policarbonato (2 animales por jaula) en una habitación con aire acondicionado a una temperatura de 22±4 ºC, con humedad relativa de 30-70% y bajo un ciclo artificial de iluminación (12 horas de luz artificial/12 horas de oscuridad). Los animales tenían libre acceso a comida y agua de grifo esterilizada.

Antes de la cirugía los animales fueron anestesiados con una inyección IM 40-80 mg/kg de una mezcla de 85/15 Ketamina HCl 100 mg/ml y Xilacina HCL 20 mg/ml.

El experimento se realizó de la siguiente manera:

Se afeitó a las ratas y se marcó una incisión de 6 cm sobre la piel que cubría la línea en la línea media ventral. La piel de los animales se preparó con solución de yodóforo y se hizo una incisión. La piel se retiró y se socavó ligeramente para facilitar la sutura al final del procedimiento. Con la pared muscular expuesta, se hizo una incisión de 5 cm en el músculo a lo largo de la línea a través de la cavidad peritoneal. La pared abdominal derecha se reflejó. Se eliminó 2 cm x 1 cm del peritoneo. El borde medio de este defecto se localizó 1 cm lateral de la incisión de la línea media y paralela a ella. El defecto de pared abdominal se expuso al aire durante 10 minutos para controlar cualquier sangrado.

Las heridas se pulverizaron con una de las preparaciones de pegamento de fibrina (EVICEL sin ninguna adición de inhibidor de proteasa o con ácido tranexámico o aprotinina como se ha indicado anteriormente). En cada rata, se pulverizó 0,5 ml de cada componente (1 ml de sellador total) en el defecto creado dentro de un molde de 2x3 cm. 1 minuto después de la pulverización, el molde se retiró. La incisión y la piel se cerraron con un 3-O Sofsilk en funcionamiento (Syneture, Cat. Nº SS-682). Los animales en los diferentes grupos se sacrificaron 1, 3, 5, 7, 9 y 11 días después de la iniciación del experimento usando CO2. Se hizo una incisión en forma de “V” exponiendo la pared abdominal, los restos de los coágulos en todos los animales sacrificados se extrajeron y pesaron.

Cada coágulo se lavó con solución salina, se colocó en un tubo de ensayo que contenía solución solubilizadora de coágulo (un volumen en un rango de 0,5-10 ml dependiendo del tamaño del coágulo; 10 ml el primer día y 0,5 ml el último días; 7M urea y 0,2M NaOH en un PBS-cloruro de sodio 0,9% tampón mezclado en una proporción de 1:2). El tubo de ensayo se dejó a temperatura ambiente durante al menos 4 horas hasta que el coágulo se disolvió por completo, como lo juzgó la inspección visual.

La concentración de proteína coagulable en el coágulo restante de cada muestra después de la solubilización del coágulo se determinó cuantitativamente mediante el siguiente procedimiento. 100 µl des solución de coágulo solubilizado se diluyeron en 900 µl de agua doblemente destilada (1:10) y se leyó a 280 nm. Las mediciones se realizaron en cubetas de 1 ml. La proteína del coágulo se determinó después de reducción de difusión de luz a 320 nm e interpolación de un estándar interno conocido. El volumen real de la solución solubilizadora de coágulo usada para disolver los restos de coágulo se tomó en cuenta para el cálculo de la cantidad de proteína.

Ejemplo 1 – Preparación de células introducidas en andamios de fibrina

Las células en placas preparadas como se ha descrito anteriormente bajo “Preparación de cultivo celular” se tripsinizaron, lavaron, transformaron en gránulos mediante centrifugación y 40.000 células se volvieron a suspender en 0,5 ml de PBS para lavar los remanentes tripsina. Las células suspendidas se transformaron de nuevo

en gránulos en una centrifugadora a 1000 g durante 4 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 22 ºC) y el sobrenadante se descartó. Las células en gránulos se sembraron después dentro de un andamio de fibrina preparado de la siguiente manera: el gránulo anterior se mezcló con 10 µl de solución de trombina (una solución como en el componente de trombina de sellador de fibrina EVICEL™, Omrix Biopharmaceuticals Ltd., pero se diluyó a una concentración de 20 UI/ml en tampón con base de calcio: 110 nM manitol, 150 mM cloruro de sodio, 20 mM acetato de sodio, 6 mg/ml de albúmina de suero humano, 40 mM cloruro de calcio). La mezcla de trombina y células se mezcló con una gota de 10 µl de una solución que comprendía diferentes concentraciones de fibrinógeno (el suministro de solución de fibrinógeno usada es el componente BAC de sellador de fibrina EVICEL™, Omrix Biopharmaceuticals Ltd y se diluyó en una concentración de 1, 10, 30, 50 o 70 mg/ml en tampón con base de glicina: 120 mM cloruro de sodio, 10 m citrato trisodio, 120 mM glicina, 95 mM hidrocloruro de arginina, 1 mM cloruro de calcio) dentro de un plato de cultivo con una placa con 24 pozos. La gota mezclada de 20 µl dejó polimerizar durante 2 minutos en una campana estéril. El andamio de fibrina formado contenía fibrinógeno en una concentración final de 0,5, 5, 15, 25 o 35 mg/ml y trombina en una concentración final de 10 UI/ml. Después, 1 ml del medio de acuerdo con el tipo de célula, como se ha detallado anteriormente, se añadió al pozo y el plato de cultivo se incubó a 37 ºC y 5% CO2. Las células se cultivaron dentro del andamio de fibrina durante 1-9 días. Durante este periodo se evaluaron varios parámetros (Ejemplos 2-6). A menos que se indique lo contrario, el medio se sustituyó cada 3 días. A menos que se indique lo contrario, se usaron los volúmenes y concentraciones escritos en este ejemplo.

Ejemplo 2 – El efecto de concentración de fibrinógeno en la habilidad para mantener la formación de un andamio de tejido tridimensional

En los siguientes experimentos, se usaron tres tipos de células para analizar el efecto de concentración de fibrinógeno para mantener un andamio de tejido tridimensional: células endoteliales de la vena umbilical humana (CEVUH), células madre mesenquimales humanas (CMM) y células derivadas de tejido del cordón umbilical humano (CTUh) como se ha especificado anteriormente. Estas células se originan de diferentes linajes celulares. CMM son células madre multipotentes que pueden diferenciarse en adipocitos, condroctios, células endoteliales y osteoblastos; CEVUH son células madre endoteliales de origen recién nacido; y CTUh son células derivadas de tejido del cordón umbilical humano que secretan una variedad de factores de crecimiento incluyendo factores de crecimiento moduladores de angiogénesis. Estas células se derivan después del parto. Las células producen al menos uno de los marcadores CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A, B, C y carecen de la producción de al menos uno de los marcadores CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G y HLA-DR, DP, DQ como lo detecta la citometría de flujo. Cda tipo de célula se introdujo en fibrina como se describe en el Ejemplo 1 y se cultiva durante un periodo de 7 días. En este punto, se tomó una imagen de contraste de fases en un aumento de X10 y se evaluó la formación de un andamio tridimensional con células introducidas. El experimento se realizó por duplicado.

Las Figs. 1, 2 y 3 muestran un imagen de contraste de fases representativa de los diferentes tipos de célula (CEVUH, CTUh y CMM, respectivamente) en las diferentes concentraciones de fibrinógeno usadas para preparar el andamio de fibrina: 1 (A); 10 (B); 30 (C); 50 (D); o 70 (E) mg/ml (la concentración de fibrinógeno final después de la mezcla de los dos componentes fue la mitad, esto es, 0,5, 5, 15, 25 y 35 mg/ml).

Los resultados muestran que cuando se usan CEVUH (Fig. 1) una estructura de tejido tridimensional con células introducidas está presente en la concentración final de fibrinógeno más baja analizada (0,5 mg/ml). Sin embargo, cuando se usan CTUh y CMM (Fig. 2 y 3) solamente se observa una estructura de tejido tridimensional en concentraciones finales de fibrinógeno relativamente altas de 25 y 35 mg/ml. El uso de CTUh y CMM y una concentración final de fibrinógeno igual o inferior a 15 mg/ml no permitieron la formación de estructuras de tejido tridimensionales y dio como resultado una monocapa de células en el fondo del pozo.

Estos resultados muestran que CMM y CTUh requieren una concentración específica de fibrinógeno con el fin de sostener la formación de un andamio de tejido tridimensional. Mientras CEVUH formó un andamio de tejido tridimensional usando una concentración baja de fibrinógeno tal como 0,5 mg/ml, CMM y CTUh necesitan una concentración de fibrinógeno superior a 15 mg/ml.

Ejemplo 3 – El efecto de un andamio de fibrina tridimensional en la morfología de CTUh introducidas y cultivadas en el andamio

El presente experimento tuvo como objetivo evaluar el efecto de cultivar CTUh en un andamio de fibrina tridimensional en la morfología adoptada por las células cultivadas.

Con este fin, se formó un andamio tridimensional de fibrina que incluía CTUh (como en el Ejemplo 1) usando volúmenes iguales de 50 mg/ml fibrinógeno y 20 UI/ml trombina (dando como resultado concentraciones finales de 25 mg/ml y 10 UI/ml, respectivamente) y se controló la morfología adoptada por las células cultivadas.

Los procesos y la formación de estructuras de tipo vaso son cambios morfológicos usados como marcadores para angiogénesis (véase sección de materiales y métodos para detalles sobre las mediciones de cambio morfológico).

La Fig. 4 muestra un imagen de contraste de fases con microscopio representativa (obtenida en una aumento X20) de CTUh cultivas en un andamio de fibrina formado a partir de 50 mg/ml fibrinógeno y 20 UI/ml trombina (25 mg/ml y 10 UI/ml finales, respectivamente). La figura se tomó después de 2 ó 6 días de cultivo en la fibrina (Figs. 4B, C, respectivamente) o en fibrina (Fig. 4A).

En la Fig. 4A puede observase que CTUh cultivadas en un andamio tridimensional de fibrina formado a partir de 50 mg/ml fibrinógeno adquirió procesos celulares (flecha rayada) y estructuras de tipo vaso. Las células cultivas en ausencia de andamios de fibrina no mostraron procesos celulares (flecha continua). Este resultado muestra que la combinación de CTUh en andamios 3D de fibrina, formados a partir de 25 mg/ml fibrinógeno (finales), indujo un efecto angiogénico en las células introducidas. Este resultado indica que CTUh introducidas en un andamio tridimensional de fibrina formado a partir de 50 mg/ml fibrinógeno puede usarse ventajosamente para aumentar la vascularización, por ejemplo, en regiones isquémicas.

Ejemplo 4 – El efecto de concentración de fibrinógeno en el andamio de fibrina en formación de procesos y longitud de CTUh y CMM introducidas y cultivadas en el andamio.

El experimento previo mostró que CTUh cultivadas en un andamio de fibrina formado a partir de una concentración final de fibrinógeno de 25 mg/ml adquirió procesos celulares y estructuras de tipo vaso (véase Fig. 4B-C) (en oposición a CTUh cultivadas en ausencia de fibrina – Fig. 4A). El siguiente experimento se realizó con el fin de analizar el efecto de concentración de fibrinógeno usado para formar el andamio de fibrina en la habilidad de CEVUH, CTUh y CMM para formar procesos. Con este fin, CEVUH, CTUh y CMM se introdujeron en andamios de fibrina preparados con diferentes concentraciones de fibrinógeno y se cultivaron como se ha descrito en el Ejemplo

1. Después de cultivar las células en los diferentes andamios, el número de proceso y la longitud de los procesos se evaluaron como se ha indicado en la sección de materiales y métodos.

La Fig. 5 muestra el número de proceso celular formado por campo cuando CEVUH (A), CTUh (C) y CMM

(B) cultivadas en andamio de fibrina formadas a partir de concentraciones crecientes de fibrinógeno (1-70 mg/ml; 0,5-35 mg/ml).

Se descubrió que en CEVUH (Fig. 5A) pueden encontrarse frecuentemente procesos en todas las concentraciones de fibrinógeno usadas para formar el andamio (1-70 mg/ml). El rango óptimo de concentración de fibrinógeno para estas células resultó ser 10-30 mg/ml andamio con base de fibrina (5-15 mg/ml finales). Sin embargo, en el caso de CTUh y CMM (Figs. 5C y B, respectivamente), se descubrió que los procesos están rara vez presentes en andamios formados con tales concentraciones bajas de fibrinógeno. Cuando se usan estas células, la frecuencia de procesos aumentó en andamios formados con altas concentraciones de fibrinógeno de > 30 mg/ml (igual o superior a 15 mg/ml finales). Con respecto a la longitud de procesos, se observo que en CEVUH (Fig. 6A), se obtiene una longitud similar en todas las concentraciones de fibrinógeno usadas (1-70 mg/ml) mientras que en el caso de CTUh y CMM (Figs. 6C, B) una concentración de fibrinógeno igual o superior a 30 mg/ml dio como resultado procesos significativamente más largos en comparación con el uso de concentración más baja de fibrinógeno de < 30 mg/ml (< 15 mg/ml finales).

Estos resultados muestran que, con el fin de obtener una estructura de tipo vaso que pueda ser beneficiosa en la formación de vasos sanguíneos, por ejemplo, en regiones isquémicas, CMM y CTUh requieren un andamio formado con una concentración final de fibrinógeno de al menos 15 mg/ml mientras que en el caso de CEVUH son óptimas concentraciones más bajas de fibrinógeno.

Ejemplo 5 – El efecto de los varios tipos de células introducidos en el andamio de fibrina en el nivel de degradación de fibrina

Los ejemplos previos mostraron que CTUh y CMM requieren un andamio de fibrina formado con una concentración de fibrinógeno relativamente alta, en comparación con CEVUH, con el fin de obtener estructuras tridimensionales de tipo vaso.

El siguiente experimento se diseñó para explorar la posibilidad de índice diferencial de degradación de fibrina atribuido a cada tipo de célula cultivada en el andamio de fibrina.

Dímero-D es un producto de degradación de fibrina formado cuando un polímero de fibrina se rompe por plasmina enzimática. La degradación de fibrina se evaluó midiendo el nivel de dímero-D en el medio de varias células cultivadas en los andamios de fibrina.

Con este fin, CEVUH, CTUh y CMM crecieron en un andamio de fibrina como el descrito en el Ejemplo 1. Se tomó una muestra (20 µl) del medio 1 y 7 días después de la siembra de las células y se midió el nivel de dímero-D usando un kit Imuclone D-dimer ELISA (Cat. Nº 602) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El medio no se sustituyó durante el periodo completo del experimento. Los andamios de fibrina sin células y los andamios de fibrina con células el día 1 sirvieron como grupos de control.

Las Figs. 7A-7B muestran la concentración de dímero-D después de 1 (A) y 7 (B) días en el medio de CEVUH, CMM y CTUh que crecieron en andamio de fibrina formado con concentraciones crecientes de fibrinógeno (y en andamio de fibrina sin células como control).

Se descubrió que en CTUh y CMM una concentración de dímero-D significativamente más alta (3-5 veces) está presente en el medio 7 días después del cultivo en comparación con el nivel de dímero-D en el medio de CEVUH cultivadas, lo que indica que CTUh y CMM tienen un alto nivel capacitivo de degradar fibrina. El alto nivel capacitivo de degradación de fibrina de CTUh y CMM es probablemente el resultado de un mayor nivel de actividad enzimática de plasmina, esto es, estas células secretan un mayor nivel de plasmina.

Estos resultados indican que con el fin de obtener un andamio tridimensional de fibrina de larga duración cuando se siembra CTUh y CMM en un andamio de fibrina, debería usarse un polímero de fibrina con un alto contenido de fibrinógeno especialmente cuando el sellador de fibrina no contiene agentes anti-fibrinolíticos. Debería señalarse que el uso de agentes anti-fibrinolíticos tales como aprotinina o ácido tranexámico ha demostrado ser citotóxico (Furtmüller et al., “Ácido tranexámico, un agentes anti-fibrinolítico muy usado, causa convulsiones por un efecto antagonístico de receptor de ácido gama-aminobutírico”. J. Pharmacol Exp Ther. 2002; 301: 168-173; Roger et al. “Evaluar las diferencias entre selladores de fibrina: recomendaciones de un comité de asesoría internacional de farmacéuticos de hospitales”. La Revista Europea de Ciencia Farmacéutica Hospitalaria Volumen 12, 2006, Publicación 1, P. 3-9).

Ejemplo 6 – La habilidad de andamios de fibrina para mantener la expansión celular

Las células sembradas en un andamio de fibrina pueden tener una capacidad limitada para proliferar en una cierta concentración celular de siembra. De este modo, el presente experimento se realizó para examinar cuál es la concentración celular óptima para la siembra inicial que puede mantenerse en el andamio de fibrina.

Números crecientes de células de los varios tipos: 1.000-10.000 células por µl de andamio de fibrina en un total de 30 µl andamio de fibrina/pozo se sembraron en una placa con 6 pozos en un andamio de fibrina o en ausencia de fibrina (y en este caso las células crecieron en una monocapa situada en el fondo de la placa con pozo). Las células se introdujeron en los andamios de fibrina de la misma manera que se ha ejemplificado anteriormente (Ejemplo 1), excepto que los andamios se generaron a partir de 15 µl de componente de fibrinógeno en una concentración de 50 mg/ml y 15 µl de componente de trombina en la concentración de 20 UI/ml (una concentración final de 25 mg/ml y 10 UI/ml, respectivamente). Las placas con pozos se incubaron a 37 ºC en una atmósfera humidificada de 5% CO2 durante 1,5 días. Después, el medio se descartó y las células se contaron como se describe en la sección de “materiales y métodos”. Las células en el cultivo monocapa se contaron con un método de tinción nuclear de Hoechst como se describe en la sección de materiales y métodos.

Los resultados se muestran en la Fig. 8A-C. como se esperaba, se observó que cuando CEVUH (Fig. 8A), CMM (Fig. 8B) y CTUh (Fig. 8C) se cultivan como una monocapa un aumento en el número de células sembradas dio como resultado un aumento proporcional en la cantidad de células presentes después de 1,5 días del cultivo. En CEVUH (Fig. 8A) un aumento en el número de células sembradas en el andamio de fibrina dio como resultado un aumento proporcional en el número de células después de 1,5 días de incubación. Sin embargo, en CMM y CTUh los números de células no aumentaron de manera significativa en la misma proporción después del mismo periodo de incubación en algunos de números iniciales altos de siembra celular. Por ejemplo, CMM sembradas por encima de 6.000 célula/µl o CTUh sembradas por encima de 4.000 célula/ µl no dieron como resultado un aumento proporcional en el número de células después del periodo de incubación de 1,5 días en comparación con CEVUY. Estos hallazgos sugieren que en CMM y CTUh el rango óptimo de concentración inicial de siembra es más estricto en comparación con el de CEVUH y es crucial para la habilidad de CMM y CTUh para crecer y proliferar en el andamio de fibrina.

Ejemplo 7 – Retención de céulas CMM, CTUh o CEVUH introducidas en andamios de fibrina en un modelo animal de músculo de extremidad.

El fin de este experimento fue examinar la habilidad del andamio de fibrina para retener células en el sitio inyectado. El modelo de inyección celular en músculo de extremidad de ratón se usó como un sistema de modelo in vivo como se describe en la sección de “materiales y métodos”.

Los resultados se resumen en la Fig. 9. El eje Y muestra el número de células por un campo microscópico dado (1000x1000 micrones) contadas en la extremidad inyectada con fibrina + células o el número de células contadas en la extremidad inyectada con células + solución salina dividido entre el número de células contadas en la extremidad inyectada con células +solución salina. Este número representa la proporción de (células inyectadas + fibrina) con (células inyectadas en solución salina).

Las Figs. 9A-9D muestran el número de células presentes en el músculo inyectado después de 1 días (A, C) y 4 días (B, D) de inyección de fibrina + células {formadas con 17,5 mg/ml finales de fibrinógeno (A) (B) o 25 mg/ml finales fibrinógeno (C) (D)} o inyección de solución salina + células. El número contado de células en la

extremidad inyectad con fibrina + células o en la extremidad inyectada con solución salina + células se dividió entre el número de células contadas en la extremidad inyectada con solución salina + células el mismo día, para obtener una proporción de células en cada extremidad.

En la figura solamente se representan CMM, aunque se observaron resultados similares con las otras células analizadas (CTUh y CEVUH) (datos no mostrados). Los resultados muestran que la inyección de células con un componente de trombina y un componente de fibrinógeno en una concentración de 50 mg/ml (25 mg/ml finales) dio como resultado un aumento significativo en la retención de células en la región inyectada 4 días después de la implantación de las células en comparación con células inyectadas con solución salina. Sin embargo, cuando se usó un componente de fibrinógeno en una concentración inferior a 35 mg/ml (17,5 mg/ml finales) no se observó un aumento significativos en la retención en comparación con células inyectadas con solución salina (Fig. 9).

Estos resultados muestran que un andamio de fibrina formado con un componente de fibrinógeno en una concentración superior a 35 mg/ml (17,5 mg/ml finales) necesita usarse para formar un andamio celular que fija las células a la región inyectada, por ejemplo, un tejido muscular durante un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo y de este modo puede usarse ventajosamente en ingeniería de tejidos.

Ejemplo 8 – El efecto de inhibidor de proteasa añadido en longevidad de coágulo de fibrina en un escenario

in vivo

El fin de este experimento fue analizar el efecto de inhibidores de proteasa añadidos (ácido tranexámico o aprotinina) en la longevidad del coágulo de fibrina en un escenario in vivo. El modelo de defecto de pared abdominal de rata se uso como se ha elaborado anteriormente. Con este fin, sea aplicaron tres composiciones diferentes de sellador de fibrina (EVICEL sin la adición de ningún inhibidor de proteasa o con ácido tranexámico o aprotinina como se ha indicado anteriormente) en un efecto creado en una pared muscular abdominal de rata (véase detalles en la sección de “materiales y métodos”). Los animales en los grupos diferentes se sacrificaron 1, 3, 5, 7, 9 y 11 días después de la iniciación del experimento y la longevidad del coágulo se evaluó midiendo el peso del coágulo y la cantidad de proteína coagulable como se ha especificado anteriormente.

El peso medio del coágulo y la cantidad media de proteína coagulable de las varias composiciones de sellador de fibrina en los varios puntos en el tiempo se presentan en la Fig. 10 y 11, respectivamente.

Los resultados obtenidos indican que el peso del coágulo (Fig. 10) y la cantidad de proteína coagulable (Fig. 11) disminuye con el tempo en todos los grupos analizados. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos en relación con el peso del coágulo y la cantidad de proteína coagulable. Estos resultados demuestran que la adición de inhibidor de proteasa en un andamio de fibrina en un escenario in vivo no altera la longevidad del coágulo. Por lo tanto, la adición de inhibidores de proteasa a andamios de fibrina solos no puede prolongar la permanencia de las células introducidas en el sitio de la implantación.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un andamio con base de fibrina capaz de mantener una población de células introducidas en el andamio que comprende una concentración inicial de células de al menos 1 x 106 células/ml andamio de células madre mesenquimales (CMM) y/o células derivadas de tejido del cordón umbilical (CTU) donde el andamio se forma con un componente de fibrinógeno que comprende fibrinógeno con una concentración final superior a 17,5 mg/ml andamio, comprendiendo el andamio CTU, CMM introducidas o una combinación de las mismas en un rango de concentración inicial de 1 x 106 a 6 x 106 células/ml andamio, donde el andamio de fibrina está sustancialmente libre de inhibidores de proteasa añadidos, y donde el andamio que comprende CMM y/o CTU introducidas es para uso en el aumento de vascularización.

2. 2.

   El andamio de acuerdo con la reivindicación 1, donde el componente de fibrinógeno se deriva de la sangre, y preferentemente el andamio está sustancialmente libre de plasmina y/o plasminógeno.

3. 3.

   CTU y/o CMM para su uso en un método de aumento de vascularización en una región limitada de un sujeto que lo necesite donde el método comprende la administración de células a la región como parte de un andamio de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2.

4. 4.

   Las CTU y/o CMM para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 3, donde la región es isquémica, dañada o comprende un tejido u órgano trasplantado.

5. 5.

   Las CTU y/o CMM para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 3 o reivindicación 4, donde la región es un tejido muscular.

6. 6.

   Las CTU y/o CMM para su uso en un método para tratar una herida donde el método comprende la administración

   o formación proximal a la herida de un andamio de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2 que comprende CTU y/o CMM introducidas.

7. 7.

   Las CTU y/o CMM para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde el andamio es capaz de mantener las células en la herida o próximas a la herida durante un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo, preferentemente donde el tiempo es al menos 4 día.

8. 8.

   Un método para preparar un andamio para su uso en el aumento de vascularización, comprendiendo dicho métodos las etapas de: proporcionar un componente de fibrinógeno; proporcionar una componente de enzima proteolítica que es capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinógeno; proporcionar una población de células que comprenden CMM y/o CTU; y mezclar el fibrinógeno, la enzima proteolítica y las células, donde el andamio formado comprende 1 x 106 a 6 x 106 células/ml andamio CMM y/o CTU, donde el componente de fibrinógeno usado para formar el andamio está en una concentración final superior a 17,5 mg/ml andamio y donde los componentes están sustancialmente libres de inhibidores de proteasa añadidos.

9. 9.

   El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde el componente de fibrinógeno se deriva de la sangre y está sustancialmente libre de plasmina y/o fibrinógeno.

10. 10.

    Un andamio de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2 que comprende CTU y/o CMM introducidas o un andamio formado de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9 para su uso en el aumento de vascularización en una región limitada en un sujeto y/o para su uso en el tratamiento de una herida.

11. 11.

    Un kit para su uso en el aumento de vascularización que comprende:

    (i)

    al menos dos recipientes separados que comprenden componentes requeridos para formar un andamio con base de fibrina, el al menos un recipiente separado comprende un componente de fibrinógeno que tiene una concentración final de fibrinógeno superior a 17,5 mg/ml andamio formado, y el al menos segundo recipiente separado comprende un componente de enzima proteolítica que es capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinógeno; y

    (ii)

    CMM y/o CTU en una concentración de al menos 1 x 106 a 6 x 106 células/ml andamio formado, donde los componentes están sustancialmente libres de inhibidores de proteasa añadidos.

12. 12.

    El kit de acuerdo con la reivindicación 11, donde las CMM y/o CTU están en un recipiente separado.

13. 13.

    El kit de acuerdo con la reivindicación 11 o reivindicación 12, donde el componente de fibrinógeno se deriva de la sangre y está sustancialmente libre de plasmina y/o plasminógeno.