KR102270617B1 - 조직 손상 및 질환을 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

조직 손상 및 질환을 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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랄프-하이코 매턴
코리 윌슨-워스
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Abstract

본 발명은 다능성 세포 또는 미세혈관 조직(여기서, 상기 세포 또는 조직은 불활성화된 바이러스로 멸균되고/되거나 처리되었다)을 포함하는 신규한 조성물, 및 이들 조성물을 사용하여 동종이계 대상체에서 조직 손상 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

Description

조직 손상 및 질환을 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING AND PREVENTING TISSUE INJURY AND DISEASE}
본 출원은 2012년 9월 19일자로 출원된 미국 가출원번호 제61/703,203호의 이익을 주장하고, 이의 개시는 본원에서 참조로서 명백하게 도입된다.
본 발명의 몇몇 실시형태는 임의의 바이러스를 불활성화시키기 위해 멸균되고/되거나 처리된 다능성 세포 및/또는 미세혈관 조직을 포함하는 신규한 조성물, 이들의 제조 방법, 및 조직 손상 및 질환(예: 관절염)의 치료 또는 예방에서 동종 또는 이종 사용 방법에 관한 것이다.
근육, 건, 인대 및 관절낭 등의 연질 조직에 대한 손상은 매우 빈번하게 발생한다. 이러한 손상은 전형적으로 통증, 염증 및 내부 조직 스트레스에 의해 특징지워지는 조직 기능장해를 가져오고, 궁극적으로 기능 장해를 가져올 수 있다. 예를 들면, 건의 염좌는 자연적으로 치유되지만, 건의 완전한 파열은 외과적으로 치료되지 않는 경우에 종종 기능장해를 유도할 것이다. 외과적 수복에도 불구하고, 아킬레스 건의 약 15% 및 2건 건판 수복의 40%는 후속적으로 실패한다. 추가로, 수복된 건은 이전-손상 강도 및 기능 수준을 좀처럼 복귀하지 않는다.
조직 수복은 일반적으로 초기 염증 반응, 이어서 세포 증식 및 조직 재구성을 포함하는 몇몇 단계를 포함한다. 조직 수복의 기본 프로세스는 섬유증식 및 혈관신생 둘 다를 포함한다. 손상된 조직 내의 모세혈관이 혈류를 재확립하기 위해 수복 영역을 향해 성장하면서, 염증성 매개인자에 의해 활성화된 섬유아세포는 창상으로 이동하고, 증식하고, 콜라겐-풍부 세포외 매트릭스 하부에 위치한다. 재구성 프로세스 동안, 반흔 조직은 재흡수되고, 본래 조직의 일부 특징을 갖는 조직을 생성하기 위해 보다 조밀한 배향 콜라겐으로 치환된다.
미국공개특허공보 제2012-0164113호(2012.06.28.자 공개)
조직 수복을 보조하기 위한 각종 상이한 치료 방법이 개발되어 있다. 이들은 조직 내부성장을 위한 스캐폴드 (scaffold)를 제공하기 위해 물리적 구조체, 예를 들면, 보다 우수한 봉합사, 골 앵커 및 패치 또는 임플란트를 포함한다. 또한, 다양한 성장 인자는, 창상 부위에 대한 조직 성장 및 이동을 개선시킬 뿐만 아니라 혈관신생을 촉진시키기 위해 사용되어 왔다. 예를 들면, 임상전 모델에서 성장 인자, 예를 들면, BMP-2, BMP-12, PDGF-BB 및 bFGF를 사용한 개선된 건 치유의 보고가 있다.
보다 최근에, 창상 치유 및 조직 재생을 촉진하기 위해 줄기 세포를 사용하는 노력이 이루어졌다. 줄기 세포는, 염증 프로세스의 조절; 손상된 조직으로의 이동 및 조직 성장에 필요한 기타 세포, 예를 들면, 내피 전구 세포의 동원; 수복 세포의 증식 자극; 반흔 형성을 통한 조직 재구성의 지원; 및 골, 연골, 건 또는 인대 조직으로의 분화를 포함하는 임의의 각종 상이한 메카니즘에 의해 창상 치유를 매개하는 것으로 생각된다. 다수의 상이한 조직을 치료 또는 생성하기 위한 줄기 세포의 사용을 기재하는 다수의 보고가 있어 왔다. 이들 연구의 대부분은, 이들이 용이하게 대량으로 수득되기 때문에, 지방 유래 줄기 세포 및 기타 다능성 세포의 사용에 집중되어 있다. 그러나, 이식된 동종이계 세포 또는 조직이 면역 반응 및 궁극적으로 거부반응을 유발하거나 유해한 바이러스 또는 기타 병원체를 전이시킬 수 있다는 관심 때문에, 이러한 연구는 자가 세포의 사용에 초점을 맞춰 왔다. 그러나, 불운하게도, 자가 줄기 세포의 사용은 불편하다. 이는 관련된 통증, 비용 및 유병률과 함께 2가지 별개의 외과 수술을 필요로 하고, 또한 처리를 위해 조직을 실험실로 출하하는 것 및 손상된 환자의 치료 지연과 연관된 위험이 있다.
명백하게는, 바람직하지 않은 면역 반응을 유발하지 않고서, 조직 손상의 치료 및 수복에 유용한 동종이계 줄기 세포 및 기타 다능성 세포의 신규한 치료학적 조성물이 당해 기술분야에서 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고, 기타 잇점을 제공한다.
따라서, 몇가지 실시형태에서, 예를 들면, 조직의 수복 및/또는 재생에 유용한 신규한 조성물, 방법, 키트 및 세포 모집단이 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 다능성 세포 또는 처리된 미세혈관 조직, 또는 상기 세포 또는 조직으로부터 수득되거나 이로부터 유래하는 세포 막을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물이 혈관신생 또는 항-염증 활성을 갖고, 상기 조성물이 멸균되고/되거나 상기 조성물 중의 바이러스가 불활성화되는, 조성물이 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 세포 또는 조성물은 배양되지 않는다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물에 존재하는 세포의 50% 이하 또는 10% 이하는 생존가능하다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물에 존재하는 세포의 실질적으로 어느 것도 생존가능하지 않다. 특정 실시형태에서, 상기 세포의 적어도 1%는 트리판 블루를 배제한다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 건조, 동결건조 또는 동결보존된다. 관련 실시형태에서, 멸균된, 건조된, 동결건조된 또는 동결보존된 조성물을 포함하는 상기 조성물은, 대략 실온에서 적어도 1개월 동안 저장하는 경우, 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 보유한다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 부형제를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은, 예를 들면, 골-유래 임플란트, 생물섬유 스캐폴드, 다공질 흡수성 폴리머, 하이드로겔, 조직 생성물을 포함하는 퍼티(putty) 또는 봉합사일 수 있는 이식가능한 스캐폴드 또는 매트릭스를 추가로 포함한다. 특히, 세포, 조직 또는 세포 막은 상기 이식가능한 스캐폴드 또는 매트릭스의 골, 건, 또는 피부대면 표면 (dermal facing surface) 상에 존재한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화된다. 그러나, 직접 투여(조직 표면에 또는 직접 주입에 의해), 동맥내 투여, 전신 투여 등을 포함하는 다른 투여 경로가 추가의 실시형태에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 세포 또는 조직은 포유동물 공여체, 임의로 인간으로부터 수득된다. 한 가지 실시형태에서, 공여체는 상기 세포 또는 조직이 수득되는 시점에서 건강한 포유동물이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 단리된 다능성 세포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 조성물은 혈관신생 또는 항-염증 활성을 갖고, 상기 방법은 공여체 포유동물로부터 수득한 조직 샘플을 해리시켜 그 안의 복수의 다능성 세포를 방출시키는 단계; 복수의 방출된 다능성 세포를 하나 이상의 다른 조직 성분으로부터 분리하여 단리된 다능성 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 단계; 상기 조성물을 멸균 전후에 임의로 건조, 동결건조 또는 동결보존시키는 단계; 상기 조성물을 멸균시키고/시키거나 상기 조성물에 존재하는 바이러스를 상기 조성물의 임의의 건조, 동결건조 또는 동결보존 전후에 불활성화시키는 단계를 포함하고, 상기 멸균된 조성물은 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 보유하는, 방법이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 세포 또는 조성물은 배양되지 않는다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들면, 멸균 또는 건조, 동결건조 또는 동결보존 전일 수 있는 방출된 세포 또는 조성물을 여과하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 해리는 조직 샘플을 하나 이상의 프로테아제와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 프로테아제는 콜라게나제를 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 프로테아제는 콜라게나제 유형 1 및 디스파제 또는 서모리신(thermolysin); 또는 MMP2, MMP14 및 디스파제 또는 서모리신을 포함하거나 이들로 이루어진다. 이들 프로테아제(또는 기타 기능적 등가물)의 조합이 사용될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 상기 해리 또는 분리는 초음파 진탕, 여과, 또는 밀도 구배의 사용을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 조직은 지방 유래 조직이고, 초음파 진탕, 여과 또는 밀도 구배의 사용은 지방세포로부터 상기 방출된 다능성 세포를 분리한다.
추가의 실시형태에서, 처리된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 조성물은 혈관신생 또는 항-염증 활성을 갖고, 상기 방법은 공여체 포유동물로부터 수득한 미세혈관 조직 샘플을 해리시켜, 해리된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물을 생성하는 단계; 하나 이상의 조직 성분을, 해리된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물로부터 제거하는 단계; 상기 조성물을 멸균 전후에 임의로 건조, 동결건조 또는 동결보존시키는 단계; 및 상기 조성물을 멸균시키고/시키거나 상기 조성물에 존재하는 바이러스를 임의의 건조, 동결건조 또는 동결보존 전후에 불활성화시키는 단계를 포함하고; 상기 멸균된 조성물은 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 보유하는, 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 세포 또는 조성물은 배양되지 않는다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 조성물을 여과시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 해리는 조직 샘플을 하나 이상의 프로테아제와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 프로테아제는 콜라게나제를 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 프로테아제는 콜라게나제 유형 1 및 디스파제 또는 서모리신; 또는 MMP2, MMP14 및 디스파제 또는 서모리신을 포함하거나 이들로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 상기 해리 또는 제거는 초음파 진탕, 여과, 또는 밀도 구배의 사용을 포함한다. 특정 실시형태에서, 미세혈관 조직은 지방-유래 조직이고, 상기 초음파 진탕, 여과 또는 밀도 구배의 사용은 지방세포를 상기 조성물로부터 제거한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 멸균의 건조 조성물을 포함하는 수분 불투과성 용기로서, 상기 조성물은 단리된 다능성 세포 또는 처리된 미세혈관 조직, 또는 상기 세포 또는 조직을 포함하거나 상기 세포 또는 조직으로부터 수득되는 세포 막을 포함하고, 상기 조성물은 혈관신생 또는 항-염증 활성을 갖고, 상기 조성물은 멸균되고/되거나 상기 조성물 중의 바이러스는 불활성화되고, 상기 조성물은, 대략 실온에서 적어도 1개월 동안 저장하는 경우, 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 보유하는, 수분 불투과성 용기를 제공한다. 특정 실시형태에서, 상기 세포 또는 조성물은 배양되지 않는다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물에 존재하는 세포의 50% 이하 또는 10% 이하는 생존가능하다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물에 존재하는 세포의 실질적으로 어느 것도 생존가능하지 않다. 특정 실시형태에서, 상기 세포의 적어도 1%는 트리판 블루를 배제한다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 부형제를 포함한다.
수분 불투과성 용기의 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 이식가능한 스캐폴드 또는 매트릭스를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 이식가능한 스캐폴드 또는 매트릭스는 골-유래된 임플란트, 생물섬유 스캐폴드, 다공질 흡수성 폴리머, 하이드로겔, 조직 생성물을 포함하는 퍼티 또는 봉합사이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포, 조직 또는 세포 막은 상기 이식가능한 스캐폴드 또는 매트릭스의 골, 건 또는 피부대면 표면 상에 존재한다.
수분 불투과성 용기의 한 가지 실시형태에서, 상기 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화된다.
본 발명의 수분 불투과성 용기의 특정 실시형태에서, 상기 세포 또는 조직은 포유동물 공여체, 임의로 인간으로부터 수득된다. 특정 실시형태에서, 상기 공여체는 상기 세포 또는 조직이 수득되는 시점에서 건강한 포유동물이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 용기는 기밀 씰(seal)을 포함하는 바이알이다. 다양한 실시형태에서, 상기 용기는 멸균 내부를 포함하는 밀봉된 팩키지 내에 존재한다.
또 다른 관련 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 방법으로 제조한 조성물을 포유동물에게 제공하는 것을 포함하여, 상기 포유동물에서 손상 또는 질환을 치료 또는 예방하거나 조직 재생을 촉진시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 포유동물에게 외과적으로 이식된다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 상기 포유동물에게 손상 또는 질환의 부위 내에 또는 인접하여 이식된다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 상기 포유동물에게 정맥내로 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 손상은 연질 조직에 존재한다. 특정 실시형태에서, 상기 손상은 건, 인대, 피부, 골, 연골, 추간판 또는 미세혈관 조직에 존재한다. 특정 실시형태에서, 상기 손상 또는 질환은 허혈성 손상, 재관류 손상, 미세혈관 손상 또는 염증이다. 특정 실시형태에서, 상기 질환은 관절염, 예를 들면, 골관절염 또는 류마티스성 관절염이다.
추가의 실시형태에서, 다능성 세포 및 하나 이상의 혈관 벽 및/또는 세포외 매트릭스 성분을 포함하는 조성물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다능성 세포를 포함하는 멸균된 조성물을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 트리판 블루를 배제하지만 증식할 수 없는 다능성 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 다능성 세포 및 하나 이상의 혈관 벽 세포외 매트릭스 성분을 포함하는 조성물을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 다능성 세포를 포함하는 멸균된 조성물을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 트리판 블루를 배제하지만 증식할 수 없는 다능성 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 관련 실시형태에서, 본 발명은 트리판 블루를 배제하지만 증식할 수 없는 멸균된 다능성 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 본 발명의 조성물의 특정 실시형태에서, 상기 조성물에 존재하는 세포의 적어도 50% 또는 적어도 90%는 트리판 블루를 배제하지만 증식할 수 없다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 다능성 세포를 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 상기 조성물에 존재하는 다능성 세포의 적어도 50% 또는 적어도 90%는 트리판 블루를 배제하지만 증식할 수 없다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물에 존재하는 전체 세포의 50% 이하 또는 10% 이하는 생존가능하다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물에 존재하는 세포의 실질적으로 어느 것도 생존가능하지 않다. 본 발명의 임의의 조성물 또는 방법의 특정 실시형태에서, 상기 세포의 적어도 1% 또는 적어도 5%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 적어도 50%, 또는 적어도 90%는 트리판 블루를 배제한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 다능성 세포의 2개 이상의 성분을 포함하는 멸균된 조성물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 다능성 세포의 5개 이상 또는 10개 이상의 성분을 포함한다. 또 다른 관련 실시형태에서, 본 발명은 다능성 세포로부터의 세포 막 및 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 임의의 생존가능한 세포를 포함하지 않거나 임의의 무손상 세포를 포함하지 않는다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 임의 조성물이 본원에 기재된 임의의 손상 또는 상태를 포함하는 대상체의 손상 또는 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있고, 상기 다능성 세포가 상기 대상체에 대해 자가유래하지 않는 것을 제공한다.
상기 요약되고 하기에 추가로 상세하게 기재된 방법은 의사가 취한 특정의 실시를 기재하지만, 이들은 다른 당사자에 의한 이들 실시의 지시를 또한 포함할 수 있는 것으로 이해해야 한다. 따라서, "미세혈관 조직에 투여하는" 등의 실시는 "미세혈관 조직의 투여를 지시하는" 것을 포함한다.
도 1은 실시예 1에 기재된 연구의 개략도를 제공한다.
도 2는 6개의 필드에서 세포의 100배 배율당 추정 세포 수를 나타내는 그래프이다. 방사선 전후(대조군)에 완충제 1 & 2 중의 BMA 및 BMB 세포는, 표지된 CM-DiI인 HUVEC 세포를 유인하기 위해 사용되었다. 세포 수는 100배 배율에서 6개 이미지(필드)의 시각적 계수로 추정했다. 계수를 평균하고, 제시된 바와 같이 플롯팅했다. 점선은 음성 배지 대조군에 대한 평균을 나타낸다. 당해 라인 위의 세포 수는 BMA 또는 BMB 물질 샘플로 인한 증가된 이주를 나타낸다. 상하로 제시된 표지는 각각의 시점에 대해 좌우로 제시된 바에 대응한다.
도 3은 이주의 12, 24 및 48시간 경과에 걸쳐 완충제 1 중의 BMA의 존재하에 표지된 인간 내피 세포의 형광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 4는 이주의 12, 24 및 48시간 경과에 걸쳐 완충제 1 중의 BMB의 존재하에 표지된 인간 내피 세포의 형광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 5는 이주의 12, 24 및 48시간 경과에 걸쳐 완충제 2 중의 BMA의 존재하에 표지된 인간 내피 세포의 형광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 6은 이주의 12, 24 및 48시간 경과에 걸쳐 완충제 2 중의 BMB의 존재하에 표지된 인간 내피 세포의 형광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 7은 표지된 인간 내피 세포의 형광 현미경 이미지를 나타낸다. 좌측 상의 샘플은, 세포가 보존되어 있는 완충제 1 & 2를 대표하는 희석하지 않은 EZ-CPZTM이다. EZ-CPZTM은 동결보존 배지이다(Incell Corp., San Antonio, TX). EZ-CPZTM은, 세포 현탁액과 온화하게 1:1(v:v) 혼합되어 있는, 즉시-사용, 혈청-비함유 및 단백질-비함유 동결보존 배지로서 인셀 코포레이션(Incell Corp.)에 의해 기재되어 있다. EZ-CPZTM은, 1차 세포 배양물, 림프구, 하이브리도마, CHO, 콜론, IBHK 및 암세포주를 포함하는 다양한 세포형의 높은 생존율 및 소생을 지지한다. EZ-CPZTM은 임상 등급의 성분, 유리질화 및 동결보존제 및 5% DMSO의 최종 농도의 독자 제형을 함유한다. EZ-CPZTM은 인간 및 기타 포유동물 세포에 대한 동결보호를 제공한다. 우측은 EZ-CPZ 및 M3DTM 규정된 배지(Incell Corp., San Antonio, TX)의 50:50 혼합물이고, 이는 처리된 미세혈관 조직 조성물 물질이 보존되는 완충제를 대표한다. M3DTM은, 염, 아미노산 및 당을 함유하지만 혈청 또는 추출물 등의 성장 인자 또는 규정되지 않은 성분을 함유하지 않는 규정된 배지로서 인셀 코포레이션에 의해 기재되어 있다. 이주의 시간 경과는 12 및 48시간 시점에서 이미지화했다.
도 8은 형광 현미경 이미지를 나타낸다. SVF 세포를 48웰 플레이트에 플레이팅하고, 대략 50% 컨플루언스로 성장시켰다. BMA 물질은 CMDiI로 염색하고, 세정했다. 50㎕의 BMA 물질을 성장하는 SVF 세포의 단일 웰 상에 위치시켰다. 형광은, SVF 세포가 CMDiI 염색된 물질을 흡수하고 이를 이들의 자가 막 내로 도입하는 경우에 관찰했다. 완충제 I 중의 BMA 물질은 상부 열에 도시하고, 완충제 2의 BMA 물질은 하부 열에 도시한다. 좌측의 물질은 조사하고, 우측의 물질(대조군)은 조사하지 않았다.
도 9는 형광 현미경 이미지를 나타낸다. SVF 세포를 48웰 플레이트에 플레이팅하고, 대략 50% 컨플루언스로 성장시켰다. BMB 물질은 CMDiI로 염색하고, 세정했다. 50㎕의 BMA 물질을 성장하는 SVF 세포의 단일 웰 상에 위치시켰다. 형광은, SVF 세포가 CMDiI 염색된 물질을 흡수하고 이를 이들의 자가 막 내로 도입되는 경우에 관찰했다. 완충제 I 중의 BMB 물질은 상부 열에 도시하고, 완충제 2의 BMB 물질은 하부 열에 도시한다. 좌측의 물질은 조사하고, 우측의 물질(대조군)은 조사하지 않았다.
도 10은 미세혈관 조직에 대한 노출에 반응하여 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 세포의 이동과 관련된 데이터를 나타낸다. 트랜스웰(Transwell) 플레이트의 막을 통과하는 HUVEC의 수를 48시간에서 계수하고, 배양 배지 + EGF 대조군과 비교했다.
도 11은 동결건조되거나 멸균된 미세혈관 조직의 투여 후에 0일, 및 7일 및 14일에서 대퇴부 동맥 절단 후의 마우스의 후지에 대한 혈류의 회복과 관련된 데이터를 나타낸다.
도 12는 단독으로 또는 동결건조되거나 멸균된 미세혈관 조직과 조합하여 마트리겔을 사용한 주사 후에 SCID 마우스에서 새로운 혈관의 생성과 관련된 데이터를 나타낸다.
도 13a 내지 13c는 미세혈관 조직의 이식 후에 골의 재생에 관한 것이다. 도 13a는 미세혈관 조직의 존재 또는 부재하에 스캐폴드의 투여후 강도, 탄성율 및 인성(대조군 대측 골과 비교하여)과 관련된 데이터를 나타낸다. 도 13b는 스캐폴드 단독의 투여후 골 재생에 관한 조직 데이터를 나타낸다. 도 13c는 미세혈관 조직과 조합하여 스캐폴드의 투여후 골 재생에 관한 조직 데이터를 나타낸다.
도 14a 내지 도 14h는 미세혈관 조직의 이식후 연골의 재생에 관한 것이다. 도 14a는 스캐폴드 단독으로 처리한 연골의 현미경 이미지를 나타내고, 도 14b, 14c 및 14d는 스캐폴드 단독으로 처리한 연골에서 유도된 연골 결함의 충전, 프로테오글리칸 체류 및 매트릭스 염색(각각)과 관련된 이미지를 나타낸다. 도 14e는 미세혈관 조직이 보충된 스캐폴드로 처리한 연골의 현미경 이미지를 나타내고, 도 14f, 14g 및 14h는 미세혈관 조직이 보충된 스캐폴드로 처리한 연골에서 유도된 연골 결함의 충전, 프로테오글리칸 체류 및 매트릭스 염색(각각)과 관련된 이미지를 나타낸다.
도 15a 내지 15f는 미세혈관 조직을 사용한 마모된 건의 수복과 관련된다. 도 15a 및 15b는 마모된 및 무처리 건의 메이슨 트리크롬(Masson's Trichrome) 염색 또는 테나신 면역조직화학을 각각 나타낸다. 도 15c 및 15d는 스캐폴드 단독으로 처리된 마모된 건의 메이슨 트리크롬 염색 또는 테나신 면역조직화학을 각각 나타낸다. 도 15e 및 15f는 미세혈관 조직이 보충된 스캐폴드로 처리한 마모된 건의 메이슨 트리크롬 염색 또는 테나신 면역조직화학을 각각 나타낸다.
본 발명은, 부분적으로, 단리된 다능성 세포 또는 처리된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물, 또는 상기 세포 또는 조직으로 구성된 세포 막을 생성하기 위해 미세혈관 조직을 처리하는 신규한 방법의 개발에 기반한다. 다양한 실시형태에서, 세포 또는 조직은 이들 과정 동안 배양되지 않는다. 유리하게는, 상기 조성물은 혈관신생 또는 항-염증 활성을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 조성물은 멸균되고/되거나, 상기 조성물 중의 바이러스는 상기 과정 동안 불활성화되지만, 상기 조성물은 여전히 예상치 않은 치료학적 효과를 나타낸다.
본 발명의 방법으로 제조한 신규한 조성물은, 대상체에서 손상, 예를 들면, 연질 조직 손상의 치료 또는 예방과 연관된 이점을 포함하여, 사전 처리된 미세혈관 조직 및 다능성 세포 조성물에 비해 이점을 제공한다. 이들 이점은 (이로써 한정되지 않지만) 하기를 포함한다: (1) 대상체의 동종이계 또는 이종 치료를 위해 본 발명의 조성물을 사용하는 능력; (2) 본 발명의 조성물은 감소된 면역 반응 및 감소된 거부 가능성을 생성한다; (3) 본 발명의 조성물은 항-염증 활성을 갖는다; (4) 본 발명의 조성물은 혈관신생 활성을 갖는다; (5) 본 발명의 조성물은 멸균되고/되거나 유해한 바이러스에 의해 오염되지 않는다; (6) 본 발명의 조성물은 사용전에 안정하게 저장할 수 있고/있거나 즉시 사용 가능할 수 있다. 요컨대, 이들 조성물은, 조직으로의 분화를 제외한, 전통적인 생존가능한 줄기 또는 다능성 세포 제조에 고유한 작용 메카니즘 모두를 제공한다. 하기의 기재에 있어서, 특정의 상세는 본 발명의 다양한 실시형태의 완전한 이해를 제공하기 위해 기재되어 있다. 그러나, 당해 기술분야의 숙련자는 본 발명이 이들 상세 없이도 실시될 수 있음을 이해할 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 숙련가가 통상 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어를 이하에 정의한다.
단어 "a" 및 "an"은, 특별히 명시하지 않는 한, 하나 이상을 의미한다.
"약"이란 기준 수량, 수준, 수치, 수, 빈도, 비율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%만큼 달라지는 수량, 수준, 수치, 수, 빈도, 비율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다. 용어 "약"과 조합하여 사용된 수치의 문맥에서 설명된 임의의 실시형태에서, 이는 용어 약을 생략할 수 있는 것이 구체적으로 의도된다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 특허청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다", 및 "포함한다" 및 "포함하는" 등의 이의 변형태는 제한 없는 포괄적 의미, 즉 "포함하나 이에 한정되지 않는" 것으로 해석되어야 한다.
"이루어진"이란, 문구 "이루어진"의 후의 모든 것을 포함하고 이에 한정되는 것을 의미한다. 따라서, 문구 "이루어진"은, 수록된 요소가 요구되거나 필수이고, 어떤 요소도 존재하지 않는 것을 나타낸다.
"실질적으로 이루어진"이란, 당해 문구 후에 수록된 임의의 요소를 포함하는 것을 의미하고, 수록된 요소에 대한 개시에 명시된 활성 또는 작용을 간섭하지 않거나 이에 관여하지 않는 다른 요소로 한정된다. 따라서, 문구 "실질적으로 이루어진"은 수록된 요소가 요구되거나 필수이지만, 다른 요소는 임의적이고, 이들이 수록된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지의 여부에 따라 존재하거나 존재하지 않을 수 있음을 나타낸다.
본 명세서 전체와 관련하여, "한 가지 실시형태" 또는 "하나의 실시형태"는 당해 실시형태와 결합하여 기재된 특정의 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 한 가지 실시형태에 포함되는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐 다양한 장소에서 문구 "한 가지 실시형태" 또는 "하나의 실시형태"의 출현은 반드시 모두 동일한 실시형태를 지칭하는 것은 아니다. 추가로, 특정의 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능" 및 "기능성" 등은 생물학적, 효소적 또는 치료적 기능을 지칭한다.
"증가된" 또는 "증강된" 양은 전형적으로 "통계학적으로 유의한" 양이고, 본원에 기재된 양 또는 수준의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50배 또는 그 이상(예: 100, 500, 1000배)(1과 이보다 큰 수 사이의 모든 정수 및 소수, 예를 들면, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 등을 포함)인 증가를 포함할 수 있다.
"감소된" 또는 "저하된" 또는 "보다 적은" 양은 전형적으로 "통계학적으로 유의한" 양이고, 본원에 기재된 양 또는 수준의 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50배 또는 그 이상(예: 100, 500, 1000배)(1과 이보다 큰 수 사이의 모든 정수 및 소수, 예를 들면, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등을 포함)인 감소를 포함할 수 있다.
"로부터 수득된"이란, 특정한 공급원, 예를 들면, 목적하는 생물 또는 목적하는 생물 내의 특정한 조직으로부터 단리되거나 이로부터 유래하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 예를 들면, 다능성 세포와 관련하여 용어 "단리된"은 이의 자연 환경으로부터 제거된 것을 의미한다. 예를 들면, 이의 자연 환경에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리되는 경우에, 세포는 단리되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "처리된 미세혈관 조직"은 본원에 기재된 바와 같이 해리되어 있는 미세혈관 조직을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "동결보존된"은, 예를 들면, 저온에서 동결되는 다능성 세포 또는 처리된 미세혈관 조직 조성물을 지칭한다. 처리된 미세혈관 조직 및 동결보존된 다능성 세포 및 미세혈관 조직 조성물은 항-염증 활성 및 혈관신생 활성을 포함하는 다양한 생물학적 특성을 갖는다.
"다능성 세포"는 2개 이상의 상이한 특수 세포형으로 분화하는 능력을 유지하는 세포를 지칭한다. "다능성 세포"는 줄기 세포 및 다능성 전구 세포를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다능성 세포"는, 본원에 기재된 방법에 따라 멸균되거나 보존되기 전에, 2개 이상의 상이한 특수 세포형으로 분화하는 세포의 본래 능력을 지칭한다. 다능성 세포의 예는 간엽계 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 내피 전구 세포, 지방-유래된 줄기 세포 및 제대 줄기 세포를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 본원에 기재된 방법에 따라 멸균 또는 보존 후에, 다능성 세포는 성장 또는 분화하는 이의 능력을 상실할 수 있는 것으로 이해된다.
"약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 제한 없이 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활주제, 감미제, 희석제, 방부제, 염료/착색제, 향미제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장화제, 용매 또는 유화제를 포함하고, 이들은 미국 식품의약품국에 의해 인간 또는 가축에서의 사용이 허용되는 것으로 승인되어 있다.
"약제학적 조성물"은 본 발명의 조성물과, 포유동물, 예를 들면, 인간에게 치료제의 전달을 위해 당해 기술분야에서 일반적으로 허용되는 매질의 제형을 지칭한다. 이러한 매질은 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 당해 문맥이 달리 명시하지 않는 한, "치료" 및, "치료된", "치료하는" 등의 유사한 단어는 임상 결과를 포함하여 유리하거나 목적하는 결과를 수득하는 접근법을 나타낸다. 치료는 임의로 손상, 질환 또는 상태의 증상의 감소 또는 완화, 또는 손상, 질환 또는 상태의 진행의 지연을 임의로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 조성물의 투여는, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 이러한 증상을 치료할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 당해 문맥이 달리 명시하지 않는 한, "예방" 및, "예방된", "예방하는" 등의 유사한 단어는 손상, 질환 또는 상태의 개시 또는 개발 가능성을 예방, 억제 또는 감소시키는 접근법을 나타낸다. 이는 또한 손상, 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상의 발생 또는 재발 가능성을 예방, 억제 또는 감소시키는 것, 또는 임의로 손상, 질환 또는 상태의 하나 이상의 개시 또는 재발의 개시를 지연시키거나 손상, 질환 또는 상태의 하나 이상의 발생 또는 재발을 지연시키는 접근법을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "예방" 및 유사한 단어는 또한 손상, 질환 또는 상태의 강도, 효과, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물의 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은, 예를 들면, 유리한 임상 결과 등의 목적하는 생물학적 효과에 영향을 미치기에 충분한 양이다.
용어 "자가 전이", "자가 이식" 등은, 조직 공여체가 또한 조직으로부터 생성된 조성물의 수령자인 치료를 지칭한다.
용어 "동종이계 전이", "동종이계 이식" 등은, 조직 공여체가 조직으로부터 생성된 조성물의 수령자와 동일한 종의 것이지만 동일한 개체는 아닌 치료를 지칭한다.
용어 "이종 전이", "이종 이식" 등은, 조직 공여체가 조직으로부터 생성된 조성물의 수령자와는 상이한 종의 것인 치료를 지칭한다.
줄기 세포 및 미세혈관 조직 조성물을 생성하는 방법
본 발명의 국면은 다능성 세포 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 생성하기 위해 혈관, 예를 들면, 미세혈관, 조직을 처리하는 신규한 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 추가의 조직 성분을 추가로 포함한다. 따라서, 용어 "처리된 미세혈관 조직 조성물"은, 무손상 다능성 세포를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 본 발명의 조성물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 미세혈관 조직 조성물은 임의의 무손상 다능성 세포를 포함하지 않거나, 임의의 살아있는 다능성 세포를 포함하지 않거나, 임의의 살아있는 세포를 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 미세혈관 조직 조성물은 다능성 세포의 단편 또는 세포 막을 포함한다. 본 발명의 "다능성 세포를 포함하는 조성물" 또는 "다능성 세포 조성물"은 살아있는 및/또는 사멸 다능성 세포를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태는, 다양한 손상, 질환 또는 병리학적 상태, 예를 들면, 연질 조직 손상의 치료 및 예방에 유용한 것들을 포함하여 다능성 세포 및 미세혈관 조직 조성물을 생성하는 신규한 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 단리된 다능성 세포 또는 미세혈관 조직 조성물을 멸균시키고/시키거나 상기 세포 또는 조직 중의 바이러스를 불활성화시키는 것을 포함한다. 이러한 멸균된 다능성 세포 및 미세혈관 조직 조성물이 손상, 질환 및 다른 병리학적 상태의 치료 또는 예방에 유용한 특성을 포함하는 목적하는 생물학적 특성을 보유한다는 것은 예상치 않은 놀라운 발견이다.
본 발명의 다능성 세포 및 미세혈관 조직 조성물은 임의의 포유동물, 예를 들면, 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이 또는 말 등의 포유동물로부터 수득한 조직으로부터 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물은 자가, 동종이계 또는 이종 대상체를 치료하기 위해 사용할 수 있다. 따라서, 조직은 치료되는 대상체 또는, 치료되는 대상체와 동일하거나 상이한 종일 수 있는 상이한 공여체 동물로부터 수득할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조직은 치료되는 대상체와 동일한 종의 동종이계 공여체, 예를 들면, 인간 또는 비인간 포유동물 공여체로부터 수득된다. 특정 실시형태에서, 공여체 동물은 건강한 공여체이다.
다양한 실시형태에서, 다능성 세포 또는 미세혈관 조직 조성물은 임의의 다수의 상이한 조직으로부터 제조된다. 특정 실시형태에서, 조직은 비-배아 조직이다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 제조에 사용된 조직은 혈관 조직 또는 미세혈관 조직, 예를 들면, 지방 조직, 피부, 골, 건 조직, 분만후 조직(예: 제대 조직 또는 태반 조직), 골수 또는 근육 조직이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 조직 샘플을 해리시켜 세포 및/또는 기타 조직 성분을 방출시키는 단계; 방출된 세포 및/또는 조직 성분의 적어도 일부를 하나 이상의 기타 조직 성분으로부터 분리하는 단계; 및 분리된 세포 및/또는 조직 성분을 멸균시키고/시키거나 분리된 세포 및/또는 조직 성분을 처리하여 바이러스를 그 속에서 불활성화시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다. 특정 실시형태에서, 분리된 세포 및/또는 조직 성분은 바이러스를 불활성화시키기 위해 멸균되거나 치료되기 전에, 동안 또는 후에 건조, 동결건조, 동결 또는 동결보존된다. 특정 실시형태에서, 분리된 세포 및/또는 조직 성분은 건조, 동결건조, 동결 또는 동결보존된 후에 바이러스를 불활성화시키기 위해 멸균되거나 처리된다. 관련 실시형태에서, 분리된 세포 및/또는 조직 성분은 동결방지제, 예를 들면, 세포를 멸균 방사선으로부터 보호하는 동결방지제와 접촉시킨 후에 바이러스를 불활성화시키기 위해 멸균되거나 처리된다. 동결방지제는 단백질을 안정화시키고, 유리 라디칼을 퀀칭시키고 산화에 저항함으로써 세포 성분을 보호할 수 있다. 손상은 조사 동안 조성물을 냉각시키고 산소를 조성물로부터 제거(조성물을 건조시키고/시키거나 진공 또는 불활성 분위기에서 조사함으로써)함으로써 추가로 최소화시킬 수 있다.
관련 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 공여체 포유동물로부터 조직 샘플을 해리시켜 그 안의 복수의 다능성 세포를 방출시키는 단계; 복수의 방출된 다능성 세포를 하나 이상의 다른 조직 성분으로부터 분리시켜, 단리된 다능성 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 단계; 및 단리된 다능성 세포를 포함하는 조성물을 멸균시키고/시키거나 단리된 다능성 세포를 포함하는 조성물에 존재하는 바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 다능성 세포를 포함하는 조성물은, 바이러스를 불활성화시키기 위해 멸균되거나 처리되기 전에, 동안 또는 후에 건조, 동결건조, 동결 또는 동결보존된다. 특정 실시형태에서, 분리된 세포 및/또는 조직 성분은, 건조, 동결건조, 동결 또는 동결보존시킨 후에 바이러스를 불화성화시키기 위해 멸균되거나 처리된다. 관련 실시형태에서, 분리된 세포 및/또는 조직 성분은, 동결방지제, 예를 들면, 세포를 멸균 방사선으로부터 보호하는 동결방지제와 접촉시킨 후에 바이러스를 불활성화시키기 위해 멸균되거나 처리된다.
추가의 관련 실시형태에서, 본 발명의 방법은 공여체 포유동물로부터 수득한 조직 샘플을 해리시켜 그 안의 복수의 조직 성분을 방출시키는 단계; 복수의 방출된 조직 성분을 분리시켜, 하나 이상의 조직 성분을 포함하는 조성물을 생성하는 단계; 및 상기 조성물을 멸균시키고/시키거나 상기 조성물에 존재하는 바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은, 바이러스를 불활성화시키기 위해 멸균 또는 처리되기 전에, 동안 또는 후에 건조, 동결건조, 동결 또는 동결보존된다. 특정 실시형태에서, 분리된 세포 및/또는 조직 성분은, 건조, 동결건조, 동결 또는 동결보존시킨 후에 바이러스를 불활성화시키기 위해 멸균되거나 처리된다. 관련 실시형태에서, 분리된 세포 및/또는 조직 성분은, 동결방지제, 예를 들면, 세포를 멸균 방산선으로부터 보호하는 동결방지제와 접촉시킨 후에 바이러스를 불활성화시키기 위해 멸균되거나 처리된다.
특정 실시형태에서, 조직 성분은 하나 이상의 다능성 세포, 분화된 세포, 세포외 매트릭스의 성분, 성장 인자, 혈관신생제, 항-염증제, 사이토킨, 케모킨 및/또는 분화제를 포함한다. 세포외 매트릭스는 본원에 기재된 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들면, 다양한 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴 및 트롬보스폰딘 등을 포함하나 이로 한정되지 않는다.
조직 샘플은 수술, 지방흡입, 생검 또는 침 생검을 포함하는 다양한 상이한 방법에 의해 대상체 또는 공여체로부터 수득할 수 있다. 공여체는 살아있는 것이거나 죽은 것, 예를 들면, 최근 죽은 것일 수 있다.
조직은 기계적 및/또는 효소적 처리 둘 다를 포함하는 다양한 방법으로 해리시킬 수 있다. 예를 들면, 조직은 기계적 힘(잘게 분쇄(mincing) 또는 전단력), 단일 또는 조합의 단백질분해 효소, 예를 들면, 매트릭스 메탈로프로테아제 및/또는 중성 프로테아제, 예를 들면, 콜라게나제, 트립신, 디스파제, 리베라제(LIBERASE)(Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Tnd.), 히알루로니다제 및/또는 펩신을 사용한 효소적 소화, 또는 기계적 및 효소적 방법의 조합에 의해 해리시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 콜라게나제의 사용을 채용하지 않는다.
특정 실시형태에서, 효소적 소화 방법은 효소의 조합, 예를 들면, 매트릭스 메탈로프로테아제와 중성 프로테아제의 조합을 사용한다. 특정 실시형태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 콜라게나제일 수 있고, 중성 프로테아제는 서모리신 또는 디스파제일 수 있다. 콜라게나제는 유형 1, 2, 3 또는 4(MMP 1, 8, 13, 18)일 수 있다. 특정 실시형태에서, 효소적 소화 방법은 매트릭스 메탈로프로테아제, 중성 프로테아제, 및 히알루론산의 소화를 위한 점액용해 효소의 조합, 예를 들면, 콜라게나제, 디스파제 및 히알루로니다제 또는 LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, ind.) 및 히알루로니다제의 조합을 채용한다. 세포 해리를 위해 당해 기술분야에 공지된 기타 효소는, 자체로 또는 다른 효소, 예를 들면, 매트릭스 메탈로프로테아제, 점액용해 효소 및 중성 프로테아제와 조합하여 사용될 수 있는, 파파인, 데옥시리보뉴클레아제, 세린 프로테아제, 예를 들면, 트립신, 키모트립신, 젤라티나제 또는 엘라스타제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 효소의 조합은 디스파제 또는 서모리신, 리베라제 및/또는 비타사이트와 함께 유형 1 콜라게나제를 포함하거나 이들로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 효소의 조합은 디스파제 또는 서모리신, 리베라제 및/또는 시자임과 함께 유형 1 콜라게나제를 포함하거나 이들로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 콜라게나제는 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 효소와 조합하여 사용되지 않는다. 특정 실시형태에서, MMP 2 및/또는 14는 MMP 1 대신에 사용된다(단독으로 또는 본원에 기재된 임의의 조합물에서).
해리를 달성하기 위해 조직 또는 세포가 프로테아제와 접촉하는 온도 및 시간은 공지되어 있거나, 당해 기술분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 효소적 소화 과정은 세포 해리를 증가시키거나 감소시키기 위해 조정될 수 있다. 예를 들면, 보다 완전한 세포 해리가 요구되는 경우, 하나 이상의 효소가 포함될 수 있거나 소화 시간이 증가될 수 있다. 세포 생존율이 유지될 필요가 없는 경우, 일부 실시형태에서, 세포 막은, 약간의 세포 용해가 효소적 소화 동안 발생하는 경우에도 부착 및 신호전달 분자를 함유하는 막을 보존하기 위해 일반적으로 순수한 상태로 유지하는 것이 바람직하다. 따라서, 리피다제 등의 효소의 사용은 본 발명의 한 가지 국면에 따라서 이러한 프로세스에서 유용하지 않을 수 있다.
선택적으로 또는 효소적 처리에 추가하여, 조직은 비-효소적 방법을 사용하여 해리시킬 수 있다. 예를 들면, 조직은, 킬레이트제, 초음파 진탕, 초음파(예 지방세포를 용해 또는 제거하기 위해) 또는 기계적 세포 해리의 사용을 포함하는 물리적 또는 화학적 수단을 사용하여 해리시킬 수 있다.
조직이 골인 특정 실시형태에서, 골은 콜라겐 매트릭스로부터 효소적(또는 기타) 처리 전에 탈무기질화시킨다. 특정 실시형태에서, 골은 EDTA를 사용하여 탈무기질화시킨다(조직을 탈지시키기 위한 용매, 이어서 골 무기질을 제거하기 위한 산과는 대조적으로). 특정 실시형태에서, 조직, 예를 들면, 골을 처리하는 방법은 하기의 하나 이상을 포함하지 않는다: 지방 및/또는 세포의 용매 추출, 입자 크기를 감소시키기 위한 동결-분쇄, 및/또는 산 탈무기질화.
조직 해리 후, 해리된 조직은 목적하는 조직 성분, 예를 들면, 다능성 세포(및/또는 기타 목적하는 세포 또는 비-세포 조직 성분)을 바람직하지 않은 조직 성분으로부터 단리하거나 분리하기 위해 추가로 처리할 수 있다. 이들 방법은, 예를 들면, 바람직하지 않은 세포 또는 분자, 예를 들면, 적혈구 세포, 지방세포, 기타 분화된 세포 또는 지질을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 방법, 예를 들면, 여과(예: 20μ 세공 크기 필터는 다능성 세포를 통과시키지만 다수의 지방세포 또는 근육 세포를 체류시킨다), 원심분리(지방세포 및 지질은 부유하지만, 다능성 세포는 펠렛화된다) 또는 밀도 구배(구배는 적혈구를 펠렛화하고 바람직하지 않은 세포와는 상이한 수준에서 다능성 세포를 현탁시키기 위해 사용될 수 있다)가 다능성 세포 및 기타 목적하는 조직 성분을 바람직하지 않은 세포 또는 조직 성분으로부터 분리하기 위해 사용될 수 있다. 사용된 특정 방법은, 부분적으로, 처리되는 조직의 공급원에 의존할 수 있다. 예를 들면, 조직 공급원이 지방 조직인 경우, 해리된 조직은 임의로 비교적 낮은 힘으로 원심분리하여 지질, 지방세포 및 일부 예비-지방세포를 미세혈관 조직의 다른 성분으로부터 분리하고, 밀도 구배는 다능성 세포를 골수로부터 단리하는 경우에 임의로 사용된다. 다른 실시형태에서, 근육 세포 단리 프로토콜, 예를 들면, 밀도 구배 원심분리의 사용은 근육 세포를 제거하고 목적하는 세포를 풍부화하기 위한 효소적 소화 후의 근육 조직을 추가로 처리하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 또한, 예를 들면, 응집괴를 제거하기 위해 여과한다. 예를 들면, 거대 응집괴를 제거하기 위해, 예를 들면, 20 내지 50μ 세공 크기 필터를 사용한 여과는 모세관의 폐색을 피하기 위해 정맥내 주사용 조성물의 제조 동안 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 여과는 해리 후에 및 사용 전에, 예를 들면, 해리 후에 및 동결건조 또는 멸균 전에 수행된다.
실시형태에 따라, 다능성 세포 조성물 및 미세혈관 조직 조성물은 저장 또는 보존을 위해 임의로 동결 또는 건조, 예를 들면, 건조(예: 동결 건조 또는 분무 건조), 동결보존 또는 동결된다. 당(예: 트레할로즈, 만니톨, 슈크로즈), 폴리알콜(예: 폴리에틸렌 글리콜), 알데히드, 단백질(예: 알부민), 아미노산(예: 글리신), 계면활성제(예: 트윈 20), DMSO 및/또는 퍼망가네이트를 포함하는 임의의 적합한 부형제는 본 발명의 조성물을 보존할 때에 사용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 부형제는 사용되지 않는다.
세포 및 이들의 활성 성분은 몇몇 방법에 의해 이온화 방사선에 의한 손상으로부터 부분적으로 보호될 수 있다. 산화방지제 또는 유리 라디칼 스캐빈저가 매우 효과적일 수 있다. 동결건조 및 건조 프로세스 자체에 사용된 당과 같은 거대분자를 고정시키는 제제는 파괴된 쇄가 이들의 본래 화학적 구조로 재조합되는 확률을 증가시킨다. 물, 공기 및 기타 산소 원급원의 제거는 단백질 또는 기타 생물학적 활성 종의 산화를 감소시킬 것이다. 조사 동안 조성물의 동결은 또한 부적절하게 재조합하는 분리된 분자의 확률을 감소시킨다. 최종적으로, 세포 또는 세포 중의 활성 분자보다 부형제의 보다 높은 농도는 단지 질량 작용 효과에 기인하여 활성 화합물의 보다 적은 절단이 존재한다는 것을 의미한다.
동결 건조(예: 동결건조)는 전형적으로 4단계: 전처리, 동결, 1차 건조 및 2차 건조를 포함한다. 전처리는 농도 조정 또는 하나 이상의 부형제의 첨가를 포함할 수 있다. 전처리 후, 다능성 세포 또는 미세혈관 조직 조성물을 동결시킨다. 동결 단계는 통상 세포 구조를 보존하기 위해 신중하게 조절된 방식으로 수행되지만(예를 들면, 1분당 약 -0.5℃ 내지 1분당 약 -50℃의 냉각 속도), 세포 생존율은 보존될 필요가 없다. 몇몇 실시형태에서, 다능성 세포 또는 미세혈관 조직 조성물은 1분당 약 -10℃의 냉각 속도로 동결된다. 냉각 속도는 사용된 특정 세포 또는 조직 및 부형제에 기초하여 조정될 수 있다. 다능성 세포 또는 미세혈관 조직 조성물은, 기계적 냉각의 사용 및/또는, 동결 건조에 적합한 온도에 도달할 때까지 드라이 아이스 또는 액체 질소에 대한 조성물 함유 용기의 노출을 포함하는 임의의 적절한 수단을 사용하여 동결시킬 수 있다. 1차 건조 단계 동안, 온도 및 압력은 다능성 세포 또는 미세혈관 조직으로부터 물의 승화를 유발하기에 적합한 조건을 제공하기 위해 조절된다. 특정 온도 및 압력은 사용된 부형제 및/또는 세포 또는 미세혈관 조직의 농도를 적응하도록 조절할 수 있다. 2차 건조 단계 동안, 온도 및 압력은 다능성 세포 또는 미세혈관 조직으로부터 동결되지 않은 물의 제거를 촉진시키기 위해 추가로 조정할 수 있다. 2차 건조 단계 후의 최종 함수량은 바람직하게는 약 1중량% 내지 약 4중량%(약 1% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 3%, 약 3% 내지 약 4%, 약 4% 내지 약 5%, 및 이의 중복 범위 포함)이지만, 저장 수명 또는 생물학적 활성을 최대화하기 위해 조정할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 다능성 세포 또는 미세혈관 조직 조성물은 분무 건조시킨다. 분무 건조 전에, 다능성 세포 또는 미세혈관 조직 조성물은 동결 건조되어야 하는 다능성 세포 또는 미세혈관 조직 조성물과 유사하게 전처리할 수 있고, 이때 부형제는 동결 건조가 아닌 분무 건조를 위해 적절하게 선택된다. 분무 건조 동안, 다능성 세포 또는 미세혈관 조직은 액적으로 분무되고, 건조 챔버에서 열풍에 노출된다. 한 가지 실시형태에서, 부형제는 사용된 온도하에 용융하지 않는 당이다. 특정 실시형태에서, 부형제는, 예를 들면, BHA, BHT 및 프로필 갈레이트 등의 산화방지제이다.
일부 실시형태에서, 다능성 세포 및 미세혈관 조직 조성물은 건조에 의해 처리되지 않지만, 대신에 동결보존된다. 세포 및 조직을 동결보존시키는 방법은 공지되어 있다. 예를 들면, 세포 또는 미세혈관 조직 조성물을 하나 이상의 부형제 또는 동결방지제(예: DMSO, PEG, 알부민 또는 당)과 혼합하고, 신중하게 조절된 방식으로 냉각시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 냉각은 2개 이상의 단계로 수행되고, 여기서 제1 단계는 조절된 방식(예: 1분당 1℃씩 온도 감소)으로 중간 온도(예: -30℃)까지 수행하고, 제2 단계는 세포 또는 조직을 중간 온도에서 보다 차가운 저장 온도(예: -196℃)까지 전달한다.
동결보존된 다능성 세포 또는 혈관 조직 조성물은 동결보존된 상태를 유지하기에 적합한 온도(예: 약 -30℃ 내지 -196℃)에서 저장할 수 있다. 동결-건조되거나 분무-건조된 처리된 세포 또는 미세혈관 조직은 동결보존된 세포, 살아있는 세포 또는 신선한 조직보다 광범위한 조건에서 저장할 수 있다. 처리된 세포 또는 미세혈관 조직의 저장에 적합한 온도는 약 -100℃ 내지 약 45℃의 온도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 동결-건조되거나 분무-건조된 처리된 세포 또는 미세혈관 조직은 실온에서 저장할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 제공된 처리된 세포 또는 미세혈관 조직의 저장 수명은, 하나 이상의 생물학적 활성을 유지하면서, 적어도 약 1주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 6개월 또는 그 이상일 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은, 대략 4℃에서 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 6개월 또는 적어도 약 1년 동안 저장하는 경우, 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 유지한다. 본원에 기재된 키트 및 조성물의 특정 실시형태에서, 조성물은, 대략 -20℃에서 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 6개월 또는 적어도 약 1년 동안 저장하는 경우, 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 유지한다. 특정 실시형태에서, 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성은, 본원에 기재된 임의의 것들을 포함하여 생체내 또는 시험관내 검정으로 측정하는 경우, 저장전 활성의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%이다.
해리된 조직, 또는 생성되는 조성물을 포함하여 이로부터 단리된 세포 및 기타 조직 성분은, 예를 들면, 미생물, 예를 들면, 박테리아, 바이러스 및 진균 또는 프리온에 의한 오염을 감소 또는 제거하기 위해 임의로 멸균시킨다. 특정 실시형태에서, 다능성 세포 및/또는 기타 조직 성분을 포함하는 조성물은 방사선을 사용하여 멸균시킨다. 멸균 방법은 전자 빔, X-선, 감마 선 또는 자외선 방사선 등의 방사선을 사용하여 존재한다. 특정 실시형태에서, 멸균은 해리된 조직 또는 이로부터 단리된 세포 및 기타 조직 성분을 감마 방사선에 약 0.5 내지 약 5.0 Mrad, 또는 약 1.0 내지 약 3.0 Mrad, 또는 약 1.0 Mrad, 또는 약 1.5 Mrad, 또는 약 2.0 Mrad, 또는 약 2.5 Mrad, 또는 약 3.0 Mrad, 또는 약 3.5 Mrad, 또는 약 4.0 Mrad, 또는 약 4.5 Mrad, 또는 약 5.0 Mrad(또는 이들 수치 사이의 임의 양의 감마 방사선) 범위의 용량에서 노출시킴으로써 수행한다. 특정 실시형태에서, 멸균은 해리된 조직, 또는 이로부터 단리된 세포 및 기타 조직 성분을 전자 빔 방사선에 약 0.5 내지 약 5.0 Mrad, 또는 약 1.0 내지 약 3.0 Mrad, 또는 약 1.O Mrad, 또는 약 1.5 Mrad, 또는 약 2.0 Mrad, 또는 약 2.5 Mrad, 또는 약 3.0 Mrad, 또는 약 3.5 Mrad, 또는 약 4.0 Mrad, 또는 약 4.5 Mrad, 또는 약 5.0 Mrad(또는 이들 수치 사이의 임의 양의 감마 방사선) 범위의 용량에서 노출시킴으로써 수행한다. 조성물이 노출되는 방사선의 양을 측정하는 것이 종종 보다 용이하다. 특정 실시형태에서, 멸균을 위한 E-빔 또는 감마 방사선 수준은 약 9 내지 약 30 kGy, 또는 약 20 내지 약 30 kGy, 또는 약 9 내지 약 17 kGy(또는 이들 수치 사이의 임의 양의 방사선)이다. 또한, 해리된 조직, 또는 이로부터 단리된 세포 및 기타 조직 성분은 바이러스를 불활성화시키기 위해 처리할 수 있다. 바이러스를 불활성화시키는 방법은 공지되어 있고, 멸균에 대해 상기 기재된 바와 같은 방사선의 사용을 포함한다. 산 또는 염기 처리, 표백, 알데히드 또는 에틸렌 옥사이드 용액 또는 가열을 포함하여, 바이러스를 불활성화시키는 기타 방법을 사용할 수 있다. 조성물의 동결건조 또는 동결에 사용된 동결방지제 및 기타 부형제는 방사선으로부터 또한 보호할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들면, 저온과 함께 당 및 알부민(또는 기타 안정화 단백질)은 세포에 대한 방사선 손상으로부터 보호한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 멸균 또는 바이러스 불활성화는 동결건조 후에 수행한다.
추가로, 생존율은 치료적 사용을 위한 처리되거나 동결보존된 다능성 세포 또는 미세혈관 조직 조성물의 적합성에 요구되지 않기 때문에, 보존 프로세스 및 저장은 생존율을 유지하기 위해 조정될 필요는 없다. 처리, 멸균 또는 동결보존 전에 제공된 다능성 세포 또는 미세혈관 조직 조성물 중의 생존 세포의 비율은 최대 100%일 수 있다. 처리, 멸균 또는 동결보존 후, 이는 약 50% 미만, 예를 들면, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만 또는 약 1% 미만일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 처리된 다능성 세포 또는 미세혈관 조직 조성물은 처리, 멸균 또는 동결보존 후에 생존 세포를 함유하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 처리되거나 동결보존된 다능성 세포 또는 미세혈관 조직 조성물은, 예를 들면, 연질 조직의 치료학적 수복 및/또는 재생에 사용된다. 추가의 국면에서, 처리되거나 동결보존된 다능성 세포 또는 미세혈관 조직 조성물은 경질 조직의 치료학적 수복 및/또는 재생에 사용된다.
추가로, 미생물 오염의 가능성을 감소시키기 위해, 공여체는 조직 조달 또는 처리 전에 미생물 생물의 소정 목록(예: HIV, HPV, EBV, TB 등)에 대해 스크리닝할 수 있다. 스크리닝은 공지된 기술, 예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응을 사용한 미생물 핵산의 존재의 검출 또는 ELISA에 의해 특정 미생물과 연관된 분자의 존재의 검출을 사용하여 수행할 수 있다. 미생물 오염된 미세혈관 조직은 본 발명의 일부 실시형태에 따라 사용으로부터 제외될 수 있다. 또한, 처리되거나 동결보존된 조직은 무균 또는 멸균 기술을 사용하여 생성할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 해리된 세포 또는 미세혈관 조직을 배양하는 것을 포함하지 않는다.
단리된 줄기 세포 및 미세혈관 조직 조성물
본 발명의 방법은 독특한 다능성 세포 및 미세혈관 조직 조성물을 생성한다. 본원에 제공된 다능성 세포 및 미세혈관 조직 조성물은, 몇몇 실시형태에서, 미세혈관 조직(예: 지방, 건 또는 근육 조직)의 해리(예: 효소적 소화에 의해)로부터 생성된 줄기 및/또는 전구 세포의 혼합물을 포함할 수 있는, 최소 처리된, 배양되지 않은 세포 또는 배양되지 않은 미세혈관 조직(또는 이의 성분)을 포함한다. 처리된 다능성 세포 및 미세혈관 조직 조성물은 추가의 분자(예: 전체 또는 단편화된 세포외 매트릭스 분자 또는 성장 인자)를 포함할 수 있다. 또한, 처리된 다능성 세포 및 미세혈관 조직 조성물은, 당해 국면에 따라, 다능성 세포의 단편 또는 막을 포함할 수 있다. 추가로, 처리된 미세혈관 조직은 무손상 다능성 세포를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법은 다능성 세포 또는 처리된 미세혈관 조직을 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 세포형 및/또는 기타 성분과 조합하여 포함하는 조성물을 제조하기 위해 사용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 추가의 세포형은 간질, 상피 또는 혈액-유래 세포이고, 섬유아세포, 여포 외부 모근 외피 세포를 포함하는 각질세포, 내피 세포, 주피세포, 적혈구 세포, 단핵구, 혈장 세포, 호중구, 혈소판, 마스트 세포, 지방세포, 근육 세포, 간세포, 신경 및 신경교아 세포, 골세포 및 골아세포를 포함하는 림프구를 포함하나 이로 한정되지 않는다.
특정 실시형태에서, 추가의 조직 성분은 세포외 매트릭스의 성분이다. 세포외 매트릭스는 다양한 성분, 예를 들면, 당단백질, 프로테오글리칸, 복합 탄수화물 및 기타 분자이다. 세포외 매트릭스는 다양한 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, 트롬보스폰딘, 테나신(사이토액틴), 엔탁틴(니도겐), 오스테오넥틴(SPARC), 안코린 CII, 콘드로넥틴, 결합 단백질, 오스테오칼신, 골 시알로단백질, 오스테오폰틴, 에피넥틴, 히알루로넥틴, 아밀로이드 P 성분, 프브릴린, 메로신, s-라미닌, 운둘린, 에필리그린, 칼리닌, 피브린, 피브리노겐 및 HSP를 포함하는 다수의 임의의 상이한 단백질을 포함할 수 있다.
관련 실시형태에서, 추가의 조직 성분은 성장 인자, 혈관신생제, 항-염증제, 사이토킨 또는 분화제를 포함한다. 예를 들면, 성장 인자 또는 혈관신생제는 염기성 섬유아세포 성장 인자, 기타 섬유아세포 성장 인자, 골 형태형성 단백질, 간세포 성장 인자, 각질세포 성장 인자, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 β1 및/또는 β3, 혈관 내피 세포 성장 인자로부터 선택할 수 있다. 사용될 수 있는 추가의 성장 인자 및 성장 인자의 부류 또는 계열은 표 15에 수록된 임의의 것들을 포함하고, 이는 또한 특정 성장 인자에 대한 대표적 생물학적 활성을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 지방 조직, 골 미네랄, 근육 세포 및 또는 혈액 세포를 전혀 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않고, 예를 들면, 하나 이상의 이들 세포형 또는 골 미네랄은 처리 동안 조성물로부터 제거된다. 이는 조성물 중의 미세혈관과 연관된 세포의 농도를 증가시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 DNA 또는 실질량의 DNA를 포함하고, 예를 들면, DNA는 처리 동안 조성물로부터 제거되지 않았고, 예를 들면, 조직은 탈세포화되지 않았고 DNA도 세정되지 않았다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 세포 및/또는 조직 성분의 수용성 현탁액이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 단독으로 구조적 스캐폴드 또는 매트릭스, 예를 들면, 피부 또는 건 이식편을 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 매트릭스로부터 유리 세포에 처리되는 피부, 제대 또는 골 등의 미세혈관 조직을 사용하여 생성할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 조성물은 항-염증 또는 혈관신생 활성을 갖는다. 관련 실시형태에서, 조성물은 혈관 형성 또는 조직 치유를 촉진시킨다. 이들 효과의 조합이 몇몇 실시형태에서 달성된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 항-염증 활성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 노출되거나 이와 접촉되는 손상 또는 발병된 조직(예: 염증 반응을 받은 손상되거나 발병된 조직)은, 손상되거나 발병된 조직이 유사하게 처리되지만 본 발명의 조성물에 노출되지 않거나 이와 접촉되지 않은 경우와 비교하여, 감소된 염증을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 노출되거나 이와 접촉된 조직 중의 염증의 양은, 손상되거나 발병된 조직이 본 발명의 조성물에 노출되지 않거나 이와 접촉되지 않은 경우의 염증의 양과 비교하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 감소된다. 염증은, 예를 들면, 조직학적으로 관찰하는 경우, 발병된 조직에서 관찰된 림프구의 수를 포함하여 당해 기술분야에서 이용가능한 수단에 의해 측정할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 시험관내 검정으로 측정할 수 있는 항-염증 활성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 존재하에 시험관내 검정으로 측정한 염증의 양은, 본 발명의 조성물의 부재하에 또는 대조군 조성물의 존재하에 동일한 검정으로 측정한 염증의 양보다 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 적다. 특정 실시형태에서, 시험관내 검정은 혼합된 림프구 반응이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 혈관신생 활성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 노출되거나 이와 접촉되는 손상된 또는 발병된 조직(예: 염증 반응을 받은 손상되거나 발병된 조직)은, 손상되거나 발병된 조직이 유사하게 처리되지만 본 발명의 조성물에 노출되지 않거나 이와 접촉되지 않은 경우와 비교하여, 증가된 혈관신생을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 노출되거나 이와 접촉되는 조직 중의 혈관신생의 양은, 손상되거나 발병된 조직이 본 발명의 조성물에 노출되지 않거나 이와 접촉되지 않은 경우의 혈관신생의 양과 비교하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500% 증가한다. 혈관신생은, 예를 들면, 본원에 기재된 후지 허혈 모델을 포함하여 당해 기술분야에서 이용가능한 수단으로 측정할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 생체내 또는 시험관내 검정으로 측정할 수 있는 혈관신생 활성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 존재하에 시험관내 검정으로 측정한 활성의 양은, 본 발명의 조성물의 부재하에 또는 대조군 조성물의 존재하에 동일한 검정으로 측정한 활성의 양보다 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400% 또는 적어도 약 500% 크다. 특정 실시형태에서, 생체내 검정은 실시예 4에 기재된 바와 같은 마트리겔 검정이다. 특정 실시형태에서, 시험관내 검정은 본원에 기재된 내피 세포 이주 검정이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 손상되거나 발병된 조직의 치유를 촉진시킨다. 즉, 이는 조직 치유 활성을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 조성물의 "조직 치유 활성"은, 유사하게 처리되지만 조성물에 노출되지 않은 유사한 조직과 비교하여, 조성물에 노출된 손상되거나 발병된 조직(예: 경질 또는 연질 조직)의 개선된 치유(예: 수복 또는 재생)을 촉진시키는 조성물의 능력이다. 개선된 치유는 완전 치유에 걸린 시간, 생성된 새로운 조직의 양, 수득되는 치유된 조직의 강도 또는 수득되는 치유된 조직의 기능 등의 임의의 적절한 수단을 사용하여 측정한다.
멸균되거나 바이러스-불활성화된 동종이계 및 이종 다능성 세포 및 처리된 미세혈관 조직 조성물은, 자가 줄기 세포로 새로운 연질 조직을 생성하는 것의 곤란성, 동종이계 및 이종성 줄기 세포가 거부될 것이고, 멸균되거나 바이러스-불활성화된 세포가 감소된 생존율, 따라서 감소된 생물학적 또는 치료학적 활성을 갖는다는 종래의 신념 때문에, 인대 및 건 등의 연질 조직의 수복을 촉진시키기 위해 이전에 사용되지 않았다. 그러나, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 반드시 정제된 줄기 세포 또는 세포 생존율에 의존하지 않는다. 오히려, 제공된 방법은 비생존 세포, 간엽계 줄기 세포 및 전구 세포, 및 이러한 세포에 의해 분비된 기타 분자(예: 사이토킨, 성장 인자, 주화성 분자 등)을 포함하여 세포 혼합물을 함유하는 조성물을 생성하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 생존 세포와 비생존 세포의 혼합물을 함유한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 존재하는 세포의 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만이 생존가능하다. 몇몇 실시형태에서, 세포의 실질적으로 전부가 생존가능하지 않다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생존가능한"은 이의 통상의 의미로 제공되고, 또한 적절한 조건, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이 처리되지 않는 경우, 동일한 세포 또는 세포형이 증식할 것으로 예상되는 조건하에 배양될 때에 증식할 수 있는 세포를 지칭한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물에 존재하는 세포의 약 2% 미만 또는 약 1% 미만이 생존가능하다. 특정 실시형태에서, 조성물에 존재하는 세포의 어느 것도 또는 실질적으로 어느 것도 생존가능하지 않다. 따라서, 용어 "비-생존가능한"은 세포가 적절한 조건, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이 처리되지 않는 경우, 동일한 세포가 증식할 것으로 예상되는 조건하에 배양될 때에 증식할 수 없는 것을 의미한다.
그러나, 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물 중의 세포의 적어도 일부는 트리판 블루를 배제한다. 특정 실시형태에서, 조성물에 존재하는 조성물의 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%는 트리판 블루를 배제한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 트리판 블루를 배제하지만 생존가능하지 않은 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물에 존재하는 세포의 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20% 또는 적어도 약 50%는 트리판 블루를 배제하지만 생존가능하지 않다.
본 발명에 따라서, 본원에 기재된 조성물 중의 세포는 생존가능하지 않고 대상체 내로 이식 후에 장기간 지속할 수 없지만, 조성물은 개선된 치유, 감소된 염증 또는 증가된 혈관신생을 유도하는 대상체에서 반응의 캐스케이드를 유발하는 것으로 이해된다. 본원에 기재된 다능성 세포 및 처리된 미세혈관 조직 조성물은, 예를 들면, 연질 조직 등의 손상되거나 발병된 조직의 치유를 촉진하거나 유도하기 위해 생존가능한 또는 전체 줄기 세포를 포함할 필요는 없다. 또한, 본 발명의 조성물은, 해리된 조직, 세포, 예를 들면, 조성물의 제조에 사용된 조직 샘플에 존재하거나 이와 연관된 다능성 세포(예: 줄기 세포), 세포 막, 세포외 매트릭스 성분 및 기타 다양한 성장 인자, 혈관신생 인자, 항-염증제, 사이토킨, 분화제 등을 포함하는 처리된 조직 및 이의 다양한 성분을 포함할 수 있다.
이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하기 위해, 상기 조성물은 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 및/또는 희석제를 포함한다. 본 발명의 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 손상, 질환 또는 장해의 치료 또는 예방을 수행하기에 충분한 양, 예를 들면, 치료학적 유효량으로 약제학적 조성물에 존재한다.
약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 및/또는 희석제는 당해 기술분야의 숙련가에게 친숙하다. 액체 용액으로서 제형화된 조성물의 경우, 허용되는 담체 및/또는 희석제는 염수 및 멸균수를 포함하고, 임의로 산화방지제, 완충제, 정균제 및 기타 통상의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 조성물을 적절한 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 배합함으로써 제조할 수 있고, 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태, 예를 들면, 분말, 과립, 용액, 주사제, 흡입제, 미세구 및 에어로졸의 조제물로 제형화될 수 있다. 이들 조성물은 또한 분산제 및 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 함유할 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 숙련가는 본 발명의 조성물을 적절한 방식으로 허용되는 관행, 예를 들면, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1990]에 개시된 것들에 따라 추가로 제형화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 경로는 제한 없이 국소, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 경구, 비내, 이식, 주입, 주사, 카테터, 국소, 경피, 흡입, 비경구 및 비내를 통한 전달을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은 외과적으로 이식, 주사, 전달(예: 카테터 또는 시린지에 의해)되거나, 달리는 수복 또는 증강을 필요로 하는 부위에 직접 또는 간접적으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 대상체의 손상 또는 질환 부위에 또는 인접하여 외과적으로 도입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 정맥내이다. 약제학적 조성물은 특정 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 외과적으로 조직 수복을 위해, 정맥내로 허혈의 치료를 위해, 통증 및 염증의 치료를 위해 관절 강 내로의 주사, 창상 내로의 주사 및 말초 혈관 질환의 치료를 위한 근육 내로의 주사이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화된다. 정맥내 투여를 위해 제형화된 조성물은, 특정 실시형태에서, 모세관 또는 기타 혈액 혈관을 잠재적으로 폐색시킬 수 있는 거대 입자 또는 응집괴를 감소시키기 위해 여과한다. 특정 실시형태에서, 정맥내 투여를 위해 제형화된 조성물은 임의로 등장성이고, 약 5.0 내지 약 9.0 범위의 pH(예: 약 7.3), 약 50 내지 약 600의 오스몰농도 및/또는 약 600 mOsm/L 이하의 오스몰농도, 예를 들면, 약 290 mOsm/L을 갖는다.
임플란트, 매트릭스 및 스캐폴드
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 임플란트, 매트릭스 또는 스캐폴드와 조합된다. 매트릭스는 생체적합성 스캐폴드, 격자, 자가-조립 구조체 등을 포함할 수 있다. 이러한 매트릭스는 세포-기반 치료, 외과적 수복, 조직 공학 및 창상 치유의 분야에서 공지되어 있다. 매트릭스는 본 발명의 조성물로 전처리(예를 들면, 시딩, 접종, 접촉)할 수 있다. 본 발명의 일부 국면에서, 조성물에 존재하는 세포 및/또는 조직 성분은 매트릭스에 부착한다. 일부 실시형태에서, 세포는 매트릭스의 간극 공간 내에 또는 브릿지에 함유된다. 특정 실시형태에서, 세포 및/또는 기타 조직 성분은 매트릭스와 밀접하게 연관하여 존재하고, 치료학적으로 사용되는 경우, 대상체 세포 및/또는 혈관신생의 성장을 유도하거나 지지한다.
본 발명의 조성물과 연관되거나 이를 포함하는 매트릭스는, 이식, 주사, 외과적 부착, 다른 조직을 사용한 이식 등을 포함하나 이로 한정되지 않는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방식으로 대상체의 체내로 도입될 수 있다. 본 발명의 조성물은 대상체에 제공되거나 이식되기 전에 임플란트, 매트릭스 또는 스캐폴드와 조합할 수 있거나, 본 발명의 조성물은 대상체에 이미 존재하는 임플란트, 매트릭스 또는 스캐폴드와 조합할 수 있다. 임플란트, 매트릭스 또는 스캐폴드는 대상체 또는 그 속의 조직 내의 목적하는 위치에 조성물을 보유하고 대상체에서 조성물을 보호하고/하거나 목적하는 속도로 또는 목적하는 시간에 걸쳐 조성물을 방출하는 물리적 구조를 제공할 수 있다.
몇몇 실시형태에 사용된 매트릭스는 생체내에서 조직 또는 기관의 형상 및/또는 크기로 구성될 수 있다. 본 발명의 스캐폴드는 평탄하거나 관형일 수 있거나, 본원에 기재된 바와 같이 이의 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 스캐폴드는 다층일 수 있다.
특정 실시형태에서, 임플란트, 매트릭스 또는 스캐폴드는 생체적합성 임플란트, 매트릭스 또는 스캐폴드이다. 임플란트, 매트릭스 또는 스캐폴드는 고체 또는 액체를 포함할 수 있다. 임플란트, 매트릭스 또는 스캐폴드는 생체분해성일 수 있다. 임플란트, 매트릭스 또는 스캐폴드는, 특정 실시형태에서, 마이크로비드 또는 입자, 골-유래 임플란트, 생물섬유 스캐폴드(예: BioFiberTM Scaffold), 다공질 흡수성 폴리머, 하이드로겔, 조직 생성물을 포함하는 퍼티 또는 봉합사 또는 이식가능한 의료 장치를 포함한다. 임플란트, 매트릭스 또는 스캐폴드는, 예를 들면, 콜라겐 매트릭스 또는 생체적합성 직물; 정형외과용 임플란트; 다공질의 유연한 이식가능한 스캐폴드; 외과용 임플란트; 다공질 코팅된 임플란트; 폴리머 용액; 용매, 예를 들면, DMSO, N-메틸피롤리돈(NMP) 및 알콜; 하이드로겔; 히알루론산 또는 기타 글리코사미노글리칸 또는 프로테오글리칸; 콜라겐; 피브린; 트롬빈; 응혈; 혈소판; 혈소판 풍부 혈장; 탈무기질 골 매트릭스; 자가 세포 및/또는 해면성 골일 수 있다.
본 발명의 조성물은, 예를 들면, 주사를 위해 하이드로겔 용액에 현탁시킬 수 있다. 적합한 하이드로겔의 예는 자가-조립성 펩티드, 예를 들면, RAD16을 포함한다. 또는, 세포를 함유하는 하이드로겔 용액은 이식 전에 내부에 분산된 세포를 갖는 매트릭스를 형성하기 위해 경화시킬 수도 있다. 하이드로겔은, 물 분자를 포획하여 겔을 형성하는 3차원 개방-격자 구조를 형성하기 위해 공유, 이온성 또는 수소 결합을 통해 가교결합되는 유기 폴리머(천연 또는 합성)일 수 있다. 하이드로겔을 형성하기 위해 사용할 수 있는 물질의 예는 이온에 의해 가교결합되는 다당류, 예를 들면, 알기네이트 및 이의 염, 펩티드, 폴리포스페이트 및 폴리아크릴레이트, 또는 온도 또는 pH에 의해 각각 가교결합되는 블록 폴리머, 예를 들면, 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 생물학적으로 적합한 임플란트, 매트릭스 또는 스캐폴드와 연관되거나, 이들 내부에 함유되거나, 이들에 적용되거나, 이들을 코팅한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 물질, 예를 들면, 유연한 생체적합성 스캐폴드(예: 직포 또는 부직포 섬유 시트 또는 트레드)를 코팅하기 위해 사용된다. 분무 건조된 처리된 조성물은, 코팅을 분무 건조 프로세스 동안 수행할 수 있기 때문에, 코팅 전에 재구성을 필요로 하지 않고서 마이크로비드 또는 입자를 포함하는 물질을 코팅하는데 특히 적합하다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 매트릭스, 예를 들면, 다공질 및/또는 콜라겐 함유 매트릭스 내에 매립되거나 매트릭스 상에 코팅된다. 특정 실시형태에서, 매트릭스는 코넥사(ConexaTM) 재구성 조직 매트릭스, BioFiberTM 스캐폴드 또는 BioFiberTM-CM 스캐폴드(Tornier; Bloomington, MN)일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 3차원 스캐폴드와 연관될 수 있고, 생체내에 이식될 수 있으며, 여기서 상기 조성물은 프레임워크 상에서 또는 내에서 세포 증식을 유도하고 생체내에서 대체 조직을 형성한다. 프레임워크 상에서 또는 내에서 증식하는 세포는 조성물 중의 세포 및/또는 스캐폴드가 이식되는 대상체의 세포를 포함할 수 있다. 이러한 3차원 프레임워크는, 혈관; 헤르니아 수복을 위한 조직; 건 및 인대 뿐만 아니라 위장 및 비뇨생식관의 것들과 유사하게 관상 구조를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 관련 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 3차원 프레임워크와 연관되어 있다. 프레임워크는 목적하는 교정 구조의 형상으로 구성될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 스캐폴드의 예는, 예를 들면, 본원에서 이의 전체가 참조로서 도입되는 미국 특허 제7,560,276호에 기재된 바와 같이, 부직포 매트, 다공성 발포체 또는 자가-조립 펩티드를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 부직포 매트는 글리콜산 및 락트산(PGA/PLA)(VICRYL; Ethicon, Inc., Somerville, N.J.) 또는 폴리-4-하이드록시부티레이트(PHA, Tepha, Lexington, MA)의 합성 흡수성 공중합체로 구성된 섬유를 사용하여 형성할 수 있다. 미국 특허 제6,355,699호에 기재된 바와 같이 동결-건조 또는 동결건조 등의 프로세스에 의해 형성된, 예를 들면, 폴리(엡실론-카프롤락톤)/폴리(글리콜산)(PCL/PGF) 공중합체로 구성된 발포체가 또한 사용될 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 프레임워크는 펠트이고, 이는 생체흡수성 물질, 예를 들면, PGA, PLA, PHA, PC 공중합체 또는 블렌드, 또는 히알루론산으로부터 제조한 멀티필라멘트 사로 구성될 수 있다.
키트
본 발명은 본 발명의 조성물, 예를 들면, 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 추가로 포함한다. 상기 조성물은 단독으로, 예를 들면, 바이알에 팩키징될 수 있거나, 기타 생성물, 예를 들면, 처리된 또는 동결보존된 미세혈관 조직과의 조합에 적합한 것들과 조합하여 팩키징될 수 있다. 또 다른 물질과 함께 팩키징되는 경우, 처리되거나 동결보존된 미세혈관 조직은 개별적으로 팩키징되거나, 다른 물질과 함께 예비 혼합 또는 결합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 처리된 미세혈관 조직은 생체적합성 물질 상의 코팅으로 팩키징되거나, 임플란트, 매트릭스 또는 스캐폴드와 결합될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 키트는 본원에 기재된 조성물을 포함하는 수분 불투과성 용기를 포함한다. 예를 들면, 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 키트는 멸균, 건조된(예: 동결건조된) 조성물을 포함하는 수분 불투과성 용기를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 단리된 다능성 세포 또는 처리된 미세혈관 조직, 또는 상기 세포 또는 조직으로 구성된 세포 막을 포함하고, 상기 조성물은 혈관신생 또는 항-염증 활성을 갖고, 상기 조성물은 멸균되고/되거나 상기 조성물 중의 바이러스는 불활성화된다.
본원에 기재된 키트 및 조성물의 특정 실시형태에서, 상기 조성물은, 대략 실온에서 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월 또는 적어도 1년 동안 저장하는 경우, 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 보유한다. 본원에 기재된 키트 및 조성물의 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 대략 실온에서 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월 또는 적어도 1년 동안 저장하는 경우, 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 보유한다. 본원에 사용된 바와 같이, "실온"은 약 20℃ 내지 약 25℃의 온도 또는 약 21℃이다. 본원에 기재된 키트 및 조성물의 특정 실시형태에서, 상기 조성물은, 대략 4℃에서 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 6개월 또는 적어도 약 1년 동안 저장하는 경우, 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 보유한다. 본원에 기재된 키트 및 조성물의 특정 실시형태에서, 상기 조성물은, 대략 -20℃에서 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 6개월 또는 적어도 약 1년 동안 저장하는 경우, 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 보유한다. 특정 실시형태에서, 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성은, 본원에 기재된 임의의 것들을 포함하여, 생체내 또는 시험관내 검정으로 측정하는 경우, 저장 전의 활성의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%이다.
본 발명의 키트 및 조성물의 특정 실시형태에서, 상기 조성물에 존재하는 세포의 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하는 생존가능하고, 상기 조성물에 존재하는 세포의 2% 이하는 생존가능하거나, 상기 조성물에 존재하는 세포의 실질적으로 어느 것도 생존가능하지 않다. 관련 실시형태에서, 상기 세포의 적어도 1%는 트리판 블루를 배제한다. 다른 실시형태에서, 상기 세포의 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%는 트리판 블루를 배제한다. 특정 실시형태에서, 상기 세포의 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%는 트리판 블루를 배제하지만, 생존가능하지 않다.
다양한 실시형태에 따르면, 본 발명의 키트는 본 발명의 조성물 및 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 키트는, 본원에 기재된 임의의 것들을 포함하나 이로 한정되지 않는, 본 발명의 조성물 및 임플란트, 스캐폴드 또는 매트릭스를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이식가능한 스캐폴드 또는 매트릭스는 골-유래 임플란트, 생물섬유 스캐폴드, 다공질 흡수성 폴리머, 하이드로겔, 조직 생성물을 포함하는 퍼티, 또는 봉합사이다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물의 세포, 조직 또는 세포 막은 상기 이식가능한 스캐폴드 또는 매트릭스의 골, 건 또는 피부대면 표면 상에 존재한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 키트는 밀봉된 용기에 본 발명의 멸균된 및 건조된(예: 동결건조된) 조성물을 포함한다. 밀봉된 용기는 수분 저항성 또는 수분 불투과성이고, 용기 내부로의 접근을 가능하게 하는 밀봉된 개구부를 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 용기는 기밀 실(seal)을 포함하는 바이알이다. 특정 실시형태에서, 상기 용기는 호일 실을 포함할 수 있는 블리스터 팩이다. 특정 실시형태에서, 밀봉된 용기의 내부는 멸균성이다. 따라서, 사용 전에, 사용자는 용기의 내부에 접근할 수 있고, 액체를 건조된 조성물에 첨가하여 이를 용해 또는 재구성한 다음, 재구성된 조성물을 대상체에게 제공하거나 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, 액체는 멸균수 또는 멸균 용액, 예를 들면, 식염수, 예를 들면, 인산염 완충된 식염수이다.
조성물 임플란트, 매트릭스 및 스캐폴드의 용도
본 발명의 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 임플란트, 매트릭스 및/또는 스캐폴드는 이를 필요로 하는 대상체에서 손상 또는 질환을 치료하거나 예방하기 위해 사용할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 조직에 또는 이를 필요로 하는 조직에 인접하여, 예를 들면, 이를 필요로 하는 조직 주변의 조직에 직접 제공하거나 적용할 수 있다. 이를 필요로 하는 대상체는, 본 발명의 조성물을 사용한 치료로부터 이익을 가질 수 있는, 손상 또는 질환을 갖거나 손상 또는 질환의 위험에 있는 대상체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들면, 인간 또는 기타 포유동물, 예를 들면, 비-인간 영장류, 개, 고양이 또는 말이다. 특정 실시형태에서, 대상체, 예를 들면, 당뇨병 환자 및 화학치료를 받은 대상체는 감소된 치유 능력을 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 연질 조직 손상 또는 질환, 경질 조직 손상 또는 질환, 골 손상 또는 질환, 관절 손상 또는 질환, 심장 조직 손상 또는 질환, 지방 조직 손상 또는 질환, 연골 손상 또는 질환 및 추간판 손상 또는 질환을 포함하나 이로 한정되지 않는, 대상체에서 다양한 조직 또는 기관의 손상 또는 질환을 치료하거나 예방하기 위해 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 연질 조직 손상을 치료하거나 예방하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이 연질 조직은 신체 전체에 걸쳐 발견되는 스캐폴드외 구조를 일반적으로 지칭하고, 연골 조직, 반월판 조직, 인대 조직, 건 조직, 추간판 조직, 치주 조직, 피부 조직, 혈관 조직, 근육 조직, 근막 조직, 골막 조직, 안 조직, 심막 조직, 폐 조직, 활막 조직, 신경 조직, 뇌 조직, 신장 조직, 골수, 비뇨생식기 조직, 장 조직, 간 조직, 췌장 조직, 비장 조직, 지방 조직 및 이들의 조합을 포함하나 이로 한정되는 것은 아니다. 연질 조직 손상은, 신체 전체에 걸쳐 발생할 수 있는, 임의의 연질 조직, 예를 들면, 근육, 인대, 건, 피부, 섬유 조직, 지방, 활막, 신경, 혈관 및 근막에 대한 상해 또는 손상을 포함한다. 제공된 처리된 미세혈관 조직의 연질 조직 치유 활성으로부터 이익을 얻을 수 있는 연질 조직 손상은 제한 없이 허혈성 사상으로부터 발생하는 건 및/또는 인대 파열 및 손상 등의 손상을 포함한다. 일반적인 연질 조직 손상은 염좌, 긴장, 타박상에서 발생하는 손상, 또는 특정 연질 조직의 과도한 사용으로부터 발생할 수 있다. 연질 조직 손상은 개방 및 폐쇄 연질 조직 손상 둘 다를 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 치료되거나 예방될 수 있는 연질 조직 손상, 질환 및 상태는 혈관, 피부 또는 근스캐폴드 조직에 대한 손상을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 연질 조직 상태는, 예를 들면, 피부의 상태[예: 반흔 교정 또는 외상성 창상, 중증 화상, 피부 궤양(예: 욕창(압력) 궤양, 정맥 궤양 및 당뇨병성 궤양) 및 외과적 창상, 예를 들면, 피부 암의 절제와 연관된 것들의 치료]; 혈관의 상태(예: 말초 동맥 질환, 관상 동맥 질환, 복부 대동맥류, 경동맥 질환 및 정맥 질환 등의 혈관 질환; 혈관 손상; 부적절한 혈관 발달); 성대에 영향을 미치는 상태; 화장품 상태(예: 수복, 증강 또는 미화를 수반하는 것들); 근육 질환(예: 선천성 근질환; 중증 근무력증; 염증성, 신경성 및 근원성 근 질환; 및 근 이영양증, 예를 들면, 뒤센 근 이영양증, 벡커 근 이영양증, 근긴장성 이영양증, 지대형 근 이영양증, 안면견갑상완형 근 이영양증, 선천성 근 이영양증, 안구인두근위축증, 원위형 근 이영양증, 및 에머리-드레이푸스 근 이영양증); 치근막 및 전방 십자인대를 포함하나 이로 한정되지 않는 건 및 인대 등의 결합 조직의 상태; 및 기관 및/또는 근막의 상태(예: 방광, 장, 골반 기저부)를 포함한다. 상당히 일반적 조직 손상의 한 가지 예는 골반 기저부에 대한 손상이다. 이는 출산시 또는, 방광의 탈장인 방광류 등의 방광질 근막에 대한 손상을 유도할 수 있는 이의 합병증으로부터 발생할 수 있는 잠재적으로 심각한 병리 상태이다. 유사한 병리 상태는 직장탈장(직장의 탈장), 장탈장(직장강 또는 방광질 포우치를 통한 장의 돌출) 및 장방광류(방광 및 장 둘 다가 돌출하는 이중 탈장)을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 바람직하지 않는 염증 또는 면역 반응과 연관된 질환을 포함하나 이로 한정되지 않은 다양한 질환을 치료 또는 예방하기 위해 사용된다. 이러한 질환의 예는 류마티스성 관절염, 골관절염 및 자가면역 질환 및 장해를 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은, 예를 들면, 손상 부위에서 염증을 감소시키고/시키거나 면역 반응, 예를 들면, 손상에 의해 유도된 면역 반응을 감소시키기 위해 사용할 수 있다. 유사하게는, 본 발명의 조성물은 이식 거부의 가능성을 예방 또는 감소시키기 위해 사용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들면, 손상 또는 조직 손상의 부위에서 혈관신생 또는 혈관재생을 촉진 또는 자극하기 위해 사용된다. 특정 실시형태에서, 손상은 조직에 대한 허혈, 저산소증 또는 재관류 손상과 연관되거나 이를 가져왔다. 본 발명에 따라 치료되거나 예방될 수 있는 허열, 저산소증 또는 재관류 손상과 연관되거나 이를 가져오는 손상 또는 질환의 예는 뇌졸중, 심근 경색 및 실혈을 포함한다. 혈관신생 또는 혈관재생을 촉진 또는 자극하기 위해 본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 손상 또는 조직 손상의 추가의 예는 이식 또는 사지 재부착을 포함한다.
본 발명의 조성물은 또한 말초 신경 손상, 발기 부전, 폐 고혈압, 다발성 경화증 및 방사선 화상을 치료 또는 예방하기 위해 사용할 수 있다. 또한, 이들은 조혈 및/또는 창상 치유를 유도하기 위해 사용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들면, 정맥내 투여용으로 제형화되는 경우, 급성 심근 경색, 허혈성 심장 부전, 뇌졸중, 말초 혈관 질환 또는 만성 폐색성 폐 질환을 치료하거나 예방하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 손상 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위해 단독으로 또는 하나 이상의 기타 치료제 또는 공정과 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 손상된 조직에 혈액 공급을 풍부화하고/하거나 조직 재생을 촉진하기 위해, 본 발명의 조성물은 혈소판-풍부 혈장과 조합하여 사용할 수 있다. 하나 이상의 기타 치료제 또는 공정과 조합하여 사용하는 경우, 본 발명의 조성물은 기타 치료제 또는 공정을 사용한 치료 전에, 치료와 동시에 또는 치료와 중복하는 시간 동안 또는 치료 후에 사용할 수 있다.
또 다른 치료제와 조합하여 사용하는 경우, 본 발명의 조성물은 다른 제제와 별개로 제공될 수 있거나, 기타 치료제를 또한 함유하는 약제학적 조성물, 예를 들면, 하나가 본 발명의 조성물인 2개 이상의 치료제를 포함하는 공제형에 존재할 수있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 추가의 치료제는 동일한 임플란트, 매트릭스 또는 스캐폴드와 조합되거나 결합된다.
본 발명의 조성물은 치료학적 유효량으로 투여되고, 이는 사용된 특정 조성물의 활성; 본 발명의 조성물이 투여되는 대상체의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이; 투여 방식 및 시간; 대상체에서 조성물의 배설 또는 분해 속도; 및 치료되는 손상, 질환 또는 상태의 유형 또는 중증도를 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 특정 실시형태에서, 치료학적 유효량은 104 내지 108개 다능성 세포 및 이들의 연관 ECM을 처리하여 수득한 물질로부터 수득된다.
본 발명의 방법은 조성물을 1회, 2회 또는 그 이상의 용량으로 투여함으로써 실시할 수 있다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 조성물은 단일 용량, 다중 용량 또는 소정 기간에 걸쳐 반복 용량으로서 투여된다.
실시예
실시예 1 - 미세혈관 조직 제조 및 특성화
본 연구에서, 미세혈관 조직은 상이한 프로세스를 통해 제조한 다음 검정했다. 요약하면, 적어도 5 내지 10lb의 피하 지방은 기관 공여체로부터 수득하고, 다음과 같이 처리했다: 조직을 잘게 분쇄하고; 이를 효소에 의해 해리시키고; 희석(퀀칭하지 않음), 회전시킨 다음, 세포 펠렛을 세척하고; 동결건조 완충제에 현탁시키고; 동결건조시킨다. 처리에 사용된 기본 조건은 다음과 같다: 지방 조직은 조직 공여체로부터 외과적으로 회수한다. 조직은 가위로 잘게 분쇄하고, 60분 동안 온화하게 진탕시키면서 37℃에서 0.2U/ml Clzyme AS(Vitacyte, Indianapolis, IN)로 PBS에 현탁시킨 다음, 3회 세척하고, M3D에 2백만개 세포/ml로 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 동결건조 직전까지 실온에서 유지하고, 세포가 EZ-CPZTM 동결보존 배지(Incell Corp., San Antonio, TX)에서 50:50으로 희석되는 경우, 바이알에 넣고, 냉각을 위해 동결건조기 트레이에 적재했다. 샘플은 프로세스 동안 및 프로세스 종료시에 검정했다.
10개 프로세스 방법이 이 연구에서 수행된다. 이들은 표 1에서 "A" 내지 "J"로 지정된다. 각각의 프로세스 방법을 분석하기 위해 사용된 검정 방법은 표 1에 수록되어 있고, 1, 2, 3, 4, 5로 지정되었으며, 표 2에 상술되어 있다.
제조 방법, 설명 및 분석 방법
제조 방법 제조 방법의 설명 *분석 방법(들)
A 대조군: ZTMTM 중의 10gm의 지방을 가위/외과용 메스로 즉시(수거로부터 12시간 미만) 잘게 분쇄하고, 기본 조건에 따라서 소화시켰다. M2,3,4,5
B 24시간: ZTMTM 중의 10gm의 지방을 가위/외과용 메스 및 기준 조건으로 처리하기 전에 24시간 동안 실온에서 저장했다. M2,4,5
C 48시간: ZTMTM 중의 10gm의 지방을 가위/외과용 메스 및 기준 조건으로 처리하기 전에 48시간 동안 실온에서 저장했다. M2,4,5
D 스케일-업: 지방 5+ 파운드를 고기 분쇄기를 사용하여 잘게 분쇄하고; 기준 조건에 따라 소화시켰다. M1,2,3,4
E 효소: 'D'로부터 잘게 분쇄한 지방 10gm를 4X 효소 농도로 소화시켰다. M2,5
F 용적: 'D'로부터 잘게 분쇄한 지방 10gm를 4X 효소 농도로, 'E'의 전체 용적의 1/4로 소화시켰다. M2,5
G 동결 건조: 모든 'D' 생성물에 대해 50:50 EZ-CPZTM:M3DTM의 제형을 사용한다. 선반을 생성물 온도가 -45℃에 달할 때까지 2.5℃/분의 냉각 속도로 실온으로부터 -45℃로 냉각시켰다. 샘플을 -45℃에서 180분 동안 유지시켰다. 선반 온도를 2.5℃/분의 냉각 속도로 -45℃로부터 -35℃로 승온시켜 1차 건조를 개시하여 챔버 압력을 8mTorr로 감소시키고, 선반 온도를 -35℃에서 2160분 동안 유지시켰다. 2차 건조를 위해, 선반 온도를 0.2℃/분의 속도로 20℃로 증가시키고, 선반을 이 온도에서 360분 동안 유지시켜 샘플을 가온시켰다. M,2,3,4,5
H 멸균: 'G'의 100개 바이알의 감마 방사선 2.5Mrad. 안정화용으로 사용 M2,3,5
I 저용량: 'G'의 80개 바이알의 감마 방사선 1.5Mrad. 비멸균된 200개 바이알과 함께, 동물 연구용으로 사용. M2,3,5
J E-빔: 'G'의 100개 바이알의 e-빔 방사선 1.5Mrad. 안정화용으로 사용 M2,3,5
연구 분석 그룹
분석 그룹 설명
M1 지방 조직 수거 전에 수행되지 않은 시험을 포함하여 감염성 질환을 위한 공여체 스크리닝
M2 세포수 및 생존능력을 위해 혈구계수기를 사용하는 세포수 및 DAPI 핵 염색에 의한 트리판 블루
M3 선택된 바이오마커: CD33, CD34, CD44, CD45 및 콜라겐 형태 IV를 위한 면역표현형 검사
M4 오염 미생물수
M5 기능적 생물 분석: 세포 이주; 마트리겔(Matrigel)
몇몇 과제가 이 연구를 위해 수행된다. 이들은 A 내지 D로 지정되고, 하기에 추가로 상세히 기재되며, 도 1에 요약되어 있다. 과제에 사용되는 특정 실험실 검정 방법(M)은 M1, M2, M3, M4 및 M5로 지정되어 있다(표 2).
과제 A. 계획 및 설정
숙주 물질, 조정, 설정 및 시험
과제 B. 공급원 물질 및 일반 공정
지방 조직은 기관 공여체로부터 수득한다. 피하 지방은 복부, 대퇴부 및 둔부로부터 취득한다. 5 내지 10파운드의 지방은 ZTMTM 수송 배지(Incell Corp., San Antonio, TX)에 수거한다.
조직을 수거하고, 다양한 단계 및 실험 방법을 통해 사망 12시간 이내에 먼저 처리한다(표 1 및 2; 도 1). 10g 분취량은 실온에서 12, 24 및 48시간 저장 후에 기준 조건을 사용하여 처리한다. > 5+ 파운드는 조직 분쇄를 위해 육류 분쇄 방법을 사용하여 처리하고, 10g 분취량은 ZSolMTM에서 4X Blendzyme 1(Vitacyte) 효소 농도로 및 단계 E에서 ZSolMTM의 4X 효소 농도 및 1/4 소화 용적으로 소화시킨다. 샘플의 벌크는 표준 효소 농도 및 방법으로 소화시킨다.
소화 후, 샘플은 ZSolFTM에서 세정하고, 원심분리하고, 경사분리한 다음, ZSolFTM에서 2회 이상 세정한다. 세포는 106 세포/ml로 동결건조 용액 벌크 생성물로서 EZ-CPZTM에서 1:1 세포 현탁액에 재현탁시키고, 1mL 분취량 용적으로 동결건조시킨다(단계 G). 동결건조된 바이알은 감마 및 E-빔 방사선으로 처리한다(단계 H, I, J). 모든 최종 생성물을 저장하고, 대표적 샘플을 시험하고, 선택된 서브세트를 후속 동물 실험에 사용한다.
과제 C. 분석
본 연구에 사용된 다양한 유형의 검정(M1 내지 M5)(표 2)는 하기에 간단히 요약되어 있다.
M1: 지방 조직 수거 전에 수행하지 않은 시험을 포함하는 감염성 질환에 대한 공여체 스크리닝. 조직 조달을 위한 공여체 스크리닝 및 협정은 표준 평가에 따라 임의의 감염성 질환을 최소화하거나 제거하기 위해 개발되어 있다. 실제의 추가 시험 및 관련 비용은 개별적으로 수행된다. 바이오버든(Bioburden) 검정을 수행한다.
M2: 세포 수는 세포 수 및 생존율을 위해 DAP1 핵(형광 현미경) 염색과 함께 혈구계(광학 현미경) 및 트리판 블루를 사용하여 수행한다. 세포 수는 중복 판독치로서 기록한다.
M3: 선택된 바이오마커에 대한 면역표현형: CD33, CD34, CD44, CD45 및 콜라겐 TypeIV. 현탁된 세포의 즉시 면역검정을 수행한다. 세포를 LabTeks에서 성장시키고, 염색한 다음, 대표적 사진은 수험자이다.
M4: 바이오버든 검정은 백 N-2에서 수용 조직의 수송 용액으로부터의 샘플에 대해 수행한다(및 처리후 {최후} 세정과 비교하여). 내독소 시험은 EndoSafe PTS 검정(Charles River)을 사용하여 수행한다. 표준 USP 배양 미생물 시험을 수행한다. ATP 신속 시험은 임의로 수행한다.
M5: 기능 생물검정은 단리된 세포, 동결건조후 및 다양한 처리 및 방사선 프로토콜 후의 샘플에 대해 수행한다. 트랜스웰을 통한 세포 이주 검정은 ADSC, 내피 및 섬유아세포에 대해 수행한다. 마트리겔 검정은 다양한 희석물, 처리 및/또는 조사 단계에서 샘플에 의해 유도된 미세혈관 제형을 평가하기 위해 수행한다.
과제 D. 데이터 분석
관찰 판독치 및 데이터는 분석을 위해 엑셀 또는 프리즘으로 전송한다. 각 TPS 및 각 세포 유형에 대한 샘플 복제물의 평균 + SD를 집계하고/하거나 비교 분석을 위해 플롯팅한다.
수행된 예비 실험으로부터 수득한 결과는 처리 조건 A, B 및 D 사이에 거의 차이가 없는 것을 나타냈고, 3.5kg 지방 조직은 바이알당 106개 세포에서 동결건조된 생성물의 1560 바이알을 생성한다.
실시예 2 - 랫트에서 아킬레스 건 손상의 치료
본 연구는 본 발명의 미세혈관 조직 제제가 아킬레스 건 손상을 수복하기 위해 사용될 수 있음을 입증한다.
32마리 수컷 스파그 다울리 랫트(1일차에 8주령 및 1일차에 약 250g)를 할란으로부터 구매하고, 적어도 3일 동안 순화시킨다. 랫트는 표 3의 연구 설계에 요약된 바와 같이 처리한다.
연구 설계
그룹 동물 #/그룹 처리 경로 종점
1 8 아킬레스 건을 마우스-치아 겸자로 약간 침윤시킨다. 우측 경골


 수술-경골과 아킬레스 건 사이에 스캐폴드 이식
종료 7일
2 8 아킬레스 건을 마우스-치아 겸자로 약간 침윤시키고 + 토니어 이식편 재료를 콜라겐으로 코팅시킨다.
3 8 아킬레스 건을 마우스-치아 겸자로 약간 침윤시키고 + 토니어 이식편 재료를 콜라겐으로 코팅시키고 + 미세혈관 조직 조성물 A로 처리한다.
4 8 아킬레스 건을 마우스-치아 겸자로 약간 침윤시키고 + 토니어 이식편 재료를 콜라겐으로 코팅시키고 + 미세혈관 조직 조성물 B로 처리한다.
총 32
연구는 동물 수명의 대략 10일에 걸쳐 수행한다. 동물은 -3일에 도착하고, -3일 내지 1일까지 순화시키고, 1일차에 수술을 받고, 7일차에 종료 계획된다.
시험 제품:
콜라겐 코팅된 생물섬유 스캐폴드
처리된 미세혈관 조직 제제 A 및 B를 멸균 WFI로 재구성하고, 스캐폴드로 흡수한다. 처리된 미세혈관 조직 조성물 A는 멸균시키지 않고, 처리된 미세혈관 조직 조성물 B는 E-빔 멸균시킨다.
마취: 1일차의 수술 전에, 동물을 칭량하고, 케타민 하이드로클로라이드 100mg/mL(40-90mg/kg) 및 자일라진 100mg/mL(5-10mg/kg)의 근육내 주사로 마취시킨다.
수술 준비: 각 동물의 우측 후지를 시험 개시 전에 1일에 면도한다. 1일차에, 피부는 베타딘 및 알콜 스크럽을 사용하여 수술 준비하고, 무균 외과 기술을 사용하여 드래핑한다.
수술 과정: 1일차에, 시험 제품은 이식 직전에 제조한다. 이식편은 위킹 작용에 의해 세포를 적재한다. 2개의 5-0 폴리프로필렌 봉합사를 고정을 위해 이식편에 위치시킨다. 이식편은 식염수와 함께 페트리 접시에 위치시키고, 사용할 때까지 피복한다.
직선의 측면 피부 절개부는 중간 경골의 수준으로 우측 후지의 미측 (원위) 경골로부터 제조한다. 이 방법을 사용하여 피부를 절개하고, 이의 종골로부터 근건 접합부까지 아킬레스 건의 측면 노출을 가능하게 하기 위해 후퇴시킨다. 추가의 절개는 아킬레스 건을 노출 및 단리하기 위해 사용한다. 노출된 아킬레스 건은 이식편 시험 제품 배치 전에 마우스-치아 겸자로 약간 연마한다. 단일 0.5mm 드릴 구멍은 이식편 고정을 위한 봉합사 통과를 가능하게 하기 위해 종골을 통해 측면에서 내측 방향으로 이루어진다. 임플란트 영역은 임의의 파편을 제거하기 위해 식염수로 관주하고, 흡입 건조시킨다.
이식편은 유지 배로부터 제거하고, 종골에 인접한 하나의 말단부와 함께 아킬레스 건의 전면을 따라 삽입한다. 두개 이식편 고정 봉합사는 변형된 메이슨-알렌 봉합사 패턴을 사용하여 근-건 접합부에 비복근 두개에 위치시킨다. 이어서, 두개 이식편 고정 봉합사는 종골 중의 드릴 구멍을 통해 통과시키고, 중간 위치에서 발로 긴장시키고, 묶는다. 6개의 봉합사 매듭은 모든 고정 봉합사를 위해 묶는다. 절개는 적절한 봉합사 물질을 사용하여 층상 방식으로 밀폐한다.
진통: 동물은 1일차에 마취로부터 회복시에 부프레노르핀(0.1-0.5mg/kg)을 피하 투여한다. 추가의 부프레노르핀은 통증을 위해 필요에 따라 적절히 투여할 수 있다.
체중 측정: 동물은 1일차에 수술 전에 및 종료 전을 포함하여 연구 종료시까지 1주 1회 랜덤으로 칭량한다(약 9 시점).
건강 관찰: 동물은 연구 기간 동안 1일 1회 모니터링한다(약 7 시점).
절개 부위 영역 관찰: 절개 부위의 관찰은 2일차 내지 7일차까지 매일 기록한다.
온도/습도 기록: 매일 실온 및 습도 측정을 기록한다.
종료 및 조직 수거: 7일차에, 동물을 안락사시키고, 이식된 시험 또는 대조군 제품 부위 및 주변 건 조직을 각각의 동물로부터 절제에 의해 수거한다. 모든 수거된 샘플은 각각의 절반에 포함된 건의 절반과 함께 스캐폴드의 중앙선을 따라 절반으로 분할한다. 수거된 조직의 절반은 통상의 조직병리학적 및 면역조직화학적 평가를 위해 10% 중성 완충된 포르말린에 저장한다. 나머지 절반은 외과용 메스의 엣지로 건 및 과성장된 연질 조직을 박리시키고, 내부성장한 조직을 갖는 스캐폴드는 유전자 발현 분석을 위해 액체 질소 중에서 ≤-70℃로 급속 동결시킨다.
랜덤으로 선택된 2마리 동물/그룹의 건(대측 아킬레스로부터 채취), 피부(보다 멀지 않은 영역으로부터 채취) 및 간의 절편을 또한 염색 대조군으로 수집하고, 면역조직화학 평가를 위해 10% 중성 완충된 포르말린에 저장한다. 각각의 대조군 조직의 일부분은 PGR 대조군을 위해 액체 질소에 급속 동결시킨다. (모든 3개의 대조군 조직은 포르말린에 함께 저장할 수 있고, 동결된 부분은 마찬가지로 함께 저장할 수 있다).
조직은 조직학(H&E, Masson's 트리크롬), 면역조직화학(SMAD8 및 테나신) 및 PGR(SMAD8, 테나신, 테노둘린 및 스클레라시스) 분석에 제공한다.
실시예 3 - 마우스에서 허혈증의 치료
이 연구는 사지 허혈증의 마우스 모델에서 본 발명의 처리된 미세혈관 조직 조성물의 효과를 입증한다. 사지 허혈증의 마우스 모델은 문헌[참조: Jang J et al, Circulation 1999; Huang N et al, JOVE 2009]에 이미 기재된 바와 같이 생성하고, 후지 허혈증의 유도 후에 혈관신생의 촉진에 있어서 세포 제제의 효과를 평가하기 위해 사용한다.
14 내지 16주령의 SDIC 마우스는 외과적으로 후지 허혈증을 유도한다. 수술 직후, 처리된 미세혈관 조직 조성물 또는 비히클 대조군을 하기 표 4에 상세한 바와 같이 동물에게 투여한다. 요약하면, 3개의 시험 세포 제품(각각 0.5×106 세포) 또는 비히클 대조군을 비복근 내로 후지 허혈증의 유도후 0일차에 근육내 주사한다. 3개의 시험 제품은 처리된 미세혈관 조직 조성물(시험 세포-I), E-빔에 의해 멸균시킨 처리된 미세혈관 조직 조성물(시험 세포-II) 및 감마 방사선으로 멸균시킨 처리된 미세혈관 조직 조성물(시험 세포-III)를 포함한다. 사지 관류의 개선은 전체 14일 동안 3 내지 4일마다 평가한다. 14일 후, 동물을 안락사시킨다. 허혈성 및 대측 비복근 둘다를 외식하고, 조직학적 분석에 제공한다.
연구 프로토콜
그룹 동물 # 시험 물질
1 10 비히클
2 10 시험 세포-I
(0.5 X 106)
3 10 시험 세포-II
(0.5 X 106)
4 10 시험 세포-III
(0.5 X 106)
종점 시험
혈류는 0, 3, 7, 11 및 14일에서 레이저 도플러 이미지화에 의해 평가한다.
동물은 14일차에 희생시키고, 사지 조직을 수거하고, 처리하고, 외식 연구를 위해 저장한다.
실시예 4 - SCID 마우스에서 혈관 형성
이들 연구는 생체내에서 혈관 구조를 형성하는 본 발명의 미세혈관 조직 제제의 능력을 입증하기 위해 마트리겔 플러그 검정을 이용한다. 마트리겔 플러그 검정은 생체내에서 진정한 혈관 형성의 결정적 검정이다. 이 검정은 복부 영역에 마트리겔로 치료 세포의 피하 이식을 포함한다. 2주의 과정 동안, 마트리겔 중의 세포는 신생혈관을 형성하기 위한 양호한 환경에 있고, 이중 일부는 숙주 혈관과 문합할 수 있다.
이 검정에서, 0.5×106 세포는 200ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자가 보충된 0.5ml 마트리겔에 매립한 다음, SCID 마우스 내로 피하 주사한다. 2개 플러그를 각각의 동물에 이식한다. 2주 후, 플러그는 혈관 형성의 조직학적 분석을 위해 외식한다. 인간을 천연 마우스 혈관으로부터 구별하기 위해, 인간 특이적 항체 표적화 내피 세포(예: CD31)는 인간-특이적 혈관을 식별하기 위해 사용한다. 인간 특이적 혈관의 존재는, 혈액 성분으로 수행된 관강구조에 의해 조직학적으로 입증된 바와 같이, 기능적 내피 세포를 입증한다. 유사하게는, 마우스-특이적 내피 세포 항체는 마우스-특이적 혈관을 식별하기 위해 사용할 수 있다. 췌장 혈관신생 인자를 분비하는 치료학적 세포의 능력은 마우스 혈관 형성에서 상대적 증강을 가져온다.
14 내지 16주령의 SCID 마우스는 하기 표 5에 상세한 바와 같이 본 발명의 미세혈관 조직 제제 또는 비히클 대조군을 함유하는 마트리겔 플러그의 이식을 제공받는다.
연구 프로토콜
그룹 동물 # 시험 물질
1 5 비히클
2 5 시험 세포-I
(0.5 X 106)
3 5 시험 세포-II
(0.5 X 106)
4 5 시험 세포-III
(0.5 X 106)
3개 시험 제품은 처리된 미세혈관 조성물(시험 세포-I), E-빔으로 멸균시킨 처리된 미세혈관 조직 조성물(시험 세포-II) 및 감마 방사선으로 멸균시킨 처리된 미세혈관 조직 조성물(시험 세포-III)을 포함한다.
실시예 5 - 랫트에서 류마티스성 관절염의 치료
이 연구는 랫트에서 7일 확립된 유형 II 콜라겐 관절염과 연관된 염증, 연골 파괴 및 골 흡수를 억제하는데 있어서 본 발명의 미세혈관 조직 제제의 효과를 입증한다.
시험 시스템
동물 수: 44
종/주 또는 품종: 르위스 랫트
판매사: Charles River
도착시의 연령/체중: 125-150g
성별: 암컷
연구 개시 시의 연령 범위: 1차 면역화시에 적어도 125g
순화: BBP에 도착후 4 내지 8일 동안 순화
하우징: 3-5/동물/케이지
물질
시험 제품(처리된 미세혈관 조직 조성물 제제) 및 적절한 비히클. 트리암시놀론 및 희석용 멸균 식염수(BBP), 보빈 유형 II 콜라겐(Elastin Products), 프로인트 불완전 보조제(Difco).
일반 연구 설계
랫트는 이소플루란으로 마취시키고, 0일 및 6일차에 다시 부위당 100㎕로, 원위 배면에 프로인트 불완전 보조제 주사 ID/SC 스프레드로 300㎕의 보빈 유형 II 콜라겐을 제공한다.
각 그룹으로의 랜덤화는, 질환이 2개 후지에서 명백해지는 경우에 관절염의 1일차에 수행한다(연구 10일)(무릎은 일반적으로 발목과 유사한 중증도의 질환을 갖지만, 용이하게 캘리퍼하기 어렵고, 따라서 발목 측정은 질환 개시를 측정할 목적으로 무릎을 대행한다.). 이는 관절염의 1일차로 된다. 관절염을 갖는 동물은 각 그룹에 대한 대략 평균 발목 캘리퍼 측정치를 갖는 처리 그룹으로 랜덤화한다.
처리(1A, 양 무릎에 둘 다)는 단지 1일에 관절염으로 발생한다. 무릎은, 발목이 너무 작아 주사하지 못하기 때문에 처리한다. 처리의 전신 효과는 발목의 캘리퍼 측정에 의해 모니터링하고, 처리의 국소 효과는 무릎 상의 조직병리에 의해 측정한다. 발목 캘리퍼 측정은 0일(기준선) -7로부터 매일 수행한다. 기준선 발목 캘리퍼 측정은 1/1000 인치로 반올림한 수치로 하나의 발목을 사용하여 0일차에 수행한다. 측정치는 체중 범위에 기초하여 랫트에 대한 조직학적 수치와 비교하여 임상적으로 정상(0.260-0.264 in)인 것으로 확인된다. 이어서, 기준선 측정치를 양 발목에 적용하고, 이들 수치는 발목이 모든 발목 골의 양호한 정의와 함께 염증의 증거가 없는 임상적으로 정상인 한, 동물에 잔류시킨다.
연구 그룹 설계화
그룹 N 화합물 경로 섭생 투여 수준 투여 용적 투여 농도
Grp 1 4 순수 N/A N/A N/A N/A N/A
Grp 2 8 비히클
대조군		 IA 양측, D1 40㎕
Grp 3 8 트리암시놀론 IA 양측, D1 0.03mgs 40㎕ 0.75mg/ml
Grp 4 8 TX-1 PO 양측, D1 2x105 세포 40㎕ 5x106 세포/ml
Grp 5 8 TX-2 PO 양측, D1 2x105 세포 40㎕ 5x106 세포/ml
Grp 6 8 TX-3 PO 양측, D1 2x105 세포 40㎕ 5x106 세포/ml
3개의 시험 제품은 처리된 미세혈관 조직 조성물(TX-1), E-빔으로 멸균시킨 처리된 미세혈관 조직 조성물(TX-II) 및 감마 방사선으로 멸균시킨 처리된 미세혈관 조직 조성물(TX-III)을 포함한다.
질환 유도
순화된 동물을 이소플루란으로 마취시키고, 콜라겐 주사(DO)를 제공했다. 6일차에, 이들을 다시 2차 콜라겐 주사로 마취시킨다. 콜라겐은 0.01N 아세트산에서 4mg/ml 용액을 생성함으로써 제조한다. 동일한 용적의 콜라겐 및 프로인트 불완전 보조제는, 물에 넣는 경우에, 이 물질의 비드가 이의 형태를 유지할 때까지 수동 혼합에 의해 유화시킨다. 각각의 동물은 배면 위의 3개 피하 부위(부위당 100㎕)에 걸쳐 300㎕의 혼합물을 각 시간표에서 취득한다.
물질
명칭(판매처): 유형 II 콜라겐(Elastin Products)
지정: 보빈 유형 II 콜라겐
특징: 가용성, 새로 태어난 송아지 관절로부터
저장 조건: 2-8℃
순도: >99.6%
명칭(판매처): 프로인트 불완전 보조제(Difco)
지정: 불완전 보조제
저장 조건: 2-8°C
시험 제품 및 비히클
시험 제품 비히클: 주사일에 제조한 줄기 세포 제제, 트리암시놀론(Vetalog, Ft, Dodge).
시험 제품 및 제형: 40㎕/무릎 관절의 주사에 적절한 농도에서 생리학적 비히클 중의 줄기 세포 제제. 식염수에서 희석되는 트리암시놀론 2mg/ml.
연구 카렌더
-8일
순응 그룹에 도착시 랫트 분배
0일 1일 2일 3일 4일
마취, 1차 콜라겐 주입
5일 6일 7일 8일 9일(0) 10일(1) 11일(2)
2차 콜라겐 주입 칭량, 캘리퍼스 기준 칭량,
투여,
캘리퍼스
(등록)		 칭량,
캘리퍼스
X/XX/2012 X/XX/2012 X/XX/2012 X/XX/2012 X/XX/2012 X/XX/2012 X/XX/2012
12일(3) 13일(4) 14일(5) 15일(6) 16일(7) 17일 18일
칭량,
캘리퍼스		 칭량,
캘리퍼스		 칭량,
캘리퍼스		 칭량,
캘리퍼스		 칭량,
캘리퍼스,
부검
살아있는 단계 행동
관절염 중증도에 의한 각 그룹으로의 랜덤화는 관절염 1일차(연구 10일)에 수행한다. 처리(양측 1A, 40㎕/관절)는 랜덤화(1일) 후에 개시한다. 체중 및 발목 캘리퍼 측정/스코어는 매일 취득한다.
동물애호 실천: 20% 이상의 체중의 감소(1주 이내)를 포함하여 가축 관리의 볼더 바이오패스 IACUC 프로그램에 따라 이환율을 나타내는 동물은 연구로부터 제거하고, 인간적으로 CO2 흡입에 의해 희생시킨다.
간 단계 배송품
간 단계 데이터 수집:
체중 관절염 0-7일
캘리퍼스 측정 관절염 0-7일 좌측 & 우측 발목
간 단계(비 PK) 샘플 수집
N/A N/A N/A
부검
동물은 출혈에 의해 관절염 7일차에 희생시킨다.
좌측 및 우측 후지의 중량 및 간, 비장 및 흉선의 중량을 포함하는 부검 데이터를 수집한다.
수집된 부검 샘플은 장기간 혈청의 분취량, 및 좌측 및 우측 후지 및 무릎을 포함한다.
관절/조직병리학적 채점의 처리
고정액 중에서 1 내지 2일 및 이어서 데칼시피어에서 4 내지 5일 후에, 발목 관절을 종방향에서 절반으로 절단하고, 무릎은 전방 면에서 절반으로 절단하고, 처리하고, 매립하고, 절단하고, 톨루이딘 블루로 염색했다.
유형 II 콜라겐 관절염을 갖는 랫트 관절에 대한 조직병리학적 채점 방법
콜라겐 관절염 발목 및 무릎은 하기 기준에 따라 염증, 파누스 형성 및 골 흡수에 대해 0 내지 5의 스코어를 제공한다:
0 = 정상
0.5 = 최소 초점 염증
1 = 활막/관절주변 조직에서 염증 세포의 최소 침윤
2 = 경도 침윤
3 = 적당한 부종과 함께 중등도의 침윤
4 = 현저한 부종과 함께 현저한 침윤
5 = 고도의 부종과 함께 고도의 침윤
유형 II 콜라겐 관절염을 갖는 마우스 및 랫트에서 염증 침윤은, 당해 병변이 급성 내지 아급성 단계에 존재하는 경우, 보다 적은 수의 림프구와 함께 호중구 및 마크로파지로 구성된다. 관절 공간 내의 조직 부종 및 호중구 삼출액은 급성 내지 아급성 단계에서 공통한다. 염증이 만성의 단핵구 염증 세포(단핵구, 림프구)로 진행함에 따라, 우세한 및 섬유아세포 증식은, 종종 이염성 매트릭스의 침착과 함께, 활막 및 관절주변 조직에서 발생한다. 삼출액은 관절 공간에서 덜 일반적이다. 주석 부분에서 지시하지 않는 한, 염증 유형은 급성 내지 아급성이다.
발목 파누스
0 = 정상
0.5 = 단지 주변 영역 및 단지 소수의 관절에만 영향을 미치는, 연골 및 연골하 골에서 파누스의 최소 침윤
1 = 주변 영역에 주로 영향을 미치는, 연골 및 연골하 골에서 파누스의 최소 침윤
2 = 경도 침윤(주변 영역에서 경골 또는 부골의 < 1/4)
3 = 중등도 침윤(주변 영역에서 영향을 미치는 경골 또는 작은 부골의 1/4 내지 1/3)
4 = 현저한 침윤(주변 영역에서 영향을 미치는 경골 또는 부골의 1/2 내지 3/4)
5 = 고도의 침윤(주변 영역에서 영향을 미치는 경골 또는 부골의 >3/4, 전체 구조의 심각한 염좌)
무릎 파누스
0 = 정상
0.5 = 단지 주변 영역 및 단지 소수 관절에만 영향을 미치는, 연골 및 연골하 골에서 파누스의 최소 침윤
1 = 연골 및 연골하 골에서 파누스의 최소 침윤, 영향을 미치는 연골 표면 또는 연골하 골의 대략 1 내지 10%
2 = 경도 침윤(경골 또는 대퇴골의 표면 또는 연골하 부분의 최대 1/4까지 연장), 영향을 미치는 연골 표면 또는 연골하 골의 대략 11 내지 25%
3 = 중등도 침윤(경골 또는 대퇴골의 표면 또는 연골하 부분의 >1/4 이상 <1/2까지 연장), 영향을 미치는 표면 또는 연골하 골의 대략 26 내지 50%
4 = 현저한 침윤(경골 또는 대퇴골 표면의 1/2 내지 3/4까지 연장), 영향을 미치는 연골 표면 또는 연골하 골의 대략 51 내지 75%
5 = 고도 침윤, 영향을 미치는 연골 표면 또는 연골하 골의 대략 76 내지 100%
발목 연골 손상(작은 부골 중시)
0 = 정상
0.5 = 단지 주변 영역 및 단지 소수의 관절에만 영향을 미치는, T 블루 염색에서 최소 감소
1 = 명백한 연골세포 소실 또는 콜라겐 붕괴의 부재하에 툴루이딘 블루 염색의 최소 내지 경도의 소실
2 = 초점 경도(표면) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 붕괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 경도의 소실
3 = 다초점 중등도(중간 영역까지의 깊이) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 붕괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 중등도의 소실, 희귀한 전체 두께 소실 부분과 함께 1/2 내지 3/4 깊이까지 영향을 미치는 보다 작은 부골
4 = 다초점의 현저한(심 영역까지의 깊이) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 붕괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 현저한 소실, 1 또는 2개의 작은 부골 표면은 연골의 전체 두께 소실을 갖는다.
5 = 다초점의 고도(타이드 마크까지의 깊이) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 붕괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 고도의 확산 소실, 2개 이상의 연골 표면에 영향을 미침
무릎 연골 손상
0 = 정상
0.5 = T 블루 염색에서 최소 감소, 단지 주변 영역에 영향을 미침
1 = 명백한 연골세포 소실 또는 콜라겐 붕괴의 부재하에 톨루이딘 블루 염색의 최소 내지 경도의 소실
2 = 초점 경도(표면) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 붕괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 경도의 소실은 영향을 미치는 연골의 50% 깊이의 작은 부분을 가질 수 있다.
3 = 다초점 내지 확산 중등도(중간 영역까지의 깊이) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 붕괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 중등도의 소실은 표면의 전체 폭의 1/4 미만 및 모든 표면의 전체 폭의 25% 이상에 영향을 미치는 전체 두께 소실의 1 내지 2개의 작은 부분을 가질 수 있다.
4 = 다초점 내지 확산 현저한(깊은 영역까지의 깊이) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 붕괴, 또는 다른 것들에 대한 거의 전체 소실 및 부분 소실을 갖는 1개 표면과 함께 톨루이딘 블루 염색의 현저한 소실, 조합된 모든 표면의 폭의 50% 미만의 전체 전반적 소실
5 = 다초점의 고도(타이드 마크까지의 깊이) 연골세포 소실 및/또는 대퇴골 및/또는 경골 상의 콜라겐 붕괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 고도의 확산 소실, 조합된 모든 표면의 폭의 50% 초과의 전체 전반적 소실
발목 골 흡수
0 = 정상
0.5 = 최소 흡수는 단지 주변 영역에 영향을 미치고 단지 소수의 관절에 영향을 미친다.
1 = 작은 부분의 흡수, 낮은 배율로 용이하게 식별되지 않음, 희귀한 파골세포
2 = 경도 - 보다 다수 부분의 흡수, 낮은 배율로 용이하게 식별되지 않음, 보다 많은 수의 파골세포, 흡수된 주변 영역에서 경골 또는 부골의 <1/4
3 = 중등도 - 피질 상의 전체 두께 결함의 부재하에 수질 소주 및 피질 골의 명백한 흡수, 약간의 수질 소주의 소실, 낮은 배율로 명백한 병변, 보다 많은 수의 파골세포, 주변 영역에서 영향을 미친 경골 또는 부골의 1/4 내지 1/3.
4 = 현저 - 종종 나머지 피질 표면의 프로파일의 왜곡과 함께 피질 골에서 전체 두께 결함, 수질 골의 현저한 소실, 다수의 파골세포, 주변 영역에서 영향을 미친 경골 또는 부골의 1/2 내지 3/4.
5 = 고도 - 종종 나머지 피질 표면의 프로파일의 왜곡과 함께 피질 골에서 전체 두께 결함, 수질 골의 현저한 소실, 다수의 파골세포, 주변 영역에서 영향을 미친 경골 또는 부골의 > 3/4, 전체 구조의 심각한 왜곡
무릎 골 흡수
0 = 정상
0.5 = 최소 흡수는 단지 주변 영역에 영향을 미친다.
1 = 최소 - 작은 부분의 흡수, 낮은 배율로 용이하게 식별되지 않음, 영향을 미치는 연골하 골의 전체 관찰 폭의 대략 1 내지 10%
2 = 경도 - 다수 부분의 흡수, 연골하 골의 명확한 소실, 영향을 미치는 연골하 골의 전체 관절 폭의 대략 11 내지 25%
3 = 중등도 - 연골하 골의 명백한 흡수, 영향을 미치는 연골하 골의 전체 관철 폭의 대략 26 내지 50%
4 = 현저 - 연골하 골의 명백한 흡수, 영향을 미치는 연골하 골의 전체 관절 폭의 대략 51 내지 75%
5 = 고도 - 파괴에 기인하여 전체 관절의 왜곡, 영향을 미치는 연골하 골의 전체 관절 폭의 대략 100%
관절주변 매트릭스 퇴적(질환 대조군과 비교하여 임의의 처리된 그룹에서 증가가 관찰되는 경우에만 채점)
0 = 정상
1 = 미약, 다초점 이염성 염색, 관절주변 조직의 과도한 확장 없음
2 = 보다 어두움, 확산 이염성 염색, 관절주변 조직의 과도한 확장 없음
3 = 보다 어두움, 확산 이염성 염색, 관절주변 조직의 경도 확장
4 = 보다 어두움, 확산 이염성 염색, 관절주변 조직의 중등도 확장
5 = 보다 어두움, 확산 이염성 염색, 관절주변 조직의 심각한 확장
통계 분석
임상 데이터
데이터는 스튜던트 t-시험 또는 만-휘트니 U 시험(비-모수)을 사용하여 분석한다. 적용가능한 경우, 데이터는 적절한 다중 비교 포스트-시험과 함께 분산의 1방향 분석(1방향 ANOVA) 또는 크루스칼-왈리스 시험(비-모수)을 사용하여 모든 그룹에 대해 추가로 분석한다. 지시되지 않는 한, 통계 분석은 단지 본래(비변형) 데이터로 수행한다. 통계 시험은 데이터의 정규화 및 분산의 균일성에 관한 특정의 가정을 만들고, 추가의 분석은 시험이 이들 가정의 위반을 생성한 경우에 요구될 수 있다. 모든 시험의 유의성은 p≤0.05로 설정된다.
발 중량의 억제율 및 AUC는 하기 식을 사용하여 계산한다:
억제율(%) = A - B/A ×100
A = 평균 질환 관리 - 평균 정상
B = 처리된 평균 - 평균 정상
실시예 6 - 염소에서 골 공동, 연골 결함 및 반월판 병변의 치료
이 연구는 골 공동, 연골 결함 및 반월판 병변의 치료에서 본 발명의 미세혈관 조직 제제의 효과를 입증한다. 이 연구에서, 각각의 동물에 대해, 우측 뒷무릎 관절을 수술하고, 3개의 상이한 독립된 외과적 결함을 생성한다. 시험된 각각의 우측 대퇴골은 대퇴골의 측면 상과부 영역에서 생성된 하나의 8mm 직경 및 20mm 깊이 골 결함, 활차 열구에서 생성된 하나의 4×7mm 장방형 및 2mm 깊이 연골 결함, 및 내측 반월판의 백색-백색 영역에서 생성된 하나의 7mm 길이 및 1-2mm 폭의 전체 두께 반월판 결함을 갖는다. 3마리 동물의 처리 그룹은 미세혈관 조직 제제로 처리한 각각의 결함을 갖고, 대조군 그룹은 단지 스캐폴드로 충전한 결함을 갖는다. 염소는 다양한 결함 부위에서 수복된 조직을 평가하고 특성화하기 위해 8주에서 평가하고, 처리된 결함은 대조군과 비교하여 육안 및 조직학적 외관에서 우수할 것으로 예상된다.
염소는 비교적 거대한 뒷무릎 관절 크기, 취급 용이성, 다른 연골, 반월판 및 골 수복 연구에서의 사용, 및 인간에서 관찰된 것과의 반응 유사성 때문에 선택되었다. 다양한 종의 염소는 말 및 인간과 유사한, 이들의 거대한 관절 크기, 반월판 수복 생리의 유사성, 1.5 내지 2mm의 무릎(뒷무릎 관절) 관절에서의 연골의 두께, 및 이들이 인간과 유사한 해면 및 피질 골(2차 골원)을 보유하는 점에 기인하여 연골 연구에 사용되어 왔다. 골, 연골 및 반월판 수복 프로세스는 시험관내 설정에서 모방할 수 없는 매우 복잡한 프로세스이다. 동물 모델은, 관절, 특히 손상된 관절의 생리가 매우 복잡하고 실험실에서 복제할 수 없기 때문에 필요하다. 이 연구에 사용된 동물은 표 9에 요약되어 있다.
동물 사용
통상 명칭 수 연령 체중 성별 동시에 수용된 # 수용 지속기간
누비 보어-크로스 염소 6 2-4세 > 120 lb. 거세된 수컷 6 6 @ 12주
누비 보어-크로스 염소 2 2-4세 > 120 lb. 거세된 수컷 2 치환 동물; 최대 12주
하나의 단피질 뒷무릎 8mm 직경 및 20mm 깊이 결함은 우측 대퇴골의 측면 영역에서 생성하고; 하나의 4×7mm 및 대략 2mm 장방형 결함은 우측 대퇴골의 측면 활차 열구에서 생성하고; 하나의 대략 7mm 길이 및 1-2mm 폭 전체 두께 결함은 우측 내측 반월판에서 생성한다. 각각의 무릎은 드로워(drawer), 운동 범위(각도계), 팽창, 온도, 마찰음, 슬개골 추적 및 외반족/내반족에 대해 물리적으로 검사한다. 클로로헥시딘, 이어서 70% 알콜 및 이어서 베타딘의 도료를 사용한 표준 외과 스크럽을 수행한다. 외과적 접근법은 우측 대퇴골의 원위 1/3으로부터 경골 평탄부의 수준까지 생성한 만곡 내측 피부 절개로 구성된다.
내측 측부 인대를 식별하고, 골-인대 부착 풋프린트의 개요를 소작으로 작성한다. 풋프린트의 중앙에서, 2.8mm 비트 및 탭을 사용하여 인대의 재부착을 위한 스크류 구멍을 생성한다. 진동 톱을 사용하여 내측 측부 인대의 부착 풋프린트를 절단하고, 이를 경골을 향해 반사되도록 한다. 관절낭을 개방하고, 무릎을 굴곡시키고, 측면으로 회전시켜 내측 반월판을 노출시킨다. 플라스틱 보호 탭을 내측 반월판하에 위치시키고, 특별하게 설계된 타원형 펀치를 사용하여 전체 두께 결함을 반월판의 백색-백색 영역에 생성한다. 이어서, 결함은 스캐폴드 또는 스캐폴드 + 화합물로 처리한다. 무릎을 세우고, 내측 측부 인대를 스크류 및 워셔로 재부착한다.
이어서, 무릎을 굴곡시키고, 측면 활차 열구의 중간점을 식별한다. 연골 결함의 굴삭 지점은 측면 활차 홈의 근위 경계로부터 원위 20mm로서 정의한다. 연골은 직경 6mm 펀치로 채점하고, 특수한 기구를 사용하여, 직경 6mm 및 깊이 대략 2mm의 결함을 연골 표면에서 생성한다. 이어서, 이 결함은 스캐폴드 또는 스캐폴드 + 화합물로 처리한다.
여전히 굴곡시킨 무릎으로, 채색된 직경 3mm 직경 비트를 사용하여 20mm 깊이로 외측 대퇴부 관절골의 상과에서 파일롯 구멍을 드릴링한다. 드릴 비트는 관절 라인에 수직으로 및 전방 표면에 수평으로 정렬한다. 이어서, 이 파일롯 구멍은 직경 8mm로 확대한다. 골 결함을 플러싱한 다음, 스캐폴드 또는 스캐폴드 + 화합물로 처리한다.
심층 및 피부 고정용의 1-0 비크릴을 사용하여 외과적 절개를 폐쇄한 후, 변형된 토마스 스플린트를 다리에 적용하여 체중 부하 및 운동을 제한한다. 유리섬유 캐스트 및 스플린트는 수술후 최소 14 + 2일 동안 유지시킬 것이다. 이 시간 동안, 동물은 작은 패덕 내에 유지시킨다.
결함당 치료 할당
그룹 동물의 수 치료
1 1 골 결함: 화합물
연골 결함: 화합물
반월판 결함: 화합물
1 2 골 결함: 화합물
연골 결함: 화합물
반월판 결함: 화합물
1 3 골 결함: 화합물
연골 결함: 화합물
반월판 결함: 화합물
1 4 골 결함: 스캐폴드
연골 결함: 스캐폴드
반월판 결함: 스캐폴드
2 5 골 결함: 스캐폴드
연골 결함: 스캐폴드
반월판 결함: 스캐폴드
2 6 골 결함: 스캐폴드
연골 결함: 스캐폴드
반월판 결함: 스캐폴드
동물은 수술후 84 +2일에서 염화칼륨 IV으로 단계 III 마취하에 안락사시킨다. 안락사 후, 뒷무릎 관절을 육안으로 평가하고, 활액 유체를 색 및 점도에 대해 육안으로 평가하고, 샘플을 표 12에 기재된 바와 같이 수집한다. 관절을 개방하고, 사진 촬영하고, 연골 부위의 표면을 표 13에 지시된 바와 같이 채점한다. 결함 부위에 대향하는 관절운동 표면은 임의의 이상 관절 표면에 대해 검사한다. 육안 평가는 대조군 및 수술된 무릎 관절 상에서 수행한다. 슬와 림프절 및 활막은 임의의 염증에 대해 검사한다.
총 평가 및 샘플 수집
샘플 총 평가 사진 및 채점 샘플 수집
우측 오금 림프절 X
우측 무릎 관절
연골 및 반월판		 X X X(H)
좌측 오금 림프절 X
좌측 무릎 관절
연골 및 반월판		 X X
H= 조직학 -단지 우측 대퇴골: 골 결함, 활차 결함, 내측 반월판
반대측 무릎은 임의의 이상 관절 표면에 대해 검사한다. 우측 무릎 관절의 육안 형태학적 평가는 표 3에 수록된 이전 채점 기준에 기초하여 연골 표면 수복을 측정하기 위해 작성한다. 우측 대퇴골은 골 공동 영역으로부터 연골 결함을 분리하기 위해 절단하고, 10배 용적의 10% 중성 완충된 포르말린이 충전된 적절하게 표지된 용기에 위치시킨다. 내측 반월판을 육안으로 평가하고, 수거하고, 10배 용적의 10% 중성 완충된 포르말린이 충전된 적절하게 표지된 용기에 위치시킨다.
전체 형태학 평가를 위한 채점 기준
특성 등급 등점
엣지 통합
(네이티브 연골에 대한 새로운 조직)		 완전
부분적
없음		 2
1
0
연골 표면의 매끄러움 매끄러움
중간
거침		 2
1
0
연골 표면, 충전도 증수
약간 강하
움푹 들어감/과성장		 2
1
0
연골의 색상, 신연골의 불투명 또는 반투명 불투명
반투명
투명		 2
1
0
활액을 수집하고, 용적, 점도(스트링), 명도 및 색에 대해 평가한다. 적절한 경우, 육안 활액 평가의 반-정량적 채점은 표 13에 개략된 바와 같이 적용한다.
활액의 설명 및 채점
채점 색상 투명도 스트링
0 S=담황색 C- 투명함 N= 정상
1 P= 핑크색 H= 안개 낌 A= 비정상
2 Y= 옐로우/R= 레드 D= 흐림 W= 물 같음
3 B= 적색 T= 탁함
전체 활액 스코어는 색, 명도 및 스트링 스코어의 합계이다(0 내지 8점).
실시예 7 - 처리된 랫트 미세혈관 조직을 사용한 세포 이주 검정
세포 이주에 대한 처리된 미세혈관 조직 조성물의 효과를 입증하기 위해, 지방-유래 간질 혈관 분획(SVF) 세포에 의해 흡수된 인간 내피 세포 이주(처리된 미세혈관 조직 조성물에 의한 화학 유인) 및 표지된 처리된 미세혈관 조직 조성물 미세소낭(MV)의 검정을 개발하고, 조성물의 생물학적 활성의 척도로서 사용했다.
이들 연구를 선택하는 근거는 (1) 처리된 미세혈관 조직 조성물은 혈관 수복의 증가를 유도할 수 있고, 따라서 내피 세포 이동은 유효한 측정기준이 될 수 있으며; (2) MV 방출 및 흡수는 조직 수복 모델에서 다중 세포형에서 발생하는 중요한 활성이고, 따라서 혈관 수복에 중요한 세포형을 갖는 SVF 세포 모집단을 사용하여 MV 흡수를 시험한다는 점이다.
일반 연구 설계
내피 세포에 대한 처리된 미세혈관 조직 조성물의 화학유인 능력을 검정하기 위해, 조성물의 샘플을 트랜스웰 플레이트의 하부 챔버에 위치시키고, 오렌지색-적색 형광 친지성 염료(CM-DiI)로 표지된 내피 세포의 이주를 12시간에서 48시간까지 경시적으로 모니터링한다. 검정은 또한 100%에서 화학적으로 정의된 동결보존 배지 EZ-CPZTM(Incell Corp., San Antonio, TX) 및 기준선 대조군으로서 EZ-CPZTM과 M3DTM(Incell Corp., San Antonio, TX) 배지의 50:50 혼합물을 포함한다.
제2 연구는 SVF 세포에 의한 동결건조된 처리된 미세혈관 조직 조성물의 흡수를 평가하기 위해 수행한다. 조성물을 CM-DiI과 함께 항온처리하여 염료가 MV 및 조성물 샘플의 세포 막 내로 도입되도록 한다. 표지된 조성물 샘플을 세정하고, 배지에서 희석시킨 다음, SVF 세포의 부착된 단층 배양물에 위치시킨다. 24시간 흡수 후, 세포를 세정한 다음, 적색 형광 염료의 흡수에 대해 가시화한다.
재료 및 방법
M3DTM은 INCELL에 의해 제조된 화학적으로 정의된 배양 배지이다. 몇몇 검정에서 M3DTM은 항생물질(1X PSF: Pen/Strcp/Fungizone 항생물질/항진균제; Invitrogen, Grand island NY)이 보충된다. M3D: 10개 배지(INCELL)는 10% 태소 혈청(FBS) 및 1X PSF이 보충된 M3DTM이다. EZ-CPZTM(Incell Corp., San Antonio, TX)은 화학적으로 정의된 동결보존 배지이다. EZ-CPZTM 및 EZ-CPZTM:M3DTM(1:1; v/v)를 기준 대조군 배지로서 사용했다.
CM-DiI은 배양 배지를 위한 수성 제형 중의 "Cell TrackerR" 형광 염료이다(Invitrogen/ Molecular Probes). 이는 세포 막 및 MV 등의 친지성 물질과 연관되고, 형광 현미경에 의해 밝은 적색 형광으로 가시화될 수 있다. 이 연구를 위해, EVQS 도립 현미경을 적색 필터와 함께 사용한다(530nm 여기, 593nm 방사).
계대 1(p1)에서 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 인셀 바이오레포지토리(INCELL Biorepository)로부터 회수한다. MV 흡수 검정을 위한 인간 SVF p1 세포는 인셀 바이오레포지토리로부터 회수한다.
모든 세포는 M3D:10TM(Incell, San Antonio, TX)에서 성장시킨다. 내피 세포는 30분 동안 37℃에서 CM-DiI와 함께 배양한 다음, 1×PSF와 함께 M3DTM으로 세정한다. 세포를 계수하고, 웰당 동일한 수의 세포는 삼중 웰로 처리된 미세혈관 조직 조성물 시험 물질이 예비 적재된 3μ 세공 크기 PET 트랜스웰 챔버(Thermofisher; Waltham, MA)의 상부 챔버에 적용한다.
흡수 분석을 위한 SVF 세포는 48-웰 플레이트에서 대수 증식 상으로 성장한다.
처리된 미세혈관 조직 조성물
처리된 미세혈관 조직 조성물을 제조하고, 시험한다(즉, BMA 및 BMB). BMA 샘플은 랫트 SVF 세포이고, BMB는 랫트 골수 단핵구 세포이고, 각각 106 세포/ml로 동결건조시킨다. 랫트 SVF 세포는 직경 1mm보다 큰 단편이 없을 때까지 가위로 정소상체 지방 패드를 분쇄함으로써 제조한 다음, 세척하고, 온화한 진탕과 함께 60분 동안 37℃에서 PBS 중의 1U/ml 클리자임(Clzyme) AS(Vitacyte, Indianapolis, IN)에서 배양한다. 세포를 2회 세척하고, 동결건조 완충제에 106/ml로 재현탁시킨다. 랫트 골수 세포는 ACDA/PBS 용액으로 대퇴골 및 경골을 플러싱하여 수득하고, 20ga 바늘을 통한 반복된 흡인 및 배출에 의해 해리시킨다. 이어서, 골수 세포는 피콜 구배로 분리하고, PBS + 1% FBS로 2회 세척하고, 완충제에 재현탁시킨다. 동결건조 후, BMA 샘플은 검출 한계 이하의 세포 수(10,000 미만)을 제공하는 반면, BMB 샘플은 표 14에 제시된 바와 같이 0.6 내지 1.0백만의 세포 수 및 10 내지 50%의 생존율(트리판 블루)를 제공한다.
BMA 및 BMB 제제의 생존 능력
샘플
 세포 # 생존율(%)
 바이알 #
동결건조 전 동결건조 후
BMA 완충제 1 45,000 2,500 80 3
BMA 완충제 2 27,000 7,500 0 3
BMA 완충제 1 4.4 x 105 6 x105 48 4
BMA 완충제 2 5 x 105 10 x 105 10 4
모든 샘플은 1년 동안 암 상태에서 동결 저장하고, 시험 샘플은 11kGy E-빔 방사선으로 멸균시킨다. 비-조사된 대조군 샘플을 멸균시키지 않는다.
표지된 내피 세포의 트랜스웰 이주
동결건조된 물질은 1× PSF와 함께 1ml의 UFDI 물에서 재구성한다. 이러한 전체 샘플 중, 300㎕를 각각의 3개 웰의 하부에 위치시키고, 200㎕ M3D로 500㎕의 최종 용적으로 되게 한다. 상부 챔버를 샘플 웰에 설정하고, 동일한 수의 CM-DiI 표지된 HUVEC p2 세포를 각각의 웰에 위치시킨다. 플레이트를 37℃에서 배양하고, 웰을 12, 24 및 48시간에서 이미지화한다. 이미지는 결과를 측정하기 위해 필드 중의 세포를 계수하여 검사한다.
SVF 세포에 의한 표지된 미세소낭의 흡수
나머지 100㎕의 동결건조된 물질을 CM-DiI와 함께 배양하여 존재하는 세포 막을 표지한다. 물질을 원심분리에 의해 M3D+1×PSF로 3회 세척한다. 흡수 검정을 위해 48-웰 플레이트 시딩된 SVF 세포를 50% 컨플루언스로 성장시키고, 상부에 층상화된 50㎕ CM-DiI 표지된 동결건조된 물질을 갖는다. 웰의 절반을 24시간에서 세정하고, 액체 마운트로 코팅하고, 건조시킨다; 다른 절반을 세정하고, 고정하고, 3일 후에 적재한다. 이미지는 결과를 측정하기 위해 검사한다.
결과
표지된 내피 세포의 트랜스웰 이주
모든 웰에 대해, 12시간 시점에서 하부 챔버에서 최소 수의 세포가 있었다. 시간이 경과됨에 따라 도 2 및 도 3 내지 7의 제1 열을 참조하면, 세포는 하부 챔버로 이주하기 시작한다. 일부 샘플은 보다 신속하게 하부 챔버로 채취된다. BMA 샘플은 도 2에서 관찰되는 바와 같이 BMB보다 많이 세포를 유인하는 경향이 있다. BMA 완충제 2 시험 그룹은 24시간에서 최저 세포 수를 갖지만, 시험 샘플 중에서 48시간 시점에서 최고 세포 수를 갖는다. 전체 BMA 샘플은 BMB 샘플보다 우수하게 작동하고, 완충제 2는 완충제 1보다 높은 이주 속도의 유도의 경향(그러나, 통계학적으로 유의적인 것은 아님)을 나타낸다.
이 검정의 다른 주목할 만한 효과는 약 20%의 BMA에서 유발된 이주 조사에서 감소 경향이 있는 반면, BMB는 거의 효과가 없었고 24시간 및 48시간에서 실질적으로 동일한 수준이었다(차이는 통계학적으로 유의적인 것은 아님).
EZ-CPZTM 배지 대조군은 약간의 이주를 갖지만, BMA 및 BMB 샘플보다 이후의 시간 경과 및 보다 낮은 정도이다. 이들 결과는 세포가 혈관신생 활성을 유도하기 위해 조성물에 대해 생존가능하거나 자가성일 필요가 없다는 것을 극적으로 입증한다.
SVF 세포에 의한 표지된 처리된 미세혈관 조직 조성물 미세소낭의 흡수
이 검정은 처리된 미세혈관 조직 조성물 MV가 SVF(간질 혈관 분획) 세포 내로 수송되는지를 측정하기 위해 수행했다. 이 검정은 나머지 100㎕의 처리된 미세혈관 조직 조성물 물질을, 세포 자체가 사멸한 경우에도 세포 막 내로 도입되는 CM-DiI와 함께 각각의 바이알에 잔류시킴으로써 수행한다. SVF 세포를 M3D:10 배지로 48웰 플레이트에 플레이팅하고, 이들이 대략 50% 컨플루언스에 도달할 때까지 부착 및 성장시킨다. 50㎕의 표지된 물질을 웰에 첨가하고, 6시간 동안 배양했다. 웰을 M3DTM으로 3회 세정하고, 습식-마운트로 고정시켰다. 이미지는, 도 8 및 9에서 보는 바와 같이, 염료가 SVF 세포로 전이됨에 따라, 몇몇 세포가 당해 물질을 실제로 흡수했음을 나타냈다.
논의
조사의 존재 또는 부재하에 BMA 및 BMB 동결건조된 물질은 이 검정에서 내피 세포에 화학-유인제로서 작용했다. 물질을 조사하는 경우, 세포 이주의 경도의 감소가 관찰되었다. 완충제 1 또는 2 사이의 차이는 무시할 수 있었다.
BMA 및 BMB 물질은, 당해 물질을 이미 성장하는 배양물의 상부에 위치시키고 24시간 동안 배양하는 경우에 살아있는 SVF 세포에 의해 흡수되었다.
이들 실험으로 설명된 몇가지 중요한 개념이 있다. SVF 샘플은 거대한 세포 소실을 나타냈고 동결건조 후에 생존능이 없었지만, 이들은 세포 무소실 및 10 내지 50%의 생존율을 나타낸 골수 샘플보다 높은 생물학적 활성을 보유했다. (SVF 세포 소실은 소화 단계 동안 과도한 효소 활성에 의해 유발될 수 있다.) 세포 제제 둘 다는 1년에 걸쳐 안정했다. 멸균은 내피 세포를 유인하는 이들의 능력에 물질적으로 영향을 미치지 않았다.
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실시예 8 - 미세혈관 조직의 시험관내 및 생체내 효과
상기 논의한 바와 같이, 다양한 줄기 세포 제제는 다양한 징후에 대해 동물 및 임상 연구에서 유리한 효과를 나타냈다. 다수의 예에서, 투여된 줄기 세포의 생존은 비교적 불량하다. 따라서, 본 연구는, 상기 몇몇 실시양태와 관련하여 논의한 바와 같이, 생존가능한 줄기 세포가 줄기 세포와 연관된 일부(또는 전부)의 치료학적 이점을 달성하기 위해 필요한지의 여부를 해결하기 위해 설계되었다. 본 연구는 상기 개시된 방법에 따라 처리된 미세혈관 조직, 줄기 및 전구 세포의 풍부한 공급원을 사용했다.
요약하면, 미세혈관 조직은 조직을 잘게 분쇄하고 후속적으로 분쇄된 조직을 효소에 의해 소화시킴으로써 인간 사체 지방 조직으로부터 단리했다. 이어서, 소화된 조직을 원심분리하여 지방을 제거하고, 미세혈관 조직을 수득했다. 미세혈관 조직을 동결보존된 완충제(M3:DC 및 EZ-CPZ 배지의 1:1 혼합물, INCELL Corporation, San Antonio, TX)에 재현탁시키고, 바이알에 분배하고, 동결건조시키거나 동결건조 및 방사선 멸균시켰다.
수득되는 처리된 미세혈관 조직을 혈관신생 및 정형외과 모델에서 세포 수, 생존율, 표현형, CFU-F 및 생물활성에 대해 검정했다.
결과
새롭된 단리된, 동결건조된 및 동결건조/멸균된 미세혈관 조직의 세포 수 및 생존율은 표 16에 제시되어 있다. 각 제제의 표현형은 표 17에 제시되어 있다.
제조 단리됨 동결건조됨 동결건조됨 + 멸균됨
세포수(DAPI/지방 g 1.2±0.2 백만 0.9±0.1 백만 1.0±0.3 백만
생존율(트리판 블루) 85±5% 15±1% 2±1%
표현형 유형 IV 콜라겐 CD31+ CD34+ CD44+ CD45+
새로운 미세혈관 조직 65±5% 52±7% 58±4% 55±10% 5±1%
동결건조됨 + 멸균됨 85±13% 73±17% 65±9% 61±13% 11±3%
세포수/세포 생존율 데이터는 미세혈관 조직의 처리에 기초하는 세포 수에 유의한 변화가 없다(예를 들면, 신선한, 건조된, 또는 건조되고 멸균되든지, 세포 수는 DAPI DNA 염색의 핵 흡수에 기초하여 거의 동등하다)는 것을 명백하게 입증한다. 그러나, 미세혈관 조직의 동결건조는 트리판 블루를 배제하는 미세혈관 조직 중의 세포의 능력을 상당히 감소시킨다. 동결건조는 생존 세포의 비율에서 약 70% 감소를 유도한다. 방사선에의 노출은 생존율을 추가로 감소시켜 미세혈관 조직에서 단지 약 2%의 세포가 생존가능했다. (확립된 콜로니-형성 단위-섬유아세포(CFU-F) 분석을 사용하여) 추가로, 기능성 중간엽 줄기 세포에 대해 분석할 때, 어떠한 기능성 중간엽 줄기 세포도 동결건조되거나 동결건조된/멸균된 제제에서 검출되지 않았다.
흥미롭게도, 변하지 않은 세포수 및 생존율의 감소에도 불구하고, 각종 처리 방법은 세포의 표현형을 변경시켰다. 표 17에 나타낸 바와 같이, 유형 IV 콜라겐은 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직에서 (신선한 제제에 대해) 적당히 증가했다. 이 데이터는, 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직이 적어도 부분적으로 이의 증가된 콜라겐 밀도에 기인하여 연조직의 회복에 충분히 적합할 수 있음을 시사한다. 콜라겐계 물질은 조직 공학에서 이들의 사용에 대해 시험되어 왔지만, 본원에 개시된 미세혈관 조직은 물질의 준비된 이용가능성, 및 이의 강화된 "줄기성"(이하 논의됨) 때문에 특히 유리하다. 확립된 조혈 줄기 세포 마커 CD31(조혈 줄기 세포), CD34(골수/조혈 줄기 세포), CD44(암 줄기상 세포) 및 CD45(조혈 줄기 세포) 각각은 본질적으로 동결건조 및 멸균화에 반응하여 상향조절되었다. 따라서, 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직에서 세포의 생존율의 거의 완전한 감소에도 불구하고, 잔류하는 임의의 세포는 줄기 세포에 의해 발현되는 것으로 공지된 마커의 발현을 증강시켰다. 이와 같이, 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직은 이 증강된 줄기성 (및 증가된 줄기성이 야기하는 간접적 효과, 예를 들면, 회복, 미세혈관 조직으로부터 성장 인자의 방출을 증강시키는 기타 내인성 세포의 파라크린 동원) 때문에 조직 재생에 더욱 적합할 수 있다.
각종 미세혈관 조직을 다른 종류의 세포를 동원하는 이들의 능력에 대해 평가했다. 세포의 동원은 각종 메카니즘에 의해 손상되거나 병에 걸린 조직의 회복 또는 재생을 증강시킬 수 있다. 예를 들면, 내피 세포의 동원은 혈관 형성을 증강시켜 새로운 조직 형성을 용이하게 하는 혈액 공급을 개선시킨다. 내재성 줄기 세포의 동원은 새로운 조직 성장 및/또는 기존의 손상 조직의 회복을 촉진시키는 사상의 캐스케이드를 개시할 수 있다. 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 DiI로 표지하고, 기저 웰 중의 다양한 형태의 미세혈관 조직과 함께 트랜스웰 플레이트의 상부에 배치했다. 내부-웰 막을 교차하는 HUVEC의 수를 48시간 후 각 형태의 미세혈관 조직에 대해 계수하고, 대조군으로서 배양 배지 단독 또는 상피 성장 인자(EGF)가 보충된 배지와 비교했다. 도 10은 결과를 나타낸다. HUVEC 세포의 적은 이주는 배지 단독에 반응하여 검출되었다. HUVEC 이동의 유도제로서 확립된 EGF는 배지 단독보다 약 10배 이상의 이주를 유도한다. 새롭게 단리된 미세혈관 조직(도 10에서 "소화된")은 EGF보다 약간 더 적은 이주를 유도하고, 동결건조된 것은 (배지 단독보다 더 클지라도) 훨씬 더 적은 이주를 유도했다. 예기치 않게, 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직은 EGF와 비교하여 거의 2배 더 큰 이주를 유도했고, 배지 단독보다 거의 20배 더 큰 이주를 유도했다. 따라서, 미세혈관 조직의 건조 및 멸균은 시험관내 세포를 동원하는 이의 능력을 상당히 증강시킨다. 그 증강된 능력은, 다수의 양태에서, 적어도 부분적으로 생체내에서 증강된 조직 회복 및/또는 재생을 제공한다.
생체내에서 그 증강된 회복은 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직이 허혈성이도록 한 조직에의 혈류의 보다 견고하고 신속한 회복을 유도한다는 것을 입증함으로써 확증되었다. SCID 마우스는 허혈(심한 조직 손상을 유도하는 상태)를 복제하기 위해 확립된 방법에 따라 대퇴동맥의 단측성 결찰 및 절개를 수행했다. 다양한 방식으로 처리된 미세혈관 조직을 0일, 3일 및 7일차에 허혈 사지에 도입했고, 마우스를 0일, 7일 및 14일째에 레이저 도플러로 이미지화했다. 도 11에 도시된 바와 같이, 식염수를 주입한 대조군 동물은 7일 또는 14일 후에 적은 혈류 회복을 나타낸다(허혈성 사지는 화살표로 지정된다). 대조적으로, 동결건조된 미세혈관 조직은 14일까지 적어도 혈류의 부분적 회복을 유도했다. 그러나, 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직은 7일까지 혈류의 상당한 증가를 유도했고, 14일에 혈류는 반대 대조군 사지로부터 크게 구별할 수 없다. 이러한 데이터는 시험관내 이주 데이터를 확증하고, 다수의 양태에서, 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직이 혈류의 회복을 증강시킬 수 있다는 것을 지시한다.
다수의 양태에서, 혈류의 회복은, 적어도 부분적으로, 소혈관(예: 미세혈관계), 중혈관 및 대직경 혈관(예: 조직에 대한 혈액의 주요 공급자인 것들)을 포함하여, 새로운 혈관의 형성에 기인한다. 마트리겔(0.5mL)을 식염수 또는 미세혈관 조직(인간)과 혼합하여 미세혈관 조직 임플란트를 생성하였고, 이를 SCID 마우스에 피하 주사했다. 14일 후, 임플란트를 제거하고, 고정시키고, α-CD31 형광 항체로 염색했다. 임플란트를 침윤시킨 혈관은 규격화하고, 현미경으로 계수했다. 표준편차는 평균 계수/필드의 12 내지 30%였다. 2개 용량의 조직을 각 처리 단계 후에 시험했다. 어떤 인간 CD31+ 세포도 발견되지 않았다.
도 12는 다양한 세포수를 갖고 상이한 방식으로 처리된 미세혈관 조직 임플란트의 이식 후 다양한 혈관 크기의 침윤에 관련되는 데이터를 요약한다. 마트리겔은 필드당 약 35개 혈관을 유도했고, 대부분 소혈관이었다. 약 50,000 세포를 갖는 동결건조된 미세혈관 조직의 이식은 중간 크기 혈관의 더욱 견고한 생성과 함께 증가된 침윤을 수득했다. 약 500,000 세포를 갖는 동결건조된 미세혈관 조직의 이식은 대직경 혈관의 수의 상당한 증가로 추가의 혈관 생성을 유도했다. 약 50,000 세포를 갖는 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직의 이식은 대혈관의 일부 생성으로, 대조군과 비교하여 증가된 혈관 수를 유도했다. 약 500,000 세포를 갖는 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직의 이식은 대조군에 비해 2배 이상 큰 상당한 혈관 생성을 유도했다. 흥미롭게도, 50,000 세포 용량과 비교하여, 보다 큰 세포수는, 거의 제로 생존율에도 불구하고, 대직경 혈관의 수를 수득했다. 따라서, 처리된 미세혈관 조직의 투여는, 동결건조되거나 동결건조/멸균되든지, 대직경 혈관의 형성을 증가시키는 것으로 나타난다. 이러한 데이터는 조직 회복의 중요한 국면인 혈관의 이주 및/또는 형성을 증강시키는 미세혈관 조직의 능력을 추가로 지지하고 있다. 또한, 다수의 양태에서, 다양한 크기의 혈관의 생성은, 순환계의 주요 분지로부터 혈액을 표적 조직(대직경)으로 운반하는 적당한 용량이 존재할 뿐만 아니라 혈액이 심지에 내측 부분(중간 및 소혈관)에서도 표적 조적 전반에 걸쳐 효과적으로 분포될 수 있다는 것을 보장한다.
정리하면, 이러한 데이터는, 미세혈관 조직이 시험관내 및 생체내 모두에서 혈관신생을 유도하는 능력을 갖는다는 것을 나타낸다. 이와 같이, 미세혈관 조직은 적당한 혈액 공급 및 영양/산소 유량을 보장함으로써 조직의 회복 및/또는 재생을 촉진시키고/시키거나 유지시키는 혈관신생을 증강시키는 이의 능력에 기초하여, 조직 회복 및/또는 재생을 실행하는 매우 매력적인 메카니즘이다.
추가로, 미세혈관 조직은 골 및 연골의 회복을 증강시키는 이의 능력에 대해 평가했다. 골에 관련하여, 8 mm x 2 cm 임계 크기 결함을 성숙한 염소의 원위 골간으로 천공시켰다. 조직 스캐폴드(생물섬유, 토르니어)을 긴밀하게 롤링시키고, 단독 결함 또는 미세혈관 조직(1ml의 용적, 약 106 세포)을 포함하는 결함에 삽입했다. 세포를 1ml 물을 바이알에 첨가하고, 간단히 빙빙 돌린 다음, 스캐폴드 상에 내용물을 적하하고, 결합을 위해 5분 동안 대기함으로써 간단히 적재했다. 12주에, 결함을 압축 시험하고, 조직학을 위해 탈회시켰다.
도 13a 내지 13c는 골 결함의 회복에 관련된 데이터를 도시한다. 도 13a는 반대측 대조군에 비해 회복된 골의 강도, 탄성율 및 인성을 나타낸다. 스캐폴드 단독 사용은 대조군 골의 약 20%의 강도 및 탄성율, 및 대조군 골의 약 50%의 인성을 갖는 손상된 골을 유도했다. 스캐폴드에 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직이 보충된 경우에, 강도, 탄성율 및 인성 각각은 스캐폴드 단독에 비해 증가되었다. 따라서, 이러한 데이터는, 미세혈관 조직의 사용이 골에 대한 손상의 회복을 촉진시킨다는 것을 나타낸다. 도 13b 및 13c는 스캐폴드만으로 처리된 골 및 미세혈관 조직이 보충된 스캐폴드로 처리된 골로부터의 대표적인 조직학을 도시한다. 도 13b(스캐폴드 단독)는 골과 결함 내부에 배치된 섬유 스캐폴드 사이의 접합부에서 일부 초기 골극 형성을 나타낸다. 이는, 섬유 스캐폴드가 도 13a의 데이터에 의해 증명된 바와 같이, 적어도 일부 골 회복을 실시한다는 것을 시사한다. 도 13c에서, 조직학은, 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직의 첨가가 스캐폴드의 임계에서 진정한 골 형성을 유도하였음을 시사한다. 따라서, 동일 시간 내에, 미세혈관 조직은 골에 대한 탈염된 전구체보다 골의 형성을 촉진시켰다. 이는, 스캐폴드와 함께 미세혈관 조직의 사용이 치유 과정을 가속화시킬 수 있다는 것을 시사한다.
연골 회복과 관련하여, 4mm x 7mm 임계 크기 결함을 성숙한 염소의 내측 활차 그루브 상의 연골로 천공시켰다. 결함은 약 1mm 깊이였고, 이는 연골보다 약간 더 깊다. 단독 또는 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직(약 106 세포)로 보충된 조직 스캐폴드(생물섬유, 토르니어)은 결함에 고정시키고, 각 코너에서 7-0 나일론 봉합으로 적소에 유지시켰다. 3개월 후, 결함을 조직학적으로 시험했다. 이 데이터는 도 14a 내지 14h에 제시된다. 도 14a 내지 14d는 스캐폴드 단독으로부터의 데이터를 나타내는 반면, 도 14e 내지 14h는 미세혈관 조직 보충된 스캐폴드로부터의 데이터를 나타낸다. 도 14a는 이미 손상된 연골 상의 스캐폴드의 거시적 도면을 나타내는 반면, 도 14e는 미세혈관 조직이 보충된 스캐폴드의 동일한 도면을 도시한다. 두 처리 그룹은 회복의 증거를 나타냈다. 도 14b 및 14f는 연골의 헤마토실린 및 에오신 염색을 나타낸다. 미세혈관 조직을 포함하는 스캐폴드의 사용은 스캐폴드 단독 사용과 비교하여 주변에 개선된 충전을 나타냈다. 도 14c 및 14g는 사프라닌 O 염색을 도시하고, 미세혈관 조직으로 처리된 결함에서 보다 큰 정도의 프로테오글리칸 및 유지를 나타낸다. 도 14d 및 14h는 결함의 톨루이딘 블루 염색을 도시하고, 미세 혈관 조직이 결함을 처리하기 위해 사용될 경우, 새롭게 생성된 연골 매트릭스가 성숙한 연골과 보다 유사하게 염색한다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터들은 함께, 상기 골 실험에 의해서와 같이, 미세혈관 조직이 연골의 회복을 촉진시킨다는 것을 확인했다.
건을 회복하는 미세혈관 조직의 능력을 평가하기 위해 실험을 또한 수행했다. 랫트 아킬레스 건을 노출시키고, 마우스 치아 겸자로 연마했다. 대조군을 동일한 방식으로 조작했다. 한 그룹의 랫트는 스캐폴드만으로, 다른 그룹은 동결건조된/멸균된 미세혈관 조직이 보충된 스캐폴드로 처리했다. 랫트를 7일 후 qPCR, 조직학 및 면역조직화학을 위해 희생시켰다. 스캐폴드 그룹은 아킬레스의 전면에 4mm X 7mm 생물섬유-CM 스캐폴드를 수용했다. 스캐폴드는 미세혈관 조직 및 처리 그룹에 106 미세혈관 세포를 적재했다. 대조군 데이터는 도 15a(마손 3색 염색) 및 15b(테나스신을 위한 면역조직화학)에 제시된다. 스캐폴드 그룹의 데이터는 도 15c 및 15d에 제시된다. 마손 3색 염색(도 15c)은 초기 건 회복의 지표인 스캐폴드 내 및 주변에 밀집된 콜라겐의 작은 포켓을 나타냈다. 유사하게, 테나스신을 위한 면역조직화학 염색(도 15d)은 다시 결함의 초기 손상의 암시인 건과 이식된 스캐폴드 사이의 주변에서 발현의 증가를 나타냈다.
미세혈관 조직 그룹에 대한 데이터는 도 15e 및 15f에 제시된다. 마손 3색 염색(도 15e)은 결함의 상당한 회복의 지표인 스캐폴드 내 및 주변에 밀집된 콜라겐이 상당한 형성을 나타냈다. 유사하게, 테나스신에 대한 면역조직화학 염색은 건과 이식된 스캐폴드 사이에 대규모 발현을 나타냈다. 이러한 데이터는 또한 결함의 상당한 회복의 지표이다.
정리하면, 이러한 실험에서 제시된 데이터는, 미세혈관 조직이 (표적 조직으로 혈액 공급을 확립하고 유지시키는데 중요한 역할을 하는) 혈관신생 뿐만 아니라 골, 연골 및 건의 회복을 증강시킬 수 있다는 것을 확립한다. 다수의 양태에서, 증강된 혈관신생은, 적어도 부분적으로, 새로운 조직의 생성 및 유지를 유도하는 미세혈관 조직의 능력에서 역할을 한다.
본원에서 참조된 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 공보 모두는 본 명세서와 모순되지 않을 정도로 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
상기 개시된 실시형태의 특정 특징 및 국면의 각종 조합 또는 부분조합이 제조될 수 있고, 여전히 본 발명의 하나 이상에 속한다고 예상된다. 추가로, 실시형태와 관련하여 임의의 특별한 특징, 국면, 방법, 특성, 특징, 품질, 속성, 요소 등의 본원의 개시가 본원에 제시된 모든 기타 실시형태에 사용될 수 있다. 따라서, 개시된 실시형태의 다양한 특징 및 국면이 개시된 발명의 가변 양식을 형성하기 위해 서로 배합되거나 치환될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본원에 개시된 본 발명의 범위는 상기한 특별한 개시 실시형태에 의해 제한되지 않아야 하는 것으로 의도된다. 또한, 본 발명은 각종 변형 및 대안의 형태에 영향을 받기 쉽고, 이의 구체적인 예는 도면에 도시되고, 본원에서 상세히 기술된다. 그러나, 본 발명은 개시된 특정 형태 또는 방법에 제한되지 않고, 반대로, 본 발명은 개시된 각종 실시형태 및 첨부된 특허청구범위의 취지 및 범위 내에 속하는 모든 변형, 등가물 및 대안을 포함한다고 이해되어야 한다. 본원에 개시된 임의의 방법은 인용된 순서로 실행될 필요는 없다. 본원에 개시된 방법은 개업의가 취하는 특정 작용을 포함하지만, 그들은 또한 그러한 작용의 임의의 제3자 지침을 명시적 또는 암시적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, "미세혈관 조직을 투여하는"과 같은 작용은 "미세혈관 조직의 투여을 지시하는"을 포함한다. 본원에 개시된 범위는 또한 임의의 및 모든 중첩, 부분 범위 및 이의 조합을 포함한다. "이하", "적어도", "초과", "미만", "사이" 등과 같은 표현은 인용된 수를 포함한다. "약" 또는 "대략"과 같은 용어가 선행된 숫자는 인용된 숫자를 포함한다. 예를 들면, "약 3 mm"는 "3 mm"를 포함한다.

Claims (92)

  1. 해리된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물로서,
    상기 해리된 미세혈관 조직은, 다능성 세포 또는 미세혈관 조직으로부터 수득되거나 이로부터 유래되는 단리된 다능성 세포 또는 세포 막을 포함하고,
    상기 조성물은 혈관신생 또는 항-염증 활성을 가지며,
    상기 조성물은 방사선조사에 의해 멸균되고 상기 조성물 중의 바이러스는 불활성화되며,
    상기 방사선조사에 의한 멸균은 0.5 내지 5.0 Mrad 범위 용량의 방사선에 조성물을 노출시킴으로써 수행되는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 세포 또는 조직이 배양되지 않거나;
    (b) 상기 조성물에 존재하는 세포의 50% 이하가 생존가능하거나; 또는
    (c) 상기 조성물이, 실온에서 적어도 1개월 동안 저장하는 경우, 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 보유하는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 건조, 동결건조 또는 동결보존되는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 임의의 생존가능한 세포를 포함하지 않는 것인, 조성물.
  5. 제1항의 조성물을 포함하는 수분 불투과성 용기로서,
    상기 조성물은 실온에서 적어도 1개월 동안 저장하는 경우, 측정 가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 보유하고,
    상기 조성물은 건조되는 것인, 수분 불투과성 용기.
  6. 제5항에 있어서,
    (a) 상기 세포 또는 조직이 배양되지 않거나; 또는
    (b) 상기 조성물에 존재하는 세포의 50% 이하가 생존가능한 것인, 수분 불투과성 용기.
  7. 단리된 다능성 세포를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,
    상기 조성물은 혈관신생 또는 항-염증 활성을 갖고,
    상기 방법은
    (a) 공여체 포유동물로부터 단리된 조직 샘플을 해리시켜 그 안의 복수의 다능성 세포를 방출시키는 단계;
    (b) 복수의 방출된 다능성 세포를 하나 이상의 다른 조직 성분으로부터 분리하여 단리된 다능성 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 단계;
    (c) 단계 (b) 또는 (d)에 따라 생성된 조성물을 건조, 동결건조 또는 동결보존시키는 단계;
    (d) 단계 (b) 또는 (c)로부터 수득되는 조성물을 방사선조사에 의해 멸균시키거나, 단계 (b) 또는 (c)로부터 수득되는 조성물에 존재하는 바이러스를 방사선조사에 의해 불활성화시키거나, 또는 둘 다인 단계를 포함하고,
    상기 방사선조사에 의한 멸균 또는 방사선조사에 의해 불활성화가 조성물을 0.5 내지 5.0 Mrad 범위 용량의 방사선에 노출시킴으로써 수행되며,
    단계 (d)로부터 수득되는 조성물은 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 보유하는, 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    (i) 상기 세포 또는 조직이 배양되지 않거나;
    (ii) 단계 (c) 전에 방출된 세포 또는 조성물을 여과하는 단계를 추가로 포함하거나; 또는
    (iii) 단계 (a)의 해리가 조직 샘플을 하나 이상의 프로테아제와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 하나 이상의 프로테아제가 콜라게나제를 포함하지 않는 것인, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 조직이 지방 유래 조직, 골수, 골, 근육 조직, 제대 조직 또는 태반 조직이고, 초음파 진탕, 여과, 원심분리 또는 밀도 구배의 사용이 방출된 다능성 세포를 지방세포 또는 하나 이상의 다른 세포 또는 조직 성분으로부터 분리하는 것인, 방법.
  10. 해리된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서,
    상기 조성물은 혈관신생 또는 항-염증 활성을 갖고, 상기 방법은
    (a) 공여체 포유동물로부터 단리된 미세혈관 조직 샘플을 해리시켜 해리된 미세혈관 조직을 포함하는 조성물을 생성하는 단계; 및
    (b) 하나 이상의 조직 성분을 단계 (a)에 따라 생성된 조성물로부터 제거하는 단계;
    (c) 단계 (b) 또는 (d)에 따라 생성된 조성물을 건조, 동결건조 또는 동결보존하는 단계; 및
    (d) 단계 (b) 또는 (c)에 이어 조성물을 방사선조사에 의해 멸균시키거나, 단계 (b) 또는 (c)에 이어 조성물에 존재하는 바이러스를 방사선조사에 의해 불활성화시키거나, 또는 둘 다인 단계를 포함하고;
    상기 방사선조사에 의한 멸균 또는 방사선조사에 의해 불활성화가 조성물을 0.5 내지 5.0 Mrad 범위 용량의 방사선에 노출시킴으로써 수행되며,
    단계 (c) 또는 (d)로부터 수득되는 조성물은 측정가능한 혈관신생 또는 항-염증 활성을 보유하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    (i) 상기 조직이 배양되지 않거나;
    (ii) 상기 방법이 조성물을 여과하는 단계를 추가로 포함하거나;
    (iii) 단계 (a)의 해리가 조직 샘플을 하나 이상의 프로테아제와 접촉시키는 것을 포함하거나; 또는
    (iv) 단계 (a)의 해리 또는 단계 (b)의 제거가 초음파 진탕, 원심분리, 여과 또는 밀도 구배의 사용을 포함하는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    - 상기 하나 이상의 프로테아제가 콜라게나제를 포함하지 않거나;
    - 상기 하나 이상의 프로테아제가 하기를 포함하거나 하기로 이루어지거나; 또는
    i) 콜라게나제 유형 1 및 디스파제;
    ii) 콜라게나제 유형 1 및 서모리신;
    iii) MMP2, MMP14 및 디스파제; 또는
    iv) MMP2, MMP14 및 서모리신;
    - 상기 미세혈관 조직이 지방 유래 조직이고, 상기 초음파 진탕, 원심분리, 여과 또는 밀도 구배의 사용이 지방세포를 단계 (a)에 따라 생성된 조성물로부터 제거하는 것인, 방법.
  13. 포유동물에서 손상 또는 질환을 치료 또는 예방하거나 조직 재생을 촉진시키기 위한 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 조성물 또는 제7항 내지 제12항 중의 어느 한 항의 방법으로 제조한 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    (a) 상기 조성물이 포유동물로의 외과적 이식에 사용되거나;
    (b) 상기 조성물이 포유동물에게 정맥내로 투여되거나;
    (c) 상기 조성물이 국소 투여되거나;
    (d) 상기 조성물이 건, 인대, 피부, 골, 연골, 추간판 또는 미세혈관 조직에 존재하는 손상의 치료에 사용되거나; 또는
    (e) 상기 조성물이 관절염의 치료에 사용되는 것인, 조성물.
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