JP2003509374A - 骨髄細胞を用いる筋ジストロフィーの治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 筋疾患に影響を与えるジストロフィンまたは他の遺伝子産物を発現するように操作された同種細胞または自己細胞のいずれかの骨髄移植を介して筋疾患を治療する方法が開示される。骨髄細胞および骨髄ＳＰ細胞（造血幹細胞の高純度集団）の両方が、本方法で使用されうる。筋疾患としては、デュシェーヌ筋ジストロフィー、ベッカー筋ジストロフィーおよび肢帯筋ジストロフィー等の筋ジストロフィーが挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 政府による支援 本発明は、全部または一部が、米国立保険研究所からの許諾番号ＨＬ５４７８
５による支援を受けたものである。米国政府は本発明にいくらかの権利を有する
。

【０００２】 関連出願 本出願は１９９９年９月１４日に出願された米国仮出願第６０／１５３，８２
１号の利益を主張するものであり、その教示は参照により本明細書に完全に組み
入れられる。

【０００３】 発明の背景 約３０００の筋蛋白が存在し、それぞれ異なる遺伝子によりコードされている
。いくつかの筋蛋白は筋線維の構造部分であり、他の筋蛋白は筋線維中の化学反
応に影響を及ぼす。筋蛋白遺伝子の欠損は筋疾患につながる。筋蛋白遺伝子の明
確な欠損は筋疾患の性質および重篤性を意味する。

【０００４】 筋ジストロフィーは筋蛋白遺伝子の欠損により生じ、典型的には、主に筋統合
の崩壊につながる横紋筋の進行性疾患であり死に至ることが多い。この組織写真
からは、線維の大きさの変化、筋細胞の壊死および再生、ならびに多くの場合、
結合組織および脂肪組織の増殖が見られる。筋蛋白遺伝子の明確な欠損は、筋ジ
ストロフィーの性質および重篤性を決定する。例えば、主要な２つのタイプの筋
ジストロフィー、すなわちデュシェーヌ( Ｄｕｃｈｅｎｎｅ) 筋ジストロフィー
（ＤＭＤ）およびベッカー( Ｂｅｃｋｅｒ) 筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は対立
遺伝子の致命的な変性筋疾患である。ＤＭＤはＸ−染色体上のジストロフィン遺
伝子の変異から生じ（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１８
：１３６３−１３６８( １９８８) ）、通常結果としてジストロフィン、骨格筋
の細胞骨格蛋白および心筋の欠損を生じる。ＢＭＤは同じ遺伝子の変異の結果生
じるが（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１８：１３６３−
１３６８( １９８８) ）、通常ジストロフィンは筋に発現するもののそのレベル
は小さくおよび／または短く、内部が削られた形をしており、結果的に穏やかな
表現型になっている。

【０００５】 細胞移植（Ｋａｒｐａｔｉ，Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１３５：２
７−３２（１９８９）；Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１１１：２４３７−２４４９( １９９０) ；およびＰａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｔ．Ａ
．ら、３３７：１７６−１７９（１９８９））またはインビボ遺伝子導入（Ａｃ
ｓａｄｉ，Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：８１５−８１８（１９９１）；Ｒａ
ｇｏｔ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３６１：６４７−６５０（１９９３）；Ｖｉｎ
ｃｅｎｔ，Ｎ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、５：１３０−１３４（１９９３））
；およびＫｏｃｈａｎｅｃｋ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ
．ＵＳＡ、９３：５７３１−５７３６（１９９６））のいずれかによってＸ連鎖
（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ）筋ジストロフィー（ｍｄｘ）マウスにおけるジストロフィ
ン発現を回復しようとするこれまでの試みはほとんど成功したが、驚くようなも
のではなく、細胞またはベクターの注射部位近傍のジストロフィン発現の回復の
み生じた（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｔ．Ａ．、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、１４：
１９７−２１２（１９９１））。

【０００６】 細胞またはベクターの注射部位を超えて、特定の筋疾患において影響を受けた
ジストロフィン発現ならびに他の遺伝子産物の発現を回復する能力は、筋疾患の
治療のために重要な治療的適用を有するであろう。このため、哺乳動物の筋疾患
において影響を与える遺伝子産物の発現を回復するための代替的なアプローチを
開発する必要性はきわめて高い。

【０００７】 発明の概要 本発明は、骨髄移植を介してそれを必要とする哺乳動物（例えば、ヒトまたは
他の哺乳動物、あるいは脊椎動物）の筋疾患を治療するための方法を提供するも
のである。一実施形態では、本発明の方法は哺乳動物に有効量の骨髄細胞を投与
することを含む。第２の実施形態では、本発明の方法は哺乳動物に有効量の骨髄
ＳＰ細胞（高純度な造血幹細胞の集団）を投与することを含む。第３の実施形態
では、本発明の方法は（ａ）所望の核酸産物をコードする目的の核酸配列を哺乳
動物由来の骨髄細胞に導入すること；および（ｂ）哺乳動物に（ａ）で生産した
細胞を投与することを含む。第４の実施形態では、本発明の方法は（ａ）所望の
核酸産物をコードする目的の核酸配列を哺乳動物由来の得られた骨髄ＳＰ細胞に
導入すること；および（ｂ）哺乳動物に（ａ）で生産した細胞を投与することを
含む。第５の実施形態では、本発明の方法は（ａ）ドナーの骨髄細胞に所望の核
酸産物をコードする目的の核酸配列を導入すること；および（ｂ）哺乳動物に（
ａ）で生産された細胞を投与することを含む。第６の実施形態では、本発明の方
法は（ａ）ドナーの骨髄ＳＰ細胞に所望の核酸産物をコードする目的の核酸配列
を導入すること；および（ｂ）哺乳動物に（ａ）で産生された細胞を投与するこ
とを含む。

【０００８】 また、本発明は、哺乳動物の筋疾患治療での使用のための薬剤の製造のための
骨髄細胞および骨髄ＳＰ細胞の使用を提供する。特定の実施形態では、所望の核
酸産物をコードする目的の核酸配列は、骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞に導入され
る。

【０００９】 さらに本発明は、本明細書に記載した方法および使用に用いられる骨髄細胞お
よび骨髄ＳＰ細胞に関する。

【００１０】 本明細書で用いられているように、所望の核酸産物とは哺乳動物の筋疾患治療
における、哺乳動物で発現される所望の蛋白質またはポリペプチド、ＤＮＡまた
はＲＮＡ（例えば、遺伝子産物）を意味する。これ以外の場合、所望の核酸産物
とは哺乳動物において欠陥があるか、または存在しないものである。特定の実施
形態では、所望の核酸産物とはジストロフィンである。他の所望の核酸産物には
カルパイン−３、サルコグリカン複合体膜（例えば、α―サルコグリカン、β―
サルコグリカン、γ―サルコグリカンおよびδ−サルコグリカン）およびラミニ
ンα２鎖を含む。

【００１１】 一般に、所望の核酸産物をコードする核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（レト
ロウイルス）などのウイルスベクターを用いて、骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞に
導入される。レトロウイルスは組み換えベクターとして機能するのに特に適した
特性を有していることが分かっており、このベクターを介して所望の核酸産物を
コードする核酸配列を哺乳動物（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物、あるいは脊
椎動物）の細胞に導入することができる。例えば、所望の核酸産物の送達に用い
る組換えレトロウイルスは、所望の組換え型ＲＮＡをカプシド包含（encapsidat
ion ）するのに必要なウイルス蛋白を生産する線維芽細胞に、所望の核酸産物を
コードするのに適したプロウイルスＤＮＡベクターを導入することによって生成
される。この方法は、哺乳動物の筋疾患を治療するために、骨髄細胞または骨髄
ＳＰ細胞に所望の核酸産物をコードする核酸配列を導入（送達）するのに用いる
ことができる方法の１つである。例えば、Ｍａｎｎ，Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ，３３：
１５３−１５９( １９８３) ；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．とＨ．Ｍ．Ｔｅｍｉｎ、
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３：２２４１−２２４９( １９８３) ；Ｃｏｎ
ｅ，Ｒ．ＤとＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８１：６３４９−６３５３( １９８４) ；Ｓｏｎｅｏｋａ．Ｙ．ら
、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２３：６２８−６３３（１９９
５）；およびＤａｎｏｓ，Ｏ．とＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ、米国特許第５，４
４９，６１４号を参照すること。

【００１２】 本発明の方法を用いて治療されうる筋疾患は、筋ジストロフィーを含む。本発
明の方法を用いて治療される筋ジストロフィーには、デュシェーヌ筋ジストロフ
ィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、筋緊張性ジストロフィ
ー（シュタイネルト病としても知られている）、肢帯筋ジストロフィー、顔面肩
甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭筋ジスト
ロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位筋ディストロフィーおよびエメリー−ドレフェス
（Ｅｍｅｒｙ−Ｄｒｅｉｆｕｓｓ）筋ジストロフィーを含む。

【００１３】 発明の詳細な説明 本明細書に記載した結果は、正常な（細分化されていない）骨髄細胞または骨
髄ＳＰ細胞と呼ばれるＸ連鎖筋ジストロフィー（ｍｄｘ）レシピエントに移植し
た後に、ジストロフィン陰性筋線維はジストロフィン陽性筋線維に変換されうる
。両例では、ジストロフィン発現は約１〜１０％の筋線維で回復した（表１およ
び２）。ある動物では、ジストロフィン発現はすべての筋線維の１０％近くにな
ることが明らかとなっており（表１）、回復のレベルは臨床的に有用な可能性が
あると思われた（Ｐｈｅｌｐｓ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、
４：１２５１−１２５８（１９９５））。また、両例においてドナー由来の核は
、筋線維内の中心および周辺の両方に位置していることが認められ、再生中およ
び成熟した筋線維の両方でジストロフィンの回復を示した（表３）。全体的に、
これらの結果は、ジストロフィンまたは他の関連する筋疾患において影響を受け
た遺伝子産物を発現するように設計された同種細胞または自己細胞のいずれかを
骨髄移植を用いて送達することによって、筋ジストロフィーおよび他の破壊的な
筋疾患の治療のため新しい方法が提供されうることを示唆している。

【００１４】 結果として、本発明は骨髄移植を用いてそれを必要とする哺乳動物（例えば、
ヒトまたは他の哺乳動物、あるいは脊椎動物）の筋疾患を治療する方法を提供す
る。また、ここで哺乳動物とはレシピエントを意味する。一実施形態では、本発
明の方法は哺乳動物に有効量のドナー骨髄細胞を投与することを含む。第２の実
施形態では、本発明の方法は哺乳動物に有効量のドナー骨髄ＳＰ細胞（高純度な
造血幹細胞の集団）を投与することを含む。第３の実施形態では、本発明の方法
は（ａ）所望の核酸産物をコードする目的の核酸配列を哺乳動物から骨髄細胞に
導入すること；および（ｂ）哺乳動物に（ａ）で生産した細胞を戻すことを含む
。第４の実施形態では、本発明の方法は（ａ）所望の核酸産物をコードする目的
の核酸配列を哺乳動物から得られた骨髄ＳＰ細胞に導入すること；および（ｂ）
哺乳動物に（ａ）で生産された細胞を戻すことを含む。第５の実施形態では、本
発明の方法は（ａ）ドナー骨髄細胞に所望の核酸産物をコードする目的の核酸配
列を導入すること；および（ｂ）哺乳動物に（ａ）で生産された細胞を投与する
ことを含む。第６の実施形態では、本発明の方法は（ａ）ドナーの骨髄ＳＰ細胞
に所望の核酸産物をコードする目的の核酸配列を導入すること；および（ｂ）哺
乳動物に（ａ）で生産された細胞を投与することを含む。

【００１５】 本明細書で用いられる時、筋疾患は、限定されないが、筋ジストロフィーなど
の劣性または遺伝性筋障害を含み、これに限定されない。筋ジストロフィーは遺
伝疾患であり、運動を制御する骨格筋または随意筋の進行性の衰弱および変性に
より特徴付けられる。また、心臓および他の不随意筋の筋は、いくつかの筋ジス
トロフィーの形態で影響を受ける。筋ジストロフィーは、当該分野において記載
されており、デュシェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフ
ィー（ＢＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー( シュタイネルト病としても知られて
いる）、肢帯筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、先
天性筋ジストロフィー、眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位筋ディスト
ロフィーおよびエメリー−ドレフェス筋ジストロフィーを含む。例えば、Ｈｏｆ
ｆｍａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１８：１３６３−１３６８（１９
８８）；Ｂｏｅｎｎｅｍａｎｎ，Ｃ．Ｇ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄ．、
８：５６９−５８２（１９９６）；Ｗｏｒｔｏｎ，Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７
０：７５５−７５６（１９９５）；Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ｍ．ら、Ｎｅｕｒｏｍ
ｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．、９（２）：１０８−１１４（１９９９）；Ｌｉｍ
，Ｌ．Ｅ．とＣａｍｐｂｅｌｌ，Ｋ．Ｐ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ
．、１１（５）：４４３−４５２( １９９８) ；Ｖｏｉｔ，Ｔ、Ｂｒａｉｎ Ｄ
ｅｖ．、２０（２）：６５−７４（１９９８）；Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｈ．、Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．、４８：４５７−４６６（１９９７）；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ
．とＵｐａｄｈｙａｙａ，Ｍ．、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．、７ （１）：５５−６２（１９９７）を参照すること。これらの参照例は本明細書
に参照によりすべて組み込まれる。

【００１６】 骨髄細胞は当該分野では一般的に知られている方法に従って任意の哺乳動物か
ら得ることができる。例えば、骨髄は髄腔に針を挿入し、骨髄を吸引することに
よってドナーから得ることができる。骨髄細胞を分離するために、骨髄はスクリ
ーンに通される。

【００１７】 骨髄ＳＰ細胞および任意の哺乳動物から骨髄ＳＰ細胞を得る方法は、Ｇｏｏｄ
ｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：１７９７−１８０６（１
９９６）；およびＧｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、国際公報第ＷＯ９６３９４８９
号（１９９６年１２月１２日発行）に記載されており、これらの参照例は本明細
書に参照によりすべて組み込まれている。また、本明細書では骨髄ＳＰ細胞とは
骨髄幹細胞の高純度な造血幹細胞の集団を意味する。

【００１８】 本発明の方法で用いられる骨髄細胞および骨髄ＳＰ細胞は、生きたもの（例え
ば、有核）である必要がある。使用される細胞はそれが戻される哺乳動物から、
または同種または異種（ドナー）の別の／異なる哺乳動物から採取され得、レシ
ピエントに導入される。例えば、この細胞はブタから採取し、ヒトに導入するこ
とができる。

【００１９】 本明細書で用いられているように「哺乳動物」および「哺乳類の」という用語
は、子に授乳しかつ生きた子を産む（真獣類または有胎類）か、または卵生（後
獣類（ｍｅｔａｔｈａｒｉａｎ）または無胎類）のいずれかである単孔類、有袋
類および有胎動物などの脊椎動物を意味する。哺乳類種の例には、ヒトおよび他
の霊長類（例えば、サル、チンパンジー）、齧歯類（例えば、ラット、マウス、
モルモット）、および反芻動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ）が含まれる。

【００２０】 本明細書で用いられているように「ドナー」という用語は、骨髄細胞または骨
髄ＳＰ細胞の天然の採取源である哺乳動物を意味する。ドナーは健常な哺乳動物
（すなわち、筋疾患に罹患していない哺乳動物）でありうる。代替的には、この
ドナーは筋疾患のある哺乳動物である。レシピエントは筋疾患に罹患している哺
乳動物である。特定の実施形態では、このレシピエントは筋ジストロフィーに罹
患した哺乳動物である。特定の目的のある一実施形態では、このレシピエントは
ヒト患者である。

【００２１】 特定の実施形態では、ドナーおよびレシピエントは免疫適合性（immunocompat
ibility ）について適合される。好適には、ドナーおよびレシピエントは、主要
組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（ヒト白血球抗原）（ＨＬＡ））−クラスＩ（
例えば、座Ａ，Ｂ，Ｃ）および−クラスＩＩ（例えば、座ＤＲ，ＤＱ，ＤＲＷ）
抗原について適合性が一致する。ドナーとレシピエントの間の免疫適合性は、当
該分野に一般に知られている方法に従って決定される（例えば、Ｃｈａｒｒｏｎ
，Ｄ．Ｓ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、３：４１６−４２２ （
１９９６）；Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｊ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、
５：４１７−４１８（１９９８）；およびＢｏｉｓｊｏｌｙ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｏｐ
ｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、９３：１２９０−１２９７（１９８６）を参照すること
）。

【００２２】 本明細書で核酸配列は核酸分子のヘテロポリマーとして定義されている。この
核酸分子は、二本鎖または一本鎖であってよく、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡな
どのデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）分子あるいはリボヌクレオチド（ＲＮ
Ａ）分子であってよい。このように、核酸配列は、例えば、該当する場合にはイ
ントロンをもつかもたない１つまたは複数のエキソンならびに１つまたは複数の
適切な制御配列を含む。一例では、この核酸分子は所望の核酸産物をコードする
単一のオープンリーディングフレームを含む。この核酸配列は操作して適切なプ
ロモータに結び付けられる。

【００２３】 所望の核酸産物をコードする核酸配列は、例えば、Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニ
ューヨークのＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社（１９８８）；およびＳａｍｂ
ｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨークＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されているように、天
然から分離されるか、天然の配列から改変されるか、デノボで製造される。核酸
は適合性クローニングや限定部位を開発、製造するといった当分野において公知
の方法により分離、融合されうる。

【００２４】 典型的には、この核酸配列は所望の核酸産物をコードする遺伝子である。この
場合、所望の核酸産物は遺伝子産物である。このような遺伝子は、典型的には、
骨髄細胞および骨髄ＳＰ細胞を所望の核酸産物を発現させることができる適切な
制御配列に作動可能に連結させる。本明細書で用いられているように「作動可能
に連結させる」という言葉は、遺伝子（または核酸配列）の発現が可能になるよ
うな方法で、遺伝子（または核酸配列）を制御配列に連結させることを意味する
ものと定義される。一般に、「作動可能に連結させる」とは「近接」を意味する
。

【００２５】 制御配列は転写プロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、適切
なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終
結を制御する配列を含む。特定の実施形態では、所望の核酸産物をコードする組
換え遺伝子（または核酸配列）は、誘導または抑制されうるプロモーターの調節
制御の下に置かれ得、これにより骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞においてこの産物
のレベルに関して程度の高い制御が提供される。

【００２６】 本明細書で用いられているように、「プロモーター」という用語はＤＮＡの配
列、通常は構造遺伝子のコード領域の上流（５’）を意味し、転写の開始に必要
となるＲＮＡポリメラーゼおよび他の因子に認識および結合部位を提供すること
によってコード領域の発現を制御する。適切なプロモーターは当該分野でよく知
られている。模範的なプロモーターには、ＳＶ４０およびヒト成長因子（ＥＦＩ
）を含む。他の適切なプロモーターが当該分野で容易に入手可能である（例えば
、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニューヨークＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社
（１９８８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨークのＣｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；
および米国特許第５，６８１，７３５号を参照）。

【００２７】 本明細書で用いられている所望の核酸産物とは、哺乳動物の筋疾患の治療にお
ける、哺乳動物での発現対象の所望の蛋白質またはポリペプチド、ＤＮＡまたは
ＲＮＡ（例えば、遺伝子産物）をいう。さもなくば、所望の核酸産物は哺乳動物
で欠如（defective ）もしくは欠損（absent）している。特定の実施形態では、
所望の核酸産物とは特定の筋疾患において影響を受けた遺伝子産物である。例え
ば、ＤＭＤまたはＢＭＤの哺乳動物を治療する場合、所望の核酸産物はジススト
ロフィンであり得る。肢帯筋ジストロフィーの哺乳動物を治療する場合、所望な
核酸産物にはカルパイン−３およびサルコグリカン複合体メンバー（例えば、α
−サルコグリカン、β−サルコグリカン、γ−サルコグリカンおよびδ−サルコ
グリカン）を含むが、これに限定されるものではない。先天性筋ジストロフィー
の哺乳動物を治療する場合、所望の核酸産物には、ラミニンα２鎖を含むが、こ
れに限定されるものではない。

【００２８】 所望の核酸産物をコードする核酸配列は、種々の方法（例えば、リポソームを
用いたトランスフェクション、感染、形質転換、直接的取込、プロジェクタイル
ボンバードメント）によって、骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞に導入されうる。特
定の実施形態では、所望の核酸産物をコードする核酸配列は、核酸ベクター、例
えば、ＤＮＡプラスミド、ウイルスまたは他の適したレプリコン（例えば、ウイ
ルスベクター）に挿入される。特定の例として、所望の核酸産物をコードする核
酸配列はウイルスのゲノムに組み込まれ、続いてこのゲノムは精製された骨髄細
胞または骨髄ＳＰ細胞に導入される。ここで用いる「組み込まれた」という用語
は、ウイルスの天然の配列に対し両側で共有結合された領域としてのウイルスの
ゲノムへの核酸配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列）の挿入を意味する。ウ
イルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例え
ば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルトミキソウイルス（例えば、
インフルエンザウイルス）等の負鎖ＲＮＡウイルス、ラブドウイルス（例えば、
狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミキソウイルス（例えば、
ハシカおよびセンダイ）、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス等の正鎖Ｒ
ＮＡウイルス、およびアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ヘルペスシ
ンプレックスウイルス１型または２型、エプスタイン−バールウイルス、サイト
メガロウイルス）およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカ
ナリーポックス）などの二本鎖ＤＮＡウイルスを含む。他のウイルスには、例え
ば、ノルウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウィルス、パ
ポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスを含む。レトロウイルス
の例には：トリ白血病−肉腫、哺乳動物のＣ型、Ｂ型およびＤ型ウイルス、ＨＴ
ＬＶ−ＢＬＶグループ、レンチウイルス、スプマウイルスを含む（Ｃｏｆｆｉｎ
，Ｊ．Ｍ．，のＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ第３版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら、Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ
−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ １９９６年
）。他の例には、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイ
ルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血
病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、ギボンザル白血
病ウイルス、Ｍａｓｏｎ Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、
サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、およびレンチウイルスを含む。他のベ
クターの例は、例えば、Ｍｃ Ｖｅｙら、米国特許第５，８０１，０３０号に記
載されており、その教示は参照により本明細書に組み込まれる。

【００２９】 所望の核酸産物をコードする核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含む組換え型
ゲノムから構成される組換え型ウイルスベクターを生成するために、パッケージ
ング細胞株が用いられる。パッケージング細胞株を用いれば、製造された組換え
ウイルスの感染性の効率およびスペクトルは共に大きくなる。

【００３０】 所望の核酸産物をコードする核酸配列を含む組換えゲノムから構成された、組
換え型ウイルスベクターを生成するのに有用なパッケージング細胞株は、本明細
書に記載されているように、ウイルスのゲノムに組み込まれる所望の核酸産物を
コードする核酸配列を含むウイルスベクターを用いて哺乳動物の宿主細胞などの
宿主細胞をトランスフェクションすることによって生成される。細胞株を生成す
るのに適した宿主細胞には、ヒト（ＨｅＬａ細胞等）、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネ
ズミ（胚性幹細胞等）、ウサギおよびサル（ＣＯＳ１細胞等）の細胞を含む。細
胞株を生成するのに適した宿主細胞は、胚細胞、骨髄幹細胞または他の前駆細胞
であってよい。この細胞が体細胞の場合、その細胞は、例えば、上皮細胞、線維
芽細胞、平滑筋細胞、血球（造血細胞、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞等を含む）、腫
瘍細胞、心筋細胞、マクロファージ、樹状細胞、神経細胞（例えば、膠細胞また
は星状細胞）、または病原体感染細胞（例えば、細菌、ウイルス、ウィルソイド
、寄生虫、またはプリオンが感染した細胞）でありうる。このような細胞は市販
のものであるかまたは寄託所から、または、生検によるなど個人から直接入手可
能である。ウイルスストックは当該分野で一般的に知られる方法に従って採取す
ることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニューヨークのＪｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｅｄｓ．，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第
２版、ニューヨークのＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；ＤａｎｏｓとＭｕｌｌｉｇａｎの米国特許第
５，４４９，６１４号；およびＭｕｌｌｉｇａｎとＷｉｌｓｏｎの米国特許第５
，４６０，９５９号を参照すること。その教示は参照により本明細書に組み込ま
れる。

【００３１】 細胞をトランスフェクトまたは形質転換する適切な方法の例には、感染法、リ
ン酸カルシウム沈殿法、エレクロポレーション法、マイクロインジェクション法
、リポフェクション法および直接的取込法を含む。このような方法は、例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨークのＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ
ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，ニューヨークのＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社（１９９８）；お
よびＤａｎｏｓとＭｕｌｌｉｇａｎの米国特許第５，４４９，６１４号に詳細に
記載されており、その教示は参照により本明細書に組み込まれる。

【００３２】 所望の核酸産物をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を含む組換えゲ
ノムを含む組換えウイルスベクターから構成されたウイルスストックは、トラン
スフェクトされた細胞をウイルス生産に適した条件下（例えば、適切な成長媒質
において、適切な時間）で維持することによって生産される。このような条件は
本発明にとって重要ではないが、一般に当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨークのＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，ニューヨークのＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社（１９９８）；米国特許
第５，４４９，６１４号；および米国特許第５，４６０，９５９号を参照するこ
と。その教示は参照により本明細書に組み込まれる。

【００３３】 また、所望の核酸産物をコードする核酸配列を含むベクターは、ベクターを細
胞膜リン脂質に標的化することによって骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞に導入され
うる。例えば、ベクターの標的化は、すべての細胞膜リン脂質に対し親和性を有
するウイルスタンパク質をＶＳＶ−Ｇ蛋白質に該ベクターを連結することによっ
て達成される。このような構築物は当業者にはよく知られた方法を用いて製造す
ることができる。

【００３４】 前述の方法の特定の例として、所望の核酸産物をコードし、骨髄細胞または骨
髄ＳＰ細胞において所望の核酸産物の発現を行なうことができる制御配列と作動
可能に連結された組換え遺伝子（または核酸配列）を、目的の特定の細胞に侵入
するウイルスのゲノムに組み込むことができる。感染によって骨髄細胞および骨
髄ＳＰ細胞は遺伝的に改変され、所望の核酸産物をコードする安定的に組み込ま
れた組換え遺伝子（または核酸配列）を含むようにすることができる。次に、こ
のように遺伝的に改変された骨髄細胞および骨髄ＳＰ細胞（組換え骨髄細胞およ
び組換え骨髄ＳＰ細胞）は、哺乳動物（レシピエント）への投与に先立って組換
え遺伝子の発現の有無を検査されうる。例えば、発現された所望の核酸産物の量
は、標準的方法（例えば、免疫沈降法）に準じて測定される。このような方法で
、所望の核酸産物が哺乳動物への投与に先立って骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞に
おいて適切なレベル（所望の量）まで発現できるかどうかがインビトロで測定さ
れる。適切なレベルまで所望の核酸産物を発現している遺伝的に改変された骨髄
細胞（組換え骨髄細胞）および遺伝的に改変された骨髄ＳＰ細胞（組換え骨髄Ｓ
Ｐ細胞）は、哺乳動物への導入（注入）のために増殖（成長）させることができ
る。細胞を増殖（成長）させる方法は当該分野ではよく知られている。

【００３５】 本明細書に記載したように遺伝的に改変されたかまたは改変されていない骨髄
細胞および骨髄ＳＰ細胞は、当業者には知られた方法に従って哺乳動物に投与
（移植、埋め込み、導入）される。例えば、骨髄移植（ＢＭＴ）は、白血病（Ｇ
ｏｒｉｎ，Ｎ．Ｃ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ、６４：３８５−３９５
（１９８６）、Ｒｉｎｇｄｅｎ，Ｏ．ら、Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ、２４：
７１−７９（１９９６））、再生不良性貧血（Ｏ' Ｒｅｉｌｌｙ，Ｒ．Ｊ．のＢ
ｌｏｏｄ６２：９４１−９６４（１９８３）、およびＧｏｒｄｏｎ−Ｓｍｉｔｈ
，Ｅ．Ｃ．、Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．、５：２５５−２６３（１９８７）
）、サラセミアメジャー（Ｔｈｏｍａｓ，Ｅ．Ｄ．、Ｐｒｏｇ Ｃｌｉｎ． Ｂ
ｉｏｌ． Ｒｅｓ．、３０９：１８７−１９１（１９８９））；およびＬｕｃａ
ｒｅｌｌｉ，Ｇ．ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１２：６７６−６８１（１９
８４）；および免疫不全症（Ｋｅｎｎｙ，Ａ．Ｂ．とＨｉｔｚｉｇ，Ｗ．Ｈ．の
Ｅｕｒ Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ、１３１：１５５−１７７（１９７９）；およびＰ
ａｒｋｍａｎ，Ｒ．ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２９８：９２１−９２７（
１９７８））などの造血細胞に係わる多数の疾患に関して記載されている。好適
には、投与形態は注入および／またはボーラス注射などの静脈内投与か、または
注射による腹腔内投与である。他の投与形態（腸管外、経粘膜、体内埋め込み、
筋内、皮内、経皮（例えば、徐放性高分子を用いて））は、一般に当該分野では
知られている。好適には、この細胞はリン酸緩衝生理食塩水などの、哺乳動物へ
の投与の特定の形態および経路に適した媒体で投与される。

【００３６】 本明細書に記載したように遺伝的に改変されたか、または改変されていない骨
髄細胞または骨髄ＳＰ細胞の「有効量」とは、ここでは、哺乳動物に投与する場
合は、治療的有効性に十分な骨髄細胞の量（例えば、疾患に関連する症状および
／または徴候を著しく低減するか削減するのに十分な量）として定義される。投
与頻度を含めて、哺乳動物に投与される、本明細書に記載したように遺伝的に改
変されたかまたは改変されていない骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞の量は、投与の
形態および経路などの種々の因子によって変動するであろう。すなわち、レシピ
エントの大きさ、年齢、性別、健康状態、体重および食事、治療される筋疾患の
症状の性質および程度、同時に行う治療の種類、治療頻度、および所望の効果で
ある。

【００３７】 骨髄由来細胞によるジストロフィンの回復の程度に影響を及ぼす多数の因子お
よび再形成プロセスの時間的動態は知られていない。かなり多数のジストロフィ
ン陽性筋線維をはっきりと生じることのできる骨髄ＳＰ細胞の数は非常に少なく
、かつ細胞の注射と検出可能なジストロフィン陽性筋線維の発現との間にはかな
りのタイムラグがあるという事実を考えれば、通常はＢＭＴの後に起こるように
、移植された細胞は骨髄の微小環境内に入植（colonize）しかつ増殖するに違い
ないと思われる。移植に用いる細胞の最適な調整法および、ある場合にはジスト
ロフィン陽性細胞が有効に生着するのを達成するようにレシピエントを調整する
ための必要条件の性質が決定されてよい。このような決定は、例えば、注射を行
う前にレシピエントの筋にダメージを与えるかまたは損傷させることによって行
われうる。細胞が筋に有効に働くために骨髄コンパートメントの再形成が不可欠
な条件である場合、骨髄由来造血幹細胞は筋を生着させるための前駆細胞の唯一
の移植源であることが分かる。

【００３８】 本明細書に報告したすべての実験において、すべてのジストロフィン陽性筋線
維はＹ−陽性（ドナー）核に関与しうるとは限らないことは注目に値する。これ
は多数の因子によるものと考えられる。第１に、オス由来組織標本へのＹ染色体
プローブのハイブリダイゼーションの効率はリンパ球の場合の９０％以上と比較
して、７０％〜８０％であることが観察され、したがって、すべてのＹ陽性核が
本明細書に記載した方法によって検出されるとは限らないと思われる（Ｇｕｓｓ
ｏｎｉ， Ｅ．ら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：１０１２−１０
１６（１９９６））。さらに、管状筋細胞内の核の領域に関する研究は、単一の
核が１８０μｍもの筋線維に沿って発現する膜関連蛋白質を産生しうることを示
した（Ｇｕｓｓｏｎｉ， Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３：９７
０−９７７（１９９７）、Ｈａｌｌ，Ｚ．Ｗ．とＲａｌｓｔｏｎ，Ｅ．、Ｃｅｌ
ｌ、５９：７７１−７７２（１９８９）、Ｐａｖｌａｔｈ，Ｇ．Ｋ．ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ、３３７：５７０−５７３（１９８９）、およびＲａｌｓｔｏｎ，Ｅ．と
Ｈａｌｌ，Ｚ．Ｗ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０９：２３４５−２３５２
（１９８９））。実際、本明細書に記載した研究では、約１ｍｍの長さまで延び
ているジストロフィン陽性線維が観察され、これはジストロフィン発現に寄与す
るドナー核を探すのをより困難にしている。最後に、これまでに報告されている
ように、Ｙ−陽性核を含まないジストロフィン陽性線維のいくつかの比率は、復
帰突然変異ジストロフィン（revertant dystrophyn）の発現から得ることができ
る可能性がある（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｅ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．、
９９：９−２５（１９９０））。

【００３９】 前述のように、ｍｄｘマウスにおいて、筋細胞移植（Ｋａｒｐａｔｉ，Ｇ．ら
、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１３５：：２７−３２（１９８９）；Ｍｏｒｇａ
ｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１１１：２４３７−２４４９( １
９９０) およびＰａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｔ．Ａら、３３７：１７６−１７９（１９
８９））またはインビボ遺伝子導入（Ａｃｓａｄｉ，Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３
５２：８１５−８１８（１９９１）；Ｒａｇｏｔ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３６
１：６４７−６５０（１９９３）；Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｎ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅ
ｔ．、５：１３０−１３４（１９９３）およびＫｏｃｈａｎｅｋ，Ｓら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３：５７３１−５７３６：（１
９９６））のいずれかによって、ジストロフィン発現を回復しようとするこれま
での試みは完全に成功したが、驚くべきものではなく、細胞またはベクターの注
射部位近傍のジストロフィン発現の回復のみにとどまった（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ
，Ｔ．Ａ．のＭｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、１４：１９７−２１２号（１９９１年
））。本明細書に示した結果から、骨髄および／またはＨＣＳの移植によって、
治療用細胞の全身送達は循環を介して唯一の可能性が得られ、これにより全体的
な個別の筋量までジストロフィン陽性細胞の分布が改善されることは明白である
。

【００４０】 非常に少数の高純度な造血幹細胞を移植に用いるための必要条件は、遺伝子導
入または遺伝子修復を必要とする治療計画を著しく促進するであろう。細胞治療
および／または遺伝子治療に造血幹細胞を用いる上で考えられるもう一つの利点
は、血液由来細胞に保管されるように、個体の寿命にわたって筋原性前駆体を継
続して生産してもよいということである。新しい筋原性細胞が時間経過と共に組
み込まれると、筋機能の改善が進行する。この点に関し、本明細書に記載した試
験では、ジストロフィン発現を示す筋線維の比率は移植後長時間経過した時点で
上昇したように見えたたことは興味深い。

【００４１】 最後に、本明細書に記載した骨髄由来ＳＰ細胞を用いた試験は、致死的に放射
線照射したレシピエントを完全に再形成する能力を有する造血幹細胞は、筋に分
化する潜在性を有しているという第１の直接的な証拠を提供する。また、本明細
書に記載した試験は、通常造血幹細胞は造血幹細胞由来ではない種々の細胞およ
び組織を修復かつ補完する手段を提供するという興味深い可能性を上げるもので
ある。この場合、ＢＭＴは種々の範囲の細胞タイプを含む細胞治療およびエキソ
ビボ治療に適用可能であることが最終的は証明されるであろう。

【００４２】 本発明を以下の実施例によって説明するが、それはいかなる限定をも意図しな
い。

【００４３】 実施例 実施例１、２および３に以下の方法を用いた。

【００４４】 動物 本明細書に記載した実験に用いたジストロフィン−欠損ｍｄｘマウスは、デュ
シェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の動物モデルであり（Ｓｉｃｉｎｓｋｉ，
Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１５７８−１５８０（１９８９）；およびＢ
ｕｌｆｉｅｌｄ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
１：１１８９−１１９２（１９８４））、ヒト疾患に非常に近似したものとして
の役割をする。このｍｄｘマウスは、ＤＭＤに生じるような同じ遺伝子欠損を有
する。ＤＭＤにみられるように、その筋線維は蛋白ジストロフィンを欠如してお
り（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｅ．Ｐ．ら、Ｃｅｌｌ．５１：９１９−９２８（１９８７
））、広範な変性を起こす。

【００４５】 ６〜８週齢でマウスを用意し、６〜１２週齢で用いた。Ｃ５７ＢＬ／１０マウ
スおよびＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ−Ｄｍｄ^mdx ／J （Ｚ連鎖筋ジストロフィー
）マウスは、共にＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏ
ｒ，ＭＥ）から入手した。

【００４６】 骨髄および造血幹細胞の精製 骨髄は大腿骨および脛骨から抽出し、赤血球は塩化アンモニウム溶液（Ｓｉｇ
ｍａ社）を用いて除去した。前述のように、造血幹細胞を精製するために、２％
ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１ｍＭのＨＥＰＥＳおよび５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈ
ｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ社）を含有するＨＢＢＳに１０⁶ 細胞／ｍｌで骨髄
細胞を再懸濁し、３７℃で９０分間インキュベートした（Ｇｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．
Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：１７９７−１８０６（１９９６）；お
よびＧｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、国際公報第ＷＯ９６３９４８９号（１９９６
年１２月１２日発行）、これらの教示は参照により本明細書に全体的に組み込ま
れる）。

【００４７】 染色後、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙ；Ｂｉｏｔｅｃ）およびストレプトアビジ
ンマイクロビーズを用いて、細胞をＳｃａ−１−陽性細胞について磁気的にプレ
富化した。細胞を分別する前に、２％ＦＣＳおよび２μｇ／ｍｌヨウ化プロピジ
ウム（ＰＩ）を含むＨＢＳＳに細胞を再懸濁した。

【００４８】 フローサイトメトリー分析および細胞分別は、デュアル・レーザーＦＡＣＳＶ
ａｎｔａｇｅフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行っ
た。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素およびヨウ化プロピジウムは共に３５０ｎｍで励起し、
その蛍光発光を４５０ｎｍおよび６００ｎｍで測定した。前述のように造血幹細
胞集団の分別ゲートを確立した（Ｇｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．、１８３：１７９７−１８０６（１９９６）；およびＧｏｏｄｅｌｌ，Ｍ
．Ａ．ら、国際公報第ＷＯ９６３９４８９号（１９９６年１２月１２日発行）を
参照のこと。これらの参照例は参照により本明細書に全体的に組み入れられる。

【００４９】 骨髄および造血幹細胞の移植 メスＸ連鎖筋ジストロフィー（ｍｄｘ）レシピエントは、３時間の間隔をあけ
て２回の放射線照射（各６００ｒａｄ）において１２００ｒａｄで致死的に放射
線照射した。骨髄または造血幹細胞を尾静脈を介して静脈に与えた。移植後、マ
ウスを酸性水に保持した。すべての動物の管理は施設のガイドラインに準拠して
行った。

【００５０】 免疫組織化学法 ジストロフィン検出は前述のように行った（Ｇｕｓｓｏｎｉ，Ｅ．ら、Ｎａｔ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：１０１２−１０１６（１９９６）、この教示
は参照により本明細書に組み込まれる）。すなわち、前脛骨（ＴＡ）筋をｍｄｘ
マウスから抽出し、イソペンタンで直ちに凍結し、−７０℃で保管した。１０μ
ｍの切片を−２０℃で採取し、シラン処理したスライド（ＤＡＫＯ）に載せた。
切片をメタノールで３分間固定した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に移し
た。１０％ＦＣＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で２０分間
切片を遮断した。少なくとも１２時間、４℃、希釈率１対５００で、ジストロフ
ィンの遠位杆体領域（distal rod domain ）（ｃＤＮＡ残留物６１８１−９５４
４）が認められる抗６〜１０の抗体（Ｌｉｄｏｖ，Ｈ．Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、
３４８：７２５−７２８（１９９０））を用いてこの切片をインキュベートし、
ジストロフィンを検出した。ＰＢＳを用いて３〜１０分間洗浄した後、ＦＩＴＣ
−結合抗−ウサギＩｇＧ抗体を用いて切片をインキュベートし、前述のように洗
浄した。

【００５１】 蛍光インサイチュハイブリダイゼーション ジストロフィンおよびドナー由来Ｙ染色体を同時に検出するために、前述した
ものと同じ切片に対し、Ｙ染色体特異的プローブ（ボストンのＣｈｉｌｄｒｅｎ
' ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌのＥｖａｎ Ｓｎｙｄｅｒ医師の提供）を用いてインサ
イチュハイブリダイゼーションを行った（また、例えば、Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｙ
、Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ、３８：１８１−１８５（１９８８）；Ｈａｒｖｅｙ，
Ａ．Ｒ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、１２：
３３９−３４３（１９９２）；Ｐｒａｄｏ，Ｖ．Ｆ．ら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．
Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．、６１：８７−９０（１９９２）；およびＨａｒｖｅｙ
，Ａ．Ｒ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１１：５０９−５８
１（１９９３）を参照のこと）。

【００５２】 前述のように、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ）を用いニックトランスレーション法によってプローブを標識し
た（Ｇｕｓｓｏｎｉ，Ｅ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：１０１
２−１０１６（１９９６）、これらは参照により本明細書に全体的に組み込まれ
る）。

【００５３】 免疫組織化学法に続き、切片をＨｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ（Ａｍｒｅｓｃｏ）に
４５分間室温で固定し、ＰＢＳで洗浄し、５０％、７０％、９０％および１００
％のエタノールで脱水した。切片を１２分間変性させ、Ｙ染色体プローブを用い
て、加湿したチャンバー内で、少なくとも１２時間、３７℃でハイブリダイゼー
ションを行った。洗浄および遮断した後、切片をローダミン結合−抗−ジゴキシ
ゲニン抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３０分間イン
キュベートした。切片を洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｓ）で希釈した４’−６’ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰ
Ｉ）（２００ｎｇ／ｍｌ）を用いて核を対比染色した。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐ
ｈｏｔ顕微鏡を用いて三帯域通過フィルタ（Ｏｍｅｇａ）を通して切片を調べた
。ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を用いて、ＦＩＴＣ、ＤＡＰＩお
よびローダミンシグナルに関して同じ顕微鏡視野の画像を別々に撮り、Ｍａｃｉ
ｎｔｏｓｈ製コンピュータを使用し、ＩＰＬａｂ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＳＵ２ソ
フトウェア（Ｓｉｇｎａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）を用いて重ね合せた。

【００５４】 実施例１ 致死的に放射線照射したｍｄｘマウスの骨髄移植後の、ジストロフィ
ン発現およびＹ染色体陽性ドナーの核の検出のための前脛骨筋の免疫組織化学分
析およびＦＩＳＨ分析 野生型ジストロフィン遺伝子を有する骨髄細胞の移植がｍｄｘマウスの筋線維
内でジストロフィン発現を回復するかどうかを測定するために、雌ｍｄｘマウス
９匹を致死的に放射線照射した後、雄Ｃ５７ＢＬ／１０マウス（ジストロフィン
陽性）由来の５×１０⁵ または１〜５×１０⁷ 個の骨髄細胞を尾静脈経由で注射
した。骨髄移植の５、８および１２週間後、前脛骨（ＴＡ）筋を免疫組織化学分
析法によりジストロフィン発現を分析し、続いて、Ｙ染色体特異的プローブを用
いて蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によりドナー由来（
雄）細胞を検出した。高倍率（１００Ｘ）で観察したところ、ジストロフィン−
陽性筋線維にドナー核が認められた。Ｙ特異的プローブを用いて、骨髄移植５週
間後の骨髄の細胞上でＦＩＳＨを行い、雄ドナー細胞によりレシピエントの骨髄
が完全に再形成されたかどうかを検証した。

【００５５】 骨髄移植５週間後、筋線維の１％未満がジストロフィンを発現し、バックグラ
ウンドレベルと同様であった（表１）。しかし、骨髄移植８週間後には、筋線維
の１％が正常な筋細胞膜の場所でジストロフィンを発現し、２５〜６３％の検出
可能な融合したドナー由来核を含むジストロフィン発現線維を有した（表１）。
骨髄移植１２週間後、各マウスで１０％もの筋線維がジストロフィンを発現し、
１０〜３０％の検出可能な融合したＹ染色体−陽性核を含むジストロフィン−陽
性筋線維を有した（表１）。

【００５６】

【表１】

【００５７】¹ 骨髄移植後の週数² ジストロフィン−陽性線維対線維総数の数を計算することにより測定したジ
ストロフィン陽性線維の割合³ Ｙ染色体−陽性核を含むジストロフィン−陽性線維の割合

【００５８】 実施例２ 致死的に放射線照射した雌ｍｄｘレシピエントへの造血幹細胞移植１
２週間後の前脛骨筋におけるジストロフィン発現およびＹ染色体−陽性核の検出 致死的に放射線照射したレシピエントを完全に再形成することのできる高純度
の造血幹細胞（ＨＳＣ）が、骨髄移植（ＢＭＴ）後にジストロフィン−陽性筋線
維を形成することができるかどうかを直接測定するために、前述のように、正常
雄Ｃ５７ＢＬ／１０マウスからＨＳＣを精製した（Ｇｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら
、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：１７９７−１８０６（１９９６）；およびＧ
ｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、国際公報第ＷＯ９６３９４８９号（１９９６年１２
月１２日発行）を参照のこと。これらの教示は本明細書に参照により全体的に組
み込まれる）。このような骨髄ＳＰ細胞と呼ばれるＨＳＣは、Ｓｃａ−１＋、直
系マーカー（lineage marker）（Ｂ２２０，Ｍａｃ−１，Ｇｒ−１，ＣＤ４，Ｃ
Ｄ５およびＣＤ８）低／陰性であり、かつきわめて少ない細胞数（１００−５０
０細胞／マウス）でレシピエントの生着を完全にすることがすでに示されている
（Ｇｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：１７９７−１
８０６（１９９６）；Ｇｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、３：１
３３７−１３４５（１９９７）；およびＧｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、国際公報
第ＷＯ９６３９４８９号（１９９６年１２月１２日発行））。また、いくつかの
骨髄ＳＰ細胞はＣＤ３４−陰性である（Ｇｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．、１８３：１７９７−１８０６（１９９６）；Ｇｏｏｄｅｌｌ，Ｍ
．Ａ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、３：１３３７−１３４５（１９９７）；およびＧ
ｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、国際公報第ＷＯ９６３９４８９号（１９９６年１２
月１２日発行））。

【００５９】 ２０００〜５０００個の雄由来の骨髄ＳＰ細胞（造血幹細胞）を９匹の致死的
に放射線照射した雌ｍｄｘマウスの尾静脈に注射した。実施例１に示すように、
幹細胞注射５、８および１２週間後に再度マウスを屠殺し、ＴＡ筋を、免疫組織
化学法によりジストロフィン発現に関して分析し、Ｙ染色体−特異的プローブを
用いてＦＩＳＨにより雄ドナー細胞の存在に関して分析した。骨髄のＦＩＳＨ分
析からは、幹細胞注射５週間後までに、雌宿主は雄ドナー細胞で完全に再形成さ
れることが確認された。

【００６０】 細分化されていない骨髄細胞が生着したレシピエントでの場合と同じく、筋線
維の１％未満が５週間でジストロフィンを発現した（表２）。８週間で、筋線維
の１％までジストロフィンが発現し、２０〜４０％の融合したＹ染色体−陽性核
を含んだジストロフィン−発現線維を有した（表２）。１２週間で、筋線維の４
％までジストロフィンが検出されえ、１０〜３０％の融合したドナー核を含むこ
れらを有した（表２）。一例では、このドナー核はジストロフィン−陽性線維の
さらに上流で融合していることが観察された。

【００６１】

【表２】

【００６２】¹ 造血幹細胞移植後の週数² ジストロフィン−陽性線維対線維総数の数を計算することにより測定したジ
ストロフィン−陽性線維の割合³ Ｙ染色体−陽性核を含むジストロフィン陽性線維の割合

【００６３】 実施例３ ジストロフィン−陽性筋線維における融合したドナー核の位置 細分化していない骨髄細胞または精製したＳＰ細胞のいずれかを用いた動物移
植の場合では、Ｙ＋核は筋線維の中心および周辺に位置していることが認められ
たが、衛星細胞、すなわち通常さらなる筋線維の修復のための局所的な予備とし
て機能する筋幹細胞の位置では観察されなかった（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｒ．、Ｍ
ｙｏｌｏｇｙ，Ｅｎｇｅｌ，Ａ．Ｇ．とＦｒａｎｚｉｎｉ−Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ
，Ｃ．、Ｅｄｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，ｐｐ９７−１１
９：１９９４；およびＭａｕｒｏ，Ａ．Ｊ．、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｃｙｔｏｌ．、９：４９３−４９５（１９６１））（表３）。

【００６４】

【表３】

【００６５】¹ 基底膜と筋細胞膜との間に位置する。² 筋線維内で融合し、筋細胞膜直下に存在する。³ 筋線維内で融合し、筋線維中心部に位置している。⁴ 筋線維内で融合し、中心部と周辺領域との間の領域に位置している。

【００６６】 以上の結果はｍｄｘマウスにおける両方の骨髄移植は、両方の再生においてジ
ストロフィン発現を回復させているが（中心に位置する核の存在により示される
ように）、骨髄由来筋前駆細胞が実際に衛星細胞を発生するかどうかという重要
な問題を生じる。衛星細胞は、筋の損傷により損傷した線維を再生するために複
製および融合が導入されるまで、筋線維の基底膜と筋細胞膜との間の静止状態に
正常に存在する（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｒ．、Ｍｙｏｌｏｇｙ，Ｅｎｇｅｌ，Ａ．
Ｇ．とＦｒａｎｚｉｎｉ−Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｃ．、Ｅｄｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ：ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，ｐｐ９７−１１９、１９９４）；およびＭａｕｒ
ｏ，Ａ．、Ｊ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｌ．、９：４９３−
４９５（１９６１））。骨髄由来細胞によって誘導される修復プロセスは、衛星
細胞に関連するものとは明らかに異なる。

【００６７】 本明細書に引用したすべての、論文、特許および特許出願の教示は、参照によ
り全体的に組み入れられる。

【００６８】 本発明をその好適な実施形態を参照して詳細に示し、かつ記載してきたが、添
付した特許請求の範囲に規定された本発明の精神および範囲から逸脱せずに、そ
こで形態および詳細の種々の変更がなされうることが当業者に理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 15/09 5/00 Ｂ (72)発明者 グッソーニ，エマニュエラ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01890 ウィンチェスター，ウッドサイド ロード 46 (72)発明者 ムリガン，リチャード，シー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01773 リンカーン，サンディー ポンド ロード ２ (72)発明者 ソネオカ，ユーコ アメリカ合衆国 ワシントン，ディーシー 20009 ユニット 200 アール ストリ ート エヌ．ダブリュ． 1759 １／２ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA02 GA11 HA17 4B065 AA92X AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 MA66 ZA942 ZB222 ZC612 4C087 AA02 BB44 BB65 BC83 MA66 ZA94 ZB22 ZC61

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞の有効量を哺乳動物に投与する
   ことを含む、それを必要とする哺乳動物における筋疾患の治療方法。
2. 【請求項２】 ａ）所望の核酸産物をコードする目的の核酸配列を骨髄細胞
   または骨髄ＳＰ細胞に導入すること、ならびに ｂ）哺乳動物にａ）で生産された細胞を投与すること を含む、それを必要とする哺乳動物における筋疾患の治療方法。
3. 【請求項３】 該核酸配列がウイルスベクターに組み込まれる請求項２記載
   の方法。
4. 【請求項４】 該骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞が治療対象の哺乳動物から得
   られる請求項１〜３いずれか記載の方法。
5. 【請求項５】 該骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞がドナー哺乳動物から得られ
   る請求項１〜３いずれか記載の方法。
6. 【請求項６】 該哺乳動物がヒトである請求項１〜５いずれか記載の方法。
7. 【請求項７】 該筋疾患が筋ジストロフィーである請求項１〜６いずれか記
   載の方法。
8. 【請求項８】 該筋ジストロフィーが肢帯筋ジストロフィーである請求項７
   記載の方法。
9. 【請求項９】 該筋ジストロフィーが、デュシェーヌ筋ジストロフィーおよ
   びベッカー筋ジストロフィーからなる群より選ばれる請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 該所望の核酸産物がジストロフィンである請求項９記載の
    方法。
11. 【請求項１１】 骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞の有効量を哺乳動物に投与す
    ることを含む、それを必要とする哺乳動物における筋ジストロフィーの治療方法
    。
12. 【請求項１２】 ａ）所望の核酸産物をコードする目的の核酸配列を骨髄細
    胞または骨髄ＳＰ細胞に導入すること、ならびに ｂ）哺乳動物にａ）で生産された細胞を投与すること を含む、それを必要とする哺乳動物における筋ジストロフィーの治療方法。
13. 【請求項１３】 該核酸配列がウイルスベクターに組み込まれる請求項１２
    記載の方法。
14. 【請求項１４】 該骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞が治療対象の哺乳動物から
    得られる請求項１１〜１３いずれか記載の方法。
15. 【請求項１５】 該骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞がドナー哺乳動物から得ら
    れる請求項１１〜１３いずれか記載の方法。
16. 【請求項１６】 該哺乳動物がヒトである請求項１１〜１５いずれか記載の
    方法。
17. 【請求項１７】 該筋ジストロフィーが肢帯筋ジストロフィーである請求項
    １１〜１６いずれか記載の方法。
18. 【請求項１８】 該筋ジストロフィーが、デュシェーヌ筋ジストロフィーお
    よびベッカー筋ジストロフィーからなる群より選ばれる請求項１１〜１６いずれ
    か記載の方法。
19. 【請求項１９】 該所望の核酸産物がジストロフィンである請求項１８記載
    の方法。
20. 【請求項２０】 哺乳動物における筋疾患の治療での使用のための薬剤の製
    造のための骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞の使用。
21. 【請求項２１】 哺乳動物における筋ジストロフィーの治療での使用のため
    の薬剤の製造のための骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞の使用。
22. 【請求項２２】 所望の核酸産物をコードする目的の核酸配列が骨髄細胞ま
    たは骨髄ＳＰ細胞に導入される請求項２０または２１記載の使用。
23. 【請求項２３】 哺乳動物における筋疾患の治療での使用のための骨髄細胞
    または骨髄ＳＰ細胞。
24. 【請求項２４】 該骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞が、それに導入された所望
    の核酸産物をコードする目的の核酸配列を含有してなる請求項２３記載の骨髄細
    胞または骨髄ＳＰ細胞。
25. 【請求項２５】 該筋疾患が筋ジストロフィーである請求項２３または２４
    記載の骨髄細胞または骨髄ＳＰ細胞。
26. 【請求項２６】 請求項２３〜２５いずれか記載の骨髄細胞または骨髄ＳＰ
    細胞を含有してなる組成物。