JP2005526838A - パーキンソン病および他の神経変性疾患を治療するためのgdnf分泌ヒト神経幹細胞の使用 - Google Patents
パーキンソン病および他の神経変性疾患を治療するためのgdnf分泌ヒト神経幹細胞の使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005526838A JP2005526838A JP2003587328A JP2003587328A JP2005526838A JP 2005526838 A JP2005526838 A JP 2005526838A JP 2003587328 A JP2003587328 A JP 2003587328A JP 2003587328 A JP2003587328 A JP 2003587328A JP 2005526838 A JP2005526838 A JP 2005526838A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gdnf
- cells
- brain
- disease
- neurospheres
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 title claims abstract description 109
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 17
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 title claims description 37
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 title description 2
- 102000024452 GDNF Human genes 0.000 title 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 title 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 title 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims abstract description 108
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 8
- 101150082979 gdnf gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 48
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 claims description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 12
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 claims description 10
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 9
- 210000002637 putamen Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 7
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 101000579126 Mus musculus Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 5
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 241001492404 Woodchuck hepatitis virus Species 0.000 claims description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 claims description 2
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 claims 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims 1
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 84
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 42
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 15
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 15
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 13
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 13
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 8
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 8
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 6
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 6
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 5
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Chemical compound C1N(C)CCC(C=2C=CC=CC=2)=C1 PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 4
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 4
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 4
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 3
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 3
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 3
- 208000012661 Dyskinesia Diseases 0.000 description 3
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 3
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 101150024821 tetO gene Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 208000021601 lentivirus infection Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 2
- VKHAHZOOUSRJNA-GCNJZUOMSA-N mifepristone Chemical compound C1([C@@H]2C3=C4CCC(=O)C=C4CC[C@H]3[C@@H]3CC[C@@]([C@]3(C2)C)(O)C#CC)=CC=C(N(C)C)C=C1 VKHAHZOOUSRJNA-GCNJZUOMSA-N 0.000 description 2
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 206010061431 Glial scar Diseases 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000574060 Homo sapiens Progesterone receptor Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000003683 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000099 Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100021584 Neurturin Human genes 0.000 description 1
- 108010015406 Neurturin Proteins 0.000 description 1
- 241000238413 Octopus Species 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 101710139464 Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028600 axonogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000002932 cholinergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 108010057988 ecdysone receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 229960003248 mifepristone Drugs 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 1
- 210000003757 neuroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000461 neuroepithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000331 sympathetic ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
- A01K67/0333—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic, polyploid
- A01K67/0337—Genetically modified Arthropods
- A01K67/0339—Genetically modified insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Psychology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
Abstract
GDNFに応答する細胞の喪失を伴う脳障害を治療する方法が開示される。1つの実施態様において、本発明は、(a)ヒト神経幹細胞を神経膠細胞由来神経栄養因子(GDNF)で形質導入するステップであって、GDNF遺伝子は誘導可能なプロモーターシステムの制御下にあるステップ、および(b)形質導入された細胞を患者の脳に移植するステップを含む。
Description
本出願は、米国仮特許出願第60/375,587号(2002年4月25日出願;これは本明細書中に参考として組み込まれる)に対する優先権を主張する。
連邦政府により援助を受けた研究または開発に関する記述
連邦政府により援助を受けた研究または開発に関する記述
神経栄養因子および神経学的病気
ヒト脳における特定の細胞群の変性は、多くの破壊的な疾患、例えば、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病、ハンチントン(Huntington)病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)および多くの他の障害などを生じさせている。そのような変性はまた、神経毒化学兵器および戦争に関連した頭部傷害のひろがりにより、軍にとって非常に重要な関心事でもある。PDは、60歳以上の100人に1人が、すなわち、およそ150万人のアメリカ人が罹患しており、合衆国では1年あたり推定で250億ドルの費用がかかっている。治療は、主として、ドーパミン前駆体L−DOPAを投与することからなる。L−DOPAはその障害の初期段階では非常に効果的であり、しかし、後期では重篤な副作用を生じさせ、最終的にはもはや作用しない。より新しい様々な薬剤が、ドーパミンの効き目を高めるために作製途上にあり、代わりの神経外科的方法もまた開発途上にある。この場合、特定の脳領域が傷つけられるか、または刺激されるかのいずれかであり、これにより、多くの場合、劇的な急性の臨床的効果がもたらされている(パーキンソン病研究グループのための深部脳刺激、2001)。しかしながら、執行機能における様々な変化もまた生じ得ることがあり(ジャハンシャヒら、Brain、123(Pt.6):1142〜1154、2000)、進行中のニューロン変性に直面しているこれらの患者に関する長期間の予後は未だ知られていない。
胎児組織に由来するドーパミンニューロンの移植もまたPDでは非常に有望であることが示されている。この場合、新しいドーパミンニューロンが患者の被殻に組み込まれ、ドーパミンの新しい供給源を提供し、これにより、場合により、臨床的改善がもたらされている(ダンネットおよびビョークルンド、Nature、399:A32〜A39、1999)。移植により、実際には、疾患の経過時に失われたニューロンが入れ替わるが、しかし、新しいドーパミンニューロンは、被殻において異所的に置かれるので、臨床的回復のためには最適でないことがある。擬似手術を含んだ大規模な患者群に対する最近の研究では、若年者の患者は移植片に応答するが、効果は高齢者の患者ではあまり劇的でなく、場合により、ジスキネジアを含む様々な副作用が、L−DOPAが存在しない場合でさえ存在したことが示されている(フリードら、N.Engl.J.Med.、344:710〜719、2001)。しかしながら、これらの副作用が、以前に行われた多くのプロトコルに対して非常に異なるプロトコルが使用されたこの研究においてなぜ認められたかに関して少し議論されている(イサクソンら、Nat.Neurosci.、4:553、2001)。薬物、神経外科的方法および移植は、PD患者のために生活の質を改善するための本当の機会を表す一方で、他の様々な代替法がある。最も注目される期待は、ドーパミンニューロンの喪失を防止すること、または、既存の細胞に新しいプロセスを生じさせるようにすることであると考えられる。この方法では、症状でなく、疾患が治療される。神経栄養因子は、近い将来にこれを達成する方法を提供し得る可能性が非常にある。
原型的な神経栄養因子は神経増殖因子(NGF)であり、これは、発達中の交感神経ニューロンおよび後根神経節ニューロンの生存および分化を調節することが示されていた(レビ−モンタルチニおよびアンゲレッティ、Dev.Biol.、7:653〜659、1963)。1963年におけるその発見以降、類似するが、それにもかかわらず、特異的な作用を有する非常に多数の新しい神経栄養因子が見出されている。2つの構造的および機能的に関連するファミリーが明らかにされている。これらは、(i)NGFスーパーファミリー(これには、NGF、BDNF、NT−3、NT−4/5およびNT−6が含まれる);および(ii)神経膠細胞系統由来神経栄養ファミリー(GDNF)(これには、GDNF、ペルセフィンおよびニュールツリンが含まれる)である。GDNFファミリーは、ドーパミンニューロンに対する神経保護作用が明らかにされており、神経突起の生長をインビトロ(リンら、Science、260:1130〜1132、1993)および損傷後のインビボ(ベックら、Nature、373:339〜341、1995;トマクら、Nature、373:335〜339、1995;ビョークルンドら、Neurobiol.Dis.、4:186〜200、1997)の両方で高める。本発明者らは、GDNFもまた、ラットのPDモデルに移植された胚性ドーパミンニューロンからの神経繊維の生長を高めることができることを以前に示している(シンクレアら、Neuroreport、7:2547〜2552、1996)。無傷のドーパミン作動系の調節を介して、GDNFはまた、乱用された薬物に対する順応において役割を有することがあり(メッセルら、Neuron、26:247〜257、2000)、そして、その受容体として、多数の他の神経伝達物質系に影響を同様に及ぼし得ることが脳全体で見出されている(ゴールデンら、J.Comp.Neurol.、398:139〜150、1998)。これは、GDNFはまた、他のニューロンを様々な異なるモデルにおいて細胞死から保護することができるためであると考えられる。
PDに対するGDNFの関連性がさらに、ドーパミンニューロンを選択的に除くことによりヒトにおいてパーキンソン病様症状を生じさせる独特の毒素1−メチル−4−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン(MPTP)を伴う研究を通して明らかにされていた(ラングストン、Acta Neurol.Scand Suppl.、100:49〜54、1984)。GDNFは、脳の実質組織に直接的に注入されたとき、マウスおよびサルの両方のモデルにおいてMPTPの毒性から保護することが示されている(トマクら、Nature、373(6512):335〜339、1995;ガッシュら、Nature、380:252〜255、1996)。これらの勇気づけられる研究により、GDNFがボーラス注射でPD患者の脳室に直接的に注入される近年の臨床試験がもたらされた。しかしながら、その結果は非常に失望すべきものであり、PDに対する評価スコアの低下をもたらさず、いくつかの副作用を伴い、また、ドーパミン繊維の回復の証拠が死後の線条体にはほとんど見られなかった(コルドワーら、Ann.Neurol.、46:419〜424、1999)。このように効果がないことに対する理由は、GDNFが脳内に浸透しないことによる可能性が非常に高いと考えられた。
何年も前に、NGF(これは類似するサイズである)は、脳室内注射後の脳の実質組織への浸透が非常に悪いことが示されていた(ラプチャクら、Neuroscience、54:445〜460、1993)。従って、GDNFが実際に被殻などの深部構造部に到達する可能性は非常に低かった。
ヒト脳における特定の細胞群の変性は、多くの破壊的な疾患、例えば、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病、ハンチントン(Huntington)病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)および多くの他の障害などを生じさせている。そのような変性はまた、神経毒化学兵器および戦争に関連した頭部傷害のひろがりにより、軍にとって非常に重要な関心事でもある。PDは、60歳以上の100人に1人が、すなわち、およそ150万人のアメリカ人が罹患しており、合衆国では1年あたり推定で250億ドルの費用がかかっている。治療は、主として、ドーパミン前駆体L−DOPAを投与することからなる。L−DOPAはその障害の初期段階では非常に効果的であり、しかし、後期では重篤な副作用を生じさせ、最終的にはもはや作用しない。より新しい様々な薬剤が、ドーパミンの効き目を高めるために作製途上にあり、代わりの神経外科的方法もまた開発途上にある。この場合、特定の脳領域が傷つけられるか、または刺激されるかのいずれかであり、これにより、多くの場合、劇的な急性の臨床的効果がもたらされている(パーキンソン病研究グループのための深部脳刺激、2001)。しかしながら、執行機能における様々な変化もまた生じ得ることがあり(ジャハンシャヒら、Brain、123(Pt.6):1142〜1154、2000)、進行中のニューロン変性に直面しているこれらの患者に関する長期間の予後は未だ知られていない。
胎児組織に由来するドーパミンニューロンの移植もまたPDでは非常に有望であることが示されている。この場合、新しいドーパミンニューロンが患者の被殻に組み込まれ、ドーパミンの新しい供給源を提供し、これにより、場合により、臨床的改善がもたらされている(ダンネットおよびビョークルンド、Nature、399:A32〜A39、1999)。移植により、実際には、疾患の経過時に失われたニューロンが入れ替わるが、しかし、新しいドーパミンニューロンは、被殻において異所的に置かれるので、臨床的回復のためには最適でないことがある。擬似手術を含んだ大規模な患者群に対する最近の研究では、若年者の患者は移植片に応答するが、効果は高齢者の患者ではあまり劇的でなく、場合により、ジスキネジアを含む様々な副作用が、L−DOPAが存在しない場合でさえ存在したことが示されている(フリードら、N.Engl.J.Med.、344:710〜719、2001)。しかしながら、これらの副作用が、以前に行われた多くのプロトコルに対して非常に異なるプロトコルが使用されたこの研究においてなぜ認められたかに関して少し議論されている(イサクソンら、Nat.Neurosci.、4:553、2001)。薬物、神経外科的方法および移植は、PD患者のために生活の質を改善するための本当の機会を表す一方で、他の様々な代替法がある。最も注目される期待は、ドーパミンニューロンの喪失を防止すること、または、既存の細胞に新しいプロセスを生じさせるようにすることであると考えられる。この方法では、症状でなく、疾患が治療される。神経栄養因子は、近い将来にこれを達成する方法を提供し得る可能性が非常にある。
原型的な神経栄養因子は神経増殖因子(NGF)であり、これは、発達中の交感神経ニューロンおよび後根神経節ニューロンの生存および分化を調節することが示されていた(レビ−モンタルチニおよびアンゲレッティ、Dev.Biol.、7:653〜659、1963)。1963年におけるその発見以降、類似するが、それにもかかわらず、特異的な作用を有する非常に多数の新しい神経栄養因子が見出されている。2つの構造的および機能的に関連するファミリーが明らかにされている。これらは、(i)NGFスーパーファミリー(これには、NGF、BDNF、NT−3、NT−4/5およびNT−6が含まれる);および(ii)神経膠細胞系統由来神経栄養ファミリー(GDNF)(これには、GDNF、ペルセフィンおよびニュールツリンが含まれる)である。GDNFファミリーは、ドーパミンニューロンに対する神経保護作用が明らかにされており、神経突起の生長をインビトロ(リンら、Science、260:1130〜1132、1993)および損傷後のインビボ(ベックら、Nature、373:339〜341、1995;トマクら、Nature、373:335〜339、1995;ビョークルンドら、Neurobiol.Dis.、4:186〜200、1997)の両方で高める。本発明者らは、GDNFもまた、ラットのPDモデルに移植された胚性ドーパミンニューロンからの神経繊維の生長を高めることができることを以前に示している(シンクレアら、Neuroreport、7:2547〜2552、1996)。無傷のドーパミン作動系の調節を介して、GDNFはまた、乱用された薬物に対する順応において役割を有することがあり(メッセルら、Neuron、26:247〜257、2000)、そして、その受容体として、多数の他の神経伝達物質系に影響を同様に及ぼし得ることが脳全体で見出されている(ゴールデンら、J.Comp.Neurol.、398:139〜150、1998)。これは、GDNFはまた、他のニューロンを様々な異なるモデルにおいて細胞死から保護することができるためであると考えられる。
PDに対するGDNFの関連性がさらに、ドーパミンニューロンを選択的に除くことによりヒトにおいてパーキンソン病様症状を生じさせる独特の毒素1−メチル−4−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン(MPTP)を伴う研究を通して明らかにされていた(ラングストン、Acta Neurol.Scand Suppl.、100:49〜54、1984)。GDNFは、脳の実質組織に直接的に注入されたとき、マウスおよびサルの両方のモデルにおいてMPTPの毒性から保護することが示されている(トマクら、Nature、373(6512):335〜339、1995;ガッシュら、Nature、380:252〜255、1996)。これらの勇気づけられる研究により、GDNFがボーラス注射でPD患者の脳室に直接的に注入される近年の臨床試験がもたらされた。しかしながら、その結果は非常に失望すべきものであり、PDに対する評価スコアの低下をもたらさず、いくつかの副作用を伴い、また、ドーパミン繊維の回復の証拠が死後の線条体にはほとんど見られなかった(コルドワーら、Ann.Neurol.、46:419〜424、1999)。このように効果がないことに対する理由は、GDNFが脳内に浸透しないことによる可能性が非常に高いと考えられた。
何年も前に、NGF(これは類似するサイズである)は、脳室内注射後の脳の実質組織への浸透が非常に悪いことが示されていた(ラプチャクら、Neuroscience、54:445〜460、1993)。従って、GDNFが実際に被殻などの深部構造部に到達する可能性は非常に低かった。
治療遺伝子のための送達媒介因子としてのウイルス
脳細胞を形質導入するための様々な操作された複製欠陥ウイルスの使用が確立されている。これらは、GDNFを様々なプロモーターのもとで生じさせるために改変されている(ビョークルンドら、Brain Res.、886:82〜98、2000に総説される)。ほぼどの研究でも、GDNFは、ドーパミンニューロンを保護すること、および、神経繊維の生長を高めることの両方が見出されていた。本発明者らの共同研究者らは、安全かつ非毒性であり、導入遺伝子を長期間にわたって発現する自己不活性化型のlenti−GDNFを開発してきた(デグロンら、Hum.Gene Ther.、11:179〜190、2000)。さらに、この同じウイルスは、ドーパミン作動性発現の年齢により誘導される減少を逆転させること、および、アカゲザルの線条体への直接的な注入の後におけるMPTPの毒性を防止することが示されていた(コルドワーら、Science、290:767〜773、2000)。そのため、このウイルスは、PD患者の脳へのGDNFに対する送達システムとしての可能性が大きいことを表している。
脳細胞を形質導入するための様々な操作された複製欠陥ウイルスの使用が確立されている。これらは、GDNFを様々なプロモーターのもとで生じさせるために改変されている(ビョークルンドら、Brain Res.、886:82〜98、2000に総説される)。ほぼどの研究でも、GDNFは、ドーパミンニューロンを保護すること、および、神経繊維の生長を高めることの両方が見出されていた。本発明者らの共同研究者らは、安全かつ非毒性であり、導入遺伝子を長期間にわたって発現する自己不活性化型のlenti−GDNFを開発してきた(デグロンら、Hum.Gene Ther.、11:179〜190、2000)。さらに、この同じウイルスは、ドーパミン作動性発現の年齢により誘導される減少を逆転させること、および、アカゲザルの線条体への直接的な注入の後におけるMPTPの毒性を防止することが示されていた(コルドワーら、Science、290:767〜773、2000)。そのため、このウイルスは、PD患者の脳へのGDNFに対する送達システムとしての可能性が大きいことを表している。
エクスビボ遺伝子治療および誘導可能なウイルスベクター
代わりの方法はエクスビボ(ex vivo)遺伝子治療である。繊維芽細胞、星状膠細胞または他の細胞株が、目的の遺伝子の最初に形質導入され、その後、脳に移植される(総説については、ガゲ、Nature、392(増刊):18〜24、1998を参照のこと)。腫瘍形成性であり得る細胞、または免疫応答を誘導する可能性を有し得る細胞を、透過性膜からのタンパク質の拡散を可能にしながら、その逃避および検出を妨げるカプセルに入れることができる(ツェングおよびアエビシャー、Prog.Brain Res.、127:189〜202、2000)。そのようなカプセル化された細胞から放出されるGDNFは、老齢ラットにおいて、機能を回復させることができ、また、ドーパミンの代謝を増大させることができる(エメリッヒら、Brain Res.、736:99〜110、1996)。しかしながら、ヒト臨床試験の場合、可能ならば、永続的な留置デバイスから脱却することに対する利点が存在する。さらに、GDNFのカプセル送達は依然として、より広い領域にわたる拡散送達ではなく、タンパク質送達の点状の供給源である。理想的には、細胞が脳に移植され、所望される標的領域内を遊走し、GDNFを変性中の神経繊維または神経細胞の環境で放出する。この技術は、(i)どの宿主ニューロンも遺伝子的に改変されないこと、(ii)細胞は生きているウイルスを保有しないこと、および(iii)GDNFの正確な放出速度を移植前にインビトロで明らかにすることができる点で、上記で強調された様々な問題を克服する。しかしながら、GDNF放出を調節できることがこれらの研究では不可欠である。
移植後のGDNF放出の制御は依然として重大な事項である。どの臨床的送達試験においても、望ましくない副作用が生じた場合、またはGDNFの最大作用が明らかにされた場合、目的とする遺伝子を停止させ、それにより遺伝子調節を可能にする方法が存在しなければならない。さらに、そのような方法では、経時的なGDNF放出の調節、および脳に送達される正確な量の調節が、通常の薬物送達と同様な様式で可能になる。遺伝子の制御された調節を可能にする様々な誘導可能な遺伝子発現システムが今や開発されている(ブラウおよびロッシ、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、96:797〜799、1999)。テトラサイクリン誘導可能なエレメントを含むウイルス構築物が最近では試験されている。目的とする遺伝子は、インビトロではドキシサイクリン(テトラサイクリンのアナログ)を培養培地に投与するか、またはインビボでは飲料水に投与した後、構築物の設計に依存してオンまたはオフが切り換えられる。これらのシステムは、インビトロで繊維芽細胞におけるニューロトロフィンおよびGFPの産生を調節すること(ブレシュら、J.Neurosci.Res.、59:402〜409、2000)、PDの齧歯類モデルに移植された後においてインビトロおよびインビボでの細胞株からのGABAの放出を調節すること(ベルストックら、J.Neurosci.Res.、60(3):302〜310、2000;ベールストックら、Sco.For Neurosci.、2001)、および、ヒトHEK293細胞株におけるGFP産生を調節すること(カフリら、Mol.Ther.、1:516〜521、2000)が示されている。さらに、インビボでのNGFの制御された放出は、傷害を受けたコリン作動性ニューロンの生存および生長を調節することが示されている(ブレシュら、Gene Ther.、8:954〜960、2001)。
代わりの方法はエクスビボ(ex vivo)遺伝子治療である。繊維芽細胞、星状膠細胞または他の細胞株が、目的の遺伝子の最初に形質導入され、その後、脳に移植される(総説については、ガゲ、Nature、392(増刊):18〜24、1998を参照のこと)。腫瘍形成性であり得る細胞、または免疫応答を誘導する可能性を有し得る細胞を、透過性膜からのタンパク質の拡散を可能にしながら、その逃避および検出を妨げるカプセルに入れることができる(ツェングおよびアエビシャー、Prog.Brain Res.、127:189〜202、2000)。そのようなカプセル化された細胞から放出されるGDNFは、老齢ラットにおいて、機能を回復させることができ、また、ドーパミンの代謝を増大させることができる(エメリッヒら、Brain Res.、736:99〜110、1996)。しかしながら、ヒト臨床試験の場合、可能ならば、永続的な留置デバイスから脱却することに対する利点が存在する。さらに、GDNFのカプセル送達は依然として、より広い領域にわたる拡散送達ではなく、タンパク質送達の点状の供給源である。理想的には、細胞が脳に移植され、所望される標的領域内を遊走し、GDNFを変性中の神経繊維または神経細胞の環境で放出する。この技術は、(i)どの宿主ニューロンも遺伝子的に改変されないこと、(ii)細胞は生きているウイルスを保有しないこと、および(iii)GDNFの正確な放出速度を移植前にインビトロで明らかにすることができる点で、上記で強調された様々な問題を克服する。しかしながら、GDNF放出を調節できることがこれらの研究では不可欠である。
移植後のGDNF放出の制御は依然として重大な事項である。どの臨床的送達試験においても、望ましくない副作用が生じた場合、またはGDNFの最大作用が明らかにされた場合、目的とする遺伝子を停止させ、それにより遺伝子調節を可能にする方法が存在しなければならない。さらに、そのような方法では、経時的なGDNF放出の調節、および脳に送達される正確な量の調節が、通常の薬物送達と同様な様式で可能になる。遺伝子の制御された調節を可能にする様々な誘導可能な遺伝子発現システムが今や開発されている(ブラウおよびロッシ、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、96:797〜799、1999)。テトラサイクリン誘導可能なエレメントを含むウイルス構築物が最近では試験されている。目的とする遺伝子は、インビトロではドキシサイクリン(テトラサイクリンのアナログ)を培養培地に投与するか、またはインビボでは飲料水に投与した後、構築物の設計に依存してオンまたはオフが切り換えられる。これらのシステムは、インビトロで繊維芽細胞におけるニューロトロフィンおよびGFPの産生を調節すること(ブレシュら、J.Neurosci.Res.、59:402〜409、2000)、PDの齧歯類モデルに移植された後においてインビトロおよびインビボでの細胞株からのGABAの放出を調節すること(ベルストックら、J.Neurosci.Res.、60(3):302〜310、2000;ベールストックら、Sco.For Neurosci.、2001)、および、ヒトHEK293細胞株におけるGFP産生を調節すること(カフリら、Mol.Ther.、1:516〜521、2000)が示されている。さらに、インビボでのNGFの制御された放出は、傷害を受けたコリン作動性ニューロンの生存および生長を調節することが示されている(ブレシュら、Gene Ther.、8:954〜960、2001)。
エクスビボ遺伝子治療のための神経幹細胞
中枢神経系(CNS)の発達時には、成熟した脳のニューロン、星状膠細胞および稀突起神経膠細胞を生じさせる脳室壁を裏打ちする神経上皮細胞の広範囲にわたる増殖が存在する(ヤコブソン、「神経細胞の胎芽細胞、組織発生および系譜」、発生神経生物学(ヤコブソン編)、New YorkおよびLondon;Plenum Press、1991)。これらの細胞は培養状態で単離することができ、また、単層物、または「ニューロスフェア」と呼ばれる自由浮動性凝集物のいずれかとして成長させることができる(ガゲ、Science、287:1433〜1439、2000;マッケイ、Science、276:66〜71、1997;レイノルズおよびワイス、Dev.Biol.、175:1〜13、1996;シェフラーら、Trends Neurosci.、22:348〜357、1999)。ニューロスフェアは、おそらくは、少数の「真」の幹細胞と、多くのより拘束された始原細胞とからなると考えられる(スベンドセンら、、Trends Neurosci.、22:357〜364、1999;スベンドセンおよびカルドウエル、Prog.Brain Res.、127:13〜34、2000)。ニューロスフェアは長期間にわたって培養状態で成長させることができ、また、移植を生き残る能力を保持するので、ニューロスフェアは細胞治療のための理想的な組織供給源である(スベンドセンおよびスミス、Trends Neurosci.、22:357〜364、1999)。
NGFを過剰発現する遺伝子組換えマウスから得られたニューロスフェアは、移植後、生物学的に活性なNGFを分泌する(カーペンターら、Exp.Neurol.、148:187〜204、1997)。ヒト神経前駆体細胞もまた、テトラサイクリン誘導可能なチロシンヒドロキシラーゼ(TH)遺伝子を駆動させるアデノウイルスベクターで感染させられている。著者らはインビトロおよび移植後のインビボの両方での遺伝子の調節を報告していたが、その反応効果は一時的であった(コルチら、Nat.Biotechnol.、17:2349〜354、1999)。これは、THの非特異的な発現が多くの場合には機能的に関連しているためであると考えられる。
別の研究では、類似するヒト神経前駆体が、不死化因子を駆動させるテトラサイクリン誘導可能なシステムで感染されられている(サーら、Nature、Biotech.、15:574〜580、1997)。ごく最近には、不死化細胞株が、GDNFを放出させるために改変され、PDのマウスモデルに関連する変化のいくつかを逆転させることが示された(アケルドら、J.Neurosci.、21:8108〜8118、2001)。
中枢神経系(CNS)の発達時には、成熟した脳のニューロン、星状膠細胞および稀突起神経膠細胞を生じさせる脳室壁を裏打ちする神経上皮細胞の広範囲にわたる増殖が存在する(ヤコブソン、「神経細胞の胎芽細胞、組織発生および系譜」、発生神経生物学(ヤコブソン編)、New YorkおよびLondon;Plenum Press、1991)。これらの細胞は培養状態で単離することができ、また、単層物、または「ニューロスフェア」と呼ばれる自由浮動性凝集物のいずれかとして成長させることができる(ガゲ、Science、287:1433〜1439、2000;マッケイ、Science、276:66〜71、1997;レイノルズおよびワイス、Dev.Biol.、175:1〜13、1996;シェフラーら、Trends Neurosci.、22:348〜357、1999)。ニューロスフェアは、おそらくは、少数の「真」の幹細胞と、多くのより拘束された始原細胞とからなると考えられる(スベンドセンら、、Trends Neurosci.、22:357〜364、1999;スベンドセンおよびカルドウエル、Prog.Brain Res.、127:13〜34、2000)。ニューロスフェアは長期間にわたって培養状態で成長させることができ、また、移植を生き残る能力を保持するので、ニューロスフェアは細胞治療のための理想的な組織供給源である(スベンドセンおよびスミス、Trends Neurosci.、22:357〜364、1999)。
NGFを過剰発現する遺伝子組換えマウスから得られたニューロスフェアは、移植後、生物学的に活性なNGFを分泌する(カーペンターら、Exp.Neurol.、148:187〜204、1997)。ヒト神経前駆体細胞もまた、テトラサイクリン誘導可能なチロシンヒドロキシラーゼ(TH)遺伝子を駆動させるアデノウイルスベクターで感染させられている。著者らはインビトロおよび移植後のインビボの両方での遺伝子の調節を報告していたが、その反応効果は一時的であった(コルチら、Nat.Biotechnol.、17:2349〜354、1999)。これは、THの非特異的な発現が多くの場合には機能的に関連しているためであると考えられる。
別の研究では、類似するヒト神経前駆体が、不死化因子を駆動させるテトラサイクリン誘導可能なシステムで感染されられている(サーら、Nature、Biotech.、15:574〜580、1997)。ごく最近には、不死化細胞株が、GDNFを放出させるために改変され、PDのマウスモデルに関連する変化のいくつかを逆転させることが示された(アケルドら、J.Neurosci.、21:8108〜8118、2001)。
ニューロスフェアの移植
これらのインビトロ研究と平行して、本発明者らは、移植された神経細胞の運命に関する3報の論文を発表している。最初の論文では、発達中の脳に由来するラット細胞およびヒト細胞の両方から得られた細胞の移植は、細胞を追跡するための良好なマーカーがこの段階では利用できないが、初代胎児組織を使用したときに見られる移植片と類似する大きい移植片を生じさせないことが示された(スベンドセンら、Exp.Neurol.、137:376〜388、1996)。他のグループからのその後の研究では、ヒト細胞を移植した後、多くの遊走する細胞をとともに、類似する小さい散在性の移植片が示されていた(ベスコビら、Exp.Neurol.、156:71〜83、1999;フリッカーら、J.Neurosci.、19:5990〜6005、1999)。本発明者らの次の移植片論文では、特定のヒトマーカーが使用され、大部分の細胞が、PDの齧歯類モデルに移植された後、注入部位から遊走し、星状膠細胞に成熟したことが示された。しかしながら、少数の細胞が、少数の動物では、ドーパミンニューロンに分化し、回転欠落を逆転させた(スベンドセンら、Exp.Neurol.、148:135〜146、1997)。本発明者らの最も最近の論文では、本発明者らは、ヒトニューロスフェア培養物を移植するときの最適な細胞密度を明らかにしており、また、移植片からの広範囲にわたる軸索の生長を明らかにするために、ヒト特異的な神経フィラメントマーカーを使用している(オステンフェルドら、Exp.Neurol.、164:215〜226、2000)。
これらのインビトロ研究と平行して、本発明者らは、移植された神経細胞の運命に関する3報の論文を発表している。最初の論文では、発達中の脳に由来するラット細胞およびヒト細胞の両方から得られた細胞の移植は、細胞を追跡するための良好なマーカーがこの段階では利用できないが、初代胎児組織を使用したときに見られる移植片と類似する大きい移植片を生じさせないことが示された(スベンドセンら、Exp.Neurol.、137:376〜388、1996)。他のグループからのその後の研究では、ヒト細胞を移植した後、多くの遊走する細胞をとともに、類似する小さい散在性の移植片が示されていた(ベスコビら、Exp.Neurol.、156:71〜83、1999;フリッカーら、J.Neurosci.、19:5990〜6005、1999)。本発明者らの次の移植片論文では、特定のヒトマーカーが使用され、大部分の細胞が、PDの齧歯類モデルに移植された後、注入部位から遊走し、星状膠細胞に成熟したことが示された。しかしながら、少数の細胞が、少数の動物では、ドーパミンニューロンに分化し、回転欠落を逆転させた(スベンドセンら、Exp.Neurol.、148:135〜146、1997)。本発明者らの最も最近の論文では、本発明者らは、ヒトニューロスフェア培養物を移植するときの最適な細胞密度を明らかにしており、また、移植片からの広範囲にわたる軸索の生長を明らかにするために、ヒト特異的な神経フィラメントマーカーを使用している(オステンフェルドら、Exp.Neurol.、164:215〜226、2000)。
1つの実施態様において、本発明は、GDNFに応答する細胞の喪失を伴う脳障害を治療する方法であって、(a)ヒト神経幹細胞を神経膠細胞由来神経栄養因子(GDNF)で形質導入するステップであって、GDNF遺伝子は誘導可能なプロモーターシステムの制御下にあるステップ、および(b)形質導入された細胞を患者の脳に移植するステップ、を含む方法である。
本発明の好ましい態様において、患者は、パーキンソン病患者、ALS患者、脳卒中患者およびハンチントン病患者からなる群から選択される。本発明の別の好ましい態様において、誘導可能なプロモーターは、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1/tTA1システムの一部である。
本発明の別の目的、利点および特徴が下記に記載される。
本発明の好ましい態様において、患者は、パーキンソン病患者、ALS患者、脳卒中患者およびハンチントン病患者からなる群から選択される。本発明の別の好ましい態様において、誘導可能なプロモーターは、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1/tTA1システムの一部である。
本発明の別の目的、利点および特徴が下記に記載される。
神経膠細胞由来神経栄養因子(GDNF)は、パーキンソン病(PD)に対する候補治療剤である。GDNFは、PDの様々なモデルにおいてドーパミンニューロンの喪失を防止することができ、また、勇気づける臨床結果および良好な安全性プロフィルを最近の小規模な臨床試験において示している。GDNFは大きいために、血液脳関門を横断することができず、従って、新規な送達方法を開発する必要がある。さらに、GDNFは一部の神経系に対する望ましくない作用を有し得るので、その送達では、脳の特定の領域を標的化する必要がある。
1つの実施態様において、本発明は、パーキンソン病などの、GDNFに応答する細胞の喪失を伴う神経学的疾患を治療する方法であって、(a)ヒト神経幹細胞を神経膠細胞由来神経栄養因子(GDNF)で形質導入するステップであって、GDNF遺伝子は誘導可能なプロモーターシステムの制御下にあるステップ、および(b)形質導入された細胞を患者の脳に移植するステップ、を含む方法である。GDNFが発現させられ、GDNF応答性ニューロン系が上方制御(up-regulate)される。
本発明は、新規な継代培養法を使用して成長させられた遺伝子操作されたヒト神経幹細胞(hNSC)を、脳の特定の領域へのGDNFの標的化された送達のためのビヒクルとして使用することに基づいている。GDNFの放出は誘導可能なプロモーターシステムの制御下にある。細胞を大量に成長させることができ、放出されたGDNFは、パーキンソン病において死亡することが知られているドーパミンニューロンに対する生物学的作用を有する。
本発明は、新規な継代培養法を使用して成長させられた遺伝子操作されたヒト神経幹細胞(hNSC)を、脳の特定の領域へのGDNFの標的化された送達のためのビヒクルとして使用することに基づいている。GDNFの放出は誘導可能なプロモーターシステムの制御下にある。細胞を大量に成長させることができ、放出されたGDNFは、パーキンソン病において死亡することが知られているドーパミンニューロンに対する生物学的作用を有する。
出願人は、本発明の様々な局面を下記で議論している。
神経幹細胞:本発明者らは、ヒト神経幹細胞(hNSC)の成長、分化および移植のための技術を改良している。(スベンドセンら、J.Neurosci.Methods、85(2):141〜152、1998;スベンドセンら、Brain Pathology、9(3):499〜513、1999;これらはともに参考として組み込まれる)。好ましくは、細胞はヒトES細胞に由来しない。その代わり、神経幹細胞は死後胎児脳組織の胎芽帯域に由来する。本発明者らは、組織を、NIHにより資金提供されるBirth Defects Laboratory(Washington、米国)から集めた。これらの細胞の利点は、細胞が、神経組織のみを生じさせることに拘束され、奇形腫または他の組織タイプを生じさせないということであり、このことは、現在、より原始的なES細胞誘導体に関して大きな関心事である。流産組織を提供し得る病院または健康管理センターなどの数多くの異なる場所から細胞を得ることが可能である。
最近、本発明者らは、hNSCを、EGF/LIFの存在下で長期間にわたって、「ニューロスフェア」と呼ばれる凝集物として維持することができ、また、hNSCは、新規な継代培養法を使用して30回〜100回の集団倍化の間、安定な成長期に達し得ることを示している。この方法では、酵素を使用するのではなく、スフェア体をより小さいセグメントに「切り刻み」、それにより細胞/細胞の接触および幹細胞「ニッチ」を維持することを伴う。これにより、複雑な補充物を培地に添加することなく、長期間の成長が可能になり、また、凍結および貯蔵することができる一致した表現型を有する細胞の産生が可能になる。本発明者らの方法では、これらの細胞は移植後に腫瘍を形成しない。これらの細胞は、短い距離または長い距離を遊走し、長期間にわたって生存し、また、星状膠細胞およびニューロンの両方を生じさせる。図1には、より詳細には下記で議論されるが、ニューロスフェアを生じさせるための好ましい方法が記載される。
神経幹細胞:本発明者らは、ヒト神経幹細胞(hNSC)の成長、分化および移植のための技術を改良している。(スベンドセンら、J.Neurosci.Methods、85(2):141〜152、1998;スベンドセンら、Brain Pathology、9(3):499〜513、1999;これらはともに参考として組み込まれる)。好ましくは、細胞はヒトES細胞に由来しない。その代わり、神経幹細胞は死後胎児脳組織の胎芽帯域に由来する。本発明者らは、組織を、NIHにより資金提供されるBirth Defects Laboratory(Washington、米国)から集めた。これらの細胞の利点は、細胞が、神経組織のみを生じさせることに拘束され、奇形腫または他の組織タイプを生じさせないということであり、このことは、現在、より原始的なES細胞誘導体に関して大きな関心事である。流産組織を提供し得る病院または健康管理センターなどの数多くの異なる場所から細胞を得ることが可能である。
最近、本発明者らは、hNSCを、EGF/LIFの存在下で長期間にわたって、「ニューロスフェア」と呼ばれる凝集物として維持することができ、また、hNSCは、新規な継代培養法を使用して30回〜100回の集団倍化の間、安定な成長期に達し得ることを示している。この方法では、酵素を使用するのではなく、スフェア体をより小さいセグメントに「切り刻み」、それにより細胞/細胞の接触および幹細胞「ニッチ」を維持することを伴う。これにより、複雑な補充物を培地に添加することなく、長期間の成長が可能になり、また、凍結および貯蔵することができる一致した表現型を有する細胞の産生が可能になる。本発明者らの方法では、これらの細胞は移植後に腫瘍を形成しない。これらの細胞は、短い距離または長い距離を遊走し、長期間にわたって生存し、また、星状膠細胞およびニューロンの両方を生じさせる。図1には、より詳細には下記で議論されるが、ニューロスフェアを生じさせるための好ましい方法が記載される。
種々の前分化方法を使用して、本発明者らは、hNSCに由来する細胞の表現型をニューロンまたは神経膠細胞のいずれかに向かわせ、かつ、その遊走を制御することを可能にしている。本発明者らは、今回、(i)外来因子の広範囲にわたる試験、(ii)完全な核型分析、および(iii)完全なマイクロアレイ遺伝子分析を受けているこれらの細胞のバンクを確立している。これらの細胞は公然と、クローンティクス(Clonetics)から入手することができる。当業者は、以前に発表された論文(例えば、スベンドセンら、上記、1998)を使用してこれらの細胞を成長させることができる。
パーキンソン病(PD)および幹細胞。PDに対する従来の幹細胞法は、ドーパミンニューロンを幹細胞から生じさせることに集中している。これは、300名を超えるPD患者に、今では、胎児組織に由来する初代ドーパミンニューロンが移植されているという事実に基づいている。しかしながら、初代ヒト胎児組織に由来するドーパミンニューロンを線条体に異所的に移植することは、ヒトにおけるPDの症状を緩和するために十分でない場合があることは今や明らかである。実際、これらの細胞は、抑制することが困難である「オフ」ジスキネジアを誘導する場合がある。推論的ではあるが、これらは、何らかの遠心性神経接合部によって制御されない移植片内のドーパミンニューロンの小さい「ホットスポット」を介する線条体におけるドーパミンの制御されない放出のためである可能性がある。ドーパミンニューロン移植片を純化し続けることは明らかに重要ではあるが、霊長類におけるさらなる研究が、現在では、臨床に戻す前に必要である。胎児脳組織に由来する神経幹細胞はドーパミンニューロンを容易に作製しないので、ヒトES細胞は、これらの研究のためのドーパミンニューロンの最も良い供給源であると考えられる。
神経膠細胞由来神経栄養因子(GDNF)。GDNFは、培養皿におけるドーパミンニューロンに対するその栄養作用によって発見された。それ以降、GDNFは、PDの様々なモデルにおいてドーパミンニューロンの変性を防止し、移植されたドーパミンニューロンを支援するために、非常に多数の研究で使用されている。本発明者らは、メドトロニクス(Medtronics)ポンプを使用して直接、高濃度のGDNFを5名のPD患者の被殻に注入することを伴った英国での臨床試験を完了したところである。ギルら、2003(下記)。オープン試験であったが、これらの患者における著しい臨床的改善、ジスキネジアの減少、および、脳におけるドーパミン貯蔵の著しい増大が認められている。2年目の時点で、すべての患者はこの高用量によく耐えており、引き続き改善している。この方法に関する問題は、ポンプを取り付けることが複雑であること、GDNFを、毎月、再充填しなければならないこと、注入される脳領域が小さいこと、および、長期間の送達での感染の可能性があるということである。さらに、GDNFの費用が長期間では非常に大きくなり得る。
神経膠細胞由来神経栄養因子(GDNF)。GDNFは、培養皿におけるドーパミンニューロンに対するその栄養作用によって発見された。それ以降、GDNFは、PDの様々なモデルにおいてドーパミンニューロンの変性を防止し、移植されたドーパミンニューロンを支援するために、非常に多数の研究で使用されている。本発明者らは、メドトロニクス(Medtronics)ポンプを使用して直接、高濃度のGDNFを5名のPD患者の被殻に注入することを伴った英国での臨床試験を完了したところである。ギルら、2003(下記)。オープン試験であったが、これらの患者における著しい臨床的改善、ジスキネジアの減少、および、脳におけるドーパミン貯蔵の著しい増大が認められている。2年目の時点で、すべての患者はこの高用量によく耐えており、引き続き改善している。この方法に関する問題は、ポンプを取り付けることが複雑であること、GDNFを、毎月、再充填しなければならないこと、注入される脳領域が小さいこと、および、長期間の送達での感染の可能性があるということである。さらに、GDNFの費用が長期間では非常に大きくなり得る。
ウイルスベクターを使用するGDNF送達。GDNFのポンプ送達に対する1つの代替法では、この増殖因子を放出させるための(インビボでの)宿主細胞のウイルス改変を伴う。直接的な遺伝子治療は注目される考えである一方で、重大な実施上の問題および安全性の問題が依然として存在し、そのような問題には、
・インビボ送達後の遺伝子投薬を正確に制御することができないこと
・最近の報告からは非常に重要であり得る正確な遺伝子挿入部位を制御することができないこと
・変性中の細胞に目的とする遺伝子を強制的に発現させることは、疾患が進行するに従い様々な問題を生じさせるかもしれないこと
・生きたHIVまたは他のウイルスタイプを直接的に注入することに関する安全性の問題
が含まれる。
本発明の方法は、目的とする増殖因子を産生させるために細胞を培養皿(エクスビボ)において改変し、その後、これらの細胞を脳に移植することである。この方法に関して、
・細胞を移植前に遺伝子投薬(タンパク質放出)について選択することができる;
・正確な挿入部位を、クローン化された細胞から実証し、ガン遺伝子との干渉について調べることができる;
・健全なエクスビボ細胞がタンパク質送達をもたらし、宿主細胞を変性させない;
・ウイルス感染がインビトロで行われ、その後、ウイルスの非存在下での大規模な拡大培養が行われるので、生きたウイルスが宿主に移行する危険性が全くない。
エクスビボ遺伝子治療に関する1つの問題は、これまでは、使用されたエクスビボ細胞のタイプであった。自家の繊維芽細胞が理想的であるようであるが、様々な問題が存在する。細胞を、遺伝子発現、外来性因子および純度について試験するために、大規模で、費用のかかる培養作業を必要とするそれぞれの患者から個々に製造しなければならない。移植されたとき、繊維芽細胞は「瘢痕」様構造を形成して、構造部を満たすために遊走しないか、または宿主CNSにも組み込まれない。星状膠細胞は別の細胞供給源であり得る。しかしながら、拡大培養後、ヒト星状膠細胞は、移植後、その柔軟性の多くを失い、そしてまた、良好な組み込みパターンおよび遊走パターンを伴わない神経膠細胞瘢痕構造を形成することが知られている。
・インビボ送達後の遺伝子投薬を正確に制御することができないこと
・最近の報告からは非常に重要であり得る正確な遺伝子挿入部位を制御することができないこと
・変性中の細胞に目的とする遺伝子を強制的に発現させることは、疾患が進行するに従い様々な問題を生じさせるかもしれないこと
・生きたHIVまたは他のウイルスタイプを直接的に注入することに関する安全性の問題
が含まれる。
本発明の方法は、目的とする増殖因子を産生させるために細胞を培養皿(エクスビボ)において改変し、その後、これらの細胞を脳に移植することである。この方法に関して、
・細胞を移植前に遺伝子投薬(タンパク質放出)について選択することができる;
・正確な挿入部位を、クローン化された細胞から実証し、ガン遺伝子との干渉について調べることができる;
・健全なエクスビボ細胞がタンパク質送達をもたらし、宿主細胞を変性させない;
・ウイルス感染がインビトロで行われ、その後、ウイルスの非存在下での大規模な拡大培養が行われるので、生きたウイルスが宿主に移行する危険性が全くない。
エクスビボ遺伝子治療に関する1つの問題は、これまでは、使用されたエクスビボ細胞のタイプであった。自家の繊維芽細胞が理想的であるようであるが、様々な問題が存在する。細胞を、遺伝子発現、外来性因子および純度について試験するために、大規模で、費用のかかる培養作業を必要とするそれぞれの患者から個々に製造しなければならない。移植されたとき、繊維芽細胞は「瘢痕」様構造を形成して、構造部を満たすために遊走しないか、または宿主CNSにも組み込まれない。星状膠細胞は別の細胞供給源であり得る。しかしながら、拡大培養後、ヒト星状膠細胞は、移植後、その柔軟性の多くを失い、そしてまた、良好な組み込みパターンおよび遊走パターンを伴わない神経膠細胞瘢痕構造を形成することが知られている。
本発明者らは、下記の理由から、ヒト神経幹細胞がエクスビボ遺子治療のための理想的なビヒクルであり得ることを本発明で提案している。
・非常に多数の神経幹細胞を成長させることができる;
・神経幹細胞は、遊走および組み込みが可能である未成熟な星状膠細胞を生じさせる;
・神経幹細胞が培養で分裂するので、神経幹細胞にウイルスを容易に感染させることができる;
・これらの細胞を脳に移植することに成功した多数の文献が存在する。
ヒト神経幹細胞を遺伝子治療法を組み合わせることにより、基礎科学を臨床に移す実際の機会がもたらされる。この場合、細胞が、様々な治療用タンパク質に対するミニポンプとして使用される。
・非常に多数の神経幹細胞を成長させることができる;
・神経幹細胞は、遊走および組み込みが可能である未成熟な星状膠細胞を生じさせる;
・神経幹細胞が培養で分裂するので、神経幹細胞にウイルスを容易に感染させることができる;
・これらの細胞を脳に移植することに成功した多数の文献が存在する。
ヒト神経幹細胞を遺伝子治療法を組み合わせることにより、基礎科学を臨床に移す実際の機会がもたらされる。この場合、細胞が、様々な治療用タンパク質に対するミニポンプとして使用される。
好ましくは、本発明の方法は、GDNF遺伝子がウイルスシステムにおける誘導可能なプロモーターの制御下にあるベクターを作製することによって行われる。好ましくは、本発明者らが下記に開示するウイルス構築物が使用される。本発明者らの誘導可能な構築物は、以前に詳しく発表されたレンチウイルスシステムに基づいている(デグロンら、Hum.Gene.Ther.、11:179〜190、2000;これは参考として組み込まれる)。「マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1/tTA1システム」が参照されるとき、デグロンらおよび下記に記載されるプロモーターシステムが参照されている。当然のことではあるが、代わりの誘導可能なプロモーター(例えば、下記に記載されるプロモーターなど)を導入することによって、このシステムを改変することができる。
その後、ヒト神経幹細胞が、好ましくは下記の方法および材料に記載されるように、GDNFベクターで形質導入される。
その後、ヒト神経幹細胞が、好ましくは下記の方法および材料に記載されるように、GDNFベクターで形質導入される。
臨床への移行。hNSCに関する我々の知識の基礎は今や、臨床的応用を記載することができるところに達している。本発明の主要な特徴は、治療用タンパク質に対する置換ビヒクルおよび「ミニポンプ」の両方として作用することができる細胞を生じさせるために、遺伝子治療を幹細胞治療と組み合わせることである。このことは、様々な神経学的障害を治療することに対する新しい非常に強力な方法を表している。細胞が、上記に記載されたように作製され、PD患者の被殻に移植される。
PD患者は、典型的には、ドーパミンニューロンを経時的に中脳から局所解剖学的様式で失っている。最初に死亡する細胞は、PET走査法によって明らかにされるように被殻の尾側領域を神経支配する細胞である(ギルら、下記、2003)。本発明者らは、患者における被殻の尾側半分を、この領域に一様に分散されたおよそ4カ所の部位を使用して標的化することを考えている。ヒト試験のための定位固定法、PET技術および他の方法が、ギルら、Nature Med.、2003年3月31日、2003、12669033に詳しく記載されている。
誘導可能なプロモーターシステムが本発明において使用され得る方法が2つある。第1の方法は「オン」形式においてであり、この場合、患者へのドキシサイクリンの投与(これは血液脳関門を浸透する)により、GDNF遺伝子構築物が活性化され、移植された幹細胞からのGDNF放出が誘導される。GDNFが最初の患者集団において安全であることが見出された場合、患者へのドキシサイクリンの投与により、GDNF発現が停止される第2の類似する「オフ」システムが設計される。本発明者らは、GDNFの長期間の発現が毒性でなく、従って、GDNFの長期間の発現は、GDNF発現を維持するために、患者が継続してドキシサイクリンを服用することを要求しない「オフ」システムに有利であることを本発明者らの最初の臨床試験から予測している。
この場合、細胞が主の脳に組み込まれ、GDNFを放出する。GDNFは、周りのドーパミン繊維によって取り込まれ、脳幹の細胞体に輸送される。動物研究に基づいて、これにより、3つのことが行われるはずである:(i)ドーパミンニューロンの継続中の死が防止される;(ii)局所的な神経繊維の生長が誘導される;そして(iii)ドーパミン産生が上方制御される。まとめると、このことは、パーキンソン病の実際の「治療」を表し、さらに、ドーパミンニューロンのさらなる変性を防止する。
本発明者らは、幹細胞移植により、(1)増殖因子の構成的な放出および考えられる毒素(例えば、グルタミン酸など)の構成的な取り込みによる、GDNFに応答する細胞の喪失を伴うPDおよび他の疾患における非正常なニューロンおよび死に向かっているニューロンに対する栄養的および構造的な支援、そして(2)誘導可能な構築物によるGDNFの放出、がもたらされると考えられる。PDにおける細胞結果は3つに分けることができる:(1)終端からのドーパミン放出の直接的な調節によるドーパミン作動系の上方制御;(2)黒質における残存ドーパミンニューロンからのその場所でのドーパミン繊維の局所的な出芽;(3)黒質における細胞体へのGDNFの逆輸送による残存ドーパミンニューロンの長期間の保護。本発明者らは、他の疾患系(ALS、脳卒中、HD)において同様な応答を予想している。
PD患者は、典型的には、ドーパミンニューロンを経時的に中脳から局所解剖学的様式で失っている。最初に死亡する細胞は、PET走査法によって明らかにされるように被殻の尾側領域を神経支配する細胞である(ギルら、下記、2003)。本発明者らは、患者における被殻の尾側半分を、この領域に一様に分散されたおよそ4カ所の部位を使用して標的化することを考えている。ヒト試験のための定位固定法、PET技術および他の方法が、ギルら、Nature Med.、2003年3月31日、2003、12669033に詳しく記載されている。
誘導可能なプロモーターシステムが本発明において使用され得る方法が2つある。第1の方法は「オン」形式においてであり、この場合、患者へのドキシサイクリンの投与(これは血液脳関門を浸透する)により、GDNF遺伝子構築物が活性化され、移植された幹細胞からのGDNF放出が誘導される。GDNFが最初の患者集団において安全であることが見出された場合、患者へのドキシサイクリンの投与により、GDNF発現が停止される第2の類似する「オフ」システムが設計される。本発明者らは、GDNFの長期間の発現が毒性でなく、従って、GDNFの長期間の発現は、GDNF発現を維持するために、患者が継続してドキシサイクリンを服用することを要求しない「オフ」システムに有利であることを本発明者らの最初の臨床試験から予測している。
この場合、細胞が主の脳に組み込まれ、GDNFを放出する。GDNFは、周りのドーパミン繊維によって取り込まれ、脳幹の細胞体に輸送される。動物研究に基づいて、これにより、3つのことが行われるはずである:(i)ドーパミンニューロンの継続中の死が防止される;(ii)局所的な神経繊維の生長が誘導される;そして(iii)ドーパミン産生が上方制御される。まとめると、このことは、パーキンソン病の実際の「治療」を表し、さらに、ドーパミンニューロンのさらなる変性を防止する。
本発明者らは、幹細胞移植により、(1)増殖因子の構成的な放出および考えられる毒素(例えば、グルタミン酸など)の構成的な取り込みによる、GDNFに応答する細胞の喪失を伴うPDおよび他の疾患における非正常なニューロンおよび死に向かっているニューロンに対する栄養的および構造的な支援、そして(2)誘導可能な構築物によるGDNFの放出、がもたらされると考えられる。PDにおける細胞結果は3つに分けることができる:(1)終端からのドーパミン放出の直接的な調節によるドーパミン作動系の上方制御;(2)黒質における残存ドーパミンニューロンからのその場所でのドーパミン繊維の局所的な出芽;(3)黒質における細胞体へのGDNFの逆輸送による残存ドーパミンニューロンの長期間の保護。本発明者らは、他の疾患系(ALS、脳卒中、HD)において同様な応答を予想している。
他の神経学的疾患:PDは幹細胞遺伝子治療のための明らかな直接の目標であるが、本発明のこの方法は、GDNFに応答する細胞の喪失を伴う数多くの他の脳障害に適用することができる。これらのなかで、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病(HD)および脳卒中が、最も可能性のある目標である。GDNF転写物を他の増殖因子転写物(例えば、GDNFに対して、異なる作用ではあるが、相補的な作用を有し得る毛様体神経栄養因子(CNTF)および脳由来神経栄養因子(BDNF)など)で置き換えることは困難ではない。従って、hNSCの二重感染は、より複雑な障害を治療するために増殖因子のカクテルをもたらす。ハンチントン病(HD)、脳卒中および筋萎縮性側索硬化症(ALS)において死亡するニューロンはすべて、GDNF治療に応答することが示されている。しかしながら、GDNFを他の増殖因子と組み合わせることは、ある種の障害についてはより良好であり得ることもまた考えられる。例えば、CNTFは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)において死亡する運動ニューロンに対する強力な作用を有することが示されており、従って、GDNFと組み合わせることは非常に有益であり得る。
材料および方法
ウイルス構築物。1つの一般的な誘導可能なシステムでは、テトラサイクリンのトランス活性化因子(tTA)を駆動させる構成的プロモーターを伴う。ドキシサイクリン(DOX)の非存在下では、tTAは、標的遺伝子をその後で駆動させる最少プロモーターの上流に位置する誘導可能なプロモーター(tetO)に結合する(ゴッセンおよびブジャルド、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:5547〜5551、1992)。DOXはtTAと結合し、従って、遺伝子の転写を妨げる。別のシステムは、ドキシサイクリンの存在下で遺伝子の活性化を可能にする逆のtet調節型システムである。この場合、rtTAと呼ばれるtTAの変異型形態が発現される。rtTAは、ドキシサイクリンが存在するときにtetOおよび遺伝子発現を活性化するだけである(ゴッセンら、Science、268:1766〜1769、1995)。誘導可能な遺伝子発現のためのより近年の方法では、tTA−KRAB抑制システムが利用される(フロインドリーブら、J.Gene Med.、1:4〜12、1999)。このtet−onシステムでは、rtTAが活性なリプレッサーKRABに結合する。テトラサイクリン誘導可能なシステムのほかに、グルココルチコイドを伴う他の誘導可能なシステムを遺伝子調節のために使用することができる。例えば、昆虫ステロイドホルモンのエクジソン、および、活性化ドメインに融合されたエクジソン受容体により、哺乳動物細胞および遺伝子組換えマウスにおける誘導可能な遺伝子発現システムがもたらされている(ノら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93:3346〜3351、1996)。また、ミフェプリストン(RU486)、および活性化ドメインに融合されたヒトプロゲステロン受容体の変異体が、誘導可能な遺伝子発現のために使用されている(ワンら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:81806〜81884、1994)。
好ましくは、本発明者らの誘導可能なレンチウイルス構築物は、以前に詳しく記載された既に発表されている非誘導型システム(デグロンら、Hum.Gene.Ther.、11:179〜190、2000;これは参考として組み込まれる)に基づいており、図2に概略的に示される。このシステムでは、マウスのホスホグリセリン酸キナーゼ1(PGK)プロモーター(強い構成的プロモーター)により、lenti−tTA構築物におけるtTA1が駆動される。ウッドチャック肝炎ウイルス(WHV)の翻訳後シス作用調節エレメントが含まれ、これは、導入遺伝子の発現を著しく高めることが示されている(デグロンら、上記、2000)。ドキシサイクリンの非存在下では、tTA1が、目的とする遺伝子(この場合、indlenti−GDNF構築物におけるGDNF、またはindlenti−GFP構築物におけるGFP)を駆動させる最少プロモーターの上流に存在するtetOに結合する。DOXの存在下では、tTAが結合し、導入遺伝子を活性化させない。
当業者は、Genbankアクセション番号L19063および同L15306またはリンら、Science、260(5111):1130〜1132、1993)(これらはともに参考として本明細書中に組み込まれる)を参照してGDNF遺伝子配列を容易に作製することができる。
ウイルス構築物。1つの一般的な誘導可能なシステムでは、テトラサイクリンのトランス活性化因子(tTA)を駆動させる構成的プロモーターを伴う。ドキシサイクリン(DOX)の非存在下では、tTAは、標的遺伝子をその後で駆動させる最少プロモーターの上流に位置する誘導可能なプロモーター(tetO)に結合する(ゴッセンおよびブジャルド、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:5547〜5551、1992)。DOXはtTAと結合し、従って、遺伝子の転写を妨げる。別のシステムは、ドキシサイクリンの存在下で遺伝子の活性化を可能にする逆のtet調節型システムである。この場合、rtTAと呼ばれるtTAの変異型形態が発現される。rtTAは、ドキシサイクリンが存在するときにtetOおよび遺伝子発現を活性化するだけである(ゴッセンら、Science、268:1766〜1769、1995)。誘導可能な遺伝子発現のためのより近年の方法では、tTA−KRAB抑制システムが利用される(フロインドリーブら、J.Gene Med.、1:4〜12、1999)。このtet−onシステムでは、rtTAが活性なリプレッサーKRABに結合する。テトラサイクリン誘導可能なシステムのほかに、グルココルチコイドを伴う他の誘導可能なシステムを遺伝子調節のために使用することができる。例えば、昆虫ステロイドホルモンのエクジソン、および、活性化ドメインに融合されたエクジソン受容体により、哺乳動物細胞および遺伝子組換えマウスにおける誘導可能な遺伝子発現システムがもたらされている(ノら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93:3346〜3351、1996)。また、ミフェプリストン(RU486)、および活性化ドメインに融合されたヒトプロゲステロン受容体の変異体が、誘導可能な遺伝子発現のために使用されている(ワンら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:81806〜81884、1994)。
好ましくは、本発明者らの誘導可能なレンチウイルス構築物は、以前に詳しく記載された既に発表されている非誘導型システム(デグロンら、Hum.Gene.Ther.、11:179〜190、2000;これは参考として組み込まれる)に基づいており、図2に概略的に示される。このシステムでは、マウスのホスホグリセリン酸キナーゼ1(PGK)プロモーター(強い構成的プロモーター)により、lenti−tTA構築物におけるtTA1が駆動される。ウッドチャック肝炎ウイルス(WHV)の翻訳後シス作用調節エレメントが含まれ、これは、導入遺伝子の発現を著しく高めることが示されている(デグロンら、上記、2000)。ドキシサイクリンの非存在下では、tTA1が、目的とする遺伝子(この場合、indlenti−GDNF構築物におけるGDNF、またはindlenti−GFP構築物におけるGFP)を駆動させる最少プロモーターの上流に存在するtetOに結合する。DOXの存在下では、tTAが結合し、導入遺伝子を活性化させない。
当業者は、Genbankアクセション番号L19063および同L15306またはリンら、Science、260(5111):1130〜1132、1993)(これらはともに参考として本明細書中に組み込まれる)を参照してGDNF遺伝子配列を容易に作製することができる。
細胞成長およびレンチウイルス感染。ヒト神経始原体細胞は、ペニシリン/ストレプトマイシン(1%)、N2(1%)およびEGF(20ng/ml)が補充されたDMEM/ハムF12においてニューロスフェアとして維持される。ニューロスフェアは、図1に概略されるように、また、以前の記載(スベンドセンら、J.Neuro.Meth.、85:141〜153、1998)のように10日毎に切り刻まれる。レンチウイルス粒子が、1%ウシ胎児血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝化生理的食塩水に懸濁された。レンチウイルス感染は、スフェア体あたり25ngのindlenti−GFPまたはindlenti−GDNFおよび75ngのlenti−tTAを用いて6時間であった。
免疫細胞化学。indlenti−GFPまたはindlenti−GDNFを感染させたニューロスフェアを、ACCUTASEを使用して解離させ、ポリ−L−リシン(0.01%)およびラミニン(0.001%)で被覆されたガラス製カバーガラスに載せた。細胞を、B27分化培地において7日間、カバーガラスあたり30,000個で置いた。4%パラホルムアルデヒドによる20分間の固定、およびリン酸塩緩衝化生理的食塩水による洗浄の後、細胞を、fitcコンジュゲート化二次抗体(ヘキスト)を用いて、ネスチン(ウサギ、ケミコン、1:200)、β−チュブリン(マウス、シグマ、1:6000)、GFAP(ウサギ、ダコ、1:3000)またはGDNF(ヤギ、R&Dシステムズ、1:2000)について染色した。
免疫細胞化学。indlenti−GFPまたはindlenti−GDNFを感染させたニューロスフェアを、ACCUTASEを使用して解離させ、ポリ−L−リシン(0.01%)およびラミニン(0.001%)で被覆されたガラス製カバーガラスに載せた。細胞を、B27分化培地において7日間、カバーガラスあたり30,000個で置いた。4%パラホルムアルデヒドによる20分間の固定、およびリン酸塩緩衝化生理的食塩水による洗浄の後、細胞を、fitcコンジュゲート化二次抗体(ヘキスト)を用いて、ネスチン(ウサギ、ケミコン、1:200)、β−チュブリン(マウス、シグマ、1:6000)、GFAP(ウサギ、ダコ、1:3000)またはGDNF(ヤギ、R&Dシステムズ、1:2000)について染色した。
GFP調節。indlenti−GFP感染の後、代表的なニューロスフェアにおけるGFP発現が蛍光写真によって明らかにされ、位相差写真が同時に撮影された。このスフェア体は、その後、ドキシサイクリン(100ng/ml)を含む培地において48時間培養され、再び蛍光および位相差の両方のもとで写真撮影された。ドキシサイクリンが培地から48時間にわたって除かれた。このウォッシュアウトの後、写真が再び蛍光および位相差の両方のもとで撮影された。
GDNFの定量および調節。indlenti−GDNF感染の後、GDNFのレベルおよび調節が評価された。ニューロスフェア(n=3)を、ACCUTASEを用いて個々に解離し、2つのウエルに二等分した。一方のウエルはB27分化培地で維持され、もう一方のウエルは、ドキシサイクリン(1000ng/ml)を含むB27分化培地で維持された。6つのウエル(3つのニューロスフェアがDOX非含有培地およびDOX含有培地に分けられた)から、1mlの上清が10日間にわたって2日毎に集められた。DOX含有置床培地またはDOX非含有置床培地が48時間毎に補充され、1mlのサンプルはその後の分析のために−20℃で保存された。GDNFは、サンプリングされた培地およびindlenti−GFP感染ニューロスフェアの培地において、製造者の説明書に従ってGDNF ELISAキット(プロメガ)を使用して測定された。それぞれの採取日について、本発明者らは、DOX非添加群におけるGDNFレベルの百分率として、DOX添加群におけるGDNFレベルを報告する。解離および置床の後2日目での採取について、本発明者らは、DOX添加およびDOX非添加に分けられたそれぞれの個々のスフェア体に対するGDNFレベルを報告する。
GDNFの定量および調節。indlenti−GDNF感染の後、GDNFのレベルおよび調節が評価された。ニューロスフェア(n=3)を、ACCUTASEを用いて個々に解離し、2つのウエルに二等分した。一方のウエルはB27分化培地で維持され、もう一方のウエルは、ドキシサイクリン(1000ng/ml)を含むB27分化培地で維持された。6つのウエル(3つのニューロスフェアがDOX非含有培地およびDOX含有培地に分けられた)から、1mlの上清が10日間にわたって2日毎に集められた。DOX含有置床培地またはDOX非含有置床培地が48時間毎に補充され、1mlのサンプルはその後の分析のために−20℃で保存された。GDNFは、サンプリングされた培地およびindlenti−GFP感染ニューロスフェアの培地において、製造者の説明書に従ってGDNF ELISAキット(プロメガ)を使用して測定された。それぞれの採取日について、本発明者らは、DOX非添加群におけるGDNFレベルの百分率として、DOX添加群におけるGDNFレベルを報告する。解離および置床の後2日目での採取について、本発明者らは、DOX添加およびDOX非添加に分けられたそれぞれの個々のスフェア体に対するGDNFレベルを報告する。
GDNFの機能的作用。初代腹側中脳をSprague−DawleyラットのE14胚から切除し、ポリリシンおよびラミニンで被覆されたカバーガラスに載せた。細胞を、基本N2(1%)培地(n=3)、野生型ニューロスフェアから得られた上清(n=3)、または、indlenti−GDNF感染ニューロスフェアから得られた上清(n=3)のいずれかにおいて7日間培養した。4%パラホルムアルデヒドによる20分間の固定、およびリン酸塩緩衝化生理的食塩水による洗浄の後、細胞培養物を、fitcコンジュゲート化二次抗体(ヘキスト)を用いて、チロシンヒドロキシラーゼ(マウス、ケミコン、1:200)について染色した。細胞を蛍光顕微鏡で調べ、群あたり3つのカバーガラスのそれぞれからの4つの視野を分析した。蛍光デジタル画像を、SPOTカメラ画像分析システムを使用するデジタルビデオカメラを用いて得た。TH陽性細胞の数を、12個の無作為に選択された視野においてTHについて免疫反応性の細胞を計数することによって定量した。神経突起の長さおよび細胞体のサイズを、12個の無作為に選択された視野においてTH陽性細胞について、μmおよび半径をそれぞれ測定するためにメタモルフ(metamorph)を使用することによって定量した。
結果
レンチウイルス感染。ニューロスフェア内の細胞はレンチウイルス構築物によって効率よく感染させられた。indlenti−GFP構築物は、始原体細胞、ニューロンおよび星状膠細胞を含む、ニューロスフェア内のすべての細胞タイプに感染することができた(図3A〜図3C)。indlenti−GDNF構築物もまた、ニューロスフェア内の細胞に感染することができた(図3D)。両方のレンチウイルス構築物の場合、感染は細胞の健康状態に影響しなかった。このことは、非感染細胞と比較したとき、感染細胞の正常な細胞形態学によって示された。ニューロスフェア内の細胞は、GFPおよびGDNFを感染後少なくとも数ヶ月間にわたって発現し続けた。
レンチウイルス感染。ニューロスフェア内の細胞はレンチウイルス構築物によって効率よく感染させられた。indlenti−GFP構築物は、始原体細胞、ニューロンおよび星状膠細胞を含む、ニューロスフェア内のすべての細胞タイプに感染することができた(図3A〜図3C)。indlenti−GDNF構築物もまた、ニューロスフェア内の細胞に感染することができた(図3D)。両方のレンチウイルス構築物の場合、感染は細胞の健康状態に影響しなかった。このことは、非感染細胞と比較したとき、感染細胞の正常な細胞形態学によって示された。ニューロスフェア内の細胞は、GFPおよびGDNFを感染後少なくとも数ヶ月間にわたって発現し続けた。
GFPの調節。GFPは、GDNFとは異なり、生細胞で見ることができるタンパク質である。従って、本発明者らは、最初に、ヒト細胞のレンチウイルス感染および遺伝子発現の調節の本発明者らの方法を最適化するためにindlenti−GFP構築物を使用した。ニューロスフェアにindlenti−GFP構築物およびlenti−tTA構築物を同時感染させると、大きい割合のGFP発現細胞をもたらした(図4D)。GFP発現ニューロスフェアをドキシサイクリンの存在下で48時間成長させたとき、GFPはほぼ完全に停止させられた(図4E)。GFPのこの厳格な調節をさらに特徴づけるために、ドキシサイクリンを48時間除いた。この簡単なウォッシュアウトの後、GFPの活発な発現が再開された(図4F)。正常な細胞形態学をレンチウイルス感染の後に相補することにより、GFP発現ニューロスフェアの位相差写真は、感染が細胞の健康状態に影響しなかったことを示しており、このことは、長期にわたるニューロスフェアの継続した正常な成長、および、典型的な健全な外見によって明らかにされる(図4A〜図4C)。
GDNFの定量および調節。可視的なGFPレポーターを使用してヒト神経細胞のレンチウイルス感染および調節が最適化されたので、本発明者らは、次に、ニューロスフェアにindlenti−GDNF構築物およびlenti−tTA構築物を同時感染させた。本発明者らは、indlenti−GDNFを有するニューロスフェアが、1つのニューロスフェアについては24時間後に6ng〜23ngの範囲にある高い濃度で、GDNFを培地に放出することを見出した(図5A)。lenti−GFPを感染させたニューロスフェアは、高感度な検出方法を用いた場合でさえ、測定のために十分な高いレベルでGDNFを放出しなかった(図5A)。個々のニューロスフェアから放出されたGDNFレベルの範囲は、最大の遺伝子発現を有する個々のニューロスフェアを選択および拡大培養することができる可能性を示唆している。興味深いことに、GDNF調節の程度は、GDNFレベルが異なるにもかかわらず、ニューロスフェア間で類似していた。2日間のDOX処理の後、GDNFレベルの減少範囲は、DOXを伴わない細胞と比較した場合、56%〜68%であり、減少の平均値は64%であった。GDNFレベルは2日間のドキシサイクリン処理の後に低下し、GDNFタンパク質の長い半減期のために時間依存的な様式で低下し続けた。10日間のDOX処理によって、DOXを伴わない細胞と比較して、GDNFレベルのほぼ90%の減少が認められた(図5B)。
GDNFは機能的作用を有する。indlenti−GDNFを感染させたニューロスフェアは高レベルのGDNFを放出することが示されたので、本発明者らは次に、ドーパミンニューロンに対するこれらのニューロスフェアの機能的作用を明らかにした。初代ドーパミンニューロンを、基本培地、野生型ヒトニューロスフェアから得られた上清、または、indlenti−GDNF感染ニューロスフェアから得られた上清のいずれかにおいて培養した。チロシンヒドロキシラーゼ(TH)が、ドーパミン作動性ニューロンに対するマーカーとして使用される。TH陽性細胞の数は、培養物が、野生型ヒトニューロスフェアから得られた上清またはindlenti−GDNF感染ニューロスフェアから得られた上清において成長させられたとき、基本培地において成長させられた培養物と比較して、著しく増大していた(p<0.0001)(図6A)。このことは、GDNFによってさらに増大させられない細胞数に対する馴化培地の全体的な作用を示唆している。しかしながら、indlenti−GDNF感染ニューロスフェアは、培養されたドーパミンニューロンの神経突起の長さに著しく影響を及ぼしている(図6B)。indlenti−GDNF上清において成長させられたドーパミンニューロン培養物は、基礎培地および野生型上清の両方と比較して、神経突起の生長を著しく増大させていた(p<0.0001)。このことはindlenti−GDNF感染ニューロスフェアの機能的な作用を明らかにしている。野生型上清において成長させられた培養物の神経突起の長さは、indlenti−GDNF上清において成長させられた培養物の神経突起の長さよりもはるかに小さく、しかしながら、長さは、基本培地における培養物と比較して増大している(p<0.0001)。再度ではあるが、このことは馴化培地の作用のいくつかを明らかにしている。さらに、indlenti−GDNF感染ニューロスフェアは、培養されたドーパミンニューロンの細胞体サイズに著しい影響を及ぼしている(図6C)。indlenti−GDNF上清において成長させられたドーパミンニューロン培養物は、基礎培地および野生型上清の両方と比較した場合、著しく増大した細胞体サイズを有していた(p<0.0001)。再度ではあるが、このことは、indlenti−GDNF感染ニューロスフェアの機能的な作用を明らかにしている。野生型上清において成長させられたニューロンの細胞体サイズは、基本培地における培養物と比較して増大しておらず、このことは馴化培地の作用を示唆していない。indlenti−GDNF感染ニューロスフェアの機能的な作用は、野生型ニューロスフェアと比較した場合、図6Dおよび図6Eにおけるドーパミンニューロンの増大した神経突起長さおよび細胞体サイズによって明瞭に明らかにされる。indlenti−GDNF感染ニューロスフェアから放出されたGDNFが培養ドーパミンニューロンに対して強力な作用を有するという事実は、これらの細胞がインビトロで生理学的関連レベルでGDNFを放出していることを明らかにしている。
Claims (17)
- GDNFに応答する細胞の喪失を伴う脳障害を治療する方法であって、
(a)ヒト神経幹細胞を神経膠細胞由来神経栄養因子(GDNF)で形質導入するステップであって、GDNF遺伝子は誘導可能なプロモーターシステムの制御下にあるステップ、および
(b)形質導入された細胞を、GDNFが発現させられる患者の脳に移植するステップ
を含む方法。 - 患者のGDNF応答性ニューロン系が上方制御される、請求項1に記載の方法。
- 前記障害がパーキンソン病である、請求項1に記載の方法。
- GDNF応答性ニューロン系がドーパミン作動性の系である、請求項3に記載の方法。
- 前記障害が、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病および脳卒中からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 誘導可能なプロモーターシステムがマウスのホスホグリセリン酸キナーゼ1/tTA1システムである、請求項1に記載の方法。
- ヒト神経細胞がニューロスフェアとして成長させられる、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が死後胎児脳組織に由来する、請求項1に記載の方法。
- 移植された細胞が遊走し、患者の脳に組み込まれる、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が脳の被殻に移植される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が脳の被殻の尾側半分に移植される、請求項10に記載の方法。
- 形質導入された細胞はさらなる異種増殖因子を含む、請求項1に記載の方法。
- 誘導可能なプロモーターと、GDNFをコードする配列とを含む、請求項1に記載される方法に有用なウイルスベクター。
- レンチウイルス型である、請求項13に記載のベクター。
- tTA1に機能的に接続されたマウスホスホグリセリン酸キナーゼ1プロモーターと、ウッドチャック肝炎ウイルスの翻訳後シス作用調節エレメントとを含む、請求項14に記載のベクター。
- ドキシサイクリンの投与が、GDNFの発現を活性化しうる、請求項15に記載のベクター。
- ドキシサイクリンの投与が、GDNFの発現を不活性化しうる、請求項15に記載のベクター。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US37558702P | 2002-04-25 | 2002-04-25 | |
PCT/US2003/012854 WO2003090689A2 (en) | 2002-04-25 | 2003-04-25 | Neurodegenerative disorder treatment using gdnf secreting neural cells |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005526838A true JP2005526838A (ja) | 2005-09-08 |
Family
ID=29270667
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003587328A Pending JP2005526838A (ja) | 2002-04-25 | 2003-04-25 | パーキンソン病および他の神経変性疾患を治療するためのgdnf分泌ヒト神経幹細胞の使用 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20030228295A1 (ja) |
JP (1) | JP2005526838A (ja) |
AU (1) | AU2003239176A1 (ja) |
CA (1) | CA2484223A1 (ja) |
WO (1) | WO2003090689A2 (ja) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7560276B2 (en) | 2003-06-27 | 2009-07-14 | Ethicon, Incorporated | Soft tissue repair and regeneration using postpartum-derived cells |
US8946151B2 (en) | 2003-02-24 | 2015-02-03 | Northern Bristol N.H.S. Trust Frenchay Hospital | Method of treating Parkinson's disease in humans by convection-enhanced infusion of glial cell-line derived neurotrophic factor to the putamen |
US9572840B2 (en) | 2003-06-27 | 2017-02-21 | DePuy Synthes Products, Inc. | Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells |
US8491883B2 (en) | 2003-06-27 | 2013-07-23 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells |
US8790637B2 (en) | 2003-06-27 | 2014-07-29 | DePuy Synthes Products, LLC | Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells |
US9592258B2 (en) | 2003-06-27 | 2017-03-14 | DePuy Synthes Products, Inc. | Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells |
US7875272B2 (en) | 2003-06-27 | 2011-01-25 | Ethicon, Incorporated | Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells |
US8518390B2 (en) | 2003-06-27 | 2013-08-27 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells |
US20070269412A1 (en) | 2003-12-02 | 2007-11-22 | Celavie Biosciences, Llc | Pluripotent cells |
PL1835924T3 (pl) | 2004-12-23 | 2014-01-31 | Ethicon Incorporated | Leczenie choroby Parkinsona i zaburzeń związanych z tą chorobą z użyciem komórek uzyskiwanych po porodzie |
ES2621847T3 (es) | 2004-12-23 | 2017-07-05 | DePuy Synthes Products, Inc. | Células posparto derivadas de tejido de cordón umbilical, y métodos de elaboración y uso de las mismas |
EP1940471A1 (en) * | 2005-10-28 | 2008-07-09 | NsGene A/S | IMPLANTABLE BIOCOMPATIBLE IMMtTNOISOLATORY VEHICLE FOR DELIVERY OF GDNF |
PL1971681T3 (pl) | 2005-12-16 | 2018-01-31 | Depuy Synthes Products Inc | Kompozycje oraz sposoby do hamowania niepożądanej odpowiedzi immunologicznej w przypadku transplantacji z brakiem zgodności tkankowej |
US9125906B2 (en) | 2005-12-28 | 2015-09-08 | DePuy Synthes Products, Inc. | Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells |
JP5323845B2 (ja) | 2007-10-05 | 2013-10-23 | エシコン・インコーポレイテッド | ヒト臍帯組織由来細胞を用いた腎組織の修復および再建 |
EP2067858A1 (en) | 2007-12-07 | 2009-06-10 | Universidad de Sevilla | Animal models for neurodegenerative diseases |
US8236538B2 (en) | 2007-12-20 | 2012-08-07 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Methods for sterilizing materials containing biologically active agents |
US10179900B2 (en) | 2008-12-19 | 2019-01-15 | DePuy Synthes Products, Inc. | Conditioned media and methods of making a conditioned media |
WO2010071864A1 (en) | 2008-12-19 | 2010-06-24 | Ethicon, Incorporated | Treatment of lung and pulmonary diseases and disorders |
US20100209399A1 (en) * | 2009-02-13 | 2010-08-19 | Celavie Biosciences, Llc | Brain-derived stem cells for repair of musculoskeletal system in vertebrate subjects |
EP2411504B1 (en) | 2009-03-26 | 2017-05-10 | DePuy Synthes Products, Inc. | Human umbilical cord tissue cells as therapy for alzheimer's disease |
SG11201403465PA (en) | 2011-12-23 | 2014-10-30 | Atrm Llc | Detection of human umbilical cord tissue-derived cells |
EP3408396A4 (en) | 2016-01-26 | 2019-10-09 | Cedars-Sinai Medical Center | IN VIVO DOUBLE RECOMBINASE MEDIATION (DRMCE) CASSETTE EXCHANGE SYSTEMS AND METHODS AND MODELS OF ASSOCIATED DISEASES |
KR20200132957A (ko) * | 2018-03-16 | 2020-11-25 | 세다르스-신나이 메디칼 센터 | 신경영양 인자의 유도성 발현을 위한 방법 및 조성물 |
CN115089613A (zh) * | 2022-07-25 | 2022-09-23 | 朗姿赛尔生物科技(广州)有限公司 | 一种神经干细胞移植在神经退行性疾病中的应用 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5650148A (en) * | 1988-12-15 | 1997-07-22 | The Regents Of The University Of California | Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage of the central nervous system |
CA2119463C (en) * | 1991-09-20 | 2003-09-16 | Leu-Fen H. Lin | Glial cell line-derived neutrophic factor |
US5843780A (en) * | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US5753505A (en) * | 1995-07-06 | 1998-05-19 | Emory University | Neuronal progenitor cells and uses thereof |
US5965440A (en) * | 1995-12-07 | 1999-10-12 | The General Hospital Corporation | Controlled gene product delivery from a regulatable retroviral vector |
US5958767A (en) * | 1998-08-14 | 1999-09-28 | The Children's Medical Center Corp. | Engraftable human neural stem cells |
US6468794B1 (en) * | 1999-02-12 | 2002-10-22 | Stemcells, Inc. | Enriched central nervous system stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for such populations |
US6800281B2 (en) * | 2000-11-09 | 2004-10-05 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Lentiviral-mediated growth factor gene therapy for neurodegenerative diseases |
-
2003
- 2003-04-25 JP JP2003587328A patent/JP2005526838A/ja active Pending
- 2003-04-25 CA CA002484223A patent/CA2484223A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-25 US US10/423,710 patent/US20030228295A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-25 WO PCT/US2003/012854 patent/WO2003090689A2/en not_active Application Discontinuation
- 2003-04-25 AU AU2003239176A patent/AU2003239176A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2003239176A1 (en) | 2003-11-10 |
WO2003090689A3 (en) | 2005-04-07 |
AU2003239176A8 (en) | 2003-11-10 |
US20030228295A1 (en) | 2003-12-11 |
CA2484223A1 (en) | 2003-11-06 |
WO2003090689A2 (en) | 2003-11-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2005526838A (ja) | パーキンソン病および他の神経変性疾患を治療するためのgdnf分泌ヒト神経幹細胞の使用 | |
US6812027B2 (en) | Discovery, localization, harvest, and propagation of an FGF2 and BDNF-responsive population of neural and neuronal progenitor cells in the adult human forebrain | |
Ohori et al. | Growth factor treatment and genetic manipulation stimulate neurogenesis and oligodendrogenesis by endogenous neural progenitors in the injured adult spinal cord | |
JP3583778B2 (ja) | 神経幹細胞の遺伝子修飾 | |
Pincus et al. | Neural stem and progenitor cells: a strategy for gene therapy and brain repair | |
Kumagai et al. | Genetically modified mesenchymal stem cells (MSCs) promote axonal regeneration and prevent hypersensitivity after spinal cord injury | |
Arias‐Carrion et al. | Neurogenesis in the subventricular zone following transcranial magnetic field stimulation and nigrostriatal lesions | |
AU716811B2 (en) | Regulation of neural stem cell proliferation | |
Isacson et al. | Future of cell and gene therapies for Parkinson's disease | |
JP2002530351A (ja) | 神経幹細胞もしくは始原細胞に影響する症状を処置するための医療製品および方法 | |
Rubio et al. | BDNF gene transfer to the mammalian brain using CNS-derived neural precursors | |
KR20010022641A (ko) | 신경학적 결함의 치료방법 | |
Lisovoski et al. | Phenotypic alteration of astrocytes induced by ciliary neurotrophic factor in the intact adult brain, as revealed by adenovirus-mediated gene transfer | |
Cushnie et al. | Using rAAV2-retro in rhesus macaques: promise and caveats for circuit manipulation | |
Kim et al. | In vitro generation of mature midbrain-type dopamine neurons by adjusting exogenous Nurr1 and Foxa2 expressions to their physiologic patterns | |
Makri et al. | Transplantation of embryonic neural stem/precursor cells overexpressing BM88/Cend1 enhances the generation of neuronal cells in the injured mouse cortex | |
Jørgensen et al. | Lentiviral delivery of meteorin protects striatal neurons against excitotoxicity and reverses motor deficits in the quinolinic acid rat model | |
Winkler et al. | Continuous exposure to glial cell line-derived neurotrophic factor to mature dopaminergic transplants impairs the graft’s ability to improve spontaneous motor behavior in parkinsonian rats | |
Galante et al. | Enhanced proliferation of oligodendrocyte progenitor cells following retrovirus mediated Achaete-scute complex-like 1 overexpression in the postnatal cerebral cortex in vivo | |
Kretz et al. | A novel primary culture technique for adult retina allows for evaluation of CNS axon regeneration in rodents | |
During et al. | Targets for gene therapy of Parkinson's disease: growth factors, signal transduction, and promoters | |
Ji et al. | Functional reconstruction of the basal ganglia neural circuit by human striatal neurons in hypoxic–ischaemic injured brain | |
WO1999055838A1 (en) | Compositions and methods for the characterization and transplantation of mammalian retinal stem cells | |
Cao et al. | Virally mediated knock-down of NR2 subunits ipsilateral to the deprived eye blocks ocular dominance plasticity | |
Galante et al. | King’s Research Portal |