ES2621610T3

ES2621610T3 - Tratamiento de la degeneración de discos intervertebrales utilizando células derivadas de tejido cordón umbilical humano

Info

Publication number: ES2621610T3
Application number: ES08867441.1T
Authority: ES
Inventors: Laura J. Brown; Anna Gosiewska; Anthony J. Kihm; Brian C. Kramer
Original assignee: DePuy Synthes Products Inc
Current assignee: DePuy Synthes Products Inc
Priority date: 2007-12-27
Filing date: 2008-12-17
Publication date: 2017-07-04
Anticipated expiration: 2028-12-17
Also published as: US20090169597A1; PL2237789T3; BRPI0821489A2; UA99167C2; EP2237789B1; EP2237789A1; AU2008343203B2; AU2008343203A1; WO2009085860A1

Abstract

Las celulas obtenidas a partir de tejido humano del cordon umbilical, en el que el tejido del cordon umbilical esta sustancialmente libre de sangre, donde las celulas: se pueden obtener por digestion enzimatica de tejido del cordon umbilical humano que esta sustancialmente libre de sangre con una metaloproteasa, una proteasa neutra y una proteasa mucolitica; son capaces de auto-renovacion y expansion en cultivo; tienen el potencial de diferenciarse; y tienen las siguientes caracteristicas: a) expresar CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFR-alfa, PD-L2, y HLA-A, B, C como se detecta por la citometria de flujo; b) no expresar CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD141, CD178, HLA-G, CD117 y HLA-DR, DP, DQ como se ha detectado por citometria de flujo; c) no expresar la telomerasa; y d) expresar, con relacion a un fibroblasto humano, celulas madre mesenquimales, o cresta iliaca de celulas de medula osea, aumento de los niveles de interleucina 8, reticulon 1, quimiocinas (CXC motivo) ligando 1 o quimiocinas (CXC motivo) ligando 3, para uso en el tratamiento de una enfermedad o condicion relacionada con la degeneracion del disco intervertebral mediante la administracion de las celulas en el nucleo pulposo o anillo fibroso del disco intervertebral

Description

CAMPO DE LA INVENCiÓN

[0001] La invenciÓfl se refiere en general al campo de la terapéutica basada en células. En algunos aspectos, la invención se refiere al uso de células derivadas de tejido del cordón umbilical para tratar una enfermedad o condición relacionada con la degeneración del disco intervertebral

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Varias publicaciones, incluyendo patentes, solicitudes publicadas, articulas técnicos y artículos académicos se citan a lo largo de la memoria descriptiva.

[0003] El dolor de espalda es una de las discapacidades más comunes, y causa malestar físico y emocional importante en los individuos afectados. El deterioro de la estructura del disco intervertebral (DIV) es una de las principales causas de dolor lumbar. La DIV se forma a partir de un anillo fibroso exlemo fibroso que rodea un núcleo pulposo gelatinoso más blando. Las fibras del anillo fibroso se adhieren a las placas terminales de los cuerpos vertebrales de la médula espinal y atrapan el núcleo pulposo, creando un entamo isobárico. Bajo una carga axial, el núcleo pulposo comprime y transfiere radialmente esa carga al anillo fibroso. La naturaleza laminada del ani llo fibroso proporciona una alta resistencia a la tracción y por lo tanto permite que se expanda radialmente en respuesta a esta carga transferida.

[0004] En una DIV sana, las células dentro de la forma del núcleo pulposo sólo alrededor del uno por ciento del tejido del disco en volumen. Estas células producen una matriz exlracelular (MEC) que contiene un alto porcentaje de proteoglicallOs. Los proteoglicanos contienen grupos funcionales sulfatados que retienen el agua, proporcionando de este modo el núcleo pulposo con sus cua lidades de amortiguación. Las células del núcleo pulposo también pueden secretar pequeñas cantidades de citocinas y metaloproteinasas de matriz (MPMs), que ayudan a regular el metabolismo de las células del núcleo pulposo

[0005] En algunos casos de la enfermedad de DIV, la degeneración gradual de la DIV es causada por las inestabilidades mecánicas en otras porciones de la columna vertebral. En estos casos, las cargas y presiones aumentadas sobre el núcleo pulposo hacen que las células dentro del disco (o macrófagos invasores) emitan cantidades mayores de lo normal de las citoquinas mencionadas anteriormente. En otros casos de enfermedad DIV, factores genéticos o apoptosis pueden causar una disminución en el número de células de disco y/o una liberación de cantidades tóxicas de citocinas y MPMs. En algunos casos, la acción de bombeo del disco puede funcionar mal (debido, por ejemplo, a una disminución de la concentración de proteoglicano dentro del núcleo pulposo), retrasando así el flujo de nutrientes en el disco, asi como el flujo de productos de desecho a partir del disco. Esta capacidad reducida para proporcionar nutrientes a las células y eliminar los residuos puede resultar en la disminución de la viabilidad celular y el metabolismo, lo que resulta en una mayor degradación de la MEC junto con la acumulación de altos niveles de toxinas que pueden causar irritación nerviosa y dolor.

[0006] A medida que la degeneración de DIV progresa, los niveles tóxicos de citoquinas y MPMs presentes en el núcleo pulposo empiezan a degradar el MEC. En particular, las MPM (mediadas por citoquinas) comienzan a escindir las porciones de retención de agua de los proteoglicanos, reduciendo así sus capacidades de retención de agua. Esta degradación conduce a un núcleo pulposo menos flexible, que cambia el patrón de carga dentro del disco, y a su vez puede conducir a la delaminación del ani llo fibroso. Estos cambios causan más inestabilidad mecánica, lo que puede hacer que las células emitan aún más citoquinas y conducir a una mayor regulación de las MPM. A medida que esta cascada destructiva continúa y la degeneración de DIV progresa, el disco comienza a protruir ("un disco hemiado"), y después se rompe, causando que el núcleo pulposo entre en contacto con la médula espinal y produzca dolor.

[0007] Actualmente, las terapias principales para degeneración de DIV son intervenciones quirúrgicas en las que degeneraron discos se escinden o se fusionan con los discos vecinos. Las terapias quirúrgicas tienen como objetivo aliviar el dolor y otros síntomas de la degeneración de DIV, pero no hacen nada para reparar o regenerar las DIV enfermos. Un enfoque para el tratamiento de las células y tejidos DIV degeneradas es el uso de terapias basadas en células, en las que se administran células vivas para reparar, reemplazar y/o remodelar tejidos enfermos. Varios estudios recientes han investigado el uso de terapias basadas en células para las condiciones de DIV degenerativas Por ejemplo, la patente de EE.UU. Los números 6,352,557 ("Ferree") y 6,340,369 CFerree 11") enseñan a cosechar células DIV vivas de un paciente, cultivando las células y trasplantándolas a una DIV afectada. Del mismo modo, Alini, Eur. Spine J., 2002: 11 (Supp.2): S215-220, describe el aislamiento y cultivo de células del núcleo pulposo, incrustar las células en una biomatriz e inyectar las células incrustadas en pacientes para restaurar la funcionalidad a las DIV afectadas. Estos enfoques, aunque prometedores, han mostrado una eficacia limitada en la reparación de

las DIVs degeneradas y sufren de complicaciones causadas por la incompatibilidad inmunológica entre los donantes de células y los receptores.

[0008] Un enfoque terapéutico alternativo basado en células es el uso de células madre, que tienen la capacidad de dividirse y diferenciarse en células que comprenden los tejidos enfermos. El trasplante de células madre puede utilizarse como una herramienta clinica para reconstituir un tejido diana, restaurando de este modo la funciona lidad fisiológica y anatómica. La aplicaciórJ de la tecnología de células madre es muy amplia, incluyendo la ingeniería de tejidos, administración de terapia génica, y la terapéutica de células, es decir, administración de agentes bioterapéuticos a un lugar de destino a través de células vivas suministradas exógenamente o componentes celulares que producen o contienen aquellos agentes (para una revisión, véase Tresco, PA et al., Advanced Drug Delivery Revie'NS, 2000; 42: 2-37). La identificación de células madre ha estimulado la investigación dirigida a la generación selectiva de tipos específicos de células para la medicina regenerativa. Un obstáculo para la realización del potencial terapéutico de la tecnología de células madre ha sido la dificultad de obtener un número suficiente de células madre. El tejido embrionario o fetal es una fuente de células madre. Se han aislado células madre y progenitoras embrionarias de varias especies de mamíferos, incluyendo seres humanos, y se han mostrado varios tipos de células de este tipo capaces de auto-renovaciórJ y expansión, así como diferenciación en un número de diferentes linajes celulares. Sin embargo, la derivación de células madre de fuentes embrionarias y fetales ha planteado muchos problemas éticos y morales que han impedido el desarrollo de la terapia con células madre embrionarias

[0009] Existe por tanto una necesidad en la técnica para agentes terapéuticos basados en células madre que eviten los problemas que rodean las células madre embrionarias y fetales. Los tejidos posparto, como el cordón umbilical y la placenta, han generado interés como una fuente alternativa de células madre multipotentes o pluripotentes. Por ejemplo, se han descrito métodos para la recuperación de células madre por periusión de la placenta o recolección de sangre o tejido de cordón umbilical. Una limitación de la obtención de células madre de estos métodos ha sido un volumen inadecuado de sangre de cordón umbilical o cantidad de células obtenidas, así como heterogeneidad o carencia de caracterización de las poblaciones de células obtenidas a partir de esas fuentes

[0010] Por consiguiente, un suministro fiable, bien caracterizado y abundante de las poblaciones sustancialmente homogéneas de células madre que tienen la capacidad de diferenciarse en células que son fenotípicamente similares a células endógenas DIV serían ventajosas en una variedad de aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas para la reparación, regeneración y/o reemplazo de células DIV, y para la reconstrucción y/o remodelación de tejidos DIV

RESUMEN DE LA INVENCiÓN

[0011] La invenciórJ proporciona células obtenidas a partir de tejido humano del cordón umbilical, en el que el tejido del cordón umbilical está sustancialmente libre de sangre, donde las células: se pueden obtener por digestión enzimática de tejido del cordón umbilical humano que está libre de sangre con una metaloproteasa, una proteasa neutra y una proteasa mucolitica; son capaces de auto-renovarse y expandirse en la cultura; Tienen el potencial para diferenciarse; y tienen las siguientes características·

a) expresar CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A, B, C como se detecta mediante citometría de flujo; b) no expresar CD31 , CD34, CD45, CDBO , CD86, CD141 , CD17B , HLA-G, CD117 Y HLA-DR, DP, DQ como se detecta mediante citometría de flujo; c) no expresar telomerasa; y d) expresar, en relación con un fibroblasto humano, células madre mesenquimatosas o células de la médula ósea de cresta ilíaca, niveles aumentados de inter1eucina 8, reticulón 1, ligando quimiocina (motivo CXC) 1 o ligando 3 de quimiocina (motivo CXC)

Para uso en el tratamiento de una enfermedad o afección relacionada con la degeneración del disco intervertebral mediante la administración de las células en el núcleo pulposo o en el anillo fibroso del disco intervertebral

[0012] En un aspecto, los métodos se describen en el presente documento para el tratamiento de una enfermedad o condición relacionada con degeneración de DIV. Los métodos comprenden la administración de células derivadas de tejido del cordón umbilical en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o condición. Preferiblemente, el tejido del cordón umbilical del que se obtienen las células está sustancialmente e:xento de sangre. Las células derivadas de tejidos del cordón umbilical son preferiblemente capaces de auto-renovación y expansión en cultivo y tienen el potencial de diferenciarse, por ejemplo, con un fenotipo de célula DIV; requieren L-valina para el crecimiento; puede crecer en al menos aproximadamente un 5% de oxigeno; no producen CD117 o HLA-DR ni telomerasa; expresar la actina del músculo liso alfa; y expresar, con relación a un fibroblasto humano, células madre mesenquimales o célula de médula ósea de cresta ilíaca, aumento de los niveles de interleucina 8 o reticulon 1.

[0013] En otro aspecto, se describen composiciones farmacéuticas para el tratamiento de una enfermedad o condición relacionada con la degeneración de DIV, comprendiendo las composiciones un vehículo

farmacéuticamente aceptable y células derivadas de tejido del cordón umbilical en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o afección, en el que el tejido del cordón umbilical del que se obtienen las células está sustancialmente libre de sangre y en el que las células son capaces de la autorrenovación y la expansión en el cultivo y tienen el potencial para diferenciar, por ejemplo, a un fenotipo de célula DIV; requieren L-valina para el crecimiento; puede crecer en al menos aproximadamente un 5% de oxígeno; no producen CD117 o HLA-DR ni telomerasa; expresar la actina del músculo liso alfa; y expresa r, en relación con un fibroblasto humano, células madre mesenquimales o células de la médula ósea de cresta ilíaca, niveles incrementados de interleucina 8 o reticulón 1.

[0014] De acuerdo con otro aspecto, kits se describen para el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad

o condición relacionada con la degeneración de DIV, los kits comprenden instrucciones para usar el kit en un método para tratar una enfermedad o condición relacionada con la degeneración de DIV, vehículo farmacéuticamente aceptable y células derivadas de tejidos del cordón umbi lical en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o afección, en el que el tejido del cordón umbilical del que se obtienen las células está sustancialmente exento de sangre y en el que las células capaces de autorenovarse y expandirse en Y tienen el potencial de diferenciar, por ejemplo, a un fenotipo de célula DIV; requerir L-valina para el crecimiento; pueden crecer en al menos aproximadamente un 5% de oxígeno; no producen CD117 o HLA-DR ni telomerasa; expresan la actina del músculo liso alfa; y expresan, en relación con un fibroblasto humano, células madre mesenquimatosas o células de la médula ósea de cresta ilíaca, niveles incrementados de interleucina 8 o reticulón 1. En algunas realizaciones, los kits descritos en la presente memoria descriptiva comprenden además al menos un reactivo y/o instrucciones para cultivar las células. En algunas realizaciones, los kits descritos en este documento comprenden instrucciones para la inducción de células a diferenciarse al menos parcialmente in vitro, por ejemplo, en células que muestran un fenotipo de núcleo pulposo celular y/o un fenotipo de células de anillo fibroso.

[0015] En diversas realizaciones, las células derivadas de tejido de cordón umbilical utilizadas en los métodos, composiciones, y/o kits descritos en este documento, expresan reticulon, ligando del receptor de quimioquinas 3, y/o la proteína quimiotáctica de granulocitos 2. En algunas formas de realización, células de cordón umbilical derivadas de tejido descritas en este documento expresan CD10, CD13, CD44, CD73 y CD90. En algunas realizaciones, las células derivadas de tejido del cordón umbilical descritas en este documento tienen la ca¡mcidad de diferenciarse en células de anillo fibroso y/o núcleos pulposos

[0016] En diversas rea lizaciones, la enfermedad o condición relacionada con la degeneración de DIV puede ser causada o inducida por la edad, trauma, auto-inmunidad, reacción inflamatoria, un defecto genético, la deposición de complejos inmunes, y/o combinaciones de los mismos. Una DIV dirigido para el tratamiento puede estar intacto o en cualquier etapa de daño o degeneración. Por ejemplo, una DIV dirigido para el tratamiento puede ser hemiado, roto, delaminado, ylo de otro modo dañado o degenerado.

[0017] En algunos métodos rea lizaciones dadas a conocer en el presente documento comprenden la adm inistración de las células derivadas de tejido umbilical no diferenciadas o derivadas de células. Las células derivadas de tejido umbilical humano producen factores tróficos beneficiosos que incluyen, pero no se limitan a citocinas, factores de crecimiento, inhibidores de proteasa, proteinas de matriz extracelular que promueven la supervivencia, el crecimiento y la diferenciación de células progenitoras o precursoras endógenas de DIV. Los factores tróficos descritos aquí podrían ser secretados directamente por las células derivadas del tejido umbilical humano trasplantadas en el medio huésped. Los factores tróficos u otros derivados celulares pueden recogerse de células derivadas de tejidos umbilicales humanos ex vivo y posteriormente introducirse en el paciente.

[0018] En algunas realizaciones, las células derivadas de tejido de cordón umbilical descritas en este documento son inducidas in vitro para diferenciarse en células de un linaje de condrocitos, y/o en células que muestran el fenotipo de una célula de anillo fibroso, una célula de núcleo pulposo, y/u otra célula de tipo DIV antes, después, o simultáneamente con la administración de las células. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los métodos descritos en este documento comprenden además la etapa de inducción de células derivadas de tejido de cordón umbilical para diferenciarse al menos parcialmente in vi/ro

[0019] En algunas realizaciones, las células derivadas de tejido de cordón umbilical se pueden modificar genéticamente para expresar un producto de gen, tal como, pero no limitado a, un producto génico que promueve la reparación ylo regeneración de los tejidos de DIV. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se modifican genéticamente para expresar un factor trófico u otro producto génico. En algunas realizaciones, el producto génico ejerce un efecto trófico o modula de otro modo las células derivadas de tejido del cordón umbilical, tipos de células adicionales administradas con las células derivadas de tejido del cordón umbilical, células endógenas DIV ylu otras células endógenas. En algunas realizaciones, el producto génico es un componente de la matriz extracelular o un agente que modula la matriz extracelular En algunas realizaciones, el producto génico estimula la expresión de una o más proteínas de matriz extracelular

[0020] En algunas realizaciones, las células derivadas de tejido de cordón umbilical se administran con al menos otro tipo de células, tales como, pero no limitado a una célula de anillo fibroso, una célula de núcleo pulposo, un fibroblasto, un condrocito, una célula madre mesenquimal, Una célula derivada del tejido adiposo u otro tipo de células madre pluripotentes o multipotentes. El al menos otro tipo celular puede administrarse simultáneamente con,

antes o después de las células derivadas del tejido del cordón umbilical

[0021] En algunas realizaciones, las células derivadas de tejido de cordón umbilical se administran con al menos un agente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se administran con un factor trófico, tal como, pero sin limitarse a, TGF-beta, GDF-5, TIMP-1 Y PDGF-BB. En varias realizaciones, el al menos un agente ejerce un efecto trófico sobre o modula de otro modo las células derivadas de tejido del cordón umbilical, uno o más tipos celulares adicionales administrados con las células derivadas de tejido del cordórJ umbilical, células DIV endógenas y/u otras células endógenas. En algunas realizaciones, al menos un agente estimula la expresión de una o más proteínas de matriz exlracelular. otros agentes que incluyen pero no se limitan a agentes antiinflamatorios, agentes de supervivencia celular, agentes reductores del dolor y agentes inmunomoduladores. El agente se puede administrar simultáneamente con, antes o después de la administración de las células derivadas del tejido del cordón umbilical.

[0022] En varios aspectos, las células se pueden administrar, dirigirse a administrarse o formularse para administrarse por inyección en una DIV, incluyendo, por ejemplo, el núcleo pulposo y/o el anillo fibroso de una DIV degenerada. En algunas realizaciones, las células son administradas, dirigidas a administrarse o formularse para administrarse de manera que las células se encapsulen dentro de un dispositivo implantable o mediante la implantación de un dispositivo o matriz que comprende las células.

[0023] Lo anterior y otras características y ventajas de la invención serán evidentes de la siguiente descripción más particular de realizaciones preferidas de la invención, como se ilustra en los dibujos adjuntos

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

[0024] Varios térmillOs relacionados con los métodos y otros aspectos de la presente invención se utilizan en toda la memoria y las reivindicaciones. Dichos términos tendrán su significado ordina rio en la técnica a menos que se indique lo contrario. otros términos definidos especificamente deben ser interpretados de una manera consistente con la definición aquí proporcionada.

[0025] Como se usa en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares ~un~, "una", ~el" y "ella" incluyen referentes plurales a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más células, y similares

[0026] El término "aproximadamente" tal como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible como una cantidad, una duraciÓfl temporal, y similares, se utiliza para abarcar variaciones de !20% o !10%, más preferiblemente .:.5%, aún más preferiblemente !1%, y aún más preferiblemente .:.0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para llevar a cabo los métodos descritos

[0027] ~Derivado" se utiliza para indicar que las células se han obtenido a partir de su fuente biológica y cultivado, expandido en cultivo, inmortalizado, o manipulado de otra manera in vitro.

[0028] "Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural. Si una molécula o composición ocurre en la naturaleza, se ha "aislado" si ha sido cambiado o removido de su entorno original, o ambos.

[0029] El término "expresar", "expresa", o "expresión" de una molécula de ácido nucleico o gen se refiere a la biosíntesis de un producto génico, por ejemplo, la biosíntesis de un polipéptido.

[0030] "Los faclores tróficos" son sustancias que promueven la supervivencia, el crecimiento, la diferenciación, proliferación ylo la maduración de una célula, o estimulan una mayor actividad biológica de una célula. Los derivados de células se refieren a cualquier material que se puede obtener a partir de células e incluyen medios acondicionados de células, lisado celular, proteinas de matriz exlracelular, factores tróficos, fracciones celulares, membranas celulares.

[0031] "Degeneración" se refiere a cualquier daño fisico, lesión, degeneración o trauma a una DIV

[0032] "Patología" se refiere a cualquier indicación estructural o funcional de una desviación del estado normal de una célula, tejido, órgano o sistema, medido por cualquier medio adecuado en la técnica.

[0033] Una "enfermedad" es cualquier desviación o deterioro en la salud, condición, o el funcionamiento de una célula, tejido, órgano, sistema u organismo en su conjunto, según se mide mediante cualquier medio adecuado en la técnica

[0034] "Tratar," "tratando" o 'tratamiento' se refieren a cualquier éxito o indicio de éxito en la atenuación o mejora de la enfermedad, daño o condición, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como reducción, remisión, disminución de los síntomas o haciendo que la enfermedad, el daño o la condición sean más tolerables para el paciente, disminuyendo la velocidad de degeneración o declive, haciendo que el punlo final de la degeneración sea

menos debilitante o mejorando el bienestar fisico o mental del sujeto. El tratamiento o mejora de los sintomas pueden basarse en parámetros objetivos o subjetivos, incluidos los resultados de un examen físico, un examen neurol6gico yfo evaluaciones psiquiátricas

[0035] ~Cantidad eficaz.~ o ~cantidad terapéuticamente eficaz~ se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a una cantidad de un compuesto, material o composición, tal como se describe en el presente documento eficaz para lograr un resultado biológico particular tal como, pero no limitado a, resultados biológicos descritos, descritos o ejemplificados en la presente memoria. Tales resultados pueden incluir, pero no se limitan al tratamiento de la enfermedad DIVo daño en un sujeto, según se determina por cualquier medio adecuado en la técnica

[0036] ~Farmacéuticamente aceptable~ se refiere a aquellas propiedades yfo sustancias que son aceptables para el paciente desde un punto de vista farmacológicoftoxicol6gico y al químico farmacéutico fabricante desde un punto de vista fisicofquímico respecto a composición, formulación, estabilidad, aceptación del paciente y biodisponibilidad.

~Vehiculo farmacéuticamente aceptable~ se refiere a un medio que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo y no es tóxico para el huésped al que se administra.

[0037] Se ha descubierto que las enfermedades y condiciones relacionadas con la degeneración del disco intervertebral (DIV) se pueden tratar mediante la administración de células derivadas de tejido de cordón umbilical tal como se describe en el presente documento. Ventajosamente, los métodos, composiciones y kits descritos en el presente documento promueven la reparación y regeneración de las DIVs degeneradas y. de este modo, alivian uno

o más síntomas asociados con la degeneración de DIV. Por consiguiente, en un aspecto, se describen métodos para tratar una enfermedad o afección relacionada con la degeneración de DIV, que comprende administrar células derivadas de tejido del cordón umbilical a una DIV en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad o condición.

[0038] En diversas realizaciones, la enfermedad o condición relacionada con la degeneración de DIV puede ser causada o inducida por la edad, trauma, auto-inmunidad, reacción inflamatoria, un defecto genético, la deposición de complejos inmunes (por ejemplo, formación de tejido de cicatriz), y/o combinaciones de los mismos. Una DIV dirigido para el tratamiento puede estar intacto o en cualquier etapa de dafio o degeneración. Por ejemplo, una DIV dirigida para el tratamiento puede estar herniada (por ejemplo, donde una porción del anillo fibroso tiene una protuberancia u otra protuberancia), rota (por ejemplo, donde al menos una porción del anillo fibroso se rompe, dando como resultado una disminución en la presión y/o el volumen del núcleo pulposo), delaminada (por ejemplo, donde se han separado dos o más capas del anillo fibroso) yfo dañada o degenerada de otro modo (pOf ejemplo, donde el ani llo fibroso tiene fisuras, grietas, o similar, y/o en el que la matriz exlracelular se degrada o se altera)

[0039] En diversas realizaciones, las células derivadas de tejido de cordón umbilical se administran a una DIV degenerada, por ejemplo por inyección, trasplante, implante, inyectar o proporcionar como un complejo de células de la matriz, o cualquier otro medio conocido en la técnica para proporcionar terapia celular. En algunas realizaciones, las células se administran directamente al anillo fibroso yfo al núcleo pulposo de la DIV. En algunas realizaciones, las células se administran indirectamente a una DIV. Por ejemplo, las células pueden estar en un vehículo acuoso, encapsuladas en un dispositivo o sembradas en una matriz, que después se implantan en o cerca de una DIV degenerada. Los vehiculos acuosos incluyen, pero no se limitan a soluciones de tampón fisiológicas tales como solución salina tampanada, solución salina tampanada con fosfato, solución de sales balanceadas de Hank, solución salina tamponada con Tris y solución salina tamponada con Hepes. En diversas realizaciones, se puede implantar un dispositivo, matriz u otro depósito celular de modo que esté unido a una pared exterior del anillo fibroso, o localizado fuera de, pero adyacente a una pared de la fibrosis anular, o adyacente a una placa terminal de un cuerpo vertebral que rodea la DIV.

[0040] En algunas realizaciones, las células se administran en la forma de un dispositivo tal como un complejo de células de la matriz. Los materiales del dispositivo incluyen, pero no se limitan a, materiales biorreabsorbibles tales como colágenos, 35/65 Poli(epsilon-caprolactona)(PCL)fPoli(ácido glicólico) (PGA), construcciones bioabsorbibles PANACRYL™, poliglactina 910 de VICRYL™. y péptidos autoensamblables y materiales no reabsorbibles tales como fluoropolímeros (por ejemplo, fluoropolímeros TEFLON®), plásticos y metales. Las matrices incluyen andamios biocompatibles, celosias, estructuras de autoensamblaje y similares, bioabsorbibles o no, liquidos, gel o sólidos. Tales matrices son conocidas en la técnica de tratamiento de células terapéuticas, reparación quirúrgica, ingeniería de tejidos y cicatrización de heridas. Preferiblemente, las matrices son pretratadas con las células terapéuticas. Más preferiblemente, las matrices se rellenan con células en estrecha asociación con la matriz o sus espacios. Las células pueden adherirse a la matriz o pueden quedar atrapadas o contenidas dentro de los espacios matriciales. Los complejos de matriz-célula son los más preferidos en los que las células crecen en estrecha asociación con la matriz y cuando se usan terapéuticamente, el crecimiento, la reparación y/o la regeneración de las propias células DIV del paciente se estimula y soporta, y la angiogénesis apropiada se estimula o se soporta. Las composiciones de células de matriz pueden introducirse en el cuerpo de un paciente de cualquier manera conocida en la técnica, incluyendo pero no limitándose a implantación, inyección, unión quirúrgica, trasplante con otro tejido, y similares. En algunas realizaciones, las matrices forman in vivo, o incluso más preferiblemente in situ, por ejemplo geles polimerizables in situ se pueden usar de acuerdo con la invención. Ejemplos de tales geles se conocen en la técnica

[0041] Las células descritas en este documento también pueden ser sembradas en matrices tridimensionales, tales como andamios y implantados in vivo, donde las células sembradas pueden proliferar sobre o en el marco, o ayudar a establecer tejido de reemplazo in vivo con o sin la cooperación de otras células. El crecimiento de células derivadas de tejido de cordón umbilical en el marco tridimensional resulta preferentemente en la formación de un tejido tridimensiooal, o fundación del mismo, que puede uti lizarse in vivo, por ejemplo pa ra reparar y/o regenerar el tejido dañado o enfermo

[0042] Las células pueden ser sembradas en un marco tridimensional o matriz, tal como un andamio, una espuma, un andamio electroestáticamente hilado, un andamio no tejido, microparticulas porosas o no porosas, o hidrogel y se administran en consecuencia. El bastidor puede configurarse en diversas formas, tales como sustancialmente plana, sustancialmente cilíndrica o tubular, o puede ser de forma completamente libre, según se requiera o se desee para la estructura correctiva considerada. Dos o más armazones sustancialmente planos pueden colocarse encima de otro y fijarse juntos como sea necesario para generar una estructura multicapa.

[0043] En tales marcos tridimensionales, las células se pueden coadministrar con otros tipos de células, u otros progenitores de tipo de tejidos blandos, incluyendo las células madre. Cuando se cultiva en un sistema de tres dimensiones, las células proliferantes pueden madurarse y segregarse apropiadamente para formar componentes de tejidos adultos análogos a las contrapartes encontradas naturalmente in vivo.

[0044] Las matrices descritas y ejemplificadas en el presente documento pueden diseñarse de tal manera que la estructura de la matriz soporta las células derivadas de tejido de cordón umbilical sin degradación posterior, apoya a las células desde el momento de la siembra hasta el trasplante de tejido es remodelado por el tejido del huésped, o permite que las células sembradas se adhieran a, proliferen, y se conviertan en una estructura de tejido que tiene suficiente integridad mecánica para apoyarse in vi/ro, momento en el cual la matriz se degrada

[0045] Las matrices, andamios, tales como espumas no tejidos, estructuras electrostáticamente hiladas, microparticulas y sistemas de auto-montaje cootemplados para uso en esta invención pueden implantarse en combinación con uno cualquiera o más células, factores de crecimiento, medicamentos u otros componentes, como agentes bioactivos que promueven la cicatrización, la regeneración, la reparación o el crecimiento de tejido, o estimulan la vascularización o inervación de los mismos o mejoran de otro modo el resultado terapéutico o la práctica de la invención, además de las célu las de la invención.

[0046] En algunas realizaciones, las células descritas en este documento se pueden cultivar libremente en cultivo, eliminado a partir del cultivo y se inocularon en un marco tridimensional. La inoculación de la estructura de tres dimensiones con una concentración de células, por ejemplo, aproximadamente 106 a 5 x 107 células por mililitro, se traduce preferiblemente en el establecimiento del soporte de tres dimensiones en periodos relativamente cortos de tiempo. Además, en alguna aplicación, puede ser preferible utilizar un número mayor o menor de células dependiendo del resultado deseado

[0047] En algunos aspectos, es útil volver a crear en el cultivo el microambiente celular encontrado in vivo, de tal manera que el grado en que las células se cultivan antes de la implantación in vivo o se utilizan in vitro puede variar Las células se pueden inocular sobre la estructura antes o después de formar la forma deseada para la implantación, por ejemplo, cuerdas, tubos, filamentos y similares. Después de la inoculación de las células sobre el armazón, el armazón se incuba preferiblemente en un medio de crecimiento apropiado. Durante el período de incubación, las células inoculadas crecerán y envolverán el armazón y pueden por ejemplo puentear, o puentear parcialmente cualquier espacio intersticial en el mismo. Es preferible, pero no necesario cultivar las células a un grado apropiado, que refleja la densidad celular in vivo de tejido que está siendo reparado o regenerado. En otras realizaciones, la presencia de las células, incluso en números bajos en el armazón, estimula el crecimiento de células sanas endógenas para facilitar la cicatrización, por ejemplo, del tejido dañado o lesionado.

[0048] Los ejemplos de matrices, por ejemplo andamios que pueden ser utilizados para los aspectos de la invención incluyen esteras, espumas porosas o semipomsas, péptidos de automontaje y similares. Las esteras no tejidas pueden formarse, por ejemplo, utilizando fibras constituidas por polímeros naturales o sintéticos. En una realización preferida, se usan copolímeros absorbibles de ácidos glicólico y láctico (PGAlPLA), vendidos bajo el nombre comercial VICRYL ™ (Ethicon, Inc., Somerville, NJ) para formar una esterilla. Las espumas, compuestas, por ejemplo, de copolímero de poli(épsilon-caprolactona)/ácido pol i(ácido glicólico) (PCUPGA), formadas por procesos tales como liofi lización, como se describe en la Patente de EE.UU. N° 6.355.699, también pueden servir como andamios .

[0049] Los geles también forman matrices adecuadas, como se usa en el presente documento. Los ejemplos incluyen geles inyectables, geles polimerizables in situ, e hidrogeles, por ejemplo compuestos de péptidos de autoensamblaje. Estos materiales se utilizan frecuentemente como crecimiento del tejido. Por ejemplo, un gel inyectable puede estar compuesto de agua, solución salina o tampón fisiológico y un material gelificante. Materiales gelificantes incluyen, pero no se limitan a proteínas, tales como, colágeno, elastina, trombina, fibronectina, gelatina, fibrina, tropoelastina, polipéptidos, la minina, proteoglicanos, cola de fibrina, coágulo de fibrina, coágulo de plasma rico en plaquetas (PRP), coágu lo de plasma pobre en plaquetas (PPP), los hidrogeles de péptidos de

autoensamblaje, y atelocolágeno; polisacáridos tales como, pectina, celulosa, celulosa oxidada, quitina, quitosano, agarosa, ácido hialurónico; polinucleótidos tales como ácidos ribonucieicos, ácidos deoxiribonucleicos, y otros tales como, alginato, alginato reticulado, poli(N-isopmpilacrilamida), poli(oxialquileno), copolímeros de po1i(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno), poli(alcohol de vinilo), poliacrilato, copolímeros de monoestearoilglicerol cosuccinato/polietilenglicol (MGSAlPEG) y combinaciones de los mismos

[0050] Redes degrada bies formadoras in situ también son adecuadas para uso en la invención (véase, p.ej, Anseth, KS el al., J. Controlied Release, 2002; 78: 199-209; Wang, D. et al., Biomaterials, 2003; 24: 3.969-3.980; de patente de EE.UU. 200210022676 a He et aL). Estos materiales se formulan como fluidos adecuados para inyección, y después pueden inducirse por una variedad de medios (p.ej., cambio en la temperatura, pH, exposición a la luz) para formar redes de hidrogel degradables in situ o in vivo.

[0051] En algunas realizaciones, el marco puede ser un fieltro, que puede estar compuesto de un hilo multifilamento hecho de un material bioabsorbible, por ejemplo, PGA, PLA, copolimeros de PCL o mezclas, o ácido hialurónico. El hilo se convierte en un fieltro utilizando técnicas de procesamiento textil estándar que consta de engaste, corle, cardado y punción. Las células de la invención pueden ser sembradas en los andamios de espuma que pueden ser estructuras compuestas. Además, el marco tridimensional puede moldearse en una forma útil, tal como una estructura especifica en o alrededor de la DIVa reparar, reemplazar, o aumentar.

[0052] El marco puede ser tratado antes de la inoculación de las células de la invención con el fin de mejorar la unión celular. POI" ejemplo, antes de la inoculación con las células de la invención, las matrices de nylon pueden ser tratadas con ácido acético 0,1 molar y se incubaron en polilisina, PBS, y/o colágeno para recubrir el nylon. El poliestireno puede ser tratado de forma similar utilizando ácido sulfúrico.

[0053] Además, las superficies extemas de la estructura de tres dimensiones se pueden modificar para mejorar la unión o el crecimiento de las células y la diferenciación del tejido, tales como por recubrimiento de plasma del marco

o adición de una o más proteínas (por ejemplo, colágenos, fibras elásticas, fibras reticulares), glicoproteinas, glicosaminoglicanos (p.ej., sulfato de heparina, condroitina-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, sulfato de dermatano, sulfato de queratina), una matriz celular, y/u otros materiales tales como, pero no limitado a, gelatina, alginatos, agar, agarosa, y gomas vegetales, entre otros.

[0054] El andamio puede estar compuesto de o tratarse con materiales que lo hacen no trombogénico. Estos tratamientos y materiales también pueden promover y mantener el crecimiento endotelial, la migración y la deposición de matriz extracelular. Ejemplos de estos materiales y tratamientos incluyen, pero no se limitan a los materiales naturales tales como proteínas de la membrana basal, tales como laminina y colágeno de tipo IV, materiales sintéticos tales como ePTFE, y siliconas de poliuretanourea segmentados, como PURSPAN® (The Polymer Technology Group, Inc., Ber1<eley, CA). Estos materiales pueden ser tratados adicionalmente para hacer el andamio no trombogénico. Tales tratamientos incluyen agentes anti-trombóticos tales como la heparina, y los tratamientos que alteran la carga superficial del material tal como recubrimiento pOI" plasma.

[0055] Diferentes proporciones de los diferentes tipos de colágeno, por ejemplo, depositados sobre el marco pueden afectar el crecimiento del tejido específico o de otras células que pueden inocularse más tarde en el marco o que pueden crecer sobre la estructura in vivo. Altemativamente, el marco puede inocularse con una mezcla de células que sintetizan los tipos de colágeno adecuados deseados. Dependiendo del tejido a cultivar, el tipo de colágeno apropiado para inocularse en el marco o producirse por las células sembradas sobre el mismo puede seleccionarse Por ejemplo, las cantidades relativas de las fibras colágenas y elásticas presentes en el marco pueden ser moduladas mediante el control de la proporción de células productoras de colágeno a las células de elastina productoras en el inóculo inicial

[0056] El marco tridimensional sembrado o inoculado de la invención puede ser para el trasplante o la implantación de cualquiera de las células cultivadas obtenidas a partir de la matriz o la propia matriz cultivadas in vivo. Los andamios tridimensionales pueden, de acuerdo con la invención, ser uti lizados para reemplazar o aumentar el tejido existente, para introducir tejido nuevo o alterado, para modificar prótesis arlificiales, o para unir tejidos o estructuras biológicas.

[0057] En algunas realizaciones, las células se pueden administrar (por ejemplo, inyectarse) en una DIVa través de una aguja, tal como una pequeña aguja de calibre. En algunas formas de realización, la aguja tiene un diámetro de alrededor de 22 calibre o menos, a fin de mitigar la posibilidad de hemiar la DIV. Al inyectar volúmenes en el núcleo pulposo, es deseable que el volumen de fármaco suministrado sea no más de aproximadamente 3 mi, preferiblemente no más de aproximadamente 1 mi, más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,5 mI. Cuando se inyecta en estas cantidades más pequeñas, se cree que el volumen añadido no causará un aumento de presión apreciable en el núcleo pulposo. Si el volumen de la inyección directa de la formulación es lo suficientemente alto como para provocar que una preocupación respecto a la sobrepresu rización del núcleo pulposo, a continuación, se prefiere que al menos una parte del núcleo pulposo se retire antes de la inyección directa. En algunas rea lizaciones, el volumen de núcleo pulposo eliminado es sustancialmente similar al volumen de la formulación a inyectar. Por ejemplo, el volumen de núcleo pulposo eliminado puede ser dentro de

aproximadamente 80-120% del volumen de la formulación a inyectar. En algunas realizaciones, las células derivadas de tejido de cordón umbilical se concentran antes de administrarse.

[0058] Las células útiles en los métodos, composiciones y kits descritos en este documento se pueden derivar de cordón umbilical de mamiferos recogido en la terminación o poco después de la terminación de cualquiera de un embarazo de término completo o embarazo prematuro, por ejemplo, después de la expulsión tras del nacimiento o la extirpación quirúrgica después de una cesárea. Sangre y residuos se eliminan del tejido del cordón umbilical antes del aislamiento de las células, por ejemplo, por lavado con cualquier medio o tampón adecuado.

[0059] Las células pueden ser aisladas de tejido del cordón umbi lical por la fuerza mecánica o por digestión enzimática. Las enzimas preferidas son las metaloproteasas, proteasas neutras y proteasas mucoliticas. Por ejemplo, varias combinaciones de colagenasa, dispasa, y hialuronidasa se pueden utilizar para disociar las células del tejido del cordón umbilical. El experto en la técnica apreciará que muchas de tales tratamientos enzimáticos son conocidos en la técnica para el aislamiento de células de diversas fuentes de tejido. Por ejemplo, las series de LlBERASE® Blendzyme (Rache) de combinaciones de enzimas son adecuadas para uso en los presentes procedimientos. Otras fuentes de enzimas son conocidas, y el experto en la técnica también puede obtener tales enzimas directamente desde sus fuentes naturales. El experto en la técnica también es capaz de evaluar enzimas nuevas, o adicionales o combinaciones de enzimas para su utilidad en el aislamiento de las células de la invención. Tratamientos enzimáticos preferidos son 0,5, 1, 1,5, o 2 horas de duración o más

[0060] Las células aisladas se pueden utilizar para iniciar cultivos celulares. Las células aisladas se transfirieron a recipientes de cultivo de tejidos estériles o bien no recubiertos o recubiertos de matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colágeno (nativo desnaturalizado, atello, o reticulado), gelatina, fibronectina y otras proteínas de la matriz extracelular. Células derivadas de tejido de cordón umbilical se cultivan en cualquier medio de cultivo capaz de sostener el crecimiento de las células tales como, pero no limitados a, DMEM (glucosa alta o baja), DMEM avanzado, DMEM/MCDB 201 , medio basal de Eagle, medio F10 de Ham (F10), medio F12 de Ham (F12), medio de Hayflick, medio de Dulbecco modificado por Iscove, medio de crecimiento de células madre mesenquimales (MSCGM), DMEMfF12, RPMI1640, y CELL-GRO-FREE. El medio de cultivo se puede complementar con uno o más componentes incluyendo, por ejemplo, suero bovino fetal, preferiblemente alrededor de 2-15% (vfv); suero equino; suero humano; suero de temera fetal; beta-mercaptoetanol, preferiblemente de aproximadamente 0,001 % (v/v); uno

o más factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1), factor inhibidor de leucocitos (LlF) y eritropoyetina; aminoácidos, incluyendo L-valina; y uno o más agentes antibióticoslantimicóticos para controlar la contaminación microbiana, tal como, por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina, ya sea solo o en combinación.

[0061] Las células se siembran en recipientes de cultivo a una densidad para permitir el crecimiento celular. En una realización, las células se cultivaron a aproximadamente Oa aproximadamente 5 por ciento en volumen de C02en el aire. En algunas realizaciones, las células se cultivaron a aproximadamente 2 a aproximadamente 25 por ciento en en el aire, preferentemente aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento 0 2 en el aire. Las células preferiblemente se cultivan a aproximadamente 25 a aproximadamente 40Q C y más preferiblemente se cultivan a 3rC. El medio en el recipiente de cultivo puede ser estático o agitado, por ejemplo, usando un biorreactor. Células derivadas de tejido de cordón umbilical se cultivan preferiblemente bajo estrés oxidativo (por ejemplo, con la adición de glutatión, vitamina C, catalasa, vitamina E, N-acetilcisteína), lo cual significa ningún o minimo daño del radical libre para las células cultivadas.

[0062] Las células derivadas de tejido de cordón umbilical se pueden pasar o eliminar a un recipiente de cultivo separado que contiene medio fresco del mismo o de un tipo diferente que el utilizado inicialmente, donde la población de células se puede expandir mitóticamente. Las células de la invención se pueden usar en cualquier punto entre el paso O y la senescencia. Las células preferiblemente se pasan entre aproximadamente 3 y aproximadamente 25 veces, se pasan más preferiblemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 veces, y preferiblemente se pasan 10 o 11 veces. La clonación ylo subclonación se pueden realizar para confirmar que una población clonal de las células ha sido aislada.

[0063] Los diferentes tipos de células presentes en el tejido del cordón umbilical se pueden fraccionar en subpoblaciones. Esto se puede lograr mediante la utilización de técnicas estándar para la separación de células incluyendo, pero no limitado a, tratamiento enzimático; clonación y selección de tipos celulares específicos, por ejemplo pero no limitado a la selección basada en marcadores morfológicos ylo bioquímicos; el crecimiento selectivo de las células deseadas (selección positiva), destrucción selectiva de células no deseadas (selección negativa); separación basada en la aglutinabilidad celular diferencial en la población mixta como, por ejemplo, con la aglutinina de soja; procedimientos de congelación-<lescongelación; propiedades de adherencia diferencial de las células en la población mixta; filtración; centrifugación convencional y zonal; elutriación centrífuga (centrifugación contracorriente); unidad de separación por gravedad; distribución en contracorriente; electroforesis; clasificación de células activadas por ftuorescencia (FACS); y similares

[0064] Los ejemplos de células aisladas de tejido del cordón umbilical se depositaroo en la American Type Culture CoIlectioo ellO de junio de 2004, y se les asignaron números de acceso ATCC de la siguientes manera: (1) a designación de la cepa UMB 022803 (P7) se le asignó el N° de Acceso PTA 6067; Y (2) a designación de la cepa UMB 022803 (P17) se le asignó el N°de Acceso PTA-6068.

[0065] Las células derivadas de tejido de cordón umbilical se pueden caracterizar, por ejemplo, por las características de crecimiento (p.ej., capacidad de duplicación de población, tiempo de duplicación, pasajes a la senescencia), análisis de cariotipo (p.ej., cariotipo normal; linaje materno o neonatal), citometría de flujo (p.ej. análisis FACS), inmunohistoquímica y/o inmunocitoquímica (p.ej. para la detección de epítopos), pertiles de expresión génica (p.ej. ensayos de chips de genes; reacción de polimerasa en cadena (por ejemplo, PCR con transcriptasa inversa, PCR en tiempo real, y PCR convenciooal», matrices de proteínas, la secreción de proteínas (p.ej., por ensayo de coagulación de plasma o el análisis de medio acondicionado POC, por ejemplo, por ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELlSA», reacción mixta de linfocitos (p.ej., como medida de la estimulación de PBMCs), y/u otros métodos conocidos en la técnica

[0066] En varios aspectos, las células derivadas de tejido de cordón umbilical tienen una o más de las siguientes características de crecimiento: requieren L-valina para el crecimiento en cultivo; son capaces de crecimiento en atmósferas que contengan oxígeno de aproximadamente 5% a por lo menos aproximadamente 20%; tienen el potencial de al menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo antes de llegar a la senectud; y/o adjuntan y expanden en un recipiente de cultivo de tejido revestido o no revestido, en el que el recipiente de cultivo de tejido revestido comprende un revestimiento de gelatina, laminina, colágeno, poliomitina, vitronectina o fibronectina [0067] En algunas realizaciones, las células tienen un cariotipo normal, que se mantiene mientras que se pasan las células. El cariotipo es particularmente útil para identificar y distinguir células neonatales de células maternas derivadas de placenta Los métodos para la determinación del cariotipo están disponibles y conocidos por los expertos en la técnica.

[0068] En algunas realizaciones, las células pueden ser caracterizadas por la producción de ciertas proteínas, incluyendo la producción de al menos uno de factor tisular, vimentina y actina de músculo liso-alfa; y la producción de al menos uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFR-alfa, PD-L2 y HLA-A, B, marcadores de superficie celular de C, tal como se detecta mediante, por ejemplo, citometría de flujo. En otras realizaciones, las células pueden ser caracterizadas por la falta de produccioo de al menos uno de CD31, C034, CD45, CD80, C086, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G, Y HLA-DR, HLA-DP, y/o de la superticie celular ERS de marcado y HLA-DQ, como se detecta por cualquier medio adecuado, tales como la citometria de flujo. En algunas realizaciones, se prefieren las células que producen al menos dos de factor tisular, vimentina y actina de músculo liso-alfa. En algunas realizaciones, se prefieren las células que producen los tres del factor de proteinas del tejido, vimentina y actina de músculo liso-alfa.

[0069] En algunas realizaciones, las células tienen, en relación coo una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal, o una célula de médula ósea de cresta ilíaca, el aumento de expresión de un gen que codifica al menos una de la interleucina 8; reticulon 1; quimiocina (motivo C-X-C) ligando 1 (actividad estimuladora del crecimiento de mela noma, alfa); quimiocina (motivo C-X-C) ligando 6 (proteína 2 de granulocitos quimiotácticos); quimiocina (motivo C-X-C) ligando 3; factor de necrosis tumoral, proteína alfa inducida 3.

[0070] En aún otras realizaciooes, las células tienen, en relación con una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal, o una célula de médula ósea de cresta ilíaca, la reducción de expresión de un gen que codifica al menos uno de: homeobox de corta estatura 2; proteína 2 de choque térmico 27 kOa; quimiocina (motivo C-X-C) ligando 12 (factor derivado de células de estroma 1); elastina (estenosis aórtica supravalvular, síndrome de Williams-Beuren); ARNm de Horno sapiens; AONc OKFZp586M2022 (a partir del clon OKFZp586M2022); homeobox 2 de mesénquima (homeobox específico a detención de crecimiento); homólogo 1 de homeobox sine oculis (Drosophila); cristalina, alfa B; activador asociado desaliñado de la morfogénesis 2; proteina DKFZP586B2420; similar a neuralina 1; tetranectina (proteína de unión del plasminágeno); src homología tres (SH3) y dominio rico en cisteína; colesterol 25-hidroxilasa; factor de transcripción relacionada con runt-3; receptor de interleucina 11, alfa; potenciador de C-endopeptidasa de procolágeno; homólogo de frizzled 7 (Drosophila); gen hipotético BC008967; colágeno, tipo VIII, alfa 1, tenascina C (hexabrachion); proteína homeobox Iroquois 5; hefaestina; integrina, beta 8; glicoproteína de vesícula sináptica 2; neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1; proteína 2 de unión de factor de crecimiento similar a la insulina, 36 kDa; AONc de Horno sapiens FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744; factor 1 de citoquina similar a receptor; canal de calcio activado por calcio de potasio intermediofpequeña conductancia, subfamilia N, miembro 4; integrina, beta 7; co-activador transcripcional con motivo de unión a POZ (TAl); homólogo 2 de homeobox sine oculis (Drosophila); proteína KIAA1034; proteína asociada a vesículas de membrana 5 (míobrevina); proteína 1 de la matríz extracelular que contiene EGF simílar a fibulína; respuesta de crecímíento temprano 3; homeobox no distal 5; proteína hipotética FLJ20373; familia de reductasa aldo-ceto 1, miembro de C3 (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo 11); biglicano; coactivador transcripcional con motivo de unión a POZ(TAl); fibronectina 1, proencefalina; integrina, similar a beta 1 (con dominios de repetición similar a EGF); ARNm de Horno sapiens de longitud completa de AONc inserto del clon Euroimage 1968422; EphA3; proteína KIAA0367; receptor del péptido natriurético Cfguanilato ciclasa C (péptido atrionatriurético receptor C); proteína hipotética FLJ1 4054; ARNm de Horno sapiens; ADNc de OKFZp564B222 (a partir del clon OKFZp564B222); BCL2/adenovirus

E1B 19 kDa proteina de interacción 3-similares; proteina 1 de unión a AE; y polipéptido 1 de subunidad Vlla de oxidasa de citocromo c (músculo).

[0071] En algunas rea lizaciones, las células pueden ser caracterizadas por la secreción de al menos una de MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1b, 1309, MDC, RANTES, y T1MP1 En algunas realizaciones, las células pueden ser caracterizadas por la falta de secreción de al menos una de TGF-beta2, ANG2, PDGFBB, Y VEGF, como se detecta por ELiSA.

[0072] En algunas realizaciones preferidas, la célula comprende dos o más del crecimiento, la producción de marcador de proteína/superficie, la expresiórJ de gen o características de secreción de sustancias. En algunas realizaciones, se prefieren células que comprenden tres, cuatro, o cinco o más de las caracteristicas En algunas realizaciones, se prefieren células que comprenden seis, siete, u ocho o más de las características. En algunas realizaciones, se prefieren células que comprenden la totalidad de las características anteriores.

[0073] Entre las células que se prefieren para su uso con los diversos aspectos de la invención están células que tienen las características descritas anteriormente, y más particularmente aquellas en las que las células tienen cariotipos normales y mantienen cariotipos normales con pases, y además en el que las células expresan cada uno de los marcadores CD1 O, CD13, CD44, CD73, CD90, alfa PDGFR, y HLA-a, B, C, en el que las células producen las proteínas inmunológicamente detectables que corresponden a los marcadores enumerados. Además de lo anterior, las células no producen proteinas correspondientes a cualquiera de los marcadores CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 , o HLA-DR, DP, DO, tal como se detecta por cualquier medio adecuado en la técnica, tales como la citometría de flujo. Las células no expresan CD117 o HLA-DR o telomerasa.

[0074] En algunos aspectos preferidos, los métodos comprenden células obtenidas o aisladas a partir de tejido de cordórJ umbilical humano a una DIV degenerada, donde las células son capaces de auto-renovación y expansión en cultivo de administración, requieren L-valina para el crecimiento, puede crecer en por lo menos aproximadamente 5% de oxígeno, no producen CD117 o HLA-DR o telomerasa, expresa actina de músculo líso alfa, y expresa, con relación a un fibroblasto humano, células madre mesenquimales, o célula ósea de hueso de cresta ilíaca, aumento de los niveles de interleucina 8 o reticulon 1 Las células aisladas de tejido de cordón umbilical humano se pueden expandir en cultivo antes de la administraciórJ. En algunas realizaciones, las células obtenidas a partir de tejido de cordórl umbilical humano tienen el potencial de diferenciarse en células de un fenotipo DIV, tales como, pero no limitado a, un fenotipo de células de anillo fibroso o un fenotipo de células del núcleo pulposo. Las células derivadas de tejido de cordón umbilical pueden integrarse en DIV del paciente, o, altemativamente, pueden proporcionar soporte para el crecimiento o la estimulaci6n para diferenciar para células madre DIV naturalmente presentes. La supervivencia de las células administradas no es determinante del éxito o resultados de su uso doode hay una mejora en la enfermedad o condición relacionada con degeneración de DIV ylo la salud general del paciente. En algunas realizaciones, las células preferiblemente al menos parcialmente integran, se multiplican, o sobreviven en el paciente. En algunas realizaciones, el paciente experimenta los beneficios de la terapia, por ejemplo de la capacidad de las células para apoyar el crecimiento de otras células, incluyendo las células madre o células progenitoras presentes en la DIV ylo los tejidos circundantes, desde el tejido en crecimiento o vascularización del tejido, ylo de la presencia de factores beneficiosos celulares, quimiocinas, citocinas y similares, pero las células no se integran ni se multiplican en el paciente. En algunos aspectos, el paciente se beneficia del tratamiento terapéutico con las células, pero las células no sobreviven por un período prolongado en el paciente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células disminuyen gradualmente en número, la viabilidad o la actividad bioquímica. En algunas realizaciones, una disminución de este tipo puede ser precedida por un periodo de actividad, por ejemplo el crecimiento, división o actividad bioquímica. En algunas realizaciones, células senescentes, no viables o incluso muertas son capaces de tener un efecto terapéutico beneficioso

[0075] Ciertas células que tienen el potencial de diferenciarse a lo largo de las lineas que conducen a diferentes fenotipos son inestables y por lo tanto pueden diferenciarse espontáneamente. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se prefieren las células que no se diferencian de forma espontánea. Por ejemplo, algunas células preferidas, cuando se cultivan en medio de crecimiento, son sustancialmente estables con respecto a los marcadores de células producidas en su superficie, y con respecto al patrón de expresión de diversos genes, por ejemplo como se determina usando perfiles de expresión génica usando, por ejemplo, ácido nucleico o ensayos de polipéptidos. Tales células permanecen sustancialmente constantes, por ejemplo en sus características de marcador de superficie, sobre los pases, a través de múltiples duplicaciones de la población

[0076] En algunas realizaciones, los métodos descritos en este documento inducen a las células derivadas de tejido de cordón umbilical para diferenciar a lo largo de una via celular DIV, hacia fenotipos de células DIV, o progenitores

o parientes más primitivos de los anteriores. Las células derivadas de tejido de cordón umbilical pueden integrarse en DIV del paciente, o, altemativamente, pueden proporcionar soporte para el crecimiento o la estimulación para diferenciar para células madre de DIV naturalmente presentes. La supervivencia de las células administradas no es determinante del éxito o resultados de su uso donde hay una mejora en la enfermedad o condición relacionada con degeneración de DIV ylo la salud general del paciente. En algunas rea lizaciones, las células preferiblemente al menos parcialmente se integran, se multiplican, o sobreviven en el paciente. En algunas rea lizaciones, el paciente experimenta los beneficios de la terapia, por ejemplo de la capacidad de las células para apoyar el crecimiento de

otras células, incluyendo las células madre o células progenitoras presentes en la DIV ylo los tejidos circundantes, desde el tejido en crecimiento o vascularización del tejido, ylo de la presencia de factores beneficiosos celulares, quimiocinas, citocinas y similares, pero las células no se integran o se multiplican en el paciente. En algunos aspectos, el paciente se beneficia del tratamiento terapéutico coo las células, pero las células no sobreviven por un periodo prolongado en el paciente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células disminuyen gradualmente en número, la viabilidad o la actividad bioquimica. En algunas realizaciones, una disminución de este tipo puede precederse por un periodo de actividad, por ejemplo el crecimiento, división o actividad bioquímica. En algunas realizaciones, células senescentes, no viables o incluso muertas son capaces de tener un efecto terapéutico beneficioso

[0077] En algunos aspectos, los métodos inventivos pueden comprender, además, la evaluación del paciente para mejoras en la estructura ylo función de DIV, ylo mejoras en la sa lud en general. Tales eva luaciones pueden proceder de acuerdo a cualesquiera medios adecuados en la técnica, incluyendo los descritos y ejemplificados en el presente documento

[0078] En algunas realizaciones, las células derivadas de tejido de cordón umbilical se administran conjuntamente con uno o más de otros tipos celulares, incluyendo pero no limitado a, otras células multipotentes o pluripotentes, o condrocitos, condroblastos, osteocitos, osteoblastos, osteoclastos, células de revestimiento del hueso, o células de médula ósea. Las células de diferentes tipos se pueden mezclar con las células derivadas de tejido de cordón umbilical inmediatamente o poco antes de la administración, o pueden co--cultivarse durante un periodo de tiempo antes de la administración. En algunas realizaciones, una población de células derivadas de tejido de cordón umbilical apoya la supervivencia, proliferación, el crecimiento, el mantenimiento, la maduración, la diferenciación, ylo aumento de la actividad de uno o más de otros tipos de células administradas conjuntamente coo las células derivadas de tejido de cordón umbilical, ylo viceversa

[0079] En algunas realizaciones, las células derivadas de tejido de cordón umbilical proporcionan soporte trófico a otros tipos de células coo las que se administran, y/o viceversa. En algunas realizaciones, es deseable que las células derivadas de tejido del cordón umbilical y las células co--cultivadas estén en contacto. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la siembra de las células como una población heterogénea de células en medio de cultivo o sobre un sustrato de cultivo adecuado. Altemativamente, las células derivadas de tejido de cordón umbilical pueden primero cultivarse hasta la confluencia y se emplea como un sustrato para las células co--cultivadas. En otras realizaciones, las células co-cultivadas pueden cultivarse en contacto con un medio acondicionado, matriz eld:racelular ylo lisado celular de las células derivadas de tejido de cordón umbilical

[0080] En diversas realizaciones, las células derivadas de tejido de cordón umbilical se puede administrar en combinación con un agente biológicamente activo, tal como un agente que modula la proliferación, diferenciación, y/o otras actividades celulares. El agente puede administrarse antes, después, o simultáneamente que las células derivadas de tejido de cordón umbilical. El agente particular elegido puede ser a discreción del profesional médico que dirige el tratamiento del paciente, y puede variar de acuerdo con necesidades particulares o estado del paciente. El agente elegido puede ser utilizado para diversos fines, tales como, pero no limitado a la facilitación de la administración de las células, mejorar la reparación y/o regeneración de la DIV, mejorar la salud general del paciente, la reducción del dolOf, la reducción o la prevención del rechazo de las células trasplantadas, y similares.

[0081] Los ejemplos de agentes que pueden administrarse con las células derivadas de tejido de cordón umbilical incluyen, pero no se limitan a, vitaminas y otros suplementos nutricionales; agentes antitrombogénicos; agentes antiapoptóticos; agentes antiinflamatorios; inmunosupresOfes (p.ej., ciclosporina, rapamicina); antioxidantes; hormonas; glicoproteinas; fibronectina; péptidos y proteinas; hidratos de carbooo (simples y/o complejos); proteoglicanos; oligonucle6tidos (ADN sentido y/o antisentido y/o ARN); proteínas moñogenéticas óseas (BMPs); factores de diferenciación; anticuerpos (por ejemplo, los anticuerpos a agentes infecciosos, tumores, fármacos u hormonas); y reactivos de terapia génica. En algunas rea lizaciones, el agente es una sustancia, tal como un analgésico, antiinflamatorio, narcótico, relajante muscular, o combinación de los mismos que alivia uno o más sintomas de una enfermedad o condición relacionada con degeneración de DIV.

[0082] En algunas realizaciones, el agente adicional es un factor trófico u otro agente que ejerce un efecto trófico contra las células derivadas de tejido de cordón umbilical, frente a células adicionales administradas con las células derivadas de tejido de cordón umbilical, contra las células de DIV endógenas (p.ej., las células de anillo fibroso, células de núcleo pulposo), y/o cootra otras células endógenas (p.ej., tejido conectivo de células progenitoras). En algunas realizaciones, el factor trófico es uno que es secretado por las células derivadas de tejido del cordón umbilical, en cuyo caso se puede derivar a partir de preparaciones de dichas células derivadas de tejido de cordón umbilical o de otra fuente. Ejemplos de tales factores o agentes incluyen, pero no se limitan a, miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, incluyendo el factor de crecimiento de fibroblastos ácido y básico (FGF-1 Y FGF-2) Y FGF-4; miembros del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), incluyendo PDGF-A-B, PDGFBB Y PDGF-AA; EGFs, miembros del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), incluyendo IGF-I y -11; la superfamilia de TGF-beta, incluyendo TGF-beta1 , 2 y 3 (incluyendo MP-52), factor inductor de osteoide (OIF), angiogenina(s), endotelinas, factor de crecimiento de hepatocitos y factor de crecimiento de queratinocitos; miembros de la proteína morfogenética ósea (BMP), la familia, tales como BMP-1, BMP-3, BMP-2, OP-1, BMP-2A,

BMP-2B, BMP-4, BMP-7 Y BMP-14; HBGF-1 Y HBGF-2; factores de diferenciación de crecimiento (GDF); miembros de la familia hedgehog de proteínas, incluyendo erizo de indio, sónico y del desierto; ADMP-1, GDF-5; TIMP-1 Y los miembros de la familia del factor estimulante de colonias (CSF), incluyendo CSF-1 , G-CSF y GM-CSF; y análogos e isoformas de los mismos.

[0083] En algunas realizaciones, el factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste de TGF-beta, TGFbeta1 , FGF, bFGF, e IGF-1 . Se cree que estos factores de crecimiento promueven la regeneración del núcleo pulposo, estimulan la proliferación y/o diferenciación de los condrocitos, y promueven la secreción de matriz extracelular. En algunas realizaciones, el factor de crecimiento es TGF-beta. Más preferiblemente, TGF-beta se administra en una cantidad de entre aproximadamente 10 ng/ml y aproximadamente 5.000 ng/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 50 ng/ml y aproximadamente 500 nglml,p.ej., entre aproximadamente 100 nglml y aproximadamente 300 ng/ml.

[0084] En algunas realizaciones, concentrado de plaquetas se proporciona como un agente terapéutico adicional. En algunas formas de realización, el concentrado de plaquetas es autólogo. En algunas realizaciones, el concentrado de plaquetas es plasma rico en plaquetas (PRP). PRP es ventajoso, ya que contiene factores de crecimiento que pueden reestimular el crecimiento de la MEC, y porque su matriz de fibrina proporciona un andamio adecuado para el nuevo crecimiento del tejido. En algunas realizaciones, el agente adicional es un lisado celular, una fracción celular soluble, una fracción celular de membrana enriquecida, medios de cultivo celular (p.ej., medio acondicionado), o matriz extracelular derivada de células derivadas de tejido de cordón umbilical u otras células [0085] En algunas realizaciones, las células derivadas de tejido de cordón umbilical se administran en combinaciórJ con un inhibidor de reductasa de HMG-CoA, incluyendo, pero no limitado a simvastatina, pravastatina, lovastatina, f1uvastatina, cerivastatina, yatorvastatina.

[0086] En algunas rea lizaciones, las células derivadas de tejido de cordón umbilical están diseñadas genéticamente para expresar uno o más agentes, tales como pero no limitado a, uno o más de los agentes terapéuticos adicionales que se describen en este documento. Las células de la invención pueden modificarse por ingeniería genética utilizando cualquiera de una variedad de vectores, incluyendo, pero no limitado a, la integración de vectores virales, p.ej. vector de retrovirus o vectores virales adeno-asociados; vectores de replicación no integrantes, p.ej. vectores de virus papiloma, vectores de SV40, vectores adenovirales; o vectores víricos de rep licación defectuosa. Otros métodos de introducción de AON en las células incluyen el uso de liposomas, electroporación, una pistola de particulas, o mediante inyección directa de ADN

[0087] Células huesped se transforman o se lransfectan con ADN controlado por, o en asociación operativa con, uno

o mas elementos apropiados de control de expresión tales como secuencias de promotor o potenciadOf, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, entre otros, y un marcador seleccionable de preferencia.

[0088] Después de la introducción del ADN extraño, las células manipuladas pueden dejarse crecer en medio enriquecido y después se cambian a medio selectivo. El marcador seleccionable en el ADN extraño confiere resistencia a la selecciórl y permite que las células integren de forma estable el ADN extraño como, por ejemplo, en un plásmido, en sus cromosomas y cultivarse para formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en células líneas. Este método se puede utilizar ventajosamente para diseñar líneas celulares que expresan el producto génico.

[0089] Cualquier promotor puede ser utilizado para conducir la expresión del gen insertado. Por ejemplo, promotores virales incluyen, pero no se limitan al promotor/potenciador CMV, SV 40, virus del papiloma, virus de Epstein-Barr o elastina promotora del gen. Preferiblemente, los elementos de control utilizados para controlar la expresión del gen de interés deben permitir la expresión regulada del gen de modo que el producto se sintetice sólo cuando sea necesario in vivo. Si se desea la expresión transitoria, promotores constitutivos se utilizan preferiblemente en un vector no integrante ylo de replicación defectuosa. Altemativamente, los promotores inducibles se podrían utilizar para conducir la expresión del gen insertado cuando sea necesario. Los promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, aquellos asociados con las proteínas de la metalotioneína y de choque térmico.

[0090] Las células de la invención pueden modificarse por ingenieria genética para expresión "knock out" o "knock downMde factores que promueven la inflamación o rechazo en el sitio de implante. Técnicas moduladoras negativas para la reducción de los niveles de expresión del gen diana o los niveles de actividad del producto del gen diana se discuten a continuación. MModulación negativa", como se usa aquí, se refiere a una reducción en el nivel ylo actividad de producto de gen diana en relación con el nivel ylo actividad del producto del gen diana en ausencia del tratamiento modulador. La expresión de un gen puede reducirse o eliminarse utilizando una serie de técnicas que incluyen, por ejemplo, inhibición de la expresión mediante la inactivación del gen completo (comúnmente denominado Mknockout") utilizando la técnica de recombinación homóloga. Por lo general, un exón que codifica una región importante de la proteína (o un exón 5' a esa región) es interrumpido por un marcador seleccionable positivo, p.ej., neo, impidiendo la producción de ARNm normal a partir del gen diana y que resulta en la inactivación del gen. Un gen también puede ser inactivado mediante la creación de una deleción en parte de un gen, o mediante la supresión del gen entero. Mediante el uso de una construcción con dos regiones de homología al gen diana que están muy separadas en el genoma, las secuencias que intervienen las dos regiones se pueden eliminar

(Mombaerts et al., Proc Nat Acad Sci EE.UU., 1991 ; 88: 3087)

[0091] ARN antisentido, de interierencia pequeña, ADNzimas y moléculas de ribozima que inhiben la expresión del gen diana también pueden usarse de acuerdo con la invención para reducir el nivel de actividad del gen diana. Por ejemplo, moléculas de ARN antisentido que inhiben la expresión de los principales complejos de genes de histocompatibilidad (HLA) han mostrado ser más versátiles con respecto a las respuestas inmunes Aún más, moléculas de triple hélice pueden ser utilizadas en la reducción del nivel de actividad del gen diana.

[0092] Estas y otras técnicas se describen en detalle por LG Davis et al. (eds), Basic Methods in Molecular Biology, 2" ed., Appleton & Lange, Norwalk, Conn., (1994).

[0093] IL-1 es un potente estimulador de la resorción del cartílago y de la producción de mediadores inflamatorios por los condrocitos (Campbell et al., J. Immun, 1991; 147 (4): 1238-1246). Usando cualquiera de las técnicas anteriores, la expresión de IL-1 puede ser eliminada o derribada en las células de la invención para reducir el riesgo de la resorción del cartílago implantado o la producción de mediadores inflamatorios por las células de la invención. Del mismo modo, la expresión de moléculas MHC de clase 11 puede ser eliminada o derribada con el fin de reducir el riesgo de rechazo del tejido implantado

[0094] Una vez que las células de la invención han sido diseñadas genéticamente, se pueden implantar directamente en el paciente para permitir el tratamiento de una enfermedad o condición relacionada con degeneración de DIV, por ejemplo mediante la producción de un producto que tiene un efecto terapéutico contra uno

o más síntomas de la enfermedad o afección, tal como un producto de gen anti-inflamatorio. Altemativamente, las células modificadas por ingeniería genética se pueden usar para producir nuevo tejido in vitro, que se implanta a continuación en el sujeto, como se describe en el presente documento

[0095] En algunos aspectos, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden células derivadas de tejido del cordón umbilical, como se describe en el presente documento, y un vehiculo farmacéuticamente aceptable Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento pueden inducir a las células derivadas de tejido de cordón umbilical a diferenciar a lo largo de una vía o linaje celular DIV, por ejemplo para mostrar un fenotipo celular de núcleo pulposo yfo un fenotipo de células de anillo fibroso. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento modulan los procesos celulares de células endógenas DIV yfo células de los tejidos circundantes, incluyendo pero no limitado a, la división celular, la diferenciación y la expresión génica. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento promueven la reparación y la regeneración de una DIV degenerada.

[0096] También se incluyen de conformidad con la presente descripción kits para la práctica de los métodos de la invención. En un aspecto, se proporcionan kits para el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad o daño de al menos una DIV. Los kits comprenden un vehiculo farmacéuticamente aceptable, células obtenidas a partir de tejido de cordón umbilical humano en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o condición, tales como aquellas células que se describen y se ejemplifican en la presente memoria, e instrucciones para usar el kit en un método para tratar a un paciente que tiene una enfermedad o condición relacionada con degeneración de DIV. Los kits pueden comprender además al menos un reactivo e instrucciones para el cultivo de las células. Los kits pueden comprender además una población de al menos otro tipo de célula, yfo al menos un agente.

[0097] En algunos aspectos, los kits comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable, un lisado, matriz extracelular, o medio acondicionado preparado a partir de células obtenidas a partir de tejido de cordón umbilical humano, que las células tienen las caracteristicas que se describen y se ejemplifican en este documento Los kits son útiles para facilitar la reparación y/o regeneración de una DIV que está dañada o enferma

[0098] Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir la invención con mayor detalle Se destinan a ilustrar, no limitar, la invención

EJ EMPLO 1

Aislamiento de células derivadas de tejido del cordón umbilical

[0099] los cordones umbilicales se obtuvieron del National Disease Research Interchange (NDRI, Filadelfia, PA) Se obtuvieron tejidos después de partos normales. El protocolo de aislamiento de células se realizó asépticamente en una campana de flujo laminar. Para eliminar la sangre y los residuos, el cable se lavó en tampón de fosfato salino (PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) en presencia de antimicóticos y antibióticos (100 unidades/mililitro de penicilina, 100 microgramoslmililitro de estreptomicina, 0,25 microgramoslmilil itro de anfotericina B). los tejidos entonces se disoció mecánicamente en placas de cultivo de tejido de 150 cm2 en presencia de 50 mililitros de medio (DMEM-baja glucosa o DMEM-alta glucosa; Invitrogen), hasta que el tejido se troceó en una pulpa fina. Los tejidos picados se transfirieron a 50 mi de tubos cónicos (aproximadamente 5 gramos de tejido por tubo). El tejido se digiere o bien en medio de DMEM-baja glucosa o bien un medio de DMEM-alta glucosa, conteniendo cada uno antimicóticos y antibióticos como se describe anteriormente. En algunos experimentos, se usó una mezcla de enzimas de

colagenasa y dispasa ("C:D;" colagenasa (Sigma, St Louis, MO), 500 unidadesfmililitro; y dispasa (Invitrogen), 50 unidades/mililitro en DMEM:-medio de baja glucosa). En otros experimentos una mezcla de colagenasa, dispasa y hialuronidasa rc: O: H") se utilizó (colagenasa, 500 unidades/mililitro; dispasa, 50 unidadesfmililitro; y hialuronidasa (Sigma), 5 unidades/mililitro, en DMEM: Baja glucosa). Los tubos cónicos que contienen las enzimas de tejido, de medio y de digestión se incubaron a 37"C en un agitador orbital (Environ, Brooklyn, NY) a 225 rpm durante 2 horas

[0100] Después de la digestión, los tejidos se centrifugaron a 150 x g durante 5 minutos, se aspiró el sobrenadante El sedimento se resuspendió en 20 mililitros de medio de crecimiento (DMEM: Baja glucosa (Invitrogen), 15 por ciento (vfv) de suero bovino fetal (FBS; suero bovino definido; Lote#AN018475; Hyclone, Logan, UT), 0,001 % (vfv) 2-mercaptoetanol (Sigma), 1 mililitro por 100 mililitros de antibiótico/antimicótico como se describe anteriormente. La suspensión celular se filtró a través de un tamiz de células de nylon de 70 micrómetros (SO Biosciences). 5 mililitros adicionales que comprenden medio de crecimiento se pasó a través del tamiz. La suspensión celular se pasó después a través de un tamiz de células de ny10n de 40 micrómetros (BO Biosciences) y se extrajo con un enjuague de 5 mililitros adicionales de medio de crecimiento

[0101] El filtrado se volvió a suspender en medio de crecimiento (volumen total de 50 mililitros) y se centrifugó a 150 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 50 mililitros de medio de crecimiento fresco. Este proceso se repitió dos veces más.

[0102] Tras la centrifugación final el sobrenadanle se aspiró y el sedimento celular se resuspendió en 5 mililitros de medio de crecimiento fresco. Se determinó el número de células viables mediante tinción con azul tripán Las células se cultivan a continuación bajo condiciones estándar.

[0103] Las células aisladas a partir de cordones umbilicales se sembraron a 5.000 célulasfcm2 en frascos de T-75 cm2 recubiertos con gelatina (Corning Inc., Corning, NY) en medio de crecimiento con antibióticos/antimicóticos como se describe anteriormente. Después de 2 días (en varios experimentos, las células se incubaron a partir de 2-4 dias), medio gastado se aspiró de los matraces. Las células se lavaron con PBS tres veces para eliminar los residuos y las células derivadas de la sangre. Las células después se rellenaron con medio de crecimiento y se dejaron crecer hasta la confluencia (aproximadamente 10 dias desde el paso O) para el paso 1 En pasajes posteriores (del pasaje 1 a 2 y así sucesivamente), las células alcanzaron sub-confluencia (confluencia del 75-85 por ciento) en 4-5 días. Para estos pasajes posteriores, las células se sembraron a 5000 células/cm2. Las células se cultivaron en un incubador humidificado con 5 por ciento de dióxido de carbono y oxigeno del aire, a 37"C

EJEMPLO 2

Evaluación de marcadores de superficie celular derivados de posparto humano por citometría de flujo

[0104] Tejido del cordón umbilical se caracterizó usando citometría de flujo para proporcionar un perfil para la identificación de células obtenidas del mismo.

[0105] Las células fueron cultivadas en Medio de Crecimiento (Gibeo Cartsbad, CA) con penicilina/estreptomicina. Las células fueron cultivadas en matraces de cultivo tisular T75, T150 Y T225 tratados con plasma (Coming, Coming, NY) hasta la confluencia. Las superficies de crecimiento de los frascos se recubrieron con gelatina mediante incubación de 2% (pfv) de gelatina (Sigma, SI. Louis, MO) durante 20 minutos a temperatura ambiente.

[0106] Las células adherentes en matraces se lavaron en PBS y se desprendieron con tripsinafEDTA. Las células fueron cosechadas, centrifugadas, y se resuspendieron en 3% (vfv) de FSS en PBS a una concentración celular de 1 x 107 por mililitro. De acuerdo a las especificaciones del fabricante, el anticuerpo para el marcador de superficie celular de interés (véase más adelante) se añadió a un centenar de microlitros de suspensión de células y la mezcla se incubó en la oscuridad durante 30 minutos a 4"C. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el anticuerpo llO unido. Las células se resuspendieron en 500 microlitros de PBS y se analizaron por citometría de flujo. El análisis de citometría de flujo se rea lizó con un instrumento citómetro (Becton Dickinson, San Jase, CA)

[0107] Se utilizaron los siguientes anticuerpos frente a marcadores de superficie celular

[0108] Las células se analizaron en los pasajes 8, 15, Y 20, Y las células derivadas de tejido de cordón umbilical de diferentes donantes se compararon entre si. Además, las células cultivadas en matraces recubiertos de gelatina se compararon con células cultivadas en frascos no recubiertos

[0109] Las células derivadas de tejido de cordón umbilical mostraron expresión positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, alfa PDGFR y HLA-A, B, C, indicado por el aumento de los valores de fluorescencia con respecto al control IgG. Estas células fueron negativas para la expresión detectable de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DO, indicado por valores de nUOfescencia comparables con el control de IgG. Las variaciones en los valores de fluorescencia de las curvas de positivos se representaron. La media (p.ej., CD13) y rango (p.ej., CD90) de las curvas positivas mostraroo alguna variación, pero las curvas parecieron normales, confirmando una población homogénea. Ambas curvas individualmente exhibieron valores mayores que el control de 19G

[0110] Las células en el pasaje 8, 15, Y 20 expresaron CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFR-alfa y HLA-A, B, C, indicadas por el aumento de fluorescencia con respecto al control lgG. Estas células fueron negativas para CD31, CD34, CD4S, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DO, indicadas por los valores de fluorescencia consistentes con el control de IgG

[0111] Los aislados de donantes separados cada uno mostró expresión positiva de CD10, CD1 3, CD44, CD73, CD 90, alfa PDGFR y HLA-A, B, C, que se refleja en el aumento de los valores de fluorescencia con respecto al control 19G. Estas células fueron negativas para la expresión de CD31 , CD34, CD45, CD117, CD141 YHLA-DR, DP, DO con valores de fluorescencia consistentes con el control de IgG.

[0112] Las células expandidas en gelatina y matraces sin recubrir fueron positivas para la expresión de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFR-alfa y HLA-A, B, C, con aumento de los valores de fluorescencia con respecto al controllgG. Estas células fueron negativas para la expresión de CD31, CD34, CD4S, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DO, con valores de fluorescencia consistentes con el control de IgG

[0113] Por lo tanto, las células derivadas de tejido de cordón umbilical son positivas para CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFR-alfa, HLA-A, B, C y negativas para CD31, CD34, CD45, CD 117, CD141 y HLA DR, DP, DO. Esta identidad era consistente entre las variaciones de variables que incluyen el donante, paso, y revestimiento de la superficie recipiente de cultivo. Alguna variación en la curva de valor de medias y rangos de histograma de valor de fluorescencia individuales se observó, pero todas las curvas positivas bajo todas las condiciones ensayadas fueron normales y expresaron valores de fluorescencia mayores que el control de IgG, lo que confirma que las células comprenden una población homogénea que tiene la expresión positiva de los marcadores.

EJEMPLO J

Caracterización inmunohistoguímica de fenotipos de células

[0114] Se recogió el tejido del cordón umbilical humano y se inmersó en 4% (pfv) de paraformaldehído durante la noche a 4Q C. La inmunohistoquímica se realizó utilizando anticuerpos dirigidos contra los siguientes epítopos: vimentina (1. 500; Sigma, SI. Louis, MO), desmina (1. 150, generado contra conejo; Sigma; o 1: 300, generado contra ratón; Chemicon, Temecula, CA), alfa-actina de músculo liso (SMA; 1: 400; Sigma), citoqueratina 18 (CK18; 1· 400; Sigma), factOf de van Willebrand (vWF; 1· 200; Sigma), y CD34 (Clase CD34 humana 111; 1· 100; Dako, Carpinteria, CA). Además, se ensayaron los siguientes marcadores: GROalfa -PE anti-humano (1. 100; Becton

Dickinson, Franklin Lakes, NJ), GCP-2 anti-humana (1· 100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), receptor 1 LDL oxidada anti-humana (ox-LDL Rl, 1. 100; Santa Cruz Biotech), y NOGO-A anti-humana (1. 100; Santa Cruz Biotech). Muestras fijadas se cortaron con un escalpelo y se colocaron dentro del compuesto de incorporación de OCT (Tissue-Tek OCT; Sakura, Torrance, CA) en un baño de hielo seco que contiene etanol. Los bloques congelados fueron entonces seccionados (10 ~m de espesor) utilizando un criostato estándar (Leica Microsystems) y se montaron en portaobjetos de vidrio para tinción

[0115] La inmunohistoquímica se realizó similarmente a los estudios previos (Messina et al., Exper Neurol, 2003;

184: 816-29). En resumen, las secciones de tejido se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se expusieron a una proteína de la solución de bloqueo que contenía PBS, 4% (vlv) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA), y 0,3% (vlv) Triton (Triton X-lOO; Sigma) durante 1 hora para acceder a antígenos intracelulares. En casos en los que se encuentra el epítopo de interés en la superficie celular (CD34, ox-LDL R1 ), Triton se omitió en todos los pasos del procedimiento con el fin de evitar la pérdida de epitopo. Además, en los casos en que el anticuerpo primario se planteó en contra de cabra (GCP-2, ox-LDL Rl , NOGO-A), 3% (vlv) de suero de burro se utilizó en lugar de suero de cabra durante todo el procedimiento. Los anticuerpos primarios, diluidos en solución de bloqueo, se aplicaron a las secciones durante un período de 4 horas a temperatura ambiente. Soluciones de anticuerpos primarios fueron removidas, y los cultivos se lavaron con PBS antes de la aplicación de las soluciones de anticuerpo secundario (1 hora a temperatura ambiente) que contiene el bloque, junto con anticuerpo de cabra anti-lgG de ratón -Texas Red (1 · 250; Molecular Probes, Eugene, OR) y/o de cabra anti-lgG de conejo -Alexa 488 (1 · 250; Molecular Probes) o de burro anti-lgG de cabra 4 FITC (1· 150; Santa Cruz Biotech). Los cultivos se lavaron, y se aplicó 10 micromolar DAPI (Molecular Probes) durante 10 minutos para visualizar los núcleos celulares

[0116] La fluorescencia se visua lizó usando el filtro de fluorescencia correspondiente en un microscopio de epifluorescencia invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). La tinción positiva fue representada por la señal de fluorescencia por encima de la tinción control. Imágenes representativas fueron capturadas utilizando una cámara de video a color digital y software de ImagePro (Media Cybernetics, Car1sbad, CA). Para las muestras de triple manchado, cada imagen fue tomada utilizando un solo filtro de emisión a la vez

[0117] La vimentina, desmina, SMA, CK18, de vWF, y marcadores de CD34 se expresaron en un subconjunto de las células que se encuentran dentro de cordón umbilical. En particular, vWF y la expresión CD34 estaban restringidos a los vasos sanguíneos contenidos en el cable. Células CD34+ estaban en la capa más intema (lado de lumen). La expresión de vimentina se encontró en toda la matriz y los vasos sanguíneos de la cuerda. SMA se limitaba a la matriz y las paredes exteriores de la arteria y la vena, pero no contenía los propios vasos. CK18 y desmina fueron observados solamente dentro de los vasos, limitándose la desmina a las capas media y exterior. La expresión de GROalfa, GCP-2, ox-LDL Rl , y NOGO-A no se observaron dentro del tejido del cordón umbilical.

EJ EMPLO 4

Análisis de oligonucleótido

[0118] Matrices de Affymetrix GeneChip® se utilizaron para comparar los perfiles de expresión génica de células derivadas de tejido de cordón umbilical con fibroblastos, células madre mesenquimatosas humanas, y otra línea de células derivadas de médula ósea humana. Este análisis proporciona una caracterización de las células derivadas del posparto e identificó los marcadores moleculares únicos para estas células.

[0119] Los cordones umbilicales humanos se obtuvieron a partir del National Disease Research Interchange (NDRJ, Filadelfia, PA) a partir de un parto normal a término con el consentimiento del paciente. Se recibieron los tejidos y las células fueron aisladas como se describe anteriormente. Las células se cultivaron en Medio de Crecimiento (usando DMEM-LG) en matraces de plástico de cultivo de tejido recubiertos con gelatina. Los cultivos se incubaron a 3rC con 5% de CÜ2.

[0120] Fibroblastos dérmicos humanos fueron adquiridos de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; Número de lote 9F0844) y ATCC CRL·1501 (CCD39SK). Ambas líneas se cultivaron en medio DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) con 10% (v/v) de suero bovino fetal (Hyc1one) y penicilina/estreptomicina (Invitrogen ). Las células fueron cultivadas en plástico estándar tratado de tejido.

[01 21] Las células madre mesenquimatosas humanas (hMSC) se compraron de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; números de lote 2F1655, 2F1656 Y 2F1657) Y se cultivaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante en MSCGM Media (Cambrex) Las células se cultivaron sobre plástico cultivadas de tejidos estándar a 3r C con 5% de COz

[01 22] Médula ósea de cresta ilíaca humana se recibió de NDRI con el consentimiento del paciente La médula se procesó de acuerdo con el método descrito por Ha, et al. fYVO 2003/025149). La médula se mezcló con tampón de lisis (155 mM NH4CI, 10 mM de KHC03, y EDTA 0,1 mM. pH 7,2) en una proporción de médula ósea de 1 parte a 20 partes tampón de lisis. La suspensión de células se sometió a vórtice, se incubó durante 2 minutos a temperatura ambiente, y se centrifugó durante 10 minutos a 500 x g. El sobrenadante se descartó y el sedimento celular se

resuspendió en medio esencial mínimo alfa (Invitrogen) suplementado con 10% (vlv) de suero bovino fetal y glutamina 4 mM. Las células se centrifugaron de nuevo y el sedimento celular se resuspendió en medio fresco. Las células mononucleares viables se contaron usando exclusión con azul de tripano (Sigma, SI. Louis, MO). Las células mononucleares se sembraron en matraces de plástico de tejido cultivado a 5 x 104 células/cm2. Las células se incubaron a 37"C con 5% de COz en 02 atmosférica estándar o a 02 de 5%. Las células se cultivaron durante 5 días sin un cambio de medio. Los medios y las células llO adherentes se retiraron después de 5 días de cultivo Las células adherentes se mantuvieron en cultivo.

[0123] Cultivos en crecimiento activo de las células se retiraron de los frascos con un raspador de células en PBS frío. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 300 x g. El sobrenadante se retiró y las células se resuspendieron en PBS fresco y se centrifugó de nuevo. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento celular se congel6 inmediatamente y se almacenó a -BOQC. ARNm celular se extrajo y se transcribió en AONc, que después se transcribió en ARNc y se marcó con biotina. La ARNc marcada con biotina se hibridó con matriz de oligonucleótido HG-U133A GeneChip (Affymetrix, Santa Clara CA). La hibridización y colección de datos se realizó de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Los análisis se realizaron usando el software de ordenador "Significance Analysis of Micromatrices" (SAM) versión 1,21 (Universidad de Stanford; Tusher et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 2002; 98: 5116-21)

[0124] Se analizaron catorce poblaciones diferentes de células. Las células junto con información de pasaje, sustrato de cultivo, y medios de cultivo se enumeran en la Tabla 1

Tabla 1. Las células analizadas por el estudio de micromatrices. Las líneas celulares se enumeran por código de identificación junto con el paso en el momento de analisis, sustrato de crecimiento celular y medio de crecimiento.

[0125] Los datos fueron evaluados por un análisis de componentes principales, analizando los 290 genes que son expresados diferencialmente en las células. Este análisis permite una comparación relativa de las similitudes entre las poblaciones. La Tabla 2 muestra las distancias euclidianas que se calcularon para la comparación de las parejas de células. Las distancias euclidianas se basan en la comparación de las células a partir de los 290 genes que son expresados diferencialmente entre los tipos de células. La distancia euclidiana es inversamente proporcional a la similitud entre la expresión de los 290 genes (p.ej., cuanto mayor sea la distancia, cuanto menos similitud existe).

Tabla 2. las distancias euclidianas para los pares de células.

ili

I

[0126] Las tablas 3 y 4 a continuación muestran la expresión de genes aumentados en las células derivadas de tejido de cordón umbilical (Tabla 3), y la reducción en las células derivadas de tejido de cordón umbilical (Tabla 4) La columna titulada "Identificación de conjunto de sondas" se refiere al código de identificación de fabricante para los

conjuntos de varias sondas de oligonucleátidos localizados en un sitio en particular en el chip, que se hibridan con el

gen llamado (columna ~Gen~), que comprende una secuencia que se puede enconlrar denlro de la base de dalos de

NCBI (GenBank) en el número de acceso especificado (columna ~número de acceso de NCBI~)

Tabla 3. Genes que muestran haber aumentado específicamente la expresión en las células derivadas de

tejido de cordón umbilical, en comparacíón con otras lineas celulares ensayadas.

I Genes ,en ,de

i,

de Nombre del gen

i ,8 2"

2~,_al

, ,8

2"

1 (actividad estimuladora 204470 al

, ,

206336 al

_al

al s al

faclo, de, í 3 alfa

Tabla 4. Los genes que muestran tener una expresión disminuida en células derivadas de tejido de cordón 25 umbilical, en comparación con otras líneas celulares ensayadas.

NM

AF(

'337 14

NM 001511

NM 002993

NM 021136 NM

Tabla 5. Los genes que mostraron tener una mayor expresión en fibroblastos en comparación con las otras líneas celulares ensayadas.

Tabla 6. Los genes que mostraron tener una mayor expresión en las células derivadas de ICBM en comparación con las otras líneas celulares ensayadas.

Genes aumentados en las células ICBM

•: proteína con repeticiones de anquirina cardíaca

•: región MHC de clase I ORF

•: integrina, alfa 10

•: proteína hipotética FLJ22362

•: UDP-N-acetilo-alfa-D-galactosamina· polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferasa 3 (GaINAc-T3)

•: proteína inducida por inlerferón 44

•: SRY (región determinante del sexo Y)-caja 9 (displasia campomélica, reversión sexual autosómica)

•: proteína asociada a queratina 1-1

•: hipocalcina 1

•: dentado 1 (síndrome de Alagille)

•: proteoglicano 1, gránulo secretor

Tabla 7. Los genes que mostraron tener una mayor expresión en las células MSC en comparación con las otras líneas celulares ensayadas. Genes aumenta en las células MSC

•: interleucina 26

•: maltasa-glucoam ilasa (alfa-glucosidasa)

•: subfamilia del receptor nuclear 4, grupo A, miembro 2

•: v-fas FBJ osteosarcoma murino homólogo de oncogén viral

•: proteína hipotética DC42

•: subfamilia de receptor nuclear 4, grupo A, miembro 2

•: FBJ osteosarcoma murino proteína de la ruta viral oncogén homólogo B

•: proteína de vía WNT1 de señalización inducible 1

•: secuencia transformante derivada de línea celular MCF.2

•: canal de potasio, subfamilia K, miembro 15

•: homeoproteína de cartílago de clase emparejada 1

•: Hamo sapiens ADNc FLJ 12232 fis, clon MAMMA1001206

•: Homo sapiens AONc FLJ34668 fis, clon LlVER2000775

•: jun B proto-oncogén

•: CLL de células Bf1infoma 6 (proteína de dedo de zinc 51)

•: proteína con dedos de zinc 36, tipo C3H, homólogo (ratón)

[0128] El análisis anterior incluye células derivadas de tres cables de diferentes cordones umbilicales y dos líneas diferentes de fibroblastos dérmicos, tres líneas de células madre mesenquimales, y tres líneas de células de médula ósea de la cresta ilíaca. El ARNm que fue expresado por estas células se analizó utilizando una matriz de oligonucleótidos que contenía sondas para 22.000 genes. Los resultados mostraroo que 290 genes se expresan diferencialmente en estos cinco tipos de células diferentes. Estos genes incluyen siete genes aumentados especificamente en las células derivadas de tejido de cordón umbilical. Se ha encootrado que cincuenta y cuatro genes tienen niveles de expresión específicamente menores en las células derivadas de tejido de cordón umbilical, en comparación con los otros tipos de células. La expresión de genes seleccionados ha sido coofirmada por PCR. Estos resultados demuestran que las células derivadas de tejido de cordón umbilical tienen un perfil de expresión de genes distintos, por ejemplo, en comparación coo células y fibroblaslos derivados de médula ósea

EJEMPLO 5

Marcadores celulares en las células derivadas de tejido del cordón umbilical

[0129] Como se demostró anteriormente, se identificaron seis genes de ~firmaH para las células derivadas de tejido de cordón umbilical: receptor de LOL oxidado 1, inter1eucina-B, renina, reticulon, ligando de receptor de quimioquinas 3 (C-X-C ligando 3), y proteina quimiotáctica de granulocitos 2 (GCP-2). Estos genes de "firma" se expresaron en niveles relativamente altos en células derivadas del posparto

[0130] Los proced imientos descritos en este ejemplo se llevaron a cabo para verificar los datos de micromatrices y encontrar concordancia/discordancia entre el gen y la expresión de proteínas, así como para establecer una serie de ensayo fiable para la detección de identificadores únicos a células derivadas de tejido del cordón umbilical.

[0131] Células derivadas de tejido de cordón umbilical (cuatro aislados), y fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF; neonatales y adultos) se cultivaron en Medio de Crecimiento con penicilina/estreptomicina en un matraz T75 recubiertos de gelatina. Las células madre mesenquimáticas (MSC) se cultivaron en bala de medio de crecimiento de célula madre mesenquimales (MSCGM; Cambrex, Walkerville, MO)

[0132] Para el protocolo de IL-8, las células se descongelaron a partir de nitrógeno líquido y se sembraron en matraces recubiertos de gelatina a 5.000 célulaslcm2, cultivadas durante 48 horas en medio de crecimiento y después se hicieron crecer durante 8 horas en 10 mililitros de privación de suero medio [DMEM-baja glucosa (Gibco, Carlsbad, CA), penicilinafestreptomicina (Gibco, Cartsbad, CA) y 0,1% (p/v) albúmina de suero bovino (BSA; Sigma, SI. Louis, MO)]. Después de este tratamiento, se extrae ARN y los sobrenadantes se centrifugaron a 150 x g durante 5 minutos para eliminar los desechos celulares. Los sobrenadantes se congelaron a -80"C para el análisis ELlSA.

[0133] Las células de posparto derivadas del cordón umbilical, así como fibroblaslos humanos derivados de prepucio neonatal humano se cultivaron en medio de crecimiento en matraces T75 recubiertos de gelatina. Las células se congelaron a paso 11 en nitrógeno líquido. Las células se descongelaron y se transfirieron a tubos de centrífuga de 15 mililitros. Después de centrifugación a 150 x g durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 4 mililitros de medio de cultivo y se contaron. Las células se cultivaron en un matraz de 75 cm2 que contenía 15 mi de medio de crecimiento a 375.000 células/matraz durante 24 horas. El medio se cambió a un medio de privación de suero durante 8 horas. El medio de privación de suero se recogió al final de la incubación, se centrifugó a 14.000 x g durante 5 minutos (y se almacenó a -20"C).

[0134] Para estimar el número de células en cada frasco, 2 mililitros de tripsinafEOTA (Gibco, Cartsbad, CA) se añadió a cada matraz Después de células desprendidas del matraz, la actividad de tripsina se neutralizó con 8 mililitros de medio de crecimiento. Las células se transfirieron a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y se centrifugaron a 150 x 9 durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y 1 mililitro de medio de crecimiento se añadió a cada tubo para resuspender las células. El número de células se estimó usando un hemocitómetro.

[0135] La cantidad de IL-8 secretada por las células en el medio de privación de suero se analizó utilizando ensayos ELlSA (R & D Systems, Minneapolis, MN). Todos los ensayos se ensayaron de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

[0136] Se extrajo ARN de células derivadas de tejido de cordón umbilical y fibroblastos confluentes o para expresión IL-8 a partir de células tratadas como se describe anteriormente. Las células se lisa ron con 350 microlitros de tampón RL T que contiene beta-mercaptoetanol (Sigma, SI. Louis, MO) según las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit; Oiagen, Valencia, CA). Se extrajo el ARN según las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit; Oiagen, Valencia, CA) y se sometió a tratamiento con AONasa (2,7 Ufmuestra) (Sigma St Louis, MO). El ARN se eluye con SO microlitros de agua tratada con DEPC y se guardó a -BO"C.

[0137] ARN también fue extraído de tejido del cordón umbilical humano. Tejido (30 miligramos) se suspendió en 700 microlitros de RL T tampón que contiene 2-mercaptoetanol. Las muestras fueron mecánicamente homogeneizadas y la extracción de RNA se procedió según la especificación del fabricante. El ARN se extrajo con 50 microlilros de agua tratada con oEPC y se guardó a -80Q C. ARN se transcribió por inversión usando hexámeros aleatorios con los reactivos de transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) a 25"C durante 10 minutos, 37"C durante 60 minutos, y 95"C durante 10 minutos. Las muestras se almacenaron a -20"C

[01 38] Los genes identificados por micromatriz de AoNc regulados de forma única en las células del posparlo (genes de firma incluyendo receptor de LoL oxidada, interleucina-8, renina y reticulon), se investigaron ad iciona lmente usando PCR en tiempo real y convenciona l.

[01 39] Se realizó la PCR en muestras de AoNc utilizando productos de expresión de genes de Assays-onoemand™: receptor de LoL oxidada (Hs00234028); renina (Hs00166915); reticulon (Hs00382515); Ligando C-X-C 3 (Hs00171061); GCP-2 (Hs00605742); IL-8 (Hs00174103); y GAPoH (Applied Biosystems, Foster City, CA) se mezclaron coo AoNc y mezcla maestra TaqMan Universal de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando un sistema de detección de secuencia 7000 con software ABI Prism 7000 SOS (Applied Biosystems, Foster City, CA). Condiciones del ciclo térmico fueron inicialmente 50"C durante 2 min y 95Q C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95Q C durante 15 segundos y 60"C durante 1 mino Datos de PCR

se anatizaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Boletin del usuario nO 2 de Applied Biosystems para ASI Prism 7700 Sequence oetecUon System)

[0140] PCR convencional se realizó utilizando un ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Bastan, Massachusetts, EE.UU.) para confirmar los resultados de PCR en tiempo real. PCR se realizó usand02 microlitros de solución de AoNc, 1 3 AmpliTaq Gold mezcla de PCR tampón de reacción universal (Applied Biosystems, Foster City, CA) y desnaturalización inicial a 94Q C durante 5 minutos. La amplificación se optimiza para cada conjunto de cebadores. Para IL-8, C-X-C ligando 3, y reticulon (94"C durante 15 segundos, 55Q C durante 15 segundos y 72"C durante 30 segundos durante 30 ciclos); para renina (94°C durante 15 segundos, 53"C durante 15 segundos y 72"C durante 30 segundos durante 38 ciclos); para el receptor de LDL oxidada y GAPDH (94"C durante 15 segundos, 5S"C durante 15 segundos y 72"C durante 30 segundos durante 33 ciclos). Los cebadores usados para la amplificación se enumeran en la Tabla 8. Primer coocentración en la reacción de PCR fi nal fue de 1 micromolar a excepción de GAPDH, que fue de 0,5 micromolar. Cebadores GAPoH fueron los mismos que en tiempo real PCR, excepto que la sonda TaqMan por el fabricante no se agregó a la reacción de PCR fina l. Las muestras se corrieron en 2% (pfv) en gel de agarosa y se tiñeron con bromuro de etidio (Sigma, St. Louis, MO). Las imágenes fueron capturadas utilizando una lámina de 667 T'Ninpack universal (VWR Intemational, South Plainfield, NJ) utilizando una longitud focal de la cámara Pala raid (VWR Intemational, South Plainfield, Nueva Jersey).

Tabla 8: Cebadores utilizados

Nombre de cebador Cebadores

Receptor LoL oxidado: S: S'-GAGAAATCCAAAGAGCAAATGG-3' (SEO ID NO: 1)

A: S'-AGAATGGMAACTGGAATAGG-3': (SEO ID NO: 2)

Ren ina: S: S'-TCnCGATGCnCGGATTCC-3' (SEa ID NO: 3)

A: S'-GAATTCTCGGAATCTCTGTIG-3': (SEO ID NO: 4)

Reticu lon: S: S'-TIACAAGCAGTGCAGAAAACC-3' (SEa ID NO: 5)

A: 5 'AGTAAACATTGAAACCACAGCC-3': (SEO ID NO: 6)

Interleucina-8: S: 5'-TCTGCAGCTCTGTGTGAAGG-3' (SEa ID NO: 7)

A: S'-CTTCAAAAACTTCTCCACAACC-3': (SEa ID NO: 8)

auimiocina (C-X-C) ligando 3: S: S' -CCCACGCCACGCTCTCC-3' (SEa ID NO: 9)

A: 5'-TCCTGTCAGTTGGTGCTCC-3': (SEO ID NO: 10)

[0141] Las células se fijaron con paraformaldehido frío al 4% (pfv) de (Sigma-Aldrich, st. Louis, MO) durante 10 minutos en temperatura ambiente. Un aislado en el pase O (PO) (directamente después del aislamiento) y dos aislamientos en el paso 11 (P11), Y se utilizaron fibroblastos (P11). La inmunocitoquímica se realizó utilizando anticuerpos dirigidos contra los siguientes epítopos: vimentina (1. 500, Sigma, SI. Louis, MO), desmina (1. 150; Sigma -levantado contra conejo; o 1· 300; Chemicon, Temecula, CA -levantado contra ratón), actina de músculo liso de alfa (SMA; 1. 400; Sigma), citoqueratina 18 (CK18; 1. 400; Sigma), factor de van Willebrand (vWF; 1. 200; Sigma), y CD34 (CD34 humana Clase 111; 1. 100; oako, Carpinteria, CA). Además, los siguientes marcadores fueron probados en células posparto de paso 11 · GRO alfa -PE anti-humano (1· 100; Becton o ickinson, Franklin Lakes, NJ), GCP-2 anti-humana (1 · 100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), receptor LDL oxidado anU-humano 1 (oxLoL R1; 1· 100; Santa Cruz Biotech), y NOGA-A anti-humana (1 · 100; Santa Cruz, Biotech)

[0142] Los cultivos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se expusieron a una solución de bloqueo de proteína que contiene PBS, suero de cabra del 4% (vfv) (Chemicon, Temecula, CA), y 0,3% (vfv) Triton (Triton X-100; Sigma, St. Louis, MO) durante 30 minutos para acceder a antigenos intracelulares. Cuando el epítopo de interés se encuentra en la superficie celular (C034, ox-LDL R1 ), Triton X-100 se omitió en todos los pasos del

procedimiento con el fin de evitar la pérdida de epítopo. Además, en los casos en que el anticuerpo primario se levantó en contra de cabra (GCP-2, ox-LDL R1 , NOGO-A), 3% (v/v) suero de burro se utilizó en lugar de suero de cabra. Los anticuerpos primarios, diluidos en solución de bloqueo, se aplicaron a los cultivos durante un período de 1 hora a temperatura ambiente. Las soluciones de anticuerpos primarios se retiraron y se lavaron los cultivos con PBS antes de la aplicación de las soluciones de anticuerpo secundario (1 hora a temperatura ambiente) que contiene el bloque, junto con anticuerpo de cabra anti-lgG de ratón-Texas Red (1· 250; Molecular Probes, Eugene, OR) y/o antiIgG de conejo de cabra -Alexa 488 (1. 250; Molecular Probes) o IgG anti-cabra de burro -FITC (1 . 150, Santa Cruz Biotech). Después, los cultivos se lavaron y 10 DAPI micromolar (Molecular Probes) se aplicó durante 10 minutos para visualizar los núcleos celulares

[0143] Después de la inmunotinción, la fluorescencia se visualizó usando un filtro de fluorescencia correspondiente en un microscopio de epi-fluorescencia invertido de Olympus (Olympus, Melville, NY). En todos los casos, la tinción positiva representó señal de fluorescencia por encima de la tinción de control donde todo el procedimiento descrito anteriormente fue seguido con la excepción de la aplicación de una solución de anticuerpo primario. Imágenes representativas fueron capturadas utilizando una cámara de video a color digital y software de ImagePro (Media Cybemetics, Carlsbad, CA). Para las muestras de triple manchado, cada imagen fue tomada utilizando un solo filtro de emisión a la vez. Montajes en capas se prepararon a continuación, utilizando el software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA).

[0144] Las células adherentes en matraces se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) y se separaron con tripsinafEDTA (Gibco, Carlsbad, CA). Las células se recogieron, se centrifugaron, y resuspendieron 3% (vfv) de FBS en PBS a una concentración celu lar de 1x107 por mililitro. Cien microlitros alícuotas se entregaron a tubos cónicos. Las células teñidas para antígenos intracelulares se permeabilizaron con tampón PermfWash (BD Pharmingen, San Diego, CA). El anticuerpo se añadió a alícuotas de acuerdo con especificaciones del fabricante y las células se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a 4Q C. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el exceso de anticuerpo. Las células que requieren un anticuerpo secundario se resuspendieron en 100 microlitros de 3% de FBS. El anticuerpo secundario se anadió de acuerdo con especificaciones del fabricante y las células se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a 4"C. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el exceso de anticuerpo secundario. Las células lavadas se resuspendieron en 0,5 mililitros de PBS y se analizaron por citometría de flujo. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: receptor LDL oxidado 1 (sc-5813; Santa Cruz, Biotech), GROa (555042; BD Pharmingen, Bedford, MA), ratón IgG1 kappa, (P-4685 y M-5284; Sigma), burro contra IgG de cabra (sc-3743; Santa Cruz, Biotech) La citometría de flujo se realizó con citómetro (Becton Dickinson San Jase, CA).

[0145] Los datos obtenidos de PCR en tiempo real se analizaron por el método MCT y expresados en una escala logarítmica. Los niveles de reticulon y expresión del receptor de LDL oxidada fueron más altos en las células derivadas de tejido de cordón umbilical, en comparación con otras células. No hay diferencia significativa en los niveles de expresión de CXC ligando 3 y GCP-2 se encontraron entre las células y los controles derivados de posparto. Los resultados de PCR en tiempo real fueron confirmados por PCR convenciona l. La secuendaciÓll de productos de PCR validaron aún más estas observaciones. No se encontró diferencia significativa en el nivel de expresión de CXC ligando 3 entre las células derivadas de posparto y controles que utilizan PCR CXC ligando 3 cebadores convencionales mencionados anteriormente.

[0146] La producción de la citoquina, IL-8 en posparto fue elevada tanto en células derivadas del posparto cultivadas den medio de crecimiento y privadas de suero. Todos los datos de PCR en tiempo real se validaron con PCR convencional y mediante la secuenciación de productos de PCR

[0147] Cuando los sobrenadantes de las células cultivadas en medio libre de suero se examinaron para la presencia de IL-8, se detectaron las cantidades más altas en medios derivados de las células umbilicales y algunos aislados de células de la placenta (Tabla 9). No se detectó IL-8 en un medio derivado de fibroblastos dérmicos humanos

Tabla 9. Cantidad de proteína IL-8 medida por ELlSA

Ti po de célula: IL ..

hFibro: NO

Umb aislado 1: 2.058,42 + 144,67

Umb aislado 2: 2368 ,86 + 22,73

Valores picogramos/millones de células, n:IE 2, sem ; NO :IE No detectado

[0148] Las células derivadas del tejido de cordón umbilical humano en el pase O se probaron para la producción de proteínas seleccionadas mediante análisis inmunocitoquímico. Inmediatamente después del aislamiento (paso O), las células se fijaron con 4% paraformaldehído y se exponen a anticuerpos para seis proteínas: Factor de van Willebrand, CD34, citoqueratina 18, desmina, actina de músculo liso-alfa, y vimentina. Células derivadas de tejido de

cordón umbilical fueron positivas para actina de músculo liso-alfa y vimentina, con el patrón de tinción consistente a través del paso 11 .

[0149] La concordancia entre los niveles de expresión de genes medidos por micromatriz y PCR (tanto en tiempo real y convencional) se ha establecido para cuatro genes: receptor LDL oxidada 1, renina, reticulon, y IL-8. La expresión de estos genes se regula diferencialmente en el nivel de ARNm en PPDCs, estando IL-8 también regulada diferencialmente a nivel de proteínas. Las células derivadas del tejido de cordón umbilical humano en el pase O se examinaron para la expresión de actina de músculo liso-alfa y vimentina, y fueron positivas para ambas. El patrón de tinción fue preservada a través del paso 11

EJEMPLO 6

Evaluación inmunológica In Vitre de las células derivadas de posparto

[0150] Se evaluaron células derivadas del posparto (PPDCs) in vitro por sus características inmunológicas en un esfuerzo para predecir la respuesta inmunológica que, en su caso, estas células provocarían sobre el trasplante in vivo. PPDCs se analizaron pOf citometría de flujo para determinar la presencia de HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, y B7-H2. Estas proteínas se expresan por las células presentadoras de antígeno (APC) y son necesarias para la estimulación directa de células T ingenuas CD4' (Abbas y Lichtman, Celular ane! Molecular Immunology, 5a Ed. (Saunders, Philadelphia, 2003; p. 171). Las lineas celulares también se analizaron por citometria de flujo para la expresión de HLA-G (Abbas y Lichtman, 2003, supra), CD 178 (Coumans, et al., Journal of Immunological Methods, 1999; 224: 185-196), y PD-L2 (Abbas y Lichtman, 2003, supra; Brown, et al., The Journal of Immunology, 2003; 170: 1257-1266). Se cree que la expresión de estas proteinas por las células que residen en tejidos de la placenta median el estado inmuno-privilegiado de los tejidos de la placenta en el útero. Para predecir el grado en que líneas de células derivadas de placenta y de tejido de cordón umbilical provocan una respuesta inmune in vivo, las líneas de células se ensayaron en una reacción mixta de linfocitos de una dirección (MLR).

[0151] Las células se cultivaron hasta la connuencia en Medio de Crecimiento que contenía penicilina/estreptomicina en matraces T75 (Corning, COfning, NY) recubiertas con gelatina al 2% (Sigma, St. Louis, MO)

[0152] Las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) y se separaron con tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, MO). Se recogieron las células, se centrifugaron y se resuspendieron en 3% (v/v) de FBS en PBS a una concentración celular de 1x101 por mililitro. Anticuerpo (Tabla 10) se añadió a un centenar de microlitros de suspensión de células según las especificaciones del fabricante y se incubó en la oscuridad durante 30 minutos a 4"C. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el anticuerpo no unido. Las células se resuspendieron en quinientos microlitros de PBS y se analizaron por citometria de flujo utilizando un instrumento FACSCalibur (Secton Dickinson, San Jose, CA)

Tabla 10.

Anticuerpo: Fabricante Numero de catalogo

HLA-DRDPDQ: BD Pharmingen (San Diego, CA) 555558

CD80: SO Pharmingen (San Diego, CA) 557227

CD86: SO Pha rmingen (San Diego, CA) 555665

87-H2: BD Pharmingen (San Diego, CA) 552502

HLA-G: Abcam (Cambridgeshire, Reino Unido) ab 7904-100

CD 178: Santa Cruz (San Cruz, CA) sc-19681

PD-L2: BD Pharmingen (San Diego, CA) 557846

Ratón IgG2a: Sigma (SI. Louis, MO) F-6522

Ratón IgGlkappa: Sigma (St Louis, MO) P-4685

[0153] Viales criopreservadas de células derivadas de tejido de cordón umbilical de paso 10 etiquetadas como línea celular A fueron enviados sobre hielo seco a CTBR (Sennevilie, Quebec) para rea lizar una reacción de linfocitos mixtos usando CTBR SOP N° CAC-031 . Se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de múltiples donantes voluntarios femeninos y masculinos. líneas celulares estimuladoras (donantes) alergénicas PSMC, autólogas PSMC, y posparto se trataron con mitomicina C. Células estimuladoras de autólogo y mitomicina C-tratadas se añadieron a PBMCs de respondedor (receptores) y se cultivaron durante 4 días. Después de la

incubación, pH]timidina se añadió a cada muestra y se cultivó durante 18 horas_Después de la cosecha de las células, se extrajo el AON radiomarcado, y [3HJ-timidina se midió utilizando un contador de centelleo.

[0154] El índice de estimulación para el donante alogéniro (SIAD) se calculó como la proliferación media de receptor

5 más donante alogénico de mitomicina e-tratado dividido por la proliferación de línea de !>ase del receptor. El índice de estimulación de los PPDCs se calculó como la proliferación media de la línea celular de posparto C-tratada con receptor más mitomicina dividido por la proliferación de línea de base del receptor.

[01 55] Se cribaron seis donantes de sangre voluntarios humanos para identificar un único donante alogérJico que

10 exhibiré una robusta respuesta de proliferación en una reacción de linfocitos mezclados con los otros cinco donantes de sangre _Este donante fue seleccionado como el donante de control positivo alogénico_Los cinco donantes de sangre restantes fueron seleccionados como receptores. El donante alogénico de control positivo y las líneas celulares de placenta tueron C-tratados por mitomicina y se cu ltivaron en una reacción de linfocitos mezclados con los cinco receptores alogénicos individuales_ Las reacciones se realizaron por triplicado utilizando dos placas de

15 cultivo celular con tres receptores por placa (Tabla 11). El índice medio de estimulaciÓll varió de 6,5 (placa 1) a 9 (placa 2) y controles positivos de donante alogénico variaron de 42,75 (placa 1) a 70 (placa 2) (Tabla 12).

Tabla 11. Reacción mixta de linfocitos Línea Celular Data-A (cordón umbilical)

OPM para ensayo 6e I)tOIlletadón Placa 10: Placa 1

N' anallbco: St__stema de culb,vo ReplicaOol 1 2 3 Me(l18 SO CV

Unea (le baSoe de ptaliferaClÓfl ÓfI raoeptor de: 1074 406 391 623.7 390_07 62.5

DPM pata anu,c de proIifend6n Placa . ~1R_

N' analltlco: S<stema de ..IlOVo 1 2 3 ...." DE cv

ar~041 iIoU:cestlmJl.iQOn

te'"autólc9a Ir¡~con mac-on..C) IM04-2478 OCI'Iame aIcJ9I!nco MLR MM·2.77 (ntada DlII: 672 510 1402 861 .3 475.19 55.2

mllOt\'IIOI'I.t el MLR con *,aa oeII.Ilar (eMIta tratada oon mI~ n:.cs. oon lI'IIIarTIIOrW e 01: 437n 48391 38231 43466.3 5087.12 11.7

"'Al: 2914 5622 "09 4881.7 1721.36 35.3

SI (00I'I.,18) SI (INi celular): 70 8

Une. ese ca.. oe ~

de raceplOl' de C:C:l'urol C.fI ....toes:wwt.C>6n (UlUlas aulC!/ogas ntlOU con: 530 508 527 521 ,7 11.93 2.3

m.1QITION. el donanllt 8IogerIjc:o MLR IM04-2479 l~,()a·2-<e?r (1rI:.ada con rTilOtnlC:Wla el: 701 5.7 11 tI 793.0 283.43 35.7

MLR con 11n.. ceU.at (CIWuI.iI tralada con mí~ Ira"..ada con mitomtcw>a e Oa ~po Al: 25593 24732 22707 24344.0 1481.61 5.1

: 5086 3932 1497 3505.0 1832.21 52.3

SI (lkInMItI) SI (\InN ceIuIaf): 47 7

L{e: inea ae DlN ae proIiÑf8aQn de receplOf de control de lIuloes:wnuI'aclOn élUlallll.l6logu 1I1I1aOa& ton 1192 854 1330 1125.3 24-4.90 21.8

rTl(tomIoon.a tI CIOnantB ~MLR: 2963 993 2197 2051 .0 993.08 48.4

IM04-2480: l"'04-2-477 (mtada 00I'I rTiIOmu;:iNC)

(at: MLR con Unu C1I!Jf.br Hu!a tra:ada 000 milOmlClna rr..ada Don lI'Iitcmiona ede 25416 29721 23757 26298.0 3078.27 11.7

...·l: 2596 507' 3426 3699.3 1262.39 34.1

SI (Oonante ) SI (1M. oeVar): 23 3

L: neil oe 08M oe p-cifefllOlClrl OC! receptor dio 695 451 555 567.0 122.44 21.6

65 Tabla 12. índice promedio de estimulación de células derivadas de tejido de cordón umbilical y un donante alogénico en una reacción mixta de linfocitos con cinco receptores alogénicos individuales.

Indice romedio de estimulación

Recipiente: Ombligo

Placa 1 receptores 1-4): 42,75 6,5

Placa 2 rece tor 5: 70 9

[0156] Los histogramas de las células derivadas de tejido de cordón umbilical ana lizados por el flujo de cilomelría que mueslra la expresión negativa de HLA-DR, DP, Da, CD80, CD86, y B7-H2, como se ha señalado por valor de fluorescencia coherenle con la IgG de conlrol, lo que indica que líneas celulares umbilicales carecen de las moléculas de superficie celular necesarias para estimular directamente células T CD4+ Los histogramas de las células derivadas de tejido de cordón umbilical ana lizados por flujo muestran cilometría de expresión positiva de PDL2, como se ha ind icado por el incremento del va lor de la fluorescencia con respecto al control IgG, y la expresión negativa de CD 178 y HLA-G, según lo observado por valor de fluorescencia consistente con el control de IgG

[0157] En las reacciones de linfocitos mixtos realizados con líneas celulares derivadas de tejido de cordón umbilical, el índice medio de estimulación varió de 6,5 a 9, y la de los controles positivos alogénicas varió de 42,75 a 70 Líneas celulares derivadas de tejido de cordón umbilical fueron negativas para la expresión de las proteínas estimulantes de HLA-DR, HLA-DP, HLA-DO, CD80, CD86, y B7-H2, tal como se mide por citometría de flujo. Líneas de células derivadas de tejido del cordón umbilical fueron negativas para la expresión de proteínas de inmunomodulación de HLA-G y CD178 y positivas para la expresión de PD-L2, medida por citometría de flujo. PBMCs de donantes alogénicos contienen células presentadoras de antígeno que expresan HLA-DR, Da, CD8, CD86, y B7-H2, permitiendo de este modo la estimulacion de células T ingenuas de CD4'. La ausencia de moléculas de superficie celular presentadoras de antígeno sobre las células derivadas de tejido de cordón umbilical y placenta necesarias para la estimulación directa de células T ingenuas CD4> y la presencia de PD-L2, una proteína inmunomcxluladora, puede explicar el bajo índice de estimulación exhibida por estas células en un MLR en comparación con los controles alogénicos

EJEMPLO 7

Secreción de factores Iróficos por células derivadas de tejido del cordón umbilical

[0158] Se midió la secreción de factores tróficos seleccionados a partir de células derivadas de tejido de cordón umbilical. Factores seleccionados para la detección incluyen: (1) los conocidos por tener actividad angiogénica, tal como el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (Rosen et al., Ciba Found Symp., 1997; 212: 215-26), proteina quimiotáctica de monocitos 1 ( MCP-1) (Salcedo et al., Blood, (2000; 96: 34-40), interleucina-8 (IL-8) (Li et al., J. Immunol, 2003; 170: 3369-76), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) (Hughes et al., Ann Thorac Surg, 2004; 77: 812-8), metaloproteinasa de matriz 1 (TIMP1), angiopoyetina 2 (ANG2), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFBB), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF), factor de 1alfa derivado del eslroma (SDF-1 alfa); (2) los conocidos por tener actividad neurotróficafneuroprotectora, tal como el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) (Cheng et al., Dev Biol, 2003; 258: 319-33), interleucina-6 (IL-6), en proteína de granulocitos quimiotáctica 2 (GCP-2), factor de crecimiento transformante beta 2 (TGFbeta2); y (3) los conocidos por tener actividad de quimioquinas, tales como proteína 1alfa de macrófago inflamatorio (MIP1a), proteína 1 beta de macrófago inflamatorio (MIP1b), quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), RANTES (reguladas en la activación, células T normales expresadas y secretadas), 1309, timo y quimiocina regulada por activación (TARC), eotaxina, quimioquina derivada de macrófagos (MDC), IL-8)

[0159] Las células de cordón umbilical, así como fibroblastos humanos derivados de prepucio neonatal humano se cultivaron en Medio de Crecimiento con penicilinafestreptomicina en matraces T75 recubiertos de gelatina. Las células fueron crioconservadas en el paso 11 y se almacenan en nitrógeno líquido. Después de la descongelación de las células, el medio de crecimiento se añadió a las células, seguido de la transferencia a un tubo de centrífuga de 15 mi y centrifugación de las células a 150 x 9 durante 5 minutos. El sobrenadante se descartó. El sedimento celular se resuspendió en 4 mililitros de medio de crecimiento, y se contaron las células. Las células se sembraron a matraz de 375.000 célu lasf75 cm1 que contenía 15 mi de medio de crecimiento y se cultivaron durante 24 horas. El medio se cambió a un medio libre de suero (DMEM de baja glucosa (Gibco), 0,1% (pfv) de albúminafsuero bovino (Sigma), penicilinafestreptomicina (Gibco» durante 8 horas. El medio libre de suero acondicionado se recogió al final de la incubación por centrifugación a 14.000 x 9 durante 5 minutos y se almacenó a 20Q C. Para estimar el número de células en cada matraz, las células se lavaron con PBS y se separaron por medio de 2 mililitros de tripsinafEDTA. La activídad de la trípsína fue ínhíbída por adícíón de 8 milílítros de Medío de Crecímíento. Las células se centrifugaron a 150 x g durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante, y las células se resuspendieron en 1 mililitro de Medio de Crecimiento. El número de células se estimó usando un hemocitómelro.

[0160] Las células se cultivaron a 3rC en dióxido de carbono y oxígeno atmosférico al 5%. Células derivadas de placenta (lote 101503) también se cultivó en 5% de oxígeno o beta-mercaptoetanol (BME). La cantidad de MCP-1, IL-6, VEGF, SDF-Ialfa, GCP-2, IL-8, Y TGF-beta 2 producida por cada muestra de células se midió mediante un

Eo.8867441 0.5-0.4-20.17

ensayo ELlSA (R&D Systems, Minneapolis, MN) Todos los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5 10.: [01 61] Las quimiocinas (MIPla, MIP1b, MCP-1, RANTES, 130.9, TARC, eotaxina, MDC, IL8), BDNF, Y los factores angiogénicos (HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMP1 , ANG2, PDGF-BB , TPO, HB-EGF se midieron utilizando SEARCHLlGHT® Proteome Arrays (Pierce Biotechnology Inc.). Matrices de proteoma son ELlSAs de sandwich multiplexados para la medición cuantitat iva de dos a 16 proteínas por pocillo. Las matrices se producen mediante la detección de un patrón 2 x 2, 3 x 3, o 4 x 4 de cuatro a 16 anticuerpos de captu ra diferentes en cada pocillO de una placa de 96 pocillos. Después de un procedimiento de sándwich ELlSA, toda la placa se forma para capturar la señal quimioluminiscente generada en cada punto dentro de cada pocillo de la placa. La cantidad de señal generada en cada punto es proporcional a la cantidad de proteina diana en el estándar origina l o muestra

15: [0162] MCP-1 e IL-6 fueron secretadas por las células derivadas de tejido del cordón umbilica l y fibroblastos dérmicos (Tabla 13). SDF-Ialfa fue secretada por los fibroblastos. GCP-2 e IL-8 se secretaron por las células derivadas de tejido de cordón umbilical en cu ltivo en presencia de BME o 5% de 0 2. GCP-2también se secretó por los fibroblastos humanos. TGF-beta2 no era detectable por el ensayo ELlSA.

Tabla 13. Resultados de ensayo ELlSA

MCP 1: IL 6 V EGF SDF1( GCP2 IL-8 TGFbeta2

Fibroblastos: 17+1 61+3 29+2 19+1 21+1 NO NO

COfdón umbilical (022803): 115D±74 4234±289 NO NO 16o..:t11 2o.58±145 NO

COfdón umbilical (071003): 2794±84 1356.±43 NO NO 2184.±98 2369!:23 NO

Los va lores presentados son detectado: picogra/millón de células/milil itro ms (n -2. sem); NO -no

30 [0163] TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1b, MCP1, RANTES, 130.9, TARC, MDC, y la IL-8 se secretaron a partir de células derivadas de tejido de cordón umbilical (Tablas 14 y 15) No se detectó Ang2, VEGF, o PDGF-BB

35 Tabla 14. Resultados de ensayo SearchUght® multiplexado ELlSA

ili de tejido (0.2280.3), U3 == I I

Tabla 15. Resultados de ensayo SearchUght® Multiplexed ELlSA

MIP1a

hFB

NO

P1

79,5

U1

NO

P3

NO

U3

NO

MIP1b: MCP1 RANTES 130.9 TARC Eotaxina MOC IL8

NO: 39,6 NO NO 0,1 NO NO 20.4,9

NO: 228,4 4,1 NO 3,8 12,2 NO 413,5

8,0: 1694,2 NO 22,4 37,6 NO 18,9 51930. ,1

NO: 10.2,7 NO NO 0,4 NO NO 63,8

5,2: 20.18,7 41 ,5 11 ,6 21,4 NO 4,8 10.515,9

hFB -fibroblastos humanos, células U1 -células derivadas de tejido del cordón umbilical (0.2280.3), U3 =células derivadas de tejido de cordón umbilical (0.710.0.3), ND =No detectado.

[0164] Las células derivadas de tejido de cordón umbilical secretan una serie de factores tróficos altamente

60. beneficiosos. Algunos de estos factores tróficos, tales como TIMP1, un inhibidor catabólico, desempeña un papel crítico en la prevención de la degradación de la matriz exlracelular por metaloproteasas de matriz. HGF, bFGF, MCP-1 Y IL-B, desempeñan papeles importantes en las funciones de supervivencia celular y la diferenciación celular. Otros factores tróficos, tales como BDNF y IL-6, tienen un papel importante en la regeneración neural.

65 EJEMPLO 8

[0165] Las células derivadas de tejido del cOfdón umbilical humanos expandidas en cultivo (022.803 P4) se sembraron en placas de cultivo tisular de 6 pocillos y se cultivaron en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM}-baja glucosa, suero bovino felal al 15% (FBS), penicilinalestreptomicina (PIS), beta-mercaptoetanol (BME) a aproximadamente 70% de confluencia. Las células se trataron entonces coo medios que contienen 10 ~m de respectivo inhibidor de la reductasa de la HMG-CoA (ácido simvastálico (Alexis Biochemicals, Lausen, Suiza) formulado como reactivos mader de 10 mM en OMSO) o vehiculo DMSO -0,1% (Sigma, SI. Louis, MO) y se incubó durante la noche. El medio se retiró por aspiración y se reemplazó coo medio que contenía 500 Ulml rhlFN-gamma (BO Pharmingen, Franklin Lakes, NJ) y 10 ~m de inhibidor respectivo de la reductasa de la HMG-CoA y se incubó durante 3 días. En el tercer día, las células se recogieron con tripsina.

[0166] Las célu las recogidas se lavaron una vez con PBS y se resuspend ieroo en 100 ~I de 3% FBS en PBS con 20 ¡.JI de HLA-OR, DP, Da marcado con FITC (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) o anticuerpo IgG marcado con FITC (BO Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y se incubó durante una hora. Las células se lavaron una vez en PBS y se resuspendieron en 500 ¡.JI de PBS y se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (BS Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

Tabla 16. Expresión HLA-DR, DP, DQ de HUTC medido por valores de intensidad de fluorescencia de FITC pre-tratados con inhibidor de la reductasa de la HMG-CoA y además tratados con IFN-gamma de citoquinas inflamatorias.

h-ratamiento de inhibidor de reductasa: Control lgG IFN-gammatratada Tratamiento sin citoquina

HMG-CoA: Media Dev. Est. Media Dev. Est Media Dev. Est

Sin tratar: ,88 5,12 274,23 219,04 5,56 8,97

Control de vehículo OMSO 0,1 %: ,09 5,67 294,08 257,08 5,54 5,46

Simvastatina: ,4 2,38 5,57 3 ,98 5,66 3,25

[0167] Tal como se muestra en la Tabla 16, células derivadas de tejido de cordón umbilical humanas de control de vehiculo de DMSO 0,1% no tratadas y incubadas con IFN-gamma de ciloquina inflamatoria mostró un aumento de HLA-DR, DP, expresión Da como se ve por el aumento de la fluorescencia detectada por citometría de flujo. Células derivadas de tejido de cordÓf'l umbilical humano pre-tratadas con un inhibidor de la reductasa de la HMG-CoA y posteriormente incubadas con IFN--gamma mostraron expresión de HLA-DR, DP, Da similares a los controles no tratados y de vehículos.

[0168] Estos datos indican que la reductasa de HMG-CoA inhibe la expresión de HLA-DR, DP, Da mediada por citoquinas inflamatorias en las células derivadas de tejido de cordón umbilical humano.

Ejemplo 9

Eficacia de células derivadas de tejido de cordón umbilical humano fHUTCl en un modelo de conejo de degeneración de disco interverlebral

[0169] Un estudio se realizó para determinar si las células derivadas de tejido umbilical humano (HUTC) soo eficaces en un modelo de conejo de degeneración de disco interveriebral (OIV). Las células se inyectan en el sitio de dimensiones de lesiones y de disco evaluadas por imágenes de rayos X El análisis de los tejidos se realizó en la necropsia.

[0170] Para evaluar los efectos de las células humanas de cordÓf'l umbilical derivadas de tejido (hUTC) en degeneración de disco intervertebral (OIV), hUTC se inyectaron en una DIV perforada. Radiografías bisemanales se obtuvieron y se analizaron para el cambio de altura del disco en comparación con el control tratado con vehiculo lesionado. El tratamiento con hUlC resultó en altura de disco aumentada, así como aumento de la tasa de recuperación en comparación con los controles del vehículo.

[0171] Creación de modelo de degeneración de disco: se seleccionaron conejos NZW hembras a los 6 meses de edad sin ningún tipo de sesgo sistémico. Los animales fueron etiquetados y se pesaron antes de la inscripción e inmediatamente antes de la necropsia. Los conejos recibieron glicopirolato (0,01 a 0,02 mgfk.g SO) antes de la sedación para reducir las secreciones orotraqueales y disminuir bradicardia asociada con la anestesia. La buprenorfina (buprenorfina HCI 0,03 mglkg) se administró preoperativamente como un analgésico preventivo. Los conejos se anestesiaron mediante la administración de clorhidrato de ketamina (25 mglkg) y maleato de acepromazina (1 mglkg, 10 mg/ml) para facilitar la intubaciÓf'l endotraqueal. Una radiografía pre-operatoria se tomó

como un control de línea de base. Una dosis de xilacina a 5 mglkg se administra por vía subcutánea o por vía intramuscular después de completarse las radiografías preoperatorias. Los animales se mantuvieron por inhalación de isoflurano (inducida en 2-3%, y se mantuvieron a 0,5-2%)

[0172] Los conejos (3,5 kg de peso) se colocaron en decubito prono lateral. Tras la preparación y cubierta, las DIVs de zona lumbar fueron expuestas a través de un enfoque retroperitoneal posterolateral mediante disección roma del músculo psoas. Se expusieron las superficies anteriores de tres DIVs lumbares consecutivas (L2/3, L3f4 Y L4f5). Mediante la utilización de una aguja 18G con un dispositivo de tapón que permite que la aguja entre a una profundidad de 5 mm, el anillo fibroso se pinchó en el aspecto ventral en el núcleo pulposo en los niveles L2/3 y L4f5. Una grapa vascular y una sutura se colocaron en el músculo psoas en el nivel L3f4 como marcadores. La herida quirúrgica creada fue reparada en capas. La piel se cerró con grapas

[0173] Después de la operación, una radiografía post--operatoria fue tomada para confirmar el nivel de la punción Se le dio 1,5 mg de meloxicam por vía oral (un dia antes de la cirugía y 2-3 dias después de la operación) Un analgésico (buprenorfina HCI 0,01 -0,03 mgfkg) se administró hasta dos veces al día durante 2-3 días, según sea necesario, en consulta con el personal veterinario. Después de la recuperación de la anestesia, los conejos fueron devueltos a sus jaulas y movilizados ad lib. Chaquetas de conejo se utilizaron en conejos para evitar que llegaran y perturbaranlvolvieran a abrir la incisión quirúrgica y eliminaran las grapas.

[0174] Evaluación de los tratamientos: Cuatro semanas después de la cirugía inicial (punción anular), un procedimiento quirúrgico similar se hizo desde el lado opuesto para evitar la hemorragia de la cicatriz formada a partir de la primera operación. Una vez que los discos en degeneración quirúrgica fueron confirmados por rayos X e inspección visual, PBS, 1.000.000 o 100.000 células se inyectaron intradiscalmente en el área de núcleo pulposo con una microjeringa con una aguja 28G, tanto a niveles L2/3 como L4f5 para cada conejo. L3f4 se dejó como control sin heridas, sin tratar. Después de la reparación de la herida quirúrgica, los conejos fueron devueltos a sus jaulas y estrechamente vigilados. Como se describió previamente, un analgésico y un antibiótico se administró durante tres dias. Cada conejo recibió 1,5 mg de meloxicam por vía oral (un día antes de la cirugía y 2-3 dias después de la operación). El comportamiento, el apetito y el cambio en el peso corporal fueron monitorizados y el personal veterinario y los investigadores controlados por estrés post--quirúrgico

[0175] Tocios los materiales de inyección se prepararon en condiciones estériles_ hUTC de calidad para investigación (Lote 0030306), evaluada con respecto a la esterilidad, micoplasma, cariotipo, y los patógenos se utilizaron para este estudio. Células criogénicamente almacenadas se descongelaron rápidamente y se diluyeron en PBS. Las células se centrifugaron y el sobrenadante se eliminó. Las células se resuspendieron en PBS y se contaron para lograr una concentración final de células de cualquiera de 100.000 o 10.000 células por microlitro. Azul de tripano se utilizó para evaluar la viabilidad. Diez microlitros de células se cargaron en micro-jeringas preesterilizadas y se inyectaron en la DIV como se describe anteriormente

[0176] En 2-, 4-, 6-, 8-, 10-, 12-, 14-Y 16-semanas post-punción y sacrificio a las 16 semanas post-punción, se realizaron radiografías para medir la altura de OIV después de la administración de clorhidrato de ketamina (25 mglkg) y maleato de acepromazina (1 mgfkg)

[0177] A las 16 semanas después de la punción anular inicial [correspondiente a las semanas 12, después de la inyección (células)], ocho conejos en cada grupo se anestesiaron con hidrocloruro de ketamina (25 mg/kg ) y maleato de acepromazina (1 mglkg) y la eutanasia con una dosis en exceso de pentobarbital (90 mglkg, solución de eutanasia B: Henry Schein Inc., Melville, NY).

[0178] Láminas de rayos X obtenidas antes de la punción, en cada punto de liempo después de la punción, yen la eutanasia se digitalizaron y se midió la altura del cuerpo y la altura del disco vertebral. La altura de OIV se expresó como OH! de acuerdo con mélodos publicados (Chujo el al., Spine, 2006; 31 : 2909-17; Masuda el al., Spine, 2006; 31 · 742-54). Un investigador ortopédico, ciego al grupo de tratamiento, interpretó de forma independiente todas las imágenes de rayos X. Rayos X digitalizados, medidas, incluyendo la altura del cuerpo vertebral y la altura de DIV, se analizaron mediante el programa personalizado para el software MATLAB (Natick, MA). Los datos fueron transportados al software Excel y la altura OIV se expresó como el índice de la altura del disco (DHI = altura OIV/altura del cuerpo OIV adyacente) basado en el método de Lu el al., Spine, 22: 1828-1834 (1997), con una ligera modificación. La altura media de DIV (OHI) se calculó promediando las mediciones obtenidas a partir de las porciones anterior, media y posterior de la OIV y dividiéndola por la media de las alturas de los cuerpos vertebrales adyacentes. El % DHI se expresó como (DHI postoperatoria/OHI preoperatoria) x 100. Además, el % de OHI se normalizó utilizando el nivel de L3/4 como el nivel de control. El % de DHI normalizada =(nivel experimental % OHII L3f4 %DHI) x 100. La tasa de recuperación también se calculó de la siguiente manera· (% DHI (punto de tiempo) -% OHI (4W [punción])) f {1 00 -% OHI (4W [punción]))

[0179] La importancia de las diferencias entre medias de los datos sobre las mediciones de rayos X fue analizada por medidas repetidas de dos vias ANOVA, o ANOVA de una via y PLSO de Fisher como una prueba post hoc Todos los datos se expresan como la media!: error estándar. El análisis estadístico se realizó utilizando Statview (Versión 5,0, SPSS, Chicago, IL) paquete de programas con un nivel de significancia de p<0,05.

[0180] El índice de altura del disco se evaluó cada dos semanas como se describió anteriormente. Los discos con menos de un déficit de 10% fueron excluidos del estudio. Los datos (mostrados en la Tabla 17) indican que la altura del disco se aumentó con una dosis hUTC de 100.000 células y disminuyó con una dosis de 1.000.000 de células en comparación con el control entre 2-12 semanas post-trasplante (6-16 semanas post-punción) (p<O,OS hUTC

(1 .000.000) vs hUTC (100.000) 2, 4, 6, Y 14 semanas después del trasplante, p<0,01 8 semanas después del trasplante)

Tabla 17. Efecto de hUTC en la altura del disco

Altura del disco (%) Control Control-SE 1,00E+06 SE 1,00E+OS SE: ° 2 4 Pre-OP 2W-P 4W100,0 79,4 79,3 0,0 3,2 2,8 100,0 76,6 76,6 0,0 2,2 1,5 100,0 84,8 76,6 0,0 1,7 2,6 6 8 10 12 14 16 2W 4W 6W 8W 10W 12W 78, 79,S 78 , 77,1 74,8 78, 2,1 2,6 3,4 4,6 3,6 2,0 74, 74,6 72,7 70, 74,4 72, 2,1 1,8 2,1 1,4 1,8 2,8 83,7 83,8 81 , 86,0 82,4 82,2 2,7 3,3 1,9 3,1 4,2 3,8

[01 81] Tasa de recuperación se midió como se describió anteriormente. Los discos con menos de un déficit de 10% fueron excluidos del estudio. Los datos (mostrados en la Tabla 18) indican que la tasa de recuperación se aumentó con una dosis hUTe de 100.000 y se disminuyó con una dosis de 1.000.000 en comparación con el control entre 212 semanas post-trasplante (6-16 semanas post-punción). (p<0,05 vs. control hUTC (100.000 células) 2 y 14 semanas post-trasplante; p<0,0112 semanas post-trasplante).

Tabla 18. Efecto de hUTC en la Tasa de recuperación (% )

índice de recuperación: °Pre-OP 2 2W-P 4 4W-P 6 2W 8 4W 10 6W 12 8W 14 16 10W 12W

Control: 0,0 0,0 0,0 -0,1 0,1 0,1 ",,1 ",,3 ",,2

Control-SE: 0,0 0,0 0,0 0,1 0,2 0,2 0,3 0,2 0,2

1,00E+06%: 0,0 0,0 0,0 ·0,1 -0,1 -0,2 ",,3 -0,1 ",,2

SE: 0,0 0,0 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

1,00E+OS%: 0,0 0,0 0,0 0,3 0,2 0,1 0,4 0,3 0,3

SE: 0,0 0,0 0,0 0,1 0,2 0,1 0,2 0,1 0,1

4S: [01 82] Por lo tanto, se evaluaron los efectos de hUlC sobre la degeneración de OIV en un modelo de conejo de degeneración de OIV inyectando hUTC en una OIV pinchada en dosis de 1.000.000 y 100.000 célu lasfinyección. Radiografias bisemanales se obtuvieron y se analizaron para el cambio de altura del disco en comparac ión con el control de perforación sin trata r. Los datos indicaron que el tratamiento con hUTe a una concentración de 100.000 dio como resultado un aumento en la altura del disco, en donde el tratamiento con una concentración de 1.000.000 disminuyó la altura del disco en comparación con el control tratado con PBS (Tabla 17). El análisis adicional de los datos reveló que la tasa de recuperación (la cantidad de recuperación/d isminución total de % de OHI normalizado) de los d iscos tratados con hUTC (100000) era mayor que la de control (Tabla 18).

55: Ejemplo 10 Expresión de proteínas umbilical in vitro de matriz extracelular por las células de tejidos humanos derivados de cordón

[01 83] Se realizó un estudio para determinar el grado de expresión de las tres proteínas de la matriz extracelular agrecano, colágeno I y colágeno 11 por hUlC in vitro. Las célu las se ensayaron solos y después de la estimulaciÓll con los factores tróficos, TGF-beta, GOF-5 y POGF-BB

65: [01 84] Los cultivos de células humanas umbilicales derivadas de tej ido (HUTC; lote 120304) se mantuvieron en cu ltivo bajo condiciones estándar. En resumen, las célu las se sembraron a 5000 células por cm cuadrado en matraces T con pasaje y resiembra cada 3-4 dias. Las células para el experimento de factor trófico se encapsularon en perlas de al9inato y se trataron con factores al medio de crecimiento estándar. Los cu ltivos se complementaron

con ácido ascórbico a 100 ¡.Jg/ml. Factores probados eran PDGF-BB a 10 ng/ml, TGFbeta-1 aS ng/ml y GDF-S a 200 ngfml. Se crearon cinco grupos de tratamiento, hUTC solo, hUTC con GDF-5, hUTC con TGF-beta1 , hUTC coo PDGF-BB y hUTC con TGF-beta1 y GDF-5

[0185] Después de 2 semanas en cultivo, las células fueron liberadas de alginato, se lavaron, se sedimentaron y se congelaron. Se aisló el ARN y la transcripción inversa se llevó a cabo para generar ADNc Las muestras se analizaron por PCR en tiempo real para la expresión de agrecano, colágeno de tipo I Y de tipo 11.

[0186] Los resultados del análisis en tiempo real PCR muestran la expresión bajo cinco condiciones de cultivo diferentes. Los resultados se muestran en la Tabla 19 y se expresan como expresión relativa a hUTC sin tratamiento de factor de crecimiento. Los cultivos tratados con PDGF-BB y GDF-S con TGF-beta1 mostraron una expresión comparable de agrecano, colágeno I y colágeno 11. Las células tratadas con TGF-beta1 mostraron cierta inducción de colágeno I y colágeno 11 y agrecano de aproximadamente 10-20 veces. La inducción más alta se observó con GDF-5 de tratamiento. Las células mostraron aproximadamente un aumento de 50 veces en agrecano y colágeno de tipo I y un aumento de más de 300 veces en la expresión de colágeno de tipo 11.

Tabla 19. Expresión de proteínas de matriz extracelular por hUTe in vitro.

Relative mRNA

Agrecanc: Colágeno I Colágeno 11

hUTC: 1 1 1

hUTC + GDF-5: 56 45 3B7

hUTC + GDF-SfTGF beta: 1 1 11 3

hUTC + PDGF: 1 <1 <1

hUTC + TGF beta: 23 7 13

LISTADO DE SECUENCIAS

[01B7]

<110> BROWN, LAURA GOSIEWSKA, ANNA KIHM , ANTHONY J . KRAMER, BRIAN

<120> DEGENERATION DE DISCO DE TRATAMIENTO INTERVERTEBRAL UTILIZANDO CÉLULAS DERIVADAS DE TEJIDO DE CORDÓN UMBILICAL HUMANO

<130> 026038.0224PTUS

<140>

<141 >

<150> 611016.849

<151 > 2007-12-27

<160> 10

<170> versión de patentln 3,S

<210> 1

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial· cebador sintético

<400> 1 aagagcaaat gg gagaaatcca 22

<210> 2 <211>21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

5 <223> Descripción de la secuencia artificial" cebador sintético

<400> 2 agaatggaaa actggaalag 9 21

<210> 3

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial" cebador sintético

<400> 3 IIcggatlcc tctlcgatgc 20

<210> 4

<211> 21 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial" cebador sintético

<400> 4 gaaltctcgg aatctctgtt 9 21

35 <210> 5

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial" cebador sintético

<400> 5 45 tlacaagcag tgcagaaaac c 21

<210> 6

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial" cebador sintético

<400> 6 gaaaccacag cc agtaaacalt 22

<210> 7

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

65 <223> Descripción de la secuencia artificial" cebador sintético

<400> 7 tctgcagctc tgtgtgaagg: 20

5: <210> 8 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial" sintético

15: <400> 8 ttctccacaa cc cttcaaaaac 22

20: <210> 9 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial

25: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: sintético <400> 9 gctctcc cccacgccac 17

30: <210> 10 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial

35: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: sintético

40: <400> 10 tcctgtcagt tggtgctcc 19

45

50

55

cebador

Claims

Reivindicaciones

1. Las células obtenidas a partir de tejido humano del cordón umbilical, en el que el tejido del cordón umbilical esta

5 sustancialmente libre de sangre, donde las células: se pueden obtener por digestión enzimatica de tejido del cordón umbilical humano que esta sustancialmente libre de sangre con una metaloproteasa, una proteasa neutra y una proteasa mucolílica; son capaces de auto-renovación y expansión en cu ltivo; tienen el potencial de diferenciarse; y tienen las siguientes características:

10 a) expresar CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFR-alfa, PD-L2, y HLA-A, B, e como se detecta por la citometria de flujo; b) no expresar CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD141, CD178, HLA-G, CD117 y HLA-DR, DP, Da como se ha detectado por citometría de flujo; c) no expresar la telomerasa ; y

15 d) expresar, con relación a un fibroblasto humano, células madre mesenquimales, o cresta iHaca de células de médula ósea, aumento de los niveles de interleucina 8, reticulon 1, quimiocinas (CXC motivo) ligando 1 o quimiocinas (CXC motivo) ligando 3,

para uso en el tratamiento de una enfermedad o condición relacionada con la degeneración del disco intervertebral 20 mediante la administración de las células en el núcleo pulposo o anillo fibroso del disco intervertebral
2. Las células para el uso de la reivindicación 1, donde el tratamiento comprende la administración a las células

(a) por inyección; 25 (b) encapsuladas dentro de un dispositivo implantable,

(c)

mediante la implantación de una matriz que comprende las células,

(d)

con al menos otro tipo de célula; o

(e)

con al menos un agente.

30 J. Las células para el uso de la reivindicación 2d, en las que al menos otro tipo de célula

(a)

se administra simultaneamente con, o antes, o después de las células obtenidas a partir de tejido de cordón umbilical humano, o

(b)

se ha diseñado para expresar al menos un producto génico exógeno.
4. Las células para el uso de la reivindicación 3b, donde el producto del gen exógeno

(a)

es un factor trófico, o

(b)

es TGF-beta o GDF-5 que modula la expresiórJ de una o más proteínas de la matriz extracelular.
5. Las células para el uso de la reivindicación 2e, donde al menos un agente

(a) se administra simultáneamente con, antes de, o después de la administración de las células obtenidas a partir

de tejido de cordón umbilica l humano; o 45 (b) es un factor trófico
6. Las células para el uso de la reivindicación 5b, donde el factor trófico

(a) se selecciona del grupo que coosiste en: TGF-beta, GDF-5, PDGF-BB Y TIMP1; o

50 (b) es TGF-beta o GDF-5 que ejerce un efecto tráfico sobre las células obtenidas a partir de tejido de cordÓfl umbilical humano
7. Las células para el uso de la reivindicación 6b donde el efecto trófico comprende el aumento de la expresión de una o más proteínas de la matriz extracelular.
8.

Las células para el uso de la reivindicación 1, donde las células se han diseñado para expresar al menos un producto génico exógeno.
9.

Las células para el uso de la reivindicación 8, donde el producto del gen exógeno

(a)

es un factor tráfico; o

(b)

es TGF-beta o GDF-5 que modula la expresiórJ de una o más proteínas de la matriz extracelular.
10. Las células para el uso de la reivindicación 1, doode las células derivadas de tejido de cordórJ umbilical tienen la 65 capacidad de diferenciarse

(a) en células de un fenotipo de células del núcleo pulposo; o

(b) en células de un fenotipo de células de anillo fibroso.