RU2599420C2 - Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток - Google Patents

Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток Download PDF

Info

Publication number
RU2599420C2
RU2599420C2 RU2013114374/10A RU2013114374A RU2599420C2 RU 2599420 C2 RU2599420 C2 RU 2599420C2 RU 2013114374/10 A RU2013114374/10 A RU 2013114374/10A RU 2013114374 A RU2013114374 A RU 2013114374A RU 2599420 C2 RU2599420 C2 RU 2599420C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
population
cell
inhibitor
pluripotent stem
Prior art date
Application number
RU2013114374/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2013114374A (ru
Inventor
Алиреза РЕЗАНИА
Original Assignee
Янссен Байотек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Байотек, Инк. filed Critical Янссен Байотек, Инк.
Publication of RU2013114374A publication Critical patent/RU2013114374A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2599420C2 publication Critical patent/RU2599420C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0613—Cells from endocrine organs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Abstract

Изобретение относится к области эмбриологии. Способ получения популяции клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы из плюрипотентных стволовых клеток, которые представляют собой человеческие эмбриональные стволовые клетки линии Н9, H1, Н7 и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002, включает стадии: культивирования популяции указанных плюрипотентных стволовых клеток; дифференцирования популяции указанных плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы; дифференцирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в популяцию клеток первичной кишечной трубки; дифференцирования популяции клеток первичной кишечной трубки в популяцию клеток заднего сегмента передней кишки и дифференцирования популяции клеток заднего сегмента передней кишки в популяцию предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы путем культивирования популяции клеток задней части передней кишки в среде с добавлением ингибитора CYP26A без добавления ретиноевой кислоты. Способ позволяет повысить эффективность дифференцирования. 17 з.п. ф-лы, 3 пр., 5 ил.

Description

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка притязает на приоритет предварительной патентной заявки серийный номер 61/378480, поданной 31 августа 2010 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки.
Область применения изобретения
В данном изобретении описываются способы содействия дифференциации плюрипотентных стволовых клеток в клетки, вырабатывающие инсулин. В частности, настоящее изобретение представляет способ использования ингибитора CYP26A, для получения популяции клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, формирующих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование сформированной эндодермы. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют ряд маркеров, как например, HNF3 beta, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.
Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании сформированной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, Pdx1. При отсутствии Pdx1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической эндодермы.
Развитие клеток поджелудочной железы in vivo по меньшей мере частично зависит от надлежащей регуляции сигналов, определяющих расположение клеток-предшественников органа. Kinkel et al. (PNAS May 12, 2009 vol. 106 no. 19 7864-7869) утверждают: “Путь развития клеток поджелудочной железы определяется ретиноевой кислотой (РК), а соответствующий размер и локализация ткани поджелудочной железы зависит от строгого контроля сигнальных путей с участием ретиноевой кислоты. Здесь мы показали, что ферменты Cyp26, разрушающие РК, играют решающую роль в развитии поджелудочной железы с нормальной передней границей”.
По имеющимся данным, клетки, обладающие свойствами островковых клеток, были получены из эмбриональных клеток мыши. Например, Lumelsky et al. описывает дифференцирование мышиных эмбриональных стволовых клеток в инсулин-секретирующие структуры, аналогичные островкам поджелудочной железы. Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) описывают инсулин-секретирующие клетки, производные мышиных эмбриональных стволовых клеток, которые нормализуют гликемию у мышей с диабетом, индуцированным стрептозотоцином.
В одном примере, Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) описывают, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы (LY294002) приводила к получению клеток, подобных β-клеткам.
в другом примере, Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) сообщают о получении инсулин-продуцирующих клеток из мышиных эмбриональных стволовых клеток с конститутивной экспрессией Pax4.
В публикации Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать Pdx1-положительную панкреатическую эндодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию Pdx1 при добавлении в культуру на 4 день дифференцирования эмбриональных стволовых клеток в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54:301, 2005).
В публикации Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией Pdx1. Результаты показывают, что экспрессия экзогенного Pdx1 очевидно повышает экспрессию генов инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, p48, Pax6 и HNF6 в образующихся дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).
В публикации Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (Pdx1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдался при использовании 1 нмоль/л активина A. Кроме того, авторы отметили, что экспрессия инсулина и Pdx1 мРНК не изменялась под действием ретиноевой кислоты; однако лечение с использованием 3nM FGF7 привело к повышению уровня транскрипта для Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).
В работе Shiraki et al. изучались эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцирование эмбриональных стволовых клеток в Pdx1-положительные клетки. Эти авторы наблюдали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли Pdx1-положительных клеток (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.).
В работе Gordon et al. показана индукция образования брахиурических [положительных]/HNF3 бета [положительных] эндодермальных клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши в отсутствие сыворотки и в присутствии активина в сочетании с ингибитором сигнального каскада Wnt (патент США № 2006/0003446A1).
Gordon et al. (PNAS, т. 103, с. 16806, 2006) утверждают: «Для образования передней первичной полоски одновременно требовались сигнальные пути Wnt и TGF-бета/nodal/активин».
Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах может не имитировать в точности программу развития у высших млекопитающих, например, у человека.
В работе Thomson et al. эмбриональные стволовые клетки выделяли из человеческих бластоцист (Science 282:114, 1998). Параллельно, Gearhart и соавторы получили клеточные линии эмбриональных зародышевых клеток человека (hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцированию которых можно путем простого культивирования с фактором, ингибирующим лейкемию (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека необходимо культивировать в крайне специфических условиях (патент США № 6200806; WO 99/20741, WO 01/51616).
D'Amour et al. описывают производство обогащенных культур сформированной эндодермы, производной от человеческих эмбриональных стволовых клеток, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцированию в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых эндодермальных органов. Клетки сформированной эндодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, могут подвергаться дальнейшему дифференцированию в Pdx1-положительные клетки после добавления FGF-10 (US 2005/0266554A1).
D'Amour et al. (Nature Biotechnology-24, 1392-1401 (2006)) утверждают: “Мы разработали процесс дифференцировки, преобразующий эмбриональные клетки человека (hES) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы: инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через фазы, напоминающие образование сформированной эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны”.
В другом примере, в публикации Fisk et al., сообщается о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека (US2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Человеческие эмбриональные стволовые клетки были впервые дифференцированы до эндодермы с помощью сочетания бутирата натрия и активина A. Затем клетки культивировали с антагонистами ФНО-β, например, Noggin, в сочетании с EGF или бетацеллюлином для получения PDX1-положительных клеток. Окончательное дифференцирование запускалось никотинамидом.
Таким образом, сохраняется значительная потребность в разработке лабораторных способов создания in vitro функциональной экспрессирующей инсулин клетки, которая была бы более близка к β-клетке. Настоящее изобретение представляет собой альтернативный подход к повышению эффективности дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие инсулин, основанный на получении клеток-предшественников поджелудочной железы с помощью агента, разрушающего ретиноевую кислоту.
Краткое описание
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ использования ингибитора CYP26A, для получения популяции клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы.
В одном варианте осуществления формирование популяции клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы достигается путем использования пошагового протокола дифференцирования, при этом популяция плюрипотентных стволовых клеток сначала дифференцируется в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы. Далее, популяция клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, дифференцируется в популяцию клеток первичной кишечной трубки. Далее, популяция клеток первичной кишечной трубки дифференцируется в популяцию клеток заднего сегмента передней кишки. Затем популяция клеток заднего сегмента передней кишки дифференцируется в популяцию предшественников эндокринных клеток путем культивирования в среде с добавлением ингибитора CYP26A.
В одном варианте осуществления изобретения популяция предшественников эндокринных клеток далее дифференцируется в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 показаны результаты анализа методом ПЦР в реальном времени образцов клеток на стадиях III-IV протокола, описанного в Примере 1, на a) PAX4, b) NGN3, c) PDX1, d) NEUROD, e) NKX6.1, f) CDX2 и g) альбумин. Ось у - кратность повышения по сравнению с недифференцированными Н1-клетками. На панели показан результат иммунологического окрашивания NGN3 контроля и культур с добавлением CYP26A на стадии IV.
На фиг. 2 показаны результаты анализа методом ПЦР в реальном времени образцов клеток на стадиях III-IV протокола, описанного в Примере 2, на a) NGN3, b) NEUROD, c) CDX2, d) NKX6.1 и e) PDX1. Ось у - кратность повышения по сравнению с недифференцированными Н1-клетками.
На фиг. 3 показаны фазово-контрастные изображения клеток на стадиях I-VI протокола, описанного в Примере 3.
На фиг. 4 показаны графики экспрессии NKX6.1 в клетках на стадиях IV-VII протокола, описанного в Примере 3, по результатам флуоресцентной проточной цитометрии.
На фиг. 5 показаны результаты иммунохимического окрашивания на PDX1, NKX6.1 и CDX2 в клетках на стадиях V и VII протокола, описанного в Примере 3.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для ясности описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития: (1) тотипотентные, то есть способные преобразоваться в любой из эмбриональных и внеэмбриональных типов клеток; (2) плюрипотентные, то есть способные преобразоваться во все типы эмбриональных клеток; (3) мультипотентные, то есть способные преобразоваться во множество клеточных линий, но в рамках одной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) могут порождать ГСК (самообновление), олигопотентные ограниченные клетки-предшественники крови и все типы клеток и элементов (например, тромбоциты), являющиеся стандартными составляющими крови); (4) олигопотентные, то есть способные преобразоваться в более ограниченное подмножество клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, то есть способные преобразоваться в единственную клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например, нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцированием представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцирования клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцирования до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцированием называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцирования. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцирования клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцирования клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцирования. Маркером, специфичным для линии дифференцирования, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцирования, которая может использоваться для оценки дифференцирования некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцирования.
Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы», «клетки стадии 1» или «стадия 1», относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, относятся клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезэндодермы и клетки сформированной эндодермы.
Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1-бета, PTF1-альфа, HNF6, HNF4-альфа, SOX9, HB9 или PROX1. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки поздней передней кишки.
Используемый в настоящей заявке термин «сформированная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3-бета, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.
Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.
Используемый в настоящей заявке термин “клетка-предшественник эндокринной клетки поджелудочной железы” относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN3, NEUROD или NKX2.2.
Используемый в настоящей заявке термин “клетка заднего сегмента передней кишки” относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1 или HNF6.
Термин “Незрелые клетки поджелудочной железы, экспрессирующие гормоны” в настоящей заявке относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: инсулин, глюкагон, соматостатин, MAFB, PDX1, ARX, NKX6.1, NKX2.2 или NEUROD.
Используемый в настоящей заявке термин "клетка первичной кишечной трубки” относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: HNF1-бета или HNF4-альфа.
«Панкреатической эндокринной клеткой», «клеткой, экспрессирующей гормон поджелудочной железы» или «клеткой, экспрессирующей характеристики эндокринной линии поджелудочной железы» в настоящем документе называется клетка, способная экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.
Выделение, размножение и культивирование полипотентных стволовых клеток
Характеристика плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при наличии) и к повышению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных полипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которая может быть обнаружена путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, Burlingame Calif.). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ПЦР в реальном времени.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных стволовых клеток является потенциал дифференцирования в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Полипотентность полипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида, и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.
Источники плюрипотентных стволовых клеток
К типам плюрипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся устойчивые линии плюрипотентных клеток, получаемые из формируемой после вынашивания плода ткани, в том числе из преэмбриональной ткани (такой как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе вынашивания, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Примерами, не ограничивающими настоящее изобретение, являются стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, например, клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей-источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).
В одном варианте осуществления получение человеческих эмбриональных стволовых клеток было описано Thomson et al. в патенте США № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995.
Культивирование плюрипотентных стволовых клеток
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки культивируют на питающем слое клеток, которые поддерживают плюрипотентные стволовые клетки в различных отношениях. Как вариант, полипотентные стволовые клетки культивируются в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию полипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое эмбриональных фибробластов мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Reubinoff et al. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое эмбриональных фибробластов мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Thompson et al. (Science 6, ноябрь 1998 г., Vol. 282. no. 5391, pp. 1145-1147). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на любом из питающих слоев клеток, описанных в работе Richards et al. (Stem Cells 21: 546-556, 2003).
В одном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека в соответствии со способами, изложенными в работе Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанных в работе Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанных в работе Miyamoto et al. (Stem Cells 22: 433-440, 2004). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанных в работе Amit et al. (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанных в работе Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005).
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20020072117. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6642048. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в международной заявке WO 2005014799. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в работе Xu et al. (Stem Cells 22: 972-980, 2004). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20070010011. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050233446. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6800480. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, описанными в международной заявке WO 2005065354.
В одном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать по методам, описанным Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в работе Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050148070. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050244962. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, описанными в международной заявке WO 2005086845.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, компонент, полученный из базальной мембраны, или компонент, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления подходящим культуральным субстратом является МАТРИГЕЛЬ® (Becton Dickenson). МАТРИГЕЛЬ® представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.
В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток, это может быть ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных сочетаниях.
Плюрипотентные стволовые клетки могут высеиваться на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.
Подходящая культуральная среда может быть изготовлена, например, из следующих компонентов модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092, нокаутная модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), Gibco № 10829-018, базовая среда Хэма F12/50% DMEM, 200 ммоль/л L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор неосновных аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.
Образование клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы из плюрипотентных стволовых клеток
Настоящее изобретение представляет способы получения популяции клеток-предшественников клеток поджелудочной железы из популяции плюрипотентных стволовых клеток. В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способы дальнейшей дифференциации клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы в клетки, экспрессирующие маркеры линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения клеток-предшественников панкреатических эндокринных клеток, включающий следующие этапы:
a. Культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. Дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы;
с. Дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в популяцию клеток первичной кишечной трубки;
d. Дифференцирование популяции клеток первичной кишечной трубки в популяцию клеток заднего сегмента передней кишки; и
e. Дифференцирование популяции клеток заднего сегмента передней кишки в популяцию предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы путем использования среды с добавлением ингибитора CYP26A.
Популяция предшественников эндокринных клеток может подвергаться дальнейшей обработке для получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для желательного вида клеток.
Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блот, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001, доп.)), а также способы иммунологического анализа, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, - способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких следующих маркеров: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть выделены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.
К плюрипотентным стволовым клеткам, которые могут использоваться в настоящем изобретении, относятся, например, человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H9 (код NIH: WA09), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (код NIH: WA01), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H7 (код NIH: WA07) и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также для использования в рамках настоящего изобретения подходят клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81.
Маркеры характерные для сформированной линии эндодермы выбираются из группы, содержащей SOX17, GATA4, HNF3-бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4, CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и Otx2. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая, как минимум, один из маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку-предшественника первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку сформированной эндодермы.
Маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы (включающей клетки первичной кишечной трубки и клетки задней части передней кишки), выбираются из группы, состоящей из: PDX1, NKX6.1, HNF1-бета, PTF1-альфа, HNF6, HNF4-альфа, SOX9, HB9 и PROX1. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая, как минимум, один из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляет собой клетку панкреатической эндодермы.
Маркеры, характерные для линии дифференцирования панкреатических эндокринных клеток, выбирают из группы, состоящей из следующих маркеров: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 и PTF-1-альфа. В одном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Соответствующей целям настоящего изобретения является клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, экспрессирующую гормоны. В альтернативном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, секретирующую гормоны.
В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования β-клеток. Клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии β-клеток, экспрессирует PDX1 и по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3-бета, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования β-клеток, представляет собой β-клетку.
Формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, из плюрипотентных стволовых клеток
Популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной панкреатической эндодермы, могут быть получены из популяций плюрипотентных стволовых клеток любыми известными способами.
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации Shinozaki et al., Development 131, 1651-1662 (2004).
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации McLean et al., Stem Cells 25, 29-38 (2007).
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 11/736908.
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 11/779311.
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 12/493741.
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 12/494789.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы
К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки поздней передней кишки. В одном варианте осуществления изобретения популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, которая была получена способами настоящего изобретения, далее дифференцируют в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, любым известным способом.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, полученные по способам настоящего изобретения, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D' Amour et al., Nature Biotechnology, 24, 1392-1401 (2006).
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, полученные по методам настоящего изобретения, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США Сер. № 11/736908.
Формирование популяции клеток-предшественников панкреатических эндокринных клеток
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения клеток-предшественников панкреатических эндокринных клеток, включающий следующие этапы:
a. Культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. Дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы;
с. Дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в популяцию клеток первичной кишечной трубки;
d. Дифференцирование популяции клеток первичной кишечной трубки в популяцию клеток заднего сегмента передней кишки; и
e. Дифференцирование популяции клеток заднего сегмента передней кишки в популяцию предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы путем культивирования в среде с добавлением ингибитора CYP26A.
Ингибитор CYP26A может применяться в концентрации от приблизительно 1 нмоль/л до приблизительно 1000 нмоль/л. Альтернативно, ингибитор CYP26A может применяться в концентрации от приблизительно 10 нмоль/л до приблизительно 100 нмоль/л.
Для использования в настоящем изобретении подходит любой ингибитор CYP26A. Например, ингибитор CYP26A может быть выбран из соединений, описанных в заявке на патент США №7468391. Альтернативно, ингибитор CYP26A может быть выбран из соединений, описанных в патентной заявке США №2005/0187298 А1. Альтернативно, ингибитор CYP26A может быть выбран из соединений, описанных в заявке на патент США №2004/0106216 А1. Альтернативно, ингибитор CYP26A может быть выбран из соединений, описанных в международной заявке WO 2005058301 A1. Альтернативно, ингибитор CYP26A может быть выбран из соединений, описанных в
PNAS от 12 мая 2009 г, т. 106, №19 7864-7869. В одном варианте осуществления ингибитор CYP26A представляет собой N-{4-[2-этил-1-(1Н-1,2,4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1,3-бензотиазол-2-амин. См. Формулу 1.
Figure 00000001
В одном варианте осуществления изобретения в среду с добавлением ингибитора CYP26A, дополнительно добавлен по меньшей мере один фактор, выбранный из группы, состоящей из фактора, способного ингибировать BMP, ингибитора сигнального каскада рецепторов TGFp, а также витамина А и активатора РКС.
В одном варианте фактором, способным ингибировать BMP, является Noggin. Noggin может использоваться в концентрациях от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 500 мкг/мл. В одном из вариантов осуществления Noggin используется в концентрации 100 нг/мл.
В одном из вариантов ингибитором сигнализации рецептора TGFp является ингибитор ALK5. В одном из вариантов ингибитором ALK5 является ингибитор ALK5 II. Ингибитор ALK5 II может применяться в концентрации от приблизительно 0,1 мкмоль/л до приблизительно 10 мкмоль/л. В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 II применяется в концентрации 1 мкмоль/л.
В одном варианте осуществления активатор протеинкиназы С (РКС) выбран из группы, состоящей из (2S,5S)-(E,Е)-8-(5-(4- (трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактама, индолактама V (ILV), форбол-12-миристат-13-ацетата (PMA) и форбол-12,13-дибутирата (PDBu). В одном из вариантов активатором протеинкиназы С является (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил) -2,4-пентадиемоиламин)бензолактам. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил) -2,4-пентадиемоиламин)бензолактам может использоваться в концентрации приблизительно от 20 нм до 500 нм. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактам в настоящем документе называется «TPB».
Создание клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
В одном варианте осуществления популяция клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы, полученная методами настоящего изобретения, далее дифференцируется в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, любым известным способом.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 11/736908.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 11/779311.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 60/953178.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 60/990529.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется, помимо прочих, следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Дифференциация клеток человеческой эмбриональной линии H1 в клетки-предшественники эндокринных клеток поджелудочной железы в культуральной среде без ФБС и с добавлением ингибитора CYP26A
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 (p40-p50) культивировали на чашках, покрытых субстратом МАТРИГЕЛЬ® (разведение 1:30) (BD Biosciences; Кат. № 356231) в среде MEF-CM (среда, кондиционированная мышиными эмбриональными фибробластами) в виде колоний, и дифференцировали в клетки-предшественники эндокринных клеток поджелудочной железы следующим образом:
a. Стадия I (сформированная эндодерма): Человеческие эмбриональные стволовые клетки культивировали в среде RPMI с добавлением 2% БСА без жирных кислот (кат. № 68700, Proliant, Огайо, США), 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота, США, 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота, США) и 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 00-18B, PeproTech, Нью-Джерси, США) в течение суток, затем использовали среду RPMI с добавлением 2% БСА, 100 нг/мл активина A, 8 нг/мл bFGF в течение еще двух суток, затем
b. Стадия II (клетки первичной кишечной трубки): Клетки культивировали в RPMI + 2% БСА без жирных кислот и 50 нг/мл FGF7 в течение 2 суток, затем
с. Стадия III (задний отдел передней кишки): Клетки помещали в среду DMEM/с высокой концентрацией глюкозы с добавлением ITS-X в разведении 1:200 (Invitrogen, Калифорния), 0,1% БСА (богатого липидами) (Invitrogen, кат. № 11021-045), 50 нг/мл FGF7, 0,25 мкМ SANT-1, 2 мкмоль/л ретиноевой кислоты (РК) (Sigma, Миссури),100 нг/мл белка Noggin (R&D Systems, Миннесота), 2,5 мкмоль/л 4-[4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-пиридин-4-ил-1H-имидазол-2-ил]бут-3-ин-1-ола (ингибитор P38, описанный в патенте США № 6521655), и активина A 20 нг/мл на пять суток, затем
d. Стадия IV (предшественник эндокринных клеток поджелудочной железы): Клетки помещали в среду DMEM/высокую концентрацию глюкозы с добавлением ITS-X в разведении ITS-X (Invitrogen, Калифорния), 0,1% БСА (Invitrogen, Калифорния), 100 нг/мл белка Noggin, 1 мкмоль/л ингибитора ALK5(SD-208, описанного в Molecular Pharmacology 2007 72:152-161), 500 нмоль/л TPB (модулятор белка-предшественника α-амилоида) (Кат. № 565740, EMD, Калифорния), 10-100 нмоль/л ингибитора CYP26A N-{4-[2-этил-1-(1H-1, 2, 4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1, 3-бензотиазол-2-амина и 10-100 нмоль/л витамина А (Кат. № R7632, Sigma, Миссури) в течение 4 суток, или
В некоторых культурах стадию IV продлевали до 6 суток. мРНК выделяли на стадиях III и IV для анализа генов панкреатических клеток методом ПЦР в реальном времени. Как показано на фиг. 1, добавление ингибитора CYP26A на стадии IV значительно усиливало экспрессию предшественников эндокринных клеток (NGN3, Pax4, NeuroD) вместе с маркером панкреатической эндодермы NKX6.1 в зависимости от дозы. Добавление витамина А вместе с ингибитором CYP26A значительно не изменяло экспрессию маркеров панкреатической эндодермы или предшественников эндокринных клеток. Кроме того, добавление ингибитора CYP26A на стадии IV уменьшало экспрессию CDX2 (маркера кишечных клеток) и альбумина (маркера клеток печени). Иммунохимическое окрашивание на NGN3 (Кат. № AF3444, R&D systems, MN) на стадии IV очевидно показало значительное ускорение экспрессии NGN3 в культурах с добавлением 100 нмоль/л ингибитора CYP26A.
Пример 2
Альтернативный способ дифференцирования клеток человеческой эмбриональной линии стволовых клеток H1 в клетки-предшественники эндокринных клеток поджелудочной железы в питательной среде без ФБС с ингибитором CYP26A
Стволовые клетки человеческой эмбриональной линии H1 (p40-p52) высевали по отдельности из суспензии 100000 кл./см2 на чашки, покрытие субстратом МАТРИГЕЛЬ® (разведение 1:30) (BD Biosciences; Кат. № 356231) в MEF-CM (среду, кондиционированную мышиными фибробластами) с добавлением 16 нг/мл FGF2 (Кат. № 100-18B, PeproTech, Нью Джерси) и 10 мкмоль/л Y27632 (ингибитор Rock, Кат. № Y0503, Sigma, Миссури). Через 72 ч после посева культуры дифференцировали в сформированную эндодерму (СЭ) следующим образом:
a. Стадия I (сформированная эндодерма): Человеческие эмбриональные клетки культивировали на среде MCDB-131 (Кат. № 10372-019, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 2% БСА без жирных кислот (кат. № 68700, Proliant, Айова), 0,0025 г/мл бикарбоната натрия (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 1X ГлутаМакса™ (кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, MN) + 20 нг/мл WNT-3a (кат. № 1324-WN-002, R&D Systems, MN) в течение суток, затем использовали среду MCDB-131 с добавлением 2% БСА, натрия бикарбоната, Глутамакса и 100 нг/мл активина A каждый день в течение последующих трех суток, затем
b. Стадия II (клетки первичной кишечной трубки): Клетки культивировали на среде MCDB-131 + 2% БСА без жирных кислот + 50 нг/мл FGF7 в течение 3 суток, затем
с. Стадия III (задний отдел передней кишки): Клетки культивировали в среде MCDB-131/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 0,1% БСА (богатого липидами) (Invitrogen, Калифорния № 11021-045), 50 нг/мл FGF7, 0,25 мкмоль/л SANT-1, 2 мкмоль/л ретиноевой кислоты (РК) (Sigma, Миссури), 2,5 мкмоль/л 4-[4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-пиридин-4-ил-1H-имидазол-2-ил]бут-3-ин-1-ол (ингибитор p38, описанный в патенте США № 6521655), 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP, Кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния), 500 нмоль/л ингибитора CYP26A N-{4-[2-этил-1-(1H-1, 2, 4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1, 3-бензотиазол-2-амин и активин A 20 нг/мл в течение четырех суток, затем
d. Стадия IV (предшественник эндокринных клеток поджелудочной железы): Клетки культивировали в среде MCDB-131/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури) Sigma Миссури, 1 мкмоль/л ингибитора ALK5 (SD-208, описан в Molecular Pharmacology 2007 72:152-161), 500 нмоль/л PDBu (активатор PKC) (Кат. № P1269, Sigma, Миссури), 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP, кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния), 0,25 мкмоль/л SANT-1 (#S4572, Sigma, Миссури) и 500 нмоль/л ингибитора CYP26A N-{4-[2-этил-1-(1H-1, 2, 4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1, 3-бензотиазол-2-амина в течение 7 суток, или
e. Стадия IV (предшественник эндокринных клеток поджелудочной железы): Клетки культивировали в среде MCDB-131/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 1 мкмоль/л ингибитора ALK5 (SD-208, описан в Molecular Pharmacology 2007 72:152-161), 500 нмоль/л PDBu (активатор PKC) (Кат. № P1269, Sigma, Миссури), 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния), 0,25 мкмоль/л SANT-1 (#S4572, Sigma, Миссури) в течение 7 суток.
мРНК для анализа генов клеток поджелудочной железы методом ПЦР в реальном времени выделяли на стадиях III и IV. Как и в описанном выше Примере 1 добавление ингибитора CYP26A на стадии IV усиливало экспрессию маркеров предшественников эндокринных клеток, например, NGN3 и NeuroD. (См. фиг. 2). Добавление ингибитора на стадиях III и IV дополнительно усиливало экспрессию NGN3 и NeuroD. Удивительно, что добавление ингибитора CYP26A на стадии III (в присутствии ретиноевой кислоты) значительно подавляло PDX-1 и NKX6.1, усиливая экспрессию CDX2. Эти результаты позволяют предположить, что оптимальной стадией для добавления ингибитора CYP26A является стадия IV.
Пример 3
Альтернативный способ дифференцирования клеток человеческой эмбриональной линии стволовых клеток H1 в эндокринные клетки поджелудочной железы в питательной среде без ФБС с ингибитором CYP26A
Стволовые клетки человеческой эмбриональной линии H1 (p40-p52) высевали отдельными клетками из суспензии 100000 кл./см2 на чашки, покрытые субстратом МАТРИГЕЛЬ® (разведение 1:30) (BD Biosciences; Кат. № 356231), в MEF-CM (среду, кондиционированную мышиными фибробластами) с добавлением 16 нг/мл FGF2 (Кат. № 100-18B, PeproTech, NJ) и 10 мкмоль/л Y27632 (ингибитор Rock, Кат. № Y0503, Sigma, Миссури). Через 72 ч после посева культуры дифференцировали в сформированную эндодерму (СЭ) следующим образом:
a. Стадия I (сформированная эндодерма): Человеческие эмбриональные стволовые клетки высевали одиночно на чашки, покрытые субстратом МАТРИГЕЛЬ, со средой MCDB-131 (Кат. № 10372-019, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 2% БСА без жирных кислот (Кат. № 68700, Proliant, Айова), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния) и 100 нг/мл GDF-8 (R&D Systems, MN) + 2,5 мкмоль/л ингибитора GSK3B 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазотетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она в течение суток, затем использовали среду MCDB-131 с 2% БСА, натрия бикарбонатом, Глутамаксом и 100 нг/мл GDF-8 следующие трое суток, затем
b. Стадия II (клетки первичной кишечной трубки): Клетки культивировали в среде MCDB-131+2% БСА без жирных кислот +50 нг/мл FGF7 в течение 3 суток, затем
с. Стадия III (задний отдел передней кишки): Клетки культивировали в среде MCDB131 /высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 0,1% БСА (богатого липидами) (Invitrogen, Калифорния No. 11021-045), 50 нг/мл FGF7, 0,25 мкмоль/л SANT-1, 2 мкмоль/л ретиноевой кислоты (РК) (Sigma, Миссури), 2,5 мкмоль/л 4-[4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-пиридин-4-ил-1H-имидазол-2-ил]бут-3-ин-1-ола, 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP Кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния) и активина A 20 нг/мл в течение четырех суток, затем
d. Стадия IV (предшественники клеток поджелудочной железы): Клетки культивировали в среде MCDB131/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 0,5% БСА (Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP, кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния), 50 нмоль/л PDBu (активатор PKC) (кат. №P1269, Sigma, Миссури), 0,25 мкмоль/л SANT-1 (#S4572, Sigma, Миссури) и 100 нмоль/л ингибитора CYP26A N-{4-[2-этил-1-(1H-1, 2, 4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1, 3-бензотиазол-2-амина в течение 3 суток, затем
e. Стадия V (предшественники эндокринных клеток поджелудочной железы): Клетки культивировали в среде MCDB13/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP, кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния), 0,25 мкмоль/л SANT-1 (#S4572, Sigma, Миссури), 2 мкмоль/л ингибитора ALK5 (SD-208, описан в Molecular Pharmacology 2007 72:152-161) и 100 нмоль/л ингибитора CYP26A N-{4-[2-этил-1-(1H-1, 2, 4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1, 3-бензотиазол-2-амина в течение 3 суток, затем F. Стадия VI (незрелые клетки поджелудочной железы, экспрессирующие гормоны): Клетки культивировали в среде MCDB131/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 0,1% БСА (Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури) 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP, Кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния) и 2 мкмоль/л ингибитора ALK5 (SD-208, описан в Molecular Pharmacology 2007 72:152-161) в течение 3 суток, затем
g. Стадия VII (Клетки поджелудочной железы, экспрессирующие гормоны): Клетки культивировали на среде MCDB131/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 0,1% БСА (Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури) 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP Кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния), 2 мкмоль/л ингибитора ALK5 (SD-208, описан в Molecular Pharmacology 2007 72:152-161) и 100 нмоль/л витамина А (Кат. № R7632, Сигма, Миссури) в течение 3 суток.
В некоторых культурах стадию VII продлевали до 18 дней. На стадиях V, VI отбирали пробы для ПЦР в реальном времени, иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) и флуоресцентной проточной цитометрии. И при проточной цитометрии, и при иммунофлуоресцентном анализе антитела к NKX6.1 получали из банка гибридом Университета Айовы (Кат. № F55A12), антитела к CDX2 приобретали в компании Abcam (Кат. № ab76541, Кембридж, Массачусетс), а антитела к PDX-1 приобретали в компании Abcam (Кат. № ab47267). На фиг. 3 показана морфология культур на разных стадиях дифференциации. После стадии II культуры имели однородную морфологию на стадиях III-VI. На фиг. 4 показана экспрессия NKX6.1 по результатам флуоресцентной проточной цитометрии на разных стадиях дифференциации. На этом чертеже подчеркивается, что протокол, описанный в Примере 3, позволяет сохранить высокую экспрессию NKX6.1 на поздних стадиях дифференциации. На фиг. 4 показаны результаты иммунофлуоресцентного окрашивания на PDX1, NKX6.1, и CDX2 на стадиях V и VII по протоколу. Более 90% NKX6.1-положительных клеток также положительны по PDX1, однако менее 10% клеток положительны по CDX2.
Публикации, цитируемые в настоящем документе, полностью включаются в настоящий документ посредством ссылки. Хотя различные аспекты изобретения иллюстрируются выше ссылками на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что область изобретения ограничивается не упомянутым выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.

Claims (18)

1. Способ получения популяции клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы из плюрипотентных стволовых клеток, которые представляют собой человеческие эмбриональные стволовые клетки линии Н9, H1, Н7 и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002, включающий стадии:
a. культивирования популяции указанных плюрипотентных стволовых клеток;
b. дифференцирования популяции указанных плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы;
c. дифференцирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в популяцию клеток первичной кишечной трубки;
d. дифференцирования популяции клеток первичной кишечной трубки в популяцию клеток заднего сегмента передней кишки; и
e. дифференцирования популяции клеток заднего сегмента передней кишки в популяцию предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы путем культивирования популяции клеток задней части передней кишки в среде с добавлением ингибитора CYP26A без добавления ретиноевой кислоты.
2. Способ по п. 1, в котором дифференциация на стадии b., с. и d. включает обработку в среде без ингибитора CYP26A.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором ингибитор CYP26A используют в концентрации от приблизительно 1 нмоль/л до приблизительно 1000 нмоль/л.
4. Способ по п. 1 или 2, в котором ингибитор CYP26A используют в концентрации от приблизительно 10 нмоль/л до приблизительно 100 нмоль/л.
5. Способ по пп. 1-4, в котором ингибитор CYP26A представляет собой N-{4-[2-этил-1-(1Н-1,2,4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1,3-бензотиазол-2-амин.
6. Способ по п. 1, в котором обработка повышает экспрессию маркеров эндокринного предшественника NGN3, Pax и NeuroD.
7. Способ по п. 1, в котором обработка уменьшает экспрессию
CDX2 и альбумина.
8. Способ по любому из пп. 1-5, в котором среда с добавлением ингибитора CYP26A также содержит по меньшей мере один фактор, выбранный из группы, состоящей из фактора, способного ингибировать BMP, ингибитора сигнального каскада рецепторов TGFβ и активатора РКС.
9. Способ по п. 8, в котором фактор, способный ингибировать BMP, включает Noggin.
10. Способ по п. 8, в котором ингибитор сигнального каскада рецепторов TGFβ включает ингибитор ALK5.
11. Способ по п. 10, в котором ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II.
12. Способ по п. 8, в котором активатор РКС выбран из группы, состоящей из (2S,5S)-(E,Е)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактама, индолактама V (ILV), форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА) и форбол-12,13-дибутирата (PDBu).
13. Способ по любому из пп. 1-5, в котором стадия дифференцировки популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, включает культивирование плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А.
14. Способ по любому из пп. 1-5, в котором стадия дифференцировки популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, включает культивирование плюрипотентных стволовых клеток в среде с GDF-8 и ингибитором GSK3B.
15. Способ по п. 14, в котором ингибитор GSK3B представляет собой 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазотетрацикло[19.3.1.1-2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он.
16. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляют собой сформированные клетки энтодермы.
17. Способ по п. 1, в котором стадия дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы в популяцию клеток первичной кишечной трубки включает культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы в среде, содержащей FGF7.
18. Способ по п. 1, в котором стадия дифференцировки популяции клеток первичной кишечной трубки в популяцию клеток заднего сегмента передней кишки включает культивирование популяции клеток первичной кишечной трубки в среде, содержащей ретиноевую кислоту и ингибитор Р38.
RU2013114374/10A 2010-08-31 2011-08-17 Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток RU2599420C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37848010P 2010-08-31 2010-08-31
US61/378,480 2010-08-31
PCT/US2011/048131 WO2012030540A2 (en) 2010-08-31 2011-08-17 Differentiation of pluripotent stem cells

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016135361A Division RU2673946C1 (ru) 2010-08-31 2011-08-17 Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013114374A RU2013114374A (ru) 2014-10-10
RU2599420C2 true RU2599420C2 (ru) 2016-10-10

Family

ID=45697776

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013114374/10A RU2599420C2 (ru) 2010-08-31 2011-08-17 Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток
RU2016135361A RU2673946C1 (ru) 2010-08-31 2011-08-17 Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016135361A RU2673946C1 (ru) 2010-08-31 2011-08-17 Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток

Country Status (16)

Country Link
US (2) US9181528B2 (ru)
EP (1) EP2611907B1 (ru)
JP (2) JP6133776B2 (ru)
KR (1) KR101836855B1 (ru)
CN (1) CN103154237B (ru)
AR (1) AR082821A1 (ru)
AU (1) AU2011296383B2 (ru)
BR (1) BR112013004614A2 (ru)
CA (1) CA2809305C (ru)
ES (1) ES2585028T3 (ru)
HK (1) HK1186492A1 (ru)
MX (1) MX348537B (ru)
PL (1) PL2611907T3 (ru)
RU (2) RU2599420C2 (ru)
SG (1) SG187947A1 (ru)
WO (1) WO2012030540A2 (ru)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
EP2185693B1 (en) 2007-07-31 2019-07-03 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
MX2010005805A (es) 2007-11-27 2010-06-09 Lifescan Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
CN105886459A (zh) 2008-02-21 2016-08-24 詹森生物科技公司 用于细胞粘附、培养和分离的方法、表面改性培养板和组合物
ES2697798T3 (es) 2008-06-30 2019-01-28 Janssen Biotech Inc Diferenciación de células madre pluripotentes
CA2742268C (en) 2008-10-31 2020-02-18 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
EP2350265B1 (en) 2008-10-31 2019-04-17 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
ES2584053T3 (es) 2008-11-20 2016-09-23 Janssen Biotech, Inc. Métodos y composiciones para la unión de células y cultivo en sustratos planos
JP2012509085A (ja) 2008-11-20 2012-04-19 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド マイクロキャリア上での多能性幹細胞の培養
MX348077B (es) 2009-07-20 2017-05-25 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
KR101867369B1 (ko) 2009-12-23 2018-06-14 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
KR20130025375A (ko) 2010-03-01 2013-03-11 얀센 바이오테크 인코포레이티드 만능 줄기 세포로부터 유래된 세포의 정제 방법
US9719068B2 (en) 2010-05-06 2017-08-01 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
CA2800610C (en) 2010-05-12 2019-09-24 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
EP2853589B1 (en) 2010-08-31 2017-12-27 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
KR101851956B1 (ko) 2010-08-31 2018-04-25 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
BR112014015417A8 (pt) 2011-12-22 2017-07-04 Janssen Biotech Inc diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células positivas de insulina hormonal únicas
KR20140131999A (ko) 2012-03-07 2014-11-14 얀센 바이오테크 인코포레이티드 만능 줄기 세포의 증폭 및 유지를 위한 한정 배지
EP2847319A4 (en) * 2012-05-07 2015-12-16 Janssen Biotech Inc DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS IN THE PANCREAS ENDODERM
ES2897649T3 (es) 2012-06-08 2022-03-02 Janssen Biotech Inc Diferenciación de células madre embrionarias humanas en células endocrinas pancreáticas
EA201992135A1 (ru) * 2012-06-26 2020-02-05 Серексис, Инк. Стволовые клетки и клетки поджелудочной железы, используемые для лечения инсулинозависимого сахарного диабета
JP6470687B2 (ja) * 2012-09-03 2019-02-13 ノヴォ ノルディスク アー／エス 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製
US10370644B2 (en) * 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
CA2896658C (en) * 2012-12-31 2021-06-22 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using hb9 regulators
SG10201709338RA (en) * 2012-12-31 2017-12-28 Janssen Biotech Inc Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells
MX2015008619A (es) * 2012-12-31 2016-01-12 Janssen Biotech Inc Suspension y agrupamiento de celulas humanas pluripotentes para la diferenciacion a celulas endocrinas pancreaticas.
KR102232650B1 (ko) 2013-06-11 2021-03-29 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 SC-β 세포 및 조성물 그리고 그 생성 방법
WO2015098962A1 (ja) * 2013-12-25 2015-07-02 東亞合成株式会社 多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導方法
EP3954759A1 (en) 2014-05-16 2022-02-16 Janssen Biotech, Inc. Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells
EP3712254A1 (en) * 2014-05-28 2020-09-23 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation
JP2017534269A (ja) * 2014-10-08 2017-11-24 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 幹細胞を肝臓細胞系譜に分化させる方法
CA2963704A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Children's Hospital Medical Center In vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells and methods of making and using same
EP3234110B1 (en) 2014-12-18 2024-02-28 President and Fellows of Harvard College METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED ß CELLS AND USES THEREOF
US10253298B2 (en) 2014-12-18 2019-04-09 President And Fellows Of Harvard College Methods for generating stem cell-derived beta cells and methods of use thereof
US10443042B2 (en) 2014-12-18 2019-10-15 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
JP6691756B2 (ja) 2015-09-29 2020-05-13 東亞合成株式会社 合成ペプチドを用いた神経幹細胞の生産方法
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
CA3016641A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Children's Hospital Medical Center Methods for the in vitro manufacture of gastric fundus tissue and compositions related to same
CA3045145A1 (en) 2016-12-05 2018-06-14 Children's Hospital Medical Center Colonic organoids and methods of making and using same
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
US10391156B2 (en) 2017-07-12 2019-08-27 Viacyte, Inc. University donor cells and related methods
IL305391A (en) 2017-11-15 2023-10-01 Vertex Pharma Preparations for the production of islet cells and methods of use
EP3833365A4 (en) 2018-08-10 2022-05-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated ISLE DIFFERENTIATION DERIVED FROM STEM CELLS
US10724052B2 (en) 2018-09-07 2020-07-28 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CA3130106C (en) 2019-03-13 2023-05-02 Valvoline Licensing And Intellectual Property Llc Novel traction fluid with improved low temperature properties
CA3139585C (en) 2019-05-31 2024-01-23 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
CN114401752B (zh) 2019-05-31 2023-04-04 W.L.戈尔及同仁股份有限公司 具有受控氧扩散距离的细胞封装装置
CA3139591C (en) 2019-05-31 2024-01-16 Timothy M. BRUHN A biocompatible membrane composite
JP2022534545A (ja) 2019-05-31 2022-08-01 ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティド 生体適合性メンブレン複合体
JP7385244B2 (ja) * 2019-06-27 2023-11-22 国立大学法人 東京大学 膵前駆細胞の分離方法
MX2022002663A (es) 2019-09-05 2022-04-07 Crispr Therapeutics Ag Celulas donantes universales.
AU2020341186A1 (en) 2019-09-05 2022-03-03 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
KR20230146007A (ko) 2020-12-31 2023-10-18 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 범용 공여자 세포
CN113234664A (zh) * 2021-05-11 2021-08-10 澳门大学 一种胰腺祖细胞的制备方法及其应用

Family Cites Families (211)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5759830A (en) 1986-11-20 1998-06-02 Massachusetts Institute Of Technology Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (ru) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
AU704723B2 (en) 1994-12-29 1999-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antitumor agent effect enhancer containing IL-6 antagonist
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
EP1028954B1 (en) 1997-04-24 2003-07-02 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory diseases
EP1028737B1 (en) 1997-07-03 2007-04-04 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells from peripheral blood
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
PT1015576E (pt) 1997-09-16 2005-09-30 Egea Biosciences Llc Metodo para a sintese quimica completa e montagem de genes e de genomas
AU1197699A (en) 1997-10-23 1999-05-10 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells
AR014195A1 (es) 1997-12-29 2001-02-07 Ortho Mcneil Pharm Inc Compuestos de trifenilpropanamida utiles para el tratamiento de procesos inflamatorios, composiciones anti-inflamatorias que los comprenden, ymetodos para prepararlos
DK1066052T3 (da) 1998-03-18 2006-06-12 Osiris Therapeutics Inc Mesenchymstamceller til forebyggelse og behandling af immunreaktioner ved transplantationer
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
AU2515600A (en) 1999-01-21 2000-08-07 Vitro Diagnostics, Inc. Immortalized cell lines and methods of making the same
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
EP1224259A4 (en) 1999-09-27 2005-04-27 Univ Florida INVERSION OF INSULIN DEPENDENT DIABETES BY ISOLATED STEM CELLS, PROGENITOR ISLANDIC CELLS, AND INSULAR TYPE STRUCTURES
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
EP1240518A4 (en) 1999-12-13 2006-05-17 Scripps Research Inst MARKERS FOR THE IDENTIFICATION AND INSULATION OF PRE-GENERIC CELLS OF A AND B PANCREAS ISOLATED CELLS
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
CN1449439A (zh) 2000-06-26 2003-10-15 株式会社雷诺再生医学研究所 细胞级分包括能分化为神经细胞的细胞
MXPA03003612A (es) 2000-10-23 2003-06-19 Smithkline Beecham Corp Compuestos novedosos.
AU2737102A (en) 2000-12-08 2002-06-18 Ortho Mcneil Pharm Inc Macroheterocylic compounds useful as kinase inhibitors
IL156339A0 (en) 2000-12-08 2004-01-04 Ortho Mcneil Pharm Inc Indazolyl-substituted pyrroline compounds as kinase inhibitors
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
EP1366148A2 (en) 2001-01-24 2003-12-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
EP1360189A1 (en) 2001-01-25 2003-11-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Formulation of boronic acid compounds
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
EP1379626A2 (en) 2001-04-19 2004-01-14 DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung A method for differentiating stem cells into insulin-producing cells
EP1391505B1 (en) 2001-04-24 2009-01-28 Ajinomoto Co., Inc. Stem cells and method of separating the same
CA2447015A1 (en) 2001-05-15 2002-11-21 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
CA2456981C (en) 2001-08-06 2012-02-28 Bresagen, Inc. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
JP2005506074A (ja) 2001-10-18 2005-03-03 イクシオン・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド 肝臓の幹細胞および前駆細胞の膵臓機能細胞への転換
WO2003039489A2 (en) * 2001-11-09 2003-05-15 Artecel Sciences, Inc. Endocrine pancreas differentiation of adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof
JP4330995B2 (ja) 2001-11-15 2009-09-16 チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 絨毛膜絨毛、羊水、および胎盤からの胎児性幹細胞を単離、増殖、および分化させる方法、ならびにその治療的使用方法
CA2469370C (en) 2001-12-07 2014-07-08 Macropore Biosurgery, Inc. Adipose-derived cell processing unit
EP2264146A1 (en) 2001-12-07 2010-12-22 Geron Corporation Islet cells from human embryonic stem cells
WO2003054169A1 (en) 2001-12-21 2003-07-03 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
CN1671835A (zh) 2001-12-28 2005-09-21 塞拉提斯股份公司 一种建立多能人胚泡衍生的干细胞的方法
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
US20050208029A1 (en) 2002-04-17 2005-09-22 Akihiro Umezawa Method of forming pancreatic beta cells from mesenchymal cells
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
EP1506192B1 (en) 2002-05-08 2008-02-27 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituted pyrroline kinase inhibitors
US20060003446A1 (en) 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
BR0311360A (pt) 2002-05-28 2006-06-06 Becton Dickinson Co métodos para expansão e transdiferenciação in vitro de células acinares pancreáticas humanas em células produtoras de insulina
WO2003104222A1 (en) 2002-06-05 2003-12-18 Janssen Pharmaceutica N.V. Bisindolyl-maleimid derivatives as kinase inhibitors
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
US20040106216A1 (en) 2002-07-02 2004-06-03 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method of measuring drug-metabolizing enzyme activity, method of evaluating inhibition of drug-metabolizing enzyme activity, and composition for these methods
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
CA2494040A1 (en) 2002-07-29 2004-02-05 Es Cell International Pte Ltd. Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose
AU2003262628A1 (en) 2002-08-14 2004-03-03 University Of Florida Bone marrow cell differentiation
US7371576B2 (en) 2002-09-06 2008-05-13 Reneuron, Inc. CD56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
AU2003285172A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 The Johns Hopkins University Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
EP1567639A4 (en) 2002-12-05 2005-12-21 Technion Res & Dev Foundation CULTURE OF HUMAN PANCREATIC ISLANDS AND USES THEREOF
WO2004055155A2 (en) 2002-12-16 2004-07-01 Technion Research & Development Foundation Ltd. Methods of preparing feeder cells-free, xeno-free human embryonic stem cells and stem cell cultures prepared using same
US20070155661A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
WO2005045001A2 (en) 2003-02-14 2005-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
US20070020242A1 (en) 2003-03-27 2007-01-25 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
WO2004090110A2 (en) 2003-03-31 2004-10-21 Bresagen Inc. Compositions and methods for the control, differentiation and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
US7413734B2 (en) 2003-06-27 2008-08-19 Ethicon, Incorporated Treatment of retinitis pigmentosa with human umbilical cord cells
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
WO2005017117A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Martin Haas Multipotent amniotic fetal stem cells (mafsc) and banking of same
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
EP1670900A4 (en) 2003-08-27 2008-06-11 Stemcells California Inc ENHANCED PANCREATIC STEM CELL AND PRECURSOR CELL POPULATIONS AND METHOD OF IDENTIFYING, INSULATING AND ENRICHING SUCH POPULATIONS
WO2005058301A1 (en) 2003-12-17 2005-06-30 Allergan, Inc. Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
WO2005116073A2 (en) 2004-04-27 2005-12-08 Cythera, Inc. Pdx1 expressing endoderm
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
CN112813019A (zh) 2003-12-23 2021-05-18 维亚希特公司 定形内胚层
DK2722387T3 (da) 2003-12-23 2020-01-20 Viacyte Inc Definitiv endoderm
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
US20050233446A1 (en) 2003-12-31 2005-10-20 Parsons Xuejun H Defined media for stem cell culture
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
WO2005071066A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for preparing pancreatic insulin secreting cells
WO2005080551A2 (en) 2004-02-12 2005-09-01 University Of Newcastle Upon Tyne Stem cells
WO2005080598A1 (ja) 2004-02-19 2005-09-01 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
JP2008500809A (ja) 2004-03-09 2008-01-17 ライフスキャン・インコーポレイテッド インスリン産生細胞を発生させるための方法
CA2558486A1 (en) 2004-03-10 2005-09-22 Alberto Hayek Compositions and methods for growth of embryonic stem cells
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
KR20070029681A (ko) 2004-04-01 2007-03-14 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 줄기 세포의 내배엽 및 이자 혈통으로의 분화
CA2573283C (en) 2004-07-09 2023-03-14 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
EP1791952A4 (en) 2004-08-13 2008-06-11 Univ Georgia Res Found COMPOSITIONS AND METHODS OF SELF-RENEWAL AND DIFFERENTIATION IN HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS
WO2006026473A2 (en) 2004-08-25 2006-03-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS UTILIZING MYC AND GSK3ß TO MANIPULATE THE PLURIPOTENCY OF EMBRYONIC STEM CELLS
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
BRPI0514778B1 (pt) 2004-09-08 2018-07-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Meio para cultivar células tronco embrionárias
DK3196296T3 (en) 2004-09-08 2019-02-04 Wisconsin Alumini Res Foundation Cultivation of human embryonic stem cells
AU2006210955A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Es Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
WO2006094286A2 (en) 2005-03-04 2006-09-08 John O'neil Adult pancreatic derived stromal cells
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
US7998938B2 (en) 2005-04-15 2011-08-16 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
US20080227656A1 (en) 2005-04-26 2008-09-18 Flemming Besenbacher Biosurface Structure Array
BRPI0611733A2 (pt) 2005-06-10 2010-09-28 Irm Llc compostos que mantêm pluripotência de células-tronco embriÈnicas
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
US20080199959A1 (en) 2005-06-21 2008-08-21 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method For Cell Culture
GB2441488C (en) 2005-06-22 2011-10-05 Geron Corp Suspension culture of human embryonic stem cells
JP5345388B2 (ja) 2005-06-30 2013-11-20 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 環式アニリノ−ピリジノトリアジン
WO2007012144A1 (en) 2005-07-29 2007-02-01 Australian Stem Cell Centre Limited Compositions and methods for growth of pluripotent cells
US20080194021A1 (en) 2005-07-29 2008-08-14 Mays Robert W Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
EP1943334A1 (en) 2005-09-02 2008-07-16 Agency for Science, Technology and Research Method of deriving progenitor cell line
WO2007030870A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Es Cell International Pte Ltd Cardiomyocyte production
EP1941032A2 (en) 2005-10-14 2008-07-09 Regents Of The University Of Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
WO2007051038A2 (en) 2005-10-27 2007-05-03 Cythera, Inc. Pdx1-expressing dorsal and ventral foregut endoderm
US8048999B2 (en) 2005-12-13 2011-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
CA2643478C (en) 2006-02-23 2019-06-18 Novocell, Inc. Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
EP1999253B1 (en) 2006-03-02 2019-05-22 Viacyte, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
CA2650812C (en) 2006-04-28 2017-12-12 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
CA2650561C (en) 2006-05-02 2014-02-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage
US7964402B2 (en) 2006-05-25 2011-06-21 Sanford-Burnham Medical Research Institute Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
AU2007254766A1 (en) 2006-06-02 2007-12-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems
CN101541953A (zh) 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
WO2007149182A2 (en) 2006-06-19 2007-12-27 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
AU2007297575A1 (en) 2006-06-26 2008-03-27 Lifescan, Inc. Pluripotent stem cell culture
US8968994B2 (en) 2006-07-06 2015-03-03 Jeremy Micah Crook Method for stem cell culture and cells derived therefrom
AU2007277364B2 (en) 2006-07-26 2010-08-12 Viacyte, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
KR101331510B1 (ko) 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
US20080091234A1 (en) 2006-09-26 2008-04-17 Kladakis Stephanie M Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
WO2008048647A1 (en) 2006-10-17 2008-04-24 Cythera, Inc. Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
MX2009004096A (es) * 2006-10-17 2009-06-16 Stiefel Laboratories Metabolitos de talarozol.
CA2666789C (en) 2006-10-18 2016-11-22 Yong Zhao Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
TW200836749A (en) 2007-01-09 2008-09-16 Vioquest Pharmaceuticals Inc Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
KR20090115142A (ko) 2007-01-30 2009-11-04 유니버시티 오브 조지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 초기 중배엽 세포，내배엽 및 중배엽 계통의 생성에 유용한 중내배엽 세포의 안정한 집단 및 다능성 유주 세포（ｍｍｃ）
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
CN101861386A (zh) 2007-07-18 2010-10-13 生命扫描有限公司 人胚胎干细胞的分化
ES2648128T3 (es) 2007-07-31 2017-12-28 Lifescan, Inc. Diferenciación de células madre pluripotentes usando células alimentadoras humanas
EP2185693B1 (en) 2007-07-31 2019-07-03 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
KR101544498B1 (ko) 2007-08-24 2015-08-17 스티칭 허트 네덜란드 칸커 인스티튜트 종양성 질환의 치료를 위한 조성물
WO2009061442A1 (en) 2007-11-06 2009-05-14 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells
MX2010005805A (es) * 2007-11-27 2010-06-09 Lifescan Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
EP2250252A2 (en) 2008-02-11 2010-11-17 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
CN105886459A (zh) 2008-02-21 2016-08-24 詹森生物科技公司 用于细胞粘附、培养和分离的方法、表面改性培养板和组合物
WO2009116951A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
DK2283117T3 (da) 2008-04-21 2014-01-20 Viacyte Inc Fremgangsmåde til oprensning af pancreatiske endodermceller afledt fra humane embryoniske stamceller
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
WO2009132083A2 (en) 2008-04-22 2009-10-29 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
WO2009154606A1 (en) 2008-06-03 2009-12-23 Cythera, Inc. Growth factors for production of definitive endoderm
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
ES2697798T3 (es) 2008-06-30 2019-01-28 Janssen Biotech Inc Diferenciación de células madre pluripotentes
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
CA2742268C (en) 2008-10-31 2020-02-18 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
DK2356213T3 (da) 2008-11-04 2019-09-09 Viacyte Inc Stamcelleaggregatsuspensionssammensætninger og fremgangsmåder til differentiering deraf
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
CA3229301A1 (en) 2008-11-14 2010-05-20 Viacyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
JP2012509085A (ja) 2008-11-20 2012-04-19 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド マイクロキャリア上での多能性幹細胞の培養
WO2010063848A1 (en) 2008-12-05 2010-06-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells
RU2540016C2 (ru) 2009-07-20 2015-01-27 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
MX348077B (es) 2009-07-20 2017-05-25 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
SG183400A1 (en) 2010-03-02 2012-09-27 Univ Singapore Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response
JP6043999B2 (ja) 2010-08-05 2016-12-14 ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション ヒト多能性細胞培養のための簡易基本培地

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
.02.2008, the whole document, especially fig.1. OSTROM ET AL., Retinoic acid promotes the generation of pancreatic endocrine progenitor cells and their further differentiations into beta-cells, PLos one, vol.3, no.7, e2841, 30.07.2008, the whole document, especially abstract, fig.2-4. *
GILTAIRE ET AL., The CYP26 inhibitor R115866 potentiates the effects of all trans retinoic acid on cultured human epidermal keratinocytes, British Journal of Dermatology, vol.160, pp. 505-513, 2009 *
KROON ET AL., Pancreatic endoderm dervived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo, Nature Biotechnology, vol.26, no.4, pp.443-452, 20 *
KROON ET AL., Pancreatic endoderm dervived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo, Nature Biotechnology, vol.26, no.4, pp.443-452, 20.02.2008, the whole document, especially fig.1. OSTROM ET AL., Retinoic acid promotes the generation of pancreatic endocrine progenitor cells and their further differentiations into beta-cells, PLos one, vol.3, no.7, e2841, 30.07.2008, the whole document, especially abstract, fig.2-4. GILTAIRE ET AL., The CYP26 inhibitor R115866 potentiates the effects of all trans retinoic acid on cultured human epidermal keratinocytes, British Journal of Dermatology, vol.160, pp. 505-513, 2009, the whole document, especially summary, fig.4. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2611907B1 (en) 2016-05-04
US20160040130A1 (en) 2016-02-11
CN103154237A (zh) 2013-06-12
HK1186492A1 (zh) 2014-03-14
EP2611907A4 (en) 2014-01-22
MX2013002407A (es) 2013-04-05
MX348537B (es) 2017-06-07
AU2011296383B2 (en) 2016-03-10
JP2013536687A (ja) 2013-09-26
AR082821A1 (es) 2013-01-09
JP2017163988A (ja) 2017-09-21
SG187947A1 (en) 2013-03-28
JP6353951B2 (ja) 2018-07-04
US20120052576A1 (en) 2012-03-01
CA2809305A1 (en) 2012-03-08
KR101836855B1 (ko) 2018-04-19
US9458430B2 (en) 2016-10-04
CA2809305C (en) 2019-06-11
RU2673946C1 (ru) 2018-12-03
EP2611907A2 (en) 2013-07-10
KR20130101029A (ko) 2013-09-12
WO2012030540A3 (en) 2012-05-31
PL2611907T3 (pl) 2016-11-30
CN103154237B (zh) 2016-03-16
US9181528B2 (en) 2015-11-10
BR112013004614A2 (pt) 2024-01-16
WO2012030540A2 (en) 2012-03-08
RU2013114374A (ru) 2014-10-10
ES2585028T3 (es) 2016-10-03
AU2011296383A1 (en) 2013-03-07
JP6133776B2 (ja) 2017-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2599420C2 (ru) Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток
US20170327793A1 (en) Differentiation of human embryonic stem cells
RU2627168C2 (ru) Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
US20180237752A1 (en) Differentiation of human embryonic stem cells