CN115074368B - 一种耐药型类风湿性关节炎动物模型的构建及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐药型类风湿性关节炎动物模型的构建及其应用，其中，CD4+细胞特异性表达ABCB5大鼠模型的构建方法包括如下步骤：将大鼠ROSA26基因的gRNA、基因载体和Cas9mRNA共同注射到大鼠受精卵中，得到F0祖代；F0祖代与野生型大鼠杂交，筛选得到ABCB5基因阳性杂合子F1代后，筛选获得阳性纯合子；纯合子大鼠与Cre重组酶工具鼠杂交，最终筛选出ABCB5和Cre双基因阳性的子代幼崽即得。整个构建过程均仅依赖于两种不同的转基因SD大鼠，且该CD4+细胞特异性表达ABCB5的SD大鼠动物模型可以基于Tam实现可控式ABCB5表达，具有极好的实用价值和科研价值。

Description

一种耐药型类风湿性关节炎动物模型的构建及其应用
技术领域
本发明属于模型动物的制备领域，具体涉及一种耐药型类风湿性关节炎动物模型的构建及其应用。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是一种常见的自身免疫性疾病，全球范围内约有3000万患者。RA是一种慢性疾病，会造成关节骨骼损伤，致残率达到30％-50％，且病情缠绵，难以治愈。患病后会导致劳动力逐渐丧失，社会参与度下降，而且患者还需面临长期的医疗费用支出，对患者的生活质量带来了极大的挑战。因此，精准的早期诊断(并迅速开始治疗)和设计合理的治疗策略(仔细控制炎症，减少或防止疾病损害)对于改善RA患者的病情和生活水平都有极大的帮助。
非甾体抗炎药(NSAIDs)、类固醇和改善症状抗风湿病药物(DMARDs)是三种主要的RA干预手段。然而这些药物都存在着一定的缺陷性，如DMARDs的使用往往会伴随一些不良的副作用。而且耐药性的产生也是目前阻碍RA成功治疗的主要原因之一。据统计，约有25％的RA患者存在多重耐药性，从而不得不停止DMARDs等药物的使用。其中，如DMARDs类的代表药物甲氨蝶呤(MTX)，ABC转运蛋白增加药物的外排是导致MTX耐药的原因之一。
但目前并无具有广泛适用性的耐药型类风湿性关节炎动物模型可用于耐药型类风湿性关节炎的研究及其治疗药物的筛选，从而致使相关药物的开发受到了限制，因此开发一种耐药型类风湿性关节炎动物模型以作为耐药型类风湿性关节炎治疗药物筛选平台，将对于相关药物的开发和治疗效果的验证以及机理性研究具有十分重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种耐药型类风湿性关节炎动物模型的构建及其应用。本发明中的耐药型类风湿性关节炎动物模型具体为CD4+细胞特异性表达ABCB5大鼠模型，其是发明人在本领域中首次构建得到的大鼠模型，基于该模型可以实现类风湿性关节炎耐药方面的研究。而且该耐药型RA大鼠模型并非全身性表达，而是基于CD4+细胞过表达ABCB5，使其更加贴近于RA病人的真实表达情况，以该模型作为测试平台对RA耐药研究和药物筛选更具有实际意义。
本发明的第一个方面，提供一种耐药型类风湿性关节炎动物模型的获得方法，包括如下步骤：
在动物的CD4+细胞中高表达ABC转运蛋白基因，然后进行风湿性关节炎造模；其中，所述耐药型类风湿性关节炎动物模型为非全身性ABC转运蛋白高表达动物模型。
发明人从类风湿性关节炎患者临床样本中鉴定出某些与耐药相关基因的高表达，阐明其功能以及如何介导细胞耐药反应，进而为临床RA治疗提供靶标。所述的耐药相关基因涉及以下几种。
1.ABCB1(ATP结合盒亚家族B成员1)：具有跨膜转运药物和磷脂的作用。一种能催化磷脂从胞质向顶端膜的外质小叶翻转的，依赖ATP的外排泵减少了多种耐药细胞内的药物累积。
2.ABCB5(ATP结合盒亚家族B成员5)：能够减少多重耐药细胞中药物积累的ATP依赖性外排转运蛋白。
3.ABCG2(ATP结合盒亚家族G成员2):ATP结合盒(ABC)家族的一种具有广泛底物特异性的ATP依赖转运蛋白，能从细胞内排出多种生理化合物、食物毒素和外源物质。
4.ABCC3(ATP结合盒亚家族C成员3):ATP结合盒(ABC)家族中ATP依赖的转运体，可与ATP结合并水解ATP，使多种底物(包括多种药物、毒物和内源性化合物)能跨细胞膜主动转运。
5.ABCC1(ATP结合盒亚家族C成员1):介导细胞质中有机阴离子和药物的输出。
6.LRP(Lung resistance-relatedprotein肺耐药相关蛋白或称Majorvaultprotein,MVP)：存在于大多数正常组织中。在具有分泌和排泄功能的上皮细胞以及长期暴露于外源性物质的细胞中观察到更高的表达，例如支气管细胞和肠道内壁细胞。在许多耐多药癌细胞中过度表达。
7.RFC(Reduced folate carrierprotein)：能够抑制叶酸和环二核苷酸亚基导入的转运蛋白，并且还能够介导抗叶酸药物甲氨蝶呤的导入。
在本发明的一些实施方式中，上述基因的筛选是基于RA病人PBMC样本中进行耐药相关蛋白筛选得到。
在本发明的一些实施方式中，所述耐药蛋白筛选具体为通过RT-PCR定量分析样本中上述蛋白mRNA表达量水平来实现，经检测ATP结合盒式蛋白亚家族B成员5(ABC转运蛋白ABCB5)在RA病人样本中高表达。并对筛选出的ABCB5转运蛋白，使用高表达该蛋白的耐药细胞系与荧光小分子药物共同构建的细胞平台，用来阐明该蛋白功能及活性。
在本发明的一些实施方式中，ABCB5转运蛋白功能作用检测具体涉及该蛋白的外排转运功能。
在本发明的一些实施方式中，ABCB5转运蛋白生物活性检测具体涉及ABCB5的外排转运药物活性和导致甲氨蝶呤药物使用量增加即细胞表现出耐药现象。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，在所述动物的CD4+细胞中高表达ABC转运蛋白基因的方法为：将ABCB5基因定点插入至大鼠染色体安全位点中，所述ABCB5基因的表达受loxp-stop-loxp序列和Cre-ERT2系统调控。
在本发明的一些实施方式中，所述Cre-ERT2系统受到双重调控。
在本发明的一些实施方式中，所述调控方式为外源性配体诱导和启动子调控；所述外源性配体包括他莫昔芬；所述启动子包括CD4+细胞特异性启动子。
本发明主要是基于发明人此前从RA病人PBMC样品中筛选出的RA耐药相关蛋白即ABCB5转运蛋白。利用CRISPR-Cas9技術构建在CD4+细胞(免疫相关细胞)中特异性高表达ABCB5的转基因SD大鼠动物模型。其中，所述转基因SD大鼠动物模型由LoxP-stop-LoxPABCB5+/+转基因鼠和pStart-K-CD4>CreERT2重组酶转基因工具鼠两部分构成。其中，所用的ABCB5转基因鼠初始基因型为杂合子，需进行杂交繁殖并用PCR鉴定出基因型为纯合子的子代。所用的重组酶转基因工具鼠的重组酶基因为非定点插入，需进行杂交繁殖并经PCR鉴定方可使用。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，在所述动物的CD4+细胞中高表达ABC转运蛋白基因的方法具体为：
(1)将含有ABCB5基因和loxp-stop-loxp序列的质粒载体1敲入F0祖代大鼠基因组中，经过传代和纯合子筛选得LoxP-stop-LoxPABCB5+/+转基因大鼠；
(2)将LoxP-stop-LoxPABCB5+/+转基因大鼠与pStart-K-CD4>CreERT2工具大鼠(简称CreERT2工具大鼠)杂交，后经传代和PCR筛选得到LoxP-stop-LoxPABCB5+/+-CD4>CreERT2大鼠；
(3)对所述的LoxP-stop-LoxPABCB5+/+-CD4>CreERT2大鼠使用Tam进行诱导，即得。
在本发明的一些实施方式中，所述获得方法中还包括对大鼠一系列的筛选和鉴定即建系的过程。对于ABCB5转基因鼠需经过杂交繁殖并鉴定筛选出纯合子幼崽即LoxP-stop-LoxPABCB5+/+转基因大鼠。其中，PCR筛选的产物及其对应基因型如下：(a)使用引物对ABCB5 F3-R1-R6时(即上游引物为RatROSA26(rAbcb5 CDS)-F3，下游引物为Rat ROSA26(rAbcb5 CDS)5'arm-R1和RatROSA26(rAbcb5 CDS)-R6)，纯合子PCR扩增产物长度为551bp，杂合子为551bp/505bp，野生型为505bp；(b)使用引物对ABCB5 F3-R6时(即上游引物为RatROSA26(rAbcb5 CDS)-F3，下游引物为RatROSA26(rAbcb5 CDS)-R6)。，纯合子无条带，杂合子为505bp，野生型也为505bp。引物对ABCB5 F3-R6仅在F1子代的鉴定中使用起重复验证作用。
而对于ABCB5转基因鼠和Cre转基因工具鼠杂交的双基因阳性幼崽的PCR筛选，使用的引物对为ABCB5 F3-R1-R6(用于筛选ABCB5纯合子转基因鼠，上游引物为RatROSA26(rAbcb5 CDS)-F3，下游引物为Rat ROSA26(rAbcb5 CDS)5'arm-R1和下游引物为RatROSA26(rAbcb5 CDS)-R6)和Cre F3-R3(用于筛选Cre工具鼠，上游引物为Transgene PCRprimer F3，下游引物为Transgene PCR primer R3)。选取LoxP-stop-LoxPABCB5+/+基因与pStart-K-CD4>CreERT2基因同时插入基因组的幼崽即为LoxP-stop-LoxP ABCB5+/+-CD4>CreERT2大鼠。
本发明的第二个方面，提供一种耐药型类风湿性关节炎动物模型的获得方法，包括如下步骤：向动物的关节腔内注射ABC转运蛋白高表达载体，然后进行类风湿性关节炎造模。
根据本发明的第一和第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述ABC转运蛋白基因为ABCB5基因。
根据本发明的第一和第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述动物包括鼠。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理使用其他动物作为实验动物，参考本发明实施例中的方法构建相应的动物模型，其动物包括但不限于鼠。
根据本发明的第一和第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述鼠包括大鼠和小鼠。
在本发明的一些实施方式中，所述鼠包括C57小鼠、Balb/C小鼠、DBA小鼠、Wistar大鼠、Lewis大鼠和SD大鼠。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理使用其他类型的鼠作为实验动物，参考本发明实施例中的方法构建相应的鼠模型，其包括但不限于上述的C57小鼠、Balb/C小鼠、DBA小鼠、Wistar大鼠、Lewis大鼠和SD大鼠。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述载体为病毒载体。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒为腺病毒或腺相关病毒。
当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理使用其他载体类型，参考本发明实施例中的方法或结合本领域中的常规操作构建相应的载体，其包括但不限于本发明实施里中的腺病毒。
根据本发明的第一和第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述动物具有多药耐药性。
根据本发明的第一和第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述动物具有甲氨蝶呤耐药性。
本发明的第三个方面，提供本发明第一或第二个方面所述的获得方法得到的动物模型在鉴别或筛选用于治疗耐药型类风湿性关节炎的化合物中的应用。
在本发明中，发明人利用上述第一方面所述方法获得的世界上首个条件性诱导CD4+細胞高表达ABCB5的SD大鼠或第二个方面所述方法获得的高表达ABCB5的SD大鼠作为关节炎大鼠耐药动物模型对筛选出的ABCB5转运蛋白抑制剂进行转基因动物体内活性实验，验证其活性。阐明该动物模型作为ABCB5转运蛋白抑制剂筛选平台的有效性和可靠性。为获得可有效治疗耐药型类风湿性关节炎的ABCB5转运蛋白抑制剂并以此进一步为临床RA治疗提供可靠的理论参考依据和数据支持。
发明人通过细胞实验验证，发现ABCB5转运蛋白可介导MTX的外排，引起MTX的耐药反应。然而目前并没有一个RA耐药的动物模型可供本领域技术人员进行体内活性研究，因此，开发一种耐药性RA大鼠模型具有极高的科研价值和实用意义。而基于上述构建的动物模型，其可以通过测试药物是否能够改善该动物模型的足肿胀、抑制相关炎症因子表达、减少关节及骨破坏、改善MicroCT评分等情况以及通过ESR评价RA病情严重程度，从而综合评价测试药物实际治疗RA耐药的效果，从而筛选出目标药物。
在本发明实施例中，鉴定出ABCB5高表达的样品为PBMC。由于PBMC中主要的细胞类型为淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)，T细胞占据其中的绝大部分(约70％)。T细胞(表达CD3+的T淋巴细胞)可分为CD4+和CD8+T细胞，它们以大约2:1的比例存在于PBMC中。T细胞在类风湿性关节炎中起着至关重要的作用，它介导了RA的发病。并且，T细胞是RA滑膜中最丰富的细胞类型之一，占滑膜组织细胞的30-50％，其中，大多数是CD4+T细胞。该模型可在免疫系统中的CD4+细胞中表达ABCB5转运蛋白。该模型相比于一般动物模型更具有针对性，可更加准确和客观的评价ABCB5转运蛋白在类风湿性关节炎中的作用。
当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理使用检测样品类型，参考本发明实施例中的方法或结合本领域中的常规操作进行相关指标的检测，其包括但不限于本发明实施里中的PBMC。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供了一种基于CRISPR-Cas9技术构建得到的CD4+细胞特异性表达ABCB5的SD大鼠动物模型，整个构建过程均仅依赖于两种不同的转基因SD大鼠，且该CD4+细胞特异性表达ABCB5的SD大鼠动物模型可以基于他莫昔芬(Tam)实现可控式ABCB5表达，具有极好的实用价值和科研价值。
2.本发明首次提出了一种CD4+细胞特异性表达ABCB5 SD大鼠作为关节炎大鼠耐药动物模型中的应用，并实际构建得到了该关节炎大鼠耐药动物模型。该关节炎大鼠耐药动物模型采用非全身性ABCB5表达，而是基于CD4+细胞过表达ABCB5，使其更加贴近于RA病人的真实表达情况，以该模型作为测试平台对RA耐药研究和药物筛选更具有实际意义。
附图说明
图1为RT-PCR法检测RA病人PBMC临床样本耐药相关基因表达情况；其中，(A)为ABCB1、ABCBG2、ABCC3、ABCC1、LRP、RFC基因的表达水平，(B)为RA病人的ABCB5基因表达水平，(C)为外周血单核细胞ABCB5表达水平与RA患者相关性ROC曲线；
图2为ABCB5高表达的RAFLS耐药细胞系的构建和流式细胞术检测RAFLS耐药细胞药物外排功能的强弱情况，其中，(A)为免疫印记法分析瞬时转染的RAFLS细胞中ABCB1或ABCB5表达的蛋白条带，(B)为罗丹明123(Rho123)或MTX-FITC在ABCB1和ABCB5过表达的RAFLS中的外排作用流式细胞术图，(C)为Rho123或MTX-FITC在ABCB1和ABCB5过表达的RAFLS中的外排效果的条形图，条形图中显示的数据用转染空载体的对照标准化；
图3为MTT法研究ABCB5在RAFLS细胞或T淋巴细胞中导致甲氨蝶呤耐药，其中，(A)为RAFLS细胞存活率变化情况，(B)为Jurkat细胞存活率变化情况；
图4为青藤碱抑制高表达ABCB5的RA-FLS对Rho123外排作用流式细胞术图(A)，维拉帕米为阳性对照；以及(B)青藤碱抑制高表达ABCB5的RAFLS对Rho123外排作用流式统计分析条形图，条形图中显示的数据用转染空载体的对照标准化；
图5为构建关节腔注射ABCB5腺病毒介导的耐药AIA大鼠模型的示意图；
图6为免疫组化DAB染色法研究ABCB5腺病毒介导的耐药AIA大鼠滑膜中ABCB5的表达水平，其中，(A)为关节腔滑膜DAB染色图，(B)为免疫组化染色评分统计学分析结果柱状图；
图7为青藤碱联合甲氨蝶呤对耐药AIA大鼠足肿胀的影响：(A)SD大鼠足部照片(B)SD大鼠足体积的变化情况；
图8为MicroCT分析耐药AIA大鼠骨破坏程度：(A)SD大鼠足部微电脑断层扫描复原图片黄色箭头指示显著骨破坏位点，(B)SD大鼠足部骨破坏评分统计学分析结果柱状图，(C)SD大鼠足部骨破坏程度评价表；
图9为RT-PCR检测SD大鼠血液样本中炎症相关细胞因子表达情况，其中，结果使用健康组作为对照标准化；
图10为基于Cre-LoxP重组酶系统构建ABCB5转基因鼠基因构建图示；
图11为Tam诱导CD4+细胞高表达ABCB5的转基因SD大鼠耐药动物模型构建图示，其中，包括：基于Tam与Cre-ERT2诱导系统构建重组酶转基因工具鼠即pStart-K-CD4>CreERT2工具大鼠，ABCB5转基因鼠即LoxP-stop-LoxP ABCB5+/+大鼠，ABCB5转基因鼠与Cre工具鼠杂交的双基因阳性子代即LoxP-stop-LoxPABCB5+/+-CD4>CreERT2大鼠(无Tam诱导)，ABCB5转基因鼠与Cre工具鼠杂交的双基因阳性子代即LoxP-stop-LoxPABCB5+/+-CD4>CreERT2大鼠(Tam诱导)；
图12为含有{CAG-loxP-stop-loxP-RatABCB5 CDs-SV40 late pA}的基因载体质粒图谱(A)和构建目标图示(B)；
图13为LoxP-stop-LoxPABCB5+/+大鼠的繁育建系图示；
图14为F1代大鼠筛选靶向等位基因的分区及标识(包含Region1-6)；
图15为由F1代大鼠繁育出的子代大鼠(F2-F4代)筛选鉴定方案图示；
图16为F1代杂合子大鼠鼠3、4、9号大鼠的PCR筛选鉴定结果(Region7-8为阴性对照)；
图17为F1代幼崽进行序列分析的结果(以3号阳性鼠为例)；
图18为使用引物对ABCB5 F3-R1-R6从繁育的子代鼠中筛选得到的纯合子大鼠的DNA凝胶电泳结果，其中，A～C分别为不同样品编号的样品结果；
图19使用引物对ABCB5 F3-R6从繁育的子代鼠中筛选得到的纯合子大鼠的DNA凝胶电泳结果(重复验证)，其中，A～C分别为不同样品编号的样品结果；
图20为ABCB5纯合子大鼠相互杂交繁育出的子代鼠使用使用引物对ABCB5 F3-R6进行PCR鉴定的结果图示；
图21为构建重组酶工具鼠pStart-K-CD4>CreERT2工具大鼠的质粒图谱；
图22为使用四对不同引物对F1代重组酶转基因工具鼠进行PCR鉴定的DNA凝胶电泳结果；
图23为由F1代重组酶转基因工具鼠繁育的子代幼崽的PCR鉴定DNA凝胶电泳结果(仅使用引物对Cre F1-R1对基因是否成功插入基因组进行判断即可)；
图24为使用引物对ABCB5 F3-R1-R6和Cre F3-R3从ABCB5转基因鼠与工具鼠杂交的子代鼠中筛选LoxP-stop-LoxPABCB5+/+-CD4>CreERT2大鼠(ABCB5和Cre双基因杂交鼠)的DNA凝胶电泳结果；
图25为使用ABCB5 Primer 1、ABCB5 Primer 2和ABCB5 Primer 3分别验证经Tam诱导后的转基因大鼠血液样本中ABCB5 mRNA表达情况；结果使用健康的对照标准化；
图26为使用ABCB5 Primer 1、ABCB5 Primer 2和ABCB5 Primer 3分别验证经Tam诱导后的转基因大鼠脾脏样本中ABCB5 mRNA表达情况；结果使用健康的对照标准化；
图27为使用ABCB5 Primer 1、ABCB5 Primer 2和ABCB5 Primer 3分别验证经Tam诱导后的转基因大鼠胸腺样本中ABCB5 mRNA表达情况；结果使用健康的对照标准化；
图28为免疫印迹法验证Tam诱导后的耐药型转基因大鼠胸腺组织样本中ABCB5的高表达；
图29为青藤碱联合甲氨蝶呤抑制耐药型转基因大鼠足肿胀情况，其中，(A)为SD大鼠足部肿胀照片，(B)为SD大鼠足体积变化情况统计学分析结果折线图示；
图30为青藤碱联合甲氨蝶呤在耐药型转基因大鼠模型中的微电脑断层扫描足部骨结构复原图片，黄色箭头指示显著骨破坏位点；
图31为青藤碱联合甲氨蝶呤在耐药型转基因大鼠模型中的骨破坏评分统计学分析结果柱状图(A)和骨破坏程度分级表(B)；
图32为青藤碱在耐药型类风湿性关节炎转基因动物模型活性实验中各组大鼠红细胞血沉速率分析结果柱状图示；
图33为使用ABCB5 Primer 1(A)、ABCB5 Primer 2(B)和ABCB5 Primer 3(C)验证在耐药型类风湿性关节炎转基因动物模型实验中各组大鼠血液样本中ABCB5 mRNA的表达水平；
图34为通过RT-PCR检测青藤碱联合甲氨蝶呤在耐药型类风湿性关节炎转基因动物模型中有效抑制多种炎症因子的表达，其中，(A)-(D)分别为血液样本中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的表达情况统计分析结果柱状图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实施例1 ABCB5转运蛋白在类风湿性关节炎病人中高表达及在关节炎成纤维滑膜细胞、T淋巴细胞中导致MTX耐药
在本实施例中，试验样本为健康人及RA患者血液样本中分离得到的人外周血单核细胞(PBMC)。其中，用于血样采集的健康供者和RA患者为：年龄为30～74岁之间，来自中国沿海地区(包括江苏、广州和澳门)，根据美国风湿病学会标准确诊为RA，类风湿因子(RFs)检测为阳性。
具体检测方法为：
(1)PBMC的获得：
将获得的血液样本与生理盐水按1:2的体积比进行稀释，并将20mL稀释血液与10mL Ficoll-Paque细胞分离液混合，100×g离心30min，将白色中间层(PBMC)转移到无菌离心管中，加入PBS洗涤。将洗涤后的PBMC转移至含有10％FBS和1％PSG的1640培养基中培养。
(2)实时荧光定量PCR分析：
在本实施例中，为了确定RA耐药性的相关基因，发明人以几种与耐药机制相关的多重耐药转运蛋白(RFC、LRP、ABCB1、ABCB5、ABCC1、ABCC3和ABCG2)为检测靶标，检测正常人和RA患者PBMC中相关靶标基因的的表达水平。
具体步骤为：提取PBMC中的总RNA。取1μg提取得到的总RNA，反转录为cDNA，以反转录得到的cDNA作为模板，使用PowerUpTM Green Master Mix，和设计的特异性引物进行RT-PCR扩增。将基因表达水平标准化为Actin(对照)，并使用2-ΔΔCT方法进行分析。对每个引物分析了3个独立实验，每组3个重复。所有数据均采用非配对t检验进行统计分析。
其中，各靶标基因的特异性引物序列如表1所示。
表1
结果如图1所示。
通过对比可以发现，与正常人相比，RA患者PBMC中除ABCB5之外，其他可能与耐药性有关的转运蛋白的表达水平均未出现显著差异(图1)。而RA患者的ABCB5相比与正常人而言存在表达显著上调(***P<0.005)的情况，说明了ABCB5可能是影响RA耐药性的主要基因。同时，在外周血单核细胞ABCB5表达水平与RA患者相关性ROC曲线中，曲线下面积为0.9483。表明在这些临床样本中，样本ABCB5高表达的同时，该样本对应的目标有极大可能也是RA患者，二者表现出较强的相关性。
实施例2 Rho123和MTX-FITC小分子荧光药物结合流式细胞术分析ABCB5外排功能
参考NCBIAY230001.1合成ABCB5序列(委托Nanjing Genscriptbiotech Inc.进行合成操作)。在合成的ABCB5序列5'端添加BamH I，在3'端添加EcoR I限制性酶切位点。通过BamH I和EcoR I限制酶克隆pcDNA 3.1-mRFP-ABCB5质粒。通过BamH I和EcoR I双酶切和测序验证单克隆。使用脂质体(3000,Invitrogen)转染试剂将ABCB5重组质粒转入类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞(RAFLS)并接种在6孔板中，每孔RAFLS细胞为106个。汇合后，将5μg/mL的Rho123(Sigma-Aldrich,R8004)或0.5μM的MTX-FITC(Invitrogen,M1198MP)添加到每个孔中，在37℃下孵育1h。使用预冷的PBS洗涤细胞5次以停止Rho123的积累。然后将细胞重悬于400μLPBS中进行流式细胞术分析。使用流式细胞仪在488nm激发波长和525nm发射波长下测量细胞内荧光。数据采集和分析均使用Cell Quest(BDBiosciences,SanJose,CA,USA)进行，所有试验至少进行三个独立实验。结果显示为荧光强度的平均值。
同时，对部分转染了ABCB1(方法同ABCB5)或ABCB5重组质粒的RAFLS细胞使用RIPA裂解液(CST,9806)处理。然后使用Bio-Rad蛋白质测定法(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)测定蛋白质浓度，进行定量。随后使用蛋白印迹法Western Blot，样品的细胞裂解物在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳,并转移到增强化学发光硝化纤维素膜，最后经封闭，抗体孵育后通过过氧化物酶偶联的二抗观察抗体的结合。
以ABCB1作为对照，检测步骤同ABCB5。其中，ABCB1的序列参考NCBI M14758.1。
结果如图2所示。
为了研究MTX吸收是否会受到ABCB5的表达的影响，发明人利用脂质体转染试剂构建的ABCB1/ABCB5高表达耐药细胞系，并连同荧光小分子药物组成了研究MTX-FITC外排活性的细胞平台。由于Rho 123作为ABC转运蛋白的底物，可用于显示ABCB1/ABCB5转染后的正常功能，而在结果中发现Rho123被有效地从ABCB1/ABCB5过表达的RAFLS中排出，同时，结合蛋白印迹法Western Blot结果。说明ABCB1/ABCB5转染成功，且具有正常转运功能。而荧光素连接的MTX则是用于流式细胞术分析测试药物外排活性的。可以发现，在没有ABCB1/ABCB5瞬时表达的情况下，超过90％的MTX-FITC在细胞内积累。结果显示过表达ABCB1并不会阻止MTX-FITC在RAFLS中的大量积累，表明MTX不是ABCB1的底物。对比ABCB1的结果，ABCB5的过表达显着降低了RAFLS中MTX-FITC的吸收，表明MTX是ABCB5的底物，可被其大量外排。
实施例3 MTT法检测甲氨蝶呤对RAFLS耐药细胞及T淋巴细胞的毒性作用
使用脂质体转染试剂将上述实施例中获得的ABCB5重组质粒转入RAFLS细胞中。在96孔板中每孔接种4×103个重组RAFLS细胞，过夜培养后，将细胞暴露于不同浓度(0.039-100μmol/L，DMSO稀释)的MTX中72小时，然后将10μL 5.0mg/mL的MTT添加到每个孔中，并在37℃下孵育4小时，然后添加100μL的增溶缓冲液(含有10％十二烷基硫酸钠的0.01mol/LHCl中)，孵育过夜。第二天测定每个孔的570nm出吸光度(A570nm)。对照组为未经处理的重组RAFLS细胞，空白组为正常RAFLS细胞。
根据吸光度计算细胞活力，计算公式为：
式中，A处理表示MTX处理后的RAFLS细胞的A570nm值；A对照表示未经处理的RAFLS细胞的A570nm值；A空白表示未接种细胞的A570nm值。
结果如图3所示。
RAFLS细胞是类风湿性关节炎的关键效应细胞，同时Jurkat(T淋巴细胞)作为一种免疫细胞，其在RA的发病及疾病的发展中起到至关重要的作用。MTX作为抗关节炎药物，在体外实验中对RAFLS表现出良好的杀灭效果。但是高表达ABCB5后，则需要更高剂量的MTX才能达到预期。结果表现为MTX IC50值成倍增加，由1.68μM上升到6.38μM。同样，在Jurkat细胞中我们得到类似的结果。正常Jurkat细胞MTX IC50值为1.72μM，高表达ABCB5的Jurkat细胞，MTX IC50值上升为8.04μM，反映ABCB5高表达引起MTX耐药反应。
实施例4利用罗丹明123(Rho123)在ABCB5高表达的RAFLS细胞中的外排作用筛选ABCB5抑制剂
根据实施例2中的方法。在6孔板中每孔接种106个RAFLS细胞，过夜培养后。使用脂质体转染试剂将ABCB5重组质粒转入RAFLS细胞中，随后将细胞暴露于不同的测试药物(分别为终浓度10μM维拉帕米(Verapamil)或100μM青藤碱(Sinomenine))中，然后在37℃、含有5％CO2的环境下孵育24小时。按终浓度5.0μg/mL的量加入Rho123，37℃孵育1小时。使用预冷的PBS洗涤细胞5次停止Rho123的积累。然后将细胞重悬于400μLPBS中进行流式细胞术分析。使用流式细胞仪在488nm激发波长和525nm发射波长下测量细胞内荧光。以转染后暴露在维拉帕米的RAFLS作为阳性对照，以转染后未经处理的RAFLS细胞为阴性对照，使用转染空载体的对照组平均值进行标准化处理。
结果如图4所示。由于ABCB5所介导的MTX外排现象在RA的治疗中是一个非常大的阻力，其会使病人对MTX表现出耐药性。因此，通过借助流式检测Rho123外排的细胞模型能够有效用于筛选ABCB5抑制剂。本实施例结果表明，正常情况下，Rho123在进入细胞后会形成信号累积。而ABCB5高表达后，在没有药物干预的情况下Rho123会被大量外排，因而荧光信号降低。相比之下，使用100μM青藤碱处理细胞后，会显著抑制外排现象，说明青藤碱能够有效抑制ABCB5对于MTX产生的外排。
实施例5腺病毒介导的ABCB5高表达关节炎大鼠模型的构建及该模型的应用效果
包括如下试验步骤：
(1)腺病毒介导的ABCB5高表达关节炎大鼠模型的构建：
在本实施例中，所用试验大鼠为5周龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，购买自广东省医学实验动物中心，体重80-120g。饲养环境为：配备有温度控制和自动通风系统的房间中，房间内12小时的光/暗循环，并且可以随意取食和饮水。
一般关节炎模型：使用完全弗氏佐剂(CFA，CAS：9007-81-2)诱发大鼠关节炎，具体步骤为：向大鼠尾根皮内注射100μLCFA，第一次发炎会在CFA注射后约第9天出现。对大鼠足体积每三天进行一次测量和记录。
高表达ABCB5关节炎模型：使用完全弗氏佐剂(CFA，CAS：9007-81-2)诱发大鼠关节炎，ABCB5腺病毒(pAV[Exp]-CMV>{rABCB5[XM_006225905.2](ns)}：T2A:EGFP)，载体构建和病毒包装由赛业生物科技有限公司完成，产品ID：AVP-VB180424-1073gvh。具体步骤为：向大鼠尾根皮内注射100μLCFA，然后在当天内使用微量注射器将100μL上述ABCB5腺病毒注射入大鼠关节腔内。
共取48只雄性大鼠，按照表2随机分为8个实验组，每组6只。
表2
疗程结束时(CFA注射后第30天)将大鼠处死，收集大鼠血液及部分脏器，右后脚拍照冻存，左后爪被截肢并固定在4％的多聚甲醛(PFA)内。
使用微电脑断层扫描(MicroCT)分析大鼠足部骨破坏情况，具体步骤为：对左后爪使用体内微型CT扫描仪((SkyScan 1176,Bruker，比利时)在Al 1mm滤片的条件下进行扫描。其中，扫描参数为：35微米分辨率，62kV，385μA，98ms曝光时间，角速度0.70。扫描结束后利用NRecon软件重建图像、CTvox软件用于打开重建的数据文件，并生成可观察的3维图片，CTAn软件对扫描数据进行分析。
MicroCT评分基于MicroCT检查的五项疾病相关指标(骨矿物质密度、骨体积分数、皮质矿物密度、小梁数目和总孔隙率)进行，MicroCT评分的计算公式为：
或
MicroCT得分为以上方法处理后五项疾病相关指标数值之和的平均值。
同时，使用实时荧光定量PCR分析大鼠血液炎症相关细胞因子的表达情况，其中，炎症相关细胞因子具体为IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-2。
具体操作为：取300-400μL收集得到的大鼠血液，使用十倍体积的红细胞裂解液(碧云天，C3702)冰上裂解10分钟，4℃条件下500g离心5min，弃去红色上清。如果发现红细胞裂解不完全，可以重复裂解。裂解完毕后使用PBS洗涤细胞。去除红细胞后，使用FavorPrepTM Blood/Ciltured Cell Total RNAMini Kit(FAVORGEN，FABRK 001-2)，按照说明书操作提取总RNA。取1μg提取得到的总RNA经反转录得到cDNA。以反转录得到的cDNA作为模板，使用PerfectStartTM Green Qpcr SuperMix(Transgen，AQ601)和设计的特异性引物进行RT-PCR扩增。将基因表达水平标准化为Actin(对照)，并使用2-ΔΔCT方法进行分析。对每个引物分析了3个独立实验，每组3个重复。所有数据均采用非配对t检验进行统计分析。
其中，各靶标基因的特异性引物序列如表3所示。
表3
同时，发明人还对大鼠关节腔滑膜上的ABCB5蛋白进行免疫组化分析(DAB染色)，具体步骤为：将PFA固定的大鼠左后腿关节进行脱钙，石蜡包埋，切片，制备得到大鼠关节腔滑膜石蜡切片。然后用二甲苯通过不同浓度的乙醇和水进行脱蜡28分钟，脱蜡后使用Target Retrieval Solution 50×Low pH(Dako Envison FLEX，Lot20080033)在97℃条件下进行抗原修复20分钟。然后使用Envision FLEX+Visualization Systems(Dako K8002)进行ABCB5抗体孵育及DAB染色(具体操作参见说明书)，将处理后的切片置于40×显微镜下进行拍照。对照片中阳性区域进行免疫组化评分，具体评分方法如下：阳性反应被定义为在图片中显示出棕色信号。染色指数(数值范围0-12)则通过将染色强度的分数与阳性区域的分数相乘来确定。其中，染色强度的分数判定标准为：染色阴性，0分；染色强度弱，1分；染色强度中等，2分；染色强度强，3分。阳性区域的分数则根据阳性细胞占比情况来判断，具体标准为：阳性细胞占比小于5％，0分；5％至25％，1分；26％至50％，2分；51％至75％，3分；大于75％，4分。
计算示例：一个含有75％肿瘤细胞的标本，染色强度中等，评分为3×2＝6，而另外25％为阴性细胞，且染色强度较弱，评分为1×1＝1，最终得分为6+1＝7。
统计分析中，0-7分被认为是低表达，8-12分被认为是高表达。
结果如图5-9所示。
图5为大鼠模型构建的示意图。
图6为关节腔滑膜组织DAB染色免疫组化结果，根据DAB染色的免疫组化照片(棕色为阳性信号)显示，在腺病毒介导的高表达ABCB5关节炎大鼠模型中，Healthy Ctrl、AIA模型组、MTX和SIN治疗组在只注射腺病毒空载体的情况下基本无阳性信号出现，显示为蓝色背景。而ABCB5组、ABCB5+MTX组、ABCB5+SIN组及ABCB5+MTX+SIN组经ABCB5高表达腺病毒感染后，均出现阳性反应，表明腺病毒成功介导ABCB5转运蛋白在关节腔滑膜组织高表达。同时根据免疫组化照片阳性信号的染色指数评价结果，也印证了ABCB5转运蛋白在ABCB5组、ABCB5+MTX组、ABCB5+SIN组及ABCB5+MTX+SIN组的滑膜中高表达。
通过动物取材前对大鼠右后爪进行拍照，可以发现AIA模型组大鼠足出现肿胀，表明造模成功。在接受2mg/kg/WeekMTX或100mg/kg/Day治疗后，大鼠足部肿胀有所减轻。但两种抗关节炎药药物的作用效果在高表达ABCB5的情况下被显著削弱，在ABCB5+MTX组、ABCB5+SIN组中，大鼠足部依然出现严重肿胀。但MTX联合SIN对高表达ABCB5关节炎大鼠表现出良好的治疗效果，联合用药组足部未出现明显肿胀。同时基于体积测量仪器，实现了大鼠足部肿胀情况的量化。通过对足体积进行连续记录，形成足体积变化曲线(图7)，发现在ABCB5转运蛋白存在的情况下，MTX及SIN单独使用时，对足体积的改善作用被显著削弱，而当两种药物联合使用时显著降低了关节炎大鼠的足肿胀情况，说明MTX及SIN联合用药能够显著改善耐药性RA的发展病况。
而对大鼠模型的左后爪经Micro CT扫描重建后，利用软件对足部骨组织进行拍照，可以直观的观察到不同实验组大鼠足部的实际骨破坏情况(图8)。可以发现，健康组大鼠足部骨质紧密，结构完整。AIA造模后，一般关节炎大鼠足部出现骨破坏(黄色箭头指示骨破坏位置)。对此，MTX或SIN单独使用减轻了足部骨破坏，但ABCB5的介入显著加重了骨破坏的位点和严重程度。而在这种情况下，MTX或SIN单独使用所带来的改善效果因ABCB5的过表达而完全失效，不能再产生减轻足部骨破坏的效果。在联合用药组中，在ABCB5过表达的情况，大鼠模型的足部骨结构基本保持完整，骨破坏位点较少。同时借助Micro CT分析软件对骨破坏情况进行量化，通过对5个量化的骨参数进行化归一处理后取平均值即为MicroCT评分(图8B)，发现ABCB5高表达后，单一药物的治疗无法缓解大鼠的骨破坏，而MTX与SIN的联合使用对足部骨表现良好的保护作用，表现为骨评分与健康组接近。对比骨破坏评级表(图8C)，可以发现ABCB5高表达情况下的MTX或SIN单独治疗组，评级为严重骨破坏，联合用药组则为轻微骨破坏，说明仅在联合用药时，才能有效改善ABCB5高表达带来的耐药性RA对骨的破坏程度。
而图9则显示了大鼠模型中相关炎症因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α的表达情况，反映了大鼠炎症的严重程度。通过实时荧光定量PCR结果，发现四个炎症因子与大鼠炎症反应表现出正相关。AIA造模后，4个炎症因子表达升高，MTX治疗降低了相关炎症因子表达，但在ABCB5的介入条件下，MTX的治疗效果显著降低。但反观联合用药组中，4个炎症因子表达均被显著抑制。说明仅在联合用药时，才能有效改善ABCB5高表达带来的耐药性RA带来的炎症反应。
综上所述，通过本实施例构建得到的ABCB5高表达耐药性关节炎大鼠模型，可以发现ABCB5转运蛋白的高表达可导致关节炎大鼠模型的MTX耐药反应，并主要表现为MTX对足肿胀、骨破坏、炎症因子表达的抑制作用降低，失去治疗活性。而利用青藤碱的联合用药，显著逆转了MTX的耐药反应，提供了青藤碱在治疗类风湿关节炎中的一种新用途，即作为ABCB5转运蛋白的抑制剂应用于耐药型类风湿性的临床治疗。
实施例6药物诱导型CD4+细胞过表达ABCB5的SD大鼠动物模型的构建及验证
Cre-LoxP系统可实现对目的基因的定点敲入、敲除、重组酶介导的盒式交换等基因工程操作。Cre蛋白是一种存在于大肠杆菌噬菌体P1的重组酶，它能在细胞内或DNA上识别LoxP序列，并根据LoxP序列的位置和LoxP序列的关系介导不同的重组反应。在本实施例中，制备条件性ABCB5基因高表达大鼠需要Floxed鼠(即某目的基因被LoxP序列锚定的大鼠，在此称为ABCB5转基因鼠)和Cre工具鼠这两种大鼠。对于ABCB5转基因鼠，其需要在大鼠基因组中定点插入一段外源基因。该基因中包含ABCB5的CDs序列且其之前设有被LoxP序列锚定的终止元件。而LoxP序列具有方向性，如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列。因此，当无Cre重组酶的情况下，终止元件的存在使得ABCB5基因无法表达。而当Cre重组酶将该终止元件切除后ABCB5才得以正常表达(原理如图10)。Cre工具大鼠即Cre重组酶在大鼠体内特定组织或细胞表达的大鼠，其Cre基因的表达受控于一个特异性启动子，该启动子决定了Cre表达的组织或细胞类型。如果同时将Cre基因置于配体或药物诱导型启动子的控制下，就可同时实现在时间和空间水平上对Cre表达的精确调控。
在本实施例中，采用Cre-ERT2大鼠作为Cre工具大鼠。Cre-ERT2大鼠是一类含有雌激素受体(estrogen receptor，ER)的配体结合区突变体(ERT)与Cre重组酶的融合蛋白表达的大鼠。Cre-ERT2在无Tamoxifen(他莫昔芬)诱导的情况下，在细胞质内处于无活性状态；当Tamoxifen诱导后，Tamoxifen的代谢产物4-OHT(雌激素类似物)与ERT结合，可使Cre-ERT2入核并发挥Cre重组酶活性。利用不同的启动子，可以在不同组织或细胞中特异性调控表达Cre重组酶。发明人通过将ABCB5转基因鼠和Cre工具鼠(图11)进行杂交的双基因阳性子代(即本发明实施例中请求保护的CD4+细胞特异性表达ABCB5的SD大鼠动物模型)。该阳性子代在无他莫昔芬诱导时，重组酶不发挥作用，ABCB5基因表达被终止(图11)。而在他莫昔芬诱导后，重组酶将终止元件剪切，CD4+细胞特异性表达ABCB5基因(图11)。
具体构建方法为：
通过CRISPR/Cas9介导的基因工程构建{CAG-loxP-stop-loxP-Rat ABCB5 CDs-SV40 late pA}敲入ROSA26位点的ABCB5转基因SD大鼠，具体为：大鼠ROSA26基因位于大鼠4号染色体上，选择内含子1-2(插入位置的序列情况为：CCTTCTTCCCTCGTGATCTGC---TTTCTGGAAGATAGGCGG，---表示插入位置)作为靶位点。gRNA靶向序列如下：
gRNA1(匹配基因的反义链):GACTCCAGTTGCAGATCACGAGG(SEQ ID NO:23)；
gRNA2(匹配基因的正义链):AAGATAGGCGGGAGTCTTCTGGG(SEQ ID NO:24)。
将大鼠ROSA26基因的gRNA、含有{CAG-loxP-stop-loxP-RatABCB5 CDs-SV40 latepA}的基因载体(质粒图谱如图12A所示)和Cas9 mRNA共同注射到大鼠受精卵中以产生靶向敲入的F0祖代(如图12B)。F0祖代与野生型大鼠杂交产生F1代，通过对F1代进行PCR鉴定和序列分析，可实现对F0祖代种系传递的鉴定，借此筛选出可稳定遗传的F0代和合格的F1代大鼠(F1代大鼠基因型为杂合子)。
由于想要得到CD4+细胞特异性表达ABCB5的SD大鼠动物模型，需要经过繁殖建系的过程，首先我们需要获得大量纯合子的ABCB5转基因鼠，因此对于由受精卵发育而来的F0祖代大鼠，依据F1代的PCR鉴定、序列分析结果，判断F0代种系传递合格后，还要经过一系列的繁育和筛选，以获得纯合子的ABCB5转基因鼠(如图13所示)。
其中，ABCB5转基因鼠的PCR鉴定和序列分析方法为：
(1)基因组DNA的获取：
取待检大鼠的尾组织(2-5mm)，加入100μL尾消化缓冲液(含终浓度50mM KCl、10mMTris-HCl(pH9.0)、0.1％Triton X-100和0.4mg/mL Proteinase K)，56℃孵育消化过夜。98℃孵育13分钟使蛋白酶K变性。以最高速度离心15分钟，上清即为基因组DNA。后续可取2μL上清作为模板进行PCR扩增(50μL体系)。
(2)对于F1代杂合子ABCB5大鼠的PCR鉴定和序列分析：
以F1代转基因大鼠为例，将步骤(1)中获得的基因组DNA中的目标基因分为6块区域(Region1-Region6)分别进行PCR鉴定(如图14～15)。同时，在载体质粒上选取两段不整合入大鼠基因组的序列(Region7-Region8)，设计对应引物，以此作为PCR鉴定的对照。对于合格的F1代PCR鉴定结果，其应为Region1-Region6为阳性，Region7和Region8为阴性。该结果可以说明该F1代大鼠基因组中被成功插入目标基因且无缺失，对应F0祖代大鼠能够稳定遗传。若否，则不能使用该F1代转基因大鼠。
其中，针对F1代转基因大鼠的Region1-Region8的特异性引物如表4所示。
表4
PCR鉴定条件为：
对于Region 2、Region 6、Region 8的鉴定所使用的PCRMixture(包括dNTPs、PCRBuffer和TaKaRa TaqHS)购自TaKaRa，型号为R007A。
反应体系如表5所示：
表5
大鼠尾基因组DNA 1.5μL
引物对(10μM) 各1μL
dNTPs(2.5mM) 1.5μL
10×PCRBuffer(5mMMg2+Plus) 3μL
TaKaRaTaqHS(5U/μL) 0.2μL
ddH2O 21.8μL
总计 30μL
对于Region 1、Region 5和Region 7的鉴定所使用的PCR Mixture(包括dNTPs、GCBuffer和TaKaRa TaqHS)购自TaKaRa，型号为RR02AG。
反应体系如表6所示：
表6
大鼠尾基因组DNA 1μL
引物对(10μM) 各1μL
dNTPs(2.5mM) 4.8μL
2×GCBuffer(5mMMg2+Plus) 15μL
TaKaRaTaqHS(5U/μL) 0.3μL
ddH2O 6.9μL
总计 30μL
反应程序均如表7所示：
表7
对于Region 3和Region 4的鉴定所使用的PCR Mixture(包括dNTPs、LongAmp TaqReaction和LongAmp TaqDNAPolymerase)购自NEB，型号为M0323S。
反应体系如表8，反应程序如表9：
表8
表9：
F1代大鼠PCR鉴定结果如图16，测序分析结果如图17(以三号阳性大鼠为例)，可知F1代大鼠中3号、4号和9号大鼠符合上述鉴定要求，获得三只杂合子阳性大鼠。
(3)对由F1代转基因大鼠繁育的子代进行PCR筛选：
对于由F1代繁育的子代鼠只需判断目标基因是否成功插入，即对其基因型进行PCR鉴定，从中挑选出纯合子幼崽。PCR鉴定采用的引物为ABCB5 F3-R1-R6(即上游引物为RatROSA26(rAbcb5 CDS)-F3，下游引物为Rat ROSA26(rAbcb5 CDS)-R3和Rat ROSA26(rAbcb5 CDS)-R6)。根据产物长度可判断转基因大鼠基因型。同时，使用ABCB5 F3-R6引物对(即上游引物为Rat ROSA26(rAbcb5 CDS)-F3，下游引物为RatROSA26(rAbcb5 CDS)-R6)重复验证排除杂合子干扰。其中，PCR筛选的产物及其对应基因型如下：(a)使用引物对ABCB5 F3-R1-R6时，纯合子PCR扩增产物长度为551bp，杂合子为551bp/505bp，野生型为505bp；(b)使用引物对ABCB5 F3-R6时，纯合子无条带，杂合子为505bp，野生型也为505bp。
由F1代杂合子大鼠繁育ABCB5转基因鼠纯合子的PCR筛选结果如图18-20，其中，图18显示使用引物ABCB5 F3-R1-R6鉴定时的结果，产物长度551bp对应的大鼠为纯合子。图19显示使用引物ABCB5ABCB5 F3-R6的重复验证结果，无条带对应的大鼠为纯合子。图20显示筛选出的ABCB5纯合子大鼠相互杂交获得的子代大鼠PCR鉴定结果，表明建系成功获得大量纯合子ABCB5转基因大鼠。
(4)Cre重组酶工具鼠的构建及PCR筛选：
Cre重组酶工具鼠的构建，首先需要进行Cre-ERT2表达载体(如图21)的构建和纯化，并利用显微注射将表达载体导入受精卵中，最后通过以下PCR检测筛选阳性F0幼崽。
其中，用于PCR检测的Cre引物如表10所示：
表10
Cre的鉴定所使用的PCRMixture(包括Green TaqMix)购自Vazyme，型号为P131-03。
反应体系如表11，反应程序如表12：
表11
大鼠尾基因组DNA 1.5μL
引物对(10μM) 各1μL
GreenTaqMix 12.5μL
ddH2O 9μL
总计 25μL
表12
筛选出合格的F0幼崽后，同样也需要经过繁育获得足够数量的Cre工具鼠进行后续实验。由于目的基因Cre-ERT2为非定点插入大鼠基因组，且拷贝数不知。对于繁育的Cre工具鼠的鉴定只需要从以上四对引物中挑选一对引物，进行PCR筛选，对目的基因存在与否进行判定即可。
Cre转基因工具鼠的PCR筛选结果如图22-23。其中，图22显示分别使用不同引物(Cre Primers 1-4)筛选出的F0代阳性幼崽共4只。图23显示由F0阳性幼崽繁育出的子代大鼠PCR筛选结果(使用引物Cre Primers 1)，PCR产物长度560bp对应阳性幼崽，表明成功获得大量Cre转基因工具大鼠。
(5)CD4+细胞高表达ABCB5的转基因鼠的制备
将纯合子的ABCB5转基因鼠(即LoxP-stop-LoxP ABCB5+/+大鼠)与Cre转基因工具鼠(即pStart-K-CD4>CreERT2大鼠)杂交并经PCR筛选出双基因阳性的幼崽。
对双基因阳性幼崽的PCR筛选，使用的引物对为ABCB5 F3-R1-R6(用于筛选ABCB5纯合子转基因鼠，上游引物为Rat ROSA26(rAbcb5 CDS)-F3，下游引物为Rat ROSA26(rAbcb5 CDS)5'arm-R1和Rat ROSA26(rAbcb5 CDS)-R3)和Cre F3-R3(用于筛选Cre工具鼠，上游引物为Transgene PCR primer F3，下游引物为Transgene PCRprimer R3)。ABCB5基因阳性幼崽PCR产物长度为551bp，Cre基因阳性幼崽PCR产物长度为778bp，双基因阳性幼崽PCR产物长度为551bp和778bp。
反应体系如表13，反应程序如表14：
表13
大鼠尾基因组DNA 4μL
引物对(10μM) 各1μL
2×TaqMix 12.5μL
ddH2O 21.8μL
总计 30μL
表14
图24显示双基因阳性幼崽的PCR筛选结果，表明成功获得大量双基因阳性幼崽(即LoxP-stop-LoxP ABCB5+/+-CD4>CreERT2大鼠)。
(6)使用他莫昔芬(Tam)诱导双基因阳性转基因大鼠的ABCB5高表达：
对步骤(5)获得的双基因阳性转基因大鼠经过Tam(购自MCE，CAS：10540-29-1)的诱导后，CD4+细胞中的Cre重组酶入核切除ABCB5前的终止元件，使得ABCB5基因得以在CD4+细胞中高表达。
具体步骤为：将他莫昔芬以10～20mg/mL的浓度溶解在玉米油(购自MCE，CAS：8001-30-7)中，在37℃下振动过夜，37℃超声30min(不超50℃)。由于他莫昔芬对光敏感，上述过程均需在遮光容器(棕色或箔包裹)中进行。他莫昔芬溶解后，在4℃保存。
对双基因阳性转基因大鼠进行腹腔注射给药，注射剂量通过体重确定，他莫昔芬使用量约为75mg/kg体重。而对于成年小鼠，100μL标准剂量的他莫昔芬/玉米油溶液对诱导重组是有效的，而大鼠最低应为50mg/kg体重给与他莫昔芬。连续5天，每24小时腹腔注射一次。
全部给药完成后，对他莫昔芬(Tam)诱导后的转基因鼠进行ABCB5基因表达的检测。
具体步骤为：在双基因阳性转基因大鼠经他莫昔芬诱导完成后，处死大鼠并获取血液、脾、胸腺。其中，脾和胸腺需进行匀浆处理，然后使用FavorPrepTM Blood/CilturedCell Total RNAMini Kit(FAVORGEN，FABRK001-2)，按照试剂盒说明书对总RNA进行提取，得到脾和胸腺组织的RNA样品。以普通SD大鼠为对照。
取1μg提取得到的脾总RNA经反转录得到cDNA。以反转录得到的cDNA作为模板，使用PerfectStartTM Green Qpcr SuperMix和设计的特异性引物进行RT-PCR扩增。将基因表达水平标准化为Actin(对照)，并使用2-ΔΔCT方法进行分析。对每个引物分析了3个独立实验，每组3个重复。所有数据均采用非配对t检验进行统计分析。
其中，特异性引物序列如表15所示。
表15
将胸腺组织经匀浆使用RIPA裂解液裂解。然后使用Bio-Rad蛋白质测定法测定蛋白质浓度。具体操作为：将RIPA裂解液处理得到的细胞裂解物在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳并转移到增强化学发光硝化纤维素膜(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)，然后用5％脱脂奶粉蛋白封闭1小时。将膜与ABCB5的一抗(SANTA CRUZ ABCB5(A-7):sc-515910)在4℃下孵育过夜。通过ECL蛋白质印迹检测试剂(Invitrogen,Paisley,Scotland,UK)利用过氧化物酶偶联的二抗观察抗体的结合。
通过上述试验，使用6对引物(靶标Region 1～6)对ABCB5转基因鼠F1代鼠的目标基因进行鉴定(Region1-6)，同时使用两对引物作为对照(Region7-8)，发现编号为3、4、9的F1代幼崽的目的基因Region1-6的PCR筛选结果为阳性，而Region7-8为阴性，表明3、4、9号目的基因成功插入对应的F0祖代大鼠基因组中且无缺失，该F1代幼崽鉴定为合格。同时，对F1代幼崽进行序列分析的结果印证以上结论。
此外，使用引物对ABCB5 F3-R1-R6和ABCB5 F3-R6对由合格的F1代繁育的幼崽进行PCR筛选。结果发现引物对ABCB5 F3-R1-R6的PCR产物为551bp，且引物对ABCB5 F3-R6的PCR产物为无条带，说明该幼崽为纯合子。对筛选出的ABCB5转基因鼠纯合子继续进行繁育，可获得大量纯合子大鼠。然后对这些大鼠继续使用ABCB5 F3-R1-R6引物对进行PCR鉴定，以验证其是否均为纯合子。
对于构建的Cre重组酶工具鼠，分别使用了4对引物(Cre Primers 1～4)进行PCR鉴定，挑选出阳性的幼崽，结果显示10，12，13号大鼠被成功插入Cre-ERT2目的基因。将筛选出的阳性Cre工具鼠与野生型大鼠进行杂交。繁育的幼崽经Cre F1-R1引物PCR鉴定后，得到大量阳性Cre工具鼠。
为了制备CD4+细胞高表达ABCB5的转基因大鼠，需将ABCB5转基因鼠纯合子和Cre工具鼠进行杂交。并使用引物对ABCB5 F3-R1和Cre F3-R3对幼崽进行PCR筛选。PCR产物同时包含551bp和778bp对应的幼崽为双基因阳性。
从普通SD大鼠和他莫昔芬诱导后的CD4+细胞高表达ABCB5的转基因大鼠获取血液、脾和胸腺，通过实时荧光定量PCR分析后，发现分别使用三对引物(如表15)进行扩增，与普通SD大鼠相比，ABCB5转基因SD大鼠血液、脾脏和胸腺中的ABCB5表达水平显着上调(***P<0.005)(图25～27)。且与普通SD大鼠相比，ABCB5转基因SD大鼠T细胞在胸腺中成熟，同时胸腺中含有大量的CD4+T细胞，通过蛋白免疫印迹法观察大鼠胸腺中的ABCB5的表达，发现在他莫昔芬诱导后与普通SD大鼠相比，诱导后的ABCB5转基因SD大鼠胸腺中出现ABCB5高表达，而普通SD大鼠胸腺裂解物电泳结果无条带，未出现ABCB5表达(图28)。
综上所述，发明人基于诱导型Cre-LoxP系统，利用CRISPR-Cas9技术成功构建了世界上首个CD4+T细胞高表达ABCB5的SD大鼠。且整个构建过程，均仅依赖于两种不同的转基因SD大鼠(ABCB5转基因鼠和Cre重组酶转基因工具鼠)。
实施例7 CD4+细胞特异性表达ABCB5 SD大鼠在关节炎大鼠耐药动物模型中的应用
(1)CD4+T细胞高表达ABCB5的关节炎大鼠耐药动物模型的构建：
取适当数量的上述实施例中得到的CD4+细胞特异性表达ABCB5 SD大鼠(双基因阳性转基因SD大鼠)进行繁育，待幼崽约两周龄时按照75mg/kg/Day的剂量，腹腔注射给予他莫昔芬，连续诱导5天。设置普通SD大鼠对照组。诱导结束后继续适应性饲养试验大鼠至少3周。使用完全弗氏佐剂(CFA，CAS：9007-81-2)诱发在大鼠体重约120-150g时大鼠关节炎(操作同上述实施例)。此后每三天使用体积测量仪器对大鼠足体积进行测量和记录。
试验共取36只大鼠，普通SD大鼠18只，ABCB5转基因SD大鼠18只，按照表16随机分为6个实验组，每组6只。
表16
疗程结束时(CFA注射后第30天)将大鼠处死，收集大鼠血液及部分脏器，右后脚拍照冻存，左后爪被截肢并固定在4％的多聚甲醛(PFA)内。
使用微电脑断层扫描(MicroCT)分析大鼠足部骨破坏情况，具体步骤同上述实施例6，并对数据进行MicroCT评分(同上述实施例)。
同时，对实验大鼠进行血沉速率检测，具体步骤为：使用9×120mm的枸橼酸钠真空血沉管采集实验大鼠静脉血标本，采集完成后，进行180度颠倒6-8次，使管中的抗凝剂与血充分混匀。将装有标本的血沉管垂直固定在专用血沉架上，记录好起始时间和对应编号，在室温保持20℃左右静置状态下，3小时后读取红细胞沉降的毫米数，具体读数方法为；沉降到规定的时间，将血沉管内血浆凹液面对齐血沉上的0刻度线并固定好，然后读出红细胞上端对齐血沉架上刻度线的数值。
同时，使用上述实施例中的方法分别检测大鼠血液细胞中炎症相关细胞因子(引物参考表3)及ABCB5(引物参考表15)的表达情况。
结果显示，通过对大鼠右后爪进行拍照，发现相较于健康对照组大鼠，AIA模型组足出现明显肿胀，表明AIA造模成功。同时，AIA大鼠(AIA模型组+MTX)在接受2mg/kg/WeekMTX治疗后，大鼠足部肿胀明显减退。对于ABCB5转基因SD大鼠，当CD4+细胞高表达ABCB5后，其足部同样会出现肿胀，MTX治疗效果被消除。而MTX联合SIN用药时，则足部未出现明显肿胀，表明联合用药对CD4+T细胞高表达ABCB5的关节炎大鼠表现出良好的治疗效果(图29A)。使用体积测量仪器量化各组大鼠足部肿胀情况，发现在CD4+细胞高表达ABCB5转运蛋白的情况下，MTX失去对足体积的改善作用。当联合用药时则显著降低了关节炎大鼠的足肿胀情况(图29B)。
实验大鼠左后爪经微电脑断层扫描后，发现普通SD大鼠健康组足部骨质紧密，结构完整。AIA造模使大鼠足部出现骨破坏(黄色箭头指示骨破坏位置)，骨质出现疏松的现象。而MTX的治疗(AIA模型组+MTX)却对足部骨组织起到了保护作用。但当CD4+细胞高表达ABCB5后抵消了MTX的治疗作用(ABCB5+AIA+MTX组)。在MTX治疗的同时加入青藤碱则显著逆转了该现象，联合用药治疗CD4+细胞高表达ABCB5 SD大鼠后，其足部骨结构保持完整，未发现明显骨破坏区域(图30)。各组MicroCT评分情况如图31A，CD4+细胞高表达ABCB5后，MTX失去治疗作用，评定为中等骨破坏(评分标准如图31B)。MTX与SIN的联合使用对足部骨表现良好的保护作用，表现为骨评分与健康组无明显差别，评定为正常。由此可见，SD大鼠在CD4+细胞高表达ABCB5后，促使AIA动物模型出现耐药反应，并对MTX抗炎药物失效，而当联用青藤碱使用后，有效抑制了ABCB5药泵作用，促使MTX抗炎效果恢复。
急性炎症由于血中急性期反应物质增多而使血沉增快，而慢性炎症如结核或风湿病也会使血沉增快，因此红细胞血沉速率ESR可以用于观察病情的变化和疗效，并用于表示病情复发和活跃。具体为病情好转时，血沉也逐渐恢复正常。在上述实施例中，通过检测大鼠ESR情况由此分析大鼠的炎症严重程度(如图32)。结果显示，CD4+细胞高表达ABCB5后，MTX的治疗无法缓解关节炎大鼠的炎症严重程度，表现为CD4+T细胞高表达ABCB5关节炎大鼠的ABCB5+AIA+MTX组与ABCB5+AIA组的血沉速率无明显差异。相反，青藤碱联合甲氨蝶呤可以显著降低ESR，控制关节炎的发展，表现出良好的抗关节炎作用。
进一步通过实时荧光定量PCR检测实验大鼠血液细胞中ABCB5与相关炎症因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α的表达水平。结果表明，对比普通SD大鼠，经他莫昔芬诱导后的转基因SD大鼠，血液细胞中的ABCB5的表达显著提高(图33)。炎症因子的表达水平反应了大鼠炎症的严重程度，如四个炎症因子与大鼠炎症反应表现出正相关，结果所示(图34)，AIA造模后4个炎症因子的表达升高，而普通SD关节炎大鼠在接受MTX治疗后，相关炎症因子表达量出现显著下调。但CD4+细胞高表达的ABCB5介入后，炎症因子的表达(ABCB5+AIA组)与使用MTX治疗的情况下并没有明显差异，反映ABCB5的表达消除了MTX的抗炎作用。反观联合用药组中4个炎症因子表达均被显著抑制。
综上所述，通过上述实施例构建得到的CD4+细胞特异性高表达ABCB5 SD大鼠成功实现了关节炎大鼠耐药动物模型的构建。在该模型中，可以验证ABCB5高表达导致的MTX耐药，并用于进一步研究如青藤碱等联合用药或其他对ABCB5表现出显著的抑制作用的相关药物对于逆转MTX耐药反应以及RA治疗的实际效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 澳门科技大学
<120> 一种耐药型类风湿性关节炎动物模型的构建及其应用
<130>
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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Claims (14)

1.一种耐药型类风湿性关节炎动物模型的获得方法，包括如下步骤：在动物的CD4+细胞中高表达ABC转运蛋白基因，然后进行类风湿性关节炎造模；其中，所述耐药型类风湿性关节炎动物模型为非全身性ABC转运蛋白高表达动物模型；所述动物为鼠；所述ABC转运蛋白基因为ABCB5基因。
2.一种耐药型类风湿性关节炎动物模型的获得方法，包括如下步骤：向动物的关节腔内注射ABC转运蛋白高表达载体，然后进行类风湿性关节炎造模；所述ABC转运蛋白基因为ABCB5基因；所述动物为鼠。
3.根据权利要求2所述的获得方法，其特征在于，所述鼠包括大鼠和小鼠。
4.根据权利要求2所述的获得方法，其特征在于，所述鼠包括C57小鼠、Balb/C小鼠、DBA小鼠、Wistar大鼠、Lewis大鼠和SD大鼠。
5.根据权利要求1所述的获得方法，其特征在于，在所述动物的CD4+细胞中高表达ABC转运蛋白基因的方法为：将ABCB5基因定点插入至大鼠染色体安全位点中，所述ABCB5基因的表达受loxp-stop-loxp序列和Cre-ERT2系统调控。
6.根据权利要求5所述的获得方法，其特征在于，所述Cre-ERT2系统受到双重调控，所述调控方式为外源性配体诱导和启动子调控；
所述外源性配体包括他莫昔芬；
所述启动子包括CD4+细胞特异性启动子。
7.根据权利要求1所述的获得方法，其特征在于，在所述动物的CD4+细胞中高表达ABC转运蛋白基因的方法为：
（1）将含有ABCB5基因和loxp-stop-loxp序列的质粒载体敲入F0祖代大鼠基因组中，经过传代和纯合子筛选得LoxP-stop-LoxP ABCB5+/+转基因大鼠；
（2）将LoxP-stop-LoxP ABCB5+/+转基因大鼠与pStart-K-CD4>CreERT2工具大鼠杂交，经传代和PCR筛选得到LoxP-stop-LoxP ABCB5+/+-CD4>CreERT2大鼠；
（3）对所述的LoxP-stop-LoxP ABCB5+/+-CD4>CreERT2大鼠使用Tam进行诱导，即得。
8.根据权利要求2所述的获得方法，其特征在于，所述载体为病毒载体。
9.根据权利要求8所述的获得方法，其特征在于，所述病毒为慢病毒。
10.根据权利要求8所述的获得方法，其特征在于，所述病毒为腺病毒或腺相关病毒。
11.根据权利要求7~10中任一项所述的获得方法，其特征在于，所述动物具有多药耐药性。
12.根据权利要求7~10中任一项所述的获得方法，其特征在于，所述动物具有甲氨蝶呤耐药性。
13.权利要求1~12任一项所述的获得方法得到的动物模型在鉴别或筛选用于治疗耐药型类风湿性关节炎的化合物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，判断化合物是否具有治疗耐药型类风湿性关节炎作用的判断标准为：当类风湿性关节炎指征中的至少一种发生逆转时，则判定化合物具有治疗耐药型类风湿性关节炎作用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002360117A (ja) * 2000-08-09 2002-12-17 Takeda Chem Ind Ltd 遺伝子導入動物
CN107666828A (zh) * 2015-04-06 2018-02-06 瑞泽恩制药公司 非人动物中的人源化t细胞介导的免疫应答
CN111041047A (zh) * 2019-12-19 2020-04-21 上海同科生物科技有限公司 一种条件性定点双过表达hpv e6/e7基因小鼠模型的构建方法
CN114245741A (zh) * 2019-03-28 2022-03-25 儿童医学中心公司 高功能性的制造的abcb5+间充质干细胞

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014130518A1 (en) * 2013-02-19 2014-08-28 Children's Medical Center Corporation Abcb5(+) stem cells for treating ocular disease
US10688105B2 (en) * 2017-07-10 2020-06-23 Macau University Of Science And Technology Method of treating refractory rheumatoid arthritis associated with p53 mutation

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002360117A (ja) * 2000-08-09 2002-12-17 Takeda Chem Ind Ltd 遺伝子導入動物
CN107666828A (zh) * 2015-04-06 2018-02-06 瑞泽恩制药公司 非人动物中的人源化t细胞介导的免疫应答
CN114245741A (zh) * 2019-03-28 2022-03-25 儿童医学中心公司 高功能性的制造的abcb5+间充质干细胞
CN111041047A (zh) * 2019-12-19 2020-04-21 上海同科生物科技有限公司 一种条件性定点双过表达hpv e6/e7基因小鼠模型的构建方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
类风湿关节炎实验性动物模型研究进展;李利青等;中国药理学通报;第37卷(第11期);1492-1497 *

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