JP2002360117A

JP2002360117A - 遺伝子導入動物

Info

Publication number: JP2002360117A
Application number: JP2001240948A
Authority: JP
Inventors: Koji Yoshimura; 浩二吉村; Atsushi Nishimura; 篤西村; Mayumi Nishida; 真由美西田; Kazuhiro Hosono; 和裕細野
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-08-09
Filing date: 2001-08-08
Publication date: 2002-12-17

Abstract

(57)【要約】【課題】軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形
性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性
関節症、眼疾患および悪性腫瘍、それらの合併症の予防
薬あるいは治療薬あるいはそれらの合併症などの病態モ
デル動物として利用することができ、これらの病態機序
の解明および疾患の治療方法の検討、ならびに治療薬の
スクリーニングを行うことが可能な遺伝子導入非ヒト哺
乳動物を提供する。【解決手段】ＭＭＰ−１９遺伝子が導入された非ヒト
哺乳動物を作出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はＭＭＰ−１９遺伝子
導入非ヒト哺乳動物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】細胞外マトリックスは、組織の細胞を取
り巻く細胞支持組織であり、コラーゲンやエラスチンな
どの繊維性タンパク質、プロテオグリカン、フィブロネ
クチン、ラミニンなどの糖タンパク質及びヒアルロン酸
などの糖質からなる。細胞外マトリックスは細胞の形態
・代謝・移動・増殖・分化など細胞の活動に重大な影響
を与え、生体の発生・加齢・炎症・創傷治癒・免疫・腫
瘍など多くの生体現象と関連することが知られている。
さらに、慢性関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症、
ガンの転移・浸潤、動脈硬化、角膜潰瘍など種々の疾病
においては細胞外マトリックスの異常な分解が起こるこ
とも知られている。この細胞外マトリックスを分解に関
与する酵素として、ＭＭＰ（matrix metalloproteinas
e）と名付けられた一群の金属プロテアーゼファミリー
が知られている。ＭＭＰの活性を調節する化合物はこれ
らの疾患の治療薬となる可能性が示唆されている。ＭＭ
Ｐはヒトにおいては約２０種類がクローン化され、その
塩基配列が報告されている。ＭＭＰは基質特異性やその
構造上の類似性から、コラゲナーゼ群、ゼラチナーゼ
群、ストロメリシン群およびＭＴ−ＭＭＰ群などのサブ
ファミリーに分類されている（I. Massova et al., FAS
EB J. 12:1075-1095, 1998）。ヒトＭＭＰ−１９（ＭＭ
Ｐ−１８やｒａｓｉ−１とも呼ばれるが同一のタンパク
質である）は５０８アミノ酸からなるタンパク質でその
構造から上記のサブファミリーに属さない新たなサブフ
ァミリーを形成するＭＭＰとして注目されている（J. C
ossins et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 228:
494-498, 1996,（ＭＭＰ−１８と記載されている）、B
A. M. Pendas et al., J. Biol. Chem. 272:4281-4286,
1997、I. Massova et al., FASEB J. 12:1075-1095, 1
998）。しかし、ＭＭＰ−１９の生理機能については排
卵との関係が指摘されているにすぎない（A. Hagglunde
t al., Endocrinology 140:4351-4358, 1999）。また疾
病との関連では、慢性関節リウマチ患者の２６％以上に
ＭＭＰ−１９の自己抗体の上昇が観察され、慢性関節リ
ウマチ患者の炎症を起こした関節滑膜血管において強く
発現していることが知られている（C. Kolb et al., Im
munology Letters 57:83-88, 1997、（ｒａｓｉ−１と
記載されている））。このように、関節疾患等の疾患と
ＭＭＰ−１９の関係が注目されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】新たな遺伝子導入（ト
ランスジェニック）動物は、例えば慢性関節リウマチや
変形性関節症などの関節疾患の予防や治療に役立つ新た
な医薬品の開発を可能にすると考えられてきた。したが
って、本発明の分野では、慢性関節リウマチや変形性関
節症などの関節疾患などで観察される軟骨基質の分解が
認められる遺伝子導入非ヒト動物（以下、トランスジェ
ニック動物と称することもある）を見出し、関節疾患モ
デル動物を大量に生産する方法の開発が望まれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＩＩ型コラ
ーゲンプロモーターの制御下にＭＭＰ−１９を発現させ
た新規なトランスジェニックラットを作製したところ、
軟骨の細胞外マトリックスが分解され、さらに四肢の短
縮などの表現型を示すことを見出した。本発明者は、こ
れらの知見を基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発
明を完成するに至った。すなわち、本発明は（１）外来
性ＭＭＰ−１９遺伝子またはその変異遺伝子を組み込ん
だＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物またはその生体の一
部、（２）非ヒト哺乳動物が、ウサギ、イヌ、ネコ、モ
ルモット、ハムスター、マウスまたはラットである上記
（１）記載の動物またはその生体の一部、（３）非ヒト
哺乳動物がラットである上記（１）記載の動物またはそ
の生体の一部、（４）外来性ＭＭＰ−１９遺伝子が配列
番号：１２で表される塩基配列を有する上記（１）記載
の動物またはその生体の一部、（５）関節疾患を発症し
ている上記（１）から（４）記載の動物またはその生体
の一部、（６）四肢の短縮と変形、頭蓋の変形、
咬合不全、上顎及び下顎切歯の過長、腰椎の石灰化
不全、尾椎の変形および尾椎椎間板の欠損から選ば
れる症状を発症している上記（１）から（４）記載の動
物またはその生体の一部、（７）外来性ＭＭＰ−１９遺
伝子またはその変異遺伝子を含有し、非ヒト哺乳動物に
おいて該遺伝子を発現し得るベクター、（８）外来性Ｍ
ＭＰ−１９遺伝子が配列番号：１２で表される塩基配列
を有する上記（７）記載のベクター、（９）さらにラッ
トＩＩ型コラーゲン遺伝子のプロモーター領域およびラ
ットＩＩ型コラーゲン遺伝子のエンハンサー領域を含有
する上記（７）記載のベクター、（１０）ｐＫＳ−ＭＭ
ＰＢｃｏｎ−１９で表示される上記（７）記載のベクタ
ー、（１１）上記（７）記載のベクターで形質転換され
た形質転換体、（１２）形質転換体が大腸菌ＪＭ１０９
／ｐＫＳ−ＭＭＰＢｃｏｎ−１９（ＦＥＲＭＢＰ−７
６４７）である上記（１１）記載の形質転換体、（１
３）上記（１から６のいずれかに）記載の動物またはそ
の生体の一部に被験物質を適用し、細胞外マトリックス
の異常な分解に起因する疾患の改善効果を検定すること
を特徴とする、細胞外マトリックスの異常な分解に起因
する疾患の予防・治療のために用いられる物質のスクリ
ーニング方法、（１４）細胞外マトリックスの異常な分
解がＭＭＰ−１９の機能異常に起因するものである上記
（１３）記載のスクリーニング方法、（１５）細胞外マ
トリックスの異常な分解に起因する疾患が、軟骨形成異
常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リ
ウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、眼疾患および
悪性腫瘍である上記（１３）記載のスクリーニング方
法、（１６）上記（１３）記載の方法により細胞外マト
リックスの異常な分解に起因する疾患の改善効果を有す
ると判定される物質を含有してなる細胞外マトリックス
の異常な分解に起因する疾患の予防・治療用医薬、（１
７）細胞外マトリックスの異常な分解に起因する疾患
が、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節
症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節
症、眼疾患および悪性腫瘍である上記（１６）記載の医
薬、（１８）哺乳動物に対して、上記（１３）記載の方
法により細胞外マトリックスの異常な分解に起因する疾
患の改善効果を有すると判定される物質の有効量を投与
することを特徴とする細胞外マトリックスの異常な分解
に起因する疾患の予防・治療法、（１９）細胞外マトリ
ックスの異常な分解に起因する疾患が、軟骨形成異常、
骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマ
チ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、眼疾患および悪性
腫瘍である上記（１８）記載の予防・治療法、（２０）
細胞外マトリックスの異常な分解に起因する疾患の予防
・治療のために用いられる物質をスクリーニングするた
めの上記（１）から（６）のいずれかに記載の動物また
はその生体の一部の用途、（２１）卵胞刺激ホルモン約
２０ないし５０ＩＵ／個体を投与した後に黄体形成ホル
モン約０ないし１０ＩＵ／個体を投与した雌ラットを雄
ラットと交配させて得られる受精卵に、外来性ＭＭＰ−
１９遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを
導入し、該受精卵を雌ラットに着床させることを特徴と
する上記（３）記載のラットまたはその生体の一部の作
製方法、（２２）黄体形成ホルモン放出ホルモンまたは
その類縁体を投与した後、雄ラットと交配させた雌の偽
妊娠ラットに、外来性ＭＭＰ−１９遺伝子またはその変
異遺伝子を組み込んだＤＮＡを導入した受精卵を着床さ
せることを特徴とする上記（３）記載のラットまたはそ
の生体の一部の作製方法、（２３）外来性ＭＭＰ−１９
遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを導入
した受精卵などを提供するものである。

【０００５】本発明の遺伝子導入非ヒト動物は、未受精
卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞な
どに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生におけ
る胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精
卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）において、リ
ン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション
法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティク
ルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などの遺伝子導入
方法によって、目的とする外来性ＭＭＰ−１９遺伝子ま
たはその変異遺伝子を目的とする細胞に導入することに
より作出される。また、該遺伝子導入方法により、体細
胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする遺伝子を導
入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、
さらに、これらの細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融
合法によって融合させることにより遺伝子導入動物を作
出することもできる。また、このようにして作製された
遺伝子導入動物の生体の一部（例えば、外来性ＭＭＰ
−１９遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡ
を有する細胞、組織、臓器など、これらに由来する細
胞または組織を培養し、必要に応じ、継代したものな
ど、該遺伝子導入動物から単離し得る各種タンパク質
またはＤＮＡなど）も、本発明の「外来性ＭＭＰ−１９
遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有す
る非ヒト哺乳動物の生体の一部」として、本発明の「外
来性ＭＭＰ−１９遺伝子またはその変異遺伝子を組み込
んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物」と同様な目的に用
いることが出来る。遺伝子導入動物の生体の一部である
組織としては、関節組織などが好ましい。遺伝子導入動
物の生体の一部である細胞としては、関節組織を構成す
る細胞などが好ましい。

【０００６】本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」
としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、
ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどが
挙げられる。好ましくは、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモ
ット、ハムスター、マウスまたはラットであり、なかで
も齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）が好ましく、とりわけラ
ット（Ｗｉｓｔａｒ、ＳＤなど）、特にＷｉｓｔａｒ系
統のラットが疾患モデル動物として最も好ましい対象動
物である。他に鳥類動物として、ニワトリなども本発明
で対象する「非ヒト哺乳動物」と同様な目的に用いるこ
とが出来る。対象となる非ヒト哺乳動物に導入する外来
性ＭＭＰ−１９遺伝子としては、例えば、ヒト、ブタ、
ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハム
スター、ラット、マウスなどの哺乳動物由来のＭＭＰ−
１９遺伝子を用いることができる。外来性ＭＭＰ−１９
遺伝子とは、遺伝子導入対象動物が有する内在性の遺伝
子とは異なる遺伝子であり、具体的には前記の哺乳動物
から単離・精製したＭＭＰ−１９遺伝子または合成した
ＭＭＰ−１９遺伝子などが用いられる。なかでも、外来
性ＭＭＰ−１９遺伝子としては、イントロンを保持しな
いＭＭＰ−１９遺伝子が好ましい。本発明の外来性ＭＭ
Ｐ−１９遺伝子の変異遺伝子としては、本発明のＤＮＡ
に変異（例えば、突然変異、部位特異的突然変異など）
が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩
基への置換などが生じた遺伝子が挙げられる。より具体
的には、該塩基の付加、欠損、他の塩基への置換の結
果、ＭＭＰ−１９を構成するアミノ酸配列において、１
ないし５個（好ましくは１または２個）のアミノ酸に置
換、付加または欠損が生じるように変異させることが好
ましく、ＭＭＰ−１９の機能を失わない変異であれば何
れの変異であってもよい。外来性ＭＭＰ−１９遺伝子と
しては、例えば、配列番号：１３で表されるアミノ酸配
列を有するヒトＭＭＰ−１９をコードする、配列番号：
１２で表される塩基配列を有する遺伝子などが用いられ
る。

【０００７】本発明における外来性ＭＭＰ−１９遺伝子
またはその変異遺伝子（以下、単にＭＭＰ−１９遺伝子
と称することもある）は、導入または発現の対象とする
非ヒト哺乳動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物
由来のものであってもよい。該遺伝子を対象動物に導入
させるにあたっては、当該遺伝子を対象となる動物の細
胞で発現させうるプロモーターの下流に連結した遺伝子
コンストラクト（例、ベクターなど）として用いるのが
一般に有利である。具体的には、ヒトのＭＭＰ−１９遺
伝子を導入させる場合、ヒトＭＭＰ−１９遺伝子と相同
性が高いＭＭＰ−１９遺伝子を有する各種哺乳動物（ウ
サギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、
マウスなど（好ましくはラットなど））に由来し、ヒト
のＭＭＰ−１９遺伝子を発現させうる各種プロモーター
の下流に、該遺伝子を連結したベクターを、対象となる
非ヒト哺乳動物の受精卵（例えばラット受精卵）へマイ
クロインジェクションすることによって、目的とするヒ
トＭＭＰ−１９遺伝子を高発現する遺伝子導入非ヒト哺
乳動物を作出できる。ＭＭＰ−１９遺伝子の発現ベクタ
ーとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプ
ラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバ
クテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレト
ロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイル
スなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大
腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは
酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられ、特に大
腸菌由来のプラスミドが好ましい。

【０００８】ＭＭＰ−１９遺伝子の遺伝子発現調節を行
うプロモーターとしては、例えばウィルス（サイトメガ
ロウィルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、
乳癌ウィルスなど）に由来する遺伝子のプロモーター、
各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモッ
ト、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニ
ワトリなど）に由来する遺伝子（例えば、アルブミン、
エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナー
ゼ、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲン、サイクリックＡＭＰ
依存タンパクキナーゼβＩサブユニット、心房ナトリウ
ム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、ニューロフ
ィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メ
タロプロティナーゼ１組織インヒビター、平滑筋αアク
チン、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ１−α）、β
アクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１お
よび２、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドＰコン
ポーネント、レニンなど）のプロモーターなどが挙げら
れるが、好ましくは軟骨組織で高発現することが可能な
モロニー白血病ウィルスプロモーター、ヒトおよびニワ
トリβアクチンプロモーターなどを用いることができ
る。ＭＭＰ−１９遺伝子をヒト、ラット、マウスなどで
軟骨特異的に発現させるには、軟骨で発現することの知
られているＩＩ型コラーゲン遺伝子のプロモーター領域
などが有効である。

【０００９】上記ベクターは、遺伝子導入哺乳動物にお
いて、目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結す
る配列（ポリＡ、一般にターミネターと呼ばれる）を有
していることが好ましく、例えば、ウィルス由来、各種
哺乳動物および鳥類由来の各遺伝子の配列を用いて遺伝
子発現を操作することが出来る。好ましくは、シミアン
ウィルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。そ
の他、目的の遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺
伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真
核遺伝子のイントロンの一部を、プロモーター領域の
５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳
領域の３’下流に連結することも目的により可能であ
る。

【００１０】ＭＭＰ−１９の翻訳領域は、ヒトや各種非
ヒト哺乳動物（ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハム
スター、ラット、マウスなど）の肝臓、腎臓、繊維芽細
胞などに由来するＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡ
ライブラリーに由来するゲノムＤＮＡの全てあるいは一
部を原料として用い、あるいはヒトや各種非ヒト哺乳動
物の肝臓、腎臓、繊維芽細胞に由来するRNAから公知の
方法により調製された相補ＤＮＡを原料として用いて、
取得することが出来る。また、上記の細胞あるいは組織
などから得られたＭＭＰ−１９の翻訳領域を用いて、点
突然変異誘発法などにより変異した翻訳領域を作製する
こともできる。これらは何れも遺伝子導入動物に利用可
能な材料である。以上の翻訳領域は、導入動物において
発現しうる遺伝子コンストラクト（例、ベクターなど）
として前記のプロモーターの下流（好ましくは、転写終
結部位の上流）に連結させる通常の遺伝子工学的手法に
より、ＭＭＰ−１９遺伝子を組み込んだＤＮＡを作製す
ることができる。

【００１１】受精卵細胞段階におけるＭＭＰ−１９遺伝
子の導入は、対象非ヒト哺乳動物の胚芽細胞および体細
胞のすべてに存在するように確保される。遺伝子導入後
の作出動物の胚芽細胞において、ＭＭＰ−１９遺伝子が
存在することは、作出動物の後代の動物全てが、その胚
芽細胞および体細胞のすべてにＭＭＰ−１９遺伝子が存
在することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動
物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞のすべてにＭＭ
Ｐ−１９遺伝子を有する。

【００１２】導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモ
ザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配するこ
とにより、すべての子孫が該遺伝子を安定に保持し、ま
た、該遺伝子を過剰に有することを確認して、通常の飼
育環境で繁殖継代することができる。外来性のＭＭＰ−
１９遺伝子を、対象非ヒト哺乳動物（好ましくはラット
など、特に好ましくはＷｉｓｔａｒ系統のラットなど）
またはその先祖の受精卵に導入する際に用いられる受精
卵は、同種の雄非ヒト哺乳動物（好ましくは雄ラットな
ど、特に好ましくはＷｉｓｔａｒ系統の雄ラットなど）
と雌非ヒト哺乳動物（好ましくは雌ラットなど、特に好
ましくはＷｉｓｔａｒ系統の雌ラットなど）を交配させ
ることによって得られる。受精卵は自然交配によっても
得られるが、雌非ヒト哺乳動物（好ましくは雌ラットな
ど、特に好ましくはＷｉｓｔａｒ系統の雌ラットなど）
の性周期を人工的に調節した後、雄非ヒト哺乳動物（好
ましくは雌ラットなど、特に好ましくはＷｉｓｔａｒ系
統の雌ラットなど）と交配させる方法が好ましい。雌非
ヒト哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法として
は、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺
激ホルモン、一般にＰＭＳＧと略する）、次いで黄体形
成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般にｈＣ
Ｇと略する）を、例えば腹腔注射などにより投与する方
法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔
は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。また、
Ｗｉｓｔａｒ系統のラットを用いる場合は、約１２時間
明期条件（例えば７：００−１９：００）で約１週間飼
育した８週齢以上のものが好ましい。非ヒト哺乳動物が
雌ラット（好ましくはＷｉｓｔａｒ系統の雌ラット）の
場合、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約４８時間後に
黄体形成ホルモンを投与し、雄ラットと交配させること
により受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモン
の投与量は約２０〜約５０ＩＵ／個体、好ましくは約３
０ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与量は約０〜約１
０ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体である。得ら
れた受精卵に、前述の方法により外来性ＭＭＰ−１９遺
伝子が導入された後、雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植
・着床され、外来性遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する
非ヒト哺乳動物が得られる。また、黄体形成ホルモン放
出ホルモン（一般にＬＨＲＨと略する）あるいはその類
縁体を投与後、雄ヒト哺乳動物と交配させることによ
り、受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物に、得
られた受精卵を人工的に移植・着床させる方法も好まし
い。ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量、ならびにそ
の投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒ
ト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。非ヒト哺乳動
物が雌ラット（好ましくはＷｉｓｔａｒ系統の雌ラッ
ト）の場合は、通常、ＬＨＲＨあるいはその類縁体（例
えば[3,5-DiI-Tyr⁵]-LH-RH、[Gln⁸]-LH-RH、[D-Ala⁶]-L
H-RH、[des-Gly¹⁰]-LH-RH、[D-His(Bzl)⁶]-LH-RHおよび
それらのEthylamideなど）を投与した後、約４日目に雄
ラットと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいは
その類縁体の投与量は、通常、約１０〜６０μｇ／個
体、好ましくは約４０μｇ／個体である。また、上記し
た雌非ヒト哺乳動物の性周期を人工的に調節して受精卵
を取得するする方法と受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒ
ト哺乳動物に、得られた受精卵を人工的に移植・着床さ
せる方法とを組み合わせて用いることが好ましい。本発
明のＭＭＰ−１９遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物
（以下、本発明の非ヒト哺乳動物と略記する場合があ
る）は、軟骨破壊を起こし、関節疾患を発症している。
また、本発明の非ヒト哺乳動物は、細胞外マトリックス
の異常な分解を起こし、細胞外マトリックスの異常な分
解に起因する疾患（例、軟骨形成異常、骨形成異常、骨
粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑
膜炎、代謝性関節症、眼疾患、悪性腫瘍など）を発症し
ている。さらに、本発明の非ヒト哺乳動物は、四肢の
短縮と変形、頭蓋の変形、咬合不全、上顎及び下
顎切歯の過長、腰椎の石灰化不全、尾椎の変形およ
び尾椎椎間板の欠損などから選ばれる症状を発症して
いる。本発明の非ヒト哺乳動物は、上記のような極めて
ユニークな特徴を有しているので、以下に示す有用な用
途を有している。

【００１３】以下に、本発明の非ヒト哺乳動物の用途を
概説する。（１）本発明のヒト哺乳動物は、外来性ＭＭＰ−１９遺
伝子が高発現させられており、このＭＭＰ−１９の酵素
活性により、軟骨破壊を起こしているので、軟骨破壊を
特徴とする各種の疾患、例えば、軟骨形成異常、骨形成
異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関
節炎、滑膜炎、代謝性関節症、眼疾患、悪性腫瘍などの
細胞外マトリックスの異常な分解に起因する疾患の予防
薬あるいは治療薬の評価のために用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明の非ヒト哺乳動物またはそ
の生体の一部に被験物質を適用し、細胞外マトリックス
の異常な分解に起因する疾患の改善効果を検定すること
を特徴とする、細胞外マトリックスの異常な分解に起因
する疾患の予防・治療のために用いられる物質のスクリ
ーニング方法を提供する。細胞外マトリックスの異常な
分解としては、ＭＭＰ−１９の機能異常に起因するもの
が挙げられる。具体的には、本発明のスクリーニング方
法では、本発明の非ヒト哺乳動物に被検物質を投与す
る。被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、
タンパク質、ＤＮＡライブラリーなどの他に、例えば温
血哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒ
ツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清な
どが用いられる。次に尿中・血中ピリジノリン量などを
指標にその薬物評価あるいは治療効果を調べることによ
り軟骨分解抑制薬の評価を行うことができる。指標とし
て、ピリジノリン量のほかに、処理個体の体重、体長、
四肢長測定、Ｘ線撮影による骨格の観察、ＭＭＰ各種、
ＴＩＭＰ（Tissue Inihibitor of Metalloproteinas
e）、プロテオグリカン、コラーゲン、ケラタン硫酸、
ヒアルロン酸、オステオカルシン、カルシウム、リン、
サイトカイン、成長因子などの血中あるいは尿中軟骨、
骨代謝生化学マーカーを指標にその薬物評価あるいは治
療効果を調べることができる。実験の必要に応じて、病
理標本の作製、サフラニンＯ染色などの方法により軟骨
破壊程度などを調べることも有用である。

【００１４】（２）上記各疾患の予防薬あるいは治療薬
の評価のために本発明の非ヒト哺乳動物に各種抗原
（例、ＩＩ型コラーゲンやアグリカンなどの基質な
ど）、細菌（例、結核菌死菌など）あるいはウイルス
（例、Epstein-Barr virusなど）を全身あるいは関節な
どの局所、一回、複数回または連続投与により上記疾患
の発症促進を行う。これらのものはモデル動物で慢性関
節リウマチを発症させることが知られている。また、Ｍ
ＭＰの活性化を行うことが知られている、トリプシンな
どのセリンプロテアーゼ、グルタチオン、活性酸素、Ｎ
Ｏなどの窒素酸化物、水銀化合物（例、4-aminophenylm
ercuric acetateなど）、炎症を惹起しプロテアーゼ活
性を発現させるＩＬ−１やＴＮＦαなどのサイトカイン
を関節に投与することにより発症を促進できる。発症の
促進した非ヒト哺乳動物は遺伝子を導入していない非ヒ
ト哺乳動物はもちろん、発症の促進していない遺伝子導
入非ヒト哺乳動物と比較して上記指標の絶対値大きいた
め、発症促進非ヒト動物を用いて（１）に記載した評価
を行なうことにより、より精度良く評価することができ
る。（３）また、本発明の非ヒト哺乳動物から採取した軟骨
片または軟骨細胞などを培養し、ＭＭＰ−１９阻害薬の
評価に用いることができる。具体的には、これらの軟骨
片あるいは軟骨細胞をＭＭＰ−１９酵素の材料として、
基質となる合成ペプチドを加えることで阻害剤が評価で
きる。必要に応じて、水銀化合物やトリプシンなどのセ
リンプロテアーゼで活性化しても良い。ＭＭＰ−１９は
軟骨破壊を促進することから、これらの評価系を用いる
ことにより、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変
形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝
性関節症、眼疾患および悪性腫瘍などの予防・治療剤の
評価に用いることができる。

【００１５】（４）さらに、本発明の非ヒト哺乳動物を
妊娠させ、該妊娠中の動物を、軟骨形成異常、骨形成異
常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節
炎、滑膜炎、代謝性関節症、眼疾患および悪性腫瘍、そ
れらの合併症の予防薬あるいは治療薬の評価のために用
いることができる。具体的には、まず最初、妊娠中の本
発明の非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する。次に出産
後の産仔の体重、体長、四肢長測定、Ｘ線撮影による形
態計測、ＭＭＰ各種、ＴＩＭＰ、プロテオグリカン、コ
ラーゲン、ケラタン硫酸、ピリジノリン、ヒアルロン
酸、オステオカルシン、カルシウム、リン、サイトカイ
ン、成長因子などの血中あるいは尿中軟骨、骨代謝生化
学マーカーを指標にその薬物評価あるいは治療効果を調
べる。実験の必要に応じて、病理標本を作製したり、続
いてサフラニンＯ染色などの方法により軟骨破壊程度な
どを調べることも有用である。（５）本発明の非ヒト哺乳動物を軟骨コラーゲンを分解
する事が知られているＭＭＰｓ（例、ＭＭＰ−１、８、
１３等）やアグリカンを分解するaggrecanaseなどの遺
伝子の導入された非ヒト哺乳動物交配し、取得された産
仔はＭＭＰ−１９のみならずこれらの遺伝子の産物（タ
ンパク質）に起因する疾患（例、軟骨形成異常、骨形成
異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関
節炎、滑膜炎、代謝性関節症、眼疾患および悪性腫瘍）
を発症することが期待される。したがって、該産仔は上
記（１）から（４）と同様またはそれに準じた方法によ
りかかる疾患の予防・治療剤の評価に用いることができ
る。以上のように、本発明のスクリーニング方法におい
て、被検物質の投与により、細胞外マトリックスの異常
な分解に起因する疾患の改善効果があると判定された場
合、その被検物質は前記した細胞外マトリックスの異常
な分解に起因する疾患の予防・治療用医薬として選択す
ることができる。上記の予防・治療用医薬として選択さ
れた物質は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、
カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などと
して経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に
許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注
射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、予防・治療
用医薬として選択された物質を生理学的に認められる担
体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合
剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される
単位用量形態で混和することによって製造することがで
きる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲
の適当な用量が得られるようにするものである。錠剤、
カプセル剤などに混和することができる添加剤として
は、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、
アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのよう
な賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸など
のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤
滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、
ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味
剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場
合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担
体を含有することができる。注射のための無菌組成物は
注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子
油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁さ
せるなどの通常の製剤実施に従って処方することができ
る。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブ
ドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソ
ルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）
などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコー
ル（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例え
ば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールな
ど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート
８０^TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油
性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げら
れ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、
リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化
剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインな
ど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチ
レングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアル
コール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合して
もよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに
充填される。また、予防・治療用医薬として選択された
物質がＤＮＡである場合、当該ＤＮＡを単独あるいはレ
トロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデ
ノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適
当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトま
たは温血動物に投与することができる。当該ＤＮＡは、
そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生
理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃や
ハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投
与できる。このようにして得られる製剤は、安全で低毒
性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、
ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、
ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して
投与することができる。予防・治療用医薬として選択さ
れた物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート
などにより差異はあるが、例えば、関節炎の治療目的で
経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）に
おいては、一日につき当該物質を約０.１ｍｇ〜１００
ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは
約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合
は、当該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患などに
よっても異なるが、例えば、関節炎の治療目的で注射剤
の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一
日につき当該物質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好まし
くは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１
〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。（６）さらに、本発明の非ヒト哺乳動物は、ＭＭＰ−１
９遺伝子異常患者の遺伝子治療用実験に用いることがで
きる。

【００１６】以上の本発明の遺伝子導入哺乳動物を、組
織培養のための細胞源として使用することも可能であ
る。また例えば、本発明の遺伝子導入ラットの組織中の
ＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、あるいは遺伝
子により発現されたタンパク組織を分析することによ
り、核内レセプターの複雑な作用の転写因子との関連性
について解析することもできる。あるいは、遺伝子を有
する組織の細胞を、標準組織培養技術により培養し、こ
れらを使用して、例えば軟骨組織を形成する細胞などの
一般に培養が困難な組織に由来する細胞の機能を研究す
ることもできる。さらに、その細胞を用いることによ
り、例えば細胞の機能を高めるような薬剤の選択も可能
である。また、高発現細胞株があれば、そこから、ＭＭ
Ｐ−１９を大量に単離精製すること、ならびにその抗体
を作製することも可能である。

【００１７】本発明の配列表の配列番号は、以下の配列
を示す。〔配列番号：１〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ（ポ
リメラーゼチェインリアクション）法に用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。〔配列番号：２〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ（ポ
リメラーゼチェインリアクション）法に用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。〔配列番号：３〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ（ポ
リメラーゼチェインリアクション）法に用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。〔配列番号：４〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ（ポ
リメラーゼチェインリアクション）法に用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。〔配列番号：５〕後述の実施例４で行われたＰＣＲ（ポ
リメラーゼチェインリアクション）法に用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。〔配列番号：６〕後述の実施例４で行われたＰＣＲ（ポ
リメラーゼチェインリアクション）法に用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。〔配列番号：７〕後述の実施例６で行われたＰＣＲ（ポ
リメラーゼチェインリアクション）法に用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。〔配列番号：８〕後述の実施例６で行われたＰＣＲ（ポ
リメラーゼチェインリアクション）法に用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。〔配列番号：９〕後述の実施例１でクローニングしたラ
ットＩＩ型コラーゲン遺伝子のプロモーター領域の塩基
配列を示す。〔配列番号：１０〕後述の実施例１でクローニングした
ラットＩＩ型コラーゲン遺伝子のエンハンサー領域の塩
基配列を示す。〔配列番号：１１〕後述の実施例２でｐＫＳ−ＭＭＰＢ
ｃｏｎ−１９の構築に用いたｐＴＢ３９９由来のスプラ
イシングサイトを含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す。〔配列番号：１２〕ヒトＭＭＰ−１９遺伝子の塩基配列
を示す。〔配列番号：１３〕ヒトＭＭＰ−１９のアミノ酸配列を
示す。

【００１８】

【発明の実施の形態】本願明細書において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUBCommission
on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を次
に挙げる。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ＲＮＡ：リボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシン後述の実施例２で得られた形質転換体大腸菌ＪＭ１０９
／ｐＫＳ−ＭＭＰＢｃｏｎ−１９は、２００１年７月２
日から茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵
便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合
研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭＢ
Ｐ−７６４７として、２００１年６月２２日から大阪府
大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２
−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託
番号ＩＦＯ１６６６６として寄託されている。

【００１９】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言う
までもない。実施例１ラットＩＩ型コラーゲン遺伝子のプロモータ
ーおよびエンハンサーのクローニングラットＩＩ型コラーゲン遺伝子のプロモーター領域は、
Kohnoら（J.Biol.Chem. 260：4441,1985）の塩基配列
をもとに設計したプライマー（5'-GTGGTGGTGGACAACTAGG
AAACTCTGG-3'：配列番号：1）および（5'-CGAGGCGAATCA
TGGCTCACCGCG-3'：配列番号：２）を用いてＰＣＲ法に
より得た。得られた約１．２Ｋｂの断片をTOPO TA Clon
ing Kit（Invitrogen社製）を用い、添付のプロトコー
ルに従い、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングした
（ｐＣＲＩＩ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ２と呼ぶ）。挿入され
たＤＮＡ断片の塩基配列をＡＢＩ社製ＤＮＡシークエン
サーで常法により確認したところ、前述文献のプロモー
ター領域の塩基配列と一致した（配列番号：９）。ｐＣ
ＲＩＩ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ２中のｐＣＲＩＩプラスミド
のマルチプルクローニングサイトのＮｏｔＩサイト
（５’側）とｐＣＲＩＩ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ２中のＩＩ
型コラーゲン遺伝子プロモーター配列内のＳｍａＩサイ
トからなる断片を以下の実験に用いた。ラットＩＩ型エ
ンハンサー領域は、Krebsbachら（J.Biol.Chem. 271：
4298,1996）の塩基配列をもとにＭｌｕＩサイトが生じ
るように設計したプライマー（5'-TCCACGCGTTTGGGAAACT
TCTTGGCTGCG-3'：配列番号：３）および（5'-GCTTCGTCG
CCGCTACGCGTGGGGCCGGA-3'：配列番号：４）を用いてＰ
ＣＲ法により得た。得られた０．３５ＫｂのＭｌｕＩ断
片に常法によりＥｃｏＲＩリンカーを付与し、pBluescr
ipt KSII+のＥｃｏＲＩサイトに挿入した（以下、ｐＫ
Ｓ−ｅｎｈａｎｃｅｒ１−４と呼ぶ）。挿入されたＤＮ
Ａ断片の塩基配列をＡＢＩ社製ＤＮＡシークエンサーで
常法により確認したところ、前述文献のエンハンサー領
域の塩基配列と一致した（配列番号：１０）。

【００２０】実施例２トランスジェニックラット作出
用発現ベクターの構築トランスジェニックラット作出用発現ベクター、ｐＫＳ
−ＭＭＰＢｃｏｎ−１９を常法に基づいて構築した。本
プラスミドは下記の１）から５）までの断片がｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＫＳＩＩ⁺のＮｏｔＩサイトに挿入さ
れたものである（図１）。１）Ｃｏｌ２Ａ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ラットＩＩ型
コラーゲン遺伝子のプロモーター領域、実施例１に記載
のｐＣＲＩＩ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ２中のｐＣＲＩＩのマ
ルチプルクローニングサイト内のＮｏｔＩサイトからｐ
ＣＲＩＩ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ２中のＩＩ型コラーゲン遺
伝子プロモーター内にあるＳｍａＩサイトまでの１１２
０ｂｐ断片（常法によるリンカー連結によりＳｍａＩサ
イトをＳａｌＩサイトに変換した）。２）ＳＶ４０ｓｐｌｉｃｉｎｇ：ｐＴＢ３９９（R.
Sasadaら、Cell Structure and Function 12：205,198
7）由来のスプライシングサイトを含むＤＮＡ断片（配
列番号：１１）の５’側をＳａｌＩサイト、３’側をＣ
ｌａＩサイトに変換したもの。３）ＭＭＰ−１９：ｐＴＢ１９２１（特開平１０−０
８０２８３）のＭＭＰ−１９ｃＤＮＡ内にあるＳａｃ
ＩサイトからＸｈｏＩサイトまでの約１６００ｂｐの遺
伝子断片。（リンカー連結によりＳａｃＩサイトをＣｌ
ａＩサイトに、ＸｈｏＩサイトをＢｇｌＩＩサイトに変
換した）。４）ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ：ｐＴＢ３９９（R.Sasada
ら、Cell Structure andFunction 12：205,1987）由来
のｐｏｌｙＡ付加シグナルを含むＢｇｌＩＩサイトから
ＨｉｎｄＩＩＩサイトまでの断片。５）Ｃｏｌ２Ａ１ｅｎｈａｎｃｅｒ：実施例１に記
載したラットＩＩ型コラーゲン遺伝子のエンハンサー領
域を含むｐＫＳ−ｅｎｈａｎｃｅｒ１−４のＨｉｎｄＩ
ＩＩサイトからＮｏｔＩサイトまでの断片。ｐＫＳ−Ｍ
ＭＰＢｃｏｎ−１９を大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳ−ＭＭＰＢｃｏｎ−１９を得
た。

【００２１】実施例３トランスジェニックラットの作
出採卵用としてラットＳＤ系統を８週齢で購入し、７：０
０〜１９：００１２時間明期条件で１週間飼育し、ま
ず１日目１１：００に卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性
腺刺激ホルモン、ＰＭＳＧ）（３０ＩＵ／個体）を腹腔
内注射し、３日目１１：００に黄体形成ホルモン（ヒト
絨毛性性腺刺激ホルモン、ｈＣＧ）（５ＩＵ／個体）を
腹腔内注射して雄ラットＳＤ系統１０週齢以降の個体と
１５：００に１：１で同居、交配させた。４日目９：０
０に交配させた雌ラットの腟栓確認を行い、１３：３０
から腟栓確認した個体を屠殺後、採卵を開始した。受精
卵で前核形成卵を選択し、１４：３０から実施例２で得
られたプラスミドｐＫＳ−ＭＭＰＢｃｏｎ−１９をＮｏ
ｔＩによって切断し、１０μｇ／ｍｌの濃度に調製した
ヒトＭＭＰ−１９遺伝子を含むＤＮＡ断片１〜２μｌを
顕微鏡下で観察しながら単細胞期のＳＤ系統ラット受精
卵の雄前核へ注入した。続いて、卵細胞を公知のＨＥＲ
培地（ＨＡＭ−Ｆ１２粉末培地（大日本製薬）３．１８
０ｇ、ＲＰＭＩ−１６４０粉末培地（大日本製薬）１．
０４０ｇ、ＭＥＭＥａｇｌｅ粉末培地（大日本製薬）
０．９５０ｇ、ＮａＨＣＯ₃（和光純薬）０．７８０
ｇ、Penicillin-G（GIBCO BRL）５００００ＵおよびStr
eptomycin（GIBCO BRL）５００００Ｕを５００ｍｌの蒸
留水に溶かしたもの）で培養し、５日目１３：３０に２
細胞期胚を確認してから、Wagnerら（Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 78:5016,1981）により記載された方法に従っ
て、偽妊娠の雌Ｗｉｓｔａｒ系統ラットの卵管に移植
し、着床させた。偽妊娠の雌Ｗｉｓｔａｒ系統ラット
（１１週齢以降）は０日目１３：００にＬＨＲＨを皮下
注射（４０μｇ／個体）し、４日目１５：００に雄Ｗｉ
ｓｔａｒ系統１２週齢以降の個体と１：１で同居、交配
させることにより作成した。５日目９：００に交配させ
た雌ラットの腟栓確認を行い使用した。

【００２２】実施例４トランスジェニックラットの遺
伝子解析４週齢に達した出産仔の尾からB.Hoganら（Manupulatin
g The Mouse Embryo、1986、Cold Spring Harvor Labor
atories）の方法で採取したＤＮＡを用いて、Col2A1 p
romoter（実施例２）の塩基配列を基に設計したプライ
マー（5'-CGCCGCTGGGCTGCCGGGTC-3'：配列番号：５）お
よびＭＭＰ−１９（実施例２）の塩基配列を基に設計し
たプライマー（5'-TTTCTCCAGCGGCCCAGCAAC-3'：配列番
号：６）を用いてＰＣＲを行った。合計１０４個体の産
仔ラットを解析した結果、６３０ｂｐのＰＣＲ断片の検
出できたＰＣＲ陽性個体は２個体であった。これら２個
体のＰＣＲ陽性個体のゲノムＤＮＡをサザンハイブリダ
イゼーション法により解析した。すなわち、１０μｇの
ＤＮＡをＢａｍＨＩで完全に切断し、２．０％アガロー
スゲル電気泳動後、ナイロンフィルターへ移した。この
フィルターを、ＭＭＰ−１９（実施例２）のＮｈｅＩサ
イトからＢｇｌＩＩサイトのＤＮＡ断片をＤＩＧＲＮ
Ａラベリングキット（ロッシュ・ダイアグノスティック
ス社製）で標識したプローブと一晩ハイブリダイズし、
２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて室温で2回洗浄し、次
に０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて６８℃で２回洗
浄した。検出にはＤＩＧ蛍光検出キット（ロッシュ・ダ
イアグノスティックス社製）を用いた。その結果、これ
ら２個体は、全てＭＭＰ−１９由来の８６０ｂｐの断片
が確認され、ＭＭＰ−１９遺伝子の導入が確認された。
また、導入された遺伝子のコピー数はＢ６０Ｆ系統が４
０コピー、Ｂ６１Ｆ系統が１０コピーであることが確認
された。

【００２３】実施例５ヘテロザイゴートのトランスジ
ェニックラット取得実施例４で得られたＢ６０Ｆ（第１世代（Ｆ₀））が１
２週齢に達した時、ＳＤ系統ラットと交配し、第２世代
（Ｆ₁）を取得した。第２世代が４週齢に達した時、実
施例４に記載の方法でＰＣＲを行い、ヘテロザイゴート
を選抜し、実施例６に用いた。

【００２４】実施例６トランスジェニックラットの軟
骨でのヒトｍＲＮＡの確認実施例５で得たトランスジェニックラット（Ｆ₁）から
摘出した肋軟骨、約２００ｍｇをＩＳＯＧＥＮ（ニッポ
ンジーン社製）中でホモジナイズし、常法によりtotal
ＲＮＡを抽出した。total ＲＮＡ５μｇを使用し、Fir
st strand cDNAsynthesis kit（アマシャムファルマシ
アバイオテク社製）を用いてプロトコールに従ってｃＤ
ＮＡ合成を行い、ＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとした。
プライマーはヒトとラットのＭＭＰ−１９に共通する配
列である（5’-CTGGATGATGCCACAAGGG-3’（配列番号：
７））および（5’-GATCCCTGCCACATCATC-3’（配列番
号：８））を用い、ラットとヒトＭＭＰ−１９のｍＲＮ
Ａを同時に増幅、検出した。また、陰性コントロールと
して、実施例５で行われたＰＣＲにより野生型と判断さ
れた個体を用いた。ＲＴ−ＰＣＲにより増幅された５３
８ｂｐの断片をヒトの断片中にのみ存在するＡｐａＬＩ
で完全に切断したところ、３４７ｂｐと１９１ｂｐの断
片が検出できたことから、トランスジェニックラットの
軟骨にヒトＭＭＰ−１９のｍＲＮＡが発現していること
が確認できた。また、ラット内在性ＭＭＰ−１９のｍＲ
ＮＡは心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、軟骨において確認
された（図２）。

【００２５】実施例７ホモザイゴートのトランスジェ
ニックラット取得実施例４で選抜したヘテロザイゴート（Ｆ₁）が１２週
齢に達した時、兄妹交配を行い第３世代（Ｆ₂）を取得
した。第３世代（Ｆ₂）が４週齢に達した時、これらの
個体の尾から実施例４に記載の方法でゲノムＤＮＡを採
取し、ＰＣＲでトランスジェニック個体を選抜した。こ
れらのトランスジェニック個体のＤＮＡについてさらに
実施例４に記載の方法に従いサザンハイブリダイゼーシ
ョン法による解析を行い、検出されたバンドの濃さを比
較することで遺伝子型を判断した。ヘテロザイゴートの
バンドに比較してホモザイゴートのバンドは約二倍の濃
さであった（図３）。以上の実験により、Ｂ６０Ｆ系統
一腹のＦ₂の遺伝子型を野生型、ヘテロザイゴートおよ
びホモザイゴートに分離することができた。

【００２６】実施例８トランスジェニックラット（Ｂ
６０Ｆ系統）の特徴の観察実施例７で得られた野生型、ヘテロザイゴートおよびホ
モザイゴートのそれぞれの個体（Ｂ６０Ｆ系統、１２週
齢、雄）の体重を測定したところ、野生型に比較してヘ
テロザイゴートが、さらにヘテロザイゴートに比較して
ホモザイゴートの体重が小さいことを見いだした。次
に、体重測定に用いた個体をネンブタールにて麻酔後、
前肢、後肢及び頭蓋の長さをノギスにて測定した。ヘテ
ロザイゴートは野生型と比較して、前肢、後肢及び頭蓋
の長さに違いは見られなかった。ホモザイゴートは野生
型及びヘテロザイゴートに比較して前肢および後肢の長
さが短いことが分かった。また頭蓋骨が長軸方向に扁平
化し長軸と垂直方向に拡張していることがわかった。結
果を表１に示す。

【表１】さらに、軟Ｘ線写真測定により全身の骨格を野生型、ヘ
テロザイゴートおよびホモザイゴート間で比較した。動
物をネンブタールにて麻酔後、軟Ｘ線発生装置(ソフテ
ックス社)内に入れ、４８ＫＶｐ、３ｍＡ、管球からの
距離６０ｃｍの条件で軟Ｘ線写真を撮影した。写真は富
士レンドールおよびレンフィックスにて使用説明書に従
って現像、定着した。フイルムをドライウェル水溶液に
浸漬後乾燥させ、シャーカステン上にて比較した。その
結果、前肢、後肢及び頭蓋の長さの違いは上記計測結果
と一致し、ホモザイゴートは野生型及びヘテロザイゴー
トに比較して前肢および後肢の長さが短いことが分かっ
た。また頭蓋骨が長軸方向に扁平化し長軸と垂直方向に
拡張していることがわかった。前肢、後肢の長管骨、頭
蓋骨及び尾椎以外の骨格には異常は見られなかった。組
み込んだ遺伝子のプロモーターにはＩＩ型コラーゲンの
プロモーターを用いているため、トランスジーン（組み
込まれた遺伝子）による影響はＩＩ型コラーゲンの発現
している部位に見られることが予想された。トランスジ
ェニックラット（Ｂ６０Ｆ系統）の右膝関節の病理検索
を行い、野生型、ヘテロザイゴートおよびホモザイゴー
ト間で比較した。動物をエーテル麻酔下で４％パラホル
ムアルデヒドを用いて心臓より潅流固定後、右膝関節部
を取り出した。周辺に付着している筋組織や結合組織を
切除後、ダイヤモンドカッターにて正中方向に関節部分
を二分割した。おのおのの関節部分をさらに４％パラホ
ルムアルデヒド中にて１４時間室温にて固定した。固定
終了後、組織片を蒸留水にて洗浄し、２０％ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．４）にて、膝関節を８日間脱灰した。脱灰液
交換は毎日行った。脱灰後、脱イオン水にて膝関節に付
着した２０％ＥＤＴＡを洗浄し、７０％エタノール、
８０％エタノール、９０％エタノール、１００％エタノ
ールを４回、キシレン２回の順で各々１時間から２時間
浸漬し、脱水、透徹を行った。次に約６０℃のパラフィ
ンに２回、各々２時間浸漬し、組織カセットを土台とし
たパラフィンブロックを作製した。ブロックは一晩以上
冷蔵庫にて急速に冷却し、完全に固めた。薄切はパラフ
ィンブロックを室温に放置し、室温に戻してから、ミク
ロトームにて５μｍにて行った。切片はマスコートを施
したスライドグラス上に温浴しながらマウントした。作
製した切片は３７℃に加温した乾燥機内で一晩放置し完
全に乾かした。脱パラフィン及び一般染色（ヘマトキシ
リンエオジン二重染色法）は下記文献を参考に行った。
（組織学研究法、佐野豊、南山堂、1985年）。また硫酸
化グリコサミノグリカンの染色は切片を脱パラフィン、
脱水後、ヘマトキシリン２分間、流水にて水洗後、０．
０２％ファーストグリーン水溶液５分間、１％酢酸水溶
液に浸洗、０．１％サフラニンＯ水溶液に１０分間行っ
た。切片の脱水は９５％エタノール、１００％エタノー
ル３回を各ステップで５回出し入れすることにより行
い、最後に１００％エタノールに５分間浸漬した。透
徹、封入は下記文献を参考に行った。（組織学研究法、
佐野豊、南山堂、1985年）。光学顕微鏡を用いて明視野
にて染色後の切片を鏡検した。野生型に比較してヘテロ
ザイゴートの大腿骨及び脛骨の関節軟骨及び成長板に異
常は見られなかった。ホモザイゴートの大腿骨及び脛骨
の関節軟骨は野生型に比較して関節軟骨層の菲薄化や肥
厚が見られる部位や表層が繊維性の関節軟骨組織に置換
している部位が存在した。また、成長板についてはホモ
ザイゴートで断裂している部位が見られた。関節軟骨層
の表層が繊維性の関節軟骨組織に置換している部位では
表層部での染色性がないことから、硫酸化グリコサミノ
グリカンの欠失が見られた。ホモザイゴートの成長板が
断裂している部位では本来の軟骨細胞の増殖方向への方
向性が一定しておらず、正常な軟骨分化が起こっていな
いことがわかった。これらのことから、長管骨における
内軟骨性骨化の異常が四肢の短縮を引き起こしているこ
とが示唆された。

【００２７】実施例９胎仔骨格の解析新規トランスジェニックラット（系統名はＭＭＰ−Ｂ６
０Ｆ）アダルトではワイルドタイプに比較してヘテロザ
イゴートが、ヘテロザイゴートに比較してホモザイゴー
トの体重が小さいこと、ホモザイゴートはワイルドタイ
プ及びヘテロザイゴートに比較して前肢および後肢の長
さが短いこと及び頭蓋骨が長軸方向に扁平化し長軸と垂
直方向に拡張していることから、骨格に異常があること
がわかった。この異常が生後後天的に起こったものなの
か、それとも胎生期に先天的に起こったものなのかを検
証する目的で、胎仔期の骨格形成に異常がないかどうか
を調べた。新規トランスジェニックラット（系統名はＭ
ＭＰ−Ｂ６０Ｆ）のホモザイゴートの雄とホモザイゴー
トの雌を同居させ、交尾させた。交尾確認後、妊娠１８
日目に妊娠動物を屠殺し、帝王切開を行い、胎仔を摘出
した。摘出された胎仔はすべてホモザイゴートであるこ
とから、胎仔の骨格異常が全例で見られるか否かを調べ
た。井上法およびKimmel法を用い、下記を参考に、胎仔
に骨軟骨二重染色を施した（組織学研究法、佐野豊、南
山堂、1985年）。新規トランスジェニックラット（系統
名はＭＭＰ−Ｂ６０Ｆ）ホモザイゴート、アダルトの検
索で見られた四肢の短縮、頭蓋の変形及び尾椎の変形が
胎生期から起こっていることがわかった。また、体後部
の腰椎から後肢にかけて、石灰化の遅延が見られた。ま
た一腹分の異常発現率はアダルトでは約５０％であった
が、胎生期では全例にいずれかの異常が観察された。こ
れらのことから新規トランスジェニックラット（系統名
はＭＭＰ−Ｂ６０Ｆ）ホモザイゴートに起きている骨格
異常は胎生期に先天的に起こったものであることが推察
された。

【００２８】実施例１０軟骨形成シグナル伝達の解析新規トランスジェニックラット（系統名はＭＭＰ−Ｂ６
０Ｆ）ホモザイゴート、アダルトでは骨格異常が起きる
ことがわかっている。このラットの関節軟骨では菲薄化
している部位が存在する。この部位で軟骨分化が正常に
起こっているか否かを免疫染色法によって各種転写因子
の発現を調べることで解析した。新規トランスジェニッ
クラット（系統名はＭＭＰ−Ｂ６０Ｆ）ホモザイゴー
ト、１２週齢雄、大腿骨遠位端の関節軟骨の切片を実施
例８と同様の方法にて作製した。作製した切片について
以下の抗体を用いて免疫染色を行った。ＦＧＦＲ３（Fi
broblast Growth Factor Receptor 3）、ＩＨＨ（India
n hedgehog）、ＰＴＣ（Patched）及びＳＭＯ（Smoothe
nd）。マウントしたスライドガラスを脱パラフィン後、
免疫染色を行った。免疫染色はベクタステインＡＢＣキ
ット（ペルオキシダーゼ法、ベクター社）を用いて行っ
た。発色基質にはＡＥＣを用いた。具体的な実験手順は
キット添付のマニュアルに従って行った。ホモザイゴー
トの軟骨層が菲薄化している部位のＦＧＦＲ３の発現は
増殖軟骨細胞層で見られ、異常はなかった。しかし、Ｉ
ＨＨはこの部位の軟骨層全層にわたって発現しており、
その受容体であるＰＴＣ及びＳＭＯの発現はこの部位に
見られなかった。正常なＩＨＨの発現が前肥大化軟骨細
胞に見られることから、軟骨層が菲薄化している部位で
は前肥大化軟骨細胞が肥大化軟骨細胞へと分化する段階
に異常が起こっていることが推察された。

【００２９】

【発明の効果】本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物は、
軟骨破壊を特徴とする各種の疾患、例えば、変形性関節
症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症
の予防薬あるいは治療薬の評価、ＭＭＰ−１９遺伝子異
常患者の遺伝子治療用実験などに用いることができ、本
発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物から採取した軟骨片ま
たは軟骨細胞などを培養し、ＭＭＰ−１９阻害薬の評価
に用いることができる。

【００３０】

【配列表】 [SEQUENCE LISTING] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Transgenic Animal <130> P2001-182 <150> JP 2000-241748 <151> 2000-8-9 <160> 13 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 GTGGTGGTGG ACAACTAGGA AACTCTGG 28 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 CGAGGCGAAT CATGGCTCAC CGCG 24 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 TCCACGCGTT TGGGAAACTT CTTGGCTGCG 30 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 GCTTCGTCGC CGCTACGCGT GGGGCCGGA 29 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 CGCCGCTGGG CTGCCGGGTC 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 TTTCTCCAGC GGCCCAGCAA C 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 CTGGATGATG CCACAAGGG 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 GATCCCTGCC ACATCATC 18 <210> 9 <211> 1120 <212> DNA <213> Rat <400> 9 gtggtggtgg acaactagga aactctggcg ctttctcctc ccctcacaaa actgagtcca 60 gctggagccg cctccagact ctctggccag ggcctcagag tggtcaacag tccctggcca 120 gcgttgctct ctccaggcta agggcaccca ctcccctgga gattcctgaa cctgggccag 180 gaagagccga attagacaag tgtctccaat ccggctgcgt gcggattttg ttgcggtgtc 240 cctcggttgt ctgcagttcc tttagtccct tccctggcct gccccttaca cctccacaca 300 ggtccccctc tgtgtaggaa tacaccagac cctctcttag ccacacacac ctccagtccc 360 ccgtctacct agattttttt catagctagt tggatggggg atgggttagg gaggctgggt 420 ttgcgagcct ccaggtggga gttcaccgac aggtactccg caaaggagct ggaaggcagg 480 tctggaaaac tgtcccccag atttaggatt ctgggcagct tccatcagct tatactttgg 540 ctcccccgcc cctaaactcc ccatccccac ctcctttctc ccgttacttc gtcctccctc 600 gcctttccag cctcgagtct aaagctccat gcttatgcct ctgcaaacaa ccccctccct 660 tctaacccca gcagaactcc gaggaaaggg gccggaggcc ctcttctcgc ctgtggttag 720 agggggcagt gtggcagtcc caagtggggg cgaccggagg ccgtctcggt gccccgcccg 780 atcaggccac tgggcacatc gggggcggga agcgggctca ccaaaggggc gactggcctt 840 ggcaggtgtg ggctctggtc cgacctgggc aggctccggg ggcggggtct caggttacaa 900 cgccacgggg ggctgggggc ggcccgcggt ttggttggtt tgccagcctt tggagcgacc 960 gggagcatat aaccggagcc tctgctggga gaagcgcagg gcgccgctgg gctgccgggt 1020 ctcctgcctc ctcctcctgc tccgagagcc tcctgcatga gggcgaggta gagacccgga 1080 cccgctccgg tctctgccgc ctcgccgagc ttcgcccggg 1120 <210> 10 <211> 372 <212> DNA <213> Rat <400> 10 gaattctcgc gtttgggaaa cttcttggct gcgaagactt tgacccacat ctgcatttct 60 cagccccagc ttccaaaagt gctgcaggtt cgggagggga gacctcagtc ctcctttgtg 120 aggcttgttt gcgttgaggg attggcagcg atggcttcca gatgggctga aaccctgccc 180 gtatttattt aaactggttc ctcgtggaga gctgtgaatc gggctctgta tgcgctcgag 240 aaaagcccca ttcatgagag gcaaggccca gtgggtcccc ccgactcccc gacccccctc 300 tcccacaatg catcccccct ccctgtgccc gcctgccgcc acctcccggg ctccggcccc 360 acgcgagaat tc 372 <210> 11 <211> 187 <212> DNA <213> Virus <400> 11 gtcgaccagc ttgaactgaa aaaccagaaa gttaactggt aagtttagtc tttttgtctt 60 ttatttcagg tcccggatcc ggtggtggtg caaatcaaag aactgctcct cagtggatgt 120 tgcctttact tctaggcctg tacggaagtg ttacttctgc tctaaaagct gcctagaatt 180 tatcgat 187 <210> 12 <211> 1524 <212> DNA <213> Human <400> 12 atgaactgcc agcagctgtg gctgggcttc ctactcccca tgacagtctc aggccgggtc 60 ctggggcttg cagaggtggc gcccgtggac tacctgtcac aatatgggta cctacagaag 120 cctctagaag gatctaataa cttcaagcca gaagatatca ccgaggctct gagagctttt 180 caggaagcat ctgaacttcc agtctcaggt cagctggatg atgccacaag ggcccgcatg 240 aggcagcctc gttgtggcct agaggatccc ttcaaccaga agacccttaa atacctgttg 300 ctgggccgct ggagaaagaa gcacctgact ttccgcatct tgaacctgcc ctccaccctt 360 ccaccccaca cagcccgggc agccctgcgt caagccttcc aggactggag caatgtggct 420 cccttgacct tccaagaggt gcaggctggt gcggctgaca tccgcctctc cttccatggc 480 cgccaaagct cgtactgttc caatactttt gatgggcctg ggagagttct ggcccatgcc 540 gacatcccag agctgggcag tgtgcacttc gacgaagacg agttctggac tgaggggacc 600 taccgtgggg tgaacctgcg catcattgca gcccatgaag tgggccatgc tctggggctt 660 gggcactccc gatattccca ggccctcatg gccccagtct acgagggcta ccggccccac 720 tttaagctgc acccagatga tgtggcaggg atccaggctc tctatggcaa gaagagtcca 780 gtgataaggg atgaggaaga agaagagaca gagctgccca ctgtgccccc agtgcccaca 840 gaacccagtc ccatgccaga cccttgcagt agtgaactgg atgccatgat gctggggccc 900 cgtgggaaga cctatgcttt caagggggac tatgtgtgga ctgtatcaga ttcaggaccg 960 ggccccttgt tccgagtgtc tgccctttgg gaggggctcc ccggaaacct ggatgctgct 1020 gtctactcgc ctcgaacaca atggattcac ttctttaagg gagacaaggt gtggcgctac 1080 attaatttca agatgtctcc tggcttcccc aagaagctga atagggtaga acctaacctg 1140 gatgcagctc tctattggcc tctcaaccaa aaggtgttcc tctttaaggg ctccgggtac 1200 tggcagtggg acgagctagc ccgaactgac ttcagcagct accccaaacc aatcaagggt 1260 ttgtttacgg gagtgccaaa ccagccctcg gctgctatga gttggcaaga tggccgagtc 1320 tacttcttca agggcaaagt ctactggcgc ctcaaccagc agcttcgagt agagaaaggc 1380 tatcccagaa atatttccca caactggatg cactgtcgtc cccggactat agacactacc 1440 ccatcaggtg ggaataccac tccctcaggt acgggcataa ccttggatac cactctctca 1500 gccacagaaa ccacgtttga atac 1524 <210> 13 <211> 508 <212> PRT <213> Human <400> 13 Met Asn Cys Gln Gln Leu Trp Leu Gly Phe Leu Leu Pro Met Thr Val 1 5 10 15 Ser Gly Arg Val Leu Gly Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Asp Tyr Leu 20 25 30 Ser Gln Tyr Gly Tyr Leu Gln Lys Pro Leu Glu Gly Ser Asn Asn Phe 35 40 45 Lys Pro Glu Asp Ile Thr Glu Ala Leu Arg Ala Phe Gln Glu Ala Ser 50 55 60 Glu Leu Pro Val Ser Gly Gln Leu Asp Asp Ala Thr Arg Ala Arg Met 65 70 75 80 Arg Gln Pro Arg Cys Gly Leu Glu Asp Pro Phe Asn Gln Lys Thr Leu 85 90 95 Lys Tyr Leu Leu Leu Gly Arg Trp Arg Lys Lys His Leu Thr Phe Arg 100 105 110 Ile Leu Asn Leu Pro Ser Thr Leu Pro Pro His Thr Ala Arg Ala Ala 115 120 125 Leu Arg Gln Ala Phe Gln Asp Trp Ser Asn Val Ala Pro Leu Thr Phe 130 135 140 Gln Glu Val Gln Ala Gly Ala Ala Asp Ile Arg Leu Ser Phe His Gly 145 150 155 160 Arg Gln Ser Ser Tyr Cys Ser Asn Thr Phe Asp Gly Pro Gly Arg Val 165 170 175 Leu Ala His Ala Asp Ile Pro Glu Leu Gly Ser Val His Phe Asp Glu 180 185 190 Asp Glu Phe Trp Thr Glu Gly Thr Tyr Arg Gly Val Asn Leu Arg Ile 195 200 205 Ile Ala Ala His Glu Val Gly His Ala Leu Gly Leu Gly His Ser Arg 210 215 220 Tyr Ser Gln Ala Leu Met Ala Pro Val Tyr Glu Gly Tyr Arg Pro His 225 230 235 240 Phe Lys Leu His Pro Asp Asp Val Ala Gly Ile Gln Ala Leu Tyr Gly 245 250 255 Lys Lys Ser Pro Val Ile Arg Asp Glu Glu Glu Glu Glu Thr Glu Leu 260 265 270 Pro Thr Val Pro Pro Val Pro Thr Glu Pro Ser Pro Met Pro Asp Pro 275 280 285 Cys Ser Ser Glu Leu Asp Ala Met Met Leu Gly Pro Arg Gly Lys Thr 290 295 300 Tyr Ala Phe Lys Gly Asp Tyr Val Trp Thr Val Ser Asp Ser Gly Pro 305 310 315 320 Gly Pro Leu Phe Arg Val Ser Ala Leu Trp Glu Gly Leu Pro Gly Asn 325 330 335 Leu Asp Ala Ala Val Tyr Ser Pro Arg Thr Gln Trp Ile His Phe Phe 340 345 350 Lys Gly Asp Lys Val Trp Arg Tyr Ile Asn Phe Lys Met Ser Pro Gly 355 360 365 Phe Pro Lys Lys Leu Asn Arg Val Glu Pro Asn Leu Asp Ala Ala Leu 370 375 380 Tyr Trp Pro Leu Asn Gln Lys Val Phe Leu Phe Lys Gly Ser Gly Tyr 385 390 395 400 Trp Gln Trp Asp Glu Leu Ala Arg Thr Asp Phe Ser Ser Tyr Pro Lys 405 410 415 Pro Ile Lys Gly Leu Phe Thr Gly Val Pro Asn Gln Pro Ser Ala Ala 420 425 430 Met Ser Trp Gln Asp Gly Arg Val Tyr Phe Phe Lys Gly Lys Val Tyr 435 440 445 Trp Arg Leu Asn Gln Gln Leu Arg Val Glu Lys Gly Tyr Pro Arg Asn 450 455 460 Ile Ser His Asn Trp Met His Cys Arg Pro Arg Thr Ile Asp Thr Thr 465 470 475 480 Pro Ser Gly Gly Asn Thr Thr Pro Ser Gly Thr Gly Ile Thr Leu Asp 485 490 495 Thr Thr Leu Ser Ala Thr Glu Thr Thr Phe Glu Tyr 500 505

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２で構築したプラスミドｐＫＳ−ＭＭＰ
Ｂｃｏｎ−１９の概略図を示す。

【図２】実施例６で行われたｍＲＮＡの検出結果を示
す。レーン１〜６はコントロールとして用いた野生型ラ
ットの、レーン７〜１２はトランスジェニックラットの
臓器を示す。また、レーン１および７は心臓を、レーン
２および８は肺を、レーン３および９は肝臓を、レーン
４および１０は脾臓を、レーン５および１１は腎臓を、
レーン６および１２は軟骨をそれぞれ示す。

【図３】実施例７で行われたサザンハイブリダイゼーシ
ョン法による解析結果を示す。レーン１、３〜６、８〜
１３はヘテロザイゴート、レーン２および７はホモザイ
ゴートを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 27/02 Ａ６１Ｐ 27/02 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 15/09 ＺＮＡ 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/37 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ｂ (72)発明者細野和裕大阪府高槻市安岡寺町５丁目29番７号Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 CB17 DA12 DA13 4B024 AA11 BA11 CA04 DA02 DA06 EA04 FA02 FA06 GA11 HA11 4B063 QA18 QA19 QQ08 QR10 QS31 4B065 AA26X AA91X AA99Y AB01 BA02 CA33 CA46 4C084 AA16 ZA33 ZA96 ZA97 ZB15 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】外来性ＭＭＰ−１９遺伝子またはその変
異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物ま
たはその生体の一部。
【請求項２】非ヒト哺乳動物が、ウサギ、イヌ、ネ
コ、モルモット、ハムスター、マウスまたはラットであ
る請求項１記載の動物またはその生体の一部。
【請求項３】非ヒト哺乳動物がラットである請求項１
記載の動物またはその生体の一部。
【請求項４】外来性ＭＭＰ−１９遺伝子が配列番号：
１２で表される塩基配列を有する請求項１記載の動物ま
たはその生体の一部。
【請求項５】関節疾患を発症している請求項１から４
記載の動物またはその生体の一部。
【請求項６】四肢の短縮と変形、頭蓋の変形、
咬合不全、上顎及び下顎切歯の過長、腰椎の石灰化
不全、尾椎の変形および尾椎椎間板の欠損から選ば
れる症状を発症している請求項１から４記載の動物また
はその生体の一部。
【請求項７】外来性ＭＭＰ−１９遺伝子またはその変
異遺伝子を含有し、非ヒト哺乳動物において該遺伝子を
発現し得るベクター。
【請求項８】外来性ＭＭＰ−１９遺伝子が配列番号：
１２で表される塩基配列を有する請求項７記載のベクタ
ー。
【請求項９】さらにラットＩＩ型コラーゲン遺伝子の
プロモーター領域およびラットＩＩ型コラーゲン遺伝子
のエンハンサー領域を含有する請求項７記載のベクタ
ー。
【請求項１０】ｐＫＳ−ＭＭＰＢｃｏｎ−１９で表示
される請求項７記載のベクター。
【請求項１１】請求項７記載のベクターで形質転換さ
れた形質転換体。
【請求項１２】形質転換体が大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫ
Ｓ−ＭＭＰＢｃｏｎ−１９（ＦＥＲＭＢＰ−７６４
７）である請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１３】請求項１から６のいずれかに記載の動
物またはその生体の一部に被験物質を適用し、細胞外マ
トリックスの異常な分解に起因する疾患の改善効果を検
定することを特徴とする、細胞外マトリックスの異常な
分解に起因する疾患の予防・治療のために用いられる物
質のスクリーニング方法。
【請求項１４】細胞外マトリックスの異常な分解がＭ
ＭＰ−１９の機能異常に起因するものである請求項１３
記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】細胞外マトリックスの異常な分解に起
因する疾患が、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、
変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代
謝性関節症、眼疾患および悪性腫瘍である請求項１３記
載のスクリーニング方法。
【請求項１６】請求項１３記載の方法により細胞外マ
トリックスの異常な分解に起因する疾患の改善効果を有
すると判定される物質を含有してなる細胞外マトリック
スの異常な分解に起因する疾患の予防・治療用医薬。
【請求項１７】細胞外マトリックスの異常な分解に起
因する疾患が、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、
変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代
謝性関節症、眼疾患および悪性腫瘍である請求項１６記
載の医薬。
【請求項１８】哺乳動物に対して、請求項１３記載の
方法により細胞外マトリックスの異常な分解に起因する
疾患の改善効果を有すると判定される物質の有効量を投
与することを特徴とする細胞外マトリックスの異常な分
解に起因する疾患の予防・治療法。
【請求項１９】細胞外マトリックスの異常な分解に起
因する疾患が、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、
変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代
謝性関節症、眼疾患および悪性腫瘍である請求項１８記
載の予防・治療法。
【請求項２０】細胞外マトリックスの異常な分解に起
因する疾患の予防・治療のために用いられる物質をスク
リーニングするための請求項１から６のいずれかに記載
の動物またはその生体の一部の用途。
【請求項２１】卵胞刺激ホルモン約２０ないし５０Ｉ
Ｕ／個体を投与した後に黄体形成ホルモン約０ないし１
０ＩＵ／個体を投与した雌ラットを雄ラットと交配させ
て得られる受精卵に、外来性ＭＭＰ−１９遺伝子または
その変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを導入し、該受精卵
を雌ラットに着床させることを特徴とする請求項３記載
のラットまたはその生体の一部の作製方法。
【請求項２２】黄体形成ホルモン放出ホルモンまたは
その類縁体を投与した後、雄ラットと交配させた雌の偽
妊娠ラットに、外来性ＭＭＰ−１９遺伝子またはその変
異遺伝子を組み込んだＤＮＡを導入した受精卵を着床さ
せることを特徴とする請求項３記載のラットまたはその
生体の一部の作製方法。
【請求項２３】外来性ＭＭＰ−１９遺伝子またはその
変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを導入した受精卵。