CN1529753B - 疾病相关蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于早期诊断、监测和治疗视网膜营养不良、年龄相关的黄斑变性、巴比综合征、巴科综合征、贝斯特病、脉络膜瘤、螺旋状萎缩、先天性黑矇、雷夫叙姆综合征、青年遗传性黄斑变性和厄舍综合征的方法和组合物。具体地，本发明涉及蛋白质“Rdcvf1”，该蛋白质在患有视网膜营养不良等疾病，例如视网膜营养不良和年龄相关的黄斑变性的患者中与在非患者中的转录和表达不同；本发明还涉及识别该蛋白质的抗体和诊断这些病症的方法。

Description

疾病相关蛋白质

发明领域

本发明涉及用于检测和治疗视网膜变性疾病的方法和组合物。具体地，本发明涉及对视锥变性进行防护的蛋白质、编码这种蛋白质的核酸分子、识别这种蛋白质的抗体以及诊断视网膜变性疾病的方法。

发明背景

光感受器是视网膜神经元的特化亚类，其与视觉相关。光感受器由视杆和视锥组成，它们是视网膜的感光细胞。每一视杆和视锥精巧地形成一个特化的睫，称作外节，其容纳了光传导机器。视杆含有特殊的吸收光的视色素——视紫质。在人类中有三种类型的视锥，其由不同的视色素的表达来表征：蓝视锥、绿视锥和红视锥色素。每一类型的视色素蛋白质调整以最大程度吸收不同波长的光。视杆视紫质介导暗视觉(在微光下)，而视锥色素负责明视觉(在亮光下)。在人类中红、蓝和绿色素也形成颜色视觉的基础。视杆和视锥中的视色素对光产生反应并在输出细胞(视杆双极神经元)中产生动作电位，其后被视网膜节神经元中继传播并在视皮质中产生视觉刺激。

在人类中，多种视网膜疾病涉及光感受器的进行性变性以及最终的死亡，因而无情地导致失明。光感受器变性都是以光感受器外节的进行性萎缩和功能丧失为特征的，所上述光感受器变性可以例如由遗传性视网膜营养不良(例如色素性视网膜炎)、年龄相关的黄斑变性和其它黄斑病变或者视网膜脱离等等引起。另外，光感受器的死亡或者光感受器的功能丧失还会导致二级视网膜神经元(视杆双极细胞和水平细胞)出现部分传入神经阻滞，因此使光感受器产生的电信号传播的整体效率下降。光感受器变性后继发的神经胶质和色素上皮的改变将引起导致缺血和神经胶质增生的血管变化。能够挽救光感受器使其免于细胞死亡和/或能够恢复功能异常(萎缩或营养不良)光感受器的功能的营养因子可能是治疗这些病症的有用治疗方法。

这些病症的恶化是指两种类型光感受器的相继丧失：最初是视杆作为遗传或环境或未知损伤的直接后果而丧失，导致夜盲和视野减小，之后不可避免的发生视锥丧失从而导致完全的失明。因此，视锥是间接死亡，因为它们并不表现原发病变。

并不是所有与视网膜营养不良相关的基因都已经被鉴定。这些基因的鉴定将使该疾病的诊断和有效疗法的确立成为可能。

发明概述

本发明总得来说涉及新的基因家族——视杆来源的视锥生存因子(Rod-derived Cone Viability Factor，Rdcvf)。第一方面，本发明提供分离的多肽，其具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列。这种多肽或其片断在患视网膜营养不良的患者眼中的含量比在没有患视网膜营养不良的个体眼中的含量大大减少。具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的分离的多肽的片断包括下述多肽，其含有约5到10个氨基酸，优选约10到约20个氨基酸，更优选约20到约100个氨基酸，并且最优选约20到约50个氨基酸。根据本发明的这一方面，提供了哺乳动物来源、并且特别是小鼠或人来源的新的多肽，以及该多肽在生物学、诊断学或治疗学上有用的片断、变体和衍生物及片断的变体和衍生物以及前述的类似物。与具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的多肽基本相似的多肽也在本发明范围之内，例如SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：1或SEQID NO：3所示核苷酸序列。与具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3核苷酸序列的核酸基本相似的核酸也在本发明范围之内，例如SEQ ID NO：5、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13中所示的核苷酸序列。在一个优选实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，其编码的多肽选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14中所示的多肽，该分离的核酸分子为例如SEQ ID NO：1的45-374位核苷酸、SEQ ID NO：3的26-676位核苷酸、SEQ ID NO：5的24-353位核苷酸、SEQ ID NO：7的48-686位核苷酸、SEQ ID NO：9的265-570位核苷酸、SEQ ID NO：11的300-770位核苷酸或者SEQ ID NO：13的331-738位核苷酸。在一个优选实施方案中，分离的DNA为包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示DNA的载体分子的形式。

第三方面，本发明包括人视网膜营养不良的诊断方法，所述方法包括在哺乳动物生物体(优选人)的眼中检测从Rdcvf1或Rdcvf2编码DNA转录的信使RNA的转录水平的下降，其中这种转录水平的下降可用于诊断生物体患有视网膜营养不良或病理学老化(ARMD)。本发明此检测方面的另一实施方案提供哺乳动物生物体(优选人)中视网膜营养不良的诊断方法，所述方法需要测量怀疑患有视网膜营养不良的人眼中Rdcvf1或Rdcvf2多肽或者其片断的量，其中通过与未患视网膜营养不良的个体眼中的此多肽或其片断的量相比所述测量到的多肽或其片断的量的减少可以用于诊断该人患有视网膜营养不良。

根据本发明另一方面，提供调节Rdcvf1或Rdcvf2基因转录的反义多核苷酸；在另一实施方案中，提供可以调节Rdcvf1或Rdcvf2基因转录的双链RNA。

本发明另一方面提供用于生产前述多肽、多肽片断、变体和衍生物、变体和衍生物的片断以及它们的类似物的方法。在本发明该方面的一个优选的实施方案中，提供生产前述Rdcvf1多肽的方法，所述方法包括将其中导入了包含外源Rdcf1或Rdcf2编码多核苷酸的表达载体的宿主细胞在足以使宿主表达Rdcvf1或Rdcvf2多肽的条件下培养，并随后回收表达的多肽。

根据本发明另一方面，提供将前述多肽和多核苷酸用于研究、生物学、临床和治疗目的的产品、组合物、工艺和方法。

在本发明某些另外的优选方面，提供抗体或其片断，所述抗体或其片断特异结合含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：8(即Rdcvf1)或者SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14(即Rdcvf2)所示氨基酸序列的多肽。在这一点的某些特别优选的方面，抗体对哺乳动物(优选小鼠，并且特别是人)Rdcvf1或Rdcvf2多肽或这些Rdcvf1或Rdcvf2多肽的部分具有高度选择性。在相关方面，本发明提供抗体或其片断，所述抗体或其片断可以与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：14所示氨基酸序列的片断或部分结合。

在另一方面，本发明提供通过向对象施用治疗有效量的RDCVF1或RDCVF2蛋白质或其相关蛋白质或其片断或部分而治疗对象所患疾病的方法，其中所述疾病由眼中Rdcvf1或Rdcvf1基因表达的改变(例如RDCVF1或RDCVF2多肽的减少)介导或者与其相关，且所述RDCVF1或RDCVF2蛋白质为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示蛋白质。本发明也提供在对象中与Rdcvf1或Rdcvf2基因表达减少或RDCVF1或RDCVF2多肽存在量减少相关的疾病或病症的诊断方法，所述方法包括在免疫测定中使用与如下多肽或其片断或部分相结合的抗体，所述多肽具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供可在体外增殖的细胞，优选脊椎动物细胞。所述细胞在培养生长时可以产生含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14氨基酸序列的多肽或其片断，其中所述细胞含有转录调控DNA序列，其中此转录调控序列不是小鼠或人的Rdcvf1或Rdcvf2转录调控序列且其控制如下DNA的转录，所述DNA编码具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：14中所示氨基酸序列的多肽或其片段。

在相关方面，本发明提供生产Rdcvf1或Rdcvf2多肽的方法，所述方法包括将其中导入了包含外源Rdcvf1或Rdcvf2编码多核苷酸的表达载体的宿主细胞在足于使该宿主细胞表达Rdcvf1或Rdcvf2多肽的条件下培养，由此产生表达的多肽，并回收此表达的多肽。

另一方面，本发明提供测定方法和试剂盒，其包括检测来自患者的机体组织样本中Rdcvf1或Rdcvf2多核苷酸或多肽或其片断的反常表达(如低于正常的表达)所必需的成分，这些试剂盒包括例如可以结合Rdcvf1或Rdcvf2的抗体或者可以与本发明多核苷酸杂交的寡核苷酸探针。在优选实施方案中，这些试剂盒也包括用于详述试剂盒成分的使用方法的说明书。

另一方面，本发明涉及在治疗人或动物时Rdcvf1或Rdcvf2多肽的使用。其相关方面涉及在制备用于治疗视网膜营养不良的药物中Rdcvf1或Rdcvf2多肽或其片断、编码Rdcvf1或Rdcvf2或其片断的核苷酸或者结合Rdcvf1或Rdcvf2或其片断的抗体的用途。

另一方面，本发明提供视网膜保护剂，其含有选自SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14的多肽以及任选地可药用载体。其相关方面，本发明提供治疗视网膜营养不良的药物组合物，其含有Rdcvf1或Rdcvf2多肽或其片断、编码Rdcvf1或Rdcvf2或其片断的核苷酸。在另一相关方面，本发明提供药物组合物，其含有治疗有效量的选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14的多肽以及可药用载体。

在相关方面，本发明提供治疗视网膜营养不良的方法，所述方法包括对有需要的对象施用治疗有效量的选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14的多肽以及可药用载体。

另一方面，本发明涉及鉴定下述分子的方法，所述分子可以结合至Rdcvf1或Rdcvf2和/或可以调节Rdcvf1或Rdcvf2的活性，或者其可以结合能调节Rdcvf1或Rdcvf2转录或翻译的核酸序列。这些方法在例如美国专利号5,541,070、5,567,317、5,593,853、5,670,326、5,679,582、5,856,083、5,858,657、5,866,341、5,876,946、5,989,814、6,010,861、6,020,141、6,030,779和6,043,024中公开，所有上述专利特此全部引用作为参考。利用这些方法鉴定的分子也在本发明范围之内。

另一方面，本发明涉及向需要治疗的对象的一个或多个组织中导入本发明核酸、并导致该组织中的细胞表达和/或分泌所述核酸所编码的一种或多种蛋白质的方法。

另一方面，本发明涉及提供用于移植的光感受器细胞的方法，其中光感受器细胞与RdCVF1或RdCVF2一起培养。

对本领域技术人员而言，本发明的其它目的、特征、优势和方面将随着以下描述而变得明显。然而应当理解，下列描述和特定实例虽说明了本发明优选实施方案，然其仅仅用于举例阐释目的。对本领域技术人员而言，经过阅读下列描述和本发明公开的其它部分可以容易地在本发明精神和范围之内作出多种改变和修改。

附图简述

图1：来自表达克隆的小鼠Rdcvf1核苷酸序列和小鼠RdCVF1氨基酸序列。

图2：小鼠Rdcvf1L核苷酸序列和氨基酸序列。

图3：人Rdcvf1和人Rdcvf1氨基酸序列。

图4：人Rdcvf1L核苷酸序列及人Rdcvf1L氨基酸序列。

图5：小鼠Rdcvf2核苷酸序列和小鼠Rdcvf2氨基酸序列。

图6：小鼠Rdcvf2L核苷酸序列和小鼠Rdcvf2L氨基酸序列。

图7：人Rdcvf2核苷酸序列和人Rdcvf2氨基酸序列。

图8描绘Rdcvf的短形式(SEQ ID No 2、6、10和14)的氨基酸比对和Rdcvf的长形式(SEQ ID No 4、8、12和14)的氨基酸比对。

图9描绘用于GST-Rdcvf1的引物。

图10：RDCVF1/RDCVF2的多比对。

图11：小鼠和人RDCVF2的比较。

图12：小鼠Rdcvf2与EST克隆be552141、bi517442、bg707818和bi603812的多比对。

图13：Rdcvf1与EST克隆bg299078、ai716631、bg294111、be108041和bg395178的多比对。

图14：修正以匹配Rdcvf1的EST序列bg299078。

图15：修正以匹配Rdcvf1L的EST序列bg294111。

图16：对5周龄C57BL/6N(绿)和C3H/HEN(红)视网膜中视杆抑制蛋白(A)和RdCSF1(B)表达的实时RT-PCR分析。

图17：RT-PCR分析，其显示Rdcvf2以视杆依赖性方式表达以及在CNS的其它部分中表达。

图18：显示RdCVF1以视杆依赖性方式表达的PCR分析。

发明详述

于此引用的所有专利申请、专利和参考文献特此全部引用作为参考。

在本发明的实施中，使用许多分子生物学、微生物学和重组DNA的常规技术。这些技术为人所公知，并且阐释在例如最新分子生物学实验方法(Current Protocols in Molecular Biology)，卷I、II、III，1997(E.M.Ausubel主编)；Sambrook等人，1989，分子克隆：实验室手册(MloecularCloning：A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；DNA克隆：实用方法(DNA Cloning：Apractical Approach)，卷I、II，1985(D.N.Glover主编)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)，1984(M.L.Gait主编)；核酸杂交(Nucleic acid Hybridization)，1985(Hames和Higgins)；转录与翻译(Transcription and Translation)，1984(Hames和Higgins主编)；动物细胞培养(Animal Cell Culture)，1986(R.I.Freshney主编)；固定化细胞与酶(Immobilized Cells and Enzymes)，1986(IRL出版社)；Perbal，1984，分子克隆实用指南(A Practical Guide toMolecular cloning)；酶学方法(Methods in Enzymology)系列(学院出版公司；哺乳动物细胞基因转移载体(Gene Transfer Vectors for MammalianCells)，1987(J.H.Miller和M.P.Calos主编，冷泉港实验室)；以及酶学方法154卷和155卷(分别由Wu和Grossman，和Wu主编)。

于此使用的“差异表达基因”是指(a)含有至少一个于此公开的DNA序列(例如，图1和SEQ ID NO：1所示，或图2和SEQ ID NO：3所示序列)的基因；(b)任何编码如下氨基酸序列的DNA序列，所述氨基酸序列由此处公开的DNA序列所编码(例如，图1和SEQ ID NO：2所示，或图2和SEQ ID NO：4所示序列)；或(c)任何与于此公开的编码序列基本相似的DNA序列。

广义而言，于此使用的与核苷酸序列相关的术语“基本相似”是指与参考核苷酸序列相对应的核苷酸序列，其中此相对应的核苷酸序列编码的多肽具有与参考核苷酸序列所编码的多肽基本相同的结构和功能，例如其中仅仅发生不影响多肽功能的氨基酸改变。优选基本相似的核苷酸序列编码由参考核苷酸序列所编码的多肽。基本相似的核苷酸序列与参考核苷酸序列之间的同一性百分比优选至少为90％，更优选至少为95％，并且更优选至少为99％。序列比较利用Smith-Waterman序列比对算法进行(参见例如Waterman，M.S.计算生物学导论：图谱、序列和基因组(Introductionto Computational Biology：Maps，sepuences and genomes)。Chapman&Hall伦敦：1995.ISBN 0-412-99391-0，或http://www-hto.usc.edu/software/seqaln/index.html)。可以使用localS程序(1.16版)及如下参数：匹配：1，错配罚分：0.33，空位(open)-开放罚分：2，空位延伸罚分：2。与参考核苷酸序列“基本相似”的核苷酸序列可以在如下条件下与参考核苷酸序列发生杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA及50℃下杂交并在2×SSC、0.1％SDS及50℃下洗涤，更有利地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA及50℃下杂交并在1×SSC、0.1％SDS及50℃下洗涤，再更有利地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mMEDTA及50℃下杂交并在0.5×SSC、0.1％SDS及50℃下洗涤，优选在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA及50℃下杂交并在0.1×SSC、0.1％SDS及50℃下洗涤，更优选在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA及50℃下杂交并在0.1×SSC、0.1％SDS及65℃下洗涤，而且该核苷酸依旧编码功能等价的基因产物。

于此公开的差异表达基因在眼组织中表达，并且特别在视杆细胞中产生，但是在患有视网膜营养不良，例如色素性视网膜炎、年龄相关黄斑变性、巴比综合征、巴科综合征、贝斯特病、脉络膜瘤(choroidema)、螺旋状萎缩、先天性黑矇、雷夫叙姆综合征、青年遗传性黄斑变性和厄舍综合征的患者中，与没有患视网膜营养不良的人的相应组织相比，这些基因在患者组织中产生的量减少，即以较小程度产生。存在于视杆组织中或与这些组织相关的从差异表达基因转录的信使RNA和从这种mRNA翻译的蛋白质的量与没有患视网膜营养不良的人的相应组织中的mRNA和蛋白质的量相比，至少减少约一半，优选至少减少约5倍，更优选至少减少约10倍，最优选至少减少约100倍。这种Rdcvf1或Rdcvf2 mRNA转录的减少于此被称为“下降的转录”。

于此使用的“宿主细胞”是指含有异源DNA的原核或真核细胞，上述异源DNA可以是通过任何方法导入所述细胞的，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、转化、病毒侵染等等。

于此使用的“异源”是指“不同的天然来源”或是指非天然状态。例如，如果利用来自另一生物体(特别是另一种类)的DNA或基因转化宿主细胞，则与宿主细胞以及携带此基因的宿主细胞的后代相对而言，这一基因就是异源基因。同样，异源也指来自并插入相同天然、原初细胞类型的核苷酸序列，但该序列处于非天然状态，例如不同的拷贝数或者在不同的调控元件的控制之下。

载体分子为其中可以插入异源核酸并且随后可以被导入适当宿主细胞的核酸分子。载体优选具有一个或多个复制起点，并且具有一个或多个重组DNA插入位点。载体常具有可以将携带载体的细胞从那些不携带该载体的细胞中筛选出来的便利手段，例如它们可以编码药物抗性基因。常用载体包括质粒、病毒基因组以及(主要在酵母和细菌中的)“人工染色体”。

按照本领域技术人员所熟知的标准命名习惯，本文中“质粒”的命名通常是以小写p开头，并且/或者紧跟着大写字母和/或数字。于此公开的起始质粒或可商业得到或可不受限制地被公众得到，或可以通过常规应用公知的发表方法从可得的质粒构建产生。可以用于本发明的多种质粒和其它克隆及表达载体为人所公知，并且对本领域技术人员而言可容易得到。而且，技术人员可以容易地构建适合本发明使用的任意数目的其它质粒。对本领域技术人员而言，从本公开可以容易地明了在本发明中这些质粒及其它载体的特性、构建和使用。

术语“分离”是指将材料从其原初环境(例如天然环境，如果它是天然的话)中移出。例如，存在于活的动物体内的天然多核苷酸或多肽不是分离的，但是从天然系统中共存的一些或所有材料中分离出来的相同的多核苷酸或多肽就是分离的，即使将其随后重新导入此天然系统。这些多核苷酸可以是载体的一部分和/或这些多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍旧是分离的，因为这种载体或组合物并不是天然环境的一部分。

于此使用的术语“转录调控序列”是指DNA序列，其可以诱导、阻抑或者调控与它们可操纵相连的蛋白质编码核酸序列的转录，例如起始序列、增强子序列和启动子序列。

与此使用的“Rdcvf1转录调控序列”或“Rdcvf2转录调控序列”为任何一种通常所发现的与哺乳动物Rdcvf1或Rdcvf2基因相关的转录调控序列，优选在小鼠或人基因组中发现的与Rdcvf2基因相关的转录调控序列。

于此使用的“非人转录调控序列”是指任何不存在于人基因组中的转录调控序列。

术语“多肽”于此可与术语“多肽(多个)”和“蛋白质(一个或多个)”互换使用。

于此使用的本发明多肽的“化学衍生物”是指含有非分子正常部分的额外化学部分的本发明多肽。这些部分可以改进分子的溶解性、吸收率、生物学半衰期等等。或者这些部分可以降低分子的毒性、消除或削弱分子的任何不为人所期望的副作用等等。可介导这些效应的部分公开在例如Remington’s药物科学(Remington’s Pharmaceution Sciences)，第16版，Mack出版公司，Easton，宾夕法尼亚(1980)。

于此使用的“神经保护剂”是指阻止或保护神经细胞使其不发生变性的化合物。“视网膜保护剂”是指阻止或保护视网膜细胞使其不发生变性的化合物。

本发明包括核酸分子，优选DNA分子，例如(1)含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的分离的核酸分子；(2)含有在高严紧条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示分离的DNA杂交的核酸序列的分离的核酸分子；和(3)与上述(1)或(2)杂交的核酸序列。这些杂交条件可以如上所述为高严紧性的或较低严紧性的。当核酸分子为脱氧寡核苷酸(“寡聚体”)时，高严紧条件可以指例如洗涤在6×SSC/0.05％焦磷酸钠中于37℃(对于14个碱基的寡聚体)、48℃(对于17个碱基的寡聚体)、55℃(对于20个碱基的寡聚体)和60℃(对于23个碱基的寡聚体)下进行。对具有不同组成的核酸而言这些严紧条件的适当范围描述在Maniatis等人的文献(如前所引)中，另外在Krause和Aaronson(1991)酶学方法，200：546-556中也有描述。

这些核酸分子可以在例如靶基因调节中作为靶基因反义分子和/或在靶基因核酸序列扩增反应中作为反义引物。此外，这些序列可以作为核酶和/或三股螺旋序列的一部分使用，也用于靶基因调节。再者，这些分子可以作为诊断方法的组分使用，籍此可以检测出RdCVF1或RdCVF2致病等位基因的存在。

本发明也包括(a)含有任何前述编码序列(即有义)和/或它们的互补链(即反义)的载体；(b)含有与调控元件可操作相连的任何前述编码序列的表达载体，其中所述调控元件可以指导该编码序列表达；以及(c)含有任何前述编码序列的遗传工程构建的宿主细胞，其中该编码序列与可以指导其在宿主细胞中表达的调控元件可操作相连。于此使用的调控元件包括但并不限于诱导型和非诱导型启动子、增强子、操纵基因和其它本领域技术人员公知的能够驱动和调节表达的元件。

本发明包括任何于此公开的核酸序列的片断。全长Rdcvf1或Rdcvf2基因的片断可以用作cDNA文库的杂交探针以分离全长基因和分离与Rdcvf1或Rdcvf2基因有高度序列相似性和相似生物学活性的其它基因。这一类型的探针优选具有至少约30个碱基，并且可以含有例如约30到约50个碱基，约50到约100个碱基，约100到约200个碱基，或者大于200(例如300)个的碱基。该探针也可以用于鉴定与全长转录本相对应的cDNA克隆及鉴定含有(包括调节区和启动子区域、外显子和内含子在内的)完整Rdcvf1或Rdcvf2基因的基因组克隆(一个或多个)。一个筛选的例子包括分离Rdcvf1或Rdcvf2基因的编码区，这可以通过使用已知的DNA序列来合成寡核苷酸探针或者对公开在图1至8中的分离的序列进行引物随机引发来完成。可以使用具有本发明基因的互补序列的标记寡核苷酸筛选人cDNA文库、基因组DNA文库以确定文库中与探针杂交的单克隆。

除以上所描述的基因序列外，这些序列的直向同源序列(可能例如存在于其它物种中)可以在不需要过多试验的情况下，利用本领域公知的分子生物学技术鉴定并且容易地分离。此外，在基因组其它基因座位上可能存在编码与这种基因产物的一个或多个结构域具有广泛同源性的蛋白质(同系物)的基因。这些基因也可以通过相似的技术进行鉴定。图8、10、11、12和13中提供了直向同源基因或同源基因的例子。

例如，分离的表达基因序列可以被标记并用于筛选由获得自目的生物体的mRNA所构建的cDNA文库。当cDNA文库所来源的生物体与标记序列所来源的生物体不同时，杂交条件为低严紧条件。另外，利用适当的低严紧条件，标记片断也可以用于筛选来自目的生物体的基因组文库。这些低严紧条件为本领域技术人员所公知，并且依赖于文库和标记序列所来源的特定生物体的系统发生的不同，这些低严紧条件可以进行可预见的改变。有关这些条件的指导参见例如Sambrook等人(以上所引)。

此外，可以利用2个简并寡核苷酸引物池进行PCR来分离先前未知的表达基因类序列，所述引物池的设计基于目的基因内的氨基酸序列进行。反应的模板可以是通过mRNA的反转录而获得的cDNA，所述mRNA可以制备自已知或怀疑表达同源物或剪切变体的人或非人细胞系或组织。

将PCR产物亚克隆并测序以保证所扩增序列为具有表达基因样核酸序列的序列。随后可以通过多种方法利用PCR片断分离全长cDNA克隆。例如，可以将扩增片断标记并用于筛选噬菌体cDNA文库。另外，标记的片断也可以用于筛选基因组文库。

PCR技术也可以被利用来分离全长的cDNA序列。例如，可以按照常规技术将RNA从适当的细胞或组织源中分离。利用对扩增片断最5’端特异的寡核苷酸引物来引发第一链合成，进行RNA的反转录反应。随后应用标准末端转移酶反应利用鸟嘌呤给产生的RNA/DNA杂合体“加尾”，利用RNAaseH消化杂合体，并且随后利用多聚-C引物引发第二链合成。这样，就可以很容易地分离到扩增片断上游的cDNA序列。所使用的克隆策略的综述参见例如Sambrook等人，1989，前述引文。

当鉴定到的差异表达基因为正常或野生型基因时，这一基因可以用于分离该基因的突变等位基因。这种分离优选在已知或怀疑具有遗传基础的生理过程和病症中进行。突变等位基因可以从已知或怀疑具有对疾病症状有作用的基因型的个体中分离。随后突变等位基因和突变等位基因产物可以在下述诊断测定系统中使用。

突变基因的cDNA可以使用例如RT-PCR分离，所述RT-PCR是本领域技术人员所公知的技术。在这种情况下，第一cDNA链可以通过将oligo-dT寡核苷酸(或随机六聚体)与分离自特定组织的mRNA杂交，并通过利用反转录酶延伸新链而合成，所述特定组织已知或被怀疑在推定携带该突变等位基因的个体中表达此突变基因。随后cDNA第二链的合成利用与正常基因5’末端特异杂交的寡核苷酸(或任何其它方法)进行。随后利用这两个引物通过PCR扩增得到产物，并将其克隆进适当的载体并通过本领域技术人员公知的方法进行DNA序列分析。通过将突变基因的DNA序列与正常基因的DNA序列相比较，可以确定出对突变基因产物的功能丢失或改变起作用的突变。

另外，可以利用来自特定组织的DNA或RNA构建和筛选基因组或cDNA文库，所述特定组织是指在怀疑携带突变等位基因的个体中已知或被怀疑表达目的基因的组织。随后将该正常基因或其任何适当的片断标记并且用作探针鉴定文库中相应的等位基因突变体。随后将含有这一基因的克隆通过本领域常规步骤纯化，并进行如上所述的序列分析。

另外，利用分离自特定组织的DNA或合成自特定组织的cDNA可以构建表达文库，所述特定组织是指在怀疑携带突变等位基因的个体中已知或被怀疑表达目的基因的组织。这样，就可以表达由推定的突变组织产生的基因产物并利用标准抗体筛选技术联合抗正常基因产物的抗体对其进行筛选，见如下所述。(筛选技术参见例如Harlow，E.和Lane等人主编，1998，“抗体：实验室手册”(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，冷泉港。)在突变导致表达的基因产物具有改变的功能(例如由错义突变导致)的情况下，多克隆抗体群有可能与突变基因产物发生交叉反应。通过与这些标记的抗体的反应检测出的文库克隆可以按如上所述被纯化并进行序列分析。

差异表达基因产物包括由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13中所示核苷酸序列编码的蛋白质，且特别是这样的多肽，该多肽就是或包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列或其片断。

另外，表达基因的产物可以包括本身为功能等价基因产物的蛋白质。该等价基因产物可以在上述差异表达基因序列所编码的氨基酸序列内含有导致沉默突变的氨基酸残基缺失、添加或替代，由此产生功能等价差异表达基因产物(多态性)。氨基酸替代可以基于所涉及残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性特征中的相似性并且通过与其它物种来源的氨基酸序列进行比较而实施。

例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；以及带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。此处使用的“功能等价”可以指能够与以上所述的差异表达基因序列所编码的内源差异表达基因产物展示出基本相似的体内或体外活性的蛋白质或多肽。“功能等价”也可以指能够与内源差异表达基因产物的相应部分以相似方式和其它细胞或细胞外分子相互作用的蛋白质或多肽。例如，“功能等价”肽在免疫测定中能够减少抗体与内源蛋白质中的相应肽(即这样的肽，其氨基酸序列被修饰后获得此“功能等价”肽)的结合或与内源蛋白质本身的结合，其中所述抗体为针对此内源蛋白质的相应肽产生的抗体。等摩尔浓度的功能等价肽可以使相应肽的上述结合至少减少约5％，优选约5％到10％，更优选约10％到25％，甚至更优选约25％到50％，并且最优选约40％到50％。

差异表达基因产物可以利用本领域公知的技术通过重组DNA技术产生。因此，本文描述制备本发明差异表达基因的多肽和肽的方法，该方法通过表达编码差异表达基因序列的核酸进行。可以使用本领域技术人员所公知的方法来构建含有表达基因蛋白质编码序列和适当的转录/翻译调控信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术以及体内重组/遗传重组。参见，例如Sambrook等人(1989，前述引文)和Ausubel等人(1989，前述引文)中所描述的技术。另外，能够编码表达基因蛋白质序列的RNA或cDNA可以利用例如合成仪化学合成。参见，例如“寡核苷酸合成”(Oligonucleotide Synthesis)(1984，Gait，M.J主编，IRL出版社，牛津)中所描述的技术，所述“寡核苷酸合成”特此全部引用作为参考。

本发明的差异表达基因编码序列可以利用多种宿主表达载体系统进行表达。这些宿主表达系统不仅是运载体也是细胞，通过此运载体目的编码序列可以得以产生并随后被纯化，而当利用适当的核苷酸编码序列转化或转染所述细胞后，该细胞可以在原位表达本发明的差异表达基因蛋白质。这些宿主载体系统包括但并不限于，用含有差异表达基因蛋白质编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或柯斯质粒DNA表达载体转化的微生物诸如细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(B.subtilis))；用含有差异表达基因蛋白质编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酿酒酵母属(Saccharomyces)，毕赤酵母属(Pichia))；用含有差异表达基因蛋白质编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有差异表达基因蛋白质编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有差异表达基因蛋白质编码序列的重组质粒转化载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；含有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3)，该重组表达构建体含有来自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、巨细胞病毒早期基因启动子)。

也可以利用其本身具有Rdcvf1或Rdcvf2基因的细胞表达RDCVF1或RDCVF2。这种表达的方法在例如美国专利5,641,670、5,733,761、5,968,502和5,994,127中详述，所有这些专利特此全部引用作为参考。通过美国专利5,641,670、5,733,761、5,968,502和5,994,127中任意一项的方法而被诱导表达RDCVF1或RDCVF2的细胞可以植入活动物的期望组织以增加该组织中RDCVF1或RDCVF2的局部浓度。

在细菌系统中，可以依据所表达的差异表达基因蛋白质的预期用途，有利地选择多种表达载体。例如，当为了生成抗体或筛选肽文库而需要产生大量的这种蛋白质时，就希望得到这样的载体，该载体可以例如指导高水平地表达可方便地纯化的融合蛋白质产物。这些载体包括但并不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，1983，EMBO J.2：1791)和pIN载体(Inouye&Inouye，1985，核酸研究(Nucleic Acids Res.)13：3101-3109；Van Heeke & Schuster，1989，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264：5503-5509)等等。在上述pUR278载体中，差异表达基因蛋白质编码序列可以与lac Z编码区以符合阅读框的方式独立地连接至载体中，由此产生融合蛋白质。PGEX载体也可以用于表达与谷胱甘肽S-转移酶(GST)形成融合蛋白质形式的外源多肽。通常，这些融合蛋白质可溶并且可以从裂解细胞中容易地纯化，所述纯化可以通过谷胱甘肽琼脂糖小珠的吸附，然后通过在游离谷胱甘肽存在下的洗脱而实现。PGEX载体设计含有凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点，这样通过利用这些内肽酶可以将克隆的靶基因蛋白质从GST部分中释放出来。

利用特定载体可以从任何期望的基因中选择启动子区域，所述载体在用于导入候选启动子片断(即可能含有启动子的片断)的限制性位点的下游含有缺少启动子区域的报告转录单位，例如氯霉素乙酰转移酶(“cat”)或萤光素酶转录单位。众所周知，向载体的cat或萤光素酶基因上游的限制性位点导入含有启动子的片断会导致CAT或萤光素酶活性的产生，这可以通过标准的CAT试验或萤光计检测。适于这一目的的载体为人所公知并可以容易地得到。三种这样的载体是pKK232-8、pCM7和pGL3(Promega，E1751，Genebank Ass n°u47295)。因此，用于表达本发明多核苷酸的启动子不仅仅包括已知和可容易得到的启动子，还包括可通过上述技术利用报告基因测定法容易地获得的启动子。

在已知细菌启动子中，适合本发明多核苷酸和多肽表达的启动子为大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、T5tac启动子、λPR、PL启动子和trp启动子。在已知真核启动子中，适合本方面的启动子为CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒(诸如Rous肉瘤病毒“RSV”)的LTR启动子和金属硫蛋白启动子(例如小鼠金属硫蛋白-I启动子)。

在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)是可以用作表达外源基因的载体的几种昆虫系统之一。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。差异表达基因的编码序列可以单独克隆至病毒的非必需区域并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的调控之下。差异表达基因的编码序列的成功插入将导致多角体蛋白基因失活并产生无包含体重组病毒(即缺少由多角体蛋白基因编码的蛋白质外壳的病毒)。随后将这些重组病毒用于感染草地贪夜蛾细胞，在所述细胞中该插入基因将得以表达(例如参见Smith等人，1983，病毒学杂志(J.Virol.)46：584；Smith，美国专利号4,251,051)。

在哺乳动物宿主细胞中，可以使用多种基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况中，目的差异表达基因编码序列可以被连接至腺病毒转录/翻译调控复合体，例如晚期启动子和三联前导序列上。随后可以将此嵌合基因通过体外或体内重组插入腺病毒基因组。在病毒基因组非必需区域(例如E1或E3区)中的插入导致重组病毒仍可存活并且能够在感染的宿主中表达差异表达基因蛋白质(例如参见Logan & Shenk，1984，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：3655-3659)。为有效翻译插入的差异表达基因编码序列，也可能需要特异的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在将包括自身的起始密码子和相邻序列的完整的差异表达基因插入合适的表达载体中时，可以不需要额外的翻译调控信号。然而，在仅插入差异表达基因编码序列的一部分时，就必须提供外源翻译调控序列，包括可能地ATG起始密码子。此外，起始密码子必须与所期望的编码序列的阅读框同相，这样才能保证完整插入片断的翻译。这些外源翻译调控信号(Kozack序列)和起始密码子可以有多种来源，包括天然的和人工合成的。表达的效率可以通过包括适当的转录增强元件、转录终止子等等增强(参见Bittner等人，1987，酶学方法(Methodsin Enzymol.)153：516-544)。

选择用于在宿主细胞中表达的合适的载体和启动子的方法为人所共知，并且用于表达载体构建、向宿主中导入载体和在宿主中实现表达的必需技术本身为本领域常规技术。

一般地，重组表达载体包括复制起点、指导下游结构序列转录的来自高表达基因的启动子和选择标志，该选择标志允许在细胞暴露于载体后分离含有载体的细胞。

另外，可以选择宿主细胞株，以便按特定预期方式调节插入序列的表达或者修饰和加工基因产物。蛋白质产物的这些修饰(如糖基化)和加工(如切割)对蛋白质的功能而言至关重要。不同的宿主细胞具有特征性的特异机制用来进行蛋白质的翻译后加工和修饰。可以选择适当的细胞系或宿主系统来保证表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为此，可以使用真核宿主细胞，该细胞具有正确加工初级转录物及糖基化和磷酸化基因产物的细胞机器。这些哺乳动物宿主细胞包括但并不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38等等。

为达到长时间、高产量生产重组蛋白质的目的，优选稳定表达。例如，可以构建稳定表达差异表达蛋白质的细胞系。除利用含有病毒复制起点的表达载体外，可以利用由适当的表达调控元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等等)调控并具有可选择标志的DNA转化宿主细胞。在导入外源DNA后，可以让构建的细胞在丰富培养基上生长1到2天，随后转移至选择培养基。重组质粒中的可选择标志赋予了选择抗性，并使得细胞可以将质粒稳定整合至其染色体上并生长形成转化灶，该转化灶反过来可以被克隆并扩大成细胞系。这一方法可以有利地用于构建表达差异表达蛋白质的细胞系。这些工程化的细胞系特别可以用于筛选和评价影响差异表达蛋白质内源活性的化合物。这些稳定的细胞系可以直接或经包囊化后作为细胞治疗的方法。

可以使用多种选择系统，包括但不限于在tk^-、hgprt^-或aprt^-细胞中分别应用的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Wigler等人，1977，细胞(Cell)11：223)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(Szybalska & Szybalski，1962，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48：2026)以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因(Lowy等人，1980，细胞(Cell)22：817)。另外，也可以将抗代谢物抗性作为选择的基础，对dhfr基因而言，其赋予氨甲蝶呤抗性(Wigler等人，1980，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77：3567；O′Hare等人，1981，美国国家科学院院报，78：1527)；对gpt基因而言，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，1981，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78：2072)；对neo基因而言，其赋予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin等人，1981，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)150：1)；以及对hygro基因而言，其赋予潮霉素抗性(Santerre等人，1984，基因(Gene)30：147)。

可供选择的融合蛋白质系统可以使在人细胞系中表达的非变性融合蛋白质容易地得以纯化(Janknecht等人，1991，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：8972-8976)。在该系统中，可以将目的基因亚克隆至痘苗重组质粒中以使该基因的开放阅读框在翻译时融合至由6个组氨酸残基组成的氨基端标签上。将感染重组痘苗病毒的细胞的提取物上Ni²⁺氮川乙酸琼脂糖柱并且利用含咪唑的缓冲液将带组氨酸标签的蛋白质选择性洗脱下来。

当差异表达蛋白质在诸如下述的测定系统中作为组分使用时，可以将差异表达蛋白质直接或间接标记以便于差异表达蛋白质与测试底物间形成的复合体的检测。可以使用多种合适的标记系统的任意一种，其包括但并不限于放射性同位素如¹²⁵I；当暴露于底物时生成可检测热量信号或光的酶标记系统；以及荧光标记。

当使用重组DNA技术产生供这种测定系统使用的差异表达蛋白质时，优选构建便于标记、固定和/或检测的融合蛋白质。

间接标记涉及使用可特异地与任一种差异表达基因产物结合的蛋白质，诸如标记的抗体。这些抗体包括但并不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链抗体及Fab片断以及由Fab表达文库产生的片断。

在另一实施方案中，利用基因治疗手段，通过施用含有编码RDCVF1或RDCVF2蛋白质或其功能衍生物的序列的核酸促进视锥功能。基因治疗是指通过向对象施用核酸来进行的治疗。在本发明的这一实施方案中，核酸产生其编码蛋白质，该蛋白质通过促进视锥功能介导治疗作用。

本领域可用的任意一项基因治疗方法都可以用于本发明。以下详细描述示例性方法。

在一个优选方面，治疗剂含有Rdcvf1或Rdcvf2核酸，该核酸为可以在适当宿主中表达RDCVF1或RDCVF2蛋白质或其片段或嵌合蛋白的表达载体的一部分。具体地，此核酸具有可操作地与Rdcvf1或Rdcvf2编码区域相连的启动子，所述启动子可为诱导型或组成型的并且任选地具组织特异性。在另一特定实施方案中，使用下述核酸分子，在该分子中Rdcvf1或Rdcvf2编码序列以及任何其它期望序列被可以促进在基因组期望位点上发生同源重组的区域侧翼包围，由此使Rdcvf1或Rdcvf2核酸可以在染色体内表达(Koller和Smithies，1989，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86：8932-8935；Zijlstra等人，1989，自然(Nature)342：435-438)。

将核酸递送给患者可以通过直接或间接方法，在直接方法中，患者直接暴露于该核酸或带有该核酸的载体，在间接方法中，首先在体外用该核酸转化细胞，然后再将细胞移植入患者体内。这两种方法分别称作体内或离体基因治疗。

在特定实施方案中，核酸直接体内施用，其在体内表达产生编码产物。这可以通过任意一项本领域公知的方法完成，例如可以将核酸构建成适当的核酸表达载体的一部分然后施用以使其成为细胞内的，例如：利用缺陷型或减毒型逆转录病毒或其它病毒载体(腺病毒、腺伴随病毒和慢病毒)感染(参见例如美国专利号4,980,286以及其它下文所提到专利)，直接注射裸DNA或利用微粒轰击(例如基因枪、生物轰击、Dupont)，或通过脂类或细胞表面受体或转染试剂包被、包囊化于脂质体、微粒或微囊中、或者将核酸与已知可进入细胞核的肽相连而施用、或者将核酸与可发生受体介导的内吞作用的配体相连而施用(参见例如美国专利5,166,320、5,728,399、5,874,297和6,030,954，所有专利特此全部引用作为参考)(这可用于靶向特异性表达该受体的靶细胞类型)，等等。在另一实施方案中，可以形成核酸-配体复合体，其中配体包括基因融合病毒肽以破坏内体，使核酸避免被溶酶体降解。在另外的实施方案中，核酸通过靶向特异性受体而体内定位从而实现细胞的特异摄取和表达(参见例如PCT出版物WO92/06180、WO 92/22635、WO 92/20316、WO 93/14188和WO 93/20221)。另外，可以将核酸导入细胞内并通过同源重组整合至宿主细胞DNA中表达(参见例如美国专利5,413,923、5,416,260和5,574,205，以及Zijlstra等人，1989，自然(Nature)342：435-438)。

在一个特定实施方案中使用含有Rdcvf1或Rdcvf2核酸的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见例如美国专利5,219,740、5,604,090和5,834,182)。这些逆转录病毒载体已经被修饰以缺失如下逆转录病毒序列，所述逆转录病毒序列为病毒基因组包装和整合至宿主细胞DNA所不必需的。将基因治疗中使用的Rdcvf1或Rdcvf2核酸克隆至载体，这样便于基因向患者的递送。

腺病毒是另一种可用于基因治疗的病毒载体。腺病毒是用于向呼吸上皮递送基因的特别有吸引力的载体。天然地，腺病毒侵染呼吸上皮，并在那里引起轻微的病症。基于腺病毒的递送系统的其它靶位点有肺、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够侵染非分裂细胞的优势。进行基于腺病毒的基因治疗的方法描述在例如美国专利5,824,544、5,868,040、5,871,722、5,880,102、5,882,877、5,885,808、5,932,210、5,981,225、5,994,106、5,994,132、5,994,134、6,001,557和6,033,8843，所有专利特此全部引用作为参考。

腺伴随病毒(AAV)也被提出用于基因治疗。腺伴随病毒是用于向视网膜递送基因的特别有吸引力的载体。生产和利用AAV的方法描述在例如美国专利5,173,414、5,252,479、5,552,311、5,658,785、5,763,416、5,773,289、5,843,742、5,869,040、5,942,496和5,948,675，所有专利特此全部引用作为参考。

另一基因治疗的方法涉及利用电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染等方法来向组织培养的细胞转移基因。通常，转移的方法包括将可选择标记转移至细胞。随后将细胞置于选择压力下以分离那些已经吸收并且表达该转移基因的细胞。随后将这些细胞直接或经包囊化后递送至患者体内。

在这种实施方案中，在将产生的重组细胞体内施用之前将核酸导入细胞中。这种导入可以通过本领域公知的任意一项方法进行，其包括但并不限于转染、电穿孔、微注射、含有该核酸序列的病毒或噬菌体载体的感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等等。将外源基因导入细胞的多种技术为本领域公知，并且只要受体细胞必需的发育和生理学功能不会被破坏，这些技术均可以用于本发明。该技术应该允许核酸稳定转移至细胞内，以使该核酸可以被所述细胞表达并优选被细胞后代遗传和表达。

所产生的重组细胞可以通过多种本领域公知的方法递送给患者。在一个优选实施方案中，将上皮细胞进行例如皮下注射。在另一实施方案中，重组皮肤细胞可以作为皮肤移植物应用于患者。重组血细胞(例如造血干细胞或祖先细胞)优选通过静脉施用。预计使用的细胞量依赖于预期效果、患者状况等等，并且可以由本领域技术人员确定。

为实现基因治疗而可以导入核酸的细胞包括任何期望的、可得到的细胞类型，并且包括但并不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞、血细胞(例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜伊红细胞、巨核细胞、粒细胞)、各种干细胞或祖先细胞，特别是造血干细胞或祖先细胞，例如获得自骨髓、脐带血、外周血、胎肝等等的造血干细胞或祖先细胞。

在优选实施方案中，用于基因治疗的细胞为患者的自体细胞。

在重组细胞用于基因治疗的实施方案中，将Rdcvf1或Rdcvf2核酸导入细胞，使其在细胞或它们的后代中表达，并且随后将重组细胞施用至体内以获得治疗效果。在一个特定实施方案中，使用干细胞或祖先细胞。任何可被分离并在体外保持的干细胞和/或祖先细胞都可潜在地用于本发明的该实施方案。这些干细胞包括但并不限于造血干细胞(HSC)、上皮组织例如皮肤和肠内衬的干细胞、胚胎心肌细胞、肝脏干细胞(参见例如WO94/08598)和神经干细胞(Stemple和Anderson，1992，细胞(Cell)71：973-985)。

上皮干细胞(ESC)或角质形成细胞可以利用已知的方法获得自例如皮肤和肠内衬等组织(Rheinwald，1980，细胞生物学方法(Meth.Cell Bio.)21A：229)。在例如皮肤等复层上皮组织中，在生发层(最靠近基底层的一层)内通过干细胞的有丝分裂而进行更新。肠内衬中的干细胞使该组织保持快的更新速度。获得自患者或捐献者皮肤或肠内衬的ESC或角质形成细胞可以在组织培养中生长(Pittelkow和Scott，1986，Mayo ClinicProc61：771)。如果ESC由捐献者提供，可能还要使用抑制宿主抗移植物反应性的方法(例如放射治疗、施用药物或抗体以促进适当的免疫抑制)。视网膜干细胞(Tropepe等人，2000，科学(Science)287：2032)。

至于造血干细胞(HSC)，任何可使HSC体外分离、增殖和保持的技术都可以用于本发明该实施方案。可供利用的技术包括(a)从分离自未来宿主或捐献者的骨髓细胞中分离和建立HSC培养物，或(b)使用以前建立的长期HSC培养物(其可能是同种异体的或异种的)。非自体HSC优选与抑制未来宿主/患者的移植免疫反应的方法联合使用。在本发明特定实施方案中，人骨髓细胞可以通过针刺抽吸获自后髂嵴(参见例如Kodo等人，1984，J.Clin.Invest.73：1377-1384)。在本发明优选实施方案中，HSC高度富集或以基本上纯的形式存在。这种富集可以在长期培养前、培养过程中或长期培养后完成，并且可以利用本领域任意一项已知技术完成。骨髓细胞长期培养物的建立和保持可以通过利用例如改良的Dexter细胞培养技术(Dexter等人，1977，细胞生理学杂志(J.Cell Physiol.)91：335)或者Witlock-Witte培养技术(Witlock和Witte，1982，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)79：3608-3612)实现。

在特定实施方案中，为进行基因治疗而导入的核酸包括可诱导启动子，该启动子可操作地连接至编码区域，这样该核酸的表达可以通过控制适当的转录诱导物的存在与否而实现操纵。

此处描述了生产可特异识别一个或多个差异表达基因表位的抗体的方法。这些抗体包括但并不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片断、F(ab’)₂片断、由Fab表达文库产生的片断、抗独特型(抗-Id)抗体以及上述任何一项的表位结合片断。这些抗体可以用于例如检测指纹图谱、靶及生物学样品中的基因，或者，备选地，其可以作为抑制异常靶基因活性的方法。因此，这些抗体可以作为疾病治疗方法的一部分使用，并且/或者可以用作诊断技术的一部分，由此可以通过本领域技术人员所熟悉的方法(参见Forster，RK，Abbott，RL，Gelender，H.(1980)Management of infectious endophthalmitisOphthalmology 87，313-319)，对房水和/或玻璃体取样以测试患者的Rdcvf1或Rdcvf2的不正常水平或者检测Rdcvf1或Rdcvf2不正常形式的存在。

为生产差异表达基因的抗体，可以通过注射差异表达蛋白质或其部分或者通过DNA免疫方法来免疫各种宿主动物。这些宿主动物包括但并不限于兔、小鼠和大鼠等等。依赖于宿主种类，多种佐剂可用于增加免疫学应答，其包括但并不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油性乳剂、匙孔

血蓝蛋白、二硝基苯酚以及潜在有用的人佐剂例如BCG(卡介苗)和小型棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。

多克隆抗体为来自利用抗原免疫的动物血清的异质抗体分子群，上述抗原例如靶基因产物或其抗原性功能衍生物。为生产多克隆抗体，可以通过利用添加了上述佐剂的差异表达基因产物注射来免疫例如以上所述的宿主动物。

单克隆抗体是针对特定抗原的同质抗体群，其可以通过利用任何可允许培养的连续细胞系产生抗体分子的技术获得。这些技术包括但并不限于Kohler和Milstein的杂交瘤技术(1975，自然(Nature)256：495-497；以及美国专利号4,376,110)、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人，1983，今日免疫学(Immunology Today)4：72；Cole等人，1983，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80：2026-2030)以及EBV杂交瘤技术(Cole等人，1985，单克隆抗体与癌症治疗(Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy)，Alan R.Liss公司，77-96)。这些抗体可以为任何免疫球蛋白种类，包括Ig G、Ig M、Ig E、Ig A、Ig D以及它们的任何亚类。产生本发明mAb的杂交瘤可以在体外或体内培养。体内产生高效价mAb的方法为目前优选的生产方法。

另外，也可以使用生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，1984，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：6851-6855；Neuberger等人，1984，自然(Nature)312：604-608；Takeda等人，1985，自然(Nature)314：452-454)，其通过将具适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有适当生物学活性的人抗体分子的基因拼接在一起而进行。嵌合抗体是其中不同的部分来自不同的动物种类的分子，例如那些具有来自小鼠mAb的可变或高变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。

备选地，可以采用产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778；Bird，1988，科学(Science)242：423-426；Huston等人，1988，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85：5879-5883；以及Ward等人，1989，自然(Nature)334：544-546)来生产差异表达基因的单链抗体。单链抗体可通过使Fv区域的重链和轻链片断借助氨基酸桥相连产生单链多肽而形成。

最优选地，采用用于生产“人源化抗体”的技术来生产于此公开的多肽、片断、衍生物和功能等价物的抗体。这些技术公开在美国专利号5,932,488、5,693,762、5,693,761、5,585,089、5,530,101、5,910,771、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,545,580、5,661,016和5,770,429中，所有这些公开特此全部引用于此作为参考。

识别特异表位的抗体片断可以通过公知的技术产生。例如，这些片断包括但并不限于：通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)₂片断和通过还原F(ab’)₂片断的二硫键而生成的Fab片断。另外，可以构建Fab表达文库(Huse等人，1989，科学(Science)，246：1275-1281)以进行具有期望特异性的单克隆Fab片断的快速而容易的鉴定。

为便于检测，特别优选使用三明治测定法，该测定法存在多种变异方式。所有方式均包括在本发明范围内。

例如，在一般的正向测定中，将未标记抗体固定于固体基质上，并将测试样品与结合的分子接触。经过适当的孵育时间，该时间将足够抗体抗原二元复合体形成。这时，再加入用能够诱导可检测信号的报告分子标记的第二抗体并孵育，孵育时间应足够抗体-抗原-标记抗体三元复合体的形成。将任何未反应物质洗去，并通过观察信号确定抗原的存在或者通过与含有已知量抗原的对照样品比较来定量。正向测定的变异方式包括同时测定和反向测定，其中在同时测定中样品和抗体同时加至结合的抗体中；而在反向测定中标记的抗体与待测试样品首先混合、孵育然后加至未标记的表面结合抗体中。这些技术为本领域技术人员所公知，并且显而易见可以进行小的改动。于此使用的“三明治测定法”意味着包括基于此基本的两位点技术的所有变异方案。对本发明的免疫测定而言，仅有的限制因素是未标记和标记的抗体应为RdCVF1或RdCVF2特异性抗体。

在这种测定中最常使用的报告分子为酶或者含荧光团或放射性核素的分子。在酶免疫测定的案例中，将酶偶联至第二抗体，这通常通过戊二醛或过碘酸实现。然而，正如易于意识到的，存在相当大量不同的连接技术，它们为本领域技术人员所公知。通常使用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等等。对于与特定酶一起使用的底物，一般选择在相应酶的水解作用后可以产生可检测的颜色改变的底物。例如对硝基苯磷酸适合与碱性磷酸酶缀合物一起使用；对过氧化物酶缀合物而言，通常使用1，2-苯二胺或甲苯胺。也可以使用荧光底物，其生成荧光产物而不是上文提及的生色底物。然后将含有适当底物的溶液加至抗体-RdCVF1-或RdCVF2-标记抗体三元复合体中。底物与连接至第二抗体的酶反应，产生定性的可见信号，该信号可以进一步通过通常地分光光度计定量以评价血清样品中Rdcvf1或Rdcvf2的存在量。

备选地，可以将荧光化合物(例如荧光素和罗丹明)在不改变抗体的结合能力的条件下化学偶联至抗体。当利用特定波长的光照射激活后，荧光色素标记的抗体吸收光能，诱导分子进入激发状态，并随后发射出特征长波长的光。该发射光在光学显微镜下表现为可观测的特征颜色。免疫荧光和EIA技术在本领域均是极为成熟的技术并且为本方法所特别优选。然而，本发明也可以使用其它报告分子，例如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。对本领域技术人员而言，如何改变方法以适应所需用途是显而易见的。

本发明也涉及本发明多核苷酸作为诊断试剂的用途。当基因编码的多肽选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14所示多肽时，对与功能不良相关的基因的突变形式的检测将提供诊断工具以增加或者限定疾病或者疾病易感性的诊断结果，其中所述疾病为由于该基因的低表达、过表达或改变的时空表达而导致，该基因中带有突变的个体可以通过多种技术在DNA水平上检测。

用于诊断的核酸可以从对象细胞中获取，例如从血液、尿液、唾液、活检组织或尸体解剖材料获取。基因组DNA可以直接用于检测或者可以在分析前通过利用PCR或者其它扩增技术进行酶学扩增。RNA或cDNA也可以以相似方式使用。缺失和插入可以通过与正常基因型比较扩增产物大小的改变来检测。点突变可以通过将扩增DNA与标记核苷酸序列杂交来鉴定。利用RNase消化或者熔解温度不同可以区分完全配对序列和错配的双链体。DNA序列的差异也可以通过DNA片断在变性或非变性(SSCP)胶上的电泳迁移率的变化或者通过DNA直接测序来检测(例如，Myers等人，科学(Science)(1985)230：1242)。在特定位置的序列改变也可以利用核酸酶保护试验，例如RNase和S1保护或者化学裂解方法(参见Cotton等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad Sci USA)(1985)85：4397-4401)揭示。在另一实施方案中，可以构建含有Rdcvf1或Rdcvf2核苷酸序列或其片断的寡核苷酸探针阵列用于例如遗传突变的有效筛选。阵列技术方法为人所共知并且具有一般适用性，可以用于解决分子遗传学的多种问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异性(参见例如M.Chee等人，科学(Science)274卷，610-613(1996))。

这些诊断试验提供了诊断或者确定疾病易感性的方法，所述方法通过利用本文描述的方法检测Rdcvf1或Rdcvf2基因上的突变进行。另外，这些疾病可以通过下述方法诊断，所述方法包括确定来自对象的样品中Rdcvf1或Rdcvf2的不正常表达：所述表达可以在RNA水平上利用任何本领域公知用于定量多核苷酸的方法测量，这些方法例如核酸扩增(例如PCR、RT-PCR)、RNase保护、Northern印迹和其它杂交方法。可以用于确定来自宿主的样品中的蛋白质(例如本发明多肽)水平的测定技术为本领域技术人员所公知。这些测定方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、Western印迹分析和ELISA测定。

因此，另一方面，本发明涉及诊断试剂盒，其包括：

(a)本发明多核苷酸，优选编码如下多肽的核苷酸序列或其片断，所述多肽选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14；

(b)与(a)互补的核苷酸序列；

(c)本发明多肽，优选多肽或其片断；或

(d)本发明多肽的抗体，优选针对选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14的多肽的抗体。

应该理解，在任何这种试剂盒中，(a)、(b)、(c)或者(d)可以组成基本组分。这种试剂盒将用于疾病的诊断或者疾病易感性的诊断，所述疾病特别是色素性视网膜炎、年龄相关黄斑变性、巴比综合征、巴科综合征、贝斯特病、脉络膜瘤、螺旋状萎缩、先天性黑矇、雷夫叙姆综合征、青年遗传性黄斑变性和厄舍综合征。本发明核苷酸序列在染色体定位上也颇有价值。染色体定位可以通过对制备自一组杂合体细胞系(小鼠-仓鼠)的DNA进行PCR获得。人基因的染色体定位可以利用同线性(syntheny)从小鼠基因的定位推测出(McCarthy等人(1997)，基因组研究，7，1153)。该序列将特异性靶向单个染色体的特定位置并且可以与其杂交，所述染色体包括小鼠和人染色体。本发明相关序列的染色体作图是将这些序列与基因相关疾病相互关连的重要第一步。一旦序列定位至精确的染色体位置，染色体上序列的物理位置即可以与遗传图数据相联系。这些数据可以在例如V.McKusick，人类孟德尔遗传(Mendelian Inheritance in Man)(可通过Johns Hopkins University Welch Medical Library，RetNet在线获得)上发现。随后在相同染色体区域定位的疾病与基因之间的关系可通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传)鉴定。

也可以确定患病和未患病个体间cDNA或基因组序列的差异。如果突变在一些或者所有患病个体中被发现而没有在任何正常个体中发现，那么该突变就有可能是该疾病的致病因素。

本发明另外的实施方案涉及为实现上述任意一项治疗效果而施用药物组合物以及可药用载体。这种药物组合物可以由Rdcvf1或Rdcvf2、模拟物或拮抗剂组成。组合物可以单独施用或者与至少一种其它药剂(例如稳定化合物)联合施用，并且其可以在任何无菌、生物相容的药用载体中施用，所述载体包括但并不限于盐水、缓冲盐溶液、葡萄糖和水。组合物可以单独施用给患者，或者联合其它药剂、药物或者激素一起施用。

本发明所包括的药物组合物可以通过多种途径施用：例如生物活性蛋白质透过巩膜递送至脉络膜和视网膜(Ambati等人(2000)眼科研究与视觉科学(Investigative Ophthalmology and Visual Science)41，1186)。局部眼用制剂(包括眼用溶液、悬液和软膏)的配制为本领域技术人员所公知(参见Remington’s药物科学，第18版，86章，1581-1592页，Mack出版公司，1990)。也可以利用其它的施用方式，包括房内(intracameral)注射(其可以直接注射至眼前房或者直接至玻璃体房)、结膜下注射和球后注射，并且生产适应这些施用方式的眼科制剂的方法也为人所公知。

本申请书中所使用的“眼外”是指眼表面和眼球和眼睑之间的(外部)空间。眼外区域的例子包括眼睑穹窿(fornix或cul-de-sac)、结膜表面和角膜表面。这一位置在所有眼组织的外部，并且接近这一区域并不需要侵入性的方法。眼外系统的例子包括插入物(insert)和“局部”用滴剂、凝胶或软膏，它们可被用于向这些区域递送治疗物质。眼外装置通常可被容易地移去，甚至患者自己亦可将其除去。

以下所述专利公开了用于向眼外区域施用药物的眼外系统。Higuchi等人在美国专利号3,981,303、3,986,510和3,995,635中公开了含有药物的可生物降解的插入物。插入物可以制成不同形状以使其停留在眼球的穹窿，眼球和眼睑之间的眼外空间。几种常见的生物相容性多聚体作为适合制备这种装置的材料被公开。这些多聚体包括藻酸锌、多聚(乳酸)、多聚(乙烯醇)、多聚(酐)和多聚(乙醇酸)。这些专利也描述了具有减小的药物渗透并具容纳药物制剂的中空室的膜包被装置。

Theeuwes的美国专利号4,217,898公开了可用于控制药物递送的微孔贮器。这些装置眼外放置在眼穹窿内。有意义的多聚体系统包括多聚(乙烯氯)-共-多聚(乙酸乙烯酯)共聚体。Kaufman在美国专利号4,865,846和4,882,150中公开了一种眼科药物递送系统，其含有至少一种可生物消解物质或用于结膜囊的软膏载体。该专利公开了适用作递送系统的多聚体系统，例如聚交酯、聚乙醇酸交酯、聚(乙烯醇)和交联胶原。

在现在描述的RDCVF1或RDCVF2蛋白质产物在治疗视网膜疾病或损伤的用途中，局部应用的眼科制剂还可有利地包括促进治疗剂向眼内渗透或转移的药剂。这种药剂为本领域所公知。例如，Ke等人在美国专利号5,221,696中公开了增强眼科制剂渗透穿过角膜的物质的使用。

眼内系统为那些适合在眼组织层内部、之间或周围的任何组织区室中使用的系统。这些位置包括结膜下(临近眼球的眼粘膜之下)、眼窝(眼球后)和眼房内(眼球本身的房室内)。与眼外系统相反，接近这些区域需要由注射或移植构成的侵入式方法。

下述专利中公开了眼内装置。Wong在美国专利号4,853,224中公开了可以导入眼房室的微囊化药物。可在这一系统中使用的多聚体包括聚酯和聚醚。Lee在美国专利号4,863,457中公开了一种可生物降解的装置，其经过手术植入眼内用于治疗剂的缓慢释放。该装置设计用于手术植入结膜(眼球粘膜下)。Krezancaki在美国专利号4,188,373中公开了在人体温条件下成凝胶的药用载体。这种载体为药物和来自合成衍生物的胶或纤维素的水悬液。Haslam等人在美国专利4,474,751和4,474,752中公开了在室温下呈液态而在体温下呈凝胶态的多聚体-药物系统。在这种系统中合适的多聚体包括聚氧乙烯和聚氧丙烯。Davis等人在美国专利号5,384,333中公开了可提供长时间药物释放的注射用可生物降解药物递送多聚体。该药物组合物是利用在可生物降解多聚体基质中的药学活性剂制成，其中多聚体基质在温度为20℃到37℃之间时为固体，而在温度为38℃到52℃之间时为可流动的。此药物递送多聚体并不限于可溶性或液体药物制剂的递送。例如，多聚体可以用作基质以使含有药物的微球、脂质体或其它微粒结合的药物稳定并保持在注射部位。

用于眼内注射的特别适合的载体为无菌蒸馏水，其中RDCVF1或RDCVF2蛋白质产物配制成可适当保存的无菌等渗溶液的形式。而另一眼科制剂可能涉及RDCVF1或RDCVF2蛋白质产物与如下药剂的制剂形式，所述药剂为例如可注射微球或脂质体，其提供蛋白质的缓慢或持续释放，该制剂可以随后以贮存注射剂形式递送。用于眼内导入RDCVF1或RDCVF2蛋白质产物的其它合适方式包括含有RDCVF1或RDCVF2蛋白质产物的可植入的药物递送装置。

本发明眼科制剂(特别是局部用制剂)可以包括其它组分，例如可眼用防腐剂、张力剂、共溶剂、湿润剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂、抗氧化剂和表面活性剂，这些均为本领域公知。例如，合适的张力增强剂包括碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露醇、山梨醇等等。优选加入足量的张力增强剂以使滴入眼中的制剂为低渗或基本等渗的。合适的防腐剂包括但并不限于苯扎氯胺、乙基汞硫代水杨酸钠、苯乙醇、羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸等等。过氧化氢也可用作防腐剂。合适的共溶剂包括但并不限于甘油、丙二醇和聚乙二醇。合适的络合剂包括咖啡碱、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精。合适的表面活性剂或湿润剂包括但并不限于脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯80)、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊等等。缓冲液可以为常规缓冲液，例如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、重碳酸盐或Tris-HCl。

制剂组分以眼外或眼内施用位点可接受的浓度存在。例如，缓冲液用于维持组合物在生理pH或稍低的pH，一般pH范围为约5到约8。其它制剂组分可以包括用于延长眼外施用的治疗剂的眼内存留的物质，这样有助于达到最大局部接触和促进吸收。适当的物质包括用于增加眼科制剂的粘性的多聚体或凝胶形成物质。脱乙酰壳多糖是在缓释液体眼科药物制剂中作为眼部释放速率控制剂的特别合适的物质(参见美国专利5,422,116，Yen等人)。对于眼科治疗剂的眼内控释(例如持续和延长递送)而言，本发明制剂的适宜度可以通过多种本领域公知的方法确定，例如在控释杂志(Journal of Controlled Release)，6：367-373，1987中所描述的方法以及其变异方法。

除活性成分外，这些药物组合物也可以含有适当的可药用载体，包括赋形剂和辅助剂，这些可药用载体可以有利于活性组分加工成药物制剂。有关配制和施用的进一步的细节可参见最新版的Remington’s药物科学(Maack出版公司，Easton，Pa)。

用于口服的药物组合物可以利用本领域公知的可药用载体配制成适于口服的剂量形式。这些载体使药物组合物可以配制成可被患者吸收的片剂、药丸、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬液等等。

用于口服的药物制剂可以通过如下方式获得：混合活性组分和固体赋形剂，任选地研磨得到的混合物并在加入适当的辅助剂后(如果需要)加工颗粒混合物得到片剂或锭剂的核芯。适当的赋形剂为碳水化合物或蛋白质填充剂，例如糖(包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇)、淀粉(来自玉米、小麦、水稻、马铃薯或其它植物)、纤维素(例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羰甲基纤维素钠)、树胶(包括阿拉伯树胶和黄芪胶)和蛋白质(例如明胶和胶原)。如果需要，可以加入崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、褐藻酸或其盐(例如藻酸钠)。

锭剂核芯部分可以与适当的包衣材料联合使用，所述材料例如浓缩的糖溶液，其也可以含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、紫胶漆溶液以及适当的有机溶剂或溶剂混合物。为进行产品标识或表征活性化合物的量(即剂量)，可以向片剂或锭剂包衣中加入着色剂或色素。

可用于口服的药物制剂包括明胶制成的轻压填充型(push-fit)胶囊以及由明胶和包衣(例如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊。轻压填充型胶囊可以含有活性成分，这些成分与填充剂或粘合剂(例如乳糖或淀粉)、滑润剂(例如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂相混和。在软胶囊中，活性化合物可以在稳定剂存在或不存在的条件下溶解或悬浮于适当的液体，例如脂肪油、液体或者液体聚乙二醇中。

适于肠胃外施用的药物制剂可以在水溶液中配制，优选在生理相容性缓冲液例如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理缓冲盐溶液中配制。水性注射悬液可以含有增加悬液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。另外，活性化合物的悬液可以制备成适当的油性注射悬液的形式。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或者脂质体。非脂类聚阳离子氨基多聚体也可以用于递送。任选地，悬液也可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解性以允许制备高浓度溶液的试剂。

对局部或经鼻施用而言，适于待渗透的特定屏障的渗透剂可以在制剂中使用。这些渗透剂为本领域公知。

本发明药物组合物可以利用本领域公知的方法制备，例如通过常规的混和、溶解、制粒、成锭、研碎、乳化、胶囊化、截留(entrapping)或者冻干等过程。

药物组合物可以以盐的形式提供，并且可以与许多种酸成盐，所述酸包括但并不限于盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等等。盐形式倾向于在水或者其它质子溶剂中比其相应的游离碱形式更容易溶解。在其它情况中，优选的制剂可以是含有下述物质之任意一种或者所有的冻干粉末：1-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖和2-7％甘露醇，pH 4.5-5.5。该冻干粉在使用前与缓冲液混和。

药物组合物一经制备，其可以在合适的容器中存放并标上其可以治疗的适应症。对Rdcvf1或Rdcvf2的给药而言，这种标记应包括施用的量、频率和方法。

适于本发明使用的药物组合物包括这样的组合物，其中活性成分以可达到预计目的的有效量存在。有效剂量的确定为本领域技术人员所公知。

对任何化合物而言，治疗有效剂量最先可以在细胞(例如瘤细胞)培养试验中或者在动物模型中评价。所述动物模型通常为小鼠、兔、狗或者猪。这些动物模型也可用于确定适当的浓度范围和施用途径。随后这些信息可被用于确定在人类中施用时的有用剂量和途径。

治疗有效剂量是指能够改善症状或病症的活性成分的量，所述活性成分例如Rdcvf1或Rdcvf2或其片断、Rdcvf1的抗体、激动剂。治疗效果和毒性可以通过在细胞培养或实验动物中利用标准的药理学方法确定，例如ED50(50％群体中的治疗有效剂量)和LD50(50％群体的致死剂量)。毒性和治疗效果的剂量比称为治疗指数，并且它可以由比值LD50/ED50来表示。优选那些展现出大的治疗指数的药物组合物。获自细胞培养试验和动物研究的数据可用于确定人用剂量的范围。这些组合物中含有的剂量优选在如下循环浓度范围内，该范围包括ED50且几乎没有或完全没有毒性。该剂量在此范围内的变动取决于所使用的剂型、患者的敏感性以及施用途径。

确切的剂量由医师根据需要治疗的对象的相关因素确定。可以调整剂量和施用方法以提供足够水平的活性部分或者维持所期望的效果。可以考虑的因素包括疾病的严重性、对象的一般健康状况、对象的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频度、联用的药物、反应敏感性以及对该疗法的耐受/应答。根据特定制剂的半衰期和清除速度，长效药物组合物可以每3到4天、每周或每两周施用一次。

依赖于所选的施用途径，正常剂量的量可以从0.1到100,000微克，直至总剂量为约1克。有关具体剂量和递送方法的指导在文献中提供，并且通常可为本领域从业人员所得到。对于核苷酸和蛋白质或它们的抑制剂本领域技术人员会使用不同制剂形式。同样，对特定细胞、病症、位置等等而言，多核苷酸或多肽的递送也将是特异的。适于口服施用蛋白质的药物制剂在例如美国专利号5,008,114、5,505,962、5,641,515、5,681,811、5,700,486、5,766,633、5,792,451、5,853,748、5,972,387、5,976,569和6,051,561中描述。

下述实施例用于举例阐明本发明，但并不以任何方式限定本发明的范围。

实施例

1.表达克隆：

1)从5周龄正常小鼠视网膜中纯化总RNA：

大体上根据Glissin等人(1974)，生物化学(Biochemistry)，13，2633-2637中所述方法利用5周龄C57BL/6N小鼠的视网膜构建cDNA文库。简言之，处死动物后，摘出动物的眼睛并将眼首先置于补充有0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。迅速解剖神经视网膜(在该组织制备中忽略视网膜色素上皮)。在每一解剖完成后，迅速将组织在新鲜配制的6M氯化胍(GC)中匀浆。将10个视网膜合并加至存在于4ml无菌试管中的2.4ml GC中，并且该组织通过在室温下剧烈匀浆1分钟而完全破碎。

从5周龄正常小鼠视网膜中纯化信使RNA(mRNA)：

mRNA的分离利用oligo-dT包被的多孔小珠(Oligotex，Qiagen)在严紧条件下根据Kuribayashi等人，(1988)核酸研究专题系列(Nucleic Acids Res.Symposium series)19，61-64的方法进行。简言之，将100-150μg小鼠视网膜总RNA与15μl oligo-dT小珠在结合缓冲液[10mM Tris pH7.5，0.3M NaCl，0.1M EDTA，0.5％w/v十二烷基硫酸钠(SDS)]中混和，并于65℃、0.5l水(becher)中孵育6分钟，随后在约3-4小时逐渐冷却至室温，然后在室温下离心以回收琼脂糖小珠。随后通过在0.4ml(0.1M Tris pH7.5，0.1M NaCl，1mM EDTA，0.5％w/v SDS)中孵育10分钟洗涤小珠两次。结合的RNA(mRNA)通过两步用50μl 70℃预热的无Rnase的水洗脱下来，利用10μl醋酸钠pH5.2和0.25ml乙醇将其沉淀并在-70℃下孵育12小时。mRNA通过离心(15000rpm 1小时，之后利用70％乙醇洗涤两次)收集并在20μl无Rnase的水中重悬。mRNA浓度在260nm测定并且rRNA污染与否按如上所述在变性条件下通过凝胶电泳检测。

cDNA合成：

cDNA合成根据Okayama和Berg，(1982)，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)2，161-170上所述方法进行。第一链合成利用2.5μg Not I接头寡核苷酸(5’TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGA CAA(T)₁₈3’)引发，并与50单位的改良莫洛尼鼠类白血病病毒(M-MLV)逆转录酶(Superscipt II，Life Technology)在供应商推荐的条件下孵育2小时。为进行第二链合成，反应物与4单位RNAseH和100单位DNA聚合酶I在SS缓冲液(40mM Tris pH7.2，85mM氯化钾，4.4mM氯化镁，3mMDTT，5μg/ml牛血清白蛋白(BSA))中(总体积0.25ml)14℃孵育4小时。EcoR I接头(5’-OH AATTCGGCACGAGG 3’-OH/3’-OHGCCGTGCTCC 5’-PO₄)连接至双链cDNA的两个末端是通过利用40单位T4 DNA连接酶(Promega，Madison，USA)在20μl总体积中在供应商推荐的条件下16℃孵育14小时完成。此反应的产物为dscDNA，其在5’端具有EcoR I半位点而3’端具有Not I半位点，这些位点可以使此dscDNA在克隆载体中定向。

在pcDNA3中连接dscDNA：

在pcDNA3中连接dscDNA根据Maniatis T.(1992)，分子克隆：实验室手册，第二版所述方法进行，其中利用了在供应商提供的条件下通过EcoR I和Not I(Promega，Madison，USA)切割制备的10μg pcDNA3质粒(Invitrogen)。

重组克隆的扩增：

重组克隆的扩增大体上根据Birnboim等人(1979)，核酸研究(NucleicAcids Res.)7，1513-1523中的方法进行。简言之，为制备具有100个初级克隆的库(汇合物)，我们稍微修改了XL1 Gold(Strategene)转化方案(由Strategene提供)，见如下。在生长培养基中孵育后，将转化反应物调节至具有20％(体积/体积)甘油和8％(体积/体积)马血清白蛋白(HAS，Life Technologies)。HAS和甘油能够抑制冻融后的死亡。通过用递增体积的每一转化反应物涂布琼脂平板(含100μg/ml氨苄青霉素)来进行滴度测定以计算出产生100个菌落的体积，而大批的转化反应物在-80℃贮存。同时进行96份文库重组质粒纯化。为制备各含100个克隆的96个库，将计算出的对应于100个克隆的体积涂布于琼脂上并使其在37℃生长20小时。DNA的纯化直接利用从琼脂平板上剥离的菌落进行。在23％甘油中将每一培养物的储存物贮存在-80℃。DNA利用Qiawell ultra(Qiagen)及供应商推荐的方案纯化。一般地，得到10μg纯化的质粒，每一制备物的浓度利用260nm光密度测量。为将所选的具100个克隆的库细分成具10个克隆的库，将50μl来自原初库的甘油储存物的1/250,000稀释物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板上。经37℃生长16小时后，在16个琼脂平板上复制了160个单菌落(每平板10个)并在37℃生长16小时。将每一平板的10个菌落收获并在液体培养基[Luria肉汤(LB)，100μg/ml氨苄青霉素]中37℃生长3小时。含30％甘油的这些培养物的储存物贮存在-80℃。如上所述制备质粒DNA。为将具10个克隆的亚库分解成单个的克隆，将50μl来自10克隆亚库的甘油储存物的1/250,000稀释物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板上。经37℃生长16小时后，挑取了16个单菌落并在2ml LB 100μg/ml氨苄青霉素中生长16小时。含30％甘油的这些培养物的储存物贮存在-80℃。利用如上所述的方法制备质粒DNA。

Cos-1细胞的瞬时转染：

Cos-1细胞的瞬时转染利用Chen和Okayama，(1987)“质粒DNA对哺乳动物细胞的高效转化”(Mol ceu Biol.，7，2745-2752)一文中所述方法进行。

鸡胚胎视网膜培养：

该方案改自Adler和Hatlee[(1989)科学(Science)，243，391]。将鸡胚胎视网膜(在卵中(in ovo)6天)分散并单层培养。在无分化信号的培养条件下，视锥占60-80％的细胞。我们制备了兔抗visinin(一种鸡视锥标志分子，Genbank登录号M84729)的多克隆抗体并证实我们的培养物中视锥的比例为60-80％。除该方法简单快捷外，我们模型的简单环境(人工合成培养基，缺少细胞与细胞接触)使其成为研究视锥存活有关营养因子的非常合适的系统。简言之，在卵中发育6天后解剖视网膜，将细胞分散并以低密度接种(10⁵个细胞/cm²)，其中的视网膜取自种鸡(progenitor)控制隔离群产生的胚胎。在10天中利用活细胞/死细胞测定(MolecularProbes，Eugene，USA)对细胞(60-80％的视锥)的生存能力进行跟踪，所述测定试验定量活的和死亡的细胞。在人工合成培养基上培养7天后，活细胞数目下降至初始细胞数目的8％。当条件培养基存在时，计数在体外7天后活细胞的数目，所述条件培养基来自转染了文库克隆汇合物的COS1细胞。

为进行本项实验，种鸡(657red label株系)在距本实验室25km远的孵化设施中于单独的分隔间中养殖。自然获得的受精卵按周收集，并在孵化后在实验室中17℃(其生物学零度)保持。每天，将5个鸡蛋20℃下孵育24小时并随后在37℃下孵育136小时，其间间歇地翻转鸡蛋在湿室中的倾斜度。培养的那天，用Mucocit-A洗涤鸡蛋表面，随后打破并将鸡胚胎转移至PBS中。每一胚胎的发育阶段根据Hamburger和Hamilton(1951)在发育生物学精粹(Essential Development Biology)(Stern和Holland主编)中的所述目视比较证实是第29天。选择了其中的2个胚胎并摘出眼，将眼转移至CO₂非依赖性培养基(Life technologies)中。解剖视网膜并转移至Ringer缓冲液中并洗涤2次。将视网膜切成小块并在胰蛋白酶溶液(0.25％w/v)中37℃处理20分钟。反应通过加入补充有10％灭活FCS的培养基(M199，Life Technologies)终止。利用25μl DNAseI(1mg/ml，Sigma)处理细胞悬液几分钟。随后将细胞悬液在人工合成培养基[CDCM，等体积的DMEM和M199培养基(Life Technologies)及具有补充物的AB(5μg/ml胰岛素；5μg/ml Transferring；64nM孕酮；0.1mM腐胺；5ng/ml硒；3mM牛磺酸；2.7μM胞苷5’-二磷酸乙醇胺；5.2μM胞苷5’-二磷酸胆碱，0.2μg/ml氢化可的松；30nM 3，3’，5-三碘-L-甲腺原氨酸；1mM丙酮酸钠)，0.3μM前列腺素D₂；0.1mg/ml亚油酸]中洗涤2次以除去FCS。采用台盼蓝染色的细胞的浓度利用Mallassez’cell测量，并对应于两个接种密度(2和4×10⁵个细胞/cm²)得到两个浓度(5.6和1.12×10⁵个细胞/ml)。

来自Cos-1转染细胞的条件培养基在冰上融化并按如下设计将50μl转移至2个处理过的96孔黑色组织培养板(Corning Costar)上，该板已用100μg/ml多聚-L-赖氨酸溶液(Sigma)进行包被：

1	1	1	1	2	C	2	2	2	3	3	P
												C	3	3	4	4	4	C	4	5	5	5	5
6	C	6	6	6	7	7	C	7	7	8	8
												8	8	C	9	9	9	9	10	C	10	10	10
11	11	11	C	11	12	12	12	12	C	13	13
												13	13	14	14	C	14	14	15	15	15	C	15
16	16	16	16	17	C	17	17	17	18	18	C
												18	18	19	19	19	19	P	20	20	20	C	20

其中数字是指具100个克隆的库的编号，C为来自转染了空载体(pcDNA3)的Cos-1细胞的条件培养基，而P为阳性对照(转染了pcDNA-小鼠GDNF的条件培养基)。

第二和第三轮筛选：

x.(y).01

x.(y).01

x.(y).01

x.(y).01

x.(y).02

C

x.(y).02

x.(y).02

x.(y).02

x.(y).03

x.(y).03

P

C

x.(y).03

x.(y).03

x.(y).04

x.(y).04

x.(y).04

C

x.(y).04

x.(y).05

x.(y).05

x.(y).05

x.(y).05

x.(y).06

C

x.(y).06

x.(y).06

x.(y).06

x.(y).07

x.(y).07

C

x.(y).07

x.(y).07

x.(y).08

x.(y).08

x.(y).08

x.(y).08

C

x.(y).09

x.(y).09

x.(y).09

x.(y).09

x.(y).10

C

x.(y).10

x.(y).10

x.(y).10

x.(y).11

x.(y).11

x.(y).11

C

x.(y).11

x.(y).12

x.(y).12

x.(y).12

x.(y).12

C

x.(y).13

x.(y).13

x.(y).13

x.(y).13

x.(y).14

x.(y).14

C

x.(y).14

x.(y).14

x.(y).15

x.(y).15

x.(y).15

C

x.(y).15

x.(y).16

x.(y).16

x.(y).16

x.(y).16

x.(y)

C

x.(y)

x.(y)

x.(y)

C57

C57

C

C57

C57

C3H

C3H

C3H

C3H

P

0

0

0

C

0

其中x(第二轮)和y(第三轮)分别代表在第一和第二轮中所选的库的编号。01到16代表所用的亚库。x(y)代表这16个库所来源的亲本库。C如第一轮中所述意义。P在第二轮中修改成为pCMVScript-CNTF，而在第三轮中逐渐改为pcDNA-939.09.08。0代表鸡视锥细胞仅存在于CDCM培养基中。C57和C3H为按照(从小鼠视网膜外植块制备条件培养基)中所述方法分别从C57B/6N和C3H/HeN 5周龄小鼠视网膜制备的视网膜外植块的条件培养基。

为使实验误差最小化，利用8道电动加样器(Biohit)将对应于2个密度(2和4×10⁵细胞/cm²)的50μl细胞悬液加至2个96孔板的孔中，所述96孔板中已加有条件培养基。细胞在5％CO₂条件下37℃孵育7天。

从小鼠视网膜外植块制备条件培养基

第二和第三轮筛选所包括的阳性对照据Mohand-Said等人(1998)进行适应性修改。将5周龄小鼠C57BL/6N(野生型)和C3H/HeN(rd1)处死并摘出眼。解剖出2个视网膜并在12孔板上用1.5ml CDCM于5％CO₂条件下37℃孵育24小时。将条件培养基回收并利用Vivaspin(Sartorius，截留点10kDa)通过超滤浓缩40倍。将条件培养基在液氮中速冻并在使用前分成小份在-20℃贮存。使用时，将条件培养基在冰上融化，在CDCM中稀释10倍并利用0.22μm滤器(Acrodisk 13，GelmanSciences)过滤除菌。

功能测定，活细胞/死细胞测定：

功能测定基于7天体外孵育后存活鸡视网膜细胞的数目。我们使用活细胞/死细胞测定试剂盒(Molecular probes，Eugene，USA)，该试剂盒基于使用两种分别对活细胞和死细胞染色的荧光染料(Calcein AM和Ethidium dimer)。活细胞具有代谢活性(这里是酯酶活性)，其可以将底物(Calcein AM)转化为发射波长520nm的荧光产物。死细胞的膜通透性发生改变并且允许核DNA被发射波长635nm的Ethidium dimmer染色。活细胞：485nm激发后520nm发射，或者死细胞：520nm激发后635nm发射。利用落射荧光显微镜，可以分别观察两种类型的荧光细胞。经7天体外培养后，将细胞在室温下暗处与2.7μM Calcein AM和0.3mMEthidium dimmer孵育30分钟。

图象采集：

简言之，图象采集的组成为：对每一个孔自动聚焦、在两种荧光下自动进行细胞计数，以及其后利用专门软件(例如Metamorph，UniversalImaging Corporation，West Chester，USA)对原始数据处理以获得每一平板孔的数字化图片。我们使用倒置显微镜(Nikon TE 200)，所述倒置显微镜装备有汞落射荧光灯、两个激发光滤片485和520nm、两个发射光滤片520和635nm、目镜(×10)、计算机驱动的电动盘(platine)(Multicontrol2000，Martzauzer)和CCD相机(Cohu)。

为记录平板，将其放置在电动盘上，并且在第一个孔上手动调焦，这样这一平面被记录(z原点)。死细胞和活细胞图象的阈值由第一个孔设定。利用白光通过手动对齐第一个孔的底部与电脑显示器上图象的底部，然后通过将第一个孔的最右边与电脑屏幕上图象的右边对齐并记录下这两个位置来调整第一个孔的中心位置。第一个孔的中心被计算出来从而给出培养板上每个孔的中心位置。我们在进行过程中注意到孔边缘具有稍高的细胞密度，因此我们从获取的图象中排除了边缘位置。每一孔的图象恰好位于正中非常重要，这样可以避免任何误导结果。当一切准备就绪，平板的第一次扫描进行死细胞的记录。死细胞密度在这些条件下较少变化。该过程通过在不同焦平面拍照并挑选最亮的那个而执行自动聚焦在准确的焦点。这个z位置被存储起来而盘在x和y轴上执行程序化运动拍下共4张图象，当将这些图象重建为一张图象时，它代表孔的2/3表面。从焦平面得到的一堆图象被存储用于对照。盘对每一板孔执行自动聚焦和四次图象获取，该过程从孔A1起始到A12，然后从B12到B1，C1到C12等等。最后，盘移出平板以过度曝光最后一个孔(H1)。死细胞的扫描花费30分钟。第二次扫描(活细胞)在转换滤光片后进行。该第二次扫描利用死细胞扫描时记录的每一孔的z位置进行。与死细胞相同，每一孔拍四张图象。在第二次扫描(22分钟)的最后，重建的死细胞和活细胞的图象被存储为利用日期自动命名的一个文件。利用预先设定的形态度量参数(平均值)来自动计数细胞的数目(死细胞和活细胞)，并将其显示在电脑显示器上以检查该实验正确与否。重要的是，基于每天的基础来检查活细胞的数目是否太高。我们已经观察到如果以过大的密度接种，鸡视网膜细胞极可能通过产生它们自己的存活因子而存活更长的时间。我们在没有这种作用的情况下筛选细胞。在第二块平板扫描(同一实验，利用2倍细胞接种密度)之前，我们在来自第一个平板的log文件名的末尾加个a。每一实验的图象在CD-rom上存储。我们已经生成了超过250个CD-rom的文库。

细胞计数和库的选择：

细胞数目(活细胞和死细胞)利用存储在CD-rom上的每个实验的图象进行计数。来自实验的log文件首先被载入电脑(离线计数)并使用Metamorph软件打开。第一步，打开对应于14个C孔(来自转染了空载体的Cos-1细胞的条件培养基)的图象。调整图象的阈值后，使用Integrated Morphometry Analysis指令对这些对照孔测量10到250个面积的目标分布(每一总面积内活细胞的数目)。该分布服从高斯分布，其中目标的最大数目与单个的细胞相对应。随后这个标准值(SV)用于计算如下面积值，即，超过此面积时目标将被计数为2个细胞(标准目标截点，SOC)，这通过我们的经验公式：SOC＝29/20.74SV完成。各培养板的SOC值用于计数培养板上活细胞的数目。随后将这些数目转移至excel表格中。

对第一轮筛选而言，将每一库的值按相对于14个对照孔的平均值+标准偏差的倍数差异(活细胞数目的增加或减少)作图。为矫正由培养板中位置不同带来的差异，我们分别计算了200个独立培养板上对应于测试库所在位置的80个孔和14个对照孔之间的平均倍数差异。平均而言，观测到的差异仅仅是由位置差异导致，并且细胞数目利用这一系数校正。为更严谨地辨别所选的库，活细胞计数按相对于对照的倍数差异作图，其中对照为不超过1.3但是大于0.4的所有值。这样，所有与对应于空载体的14个孔相比其倍数差异在0.4到1.3之间的库被认为没有作用并被用作对照。经校正，将2个培养板的与对照相比的倍数差异相乘，并且结果按照降低的倍数差异排序。将位于该列表的顶端的库进一步通过视察对应于实验的20个库(2个培养板)的图表以及活细胞和死细胞的图象来检查以避免筛选到错误的库。

对第二轮和第三轮而言，用于亚库筛选的培养板包括另外的对照。我们从5周龄小鼠的视网膜外植块制备了条件培养基。我们选择对于来自C57BL/6N的视网膜外植块记录为阳性结果的实验并排除了其它的实验。将结果以相对于14个对照孔的倍数差异作图，对照未进行重新计算。将2个培养板与对照的倍数差异相乘并对16个亚库按照降低的倍数差异排序所获结果。

用T7引物(5′GTAATACGACTCACTATAGGGC3′)在毛细管测序仪(CEQ2000，Beckman Coulter)上测序分离的cDNA。使用Basia LocalAlignment Search Tool(BLAST)将DNA序列和数据库作比较。

Rdcvf2以及人同源基因的鉴定：

利用Rdcvf1序列(编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4多肽的核苷酸序列)和BLAST，鉴定到同源小鼠和人多肽(图8)。鉴定到与小鼠RdCVF2(GenBank登录号：bc016199)同源的EST克隆：GenBank登录号：be552141、bi517442、bg707818、bi603812、ai433287、be088414、bg297383、bg297304(也参见图12)。与小鼠Rdcvf1(SEQ ID NO：1)同源的EST克隆也得以鉴定：GenBank登录号：bg299078、ai716631、bg294111、be108041、bg395178(也参见图13)。

Rdcvf1表达的实时RT-PCR分析

5周龄小鼠C57BL/6N和C3H/HeN以及同类系C3H(+/+和rd/rd)中Rdcvf1的视网膜表达利用实时RT-PCR方法研究，所述实时RT-PCR利用sybergreen PCR试剂盒(Roche)在光循环仪(Roche)上进行。cDNA通过利用随机六聚体寡核苷酸(pdN6，Amersham)引发、利用M-MLV逆转录酶(superscript II，Life Technologies)和来自小鼠视网膜(按1所述制备)的总RNA产生。cDNA的标准化利用普遍存在的信使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)进行。将0.2μl第一链cDNA合成物(相当于10ng总RNA)利用2μM寡核苷酸SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25扩增，总体积为25μl，实验重复3次。上述扩增利用下述程序：95℃30秒，以及35个循环(95℃1秒，55℃18秒，72℃10秒)。分析(图16)显示在rd1小鼠(C3H/HeN)中视杆变性后Rdcvf1表达下降。实时RT-PCR也显示Rdcvf1直接由光感受器表达，该实时RT-PCR使用的RNA制备自通过振动切片机切片得到的视网膜外层。

产物利用琼脂糖凝胶电泳检测。利用另一对Rdcvf1特异引物也得到了相似结果。作为阳性对照，在相同条件下利用引物(5’CTATTACGTCAAGCCTGTAGCC3’和5’CATCCTCATCTTTCTTCCTTC3’)检测视杆抑制蛋白(ASS n°M24086)的表达。对Rdcvf1是视锥保护因子的确认可以通过向5周龄rd1小鼠(C3H/HeN)的视网膜外植块中加入适当的量的Rdcvf1获得。适当的量可以通过一些最初的滴定实验确定。与合适的对照相比，7天后视锥存活将增加。

Rdcvf2的RT-PCR分析

Rdcvf2表达的RT-PCR分析利用引物5’GCCAGCGTTTTCTGCCTTTTAC3’和5’AAGCCCTGCCTGCTCTAACATC3’。分析表明Rdcvf2以视杆依赖性方式表达并且Rdcvf2的表达并不仅仅限制在视网膜，而是其它神经细胞也表达Rdcvf2(图17)，而Rdcvf1的表达似乎限于视网膜细胞。

Rdcvf1或Rdcvf2的活细胞/死细胞测定

利用带有在可诱导启动子控制下的Rdcvf1或Rdcvf2的适宜表达载体转染Cos-1细胞。对照细胞利用空载体转染。在诱导Rdcvf1或Rdcvf2表达后将细胞孵育一段合适的时间。随后，按照上述方法计数与条件培养基一起孵育的存活的视锥细胞数和存活的对照细胞数，所述条件培养基来自转染了Rdcvf1或Rdcvf2的COS-1细胞。表达Rdcvf1或Rdcvf2的细胞表现出存活细胞数量显著地较高。

视杆特异性因子

对来自5周龄C57BL/6N和C3H/HeN的视网膜外植块中视杆抑制蛋白(对照)和Rdcvf1的表达的实时RT-PCR分析在标准条件下进行，并利用了下述引物：

SEQ ID NO：24：5’TCTATGTGTCCCAGGACCCTACAG3’

SEQ ID NO：25：5’TTTATGCACAAGTAGTACCAGGACAG3’。

结果显示RdCVF1仅在视杆存在的情况下表达(视杆来源的CVF1)。

多克隆抗体的产生

多克隆抗体通过向兔注射谷胱甘肽-S-转移酶(GST)纯化的融合蛋白质(GST-Rdcvf1)以及来自SEQ ID NO：2的小鼠RdCVF1肽序列氨基酸第11至32位(Ab n°2)和SEQ ID NO：2肽序列氨基酸第79至96位(Abn°3)而制备。融合构建体pGST-Rdcvf1通过在标准条件下使用pcDNA-Rdcvf1作为模板并利用寡核苷酸SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27扩增而制备。将Rdc f1的开放阅读框(ORF)在读框内克隆至pGex2TK(Pharmacia)的Bam HI和Eco RI限制位点之间，并通过标准方法转化至大肠杆菌[BL21(DE3)pLysS，Promega]。单菌落在含100μg/ml氨苄青霉素的3升LB液体培养基中30℃下生长，并且通过添加1μg/ml异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质产生，并使其继续在30℃下生长5小时。将细胞收获、超声裂解并按照标准方案利用谷胱甘肽琼脂糖纯化。融合蛋白质利用10mM还原型谷胱甘肽在室温下洗脱。在注射兔之前将洗脱的蛋白质对PBS透析。蛋白质纯度通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。通过在80个位点皮内注射100μg纯化的GST-Rdcvf1来免疫2只兔。8周后收获血清。

Claims (26)

1.分离的多肽，其由SEQ ID NO：2所示多肽的氨基酸序列组成。

2.分离的核酸分子，其编码权利要求1的多肽。

3.宿主细胞，其含有根据权利要求2所述的分离的核酸分子。

4.载体分子，其含有根据权利要求2所述的分离的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的载体分子，其含有转录调控序列。

6.宿主细胞，其含有根据权利要求5所述的载体分子。

7.脊椎动物宿主细胞，其可以在体外增殖并且能够在培养生长时产生根据权利要求1所述的多肽，其中所述细胞含有至少一个转录调控序列，其中所述至少一个转录调控序列调控编码权利要求1的多肽的DNA的转录。

8.根据权利要求7所述的脊椎动物细胞，其中所述至少一个转录调控DNA序列为非人转录调控序列。

9.诊断人视网膜营养不良的试剂盒，其包括：(a)编码权利要求1的多肽的核酸、或(b)与(a)核酸互补的核酸。

10.根据权利要求9的试剂盒，其中在所述诊断中使用(a)或(b)所述的核酸，通过杂交用于检测人眼中与之杂交的信使RNA的转录水平。

11.可以与含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽特异性结合的纯化的抗体。

12.根据权利要求11所述的抗体，其为多克隆抗体。

13.根据权利要求11所述的抗体，其为单克隆抗体。

14.抗体片段，其为根据权利要求11所述的抗体的片段，其为Fab或F(ab’)₂片段。

15.用于人视网膜营养不良诊断的试剂盒，其包括采集样品的手段和根据权利要求11所述的抗体或根据权利要求14所述的抗体片段。

16.权利要求11的抗体或权利要求14的抗体片段在制备诊断人视网膜营养不良的试剂盒中的用途。

17.权利要求16的用途，其中所述诊断包括步骤：使所述组织与所述抗体或所述抗体片段接触，并检测所述抗体或所述抗体片段与所述组织中多肽的特异结合。

18.生产权利要求1的多肽的方法，其包括：将其中含有包含编码该多肽的外源多核苷酸的表达载体的宿主细胞在足以使该多肽在该宿主细胞中表达的条件下进行培养，由此产生表达的多肽；并将所述细胞产生的多肽回收。

19.预防或保护神经细胞免于变性的非治疗目的的方法，其包括：利用载体转染所述细胞，其中所述载体含有可操作地连接至转录调控序列上的编码权利要求1的多肽的核酸序列；并在所述细胞中表达所述多肽。

20.权利要求19所述的方法，其中所述细胞为视网膜细胞。

21.权利要求20所述的方法，其中载体为来自腺病毒或腺伴随病毒的载体。

22.视网膜保护剂，其含有SEQ ID NO：2的多肽以及任选地可药用载体。

23.视网膜保护剂，其含有治疗有效量的编码SEQ ID NO：2的多肽的核酸以及任选地可药用载体。

24.药物组合物，其含有治疗有效量的多肽和可药用载体，其中所述多肽为SEQ ID NO：2。

25.药物组合物，其含有治疗有效量的核酸和可药用载体，其中所述核酸为SEQ ID NO：1。

26.SEQ ID NO：2的多肽在制备用于治疗视网膜营养不良的药物组合物中的用途。

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