PL213658B1

PL213658B1 - Kompozycje farmaceutyczne zawierajace terapeutycznie skuteczna ilosc polipeptydu; kompozycje farmaceutyczne zawierajace terapeutycznie skuteczna ilosc kwasu nukleinowego; zastosowanie wspomnianych polipeptydów, czasteczek kwasu nukleinowego, kwasu nukleinowego i wektora zawierajacego kwas nukleinowy; sposoby diagnozowania dystrofii siatkówki; izolowany polipeptyd; sposób jego wytwarzania; oczyszczone przeciwcialo lub jego fragment oraz zestaw do diagnozowania dystrofii siatkówki

Info

Publication number: PL213658B1
Application number: PL364681A
Authority: PL
Inventors: Hicks David; Léveillard Thierry; Mohand-Said Saddek; Alain Sahel José
Original assignee: Novartis Ag; Universite Louis Pasteur
Priority date: 2001-04-06
Filing date: 2002-04-05
Publication date: 2013-04-30
Also published as: CA2443345C; CZ305800B6; AU2002312794B2; EP1379657A2; US8114849B2; US8394756B2; ZA200307403B; NO331277B1; SK288465B6; ECSP024345A; RU2384586C2; MXPA03009114A; US20040204350A1; WO2002081513A3; BRPI0208870B8; FR2823221A1; PL364681A1; US8071745B2; JP2009232843A; US7795387B2

Description

Wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych zawierających terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu, oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik. Dodatkowo, wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych zawierających terapeutycznie skuteczną ilość kwasu nukleinowego oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik. Ponadto, wynalazek dotyczy zastosowań wspomnianych polipeptydów, cząsteczek kwasu nukleinowego, kwasu nukleinowego i wektora zawierającego kwas nukleinowy; sposobów diagnozowania dystrofii siatkówki, jak również izolowanego polipeptydu, sposobu jego wytwarzania, oczyszczonego przeciwciała lub jego fragmentu oraz zestawu do diagnozowania dystrofii siatkówki.

Wynalazek może być wykorzystywany do wykrywania i leczenia chorób degeneracyjnych siatkówki. W szczególności polipeptyd stanowiący przedmiot wynalazku chroni przed degeneracją czopków siatkówki.

Fotoreceptory są wyspecjalizowanym rodzajem neuronów siatkówki, które są odpowiedzialne za widzenie. Fotoreceptory składają się z pręcików i czopków, które są światłoczułymi komórkami siatkówki. Każdy pręcik i czopek wytwarza wyspecjalizowaną rzęskę, określaną jako zewnętrzny segment, która zawiera mechanizm fototransdukcji. Pręciki zawierają specyficzny, absorbujący światło barwnik, rodopsynę. U ludzi występują trzy klasy czopków siatkówki charakteryzujące się ekspresją różnych barwników wzrokowych: niebieskiego, zielonego i czerwonego barwnika czopków. Każdy typ białka barwnika wzrokowego jest nastawiony na maksymalną absorpcję światła przy różnych długościach fali. Rodopsyna czopków pośredniczy w widzeniu w ciemności (w przyćmionym świetle), podczas gdy barwniki czopków siatkówki są odpowiedzialne za widzenie fotopowe (w jasnym świetle). Czerwone, niebieskie i zielone barwniki tworzą podstawę kolorowego widzenia u ludzi. Barwniki wzrokowe w pręcikach i czopkach siatkówki reagują na światło i wytwarzają potencjał czynnościowy w komórkach wyprowadzających, dwubiegunowych neuronach pręcików, który jest następnie przekazywany przez zwój siatkówki i wytwarza bodziec wzrokowy w korze wzrokowej.

U ludzi wiele chorób siatkówki polega na postępującej degeneracji i ewentualnej śmierci fotoreceptorów, prowadząc nieodwołalnie do ślepoty. Degeneracja fotoreceptorów, taka jak dziedziczne dystrofie siatkówki (np. barwnikowe zwyrodnienie siatkówki), związana z wiekiem degeneracja plamki i inne rodzaje zwyrodnienia plamki lub odwarstwienie siatkówki charakteryzują się postępującą atrofią i zanikiem czynności zewnętrznego segmentu fotoreceptora. W dodatku śmierć fotoreceptorów lub zanik czynności fotoreceptorów powoduje częściową deaferentację neuronów siatkówki drugiego rzędu (dwubiegunowych i poziomych komórek pręcików) u pacjentów chorych na dystrofie siatkówki, co prowadzi do spadku ogólnej wydajności propagacji sygnału elektrycznego generowanego przez fotoreceptory. Wtórne zmiany w gleju i nabłonku barwnikowym wynikające z deceneracji fotoreceptorów powodują zmiany w naczyniach prowadzące do niedokrwienia i glejozy. Czynniki troficzne zdolne do uratowania fotoreceptorów od śmierci komórkowej i/lub przywrócenia czynności fotoreceptorów dysfunkcyjnych (zanikowych lub dystroficznych) mogą stanowić użyteczną terapię do leczenia takich stanów.

Progresja tych stanów prowadzi do następującej kolejno utraty dwóch klas fotoreceptorów: początkowo utracone zostają pręciki jako bezpośredni skutek nieznanych uszkodzeń genetycznych lub środowiskowych, powodujących ślepotę zmierzchową i zmniejszenie pola widzenia z następującą utratą czopków siatkówki prowadzącą do całkowitej ślepoty. I tak, czopki siatkówki obumierają w sposób niebezpośredni, ponieważ nie wykazują pierwotnego uszkodzenia.

Nie wszystkie spośród genów związanych z dystrofią siatkówki zostały do tej pory zidentyfikowane. Identyfikacja takich genów umożliwiłaby zarówno diagnozę, jak i określenie skutecznych terapii.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu, przy czym polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera terapeutycznie skuteczną ilość kwasu nukleinowego oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik, gdzie kwas nukleinowy zawiera sekwencję nukleotydową wybraną z grupy, w skład której wchodzą nukleotydy 45-374 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1, nukleotydy 26-676 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3, nukleotydy 24-353 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5, nukleotydy 48-686 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 7, nukleotydy 265-570 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 9,

PL 213 658 B1 nukleotydy 300-770 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 11, nukleotydy 331-738 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 13.

Przedmiotem wynalazku jest również polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 2, do zastosowania jako farmaceutyk.

Przedmiotem wynalazku jest również polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencję o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, do zastosowania jako farmaceutyk.

Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydów kodującą polipeptydy określone powyżej, do zastosowania jako farmaceutyk.

Przedmiotem wynalazku jest również kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową wybraną z grupy, w skład której wchodzą nukleotydy 45-374 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1, nukleotydy 26-676 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3, nukleotydy 24-353 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5, nukleotydy 48-686 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 7, nukleotydy 265-570 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 9, nukleotydy 300-770 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 11, nukleotydy 331-738 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 13, do zastosowania jako farmaceutyk.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową wybraną z grupy w skład której wchodzą sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencja o numerze identyfikacyjnym 14, do wytwarzania leku do leczenia dystrofii siatkówki.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, do wytwarzania leku do leczenia dystrofii siatkówki.

W każdym przypadku, dystrofia siatkówki wybrana jest korzystnie z grupy obejmującej barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, degenerację plamki związaną z wiekiem, zespół Bardet-Biedela, zespół Bassen-Kornzweiga, chorobę Besta, postępujące zwyrodnienie naczyniówki i siatkówki, zanik kolisty, ślepotę wrodzoną, zespół Refsuna, chorobę Stargardta i zespół Ushera.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor zawierający kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, czynnie połączony z sekwencją kontroli transkrypcji, do zastosowania w terapii genowej.

Korzystnie, wektor pochodzi od adenowirusa lub wirusa towarzyszącego adenowirusom.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób diagnozowania dystrofii siatkówki u człowieka, charakteryzujący się tym, że obejmuje pomiar in vitro albo ex vivo ilości informacyjnego RNA powstałego z transkrypcji cDNA polipeptydu w oku człowieka, gdzie polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, przy czym zmniejszanie się ilości informacyjnego RNA w czasie oznacza diagnozę dystrofii siatkówki.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób diagnozowania dystrofii siatkówki u człowieka, charakteryzujący się tym, że obejmuje pomiar in vitro albo ex vivo ilości polipeptydu w komórkach pręcikonośnych u człowieka, gdzie polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, przy czym zmniejszanie się ilości polipeptydu w czasie oznacza diagnozę dystrofii siatkówki.

Korzystnie, etap pomiaru obejmuje kontaktowanie komórek z przeciwciałem, które specyficznie wiąże się z polipeptydem, oraz wykrywanie specyficznego wiązania się przeciwciała z polipeptydem

PL 213 658 B1 lub jego fragmentem o działaniu ochronnym względem siatkówki w komórkach, przy czym wykrycie specyficznego wiązania z polipeptydem wskazuje na obecność polipeptydu RDCVF1 albo RDCVF2, lub jego fragmentu.

Przedmiotem wynalazku jest również izolowany polipeptyd wykazujący aktywność chroniącą siatkówkę, zawierający sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 2.

Przedmiotem wynalazku jest również izolowany polipeptyd wykazujący aktywność chroniącą siatkówkę, składający się z sekwencji aminokwasowej co najmniej w 90% identycznej z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 2.

Przedmiotem wynalazku jest również izolowany polipeptyd wykazujący aktywność chroniącą siatkówkę, zawierający sekwencję aminokwasową co najmniej w 99% identyczną z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 4.

Przedmiotem wynalazku jest również izolowany polipeptyd wykazujący aktywność chroniącą siatkówkę, składający się z sekwencji aminokwasowej co najmniej w 99% identycznej z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 4.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania polipeptydu określonego powyżej charakteryzujący się tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza z wektorem ekspresyjnym zawierającym polinukleotyd pochodzenia egzogennego kodujący polipeptyd, w warunkach wystarczających do ekspresji polipeptydu w komórce gospodarza, z uzyskaniem ekspresji polipeptydu.

Korzystnie, sposób dodatkowo obejmuje odzyskiwanie polipeptydu.

Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało lub jego fragment charakteryzujący się tym, że specyficznie wiąże się z polipeptydem składającym się z sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14.

Korzystnie, przeciwciało jest przeciwciałem poliklonalnym.

Korzystnie, przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.

Korzystnie, fragment przeciwciała jest fragmentem Fab lub F(ab')2.

Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do diagnozowania dystrofii siatkówki u człowieka charakteryzujący się tym, że zawiera elementy do pobierania próbek i przeciwciała określone powyżej.

Wynalazek ogólnie dotyczy nowej rodziny genów, pochodzącego z pręcików czynnika żywotności czopków siatkówki (Rdcvf).

Izolowany polipeptyd o sekwencji aminokwasów jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, lub jego fragmenty występują w oczach chorych na dystrofię siatkówki w znacznie mniejszym stopniu niż w oczach osobników nie chorujących na dystrofię siatkówki. Fragmenty izolowanego polipeptydu o sekwencji aminokwasów jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4 będą zawierały polipeptydy zawierające od około 5 do 10 aminokwasów, korzystnie od około 10 do około 20 aminokwasów, korzystniej od około 20 do około 100 aminokwasów i najkorzystniej od około 20 do około 50 aminokwasów.

Nowy polipeptyd może pochodzić od ssaka, a w szczególności od myszy lub człowieka, a wynalazek dotyczy również jego biologicznie, diagnostycznie lub terapeutycznie użytecznych fragmentów, wariantów i pochodnych, wariantów i pochodnych fragmentów i analogów powyższych. Również w zakresie wynalazku są polipeptydy, które są zasadniczo podobne do polipeptydu o sekwencji aminokwasów, jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4 np. sekwencji aminokwasów, jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14.

Zgodnie z wynalazkiem izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydów, jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3. Również w zakresie wynalazku są kwasy nukleinowe, które są zasadniczo podobne do kwasu nukleinowego o sekwencji nukleotydów, jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3 np. sekwencji nukleotydów, jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 7, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 9, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 11 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 13.

PL 213 658 B1

W korzystnym wariancie realizacji wynalazek obejmuje izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd wybrany z grupy składającej się z polipeptydów określonych w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14 np. nukleotydy 45-374 z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1, nukleotydy 26-676 z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3, nukleotydy 24-353 z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5, nukleotydy 48-686 z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 7, nukleotydy 265-570 z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 9, nukleotydy 300-770 z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 11 lub nukleotydy 331-738 z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 13. W korzystnym wariancie realizacji izolowane DNA przybiera formę cząsteczki wektorowej zawierającej DNA jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3.

Sposób diagnozowania dystrofii siatkówki u człowieka według wynalazku obejmuje wykrywanie zmniejszonej transkrypcji informacyjnego RNA podlegającego transkrypcji z DNA kodującego Rdcvf1 lub Rdcvf2 w oku ssaka, korzystnie człowieka, gdzie taka zmniejszona transkrypcja ma u osobnika znaczenie diagnostyczne w odniesieniu do dystrofii siatkówki lub patologicznego starzenia (ARMD). Innym wariantem realizacji testowego aspektu wynalazku jest sposób diagnozowania dystrofii siatkówki u ssaka, korzystnie człowieka, który wymaga pomiaru ilości polipeptydu Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub jego fragmentu w oku człowieka z podejrzeniem dystrofii siatkówki, gdzie obecność zmniejszonej ilości polipeptydu lub jego fragmentu względem ilości polipeptydu lub jego fragmentów w oku osobnika nie chorującego na dystrofię siatkówki ma u osobnika znaczenie diagnostyczne w odniesieniu do dystrofii siatkówki.

Wynalazek dotyczy również antysensownych polinukleotydów, które regulują transkrypcję genu Rdcvf1 lub Rdcvf2; w kolejnym zastosowaniu przedmiotem wynalazku jest RNA o podwójnym łańcuchu, które reguluje transkrypcję genu Rdcvf1 lub Rdcvf2.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób wytwarzania wyżej wymienionych polipeptydów, fragmentów polipeptydów, wariantów i pochodnych, fragmentów wariantów i pochodnych oraz analogów wyżej wymienionych. W korzystnym wariancie realizacji tego aspektu wynalazku jego przedmiotem są sposoby wytwarzania wyżej wymienionych polipeptydów Rdcvf1, obejmujące hodowanie komórek gospodarza, posiadających inkorporowany wektor ekspresyjny zawierający egzogenny polinukleotyd kodujący Rcdvf1 lub Rdcvf2 w warunkach wystarczających do ekspresji polipeptydów Rdcvf1 lub Rdcvf2 u gospodarza i następnie do odzyskiwania polipeptydu podlegającego ekspresji.

Niniejszy wynalazek może być stosowany między innymi do celów badawczych, biologicznych, klinicznych i terapeutycznych.

Zgodnie z wynalazkiem, przeciwciało lub jego fragment specyficznie wiąże się z polipeptydem zawierającym sekwencję aminokwasów, jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, tj. Rdcvf1 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, tj. Rdcvf2. W pewnych szczególnie korzystnych aspektach w tym względzie, przeciwciała są wysoce selektywne względem pochodzących od ssaków, korzystnie mysich i w szczególności ludzkich polipeptydów Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub części takich polipeptydów Rdcvf1 lub Rdcvf2. W szczególnie korzystnym wariancie, przeciwciało lub jego fragment wiąże się z fragmentem lub częścią sekwencji aminokwasów, jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14.

Wynalazek może być zastosowany w sposobach leczenia choroby osobnika, w której pośredniczy lub z którą ma związek zmiana ekspresji genu Rdcvf1 lub Rdcvf2 np. spadek poziomu polipeptydu RDCF1 lub RDCFV2 w oku, poprzez podanie osobnikowi skutecznych terapeutycznie ilości białka RDCVf1 lub RDCVF2, jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14 lub pokrewnego białka Iub jego fragmentu lub części.

W zakres wynalazku wchodzą też sposoby diagnozowania choroby lub stanu związanego z obniżeniem ekspresji genu Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub spadkiem poziomu polipeptydu RDCVF1 lub RDCVF2 u osobnika, które obejmują zastosowanie przeciwciała, które wiąże się z polipeptydem o se6

PL 213 658 B1 kwencji aminokwasów, jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14 Iub jego fragmentu lub części w teście immunologicznym.

Wynalazek dostarcza również komórek, które mogą być reprodukowane in vitro, korzystnie komórek kręgowca, które są zdolne w warunkach hodowlanych do wytwarzania polipeptydu, który zawiera sekwencje aminokwasów, jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14 lub jego fragmenty, gdzie komórki zawierają kontrolne sekwencje transkrypcji DNA inne niż mysie lub ludzkie kontrolne sekwencje transkrypcji Rdcvf1 lub Rdcvf2, gdzie kontrolne sekwencje transkrypcji kontrolują transkrypcję DNA kodującego polipeptyd o sekwencji aminokwasów według sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14 lub ich fragmenty.

Sposób wytwarzania polipeptydów Rdcvf1 lub Rdcvf2 według wynalazku obejmuje hodowanie komórki gospodarza posiadającej dołączony wektor ekspresyjny zawierający egzogenny polinukleotyd kodujący Rdcvf1 lub Rdcvf2 w warunkach wystarczających do ekspresji peptydów Rdcvf1 lub Rdcvf2 w komórce gospodarza, przez co zachodzi wytwarzanie polipeptydu podlegającego ekspresji i odzyskiwanie polipeptydu podlegającego ekspresji.

W zakres wynalazku wchodzą również sposoby testowania i zestawy zawierające komponenty potrzebne do wykrycia nieprawidłowej, np. niższej od prawidłowej, ekspresji polinukleotydów lub polipeptydów Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub ich fragmentów w próbkach tkanek pobranych od pacjenta; zestawy takie zawierają np. przeciwciała, które wiążą się z Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub próbki oligonukleotydów, które hybrydyzują z polinukleotydami według wynalazku. W korzystnym wariancie realizacji, takie zestawy również zawierają instrukcje opisujące procedury zastosowania komponentów zestawu.

Zgodnie z wynalazkiem polipeptyd Rdcvf1 lub Rdcvf2 może być stosowany w leczeniu człowieka lub zwierzęcia. W powiązanym aspekcie przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub jego fragmentu, nukleotydu kodującego Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub jego fragmentu lub przeciwciała, które wiąże się z Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub jego fragmentem do produkcji leku do leczenia dystrofii siatkówki.

W zakres wynalazku wchodzi również środek chroniący siatkówkę zawierający polipeptyd wybrany z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14 i, opcjonalnie, farmaceutycznie akceptowalny nośnik. W nawiązaniu, wynalazek obejmuje również kompozycje farmaceutyczne zawierające polipeptyd Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub jego fragment, nukleotyd kodujący Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub jego fragment do leczenia dystrofii siatkówki. W innym powiązanym aspekcie wynalazek obejmuje także kompozycję farmaceutyczną zawierającą terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu wybranego z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14 i farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

Wynalazek znajduje zastosowanie w sposobie leczenia dystrofii siatkówki obejmującym podanie terapeutycznie skutecznej ilości polipeptydu wybranego z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14 i farmaceutycznie akceptowalnego nośnika osobnikowi potrzebującemu takiego leczenia.

Wynalazek ukierunkowany jest także na sposoby identyfikacji cząsteczek, które mogą się wiązać z Rdcvf1 lub Rdcvf2 i/lub modulować aktywność Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub cząsteczek, które mogą się wiązać z sekwencjami kwasu nukleinowego, które modulują transkrypcję lub translację Rdcvf1 lub Rdcvf2. Takie sposoby są ujawnione np. w amerykańskich dokumentach patentowych nr 5,541,070; 5,567,317; 5,593,853; 5,670,326; 5,679,582; 5,856,083; 5,858,657; 5,866,341; 5,876,946; 5,989,814;

PL 213 658 B1

6,010,861; 6,020,141; 6,030,779 i 6,043,024, z których wszystkie są załączone tu w całości w charakterze odnośników. Cząsteczki identyfikowane takimi sposobami są również w zakresie wynalazku.

Zgodnie z wynalazkiem, kwasy nukleinowe według wynalazku mogą być wprowadzane do jednej lub więcej tkanek osobnika potrzebującego leczenia, co powoduje, że jedno lub więcej białek kodowanych przez kwasy nukleinowe podlega ekspresji i/lub jest wydzielane przez komórki w obrębie tkanki.

Wynalazek zapewnia również sposób dostarczania komórek fotoreceptorowych do implantacji, w którym komórki fotoreceptorowe są hodowane razem z RdCVf1 lub RdCVf2.

Inne cele, cechy, zalety i aspekty wynalazku staną się wiadome dla osoby biegłej w dziedzinie z następującego opisu. Należy jednak rozumieć, że następujący opis i specyficzne przykłady, podczas gdy wskazują korzystne warianty realizacji wynalazku, są zamieszczone jedynie w charakterze ilustracyjnym. Różne zmiany i modyfikacje w duchu i zakresie ujawnionego wynalazku staną się oczywiste dla osoby biegłej w dziedzinie po przeczytaniu następującego opisu oraz innych części ujawnienia.

Krótki opis rysunków

Fig. 1: sekwencja nukleotydów Rdcvf1 myszy z klonowania ekspresyjnego i sekwencja aminokwasów RdCVF1 myszy.

Fig. 2: sekwencja nukleotydów Rdcvf1L myszy i sekwencja aminokwasów.

Fig. 3: ludzki Rdcvf1 i sekwencja aminokwasów Rdcvf1 człowieka.

Fig. 4: sekwencja nukleotydów Rdcvf1L człowieka i sekwencja aminokwasów Rdcvf1L człowieka.

Fig. 5: sekwencja nukleotydów Rdcvf2 myszy i aminokwasy Rdcvf2 myszy.

Fig. 6: sekwencja nukleotydów Rdcvf2L myszy i aminokwas Rdcvf2L myszy.

Fig. 7: sekwencja nukleotydów Rdcvf2 człowieka i sekwencja aminokwasów Rdcvf2 człowieka.

Fig. 8: ukazuje dopasowanie aminokwasów krótkich form Rdcvf: (numer identyfikacyjny sekwencji 2, 6, 10 i 14 i długich form Rdcvf: numer identyfikacyjny sekwencji 4, 8, 12 i 14).

Fig. 9 ukazuje primery dla GST-Rdcvf1.

Fig. 10: wielokrotne dopasowanie RDCVF1/RDCVF2.

Fig. 11: porównanie mysiego i ludzkiego RDCVF2.

Fig. 12: wielokrotne uporządkowanie mysiego Rdcvf2 z klonami EST be552141, bi517442, bg707818 i bi603812.

Fig. 13: wielokrotne dopasowanie Rdcvf1 z klonami EST bg299078, ai716631, bg294111, be108041 i bg395178.

Fig. 14: sekwencja EST bg299078 skorygowana do zestawienia z Rdcvf1.

Fig. 15: sekwencja EST bg294111 skorygowana do zestawienia z Rdcvf1L.

Fig. 16: analiza RT-PCR czasu rzeczywistego ekspresji arestyny pręcików (A) i RdCSF1 (B) w 5-tygodniowej siatkówce C57BL/6@N 5 tygodni (zielona) i C3H/HE@N (czerwona).

Fig. 17: analiza RT-PCR ukazująca, że Rdcvf2 podlega ekspresji w zależności od pręcików i podlega ekspresji w innej części ośrodkowego układu nerwowego.

Fig. 18: analiza PCR ukazująca, że RdCVF1 podlega ekspresji w zależności od pręcików.

Wszystkie zgłoszenia patentowe, dokumenty patentowe i odnośniki literaturowe cytowane tutaj są niniejszym załączone tu w całości.

W praktyce wynalazku stosowanych jest wiele konwencjonalnych technik biologii molekularnej, mikrobiologii i rekombinacji DNA. Te techniki są dobrze znane i są wyjaśnione np. odpowiednio w Current Protocols in Molecular Biology, tom I, II i III, 1997 ((F.M. Ausubel ed.): Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, tomy I i II, 1985 (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R.I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J.H. Miller I M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory) i Methods in Enzymology Vol. 154 I Vol. 155 (Wu i Grossman, and Wu, eds.).

Jak określa się tutaj, „gen podlegający zróżnicowanej ekspresji odnosi się do (a) genu zawierającego co najmniej jedną z sekwencji DNA ujawnioną tutaj (np. jak ukazano na fig. 1 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1 lub jak ukazano na fig. 2 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3); (b) jakakolwiek sekwencja DNA, która koduje sekwencję aminokwasów kodowaną przez sekwencje DNA ujawnione tutaj (np. jak ukazano na fig. 1 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 lub jak uka8

PL 213 658 B1 zano na fig. 2 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4); lub (c) jakakolwiek sekwencja DNA, która jest zasadniczo podobna do sekwencji kodujących ujawnionych tutaj.

W najszerszym znaczeniu termin „zasadniczo podobna, gdy jest używany tutaj w odniesieniu do sekwencji nukleotydów, oznacza sekwencję nukleotydów odpowiadającą referencyjnej sekwencji nukleotydów, gdzie odpowiadająca sekwencja koduje polipeptyd posiadający zasadniczo taką samą strukturę i funkcję, jak polipeptyd kodowany przez referencyjną sekwencję nukleotydów, np. gdzie zachodzą jedynie zmiany w aminokwasach nie wpływające na funkcję polipeptydu. Korzystnie zasadniczo podobna sekwencja nukleotydów koduje polipeptyd kodowany przez referencyjną sekwencję nukleotydów. Procent identyczności pomiędzy zasadniczo podobną sekwencją nukleotydów i referencyjną sekwencją nukleotydów wynosi korzystnie co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, w dalszym ciągu korzystniej co najmniej 99%. Porównania sekwencji są przeprowadzane przy użyciu algorytmu uporządkowania sekwencji Smith-Watermana (patrz np. Waterman, M. S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman & Hall. London: 1995. ISBN 0-412-99391, Iub http://www.hto.usc.edu/software/seqaln/index.html). Program localS, wersja 1.16 stosowany jest z następującymi parametrami: match: 1, mismatch penalty: 0,33, open-gap penalty: 2, extended-gap penalty: 2. Sekwencja nukleotydów zasadniczo podobna do referencyjnej sekwencji nukleotydów hybrydyzuje do referencyjnej sekwencji nukleotydów w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA w 50°C z przemywaniem w 2X SSC, 0,1% SDS w 50°C, korzystniej w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA w 50°C z przemywaniem w 1X SSC, 0,1% SDS w 50°C, korzystniej wciąż w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA w 50°C z przemywaniem w 0,5X SSC, 0,1% SDS w 50°C, korzystnie w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPO4 1 mM EDTA w 50°C z przemywaniem w 0,1X SSC, 0,1% SDS w 50°C, korzystniej w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA w 50°C z przemywaniem w 0,1X SSC, 0,1% SDS w 65°C, jednak wciąż koduje funkcjonalnie ekwiwalentny produkt genowy.

Geny podlegające zróżnicowanej ekspresji ujawnione tutaj podlegają ekspresji w tkankach oka i w szczególności w komórkach pręcików, jednak u człowieka chorego na dystrofię siatkówki taką, jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, związaną z wiekiem degenerację plamki, zespół Bardet-Biedela, zespół Bassena-Kornzweiga, chorobę Besta, postępujące zwyrodnienie naczyniówki i siatkówki, zanik kolisty, wrodzone barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (congenital amourosis), zespół Refsuna, chorobę Stargardta i zespół Ushera podlegają ekspresji we względnie mniejszym zakresie tj. w mniejszym zakresie niż u osób nie chorujących na dystrofie siatkówki. Informacyjne RNA, które ulega transkrypcji z genów podlegających zróżnicowanej ekspresji i białko, które ulega translacji z takiego mRNA jest obecne w tkankach pręcików i jest związane z takimi tkankami w ilości co najmniej około połowy, korzystniej co najmniej pięć razy, korzystniej co najmniej dziesięć razy, najkorzystniej co najmniej około sto razy mniejszej niż poziomy mRNA i białka obecnego w odpowiadających tkankach występujących u ludzi, którzy nie chorują na dystrofię siatkówki. Takie zmniejszenie transkrypcji Rdcvf1 lub Rdcvf2 jest określane tutaj jako „zmniejszona transkrypcja.

„Komórka gospodarza, jak określa się tutaj, oznacza komórkę prokariotyczną lub eukariotyczną, która zawiera heterologiczne DNA, które wprowadzono do komórki jakimkolwiek sposobami np. przez elektroporację, precypitację z fosforanem wapnia, mikroiniekcję, transformację, infekcję wirusową i tym podobne.

„Heterologiczne, jak określa się tutaj, oznacza „innego naturalnego pochodzenia lub reprezentuje stan nienaturalny. Na przykład, jeżeli komórka gospodarza jest transformowana z DNA lub genem pochodzącym od innego organizmu, szczególnie od innego gatunku, ten gen jest heterologiczny w odniesieniu do komórki gospodarza i również w odniesieniu do potomków komórki gospodarza, którzy są nosicielami tego genu. Podobnie, „heterologiczna odnosi się do sekwencji nukleotydów otrzymanej z i wprowadzonej do tego samego, naturalnego oryginalnego typu komórek, lecz która jest obecna w stanie nienaturalnym, np. inny numer kopii lub pod kontrolą innych elementów regulatorowych.

Cząsteczka wektora jest cząsteczką kwasu nukleinowego, do której może być wprowadzony heterologiczny kwas nukleinowy, który może być następnie wprowadzony do odpowiedniej komórki gospodarza. Wektory korzystnie posiadają jeden lub więcej początków replikacji i jedno lub więcej miejsc, do których może być wprowadzone rekombinacyjne DNA. Wektory często posiadają dogodne środki, poprzez które można wyselekcjonować komórki z wektorami spośród innych komórek np. kodują geny oporności na leki. Do powszechnych wektorów należą plazmidy, genomy wirusowe i (pierwotnie u drożdży i bakterii) „sztuczne chromosomy.

PL 213 658 B1 „Plazmidy ogólnie są tutaj oznaczane małą literą p, przed którą lub za którą występują duże litery i/lub cyfry zgodnie ze standardowymi konwencjami nazewnictwa znanymi osobom biegłym w dziedzinie. Plazmidy zapoczątkowujące ujawnione tutaj są albo dostępne na rynku, powszechnie dostępne bez ograniczeń, albo mogą być tworzone z dostępnych plazmidów poprzez rutynowe zastosowanie dobrze znanych, opublikowanych procedur. Wiele plazmidów i innych wektorów klonujących i ekspresyjnych, które mogą być użyte zgodnie z wynalazkiem są dobrze znane i łatwo dostępne dla osób biegłych w dziedzinie. Co więcej, osoby biegłe w dziedzinie mogą z łatwością utworzyć dowolną ilość innych plazmidów odpowiednich do zastosowania według wynalazku. Właściwości, tworzenie i zastosowanie takich plazmidów, jak również innych wektorów według wynalazku szybko będzie oczywiste dla osób biegłych w dziedzinie na podstawie treści wynalazku.

Termin „izolowany oznacza, że materiał jest pobrany ze swojego oryginalnego środowiska (np. środowiska naturalnego, jeżeli występuje on naturalnie). Na przykład naturalnie występujący polinukleotyd lub polipeptyd obecny w żywym zwierzęciu nie jest izolowany, lecz ten sam polinukleotyd lub polipeptyd oddzielony od niektórych lub wszystkich współistniejących materiałów w systemie naturalnym jest izolowany, nawet jeżeli jest następnie ponownie wprowadzany do sytemu naturalnego. Takie polinukleotydy mogą być częścią wektora i/lub takie polinukleotydy lub polipeptydy mogą być częścią kompozycji i wciąż być izolowane, ponieważ taki wektor lub kompozycja nie są częścią naturalnego środowiska.

Jak stosuje się tutaj, termin „kontrolna sekwencja transkrypcyjna odnosi się do sekwencji DNA, jak sekwencje inicjujące, sekwencje enhancera i sekwencje promotora, które indukują, hamują lub w inny sposób kontrolują transkrypcję kwasu nukleinowego kodującego białko, z która są operacyjnie połączone.

Jak stosuje się tutaj, termin „kontrolna sekwencja transkrypcyjna Rdcvf1 lub „kontrolna sekwencja transkrypcyjna Rdcvf2 oznaczają dowolne spośród kontrolnych sekwencji transkrypcyjnych normalnie występujących w powiązaniu z genem Rdcvf1 lub Rdcvf2 ssaków, korzystnie z genem Rdcvf2, jak stwierdza się w genomie myszy lub człowieka.

Jak stosuje się tutaj, termin „kontrolna sekwencja transkrypcyjna nie pochodząca od człowieka oznacza dowolną kontrolną sekwencją transkrypcyjną nie występującą w ludzkim genomie.

Termin „polipeptyd jest tutaj używany zamiennie z terminami „polipeptydy i „białko („białka).

Jak stosuje się tutaj, termin „pochodna chemiczna polipeptydu według wynalazku oznacza polipeptyd według wynalazku, który zawiera dodatkowe ugrupowania chemiczne nie będące normalnie częścią cząsteczki. Takie ugrupowania mogą poprawiać rozpuszczalność cząsteczki, absorpcję, biologiczny okres półtrwania, itp. Ugrupowania mogą alternatywnie zmniejszać toksyczność cząsteczki, eliminować lub łagodzić jakiekolwiek działania niepożądane cząsteczki, itp. Ugrupowania zdolne do pośredniczenia w takich efektach są ujawnione np. w Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa (1980).

Jak stosuje się tutaj, termin „środek neuroprotekcyjny oznacza związek, który zapobiega lub chroni komórki nerwowe przed degeneracją. Termin „środek chroniący siatkówkę oznacza związek, który zapobiega lub chroni komórki siatkówki przed degeneracją.

Wynalazek obejmuje cząsteczki kwasu nukleinowego, korzystnie cząsteczki DNA takie, jak (1) izolowany zawierający sekwencję nukleotydów jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3, (2) izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego, które zawierają sekwencje kwasu nukleinowego, które hybrydyzują w surowych warunkach do izolowanego DNA, jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3 i (3) sekwencje kwasu nukleinowego, które hybrydyzują do (1) lub (2) powyżej. Takie warunki hybrydyzacji mogą być wysoce surowe lub mniej surowe, jak opisano powyżej. W przypadkach, gdy cząsteczki kwasu nukleinowego są dezoksyoligonukleotydami („oligos) wysoce surowe warunki mogą się odnosić np. do przemywania w 6X SSC/0,05% pirofosforanie sodu w 37°C (dla 14-zasadowych oligos), 48°C (dla 17-zasadowych oligos), 55°C (dla 20-zasadowych oligos) i 60°C (dla 23-zasadowych oligos). Odpowiednie zakresy takich surowych warunków dla kwasów nukleinowych różnych kompozycji są opisane przez Krausego i Aaronsona (1991) Methods of Enzymology, 200:546-556 w dodatku do Maniatisa i wsp. cytowanych powyżej.

Cząsteczki kwasu nukleinowego mogą zachowywać się jak antysensowne cząsteczki genu docelowego użyteczne na przykład w regulacji genu docelowego i/lub jak antysensowne primery w reakcjach amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego genu docelowego. Dalej, takie sekwencje mogą być używane jako część rybozymu i/lub sekwencje potrójnej spirali, również użytecznej w regulacji

PL 213 658 B1 genu docelowego. I dalej, takie cząsteczki mogą być stosowane jako komponenty sposobów diagnostycznych, w których może być wykryta obecność powodującego chorobę allelu RdCVF1 lub RdCVF2.

Wynalazek również obejmuje (a) wektory, które zawierają którąkolwiek z powyższych sekwencji kodujących (tj. sensownych) i/lub ich komplementów (tj. antysensownych); (b) wektory ekspresyjne, które zawierają którąkolwiek z powyższych sekwencji kodujących operacyjnie powiązanych z elementem regulatorowym, który ukierunkowuje ekspresję sekwencji kodujących i (c) komórki gospodarza zmienione metodą inżynierii genetycznej, które zawierają którąkolwiek z powyższych sekwencji kodujących operacyjnie powiązanych z elementem regulatorowym, który ukierunkowuje ekspresję sekwencji kodujących w komórce gospodarza. Jak stosuje się tutaj, elementy regulatorowe obejmują (lecz nie są ograniczone do) indukcyjne i nie-indukcyjne promotory, enhancery, operatory i inne elementy znane osobom biegłym w dziedzinie, które wywołują i regulują ekspresję.

Wynalazek obejmuje fragmenty którejkolwiek spośród sekwencji kwasu nukleinowego ujawnionych tutaj. Fragmenty pełnej długości genu Rdcvf1 lub Rdcvf2 mogą być używane jako próbka hybrydyzacji do biblioteki cDNA w celu izolacji pełnej długości genu i izolacji innych genów, które wykazują duże podobieństwo sekwencji do genu Rdcvf1 lub Rdcvf2 i podobną aktywność biologiczną. Próbki tego typu korzystnie posiadają co najmniej około 30 zasad i mogą zawierać na przykład od około 30 do około 50 zasad, około 50 do około 100 zasad, około 100 do około 200 zasad lub więcej niż 200 zasad (np. 300). Próbka może być również używana do identyfikacji klonu cDNA odpowiadającego pełnej długości transkryptowi i klonu genomowego lub klonów, które zawierają kompletny gen Rdcvf1 lub Rdcvf2 włącznie z regionami regulatorowymi i promotorowymi, egzonami i intronami. Przykład skriningu obejmuje izolowanie regionu kodującego genu Rdcvf1 lub Rdcvf2 przez użycie znanej sekwencji DNA w celu syntezy próbki oligonukleotydu lub losowe zapoczątkowywanie izolowanej sekwencji ujawnionej na rysunkach 1 do 8. Oznakowane oligonukleotydy posiadające sekwencje komplementarne do sekwencji genu według wynalazku są używane do skriningu biblioteki ludzkiego cDNA, genomowego DNA w celu określenia, z którymi indywidualnymi klonami biblioteki próbka hybrydyzuje.

W dodatku do sekwencji genowej opisanej powyżej, ortologi takich sekwencji, które mogą np. występować u innych gatunków, mogą być zidentyfikowane i mogą być z łatwością wyizolowane bez zbędnego eksperymentowania sposobami biologii molekularnej dobrze znanymi w dziedzinie. Dalej, mogą występować geny w innych genetycznych Ioci w obrębie genomu, które kodują białka o ekstensywnej homologii (homologi) do jednej lub więcej domen takich produktów genowych. Te geny mogą również być zidentyfikowane przez podobne techniki. Przykłady ortologów i homologów są przedstawione na rysunkach 8, 10, 11, 12 lub 13.

Na przykład, izolowana sekwencja genu ulegającemu ekspresji może być znakowana i używana do skriningu biblioteki cDNA utworzonej z mRNA uzyskanego z interesującego organizmu. Warunki hybrydyzacji będą mniej surowe, gdy biblioteka cDNA była uzyskana z innego organizmu niż typ organizmu, od którego uzyskano znakowaną sekwencję. Alternatywnie, znakowany fragment może być używany do skriningu biblioteki genomowej otrzymanej z interesującego organizmu, i ponownie, przy zastosowaniu odpowiednio mniej surowych warunków. Takie mniej surowe warunki są dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie i będą się zmieniały w sposób przewidywalny w zależności od filogenezy specyficznych organizmów, od których pochodzi biblioteka i znakowane sekwencje. W celu uzyskania wskazówek na temat tych warunków, patrz np. Sambrook i wsp. cytowani powyżej.

Dalej, uprzednio nieznana sekwencja typu genu ulegającego ekspresji może być izolowana przez przeprowadzenie PCR przy użyciu dwóch zdegenerowanych zbiorów primera oligonukleotydu określonych na podstawie sekwencji aminokwasów w obrębie interesującego genu. Matrycą dla reakcji może być cDNA uzyskane przez odwrotną transkrypcję mRNA spreparowaną z linii komórek ludzkich lub innych niż ludzkie lub tkanek znanych lub podejrzewanych o ekspresję homologu lub składanych wariantów.

Produkt PCR może być subklonowany i sekwencjonowany w celu zapewnienia, że amplifikowane sekwencje reprezentują sekwencje sekwencji podobnego do genu kwasu nukleinowego podlegającego ekspresji. Fragment PCR może być wówczas użyty do izolacji pełnej długości klonu cDNA na wiele sposobów. Na przykład amplifikowany fragment może być znakowany i użyty do skriningu biblioteki cDNA bakteriofaga. Alternatywnie, znakowany fragment może być użyty do skriningu biblioteki genomu.

PL 213 658 B1

Technologia PCR może również być użyta do izolacji pełnej długości sekwencji cDNA. Na przykład RNA może być wyizolowane według standardowych procedur z odpowiedniego źródła komórkowego lub tkankowego. Reakcja odwrotnej transkrypcji może być przeprowadzona na RNA przy użyciu primera oligonukleotydowego specyficznego dla większości końców 5' amplifikowanego fragmentu do zapoczątkowania syntezy pierwszej nici. Powstała hybryda RNA/DNA może wówczas być „zakończona guaninami przy użyciu standardowej reakcji terminalnej transferazy, hybryda może być trawiona RNAzą H i synteza drugiej nici może być wówczas zapoczątkowana primerem poli-C. I tak, sekwencje cDNA w górę od amplifikowanego fragmentu mogą być z łatwością wyizolowane. W celu zapoznania się z przeglądem strategii klonowania, które mogą być użyte, patrz np. Sambrook i wsp., supra.

W przypadkach, gdy zidentyfikowany gen podlegający zróżnicowanej ekspresji jest normalnym genem, lub genem typu dzikiego, ten gen może być użyty do izolacji zmutowanych alleli genu. Taka izolacja jest korzystna w procesach i zaburzeniach, o których wiadomo lub są podejrzewane o posiadanie podłoża genetycznego. Zmutowane allele mogą być wyizolowane od osobników, o których wiadomo lub są podejrzewani o posiadanie genotypu, który przyczynia się do objawów choroby. Zmutowane allele i produkty zmutowanych alleli mogą być wówczas użyte w systemach testów diagnostycznych opisanych poniżej.

Może być wyizolowane cDNA zmutowanego genu na przykład przy użyciu RT-PCR, techniki, która jest dobrze znana osobom biegłym w dziedzinie. W tym przypadku pierwsza nić cDNA może być zsyntetyzowana przez hybrydyzację oligonukleotydu oligo-dT (lub losowych heksamerów) do mRNA izolowanego z tkanki, o której wiadomo lub jest podejrzewana o ekspresję u osobnika przypuszczalnie będącego nosicielem zmutowanego allelu i przez przedłużenie nowej nici za pomocą odwrotnej transkryptazy. Druga nić cDNA jest wówczas syntetyzowana przy użyciu oligonukleotydu, który hybrydyzuje specyficznie do końca 5' normalnego genu (lub w jakikolwiek inny sposób). Przy użyciu tych dwóch primerów produkt jest następnie amplifikowany za pomocą PCR, klonowany do odpowiedniego wektora i poddany analizie sekwencji DNA sposobami dobrze znanymi osobom biegłym w dziedzinie. Przez porównanie sekwencji DNA zmutowanego genu do sekwencji normalnego genu, mutacja (mutacje) odpowiedzialne za utratę lub zmianę czynności produktu zmutowanego genu mogą być określone.

Alternatywnie, biblioteka genomowa lub cDNA może być skonstruowana i przeglądana przy użyciu DNA lub RNA z tkanki, o której wiadomo lub jest podejrzewana o ekspresję interesującego genu u osobnika podejrzewanego o to, że jest nosicielem zmutowanego allelu. Normalny gen lub jego jakikolwiek odpowiedni fragment może być wówczas znakowany i użyty jako próbka do identyfikacji odpowiadającego zmutowanego allelu w bibliotece. Klon zawierający ten gen może być wówczas oczyszczony sposobami rutynowo praktykowanymi w dziedzinie i poddany analizie sekwencji jak opisano powyżej.

Dodatkowo, można skonstruować bibliotekę ekspresyjną przy użyciu DNA wyizolowanego z lub cDNA zsyntetyzowanego z tkanki, o której wiadomo, lub która jest podejrzewana o ekspresję interesującego genu u osobnika podejrzewanego o to, że jest nosicielem zmutowanego allelu. W ten sposób produkty genowe wytworzone przez przypuszczalnie zmutowaną tkankę mogą podlegać ekspresji i skriningowi przy użyciu standardowych technik z wykorzystaniem przeciwciał w połączeniu z przeciwciałami skierowanymi przeciwko normalnemu produktowi genu, jak opisano poniżej. (Aby dowiedzieć się o technikach skriningu patrz np. Harlow, E. I Lane eds., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor). W przypadkach, gdy efekty mutacji w produkcie genu podlegającego ekspresji o zmienionej funkcji (np. jako wynik mutacji typu missense), prawdopodobne jest, że zestaw przeciwciał poliklonalnych będzie reagował krzyżowo z produktem zmutowanego genu. Klony biblioteki wykryte przez ich reakcję z takimi znakowanymi przeciwciałami mogą być oczyszczone i poddane analizie sekwencji, jak opisano powyżej.

Produkty genowe podlegające zróżnicowanej ekspresji obejmują białka kodowane przez sekwencje nukleotydów, jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 7, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 9, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 11 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 13, w szczególności polipeptyd, który posiada lub zawiera sekwencję aminokwasów określoną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwen12

PL 213 658 B1 cji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14 Iub jego fragmenty.

Dodatkowo, produkty genu podlegającego ekspresji mogą obejmować białka, które reprezentują funkcjonalnie równoważne produkty genu. Taki równoważny produkt genu może zawierać delecje, addycje lub substytucje reszt aminokwasów w obrębie sekwencji aminokwasów kodowanych przez opisane wyżej sekwencje genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji, lecz które powodują ukrytą zmianę i w ten sposób wytwarzają funkcjonalnie równoważny produkt genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji (polimorfizmy). Substytucje aminokwasów mogą zachodzić na podstawie podobieństw w polarności, ładunku, rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilowości i/lub charakterze amfifatycznym zaangażowanych reszt i na podstawie porównania sekwencją aminokwasów od innych gatunków.

Na przykład niepolarne (hydrofobowe) aminokwasy obejmują alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę; polarne obojętne aminokwasy obejmują glicynę, serynę, treoninę, cysteinę, tyrozynę, asparaginę i glutaminę; dodatnio naładowane (zasadowe) aminokwasy obejmują argininę, lizynę i histydynę i ujemnie naładowane (kwasowe) aminokwasy obejmują kwas asparaginowy i kwas glutaminowy.

Termin „funkcjonalnie równoważny, jak stosuje się tutaj, może odnosić się do białka lub polipeptydu zdolnego do wykazywania zasadniczo podobnej aktywności in vivo lub in vitro, jako endogennego produktu genu podlegającego ekspresji kodowanego przez opisane wyżej sekwencje genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji. Termin „funkcjonalnie równoważny może również odnosić się do białek lub polipeptydów zdolnych do interakcji z innymi komórkowymi lub pozakomórkowymi cząsteczkami w sposób podobny do sposobu, w jaki wchodziłaby w interakcje odpowiadająca część endogennego produktu genu podlegającego ekspresji. Na przykład, „funkcjonalnie równoważny polipeptyd byłby zdolny, w teście immunologicznym, do zmniejszania wiązania przeciwciała z odpowiadającym peptydem (tj. sekwencją aminokwasów peptydu, która została zmodyfikowana w celu uzyskania „funkcjonalnie równoważnego peptydu) endogennego białka lub z samym białkiem endogennym, gdzie przeciwciało zostało skierowane przeciwko odpowiadającemu peptydowi endogennego białka. Równomolowe stężenie funkcjonalnie równoważnego peptydu będzie zmniejszało wiązanie odpowiadającego peptydu o około 5%, korzystnie pomiędzy około 5% a 10%, korzystniej pomiędzy około 10% a 20%, nawet bardziej korzystnie pomiędzy około 25% a 50% i najkorzystniej pomiędzy około 40% a 50%.

Produkty genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji mogą być wytwarzane za pomocą technologii rekombinacyjnego DNA dobrze znanej w dziedzinie. I tak, opisane są tu sposoby tworzenia polipeptydów i peptydów genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji według wynalazku przez ekspresję kwasu nukleinowego kodującego sekwencje genu podlegające zróżnicowanej ekspresji. Sposoby, które są dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie mogą być używane do konstruowania wektorów ekspresyjnych zawierających sekwencje kodujące białko genu podlegającego ekspresji i odpowiednie sygnały kontrolne transkrypcji/translacji. Te sposoby obejmują na przykład techniki rekombinacyjnego DNA in vitro, techniki syntetyczne i rekombinację/genetyczną rekombinacje in vivo. Patrz na przykład techniki opisane przez Sambrooka i wsp., 1989, supra i Ausubela i wsp., 1989, supra. Alternatywnie, RNA lub cDNA zdolne do kodowania sekwencji białka genu podlegającego ekspresji mogą być zsyntetyzowane chemicznie przy użyciu, na przykład, syntezatora. Patrz, na przykład, techniki opisane w „Oligonucleotide Synthesis, 1984, Gait, M. J. Ed., IRL Press, Oxford, który jest załączony tu w całości w charakterze odnośnika.

Wiele różnych systemów wektorowych ekspresji u gospodarza może być używanych do ekspresji sekwencji kodujących genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji według wynalazku. Takie systemy ekspresji u gospodarza reprezentują podłoża, poprzez które interesujące sekwencje kodujące mogą być wytwarzane i następnie oczyszczane, lecz również reprezentują komórki, które mogą, gdy są transformowane są transfekowane odpowiednimi sekwencjami kodującymi nukleotyd, powodować ekspresję białko genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji według wynalazku in situ. Obejmują one (lecz nie są ograniczone do) mikroorganizmy takie, jak bakterie (np. E coli, B. subtilis) transformowane z DNA rekombinacyjnego bakteriofaga, wektory ekspresyjne DNA plazmidu lub DNA kosmidu zawierające sekwencje kodujące białka genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji; drożdże (np. Saccharomyces, Pichia) transformowane rekombinacyjnymi wektorami ekspresyjnymi drożdży zawierającymi sekwencje kodujące białka genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji; systemy komórek owadów zainfekowanych wirusowymi wektorami ekspresji (np. baculowirusy) zawierającymi

PL 213 658 B1 sekwencje kodujące białka genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji, systemy komórek roślinnych zainfekowane wirusowymi rekombinacyjnymi wektorami ekspresyjnymi (np. wirus mozaiki kalafiorów, CaMV, wirus mozaiki tytoniowej, TMV) lub transformowane rekombinacyjnymi wektorami transformacji plazmidów (np. plazmid Ti) zawierającymi sekwencje kodujące białka genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji lub systemy komórek ssaków (np. COS, CHO, BHK, 293, 3T3) będące siedliskiem rekombinacyjnych konstruktów ekspresyjnych zawierających promotory uzyskane z genomu komórek ssaków (np. promotor metalotioneiny) lub z wirusów ssaków (np. późny promotor adenowirusa; promotor 7,5K wirusa krowianki; wczesny promotor genowy cytomegalowirusa).

Ekspresja RDCVF1 lub RDCVF2 przez komórkę z genu Rdcvf1 lub Rdcvf2, który jest naturalny dla komórki może również być przeprowadzona. Sposoby takiej ekspresji są wyszczególnione np. w amerykańskich dokumentach patentowych nr 5,641,670; 5,733,761; 5,968,502 i 5,994,127, z których wszystkie są załączone tu w całości w charakterze odnośników. Komórki, które były indukowane w celu ekspresji RDCVF1 lub RDCVF2 sposobami według któregokolwiek z amerykańskich dokumentów patentowych 5,641,670; 5,733,761; 5,968,502 i 5,994,127 mogą być implantowane do pożądanej tkanki żyjącego zwierzęcia w celu zwiększenia miejscowego stężenia RDCVF1 lub RDCVF2 i tkance.

W systemach bakteryjnych można korzystnie wyselekcjonować wiele wektorów ekspresyjnych w zależności od zastosowania przewidzianego dla ekspresji białka genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji. Na przykład, gdy ma być wytworzona duża ilość takiego białka, na przykład do utworzenia przeciwciał lub od skriningu bibliotek peptydowych, mogą być pożądane wektory, które ukierunkowują ekspresję dużych ilości produktów białek fuzyjnych. Do takich wektorów należą (lecz nie są ograniczone do) wektor ekspresyjny pUR278 E. Coli (Ruther i wsp., 1983, EMBO J. 2:1791), w którym sekwencja kodująca białka genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji może być indywidualnie wiązana z wektorem w ramce z regionem kodującym Iac Z tak, że wytwarzane jest białko fuzyjne; wektory pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleis Acids Res. 13:3101-3109; Van Heecke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509) i tym podobne. Wektory PGEX mogą również być użyte do przeprowadzania ekspresji obcych polipeptydów jako białek fuzyjnych z S-transferazą glutationu (GST). Ogólnie, takie białka fuzyjne są rozpuszczalne i mogą być z łatwością oczyszczone z komórek ulegających Iizie przez adsorpcję na kroplach glutationu-asefagarozy i, następnie, przez wymywanie w obecności wolnego glutationu. Wektory PGEX są tak zaprojektowane, że zawierają miejsca rozszczepienia proteazy trombiny lub czynnika Xa tak, że sklonowane białko docelowego genu może być uwolnione z ugrupowania GST przy użyciu tych endopeptydaz.

Regiony promotorowe mogą być wybrane z dowolnego pożądanego genu przy użyciu wektorów, które zawierają jednostkę transkrypcji reportera bez regionu promotora taką, jak acetylotransferazę chloramfenikolu („CAT) lub jednostkę transkrypcji lucyferazy, w dół strumienia od miejsca lub miejsc restrykcji w celu wprowadzenia kandydującego fragmentu promotora tj. fragmentu, który może zawierać promotor. Jak dobrze wiadomo, wprowadzenie wektora fragmentu zawierającego promotor w miejscu restrykcji w górę strumienia genu CAT lub lucyferazy zagraża aktywności CAT lub lucyferazy, co może być wykryte standardowymi testami CAT lub luminometrią. Wektory odpowiednie do tej pory są dobrze znane i mogą być z łatwością uzyskane. Trzy takie wektory to pKK232-8, -pCM7 i pGL3 (Promega, E1751, Genebank Ass n° u47295). I tak, promotory do ekspresji polinukleotydów według wynalazku obejmują nie tylko dobrze znane łatwo dostępne promotory, lecz również promotory, które mogą być z łatwością uzyskane dzięki powyższej technice, przy użyciu testu genu reportera.

Wśród znanych promotorów bakteryjnych odpowiednich do ekspresji polinukleotydów i polipeptydów według wynalazku znajdują się promotory IacI i IacZ E. coli, promotory T3 i T7, promotor T5 tac, lambda PR, promotory PL i promotor trp. Wśród znanych promotorów eukariotycznych odpowiednich w tym względzie znajduje się szybki wczesny promotor CMV, promotor kinazy tymidyny HSV, wczesne i późne promotory SV40, promotory retrowirusowych LTR takie, jak promotory wirusa mięsaka Rousa („RSV) i promotory metalotioneiny takie, jak promotor metalotioneiny-I myszy.

W systemach owadzich, wirus jądrowej polihedrozy Autographa californica ((AcNPV) jest jednym z kilku systemów owadzich, które mogą być użyte jako wektory do ekspresji obcych genów. Wirus rośnie w komórkach Spodoptera frugiperda. Sekwencja kodująca genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji może być klonowana indywidualnie do niezasadniczych regionów (na przykład genu polihedryny) wirusa i umieszczana pod kontrolą promotora AcNPV (na przykład promotora polihedryny). Zakończone powodzeniem umieszczenie sekwencji kodującej genu ulegającego zróżnicowanej ekspresji spowoduje inaktywację genu polihedryny i wytwarzanie nie-zamkniętego rekombinacyjnego

PL 213 658 B1 wirusa (tj. wirusa bez białkowatej otoczki kodowanej przez gen polihedryny). Te rekombinacyjne wirusy są następnie używane do infekowania komórek Spodoptera frugiperda, w których zachodzi ekspresja umieszczonego genu). (Np. patrz Smith i wsp., 1983, J. Virol. 46:584; Smith, U.S. Pat. 4,215,051).

W komórkach gospodarza pochodzących od ssaków, można zastosować wiele systemów ekspresyjnych opartych na wirusach. W przypadkach, gdy używany jest adenowirus jako wektor ekspresyjny, interesująca sekwencja kodująca genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji może być związana z kompleksem kontrolnym transkrypcji/translacji, np. późnym promotorem wiodącą sekwencją trójdzielną. Gen chimeryczny może być wówczas umieszczony w genomie adenowirusa przez rekombinację in vitro lub in vivo. Umieszczenie w nie-zasadniczym regionie genomu wirusa (np. regionie E1 lub E3) spowoduje powstanie wirusa rekombinacyjnego, który jest zdolny do przeżycia i ekspresji białka genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji w zainfekowanych gospodarzach (np. patrz Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). Specyficzne sygnały inicjacji mogą być wymagane do skutecznej translacji umieszczonych sekwencji kodujących genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji. Te sygnały obejmują kodon inicjacji ATG i przylegające sekwencje.

W przypadkach, gdzie cały gen podlegający zróżnicowanej ekspresji, włącznie z jego własnym kodonem inicjacyjnym i przylegającymi sekwencjami, jest włączony do odpowiedniego wektora ekspresji, mogą nie być potrzebne dodatkowe sygnały kontroli translacji. Jednakże, w przypadkach, gdzie jedynie część sekwencji kodującej genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji jest umieszczona, egzogenne sygnały kontroli translacji, włącznie, być może, z kodonem inicjacyjnym ATG, musi być zapewnione. Co więcej, kodon inicjacyjny musi być w fazie z ramką odczytującą pożądanej sekwencji kodującej w celu zapewnienia translacji całej wstawki. Te egzogenne sygnały kontroli translacji (sekwencja Kozacka) i kodony inicjacyjne mogą mieć różne pochodzenie, zarówno naturalne, jak syntetyczne. Skuteczność ekspresji może być wzmożona przez włączenie odpowiednich elementów wzmacniających transkrypcję, terminatorów transkrypcji, itp. (patrz Bittner i wsp., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).

Wybór odpowiednich wektorów i promotorów do ekspresji w komórce gospodarza jest dobrze znaną procedurą, a wymagane techniki konstrukcji wektorów ekspresyjnych, umieszczania wektorów w gospodarzu i ekspresja w gospodarzu per se są rutynowymi umiejętnościami osób biegłych w dziedzinie.

Ogólnie, rekombinacyjne wektory ekspresyjne będą obejmowały początki replikacji, promotor otrzymany z genu podlegającego znacznej ekspresji w celu ukierunkowania transkrypcji sekwencji strukturalnej w dół strumienia i obieralny marker w celu umożliwienia izolacji komórek zawierających wektor po ekspozycji na wektor.

Dodatkowo, może być wybrany szczep komórek gospodarza, który moduluje ekspresję włączonych sekwencji lub modyfikuje i przetwarza produkt genu w specyficzny, pożądany sposób. Takie modyfikacje (np. glikozylacja) i przetwarzanie (np. rozszczepianie) produktów białkowych może być ważne dla funkcji białka. Odmienne komórki gospodarza posiadają charakterystyczne i specyficzne mechanizmy dla przetwarzania potranslacyjnego i modyfikacji białek. Odpowiednie linie komórkowe lub systemy gospodarza mogą być wybrane w celu zapewnienia poprawnej modyfikacji i przetwarzania obcego białka podlegającego ekspresji. Do tego momentu, mogą być użyte komórki gospodarzy eukariotycznych, które posiadają mechanizmy komórkowe do prawidłowego przetwarzania pierwotnego transkryptu, glikozylacji i fosforylacji produktu genowego. Do takich komórek gospodarza pochodzących od ssaków należą (lecz nie są ograniczone do) CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 itp.

W celu długotrwałej, wysokowydajnej produkcji rekombinacyjnych białek, korzystna jest stabilna ekspresja. Na przykład linie komórkowe, w których w sposób stabilny zachodzi ekspresja białka podlegającego zróżnicowanej ekspresji, mogą być poddawane inżynierii. Zamiast używania wektorów ekspresji, które zawierają wirusowe początki replikacji, komórki gospodarza mogą być transformowane za pomocą DNA kontrolowanego przez odpowiednie elementy kontroli ekspresji (np. promotor, enhancer, sekwencje, terminatory transkrypcji, miejsca poliadenylacji, itp.) i wybieralny marker. Po wprowadzeniu obcego DNA, komórki poddane inżynierii mogą być hodowane przez 1-2 dni na wzbogaconych podłożach, a następnie na selektywnych podłożach. Wybieralny marker w rekombinacyjnym plazmidzie nadaje oporność selekcji i umożliwia komórkom stabilną integrację plazmidu do ich chromosomów i wzrost formujący ogniska, które z kolei mogą być klonowane i rozmnażane w liniach komórkowych. Ten sposób może korzystnie być używany do inżynierii linii komórkowych, w których zachodzi zróżnicowana ekspresja białka. Takie linie komórkowe poddane inżynierii mogą być szczególPL 213 658 B1 nie użyteczne w skriningu i ocenie związków, które wpływają na endogenną aktywność białka podlegającego zróżnicowanej ekspresji. Te stabilne linie komórkowe mogą być używane jako terapia komórkowa bezpośrednio lub po kapsułkowaniu.

Wiele systemów selekcji może być zastosowanych, włącznie z (lecz bez ograniczenia do) genami kinazy tymidyny wirusa opryszczki zwykłej (Wigier i wsp., 1977, Cell 11:223), fosforybozylotransferazy hipoksantyno-guaninowej (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026) i fosforybozylotransferazy adeninowej (Łowy i wsp., 1980, Cell 22:817), które mogą być zastosowane w komórkach tk^-, hgprt^- lub aprt^-, odpowiednio. Może być również użyta oporność antymetabolitów jako podstawa selekcji dla genów dhfr, która nadaje oporność na metotreksat (Wigier i wsp., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare i wsp., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, które nadaje oporność na kwas mykofenolowy (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, który nadaje oporność na aminoglikozyd G-418 (Colberre-Garapin I wsp., 1981, J. Mol. Biol. 150:1) i hygro, który nadaje oporność na higromycynę (Santerre i wsp., 1984, Gene 30:147).

Alternatywny system białka fuzyjnego umożliwia szybkie oczyszczanie niezdenaturowanych białek fuzyjnych, których ekspresja zachodzi w komórkach człowieka (Janknecht i wsp., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976). W tym systemie interesujący gen jest subklonowany do plazmidu rekombinacyjnego krowianki tak, że ramka otwartego odczytu genu podlega fuzji translacyjnej do amino-końcowego markera zawierającego sześć reszt histydyny. Ekstrakty z komórek zainfekowanych rekombinacyjnym wirusem krowianki są umieszczane na kolumnach Ni⁺² kwas nitrylooctowy-agaroza i znakowane histydyną białka są selektywnie wymywane buforami zawierającymi imidazol.

Gdy jest używane jako komponent w systemach testowych, jak opisane wyżej, białko podlegające zróżnicowanej ekspresji może być znakowane, bezpośrednio albo pośrednio, w celu ułatwienia detekcji kompleksu utworzonego pomiędzy białkiem podlegającym zróżnicowanej ekspresji i substancją testową. Jakikolwiek z wielu odpowiednich systemów znakowania może być użyty włącznie

125 z (lecz bez ograniczenia do) radioizotopami takimi, jak ¹²⁵I; systemami znakowania enzymów, które generują wykrywalny sygnał kalorymetryczny lub światło pod wpływem ekspozycji na substrat i znakowaniem fluorescencyjnym.

Gdy stosowana jest technologia rekombinacyjnego DNA w celu wytworzenia białka podlegającego zróżnicowanej ekspresji do takich systemów testowych, może być korzystne zastosowanie inżynierii do uzyskania białek fuzyjnych, które ułatwiają znakowanie, immobilizację i/lub detekcję.

W znakowaniu niebezpośrednim używa się białka takiego, jak znakowane przeciwciało, które specyficznie wiąże się z produktem genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji. Takie przeciwciała obejmują (lecz nie są ograniczone do) przeciwciała poliklonalne, monoklonalne, chimeryczne, jednołańcuchowe, fragmenty Fab lub fragmenty wytworzone przez bibliotekę ekspresyjną Fab.

W innym zastosowaniu kwasy nukleinowe zawierające sekwencje kodujące białko RDCVF1 lub RDCVF2 lub jego funkcjonalną pochodną są stosowane do wspomagania czynności czopków siatkówki sposobem terapii genowej. Terapia genowa oznacza terapię przeprowadzaną przez podanie osobnikowi kwasu nukleinowego. W tym zastosowaniu wynalazku, kwas nukleinowy wytwarza białko, które koduje i które wywiera efekt terapeutyczny poprzez wspomaganie czynności czopków siatkówki.

Dowolny z dostępnych sposobów terapii genowej znanych w dziedzinie może być użyty według wynalazku. Przykładowe sposoby są opisane poniżej.

W korzystnym aspekcie terapeutyk zawiera kwas nukleinowy Rdcvf1 lub Rdcvf2, który jest częścią wektora ekspresyjnego, który powoduje ekspresję białka RDCVF1 lub RDCVF2 lub jego fragmentu lub jego białka chimerycznego u odpowiedniego gospodarza. W szczególności taki kwas nukleinowy posiada promotor operacyjnie powiązany z regionem kodującym Rdcvf1 lub Rdcvf2, który to promotor jest indukcyjny lub konstytucyjny i, opcjonalnie, tkankowo-specyficzny. W innym szczególnym zastosowaniu używana jest cząsteczka kwasu nukleinowego, w którym sekwencje kodujące Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub inne pożądane sekwencje są po obu stronach otoczone przez regiony, które promują homologiczną rekombinację w pożądanym miejscu genomu i w ten sposób powodują wewnątrzchromosomalną ekspresję kwasu nukleinowego Rdcvf1 lub Rdcvf2 (Koller i Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra i wsp., 1989, Nature 342:435-438).

Dostarczenie pacjentowi kwasu nukleinowego może być bezpośrednie, w tym przypadku pacjent jest bezpośrednio eksponowany na działanie kwasu nukleinowego lub wektora będącego nosicielem kwasu nukleinowego lub niebezpośrednie, w tym przypadku komórki są najpierw transformowane z kwasem nukleinowym in vitro, następnie transplantowane pacjentowi. Te dwa podejścia są znane, odpowiednio, jako terapia genowa in vivo i ex vivo.

PL 213 658 B1

W specyficznym zastosowaniu kwas nukleinowy jest bezpośrednio podawany in vivo. Gdzie podlega ekspresji wytwarzając kodowany produkt. Można to osiągnąć jednym z wielu sposobów znanych dziedzinie np. przez konstruowanie go jako część odpowiedniego wektora ekspresyjnego kwasu nukleinowego i podawanie go tak, że staje się wewnątrzkomórkowy np. przez infekcję przy użyciu uszkodzonego lub osłabionego wektora retrowirusowego lub innego wektora wirusowego (adenowirus, wirus związany z adenowirusem i lentiwirus) (patrz np. U.S. Pat. No. 4,980,286 i inne wymienione poniżej) lub przez bezpośrednią iniekcję czystego DNA lub przez bombardowanie mikrocząsteczkami (np. pistolet genowy; Biolistic, Dupont) lub powlekanie lipidami lub receptorami powierzchni komórki lub środkami transfekującymi, zamykanie w liposomach, mikrocząsteczkach lub mikrokapsułkach lub przez podawanie go w powiązaniu z peptydem, o którym wiadomo, że wchodzi do jądra, poprzez podawanie go w powiązaniu z Iigandem podlegającym endocytozie za pośrednictwem receptora (patrz np. amerykańskie dokumenty patentowe nr 5,166,320; 5,728,399; 5,874,291 i 6,030,954, z których wszystkie są załączone tu w całości w charakterze odnośników) (które mogą być używane do kierowania do typów komórek, w których specyficznie zachodzi ekspresja receptorów) itp. W innym zastosowaniu może być tworzony kompleks kwas nukleinowy-ligand, w którym Iigand zawiera fuzjogenny peptyd wirusowy do przerywania endosomów, pozwalając kwasowi nukleinowemu na uniknięcie degradacji przez lizosomy. W jeszcze innym zastosowaniu kwas nukleinowy może być celem działania in vivo dla komórkowo-specyficznego wychwytu i ekspresji, przez działanie na specyficzny receptor (patrz np. publikacje zgłoszeń PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO93/14188 i WO 93/20221). Alternatywnie, kwas nukleinowy może być wprowadzany wewnątrzkomórkowo i inkorporowany w obrębie DNA komórki gospodarza w celu wywołania ekspresji, przez homologiczną rekombinację (patrz np. amerykańskie dokumenty patentowe nr 5,413,923; 5,416,260 i 5,574,205 i Zijlstra i wsp., 1989, Nature, 342:435-438).

W specyficznym zastosowaniu stosowany jest wektor wirusowy, który zawiera kwas nukleinowy Rdcvf1 lub Rdcvf2. Na przykład może być stosowany wektor retrowirusowy (patrz np. amerykańskie dokumenty patentowe nr 5,219,740; 5,604,090 i 5,834,182). Te wektory retrowirusowe zostały zmodyfikowane w celu skasowania sekwencji retrowirusowych, które nie są potrzebne do upakowania genomu wirusa i integracji z DNA komórki gospodarza. Kwas nukleinowy Rdcvf1 lub Rdcvf2, który ma być użyty w terapii genowej jest klonowany do wektora, który ułatwia dostarczenie genu pacjentowi.

Adenowirusy są innymi wektorami wirusowymi, które mogą być użyte w terapii genowej. Adenowirusy są szczególnie korzystnymi wektorami do dostarczania genów do nabłonka dróg oddechowych. Adenowirusy naturalnie infekują nabłonek dróg oddechowych, gdzie wywołują łagodną chorobę. Inne cele działania systemów dostarczających opartych na adenowirusach to wątroba, ośrodkowy układ nerwowy, komórki śródbłonka i mięśnie. Adenowirusy mają tę zaletę, że są zdolne do infekowania komórek nie-dzielących się. Sposoby przeprowadzania terapii genowej opartej na adenowirusach są opisane np. w amerykańskich dokumentach patentowych nr 5,824,544; 5,868,040; 5,871,722; 5,880,102; 5,882,877; 5,885,808; 5,932,210; 5,981,225; 5,994,106; 5,994,132; 5,994,134; 6,001,557 i 6,033,8843, z których wszystkie są w całości załączone tu w charakterze odnośników.

Proponowano również zastosowanie w terapii genowej wirusa związanego z adenowirusem (AAV). Wirusy związane z adenowirusami są szczególnie korzystnymi wektorami do dostarczania genów do siatkówki. Sposoby wytwarzania i wykorzystania AAV są, opisane np. w amerykańskich dokumentach patentowych nr 5,173,414; 5,252,479; 5,552,311; 5,658,785; 5,763,416; 5,773,289; 5,843,742; 5,869,040; 5,942,496 i 5,948,675, z których wszystkie są tu załączone w całości w charakterze odnośników.

Inne podejście do terapii genowej polega na przenoszeniu genu do komórek w hodowli tkankowej poprzez takie sposoby, jak elektroporacja, lipofekcja, transfekcja przy użyciu fosforanu wapni lub infekcja wirusowa. Zazwyczaj sposób przenoszenia obejmuje transfer wybieralnego markera do komórek.

Komórki są następnie poddawane selekcji w celu izolacji tych komórek, które przyjęły gen i w których zachodzi jego ekspresja. Te komórki są następnie dostarczane pacjentowi bezpośrednio lub po kapsułkowaniu.

W tym zastosowaniu kwas nukleinowy jest wprowadzany do komórki przed zastosowaniem in vivo powstającej komórki rekombinacyjnej. Takie wprowadzenie może być przeprowadzone jakimkolwiek sposobem znanym w dziedzinie, włącznie z (lecz bez ograniczenia do) transfekcją, elektroporacją, mikroiniekcją, infekcją wektorem wirusowym lub bakteriofagiem zawierającym sekwencje kwasu nukleinowego, fuzją komórkową, transferem genu za pośrednictwem chromosomu, mikrokomórkowym transferem genu, fuzją sferoplastu itp.

PL 213 658 B1

W dziedzinie znanych jest wiele technik wprowadzania obcych genów do komórek i mogą one być stosowane zgodnie z wynalazkiem pod warunkiem, że konieczne rozwojowe i fizjologiczne funkcje tych komórek nie są zaburzone. Technika powinna zapewniać stabilny transfer kwasu nukleinowego do komórki tak, że może on podlegać ekspresji w komórce oraz być dziedziczony i podlegać ekspresji w komórkach potomnych.

Powstające komórki rekombinacyjne mogą być dostarczane pacjentowi różnymi sposobami znanymi w dziedzinie. W korzystnym zastosowaniu komórki nabłonka są wstrzykiwane np. podskórnie. W innym zastosowaniu rekombinacyjne komórki skóry mogą być zastosowane u pacjenta jako przeszczep skóry. Rekombinacyjne komórki krwi (np. komórki macierzyste szpiku lub komórki prekursorowe) są korzystnie stosowane dożylnie. Przewidywana do zastosowania ilość komórek zależy od pożądanego efektu, stanu pacjenta itp. i może być określana przez osobę biegłą w dziedzinie.

Komórki, do których może być wprowadzony kwas nukleinowy do celów terapii genowej obejmują jakiekolwiek pożądany, dostępny typ komórek, do których należą (lecz nie są ograniczone do) komórki nabłonka, komórki śródbłonka, keratynocyty, fibroblasty, komórki mięśniowe, hepatocyty, komórki krwi takie, jak limfocyty T, limfocyty B, monocyty, makrofagi, neutrofile, eozynofile, megakariocyty, granulocyty, różne komórki macierzyste lub prekursorowe, w szczególności komórki macierzyste lub prekursorowe szpiku, np. uzyskane ze szpiku kostnego, pępowiny, krwi obwodowej, wątroby płodu itp.

W korzystnym zastosowaniu komórka stosowana do terapii genowej jest autologiczna w odniesieniu do pacjenta.

W zastosowaniu, w którym komórki rekombinacyjne są stosowane w terapii genowej, kwas nukleinowy Rdcvf1 lub Rdcvf2 jest wprowadzany do komórek tak, że może podlegać ekspresji w komórkach lub ich potomkach i komórki rekombinacyjne są następnie stosowane in vivo w celu wywołania efektu terapeutycznego. W specyficznym zastosowaniu używane są komórki macierzyste lub krwiotwórcze. Jakiekolwiek komórki macierzyste i/lub prekursorowe, które mogą być izolowane i utrzymywane in vitro mogą być potencjalnie użyte zgodnie z tym zastosowaniem wynalazku. Takie komórki macierzyste obejmują (lecz nie są ograniczone do) komórki macierzyste szpiku (HSC), komórki macierzyste tkanek nabłonkowych takich, jak skóra i wyściółka jelit, komórki mięśnia sercowego embrionu, komórki macierzyste wątroby (patrz np. WO 94/08598) i komórki macierzyste układu nerwowego (Stemple i Anderson, 1992, Cell 71:973-985).

Komórki macierzyste nabłonka ((ESCs) lub keratynocyty mogą być uzyskane z tkanek takich, jak skóra i wyściółka jelit znanymi sposobami (Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229). W warstwowej tkance nabłonkowej takiej, jak skóra następuje odnowienie na skutek mitozy komórek macierzystych w warstwie rozrodczej, najbliższej blaszki podstawowej. Komórki macierzyste w obrębie wyściółki jelit umożliwiają szybkie odnowienie tej tkanki. ESCs lub keratynocyty uzyskane ze skóry lub wyściółki jelit pacjenta lub dawcy mogą być hodowane w hodowli tkankowej (Pittelkow i Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771). Jeżeli ESCs pochodzą od dawcy, może być zastosowany sposób hamowania reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi (np. naświetlanie, podanie leku lub przeciwciała w celu wywołania umiarkowanej immunosupresji). Komórki macierzyste siatkówki (Tropepe i wsp., 2000, Science, 287:2032).

W odniesieniu do komórek macierzystych szpiku (HSC), może zostać zastosowana jakakolwiek technika w tym zastosowaniu wynalazku, która zapewnia izolację, rozmnażanie i utrzymywanie HSC in vitro. Do technik, zgodnie z którymi można to uzyskać należą (a) izolacja i założenie hodowli HSC ze szpiku kostnego izolowanego od przyszłego gospodarza lub (b) zastosowanie wcześniej założonych, długoterminowych hodowli HSC, które mogą być alogeniczne lub ksenogeniczne. Nieautologiczne HSC jest stosowane korzystnie w połączeniu ze sposobem hamowania reakcji immunologicznych spowodowanych transplantacją u przyszłego gospodarza/pacjenta. W szczególnym zastosowaniu wynalazku, ludzkie komórki szpiku kostnego mogą być uzyskane z tylnego grzebienia biodrowego przez aspirację igłową (patrz np. Kodo i wsp., 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384). W korzystnym zastosowaniu wynalazku, HSC mogą występować w formie wysoce wzbogaconej lub zasadniczo czystej. To wzbogacenie może zostać dokonane przed, w czasie lub po długotrwałej hodowli i może być wykonane jakąkolwiek techniką znaną w dziedzinie. Długotrwałe hodowle komórek szpiku kostnego mogą być założone i utrzymywane, na przykład, za pomocą zmodyfikowanych technik hodowli komórkowej Dextera (Dexter i wsp., 1977, J. Cell. Physiol. 91:335) lub technik hodowlanych Witlock-Witte'a (Witlock i Witte, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:3608-3612).

PL 213 658 B1

W specyficznym zastosowaniu, kwas nukleinowy, który ma być wprowadzony do celów terapii genowej zawiera indukcyjny promotor operacyjnie powiązany z regionem kodującym tak, że ekspresja kwasu nukleinowego jest kontrolowana przez obecność lub brak odpowiedniego induktora transkrypcji.

Opisane tu są sposoby wytwarzania przeciwciał zdolnych do specyficznego rozpoznawania jednego lub więcej epitopu genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji. Takie przeciwciała mogą obejmować (lecz nie są ograniczone do) przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalne (mAbs), przeciwciała humanizowane lub chimeryczne, przeciwciała o pojedynczym łańcuchu, fragmenty Fab, fragmenty F(ab')2, fragmenty wytworzone przez bibliotekę ekspresyjną Fab, przeciwciała anty-idiotypowe (anti-Id) i fragmenty wiążące epitop któregokolwiek z powyższych. Takie przeciwciała mogą być używane na przykład w wykrywaniu odcisku palca, celu, genu w próbce biologicznej lub, alternatywnie, jako sposób zahamowania patologicznej aktywności genu docelowego. I tak, takie przeciwciała mogą być wykorzystane jako część spośród sposobów leczenia chorób i/lub być używane jako część spośród technik diagnostycznych, w których można testować zmieniony poziom Rdcvf1 lub Rdcvf2 u pacjenta lub obecność patologicznych form Rdcvf1 lub Rdcvf2 przez pobieranie cieczy wodnistej i/lub ciała szklistego sposobami znanymi osobom biegłym w dziedzinie (np. Forster, RK, Abbott, RL, Gelender, H. (1980) Management of infectious endophtalmitis Ophtalmology 87, 313-319).

W celu wytworzenia przeciwciał przeciwko genowi podlegającemu zróżnicowanej ekspresji, można immunizować różne zwierzęta-gospodarzy przez iniekcję białka o zróżnicowanej ekspresji lub jego części lub przez immunizację za pomocą DNA. Takie zwierzęta-gospodarze obejmują (lecz nie są ograniczone do) króliki, myszy i szczury, wymieniając tylko niektóre. Różne adiuwanty mogą być zastosowane w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej, zależnie od gatunków gospodarzy, włącznie z (lecz bez ograniczenia do), adiuwantem Freunda, żelami mineralnymi, jak wodorotlenek glinu, substancjami powierzchniowo czynnymi, jak lizolecytyna, poliole powierzchniowo czynne, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocjaninę pochodzącą od czareczki, dinitrofenol i potencjalnie użyteczne ludzkie adiuwanty, jak BCG (pałeczka Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum.

Przeciwciała poliklonalne są heterogennymi populacjami cząsteczek przeciwciał otrzymywanymi z osocza zwierząt immunizowanych antygenem takim jak docelowy produkt genu lub jego antygenowa funkcjonalna pochodna. W celu wytworzenia przeciwciał poliklonalnych zwierzęta-gospodarze takie, jak opisani powyżej, mogą być immunizowane przez iniekcję produktu genu podlegającego zróżnicowanej ekspresji uzupełnionego adiuwantami, jakie również opisano powyżej.

Przeciwciała monoklonalne, które są homogennymi populacjami przeciwciał przeciwko szczególnemu antygenowi, mogą być uzyskane przez zastosowanie dowolnej techniki, która prowadzi do wytworzenia cząsteczek przeciwciał przez ciągłe linie komórkowe w hodowli. Należą do nich (lecz nie są ograniczone do) technika hybrydoma według Kohlera i Milsteina (1975, Nature 256:495-497 i amerykański dokument patentowy nr 4,376,110), technika hybrydoma ludzkich komórek B (Kosbor i wsp., 1983, Immunology Today 4:72; Cole i wsp., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030), i technika hybrydoma-EBV (Cole i wsp., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., str. 77-96). Takie przeciwciała mogą należeć do którejkolwiek klasy immunoglobulin włącznie z IgG, IgM, IgE, IgA, IgD i którejkolwiek ich podklasy. Hybrydoma wytwarzające mAb według wynalazku może być hodowane in vitro i in vivo. Wytwarzanie wysokich mian mAb in vivo jest szczególnie korzystnym sposobem wytwarzania.

Dodatkowo, mogą być zastosowane techniki opracowane w celu wytwarzania „przeciwciał chimerycznych (Morrison i wsp., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855); Neuberger i wsp., 1984, Nature, 312:604-608); Takeda i wsp., 1985, Nature, 314:452-454) przez łączenie genów z cząsteczki przeciwciała myszy o odpowiedniej specyficzności antygenowej z genami z cząsteczki ludzkiego przeciwciała o odpowiedniej aktywności biologicznej. Przeciwciało chimeryczne jest cząsteczką, w której rożne części są uzyskane od różnych gatunków zwierząt taką, jak cząsteczka posiadająca zmienny lub hiperzmienny region pochodzący od mysiego mAb i stały region ludzkiej immunoglobuliny.

Alternatywnie, techniki opisane do wytwarzania przeciwciał o pojedynczym łańcuchu (amerykański dokument patentowy nr 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423-426; Huston i wsp. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883) i Ward i wsp., 1989, Nature 334:544-546) mogą być zaadaptowane do wytwarzania przeciwciał o jednym łańcuchu przeciwko genowi podlegającemu zróżnicowanej ekspresji. Przeciwciała o pojedynczym łańcuchu są tworzone przez łączenie fragmentów łańcucha ciężkiego i lekkiego regionu Fv przez mostek aminokwasowy, co powoduje powstanie polipeptydu o pojedynczym łańcuchu.

PL 213 658 B1

Najkorzystniej, techniki użyteczne do wytwarzania „humanizowanych przeciwciał mogą być zaadaptowane do wytwarzania przeciwciał przeciwko polipeptydom, fragmentom, pochodnym i funkcjonalnym ekwiwalentom ujawnionym tutaj. Takie techniki są ujawnione w amerykańskich dokumentach patentowych nr 5,932, 448; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 5,530,101; 5,910,771; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650, 5,545,580; 5,661,016 i 5,770,429, których ujawnienia są załączone tu w całości jako odnośniki.

Fragmenty przeciwciała, które rozpoznają specyficzne epitopy mogą być wygenerowane za pomocą znanych technik. Na przykład, takie fragmenty obejmują (lecz nie są ograniczone do) fragmenty F(ab')2, które mogą być tworzone przez wytrawianie pepsyną cząsteczki przeciwciała i fragmenty Fab, które mogą być generowane przez redukcję mostków dwusiarczkowych fragmentów F(ab')2. Alternatywnie, mogą być konstruowane biblioteki ekspresyjne Fab (Huse i wsp., 1989, Science, 246:1275-1281) w celu umożliwienia szybkiej i łatwej identyfikacji fragmentów monoklonalnego Fab o pożądanej specyficzności.

Szczególnie korzystny, dla łatwego wykrywania, jest test sandwiczowy, który ma wiele wariantów, z których wszystkie mogą być wykorzystane według wynalazku.

Na przykład w typowym teście progresywnym przeciwciało jest unieruchamiane na stałym substracie i próbka, która ma być badana, wchodzi w kontakt ze związaną cząsteczką. Po odpowiednim czasie inkubacji powstaje binarny kompleks przeciwciało-antygen. W tym punkcie drugie przeciwciało znakowane cząsteczką reportera zdolną do indukowania wykrywalnego sygnału jest dodawane i inkubowane, przez czas wystarczający do powstania trójskładnikowego kompleksu przeciwciało-antygen-znakowane przeciwciało. Jakikolwiek nieprzereagowany materiał jest wymywany i obecność antygenu jest określana przez obserwację sygnału lub może być zmierzona ilościowo przez porównanie z próbką kontrolną zawierającą znaną ilość antygenu. Odmiany testu progresywnego obejmują test jednoczesny, w którym zarówno próbka, jak i przeciwciało są dodawane jednocześnie do związanego przeciwciała lub test odwrotny, w którym znakowane przeciwciało i próbka do badania są najpierw łączone, inkubowane i dodawane do nie-znakowanego przeciwciała związanego powierzchniowo. Te techniki są dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie, a możliwość nieznacznych zmian będzie oczywista. Jak stosuje się tutaj, należy rozumieć, że „test sandwiczowy obejmuje wszystkie odmiany podstawowej techniki dwustronnej. Dla testów immunologicznych według wynalazku, jedynym czynnikiem ograniczającym jest to, że nieznakowane i znakowane przeciwciała są specyficzne dla RdCVF1 lub RdCVF2.

Najczęściej używanymi cząsteczkami reportera w tym typie testu są albo enzymy, albo cząsteczki zawierające fluorofor lub radionuklid. W przypadku enzymatycznego testu immunologicznego enzym jest koniugowany z drugim przeciwciałem, zazwyczaj przy użyciu aldehydu glutarowego lub nadjodanu. Jednakże, jak wkrótce stanie się jasne, istnieje wiele technik odmiennego wiązania, które są dobrze znane osobie biegłej w dziedzinie. Do powszechnie stosowanych enzymów należy między innymi peroksydaza chrzanu, oksydaza glukozy, beta-galaktozydaza i fosfataza alkaliczna. Substraty używane ze specyficznymi enzymami są ogólnie wybierane do powodowania, przez hydrolizę odpowiadającego enzymu, wykrywalnej zmiany koloru. Na przykład fosforan p-nitrofenylu jest odpowiedni do stosowania z koniugatami alkalicznej fosfatazy; dla koniugatów peroksydazy stosuje się powszechnie 1,2-fenylenodiaminę lub toluidynę. Możliwe jest również zastosowanie substratów fluorogennych, które powodują powstanie fluoroscencyjnego produktu zamiast substratów chromogennych opisanych powyżej. Roztwór zawierający odpowiedni substrat jest następnie dodawany do trzeciorzędowego kompleksu przeciwciało-RdCVF1 lub RdCVF2-znakowane przeciwciało. Substrat reaguje z enzymem połączonym z drugim przeciwciałem powodując powstanie jakościowego wizualnego sygnału, który może być dalej oceniany ilościowo, zazwyczaj przez spektrofotometrię, w celu oznaczenia ilości Rdcvf1 lub Rdcvf2, który jest obecny w próbce osocza.

Zamiennie, związki fluorescencyjne, jak fluoresceina i rodamina, mogą być chemicznie sprzęgane z przeciwciałami bez zmieniania ich zdolności do wiązania. Gdy jest aktywowane światłem o określonej długości fali, przeciwciało znakowane fluorochromem absorbuje energię światła, indukuje stan pobudzenia w cząsteczce, po czym następuje emisja światła o charakterystycznej dłuższej fali. Emisja występuje jako charakterystyczny kolor wykrywalny wizualnie w mikroskopie świetlnym. Immunofluorescencja i techniki EIA są bardzo dobrze znane w dziedzinie i są szczególnie korzystne w tym sposobie. Jednakże, inne cząsteczki reportera, jak radioizotopy, cząsteczki chemiluminescencyjne lub bioluminescencyjne mogą być również wykorzystane. Dla osoby biegłej w dziedzinie będzie oczywiste, jak można zmieniać procedurę w wymaganym zastosowaniu.

PL 213 658 B1

W zakres wynalazku wchodzi zastosowanie polinukleotydów według wynalazku jako odczynników diagnostycznych. Wykrywanie zmutowanej formy genu kodującego polipeptyd wybrany z grupy składającej się z polipeptydów określonych w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, która ma związek z dysfunkcją może być narzędziem diagnostycznym, które może służyć dodatkowo postawieniu diagnozy lub służyć jako podstawa diagnozy choroby lub wrażliwości na zachorowanie, co wynika ze zbyt małej ekspresji, nadmiernej ekspresji lub zmienionej przestrzennej lub aktualnej ekspresji genu. Osoby będące nosicielami mutacji genu mogą być wykrywane na poziomie DNA za pomocą różnych technik.

Kwasy nukleinowe do diagnozowania mogą być uzyskane z komórek osobnika, np. z krwi, moczu, śliny, biopsji tkankowej lub materiału z autopsji. Genomowe DNA może być używane bezpośrednio do wykrywania lub może być amplifikowane enzymatycznie przy użyciu PCR lub innych technik amplifikacji przed analizą. RNA lub cDNA może być również użyte w podobny sposób. Delecje i wtrącenia mogą być wykryte przez zmianę wymiaru amplifikowanego produktu w porównaniu z normalnym genotypem. Mutacje punktowe mogą być zidentyfikowane przez hybrydyzację amplifikowanego DNA ze znakowaną sekwencją nukleotydów. Doskonale dopasowane sekwencje mogą być odróżnione od niedopasowanych dupleksów przez wytrawianie RNazą lub na podstawie różnicy temperatur topnienia. Różnice sekwencji DNA mogą również być wykrywane na podstawie zmian ruchliwości elektroforetycznej fragmentów DNA w żelach, z dodatkiem lub bez środków denaturujących (SSCP) lub przez bezpośrednie sekwencjonowanie DNA (np. Myers i wsp., Science, (1985) 230:1242). Zmiany sekwencji w specyficznych miejscach mogą być również ujawnione w testach ochrony nukleazy, jak ochrona RNazy i S1 lub przez chemiczne rozszczepienie (patrz Cotton i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401). W innym zastosowaniu szereg próbek oligonukleotydów zawierających sekwencje nukleotydów Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub jej fragmenty może zostać utworzony w celu przeprowadzenia skutecznego skriningu np. mutacji genetycznych. Sposoby technologii szeregowych są dobrze znane w dziedzinie i są ogólnie stosowane oraz mogą być zastosowane do rozwiązywania wielu problemów genetyki molekularnej włącznie z ekspresją genów, związków genetycznych i zmienności genetycznej (patrz na przykład M. Chee i wsp., Science, Vol. 274, str. 610-613 (1996).

Testy diagnostyczne oferują możliwość diagnozowania lub określania wrażliwości na zachorowanie poprzez wykrywanie mutacji genu Rdcvf1 lub Rdcvf2 opisanymi sposobami. Dodatkowo, takie choroby mogą być diagnozowane sposobami polegającymi na stwierdzaniu w próbce pobranej od osobnika obecności patologicznej ekspresji Rdcvf1 lub Rdcvf2: ekspresja może być zmierzona na poziomie RNA przy użyciu któregokolwiek ze sposobów dobrze znanych w dziedzinie służących do kwantyfikacji polinukleotydów, jak na przykład amplifikacja kwasu nukleinowego, na przykład PCR, RT-PCR, ochrona RNazy, Northern blotting i inne sposoby hybrydyzacji. Techniki testów, które mogą być zastosowane w celu określenia ilości białka takiego, jak polipeptyd według wynalazku, w próbce uzyskanej od gospodarza, są dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie. Takie sposoby testowe obejmują testy radioimmunologiczne, testy wiązania konkurencyjnego, analizę Western Blot i testy ELISA.

I tak, w innym aspekcie, w zakres wynalazku wchodzi zestaw diagnostyczny, który zawiera:

(a) polinukleotyd według wynalazku, korzystnie sekwencję nukleotydów kodującą polipeptyd wybrany z grupy składającej się z polipeptydów, jak określono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14 lub jego fragmenty;

(b) sekwencję nukleotydów komplementarną do sekwencji z (a);

(c) polipeptyd według wynalazku, korzystnie polipeptyd lub jego fragmenty lub (d) przeciwciało przeciwko polipeptydowi według wynalazku, korzystnie przeciwko polipeptydowi wybranemu z grupy składającej się z polipeptydów określonych w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14.

Będzie korzystne, jeżeli którykolwiek z tych zestawów (a), (b), (c) lub będzie zawierał zasadniczy komponent. Taki zestaw będzie użyteczny w diagnozowaniu choroby lub wrażliwości na zachorowanie, w szczególności na barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, związaną z wiekiem degenerację

PL 213 658 B1 plamki, zespół Bardet-Biedela, zespół Bassen-Kornzweiga, chorobę Besta, postępujące zwyrodnienie naczyniówki i siatkówki, zanik kolisty, wrodzone barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (congenital amourosis), zespół Refsuna, chorobę Stargardta i zespół Ushera. Sekwencje nukleotydów według wynalazku są również użyteczne w lokalizacji chromosomów. Lokalizacja chromosomowa może być uzyskane przez PCR lub DNA przygotowane z panelu hybrydowych linii komórkowych (mysz-chomik). Lokalizacja chromosomowa genu człowieka może być przewidziana na podstawie lokalizacji genu myszy przez syntenię (syntheny) (McCarthy i wsp., (1997), Genome research, 7, 1153). Sekwencja jest szczególnie celem do określenia i może hybrydyzować ze szczególną lokalizacją na indywidualnym chromosomie, włącznie z chromosomem myszy lub człowieka. Mapowanie odpowiednich sekwencji na chromosomie według wynalazku jest ważnym pierwszym etapem w korelowaniu tych sekwencji z chorobą związaną z genem. Gdy sekwencja zostanie mapowana w dokładnej lokalizacji chromosomu, fizyczna pozycja sekwencji na chromosomie może być skorelowana z danymi z mapy genetycznej. Takie dane dostępne są np. w V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (dostępne online poprzez John Hopkins University Welch Medical Library, RetNet). Związek między genami a chorobami, po poddaniu mapowaniu w tym samym regionie chromosomu może zostać zidentyfikowany przez analizę łączącą (współdziedziczenie fizycznie przylegających genów).

Różnice w cDNA lub sekwencji genomu pomiędzy chorymi i zdrowymi osobnikami mogą być również określone. Jeżeli obserwowana jest mutacja u niektórych lub wszystkich chorych osobników, lecz u żadnego zdrowego osobnika, wtedy jest możliwe, że mutacja jest przyczyną choroby.

Zgodnie z wynalazkiem kompozycji farmaceutyczna może być podawana w połączeniu z farmaceutycznie akceptowanym nośnikiem w celu uzyskania któregokolwiek efektów terapeutycznych opisywanych powyżej. Takie kompozycje farmaceutyczne mogą się składać z mimetyków lub agonistów Rdcvf1 lub Rdcvf2. Kompozycje mogą być podawane w monoterapii lub w kombinacji z co najmniej jednym innym środkiem takim, jak związek stabilizujący, który może być podawany w jakimkolwiek sterylnym, biokompatybilnym nośniku farmaceutycznym włącznie z (lecz bez ograniczenia do) soli, zbuforowanej soli, dekstrozy i wody. Kompozycje mogą być podawane pacjentowi w monoterapii lub w kombinacji z innymi środkami, lekami lub hormonami.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być podawane różnymi drogami: np. Transscleral delivery of bioreactive protein to the choroid and retina Ambati i wsp. (2000) Investigative Ophtalmology and Visual Science, 41, 1186. Forma preparatów okulistycznych do miejscowego stosowania, włącznie z roztworami, zawiesinami i maściami jest dobrze znana osobom biegłym w dziedzinie (patrz Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Rozdział 86, strony 1581-1592 Mack Publishing Company, 1990). Dostępne są inne sposoby podawania, włącznie z iniekcjami do komory oka (które mogą być wykonane bezpośrednio do komory przedniej lub do ciała szklistego), iniekcje podspojówkowe i zagałkowe; sposoby i środki do produkcji preparatów okulistycznych odpowiednich do takich dróg podania są również dobrze znane.

Jak stosuje się w tym zgłoszeniu, „pozaoczne odnosi się do powierzchni oka i (zewnętrznej) przestrzeni pomiędzy gałką oczną a powieką. Przykłady regionów pozaocznych obejmują łuk lub ślepo zakończoną jamę powieki, powierzchnie spojówek i powierzchnię rogówki. Ta lokalizacja jest zewnętrzna w stosunku do całkowitej tkanki oka i inwazyjna procedura nie jest wymagana do dostania się do tego rejonu. Przykłady pozaocznych systemów obejmują wkładki i „miejscowo stosowane krople, żele lub maści, które mogą być używane do dostarczania materiału terapeutycznego tych rejonów. Przyrządy pozaoczne są ogólnie łatwo usuwalne, nawet przez pacjenta.

Następujące dokumenty patentowe ujawniają systemy pozagałkowe, które są używane do podawania leków do rejonów pozagałkowych. Higuchi i wsp. ujawnia w amerykańskich dokumentach patentowych nr 3,981,303, 3,986,510 i 3,995,635 ulegającą biodegradacji wkładkę oczną, która zawiera lek. Wkładka może przybierać różne kształty w celu utrzymania w ślepo zakończonej jamie powieki, pozagałkowej przestrzeni między gałką oczną a powieką. Ujawniono kilka zwykłych biokompatybilnych polimerów jako użytecznych w wytwarzaniu tego przyrządu. Te polimery obejmują alginian cynku, poli(kwas mlekowy), polialkohol winylowy), poli(bezwodniki) i poli(kwas glikolowy). Dokumenty patentowe również opisują urządzenia pokryte błoną o obniżonej przenikaIności dla leku i wklęsłe komory utrzymujące preparat.

Theeuwes, w amerykańskim dokumencie patentowym nr 4,217,898 ujawnia mikroporowate zbiorniczki, które są używane do kontrolowania dostarczania leku. Te urządzenia są umieszczane poza gałką oczną w ślepo zakończonej jamie spojówek spojówkowym. Do interesujących systemów polimerowych należą kopolimery poli(chlorku winylu)-ko-poli(octanu winylu). Kaufman ujawnia w ame22

PL 213 658 B1 rykańskich dokumentach patentowych nr 4,865,846 i 4,882,150 system dostarczania leku okulistycznego, który zawiera co najmniej jeden materiał bioerozyjny lub nośnik maści do worka spojówkowego. Dokument patentowy ujawnia systemy polimerowe takie, jak poli(laktyd), poli(glikolid), poli(alkohol winylowy) i poprzecznie usieciowany kolagen jako odpowiednie systemy dostarczania.

W obecnie opisywanym zastosowaniu produktu białkowego RDCVF1 lub RDCVF2 do leczenia choroby lub uszkodzenia siatkówki, korzystne jest również to, że miejscowo stosowane preparaty okulistyczne zawierają środek nasilający penetrację lub transport środka leczniczego do oka. Takie środki są znane w dziedzinie. Na przykład Ke i wsp., amerykański dokument patentowy nr 5,221,696 ujawnia zastosowanie materiałów do zwiększania penetracji preparatów okulistycznych przez rogówkę.

Systemy wewnątrzgałkowe są systemami, które są odpowiednie do zastosowania w dowolnym kompartmencie tkankowym w obrębie, pomiędzy lub wokół warstw tkankowych samego oka. Te miejsca obejmują obszar podspojówkowy (pod błoną śluzową przylegającą do gałki ocznej), obszar zagałkowy (za gałką oczną) i obszar wewnątrzkomorowy (wewnątrz komór samej gałki ocznej). W przeciwieństwie do systemów pozaocznych, dostęp do tych obszarów wymaga inwazyjnej procedury polegającej na iniekcji lub implantacji.

Następujące dokumenty patentowe ujawniają urządzenia wewnątrzgałkowe. Wong, amerykański dokument patentowy nr 4,853,224 ujawnia leki w mikrokapsułkach do podawania do komory oka. Polimery, które są używane w tym systemie obejmują poliestry i polietery. Lee, amerykański dokument patentowy 4,863,457 ujawnia ulegające biodegradacji urządzenie, które jest chirurgicznie wszczepiane do oka w celu zapewnienia przedłużonego uwalniania środków terapeutycznych. Urządzenie jest przeznaczone do chirurgicznego wszczepiania pod spojówkę (błona śluzowa gałki ocznej). Krezancaki, amerykański dokument patentowy 4,188,373 ujawnia podłoże farmaceutyczne, które przechodzi w formę żelu w temperaturze ludzkiego ciała. To podłoże jest wodną zawiesiną leku i syntetycznych pochodnych gum lub pochodnych celulozy. Haslam i wsp. ujawniają w amerykańskich dokumentach patentowych nr 4,474,751 i 4,474,752 system polimer-lek, który jest płynny w temperaturze pokojowej i przechodzi w formę żelu w temperaturze ciała. Odpowiednie polimery używane w tym systemie obejmują polioksyetylen i polioksypropylen. Davis i wsp. ujawniają w patencie U.S. Pat. Nr 5,384,333 ulegający biodegradacji, iniekcyjny polimer do dostarczania leku, który zapewnia długotrwałe uwalnianie leku. Kompozycja leku składa się ze środka farmaceutycznie aktywnego w ulegającej biodegradacji matrycy polimerowej, gdzie matryca polimerowa jest w stanie stałym w zakresie temperatur 20°C do 37°C i przechodzi w stan płynny w zakresie temperatur 38°C do 52°C. Polimer do dostarczania leku nie jest ograniczony do dostarczania rozpuszczalnych lub płynnych preparatów farmaceutycznych. Na przykład polimer może być używany jako matryca do stabilizowania i utrzymywania w miejscu iniekcji zawierających lek mikrosfer, liposomów lub innych leków połączonych z cząsteczkami.

Szczególnie odpowiednim podłożem do iniekcji wewnątrzgałkowych jest sterylna woda destylowana, w której produkt białkowy RDCVF1 lub RDCVF2 jest w formie sterylnego, izotonicznego roztworu, właściwie konserwowanego. Jeszcze inny preparat okulistyczny może składać się z produktu białkowego RDCVF1 lub RDCVF2 ze środkiem takim, jak iniekcyjne mikrosfery lub liposomy, który zapewnia wolne lub przedłużone uwalnianie białka, które może być wówczas dostarczane jako iniekcja depot. Inne odpowiednie środki do wewnątrzgałkowego dostarczania produktu białkowego RDCVF1 lub RDCVF2 obejmują urządzenia dostarczające leki, które są implantowane lub zawierające produkt białkowy RDCVF1 lub RDCVF2.

Preparaty okulistyczne według wynalazku, szczególnie preparaty do miejscowego stosowania, mogą zawierać inne komponenty, na przykład akceptowane w okulistyce środki konserwujące, środki tonizujące, ko-solwenty, środki zwilżające, środki kompleksujące, środki buforujące, środki przeciw drobnoustrojom, przeciwutleniacze i środki powierzchniowo czynne, które są dobrze znane w dziedzinie. Na przykład odpowiednie środki tonizujące obejmują halidki metali alkalicznych (korzystnie chlorek sodu lub chlorek potasu), mannit, sorbit i tym podobne. Skuteczny środek tonizujący jest korzystnie dodawany tak, że preparat, który ma być podany do oka jest hipotoniczny lub zasadniczo izotoniczny. Odpowiednie środki konserwujące obejmują (lecz nie są ograniczone do) chlorek benzalkonium, timerosal, alkohol fenetylowy, metyloparaben, propyloparaben, chlorheksydynę, kwas sorbinowy i tym podobne. Nadtlenek wodoru może również być stosowany jako środek konserwujący. Odpowiednie współrozpuszczalniki obejmują (lecz nie są ograniczone do) glicerynę, glikol propylenowy i poli(glikol etylenowy). Odpowiednie środki kompleksujące obejmują kofeinę, poliwinylopirolidon, beta-cyklodekstrynę lub hydroksypropylo-beta-cyklodekstrynę. Odpowiednie środki powierzchniowo czynne lub środki zwilżające obejmują (lecz nie są ograniczone do) estry sorbitanu, polisorbaty, jak

PL 213 658 B1 polisorbat 80, trometaminę, lecytynę, cholesterol, tyloksapol i tym podobne. Bufory mogą być konwencjonalnymi buforami, jak boran, cytrynian, fosforan, węglan lub Tris-HCI.

Komponenty preparatu są obecne w stężeniach, które są akceptowalne do pozaocznego lub wewnątrzgałkowego miejsca podania. Na przykład bufory są stosowane do utrzymywania kompozycji w fizjologicznym pH lub nieznacznie niższym pH, typowo w zakresie pH od około 5 do około 8. Dodatkowe komponenty preparatu mogą obejmować materiały, które zapewniają przedłużoną obecność środka terapeutycznego podanego pozaocznie tak, aby zmaksymalizować miejscowy kontakt i nasilić absorpcję. Odpowiednie materiały obejmują polimery lub tworzące żel materiały, które zapewniają zwiększoną lepkość preparatu okulistycznego. Chitozan jest szczególnie odpowiednim materiałem, jako środek kontrolujący tempo uwalniania leku okulistycznego w płynnych preparatach o przedłużonym uwalnianiu (patrz amerykański dokument patentowy 5,422,116, Yen i wsp.). To czy preparaty według wynalazku są odpowiednie do kontrolowanego uwalniania (np. o przedłużonym uwalnianiu) okulistycznego środka leczniczego w oku może być ustalona zgodnie z procedurami znanymi w dziedzinie, np. jak opisano w Journal of Controlled Release, 6:367-373, 1887, jak również jego odmianami.

W dodatku do składników czynnych, te kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać odpowiednie akceptowane farmaceutycznie nośniki zawierające składniki i substancje pomocnicze, które ułatwiają przetwarzanie związków czynnych w celu wytworzenia preparatów, które mogą mieć zastosowanie farmaceutyczne. Dalsze szczegóły na temat technik tworzenia preparatów i ich administrowania można znaleźć w ostatnim wydaniu Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa).

Kompozycje farmaceutyczne do stosowania doustnego mogą być wytwarzane z użyciem farmaceutycznie akceptowanych nośników dobrze znanych w dziedzinie w dawkach odpowiednich do stosowania doustnego. Takie nośniki umożliwiają formowanie kompozycji farmaceutycznych w tabletki, pigułki, drażetki, kapsułki, płyny, żele, syropy, rzadkie zawiesiny, zawiesiny i tym podobne, do zażycia przez pacjenta.

Preparaty farmaceutyczne do stosowania doustnego mogą być uzyskane poprzez kombinację związków aktywnych ze stałą substancją nieaktywną, opcjonalnie mielenie powstałej mieszaniny i przetwarzanie mieszaniny granulek, po dodaniu odpowiednich substancji pomocniczych, jeżeli to pożądane, w celu uzyskania tabletek lub rdzeni drażetek. Odpowiednie substancje nieaktywne to wypełniacze węglowodanowe lub białkowe takie, jak cukry, włącznie z laktozą, sacharozą, mannitolem lub sorbitolem; skrobia kukurydziana, pszenna, ryżowa, ziemniaczana lub z innych roślin; celuloza taka, jak metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza lub karboksymetyloceluloza sodowa; gumy włącznie z arabską i tragakantową i białka takie, jak żelatyna i kolagen. Jeżeli to pożądane mogą być dodane środki dezintegrujące lub rozpuszczające takie, jak poprzecznie usieciowany o poliwinylopirolidon, agar, kwas alginowy Iub jego sól, jak alginian sodu.

Rdzenie drażetek mogą być stosowane z odpowiednimi powłoczkami takimi, jak stężone roztwory cukrowe, które mogą również zawierać gumę arabską, talk, poliwinylopirolidon, żel karbopol, poli(glikol etylenowy) i/lub dwutlenek tytanu, roztwory lakierujące i odpowiednie organiczne rozpuszczalniki lub mieszaniny rozpuszczalników. Farby lub pigmenty mogą być dodane do tabletek lub powłoczek drażetek w celu identyfikacji produktu i scharakteryzowania ilości związku aktywnego tj. dawkowania.

Preparaty farmaceutyczne, które mogą być stosowane doustnie obejmują odkształcalne kapsułki z żelatyny, jak również miękkie, stemplowane kapsułki z żelatyny i powłoczki takiej, jak glicerol lub sorbit. Odkształcalne kapsułki mogą zawierać składniki aktywne wymieszane z wypełniaczem lub środkami wiążącymi takimi, jak laktoza lub skrobie, środki zwilżające takie, jak talk lub stearynian magnezu i opcjonalnie, stabilizatory. W miękkich kapsułkach związki aktywne mogą być rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich płynach takich, jak tłuszcz ciekły, płyn, płynny glikol polietylenowy ze stabilizatorami lub bez.

Preparaty farmaceutyczne odpowiednie do stosowania parenteraInego mogą być wytwarzane w roztworach wodnych, korzystnie w fizjologicznie kompatybilnych buforach takich, jak roztwór Hanksa, roztwór Ringera lub fizjologicznie zbuforowana sól. Wodne zawiesiny do iniekcji mogą zawierać substancje, które zwiększają lepkość zawiesiny takie, jak karboksymetyloceluloza sodowa, sorbitol lub dekstran. Dodatkowo, zawiesiny związków aktywnych mogą być przygotowane jako odpowiednie zawiesiny olejowe do iniekcji. Odpowiednie Iipofilowe rozpuszczalniki lub podłoża obejmują płynne tłuszcze takie, jak olej sezamowy lub syntetyczne estry kwasów tłuszczowych, jak oleinian etylu lub triglicerydy lub liposomy. Nielipidowe polikationowe aminopolimery mogą również być używane jako nośniki.

PL 213 658 B1

Opcjonalnie, zawiesina może również zawierać odpowiednie stabilizatory lub środki, które zwiększają rozpuszczalność związków, aby umożliwić przygotowanie bardzo stężonych roztworów.

Do stosowania miejscowego lub donosowego, w preparacie stosuje się środki penetrujące odpowiednie do szczególnej bariery, przez którą ma zachodzić penetracja. Takie środki penetrujące są ogólnie znane w dziedzinie.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być wytwarzane w sposób znany w dziedzinie np. przez konwencjonalne mieszanie, rozpuszczanie, granulowanie, tworzenie drażetek, mielenie mokre i frakcjonowanie sedymentacyjne, emulgowanie, kapsułkowanie, zamykanie lub liofilizację.

Kompozycje farmaceutyczne mogą być w formie soli i być tworzone z wieloma kwasami włącznie (lecz bez ograniczenia do) solnego, siarkowego, octowego, mlekowego, winowego, jabłkowego, bursztynowego, itp. Sole mają tendencję do większej rozpuszczalności w wodnych lub innych protonowych rozpuszczalnikach niż odpowiednie formy wolnej zasady. W innych przypadkach korzystnym preparatem może być liofilizowany proszek, który może zawierać którekolwiek lub wszystkie z następujących: 1-50 mM histydyny, 0,1%-2% sacharozy i 2-7% mannitu w zakresie pH 4,5-5,5, który jest łączony z buforem przed użyciem.

Po przygotowaniu kompozycji farmaceutycznych, umieszczane są one w odpowiednim pojemniku i oznakowane do leczenia wskazanego schorzenia. Przy stosowaniu Rdcvf1 lub Rdcvf2 takie oznakowanie będzie obejmowało ilość, częstotliwość i sposób stosowania.

Kompozycje farmaceutyczne odpowiednie do stosowania według wynalazku obejmują kompozycje, w których składniki aktywne są zawarte w ilości skutecznej do osiągnięcia zamierzonego skutku. Określenie skutecznej dawki jest możliwe dla osób biegłych w dziedzinie.

Dla jakiegokolwiek związku, dawka terapeutycznie skuteczna może być wstępnie określona w badaniach na hodowlach komórkowych np. komórkach nowotworowych lub na modelach zwierzęcych, zazwyczaj myszach, królikach, psach lub świniach. Model zwierzęcy może być również stosowany do określenia odpowiedniego zakresu stężeń i drogi podania. Takie informacja mogą być następnie użyte do określenia właściwych dawek i dróg podania u ludzi.

Dawka terapeutycznie skuteczna oznacza ilość składnika aktywnego, na przykład Rdcvf1 lub Rdcvf2 lub ich fragmentów, przeciwciał przeciwko Rdcvf1, agonistów, która powoduje poprawę w zakresie objawów lub stanu. Skuteczność terapeutyczna i toksyczność mogą być określone na podstawie standardowych procedur farmaceutycznych w hodowlach komórkowych lub na zwierzętach eksperymentalnych, np. ED50 (dawka terapeutycznie skuteczna u 50% populacji) i LD50 (dawka śmiertelna dla 50% populacji). Stosunek dawki pomiędzy efektem toksycznym a terapeutycznym to indeks terapeutyczny; może on być wyrażony jako stosunek LD50/ED50. Korzystne są kompozycje farmaceutyczne, które mają wysokie indeksy terapeutyczne. Dane uzyskane z testów na hodowlach komórkowych i w badaniach na zwierzętach używane są do określania zakresu dawek do stosowania u człowieka. Dawka zawarte w takich kompozycjach jest korzystnie w zakresie krążących stężeń, które obejmują ED50 z niewielką toksycznością lub bez toksyczności. Dawka jest zróżnicowana w tym zakresie zależnie od zastosowanej formy leku, wrażliwości pacjenta i drogi podania.

Dokładna dawka jest określana przez praktyka w świetle czynników związanych z osobnikiem, który wymaga leczenia. Dawka i podanie leku są dostosowywane w celu zapewnienia wystarczających stężeń składnika aktywnego lub utrzymania pożądanego efektu. Czynniki, które mogą być wzięte pod uwagę obejmują nasilenie stanu chorobowego, ogólne zdrowie osobnika, wiek, wagę i płeć osobnika, dietę, czas i częstotliwość podawania leku, kombinacje leków, reakcje nadwrażliwości oraz tolerancję/reakcję na terapię. Długo działające kompozycje farmaceutyczne mogą być stosowane co 3 do 4 dni, co tydzień lub raz na dwa tygodnie zależnie od okresu półtrwania i szybkości klirensu szczególnego preparatu.

Normalne zakresy dawek mogą wahać się od 0,1 do 100000 mikrogramów do dawki całkowitej 1 g, zależnie od drogi podania. Wskazówki co do szczególnych dawek i sposobów dostarczania leków są podane w literaturze i ogólnie dostępne dla praktyków. Osoby biegłe w dziedzinie zastosują różne preparaty dla nukleotydów niż dla białek lub ich inhibitorów. Podobnie, dostarczanie polinukleotydów lub polipeptydów będzie specyficzne dla szczególnych komórek, stanów, umiejscowienia itp. Preparaty farmaceutyczne odpowiednie do stosowani doustnego białek są opisane np. w amerykańskich dokumentach patentowych nr 5,008,114; 5,505,962; 5,681,811; 5,700,486; 5,766,633; 5,792,451; 5,853,748; 5,972,387; 5,976,569 i 6,051,561.

Następujące przykłady ilustrują wynalazek bez ograniczania jego zakresu.

PL 213 658 B1

P r z y k ł a d y

1. Klonowanie ekspresyjne

Całkowite oczyszczanie ARN z siatkówek pięciotygodniowych normalnych myszy:

Biblioteka cDNA została skonstruowana z siatkówek pięciotygodniowych myszy C57BL/6@N ogólnie według metody Glissina i wsp. (1974), Biochemistry, 13, 2633-2637. W skrócie, po zabiciu zwierząt pobrano od nich gałki oczne i umieszczono najpierw w soli buforu fosforanowego (PBS) wzbogaconej 0,1% dietylopirowęglanu (DEPC). Nerwowa część siatkówki została szybko wycięta (pigmentowany nabłonek siatkówki został ominięty w tym preparacie tkankowym). Wkrótce po wycięciu tkanki były homogenizowane w świeżym chlorku guanidyniowym. Zebrano dziesięć siatkówek w 2,4 ml GC w 4-mililitrowych sterylnych rurkach i tkanka została całkowicie rozerwana przez silną homogenizację przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.

Oczyszczanie informacyjnego RNA (mRNA) z siatkówek pięciotygodniowych normalnych myszy: mRNA zostało wyizolowane na porowatych kuleczkach pokrytych oligo-dT (Oliogtex, Qiagen) w surowych warunkach według metody Kuribayashi'ego i wsp., (1988) Nucleic Acid Res. Symposium series, 19, 61-64. W skrócie, 100-150 μg całkowitego RNA siatkówki myszy zmieszano z 15 μΙ kuleczek oligo-dT w buforze wiążącym [10 mM Tris pH 7,5; 0,3 M NaCI; 0,1 M EDTA; 0,5% w/v soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS)] i inkubowano przez 6 minut w 65°C w 0,5 I zbiorniku wody, następnie stopniowo ochładzano do temperatury pokojowej przez około 3-4 godziny, następnie wirowano w temperaturze pokojowej w celu odzyskania kuleczek agarozy. Potem przemywano je dwa razy przez inkubację przez 10 minut w 0,4 ml (0,1 M Tris pH 7,5; 0,1 M NaCI; 1 mM EDTA; 0,5% w/v SDS). Związane RNA (mRNA) wymywano w dwóch etapach za pomocą 50 μΙ podgrzanej do 70°C wody wolnej od RNAzy, precypitowano z 10 μΙ octanu sodu pH 5,2 i 0,25 ml etanolu i inkubowano przez 12 godzin w -70°C. MRNA zbierano przez wirowanie (1 godzina przy 15000 obrotów na minutę, następnie przemywano dwa razy 70% etanolem) i ponownie zawieszano w 20 μΙ wody wolnej od RNAzy. Stężenie mRNA mierzono przy 260 nm i brak obecności zanieczyszczeń rRNA sprawdzano za pomocą elektroforezy żelowej w warunkach denaturujących jak wyżej.

Synteza cDNA:

Była przeprowadzana według metody Okayamy i Berga (1982), Mol Cell Biol., 2, 161-170. Synteza pierwszej nici została zapoczątkowana za pomocą 2,5 μg adaptorowego oligonukleotydu NotI (5TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGACAA(t)18 3') i była inkubowana przez 2 godziny z 50 jednostkami zmodyfikowanej odwrotnej transkryptazy wirusa białaczki myszy Moloneya (M-MLV) (Superscript II, Life Technology) w warunkach zalecanych przez dostawcę. Do syntezy drugiej nici reakcję inkubowano przez 4 godziny w 14°C z 4 jednostkami RNAseH i 100 jednostkami polimerazy I DNA w buforze SS [40 mM Tris pH 7,2; 85 mM chlorku potasu; 4,4 mM chlorku magnezu; 3 mM DTT; 5 μg/ml albuminy osocza bydlęcego (BSA)] w ostatecznej objętości 0,25 ml. Adaptery EcoRI (5'-OH AATTCGGCACGAGG 3'-OH/3'-OH GCCGTGCTCC5'-PO4) poddano Iigacji na obu końcach podwójnej nici cDNA przez 14 godzin w 16°C przy użyciu Iigazy T4 DNA (Promega, Madison, USA) w całkowitej objętości 20 μΙ w warunkach zalecanych przez dostawcę. Produktami tej reakcji są dsc DNA, które posiadają połowiczne miejsce EcoRI przy 5' i połowiczne miejsce NotI przy 3', które mogą być ukierunkowane w wektorze klonującym.

Ligacja dscDNA w pcDNA3:

Została przeprowadzona według Maniatisa T. (1992), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., przy użyciu 10 μl plazmidu pcDNA3 (Invitrogen) przygotowanego przez przecięcie za pomocą EcoRI i NotI (Promega, Madison, USA) w warunkach określonych przez dostawcę.

Propagacja rekombinacyjnych klonów:

Została przeprowadzona ogólnie według metody Birnboima i wsp. (1979), Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523. W skrócie, w celu utworzenia zbiorów 100 pierwotnych klonów, nieznacznie zmodyfikowaliśmy protokół transformacji XL1 Gold (Strategene) (dostarczony przez Strategene), jak następuje. Po inkubacji w pożywce wzrostowej, reakcję transformacji przeniesiono do 20% (objętościowych) glicerolu i 8% (objętościowych) albuminy osocza końskiego (HAS, Life Technologies). HAS i glicerol zapobiegał śmierci w następstwie rozmrażania. Miareczkowanie wykonano przez pokrywanie płytek agarowych (100 μg/ml ampicyliny) wzrastających objętości każdej reakcji transformacji w celu obliczenia objętości dających 100 kolonii, podczas gdy masa reakcji transformacji była przechowywana w -80°C. Plazmidy rekombinacyjne z biblioteki były oczyszczone, 96 za jednym razem. W celu przygotowania 96 zbiorów 100 klonów, obliczona objętość odpowiadająca 100 klonom została umieszczona na agarze i hodowana przez 20 godzin w 37°C. DNA oczyszczono bezpośrednio z kolonii pobranych z płytek

PL 213 658 B1 agarowych. Zapas każdej hodowli w 23% glicerolu przechowywano w -80°C. DNA oczyszczono przy użyciu Qiawelluu ultra (Qiagen) przy użyciu protokołu zalecanego przez dostawcę. Typowo, uzyskano μg oczyszczonego plazmidu, stężenie każdego preparatu mierzono przy użyciu gęstości optycznej przy 260 nm. Aby podzielić wybrane 100 zbiorów na 10 podzbiorów, 50 μΙ rozcieńczenia 1/250000 zapasu glicerolu z oryginalnego zbioru umieszczono na płytce agarowej z 100 μg/ml ampicyliny. Po utrzymywaniu przez 16 godzin w 37°C, indywidualne 100 kolonii replikowano na 16 płytkach agarowych (10 na płytce) i utrzymywano przez 16 godzin w 37°C. 10 kolonii z każdej płytki zbierano i utrzymywano w płynnej pożywce [Luria Broth (LB), 100 μg/ml ampicyliny] przez 3 godziny w 37°C. Zapas tych hodowli w 30% glicerolu przechowywano w -80°C. DNA plazmidu przygotowywano jak poprzednio. Aby podzielić 10 podzbiorów na indywidualne klony, 50 μΙ rozcieńczenia zapasu glicerolu 10 podzbiorów umieszczano na płytce agarowej ze 100 μg/ml ampicyliny. Po utrzymywaniu przez 16 godzin w 37°C, 16 indywidualnych kolonii pobierano i utrzymywano przez 16 godzin w 2 ml LB 100 μg/ml ampicyliny. Zapas tych hodowli w 30% glicerolu przechowywano w -80°C. DNA plazmidu przygotowywano jak poprzednio.

Przejściowa transfekcja w komórkach Cos-1

Została przeprowadzona przy użyciu metody Chena i Okayamy (1987), Highefficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA (Mol. Cell Biol., 7, 2745-2752).

Hodowle siatkówek embrionów kurcząt

Protokół zaadoptowano według Adlera i Hatlee [(1989) Science, 243, 391], Siatkówka embrionu kurczęcia (6 dni in ovo) została zdysocjowana i umieszczona w jednowarstwowej hodowli. W warunkach tej hodowli przy braku sygnałów dyferencjacji, czopki siatkówki reprezentują 60-80% komórek. Wytworzyliśmy przeciwciała poliklonalne u królika przeciwko wizynie (marker czopka siatkówki kurczęcia, numer zgłoszenia w Genbank M84729) i potwierdziliśmy, że liczba czopków siatkówki w naszej hodowli wynosi 60-80%. Proste otoczenie naszego modelu (chemicznie zdefiniowana pożywka, brak kontaktów między komórkami) w dodatku do łatwości i szybkości metody sprawiają, ze jest to bardzo odpowiedni system do badania czynników troficznych zaangażowanych w przeżywalność czopków siatkówki. W skrócie, siatkówki z embrionów wydzielone z kontrolnych próbek od ich bezpośrednich przodków są wycinane po sześciu dniach rozwoju in ovo, komórki są dysocjowane i umie52 szczane na płytkach przy niskiej gęstości (10⁵ komórek/cm²). W czasie dziesięciu dni obserwowano przeżywalność (60-80% czopków siatkówki) przy zastosowaniu testu MARTWE/ŻYWE (Molecular probes, Eugene, USA), testu, w którym oblicza się komórki żywe i martwe. Liczba żywych komórek spada do 8% początkowej liczby komórek po siedmiu dniach hodowli na chemicznie zdefiniowanej pożywce. Gdy przeprowadza się test w obecności wzbogaconej pożywki z komórek COS1 transfekowanych zbiorami klonów z biblioteki, żywe komórki są obliczane po siedmiu dniach in vitro.

Bezpośredni przodkowie kurcząt (szczep 657 red label) byli utrzymywani w oddzielnym pomieszczeniu do celów tego eksperymentu w wylęgarni znajdującej się 25 km od laboratorium. Zapłodnione jaja uzyskane naturalnie zbierano co tydzień po wysiadywaniu i utrzymywano w 17°C (ich biologiczne zero) w laboratorium. Dziennie inkubowano 5 jaj przez 24 godziny w 20°C, następnie przez 136 godzin w 37°C w ze zmiennym nachyleniem jaj w nawilgoconej komorze. W dniu eksperymentu, powierzchnie jaj zmywano za pomocą Mukocitu-A i rozbijano, a embriony kurcząt przenoszono do PBS. Stadium rozwoju każdego embrionu weryfikowano przez porównanie wizualne według Hamburgera i Hamiltona (1951), w Essential Development Biology, Stern i Holland Ed. Wybierano dwa embriony i pobierano gałki oczne, które przenoszono do pożywki niezależnej od CO2 (Life technologies). Siatkówki wycinano i przenoszono do buforu Ringera i przemywano dwukrotnie. Siatkówki pocięto na małe kawałki i traktowano przez 20 minut w 37°C roztworem trypsyny (0,25% w/v). Reakcję zatrzymywano przez dodanie pożywki hodowlanej (M199, Life Technologies) uzupełnionym 10% inaktywowanym FCS. Zawiesinę komórek traktowano przez kilka minut 25 μΙ DNAzy (1 mg/ml), Sigma). Zawiesinę komórek przemywano następnie dwukrotnie chemicznie zdefiniowaną pożywką hodowlaną [CDCM, równe objętości pożywek DMEM i M199 (Life Technologies) i AB z suplementami (5 μg/ml insuliny; 5 μg/ml transferyny; 64 nM progesteronu; 0,1 mM putrescyny; 5 ng/ml selenu; 3 mM tauryny; 2,7 μΜ cytydyno-5'-difosfoetanoloaminy; 5,2 μΜ cytydyno-5'-difosfocholiny, 0,2 μΜ hydrokortyzonu; 30 nM 3',3'-trójjodotyroniny; 1 mM pirogronianu sodu), 0,3 μΜ prostaglandyny D2; 0,1 mg/ml kwasu linolowego] w celu usunięcia FCS. Stężenie komórek barwionych błękitem trypanu mierzono komorą ₅

Mallasseza i tworzono dwa stężenia (5,6 i 1,12 10⁵ komórek/ml) odpowiadające dwóm gęstościom na płytkach (2 i 4 10⁵ komórek/ml).

PL 213 658 B1

Wzbogacone pożywki z komórek transfekowanych Cos-1 rozmrażano na lodzie i przenoszono 50 μΙ do dwóch czarnych płytek zwierających 96 studzienek traktowanych hodowlą tkankową (Cornig

Costar), które pokryto roztworem 100 μg/ml poli-L-lizyny (Sigma) według planu:

Pierwszy cykl skriningu:

1	1	1	1	2	C	2	2	2	3	3	P
C	3	3	4	4	4	C	4	5	5	5	5
6	C	6	6	6	7	7	C	7	7	8	8
8	8	C	9	9	9	9	10	C	10	10	10
11	11	11	C	11	12	12	12	12	C	13	13
13	13	14	14	C	14	14	15	15	15	C	15
16	16	16	16	17	C	17	17	17	18	18	C
18	18	19	19	19	19	P	20	20	20	C	20

Gdzie numery oznaczają n° zbiorów 100 klonów, C oznacza wzbogacone pożywki z komórek Cos-1 transfekowanych pustym wektorem (pcDNA3) i P oznacza pozytywną kontrolę (wzbogacone pożywki transfekowane pcDNA-mysiGDNF.

Drugi i trzeci cykl skriningu:

x.(y).01	x.(y).01	x.(y).01	x.(y).01	x.(y).02	C	x.(y).02	x.(y).02	x.(y).02	x.(y).03	x.(y).03	P
C	x.(y).03	x.(y).03	x.(y).04	x.(y).04	x.(y).04	C	x.(y).04	x.(y).05	x.(y).05	x.(y).05	x.(y).05
x.(y).06	C	x.(y).06	x.(y).06	x.(y).06	x.(y).07	x.(y).07	C	x.(y).07	x.(y).07	x.(y).08	x.(y).08
x.(y).08	x.(y).08	C	x.(y).09	x.(y).09	x.(y).09	x.(y).09	x.(y).10	C	x.(y).10	x.(y).10	x.(y).10
x.(y).11	x.(y).11	x.(y).11	C	x.(y).11	x.(y).12	x.(y).12	x.(y).12	x.(y).12	C	x.(y).13	x.(y).13
x.(y).13	x.(y).13	x.(y).14	x.(y).14	C	x.(y).14	x.(y).14	x.(y).15	x.(y).15	x.(y).15	C	x.(y).15
x.(y).16	x.(y).16	x.(y).16	x.(y).16	x.(y)	C	x.(y)	x.(y)	x.(y)	C57	C57	C
C57	C57	C3H	C3H	C3H	C3H	P	0	0	0	C	0

gdzie x (drugi cykl) I y (trzeci cykl) reprezentują nr zbiorów wyselekcjonowanych odpowiednio w pierwszym i drugim cyklu. 01 do 16 reprezentują używane podzbiory. X(y) reprezentują zbiór rodzicielski, z którego otrzymano 16 zbiorów. C oznacza pierwszy cykl. P został zmodyfikowany jako pCMVSCript-CNTF w drugim cyklu i progresywnie do pcDNA-939-09-08 w trzecim cyklu. O reprezentuje komórki czopków siatkówki jedynie w pożywce CDCM. C57 i C3H, wzbogacone pożywki z eksplantów siatkówek przygotowano, jak opisano w (przygotowanie wzbogaconych pożywek z eksplantów siatkówek myszy) z siatkówek myszy C57BL/6@N i C3H/He@N w wieku 5 tygodni, odpowiednio.

μΙ zawiesin komórek odpowiadających dwóm gęstościom (2 i 4 10⁵ komórek/cm²) dodano do studzienki dwóch płytek o 96 studzienkach wypełnionych wzbogaconymi podłożami za pomocą 8-kanałowej pipety automatycznej (Biohit) w celu zminimalizowania błędów eksperymentalnych. Komórki były inkubowane przez 7 dni w 37°C w 5% CO2.

Przygotowanie wzbogaconych podłoży z eksplantów siatkówek myszy:

Drugi i trzeci cykl skriningu obejmował pozytywne kontrole według Mohand-Daid i wsp. (1998). Myszy 5C57BL/6@N (dziki typ) i C3H/He@N (rdl) w wieku 5 tygodni zabijano i pobierano gałki oczne. Wycięto dwie siatkówki i inkubowano przez 24 godziny w 37°C w 5% CO2 w 1,5 ml CDCM na 12-studzienkowych płytkach. Wzbogacone podłoża pobierano i koncentrowano 40 razy przez ultrafiltrację na Vivaspin (Sartorius, punkt cięcia 10 kDa). Wzbogacone podłoża zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w próbkach w -20°C przed użyciem. W dniu użycia, wzbogacone podłoża rozmrażano na

PL 213 658 B1 lodzie, rozcieńczano 10 razy w CDCM i sterylizowano przez filtrację na filtrze 0,22 μm (Acrodisk 13,

Gelman Sciences).

Test funkcjonalny, test Żywe/Martwe:

Test funkcjonalny oparty jest na liczbie siatkówek kurcząt żywych po 7 dniach inkubacji in vitro. Używaliśmy zestawu testowego Żywe/Martwe (Molecular probes, Eugene, USA), który oparty jest na dwóch fluorogennych barwnikach (Calcein AM i dimer etydyny), które barwią żywe i martwe komórki, odpowiednio. Komórka, która jest żywa, wykazuje aktywność metaboliczną, która konwertuje substrat (Calcein AM) w produkcie fluorescencyjnym emitującym przy 520 nm. Przepuszczalność błonowa martwej komórki jest zmieniona i przepuszcza DNA jądra zabarwione dimerem etydyny przy 635 nm. Komórka jest żywa: emituje przy 520 nm po wzbudzeniu przy 485 nm lub martwa: emituje przy 635 nm po wzbudzeniu przy 520 nm. Przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej można zobrazować oddzielnie dwa typy fluorescencyjnych komórek. Po 7 dniach in vitro komórki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności z 2,7 μΜ CaIceiny-AM i 0,3 mM dimeru etydyny.

Gromadzenie obrazów.

W skrócie, gromadzenie obrazów polegało na autoogniskowaniu każdej studzienki, automatycznym liczeniu komórek w dwóch fluorescencjach, a następnie przetwarzaniu surowych danych przy użyciu specjalistycznego oprogramowania np. Metamorph (Universal Imaging Corporation, West Chester, USA) w celu uzyskania cyfrowych obrazów każdej studzienki na płytce. Używaliśmy mikroskopu inwersyjnego (Nikon TE 200) wyposażonego w epifluorescencyjną lampę rtęciową z dwoma filtrami wzbudzania 485 i 520 nm, dwoma filtrami emisyjnymi 520 i 635 nm, obiektywem (x10), sterowaną komputerowo automatyczną płytą (Multicontrol 2000, Martzauzer i kamera CCD (Cohu).

W celu zarejestrowania płytki, była ona umieszczana na automatycznej płycie i ręcznie wykonywano ogniskowanie na pierwszej studzience i tę płaszczyznę rejestrowano (początek z). Granica między obrazem żywych i martwych komórek ustalana była przy pierwszej studzience. Środek pierwszej studzienki był nastawiany przy użyciu światła białego przez manualne wyrównanie dołu pierwszej studzienki do dołu obrazu na monitorze komputera, następnie przez wyrównanie prawej krawędzi pierwszej studzienki do prawej strony obrazu na ekranie komputera i rejestrowano obie pozycje. Środek pierwszej studzienki był obliczany i wskazywał pozycję środka każdej studzienki na płytce. Zauważyliśmy w procesie opracowywania, że na obrzeżu studzienki komórki są nieco bardziej zagęszczone i wyłączyliśmy obrzeże z gromadzenia obrazów. Ważne jest, aby obraz z każdej studzienki był perfekcyjnie wypośrodkowany w celu uniknięcia błędnych wyników. Po nastawieniu, pierwszy obraz płytki ukazuje rejestr martwych komórek. Gęstość martwych komórek mniej zmienna w tych warunkach. Aplikacja wykonuje autoogniskowanie przez rejestrowanie obrazów w różnych płaszczyznach ogniskowych i wybieranie najjaśniejszego, prawego ogniska. Ta pozycja z jest zachowywana i płyta wykonuje zaprogramowane ruchy w osi x i y rejestrując w sumie 4 obrazy które, gdy są odtworzone w jednym obrazie, reprezentują 2/3 powierzchni studzienki. Zestaw obrazów z płaszczyzn ogniskowych jest rejestrowany w celu kontroli. Płyta wykonuje autoogniskowanie i cztery rejestry każdej studzienki na płytce począwszy od A1 do A12, następnie B12 do B1, C1 do C12, itp. Na końcu płyta przesuwa się na zewnątrz płytki w celu ekspozycji ostatniej płytki (H1). Skanowanie martwych komórek trwa 30 minut. Drugi obraz (żywe komórki) jest rejestrowany po zmianie filtra. Ten drugi obraz używa zarejestrowanej pozycji z każdej płytki z obrazu martwych komórek. Cztery obrazy każdej studzienki są rejestrowane, jak w przypadku martwych komórek. Przy końcu rejestrowania drugiego obrazu (22 minuty) odtworzone obrazy żywych i martwych komórek są zachowywane w pliku, który automatycznie uzyskuje nazwę z datą. Ilość komórek (martwych i żywych) jest liczona automatycznie z wstępnie ustalonymi parametrami morfometrycznymi (średnio) i wyświetlana na monitorze komputera w celu sprawdzenia poprawności eksperymentu. Ważne jest codzienne sprawdzanie, czy liczba komórek żywych nie jest za wysoka. Zaobserwowaliśmy, że gdy komórki są umieszczone na płytce w zbyt dużej gęstości, komórki siatkówek kurcząt przeżywają dłużej prawdopodobnie na skutek wytwarzania ich własnego czynnika przedłużającego przeżywalność. Dokonaliśmy skriningu komórek nie obserwując tego efektu. Przez skanowaniem drugiej płytki (taki sam eksperyment z podwójną gęstością komórek na płytce), dodawaliśmy a na końcu nazwy zarejestrowanego pliku z pierwszej płytki. Obrazy z każdego eksperymentu były przechowywane na CD-ROM-ie. Utworzyliśmy bibliotekę ponad 250 CD-ROM-ów.

PL 213 658 B1

Liczenie komórek i wybór zbiorów:

Liczba komórek (żywych i martwych) była obliczana przy użyciu obrazów z każdego eksperymentu przechowywanych na CD-ROM-ie. Zarejestrowany plik z eksperymentu był najpierw wprowadzany do komputera (liczenie off-line) i otwierany przy użyciu oprogramowania Metamorph. W pierwszym etapie otwierane były obrazy odpowiadające 14 studzienkom C (wzbogacone podłoża z komórek Cos-1 transfekowanych pustym wektorem). Po regulacji granicy obrazu używano komendy Integrated Morphometry Analysis w celu zmierzenia dystrybucji obszarów pomiędzy 10 a 250 obiektu (liczba żywych komórek dla każdego całkowitego obszaru) dla tych studzienek kontrolnych. Dystrybucja była zgodna z krzywą Gaussa z maksymalną liczbą obiektów odpowiadającą izolowanej komórce. Ta wartość standardowa (SV) była następnie używana do obliczenia wartości obszaru powyżej, gdzie obiekt był liczony jako dwie komórki (standardowe przecięcie obiektu, SOC) przez funkcję empiryczną: SOC = 29/20,74 SV. Wartość SOC każdej indywidualnej płytki była używana do liczenia ilości żywych komórek na płytce. Te liczby były następnie przenoszone do tabeli Excel.

Dla pierwszego cyklu skriningu, wartość była przedstawiana na wykresie dla każdego zbioru jako złożona różnica (wzrost lub spadek ilości żywych komórek) w zależności od średniej z 14 studzienek kontrolnych + odchylenie standardowe. W celu zniwelowania różnic wynikających z odmiennego umiejscowienia na płytce obliczyliśmy średnią złożonej różnicy indywidualnie pomiędzy 80 studzienkami odpowiadającymi umiejscowieniom, gdzie zbiory są testowane i 14 studzienkami kontrolnymi dla 200 niezależnych płytek. Średnio, obserwowane różnice są spowodowane jedynie różnicą umiejscowienia i liczby komórek zostały skorygowane z tym współczynnikiem. W celu ściślejszego odróżnienia zbiorów, które miały być wybrane, liczby żywych komórek zostały przedstawione na wykresie jako złożona różnica w zależności od kontroli wszystkich wartości nie przekraczających 1,3 lecz przekraczających 0,4. W ten sposób wszystkie zbiory przedstawiono jako złożoną różnicę w zależności od 14 studzienek odpowiadających pustemu wektorowi, a znajdujące się w przedziale 0,4 do 1,3 uznano za nie istotne i używane były jako kontrola. Po korekcji, złożona różnica w zależności od kontroli dwóch płytek została pomnożona i wynik posortowano według malejącej złożonej różnicy. Zbiory na górze tej listy były dalej sprawdzane przez inspekcje wizualną wykresu odpowiadającego 20 zbiorom eksperymentu (obie płytki) i obrazom żywych i martwych komórek w celu uniknięcia obrazowania mylących zbiorów.

Do drugiego i trzeciego cyklu, skrining podzbiorów płytek obejmuje dodatkową kontrolę. Przygotowaliśmy wzbogacone pożywki z eksplantów siatkówek w wieku 5 tygodni. Wybraliśmy eksperymenty, gdzie rejestrowano pozytywne efekty dla eksplantów siatkówek od C57BL/6@N i odrzuciliśmy inne. Wyniki zostały przedstawione na wykresie jako złożona różnica w zależności od 14 studzienek kontrolnych, nie liczono ponownie kontroli. Złożona różnica w zależności od kontroli dwóch płytek została pomnożona i wyniki zestawiono według malejącej złożonej różnicy dla 16 podzbiorów.

Dokonano sekwencjonowania wyizolowanego cDNA przy użyciu primeru T7 (5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3') na sekwenserze kapilarnym (CEQ2000, Beckman Coulter). Sekwencja DNA została porównana z bazami danych przy użyciu Basic Local Alignment Serach Tool (BLAST).

Identyfikacja Rdcvf2 i ludzkich homologów

Przy użyciu sekwencji Rdcvf1 (sekwencji nukleotydów kodującej polipeptydy określonej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4) i BLAST, zidentyfikowano homologiczne mysie i ludzkie polipeptydy (rysunek 8). Klony EST z homologią do RdCVF2 myszy (GenBank, Accession Nr: bc016199) zostały zidentyfikowane: numery zgłoszeń Gen Bank: be552141, bi517442, bg707818, bi603812, ai433287, be088414, bg297383, bg297304 (patrz również rysunek 12). Klony EST z homologią do Rdcvf1 myszy (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1) zostały zidentyfikowane: numery zgłoszeń Gen Bank: bg299078, ai716631, bg294111, be108041, bg395178 (patrz również rysunek 13).

Analiza RT-PCR czasu rzeczywistego ekspresji Rdcvf1:

Ekspresja siatkówkowa Rdcvf1 u myszy C57BL/6@N i C3H/@N wieku 5 tygodni, jak również spokrewnionych C3H (+/+ i rd/rd) była badana przy użyciu RT-PCR czasu rzeczywistego na cyklerze świetlnym (Roche) z zestawem sybergreen PCR (Roche). cDNA zostały wytworzone przez zapoczątkowywanie z losowym oligonukleotydem heksamerowym (pdN6, Amersham), odwrotna transkryptaza M-MLV (superscrip II, Life Technologies) i całkowite RNA z siatkówki myszy przygotowano jak w 1). cDNA normalizowano przy użyciu wszechobecnej informacyjnej dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PDH). 0,2 μΙ z syntezy pierwszej nici cDNA (ekwiwalent 10 ng całkowitego RNA) amplifikowano z 2 μΜ oligonukleotydów według sekwencji o numerze identyfikacyjnym 24 i sekwencji

PL 213 658 B1 o numerze identyfikacyjnym 25 w trzech kopiach w całkowitej objętości 25 μΙ przy użyciu następującego programu: 30 sekund w 95°C i 35 cykli sekwencji (1 sekunda w 95°C, 18 sekund w 55°C, 10 sekund w 72°C). Analiza (rysunek 16) ukazuje, że ekspresja Rdcvf1 zmniejsza się po degeneracji pręcików u myszy rdl (C3H/He@N). Wykazano również, że Rdcvf1 podlega bezpośredniej ekspresji przez fotoreceptory przy użyciu RT-PCR czasu rzeczywistego przy użyciu RNA wypreparowanego z zewnętrznej warstwy siatkówki przez sekcjonowanie wibratomem.

Produkty sprawdzano przez elektroforezę na żelu agarowym. Podobne wyniki uzyskano z inną parą specyficznych primerów Rdcvf1. Jako pozytywna kontrola, ekspresja arestyny pręcików (Ass n° M24086) jest monitorowana w tych samych warunkach z primerami (5' CTATTACGTCAAGCCTGTAGCC 3' i 5' CATCCTCATCTTTCTTCCCTTC 3'). Potwierdzenie, że Rdcvf1 jest czynnikiem chroniącym pręciki może być uzyskane przez dodanie odpowiedniej ilości Rdcvf1 do eksplantu siatkówki myszy rdl w wieku 5 tygodni (C3H/He@N). Jaka ilość jest odpowiednia, można stwierdzić na podstawie takich samych eksperymentów miareczkowania. W porównaniu z odpowiednimi kontrolami, po 7 dniach przeżywalność pręcików będzie zwiększona.

Analiza Rdcvf2 metodą RT-PCR

RT-PCR do ekspresji Rdcvf2 przeprowadzono przy użyciu primerów 5' GCCAGCGTTTTCTGCCTTTTAC 3' i 5' AAGCCCTGCCTGCTCTTAACATC 3'. Analiza wykazuje, że Rdcvf2 podlega ekspresji zależnie od pręcików i że ekspresja Rdcvf2 nie jest ograniczona do siatkówki, lecz zachodzi również w innych komórkach nerwowych (rysunek 17), podczas gdy ekspresja Rdcvf1 wydaje się być ograniczona do komórek siatkówki.

Testy Żywe/Martwe dla Rdcvf1 lub Rdcvf2

Komórki COS-1 były transfekowane odpowiednim wektorem ekspresyjnym przenoszącym Rdcvf1 lub Rdcvf2 pod kontrolą indukcyjnego promotora. Komórki kontrolne transfekowano pustym wektorem. Komórki inkubowano przez odpowiedni czas podczas indukcji ekspresji Rdcvf1 lub Rdcvf2. Następnie liczono liczbę żywych komórek czopków siatkówki inkubowanych ze wzbogaconymi podłożami z komórek COS- transfekowanych za pomocą Rdcvf1 lub Rdcvf2 i komórek kontrolnych według powyżej opisanego sposobu. Komórki, w których zachodzi ekspresja Rdcvf1 lub Rdcvf2 wykazują znacznie zwiększoną przeżywalność.

Czynnik specyficzny dla pręcików

Analiza RT-PCR czasu rzeczywistego, przeprowadzona w standardowych warunkach, ekspresji arestyny pręcików (kontrola) i Rdcvf1 w eksplantach siatkówek w wieku 5 tygodni od C57BL/6@N i C3H/HE@N przy użyciu primerów:

sekwencja o numerze identyfikacyjnym 24: 5' TCTATGTGTCCCCAGGACCCTACAG 3' sekwencja o numerze identyfikacyjnym 25: 5 TTTATGCACAAGTAGTACCAGGACAG 3' wykazuje, że Rdcvf1 podlega ekspresji tylko w obecności pręcików (pochodzące z pręcików CVF1).

Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych

Przeciwciała poliklonalne były przygotowywane przez wstrzyknięcie królikowi oczyszczonego białka fuzyjnego glutationo-S-transferazy (GST) (GST-Rdcvf1), jak również z sekwencji aminokwasów 11 do 32 peptydu RdCVF1 myszy z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 (Ab n°2) i sekwencji aminokwasów 79 do 96 peptydu z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 (Ab n°3). Konstrukt fuzyjny pGST-Rdcvf1 był przygotowany przez amplifikację z oligonukleotydami z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 26 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 27 przy użyciu pcDNA-Rdcvf1 jako matrycy w warunkach standardowych. Ramka Otwartego Odczytu (ORF) Rdcvf1 była klonowana w ramce do pGex2TK (Pharmacia) pomiędzy miejscami restrykcji BamHI i EcoRI i transformowana do E coli [BL21 (DE3) pLysS, Prmega] według standardowej procedury. Pojedyncza kolonia wyrastała na pożywce płynnej LB z 100 μg/ml ampicyliny w 30°C i wytwarzanie białka było indukowane przez dodanie 1 μg/ml izopropylotio-3-D-galaktozydu (IPTG) i kontynuowane przez 5 godzin w 30°C. Komórki zbierano, poddawano Iizie za pomocą ultradźwięków i oczyszczano na sefarozie glutationowej według standardowego protokołu. Białko fuzyjne wymywano za pomocą 10 mM zredukowanego glutationu w temperaturze pokojowej. Wymyte białko dializowano do PBS przed wstrzyknięciem królikom. Czystość białka monitorowano za pomocą elektroforezy na żelu poliakrylamidowym. Immunizowano dwa króliki przez śródskórną iniekcję w 80 miejscach 100 μg oczyszczonego GST-Rdcvf1. Osocze pobierano po 8 tygodniach.

PL 213 658 B1

LISTA SEKWENCJI <110> UNIVERSITE LOUIS PASTEUR/ NOVARTIS AG <120> Białko związane z zachorowalnością <130> 4-318S3 <160> 35 <170> Patentln yersion. 3.1 <21Q> 1 <211> 468 <212> DNA <213> Mus musculus (mysz domowa) <220>

<221> CDS <222> (45)..(374) <223>

<400> 1 atcggatccc tctctgggtc cccagctcct tgcatactgc tace atg gca tet etc 56

Met Ala Ser Leu 1

ttc Phe 5

tet Ser

gga ęgę

atc Ile

ttg Leu 10

atc ile

agg aac Arg Asn

aac Asn

age Ser 15

gac Asp

cag Gin

gat gaa gtg

104

Gly

Arg

Asp

Glu

Val 20

gag

aca

gag

gca

gag

ctg

age

cgt

agg

tta

gag

aat

cgt

ctg

gtg

ttg

152

Glu

Thr

Glu

Ala

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Glu

Asn

Arg

Leu

Val

Leu

25

30

35

ctg

ttc

ggc

gee

ggc

gee

tgt

CCC

cag

tgc

cag

gee

ttt

gee

cca

200

Leu

Phe

Gly

Ala

Gly

Ala

cys

Pro

Gin

Cys

Gin

Ala

Phe

Ala

Pro

40

45

50

gtc

ctc

aaa

gac

ttc

gtg

cgg

etc

act

gac

gag

ttc

tac

gtg

ctg

248

Val

Leu

Lys

Asp

Phe

Val

Arg

Leu

Thr

Asp

Glu

Phe

Tyr

Val

Leu

55

60

65

cgg

gca

cag

ctg

gee

ctg

gtc

tat

gtg

tcc

cag

gac

cct

aca

gag

296

Arg

Ala

Gin

Leu

Ala

Leu

Val

Tyr

Val

Ser

Gin

Asp

Pro

Thr

Glu

70

75

80

PL 213 658 B1

344

gag caa cag gac

ctc Leu

ttc Phe 90

ctc Leu

agg Arg

gac Asp

atg Met

cct Pro 95

gaa Glu

aaa Lys

tgg Trp

ctc Leu

ttc Phe 100

Glu 85

Gin Gin Asp

ctg

ccg

ttc

cat

gat

gaa

ctg

agg

tga

ggccccaggg

aagaccaggg

Leu

Pro

Phe

His

Asp

Glu

Leu

Arg

105

394 agggcttcct ggagaaggca tttccctgga ggfcttactgt cctggtacta cttgtgcata 454 aagaggtatt cctc 458

<210>	2
<211>	109
<212>	PET
<213>	Mus musculus
<400>	2
Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp

10 15

Gin Asp Glu Val Glu Thr Glu Ala Glu Leu Ser Arg Arg Leu Glu Asn 20 25 30

Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gin Cys Gin 35 40 45

Ala Phe Ala Pro Val Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu 50 55 60

Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gin Leu Ala Leu Val Tyr Val Ser Gin

70 75 80

Asp Pro Thr Glu Glu Gin Gin Asp Leu Phe Leu Arg Asp Ket Pro Glu

90 95

Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe His Asp Glu Leu Arg Arg 100 105

<210>	3
<211>	764
<212>	DMA
<213>	Mus musculus
<220>

PL 213 658 B1 <221> CDS <222> (261..(676) <223>

<400> 3 ccccagctcc ttgcatactg ctacc afcg gca tct ctc ttc tct gga cgc atc 52

Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile

5 ttg atc agg aac aac agc gac cag gat gaa gtg gag aca gag gca gag 100

Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp Gin Asp Glu Val Glu Thr Glu Ala Glu

15 20 25 ctg agc cgt agg tta gag aat cgt ctg gtg ttg ctg ttc ttc ggc gcc 148

Leu Ser Arg Arg Leu Glu Asn Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala

35 40 ggc gce tgt ccc cag tgc cag gcc ttt gcc cca gtc ctc aaa gac ttc 196

Gly Ala Cys Pro Gin Cys Gin Ala Phe Ala Pro Val Leu Lys Asp Phe

50 55 ttc gtg cgg ctc act gac gag ttc tac gtg ctg cgg gca gca cag ctg 244

Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gin Leu

65 70 gcc ctg gtc tat gtg tcc cag gac cct aca gag gag caa cag gac ctc 292

Ala Leu Val Tyr Val Ser Gin Asp Pro Thr Glu Glu Gin Gin Asp Leu

80 85 ttc ctc agg gac atg cct gaa aaa tgg ctc ttc ctg ccg ttc cat gat 340

Phe Leu Arg Asp Met Pro Glu Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe His Asp

95 100 105 gaa ctg agg agg gac ctc ggg cgc cag ttc tct gtc cgt caa ctg cca 388

Glu Leu Arg Arg Asp Leu Gly Arg Gin Phe Ser Val Arg Gin Leu Pro

110 115 120 gcg gtt gtg gta ctt aag cct ggt ggg gac gtg ctg aca agc gac gcc 436

Ala Val Val val Leu Lys Pro Gly Gly Asp Val Leu Thr Ser Asp Ala

125 130 135 acg gag gag atc cag cgt ctg gga ccc gcc tgc ttt gcc aac tgg cag 484

Thr Glu Glu Ile Gin Arg Leu Gly Pro Ala Cys Phe Ala Asn Trp Gin

140 145 150 gag gcc gca gag ctc ctg gac cgc agc ttc ctg caa ccg gag gat ttg 532

Glu Ala Ala Glu Leu Leu Asp Arg Ser Phe Leu Gin Pro Glu Asp Leu

155 160 165 gat gag cct gcg cgg cgc agc atc acc gag cct ctg cgc cgt cgc aag 580

Asp Glu Pro Ala Arg Arg Ser Ile Thr Glu Pro Leu Arg Arg Arg Lys

170 175 180 185 tac ega gta gac cgg gat gtc ggc ggg agc ggg gcg aaa cgg cgc gac 628

Tyr Arg Val Asp Arg Asp Val Gly Gly Ser Gly Ala Lys Arg Arg Asp

190 195 200 tct ggt gaa ccc cag ggg gac gcg ggt aca agg gcg gag ctc tgg tga 676

PL 213 658 B1

Ser Gly Glu Pro Gin Gly Asp Ala Gly Thr Arg Ala Glu Leu Trp 205 210 215 ctcccagggt aggagtgggg accggagctc tggtgacacc aaagtaccgg fcgcacgaccg 736 aggttgatga ccctcccgaa ggaaccgg 764

<210> '

1

<211> 216

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> -

4

Met

Ala

Ser

Leu

Phe

Ser

Gly

Arg

Ile

Leu

Ile

Arg

Asn

Ser

Asp

1

5

10

15

Gin

Asp

Glu

Val

Glu

Thr

Glu

Ala

Glu

Leu

Ser

Arg

Leu

Glu

Asn

20

25

30

Arg

Leu

Val

Leu

Phe

Gly

Ala

Gly

Ala

Cys

Pro

Gin

Cys

Gin

35

40

45

Ala

Phe

Ala

Pro

Val

Leu

Lys

Asp

Phe

Val

Arg

Leu

Thr

Asp

Glu

50

55

60

Phe

Tyr

Val

Leu

Arg

^31 ćt

Ala

Gin

Leu

Ala

Leu

Val

Tyr

Val

Ser

Gin

65

70

75

80

Asp

Pro

Thr

Glu

Gin

Asp

Leu

Phe

Leu

Arg

Asp

Met

Pro

Glu

85

90

95

Lys

Trp

Leu

Phe

Leu

Pro

Phe

11 3n Ϊ3

Asp

Glu

Leu

Arg

Asp

Leu

Gly

100

105

110

Arg

Gin

Phe

Ser

val

Arg

Gln

Leu

Pro

Ala

Val

Leu

Lys

Pro

115

120

125

Gly

Asp

Val

Leu

Thr

Ser

Asp

Ala

ΤΊιχ*

Glu

Ile

Gin

Arg

Leu

130

135

140

Gly

Pro

Ala

Cys

Phe

Ala

Asn

Trp

Gin

Glu

Ara

Ala

Glu

Leu

Asp

145

150

155

160

Arg

Ser

Phe

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Leu

Asp

Glu

Pro

Ala

Arg

Ser

165

170

175

PL 213 658 B1

Ile Thr Glu Pro Leu Arg Arg Arg Lys Tyr Arg Val Asp Arg Asp Val 180 185 190

Gly Gly Ser Gly Ala Lys Arg Arg Asp Ser Gly Glu Pro Gin Gły Asp 195 200 205

Ala Gly Thr Arg Ala Glu Leu Trp 210 215

<210>	5
<211>	353
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<220>
<221>	CDS
<222>	<24?	. . (353)
<223>
<400>	5

cccagcaccc aacccaggtt acc atg gcc tcc ctg ttc tct ggc cgc atc ctg 53

Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu 15 10

atc Ile

cgc Arg

aac Asn

aat Asn

agc Ser 15

gac Asp

cag gac Gin Asp

gag Glu

ctg gat

acg gag gct

sag Glu 25

gtc Val

101

Leu 20

Asp

Thr

Glu

Ala

agt

cgc

agg

ctg

gag

aac

cgg

ctg

gtg

ctg

ttc

ttt

ggt

gct

SSS

149

Ser

Arg

Leu

Glu

Asn

Arg

Leu

Val

Leu

Phe

Gly

Ala

Gly

30

35

40

gct

tgt

cca

cag

tgc

cag

gcc

ttc

gtg

ccc

atc

ctc

aag

gac

ttc

197

Ala

Cys

Pro

Gin

Cys

Gin

Ala

Phe

Val

Pro

Ile

Leu

Lys

Asp

Phe

45

50

55

gtg

cgg

ctc

aca

gat

gag

ttc

tat

gta

ctg

cgg

gcg

gct

cag

ctg

gcc

245

Val

Arg

Leu

Thr

Asp

Glu

Phe

Tyr

Val

Leu

Arg

Ala

Gin

Leu.

Ala

60

65

70

ctg gtg

tac Tyr

Stg Val

tcc Ser

cag Gin 80

gac Asp

tcc Ser

acg gag Thr Glu.

gag Glu 85

cag Gin

gac Asp

ctg Leu

ttc Phe 90

lSu 75

Val

ctc

aag

gac

atg

cca

aag

asa

tgg

ctt

ttc

ctg

CCC

ttt

gag

gat

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

nys

Lys

Trp

Leu

Phe

Leu

Pro

Phe

Glu

Asp

95

100

105

ctg agg agg tga Leu Arg Arg

353

PL 213 658 B1 <210> 6 <211> 109 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> i

5

Met

Ala

Ser

Leu

Phe

Ser

Gly

Arg

Ile

Leu

Ile

Arg

Asn

Ser

Asp

1

5

10

15

Gin

Asp

Glu

Leu

Asp

Thr

Glu

Ala

Glu

Val

Ser

Arg

Leu

Glu

Asn

20

25

30

Arg

Leu

Val

Leu

Phe

Gly

Ala

Gly

Ala

Cys

Pro

Gin

Cys

Gin

35

40

45

Ala

Phe

Val

Pro

Ile

Leu

Lys

Asp

Phe

Val

Arg

Leu

Thr

Asp

Glu

50

55

60

Phe

Tyr

Val

Leu

Arg

Ala

Gin

Leu

Ala

Leu

Val

Tyr

Val

Ser

Gin

65

70

75

80

Asp

Ser

Thr

Glu

Gin

Asp

Leu

Phe

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

Lys

85

90

95

Lys

Trp

Leu

Phe

Leu

Pro

Phe

Glu

Asp

Leu

Arg

100

105

<210> 7 <211> 686 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (48)..(686) <223>

<400> 7 ccggggacca cacgccgcgc tgtccccagc acccaaccca ggttacc atg gcc tcc 56

Met Ala Ser 1

PL 213 658 B1

ctg Leu

ttc Phe 5

tct Ser

ggc Gly

cgc Arg

atc Ile

ctg Leu 10

atc Ile

cgc Arg

aac Asn

aat agc

gac cag gac gag

104

Asn

Ser 15

Asp

Gin

Asp

Glu

ctg

gat

acg

gag

gct

gag

gtc

agt

cgc

agg

ctg

gag

aac

cgg

ctg

gtg

152

Leu 20

Asp

Thr

Glu

Ala

Glu 25

Val

Ser

Arg

Leu 30

Glu

Asn

Arg

Leu

Vai 35

ctg

ttc

ttt

ggt

gct

ggg

gct

tgt

cca

cag

tgc

cag

gcc

ttc

gtg

200

Leu

Phe

Gly 40

Ala

Gly

Ala

Cys

Pro 45

Gin

Cys

Gin

Ala

Phe 50

Val

ccc

atc

ctc

aag

gac

ttc

gtg

cgg

ctc

aca

gat

gag

ttc

tat

gta

248

Pro

Ile

Leu

Lys 55

Asp

Phe

Val

Arg 60

Leu

Thr

Asp

Glu

Phe 65

Tyr

Val

ctg

cgg

gcg

gct

cag

ctg

gcc

ctg

gtg

tac

gtg

tcc

cag

gac

tcc

acg

296

Leu

Arg

Ala 70

Ala

Gin

Leu

Ala

Leu 75

Val

Tyr

Val

Ser

Gin 80

Asp

Ser

Thr

gag

cag

gac

ctg

ttc

Ctc

aag

gac

atg

cca

aag

aaa

tgg

ctt

344

Glu

Glu 85

Gin

Asp

Leu

Phe 90

Leu

Lys

Asp

Met

Pro 95

Lys

Trp

Leu

ttc

ctg

ccc

ttt

gag

gat

ctg

agg

gac

ctc

ggg

cgc

cag

ttc

392

Phe 100

Leu

Pro

Phe

Glu

Asp 105

Asp

Leu

Arg

Asp 110

Leu

Gly

Arg

Gin

Phe 115

tca

gtg

gag

cgc

ctg

ccg

gcg

gtc

gtg

ctc

aag

ccg

gac

ggg

gac

440

Ser

Val

Glu

Arg

Leu 120

Pro

Ala

Val

Val 125

Leu

Lys

Pro

Asp

Gly 130

Asp

Val

Leu

Thr

Arg 135

Asp

Gly

Ala

Asp

Glu 140

Ile

Gin

Arg

Leu

Gly 145

Thr

Ala

tgc

ttc

gcc

aac

tgg

cag

gag

gcg

gcc

gag

gtg

ctg

gac

cgc

aac

ttc

536

Cys

Phe

Ala 150

Asn

Trp

Gin

Glu

Ala 155

Ala

Glu

Val

Leu

Asp 160

Arg

Asn

Phe

cag

ctg

cca

gag

gac

ctg

gag

gac

cag

gag

cca

cgg

agc

ctc

acc

gag

584

Gin

Leu 165

Pro

Glu

Asp

LOU

Giu 170

Asp

Gin

Glu

Pro

Arg 175

Ser

Leu

Thr

Glu

tgc

ctg

cgc

cac

aag

tac

cgc

gtg

gaa

aag

g=g

gcg

ega

ggc

ggg

632

Cys 180

Leu

Arg

His

Lys 185

Tyr

Arg

Val

Glu

Lys 190

Ala

Arg

Giy

Giy 195

cgc

gac

ccc

ggg

gga

ggg

ggt

ggg

gag

ggc

ggg

gcc

ggg

gga

ctg

680

Arg

Asp

Pro

Gly

Giy

Gly

Glu

Giy

Gly

Ala

Gly

Leu

200 205 210 ttc tga 686

Phe
<210>	s
<211>	212
<2 12 >	PRT

PL 213 658 B1 <213> Homo sapiens <400> 8

Met Ala Ser Len Phe Ser Gly Arg Ile Len Ile Arg Asn Asn Ser Asp 15 10 15

Gin Asp Gin Leu Asp Thr Glu Ala Glu Val Ser Arg Arg Leu Glu Asn 20 25 30

Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gin Cys Gin 35 40 45

Ala Phe Val Pro Ile Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu 50 55 60

Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gin Leu Ala Leu Val Tyr Val Ser Gin 65 70 75 80

Asp Ser Thr Glu Glu Gin Gin Asp Leu Phe Leu Lys Asp Met Pro Lys 85 90 95

Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe Glu Asp Asp Leu Arg Arg Asp Leu Gly ICO 105 110

Arg Gin Phe Ser Val Glu Arg Leu Pro Ala Val Val Val Leu Lys Pro 115 120 125

Asp Gly Asp Val Leu Thr Arg Asp Gly Ala Asp Glu Ile Gin Arg Leu 130 135 140

Gly Thr Ala Cys Phe Ala Asn Trp Gin Glu Ala Ala Glu Val Leu Asp 145 150 155 160

Arg Asn Phe Gin Leu Pro Glu Asp Leu Glu Asp Gin Glu Pro Arg Ser 165 170 175

Leu Thr Glu Cys Leu Arg Arg His Lys Tyr Arg Val Glu Lys Ala Ala 180 135 190

Arg Gly Gly Arg Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly Gly Ala 195 200 205

Gly Gly Leu Phe 210

PL 213 658 B1 <211> 600 i ο>

<212> DNA <213> Mus musculus <220= <221> CDS <222> (265)..(570) <223>

<400>

ataaaataga	gggtgggaga	ggttgatggc	gtggctctgc	tttttggtgc	ggggcaccca	60
gctgtcatcg	ctgctgtcgc	agcttctgga	gtggccactg	tgctctctcc	tcccttcggc	120
tcaaggtgag	ctgttccagc	agaaggcggg	gctgagaggc	gcctagtgct	gcgggaggct	180
cagtgtcatc	ttccagctaa	caggtggeeg	tgcagcccag	ggctcgtctc	tccactgtgt	240
cctcttcacg	ccgagctcgt	ggcg atg gtg gac gtg ctg ggc ggg	cgg ege	291
		Met Val Asp Val Leu Gly Gly	Arg Arg

ctg gtg acc cgg gag ggc acg gtg gtg gag gcc gag gtg gcg eta cag Leu Val Thr Arg Glu Gly Thr Val Val Glu Ala Glu Val Al

339 a Leu Gin 25 aag gtg gta get ttg tac ttt gcg gcg ggc cgg tgc teg ccc age

Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr Phe Ala Ala Gly Arg Cys Ser Pro Ser

3S7 ege gac ttc acg ccg ctg etc tgc gac ttc tac acg gag ctg gtg age

Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu Cys Asp Phe Tyr Thr Glu Leu fal

435

Ser gag gcg cgg cgg ccc get ccc ttc gag gtg gtt ttc gtg teg gca

Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro Phe Glu Val Val gac

Phe Val Ser Ala Asp 70

483 ggc agt gcg gag gag atg ttg gac ttc atg ege gag ctg cac ggc tcc Gly Ser Ala Glu Glu Met Leu Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ser

531 tgg ctg gca ttg ccc ttc cac gac ccc tac cgg cag tga gfcggggac ^TrP Leu Ala Leu Pro Phe His Asp Pro Tyr Arg Gin

580

100 aggggtcatg gggctggcgc

600 <210> 10 <211> 101

PL 213 658 B1 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10

Met Val Asp Val Leu Gly Gly Arg Arg Leu Val Thr Arg Glu Gly Thr 15 10 15

Val Val Glu Ala Glu Val Ala Leu Gin Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr 20 25 30

Phe Ala Ala Gly Arg Cys Ser Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu 35 40 45

Cys Asp 50

Phe

Tyir

Thr

Glu

Leu 55

Val

Ser

Glu

Ala

Arg 60

Arg

Pro

Ala

Pro

Phe Glu 65

Val

Phe

Val 70

Ser

Ala

Asp

Gly

Ser 75

Ala

Glu

Met

Leu 80

Asp Phe

Met

Arg

Glu 85

Leu

His

Gly

Ser

Trp 90

Leu

Ala

Leu

Pro

Phe 95

His

Asp Pro

Tyr

Arg 100

Gin

<210>

11

<211>

1164

<212>

DNA

<213>

Mus musculus

<220>

<221>

CDS

<222>

(300)

..(770)

<223>

<400> 11

ttgactctgg	tgggtagaga gggtttgcaa ggcaggataa aatagagggt gggagaggtt	60
gatggcgtgg	ctctgctttt tggtgcgggg caccagctgt catcgctgct gtcgcagctt	120
ctggagtggc	cactgtgctc tctcctccct tcggctcaag gtgagctgtt ccagcagaag	180
gcggggctga	gaggcgccta gtgctgcggg aggctcagtg tcatcttcca gctaacaggt	240
ggccgtgcag	cccagggctc gtctctccac tgtgtcctct tcacgccgag ctcgtggcg	299

PL 213 658 B1

atg Met 1

gtg Val

gac Asp

gtg Val

ctg Leu 5

ggc ggg Gly Gly

cgg cgc Arg Arg

ctg gtg acc

cgg gag

ggc Gly 15

acg Thr

347

Leu 10

Val

Thr

Arg

Glu

gtg

gag

gcc

gag

gtg

gcg

ctg

cag

aac

aag

gtg

gta

get

ttg

tac

395

Val

Glu

Ala

Glu

val

Ala

Leu

Gin

Asn

Lys

Val

Ala

Leu

Tyr

20

25

30

ttt

gcg

ggc

cgg

tgc

teg

ccc

agc

cgc

gac

ttc

acg

ccg

ctg

ctc

443

Phe

Ala

Gly

Arg

Cys

Ser

Pro

Ser

Arg

Asp

Phe

Thr

Pro

Leu

35

40

45

tgc

gac

ttc

tac

acg

gag

ctg

gtg

agc

gag

gcg

tgg

cgg

ccc

get

ccc

431

Cys

Asp

Phe

Tyr

Thr

Glu

Leu

Val

Ser

Glu

Ala

Arg

Pro

Ala

Pro

50

55

60

ttc

gag

gtg

gtt

ttc

gtg

teg

gca

gac

ggc

agt

gcg

gag

atg

ttg

533

Phe

Glu

Val

Phe

Val

Ser

Ala

Asp

Gly

Ser

Ala

Glu

Ket

Leu

65

70

75

80

gac

ttc

atg

cgc

gag

ctg

cac

ggc

tcc

tgg

ctg

gca

ttg

ccc

ttc

cac

537

Asp

Phe

Met

Arg

Glu

Leu

His

Gly

Ser

Trp

Leu

Ala

Leu

Pro

Phe

His

85

90

35

gac

ccc

tac

cgg

cat

gaa

ctg

aag

agg

tac

gaa

atc

acc

gcc

atc

635

Asp

Pro

Tyr

Arg

His

Glu

Leu

Lys

Arg

Tyr

Glu

Ile

Thr

Ala

Ile

100

105

110

ccc

aag

ctg

gtg

gtc

atc

aag

cag

aac

gga

get

gtc

atc

acc

aac

ćl&ćt

683

Pro

Lys

Leu

Val

Ile

Lys

Gin

Asn

Gly

Ala

Val

Ile

Thr

Asn

Lys

115

120

125

ggg

cgg

aag

cag

atc

ega

gag

cgc

ggg

eta

get

tgc

ttt

cag

aac

tgg

731

Gly

Arg

Lys

Gin

Ile

Arg

Glu

Arg

Gly

Leu

Ala

Cys

Phe

Gin

Asn

Trp

130

135

140

gtg

gaa

gca

gcc

gat

gtt

ttc

caa

aac

ttc

teg

ggg

tga

ccagggcagt

780

Val

Glu

Ala

Asp

Val

Phe

Gin

Asn

Phe

Ser

Gly

145

150

155

tgctggaagt	tcagggcaac	tatcttcaaa	aagggcttag	ctggfctcccC	tctctgctga	840
ggaatgtcat	fcgtagagtca	ccatgctgtg	acagagagca	taaactgctc	aggaaagaac	900
tacgtctgcc	ccctgtgggt	cctagagctc	cgttgaafcgt	ttatttctta	cacctttctc	960
caccggtgcc	taggatccag	gacacatcag	ccacgagtta	acagaactct	atgcaagatg	1020
ctctttccta	caggaaattt	ctttgataaa	ttgacctatg	gaggtgatac	attttctgat	1080
gacatttttg	tgatgctttg	gtaaacgtat	ttattactcg	ggtttgtaga	ctgtgtaatt	1140
taataaacca	acactcaeac	tttg				1164

<210>	12
< 211 >	156
<212>	PHT

PL 213 658 B1 <213> Mus musculus <400> 12

Met Val Asp Val Leu Gly Gly Arg Arg Leu Val Thr Arg Glu Gly Thr 15 10 15

Val Val Glu Ala Glu Val Ala Leu Gin Asn Lys Val fal Ala Leu Tyr 20 25 30

Phe Ala Ala Gly Arg Cys Ser Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu 35 40 45

Cys Asp Phe Tyr Thr Glu Leu val Ser Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro 50 55 60

Phe Glu fal Val Phe Val Ser Ala Asp Gly Ser Ala Glu Glu Met Leu

70 75 80

Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ser Trp Leu Ala Leu Pro Phe His

90 95

Asp Pro Tyr Arg His Glu Leu Lys Lys Arg Tyr Glu Ile Thr Ala Ile 100 105 110

Pro Lys Leu Val Val Ile Lys Gin Asn Gly Ala Val Ile Thr Asn Lys 115 120 125

Gly Arg Lys Gin Ile Arg Glu Arg Gly Leu Ala Cys Phe Gin Asn Trp 130 135 140

Val Glu Ala Ala Asp Val Phe Gin Asn Phe Ser Gly

145 150 155

<210>	13
<211>	1472
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<220>
<221>	CDS
<222>	(331)	. , (738)
<223>

PL 213 658 B1

<400> 13
gtgtgggcgg	ggcgcagttg	ggggagggtg	cagagacctg	agggcttgag	gttgcctggc	60
tggccecgct	cccagaggcg	ggtgccgcgc	tgtcgcccag	gtatctgggg	tctctggtgt	120
ctgagtgtct	cattgtcggc	gcgaacacaa	ttgctccagc	cacaggcgag	gcctggccaa	180
ggtgtgggcg	catctagggc	aggtcttgag	aggtccagcg	cccggtggtg	cggacagagg	240
cggggcaccg	cggcgctcgc	cgccgcctcc	ccgcaggtga	tcatcctcct	gcaggtgtcc	300
tcgggtctca	ggtggctgcg	tgtctgcgcc	atg gtt gac att ctg ggc gag cgg	354

Met Val Asp Ile Leu Gly Glu Arg 1 5 cac ctg gtg acc tgt aag ggc gcg acg gtg gag gcc gag gcg gcg ctg 402

His Leu Val Thr Cys Lys Gly Ala Thr Val Glu Ala Glu Ala Ala Leu

15 20 cag aac aag gtg gtg gca ctg tac ttc gcg gcg gcc cgg tgc gcg ccg 450

Gin Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr Phe Ala Ala Ala Arg Cys Ala Pro

30 35 40 agc cgc gac ttc acg ccg ctg ctc tgc gac ttc tat acg gcg ctg gtg 498

Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu Cys Asp Phe Tyr Thr Ala Leu Val

50 55 gcc gag gcg cgg cgg ccc gcg ccc ttc gaa gtg gtc ttc gtg tca gcc 540

Ala Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro Phe Glu Val Val Phe Val Ser Ala

65 70 gac ggc a ctc tgc cag gag atg ctg gac ttc atg cgc gag ctg cat ggc 594

Asp Gly Ser Cys Gin Glu Met Leu Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly

80 85 gcc tgg ctg gcg ctg ccc ttc cac gac ccc tac cgg caa cgg agt ctc 642

Ala Trp Leu Ala Leu Pro Phe His Asp Pro Tyr Arg Gin Arg Ser Leu

95 100

gct Ala 105

ctg Leu

ttg ccc agg Leu Pro Arg

ctg Leu 110

ęag Glu

tgc agt

ggc gtg atc

tta Leu

gct Ala

cac His

tgc Cys 120

Cys

Ser

Gly

Val 115

Ile

aac

ctt

tgc

ctc

ctg

ggt

tca

agt

gat

tct

CtcL

gcc

tta

gcc

tcc

tga

Asn

Leu

Cys

Leu

Gly

Ser

Asp

Ser

Leu

Ala

Leu

Ala

Ser

125

130

135

gcatctggga	ctacagccat	tgctgtgaat	tacgtgaggg	aaagatattg	aagaggagtt	798
ggacactccg	agagtgcagc	tgttctcccc	ccgcaccatc	cgtgtcctgc	attctgcgag	858
tctgtgctca	ttaacaatgt	gctgtgacca	tgtgactcag	caatcctgct	gctgggtata	918
tacccgaaag	aaaggaaaag	gaagccagta	tattgaagag	gtatetgcac	ccccatgttt	978
attgcagcac	tgttcacaac	agccaagatt	tggaagcaac	ctaagtgtcc	atcaacagat	1038
gaatggataa	agaaaacgtg	g t aca t a t a c	acaatggagt	actcttcagc	a t1. aiai ci aa ci	1098
atgagattct	gtcatttgca	ataatataga	tggaaaagga	ggcccttatg	tgaagtgaaa	1158

PL 213 658 B1

taagccaggc aeagaaagac aaacatcaca	tgttctcact	tatttgtggg atctaatgat	1218
caaaacaatt gaactcttgg acatagagag	tagaaggttg	gttaccagaa gctggaaagg	1278
aaagtggggt tgggaggaag gtgggaatgg	ttaataggta	caaaaaaata caaagaataa	1338
ataagaccta atatttgata gcacaacagt	gtgactactg	tcaataatca tttaattgta	1398
catttaaaaa taactataat tgcattgttt dS.Ćt3.cl&ctĆlĆl£l ćl<Xći.el <210> 14 <211> 135 <212> PRT <213> Horno sapiens <400> 14	gtaacacaaa	agataaatge ttgaggagaa	1458 1472
Met Val Asp Ile Leu Gly Głu Arg	His Leu Val	Thr Cys Ijys Gly Ala
1 5	10	15
Thr Val Glu Ala Glu Ala Ala Leu	Gin Asn Lys	Val Val Ala Leu Tyr
20	25	30
Phe Ala Ala Ala Arg Cys Ala Pro 35 40	Ser Arg Asp	Phe Thr Pro Leu Leu 45
Cys Asp Phe Tyr Thr Ala Leu Val 50 55	Ala Glu Ala	Arg Arg Pro Ala Pro 60
Phe Glu Val Val Phe Val Ser Ala	Asp Gly Ser	Cys Gin Glu Met Leu
65 70	75	80
Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly	Ala Trp Leu	Ala Leu Pro Phe His
85	90	95
Asp Pro Tyr Arg Gin Arg Ser Leu	Ala Leu Leu	Pro Arg Leu Glu Cys
100	105	110
Ser Gly Val Ile Leu Ala His Cys 115 120 Asp Ser Leu Ala Leu Ala Ser 130 135	Asn. Leu Cys	Leu Leu Gly Ser Ser 125

<210> 15

PL 213 658 B1 <211> 702 <212> DMA <213> Mus musculus <400> 15

atcggatcct	ctctgggtcc	ccagctcctt	gcatactgct	aecatggcat	ctctcttctc	SO
tggacgcatc	ttgatcagga	acaacagcga	ccaggatgaa	gtggagacag	aggcagagct	120
gagccgtagg	ttagagaatc	gtctggtgtt	gctgttcttc	ggcgccggcg	cctgtcccca	180
gtgccaggcc	ttgccccagt	cctcaaagac	ttcttcgtgc	ggctcactga	cgagttctac	240
gtgctgcggg	cagcacagct	ggccctggtc	tatgtgtccc	aggaccctac	agaggagcaa	300
caggacctct	tcctcaggga	catgcctgaa	aaatggctct	tcctgccgtc	ccactgatga	350
actgaggagg	tgaggcccca	gggaagacca	gggagggctt	cctggagaag	gcatttccct	420
ggaggtttac	tgtcctggta	ctacttgtgc	actaaagagg	tattcctcca	caccaaccac	480
aggcgacaac	aacacacaag	apgtgtccca	tccgctcttc	catcacagcc	cactgacgcc	540
agacagcatc	gcgacgctca	cggctcagaa	aaacacaggt	agtctcacag	gcctgccatc	600
ctaatactgg	ccaccctgag	cacaagagcg	atggctacaa	gcctcaaggc	tagaatctaa	650
aaccacgagg	tggggaccgt	aggccccact	ccccgggagc	gc		702

<210 16 <211> 387 <212> DNA <213> Rattus norvegicus

<400> 16
cggccgctta	attaagacgg	atccccgact	acgtagtcgg	gaattcggca	cgaggggccg	60
catcttgatc	aggaacaaca	gcgaccagga	tgaagtggag	acagaggcag	agctgagccg	120
ccggttagag	aatcgtcttg	tgctactgtt	cttcggtgct	ggggcctgtc	cccagtgcca	180
ggccttcgcc	ccagtcctca	aagacttctt	cgtgcggctc	actgatgagt	tctacgtgct	240
acgggcagca	cagctggccc	tggtctatgt	gtcccaggac	cctaeagagg	agcaacagga	300
cctgttcctc	cgggacatgc	ctgaaaagtg	gctcttcctg	ccgttccatg	atgacctgag	350
gagagacctc	gggcgccagt	tctccgt				387

<210> 17

PL 213 658 B1 <211> 759 <212> DNA <213> Mus musculug <400> 17

cagetcettg	catactgcta	ccatggcatc	tctcttctct	ggacgcatct	tgatcaggaa	60
caacagcgac	caggatgaag	tggagacaga	ggcagagctg	agccgtaggt	tagagaatcg	120
tctggtgtgc	tgttcttcgg	cgccggcgcc	tgtccccagt	gccaggcctt	gccccagtcc	180
tcaaagactt	cttcgtgcgg	ctcactgacg	agttctaegt	getgcgggca	gcacagctgg	240
ccctggtcta	tgtgtcccag	gaccctacag	aggagcaaca	ggacctcttc	ctcagggaca	300
tgcetgaaaa	atggctcttc	ctgccgttcc	atgatgaact	gaggagggac	ctcgggcgcc	360
agttctctgt	ccgtcaactg	ccagcggttg	tggtacttaa	gcctggtggg	gacgtgctga	420
caagcgacgc	cacggaggag	atccagcgtc	tgggacccgc	ctgctttgcc	aactggcagg	480
aggccgcaga	gctcctggac	cgcagcttcc	tgcaaccgga	ggatttggat	gagcctgcgc	540
ggcgcagcat	caccgagcct	ctgcgccgtc	gcaagtaccg	agtagaccgg	gatgtcggcg	600
ggagcggggc	gaaacggcgc	gactctggtg	aaccccaggg	ggacgcgggt	acaagggcgg	6S0
agctctggtg	actcccaggg	taggagtggg	gaccggagct	ctggtgacac	caaagtaccg	720
gtgcacgacc	gaggttgatg	accctcccga	aggaaccgg			₇₅₉

<210> 18 <211> 443 <212> DNA <213> Rattus noryegicus

<220>
<221> misc <222> (46) <223> dowc <400> 18 acgaggtcaa	:_f eature ..(46) dny nukleotyd ccttggctac acagggagtc	tgaggacagc	atgggntaca	agaaaccctc	60
tctcaaaacc	aaacaaggcc	tggcagtact	ćigtgcacttg	ggaggcagag	gaacaacagc	120
gaccaggatg	aagtggagac	agaggcagag	ctgagccgcc	ggttagagaa	tcgtcttgtg	180
ctactgttct	tcggtgctgg	ggcctgtccc	cagtgccagg	ccttcgcccc	agtcc tcaaa	240
gacttcttcg	tgcggctcac	tgatgagttc	tacgtgctac	gggcagcaca	gctggccctg	300

PL 213 658 B1

gcctatgtgt	cecaggaccc	tacagaggag	caacaggacc	tgttcctccg	ggacatgcct	360
gaaaagtggc	tcttcctgcc	gttccatgat	gacctgagga	gtaataaaaa	ttagaggttg	420
tggctcaaaa	aaaaaaaaaa	aaa				443
<210> 19
<211> 889
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
acgccgcgct	gtccccagca	cccaacccag	gttaccatgg	cctccctgtt	ctctggccgc	60
atcctgatcc	gcaacaatag	cgaccaggac	gagctggafca	cggaggctga	ggtcagtcgc	120
aggctggaga	accggctggt	gctgctgttc	tttggtgctg	gggcttgtcc	acagtgccag	180
gccttcgtgc	ccatcctcaa	ggacttcttc	gtgcggctca	cagatgagtt	ctatgtactg	240
cgggcggctc	agctggccct	ggtgtacgtg	tcccaggact	ccacggagga	gcagcaggac	300
ctgttcctca	aggacatgcc	aaagaaatgg	cttttcctgc	cctttgagga	tgatctgagg	360
agggacctcg	ggcgccagtt	ctcagtggag	cgcctgccgg	cggtcgtggt	gctcaagccg	420
gacggggacg	tgctcactcg	cgacggcgcc	gacgagatcc	agcgcctggg	caccgcctgc	480
ttcgccaact	ggcaggaggc	ggccgaggtg	ctggaccgca	acttccagct	gcc&gaggac	540
ctggaggacc	aggagccacg	gagcctcacc	gagtgcctgc	gccgccacaa	gtaccgcgtg	600
gaaaaggcgg	cgcgaggcgg	cgcgacccgg	ggęagOfggct,	ggggacggag	gccggggccc	660
ggggggctgt	actgaccgct	gggtggagea	gagggagggg	gattggtgga	ij-Ł lZL C iZŁ C· *3- ϋ	720
ccacacgcag	ccagcaccag	gtatcccgac	taggggagac	agggcgaaga	cctgacccaa	7B0
agcacaacca	ccggggacac	taaacgactc	aactcaatcc	tgfcgggcacc	aggacaccgc	840
aaaa3&aa&£	aaaaaaagca	aaatgcaaaa	aaagacagga	catacgacg		889
<210> 20
<211> 348
<212> DNA
Homo sapiens
<400> 20
tgtcctcggg	tctcaggtgg	ctgcgtgtct	gcgccatggt	tgacattctg	ggcgagcggc	60

PL 213 658 B1

acctggtgac	ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg	120
tggcactgta	cttcgcggcg gcccggtgcg cgecgagccg cgacttcacg ccgctgctct	180
gcgacttcta	tacggcgctg gtggccgagg cgcggcggcc cgcgcccttc gaagtggtct	240
tcgtgtcagc	cgacggcagc tcccaggaga tgctggactt catgcgcgag ctgcatggcg	300
cctggctggc	gctgcccttc cacgacccct accggcacca ttgctgtg	348

<210> 21 <211> 340 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 21
tgtcctcggg	tctcaggtgg	ctgcgtgtct	gcgccatggt	tgacattctg	ggcgagcggc	60
acctggtgac	ctgtaagggc	gcgacggtgg	aggccgaggc	ggcgctgcag	aacaaggtgg	120
tggcactgta	cttcgcggcg	gccggtgcgc	gccgagccgc	gattcacgcc	gctgctctgc	180
gacttctata	cggcgctggt	ggccgagcgc	ggggccgcgc	cttcgaagtg	gtcttcgtgt	240
cagccgacgg	cagctcccag	gagatgctgg	acttcatgcg	cgagctgatg	gcgcctggct	300
ggcgctgcct	t cc^c^hc e e	ctaccggcac	agccggagcc			340

<210> 22 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 22
tgtcctcggg	tctcaggtgg	ctgcgtgtct	gcgccatggt	tgacattctg	ggcgagcggc	60
acctggtgac	ctgtaagggc	gcgacggtgg	aggccgaggc	ggcgctgcag	aacaaggtgg	120
tggcactgta	cttcgcggcg	gcccggtgcg	cgecgagccg	cgacttcacg	ccgctgctct	180
gcgacttcta	tacggcgctg	gtggccgagg	cgcggcggcc	cgcgcccttc	gaagtggtct	240
tcgtgtcagc	cgacggcagc	tgccaggaga	tgctggactt	catgcgcgag	ctgcatggcg	300
cctggctggc	gctgcccttc	cacgaaccct	accggcaacg	gagtctcg		348
<210> 23
<211> 350

PL 213 658 B1

<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
tgtcctcggg	tctcaggtgg	ctgcgtgtct	gcgccatggt	tgacattctg	ggcgagcggc	60
acctggtgac	ctgtaagggc	gcgacggtgg	aggccgaggc	ggcgctgcag	aacaaggtgg	120
tggcactgta	ettcgcggcg	gcccggtgcg	cgccgagccg	cgacttcacg	ccgctgctct	180
gcgacttcta	tacggcgctg	gtggccgagg	cgcggcggcc	cgcgcccttc	gaagtggtct	240
tcgtgtcagc	cgacggcagc	tgccaggaga	tgcttggact	tcatgcgcga	gctgcattgc	300
gcctggcttg	gcgctgccct	tccacgaccc	ctaccggcaa	cggagtctcg		350

<210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> Primer <400> 24 tctatgtgtc ceaggaccct acag 24 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> Primer <400> 25 tttatgcaca agtagtacca ggacag 26 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

PL 213 658 B1 <223> Primer <400> 26 cgggatccat ggcatctctc ttctctggac gc 32

<2I0>	27
<211>	31
<212>	DNA
<213>	sztuczna sekwencja

<220>

<223>	Primer
<400>	27

ggaattctca cctcctcagt tcatcatgga a 31

<210>	28
<211>	50
<212>	DNA
<213>	sztuczna sekwencja

<220>

<223>	Adapter
<400>	28

tgttaccaat ctgaagtggg agcggccgac aatttttttt tttttttttt 50

<210>	29
<211>	14
<212>	DNA
<213>	sztuczna sekwencja

<220>

<223>	Adaptor
<400>	2 9

aattcggcac gagg 14 <210> 30

PL 213 658 B1

<211>	10
<212>	DNA
<213>	sztuczna sekwencja
<220>

<223>	Adapter
<400>	30

cctcgtgccg 10

<210>	31
<211>	22
<212>	DNA
<213>	sztuczna sekwencja

<220>

<223>	Primer
<400>	31

gtaatacgac tcactatagg gc 22

<210>	32
<211>	22
<212>	DNA
<213>	sztuczna sekwencja
<220>

<223>	Primer
<400>	32

ctattacgtc aagcctgtag cc 22

<210>	33
<211>	22
<212>	DNA
<213>	sztuczna sekwencja
<220>

<223>

Primer

PL 213 658 B1 <400> 33 catcctcatc tttcttccct tc 22

<210>	34
<211>	22
<212>	DNA
<213>	sztuczna
<400>	34

gccagcgttt tctgcctttt ac 22

<210>	35
<211>	22
<212>	DNA
<213>	sztuczna
<400>	35

aagccctgcc tgctctaaca tc 22

Claims

1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu, przy czym polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

2. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera terapeutycznie skuteczną ilość kwasu nukleinowego oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik, gdzie kwas nukleinowy zawiera sekwencję nukleotydową wybraną z grupy, w skład której wchodzą nukleotydy 45-374 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1, nukleotydy 26-676 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3, nukleotydy 24-353 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5, nukleotydy 48-686 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 7, nukleotydy 265-570 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 9, nukleotydy 300-770 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 11 i nukleotydy 331-738 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 13.

3. Polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencję o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, do zastosowania jako farmaceutyk.

4. Cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydów kodującą polipeptyd określony w zastrzeżeniu 3 do zastosowania jako farmaceutyk.

5. Kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową wybraną z grupy, w skład której wchodzą nukleotydy 45-374 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1, nukleotydy 26-676 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3, nukleotydy 24-353 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5, nukleotydy 48-686 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 7, nukleotydy 265-570 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 9, nukleotydy 300-770 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 11 i nukleotydy 331-738 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 13, do zastosowania jako farmaceutyk.

6. Zastosowanie polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową wybraną z grupy, w skład której wchodzą sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencja o numerze identyfikacyjnym 14, do wytwarzania leku do leczenia dystrofii siatkówki.

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że dystrofia siatkówki wybrana jest z grupy obejmującej barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, degenerację plamki związaną z wiekiem, zespół Bardet-Biedela, zespół Bassen-Kornzweiga, chorobę Besta, postępujące zwyrodnienie naczyniówki i siatkówki, zanik kolisty, ślepotę wrodzoną, zespół Refsuna, chorobę Stargardta i zespół Ushera.

8. Zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, do wytwarzania leku do leczenia dystrofii siatkówki.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że dystrofia siatkówki wybrana jest z grupy obejmującej barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, degenerację plamki związaną z wiekiem, zespół Bardet-Biedela, zespół Bassen-Kornzweiga, chorobę Besta, postępujące zwyrodnienie naczyniówki i siatkówki, zanik kolisty, ślepotę wrodzoną, zespół Refsuna, chorobę Stargardta i zespół Ushera.

10. Wektor zawierający kwas nukleinowy kodujący polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, czynnie połączony z sekwencją kontroli transkrypcji, do zastosowania w terapii genowej.

11. Wektor według zastrzeżenia 10, znamienny tym, że pochodzi od adenowirusa lub wirusa towarzyszącego adenowirusom.

12. Sposób diagnozowania dystrofii siatkówki u człowieka, znamienny tym, że obejmuje pomiar in vitro albo ex vivo ilości informacyjnego RNA powstałego z transkrypcji cDNA polipeptydu w oku

PL 213 658 B1 człowieka, gdzie polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, przy czym zmniejszanie się ilości informacyjnego RNA w czasie oznacza diagnozę dystrofii siatkówki.

13. Sposób diagnozowania dystrofii siatkówki u człowieka, znamienny tym, że obejmuje pomiar in vitro albo ex vivo ilości polipeptydu w komórkach pręcikonośnych u człowieka, gdzie polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14, przy czym zmniejszanie się ilości polipeptydu w czasie oznacza diagnozę dystrofii siatkówki.

14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że etap pomiaru obejmuje kontaktowanie komórek z przeciwciałem, które specyficznie wiąże się z polipeptydem, oraz wykrywanie specyficznego wiązania się przeciwciała z polipeptydem lub jego fragmentem o działaniu ochronnym względem siatkówki w komórkach, przy czym wykrycie specyficznego wiązania z polipeptydem wskazuje na obecność polipeptydu RDCVF1 albo RDCVF2, lub jego fragmentu.

15. Izolowany polipeptyd wykazujący aktywność chroniącą siatkówkę, zawierający sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 2.

16. Izolowany polipeptyd wykazujący aktywność chroniącą siatkówkę, składający się z sekwencji aminokwasowej co najmniej w 90% identycznej z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 2.

17. Izolowany polipeptyd wykazujący aktywność chroniącą siatkówkę, zawierający sekwencję aminokwasową co najmniej w 99% identyczną z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 4.

18. Izolowany polipeptyd wykazujący aktywność chroniącą siatkówkę, składający się z sekwencji aminokwasowej co najmniej w 99% identycznej z sekwencją o numerze identyfikacyjnym 4.

19. Sposób wytwarzania polipeptydu określonego w jednym z zastrzeżeń 15-18, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza z wektorem ekspresyjnym zawierającym polinukleotyd pochodzenia egzogennego kodujący polipeptyd, w warunkach wystarczających do ekspresji polipeptydu w komórce gospodarza, z uzyskaniem ekspresji polipeptydu.

20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje odzyskiwanie polipeptydu.

21. Oczyszczone przeciwciało lub jego fragment, znamienny tym, że specyficznie wiąże się z polipeptydem, który składa się z sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z sekwencji aminokwasowej określonej przez sekwencję o numerze identyfikacyjnym 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10, sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14.

22. Przeciwciało według zastrz. 21, znamienne tym, że jest przeciwciałem poliklonalnym.

23. Przeciwciało według zastrz. 21, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym.

24. Fragment przeciwciała według zastrz. 21, znamienny tym, że jest fragmentem Fab lub F(ab')2.

25. Zestaw do diagnozowania dystrofii siatkówki u człowieka, znamienny tym, że zawiera elementy do po pobierania próbek i przeciwciało określone w zastrzeżeniu 21.