CZ305800B6 - Farmaceutická kompozice, způsob diagnostiky retinální dystrofie, rekombinantní polypeptid, způsob produkce tohoto polypeptidu, rekombinantní protilátka a její fragment - Google Patents

Abstract

Vynález se týká farmaceutické kompozice obsahující terapeuticky účinné množství polypeptidu zvoleného ze souboru zahrnujícího SEKV. ID. č. 2, SEKV. ID. č. 4, SEKV. ID. č. 6, SEKV. ID. č. 8, SEKV. ID. č. 10, SEKV. ID. č. 12 a SEKV. ID. č. 14 a farmaceuticky přijatelný nosič, způsobu diagnostiky retinální dystrofie u člověka, rekombinantního polypeptidu, způsobu produkce tohoto polypeptidu, jakož i rekombinantní protilátky a jejího fragmentu.

Description

Farmaceutická kompozice, způsob diagnostiky retinální dystrofie, rekombinantní polypeptid, způsob produkce tohoto polypeptidu, rekombinantní protilátka a její fragment

Oblast techniky

Tento vynález se týká přípravků pro detekci a léčbu degenerativních chorob sítnice. Konkrétně se vynález týká proteinu, který chrání proti degeneraci čípků, molekul nukleové kyseliny, které kódují takový protein, protilátky, které rozpoznávají protein a způsobů diagnostiky degenerativních chorob sítnice.

Dosavadní stav techniky

Fotoreceptory jsou specializovanou podmnožinou neuron sítnice (retiny), které zodpovídají za vidění. Fotoreceptory se skládají z tyčinek a čípků, což jsou fotosenzitivní buňky sítnice. Každá tyčinka a čípek vytváří specializovanou řasinku, nazývanou vnější segment, kde sídlí fototransdukční aparát. Tyčinky obsahují specifický vizuální pigment absorbující světlo, rodopsin. U lidí existují tři skupiny čípků, charakterizované expresí rozdílných vizuálních pigmentů: čípek pro modrý pigment, čípek pro zelený pigment a čípek pro červený pigment. Každý typ proteinu vizuálního pigmentu je přizpůsoben tak, aby maximálně absorboval světlo v různých vlnových délkách. Rodopsin tyčinek zprostředkovává skotopické vidění (za šera), zatímco čípkové pigmenty zodpovídají za fotopické vidění (v jasném světle). Červený, modrý a zelený pigment také tvoří základ barevného vidění u lidí. Vizuální pigmenty v tyčinkách a čípcích reagují na světlo a vytvářejí akční potenciál ve výstupních buňkách, tyčinkových bipolámích neuronů, který je pak přenášen gangliovými neurony sítnice za vzniku vizuálních podnětů ve zrakové kůře.

U lidí velký počet chorob sítnice zahrnuje progresivní degeneraci a eventuální úmrtí fotoreceptorů, vedoucí neúprosně ke slepotě. Degenerace fotoreceptorů, jako například dědičnými retinálními dystrofiemi (např. retinitis pigmentosa), makulámí degenerace se vztahem kvěku a další makulopatie nebo odchlípení sítnice, jsou všechny charakterizovány progresivní atrofií a ztrátou funkce vnějších segmentů fotoreceptorů. Kromě toho úmrtí fotoreceptorů nebo ztráta fotorecepční funkce má za následek parciální deaferentaci retinálních neuronů druhého řádu (bipolámích buněk tyčinek a horizontálních buněk) u pacientů s retinální dystrofií, proto klesá celková účinnost propagace elektrického signálu tvořeného fotoreceptory. Sekundární změny gliového a pigmentového epitelu sekundární k degeneraci fotoreceptorů má za následek vaskulámí změny vedoucí k ischémii a glióze. Trofické faktory, které jsou schopné zachránit fotoreceptory před buněčnou smrtí a/nebo obnovovat funkce dysfunkčních (atrofických nebo dystrofických) fotoreceptorů, mohou představovat použitelnou terapii na léčbu těchto chorobných stavů.

Progrese těchto chorobných stavů směřuje k následné ztrátě těchto dvou skupin fotoreceptorů: zpočátku jsou tyčinky ztráceny jako přímý důsledek genetické léze nebo léze způsobené vlivy prostředí nebo neznámého původu, což má za následek noční slepotu a redukci zorného pole následovanou nevyhnutelně ztrátou čípků vedoucí k celkové slepotě. Čípky umírají nepřímo, protože neprojevují primární lézi.

Ne všechny z genů spojených s retinální dystrofií už byly identifikovány. Identifikace takových genů by umožnila jak diagnostikovat onemocnění, tak poznat účinnou terapii.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je farmaceutická kompozice obsahující terapeuticky účinné množství polypeptidu zvoleného ze souboru zahrnujícího SEKY. ID. č. 2, SEKY. ID. č. 4, SEKY. ID. č. 6,

- 1 CZ 305800 B6

SEKV. ID. č. 8, SEKV. ID. č. 10, SEKV. ID. č. 12 a SEKV. ID. č. 14 a farmaceuticky přijatelný nosič.

Výhodně uvedená farmaceutická kompozice obsahuje terapeuticky účinné množství nukleové kyseliny zvolené ze souboru sestávajícího ze SEKV. ID. č. I nebo její kódující oblasti, SEKV. ID. č. 3 nebo její kódující oblasti, SEKV. ID. č. 5 nebo její kódující oblasti, SEKV. ID. č. 7 nebo její kódující oblasti, SEKV. ID. č. 9 nebo její kódující oblasti a farmaceuticky přijatelný nosič.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob diagnostiky retinální dystrofie u člověka, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

-detekci in vitro nebo ex vivo transkripce mediátorové RNA transkribované z DNA kódující RDCVF1 nebo RDCVF2 cDNA, uvedené v SEKV. ID. č. 5 nebo její kódující oblasti, SEKV. ID. č. 7 nebo její kódující oblasti nebo SEKV. ID. č. 13 nebo její kódující oblasti v oku člověka, přičemž snížená transkripce vzhledem k transkripcí v oku individua netrpícího retinální dystrofií znamená, že uvedený člověk je diagnostikován jako trpící retinální dystrofií, nebo alternativně zahrnuje:

-měření in vitro nebo ex vivo množství polypeptidu RDCVF1 nebo RDCVF2 obsahujícího aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEKV. ID. č. 6. SEKV. ID. č. 8 nebo SEKV. ID. č. 14 v tyčinkách oční sítnice člověka, přičemž přítomnost sníženého množství uvedeného polypeptidu vzhledem k množství polypeptidu v normální oční tkáni znamená, že uvedený člověk je diagnostikován jako trpící retinální dystrofií.

Předmětem vynálezu je rovněž rekombinantní polypeptid sestávající z aminokyselinové sekvence uvedené v SEKV. ID. č. 2 nebo z rekombinantního polypeptidu kódovaného nukleotidovou sekvencí SEKV. ID. č. 1 nebo její kódující oblastí, nebo sestávající z aminokyselinové sekvence uvedené v SEKV. ID. č. 4 nebo z rekombinantního polypeptidu kódovaného nukleotidovou sekvencí SEKV. ID. č. 3 nebo její kódující oblastí.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob produkce uvedeného RDCVF polypeptidu obsahující: kultivaci hostitelské buňky obsahující inkorporovaný expresní vektor obsahující exogenně-odvozený polynukleotid kódující uvedený polypeptid za podmínek dostatečných k expresi uvedeného polypeptidu v hostitelské buňce, čímž dojde k produkci exprimovaného polypeptidu, a izolaci polypeptidu produkovaného buňkou.

Předmětem vynálezu je rekombinantní protilátka nebo její fragment, který specificky váže aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEKV. ID. č. 2, SEKV. ID. č. 4, SEKV. ID. č. 6, SEKV. ID. č. 8, SEKV. ID. č. 10, SEKV. ID. č. 12 nebo SEKV. ID. č. 14.

Výhodně je uvedeným fragmentem protilátky fragment Fab nebo F(ab')2.

Výhodně je uvedenou rekombinantní protilátkou monoklonální protilátka.

Další předměty, rysy, výhody a aspekty předkládaného vynálezu budou zřejmé odborníkům z následujícího podrobného popisu. Je třeba připomenout, že následující popis a specifické příklady ukazující výhodná provedení vynálezu jsou pouze ilustrační a rozsah vynálezu nijak neomezují. Různé změny a modifikace, aniž by došlo k odchýlení od vynálezecké myšlenky a rozsahu popsaného vynálezu, budou odborníkovi zřejmé na základě předloženého popisu, příkladů, obrázků a nároků.

Objasnění výkresů

Obrázek 1: Myší nukleotidová sekvence Rdcvfl z expresní klonování a myší aminokyselinová sekvence RdCVFl.

-2CZ 305800 B6

Obrázek 2: Myší nukleotidová sekvence RdcvflL a odpovídající aminokyselinová sekvence.

Obrázek 3: Humánní Rdcvfl a humánní aminokyselinová sekvence Rdcvfl.

Obrázek 4: Humánní nukleotidová sekvence RdcvflL a humánní aminokyselinová sekvence RdcvflL.

Obrázek 5: Myší nukleotidová sekvence Rdcvf2 myší aminokyselinová sekvence Rdcvf2.

Obrázek 6: Myší nukleotidová sekvence Rdcvf2L a myší aminokyselinová sekvence Rdcvf2L.

Obrázek 7: Humánní nukleotidová sekvence Rdcvf2 a humánní aminokyselinová sekvence Rdcvf2.

Obrázek 8: ukazuje porovnání aminokyselinových sekvencí krátkých forem Rdcvf (SEKV. ID. C. 2, 6, 10 a 14) a dlouhých forem Rdcvf (SEKV. ID. Č. 4, 8, 12 a 14).

Obrázek 9 ukazuje oligonukleotidové primery pro GST-Rdcvfl.

Obrázek 10: Vícenásobné porovnání RDCVF 1/RDCVF2.

Obrázek 11: Srovnání myší a humánní sekvence RDCVF2.

Obrázek 12: Vícenásobné porovnání myšího Rdcv2 s EST klony be552141, bi517442, bg707818 abi603812.

Obrázek 13: Vícenásobné porovnání Rdcvfl a EST klony bg299078, ai716631, bg294111, be 108041 abg395178.

Obrázek 14: EST sekvence bg299078 upravená na nejvyšší shodu („match“) s Rdcvfl.

Obrázek 15: EST sekvence bg294111 upravená na nejvyšší shodu s RdcvflL.

Obrázek 16: RT-PCR analýza v reálném čase exprese arrestinu tyčinek (A) a RdCSFl (B) v sítnici ve stáří 5 týdnů u C57BL/6@N (zelená) a C3H/HE@N (červená).

Obrázek 17: RT-PCR analýza ukazující, že Rdcvf2 je exprimován způsobem závislým na tyčinkách a je exprimován v jiné části CNS.

Obrázek 18: PCR analýza ukazující, že RdCVFl je exprimován způsobem závislým na tyčinkách.

Podrobný popis vynálezu

Všechny v tomto textu citované patentové přihlášky, patenty a další literatura jsou tímto v plném rozsahu zahrnuty formou odkazu.

Při realizaci předkládaného vynálezu se užívají běžné metody molekulární biologie, mikrobiologie a rekombinantní DNA. Tyto metody jsou odborníkům dobře známy a byly popsány například v Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, a III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animl Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and Μ. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); and Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds.).

Termín „diferenčně exprimovaný gen“ užívaný v předkládaném textu se týká (a) genu, který obsahuje alespoň jednu z DNA sekvencí popsaných v tomto textu (např. sekvence na obr. 1 a SEKV. ID. Č. 1 nebo sekvence na obr. 2 a SEKV. ID. Č. 3), (b) jakékoliv DNA sekvence, která

-3 CZ 305800 B6 kóduje aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA sekvencí popsanou v tomto textu (např. sekvence na obr. 1 a SEKV. ID. Č. 2 nebo sekvence na obr. 2 a SEKV. ID. Č. 4) nebo (c) jakékoliv DNA sekvence, která je v podstatě podobná kódující sekvenci popsané v tomto textu.

Termín „v podstatě podobná“, ve svém nejširším významu, jak se používá v tomto textu, pokud se týká nukleotidová sekvence, znamená nukleotidovou sekvenci odpovídající referenční nukleotidové sekvenci, kde odpovídající sekvence kóduje polypeptid mající v podstatě stejnou strukturu a funkci jako polypeptid kódovaný referenční nukleotidovou sekvencí, např. kde změny aminokyselin, které se vyskytují, nepostihují funkci polypeptidu. Je žádoucí, aby v podstatě podobná nukleotidová sekvence kódovala polypeptid kódovaný referenční nukleotidovou sekvencí. Procento identity mezi v podstatě podobnou nukleotidovou sekvencí a referenční nukleotidovou sekvencí by mělo být alespoň 90 %, výhodněji alespoň 95 %, ještě výhodněji alespoň 99 %. Srovnání sekvencí je prováděno s použitím Smith-Watermanova algoritmu pro porovnávání sekvencí (viz např. Waterman, M. S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman & Hall. London: 1995. ISBN 0-412-99391-0, nebo viz také http://www- hto.usc.edu/software/seqaln/index.html. program Locals, verze 1,16, byl použit s následujícími parametry: Shoda („match“): 1, penalta za záměnu: 0,33, penalta za otevřenou mezeru: 2, penalta za rozšířenou mezeru: 2. Nukleotidová sekvence „v podstatě podobná“ referenční nukleotidová sekvenci hybridizuje s referenční nukleotidovou sekvencí v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO₄, ImM EDTA v 50 °C, po promytí v 2X SSC, 0,1% SDS v 50 °C, nebo výhodněji v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO₄, ImM EDTA v 50 °C, po promytí v IX SSC, 0,1% SDS v 50 °C, nebo ještě výhodněji v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO₄, ImM EDTA v 50 °C, po promytí v 0,5X SSC, 0,1% SDS v 50 °C, výhodně v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO₄, ImM EDTA v 50 °C s promytím v 0,lX SSC, 0,1% SDS v 50 °C, výhodněji v 7% dodecylsulfátu sodném (SDS), 0,5M NaPO₄, ImM EDTA 50 °C s promytím v 0,lX SSC, 0,1% SDS v 65 °C, přičemž stále kóduje funkčně rovnocenný genový produkt.

Diferenčně exprimované geny popsané v tomto textu jsou exprimovány v oční tkáni a konkrétně v tyčinkách (tyčinkových buňkách), nicméně u člověka postiženého retinální dystrofií, jako například onemocnění retinitis pigmentosa, makulámí degenerace se vztahem k věku, BardetůvBiedlův syndrom, Bassenův-Komzweigův syndrom, Bestova nemoc, chloroidom, spirálovitá atrofie, kongenitální amauróza, Refsumův syndrom, Stargardtova nemoc a Usherův syndrom, se tvoří v menším množství než v odpovídající tkáni u lidí, kteří netrpí retinální dystrofií. Mediátorová RNA (mRNA) transkribovaná z diferenčně exprimovaných genů a proteiny translatované z této mRNA, jsou přítomny tyčinkové tkáni a/nebo spojeny s takovými tkáněmi v množství nejvýše přibližně polovina, výhodně nejvýše pětkrát menším, výhodněji nejvýše deset krát, nejvýhodněji nejvýše lOOkrát menším než jsou hladiny mRNA a proteinu zjištěné v odpovídajících tkáních u lidí, kteří netrpí retinální dystrofií. Takové snížení transkripce Rdcvfl nebo Rdcvf2 mRNA je nazýváno v tomto textu jako „snížená transkripce“.

Termín „hostitelská buňka“ jak se v tomto textu používá, se týká prokaryotické nebo eukaryotické buňky, která obsahuje heterologní DNA, která byla do buňky vnesena kteroukoliv ze známých metod, např., elektroporací, precípitací s fosforečnanem vápenatým, microinjekcí, transformací, virovou infekcí apod.

Termín „heterologní“ znamená totéž co „odlišného přírodního původu“ nebo představuje „nepřírodní“ stav (stav nevyskytující se v přírodě). Například jestliže hostitelská buňka je transformovaná DNA nebo genem pocházejícím z jiného organismu, konkrétně jiného biologického druhu, pak je gen heterologní ve vztahu k hostitelské buňce, a také k potomstvu hostitelské buňky, které nese tento gen. Podobně se termín heterologní týká nukleotidová sekvence pocházející z téhož organizmu, do kterého je pak vložena, ale která je přítomna v „nepřírodním“ stavu, např. v odlišném počtu kopií nebo pod kontrolou odlišných regulačních prvků, ve srovnání se stavem, v jakém se vyskytuje v přírodě.

-4CZ 305800 B6

Vektorová molekula je molekula nukleové kyseliny, do které může být vložena heterologní nukleová kyselina, a která pak může být vložena do vhodné hostitelské buňky. Vektory výhodně mají jeden nebo více replikačních počátků a jedno nebo více míst, do kterého může být vložena rekombinantní DNA. Vektory často obsahují výhodné prostředky, jejichž pomocí mohou být buňky obsahující vektory odlišeny od buněk, které vektor neobsahují, např. kódují geny rezistence k léčivům. K obvyklým vektorům patří plazmidy, viry a (primárně v kvasinkách a baktériích) tzv. „umělé chromozómy“.

„Plazmidy“, obecně označované v tomto textu názvem, kterému předchází písmeno malé p, a pak následují zpravidla velká písmena a/nebo čísla, v souladu s mezinárodní konvencí o názvech, jsou odborníkům dobře známy. Plazmidy popsané v tomto textu jsou buďto komerčně dostupné, veřejně dostupné bez omezení nebo mohou být zkonstruovány z dostupných plazmidů rutinní aplikací dobře známých postupů, které byly publikovány. Mnohé plazmidy a další klonovací a expresní vektory, které mohou být použity podle předkládaného vynálezu, jsou odborníkům známy a jsou pro ně snadno dostupné. Navíc odborník snadno může zkonstruovat rutinním postupem libovolný počet dalších plazmidů, které budou vhodné pro použití ve vynálezu. Vlastnosti, konstrukce a použití takových plazmidů, a také dalších vektorů v předkládaném vynálezu je odborníkům jasné z předloženého popisu.

Termín „izolovaná“ znamená, že látka je odstraněna ze svého původního prostředí (např. přírodního prostředí, jestliže se normálně vyskytuje v přírodě). Například v přírodě se vyskytující polynukleotid nebo polypeptid přítomný v žijícím zvířeti není izolovaný, ale stejný polynukleotid nebo polypeptid, oddělený od některých nebo všech látek, se kterými se v přírodním systému společně vyskytoval, je považován za izolovaný, a to dokonce i v takovém případě, jestliže byl následně znovu vnesen do přírodního systému. Tak izolované polynukleotidy mohou být částí vektoru a/nebo izolované polynukleotidy nebo polypeptidy mohou být části kompozice nebo přípravku, a přitom jde stále o izolované látky, neboť vektor nebo kompozice nejsou přírodním prostředím.

Termín „transkripční kontrolní sekvence“ se týká DNA sekvence, jako například iniciační sekvence, enhancerové (zesilovací) sekvence a promotorové sekvence, které indukují, zesilují, potlačují nebo jinak regulují transkripci sekvence nukleové kyseliny kódující protein, ke které jsou operativně připojeny.

Termíny „transkripční kontrolní sekvence Rdcvfl“ nebo „transkripční kontrolní sekvence Rdcvf2“ označují jakékoliv z transkripčních kontrolních sekvencí, které se normálně nacházejí asociované se savčím genem Rdcvfl nebo Rdcvf2, výhodně s genem Rdcvf2 v myším nebo humánním genomu.

Termín „transkripční kontrolní sekvence jiného než lidského původu“ se týká jakékoliv transkripční kontrolní sekvence nevyskytující se v humánním genomu.

Termín „polypeptid“ se užívá v tomto textu zaměnitelně s termíny „polypeptidy“ a „protein“ a „proteiny“.

Termín „chemický derivát“ polypeptidů podle vynálezu, jak se v tomto textu používá, označuje polypeptid podle vynálezu, který obsahuje další chemické skupiny, které nejsou normálně částí molekuly. Takové skupiny mohou např. zlepšit rozpustnost molekuly, absorpci, biologický poločas apod. Skupiny může alternativně snížit toxicitu molekuly, vyloučit nebo zmírnit nežádoucí vedlejší účinky molekuly apod. Skupiny schopné zprostředkovat takové účinky byly popsány například v Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980).

Termín „neuroprotektivní agens“ označuje v kontextu předkládaného popisu sloučeninu, která zabraňuje degeneraci neuronových buněk nebo chrání neuronové buňky před degenerací. Podob

-5 CZ 305800 B6 ně „retinoprotektivní agens“ je sloučenina, která zabraňuje degeneraci buněk sítnice (retiny) nebo chrání buňky sítnice před degenerací.

Vynález zahrnuje molekuly nukleové kyseliny, výhodně DNA molekuly, jako například (1) izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uveden v SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. C. 3, (2) izolované molekuly nukleové kyseliny, které obsahují sekvence nukleové kyseliny, která hybridizuje s izolovanou DNA uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č. 3 a (3) sekvence nukleové kyseliny, která hybridizuje s (1) nebo (1). Tyto hybridizační podmínky mohou být velmi přísné nebo méně přísné. V příkladech, kde molekuly nukleové kyseliny jsou deoxyoligonukleotidy („oligos“), jsou doporučené vysoce přísné podmínky např. promytí v 6X SSC/0,05% difosforečnan sodný ve 37 °C (pro oligonukleotid sestávající ze 14 bází), 48 °C (pro oligo zel7 bází), 55 °C (pro oligo ze 20 bází) a 60 °C (pro oligo ze 23 bází). Vhodné rozsahy takových přísných podmínek pro nukleové kyseliny odlišného složení jsou popsány v publikaci: Krause and Aaronson (1991) Methods in Enzymology, 200:546-556 in addition to Maniatis et al. (citováno výše).

Tyto molekuly nukleové kyseliny mohou působit jako antisense molekuly na cílový gen, a jsou použitelné například k regulaci cílového genu a/nebo jako antisense primery v amplifikační reakci sekvence nukleové kyseliny cílového genu. Dále taková sekvence může být použita jako část ribozymu a/nebo trojšroubovicové molekuly, která je také použitelná pro regulaci cílového genu. A dále tyto molekuly mohou být použity jako složky diagnostických postupů, kdy je detekována přítomnost aiely RdCVFl nebo RdCVF2, která je příčinou nemoci.

Vynález také zahrnuje (a) vektory, který obsahují kteroukoliv z předcházejících kódujících sekvencí (tj. sense sekvence) a/nebo knim komplementárních sekvencí (tj. antisense sekvence), (b) expresní vektory, které obsahují kteroukoliv z předcházejících kódujících sekvencí operativně spojenou s regulačním prvkem, který řídí expresi kódující sekvence, a (c) geneticky modifikované hostitelské buňky, které obsahují kteroukoliv z předcházejících kódujících sekvencí operativně spojenou s regulačním prvkem, který řídí expresi kódující sekvence v hostitelské buňce. Jak se v tomto textu používá, regulační prvky zahrnují, ale bez omezení, indukovatelné a neindukovatelné promotory, enhancery (zesilující elementy), operátory a další elementy řídící a regulující expresi, které jsou odborníkům známy.

Vynález dále zahrnuje fragmenty kterýkoliv sekvencí nukleových kyselin popsaných v tomto textu. Fragmenty úplného „full-lenght“ Rdcvfl nebo Rdcvf2 genu mohou být použity jako hybridizační sonda pro cDNA knihovnu k izolaci kompletního genu a k izolaci dalších genů, které mají vysokou sekvenční podobnost s Rdcvfl nebo Rdcvf2 gen a podobnou biologickou aktivitu. Sondy tohoto typu mají výhodně alespoň 30 bází, a obsahují například přibližně od 30 do přibližně 50 bází, přibližně 50 až přibližně 100 bází, přibližně 100 až přibližně 200 bází nebo více než 200 bází (např. 300). Sonda může také být použita k identifikaci cDNA klonu odpovídajícího kompletnímu transkriptu genomového klonu, nebo klonu, který obsahuje kompletní Rdcvfl nebo Rdcvf2 gen včetně regulačního a promotorového úseku, exonů a intronů. Příklad screeningu zahrnuje izolaci kódujícího úseku Rdcvfl nebo Rdcvf2 genu tak, že se použije známá DNA sekvence pro syntézu oligonukleotidové sondy nebo se užije postup s náhodným primerem a izolovaná sekvence popsaná na obrázku 1 až 8. Značené oligonukleotidy mající sekvence komplementární k sekvenci genů podle předkládaného vynálezu se použijí pro screening knihovny humánní cDNA nebo genomové DNA k určení, který individuální klon knihovny hybridizuje se sondou.

Kromě genových sekvencí popsaných výše mohou být identifikovány také orthology těchto sekvencí, které mohou být například přítomny u jiného biologického druhu, a mohou být pak snadno izolovány, rutinními molekulárně biologickými postupy, které jsou známy v oboru, bez nepřiměřeného experimentování. Dále mohou existovat geny v jiných genetických lokusech v genomu, které kódují proteiny, které mají rozsáhlou homologii (homologie) s jednou nebo více doménami genových produktů podle vynálezu. Tyto geny mohou být také identifikovány podobnými postupy. Příklady orthologů nebo homologů jsou poskytovány na obr. 8, 10, 11, 12 a 13.

-6CZ 305800 B6

Například izolovaná exprimovaná genová sekvence může být značena a použita ke screeningu cDNA knihovny konstruované z mRNA získané z požadovaného organizmu. Hybridizační podmínky budou s nižší stringencí, když cDNA knihovna byla získána z organizmu odlišného od organizmu, ze kterého pochází značená sekvence. Jinak může být značený fragment použit ke screeningu genomových knihoven pocházejících z požadovaného organismu, a sice také s použitím podmínek přiměřeně nízké stringence. Takový podmínky nízké stringence jsou dobře známé odborníkům a předvídatelně se mění v závislosti íylogenezi specifických organizmů, ze kterých byla získána knihovna a značená sekvence. Pro instrukce ohledně volby vhodných podmínek, viz například Sambrook et al. (cit. výše).

Dále, dříve neznámá exprimovaná sekvence typu genu může být izolována pomocí PCR (polymerázové řetězové reakce) s použitím dvou degenerovaných oligonukleotidových příměrových poolů, navržených na základě aminokyselinové sekvence požadovaného genu. Templát pro reakci může být cDNA získaná reverzní transkripcí z mRNA připravené z buněčné linie nebo tkáně humánního nebo jiného než humánního původu, o které je známo nebo o které se domníváme, že exprimuje homolog nebo sestřihovou variantu.

PCR produkt může být subklonován a sekvencován, aby se zajistilo, že amplifikovaná sekvence představuje sekvenci exprimované genu podobné sekvence nukleové kyseliny.PCR fragment může pak být použit pro izolaci klonu kompletní cDNA celou řadou metod. Například amplifikovaný fragment může být značena použit pro screening bakteriofágové cDNA knihovny. Alternativně značený fragment může být použit pro screening genomové knihovny.

PCR technika může také být použita k izolaci kompletní cDNA sekvence. Například může být izolována RNA, a sice standardní postupy, z vhodného buněčného nebo tkáňového zdroje. Reverzní transkriptázová reakce může být provedena na RNA s použitím oligonukleotidového primem specifického pro 5' konec amplifikovaného fragmentu jako očka pro syntézu prvního vlákna. Výsledný RNA/DNA hybrid může pak být doplněn guaniny s použitím standardní reakce s terminální transferázou, hybrid může být štěpen Rnázou H a syntéza druhého vlákna pak může být zahájena prostřednictvím poly-C primem jako očka. Takže cDNA sekvence v protisměm („upstream“) od amplifikovaného fragmentu může být snadno izolována. Pro přehled klonování strategii, které mohou být použit, viz např., Sambrook et al., 1989 (viz výše).

V případy, kdy identifikovaný diferenčně exprimovaný gen je normální gen nebo gen divokého typu, pak tento gen může být použit k izolaci mutantní alely genu. Taková izolace je výhodná u procesů a chorobných stavů, které jsou známy nebo podezřelé tím, že mají genetický základ. Mutantní alely mohou být izolovány z jednotlivců buďto známých nebo podezřelých z toho, že mají genotyp, který přispívá k symptomům onemocnění. Mutantní alely a produkty mutantních alel pak mohou být použity v diagnostických testovacích systémech popsaných níže.

cDNA mutovaného genu může být izolována, například tak, že se použije RT-PCR technika, která je dobře známa odborníkům. V takovém případě první cDNA vlákno může být syntetizováno hybridizační oligo-dT oligonukleotidu (nebo náhodných hexamerů) k mRNA izolované z tkáně známé nebo podezřelý tím, že se exprimuje v jedinci domněle nesoucím mutantní alelu, a dále extenzí nového vlákna reverzní transkriptázou. Druhé vlákno cDNA je pak syntetizováno s použitím oligonukleotidu, který hybriduje specificky k 5' konci normálního genu (nebo kterýmkoliv jiným známým způsobem). S použitím těchto dvou primerů je pak možné pomocí PCR amplifikovat celý produkt, klonovat do vhodného vektor a podrobit ho DNA sekvenční analýze, a to metodami, které jsou dobře známy odborníkům. Porovnáním DNA sekvence mutovaného genu a normálního genu mohou být zjištěny mutace zodpovědné za ztrátu nebo změnu funkce mutovaného genového produktu.

Alternativně genomová nebo cDNA knihovna mohou být zkonstruovány a podrobeny screeningu s použitím DNA nebo RNA, z tkáně známé nebo podezřelé tím, že exprimuje požadovaný gen u jednotlivce, který domněle nese mutantní alelu. Normální gen nebo kterýkoliv jeho vhodný frag

-7CZ 305800 B6 ment může pak být značen a použit jako sonda k identifikaci odpovídající mutantní alely v knihovně. Klon obsahující tento gen pak může být purifikován metodami rutinně užívanými v oboru a pak podroben sekvenční analýze, jak bylo popsáno výše.

A dále, expresní knihovny mohou být konstruovány s využitím DNA izolované nebo cDNA syntetizované z tkáně známé nebo podezřelé tím, že exprimuje požadovaný gen, z jedince, který je suspektně nositelem mutantní alely. Tímto způsobem jsou exprimovány genové produkty tvořené v domněle mutantní tkáni a ty mohou být dále podrobeny screeningu s použitím standardních metod užívajících protilátky vytvořenými proti normálním genovým produktům, jak bude dále popsáno. (Metody screeningu viz např. například Harlow, E. and Lane, eds., 1988, „Antibodies: A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor). V případech, kdy mutace vedou k expresi genového produktu se změněnou funkcí (např. v důsledku mutace beze smyslu („missence“)), soubor polyklonálních protilátek pravděpodobně bude zkříženě reagovat s mutovaným genovým produktem. Klony z knihovny identifikované prostřednictvím jejich reakce s takovými značenými protilátkami mohou být dále purifikovány a podrobeny sekvenční analýze, jak bylo popsáno výše.

Diferenčně exprimované genové produkty zahrnují proteiny kódované nukleotidovými sekvencemi uvedenými jako SEKV. ID. Č. 1, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 7, SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 11 nebo SEKV. ID. Č. 13, konkrétně se jedná o polypeptid, který má nebo obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 nebo SEKV. ID. Č. 14 nebo jejich fragmenty.

Kromě toho, exprimované genové produkty zahrnují i proteiny, které představují funkčně rovnocenné genové produkty. Takový ekvivalentní genový produkt může obsahovat delece, adice nebo substituce aminokyselinových zbytků v aminokyselinové sekvenci kódované sekvencí diferenčně exprimovaného genu, popsaného výše, která ale vede k tzv. umlčené změně, takže je produkován funkčně rovnocenný diferenčně exprimovaný genový produkt (polymorfismy). Substituce aminokyselin může být provedena na základě podobnosti zúčastněných aminokyselinových zbytků v polaritě, náboji, rozpustnosti nebo hydrofobních, hydrofilních a/nebo amfipatických vlastností a na srovnání s aminokyselinovou sekvencí jiného biologického druhu.

Například nepolární (hydrofobní) aminokyseliny jsou alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin, polární neutrální aminokyseliny jsou glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin, pozitivně nabité (bazické) aminokyseliny jsou arginin, lysin a histidin a záporně nabité (kyselé) aminokyseliny jsou asparagová kyselina a glutamová kyselina.

Termín „funkčně ekvivalentní“ jak se v tomto textu používá, označuje protein nebo polypeptid schopný vykazovat v podstatě podobnou in vivo nebo in vitro aktivitu jako endogenní diferenčně exprimovaný genový produkt kódovaný diferenčně exprimovanou genovou sekvencí popsanou výše. Termín „funkčně ekvivalentní“ se týká také proteinů nebo polypeptidů schopných interakce s jinými buněčnými nebo extracelulámími molekulami způsobem podobným, kterým by reagovala odpovídající část endogenního diferenčně exprimovaného genového produktu. Například „funkčně ekvivalentní“ peptid by byl schopný v imunotestu snížit vazbu protilátky k odpovídajícímu peptidů (tj. peptidové aminokyselinové sekvenci, která byla modifikována, aby se získal „funkčně ekvivalentní“ peptid) endogenního proteinu nebo k endogennímu proteinu samotnému, když protilátka byla připravena proti odpovídajícímu peptidů endogenního proteinu. Ekvimolámí koncentrace funkčně rovnocenného peptidů sníží výše zmíněnou vazbu odpovídajícího peptidů alespoň přibližně o 5 %, výhodně přibližně o 5 % až 10 %, výhodněji přibližně od 10 % do 25 %, dokonce ještě výhodněji přibližně o 25 % až 50 % a nejvýhodněji přibližně o 40 % až 50 %.

Diferenčně exprimované genové produkty mohou být připraveny užitím technologie rekombinantní DNA, která je odborníkům dobře známa. Takže jsou zde popsány způsoby přípravy poly

-8CZ 305800 B6 peptidů a peptidů diferenčně exprimovaných genů podle vynálezu tím, že se exprimující nukleové kyseliny kódující diferenčně exprimované genové sekvence. Metody, které jsou odborníkům známé, mohou být použity ke konstrukci expresních vektorů obsahujících kódující sekvenci genu pro expresi proteinu a vhodné transkripční/translační kontrolní signály. Tyto metody zahrnují, například in vitro rekombinantní DNA techniky, syntetické techniky a in vivo rekombinaci/genetickou rekombinaci. Viz, například techniky popsané v publikaci Sambrook et al., 1989, (cit. výše) a Ausubel et al., 1989 (cit. výše). Alternativně RNA nebo cDNA schopná kódovat sekvenci genu pro expresi proteinu mohou být chemicky syntetizovány s použitím například automatických syntetizátorů. Viz například techniky popsané v publikaci „Oligonucleotide Synthesis“, 1984, Gait, M. J. ed„ IRL Press, Oxford, která je zahrnuta formou odkazu.

Celá řada systémů hostitel - expresní vektor může být použita pro expresi kódující sekvence diferenčně exprimovaného genu podle vynálezu. Takový systém hostitel - expresní vektor představuje vehikulum, jehož prostřednictvím může být požadovaná sekvence vytvořena a následovně purifikována, ale také představuje buňky, které mohou, když byly transformovány nebo transfekovány vhodnou nukleotidovou kódující sekvencí, insitu exprimovat protein diferenčně exprimovaného genu podle vynálezu. Patří k nim, ale bez omezení, mikroorganizmy jako například baktérie (např. E. coli, B. subtilis) transformované rekombinantním bakteriofágovým, plazmidovým nebo kozmidovým DNA expresním vektorem, který obsahuje kódující sekvenci genu diferenčně exprimovaného proteinu, kvasinky (např. Saccharomyces, Pichia) transformované rekombinantním kvasinkovým expresním vektorem obsahujícím kódující sekvenci genu diferenčně exprimovaného proteinu, systémy hmyzích buněk infikovaných rekombinantním virovým expresním vektorem (např. bakulovirus) obsahujícím kódující sekvenci genu diferenčně exprimovaného proteinu, systémy rostlinných buněk infikovaných rekombinantním virovým expresním vektorem (např. virus mozaiky květáku, CaMV, virus mozaiky tabáku, TMV) nebo transformované rekombinantním plazmidovým transformačním vektorem (např. Ti plazmid) obsahujícím kódující sekvenci genu diferenčně exprimovaného proteinu nebo systémy savčích buněk (např. buňky COS, CHO, BHK, 293, 3T3) nesoucí rekombinantní expresní konstrukty obsahující promotory pocházející z genomu savčích buněk (např., metalothioneinový promotor) nebo ze savčích virů (např. adenovirový pozdní promotor, 7,5K promotor viru vakcínie, promotor časných genů cytomegaloviru).

Exprese polypeptidu RDCVF1 nebo RDCVF2 buňkou z genu Rdcvfl nebo Rdcvf2, který je pro buňku nativní, může být také realizována. Metody vhodné pro takovou expresi byly popsány např. v patentech USA 5 641 670, 5 733 761, 5 968 502 a 5 994 127, které jsou výslovně zahrnuty formou odkazu v tomto textu. Buňky, které byly indukovány k expresi RDCVF1 nebo RDCVF2 metodami podle kteréhokoliv z patentů USA 5 641 670, 5 733 761, 5 968 502 a 5 994 127, mohou být implantovány do požadované tkáně v žijícím zvířeti, aby se zvýšila lokální koncentraci RDCVF1 nebo RDCVF2 v tkáni.

V bakteriálních systémech lze výhodně vybrat celou řadu expresních vektorů pro expresi proteinu diferenčně exprimovaného genu v závislosti na zamýšleném použití. Například když má být produkováno velké množství takového proteinu, pro přípravu protilátek nebo screening peptidových knihoven, jsou výhodné například vektory, které regulují vysokou hladinu exprese fuzních proteinových produktů. K takovým vektorům patří, ale bez omezení, E. coli expresní vektor pUR278 (Ruther et aL, 1983, EMBO J. 2:1791), ve kterém sekvence kódující protein diferenčně exprimovaného genu může být ligována individuálně do vektoru ve shodném čtecím rámci s kódujícím úsekem lacZ takže se vytvoří fůzní protein, pIN vektory (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chern. 264:5503-5509). Mohou také být použity PGEX vektory exprimující cizorodé polypeptidy jako fúzní proteiny s glutathion-Stransferázou (GST). Obecně, takové fúzní proteiny jsou rozpustné a mohou být snadno purifíkovány z lyžovaných buněk adsorpcí na glutathion—sefarózové perličky následovanou elucí za přítomnosti volného glutathionu. PGEX vektory jsou navrženy tak, že obsahují štěpná místa trombinu nebo proteázy faktoru Xa, takže protein klonovaného cílového genu může být odštěpen od GST skupiny s použitím uvedených endopeptidáz.

-9CZ 305800 B6

Promotorové úseky mohou být vybrány z kterýchkoliv požadovaných genů použitím vektorů, které obsahují reportérovou transkripční jednotku postrádající promotorový úsek, jako například chloramfenikolacetyltransferázovou („CAT“) nebo luciferázovou transkripční jednotku, po směru („downstream“) od restrikčního místa nebo místa pro vložení zkoumaného promotorového fragmentu, tj. fragmentu, který může obsahovat promotor. Jak je dobře známo, vložení promotoru obsahujícího fragmentu do restrikčního místa vektoru v protisměru od CAT nebo luciferázového genu vede k produkci CAT nebo luciferázové aktivity, které mohou být detekovány standardními CAT testy nebo luminometry. Vektory vhodné pro tento účel jsou dobře známy a jsou snadno dostupné. Tři příklady takových vektorů jsou pKK232-8, pCM7 a pGL3 (Promega, El751, Genebank č. u47295). Takže promotory pro expresi polynukleotidů podle předkládaného vynálezu zahrnují nejen známé a snadno dostupné promotory, ale také promotory, které mohou být získány výše popsaným způsobem užitím testu s reportérovým genem.

Ke známým bakteriálním promotorům vhodným k expresi polynukleotidů a polypeptidů podle předkládaného vynálezu patří E. coli láci a lacZ promotory, T3 a T7 promotory, T5 tac promotor a promotory lambda PR, PL a trp. Mezi známé eukaryotické promotory vhodné v tomto směru patří CMV bezprostředně časný promotor, promotor thymidinkinázy z HSV, časný a pozdní promotor z SV40, promotory z retrovirových LTR, jako například viru Rousova sarkomu (RSV) a metalothioneinové promotory, jako například myší promotor metalothionein-I.

V hmyzích systémech, virus polyhedrosy jádra (AcNPV) zAutogapha californica je jeden z několika hmyzích systémů, které mohou být použity jako vektory pro expresi cizorodých genů. Virus se množí v buňkách Spodoptera frugiperda. Kódující sekvence diferenčně exprimovaného genu může být klonována individuálně do neesenciálních úseků (například gen polyhedrinu) viru a vložen pod kontrolou AcNPV promotor (například promotor polyhedrinu). Úspěšná inzerce kódující sekvence diferenčně exprimovaného genu povede k inaktivaci polyhedrinového genu a produkci neobaleného rekombinantního viru (tj. viru postrádajícího proteinový obal kódovaný gene pro polyhedrin). Tyto rekombinantní viry jsou pak použity k infekci buněk Spodoptera frugiperda, ve kterých je pak vložený gen exprimován. (např. viz Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, U.S. Patent 4,215,051).

V savčích hostitelských buňkách může být použita také celá řada expresních systémů založených na virech. V případech, kdy je užit adenovirus jako expresní vektor, kódující sekvence požadovaného diferenčně exprimovaného genu může být ligována k adenovirovému kontrolnímu komplexu transkripce/translace, jako je např. pozdní promotor a tripartitní vedoucí sekvence. Tento chimérický gen pak může být vložen do adenovirového genomu rekombinaci in vitro nebo invivo. Inzerce do neesenciálního úseku virového genomu (např. úsek El nebo E3) poskytne rekombinantní virus, který je životaschopný a je schopný exprimovat protein diferenčně exprimovaného genu v infikované hostitelské buňce (např., Viz Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). Specifické iniciační signály mohou být požadovány pro účinnou translaci vložené kódující sekvence diferenčně exprimovaného genu. Tyto signály zahrnují ATG iniciační kodon a přilehlé sekvence. V případech, kdy celý diferenčně exprimovaný gen, včetně jeho vlastního iniciačního kodonu a přilehlých sekvencí, je vložen do vhodného expresního vektoru, žádný další translační kontrolní signál již není potřeba. Nicméně v případě, kdy je vložena jen část kódující sekvence diferenčně exprimovaného genu, exogenní translační kontrolní signál, případně včetně ATG iniciačního kodonu, musí být poskytnout. Kromě toho, iniciační kodon musí být ve fázi s čtecím rámcem požadované kódující sekvence, aby se zajistila translace celého inzertu. Tyto exogenní translační kontrolní signály (Kozackovy sekvence) a iniciační kodony mohou pocházet z různých zdrojů, jak přírodního tak i syntetického původu. Účinnost exprese může být zesílena vložením vhodného enhanceru transkripce, terminátoru transkripce apod. (viz Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).

Selekce vhodných vektorů a promotorů pro expresi v hostitelské buňce je dobře známým postupem a potřebné postupy pro konstrukci expresního vektoru, zavedení vektoru do hostitele a expresi v hostiteli jsou rutinními postupy, které jsou v oboru známy.

- 10CZ 305800 B6

Obecně, rekombinantní expresní vektory obsahují počátek replikace, promotor pocházející z genu s vysokou hladinou exprese pro řízení transkripce po směru („downstream“) ležícího strukturálního genu a volitelně selekční marker umožňující po kontaktování buněk a vektoru izolaci buněk, které obsahují vektor.

Kromě toho může být vybrán i hostitelský buněčný kmen, který moduluje expresi vložené sekvence nebo modifikuje a zpracovává genový produkt specifickým způsobem. Takové modifikace (např. glykosylace) a opracování (např. štěpení) proteinových produktů mohou být důležitými faktory pro funkce proteinu. Různé hostitelské buňky mají charakteristické a specifický mechanismy pro posttranslační opracování a modifikace proteinů. Vhodné buněčné linie nebo hostitelské systémy mohou být zvoleny, aby se zajistila správná modifikace a opracování exprimovaného cizorodého proteinu. Pro tento účel mohou být použity eukaryotické hostitelské buňky, které mají vlastní buněčný aparát pro správné opracování primárního transkriptu, glykosylaci a fosforylaci genového produktu. Takové savčí hostitelské buňky jsou, ale bez omezení, buňky CHO, VĚRO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138 apod.

Pro dlouhodobou produkci rekombinantního proteinu s vysokým výtěžkem je výhodná stabilní exprese. Například může být geneticky zkonstruována buněčná linie, která trvale exprimuje diferenčně exprimovaný protein. Spíše než expresními vektory, které obsahují virový počátek replikace, hostitelské buňky mohou být transformovány DNA řízenou vhodnými expresními kontrolními prvky (jako je např. promotor, enhancer, sekvence, transkripce terminátoiy, polyadenylace místa apod.) a obsahující selekční marker. Po vložení cizí DNA se geneticky upravené buňky ponechají růst po dobu 1 až 2 dní v obohacených médiích a pak jsou přeneseny do selektivního média. Selekční marker v rekombinantním plazmidu poskytne rezistenci k selekci a umožní, aby buňky, které trvale inkorporovaly plazmid do chromozómů, rostly za vzniku „fokusů“, které mohou být klonovány a pak namnoženy do buněčné linie. Tento způsob může výhodně být použit ke genové manipulaci buněčné linie, která exprimuje diferenčně exprimovaný protein. Taková geneticky upravená buněčná linie může být konkrétně použitelná pro screening a hodnocení sloučenin, které ovlivňují endogenní aktivitu diferenčně exprimovaných proteinů. Takové stabilní buněčné linie mohou být použity přímo jako prostředek buněčné terapie přímo nebo po obalení.

Může být použita celá řada selekčních systémů, jako je např. (aniž by výčet byl omezující) thymidin kináza viru herpes simplex (Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), hypoxanthin-guanin fosforibosyltransferáza (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), adeninfosforibosyltransferáza (Lowy, et al., 1980, Cell 22:817), které mohou být užity v buňkách tk“, hgprť nebo aprf, v daném pořadí. Také rezistence k antimetabolitům může být použita jako základ selekce na dhfr, který udělí rezistenci k methotrexatu (Wigler, et al., 1980, Nati. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527), gpt, který udělí rezistenci k mykofenolové kyselině (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072), neo, který udělí rezistenci k aminoglykosidu G-418 (Colberre-Gerapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1) a hygro, který udělí rezistenci k hygromycinu (Santerre, et al., 1984, Gene 30:147).

Alternativní systém fúzních proteinů umožňuje rychlou purifíkaci nedenaturovaného fuzního proteinu exprimovaného v humánní buněčné linii (Janknecht, et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976). V tomto systému je požadovaný gen subklonován do rekombinantního plazmidu vakcínie, takže otevřený čtecí rámec genu je translačně fúzován k aminokoncové „značce“, kterou tvoří šest histidinových zbytků. Extrakty z buněk infikovaných rekombinantním virem vakcínie jsou pak naneseny na klony s Ni²⁺ nitrilooctovou kyselinou-agarózou a histidinem značené proteiny jsou pak selektivně eluována imidazol-obsahujícím pufrem.

Když se použijí jako složky v testovacích systémech, jako například popsaných dále, diferenčně exprimovaný protein může být označen, buď přímo nebo nepřímo, pro usnadnění detekce komplexu vytvořeného mezi diferenčně exprimovaným proteinem a testovací látkou. Kterýkoliv z celé řady značících systémů může být použit, včetně (bez omezení) radioizotopů, jako je napří

- 11 CZ 305800 B6 klad ^l25I, enzymatických značících systémů, které vytvářejí detekovatelný kolorimetrický signál nebo světlo, když jsou exponovány k substrátu, a fluorescenční značky.

Když je užita technologie rekombinantní DNA k produkci diferenčně exprimovaného proteinu pro takové testovací systémy, může být výhodné zkonstruovat fúzní proteiny, které usnadňují značení, imobilizaci a/nebo detekci.

Nepřímé značení zahrnuje použití proteinu, jako například značené protilátky, který se specificky váže k produktu diferenčně exprimovaného genu. Takové protilátky zahrnují, ale bez omezení, polyklonální, monoklonální, chimérické, jednořetězcové protilátky, Fab fragmenty protilátek a fragmenty vytvořené z Fab expresní knihovny.

V jiném provedení vynálezu nukleové kyseliny obsahující sekvence kódující protein RDCVF1 nebo RDCVF2 nebo jeho funkční derivát jsou podávány, aby podporovaly funkci čípků, a sice metodami genové terapie. Genová terapie se týká terapie prováděné podáváním nukleové kyseliny pacientovi. V tomto provedení vynálezu nukleová kyselina produkuje kódovaný protein, který zprostředkuje terapeutický účinek tím, že podporuje funkce čípků.

Kterákoliv z dostupných metod genové terapie může být použita pro realizaci předkládaného vynálezu. Příklady metod jsou popsány dále.

Ve výhodném aspektu léčivý přípravek obsahuje nukleovou kyselinu Rdcvfl nebo Rdcvf2, který je částí expresního vektoru, který exprimuje protein RDCVF1 nebo RDCVF2 nebo jeho fragment nebo jeho chimérický protein ve vhodném hostiteli. Konkrétně tato nukleová kyselina má promotor operativně spojený s Rdcvfl nebo Rdcvfž kódujícím úsekem, přičemž promotor je indukovatelný nebo konstitutivní, a volitelně tkáňově specifický. V dalším konkrétním provedení je použita molekula nukleové kyseliny, kde Rdcvfl nebo Rdcvf2 kódující sekvence a jakákoliv jiná požadovaná sekvence jsou obklopeny oblastmi, které podporují homologní rekombinaci v požadovaném místě genomu, takže dochází k intrachromozomové expresi nukleové kyseliny Rdcvfl nebo Rdcvf2 (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435—43 8).

Podání nukleové kyseliny pacientovi může být buďto přímé, v takovém případě je pacient přímo exponován nukleové kyselině nebo vektoru nesoucímu nukleovou kyselinu, nebo nepřímé, v takovém případě jsou nejdříve buňky transformovány nukleovou kyselinou in vitro a pak jsou transplantovány pacientovi. Tyto dva přístupy jsou známy, v daném pořadí, jako in vivo nebo ex vivo genová terapie.

Ve specifickém provedení nukleová kyselina je přímo podávána in vivo, kde je exprimována za vzniku kódovaného produktu. Tento postup může být uskutečněn kteroukoliv z četných metod známých v oboru, např. tak, že se nukleová kyselina vloží jako část vhodného expresního vektoru a podá se tak, že se stane intracelulámí složkou, např. infekcí s použitím defektního nebo atenuovaného (oslabeného) retrovirového nebo jiného viru (adenovirus, adeno-asociovaný virus, lentivirus) (viz např. patent USA 4 980 286 a další, citované výše), nebo přímým vstřikem holé DNA nebo použitím ostřelování mikročásticemi (např. genová „puška“, Biolistic, Dupont) nebo potaženou lipidy nebo receptory buněčného povrch nebo transfekčními činidly, obalenou v lipozomech, v mikročásticích nebo mikrotobolkách, nebo navázanou na peptid, o kterém je známo, že vstupuje do jádra, nebo navázanou k ligandu, který pak podléhá receptoremzprostředkované endocytóze (viz např. patenty USA 5 166 320, 5 728 399, 5 874 297 a 6 030 954, které jsou zahrnuty formou odkazu), kterýžto postup může být použit k cílení na buněčné typy specificky exprimující receptory, apod. V dalším provedení mohou být vytvořeny komplexy nukleová kyselina - ligand, ve kterých ligand obsahuje fusogenní virový peptid pro narušení endosomů, což dovolí nukleové kyselině vyhnout se lysosomální degradaci. V ještě dalším provedení nukleová kyselina může být zaměřena in vivo pro buněčně specifický příjem a expresi, cílením na specifický receptor (viz např. PCT Publikace WO 92 06180, WO 92 22635,

- 12CZ 305800 B6

WO 92 20316, WO 93 14188 a WO 93 20221). Alternativně nukleová kyselina může být vložena intracelulámě a vnesena do DNA hostitelské buňky pro expresi homologní rekombinací (viz např. patenty US 5 413 923; 5 416 260 ; a 5 574 205; a Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435^138).

Ve specifickém provedení je použit virový vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu Rdcvfl nebo Rdcvf2. Například může být použit retrovirový vektor (viz např. patenty US 5 219 740, 5 604 090 a 5 834 182). Tyto retrovirové vektory byly modifikovány odstraněním retrovirových sekvencí, které nejsou nutné pro sbalení virového genomu a integraci do DNA hostitelské buňky. Nukleová kyselina Rdcvfl nebo Rdcvfž pro použití v genové terapii je klonována do vektoru, který usnadní aplikaci genu do pacienta.

Adenoviry jsou další virové vektoiy, které mohou být použity v genové terapii. Adenoviry jsou obzvláště atraktivní vehikula pro přenos genů do respiračního epitelu. Adenoviry přirozeně infikují respirační epitel, kde způsobují mírná onemocnění. Dalším cílem pro aplikační systémy založené na adenovirech jsou játra, centrální nervový systém, endotelové buňky a sval. Adenoviry mají výhodu, že jsou schopny infikovat nedělící se buňky. Metody použití adenovirů v genové terapii jsou popsány např. v patentech USA 5 824 544, 5 868 040, 5 871 722, 5 880 102, 5 882 877, 5 885 808, 5 932 210, 5 981 225, 5 994 106, 5 994 132, 5 994 134, 6 001 557 a 6 033 8843, které jsou zahrnuty formou odkazu.

Adeno-asociované viry (AAV) byly také navrženy pro použití v genové terapii. Adenoasociované viry jsou obzvláště atraktivní vehikula pro přenos genů do sítnice. Metody využívající AAV jsou popsány např. patentech USA 5 173 414, 5 252 479, 5 552 311, 5 658 785, 5 763 416, 5 773 289, 5 843 742, 5 869 040, 5 942 496 a 5 948 675, které jsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu.

Další přístup v genové terapii zahrnuje přenos genu do buněk ve tkáňové kultuře takovými metodami jako je elektroporace, lipofekce, transfekce zprostředkované fosforečnanem vápenatým nebo virovou infekcí. Obvykle způsob přenosu zahrnuje také přenos selekčního markéru do buněk. Buňky jsou pak umístěny pod selekční tlak, aby byly izolovány ty buňky, které přijaly a exprimují přenesený gen. Tyto buňky jsou pak podány pacientovi přímo nebo po obalení.

V tomto provedení je nukleová kyselina vnesena do buňky před podáním in vivo výsledné rekombinantní buňky. Toto vnesení může být provedeno jakýmkoliv způsobem známým v oboru, který zahrnuje, avšak bez omezení, transfekci, elektroporaci, mikroinjekci, infekci virovým nebo bakteriofágovým vektorem obsahujícím požadovanou sekvenci nukleové kyseliny, buněčnou fúzí, chromozomem zprostředkovaným přenosem genu, mikrobuňkou zprostředkovaným přenosem genu, fúzí sferoplastů apod. Pro vnášení cizorodých genů do buněk jsou známé četné techniky a mohou být využity při realizaci předkládaného vynálezu, za předpokladu, že nebudou narušeny nutné vývojové a fyziologické funkce příjemce buňky. Použitý postup by měl zajistit stabilní přenos nukleové kyseliny do buňky, aby nukleová kyselina mohla být v buňce exprimována a výhodně dědičná a exprimovatelná i v buněčném potomstvu.

Výsledné rekombinantní buňky mohou být podávány pacientům různými metodami známými v oboru. Ve výhodném provedení epiteliální buňky jsou injektovány, např. subkutánně. V dalším provedení rekombinantní kožní buňky mohou být použity jako kožní štěp (transplantát) u pacienta. Rekombinantní krvinky (např. hematopoetické kmenové buňky nebo progenitorové buňky) jsou výhodně podávány intravenózně. Množství použitých buněk v genové terapii závisí na žádaném efektu, stavu pacienta a dalších faktorech, a může být odborníkem rutinně stanoveno.

Buňky, do kterých se může vnášet molekula nukleové kyseliny pro účely genové terapie, jsou jakékoliv požadované buňky, např. (aniž by výčet byl omezující) epitelové buňky, endotelové buňky, keratinocyty, fibroblasty, svalové buňky, hepatocyty, krevní buňky jako jsou T lymfocyty, B lymfocyty, monocyty, makrofágy, neutrofily, eosinofily, megakaryocyty, granulocyty, růz

- 13CZ 305800 B6 né kmenové a progenitorové buňky, zejména hematopoetické kmenové a progenitorové buňky, které jsou např. získány z kostní dřeně, pupečníkové krve, periferní krve, fetálních jater apod.

V provedení, kdy jsou v genové terapii použity rekombinantní buňky, Rdcvfl nebo Rdcvf2 nukleová kyselina je zavedena do buněk tak, že je exprimována buňkami nebo jejich potomstvem a rekombinantní buňky jsou pak podávány in vivo pro dosažení terapeutického účinku. Ve specifickém provedení jsou použity kmenové nebo progenitorové buňky. Kterékoliv kmenové a/nebo progenitorové buňky, které mohou být izolovány a udržovaný in vitro, mohou být potenciálně použity v souladu s tímto provedením podle předkládaného vynálezu. Takové kmenové buňky zahrnují, ale bez omezení, hemopoetické kmenové buňky (HSC), kmenové buňky epitelových tkání, jako je například kůže a epitel střev, embryonální srdeční svalové buňky, jatemí kmenové buňky (viz např. WO 94 08598) a nervové kmenové buňky (Stemple a Anderson, 1992, Cell 71:973-985).

Epitelové kmenové buňky (ESC) nebo keratinocyty mohou být získány z tkání, jako je například kůže a epitel střev, známými postupy (Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229). Ve vrstevnaté epitelové tkáni, jako je například kůže, obnova nastává mitózou kmenových buněk v germinativní vrstvě, vrstva nejbližší lamina basalis. Kmenové buňky ve střevním epitelu zajišťují rychlé tempo obnovy této tkáně. ESC nebo keratinocyty získané z kůže nebo střevního epitelu pacienta nebo dárce mohou být pěstovány ve tkáňové kultuře (Pittelkow a Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771). Jestliže ESC jsou poskytnuty dárcem, může také být použit nějaký způsob suprese reakce štěpu proti hostiteli (např. ozáření, podávání léčiv nebo protilátek pro podporu mírné imunosuprese). Kmenové buňky ve střevním epitelu zajišťují rychlé tempo obnovy této tkáně. ESC nebo keratinocyty získané z kůže nebo střevního epitelu pacienta nebo dárce mohou být pěstovány ve tkáňové kultuře (Pittelkow a Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771). Jestliže ESC jsou poskytnuty dárcem, může také být použit nějaký způsob suprese reakce štěpu proti hostiteli (např. ozáření, podávání léčiv nebo protilátek pro podporu mírné imunosuprese). Kmenové buňky sítnice byly také popsány (Tropepe et al., 2000, Science, 287: 2032).

Co se týká hemopoetických kmenových buněk (HSC), kterákoliv technika, která zajistí izolaci, rozmnožování a udržování HSC in vitro, může být použita v tomto provedení vynálezu. Techniky, kterými to může být uskutečněno, zahrnují (a) izolaci a založení HSC kultur z buněk kostní dřeně izolovaných z budoucího hostitele nebo dárce nebo (b) použití dříve založených dlouhodobých HSC kultur, které mohou být alogenní nebo xenogenní. Neautologní HSC jsou použity výhodně ve spojení se způsobem suprese transplantačních imunitních reakcí budoucího hostitele/pacienta. V konkrétním provedení podle předkládaného vynálezu humánní buňky kostní dřeně mohou být získány z hřebene zadní kosti kyčelní aspirací jehlou (viz např. Kodo et al., 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384). Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu, HSCS mohou být ve vysoce obohacené nebo v podstatě v čisté formě. Toto obohacen může být uskutečněno před dlouhodobou kultivací, během kultivace nebo po ní a může být prováděno kteroukoliv technikou v oboru známou. Dlouhodobé kultivace buněk kostní dřeně mohou být založeny a udržovány například s použitím modifikovaných technik pro tkáňové kultury podle Dextera (Dexter et al., 1977, J. Cell Physiol. 91:335) nebo technikami pro tkáňové kultury podle Witlocka a Witteho (Witlock a Witte, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3608-3612).

Ve specifickém provedení nukleová kyselina, která má být zavedena pro účely genové terapie, obsahuje indukovatelný promotor operativně spojený s kódujícím úsekem tak, že exprese nukleové kyseliny je kontrolovatelná řízením přítomnosti nebo nepřítomnosti vhodného induktoru transkripce.

V tomto textu jsou popsány způsoby produkce protilátek schopných specificky rozpoznávat jeden nebo více diferenčně exprimovaných genových epitopů. Takové protilátky mohou zahrnovat, ale bez omezení, polyklonální protilátky, monoklonální protilátky (mAb), humanizované nebo chimérické protilátky, jednořetězcové protilátky, Fab fragmenty, F(ab')₂ fragmenty, fragmenty vytvářené Fab expresní knihovnou, anti—idiotypové (anti-Id) protilátky a fragmenty vázající epitop

- 14CZ 305800 B6 kterékoliv výše uvedené protilátky. Takové protilátky mohou být použity například pro detekci „otisku prstů“, cílového genu v biologickém vzorku nebo alternativně jako způsob inhibice abnormální aktivity cílového genu. Tyto protilátky tedy mohou být použity jako součást léčebných způsobů nemocí a/nebo mohou být použity jako součást diagnostických technik, přičemž pacienti mohou být testováni na abnormální hladiny Rdcvfl nebo Rdcvf2 nebo na přítomnost abnormálních forem Rdcvfl nebo Rdcvf2 odběrem vzorků komorové vody a/nebo sklivce metodami známými odborníky v oboru (např. Forster, RK, Abbott, RL, Ge lender, H„ 1980, Management of infectious endophthalmitis Ophthalmology 87, 313-319)].

Pro produkci protilátek k diferenčně exprimovanému genu mohou být různá hostitelská zvířata imunizována injekcí diferenčně exprimovaného proteinu nebo jeho částí nebo DNA imunizací. Taková hostitelská zvířata mohou zahrnovat, ale bez omezení, králíky, myši a laboratorní potkany, aby byla jmenována alespoň některá. Pro zesílení imunologické reakce mohou být použita různá adjuvancia, v závislosti na druhu hostitele, zahrnující bez omezení včetně Freundovo adjuvans (kompletní a nekompletní), minerální gely, jako je například hydroxid hlinitý, povrchově účinné látky, jako je například lysolecitin, polyoly typu „pluronic“, polyanionty, peptidy, olejové emulze, hemokyanin přílipky, dinitrofenol a potenciálně použitelná humánní adjuvancia, jako je například BCG (bacil Calmette-Guerin) a Corynebacterium parvum.

Polyklonální protilátky jsou heterogenní populací protilátkových molekul pocházejících ze séra zvířat imunizovaných antigenem, jako je například produkt cílového genu nebo jeho antigenní funkční derivát. Pro produkci polyklonálních protilátek mohou být hostitelská zvířata, jako jsou například ta popsaná výše, imunizována injekcí diferenčně exprimovaného genového produktu doplněného adjuvancii, jak také bylo popsáno výše.

Monoklonální protilátky, které jsou homogenní populací protilátek ke konkrétnímu antigenu, mohou být získány kteroukoliv technikou, která zajistí produkci protilátkových molekul kontinuální buněčnou linií v kultuře. Ty zahrnují, ale bez omezení, techniku hybridomu podle autorů Kohler a Milstein, (1975, Nature 256:495—497, a patent Spojených Států č. 4 376 110), techniku hybridomu humánních B lymfocytů (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72, Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) a techniku EBV hybridomu (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., s. 77-96). Takové protilátky mohou být kterékoliv třídy imunoglobulinů včetně IgG, IgM, IgE, IgA, IgD a kterékoliv její podtřídy. Hybridom produkující mAb podle tohoto vynálezu může být kultivován in vitro nebo in vivo. Produkce vysokých titrů mAb in vivo činí z této metody v současnosti výhodný způsob produkce.

Kromě toho mohou být použity techniky vyvinuté pro produkci „chimérických protilátek“ (Morrison et al., 1984, Proč. Nati. Acad. Sci., 81:6851-6855, Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608, Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454) sestřihem genů z myší protilátkové molekuly vhodné antigenní specifity společně s geny z humánní protilátkové molekuly vhodné biologické aktivity. Chimérická protilátka je molekula, ve které odlišné části pocházejí z různých živočišných druhů, jako jsou například protilátky, které mají variabilní nebo hypervariabilní úsek pocházející z myší mAb a konstantní úsek z humánního imunoglobulinu.

Alternativně, techniky popsané pro produkci jednořetězcových protilátek (patent Spojených Států 4 946 778, Bird, 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, a Ward et aL, 1989, Nature 334:544-546) mohou být přizpůsobeny pro přípravu jednořetězcových protilátek k diferenčně exprimovaným genům. Jednořetězcové protilátky jsou vytvářeny spojením fragmentů těžkého a lehkého řetězce Fv úseku prostřednictvím aminokyselinového můstku, což HAS za následek jednořetězcový polypeptid.

Nejvýhodněji mohou být techniky použitelné pro produkci „humanizovaných protilátek“ přizpůsobeny tak, aby produkovaly protilátky k polypeptidům, fragmentům, derivátům a funkčním ekvivalentům popsaným v tomto textu. Takové techniky jsou popsány v patentech Spojených

- 15CZ 305800 B6

Států 5 932 448, 5 693 762, 5 693 761, 5 585 089, 5 530 101, 5 910 771, 5 569 825, 5 625 126, 5 633 425, 5 789 650, 5 545 580, 5 661 016 a 5 770 429, popis každého z nich je zahrnut v tomto textu formou odkazu ve své celistvosti.

Protilátkové fragmenty, které rozpoznávají specifické epitopy, mohou být tvořeny známými technikami. Takové fragmenty například zahrnují, ale bez omezení; F(ab')₂ fragmenty, které mohou být tvořeny štěpením pepsinem protilátkové molekula a Fab fragmenty, které mohou být tvořeny redukcí disulfidových můstků F(ab')₂ fragmentů. Alternativně, mohou být konstruovány Fab expresní knihovny (Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281), aby se umožnila rychlá a snadná identifikace monoklonálních Fab fragmentů s požadovanou specifitou.

Pro snadnost detekce je obzvláště výhodný test typu sendviče, jehož existuje velké množství variací, předpokládá se, že každá z nich je zahrnována předkládaným vynálezem.

Například v typickém přímém testuje neznačená protilátka imobilizována na pevném substrátu a testovaný vzorek je přiveden do kontaktu s navázanou molekulou. Po vhodné době inkubace, po časové období dostatečné pro to, aby se umožnila tvorba binárního komplexu protilátka-antigen, v tomto bodě je pak přidána druhá protilátka, značená reportérovou molekulou schopnou indukovat detekovatelný signál, a je inkubována po dobu dostatečnou pro umožnění tvorby trojitého komplexu protilátka-antigen-značená protilátka. Všechna nezreagovaná látka je vymyta a přítomnost antigenu je určena pozorováním signálu nebo může být kvantifikována srovnáním s kontrolním vzorkem obsahujícím známá množství antigenu. Variace přímého testu zahrnují simultánní test, kdy jsou jak vzorek, tak protilátka přidány současně k vazebné protilátce nebo reverzní test, ve kterém je značená protilátka a testovaný vzorek nejprve spojeny, inkubovány a přidány k neznačené povrchově vázané protilátce. Tyto techniky jsou odborníkům dobře známy a možnost menších variací je snadno patrná. Je zamýšleno, že termín „sendvičový test“, jak se v tomto textu používá, zahrnuje všechny variace základní „dvoumístné“ techniky. Co se týče imunotestů podle předkládaného vynálezu, jediný limitující faktor je, že neznačené a značené protilátky jsou RdCVFl- nebo RdCVF2-specifická protilátka.

Nejběžněji používané reportérové molekuly v tomto typu testu jsou buď enzymy nebo molekuly obsahující fluorofor či radionuklid. V případě enzymového imunotestu je enzym konjugován ke druhé protilátce, obvykle pomocí glutaraldehydu nebojodistanu. Nicméně, jak lze snadno připustit, existuje celá řada různých technik ligace, které jsou odborníkovi známy. Běžně používané enzymy zahrnuj í křenovou peroxidázu, glukózooxidázu, β-galaktosidázu a alkalickou fosfatázu, mimo jiné. Substráty, které se používají se specifickými enzymy, jsou všeobecně vybírány podle tvorby detekovatelných změn barev při hydrolýze odpovídajícím enzymem. Například p-nitrofenylfosfát je vhodné použít pro konjugáty s alkalickou fosfatázou, pro konjugáty s peroxidázou je obecně používán 1,2-fenylendiamin nebo toluidin. Je také možné používat fluorgenní substráty, které poskytují fluorescenční produkt, spíše než chromogenní substráty uvedené výše. Roztok obsahující vhodný substrát je pak přidán k trojitému komplexu protilátka-RdCVFl- nebo RdCVF2-značená protilátka. Substrát reaguje s enzymem spojeným s druhou protilátkou za vzniku kvalitativního vizuálního signálu, který může být dále kvantifikován, obvykle spektrofotometricky, za poskytnutí vyhodnocení množství Rdcvfl nebo Rdcvf2, které je přítomné ve vzorku séra.

Alternativně mohou být fluorescenční sloučeniny, jako je například fluorescein a rodamin, chemicky kondenzovány k protilátkám bez změny jejich vazebné kapacity. Když jsou aktivovány ozářením světlem konkrétní vlnové délky, fluorchromem značená protilátka pohlcuje světelnou energii, indukuje stav excitability v molekule, následovaný emisí světla v charakteristické další vlnové délce. Emise se jeví jako charakteristická barva vizuálně detekovatelná světelným mikroskopem. Imunofluorescenční techniky a E1A techniky jsou obě dobře zavedené v oboru a jsou obzvláště výhodné pro předkládaný způsob. Nicméně mohou také být použity další reportérové molekuly, jako jsou například radioizotopy, chemiluminiscenční nebo bioluminiscenční molekuly. Odborníkovi je ihned zjevné, jak lze měnit postup tak, aby byl vhodný pro požadované použití.

-16CL 305800 B6

Tento vynález se také týká použití polynukleotidů podle předkládaného vynálezu jako diagnostických reagencií. Detekce mutované formy genu kódující polypeptid vybraný ze skupiny, kterou tvoří polypeptidy uvedené v SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 14, která je spojována s dysfunkcí, bude 5 poskytovat diagnostický nástroj, který se může přidat k diagnostice onemocnění nebo může definovat nemoc nebo vnímavost na onemocnění, které je důsledkem nízké exprese, nadměrné exprese nebo změněné prostorové nebo časové exprese genu. Jednotlivci nesoucí mutace v genu mohou být detekováni na úrovni DNA celou řadou technik.

Nukleové kyseliny pro diagnostiku mohou být získány z buněk pacienta, jako například z krve, moči, slin, tkáňové biopsie nebo pitevního materiálu. Genomová DNA může být použita přímo pro detekci nebo může být amplifikována enzymaticky s použitím PCR nebo jiné amplifikační techniky před analýzou. Podobným způsobem mohou také být použity RNA nebo cDNA. Delece a inzerce mohou být detekovány změnou velikosti amplifikovaného produktu ve srovnání 15 s normálním genotypem. Bodové mutace mohou být identifikovány hybridizací amplifikované DNA ke značeným nukleotidovým sekvencím. Dokonale komplementární srovnané sekvence mohou být odlišeny od nesouhlasných duplexů štěpením RNázou nebo rozdíly v teplotách tání. Rozdíly DNA sekvence mohou také být detekována změnami elektroforetické pohyblivosti DNA fragmentů na gelech, buď s denaturačními činidly nebo bez nich (SSCP) nebo přímým sekvenco20 váním DNA (např. Myers et al., Science, 1985, 230:1242). Změny sekvence ve specifické lokalizaci mohou také být odhaleny nukleázovými protekčními testy, jako je například protekce před RNázou a Sl, nebo metodou chemického štěpení (viz Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 85: 4397-4401). V dalším provedení může být konstruována matice oligonukleotidových sond obsahující Rdcvfl nebo Rdcvf2 nukleotidovou sekvenci nebo její fragmenty pro provádění účinného screeningu např. genetických mutací. Technologické metody používající matice jsou známy a mají obecnou použitelnost a mohou být použity pro řešení celé řady otázek molekulární genetiky, včetně genové exprese, genetické vazby a genetické variability (viz například: M. Chee et al., Science, díl 274, s. 610-613, 1996).

Diagnostické testy nabízejí postup diagnostiky nebo určování vnímavosti na onemocnění prostřednictvím detekce mutace Rdcvfl nebo Rdcvf2 genu popsanými metodami. Kromě toho tyto nemoci mohou být diagnostikovány metodami zahrnujícími zjišťování abnormální exprese Rdcvfl nebo Rdcvf2 ve vzorku pocházejícím od pacienta: exprese může být měřena na úrovni RNA s požitím kterékoliv metody dobře známé v oboru kvantifikace polynukleotidů, jako je například 35 amplifikace nukleové kyseliny, například PCR, RT-PCR, protekce RNázou, Northern blotování a další hybridizační metody. Techniky testování, které mohou být použity pro určování hladin proteinu, jako je například polypeptid podle předkládaného vynálezu, ve vzorku pocházejícího od hostitele, jsou odborníkům v oboru známy. Takové testovací metody zahrnují radioimunotesty, kompetitivní vazebné testy, analýzu Western blotováním a testy ELISA.

V dalším aspektu se tedy předkládaný vynález týká diagnostické soupravy, která obsahuje:

(a) polynukleotid podle předkládaného vynálezu, výhodně nukleotidová sekvence kódující polypeptid vybraný ze skupiny, kterou tvoří polypeptidy uvedené v SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 14, nebo 45 jeho fragment, (b) nukleotidová sekvence komplementární k sekvenci uvedené v bodě (a), (c) polypeptid podle předkládaného vynálezu, výhodně polypeptid nebo jeho fragment nebo (d) protilátka k polypeptidu podle předkládaného vynálezu, výhodně k polypeptidu vybranému ze skupiny, kterou tvoří polypeptidy uvedené v SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6, 50 SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 14.

Je nutné uznat, že kterákoliv taková souprava, (a), (b), (c) nebo (d) může zahrnovat podstatnou složku. Taková souprava bude použita při diagnostice onemocnění nebo vnímavosti na onemocnění, obzvláště retinitis pigmentosa, makulámí degenerace se vztahem k věku, Bardetův-Biedlův

- 17CZ 305800 B6 syndrom, Bassenův-Komzweigův syndrom, Bestova nemoc, choroidom, spirálovitá atrofie, kongenitální amauróza, Refsumův syndrom, Stargardtova nemoc a Usherův syndrom. Nukleotidová sekvence podle předkládaného vynálezu je také cenná pro lokalizaci chromozómu. Chromozómové lokalizace může být dosaženo pomocí PCR na DNA připravené z panelu hybridních buněčných linií (myš-křeček). Chromozómová lokalizace humánního genu může být předpovězena z lokalizace myšího genu na základě syntenie (MacCarthy et al., 1997, Genome Research, 7, 1153). Sekvence je specificky cílena do konkrétní lokalizace a může hybridizovat s konkrétní lokalizací na individuálním chromozómu, včetně myšího nebo humánního chromozómu. Zmapování relevantních sekvencí k chromozómům podle předkládaného vynálezu je důležitý první krok pro korelaci těchto sekvencí s nemocemi sdružovanými s geny. Jakmile byla jednou sekvence vyznačena do přesné chromozómové lokalizace, fyzická poloha sekvence na chromozómu může být korelována s daty genetických map. Taková data lze nalézt například v práci V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (dostupná on-line prostřednictvím Johns Hopkins University Welch Medical Library, RetNet). Vztah mezi geny a nemocemi, které byly mapovány do stejné chromozómové oblasti je pak identifikován prostřednictvím vazebné analýzy (společná dědičnost fyzicky přilehlých genů).

Mohou také být určeny rozdíly v cDNA nebo genomových sekvencích mezi postiženými a nepostiženými jedinci. Jestliže mutace je pozorována u některých nebo u všech postižených jedinců, ale ne u kterýchkoliv normálních jedinců, pak je mutace pravděpodobně kauzativní agens onemocnění.

Další provedení vynálezu se týká podávání farmaceutického přípravku, ve spojitosti s farmaceuticky přijatelným nosičem, pro kterýkoliv terapeutický účinek pojednaný výše. Takové farmaceutické přípravky se mohou skládat z Rdcvfl nebo Rdcvf2, mimetik nebo agonistů. Přípravky mohou být podávány samotné nebo v kombinaci s alespoň jedním dalším činidlem, jako je například stabilizátor, který může být podáván ve kterémkoliv sterilním biologicky kompatibilním farmaceutickém nosiči, včetně, ale bez omezení, fyziologického roztoku, pufrovaného fyziologického roztoku, dextrózy a vody. Přípravky mohou být podávány pacientovi samotné nebo v kombinaci s dalšími činidly, léky nebo hormony.

Farmaceutické přípravky zahrnované vynálezem mohou být podávány kteroukoliv cestou: např. aplikací biologicky reaktivního proteinu přes skléru k cévnatce a sítnici (Ambati et al., 2000, Investigative Ophthalmology and Visual Science, 41, 1186). Formulace topických oftalmických preparátů, včetně očních roztoků, suspenzí a mastí, jsou odborníkům známy (viz Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, kapitola 86, stránky 1581-1592, Mack Publishing Company, 1990). K dispozici jsou další způsoby podávání, včetně injekcí do komor (které mohou být prováděny přímo do přední komory nebo přímo do komory sklivce), subkonjunktivální injekce a retrobulbámí injekce a jsou také dobře známy metody a prostředky pro výrobu očních preparátů vhodných pro takové způsoby podávání.

Jak se používá v této přihlášce, termín „extraokulámí“ se týká očního povrchu a (vnějšího) prostoru mezi oční bulvou a víčkem. Příklady extraokulámí úseků zahrnují spojivkovou klenbu nebo spojivkový vak, povrch spojivek a povrch rohovky. Tato lokalizace je externí pro všechny oční tkáně a pro přístup do této oblasti není vyžadován invazívní postup. Příklady extraokulámích systémů zahrnují inzerty a „topicky“ aplikované kapky, gely nebo masti, které mohou být použity pro aplikaci terapeutické látky do těchto úseků. Extraokulámí zařízení jsou všeobecně snadno odstranitelná, dokonce i pacientem.

Následující patenty popisují extraokulámí systémy, které jsou používány pro aplikaci léků do extraokulámích úseků. Higuchi et al. popisuje v patentech Spojených Států 3 981 303, 3 986 510 a 3 995 635, biologicky rozložitelný oční inzert, který obsahuje lék. Inzert může být vytvořen v různých tvarech pro udržení ve spojivkovém vaku oční bulvy, extraokulámím prostorem mezi oční bulvou a víčkem. Některé běžné biologicky kompatibilní polymery byly popsány jako vhodné pro použití při konstrukci tohoto zařízení. Tyto polymery zahrnují alginát zinečnatý, po

-18CZ 305800 B6 ly(mléčnou kyselinu), poly(vinylalkohol), poly(anhydridy) a poly(glykolovou kyselinu). Patenty také popisují membránou potažená zařízení se sníženou permeací pro lék a duté komůrky zadržující formulaci léčiva.

Patent Spojených Států 4 217 898, popisuje mikroporézní zásobníky, které jsou používány pro řízenou aplikaci léčiv. Tato zařízení jsou umístěna extraokulámě ve spojivkovém vaku. Požadované polymerové systémy zahrnují kopolymery poly(vinylchlorid)-ko-poly(vinylacetát). Kaufman popisuje v patentech Spojených Států 4 865 846 a 4 882 150 aplikační systém pro oční léčiva, který zahrnuje alespoň jednu biologicky rozrušitelnou látku nebo nosič mastí pro spojivkový vak. Patent popisuje polymerové systémy, jako je například poly(laktid), poly(glykolid), poly(vinylalkohol) a zesítěný kolagen, jako vhodné aplikační systémy.

V současnosti popsané použití RDCVF1 nebo RDCVF2 proteinového produktu pro léčbu onemocnění nebo poranění sítnice je také výhodné, protože topicky aplikovaná oční formulace zahrnuje agens pro podporu penetrace nebo transportu terapeutického agens do oka. Taková agens jsou v oboru známa. Například autoři Ke et al., patent Spojených Států 5 221 696, popisují použití látek pro zvýšení penetrace očních preparátů přes rohovku.

Intraokulární systémy jsou ty systémy, které jsou vhodné pro použití v kterémkoliv tkáňovém kompartmentu v tkáňových vrstvách oka samotného, mezi nimi nebo kolem nich. Tyto lokalizace zahrnují subkonjunktivální (pod oční sliznicí přilehlé k oční bulvě), orbitální (za oční bulvou) a intrakomorovou (v komorách samotné oční bulvy). Na rozdíl od extraokulámích systémů je pro přístup do těchto úseků vyžadován invazívní postup skládající se z injekce nebo implantace.

Následující patenty popisují intraokulární zařízení. Wong, patent Spojených Států 4 853 224, popisuje mikroopouzdřená léčiva pro zavedení do komory oka. Polymery, které jsou použity v tomto systému, zahrnují polyestery a polyethery. Lee, patent Spojených Států 4 863 457, popisuje biologicky rozložitelné zařízení, které je chirurgicky implantováno intraokulámě pro prodloužené uvolňování terapeutického agens. Zařízení je určeno pro chirurgickou implantaci pod konjuktivu (sliznice oční bulvy). Krezancaki, patent Spojených Států 4 188 373, popisuje farmaceutické vehikulum, které vytváří gel při tělesné teplotě člověka. Toto vehikulum je vodná suspenze léčiva a gum nebo syntetických derivátů na základě celulózy. Haslam et al. Popisuje v patentu Spojených Států 4 474 751 a 4 474 752 systém polymer-léčivo, který je kapalný při teplotě místnosti a vytváří gel při tělesné teplotě. Vhodný polymery použité v tomto systému zahrnují polyoxyethylen a polyoxypropylen. Davis et al. Popisují v patentu Spojených Států 5 384 333 biologicky rozložitelný injikovatelný lékový aplikační polymer, který zajišťuje dlouhodobé uvolňování léčiva. Kompozice léku je tvořena farmaceuticky účinnou látkou v biologicky rozložitelné polymerové matrici, kde polymerová matrice je pevná při teplotách v rozsahu 20 °C až 37 °C a je tekutá při teplotách v rozsahu 38 °C až 52 °C. Lékový aplikační polymer není omezený na aplikaci rozpustných nebo kapalných formulací léčiva. Například polymer může být použit jako matrice pro stabilizaci a zadržení mikrosfér obsahujících léčivo v místě injekce, lipozomů nebo dalších léčiv navázaných na částice.

Obzvláště vhodné vehikulum pro intraokulární injekci je sterilní destilovaná voda, ve kterém RDCVF1 nebo RDCVF2 proteinový produkt je formulován jako sterilní, izotonický roztok, vhodně konzervovaný. Ještě další oční přípravek může zahrnovat formulaci RDCVF1 nebo RDCVF2 proteinového produktu s agens, jako jsou například injikovatelné mikrosféry nebo lipozomy, které zajišťují pomalé nebo prodloužené uvolňování proteinu, který pak může být aplikován jako depotní injekce. Další vhodné prostředky pro intraokulární zavedení RDCVF1 nebo RDCVF2 proteinového produktu zahrnují implantovatelná léková aplikační zařízení nebo zařízení, která obsahují RDCVF1 nebo RDCVF2 proteinový produkt.

Oční preparáty podle předkládaného vynálezu, obzvláště topické preparáty, mohu zahrnovat další složky, například oftalmicky přijatelná konzervační činidla, tonizační činidla, společná rozpouštědla, smáčedla, komplexační činidla, pufrovací činidla, antimikrobiální činidla, antioxidanty a

-19CZ 305800 B6 surfaktanty, jak jsou v oboru známy. Například vhodná zesilující tonizační činidla zahrnují halogenidy alkalických kovů (výhodně chlorid sodný nebo draselný), mannitol, sorbitol apod. Činidlo zesilující dostatečně tonicitu je výhodně přidáváno tak, že formulace, která má být instilována do oka je hypotonická nebo v podstatě izotonická. Vhodná konzervační činidla zahrnují, ale bez omezení, benzalkoniumchlorid, thimerosal, fenethylalkohol, methylparaben, propylparaben, chlorhexidin, kyselinu sorbovou apod. Jako konzervační činidlo může také být použit peroxid vodíku. Vhodná společná rozpouštědla zahrnují, ale bez omezení, glycerin, propylenglykol a polyethylenglykol. Vhodná komplexační činidla zahrnují kofein, polyvinylpyrrolidon, β-cyklodextrin nebo hydroxypropyl-p-cyklodextrin. Vhodné surfaktanty nebo smáčedla zahrnují, ale bez omezení, estery sorbítanu, polysorbáty, jako je například polysorbát 80, tromethamín, lecitin, cholesterol, tyloxapol apod. Pufry mohou být běžné pufry, jako je například borát, citrát, fosfát, hydrouhličitan nebo Tris-HCl.

Složky formulací jsou přítomny v koncentracích, které jsou přijatelné pro extraokulámí nebo intraokulámí místo podávání. Například pufry jsou použity pro udržování přípravku ve fyziologickém pH nebo v mírně nižším pH, typicky v rozsahu pH přibližně od 5 do přibližně 8. Další složky formulací mohou zahrnovat látky, které zajišťují prodloužený pobyt v oku extraokulámě podávaného terapeutického agens, aby se maximalizoval topický kontakt a podporovala absorpce. Vhodné látky zahrnují polymery nebo látky vytvářející gel, které zajišťují zvýšenou viskozitu očního přípravku. Chitosan je obzvláště vhodná látka jako činidlo řídící rychlost uvolňování v oku v tekutých formulacích oftalmických léčiv s prodlouženým uvolňováním (viz patent Spojených Států č. 5 442 116, Yen, etl. AI.) Vhodnost formulací podle předkládaného vynálezu pro řízené uvolňování (např. prodloužené a déle trvající aplikace) očního léčivého agens do oka může být určována různými postupy v oboru známými, např. jak bylo popsáno v Journal of Controlled Release, 6:367-373, 1987, a také jejich variacemi.

Kromě toho účinných složek tyto farmaceutické přípravky mohou obsahovat vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnující účinných sloučenin do přípravků, které mohou být použity farmaceuticky. Další detaily o technikách formulace a podávání mohou být zjištěny v posledním vydání Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.).

Farmaceutické přípravky pro perorální podávání mohou být formulovány s použitím farmaceuticky přijatelných nosičů v oboru dobře známých v dávkách vhodných pro perorální podávání. Takové nosiče umožní to, že farmaceutické přípravky jsou formulovány jako tablety, pilulky, dražé, tobolky, kapaliny, gely, sirupy, kaše, suspenze, apod. pro užívání pacientem.

Farmaceutické přípravky pro perorální použití mohou být získány kombinací účinných sloučenin s pevným excipientem, volitelně mletím výsledné směsi a zpracováním směsi granulí po přidání vhodných pomocných látek, je-li žádoucí, za zisku jader tablet nebo dražé. Vhodné excipienty jsou sacharidová nebo proteinová plnidla, jako jsou například cukry, včetně laktózy, sacharózy, mannitolu nebo sorbitolu, škrob z kukuřice, pšenice, rýže, brambor nebo dalších rostlin, celulóza, jako je například methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza nebo sodná sůl karboxymethylcelulózy, gumy včetně arabské gumy a tragantu, a proteiny, jako je například želatina a kolagen. Je-li žádoucí, mohou být přidána rozvolňovadla nebo solubilizační činidla, jako je například zesítěný polyvinylpyrrolidon, agar, alginová kyselina nebo její sůl, jako je například alginát sodný.

Jádra dražé mohou být použita ve spojení s vhodnými obaly, jako jsou například koncentrované sacharidové roztoky, které mohou také obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidon, karbopolový gel, polyethylenglykol, a/nebo oxid titaničitý, roztoky laků a vhodná organická rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel. K obalům tablet nebo dražé mohou být přidány pigmenty nebo barviva pro identifikaci produktu nebo charakterizaci množství účinné sloučeniny, tj. dávky.

Farmaceutické přípravky, které mohou být použity perorálně, zahrnují „push-fit“ tobolky vytvořené ze želatiny, a také měkké uzavřené tobolky vytvořené ze želatiny a povlaku, jako je například glycerol nebo sorbitol. Push-fit tobolky mohou obsahovat účinné složky smíchané s plnid

-20CZ 305800 B6 lem nebo pojivý, jako je například laktóza nebo škroby, lubrikanty, jako je například talek nebo stearát hořečnatý, a volitelně, se stabilizátory. V měkkých tobolkách mohou být účinné sloučeniny rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných kapalinách, jako jsou například kapalné mastné oleje, nebo kapalný polyethylenglykol se stabilizátory nebo bez nich.

Farmaceutické formulace vhodné pro parenterální podávání mohou být formulovány ve vodných roztocích, výhodně ve fyziologicky kompatibilních pufrech, jako je například Hanksův roztok, Ringerův roztok nebo pufrovaný fyziologický roztok. Vodná injekční suspenze mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, jako je například sodná sůl karboxymethylcelulózy, sorbitol nebo dextran. Dále mohou být suspenze účinných sloučenin připraveny jako vhodné olejnaté injekční suspenze. Vhodná lipofilní rozpouštědla nebo vehikula zahrnují mastné oleje, jako je například sezamový olej nebo syntetické estery mastných kyselin, jako je například ethyloleát nebo triglyceridy nebo lipozomy. Pro aplikaci mohou také být použity nelipidové polykat iontové aminopolymery. Volitelně, suspenze může také obsahovat vhodné stabilizátory nebo činidla, která zvyšují rozpustnost sloučenin, aby se umožnila příprava vysoce koncentrovaných roztoků.

Pro topické nebo nasální podávání jsou ve formulaci použita penetrující činidla vhodná ktomu, aby byla přestoupena konkrétní překážka. Taková penetrující činidla jsou v oboru všeobecně známa.

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být vyráběny způsobem, který je v oboru znám, např. pomocí obvyklých postupů míchání, rozpouštění, granulování, tvorby dražé, leštěním, emulgace, opouzdřování, zachytávání nebo lyofilizace.

Farmaceutický přípravek může být poskytován jako sůl a může být formulován s mnoha kyselinami, jako je například bez omezení včetně, kyselina chlorovodíková, sírová, octová, mléčná, vinná, jablečná, jantarová, apod. Soli inklinují ktomu, že jsou rozpustnější ve vodných nebo jiných protonových rozpouštědlech než jsou odpovídající formy volných bází. V dalších případech výhodný přípravek může být lyofilizovaný prášek, který může obsahovat kteroukoliv nebo všechny následující látky: 1 až 50mM histidin, 0,1% - 2% sacharóza a 2 až 7% mannitol, v pH roztahu od 4,5 do 5,5, který je smíchán s pufrem před použitím.

Poté, co byly farmaceutické přípravky připraveny, mohou být umístěny ve vhodné nádobce a označeny pro léčení indikovaného chorobného stavu. Co se týče podávání Rdcvfl nebo Rdcvf2, takové označení by zahrnovalo množství, frekvenci a způsob podávání.

Farmaceutické přípravky vhodné pro použití v tomto vynálezu zahrnují přípravky, kde účinné složky jsou obsaženy v množství účinném pro dosažení zamýšleného cíle. Stanovení účinné dávky je ve schopnosti daného odborníka.

Pro kteroukoliv sloučeninu terapeuticky účinná dávka může být stanovena zpočátku buď v testech na tkáňových kulturách, např. neoplastických buněk, nebo na zvířecích modelech, obvykle myších, králících, psech nebo prasatech. Zvířecí model může také být použit pro určování rozsahu vhodných koncentrací a způsobu podávání. Taková informace může pak být použita pro určení dávek a způsobů podávání použitelných u lidí.

Terapeuticky účinný dávka se týká takového množství účinné složky, například Rdcvfl nebo Rdcvf2 nebo jejich fragmentů, protilátek k Rdcvfl, agonistů, které zlepší symptomy nebo chorobný stav. Terapeutická účinnost a toxicita mohou být určeny standardními farmaceutickými postupy na buněčných kulturách nebo experimentálních zvířatech, např. ED50 (dávka terapeuticky účinná u 50 % populace) a LD50 (dávka smrtelný pro 50 % populace). Poměr dávek mezi toxickými a terapeutickými účinky je terapeutický index a může být vyjádřen jako poměr LD50/ED50. Farmaceutické přípravky, které projevují vysoké terapeutické indexy, jsou preferovány. Data získaná z testů na tkáňových kulturách a ze studií se zvířaty jsou použita při formulaci rozsahu dávek pro humánní použití. Dávka obsažená v takových přípravcích je výhodně v rozsa

-21 CZ 305800 B6 hu cirkulujících koncentrací, které mají ED50 s malou nebo žádnou toxicitou. Dávka se mění v tomto rozsahu v závislosti na použité lékové formě, senzitivitě pacienta a způsobu podávání.

Přesná dávka bude určena praktickým lékařem ve světle faktorů vztahujících se k pacientovi, který vyžaduje léčbu. Dávka a podávání jsou upraveny tak, aby poskytly dostatečné hladiny účinné skupiny nebo udržely žádaný efekt. Faktory, které mohou brány do úvahy, zahrnují závažnost stavu nemoci, všeobecné zdraví pacienta, věk, hmotnost a pohlaví pacienta, stav výživy, čas a frekvenci podávání, lékovou kombinaci (kombinace), citlivost reakce a toleranci/reakci na terapii. Dlouhodobě působící farmaceutické přípravky mohou být podávány každé 3 až 4 dny, každý týden nebo jednou každé dva týdny v závislosti na poločase a rychlosti clearance konkrétní formulace.

Normální dávkové množství se může měnit od 0,1 až do 100 000 mikrogramů, až do celkové dávky přibližně 1 g v závislosti na způsobu podávání. Směrnice, co se týče konkrétních dávek a způsobů aplikace je poskytnuto v literatuře a všeobecně dostupné odborníkům v oboru. Odborníci budou používat odlišné formulace pro nukleotidy než pro proteiny nebo jejich inhibitory. Podobně, aplikace polynukleotidů nebo polypeptidů bude specifická pro konkrétní buňky, chorobné stavy, lokalizace, apod. Farmaceutické formulace vhodné pro perorální podávání proteinů jsou popsány např. v patentech Spojených Států 5 008 114, 5 505 962, 5 641 515, 5 681 811, 5 700 486, 5 766 633, 5 792 451, 5 853 748, 5 972 387, 5 976 569 a 6 051 561.

Následující příklady ilustrují předkládaný vynález, aniž by jakýmkoliv způsobem omezovaly jeho rozsah.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Expresní klonování

Izolace celkové RNA z normální sítnice myší starých pět týdnů

Knihovna cDNA byla konstruována ze sítnic myší C57BL/6@N starých pět týdnů obecně podle způsobu autorů Glissin et al., 1974, Biochemistry, 13, 2633-2637. Stručně, po utracení byla zvířata enukleována a oči byly nejdříve umístěny ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS) doplněném 0,1% diethylpyrokarbonátem (DEPC). Nervová část sítnice byla rychle disekována (retinální pigmentový epitel byl vynecháván v tomto tkáňovém preparátu). Rychle po každé disekci byly tkáně homogenizovány v čerstvém 6M guanidiniumchloridu. Deset sítnic bylo sloučeno do 2,4 ml GC do sterilních zkumavek o objemu 4 ml a tkáň byla porušena kompletně silnou homogenizací po dobu 1 minuty při teplotě místnosti.

Izolace messenger RNA (mRNA) z normální sítnice myší starých pět týdnů.

MRNA byla izolována na oligo-dT potažených porézních perličkách (Oligotex, Qiagen) ve stringentních podmínkách podle metody autorů Kuribayashi et al., 1988, Nucleic Acids Res. Symposium series, 19, 61-64. Stručně, 100-150 pg celkové RNA myší sítnice bylo mícháno s 15 μΐ oligo-dT perliček ve vazebném pufru [lOmM Tris pH 7,5, 0,3M NaCl, 0,lM EDTA, 0,5% hmotnost/objem dodecylsulfát sodný (SDS)] a inkubováno 6 minut v 65 °C v kádince o objemu 0,5 1 s vodou, pak postupně ochlazeno na teplotu místnosti po dobu asi 3 až 4 hodin, a pak stočeno při teplotě místnosti, a by se znovu získaly agarózové perličky. Byly pak dvakrát promyty inkubací po dobu 10 minut v 0,4 ml pufru (0,lM Tris pH 7,5, 0,lM NaCl, ImM EDTA, 0,5% hmotnost/objem SDS). Navázaná RNA (mRNA) byla eluována ve dvou krocích 50 μΙ vody o teplotě 70 °C bez RNázy, precipitována 10 μΐ acetátu sodného, pH 5,2, a 0,25 ml ethanolu a inkubována

-22CZ 305800 B6 hodin v -70 °C. mRNA byla sbírána centrifugací (1 hodina v 15 000 rpm, následováno dvěma promytími 70% ethanolem) a resuspendována ve 20 μΐ vody bez RNázy. mRNA koncentrace byla měřena ve 260 nm a nepřítomnost kontaminace rRNA byla kontrolována gelovou elektroforézou v denaturačních podmínkách, jak uvedeno výše.

Syntéza cDNA

Byla prováděna podle metody autorů Okayama a Berg, 1982, Mol Cell Biol., 2, 161-170. Syntéza prvního vlákna byla započata primerem, 2,5 pg Notl adaptérového oligonukleotidu (5'TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGACAA(T)_I8 3') a inkubována po dobu 2 hodin s 50 jednotkami modifikované reverzní transkriptázy viru Moloneyho myší leukémie (M-MLV) (Superscript II, Life Technology) v podmínkách doporučených dodavatelem. Co se týče syntézy druhého vlákna, reakce byla inkubována 4 hodiny ve 14 °C se 4 jednotkami RNázyH a 100 jednotkami DNA polymerázy I v SS pufru [40mM Tris pH 7,2, 85mM chlorid draselný, 4,4mM chlorid hořečnatý, 3mM DTT, 5 pg/ml bovinní sérový albumin (BSA)] v konečném objemu 0,25 ml. Adaptéry EcoRI (5'-OH AATTCGGCACGAGG 3'-OH/3'-OH GCCGTGCTCC5'-PO₄) byly ligovány na oba konce dvoj vláknové cDNA během 14 hodin v 16 °C s použitím 40 jednotek T4 DNA ligázy (Promega, Madison, USA) v celkovém objemu 20 μΐ v podmínkách doporučených dodavatelem. Produkty této reakce jsou dscDNA, které mají poloviční místo EcoRI v 5' a Notl poloviční místo ve 3', která mohou být orientována v klonovacím vektoru.

Ligace dscDNA do pcDNA3

Byla prováděna podle práce Maniatis T., 1992, Molecular cloning: a laboratory manual, 2. vyd., s použitím 10 pg plazmidu pcDNA3 (Invitrogen) připraveného štěpením s EcoRI a Notl (Promega, Madison, USA) v podmínkách doporučených dodavatelem.

Množení rekombinantních klonů

Bylo prováděno obecně podle způsobu autorů Bimboim et al., 1979, Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523. Stručně, aby vytvořili pool 100 primárních klonů, původci mírně modifikovalo XL1 Gold (Stratagene) transformační protokol (poskytovaný firmou Stratagene) takto. Po inkubaci v růstovém médiu byla transformační reakce vložena do 20% (objem/objem) glycerolu a 8% (objem/objem) koňského sérového albuminu (HAS, Life Technologies). HAS a glycerol zabránily odumření po zmražení a rozmražení. Titrace byla prováděna vynesením na agarové misky (100 pg/ml ampicilin) zvyšováním objemu každé transformační reakce, aby se vypočetl objem poskytující 100 kolonií, zatímco zásoba transformační reakce byla uložena v -80 °C. Rekombinantní plazmidy z knihovny byly purifikovány po 96 najednou. Aby bylo připraveno 96 poolů ze 100 klonů, vypočtený objem odpovídající 100 klonům byl nanesen na agar a pěstován 20 hodin ve 37 °C. DNA byla purifikována přímo z kolonií snesených z agarových misek. Zásobní roztok každé kultury ve 23% glycerolu byl uložen v -80 °C. DNA byla purifikována s použitím Qiawell ultra (Qiagen) s použitím protokolu doporučeného dodavatelem. Typicky, 10 pg purifikovaného plazmidu bylo získáno, koncentrace každého preparátu byla měřena s použitím optické denzity ve 260 nm. Pro další rozdělení vybraných poolů po 100 do poolů po 10, 50 μΙ ředění 1/250 000 glycerolového zásobního roztoku z původního poolu bylo naneseno na agarovou misku s koncentrací ampicilinu 100 pg/ml. Po růstu po dobu 16 hodin ve 37 °C, jednotlivých 160 kolonií bylo replikováno na 16 agarových miskách (10 na misku) a pěstováno po dobu 16 hodin ve 37 °C. 10 kolonií z každé misky bylo získáno a pěstováno v tekutém médiu [Luria Broth (LB), 100 pg/ml ampicilin] po dobu 3 hodin ve 37 °C. Zásobní roztok těchto kultur ve 30% glycerolu byl uložen v -80 °C. Plazmidová DNA byla připravena tak, jak je uvedeno výše. Pro další rozdělení podskupin poolů po 10 na individuální klony, 50 pl ředění 1/250 000 glycerolového zásobního roztoku z podskupin poolů po 10 bylo naneseno na agarovou misku s koncentrací ampicilinu 100 pg/ml. Po růstu po dobu 16 hodin ve 37 °C, 16 individuálních kolonií bylo vybráno a pěstováno po dobu 16 hodin ve 2 ml LB s koncentrací ampicilinu 100 pg/ml. Zásobní roztok těchto

-23CZ 305800 B6 kultur ve 30% glycerolu byl uložen v -80 °C. Plazmidová DNA byla připravena tak, jak je uvedeno výše.

Přechodná (tranzientní) transfekce v buňkách Cos-1

Byla prováděna s použitím metody autorů Chen a Okayama, 1987, High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA (mol Cell Biol., 7, 2745-2752).

Tkáňové kultury sítnice kuřecího embrya

Protokol byl přizpůsoben podle autorů Adler a Hatlee [1989, Science, 243m 391]. Sítnice kuřecího embrya (6 dnů in ovo) byla oddělena a nanesena na misky v jednovrstevné kultuře. V těchto kultivačních podmínkách s nepřítomností diferenciačních signálů, čípky představují 60 až 80 % buněk. Původci vytvořili polyklonální protilátky v králíkovi proti visinini (marker kuřecích čípků, Genbank přístupové č. M84729) a ověřili, že podíl čípků kultuře byl 60 až 80 %. Jednoduché prostředí modelu původců vynálezu (chemicky definované médium, nepřítomnost buněk buněčných kontaktů) kromě snadnosti a rychlosti metody činí z něj velmi vhodný systém pro studii trofických faktorů zapojených do přežívání čípků. Stručně, sítnice embryí pocházejících z kontrolních izolátů, byly pitvány po šesti dnech vývoje in ovo, buňky byly rozděleny a naneseny na misky v nízké denzitě (10⁵ buněk/cm²). Během deseti dnů byla sledována životaschopnost buněk (60 až 80 % čípků) s použitím testu LIVE/DEAD (Molecular probes, Eugene, USA), testu, který kvantifikuje živé a mrtvé buňky. Počet živých buněk poklesl na 8 % počátečního počtu buněk po sedmi dnech v kultuře v chemicky definovaném médiu. Když byl test prováděn v přítomnosti kondicionovaného média z COS 1 buněk transfekovaných pooly klonů z knihovny, živé buňky byly počítány po sedmi dnech in vitro.

Kuřecí progenitorové buňky (kmen 657 červené označení) byly udržovány v odděleném kompartmentu pro účel tohoto experimentu v líhni 25 km od laboratoře. Oplodněná vejce získaná přirozenou cestou byla sbírána týdně a udržována v 17 °C (odpovídající biologická nula) v laboratoři po vylíhnutí. Denně bylo inkubováno 5 vajec po dobu 24 hodin ve 20 °C, pak 136 hodin ve 37 °C s intermitentním obracením sklonu vajec ve zvlhčované komoře. V den kultivace byl povrch vejce omyt Mucocit-A, pak byl rozbit, a kuřecí embrya byla přenesena do PBS. Bylo ověřeno, že fáze vývoje každého embrya odpovídá stupni 29. Vizuálním srovnáním s prací autorů Hamburger a Halmiton, (1951, v Essential Development Biology, Stem and Holland vyd.). Dvě embrya byla vybrána a enukleována, oči byly přeneseny do CO2-nezávislého média (Life Technologies). Sítnice byly disekovány a přeneseny do Ringerova pufru a dvakrát promyty. Sítnice byly nařezány na malé kusy a ošetřovány 20 minut ve 37 °C roztok trypsinu (0,25 % hmotnost/objem). Reakce byla zastavena přidáním kultivačního média (Ml99, Life Technologies) doplněného 10% deaktivovaným FCS. Buněčná suspenze byla ošetřena několik minut ve 25 μΐ DNAázy I v koncentraci 1 mg/ml (Sigma). Buněčná suspenze pak byla dvakrát promyta chemickým definovaným kultivačním médiem [CDCM, stejné objemy médií DMEM a M199 (Life Technologies) a AB s doplňky (5pg/ml inzulín, 5pg/ml transferrin, 64nM progesteron, 0,lmM putrescin, 5ng/ml selene, 3mM taurin, 2,7μΜ cytidin 5'-difosfoethanolamin, 5,2 μΜ cytidin 5'difosfocholin, 0,2μg/ml hydrokortison, 30nM 3,3'-5-trijodo-L-thyronin, lmM pyruvát sodný), 0,3μΜ prostaglandin D₂, 0,1 mg/ml linolová kyselina], aby se odstranilo FCS. Koncentrace buněk obarvených trypanovou modří byla měřena pomocí Mallassezovy komůrky a upravena na dvě koncentrace (5,6 a 1,12 x 10⁵ buněk) odpovídající dvěma hustotám nanášení na misky (2 a 4 x 10⁵ buněk/cm²).

Kondicionovaná média z Cos-1 transfekovaných buněk jsou rozmražena na ledu a 50 μΐ přeneseno se na dvě 96-jamkové destičky pro tkáňové kultury ošetřené černí (Corning Costar), které byly potaženy roztokem 100 pg/ml Poly-L-lysinu (Sigma) podle schématu:

-24CZ 305800 B6

První kolo screeningu:

1	1	1	1	2	C	2	2	2	3	3	P
c	3	3	4	4	4	C	4	5	5	5	5
6	C	6	6	6	7	7	C	7	7	8	8
8	8	C	9	9	9	9	10	C	10	10	10
11	11	11	C	11	12	12	12	12	C	13	13
13	13	14	14	C	14	14	15	15	15	C	15
16	16	16	16	17	C	17	17	17	18	18	C
18	18	19	19	19	19	P	20	20	20	C	20

Kde čísla odkazují na počet poolů 100 klonů, C znamená kondicionovaná média z Cos-1 buněk transfekovaných prázdným vektorem (pcDNA3) a P pozitivní kontroly (kondicionovaná média transfekovaná pcDNA-myšíGDNF).

Druhé a třetí kolo screeningu:

χ.(y). 01	χ.(y). 01	χ.(y). 01	x.(y). 01	X.(y). 02	C	X.(y). 02	x.(y). 02	x.(y). 02	χ.(y). 03	x.(y). 03	P
C	χ.(y). 03	χ.(y). 03	χ.(y). 04	x.(y). 04	x.(y). 04	c	χ.(y). 04	x.(y). 05	x.(y). 05	x.(y). 05	X.(y)05
χ.(y). 06	C	x.(y)06	x.(y). 06	x.(y). 06	χ.(y). 07	x.(y). 07	C	x.(y)· 07	x.(y). 07	x.(y). 08	x.(y). 08
x.(y). 08	x.(y). 08	C	x.(y)« 09	x.(y). 09	x.(y). 09	x.(y). 09	x.(y). 10	C	x.(y). 10	x.(y). 10	x.(y). 10
χ.(y). 11	χ.(y). 11	χ.(y)· 11	C	x.(y). 11	x.(y). 12	x.(y) · 12	x.(y). 12	χ.(y)· 12	C	x.(y). 13	x.(y). 13
x.(y). 13	x.(y). 13	χ.(y). 14	χ.(y). 14	c	χ.(y). 14	x.(y). 14	x.(y). 15	x.(y). 15	x.(y). 15	c	x.(y). 15
x.(y). 16	x.(y). 16	χ. (y). 16	χ.(y). 16	X. (y)	c	x. (y)	X. (y)	x. (y)	C57	C57	c
C57	C57	C3H	C3H	C3H	C3H	P	0	0	0	c	0

Kde x (druhé kolo) a y (třetí kolo) představují počet poolů vybraných v prvním a druhém kole, vdaném pořadí. 01 až 16 představují použité podskupiny poolů. x(y) reprezentuje parenterální pool, ze kterého pochází 16 poolů. C znamená totéž, co v prvním kole. P byl modifikován jako pCMVScript-CNTF v druhém kole a postupně pcDNA-939.09.08 ve třetím kole. 0 reprezentuje kuřecí buňky čípků pouze v CDCM mediu. C57 a C3H, kondicionovaná média z explantátů sítnic připravená tak, jak bylo popsáno v části týkající se přípravy kondicionovaných médií z explantátů sítnic myší ze sítnic myší C57BL/6@N a C3H/He@N ve věku 5 týdnů, v daném pořadí.

μΐ buněčných suspenzí odpovídajících dvěma hustotám (2 a 4x 10⁵ buněk/cm²) bylo přidáno do jamek dvou 96jamkových destiček naplněných kondicionováným médiem 8 kanálovou motorizovanou pipetou (Biohit), aby se minimalizovaly experimentální chyby. Buňky byly inkubovány po dobu 7 dní ve 37 °C v 5% CO₂.

-25CZ 305800 B6

Příprava kondicionovaných médií z explantátů sítnic myší

Druhé a třetí kolo screeningu zahrnovalo pozitivní kontroly adaptové dle Mohand-Saíd et al., 1998. Myši kmenů 5C57BL/6@N (divokého typu) a C3H/He@N (rdi) ve věku pěti týdnů byly utraceny a enukleovány. Dvě sítnice byly disekovány a inkubovány po dobu 24 hodin ve 37 °C v 5% CO₂ v 1,5 ml CDCM na 12jamkových destičkách. Kondicionovaná média byla získána a 40 krát koncentrována ultrafiltrací na přístroji Vivaspin (Sartorius, hraniční velikost 10 kD). Kondicionovaná média byla zmražena v kapalném dusíku a skladována v alikvotech v -20 °C před použitím. V den použití byla kondicionovaná média rozmražena na ledu, naředěna 10 krát CDCM a sterilizována filtrací přes 0,22 pm filtr (Acrodisk 13, Gelman Sciences).

Funkční test, test LIVE/DEAD

Funkční test je založen na počtu buněk kuřecích sítnic životaschopných po 7 dnech inkubace in vitro. Původci používali testovací soupravu LIVE/DEAD (Molecular probes, Eugene, USA), která je založena na použití dvou fluorogenních barvi v (Calcein AM a dimer ethidia), které barví živé a mrtvé buňky, v daném pořadí. Buňka, která je živá, vyvíjí metabolickou aktivitu (v tomto případě esterázovou aktivitu), která konvertuje substrát (Calcein AM) na jeho fluorescenční produkt emitující v 520 nm. Permeabilita membrány mrtvé buňky je změněna a umožňuje DNA barvení jádra dimerem ethidia emitujícím v 635 nm. Buňka je živá: emituje v 520 nm po excitaci 485 nm nebo mrtvá: emituje v 635 nm po excitaci 520 nm. S použitím epifluorescenční mikroskopie mohou být tyto dva typy fluorescenčních buněk zobrazeny odděleně. Po 7 dnech in vitro byly buňky inkubovány po dobu 30 minut při teplotě místnosti ve tmě s 2,7 μΜ Calcein-AM a 0,3 mM dimerem ethidia.

Získání snímků

Stručně, získání snímků sestávalo z autofokusace každé jamky, automatického počítání buněk ve dvou fluorescencích následovaném zpracováním hrubých údajů s použitím specializovaného software, např. Metamorph (Universal Imaging Corporation, West Chester, USA), čímž se získal digitalizovaný obraz každé jamky na destičce. Původci používaly invertovaný mikroskop (Nikon TE 200) vybavený rtuťovou epifluorescenční lampou s dvěma excitačními filtry 485 a 520 nm, dvěma emisními filtry 520 a 635 nm, objektivem (xlO) a počítačem řízeným motorizovaným stolkem (Multicontrol 2000, Martzauzer a CCD kamera (Cohu).

Pro snímání byla destička umístěna na motorizovaném stolku a zaostření bylo prováděno ručně na první jamce, a tato zaostřovací rovina byla zaznamenána (výchozí). Práh obrazu mrtvého a živého je nastaven z první jamky.

Střed první jamky je nastaven s použitím bílého světla tím, že se ručně nastaví dno jamky na spodek obrazu na počítačovém monitoru, a pak se zarovná pravý kraj první jamky s pravou hranou obrazu na počítačovém na počítačovém monitoru a tyto dvě polohy se zaznamenají. Střed první jamky se pak vypočte a určí polohu střed všech dalších jamek na destičce. Při vývoji metody se původci povšimli, že existuje nepatrně vyšší denzita buněk u okraje jamky a vyřadili proto okraje ze sběru dat. Je důležité, aby obraz každé jamky byl perfektně vycentrován, aby se zabránilo jakýmkoliv klamným výsledkům. Když je vše nastaveno, první skenovací destičky zaznamená mrtvé buněk. Denzita mrtvých buněk je za těchto podmínek méně variabilní. Program provede automatické zaostřování tím, že sejme obrazy v různých ohniskových rovinách a vybere ten nejjasnější, pak koriguje zaostření. Tato poloha je pak uchována uložena a motorizovaný stolek koná naprogramované pohyby ve směru os x a y a sejme celkem 4 obrazy, které po reorganizaci do jednoho obrazu reprezentují 2/3 povrchu jamky. Řada obrazů z ohniskových rovin je uchována pro kontrolu. Stolek vykoná automatické zaostřování a provede čtyři snímky pro každou jamku destičky počínaje jamkami Al až A12, pak B12 až Bl, Cl až C12 atd. Na konci se stolek posune mimo destičku, aby se přeexponoval poslední jamka (Hl). Skenování mrtvých buněk trvá 30 minut. Druhé skenování (živé buňky) se provede po výměně filtru. Toto druhé skenování se

-26CZ 305800 B6 provádí s použitím zaznamenané polohy každé jamky z předchozího skenování mrtvých buněk. Pro každou jamku jsou provedeny čtyři snímky stejně jako pro mrtvé buňky. Na konci druhého skenování (22 minut) reorganizované obrazy mrtvých a živých buněk jsou uloženy do datového souboru, který je automaticky označen datem dne. Počty buněk (mrtvých a živých) jsou počítány automaticky s předem nastavenými morfometrickými parametry (průměrnými) a jsou ukazovány na počítači, aby bylo možné kontrolovat, zda experiment probíhá správně. Je důležité kontrolovat denně, zda počet živých buněk není příliš vysoký. Původci zjistili, že jestliže se nanese příliš vysoká denzita buněk, buňky kuřecí sítnice přežívají déle pravděpodobně proto, že produkují vlastní přežívací faktor. Buňky byly proto skenovány v nepřítomnosti tohoto účinku. Před skenováním druhé destičky (stejný experimentovat, ale s dvakrát vyšší hustotou nanesených buněk) bylo přidáno „a“ na konec jména uloženého souboru pro první destičku. Snímky z každého experimentu pak byly uloženy na CD-ROM. Byla tak vytvořena knihovna s více než 250 CD-ROM.

Počítání buněk a poolů

Počty buněk (živé a mrtvé) byly určeny ze snímků archivovaných pro každý experiment na CDRM. Sběrný datový soubor z experimentu byl nejdříve uložen do počítače (počítání off-line) a otevřel s použitím softwaru Metamorph. V prvním kroku se otevřely obrazy odpovídající 14 jamkám C (kondicionovaná média z Cos-1 buněk transfekovaných prázdným vektorem). Poté, co byl nastaven práh obrazu, příkaz Integrated Morphometry Analysis byl použit ke zjištění distribuce oblastí mezi 10 a 250 objekty (počet živých buněk pro každou celkovou oblast) pro tyto kontrolní jamky. Distribuce sledovala Gaussovu křivku s maximálním počtem objektů odpovídajících izolované buňce. Tato standardní hodnota (SV) pak byla použita k výpočtu hodnot pro oblasti vyšší, kde objekt je počítán jako dvě buňky (standardní řez objektu, SOC) na základě vlastní empirické funkce: SOC = 29/20,74/SV. Hodnota SOC každé individuální destičky je pak určena k výpočtu množství živých buněk na destičce. Tyto hodnoty se pak přenesou do tabulky v programu Excel.

V prvním kole screeningu byly hodnoty získané pro každý pool vyneseny jako násobky (zvýšení nebo snížení počtu živých buněk) proti průměru ze 14 kontrolních jamek + směrodatná odchylka. Aby se potlačila variabilita způsobená rozdílnou polohou na destičce, byl vypočten průměr rozdílu individuálně mezi 80 jamkami odpovídajícími polohám, kde jsou testované pooly, a 14 kontrolním jamkám pro 200 nezávislých destiček. V průměru byly pozorované rozdíly jen důsledek rozdílné polohy a počty buněk pak byly korigovány takto získaným koeficientem. Pro přísnější diskriminaci při výběru poolů byly počty živých buněk vyneseny do grafu jako násobky rozdílu proti kontrole a všechny hodnoty byly menší než 1,3 ale větší než 0,4. Tímto způsobem bylo určeno, že všechny pooly s násobkem rozdílu proti průměru 14 jamek odpovídajících prázdnému vektoru ležící v intervalu od 0,4 do 1,3 byly považovány za neúčinné a byly použity jako kontrola. Po korekci násobek rozdílu proti kontrolním dvěma destičkám vynásoben a výsledek byl roztříděn podle klesajícího násobku. Pooly na vrcholu tohoto seznamu byly dále vizuálně kontrolovány prohlídkou grafu odpovídajícího 20 poolům z experimentu (obě destičky) a snímků živých a mrtvých buněk, aby se zabránilo screeningu klamných poolů.

Pro druhé a třetí kolo screening destiček na podskupiny poolů zahrnoval další kontroly. Původci připravili kondicionovaná média z retinálních explantátů myší ve věku 5 týdnů. Původci vybrali experimenty, kde byly zaznamenány pozitivní účinky na explantáty sítnic myší C57BL/6@N, a vyloučili ostatní. Výsledky byly vyneseny do grafu jako násobek rozdílu proti 14 kontrolním jamkám, nebylo prováděno žádné přepočítávání kontrol. Násobek rozdílu proti kontrolám ze dvou destiček byl vynásoben a výsledky byly tříděny podle poklesu násobku rozdílu pro 16 podskupin poolů.

Izolovaná cDNA byla sekvencována s použitím T7 příměru (5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3') na kapilárním sekvenátoru (CEQ2000, Beckman Coulter). DNA sekvence byly srovnány s databázemi s použitím programu Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).

-27CZ 305800 B6

Identifikace Rdcvf2 a humánních homologů

S použitím Rdcvfl sekvence (nukleotidová sekvence kódující polypeptidy uvedené v SEKV. ID. Č. 2 nebo SEKV. ID. Č. 4) a programu BLAST byly identifikovány homologní myší a humánní polypeptidy (obrázek 8). Byly identifikovány EST klony s homologií k myší RdCVF2 (GenBank přístupové č. Bc016199): GenBank přístupová č.: be552141, bi517442, bg707818, bi603812, ai433287, be088414, bg297383, bg297304 (viz také obrázek 12). Byly identifikovány EST klony s homologií k myší Rdcvfl (SEKV. ID. Č. 1): GenBank přístupové č. Bg299078, ai716631, bg294111, be 108041, bg395178 (viz také obrázek 13).

RT-PCR analýza Rdcvfl exprese v reálném čase

Retinální exprese Rdcvfl kmeny myší C57BL/6@N a C3H/He@N, také ve věku stejném jako kongenní C3H (+/+ a rd/rd) 5 týdnů, byla studována s použitím RT-PCR v reálném čase na cykleru (Roche) PCR soupravou s barvivém sybergreen (Roche). cDNA jsou tvořeny s použitím primeru, a to náhodným hexamemím oligonukleotidem (pdN6, Amersham), M-MLV reverzní transkriptázou (Superscript II, Life Technologies) a celkové RNA z myší sítnice připravené jako v bodě 1). cDNA jsou standardizovány s použitím všudypřítomné messenger RNA glukózo-6fosfátdehydrogenázy (G6PDH). Syntéza 0,2 μΐ prvního vlákna cDNA (ekvivalent 10 ng celkové RNA) je amplifikována 2 μΜ oligonukleotidy SEKV. ID. Č. 24 a SEKV. ID. Č. 25 v trojím opakování v celkovém objemu 25 μΐ s použitím následujícího programu: 30 sekund v 95 °C a 35 cyklů sledu (1 sekunda v 95 °C, 18 sekund v 55 °C, 10 sekund v 72 °C). Analýza (obrázek 16) ukazuje, že exprese Rdcvfl se snižuje po degeneraci tyčinek u rdi myší (C3H/He@N). Bylo také ukázáno pomocí RT-PCR v reálném čase s použitím RNA připravené z vnější vrstvy sítnice z řezů na vibratomu, že Rdcvfl je přímo exprimován fotoreceptory.

Produkty byly kontrolovány elektroforézou na agarózovém gelu. Podobné výsledky byly získány s dalším párem Rdcvfl specifických primerů. Jako pozitivní kontrola byla monitorována exprese arrestinu tyčinek (klon č. M24086) ve stejných podmínkách s primery (5' CTATTACGTCAAGCCTGTAGCC 3' a 5' CATCCTCATCTTTCTTCCCTTC 3'). Potvrzení, že Rdcvfl je protektivní faktor čípků může být získáno přidáním vhodného množství Rdcvfl k retinálnímu explantátu z 5 týdnů staré rdi myši (C3H/He@N). Ke vhodnému množství lze dospět některými výchozími titračními experimenty. Ve srovnání s vhodnými kontrolami po 7 dnech je přežívání čípků zvýšeno.

RT-PCR analýza Rdcvf2

RT-PCR pro expresi Rdcvf2 bylo prováděno s použitím primerů:

5’-GCCAGCGTTTTCTGCCTTTTAC-3’ a

5'-AAGCCCTGCCTGCTCTAACATC-3'.

Analýza ukazuje, že RdCVF2 je exprimován způsobem závislým na tyčinkách a že Rdcvf2 exprese není restringována na sítnici, ale že také další neuronové buňky exprimují Rdcvf2 (obrázek 17), zatímco exprese Rdcvfl se jeví být restringována na buňky sítnice.

-28CZ 305800 B6

Testy LIVE/DEAD Rdcvfl nebo Rdcvf2

Buňky COS-1 jsou transfekovány vhodným expresním vektorem nesoucím Rdcvfl nebo Rdcvf2 pod kontrolou indukovatelného promotoru. Kontrolní buňky jsou transfekovány prázdným vektorem. Buňky jsou inkubovány po vhodné časové období po indukci Rdcvfl nebo Rdcvf2 exprese. Následně, počet přežívajících buněk čípků inkubovaných s kondicionovaným médiem z COS-1 buněk transfekovaných Rdcvfl nebo Rdcvf2 a počet přežívajících kontrolních buněk je počítán podle výše popsaného způsobu. Buňky exprimující Rdcvfl nebo Rdcvf2 ukazují významně vyšší množství přežívajících buněk.

Faktor specifický pro tyčinky

Analýza RT-PCR v reálném čase, prováděná ve standardních podmínkách, exprese arrestinu tyčinek (kontrola) a Rdcvfl na 5 týdnů starých retinálních explantátech myší C57BL/6@N ve věku 5 týdnů a C3H/HE@N, s použitím primerů:

SEKV. ID. Č.: 24: 5’ TCTATGTGTCCCAGGACCCTACAG 3’

SEKV. ID. Č.: 25: 5 TTTATGCACAAGTAGTACCAGGACAG 3'

Analýza prokázala, že RdCVFl je exprimován pouze v přítomnosti tyčinek (tyčinkovýCVFl).

Produkce polyklonálních protilátek

Polyklonální protilátky byly připraveny injekcí purifikovaného fúzního proteinu s glutathion-Stransferázou (GST) (GST-Rdcvfl), a také aminokyselin z myší RdCVFl peptidové sekvence 11 až 32 ze SEKV ID Č. 2 (Ab č. 2) a aminokyselin peptidové sekvence 79 až 96 ze SEKV ID Č. 2 (Ab č. 3) do králíka. Fúzní konstrukt pGST-Rdcvfl byl připraven amplifikací s oligonukleotidy SEKV. ID. Č. 26 a SEKV. ID. Č. 27 s použitím pcDNA-Rdcvfl jako templátu ve standardních podmínkách. Otevřený čtecí rámec (ORF) Rdcvfl byl klonován ve shodném čtecím rámci do pGex2TK (Pharmacia) mezi BamHI a EcoRI restrikční místa a transformován do E. coli (BL21 (DE3) pLysS, Promega] standardním postupem. Jedna kolonie byla pěstována ve 3 litrech LB tekutého média s ampicilinem v koncentraci 100 pg/ml ve 30 °C a produkce proteinu byla indukována přidáním isopropylthio-P-D-galaktosidu (IPTG) v koncentraci 1 pg/ml a pokračovala po dobu 5 hodin ve 30 °C. Buňky byly sklizeny, lyžovány sonikací a purifikovány na gluthationsefaróze podle standardního protokolu. Fúzní protein byl eluován lOmM redukovaným glutathionem při teplotě místnosti. Eluovaný protein byl dialyzován do PBS před injekcí králíkům. Čistota proteinu byla monitorována elektroforézou v polyakrylamidovém gelu. Dva králíci byli imunizováni intradermální injekcí v 80 místech 100 pg purifikovaného GST-Rdcvfl. Sérum bylo sklízeno po 8 týdnech.

-29CZ 305800 B6

SEZNAM SEKEVNCÍ <210> 1 <211> 468 <212> ONA <213> Mus museu!us <220>

<221> COS <222> (45)..(374) <223>

<400> 1 atcggatccc tctctgggtc cccagctcct tgcatactgc tacc atg gca tet etc 56

Met Ala Ser Leu 1 ttc tet gga ege ate ttg ate agg aac aac age gac cag gat gaa gtg phe ser Gly Arg lie Leu lie Arg Asn Asn ser Asp Gin Asp Gluval

10 1520 gag aca gag gca gag etg age cgt agg tta gag aat cgt ctg gtgttg

Glu Thr Glu Ala Glu Leu Ser Arg Arg Leu Glu Asn Arg Leu valLeu

3035 etg ttc ttc ggc gee ggc gcc tgt ccc cag tgc cag gee ttt gcc cca

Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gin cys Gin Ala Phe Ala Pro

4550 gtc ctc aaa gac ttc ttc gtg egg etc act gac gag ttc tac gtg ctg val Leu L^s Asp Phe Phe val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Tyr val Leu cgg gca gca cag ctg gcc ctg gtc tat gtg tcc cag gac cct aca gag

Arg Ala Ala Gin Leu Ala Leu val tyr val Ser Gin Asp Pro Thr Glu

104

152

200

248

296

7580 gag caa cag gac etc ttc etc agg gac atg cct gaa aaa tgg etc ttc344

Glu Gin Gin Asp Leu Phe Leu Arg Asp Met pro Glu Lys Trp Leuphe

90 95100 ctg ecg ttc cat gat gaa ctg agg agg tga ggccccaggg aagaccaggg394

Leu Pro Phe His As| Glu Leu Arg Arg agggcttcct ggagaaggca tttccctgga ggtttactgt cctggtacta cttgtgcata 454 aagaggtatt cctc

468

-30CZ 305800 B6 <210> 2 <2U> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2

Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg lie Leu lie Arg Asn Asn Ser Asp

5 1015

Gin Asp Glu val Glu Thr Glu Ala Glu Leu Ser Arg Arg Leu GluAsn

2530

Arg Leu val Leu Leu phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gin cys Gin 35 4045

Ala Phe Ala Pro val Leu Lys Asp Phe phe Val Arg Leu Thr Asp Glu 50 5560

Phe iyr val Leu Arg Ala Ala Gin Leu Ala Leu val Tyr Val ser Gin

70 7580

Asp Pro Thr Glu Glu Gin Gin Asp Leu Phe Leu Arg Asp Met Pro Glu

9095

Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe His as^ Glu Leu Arg Arg <210> 3 <2U> 764 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (26)..(676) <223>

-31 CZ 305800 B6 <400> 3

ccccagctcc ttgcatactg ctacc atg gca tct

etc ttc

tct ser

gga ege ate Giy Arg lie

52

Met 1

Ala

Ser

Leu

Phe 5

ttg

ate

agg

aac

aac

age

gac

cag

gat

gaa

gag

aca

gag

gca

gag

100

Leu

He

Arg

Asn

Asn

Ser

Asp

Gin

Asp

Glu

Glu

Thr

Glu

Ala

Glu

10

15

20

25

ctg

age

cgt

agg

tta

gag

aat

cgt

ctg

gtg Val

ttg

ctg

ttc

ttc

ggc Giy

gee

148

Leu

ser

Arg

Arg

Leu

Glu

Asn

Arg

Leu

Leu

Leu

Phe

Phe

Ala

30

35

40

ggc Gly

gcc

tgt

ccc

cag

tgc

cag

gee

ttt

gee

cca

gtc

etc

aaa

gac

ttc

196

Ala

cys

pro 45

Gin

cys

Gin

Ala

Phe 50

Ala

pro

Val

Leu

Asp

Phe

ttc

gtg Val

egg

etc

act

gac

gag

ttc

tac

«3

ctg

egg

gca

gca

cag

ctg

244

Phe

Arg

Leu

Thr

ASp

Glu

Phe

Tyr

Leu

Arg

Ala Ala

Gin

Leu

60

65

70

gcc

ctg

gtc

tat

tee

cag

gac

cct

aca

gag

gag

caa

cag

gac

etc

292

Ala

Leu

Val

Tyr

Ser

Gin

Asp

pro

Thr

Glu

Glu

Gin

Gin

Asp

Leu

75

80

85

ttc

etc

agg

gac

atg

cct

gaa

aaa

tgg

etc

ttc

ctg

ccg

ttc

cat

gat

340

Phe 90

Leu

Arg

Asp

Met

Pro 95

Glu

Lys Trp

Leu

Phe 100

Leu

pro

phe

HiS

10?

gaa

ctg

agg

agg

gac

etc

egg ege cag

ttc

tct

gtc

cgt

caa

ctg

cca

388

Glu

Leu

Arg Arg Asg

Leu

Gly Arg

Gin

Phe 115

Ser

Val

Arg

Gin

Leu 120

Pro

gcg gtt

gtg val

gta

ett

aag

cct

ggt

ggg gac

?3

ctg

aca

age

gac

gee

436

Ala Vai

Val 125

Leu

Lys

pro

Giy

as

Asp

Leu

Thr

ser 135

Asp

Ala

acg

gag

gag

ate

cag

cgt

ctg

gga &

ccc

gee

tgc

ttt

gee

aac

tgg

cag

484

Thr

Glu

Glu 140

lie

Gin

Arg

Leu

pro

Ala

cys

Phe

Ala 150

Asn

Trp

Gin

gag

gcc

gca

gag

etc

ctg

gac

ege

age

ttc

ctg

caa

ccg

gag

gat

ttg

532

GlU

Ala 155

Ala

Glu

Leu

Leu

Asp 160

Arg

ser

Phe

Leu

Gin 165

Pro

Glu

Asp

Leu

gat

gag

cct

gcg

egg

ege

age

ate

acc

gag

cct

ctg

ege

cgt

ege

aag

580

Asp

Glu

pro Ala

Arg

Arg

Ser

lie Thr

Glu

Pro

Leu

Arg Arg Arg

Lys

170

175

180

185

tac

ega

gta

gac

egg

gat

gtc

ggc ggg Giy Gly

age

ggg Giy

gcg

aaa cog

ege

gac

628

iyr Arg

val

Asp

Arg 190

Asp

Val

Ser 195

Ala

Lys Arg Arg 200

Asp

tct

ggt Gly

gaa

ccc cag

999 Gly

gac

gcg

ggt

aca agg gcg gag etc tgg

tga

676

Ser

Glu

pro Gin 205

Asp

Ala

Gly 210

Thr Arg Ala Glu Leu Trp 215

ctcccagggt aggagtgggg accggagctc tggtgacacc aaagtaccgg tgcacgaccg

736

-32CZ 305800 B6 aggttgatga ccctcccgaa ggaaccgg

764 <210> 4 <211> 216 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4

Met Ala ser Leu Phe Ser Gly Arg

Leu lie Arg Asn Asn Ser Asp 10 15

Gin Asp Glu val Glu Thr Glu Ala 20

Leu ser Arg Arg Leu Glu Asn 30

Arg Leu val Leu Leu Phe Phe Gly 35 40

Gly Ala Cys Pro Gin cys Gin

Ala Phe Ala pro val Leu Lys Asp 50 55

Phe val Arg Leu Thr Asp Glu 60 phe iyr val Leu Arg Ala Ala Gin 65 70

Ala Leu val Tyr val ser Gin 75 80

Asp Pro Thr Glu Glu Gin Gin Asp

Phe Leu Arg Asp Met pro Glu 90 95

Lys Trp Leu Phe Leu Pro Hie His 100

Glu Leu Arg Arg Asg Leu Gly

Arg Gin phe ser val Arg Gin Leu

115 120

Ala val val val Leu Lys pro 125

Gly Gig Asp val Leu Thr S|r Asp

Thr Glu Glu He Gin Arg Leu 140

Gl$ Pro Ala cys phe Ala Asn Trp

Glu Ala Ala Glu Leu Leu Asi

155 161

Arg ser phe Leu Gin Pro Glu Asp 165

Asp Glu Pro Ala Arg Arg Ser 170 175 lie Thr Glu Pro Leu Arg Arg Arg 180

Tyr Arg Val Asp Arg Asp Val 190

Gly Gly ser Gly Ala Lys Arg An ser Gly Glu Pro Gin Gly Asp 205

-33CZ 305800 B6

Ala Gly Thr Arg Ala Glu Leu Trp

210 215 <210> 5 <211> 353 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (24)..(353) <223>

<400> 5

cccagcaccc aacccaggtt acc atg gcc tcc ctg ttc tct ggc cgc ate etg Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg lie Leu 15 10	53
ate cgc aac aat age gac cag gac gag ctg gat acg gag get gag gtc	101
He Arg Asn Asn Ser Asp Gin Asp Glu Leu Asp Thr Glu Ala Glu val 15 20 25
agt cgc agg ctg gag aac egg ctg gtg ctg ctg ttc ttt ggt get ggg ser Arg Arg Leu Glu Asn Arg Leu val Leu Leu phe Phe Gly Ala Gly 30 35 40	149
get tgt cca cag tgc cag gcc ttc gtg ecc ate etc aag gac ttc ttc	197
Ala Cys Pro Gin Cys Gin Ala Phe val pro lie Leu Lys Asp Phe Phe 45 50 55
gtg egg etc aca gat gag ttc tat gta ctg egg geg get cag ctg gcc Val Arg Leu Thr Asp Glu phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gin Leu Ala 60 65 70 ctg gtg tac gtg tcc cag gac tcc acg gag gag cag cag gac ctg ttc Leu Val Tyr Vai Ser Gin Asp ser Thr Glu Glu Gin Gin Asp Leu Phe 75 80 85 90	245
293
etc aag gac atg cca aag aaa tgg ett ttc ctg ccc ttt gag gat gat	341
Leu Lys Asp Met Pro Lys Lys Trp Leu Phe Leu pro Phe Glu Asp Asp 95 100 105 ctg agg agg tga Leu Arg Arg	353

<210> 6 <2H> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens

-34CZ 305800 B6 <400> 6

Met Ala ser Leu phe Ser Gly 1 5

Gin Asp Glu Leu Asp Thr Glu 20

Arg Leu val Leu ueu phe Phe 35

Ala Phe val Pro lie Leu Lys 50 55

Phe Tyr val Leu Arg Ala Ala 65 70

Asp Ser Thr Glu Glu Gin Gin 85

Lys Trp Leu Phe Leu pro phe 100 <210> 7 <211> 686 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (48)..(686) <223>

lie Leu lie Arg Asn Asn ser Asp 10 15

Glu val ser Arg Arg Leu Glu Asn 25 30

Ala Gly Ala cys pro Gin Cys Gin phe phe val Arg Leu Thr Asp Glu 60

Leu Ala Leu val Tyr val ser Gin 75 80

Leu Phe Leu Lys Asp Met pro Lys 90 95

Asg Asp Leu Arg Arg

-35CZ 305800 B6 <40Q> 7 ccggggacca cacgccgcgc tgtccccagc acccaaccca ggttacc atg gcc tcc Met Ala Ser 1

ctg Leu ctg Leu 20 ctg Leu

ttc Phe 5 gat Asp ctg Leu

tet Ser acg Thr ttc Hie

ggc Gly gag Glu ttt Phe

ege Arg get Ala ggt Gly 40

ate He gag Glu 25 get Ala

ctg ate ege Leu lie Arg 10 gtc agt ege val ser Arg ggg get tgt Giy Ala cys

aac aat age gac Asn Asn ser Asp 15 agg ctg gag aac

cag Gin egg Arg XS

gac Asp ctg Leu ttc phe 50

gag Glu «3 35 «3

Arg Leu 30 cca cag pro Gin 45

G1U Asn tgc cag cys Gin

ccc Pro

ate lie

etc Leu

aag

gac Asp

ttc Phe

ttc gtg egg Phe val Arg 60

etc aca Leu Thr

gat Asp

gag gIu

ttc phe 65

tat Tyr

gta val

ctg Leu

egg Arg

geg Ala 70

xs

cag Gin

ctg Leu

gee ctg gtg Ala Leu Val 75

tac gtg Tyr val

tec Ser

cag Gin 80

gac Asp

tec Ser

acg Thr

gag Glu

gag Glu 85

cag Gin

cag Gin

gac Asp

ctg Leu

ttc etc aag Phe Leu Lys 90

gac atg Asp Met

cca Pro 95

aag Lys

aaa Lys

tgg Trp

ett Leu

ttc Phe 100

ctg Leu

ccc Pro

ttt gag Phe Glu

gat Asp 105

gat ctg agg Asp Leu Arg

agg gac ArgAsg

etc Leu

ggg ege Giy Arg

cag Gin

ttc Phe 115

tea ser

gtg val

gag Glu

ege Arg

ctg Leu 120

ecg geg gtc gtg Pro Ala Val val

gtg etc Val Leu 125

aag Lys

ccg Pro

gac Asp

ggg Gly 130

gac Asp

gtg Val

etc act Leu Thr

ege gac Arg Asp 135

ggc Giy

gee gac gag Ala Asp Glu 140

ate cag lie Gin

ege Arg

ctg Leu

ggc Giy 145

acc Thr

gcc Ala

tgc cys

ttc Phe

gcc Ala 150

aac tgg Asn Trp

cag Gin

gag geg gee Glu Ala Ala 155

gag gtg Glu val

ctg Leu

gac Asp 160

ege Arg

aac Asn

ttc Phe

cag Gin

ctg Leu 165

cca Pro

gag Glu

gac Asp

ctg Leu

gag gac cag Glu Asp Gin 170

gag cca Glu Pro

egg

age Ser

etc Leu

acc Thr

gag gIu

tgc ctg Cys Leu 180

ege Arg

ege Arg

cac His

aag

tac ege gtg Tyr Arg Val

gaa aag geg geg Glu Lys Ala Ala 190

ega Arg

ggc Gly

ggg Gly 195

ege gac Arg Asp

ccc Pro

ggg Gly

gga Gly 200

ggg Gly

got ggg gag Gly Gly Glu

gag ggc ggg gee ggg Glu Giy Gly Ala Giy 205

ggg Gly 210

ctg Leu

ttc tga phe

104

152

200

248

296

344

392

440

488

536

584

632

680

686

-36CZ 305800 B6 <210> 8 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg lie Leu He Arg Asn Asn sen Asp

5 1015

Gin Asp Glu Leu Asp Thr Glu Ala Glu val Ser Arg Arg Leu GluAsn

2530

Arg Leu val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala cys Pro Gin cys Gin • W’

Ala Phe val Pro He Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu 50 5560

Phe Tyr val Leu Arg Ala Ala Gin Leu Ala Leu val Tyr val ser Gin 65 70 7580

Asp Ser Thr Glu Glu Gin Gin Asp Leu Phe Leu Lys Asp Met Pro Lys 85 9095

Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe Glu Asp Asp Leu Arg Arg Asp Leu Gly

100 10511b

Arg Gin Phe Ser val Glu Arg Leu Pro Ala Val Val val Leu Lys Pro US 120125

Asp Gly Asp val Leu Thr Arg Asp Gly Ala Asp Glu lie Gin Arg Leu

Gly Thr Ala cys Phe Ala Asn Trp Gin Glu Ala Ala Glu Val Leu Asp 145 150 155160

Arg Asn Phe Gin Leu Pro Glu Asp Leu Glu Asp Gin Glu Pro Arg Ser 165 170175

Leu Thr Glu c^s Leu Arg Arg His Lys Tyr Arg Val Glu Lys Ala Ala

Arg Gly Gly Arg Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly Gly Ala

205

Gly Gl^ Leu Phe

-37 CZ 305800 B6 <210> 9 <211> 600 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (265)..(570) <223>

<4O0> 9 ataaaataga gggtgggaga ggttgatggc gtggctctgc tttttggtgc ggggcaccca60 gctgtcatcg ctgctgtcgc agcttctgga gtggccactg tgctctctcc tcccttcggc120 tcaaggtgag ctgttccagc agaaggcggg gctgagaggc gcctagtgct gcgggaggct180 cagtgtcatc ttccagctaa caggtggccg tgcagcccag ggctcgtctc tccactgtgt240 cctcttcacg ccgagctcgt ggcg atg gtg gac gtg ctg ggc ggg egg ege291

Met vai Asp vai Leu Gly Gly Arg Arg ctg gtg acc egg gag ggc acg gtg gtg gag gee gag gtg geg ctg cag339

Leu Vai Thr Arg Glu Gly Thr Vai Vai Glu Ala Glu vai Ala LeuGin

15 2025 aae aag gtg gta get ttg tat ttt geg geg ggc egg tgc teg ccc age387

Asn Lys vai vai Ala Leu Tyr Phe Ala Ala Gly Arg cys ser ProSer

3540 ege gac ttc acg ccg ctg etc tgc gac ttc tac acg gag ctg gtg age435

Arg Asp phe Thr Pro Leu Leu cys Asp Phe Tyr Thr Glu Leu vaiSer

5055 gag geg egg egg ccc get ccc ttc gag gtg gtt ttc gtg teg gca gac483

Glu Ala Arg Arg Pro Ala pro Phe Glu Vai vai Phe Vai ser AlaAsp

65 .70 ggc agt geg gag gag atg ttg gac ttc atg ege gag ctg cac ggc tee531

Gly Ser Ala Glu Glu Met Leu Asp Phe Met Arg Glu Leu His GlySer

8085 tgg ctg gca ttg ccc ttc cac gac ccc tac egg cag tga gtggggaccc 580 Trp Leu Ala Leu Pro Phe His Asp Pro Tyr Arg Gin 90 95100 aggggtcatg gggctggcgc600

-38CZ 305800 B6 <210> 10 <211> 101 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10

Met Vai Asp Vai Leu Gly Gly Arg Arg Leu Vai Thr Arg Glu Gly Thr 15 1015 val Val Glu Ala Glu val Ala Leu Gin Asn Lys val Vai Ala Leu Tyr 20 2530

Phe Ala Ala Gly Arg cys ser Pro Ser Arg Asp Phe Thr pro LeuLeu

Cys Asp Phe Tyr Thr Glu Leu Vai Ser Glu Ala Arg Arg pro AlaPro

5560

Phe Glu Val val Phe Vai Ser Ala Asp Gly ser Ala Glu Glu MetLeu

70 7580

Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ser Trp Leu Ala Leu Pro PheHis

9095

Asp Pro Tyr Arg Gin <210> 11 <2U> 1164 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (300)..(770) <223>

-39CZ 305800 B6 <400> 11 ttgactctgg tgggtagaga gggtttgcaa ggcaggataa aatagagggt gggagaggtt 60 gatggcgtgg ctctgctttt tggtgcgggg caccagctgt catcgctgct gtcgcagctt 120 ctggagtggc cactgtgctc tctcctccct tcggctcaag gtgagctgtt ccagcagaag 180 gcggggctga gaggcgccta gtgctgcggg aggctcagtg tcatcttcca gctaacaggt 240 ggccgtgcag cccagggctc gtctctccac tgtgtcctct tcacgccgag ctcgtggcg 299 atg gtg gac gtg ctg ggc ggg egg ege etg gtg acc egg gag ggc acg 347 Met val Asp Val Leu Gly Gly Arg Arg Leu vai Thr Arg Glu Giy Thr IS 1015 gtg gtg gag gee gag gtg geg ctg cag aac aag gtg gta get ttg tac395 val Vai Glu Ala Glu Val Ala Leu Gin Asn Lys vai val Ala Leu Tyr

2530 ttt geg geg ggc egg tgc teg ccc age ege gac ttc acg ccg ctg etc443

Phe Ala Ala Giy Arg cys ser pro ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu

4045 tgc gac ttc tac acg gag ctg gtg age gag geg egg egg ccc get ccc491 cys Asp Phe Tyr Thr Glu Leu Vai ser Glu Ala Arg Arg Pro Ala pro

5560 ttc gag gtg gtt ttc gtg teg gca gac ggc agt geg gag gag atg ttg539

Phe Glu Vai Val Phe Val Ser Ala Asp Gly ser Ala Glu Glu Met Leu

70 7580 flac ttc atg ege gag ctg cac ggc tee tgg ctg gca ttg ccc ttc eac587

Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly ser Trp Leu Ala Leu pro Phe His

9095 gac ccc tac egg cat gaa ctg aag Asp Pro Tyr Arg His Glu Leu Lys ccc aag ctg gtg gtc ate aag cag Pro Lys Leu Val Val He Lys Gin 115 120 ggg egg aag cag ate ega gag ege Gly Arg Lys Gin He Arg Glu Arg gtg gaa gca gee gat gtt ttc caa val Glu Ala Ala Asp val Phe Gin 145 150 aag agg tac gaa ate acc gee ate Lys Arg iyr Glu lie Thr Ala lie 105 110 aac gga get gtc ate acc aac aaa

Asn Gly Ala Val lie Thr Asn Lys 125 ggg eta get tgc ttt cag aac tgg Gly Leu Ala cys Phe Gin Asn Trp 140 aac ttc teg ggg tga ccagggcagt Asn Phe ser Giy

155

635

683

731

780

-40CZ 305800 B6 tgctggaagt tcagggcaac tatcttcaaa aagggcttag ctggttccct tctctgctga840 ggaatgtcat tgtagagtca ccatgctgtg acagagagca taaactgctc aggaaagaac900 tacgtctgcc ccctgtgggt cctagagctc cgttgaatgt ttatttctta cacctttctc960 caccggtgcc taggatccag gacacatcag ccacgagtta acagaactct atgcaagatg1020 ctctttccta caggaaattt ctttgataaa ttgacctatg gaggtgatac attttctgat1080 gacatttttg tgatgctttg gtaaacgtat ttattactcg ggtttgtaga ctgtgtaatt 1140 taataaacca acactcacac tttg1164 <210> 12 <211> 156 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12

Met val Asp Val Leu Gly Gly Arg Arg Leu val Thr Arg Glu Gly Thr 15 1015

Val val Glu Ala Glu val Ala Leu Gin Asn Lys val Val Ala Leu Tyr 20 2530

Phe Ala Ala Gly Arg cys Ser Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu 35 4045 cys Asp Phe Tyr Thr Glu Leu val Ser Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro 50 5560

Phe Cílu val val Phe Val Ser Ala Asp Gly ser Ala Glu Glu Met Leu 65 70 7580

Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly ser Trp Leu Ala Leu Pro Phe His 85 9095

Asp Pro Tyr Arg His Glu

Leu

Lys Lys Arg Tyr Glu lie Thr Ala lie

105HO pro Lys Leu val 115

Gly Arg Lys Gin val He Lys Gin Asn Gly Ala Val lie Thr Asn Lys 120125

He Arg Glu Arg Gly Leu Ala cys Phe Gin Asn Trp 135140 val Glu Ala Ala Asp val phe Gin Asn Phe ser Gly 145 150155

-41 CZ 305800 B6 <210> 13 <211> 1472 <212> DMA <213> Homo sapiens <22O>

<221> COS <222> (331)..(738) <223>

<400> 13 gtgtgggcgg ggcgcagttg ggggagggtg cagagacctg agggcttgag gttgcctggc60 tggccccgct cccagaggcg ggtgccgcgc tgtcgcccag gtatctgggg tctctggtgt120 ctgagtgtct cattgtcggc gcgaacacaa ttgctccagc cacaggcgag gcctggccaa180 ggtgtgggcg catctagggc aggtcttgag aggtccagcg cccggtggtg cggacagagg240 cggggcaccg cggcgctcgc cgccgcctcc ccgcaggtga tcatcctcct gcaggtgtcc300 tcgggtctca ggtggctgcg tgtctgcgcc atg gtt gac att ctg ggc gag egg 354 Met val Asp lie Leu Gly Glu Arg cac ctg His Leu cag aac Gin Asn 25 age ege Ser Arg gtg ace tgt aag val Thr cys Lys gee gag Ala Glu aag gtg gtg gca Lys val val Ala 30 gac ttc acg ccg Asp Phe Thr Pro 45 geg egg egg ccc Ala Arg Arg Pro 60 ggc geg acg gtg gag gee gag geg geg ctg

Gly Ala Thr val Glu Ala Glu Ala Ala Leu

1520 ctg tac ttc geg geg gee egg tgc gegccg

Leu Tyr Phe Ala Ala Ala Arg cys AlaPro

3540 ctg etc tgc gac ttc tat acg geg ctggtg

Leu Leu cys Asp Phe Tyr Thr Ala LeuVai

5055 geg ccc ttc gaa gtg gtc ttc gtg teagee

Ala Pro Phe Glu val val phe Val SerAla

6570

402

450

498

546 gac ggc age tgc cag gag atg ctg gac ttc atg ege gag ctg cat ggc Asp Gly ser cys Gin Glu Met Leu Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly 75 8085 gee tgg ctg geg ctg ccc ttc cac gac ccc tac egg caa egg agtetc

Ala Trp Leu Ala Leu Pro Phe His Asp Pro Tyr Arg Gin Arg SerLeu

95100 get ctg ttg ccc agg ctg gag tgc agt ggc gtg ate tta get cactgc

Ala Leu Leu Pro Arg Leu Glu cys Ser Gly val lie Leu Ala HisCys

105 HO 115120 aac ett tgc etc ctg ggt tea agt gat tet eta gee tta gee teetga

Asn Leu cys Leu Leu Giy Ser ser Asp ser Leu Ala Leu Ala ser

125 130135

594

642

690

738

-42CL 305800 B6 gcatctggga ctacagccat tgctgtgaat ggacactccg agagtgcagc tgttctcccc tctgtgctca ttaacaatgt gctgtgacca tacccgaaag aaaggaaaag gaagccagta attgcagcac tgttcacaac agccaagatt gaatggataa agaaaacgtg gtacatatac atgagattct gtcatttgca ataatataga taagccaggc acagaaagac aaacatcaca caaaacaatt gaactcttgg acatagagag aaagtggggt tgggaggaag gtgggaatgg ataagaccta atatttgata gcacaacagt catttaaaaa taactataat tgcattgttt aaaaaaaaaa aaaa tacgtgaggg aaagatattg aagaggagtt ccgcaccatc cgtgtcctgc attctgcgag tgtgactcag caatcctgct gctgggtata tattgaagag gtatctgcac ccccatgtťt tggaagcaac ctaagtgtcc atcaacagat acaatggagt actcttcagc cattaaaaaa tggaaaagga ggcccttatg tgaagtgaaa tgttctcact tatttgtggg atctaatgat tagaaggttg gttaccagaa gctggaaagg ttaataggta caaaaaaata caaagaataa gtgactactg tcaataatca tttaattgta gtaacacaaa agataaatgc ttgaggagaa

798

858

918

978

1038

1098

1158

1218

1278

1338

1398

1458

1472 <210> 14 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Met Val Asp lie Leu Gly Glu Arg His Leu val Thr cys Lys Gly Ala

5 1015

Thr val Glu Ala Glu Ala Ala Leu Gin Asn Lys val val Ala Leu Tyr

2530

Phe Ala Ala Ala Arg cys Ala pro ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu 35 4045

-43 CZ 305800 B6 cys Asp Phe Tyr Thr Ala Leu Val Ala Glu Ala 5055

Arg Arg Pro Ala Pro 60

Phe Glu val val Phe Val Ser Ala Asp Gly Ser cys Gin 65 7075

Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ala Trp Leu Ala Leu 8590

Asp Pro Tyr Arg Gin Arg ser Leu Ala Leu Leu Pro Arg

Ser Gly Val lie Leu Ala His Cys Asn Leu cys Leu Leu

115 120125

Glu Met Leu 80

Pro Phe His 95

Leu Glu cys 110

Gly Ser ser

Asp ser Leu Ala Leu Ala ser

130135 <210> 15 <211> 702 <212> DNA <213> Mus museu!us <400> 15 atcggatcct ctctgggtcc ccagctcctt gcatactgct accatggcat ctctcttctc 60 tggacgcatc ttgatcagga acaacagcga ccaggatgaa gtggagacag aggcagagct 120 gageegtagg ttagagaatc gtctggtgtt gctgttcttc ggcgccggcg cctgtcccca 180 gtgccaggcc ttgccccagt cctcaaagac ttcttcgtgc ggctcactga cgagttctac 240 gtgctgcggg cagcacagct ggccctggtc tatgtgtccc aggaccctac agaggagcaa 300 caggacctct tcctcaggga catgeetgaa aaatggctct tcctgccgtc ccactgatga 360 aetgaggagg tgaggcccca gggaagacca gggagggctt cctggagaag gcatttccct 420 ggaggtttac tgtcctggta ctacttgtgc actaaagagg tattcctcca caccaaccac 480 aggcgacaac aacacacaag aggtgtccca tccgctcttc catcacagcc cactgacgcc 540 agacagcatc gcgacgctca cggctcagaa aaacacaggt agtctcacag gcctgccatc 600 etaataetgg ccaccctgag cacaagagcg atggctacaa gcctcaaggc tagaatetaa 660 aaccacgagg tggggaccgt aggccccact ccccgggagc gc 702

-44CZ 305800 B6 <210> 16 <2U> 387 <212> DMA <213> Rattus norvegicus <400> 16 cggccgctta attaagacgg atccccgact acgtagtcgg gaattcggca cgaggggccg60 catcttgatc aggaacaaca gcgaccagga tgaagtggag acagaggcag agctgagccg120 ccggttagag aatcgtcttg tgctactgtt cttcggtgct ggggcctgtc cccagtgcca180 ggccttcgcc ccagtcctca aagacttctt cgtgcggctc actgatgagt tctacgtgct240 acgggcagca cagctggccc tggtctatgt gtcccaggac cctacagagg agcaacagga300 cctgttcctc cgggacatgc ctgaaaagtg gctcttcctg ccgttccatg atgacctgag360 gagagacctc gggcgccagt tctccgt387 <210> 17 <211> 759 <212> DNA <213> Mus musculus <40Q> 17 cagctccttg catactgcta ccatggcatc tctcttctct ggacgcatct tgatcaggaa60 caacagcgac caggatgaag tggagacaga ggcagagctg agccgtaggt tagagaatcg120 tctggtgtgc tgttcttcgg cgccggcgcc tgtccccagt gccaggcctt gccccagtcc180 tcaaagactt cttcgtgcgg ctcactgacg agttctacgt gctgcgggca gcacagctgg 240 .

ccctggtcta tgtgtcccag gaccctácag aggagcaaca ggacctcttc ctcagggaca300 tgcctgaaaa atggctcttc ctgccgttcc atgatgaact gaggagggac ctcgggcgcc360 agttctctgt ccgtcaactg ccagcggttg tggtacttaa gcctggtggg gacgtgctga420 caagcgacgc cacggaggag atccagcgtc tgggacccgc ctgctttgcc aactggcagg480 aggccgcaga gctcctggac cgcagcttcc tgcaaccgga ggatttggat gagcctgcgc540 ggcgcagcat caccgagcct ctgcgccgtc gcaagtaccg agtagaccgg gatgtcggcg600 ggagcggggc gaaacggcgc gactctggtg aaccccaggg ggacgcgggt acaagggcgg660 agctctggtg actcccaggg taggagtggg gaccggagct ctggtgacac caaagtaccg720 gtgcacgacc gaggttgatg accctcccga aggaaccgg759

-45CZ 305800 B6 <210> 18 <211> 443 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> různé vlastnosti <222> (46)..(46) <223> jakýkoliv nukleotid <400> 18 acgaggtcaa ccttggctac acagggagtc tgaggacagc atgggntaca agaaaccctc60 tctcaaaacc aaacaaggcc tggcagtact agtgcacttg ggaggcagag gaacaacagc120 gaccaggatg aagtggagac agaggcagag ctgagccgcc ggttagagaa tcgtcttgtg180 ctactgttct tcggtgctgg ggcctgtccc cagtgccagg ccttcgcccc agtcctcaaa240 gacttcttcg tgcggctcac tgatgagttc tacgtgctac gggcagcaca gctggccctg300 gtctatgtgt cccaggaccc tacagaggag caacaggacc tgttcctccg ggacatgcct360 gaaaagtggc tcttcctgcc gttccatgat gacctgagga gtaataaaaa ttagaggttg 420 tggctcaaaa aaaaaaaaaa aaa443 <210> 19 <2U> 889 <212> DNA <213> Homo sapiens

-46CL 305800 B6 <400> 19 acgccgcgct gtccccagca cccaacccag gttaccatgg cctccctgtt ctctggccgc60 atcctgatcc gcaacaatag cgaccaggac gagctggata cggaggctga ggtcagtcgc120 aggctggaga accggctggt gctgctgttc tttggtgctg gggcttgtcc acagtgccag180 gccttcgtgc ccatcctcaa ggacttcttc gtgcggctca cagatgagtt ctatgtactg240 cgggcggctc agctggccct ggtgtacgtg tcccaggact ccacggagga gcagcaggac300 ctgttcctca aggacatgcc aaagaaatgg cttttcctgc cctttgagga tgatctgagg360 agggacctcg ggcgccagtt ctcagtggag cgcctgccgg cggtcgtggt gctcaagccg420 gacggggacg tgctcactcg cgacggcgcc gacgagatcc agcgcctggg caccgcctgc480 ttcgccaact ggcaggaggc ggccgaggtg ctggaccgca acttccagct gccagaggac540 ctggaggacc aggagccacg gagcctcacc gagtgcctgc gccgccacaa gtaccgcgtg600 gaaaaggcgg cgcgaggcgg cgcgacccgg gggaggggct ggggacggag gccggggccc660 sgggggctgt actgaccgct gggtggagca gagggagggg gattggtgga agaacaacaa720 ccacacgcag ccagcaccag gtatcccgac taggggagac agggcgaaga cctgacccaa780 agcacaacca ccggggacac taaacgactc aactcaatcc tgtgggcacc aggacaccgc840 aaaaaaaaac aaaaaaagca aaatgcaaaa aaagacagga catacgacg889 <210> 20 <2U> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tgtcctcggg tctcaggtgg ctgcgtgtct gcgccatggt tgacattctg ggcgagcggc 60 acctggtgac ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg 120 tggcactgta cttcgcggcg gcccggtgcg cgccgagccg cgacttcacg ccgctgctct 180 gcgacttcta tacggcgctg gtggccgagg cgcggcggcc cgcgcccttc gaagtggtct 240 tcgtgtcagc cgacggcagc tcccaggaga tgctggactt catgcgcgag ctgcatggcg 300 cctggctggc gctgcccttc cacgacccct accggcacca ttgctgtg 348 <210> 21 <211> 340 <212> DNA <213> Homo sapiens

-47CZ 305800 B6 <400> 21 tgtcctcggg tctcaggtgg ctgcgtgtct gcgccatggt tgacattctg ggcgagcggc60 acctggtgac ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg120 tggcactgta cttcgcggcg gccggtgcgc gccgagccgc gattcacgcc gctgctctgc180 gacttctata cggcgctggt ggccgagcgc ggggccgcgc cttcgaagtg gtcttcgtgt240 cagccgacgg cagctcccag gagatgctgg acttcatgcg cgagctgatg gcgcctggct300 ggcgctgcct tccacgaccc ctaccggcac agccggagcc340 <210> 22 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tgtcctcggg tctcaggtgg ctgcgtgtct gcgccatggt tgacattctg ggcgagcggc60 acctggtgac ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg 120 tggcactgta cttcgcggcg gcccggtgcg cgccgagccg cgacttcacg ccgctgctct180 gcgacttcta tacggcgctg gtggccgagg cgcggcggcc cgcgcccttc gaagtggtct240 tcgtgtcagc cgacggcagc tgccaggaga tgctggactt catgcgcgag ctgcatggcg300 cctggctggc gctgcccttc cacgaaccct accggcaacg gagtctcg348 <210> 23 <211> 350 <212> DNA <213> Homo sapiens

-48CZ 305800 B6 <40Q> 23 tgtcctcggg tctcaggtgg ctgcgtgtct gcgccatggt tgacattctg ggcgagcggc60 acctggtgac ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg120 tggcactgta cttcgcggcg gcccggtgcg cgccgagccg cgacttcacg ccgctgctct180 gcgacttcta tacggcgctg gtggccgagg cgcggcggcc cgcgcccttc gaagtggtct240 tcgtgtcagc cgacggcagc tgccaggaga tgcttggact tcatgcgcga gctgcattgc300 gcctggcttg gcgctgccct tccacgaccc ctaccggcaa cggagtctcg350 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Primer <400> 24 tctatgtgtc ccaggaccct acag 24 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> primer <4OO> 25 tttatgcaca agtagtacca ggacag 26 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Umělá sekvence

-49CZ 305800 B6 <220>

<223> Primer <400> 26 cgggatccat ggcatctctc ttctctggac gc 32 <210> 27 <2H> 31 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Primer <400> 27 ggaattctca cctcctcagt tcatcatgga a 31 <210> 28 <211> 50 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Adaptérová sekvence <400> 28 tgttaccaat ctgaagtggg agcggccgac aatttttttt tttttttttt 50 <210> 29 <211> 14 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Adaptérová sekvence <400> 29 aattcggcac gagg 14 <210> 30 <211> 10 <212> DNA

-50CZ 305800 B6 <213> Umělá sekvence <220>

<223> Adaptérová sekvence <400> 30 cctcgtgccg <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> primer <400> 31 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> primer <400> 32 ctattacgtc aagcctgtag cc 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Primer <400> 33 catcctcatc tttcttccct tc 22 <210> 34 <2H> 22 <212> DNA

-51 CZ 305800 B6 <213> Umělá sekvence <400> 34 gccagcgtn tctgcctttt ac 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 35 aagccctgcc tgctctaaca tc 22

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství polypeptidu zvoleného ze souboru zahrnujícího SEKV. ID. č. 2, SEKV. ID. č. 4, SEKV. ID. č. 6, SEKV. ID. č. 8, SEKV. ID. č. 10, SEKV. ID. č. 12 a SEKV. ID. č. 14 a farmaceuticky přijatelný nosič.
2. 2. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství nukleové kyseliny zvolené ze souboru sestávajícího ze SEKV. ID. č. 1 nebo její kódující oblasti, SEKV. ID. č. 3 nebo její kódující oblasti, SEKV. ID. č. 5 nebo její kódující oblasti, SEKV. ID. č. 7 nebo její kódující oblasti, SEKV. ID. č. 9 nebo její kódující oblasti a farmaceuticky přijatelný nosič.
3. 3. Způsob diagnostiky retinální dystrofie u člověka, vyznačený tím, že zahrnuje:

   detekci in vitro nebo ex vivo transkripce mediátorové RNA transkribované z DNA kódující RDCVF1 nebo RDCVF2 cDNA, uvedené v SEKV. ID. č. 5 nebo její kódující oblasti, SEKV. ID. č. 7 nebo její kódující oblasti nebo SEKV. ID. č. 13 nebo její kódující oblasti v oku člověka, přičemž snížená transkripce vzhledem ke transkripci v oku individua netrpícího retinální dystrofií znamená, že uvedený člověk je diagnostikován jako trpící retinální dystrofií, nebo alternativně zahrnuje měření in vitro nebo ex vivo množství polypeptidu RDCVF1 nebo RDCVF2 obsahujícího aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEKV. ID. č. 6, SEKV. ID. č. 8 nebo SEKV. ID. č. 14 v tyčinkách oční sítnice člověka, přičemž přítomnost sníženého množství uvedeného polypeptidu vzhledem k množství polypeptidu v normální oční tkáni znamená, že uvedený člověk je diagnostikován jako trpící retinální dystrofií.
4. 4. Rekombinantní polypeptid sestávající z aminokyselinové sekvence uvedené v SEKV. ID. č. 2 nebo z rekombinantního polypeptidu kódovaného nukleotidovou sekvencí SEKV. ID. č. 1 nebo její kódující oblastí, nebo sestávající z aminokyselinové sekvence uvedené v SEKV. ID. č. 4 nebo z rekombinantního polypeptidu kódovaného nukleotidovou sekvencí SEKV. ID. č. 3 nebo její kódující oblastí.

   -52CZ 305800 B6
5. 5. Způsob produkce RDCVF polypeptidu podle nároku 4, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky obsahující inkorporovaný expresní vektor obsahující exogenněodvozený polynukleotid kódující uvedený polypeptid za podmínek dostatečných k expresi uvedeného polypeptidu v hostitelské buňce, čímž dojde k produkci exprimovaného polypeptidu, a izolaci polypeptidu produkovaného buňkou.
6. 6. Rekombinantní protilátka nebo její fragment, který specificky váže aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEKV. ID. č. 2, SEKV. ID. č. 4, SEKV. ID. č. 6, SEKV. ID. č. 8, SEKY. ID. č. 10, SEKV. ID. č. 12 nebo SEKV. ID. č. 14.
7. 7. Fragment protilátky podle nároku 6, kterým je fragment Fab nebo F(ab')2.

   8, Rekombinantní protilátka podle nároku 6, kterou je monoklonální protilátka.

   15 výkresů