KR100913258B1 - 질환-관련 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 망막 이영양증, 노화-관련 황반 변성, 바르데트-비델 증후군, 바쎈-코른츠바이히 증후군, 베스트병, 맥락막 결여, 맥락막 위축, 선천성 흑내장, 레프선 증후군, 스타가르트 질환 및 어셔 증후군의 초기 진단, 모니터링 및 치료를 위한 조성물 및 방법을 개시하고 있다. 구체적으로, 본 발명은 망막 이영양증 및 노화-관련 황반 변성과 같은 망막 이영양증 등에 걸린 대상체에서 정상 개체에 비해 차등적으로 전사 및 발현되는, 2Rdcvf1이라 명명된 단백질; 이 단백질을 인식하는 항체; 및 그러한 증상의 진단 방법에 관한 것이다.

망막 이영양증, 간상세포, 원추세포, 폴리펩티드, 뉴클레오티드

Description

질환-관련 단백질 {Disease-Associated Protein}

본 발명은 망막 퇴행성 질환의 검출 및 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 원추세포가 퇴화되지 않도록 보호하는 단백질, 그러한 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 이 단백질을 인식하는 항체, 및 망막 퇴행성 질환의 진단 방법에 관한 것이다.

광수용체는 망막 뉴런의 특별한 서브세트로서 시각을 담당한다. 광수용체는 망막의 광반응성 세포인 간상세포와 원추세포로 구성되어 있다. 간상세포와 원추세포 각각은 광변환 기구를 보유하는, 외부 세그먼트로 언급되는 특별한 섬모를 만들어 낸다. 간상세포는 빛을 흡수하는 특별한 시각 색소인 로돕신 (rhodopsin)을 함유한다. 인간에게는 3가지 종류의 원추세포가 존재하며, 이들은 청색 원추세포 색소, 녹색 원추세포 색소 및 적색 원추세포 색소라는 상이한 시각 색소를 발현하는 특징이 있다. 시각 색소 단백질의 각 유형은 상이한 파장의 빛을 최대로 흡수한다. 간상세포 로돕신은 암순응 시각 (scotopic vision, 어두운 빛)을 매개하는 반면, 원추세포 색소는 명순응 시각 (photopic vision, 밝은 빛)을 담당한다. 적색, 청색 및 녹색 색소는 또한 인간에서의 칼라 시각의 기초를 형성한다. 간상세포 및 원추세포의 시각 색소는 빛에 반응하여 출력 (output) 세포인 간상 2극성 뉴 런에서 활동 전위를 생성하고, 그 후에 활동 전위는 망막 신경절 뉴런에 의해 전달되어 시각 피질에서 시각 자극을 생성한다.

인간에 있어서, 다수의 망막 질환이 광수용체의 점진적 퇴화 및 그에 따른 광수용체의 사멸과 관련되어 있고, 그 결과 실명을 초래하게 된다. 유전적인 망막 이영양증 (예를 들어, 망막색소변성증), 노화-관련 황반 변성 및 기타 황반병증, 또는 망막 박리 등에 의한 광수용체의 퇴화는 모두 광수용체 외부 세그먼트가 점전적으로 위축되고 그 기능이 소실된다는 특징이 있다. 또한, 광수용체의 사멸 또는 광수용체 기능 소실은 망막 이영양증 환자에서 제2 망막 뉴런 (간상 2극성 세포 및 수평 세포)의 부분적 구심로차단 (deafferentation)을 초래함으로써, 광수용체에 의해 생성된 전기 신호의 전체적 전파 효율을 감소시킨다. 광수용체 퇴화에 따른 제2 신경교 및 색소 상피 변화는 혈류 변화를 초래하여 허혈 및 신경교증을 유발한다. 광수용체를 세포 사멸로부터 보호하고(하거나) 기능부전성 (위축성 또는 이영양성) 광수용체의 기능을 복구시킬 수 있는 영양성 인자는 그러한 증상의 처치용 요법에 유용할 수 있다.

이러한 증상들의 진전에서는 2가지 종류의 광수용체가 순차적으로 소실되는 경향이 있다. 즉, 우선 유전적 또는 환경적 손상이나 미지의 손상에 의한 직접적인 결과로써 간상세포가 소실되어 야맹증 및 시야 감소를 초래한 후, 필연적으로 원추세포가 소실되어 완전한 실명을 초래한다. 따라서, 원추세포는 1차적 손상을 나타내지 않기 때문에 간접적으로 사멸한다.

망막 이영양증에 관여하는 모든 유전자가 아직 동정되지는 않았다. 그러한 유전자들의 동정은 질환의 진단 및 효과적인 요법의 동정 둘 다를 가능하게 할 것이다.

<발명의 개요>

본 발명은 일반적으로 신규 유전자 군인 간상세포-유래 원추세포 생존능 인자 (Rod-derived Cone Viability Factor; Rdcvf)에 관한 것이다. 제1 측면에서, 본 발명은 서열 2 또는 서열 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 그러한 폴리펩티드 또는 그의 단편은, 망막 이영양증에 걸리지 않은 개체의 안구에서보다 망막 이영양증 환자의 안구에서 훨씬 더 적은 양으로 발견된다. 서열 2 또는 서열 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드의 단편은 약 5 내지 10개 아미노산, 바람직하게는 약 10 내지 약 20개 아미노산, 보다 바람직하게는 약 20 내지 약 100개 아미노산, 가장 바람직하게는 약 20 내지 약 50개 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 포함할 것이다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, 포유동물 기원의 (특히, 마우스 또는 인간 기원의) 신규 폴리펩티드 뿐만 아니라, 생물학적, 진단학적 또는 치료학적으로 유용한 그의 단편, 변이체 및 유도체, 이들 단편의 변이체 및 유도체, 및 상기한 것들의 유사체가 제공된다. 또한, 서열 2 또는 서열 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드, 예를 들어 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 본 발명의 범위 내에 있다.

제2 측면에서, 본 발명은 서열 1 또는 서열 3에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 또한, 서열 1 또는 서열 3에 기재된 뉴클 레오티드 서열을 갖는 핵산과 실질적으로 유사한 핵산, 예를 들어 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11 또는 서열 13에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산도 본 발명의 범위 내에 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14에 기재된 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 예를 들어 서열 1의 뉴클레오티드 45-374, 서열 3의 뉴클레오티드 26-676, 서열 5의 뉴클레오티드 24-353, 서열 7의 뉴클레오티드 48-686, 서열 9의 뉴클레오티드 265-570, 서열 11의 뉴클레오티드 300-770 또는 서열 13의 뉴클레오티드 331-738을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 DNA는 서열 1 또는 서열 3에 기재된 DNA를 포함하는 벡터 분자의 형태이다.

본 발명의 제3 측면은 포유동물 생물체 (바람직하게는 인간)의 안구에서 Rdcvf1 또는 Rdcvf2를 코딩하는 DNA로부터 전사된 전령 RNA의 전사 감소 여부를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 그러한 전사의 감소는 생물체의 망막 이영양증 또는 병리적 노화 (ARMD)의 증상을 나타내는 것인, 인간에서 망막 이영양증을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 분석 측면에서의 다른 실시양태는 망막 이영양증에 걸린 것으로 의심되는 인간의 안구에서 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 폴리펩티드 또는 그의 단편의 양을 측정하는 것을 필요로 하며, 여기서 상기 폴리펩티드 또는 그의 단편의 양이 망막 이영양증에 걸리지 않은 개체의 안구에서 측정된 양에 비해 감소된 것은 상기 인간이 망막 이영양증에 걸렸다는 증상을 나타내는 것인, 포유동물 생물체 (바람직하게는 인간)에서 망막 이영양증을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 따라, Rdcvf1 또는 Rdcvf2 유전자의 전사를 조절하는 안티센스 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 다른 실시양태에서는 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 유전자의 전사를 조절할 수 있는 이중 가닥 RNA가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에서는 상기 언급한 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 변이체 및 유도체, 상기 변이체 및 유도체의 단편, 및 상기한 것들의 유사체가 제공된다. 본 발명의 이러한 측면의 바람직한 실시양태에서는, 외부에서 유래된 Rdcvf1 또는 Rdcvf2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터가 혼입된 숙주 세포를, 상기 숙주 세포에서 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 폴리펩티드의 발현에 충분한 조건 하에서 배양한 후, 발현된 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 상기 언급한 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 폴리펩티드의 생산 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 언급한 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 이용하는, 특히 연구, 생물학, 임상 및 치료 목적으로 이용하는 제품, 조성물, 공정 및 방법이 제공된다.

본 발명의 부가적인 바람직한 측면에서, 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서열 8에 기재된 아미노산 서열 (즉, Rdcvf1), 또는 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 기재된 아미노산 서열 (즉, Rdcvf2)을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편이 제공된다. 이와 관련한 특히 바람직한 측면에서, 항체는 포유동물 (바람직하게는 마우스, 특히 인간)의 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 폴리펩티드, 또는 그러한 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 폴리펩티드의 일부에 대해 매우 선택성이 높다. 관련 측면에서, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 기재된 아미노산 서열의 단편 또는 일부에 결합하는 항체 또는 그의 단편이 제공된다.

다른 측면에서, 대상체에게 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 기재된 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 단백질 또는 관련 단백질이나 그의 단편 또는 일부를 치료 유효량으로 투여함으로써, 상기 대상체에서 Rdcvf1 또는 Rdcvf2의 유전자 발현 변화 (예를 들어, 안구에서 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 폴리펩티드의 존재량 감소)에 의해 매개되거나 이와 관련된 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 또한, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 항체, 또는 그의 단편 또는 일부를 면역분석법에 이용하는 것을 포함하는, 대상체에서 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 유전자 발현의 감소 또는 RDCVF1 또는 RDCVF2 폴리펩티드의 존재량 감소와 관련된 질환 또는 증상을 진단하는 방법이 제공된다.

또다른 측면에서 본 발명은, 시험관내에서 증식할 수 있고, 배양시에 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 생산할 수 있으며, 마우스 또는 인간의 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 전사 조절 서열 이외의 전사 조절 DNA 서열 (여기서, 전사 조절 서열은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA의 전사를 조절함)을 함유하는 세포 (바람직하게는 척추동물 세포)를 제공한다.

관련 측면에서, 본 발명은 외부에서 유래된 Rdcvf1 또는 Rdcvf2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터가 혼입된 숙주 세포를, 상기 숙주 세포에서 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 폴리펩티드의 발현에 충분한 조건 하에서 배양함으로써 발현된 폴리펩티드의 생산을 유발하고, 발현된 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, Rdcvf1 또는 Rdcvf2 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 측면에서, 환자에서 유래한 신체 조직 샘플에서 비정상적인 (예를 들어, 정상 미만의) Rdcvf1 또는 Rdcvf2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 그의 단편의 발현을 검출하는 데 필수적인 성분들을 포함하는 분석 방법 및 킷트가 제공되며, 상기 킷트는 예를 들어 Rdcvf1 또는 Rdcvf2에 결합하는 항체, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 그러한 킷트는 또한 킷트 성분들을 사용하는 절차에 대한 상세한 지침도 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 폴리펩티드의, 인간 또는 동물 신체의 치료에 있어서의 용도에 관한 것이다. 관련 측면은 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 폴리펩티드 또는 그의 단편, Rdcvf1 또는 Rdcvf2를 코딩하는 뉴클레오티드 또는 그의 단편, 또는 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 또는 그의 단편에 결합하는 항체의, 망막 이영양증 치료용 의약 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14의 군으로부터 선택된 폴리펩티드, 및 임의로는 제약상 허용되는 담체를 포함하는 망막보호제를 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 폴리펩티드 또는 그의 단편, 또는 Rdcvf1 또는 Rdcvf2를 코딩하는 뉴클레오 티드 또는 그의 단편을 포함하는, 망막 이영양증 치료용 제약 조성물을 제공한다. 다른 관련 측면에서, 본 발명은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14의 군으로부터 선택된 치료 유효량의 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

관련 측면에서, 본 발명은 망막 이영양증의 치료를 필요로 하는 대상체에게 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14의 군으로부터 선택된 치료 유효량의 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 투여하는 것을 포함하는, 망막 이영양증을 치료하는 방법을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 Rdcvf1 또는 Rdcvf2에 결합하고(하거나) Rdcvf1 또는 Rdcvf2의 활성을 조절할 수 있는 분자, 또는 Rdcvf1 또는 Rdcvf2의 전사 또는 번역을 조절할 수 있는 핵산 서열에 결합할 수 있는 분자를 동정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,541,070호, 제5,567,317호, 제5,593,853호, 제5,670,326호, 제5,679,582호, 제5,856,083호, 제5,858,657호, 제5,866,341호, 제5,876,946호, 제5,989,814호, 제6,010,861호, 제6,020,141호, 제6,030,779호 및 제6,043,024호에 개시되어 있으며, 이들 문헌은 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 이러한 방법에 의해 동정된 분자들도 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체의 하나 이상의 조직에 본 발명의 핵산을 도입하는 방법에 관한 것이며, 상기 도입의 결과 상기 핵산에 의해 코딩된 하나 이상의 단백질은 상기 조직 내의 세포에 의해 발현 및(또는) 분 비된다.

다른 측면에서, 본 발명은 Rdcvf1 또는 Rdcvf2와 함께 배양된 이식용 광수용체 세포를 수득하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적, 특징, 이점 및 측면들은 하기 설명으로부터 당업자에게 분명해질 것이다. 그러나, 하기 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내는 것이며, 단지 예시의 목적으로 제시된 것임을 이해해야 한다. 당업자에게는 하기 설명 내용 및 본 개시 내용의 다른 부분으로부터 개시된 발명의 정신 및 범위 내의 다양한 변화 및 변형이 가능함이 분명해질 것이다.

도 1은 발현용으로 클로닝된 마우스 Rdcvf1의 뉴클레오티드 서열 및 RdCVF1의 아미노산 서열이다.

도 2는 마우스 Rdcvf1L의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이다.

도 3은 인간 Rdcvf1 및 인간 Rdcvf1의 아미노산 서열이다.

도 4는 인간 Rdcvf1L의 뉴클레오티드 서열 및 인간 Rdcvf1L의 아미노산 서열이다.

도 5는 마우스 Rdcvf2의 뉴클레오티드 서열 및 마우스 Rdcvf2의 아미노산이다.

도 6은 마우스 Rdcvf2L의 뉴클레오티드 서열 및 마우스 Rdcvf2L의 아미노산이다.

도 7은 인간 Rdcvf2의 뉴클레오티드 서열 및 인간 Rdcvf2의 아미노산 서열이 다.

도 8은 짧은 형태의 Rdcvf (서열 2, 서열 6, 서열 10 및 서열 14) 및 긴 형태의 Rdcvf (서열 4, 서열 8, 서열 12 및 서열 14)의 아미노산 정렬을 나타낸다.

도 9는 GST-Rdcvf1에 대한 프라이머를 나타낸다.

도 10은 RDCFV1/RDCVF2의 다중 정렬이다.

도 11은 마우스와 인간의 RDCVF2를 비교한 것이다.

도 12는 마우스 Rdcvf2를 EST 클론인 be552141, bi517442, bg707818 및 bi603812와 다중 정렬시킨 것이다.

도 13은 Rdcvf1을 EST 클론인 bg299078, ai716631, bg294111, be108041 및 bg395178과 다중 정렬시킨 것이다.

도 14는 Rdcvf1과 매치되도록 보정된 EST 서열 bg299078이다.

도 15는 Rdcvf1L과 매치되도록 보정된 EST 서열 bg294111이다.

도 16은 5주령 C57BL/6@N 마우스의 망막 (녹색) 및 5주령 C3H/HE@N 마우스의 망막 (적색)에서 간상세포 어레스틴 (arrestin) (A) 및 RdCVF1 (B)의 발현에 대한 실시간 RT-PCR 분석을 나타낸다.

도 17은 Rdcvf2가 간상세포에 의존적인 방식으로 발현되며 CNS의 다른 부분에서 발현됨을 보여주는 RT-PCR 분석이다.

도 18은 RdCVF1이 간상세포에 의존적인 방식으로 발현됨을 보여주는 PCR 분석이다.

본원에 인용된 모든 특허 출원, 특허 및 참고문헌은 각각의 거명을 통해 그 전문에 본원에 참고로 포함된다.

본 발명을 실시함에 있어, 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 분야의 통상적인 많은 기술이 이용된다. 이들 기술은 공지된 것들이며, 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.)], [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.], [DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.)], [Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.)], [Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins)], [Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.)], [Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.)], [Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press)], [Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning, the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)], [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory)] 및 [Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds.)]에 설명되어 있다.

본원에 사용된 "차등적으로 발현되는 유전자"는 (a) 본원에 개시된 DNA 서열들 중 하나 이상을 함유하는 유전자 (예를 들어, 도 1 및 서열 1에 기재된 것, 또는 도 2 및 서열 3에 기재된 것); (b) 본원에 개시된 DNA 서열들에 의해 코딩된 아 미노산 서열 (예를 들어, 도 1 및 서열 2에 기재된 것, 또는 도 2 및 서열 4에 기재된 것)을 코딩하는 임의의 DNA 서열; 또는 (c) 본원에 개시된 코딩 서열들과 실질적으로 유사한 임의의 DNA 서열을 의미한다.

가장 넓은 의미로, 뉴클레오티드 서열과 관련하여 본원에 사용되는 용어 "실질적으로 유사한"은 특정 뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열에 상응함을 의미하며, 여기서 상응하는 서열은 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 구조 및 기능을 갖는 폴리펩티드 (예를 들어, 폴리펩티드의 기능에 영향을 미치지 않는 아미노산의 변화만이 발생함)를 코딩한다. 바람직하게는, 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열은 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 코딩한다. 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열과 기준 서열 사이의 동일성 (％)은, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 보다 더 바람직하게는 99％ 이상이다. 서열 비교는 스미쓰-워터만 (Simth-Waterman) 서열 정렬 연산법 (예를 들어, 문헌 [Waterman, M.S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman ＆ Hall. London: 1995. ISBN 0-412-99391-0] 또는 인터넷 사이트 (http://www-hto.usc.edu/software/seqaln/index.html) 참조)을 이용하여 수행한다. 로컬에스 (localS) 프로그램 버젼 1.16은 하기 파라미터로 사용한다: 매치 (match): 1, 미스매치 패널티 (mismatch penalty): 0.33, 오픈-갭 (open-gap) 패널티: 2, 확장-갭 (extended-gap) 패널티: 2. 기준 뉴클레오티드 서열과 "실질적으로 유사한" 뉴클 레오티드 서열은, 7％ 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA에서 50℃로 혼성화시켜 2X SSC, 0.1％ SDS에서 50℃로 세척시, 보다 바람직하게는 7％ 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA에서 50℃로 혼성화시켜 1X SSC, 0.1％ SDS에서 50℃로 세척시, 보다 더 바람직하게는 7％ 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA에서 50℃로 혼성화시켜 0.5X SSC, 0.1％ SDS에서 50℃로 세척시, 바람직하게는 7％ 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA에서 50℃로 혼성화시켜 0.1X SSC, 0.1％ SDS에서 50℃로 세척시, 보다 바람직하게는 7％ 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO₄, 1 mM EDTA에서 50℃로 혼성화시켜 0.1X SSC, 0.1％ SDS에서 65℃로 세척시 기준 서열에 혼성화되며, 여전히 기능적으로 동등한 유전자 산물을 코딩한다.

차등적으로 발현되는 본원의 유전자는 안구 조직에서 발현되며, 특히 간상세포에서 생산되지만, 망막 이영양증, 예를 들어 망막색소변성증, 노화-관련 황반 변성, 바르데트-비델 (Bardet-Biedel) 증후군, 바쎈-코른츠바이히 (Bassen-kornzweig) 증후군, 베스트병, 맥락막 결여, 맥락막 위축, 선천성 흑내장, 레프선 (Refsun) 증후군, 스타가르트 (Stargardt) 질환 및 어셔 (Usher) 증후군에 걸린 인간에서는 망막 이영양증에 걸리지 않은 인간의 상응하는 조직에 비해 감소된 양으로 (즉, 적은 양으로) 생산된다. 차등적으로 발현되는 유전자로부터 전사된 전령 RNA, 및 그러한 mRNA로부터 번역된 단백질은 망막 이영양증에 걸리지 않은 인간에 서 발견되는 상응하는 조직의 mRNA 및 단백질의 양에 비해 약 절반 이상의 양만큼, 바람직하게는 약 5배 이상의 양만큼, 보다 바람직하게는 약 10배 이상의 양만큼, 가장 바람직하게는 약 100배 이상의 양만큼 적은 양으로 간상세포 조직에 존재하고(하거나) 그러한 조직에 결합되어 있다. Rdcvf1 또는 Rdcvf2 mRNA의 이러한 전사 감소는 본원에서 "전사의 감소"로 언급된다.

본원에 사용된 "숙주 세포"는, 예를 들어 전기천공법, 인산칼슘 침전법, 미세주입법, 형질전환법 및 바이러스 감염법 등에 의해 세포에 도입된 이종 DNA를 함유하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.

본원에 사용된 "이종"은 "자연상의 기원이 상이한 것"을 의미하거나 자연 상태가 아닌 상태를 의미한다. 예를 들어, 숙주 세포가 다른 생물체 (특히, 다른 종)에서 유래한 DNA 또는 유전자로 형질전환된 경우, 이 유전자는 상기 숙주 세포에 대해 이종이며, 또한 이 유전자를 지닌 숙주 세포의 후손에 대해서도 이종이다. 이와 유사하게, 이종이란 동일한 기원 세포형으로부터 유래하여 동일한 기원 세포형에 삽입되었지만, 자연 상태가 아닌 상태로 존재하는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 카피수가 상이하거나 상이한 조절 인자에 의해 조절됨)을 나타낸다.

벡터 분자는 이종 핵산이 삽입되어 있는 핵산 분자이며, 이는 추후에 적당한 숙주 세포로 도입될 수 있다. 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 복제 기점과, 재조합 DNA가 삽입될 수 있는 하나 이상의 부위를 갖는다. 대체로 벡터는, 벡터를 포함한 세포가 이를 포함하지 않은 세포로부터 선별될 수 있게 하는 편리한 수단을 갖는다 (예를 들어,벡터는 약물 내성 유전자를 코딩함). 통상적인 벡터로는 플라 스미드, 바이러스 게놈, 및 (주로 효모 및 박테리아에서의) "인공 염색체"가 있다.

"플라스미드"는 본원에서 일반적으로 당업자에게 친숙한 표준 명명 규약에 따라, 소문자 p가 앞쪽에 붙어서 명명되고(되거나) 소문자 p 뒤쪽에 대문자 및(또는) 숫자가 붙어서 명명된다. 본원에 개시된 출발 플라스미드는 상업적으로 시판되거나, 제한없이 공공연하게 입수가능하거나, 또는 입수가능한 플라스미드로부터 공지된 절차를 통상적으로 이용하여 작제할 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 많은 플라스미드 및 기타 클로닝 및 발현 벡터는 공지되어 있으며, 당업자에게는 용이하게 입수가능하다. 더욱이, 당업자는 본 발명에 사용하기 적합한 다수의 다른 플라스미드를 작제할 수 있다. 본 발명에 있어서, 그러한 플라스미드 뿐만 아니라 다른 벡터의 특성, 구조 및 용도도 본 개시 내용으로부터 당업자에게 분명해질 것이다.

용어 "단리된"은 자신의 원래 환경 (예를 들어, 자연 발생의 것이라면 자연 환경)으로부터 분리된 물질을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니지만, 자연계에 함께 존재하는 물질의 일부 또는 전부로부터 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 분리된 것이면, 이후에 자연계 내로 다시 도입된다 할지라도 단리된 것이다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고(있거나) 그러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 그러한 벡터 또는 조성물은 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 또한 단리된 것이다.

본원에 사용된 용어 "전사 조절 서열"은 개시 서열, 인핸서 서열 및 프로모 터 서열과 같은 DNA 서열을 의미하며, 이는 자신에게 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 코딩하는 단백질의 전사를 유도하거나, 억제하거나, 또는 다르게 조절한다.

본원에 사용된 "Rdcvf1 전사 조절 서열" 또는 "Rdcvf2 전사 조절 서열"은 포유동물의 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 유전자와 관련하여, 바람직하게는 마우스 또는 인간의 게놈에서 발견되는 Rdcvf2 유전자와 관련하여 정상적으로 발견되는 임의의 전사 조절 서열이다.

본원에 사용된 "비-인간 전사 조절 서열"은 인간 게놈에서 발견되지 않는 임의의 전사 조절 서열을 의미한다.

용어 "폴리펩티드"는 본원에서 용어 "폴리펩티드들" 및 "단백질(들)"과 상호 교환가능하게 사용된다.

본원에 사용된 본 발명 폴리펩티드의 "화학 유도체"는, 정상적으로는 분자의 일부가 아닌 부가의 화학 잔기를 함유하는 본 발명의 폴리펩티드를 의미한다. 그러한 잔기는 분자의 용해도, 흡수도, 생물학적 반감기 등을 향상시킬 수 있다. 이 잔기는 또한 분자의 독성을 감소시킬 수도, 분자의 원치않는 임의 부작용을 제거 또는 감소시킬 수도 있다. 그러한 효과를 매개할 수 있는 잔기는, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980)]에 개시되어 있다.

본원에 사용된 "신경보호제"는 신경 세포가 퇴화되는 것을 예방하거나 퇴화되지 않도록 보호하는 화합물이다. "망막보호제"는 망막 세포가 퇴화되는 것을 예방하거나 퇴화되지 않도록 보호하는 화합물이다.

본 발명은 (1) 서열 1 또는 서열 3에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, (2) 높은 엄격도 조건 하에서 서열 1 또는 서열 3에 기재된 단리된 DNA에 혼성화되는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 및 (3) 상기 (1) 또는 (2)에 혼성화되는 핵산 서열과 같은 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자를 포함한다. 그러한 혼성화 조건은 상기 기재된 바와 같이 고도로 엄격하거나 덜 엄격할 수 있다. 핵산 분자가 데옥시올리고뉴클레오티드 ("올리고")인 경우, 고도로 엄격한 조건은 6X SSC/0.05％ 피로인산나트륨에서, (14개 염기의 올리고인 경우) 37℃, (17개 염기의 올리고인 경우) 48℃, (20개 염기의 올리고인 경우) 55℃ 및 (23개 염기의 올리고인 경우) 60℃로 세척하는 것을 나타낼 수 있다. 다양한 조성의 핵산에 대한 그러한 엄격도 조건의 적합한 범위는 상기 인용된 마니아티스 등 (Maniatis et al.)의 문헌 뿐만 아니라 문헌 [Krause and Aaronson (1991) Methods in Enzymology, 200:546-556]에 기재되어 있다.

이들 핵산 분자는, 예를 들어 표적 유전자의 조절에 유용한 표적 유전자의 안티센스 분자로서 작용하고(하거나) 표적 유전자 핵산 서열의 증폭 반응에 유용한 안타센스 프라이머로서 작용할 수 있다. 또한, 그러한 서열은 리보자임 (ribozyme) 및(또는) 삼중 나선 서열의 일부로서 사용될 수 있으며, 또한 표적 유전자의 조절에 유용할 수 있다. 또한, 그러한 분자는 진단 방법의 성분으로서 사용될 수 있으며, 이 방법에 의해 RdCVF1 또는 RdCVF2 질환-유발 대립유전자의 존재를 검출할 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 상기한 임의의 코딩 서열 (즉, 센스) 및(또는) 이들의 상보 서열 (즉, 안티센스)을 함유하는 벡터; (b) 코딩 서열의 발현을 지시하는 조절 인자와 작동가능하게 결합된 임의의 상기 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터; 및 (c) 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시하는 조절 인자와 작동가능하게 결합된 임의의 상기 코딩 서열을 함유하는, 유전공학적으로 조작된 숙주 세포를 포함한다. 본원에 사용된 조절 인자란 유도가능한 및 유도불가능한 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 (operator), 및 발현을 지시하고 조절하는 것으로 당업자에게 공지된 기타 인자들이 포함되지만, 이것으로 한정되지는 않는다.

본 발명은 본원에 개시된 임의 핵산 서열들의 단편을 포함한다. 전장 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 유전자의 단편을 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 프로브로서 사용하여, 전장 유전자를 단리할 수 있고, 또한 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 유전자와 높은 서열 유사성을 가지며 유사한 생물학적 활성을 가지는 다른 유전자를 단리할 수도 있다. 이러한 유형의 프로브는, 바람직하게는 약 30개 이상의 염기를 가지며, 예를 들어 약 30개 내지 약 50개의 염기, 약 50개 내지 약 100개의 염기, 약 100개 내지 약 200개의 염기, 또는 200개 이상의 염기 (예를 들어, 300개의 염기)를 함유할 수 있다. 또한, 이 프로브를 사용하여 전장 전사체 및 게놈 클론에 상응하는 cDNA 클론, 또는 조절 영역과 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함한 완전한 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 유전자를 함유하는 클론을 동정할 수 있다. 스크리닝의 한 예는, 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하기 위해 공지의 DNA 서열을 사용하거나 도 1 내지 8에 개시된 단리된 서열을 랜덤 프라이밍하여, Rdcvf1 또는 Rdcvf2 유전자의 코딩 영역을 단리하는 것을 포함한다. 본 발명의 유전자에 대해 상보적인 서열 을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 인간 cDNA, 게놈 DNA의 라이브러리를 스크리닝함으로써, 라이브러리의 어떤 클론에 프로브가 혼성화되는지 결정한다.

상기 기재된 유전자 서열 이외에, 예를 들어 다른 종에 존재할 수도 있는 그러한 서열의 오르토로그 (ortholog)도 동정할 수 있으며, 이를 당업계 공지의 분자 생물학 기술에 의해 과도한 실험없이 용이하게 단리할 수도 있다. 또한, 게놈 내의 다른 유전자 좌위 (locus)에 유전자 산물의 하나 이상의 도메인과 매우 상동성인 단백질 (상동체)을 코딩하는 유전자가 존재할 수 있다. 이들 유전자도 또한 유사한 기술을 통해 동정될 수 있다. 오르토로그 또는 상동체의 예는 도 8, 도 10, 도 11, 도 12 또는 도 13에 제공되어 있다.

예를 들어, 발현 및 단리된 유전자 서열은 표지될 수 있으며, 관심있는 생물체로부터 얻은 mRNA를 사용하여 제조된 cDNA 라이브러리의 스크리닝에 사용될 수 있다. cDNA 라이브러리가, 표지된 서열이 유래된 생물체의 유형과 다른 생물체로부터 유래했을 때, 혼성화 조건은 낮은 엄격도 조건일 것이다. 별법으로, 표지된 단편은 적당히 낮은 엄격도 조건을 이용하여, 관심있는 생물체로부터 유래한 게놈 라이브러리의 스크리닝에 다시 사용될 수 있다. 이러한 낮은 엄격도 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 라이브러리와 표지된 서열이 유래된 특정 생물체의 계통에 따라 예측가능하게 달라질 것이다. 그러한 조건의 안내는 상기 인용된 샘브룩 등 (Sambrook et al.)의 문헌을 참조한다.

또한, 기존에 미공지의 발현된 유전자형 서열도, 관심있는 유전자 내의 아미노산 서열에 기초한 2개의 다의형 (degenerated) 올리고뉴클레오티드 프라이머 풀 (pool)을 사용한 PCR에 의해 단리될 수 있다. 상기 반응의 주형은, 동족체 또는 스플라이싱 변이체를 발현하는 것으로 공지되거나 이와 같이 의심되는 인간 또는 인간 이외의 세포주 또는 조직으로부터 제조된 mRNA의 역전사에 의해 수득된 cDNA일 수 있다.

PCR 산물은, 증폭된 서열이 발현된 유전자형 핵산 서열을 나타낸다는 것을 확인하기 위해 서브클로닝되거나 서열분석될 수 있다. 그 후, PCR 단편은 다양한 방법에 의한 전장 cDNA 클론의 단리에 사용될 수 있다. 예를 들어, 증폭된 단편은 박테리오파지 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해 표지되어 사용될 수 있다. 별법으로, 표지된 단편은 게놈 라이브러리의 스크리닝에 사용될 수도 있다.

PCR 기술은 또한 전장 cDNA 서열을 단리하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 표준 절차에 따라 적당한 세포 또는 조직 공급원으로부터 RNA를 단리할 수 있다. 제1 가닥 합성의 프라이밍을 위해, 증폭된 단편의 5' 최말단에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 상기 RNA 상에서 역전사 반응을 수행할 수 있다. 그 후, 생성된 RNA/DNA 하이브리드를 표준 말단 트랜스퍼라제 반응에 의해 구아닌으로 테일링 (tailing)시키고, 하이브리드를 RNAse H로 분해한 후, 폴리-C 프라이머로 제2 가닥 합성을 프라이밍시킬 수 있다. 이와 같이 하여, 증폭된 단편의 상류 cDNA 서열을 용이하게 단리할 수 있다. 이용가능한 클로닝 전략에 대한 고찰은 샘브룩 등의 상기 문헌 [Sambrook et al., 1989]을 참조한다.

동정된 차등적 발현 유전자가 정상 유전자 또는 야생형 유전자인 경우, 이 유전자를 사용하여 이 유전자의 돌연변이 대립유전자를 단리할 수 있다. 이러한 단리는, 유전적 기초를 가진 것으로 공지되거나 이와 같이 의심되는 질환 및 과정에 바람직하다. 돌연변이 대립유전자는 질환 증상에 기여하는 유전자형을 갖는 것으로 공지되거나 이와 같이 의심되는 개체로부터 단리될 수 있다. 돌연변이 대립유전자 및 돌연변이 대립유전자 산물은 이후에 하기 설명하는 진단 분석 시스템에 이용될 수 있다.

예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 기술인 RT-PCR을 이용하여 돌연변이체 유전자의 cDNA를 단리할 수 있다. 이 경우 제1 cDNA 가닥은, 돌연변이 대립유전자를 보유하는 것으로 추정되는 개체에서 발현되는 것으로 공지되거나 이와 같이 의심되는 조직으로부터 단리된 mRNA에 올리고-dT 올리고뉴클레오티드 (또는 랜덤 6량체)를 혼성화시키고, 역전사효소로 새로운 가닥을 연장시킴으로써 합성될 수 있다. cDNA의 제2 가닥은 그 후에 정상 유전자의 5' 말단에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 (또는 임의의 다른 수단으로) 합성된다. 이들 2개의 프라이머를 사용하여, 상기 산물은 PCR을 통해 증폭되고, 적합한 벡터로 클로닝되어, 당업자에게 공지된 방법을 통해 DNA 서열 분석된다. 돌연변이 유전자와 정상 유전자의 DNA 서열을 비교함으로써, 돌연변이 유전자 산물의 기능 소실 또는 기능 변화에 관여하는 돌연변이(들)을 확인할 수 있다.

별법으로, 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 제조하고, 돌연변이 대립유전자를 보유하는 것으로 의심되는 개체에서, 관심있는 유전자를 발현하는 것으로 공지되거나 이와 같이 의심되는 조직으로부터 유래한 DNA 또는 RNA를 사용하여 상기 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 그 후, 정상 유전자 또는 적합한 그의 임 의 단편을 표지하여, 라이브러리에서 상응하는 돌연변이 대립유전자를 동정하기 위한 프로브로서 사용할 수 있다. 이 유전자를 함유하는 클론은 그 후에 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법을 통해 정제된 후, 상기 기재된 바와 같이 서열 분석될 수 있다.

또한, 돌연변이 대립유전자를 보유하는 것으로 의심되는 개체에서 관심있는 유전자를 발현하는 것으로 공지되거나 이와 같이 의심되는 조직으로부터 단리된 DNA 또는 상기 조직으로부터 합성된 cDNA를 이용하여 발현 라이브러리를 제조할 수 있다. 이와 같은 방식으로, 추정된 돌연변이 조직에 의해 만들어진 유전자 산물을 발현하여, 하기 기재되는 바와 같은 정상 유전자 산물에 대해 생성된 항체와 관련된 표준 항체 스크리닝 기술을 이용하여 스크리닝할 수 있다. 스크리닝 기술에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Harlow, E. and Lane, eds., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor]을 참조한다. 돌연변이에 의해 (예를 들어, 미스센스 (missense) 돌연변이의 결과로) 발현된 유전자의 기능이 변화되는 경우, 폴리클로날 세트의 항체는 돌연변이 유전자 산물과 교차반응할 것이다. 이들을 표지된 항체와 반응시켜 검출한 라이브러리 클론은 정제되어, 상기 기재된 바와 같이 서열 분석될 수 있다.

차등적으로 발현되는 유전자 산물에는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11 또는 서열 13에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질, 특히 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 기재된 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들의 단편이 포함된다.

또한, 발현된 유전자 산물은 기능적으로 동등한 유전자 산물인 단백질을 포함할 수 있다. 이와 같은 동등한 유전자 산물은 상기 기재된 차등적 발현 유전자 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 내에서 아미노산 잔기의 결실, 부가 또는 치환을 함유할 수 있지만, 그 결과로 침묵 (silent) 변이가 생성되어 기능적으로 동등한 차등적 발현 유전자 산물이 만들어진다 (다형성). 아미노산 치환은 관련 잔기가 나타내는 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및(또는) 양쪽성의 유사성에 기초하여 만들 수 있고, 아미노산 서열을 다른 종의 아미노산 서열과 비교하여 만들 수도 있다.

예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산에는 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함되고; 극성 중성 아미노산에는 글리산, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함되고; 양전하 (염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 포함되며; 음전하 (산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다. 본원에 사용된 "기능적으로 동등한"이란 차등적으로 발현되는 상기 유전자 서열에 의해 코딩되는 내생성 차등적 발현 유전자 산물과 실질적으로 유사한 생체내 또는 시험관내 활성을 나타낼 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 또한, "기능적으로 동등한"이란 차등적으로 발현되는 내생성 유전자 산물의 상응하는 부분이 나타내는 것과 유사한 방식으로 다른 세포내 또는 세포외 분자와 상호작용할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, "기능적으로 동등한" 펩티드는 면역분석에서 내생성 단백질의 상응하는 펩티드 (즉, "기능적으로 동등한" 펩티드를 수득하 기 위해 변형된 펩티드의 아미노산 서열)에 대한, 또는 내생성 단백질 자체에 대한 항체 (이 항체는 내생성 단백질의 상응하는 펩티드에 대해 생성됨)의 결합력을 감소시킬 수 있을 것이다. 등몰 농도의 기능적으로 동등한 펩티드는 상응하는 펩티드의 상기 결합력을 약 5％ 이상, 바람직하게는 약 5％ 내지 10％, 보다 바람직하게는 약 10％ 내지 25％, 보다 더 바람직하게는 약 25％ 내지 50％, 가장 바람직하게는 약 40％ 내지 50％ 감소시킬 것이다.

차등적으로 발현되는 유전자 산물은 당업계에 공지된 기술을 이용한 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 차등적으로 발현되는 유전자의 폴리펩티드를 제조하는 방법, 및 차등적으로 발현되는 유전자 서열을 코딩하는 핵산의 발현에 의한 본 발명의 펩티드는 본원에 기재되어 있다. 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 발현된 유전자 단백질 코딩 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이러한 방법에는, 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합이 포함된다. 예를 들어, 샘브룩 등의 상기 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 기재된 기술 및 오수벨 등의 상기 문헌 [Ausubel et al., 1989]에 기재된 기술을 참조한다. 별법으로, 발현된 유전자 단백질 서열을 코딩할 수 있는 RNA 또는 cDNA는, 예를 들어 합성기를 이용하여 화학적으로 합성할 수도 있다. 예를 들어, 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 ["Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford]에 기재된 기술을 참조한다.

다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본 발명의 차등적으로 발현되는 유전자 코 딩 서열의 발현에 이용될 수 있다. 그러한 숙주-발현 시스템은 관심있는 코딩 서열이 제조 및 추후 정제될 수 있는 수단일 뿐만 아니라, 적당한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염된 경우에 본 발명의 차등적 발현 유전자 단백질을 원래 위치에서 (in situ) 발현할 수 있는 수단이기도 하다. 그 예로는, 차등적으로 발현되는 유전자 단백질 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis))와 같은 미생물; 차등적으로 발현되는 유전자 단백질 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예를 들어, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 피치아 (Pichia)); 차등적으로 발현되는 유전자 단백질 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 차등적으로 발현되는 유전자 단백질 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스인 CaMV, 담배 모자이크 바이러스인 TMV)로 감염되거나 또는 상기 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 형질전환 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래한 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래한 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, 사이토메갈로바이러스 초기 유전자 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 작제물을 보유한 포유동물 세포 시스템 (예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 3T3)이 포함되지만, 이것으로 한정되지는 않는다.

세포 고유의 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 유전자로부터의 세포에 의한 RDCVF1 또는 RDCVF2의 발현도 수행할 수 있다. 그러한 발현의 방법은 미국 특허 제5,641,670호, 제5,733,761호, 제5,968,502호 및 제5,994,127호에 상세히 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 미국 특허 제5,641,670호, 제5,733,761호, 제5,968,502호 및 제5,994,127호 중 어느 하나의 방법에 의해 RDCVF1 또는 RDCVF2의 발현이 유도된 세포를 살아있는 동물의 원하는 조직에 이식하여, 상기 조직에서 RDCVF1 또는 RDCVF2의 국소 농도를 증가시킬 수 있다.

박테리아 시스템에서, 차등적으로 발현되는 유전자 단백질의 용도에 따라 수많은 발현 벡터를 유리하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 항체 생성 또는 펩티드 라이브러리의 스크리닝을 위해 이러한 단백질을 다량 생산할 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질 산물의 고 수준 발현을 지시하는 벡터 등이 바람직할 수 있다. 이러한 벡터로는, 차등적으로 발현되는 유전자 단백질의 코딩 서열이 벡터에서 lacZ 코딩 영역과 프레임에 맞게 각각 라이게이션되어 융합 단백질을 생산할 수 있는 이. 콜라이 (E. coli) 발현 벡터 pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791); pIN 벡터 (Inouye ＆ Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke ＆ Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. pGEX 벡터를 사용하여, 외래 폴리펩티드를 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다. 통상적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 글루타티온-세파로스 비드에 흡착시켰다가 유리 글루타티온의 존재하에 용출시켜, 용균된 세포로부터 쉽게 정제할 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 고안되어 있어서, 이들 엔도펩티다제를 사용하면, 클로닝된 표적 유전자 단백질을 GST 잔기로부터 방출시킬 수 있다.

프로모터 영역은 후보 프로모터 단편, 즉, 프로모터를 함유할 수 있는 단편을 도입하기 위한 제한 부위(들)의 하류에 프로모터 영역이 결실된 리포터 전사 단위, 예를 들어 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 ("cat") 또는 루시퍼라제 전사 단위를 함유하는 벡터를 사용하여 임의의 원하는 유전자로부터 선택할 수 있다. 공지된 바와 같이, 벡터 중 cat 또는 루시퍼라제 유전자 상류의 제한 부위에 프로모터-함유 단편을 도입하면 CAT 또는 루시퍼라제 활성이 생성되며, 이는 표준 CAT 분석법 또는 광도계로 검출할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 벡터는 공지되어 있고 쉽게 입수가능하다. 이러한 벡터는 pKK232-8, pCM7 및 pGL3 (프로메가 (Promega), E1751, 진뱅크 (Genebank) 허가번호 u47295)이다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 발현을 위한 프로모터에는, 공지되어 있고 쉽게 입수가능한 프로모터 뿐 아니라, 리포터 유전자 분석법을 이용한 상기 기술로 쉽게 수득할 수 있는 프로모터도 포함된다.

공지된 박테리아 프로모터 중에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 발현에 적합한 프로모터는 이. 콜라이 (E. coli) lacI 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, T5 tac 프로모터, 람다 PR, PL 프로모터, 및 trp 프로모터이다. 공지된 진핵생물의 프로모터 중에서, 이와 관련한 적합한 프로모터는 CMV 극초기 프로모터, HSV 티미딘 키나아제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 레트 로바이러스 LTR의 프로모터, 예를 들어 라우스 육종 바이러스 ("RSV")의 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터, 예를 들어 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터이다.

곤충 시스템에서, AcNPV (오토그라파 캘리포니카 (Autographa californica) 핵 다면체형성 바이러스)는 외래 유전자를 발현하는 벡터로 사용할 수 있는 여러 곤충 시스템 중 하나이다. 상기 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 차등적으로 발현되는 유전자 코딩 서열은 바이러스의 비필수 영역 (예를 들어 폴리헤드린 (polyhedrin) 유전자)으로 개별적으로 클로닝되고, AcNPV 프로모터 (예를 들어 폴리헤드린 프로모터)의 조절 하에 놓일 수 있다. 차등적으로 발현되는 유전자 코딩 서열이 성공적으로 삽입되면 폴리헤드린 유전자가 불활성화되고 비-폐색 재조합 바이러스 (즉, 폴리헤드린 유전자가 코딩하는 단백질성 외피가 결실된 바이러스)가 생성될 것이다. 그 후, 이들 재조합 바이러스를 사용하여 스포도프테라 프루기페르다 세포를 감염시키고, 이 안에서 삽입된 유전자가 발현된다 (예를 들어 문헌 [Smith et al., 1983, J. Virol. 46:584], 스미스 (Smith)의 미국 특허 제4,215,051호 참조).

포유동물 숙주 세포에서, 수많은 바이러스-기재의 발현 시스템을 이용할 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 관심있는 차등적 발현 유전자 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 3원 리더 서열로 라이게이션될 수 있다. 그 후, 상기 키메라 유전자를 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈 내로 삽입할 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역 (예를 들어, 영역 E1 또는 E3)으로 삽입하면, 감염된 숙 주에서 생존 가능하고 차등적 발현 유전자 단백질을 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 생성될 것이다 (예를 들어 문헌 [Logan ＆ Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659] 참조). 또한, 삽입된 차등적 발현 유전자 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특별한 개시 신호가 요구될 수 있다. 상기 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 그의 고유 개시 코돈 및 인접 서열을 포함하여 전체 차등적 발현 유전자가 적당한 발현 벡터로 삽입된 경우, 추가의 번역 조절 신호가 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 차등적으로 발현되는 유전자 코딩 서열의 오직 일부만이 삽입된 경우에는, 아마도 ATG 개시 코돈을 포함하여 외생성 번역 조절 신호가 제공되어야 할 것이다. 더욱이, 개시 코돈은 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임에 맞게 존재하여 전체 삽입체를 번역시켜야 한다. 이러한 외생성 번역 조절 신호 (코작 (Kozack) 서열) 및 개시 코돈의 기원은 천연 및 합성 모두로 다양할 수 있다. 발현의 효율은 적당한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함함으로써 향상될 수 있다. (문헌 [Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544] 참조).

숙주 세포에서의 발현을 위한 적당한 벡터 및 프로모터의 선택은 공지된 절차이고 발현 벡터 제조를 위한 필수 기술이며, 숙주로의 벡터 도입 및 숙주에서의 발현은 그 자체로 당업계의 일상적인 기술이다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기점, 고도로 발현되는 유전자로부터 유래하여 하류에 있는 구조적 서열의 전사를 지시하는 프로모터, 및 세포를 벡터에 노출시킨 후에 벡터를 함유하는 세포를 단리할 수 있게 하는 선별가능한 마커를 포 함할 것이다.

또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 유전자 산물을 원하는 특이적인 방식으로 변형시키거나 프로세싱하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형 (예를 들어, 글리코실화) 및 프로세싱 (예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 여러가지 숙주 세포들은 단백질의 번역후 프로세싱 및 변형에 대한 독특하고 특이적인 메카니즘을 갖고 있다. 적당한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택하여 발현된 외래 단백질의 올바른 변형 및 프로세싱을 보증할 수 있다. 이러한 목적으로, 1차 전사체의 적당한 프로세싱, 유전자 산물의 글리코실화 및 인산화를 위한 세포내 기구를 보유하는 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포로는 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

재조합 단백질을 장기간에 걸쳐 고수율로 생산하기 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 차등적으로 발현되는 단백질을 안정하게 발현하는 세포주를 유전공학적으로 조작할 수 있다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것이 아니라, 적당한 발현 조절 인자 (예를 들어, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선별가능한 마커에 의해 조절되는 DNA를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후에, 유전공학적으로 조작된 세포를 풍부 배지 (enriched media) 중에서 1 내지 2일 동안 성장시킬 수 있고, 그 후에 선별 배지로 교체한다. 재조합 플라스미드 중의 선별가능한 마커는 선별에 대한 내성을 부여하고, 세포로 하여금 플라스미드를 그의 염 색체에 안정하게 통합시키도록 하며, 세포가 성장하여 이후에 세포주로 클로닝 및 증식될 수 있게 한다. 상기 방법을 이용하여 차등적 발현 단백질을 발현하는 세포주를 유전공학적으로 조작하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 유전공학적으로 조작된 세포주는 차등적 발현 단백질의 내생적 활성에 영향을 미치는 화합물을 스크리닝하고 평가하는 데에 특히 유용할 수 있다. 상기 안정한 세포주는 세포 요법의 방식으로서 직접 또는 캡슐화시킨 후에 사용할 수 있다.

단순 포진 바이러스 (herpes simplex virus) 티미딘 키나아제 (Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Szybalska ＆ Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy, et al., 1980, Cell 22:817) 유전자 등을 비롯한 수많은 선별 시스템을, 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 사용할 수 있다. 또한, 항대사물질 내성은 dhfr, gpt, neo 및 hygro 유전자에 대한 선별의 기초로서 이용할 수 있으며, dhfr 유전자는 메토트렉세이트에 내성을 부여하고 (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt 유전자는 마이코페놀산에 내성을 부여하고 (Mulligan ＆ Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo 유전자는 아미노글리코시드 G-418에 내성을 부여하고 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); hygro 유전자는 하이그로마이신에 내성을 부여한다 (Santerre, et al., 1984, Gene 30:147).

다른 융합 단백질 시스템에서는 인간 세포주에서 발현되는 비-변성된 융합 단백질의 용이한 정제를 가능하게 한다 (Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976). 상기 시스템에서, 관심 유전자는 백시니아 재조합 플라스미드로 서브클로닝되어, 유전자의 오픈 리딩 프레임이 6개의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노-말단 태그로 융합된 채로 번역된다. 재조합 백시니아 바이러스에 감염된 세포로부터의 추출물을 Ni²⁺ 니트릴로아세트산-아가로스 컬럼에 로딩하고, 히스티딘-태그가 부착된 단백질을 이미다졸-함유 완충액으로 선택적으로 용출시킨다.

차등적으로 발현되는 단백질이 하기 기재하는 것과 같은 분석 시스템에서의 성분으로서 사용되는 경우, 차등적으로 발현되는 단백질을 직접적으로 또는 간접적으로 표지하여 차등적 발현 단백질과 시험 재료 사이에서 형성되는 복합체의 검출을 용이하게 할 수 있다. ¹²⁵I 등과 같은 방사성 동위원소; 기질에 노출되었을 때 검출가능한 열량측정 신호 또는 빛을 방출하는 효소 표지 시스템; 및 형광성 표지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 다양하고 적합한 표지 시스템을 사용할 수 있다.

재조합 DNA 기술을 이용하여 이러한 분석 시스템을 위한 차등적 발현 단백질을 생산하는 경우에는 표지, 고정화 및(또는) 검출을 용이하게 할 수 있는 융합 단백질을 유전공학적으로 조작하는 것이 유리할 수 있다.

간접적 표지는 차등적 발현 유전자 산물에 특이적으로 결합하는 표지된 항체 등과 같은 단백질의 사용을 포함한다. 이러한 항체로는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 단일쇄, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

다른 실시양태에서, RDCVF1 또는 RDCVF2 단백질을 코딩하는 서열 또는 이의 기능적 유도체를 포함하는 핵산은 유전자 요법에 의해 원추세포 기능을 증진시키기 위해 투여한다. 유전자 요법은 핵산을 대상체에 투여하여 수행하는 요법을 나타낸다. 본 발명의 상기 실시양태에서, 핵산은 원추세포 기능을 증진시킴으로써 치료 효과를 매개하는 그의 코딩된 단백질을 생산한다.

본 발명에 따라, 당업계에서 이용가능한 유전자 요법의 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예시적인 방법을 하기 기재한다.

바람직한 측면에서, 치료제는 적합한 숙주에서 RDCVF1 또는 RDCVF2 단백질 또는 이의 단편 또는 키메라 단백질을 발현하는 발현 벡터의 일부인 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 핵산을 포함한다. 특히, 이러한 핵산은 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 프로모터를 보유하고 있으며, 상기 프로모터는 유도가능하거나 구성적 프로모터이고, 경우에 따라 조직-특이적이다. 다른 특정 실시양태에서, Rdcvf1 또는 Rdcvf2 코딩 서열 및 임의의 다른 원하는 서열이 게놈의 원하는 부위에서 상동성 재조합을 증진시키는 영역에 인접해 있을 때, 특정 핵산 분자를 사용하여 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 핵산을 염색체내에서 발현시킨다 (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).

환자로의 핵산 전달은, 환자가 핵산 또는 핵산-운반 벡터에 직접적으로 노출 된 경우에는 직접적이며, 세포가 먼저 시험관내에서 핵산으로 형질전환된 후, 환자로 이식되는 경우에는 간접적이다. 상기 두 접근법은 각각, 생체내 또는 생체외 유전자 요법으로서 공지되어 있다.

특정 실시양태에서, 핵산은 생체내로 직접 투여되고, 여기서 발현되어 코딩된 산물을 생산한다. 이는 당업계에 공지된 수많은 방법 중 임의의 방법, 예를 들어, 핵산을 적당한 핵산 발현 벡터의 일부로서 제조하고 이를 투여하여, 예를 들어 결손된 또는 약화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터 (아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 렌티바이러스)를 사용하여 감염시키거나 (예를 들어, 미국 특허 제4,980,286호 및 하기 언급한 다른 문헌을 참조), 순수한 (naked) DNA를 직접 주사하거나, 미세입자 주입기 (microparticle bombardment)(예를 들어, 유전자 총 (gene gun); Biolistic, Dupont)를 사용하거나, 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로 코팅하거나, 리포좀, 미세입자 또는 마이크로캡슐제내로 캡슐화하거나, 핵으로 들어가는 것으로 공지된 펩티드와 연결하여 이를 투여하거나, 리간드와 연결하여 수용체-매개 내포작용으로 이를 대상체에 투여함으로써 (예를 들어, 미국 특허 제5,166,320호; 동 제5,728,399호; 동 제5,874,297호; 및 동 제6,030,954호를 참조하며, 이들 문헌은 이 거명을 통해 그 전문에 본원에 참고로 포함됨) (이를 사용하여 수용체를 특이적으로 발현시키는 세포 유형을 표적화할 수 있음) 세포내에 존재하도록 하여 달성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 리간드가 융해성 (fusogenic) 바이러스 펩티드를 포함하여 엔도좀을 방해하는 핵산-리간드 복합체가 형성될 수 있고, 상기 복합체는 핵산이 리소좀에 의해 분해되지 않도록 해준다. 다른 실시양태에서, 핵산은 생체내에서 특이적인 수용체를 표적화함으로써 세포 특이적 유입 및 발현에 대해 표적화될 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; WO93/14188; 및 WO 93/20221 참조). 별법으로, 핵산은 세포내로 도입될 수 있고 상동성 재조합에 의해 숙주 세포 DNA로 혼입되어 발현될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,413,923호; 동 제5,416,260호; 및 동 제5,574,205호; 및 문헌 [Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438] 참조).

특정 실시양태에서, Rdcvf1 또는 Rdcvf2 핵산을 함유하는 바이러스 벡터를 사용한다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,219,740호; 동 제5,604,090호; 및 동 제5,834,182호 참조). 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 패키징 및 숙주 세포 DNA로의 통합에 필수적이지 않은 레트로바이러스 서열이 결실되도록 변형된 것이다. 유전자 요법에 사용되는 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 핵산은 환자로의 유전자 전달을 용이하게 하는 벡터로 클로닝된다.

아데노바이러스는 유전자 요법에서 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 특히 호흡기 상피로 유전자를 전달하는 제 유용한 비히클이다. 아데노바이러스는 자연 상태에서 호흡기 상피를 감염시켜 그곳에 온화한 질환을 유발시킨다. 아데노바이러스-기재의 전달 시스템에 관한 다른 표적은 간, 중추신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있다는 장점이 있다. 아데노바이러스-기재의 유전자 요법을 수행하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,824,544호; 동 제5,868,040호; 동 제5,871,722호; 동 제5,880,102호; 동 제5,882,877호; 동 제5,885,808호; 동 제5,932,210호; 동 제5,981,225호; 동 제5,994,106호; 동 제5,994,132호; 동 제5,994,134호; 동 제6,001,557호; 및 동 제6,033,8843호에 기재되어 있고, 이들 문헌은 이 거명을 통해 그 전문에 본원에 참고로 포함된다.

아데노-관련 바이러스 (Adeno-Associated Virus; AAV)도 유전자 요법에서의 사용이 제안되어 왔다. 아데노-관련 바이러스는 유전자를 망막으로 전달하는 데 특히 유용한 비히클이다. AAV의 제조 및 사용 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,173,414호; 동 제5,252,479호; 동 제5,552,311호; 동 제5,658,785호; 동 제5,763,416호; 동 제5,773,289호; 동 제5,843,742호; 동 제5,869,040호; 동 제5,942,496호; 및 동 제5,948,675호에 기재되어 있고, 이들 문헌은 이 거명을 통해 그 전문에 본원에 참고로 포함된다.

유전자 요법에의 다른 접근법은 전기천공법, 리포펙션법, 인산칼슘 매개의 형질감염 또는 바이러스 감염 등과 같은 방법으로 조직 배양에서 유전자를 세포로 수송하는 것을 포함한다. 통상적으로, 수송 방법은 선별가능한 마커를 세포로 수송하는 것을 포함한다. 그 후, 세포를 선별하고, 수송된 유전자를 취하여 발현하고 있는 세포들을 단리한다. 그 후, 상기 세포들을 직접적으로 또는 캡슐화한 후에 환자로 전달시킨다.

상기 실시양태에서, 핵산을 세포로 도입시킨 후에 생성된 재조합 세포를 생체내로 투여한다. 이러한 도입은 형질감염, 전기천공법, 미세주사, 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전 자 수송, 미세세포-매개 유전자 수송, 스페로플라스트 (spheroplast) 융합 등을 비롯한, 당업계에 공지된 임의의 방법으로 수행할 수 있다. 외래 유전자를 세포로 도입시키기 위한 수많은 기술이 당업계에 공지되어 있고, 수용 세포의 필수적인 발생적 기능 및 생리적 기능을 파괴하지 않는한 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 상기 기술은 세포로의 핵산의 안정한 전달을 제공해야 하므로, 핵산은 상기 세포에 의해 발현가능하고, 바람직하게는 유전되어 자손 세포에 의해 발현가능하다.

결과의 재조합 세포는 당업계에 공지된 각종 방법에 의해 환자로 전달할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상피 세포는 예를 들어 피하로 주사한다. 다른 실시양태에서, 재조합 피부 세포를 피부 이식편으로서 환자에 적용시킬 수 있다. 재조합 혈액 세포 (예를 들어, 조혈 간세포 또는 선조 세포)는 정맥내로 투여하는 것이 바람직하다. 세포의 사용 계획량은 원하는 효과, 환자 상태 등에 따라 달라지며 당업자에 의해 결정될 수 있다.

유전자 요법의 목적상 핵산이 도입될 수 있는 세포로는 임의의 원하는 이용가능한 세포 유형이 포함되며, 상피 세포, 내피 세포, 각질 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간 세포; 혈액 세포, 예를 들어 T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거핵구, 과립구; 각종 간세포 또는 선조 세포, 특히, 골수, 제대혈, 말초혈, 태아 간 등으로부터 수득하는 조혈 간세포 또는 선조 세포 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

바람직한 실시양태에서, 유전자 요법에 사용하는 세포는 환자에 자가이식형이다.

유전자 요법에 재조합 세포를 사용하는 한 실시양태에서, Rdcvf1 또는 Rdcvf2 핵산을 세포로 도입시켜 상기 세포 또는 그의 자손에 의해 발현가능하도록 한 후, 재조합 세포를 치료상 효과를 위해 생체내로 투여한다. 특정 실시양태에서는 간세포 또는 선조 세포를 사용한다. 본 발명의 상기 실시양태에 따라, 시험관내에서 단리하고 유지할 수 있는 임의의 간세포 및(또는) 선조 세포를 잠재적으로 사용할 수 있다. 이러한 간세포로는 조혈 간세포 (HSC), 피부 및 장관 내막 등과 같은 상피 조직의 간세포, 배아 심장 근육 세포, 간의 간세포 (예를 들어, WO 94/08598을 참조) 및 신경 간세포 (Stemple and Anderson, 1992, Cells 71:973-985) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

상피 간세포 (ESC) 또는 각질 세포는 공지된 절차 (Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229)에 의해 피부 및 장관 내막 등과 같은 조직으로부터 수득할 수 있다. 피부 등과 같은 계층화된 상피 조직에서, 재생은 기저막과 가장 가까운 층인 배아층 내부 간세포의 유사분열에 의해 발생한다. 장관 내막 내부의 간세포는 상기 조직의 빠른 재생 속도를 제공한다. 환자 또는 기증자의 피부 또는 장관 내막으로부터 수득한 ESC 또는 각질 세포는 조직 배양에서 성장할 수 있다 (Pittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771). ESC가 기증자에 의해 제공되는 경우, 숙주 대 이식편 반응성의 억제 방법 (예를 들어, 온건한 면역억제을 증진시키기 위한 조사(照射), 약물 또는 항체 투여)도 이용할 수 있다. 망막 간세포 (Tropepe et al., 2000, Science, 287: 2032).

조혈 간세포 (HSC)와 관련하여, HSC의 시험관내 단리, 번식 및 유지를 제공 하는 임의의 기술이 본 발명의 상기 실시양태에서 사용될 수 있다. 이를 달성할 수 있는 기술로는 (a) 미래의 숙주 또는 기증자로부터 단리된 골수 세포로부터 HSC 배양물의 단리 및 확립, 또는 (b) 동종 또는 이종일 수 있는 미리 확립된 장기간의 HSC 배양물의 사용이 포함된다. 비-자가이식형 HSC는 미래의 숙주/환자의 이식 면역 반응의 억제 방법과 병용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 인간 골수 세포는 후장골능 (posterior iliac crest)으로부터 미세침 흡인으로 수득할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kodo et al., 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384] 참조). 본 발명의 바람직한 실시양태에서, HSC는 고도로 풍부해지거나 실질적으로 순수한 형태로 생산될 수 있다. HSC를 풍부하게 하는 것은 장기간의 배양 이전에, 도중에 또는 이후에 달성할 수 있고, 당업계에 공지된 임의의 기술로 수행할 수 있다. 골수 세포의 장기간 배양은, 예를 들어 변형된 덱스터 세포 배양 기술 (Dexter et al., 1977, J. Cell Physiol. 91:335) 또는 위트록-위트 배양 기술 (Witlock and Witte, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3608-3612)을 이용하여 확립하고 유지할 수 있다.

특정 실시양태에서, 유전자 요법의 목적으로 도입될 핵산은 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하며, 전사의 적당한 유도물질 (inducer)의 존재 또는 부재를 조절함으로써 핵산의 발현이 조절가능하다.

하나 이상의 차등적 발현 유전자 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있는 항체의 생성 방법을 본원에 기재한다. 이러한 항체로는 폴리클로날 항체, 모노클로 날 항체 (mAb), 인간화 항체 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab')₂ 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항-유전자형 (anti-Id) 항체 및 상기 중 임의의 에피토프-결합 단편 등이 있을 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 항체는, 예를 들어 지문, 표적, 생물학적 샘플 중 유전자의 검출에 사용할 수 있거나 별법으로는, 비정상 표적 유전자 활성의 억제 방법으로서 사용할 수 있다. 따라서, 이러한 항체는 질환 치료 방법의 일부로서 사용할 수 있고(있거나), 안구 방수 및(또는) 유리체를 당업자에게 친숙한 방법으로 샘플링함으로써 Rdcvf1 또는 Rdcvf2의 비정상 수준 또는 Rdcvf1 또는 Rdcvf2의 비정상 형태의 존재에 관해 환자를 시험할 수 있는 진단 기술의 일부로서 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Forster, RK, Abbott, RL, Gelender, H. (1980) Management of infectious endophthalmitis Ophthalmology 87, 313-319]).

차등적으로 발현되는 유전자에 대한 항체를 생산하기 위하여, 차등적 발현 단백질 또는 이의 일부를 주사하거나 DNA 면역법에 의해 각종 숙주 동물을 면역화할 수 있다. 이러한 숙주 동물에는 토끼, 마우스 및 래트 등의 동물이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 숙주 종에 따라 각종 면역보강제를 사용하여 면역 반응을 증가시킬 수 있고, 상기 면역보강제로는 프로인트 (Freund) 면역보강제 (완전 및 불완전), 수산화알루미늄 등과 같은 미네랄 겔, 리소레시틴 등과 같은 표면 활성 물질, 플루오닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀전, 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀, 및 BCG (bacille Calmette- Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum) 등과 같은 잠재적으로 유용한 인간 면역보강제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

폴리클로날 항체는 표적 유전자 산물 등과 같은 항원 또는 이의 항원성 기능적 유도체로 면역화된 동물의 혈청으로부터 유도되는 항체 분자의 이종 집단이다. 폴리클로날 항체를 생산하기 위해, 상기 기재한 것과 같은 숙주 동물을 상기 기재한 바와 같은 면역보강제로 보충된 차등적 발현 유전자 산물을 주사하여 면역화시킬 수 있다.

특정 항원에 대한 항체의 동종 집단인 모노클로날 항체는, 연속적인 세포주 배양물에 의해 항체 분자를 생산하는 임의의 기술로 수득할 수 있다. 상기 기술에는 콜러 (Kohler) 및 밀스타인 (Milstein)의 하이브리도마 기술 (문헌 [1975, Nature 256:495-497]; 및 미국 특허 제4,376,110호), 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) 및 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스 및 이의 임의의 하위클래스일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양할 수 있다. 생체내 mAb의 고 역가 생산으로 인해 이 방법이 현재 바람직한 생산법이다.

또한, 적당한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적당한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 스플라이싱함으로써 "키메라 항체"를 생성하기 위해 개발된 기술 (문헌 [Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855]; [Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608]; [Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454])을 이용할 수 있다. 키메라 항체는 여러 부분들이 상이한 동물 종, 예를 들어 뮤린 (murine) mAb로부터 유도된 가변 영역 또는 초가변 영역, 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 보유하는 종으로부터 유도된 분자이다.

별법으로, 단일쇄 항체의 생성에 관해 기재된 기술 (미국 특허 제4,946,778호; 문헌 [Bird, 1988, Science 242:423-426]; [Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; 및 [Ward et al., 1989, Nature 334:544-546])을 개조하여 차등적 발현 유전자-단일쇄 항체를 생산할 수 있다. 단일쇄 항체는 아미노산 결합을 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결시켜 형성되며, 이로 인해 단일쇄 폴리펩티드가 생성된다.

가장 바람직하게는, "인간화 항체"의 생산에 유용한 기술을 개조하여 폴리펩티드, 단편, 유도체 및 본원에 개시한 기능적 등가물에 대한 항체를 생산할 수 있다. 이러한 기술은 미국 특허 제5,932,448호; 동 제5,693,762호; 동 제5,693,761호; 동 제5,585,089호; 동 제5,530,101호; 동 제5,910,771호; 동 제5,569,825호; 동 제5,625,126호; 동 제5,633,425호; 동 제5,789,650호; 동 제5,545,580호; 동 제5,661,016호; 및 동 제5,770,429호에 개시되어 있고, 이들 문헌은 이 거명을 통해 그 전문에 본원에 참고로 포함된다.

특정 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 발생할 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편에는 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')₂ 단편, 및 F(ab')₂ 단편의 이황결합 환원으로 생성될 수 있는 Fab 단편이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 별법으로, Fab 발현 라이브러리를 제조하여 (Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281) 원하는 특이성을 가진 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 용이하게 확인할 수 있다.

수많은 변형이 존재하는 샌드위치 분석법이 검출의 용이함 면에서 특히 바람직하며, 본 발명은 이 모두를 포함한다.

예를 들어, 전형적인 정방향 분석법에서, 비표지된 항체를 고상 기질에 고정시키고 시험할 샘플을 결합된 분자와 접촉하게 한다. 적합한 기간 동안 인큐베이션한 후, 충분한 시간 동안 항체-항원 2원 복합체를 생성하게 한다. 이 때, 검출가능한 신호를 유도할 수 있는 리포터 분자로 표지된 제2 항체를 첨가하고, 인큐베이션시켜 충분한 시간 동안 항체-항원-표지된 항체의 3원 복합체를 형성시킨다. 반응하지 않은 임의의 물질을 세척해 내고 신호를 관찰하여 항원의 존재량을 측정하거나 공지된 양의 항원을 함유하는 대조군 샘플과 비교하여 정량할 수 있다. 정방향 분석법에서의 변형은 샘플 및 항체 모두를 결합된 항체에 동시에 첨가하는 동시분석법, 또는 시험할 표지된 항체 및 샘플을 먼저 배합시키고 인큐베이션하여 비표지된 표면 결합된 항체에 첨가하는 역방향 분석법을 포함한다. 상기 기술은 당업자에게 공지되어 있고 미미한 변형의 가능성은 명백할 것이다. 본원에서 사용된 "샌드위치 분석법"은 기본적인 2-부위 기술의 모든 변형을 포함하는 것으로 의도된 다. 본 발명의 면역분석법에서, 유일한 제한 인자는 비표지된 항체 및 표지된 항체가 RdCVF1- 또는 RdCVF2-특이적 항체라는 것이다.

상기 유형의 분석법에서 가장 통상적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광발색단-함유 분자 또는 방사성핵종-함유 분자이다. 효소 면역분석법의 경우, 효소는 통상적으로는 글루타르알데히드 또는 페리오데이트에 의해 제2 항체와 접합한다. 그러나, 쉽게 인식되는 바와 같이 당업자에게 공지된 다양한 라이게이션 기술이 존재한다. 통상적으로 사용되는 효소로는, 특히 양고추냉이 (horseradish) 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제 및 알칼리성 포스파타제가 포함된다. 일반적으로, 특이적인 효소와 함께 사용할 기질은 상응하는 효소에 의한 가수분해 후 검출가능한 색깔 변화의 형성에 의해 선별된다. 예를 들어, p-니트로페닐 포스페이트는 알칼리성 포스파타제 접합에 사용하기에 적합하고, 1,2-페닐렌디아민 또는 톨루이딘은 퍼옥시다제 접합에 통상적으로 사용한다. 상기 기재한 발색성 기질 이외에 형광성 생성물을 산출하는 형광성 기질을 사용하는 것도 가능하다. 그 후, 적당한 기질을 함유하는 용액을 항체-RdCVF1- 또는 RdCVF2-표지된 항체의 3원 복합체에 첨가한다. 상기 기질은 제2 항체에 연결된 효소와 반응하여 정성적인 시각 신호를 제공하고, 통상적으로는 이를 분광광도계로 추가로 정량하여 혈청 샘플에 존재하는 Rdcvf1 또는 Rdcvf2의 양을 측정할 수 있다.

별법으로, 플루오레세인 및 로다민 등과 같은 형광성 화합물은 그의 결합 능력을 변화시키지 않고 항체와 화학적으로 커플링될 수 있다. 형광색소-표지된 항체가 특정 파장의 빛의 조명에 의해 활성화된 경우, 형광색소-표지된 항체는 빛 에 너지를 흡수하여 분자의 여기 상태를 유도한 후, 특징적인 더 긴 파장의 빛을 방출한다. 상기 방출은 광학현미경을 이용하여 시각적으로 검출가능한 특징적인 색깔로서 나타난다. 면역형광법 및 EIA 기술은 모두 당업계에 매우 잘 확립되어 있고 본 발명의 방법에 특히 바람직하다. 그러나, 방사성 동위원소, 화학발광 또는 생물발광 분자 등과 같은 다른 리포터 분자도 사용할 수 있다. 요구되는 용도에 적합하도록 절차를 변화시키는 방법은 당업자에게 명백할 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 진단 시약으로서의 용도에 관한 것이다. 기능장애와 관련된, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14에 기재된 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 돌연변이 형태를 검출함으로써 첨가될 수 있는 진단 도구가 제공되거나, 또는 유전자의 저-발현, 과-발현, 또는 변경된 공간적 또는 일시적 발현으로부터 유발되는 질환의 진단 또는 상기 질환에의 감수성을 규정하는 진단 도구가 제공될 것이다. 유전자에 돌연변이를 가진 개체는 다양한 기술에 의해 DNA 수준에서 검출될 수 있다.

진단용 핵산은 혈액, 뇨, 타액, 조직 생검 또는 부검 물질 등과 같은 대상체의 세포로부터 수득할 수 있다. 게놈 DNA는 검출을 위해 직접적으로 사용할 수 있거나 분석 전에 PCR 또는 다른 증폭 기술을 이용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다. RNA 또는 cDNA도 유사한 방식으로 사용할 수 있다. 결실 및 삽입은 증폭된 산물의 크기 변화를 정상 유전자형과 비교하여 검출할 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 표지된 뉴클레오티드 서열과 혼성화시킴으로써 확인할 수 있다. 완벽 하게 매치된 서열은 RNase 분해 또는 용융 온도의 차이에 의해 미스매치된 이중 나선과 구별할 수 있다. 또한, DNA 서열 차이는 변성제 (SSCP)를 사용하거나 사용하지 않고 겔에서 DNA 단편의 전기영동 이동성의 변화에 의해 검출하거나, 또는 직접적인 DNA 서열분석 (예를 들어, [Myers et al., Science (1985) 230:1242])에 의해 검출할 수 있다. 특정 위치에서의 서열 변화는 RNase 및 S1 보호 등과 같은 뉴클레아제 보호 분석법, 또는 화학적 절단 방법에 의해서도 밝혀질 수 있다 (문헌 [Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401] 참조). 다른 실시양태에서, Rdcvf1 또는 Rdcvf2 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브의 어레이 (array)를 제작하여, 유전자 돌연변이 등의 효율적인 스크리닝을 수행할 수 있다. 어레이 기술 방법은 공지되어 있고, 일반적으로 응용되며, 유전자 발현, 유전자 연관 및 유전자 변이성을 비롯한 분자 유전학에서의 다양한 의문을 해결하기 위해 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [M. Chee et al., Science, Vol 274, pp 610-613 (1996)] 참조).

진단 분석법은 기재한 방법에 의해 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 유전자에서의 돌연변이를 검출하여 질환에 대한 감수성을 진단하거나 측정하는 방법을 제공한다. 또한, 이러한 질환은 대상체로부터 유래한 샘플로부터 비정상 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 발현을 측정하는 단계를 포함하는 방법으로 진단할 수 있고, 상기 발현은 예를 들어 핵산 증폭, 예를 들어 PCR, RT-PCR, RNase 보호, 노던 블롯팅 및 다른 혼성화 방법 등과 같은 폴리뉴클레오티드 정량에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 RNA 수준에서 측정할 수 있다. 숙주로부터 유래한 샘플에서 본 발명의 폴리펩티드 등과 같은 단백질의 수준을 측정하기 위해 사용할 수 있는 분석 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 분석법에는 방사성면역분석법, 경쟁적-결합 분석법, 웨스턴 블롯 분석법 및 ELISA 분석법이 포함된다.

따라서, 다른 측면에서 본 발명은

(a) 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14에 기재된 폴리펩티드 또는 이의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;

(b) (a)의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 뉴클레오티드 서열;

(c) 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14에 기재된 폴리펩티드 또는 이의 단편; 또는

(d) 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체, 바람직하게는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 및 서열 14에 기재된 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드에 대한 항체

를 포함하는 진단 킷트에 관한 것이다.

이러한 임의의 킷트에서, (a), (b), (c) 또는 (d)는 실질적인 성분을 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 킷트는 질환 또는 질환에 대한 감수성, 특히 망막색소변성증, 노화-관련 황반 변성, 바르데트-비델 증후군, 바쎈-코른츠바이히 증후군, 베스트병, 맥락막 결여, 맥락막 위축, 선천성 흑내장, 레프선 증후군, 스타가르트 질환 및 어셔 증후군 또는 이에 대한 감수성을 진단하는데 유용할 것이다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 염색체 위치 측정에도 유용하다. 염색체의 위치는 하이브리드 세포주 (마우스-햄스터)의 패널로부터 제조된 DNA에서 PCR에 의해 수득할 수 있다. 인간 유전자의 염색체 위치는 신테니 (syntheny)에 의해 마우스 유전자의 위치로부터 예상할 수 있다 (McCarthy et al.(1997), Genome research, 7, 1153). 서열은 마우스 또는 인간 염색체를 포함하여 개개의 염색체상의 특정 위치에 특이적으로 표적화되고 그와 혼성화될 수 있다. 본 발명에 따라 염색체에 상응하는 서열을 맵핑하는 것은 상기 서열과 유전자 관련 질환을 연관시킨다는 점에서 중요한 첫째 단계이다. 일단 서열이 정확한 염색체의 위치에 맵핑되었다면, 염색체상의 서열의 물리적 위치는 유전자 맵 데이타와 연관될 수 있다. 이러한 데이타는, 예를 들어 문헌 [V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man] (존스 홉킨스 대학교 웰치 의학 도서관 (Welch Medical Library), 렛넷 (RetNet)을 통해 온라인으로 이용가능함)에서 발견된다. 그 후, 동일한 염색체 영역에 맵핑된 유전자와 질환과의 관계를 연결 분석 (물리적으로 인접한 유전자의 공동유전)으로 확인한다.

영향을 받는 개체와 영향을 받지 않는 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열의 차이도 측정할 수 있다. 돌연변이가 영향을 받는 개체의 일부 또는 모두에서 관찰되나 임의의 정상적인 개체에서는 관찰되지 않는다면, 돌연변이는 질환의 원인일 가능성이 있다.

본 발명의 추가의 실시양태는 상기 논의한 임의의 치료 효과를 위해 제약상 허용되는 담체와 함께 제약 조성물을 투여하는 것에 관한 것이다. 이러한 제약 조성물은 Rdcvf1 또는 Rdcvf2, 모방약 또는 작용제로 구성될 수 있다. 상기 조성물은 단독으로, 또는 1종 이상의 안정화 화합물 등의 기타 작용제와 조합하여 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 및 물 등을 비롯한 임의의 살균된 생체적합성 제약 담체를 통하여 투여할 수 있다. 조성물은 단독으로, 또는 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 공동으로 투여할 수 있다.

본 발명에 포함되는 제약 조성물은 수많은 경로로 투여할 수 있는데, 예를 들면 공막을 통해 맥락막 및 망막으로 생반응성 단백질을 전달한다 (Ambati et al. (2000) Investigative Ophthalmology and Visual Science, 41, 1186). 안구 용액, 현탁액 및 연고를 포함하는 국소 안구 제제의 제형화는 당업자에게 공지되어 있다 (문헌 [Remington's Pharmaceuticals Sciences, 18th Edition, Chapter 86, pages 1581-1592 Mack Publishing Company, 1990]을 참조). 안방내 (intracameral) 주사 (전방 (anterior chamber) 또는 유리체방 (vitreous chamber)으로 직접 주사할 수 있음), 결막하 주사 및 안구후 (retrobulbar) 주사를 포함하는 다른 투여 방식들이 이용가능하고, 이러한 투여 방식에 적합한 안구 제제의 제조 방법 및 수단도 공지되어 있다.

본 명세서에서 사용된 "외안"은 안구 표면 및 안구와 안검 사이의 (외부) 공간을 의미한다. 외안 영역의 예로는 안검 천장 또는 맹낭 (cul-de-sac), 결막 표면 및 각막 표면이 있다. 상기 위치는 모든 안구 조직의 외부이며, 상기 영역에 접근하기 위해 침입성 절차는 필요하지 않다. 외안 시스템의 예로는 치료적 물질을 상기 영역에 운반하기 위해 사용될 수 있는 삽입물 및 "국소적으로" 도포되는 점안제, 겔 또는 연고제 등이 있다. 일반적으로, 외안 장치는 쉽게, 심지어 환자에 의해 제거가능하다.

하기 특허들은 외안 영역에 약물을 투여하기 위해 사용하는 외안 시스템을 개시한다. 히구찌 (Higuchi) 등은 미국 특허 제3,981,303호, 동 제3,986,510호 및 동 제3,995,635호에 약물을 함유하는 생분해성 안구 삽입물을 개시한다. 상기 삽입물은 안구의 맹낭, 안구와 안검 사이의 외안 공간에서의 체류를 위해 여러 가지 형태로 제조될 수 있다. 여러 통상적인 생체적합성 중합체가 상기 장치의 제작에 사용하기에 적합하다고 개시되어 있다. 이러한 중합체로는 알긴산아연, 폴리(락트산), 폴리(비닐 알콜), 폴리(무수물) 및 폴리(글리콜산)이 포함된다. 상기 특허는 약물의 침투성이 감소된 막 코팅된 장치 및 약물 제형을 보유하는 중공 (hollow) 챔버도 기재하고 있다.

티우웨스 (Theeuwes)의 미국 특허 제4,217,898호는 제어된 약물 전달에 사용되는 미공성 저장소를 개시한다. 상기 장치는 안구 맹낭에서 안구바깥쪽으로 놓여진다. 관심있는 중합체 시스템으로는 폴리(비닐클로라이드)-코-폴리(비닐 아세테이트) 공중합체가 있다. 카우프만 (Kaufman)은 미국 특허 제4,865,846호 및 동 제4,882,150호에 1종 이상의 생체-침식가능한 물질 또는 연고제 담체를 함유하는 결막 낭으로의 안구 약물 전달 시스템을 개시한다. 상기 특허는 적합한 전달 시스템으로서 폴리(락티드), 폴리(글리콜리드), 폴리(비닐 알콜) 등과 같은 중합체 시스템 및 가교 콜라겐을 개시한다.

RDCVF1 또는 RDCVF2 단백질 산물의 망막 질환 또는 상해의 치료를 위한 본 발명 기재의 용도에서, 국소적으로 도포된 안구 제형은 눈으로 치료제를 침투시키거나 수송시키는 것을 증진시키는 작용제를 포함하는 것이 또한 유리하다. 이러한 작용제는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 케 (Ke) 등의 미국 특허 제5,221,696호는 안구 제제의 각막을 통한 침투를 향상시키는 물질의 용도를 개시한다.

내안 시스템은 안구 자체의 조직 층들 내부, 사이 또는 주변의 임의의 조직 구획에 사용하기에 적합한 시스템이다. 상기 위치로는 결막하 (안구에 인접한 안구 점막 아래쪽), 안와(眼窩) (안구 뒤쪽) 및 안방내 (안구 자체의 방 내부)가 포함된다. 외안 시스템과 대조적으로, 상기 영역에 접근하기 위해서는 주사 또는 이식 등의 침입성 절차가 요구된다.

하기 특허들은 내안 장치를 개시한다. 옹 (Wong)의 미국 특허 제4,853,224호는 안구의 방으로 도입시키기 위한 미세캡슐화된 약물을 개시한다. 상기 시스템에서 사용되는 중합체로는 폴리에스테르 및 폴리에테르가 포함된다. 리 (Lee)의 미국 특허 제4,863,457호는 치료제의 서방형 방출을 위해 안구내로 외과적으로 이식하는 생분해성 장치를 개시한다. 상기 장치는 결막 (안구의 점막) 아래쪽의 외과적 이식을 위하여 고안된다. 크레잔카키 (Krezancaki)의 미국 특허 제4,188,373호는 신체 온도에서 겔화되는 제약 비히클을 개시한다. 상기 비히클은 약물 및 고무질 또는 셀룰로스 유래 합성 유도체의 수성 현탁액이다. 하슬람 (Haslam) 등은 미국 특허 제4,474,751호 및 동 제4,474,752호에서 실온에서 액체이고 체온에서 겔화되는 중합체-약물 시스템을 개시한다. 상기 시스템에 사용되는 적합한 중합체에는 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시 프로필렌이 포함된다. 다비스 (Davis) 등은 미국 특허 제5,384,333호에서 장기간의 약물 방출을 제공하는 생분해성 주사가능한 약물 전달 중합체를 개시한다. 약물 조성물은 생분해성 중합체 매트릭스 내의 제약적으로 활성인 작용제로 구성되며, 여기서 중합체 매트릭스는 20℃ 내지 37℃의 범위의 온도에서는 고상이고 38℃ 내지 52℃의 범위의 온도에서는 유동성이다. 약물 전달 중합체는 가용성이거나 액체인 약물 제형의 전달에만 제한되지 않는다. 예를 들어, 중합체는 주사 부위에서 약물-함유 마이크로스피어, 리포좀 또는 다른 미립자-결합 약물을 안정화하고 보유하기 위한 매트릭스로서 사용할 수 있다.

내안 주사에 특히 적합한 비히클은 RDCVF1 또는 RDCVF2 단백질 산물이 적당히 보존된 멸균 등장 용액으로서 제형화된 멸균 증류수이다. 다른 안구 제제로는 주사가능한 마이크로스피어 또는 리포좀 등과 같은 작용제를 이용한 RDCVF1 또는 RDCVF2 단백질 산물 제형이 포함될 수 있으며, 이는 이후 데포 (depot) 주사로서 전달될 수 있는 단백질의 저속 방출 또는 서방형 방출을 제공한다. RDCVF1 또는 RDCVF2 단백질 산물의 내안 도입에 적합한 다른 수단으로는 RDCVF1 또는 RDCVF2 단백질 산물을 함유하는 이식가능한 약물 전달 장치가 포함된다.

본 발명의 안구 제제, 특히 국소 제제는 다른 성분들, 예를 들어 당업계에 공지된 바와 같은 안구에 허용가능한 보존제, 장성제, 공용매, 습윤제, 복합화제, 완충제, 항미생물제, 산화방지제 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 장성 향상제로는 할로겐화 알칼리 금속 (바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨), 만니톨, 소르비톨 등이 있다. 충분한 장성 향상제를 첨가하여 눈에 점안할 제형을 저장 또는 실질적으로 등장이도록 하는 것이 유리하다. 적합한 보존제로는 염화벤즈알코늄, 티메로살, 페네틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시 딘, 소르브산 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 과산화수소도 보존제로서 사용할 수 있다. 적합한 공용매로는 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 적합한 복합화제로는 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린, 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린이 있다. 적합한 계면활성제 또는 습윤제로는 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 80 등과 같은 폴리소르베이트, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사폴 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 완충액은 붕산염, 시트르산염, 인산염, 중탄산염 또는 트리스-HCl 등과 같은 통상적인 완충액일 수 있다.

제형 성분은 투여하는 외안 또는 내안 부위에 허용가능한 농도로 존재한다. 예를 들어, 완충액을 사용하여 생리적 pH 또는 약간 낮은 pH에서, 전형적으로는 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내에서 조성물을 유지시킨다. 추가의 제형화 성분은 외안에 투여되는 치료제를 안구에 오래 머무르도록 하는 물질을 포함하여 국소 접촉을 최대화하고 흡수를 증진시킬 수 있다. 적합한 물질로는 안구 제제의 점도를 증가시키는 중합체 또는 겔 형성 물질이 포함된다. 키토산은 서방형 액체 안구 약물 제형에서 안구 방출-속도 제어제로서 특히 적합한 물질이다 (옌 (Yen) 등의 미국 특허 제5,422,116호를 참조). 안구 치료제의 제어 방출 (예를 들어, 서방형 및 연장형 전달)을 위한 본 발명의 제형의 안구 적합성은 당업계에 공지된 각종 절차로, 예를 들어 문헌 [Journal of Controlled Release, 6:367-373, 1987] 및 이의 변형물에 기재된 바와 같이 결정할 수 있다.

활성 성분 이외에, 상기 제약 조성물은 활성 화합물의 제약상 사용할 수 있 는 제제로의 프로세싱을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 비롯한 적합한 제약상 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 제형화 및 투여 기술에 대한 추가의 상세사항은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.)]의 최신판에서 발견할 수 있다.

경구 투여용 제약 조성물은 경구 투여에 적합한 투여량으로 당업계에 공지된 제약상 허용되는 담체를 이용하여 제형화할 수 있다. 이러한 담체는 제약 조성물을 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액제 등으로서 제형화하여 환자가 섭취할 수 있게 한다.

경구용 제약 제제는 활성 화합물과 고상 부형제를 조합하고, 임의로 생성되는 혼합물을 분쇄하고, 과립 혼합물을 가공하고, 필요에 따라 적합한 보조제를 첨가한 후, 정제 또는 당의정으로서 수득할 수 있다. 적합한 부형제로는 카르보히드레이트 또는 단백질 충전재, 예컨대 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 비롯한 당; 옥수수, 밀, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터의 전분; 셀룰로스, 예컨대 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 또는 나트륨 카르복시메틸셀룰로스; 아라비아 고무 및 트라가칸트를 비롯한 고무; 및 단백질, 예컨대 젤라틴 및 콜라겐이 있다. 필요에 따라, 붕해제 또는 가용화제를 첨가할 수 있으며, 예로는 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 알긴산나트륨이 있다.

당의정은 농축된 당 용액과 같은 적합한 코팅제와 함께 사용될 수 있으며, 아라비아 고무, 활석, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및(또는) 이산화티탄, 락카 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 염료 또는 안료는 제품 확인을 위해 또는 활성 화합물의 양, 즉 투여량을 특징화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

경구용으로 사용될 수 있는 제약 제제로는 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏 (push-fit) 캡슐제 뿐만 아니라, 젤라틴 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 코팅제로 제조된 연질 밀봉 캡슐제가 포함된다. 푸쉬-핏 캡슐제에서, 활성 성분은 충전재 또는 결합제, 예컨대 락토스 또는 전분, 윤활제, 예컨대 활석 또는 스테아르산 마그네슘, 및 임의로 안정화제와 혼합되어 있을 수 있다. 연질 캡슐제에서, 활성 화합물은 안정화제의 존재 또는 부재하에 적합한 액체, 예컨대 지방유, 액체, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 분산될 수 있다.

비경구 투여에 적합한 제약 제제는 생리학적으로 적합한 완충제, 예컨대 행크스 (Hanks) 용액, 링거 (Ringer) 용액, 또는 생리학적으로 완충된 염수 중의 수용액제로 제제화될 수 있다. 수성 주사 현탁액제는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 나트륨 카르복시메틸메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액제는 적당한 유성 주사 현탁액제로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클로는 참깨유와 같은 지방유, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀이 포함된다. 비지질 다가 양이온 아미노 중합체 또한 전달을 위해 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액제는 또한 적합한 안정화제, 또는 화합물의 가용성을 증가시켜 고농축 용액제를 제조할 수 있게 해주는 보조제를 함유할 수 있다.

국소 또는 비강 투여의 경우, 투과하고자 하는 특정 장벽에 적당한 투과제가 제제에 사용될 수 있다. 이러한 투과제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.

본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지된 방식으로, 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분말화, 유화, 캡슐화, 트랩핑화 또는 동결 건조 공정에 의해 제조될 수 있다.

제약 조성물은 염으로서 제공될 수 있고, 이러한 염은 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 비롯한 여러 산을 이용하여 형성할 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태에 비해 수성이거나, 또는 다른 양성자성 용매 중에서 보다 가용성인 경향이 있다. 다른 경우, 바람직한 제제는 1 내지 50 mM 히스티딘, 0.1％ 내지 2％ 수크로스, 및 2 내지 7％ 만니톨 (pH 범위 4.5 내지 5.5) 중 임의의 것 또는 이들 모두를 함유할 수 있으며 사용전에 완충제와 합해지는 동결 건조된 분말일 수 있다.

제약 조성물을 제조한 후, 이들은 적당한 용기에 담겨지거나 지시된 증상의 치료를 위해 표지될 수 있다. Rdcvf1 또는 Rdcvf2를 투여하는 경우, 그러한 표지에는 투여하는 양, 빈도 및 방법이 포함된다.

본 발명에 사용하기에 적합한 제약 조성물로는 활성 성분이 의도된 목적을 달성하기 위한 유효량으로 함유된 조성물이 포함된다. 유효 투여량의 결정은 당업자의 능력내에서 용이하게 이루어진다.

어떠한 화합물이더라도, 치료 유효 투여량은 먼저 신생 세포와 같은 세포의 배양물 분석으로, 또는 보통 마우스, 토끼, 개 또는 돼지와 같은 동물 모델로 평가할 수 있다. 동물 모델은 또한 적당한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 다음, 이러한 정보를 이용하여 인간을 위한 유용한 투여량 및 투여 경로를 결정할 수 있다.

치료 유효 투여량은 징후 또는 증상을 완화시킬 수 있는 활성 성분, 예를 들어 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 또는 그의 단편, Rdcvf1에 대한 항체, 작용제의 양을 말한다. 치료 효능 및 독성, 예를 들어 ED50 (군집의 50％에 치료 효과가 있는 투여량) 및 LD50 (군집의 50％를 치사시키는 투여량)은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 실무에 의해 측정할 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 투여비가 치료 지수이고, 이는 LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 보다 큰 치료 지수를 나타내는 제약 조성물이 바람직하다. 세포 배양물 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이타는 인간에게 사용시 투여량 범위를 도출하는데 이용된다. 그러한 조성물에 함유되는 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위내이다. 투여량은 이용되는 투여 형태, 환자의 감수성 및 투여 경로에 따라 상기 범위내에서 달라진다.

정확한 투여량은 치료를 요하는 개체와 관련된 인자에 비추어 실무자에 의해 결정될 것이다. 투여량 및 투여 방법은 충분한 수준의 활성 잔기를 제공하도록 또는 원하는 효과를 유지하도록 조정된다. 고려될 수 있는 인자로는 질병 상태의 중증도, 개체의 전반적인 건강, 개체의 연령, 체중 및 성별, 식이, 투여 시간 및 빈도, 병용 약물, 반응 민감도, 및 요법에 대한 내성/반응성이 포함된다. 장기 작용 제약 조성물은 특정 제제의 반감기 및 제거 속도에 따라 3 내지 4일 마다, 매주, 또는 2주에 한번씩 투여될 수 있다.

정상적인 투여량은 0.1 내지 100,000 마이크로그램일 수 있고, 투여 경로에 따라 약 1 g 이하의 총 투여량으로 투여할 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌에 제시되어 있으며, 일반적으로 당업계의 실무자들에게 알려져 있다. 당업자라면 단백질 또는 그의 억제제에 비해 뉴클레오티드에 대해서는 상이한 제형을 이용할 것이다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전달은 특정 세포, 조건, 위치 등에 대해 특이적일 것이다. 단백질의 경구 투여에 적합한 제약 제제는 예를 들어 미국 특허 5,008,114호, 5,505,962호, 5,641,515호, 5,681,811호, 5,700,486호, 5,766,633호, 5,792,451호, 5,853,748호, 5,972,387호, 5,976,569호, 및 6,051,561호에 기재되어 있다.

하기 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않고 본 발명을 설명한다.

1. 발현 클로닝:

1) 5주령 정상 마우스 망막으로부터 전체 RNA의 정제:

cDNA 라이브러리를 일반적으로 문헌 [Glissin et al (1974), Biochemistry, 13, 2633-2637]의 방법에 따라 5주령 C57BL/6@N 마우스의 망막으로부터 제조하였다. 간략히, 동물을 치사시킨 후, 적출된 안구를 먼저 0.1％ 디에틸 피로카르보네이트 (DEPC)로 보충된 인산염 완충 염수 (PBS) 중에 넣었다. 망막 신경을 신속히 절개하였다 (이 조직 제제에서 망막 색소 상피는 제외하였다). 각각의 절개 직후에, 조직을 새로운 6 M 구아니디늄 클로라이드 중에서 균질화시켰다. 10개의 망막 을 4 ml 멸균 튜브에서 GC 2.4 ml 중에 모으고, 조직을 실온에서 1분 동안 강력 균질화하여 완전히 파쇄시켰다.

5주령 정상 마우스 망막으로부터 전령 RNA (mRNA)의 정제:

mRNA를 문헌 [Kuribayashi et al., (1988), Nucleic Acids Res. Symposium series, 19, 61-64]의 방법에 따른 엄격 조건하에 올리고-dT 코팅된 다공성 비드 (올리고텍스 (Oligotex), 퀴아젠 (Qiagen)) 상에서 단리하였다. 간략히, 전체 마우스 망막 RNA 100 내지 150 ㎍을 결합 완충액 [10 mM Tris pH 7.5; 0.3 M NaCl; 0.1 M EDTA; 0.5％ w/v 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)] 중에서 올리고-dT 비드 15 ㎕과 혼합하고, 물 0.5 ℓ베허 (becher) 중에서 6분 동안 65℃에서 인큐베이션한 다음, 약 3 내지 4시간에 걸쳐 점차적으로 실온으로 냉각시킨 후, 실온에서 원심분리하여 아가로스 비드를 회수하였다. 다음, 이들을 완충액 (0.1 M Tris pH 7.5; 0.1 M NaCl; 1 mM EDTA; 0.5％ w/v SDS) 0.4 ml 중에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 2회 세척하였다. 결합된 RNA (mRNA)를 70℃로 가온된 RNAse 무함유수 50 ㎕로 2단계 용출시키고, 아세트산나트륨 (pH 5.2) 10 ㎕ 및 에탄올 0.25 ml를 사용하여 침전시키고, -70℃에서 12시간 인큐베이션하였다. mRNA를 원심분리 (15,000 rpm에서 1시간에 이어, 70％ 에탄올로 2회 세척)에 의해 수집하고, RNAse 무함유수 20 ㎕에 재현탁시켰다. mRNA 농도를 260 nm에서 측정하고, rRNA 오염이 없음을 상기와 같은 변성 조건하에 겔 전기영동으로 확인하였다.

cDNA 합성:

cDNA 합성을 문헌 [Okayama and Berg, (1982), Mol Cell Biol., 2, 161-170] 의 방법에 따라 수행하였다. 제1 가닥 합성은 NotI 어댑터 올리고뉴클레오티드 (5' TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGACAA(T)₁₈ 3') 2.5 ㎍으로 프라이밍하고, 공급자에 의해 추천된 조건하에 변형된 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (modified Moloney Murine Leukaemia Virus; M-MLV) 역전사효소 (수퍼스크립트 (Superscript) II, 라이프 테크놀로지 (Life Technology)) 50 단위와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 제2 가닥 합성의 경우, 반응물을 0.25 ml의 최종 부피에서 SS 완충액 [40 mM Tris pH 7.2; 85 mM 염화칼륨; 4.4 mM 염화마그네슘; 3 mM DTT; 5 ㎍/ml 소 혈청 알부민 (BSA)] 중에서 RNAseH 4 단위 및 DNA 중합효소 I 100 단위와 함께 14℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. EcoRI 어댑터 (5'-OH AATTCGGCACGAGG 3'-OH/3'-OH GCCGTGCTCC5'-PO₄)를 공급자에 의해 추천된 조건하에 16℃에서 14시간 동안 20 ㎕의 전체 부피에서 T4 DNA 리가아제 (프로메가 (Promega), 미국 메디슨 소재) 40 단위를 이용하여 이중 가닥 cDNA의 양 말단에 라이게이션시켰다. 이 반응의 생성물은 클로닝 벡터에서 유래될 수 있는 5'에서 EcoRI 절반 부위 및 3'에서 NotI 절반 부위를 갖는 dscDNA이다.

pcDNA3에 dscDNA의 라이게이션:

pcDNA3에 dscDNA의 라이게이션을 공급자에 의해 명시된 조건하에 EcoRI 및 NotI (프로메가, 미국 메디슨 소재)로 절단하여 제조된 pcDNA3 플라스미드 (인비트로젠 (Invitrogen)) 10 ㎍를 이용하여 문헌 [Maniatis T.(1992), Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed,.]에 따라 수행하였다.

재조합 클론의 증식:

재조합 클론의 증식은 일반적으로 문헌 [Birnboim et al (1979), Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523]의 방법에 따라 수행하였다. 간략히, 100개의 1차 클론으로 된 풀을 제조하기 위해, 본 발명자들은 하기한 바와 같이 XL1 골드 (스트라타진 (Stratagene)) 형질전환 프로토콜 (스트라타진에 의해 제공)을 약간 변형시켰다. 증식 배지에서 인큐베이션한 후, 형질전환 반응을 20％ (부피/부피) 글리세롤 및 8％ (부피/부피) 말 혈청 알부민 (HAS, 라이프 테크놀로지즈 (Life Technologies))에서 일으켰다. HAS 및 글리세롤은 냉동 해동에 따른 사멸을 방지한다. 100개의 콜로니를 제공하는 부피가 되도록 각 형질전환 반응물의 부피를 증가시키면서 아가 플레이트 (앰피실린 100 ㎍/ml) 상에서 플레이팅하여 적정하고, 전체 형질전환 반응물을 -80℃에서 저장하였다. 이 라이브러리로부터 재조합 플라스미드를 한번에 96개씩 정제하였다. 클론 100개씩을 갖는 96개의 풀을 제조하기 위해, 100개의 클론에 상응하도록 계산된 부피를 아가 상에서 플레이팅하고, 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 아가 플레이트로부터 떼어낸 콜로니로부터 DNA를 직접 정제하였다. 각 배양물의 원액을 23％ 글리세롤 중에서 -80℃하에 저장하였다. 공급자에 의해 추천된 프로토콜에 따라 퀴아웰 울트라 (Qiawell ultra; 퀴아젠 (Qiagen))를 이용하여 DNA를 정제하였다. 전형적으로, 정제된 플라스미드 10 ㎍을 수득하고, 각 작제물의 농도는 260 nm에서의 광학 밀도를 이용하여 측정하였다. 선택된 100개의 풀을 10개의 하위 풀로 나누기 위해, 원래 풀로부터 얻은 글리세롤 원액의 1/250,000 희석액 50 ㎕을 아가 플레이트 상에서 앰피실린 100 ㎍/ml의 존재하에 플레이팅하였다. 37℃에서 16시간 후, 160개의 개별 콜로니를 16개의 아가 플레이트 (플레이트 당 10개) 상에 복재시키고, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 각 플레이트로부터의 10개의 콜로니를 수집하여, 액체 배지 [루리아 브로쓰 (Luria Broth; LB), 앰피실린 100 ㎍/ml]에서 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이들 배양물의 원액을 30％ 글리세롤 중에서 -80℃하에 저장하였다. 플라스미드 DNA는 사용전에 제조하였다. 10개의 하위 풀을 개별 클론으로 나누기 위해, 10개의 하위 풀로부터의 글리세롤 원액의 1/250,000 희석액 50 ㎕을 아가 플레이트 상에 앰피실린 100 ㎍/ml의 존재하에 플레이팅하였다. 37℃에서 16시간 동안 배양한 후, 16개의 개별 콜로니를 골라서 LB 2 mL 및 앰피실린 100 ㎍/ml 중에서 16시간 동안 배양하였다. 이들 배양물의 원액을 30％ 글리세롤 중에서 -80℃하에 저장하였다. 플라스미드 DNA는 사용전에 제조하였다.

Cos-1 세포에서의 일시적 형질감염:

Cos-1 세포에서의 일시적 형질감염은 문헌 [Chen and Okayama, (1987), High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA (Mol Cell Biol., 7, 2745-27520)]의 방법을 이용하여 수행하였다.

병아리 배아 망막 배양물:

이 프로토콜은 문헌 [Adler and Hatlee, (1989) Science, 243, 391]으로부터 채택하였다. 병아리 배아 망막 (난내에서 (in ovo) 6일)을 분리하여 단층 배양물로 플레이팅하였다. 분화 신호가 없는 배양 조건하에, 원추세포는 세포의 60 내지 80％이다. 본 발명자들은 토끼에서 비지닌 (visinin; 병아리 원추세포 마커, 진뱅 크 (Genbank) 허가번호 M84729)에 대한 폴리클로날 항체를 생성시키고, 본 발명자들의 배양물에서 원추세포의 비율이 60 내지 80％임을 입증하였다. 본 발명자들의 모델의 단순한 환경 (화학적 조성이 규정된 배지, 세포 대 세포 접촉 없음)과 이 방법의 용이함 및 신속함은 원추세포 생존과 관련된 영양 인자를 연구하기 위한 매우 적당한 시스템을 가능하게 한다. 간략히, 선조의 대조군 단리물로부터 얻은 배아의 망막을 난내 발생 6일 후에 절개하고, 세포를 분리하여 저농도 (10⁵ 세포/㎠)로 플레이팅하였다. 10일 동안, 세포 생존력 (60 내지 80％ 원추세포)을 생존 및 사멸 세포를 정량화하는 생존/사멸 분석법 (몰레큘라 프로브즈 (Molecular probes), 미국 유진 소재)을 이용하여 추적하였다. 배양한지 7일 후, 화학적 조성이 규정된 배지에서 생존 세포의 수는 초기 세포수의 8％로 감소하였다. 라이브러리로부터 얻은 클론의 풀로 형질감염시킨 COS1 세포로부터의 조건화 배지의 존재하에 수행하였을 때, 7일 후 시험관 내에서 생존 세포를 계수하였다.

실험실로부터 25 km 떨어진 부화 시설에서 본 실험의 목적을 위해 분리된 구획에서 병아리 선조 (균주 657, 적색 표지)를 유지시켰다. 자연적으로 얻은 수정란을 매주 수집하고, 부화시킨 후, 실험실에서 17℃ (그들의 생물학적 제로)에서 유지시켰다. 매일, 5개의 계란을 습윤 챔버에서 계란의 경사를 간헐적으로 전환시키면서 20℃에서 24시간에 이어 37℃에서 136시간 동안 인큐베이션하였다. 배양한 날, 계란의 표면을 뮤코킷-A (Mucocit-A)로 세척한 다음 깨트리고, 병아리 배아를 PBS에 옮겼다. 각 배아의 발생 단계는, 문헌 [Hamburger and Hamilton (1951), Essential Development Biology, Stern and Holland Ed.]에 따른 시각적 비교에 의해 29 단계인 것으로 입증되었다. 배아 중 2개를 선택하여, 적출된 안구를 CO₂-의존성 배지 (라이프 테크놀로지즈)에 옮겼다. 망막을 절개하고 링거 완충액으로 옮기고, 2회 세척하였다. 망막을 작은 조각으로 절단하고, 트립신 용액 (0.25％ w/v)으로 37℃에서 20분 동안 처리하였다. 10％ 불활성 FCS로 보충된 배양 배지 (M199, 라이프 테크놀로지즈)를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 세포 현탁액을 DNAse I (1 mg/ml, 시그마 (Sigma)) 25 ㎕로 수분 동안 처리하였다. 다음, 세포 현탁액을 화학적 조성이 규정된 배양 배지 [CDCM, 동부피의 DMEM 및 M199 배지 (라이프 테크놀로지즈) 및 보충된 AB (5 ㎍/ml 인슐린; 5 ㎍/ml 트랜스퍼링 (Transferring); 64 nM 프로게스테론; 0.1 mM 푸트레신; 5 ng/ml 셀레늄; 3 mM 타우린; 2.7 μM 시티딘 5'-디포스포에탄올아민; 5.2 μM 시티딘 5-디포스포콜린, 0.2 ㎍/ml 하이드로코르티손; 30 nM 3,3'-5-트리요오도-L-티로신; 1 mM 피루브산나트륨), 0.3 μM 프로스타글란딘 D₂; 0.1 mg/ml 리놀레산]로 2회 세척하여 FCS를 제거하였다. 트립판 블루로 염색된 세포의 농도는 말라세즈 (Mallassez) 세포를 이용하여 측정하고, 2가지 플레이팅 밀도 (2 및 4 ×10⁵ 세포/㎠)에 상응하는 두가지 농도 (5.6 및 1.12 ×10⁵ 세포/ml)가 얻어졌다.

Cos-1 형질감염된 세포로부터의 조건화 배지를 얼음상에서 해동시키고, 50 ㎕를 하기 계획에 따라 폴리-L-리신 (시그마)의 100 ㎍/ml 용액으로 코팅된 2개의 96 웰 조직 배양물 처리된 블랙 플레이트 (코닝 코스타 (Corning Costar))에 옮겼다.

제1 라운드 스크리닝:

숫자는 100개의 클론으로 된 풀의 개수를 나타내고, C는 빈 벡터 (pcDNA3)로 형질감염된 Cos-1 세포로부터의 조건화 배지를 나타내고, P는 양성 대조군 (pcDNA-mouseGDNF로 형질감염된 조건화 배지)을 나타낸다.

제2 및 제3 라운드 스크리닝:

x (제2 라운드) 및 y (제3 라운드)는 각각 제1 및 제2 라운드에서 선택된 풀의 개수를 나타내고, 01 내지 16은 사용된 하위 풀을 나타낸다. x(y)는 16개의 풀이 유래되는 모 풀을 나타낸다. C는 제1 라운드에서와 동일하다. P는 제2 라운드 에서는 pCMVScript-CNTF로 변형시켰고, 제3 라운드에서는 pcDNA-939.09.08로 점차적으로 변형시켰다. 0은 CDCM 배지에 병아리 원추세포만 있음을 나타낸다. 망막의 외식편으로부터의 조건화 배지인 C57 및 C3H는 하기 "마우스 망막의 외식편으로부터의 조건화 배지의 제조"에서 기재된 바와 같이 각각 5주령된 C57BL/6@N 및 C3H/He@N 마우스 망막으로부터 제조하였다.

두가지 밀도 (2 및 4 ×10⁵ 세포/㎠)에 상응하는 세포 현탁액 50 ㎕을 8 채널 전동 피펫 (바이오힛 (Biohit))을 이용하여 조건화 배지로 충전된 2개의 96 웰 플레이트에 첨가하여 실험 오차를 최소화하였다. 세포를 37℃에서 7일 동안 5％ CO₂하에 인큐베이션하였다.

마우스 망막의 외식편으로부터 조건화 배지의 제조:

제2 및 제3 라운드 스크리닝에는 모핸드-사이드 (Mohand-Said) 등 (1998)의 문헌으로부터 채택된 양성 대조군이 포함되었다. 5주령 마우스 5C57BL/6@N (야생형) 및 C3H/He@N (rd1)을 사멸시키고 적출하였다. 2개의 망막을 절개하여 12 웰 플레이트에서 37℃에서 24시간 동안 5％ CO₂하에 CDCM 1.5 ml 중에서 인큐베이션하였다. 조건화 배지를 회수하고, 비바스핀 (Vivaspin; 사르토리우스 (Sartorius), 여과 한계 10 kDa) 상에서 한외여과에 의해 40배 농축하였다. 조건화 배지를 액체 질소에서 냉동시키고, 사용전에 -20℃에서 분취액으로 저장하였다. 사용하는 날, 조건화 배지를 얼음상에서 해동하고, CDCM 중에서 10배 희석하고, 0.22 ㎛ 필터 (아크로디스크 (Acrodisk) 13, 겔람 사이언시즈 (Gelman Sciences)) 상에서 여과에 의해 멸균시켰다.

기능 분석, 생존/사멸 분석:

기능 분석은 시험관내 인큐베이션 7일 후에 생존하는 병아리 망막 세포의 수를 기초로 한다. 본 발명자들은 각각 생존 및 사멸 세포를 염색하는 두가지 형광 염료 (칼세인 AM 및 에티듐 이량체)를 기초로 하는 생존/사멸 분석 킷트 (몰레큘라 프로브즈, 미국 유진 소재)를 사용하였다. 생존하는 세포는 대사 활성 (이 경우에는 에스테라제 활성)이 진행되어 기질 (칼세인 AM)을 520 nm에서 방출되는 형광 생성물로 전환시킨다. 사멸 세포의 막 투과성은 변경되어, 635 nm에서 방출되는 에티듐 이량체에 의해 핵의 DNA가 염색된다. 세포는 생존하거나 (485 nm에서 여기 후 520 nm에서 방출) 사멸된다 (520 nm에서 여기 후 635 nm에서 방출). 형광 현미경을 이용하여, 두가지 유형의 형광 세포를 별도로 가시화할 수 있다. 시험관내에서 7일 후, 세포를 칼세인 AM 2.7 μM 및 에티듐 이량체 0.3 mM와 함께 실온에서 30분 동안 암흑하에 인큐베이션하였다.

화상 획득:

간략히, 화상 획득은 각 웰을 자동으로 초점을 맞추고, 두가지 형광을 갖는 세포를 자동으로 계수한 다음, 전문가용 소프트웨어, 예를 들어 메타모르프 (Metamorph; 유니버셜 이미징 코포레이션 (Universal Imaging Corporation), 미국 웨스트 체스터 소재)로 원 데이타를 가공하여, 플레이트에 있는 각 웰의 디지털 사진을 수득하는 것으로 구성된다. 본 발명자들은 두가지 여기 필터 485 및 520 nm 및 두가지 방출 필터 520 및 635 nm를 갖는 수은 형광 램프, 검체 (x10), 전동 플 라틴으로 구동되는 컴퓨터 (멀티컨트롤 (Multicontrol) 2000, 마르챠우저 (Martzauzer)) 및 CCD 카메라 (코우 (Cohu))를 구비한 도립 현미경 (니콘 (Nikon) TE 200)를 이용하였다.

플레이트를 판독하기 위해, 플레이트를 전동 플라틴 상에 놓고, 제1 웰 상에서 수동으로 초점을 맞추고, 이 평면을 기록하였다 (z 원점). 생존 및 사멸 화상의 역가 (threshold)를 제1 웰로부터 설정하였다. 백색광을 이용하여 컴퓨터 모니터 상에서 수동으로 제1 웰의 바닥을 화상의 바닥에 맞춘 다음, 컴퓨터 스크린 상에서 제1 웰의 제일 오른쪽을 화상의 오른쪽에 맞추고, 두 위치를 기록함으로써 제1 웰의 중앙을 조정하였다. 제1 웰의 중앙을 산정하여 플레이트의 각 웰의 중앙 위치를 제공하였다. 본 발명자들은 현상 공정에서 웰의 연부에서 세포의 밀도가 조금 더 높다는 것을 확인하여, 연부는 화상 획득에서 배제하였다. 어떠한 잘못된 결과라도 방지하기 위해 각 웰로부터의 화상의 중앙을 정확히 맞추는 것이 중요하다. 작동시, 플레이트의 제1 스캔은 사멸 세포의 판독을 수행하였다. 사멸 세포 밀도는 이러한 조건하에 덜 가변적이다. 어플리케이션은 여러 초점 플랜에서 화상을 취하여 정확한 초점으로서 가장 밝은 것을 선택함으로써 자동으로 초점을 맞추었다. 이 z 위치를 저장하고, 플라틴은 한 화상에서 재구성시 웰 표면의 2/3를 나타내는 총 4개의 화상을 취하면서 x 및 y 축에서 프로그래밍된 이동을 수행하였다. 초점 플랜으로부터의 수많은 화상을 대조군으로 저장하였다. 플라틴은 자동으로 초점을 맞추고, 웰 A1 내지 A12에 이어 B12 내지 B1, C1 내지 C12 등으로 시작하여 플레이트의 각 웰에 대해 4회 획득하였다. 마지막으로, 플라틴은 플레이트 외측으 로 이동하여 마지막 웰 (H1)을 과노출시켰다. 사멸 세포의 스캐닝은 30분 걸렸다. 제2 스캔 (생존 세포)은 필터를 교체한 후에 수행하였다. 이 제2 스캔에서는 사멸 스캔으로부터 기록된 각 웰의 z 위치를 이용하였다. 4개의 화상을 사멸 세포에서와 마찬가지로 각각 취하였다. 제2 스캔의 마지막에 (22분), 재구성된 사멸 및 생존 화상을 수행 날짜가 자동적으로 기명되는 파일에 저장하였다. 세포 수 (사멸 및 생존)를 미리 설정된 형태 계측 변수를 이용하여 자동으로 계수하고 (평균), 컴퓨터 모니터 상에 표시하여 실험이 정확한지를 확인하였다. 생존 세포의 수가 너무 높지 않은가를 매일 확인하는 것이 중요하다. 본 발명자들은 매우 중요한 밀도로 플레이팅한 경우 병아리 망막 세포가 그들의 자체 생존 인자에 의해 보다 오래 생존하는 경향이 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이러한 효과를 배제하여 세포를 스크리닝하였다. 제2 플레이트에서 스캐닝 (플레이팅된 세포의 밀도가 2배인 동일한 실험)하기 전에, 본 발명자들은 제1 플레이트로부터 로그 파일의 이름 제일 끝에 α를 기입하였다. 각 실험으로부터 얻은 화상을 CD-롬에 저장하였다. 본 발명자들은 250 CD-롬으로 구성된 라이브러리를 생성시켰다.

세포 계수 및 풀의 선택:

세포 수 (생존 및 사멸)를 CD-롬 상에 저장된 각 실험의 화상을 이용하여 계수하였다. 실험으로부터 얻은 로그 파일을 먼저 컴퓨터 상에 로딩하고 (오프-라인으로 계수), 메타모르프 소프트웨어를 이용하여 파일을 열었다. 제1 단계에서, 14 웰 C (빈 벡터로 형질감염된 Cos-1 세포로부터의 조건화 배지)에 상응하는 화상을 열었다. 화상의 역가를 조정한 후, 지시된 집적 형태 계측 분석 (command Integrated Morphometry Analysis)을 이용하여 대조군 웰에서 10 내지 250개의 검체의 면적 분포 (각각의 전체 영역에서 생존 세포의 수)를 측정하였다. 이 분포는 검체의 최대수가 단리된 세포에 상응하는 가우스 (Gaussian) 곡선을 따랐다. 다음, 이 표준값 (SV)을 이용하여 세포가 2개보다 많은 검체의 면적값 (표준 검체 감가 (standard object cut); SOC)을 본 발명자들의 실험 함수 SOC = 29/20.74 SV에 의해 계산하였다. 각각의 개별 플레이트의 SOC값을 이용하여 플레이트에서 생존 세포의 수를 계수하였다. 다음, 이들 수를 엑셀표로 변환하였다.

제1 라운드 스크리닝의 경우, 각각의 풀에서 상기 값을 14개 대조군 웰의 평균 + 표준 편차에 대한 배수 차이 (생존 세포 수의 증가 또는 감소)로서 플롯팅하였다. 플레이트내의 여러 위치에서 나온 변량을 보정하기 위해, 본 발명자들은 시험하는 풀의 위치에 상응하는 80개의 웰과 14개의 대조군 웰 사이의 배수 차이의 평균을 200개의 독립적인 플레이트에서 개별적으로 계산하였다. 평균적으로, 상기 배수 차이는 위치 차이에 의해서만 관찰되고, 세포 수는 이 계수를 이용하여 보정하였다. 선택하고자 하는 풀을 보다 엄격한 방식으로 구별하기 위해, 생존 세포 수를 대조군에 대한 배수 차이로서 플롯팅하였고, 모든 값은 0.4 내지 1.3이었다. 이러한 방식으로, 빈 벡터에 상응하는 14개의 웰에 대한 배수 차이가 0.4 내지 1.3인 모든 풀은 효과가 없는 것으로 간주되어 대조군으로 사용되었다. 보정한 후, 2개의 플레이트의 대조군에 대한 배수 차이를 곱하고, 배수 차이가 감소하는 방식으로 결과를 분류하였다. 이 리스트의 최상단에 있는 풀은 실험하는 20개의 풀 (두 플레이트 모두)에 상응하는 그래프와 생존 및 사멸 세포의 화상을 시각적으로 검사 함으로써 추가로 확인하여 잘못된 풀을 스크리닝하는 것을 방지하였다.

제2 및 제3 라운드의 경우, 하위 풀에 대한 플레이트 스크리닝은 추가의 대조군을 포함하였다. 본 발명자들은 5주령의 망막 외식편으로부터의 조건화 배지를 제조하였다. 본 발명자들은 C57BL/6@N로부터 얻은 망막 외식편에 대해 양성 효과가 기록된 실험을 선택하고, 나머지는 제외하였다. 결과를 14개의 대조군 웰에 대한 배수 차이로서 플롯팅하였고, 대조군을 재산정하지는 않았다. 2개의 플레이트의 대조군에 대한 배수 차이를 곱하고, 배수 차이가 감소하는 방식으로 결과를 분류하였다.

단리된 cDNA를 모세관 서열분석기 (CEQ2000, 벡크만 코울터 (Beckman Coulter)) 상에서 T7 프라이머 (5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3')를 이용하여 서열분석하였다. DNA 서열을 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 데이타베이스와 비교하였다.

Rdcvf2 및 인간 상동체의 동정:

Rdcvf1 서열 (서열 2 또는 서열 4로 지칭되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열) 및 BLAST를 이용하여, 상동성인 뮤린 및 인간 폴리펩티드를 확인하였다 (도 8). 마우스 RdCVF2 (진뱅크 허가번호: bc016199)와 상동성인 EST 클론이 진뱅크 허가번호 be552141, bi517442, bg707818, bi603812, ai433287, be088414, bg297383, bg297304로 확인되었다 (도 12 참조). 마우스 Rdcvf1 (서열 1)과 상동성인 EST 클론이 진뱅크 허가번호 bg299078, ai716631, bg294111, be108041, bg395178로 확인되었다 (도 13 참조).

Rdcvf1 발현의 실시간 RT-PCR 분석:

5주령 마우스 C57BL/6@N 및 C3H/He@N 뿐만 아니라 유사 유전자형 (congenic) C3H (+/+ 및 rd/rd)에 의한 Rdcvf1의 망막 발현을 사이버그린 (sybergreen) PCR 킷트 (로슈 (Roche))를 구비한 광순환기 (lightcycler; 로슈) 상에서 실시간 RT-PCR을 이용하여 연구하였다. cDNA는 랜덤 6량체 올리고뉴클레오티드 (pdN6, 아머샴 (Amersham)), M-MLV 역전사효소 (수퍼스크립트 II, 라이프 테크놀로지즈) 및 1)에서 제조된 마우스 망막으로부터의 전체 RNA로 프라이밍시킴으로써 제조하였다. cDNA를 편재된 메신저 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 (G6PDH)를 이용하여 정규화하였다. 제1 가닥 cDNA 합성체 0.2 ㎕ (전체 RNA 10 ng에 해당)을 95℃에서 30초 및 35회 사이클 (한 사이클의 순서: 95℃에서 1초, 55℃에서 18초, 72℃에서 10초)의 프로그램에 따라 서열 24 및 서열 25의 올리고뉴클레오티드 2 μM을 이용하여 25 ㎕의 전체 부피에서 3배 증폭시켰다. 분석 결과 (도 16), Rdcvf1 발현은 rd1 마우스 (C3H/He@N)에서 간상세포 퇴화후에 감소된 것으로 나타났다. Rdcvf1 또한 진동 박편기에 의해 망막의 외층으로부터 제조된 RNA를 이용하여 실시간 RT-PCR에 의해서 광수용체에 의해 직접 발현되는 것으로 나타났다. 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다. 유사한 결과를 또다른 쌍의 Rdcvf1 특이적 프라이머에서 수득하였다. 양성 대조군으로서, 간상세포 어레스틴 (허가번호 M24086)의 발현을 프라이머 (5' CTATTACGTCAAGCCTGTAGCC 3' 및 5' CATCCTCATCTTTCTTCCCTTC 3')를 이용하는 동일한 조건으로 모니터링하였다. Rdcvf1이 원추세포 보호 인자라는 것은 적합한 양의 Rdcvf1을 5주령 rd1 마우스 (C3H/He@N)의 망막 외식편에 첨가 함으로써 확인할 수 있다. 적합한 양은 일부 초기 적정 실험에 의해 도출할 수 있다. 7일 후, 원추세포의 생존이 적당한 대조군에 비해 증가할 것이다.

Rdcvf2의 RT-PCR 분석

Rdcvf2 발현에 대한 RT-PCR을 프라이머 5' GCCAGCGTTTTCTGCCTTTTAC 3' 및 5' AAGCCCTGCCTGCTCTAACATC 3'을 이용하여 수행하였다. 분석 결과, RdCVF2가 간상세포 의존적인 방식으로 발현되고, Rdcvf2 발현이 망막에서 제한적이지 않지만 다른 신경 세포 또한 Rdcvf2를 발현하는 것으로 나타난 반면 (도 17), Rdcvf1의 발현은 망막 세포로 제한되는 것으로 여겨진다.

Rdcvf1 또는 Rdcvf2의 생존/사멸 분석

COS-1 세포를 유도가능한 프로모터의 조절하에 Rdcvf1 또는 Rdcvf2를 갖는 적합한 발현 벡터로 형질감염시켰다. 대조군 세포는 빈 벡터로 형질감염시켰다. 세포를 Rdcvf1 또는 Rdcvf2 발현을 유도하는 적합한 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 생존 원추세포의 수를 Rdcvf1 또는 Rdcvf2로 형질감염된 COS-1 세포로부터의 조건화 배지와 함께 인큐베이션하고, 생존 대조군 세포의 수를 상기 기재한 방법에 따라 계수하였다. Rdcvf1 또는 Rdcvf2를 발현하는 세포는 상당히 많은 양이 생존하였다.

간상세포 특이적 인자

프라이머로서 서열 24 (5' TCTATGTGTCCCAGGACCCTACAG 3') 및 서열 25 (5' TTTATGCACAAGTAGTACCAGGACAG 3')을 이용하여 표준 조건하에 5주령 C57BL/6@N 및 C3H/HE@N로부터 얻은 망막 외식편에서 간상세포 어레스틴 (대조군) 및 Rdcvf1의 발 현에 대해 실시간 RT-PCR 분석한 결과, RdCVF1 (간상세포 유래된 CVF1)이 간상세포의 존재하에서만 발현된다는 것이 입증되었다.

폴리클로날 항체의 생성:

글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 정제된 융합 단백질 (GST-Rdcvf1) 뿐만 아니라 마우스 RdCVF1의 서열 2로부터의 펩티드 서열 아미노산 11 내지 32 (항체 2) 및 서열 2로부터의 펩티드 서열 아미노산 79 내지 96 (항체 3)을 토끼에게 주입하여 폴리클로날 항체를 제조하였다. 융합 작제물 pGST-Rdcvf1은 표준 조건하에 주형으로서 pcDNA-Rdcvf1을 이용하여 서열 26 및 서열 27의 올리고뉴클레오티드로 증폭시켜 제조하였다. Rdcvf1의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 BamHI 및 EcoRI 제한 부위 사이에서 pGex2TK (파마시아 (Pharmacia))에 프레임에 맞게 클로닝하고, 표준 절차에 의해 이. 콜라이 (E. coli) [BL21 (DE3) pLysS, 프로메가]으로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 30℃에서 앰피실린 100 ㎍/ml 존재하에 LB 액체 배지 3 ℓ에서 배양하고, 이소프로필티오-β-D-갈락토시드 (IPTG) 1 ㎍/ml을 첨가하여 단백질 생성을 유도하고, 30℃에서 5시간 동안 지속하였다. 세포를 수집하고, 초음파 처리에 의해 용균시키고, 표준 프로토콜하에 글루타티온 세파로스 상에서 정제하였다. 융합 단백질을 환원된 글루타티온 10 mM으로 실온에서 용출시켰다. 용출된 단백질을 토끼에게 주사하기 전에 PBS로 투석하였다. 단백질 순도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 모니터링하였다. 2마리의 토끼의 80개 부위에 정제된 GST-Rdcvf1 100 ㎍을 경피 주사하여 토끼를 면역화시켰다. 혈청을 8주 후에 수집하였다.

<110> UNIVERSITE LOUIS PASTEUR/ NOVARTIS AG <120> Disease associated protein <130> 4-31883 <160> 35 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 468 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (45)..(374) <223> <400> 1 atcggatccc tctctgggtc cccagctcct tgcatactgc tacc atg gca tct ctc 56 Met Ala Ser Leu 1 ttc tct gga cgc atc ttg atc agg aac aac agc gac cag gat gaa gtg 104 Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp Gln Asp Glu Val 5 10 15 20 gag aca gag gca gag ctg agc cgt agg tta gag aat cgt ctg gtg ttg 152 Glu Thr Glu Ala Glu Leu Ser Arg Arg Leu Glu Asn Arg Leu Val Leu 25 30 35 ctg ttc ttc ggc gcc ggc gcc tgt ccc cag tgc cag gcc ttt gcc cca 200 Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gln Cys Gln Ala Phe Ala Pro 40 45 50 gtc ctc aaa gac ttc ttc gtg cgg ctc act gac gag ttc tac gtg ctg 248 Val Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Tyr Val Leu 55 60 65 cgg gca gca cag ctg gcc ctg gtc tat gtg tcc cag gac cct aca gag 296 Arg Ala Ala Gln Leu Ala Leu Val Tyr Val Ser Gln Asp Pro 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Arg Arg Lys Tyr Arg Val Asp Arg Asp Val 180 185 190 Gly Gly Ser Gly Ala Lys Arg Arg Asp Ser Gly Glu Pro Gln Gly Asp 195 200 205 Ala Gly Thr Arg Ala Glu Leu Trp 210 215 <210> 5 <211> 353 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (24)..(353) <223> <400> 5 cccagcaccc aacccaggtt acc atg gcc tcc ctg ttc tct ggc cgc atc ctg 53 Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu 1 5 10 atc cgc aac aat agc gac cag gac gag ctg gat acg gag gct gag gtc 101 Ile Arg Asn Asn Ser Asp Gln Asp Glu Leu Asp Thr Glu Ala Glu Val 15 20 25 agt cgc agg ctg gag aac cgg ctg gtg ctg ctg ttc ttt ggt gct ggg 149 Ser Arg Arg Leu Glu Asn Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly 30 35 40 gct tgt cca cag tgc cag gcc ttc gtg ccc atc ctc aag gac ttc ttc 197 Ala Cys Pro Gln Cys Gln Ala Phe Val Pro Ile Leu Lys Asp Phe Phe 45 50 55 gtg cgg ctc aca gat gag ttc tat gta ctg cgg gcg gct cag ctg gcc 245 Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gln Leu Ala 60 65 70 ctg gtg tac gtg tcc cag gac tcc acg gag gag cag cag gac 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actcttcagc cattaaaaaa 1098 atgagattct gtcatttgca ataatataga tggaaaagga ggcccttatg tgaagtgaaa 1158 taagccaggc acagaaagac aaacatcaca tgttctcact tatttgtggg atctaatgat 1218 caaaacaatt gaactcttgg acatagagag tagaaggttg gttaccagaa gctggaaagg 1278 aaagtggggt tgggaggaag gtgggaatgg ttaataggta caaaaaaata caaagaataa 1338 ataagaccta atatttgata gcacaacagt gtgactactg tcaataatca tttaattgta 1398 catttaaaaa taactataat tgcattgttt gtaacacaaa agataaatgc ttgaggagaa 1458 aaaaaaaaaa aaaa 1472 <210> 14 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Val Asp Ile Leu Gly Glu Arg His Leu Val Thr Cys Lys Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Glu Ala Glu Ala Ala Leu Gln Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr 20 25 30 Phe Ala Ala Ala Arg Cys Ala Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu 35 40 45 Cys Asp Phe Tyr Thr Ala Leu Val Ala Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro 50 55 60 Phe Glu Val Val Phe Val Ser Ala Asp Gly Ser Cys Gln Glu Met Leu 65 70 75 80 Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ala Trp Leu Ala Leu Pro Phe His 85 90 95 Asp Pro Tyr Arg Gln Arg Ser 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ggccgagcgc ggggccgcgc cttcgaagtg gtcttcgtgt 240 cagccgacgg cagctcccag gagatgctgg acttcatgcg cgagctgatg gcgcctggct 300 ggcgctgcct tccacgaccc ctaccggcac agccggagcc 340 <210> 22 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tgtcctcggg tctcaggtgg ctgcgtgtct gcgccatggt tgacattctg ggcgagcggc 60 acctggtgac ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg 120 tggcactgta cttcgcggcg gcccggtgcg cgccgagccg cgacttcacg ccgctgctct 180 gcgacttcta tacggcgctg gtggccgagg cgcggcggcc cgcgcccttc gaagtggtct 240 tcgtgtcagc cgacggcagc tgccaggaga tgctggactt catgcgcgag ctgcatggcg 300 cctggctggc gctgcccttc cacgaaccct accggcaacg gagtctcg 348 <210> 23 <211> 350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tgtcctcggg tctcaggtgg ctgcgtgtct gcgccatggt tgacattctg ggcgagcggc 60 acctggtgac ctgtaagggc gcgacggtgg aggccgaggc ggcgctgcag aacaaggtgg 120 tggcactgta cttcgcggcg gcccggtgcg cgccgagccg cgacttcacg ccgctgctct 180 gcgacttcta tacggcgctg gtggccgagg cgcggcggcc cgcgcccttc gaagtggtct 240 tcgtgtcagc cgacggcagc tgccaggaga tgcttggact tcatgcgcga gctgcattgc 300 gcctggcttg gcgctgccct tccacgaccc ctaccggcaa cggagtctcg 350 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 tctatgtgtc ccaggaccct acag 24 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 tttatgcaca agtagtacca ggacag 26 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 cgggatccat ggcatctctc ttctctggac gc 32 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 ggaattctca cctcctcagt tcatcatgga a 31 <210> 28 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor <400> 28 tgttaccaat ctgaagtggg agcggccgac aatttttttt tttttttttt 50 <210> 29 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor <400> 29 aattcggcac gagg 14 <210> 30 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor <400> 30 cctcgtgccg 10 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 gtaatacgac 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Claims (28)

1. 서열 2 및 서열 4에 기재된 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드.
2. 서열 2 및 서열 4에 기재된 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 단리된 폴리펩티드.
3. 삭제
4. 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
5. 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 DNA의 단편을 적어도 포함하는 벡터 분자.
6. 제5항에 있어서, 전사 조절 서열을 포함하는 벡터 분자.
7. 삭제
8. 제5항에 따른 벡터 분자를 포함하는 숙주 세포.
9. 제1항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사를 조절하는 하나 이상의 전사 조절 서열을 포함하는, 시험관내에서 증식할 수 있고, 배양시 제1항에 따른 폴리펩티드를 생산할 수 있는 척추동물 숙주 세포.
10. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 전사 조절 DNA 서열이 비-인간 전사 조절 서열인 척추동물 숙주 세포.
11. 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 전사된 전령 RNA의 전사 수준을 (a) 시험 안구 조직 시료와 (b) 정상 안구 조직에서 측정하는 것을 포함하고, 여기서 정상 안구 조직과 비교하여 감소된 전사 수준의 존재가 인간이 망막 이영양증에 걸렸다는 증상을 나타내는 것인, 인간에서 망막 이영양증의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 상기 폴리뉴클레오티드로부터 전사된 전령 RNA의 전사 수준을 측정하는 방법.
12. 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 그의 단편의 양을 (a) 시험 간상세포 시료와 (b) 정상 안구 조직에서 측정하는 것을 포함하고, 여기서 정상 안구 조직에서의 상기 폴리펩티드 또는 그의 단편의 양과 비교하여 폴리펩티드 또는 그의 단편의 감소된 양의 존재가 인간이 망막 이영양증에 걸렸다는 증상을 나타내는 것인, 인간에서 망막 이영양증의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 상기 폴리펩티드 또는 그의 단편의 양을 측정하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 측정 단계가, 상기 조직을 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜, 상기 조직에서 폴리펩티드와 상기 항체의 특이적 결합을 검출하는 것을 포함하며, 여기서 폴리펩티드에 대한 특이적 결합의 검출은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 그의 단편의 존재를 나타내는 것인 방법.
14. 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 정제된 항체 또는 그의 Fab 또는 F(ab')₂ 단편.
15. 삭제
16. 제14항에 있어서, 폴리클로날 항체인 항체.
17. 제14항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
18. 시료를 수집하는 수단, 및 제14항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 인간의 망막 이영양증 진단용 킷트.
19. 외부에서 유래된 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터가 혼입된 숙주 세포를, 상기 숙주 세포에서 상기 폴리펩티드의 발현에 충분한 조건 하에서 배양함으로써 발현된 폴리펩티드의 생산을 유발하고, 상기 세포에 의해 생산된 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드의 생산 방법.
20. 전사 조절 서열과 작동가능하게 연결된, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는, 신경 세포가 퇴화되는 것을 예방하거나 퇴화되지 않도록 보호함으로써 망막 이영양증을 치료하기 위한 제약 조성물.
21. 제20항에 있어서, 상기 세포가 망막 세포인 제약 조성물.
22. 제21항에 있어서, 상기 벡터가 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래한 것인 제약 조성물.
23. 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14의 군으로부터 선택된 폴리펩티드, 및 임의로는 제약상 허용되는 담체를 포함하는 망막 보호제.
24. 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11 또는 서열 13의 군으로부터 선택된 치료 유효량의 핵산, 및 임의로는 제약상 허용되는 담체를 포함하는 망막보호제.
25. 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12 또는 서열 14의 군으로부터 선택된 치료 유효량의 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 망막 이영양증 치료용 제약 조성물.
26. 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11 또는 서열 13의 군으로부터 선택된 치료 유효량의 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 망막 이영양증 치료용 제약 조성물.
27. 삭제
28. 제25항에 있어서, 망막색소변성증, 노화-관련 황반 변성, 바르데트-비델 (Bardet-Biedel) 증후군, 바쎈-코른츠바이히 (Bassen-kornzweig) 증후군, 베스트병, 맥락막 결여, 맥락막 위축, 선천성 흑내장, 레프선 (Refsun) 증후군, 스타가르트 (Stargardt) 질환 또는 어셔 (Usher) 증후군을 치료하기 위한 제약 조성물.

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