ES2597835T3 - Proteína asociada a enfermedad - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido seleccionado del grupo de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:14, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

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Tal como se emplea en la presente, la expresión "secuencia de control transcripcional" se refiere a secuencias de ADN, tales como secuencias de iniciadores, secuencias de potenciadores y secuencias de promotores, que inducen, reprimen o controlan de otra forma la transcripción de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas a las cuales están unidas operablemente.

Tal como se emplean en la presente, "secuencias de control transcripcional de Rdcvf1" o "secuencias de control transcripcional de Rdcvf2" son cualquiera de las secuencias de control transcripcional que normalmente aparecen asociadas con un gen Rdcvf1 o Rdcvf2 de mamífero, preferiblemente con el gen Rdcvf2 tal como se encuentra en el genoma de ratón o humano.

Tal como se emplea en la presente, una "secuencia de control transcripcional no humana" es cualquier secuencia de control transcripcional que no se encuentra en el genoma humano.

El término "polipéptido" se emplea de manera intercambiable en la presente con los términos "polipéptidos", "proteína" y "proteínas".

Tal como se emplea en la presente, un "derivado químico" de un polipéptido de la invención es un polipéptido de la invención que contiene otros restos químicos que normalmente no son parte de la molécula. Estos restos pueden mejorar la solubilidad, la absorción, la semivida biológica, etc., de la molécula. Los restos, como alternativa, pueden disminuir la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario no deseable de la molécula, etc. Los restos capaces de mediar en dichos efectos se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980).

Tal como se emplea en la presente, un "agente neuroprotector" es un compuesto que previene o protege a las células neuronales de la degeneración. Un "agente retinoprotector" es un compuesto que previene o protege a las células retinianas de la degeneración.

La invención incluye moléculas de ácidos nucleicos, preferiblemente moléculas de ADN, tales como (1) un aislado que comprende una secuencia de nucleótido según se indica en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, (2) moléculas de ácidos nucleicos aisladas que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones de alta rigurosidad al ADN aislado indicado en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, y (3) secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan con los anteriores (1) o (2). Estas condiciones de hibridación pueden ser muy rigurosas o menos rigurosas, tal como se describió anteriormente. En los casos en que las moléculas de ácidos nucleicos son desoxioligonucleótidos ("oligos"), las condiciones de alta rigurosidad pueden referirse, por ejemplo, a un lavado en 6X SSC/pirofosfato de sodio al 0,05% a 37 °C (para oligos de 14 bases), 48 °C (para oligos de 17 bases), 55 °C (para oligos de 20 bases), y 60 °C (para oligos de 23 bases). Los intervalos adecuados de dichas condiciones de rigurosidad para los ácidos nucleicos de composiciones variables se describen en Krause y Aaronson (1991), Methods in Enzymology, 200:546-556, además de Maniatis et al., citado anteriormente.

Estas moléculas de ácidos nucleicos pueden actuar como moléculas antisentido de genes diana, útiles, por ejemplo en la regulación de genes diana y/o como cebadores antisentido en reacciones de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos de genes diana. Además, estas secuencias pueden emplearse como parte de secuencias de ribozimas y/o triple hélice que también son útiles para la regulación de genes diana. Además, dichas moléculas pueden emplearse como componentes de métodos de diagnóstico, por los cuales puede detectarse la presencia de un alelo que provoca enfermedad de RdCVF1 o RdCVF2.

La invención también incluye (a) vectores que contienen cualquiera de las secuencias codificadoras anteriores (es decir, sentido) y/o sus complementos (es decir, antisentido); (b) vectores de expresión que contienen cualquiera de la secuencias codificadoras anteriores asociadas operablemente con un elemento regulador que dirige la expresión de las secuencias codificadoras; y (c) células hospedantes genéticamente modificadas que contienen cualquiera de las secuencias codificadoras anteriores asociadas operablemente con un elemento regulador que dirige la expresión de las secuencias codificadoras en la célula hospedante. Tal como se emplean en la presente, los elementos reguladores incluyen, pero no se limitan a promotores inducibles y no inducibles, potenciadores, operadores y otros elementos conocidos por los expertos en la técnica que dirigen y regulan la expresión.

La invención incluye fragmentos de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente. Los fragmentos del gen Rdcvf1 o Rdcvf2 de longitud completa pueden emplearse como sonda de hibridación para un banco de ADNc para aislar el gen de longitud completa y para aislar otros genes que tienen una alta similitud de secuencia con el gen Rdcvf1 o Rdcvf2 y una actividad biológica similar. Las sondas de este tipo preferiblemente tienen al menos aproximadamente 30 bases y pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 bases, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 bases, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 bases, o más de 200 bases (por ejemplo, 300). La sonda también puede utilizarse para identificar un clon de ADNc que se corresponde con un transcrito de longitud completa y un clon o clones genómicos que contienen el gen Rdcvf1 o Rdcvf2 completo que incluye regiones reguladoras y de promotor, exones e intrones. Un ejemplo de una selección comprende aislar la región codificadora del gen Rdcvf1 o Rdcvf2 empleando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda oligonucleotídica, o el cebado aleatorio de la secuencia aislada descrita en la figura 1 a 8. Se emplean oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementaria

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Además, puede construirse un banco de expresión empleando ADN aislado o ADNc sintetizado a partir de un tejido que se sabe o se sospecha que expresa el gen de interés en un individuo sospechoso de portar el alelo mutante. De esta manera, los productos génicos fabricados por el tejido mutante putativo pueden expresarse y seleccionarse empleando técnicas de selección de anticuerpos convencionales, junto con anticuerpos generados contra el producto génico normal, tal como se describe a continuación (para las técnicas de selección, véase, por ejemplo, Harlow, E. y Lane, eds., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor.) En los casos en que la mutación produce un producto génico expresado con una función alterada (por ejemplo, como resultado de una mutación de sentido erróneo), es probable que un conjunto policlonal de anticuerpos presente reacción cruzada con el producto del gen mutante. Los clones del banco detectados a través de su reacción con dichos anticuerpos marcados pueden purificarse y someterse a un análisis de secuencia tal como se describió anteriormente.

Los productos del gen diferencialmente expresado incluyen las proteínas codificadas por la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13, en particular, un polipéptido que es o que incluye la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:14.

Además, los productos génicos expresados pueden incluir proteínas que representan productos génicos funcionalmente equivalentes. Este producto génico equivalente puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de restos aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias génicas diferencialmente expresadas descritas anteriormente, pero que producen un cambio silencioso, produciendo así un producto del gen diferencialmente expresado funcionalmente equivalente (polimorfismos). Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse basándose en la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los restos implicados y la comparación con secuencias de aminoácidos de otras especies.

Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina; los aminoácidos de carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos de carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. "Funcionalmente equivalente," tal como se emplea en la presente, puede referirse a una proteína o un polipéptido capaz de mostrar una actividad in vivo o in vitro sustancialmente similar a los productos del gen diferencialmente expresado endógenos codificados por las secuencias del gen diferencialmente expresado descritas anteriormente. "Funcionalmente equivalente" también puede referirse a proteínas o polipéptidos capaces de interaccionar con otras moléculas celulares o extracelulares de una manera similar a la manera en que lo haría la correspondiente porción del producto del gen diferencialmente expresado endógeno. Por ejemplo, un péptido "funcionalmente equivalente" será capaz, en un inmunoensayo, de disminuir la unión de un anticuerpo con el correspondiente péptido (es decir, la secuencia de aminoácidos peptídica que se modificó para lograr el péptido "funcionalmente equivalente") de la proteína endógena, o la propia proteína endógena, habiéndose generado este anticuerpo contra el correspondiente péptido de la proteína endógena. Una concentración equimolar del péptido funcionalmente equivalente disminuirá la unión mencionada del correspondiente péptido en al menos aproximadamente 5%, preferiblemente entre aproximadamente 5% y 10%, más preferiblemente entre aproximadamente 10% y 25%, aún más preferiblemente entre aproximadamente 25% y 50%, y lo más preferiblemente entre aproximadamente 40% y 50%.

Los productos del gen diferencialmente expresado pueden ser producidos mediante la tecnología del ADN recombinante empleando técnicas muy conocidas en la técnica. Así, en la presente se describen métodos para preparar los polipéptidos y péptidos del gen diferencialmente expresado de la invención expresando el ácido nucleico que codifica las secuencias del gen diferencialmente expresado. Los métodos, que son muy conocidos por los expertos en la técnica, pueden utilizarse para construir vectores de expresión que contiene la secuencias codificadoras de la proteína del gen expresado y las señales de control transcripcional/traduccional apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación genética. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1989, supra, y Ausubel et al., 1989, supra. Como alternativa, un ARN o ADNc capaz de codificar secuencias de proteínas del gen expresado puede sintetizarse de modo químico empleando, por ejemplo, sintetizadores. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en "Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

Puede utilizarse una diversidad de sistemas de hospedante-vector de expresión para expresar las secuencias codificadoras de los genes diferencialmente expresados de la invención. Estos sistemas de hospedante-expresión representan vehículos mediante los cuales pueden producirse secuencias codificadoras de interés y después purificarse, pero también representan células que, cuando se transforman o se transfectan con las secuencias codificadoras de nucleótidos apropiadas, pueden expresar la proteína del gen diferencialmente expresado de la invención in situ. Estos incluyen, pero no se limitan a microorganismos, tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformados con vectores de expresión recombinantes de ADN de bacteriófago, ADN plasmídico o ADN cosmídico que contienen secuencias codificadoras de proteínas de genes diferencialmente expresados; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen las secuencias codificadoras de proteínas de genes diferencialmente expresados; sistemas de células de

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insertarse en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción de una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, la región E1 o E3) producirá un virus recombinante que es viable y es capaz de expresar la proteína del gen diferencialmente expresado en hospedantes infectados (por ejemplo, véase Logan y Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3655-3659). También pueden ser necesarias señales de inicio específicas para una traducción eficaz de las secuencias codificadoras del gen diferencialmente expresado insertado. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. En los casos en que un gen diferencialmente expresado completo, que incluya su propio codón de inicio y las secuencias adyacentes, se inserte en el vector de expresión apropiado, es posible que no sean necesarias más señales de control traduccional. Sin embargo, en los casos en que solo se inserta una porción de la secuencia codificadora del gen diferencialmente expresado, deben proporcionarse señales de control traduccional exógenas, que incluyen, quizás, el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificadora deseada para asegurar la traducción de la inserción completa. Estas señales de control traduccional exógenas (secuencia Kozack) y los codones de inicio pueden tener una diversidad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción adecuados, terminadores de la transcripción, etc. (véase Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol., 153:516-544).

La selección de los vectores y promotores apropiados para la expresión en una célula hospedante es un procedimiento muy conocido y la técnicas necesarias para la construcción de vectores de expresión, la introducción del vector en el hospedante y la expresión en el hospedante son técnicas habituales per se en la técnica.

En general, los vectores de expresión recombinantes incluyen orígenes de la replicación, un promotor derivado de un gen muy expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural cadena abajo, y un marcador seleccionable para permitir el aislamiento de las células que contienen el vector después de la exposición al vector.

Además, puede elegirse una cepa de células hospedantes que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico en el modo específico deseado. Estas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, ruptura) de productos de proteínas pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospedantes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de proteínas. Pueden elegirse las líneas celulares o los sistemas de hospedante apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Para este fin, pueden utilizarse células hospedantes eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Estas células hospedantes de mamífero incluyen, pero no se limitan a CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, etc.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden modificarse líneas celulares que expresan de forma estable la proteína diferencialmente expresada. En lugar de emplear vectores de expresión que contienen orígenes de la replicación víricos, las células hospedantes pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, secuencias de promotores y potenciadores, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, las células modificadas pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar de modo estable el plásmido en sus cromosomas y crecer para formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede utilizarse de modo ventajoso para modificar líneas celulares que expresan la proteína diferencialmente expresada. Estas líneas celulares modificadas pueden ser particularmente útiles para la selección y la evaluación de compuestos que afectan a la actividad endógena de la proteína diferencialmente expresada. Estas líneas celulares estables pueden utilizarse como forma de terapia celular directamente o después de la encapsulación.

Puede utilizarse una serie de sistemas de selección que incluyen, pero no se limitan a los genes de timidina quinasa del virus del herpes simplex (Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:2026), y de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy, et al., 1980, Cell 22:817) en células tk-, hgprt-o aprt -, respectivamente. Además puede emplearse la resistencia a antimetabolitos como base para la selección del gen dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527); gen gpt, que confiere resistencia al ácido micofénolico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072); gen neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol., 150:1); y gen hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre, et al., 1984, Gene, 30:147).

Un sistema de proteínas de fusión alternativo permite la purificación sencilla de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas celulares humanas (Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8972-8976). En este sistema, el gen de interés se subclona en un plásmido de recombinación de vaccinia de modo que el marco de lectura abierto del gen se condensa traduccionalmente con un marcador amino-terminal que consiste en seis restos histidina. Extractos de células infectadas con el virus de vaccinia recombinante se cargan en una columna de agarosa-ácido nitriloacético Ni2+ y las proteínas marcadas con histidina se eluyen selectivamente con tampones que contienen imidazol.

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Cuando se emplea como un componente en sistemas de ensayo tales como los descritos a continuación, la proteína diferencialmente expresada puede marcarse, de modo directo o indirecto, para facilitar la detección del complejo formado entre la proteína diferencialmente expresada y una sustancia de ensayo. Puede utilizarse cualquiera de una diversidad de sistemas de marcaje adecuados que incluyen, pero no se limitan a radioisótopos, tales como 125I; sistemas de marcaje de enzimas que generan una señal calorimétrica detectable o luz cuando se exponen al sustrato; y marcadores fluorescentes.

Cuando se emplea la tecnología del ADN recombinante para producir la proteína diferencialmente expresada en dichos sistemas de ensayo, puede resultar ventajoso modificar proteínas de fusión que puedan facilitar el marcaje, la inmovilización y/o la detección.

El marcaje indirecto implica el uso de una proteína, tal como un anticuerpo marcado, que se une específicamente a un producto de un gen diferencialmente expresado. Estos anticuerpos incluyen, pero no se limitan a anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, monocatenarios, fragmentos Fab y fragmentos producidos por un banco de expresión de Fab.

En otra realización, los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica una proteína de RDCVF1 o RDCVF2 se administran para estimular la función de los conos, como una terapia génica. Una terapia génica se refiere a una terapia realizada mediante la administración de un ácido nucleico a un sujeto. En esta realización de la invención, el ácido nucleico produce su proteína codificada, que media en un efecto terapéutico estimulando la función de los conos.

Cualquiera de los métodos de terapia génica disponibles en la técnica puede utilizarse según la presente invención. A continuación se describen ejemplos de métodos.

En un aspecto preferido, el producto terapéutico comprende un ácido nucleico de Rdcvf1 o Rdcvf2 que es parte de un vector de expresión que expresa una proteína de RDCVF1 o RDCVF2 o uno de sus fragmentos o proteínas quiméricas, en un hospedante adecuado. En particular, dicho ácido nucleico presenta un promotor operablemente unido a la región codificadora de Rdcvf1 o Rdcvf2 y dicho promotor es inducible o constitutivo y, opcionalmente, específico de tejido. En otra realización particular, se emplea una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias codificadoras de Rdcvf1 o Rdcvf2 y cualquier otra secuencia deseada están flanqueadas por regiones que estimulan la recombinación homóloga en un sitio deseado en el genoma, proporcionando con ello la expresión intracromosómica del ácido nucleico de Rdcvf1 o Rdcvf2 (Koller y Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature, 342:435-438).

La administración del ácido nucleico al paciente puede ser directa, en cuyo caso el paciente se expone directamente al ácido nucleico o al vector que porta el ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso las células primero se transforman con el ácido nucleico in vitro, y después se transplantan al paciente. Estas dos estrategias se conocen, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo.

En una realización específica, el ácido nucleico se administra directamente in vivo, en donde se expresa para producir el producto codificado. Esto puede lograrse mediante cualquiera de numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de modo que deviene intracelular, por ejemplo, mediante una infección empleando un vector retrovírico defectuoso o atenuado u otro vector vírico (adenovirus, virus adenoasociado y lentivirus) (véase, por ejemplo, la patente de EEUU n.º 4.980.286 y otras mencionadas infra), o mediante inyección directa de ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont),

o revistiendo con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transección, encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, o mediante su administración unido a un péptido que se sabe que entra en el núcleo, mediante su administración unido a un ligando sometido a la endocitosis mediada por receptor (véanse, por ejemplo, las patentes de EEUU 5.166.320; 5.728.399; 5.874.297; y 6.030.954) (que puede utilizarse para localizar tipos celulares que expresan específicamente los receptores), etc. En otra realización, puede formarse un complejo de ácido nucleico-ligando en el que el ligando comprende un péptido vírico fusogénico para alterar los endosomas, lo cual permite al ácido nucleico evitar la degradación lisosómica. En otra realización, el ácido nucleico puede dirigirse in vivo para la captación específica de célula y la expresión, mediante el transporte dirigido a un receptor específico (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; WO93/14188; y WO 93/20221). Como alternativa, el ácido nucleico puede introducirse de modo intracelular e incorporarse dentro del ADN de la célula hospedante para su expresión mediante recombinación homóloga (véanse, por ejemplo, las patentes de EEUU 5.413.923; 5.416.260; and 5.574.205; y Zijlstra et al., 1989, Nature, 342:435-438).

En una realización específica, se emplea un vector vírico que contiene el ácido nucleico de Rdcvf1 o Rdcvf2. Por ejemplo, puede emplear un vector retrovírico (véanse, por ejemplo, las patentes de EEUU 5.219.740; 5.604.090; y 5.834.182). Estos vectores retrovíricos se han modificado para delecionar las secuencias retrovíricas que no son necesarias para la encapsulación del genoma vírico y la integración en el ADN de la célula hospedante. El ácido nucleico de Rdcvf1 o Rdcvf2 que se va a utilizar en la terapia génica se clona en el vector, lo cual facilita el transporte del gen a un paciente.

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Los adenovirus son otros vectores víricos que pueden emplearse en terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para transportar genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus naturalmente infectan al epitelio respiratorio, en donde provocan una enfermedad suave. Otras dianas para los sistemas de transporte basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales y el músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de que son capaces de infectar a células que no se encuentran en división. Los métodos para realizar terapias génicas basadas en adenovirus se describen, por ejemplo, en las patentes de EEUU 5.824.544; 5.868.040; 5.871.722; 5.880.102; 5.882.877; 5.885.808; 5.932.210; 5.981.225; 5.994.106; 5.994.132; 5.994.134; 6.001.557; y 6.033.8843.

Los virus adenoasociados (AAV) también se han propuesto para su uso en la terapia génica. Los virus adenoasociados son vehículos especialmente atractivos para transportar genes a la retina. Se describen métodos para producir e utilizar AAV, por ejemplo, en las patentes de EEUU 5.173.414; 5.252.479; 5.552.311; 5.658.785; 5.763.416; 5.773.289; 5.843.742; 5.869.040; 5.942.496; y 5.948.675.

Otra estrategia en la terapia génica implica la transferencia de un gen a células en cultivo de tejido mediante métodos tales como la electroporación, la lipofección, la transfección mediada por fosfato de calcio o la infección vírica. Habitualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Después las células se colocan bajo una selección para aislar las células que han captado y están expresando el gen transferido. Estas células después se administran a un paciente directamente o después de una encapsulación.

En esta realización, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Esta introducción puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluye, pero no se limita a transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector vírico o de bacteriófago que contiene las secuencias de ácidos nucleicos, fusión de células, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos, etc. En la técnica se conocen numerosas técnicas para la introducción de genes extraños en células y estas pueden utilizarse según la presente invención, con la condición de que no se alteren las funciones fisiológicas y del desarrollo necesarias de las células receptoras. La técnica debe proporcionar la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que el ácido nucleico pueda ser expresado por la célula y preferiblemente se herede y pueda ser expresado por la progenie de la célula.

Las células recombinantes resultantes pueden administrarse a un paciente mediante diversos métodos conocidos en la técnica. En una realización preferida, se inyectan células epiteliales, por ejemplo, por vía subcutánea. En otra realización, las células de la piel recombinantes pueden aplicarse como un injerto de piel al paciente. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células pluripotenciales o progenitoras hematopoyéticas) se administran preferiblemente por vía intravenosa. La cantidad de células prevista para su uso depende del efecto deseado, del estado del paciente, etc., y puede ser determinada por los expertos en la técnica.

Las células en las que puede introducirse un ácido nucleico para fines de terapia génica incluyen cualquier tipo de célula deseada y disponible, e incluyen, pero no se limitan a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas, tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células pluripotenciales o progenitoras, en particular, células pluripotenciales o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, obtenidas de la médula ósea, sangre de cordón umbilical, sangre periférica; hígado fetal, etc.

En una realización preferida, la célula empleada para la terapia génica es autóloga al paciente.

En una realización en la que se emplean células recombinantes en terapia génica, se introduce un ácido nucleico de Rdcvf1 o Rdcvf2 en las células de modo que pueda ser expresado por las células o su progenie, y las células recombinantes después se administran in vivo para lograr un efecto terapéutico. En una realización específica, se emplean células pluripotenciales o progenitoras. Cualquier célula pluripotencial y/o progenitora que pueda aislarse y mantenerse in vitro puede emplearse potencialmente según esta realización de la presente invención. Estas células pluripotenciales incluyen, pero no se limitan a células pluripotenciales hematopoyéticas (HSC), células pluripotenciales de tejidos epiteliales, tales como la piel y el revestimiento del intestino, células de músculo cardíaco embrionario, células pluripotenciales del hígado (véase, por ejemplo, el documento WO 94/08598), y células pluripotenciales neurales (Stemple y Anderson, 1992, Cell, 71:973-985).

Pueden obtenerse células pluripotenciales epiteliales (ESC) o queratinocitos a partir de tejidos tales como la piel y el revestimiento del intestino mediante procedimientos conocidos (Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio., 21A:229). En un tejido epitelial estratificado, tal como la piel, la renovación se produce por mitosis de las células pluripotenciales dentro de la capa germinal, la capa más cercana a la lámina basal. Las células pluripotenciales dentro del revestimiento del intestino proporcionan una tasa de renovación rápida de este tejido. Las ESC o queratinocitos obtenidos de la piel o el revestimiento del intestino de un paciente o donante pueden cultivarse en cultivo de tejidos (Pittelkow y Scott, 1986, Mayo Clinic Proc., 61:771). Si las ESC son proporcionadas por un donante, también puede emplearse un método para la supresión de la reactividad del hospedante contra el injerto (por ejemplo, irradiación, administración de fármacos o anticuerpos para estimular una inmunosupresión moderada). Células pluripotenciales

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retinianas (Tropepe et al., 2000, Science, 287:2032).

Con respecto a las células pluripotenciales hematopoyéticas (HSC), puede utilizarse cualquier técnica que proporcione el aislamiento, la propagación y el mantenimiento in vitro de HSC en esta realización de la invención. Las técnicas mediante las cuales esto puede lograrse incluyen (a) el aislamiento y el establecimiento de cultivos de HSC a partir de células de la médula ósea aisladas a partir del futuro hospedante o de un donante, o (b) el uso de cultivos de HSC a largo plazo previamente establecidos, que pueden ser alogeneicos o xenogeneicos. Preferiblemente, se emplean HSC no autólogas junto con un método para suprimir las reacciones inmunológicas de transplante del futuro hospedante/paciente. En una realización concreta de la presente invención, pueden obtenerse células de la médula ósea humanas a partir de la cresta ilíaca posterior mediante una aspiración con aguja (véase, por ejemplo, Kodo et al., 1984, J. Clin. Invest., 73:1377-1384). En una realización preferida de la presente invención, se puede enriquecer en gran medida las HSC o proporcionarse en forma sustancialmente pura. Este enriquecimiento puede realizarse antes, durante o después del cultivo a largo plazo, y esto puede realizarse por medio de cualquier técnica conocida en la técnica. Los cultivos a largo plazo de células de la médula ósea pueden establecerse y mantenerse empleando, por ejemplo, técnicas de cultivo de células Dexter modificadas (Dexter et al., 1977, J. Cell Physiol., 91:335) o técnicas de cultivo de Witlock-Witte (Witlock y Witte, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:3608-3612).

En una realización específica, el ácido nucleico que se va a introducir para una terapia génica comprende un promotor inducible unido operablemente con la región codificadora, de modo que la expresión del ácido nucleico pueda ser controlada controlando la presencia o la ausencia del inductor de la transcripción apropiado.

En la presente se describen métodos para la producción de anticuerpos capaces de reconocer específicamente uno

o más epitopos de genes diferencialmente expresados. Estos anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAb), anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos por un banco de expresión de Fab, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id), y fragmentos de unión al epitopo de cualquiera de los anteriores. Estos anticuerpos pueden utilizarse, por ejemplo, para la detección de una huella, diana, gen en una muestra biológica o, como alternativa, como un método para la inhibición de la actividad anómala del gen diana. Así, estos anticuerpos pueden utilizarse como parte de métodos de tratamiento de enfermedades y/o pueden utilizarse como parte de técnicas de diagnóstico, por las cuales los pacientes pueden ensayarse para detectar unos niveles anómalos de Rdcvf1 o Rdcvf2, o para detectar la presencia de formas anómalas de Rdcvf1 o Rdcvf2 tomando muestras del humor acuoso y/o vítreo mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, Forster, R.K., Abbott, R.L., Gelender, H. (1980), Management of infectious endophthalmitis, Ophthalmology, 87,313-319)].

Para la producción de anticuerpos contra un gen diferencialmente expresado, diversos animales hospedantes pueden ser inmunizados mediante una inyección con una proteína diferencialmente expresada, o una de sus porciones, o mediante inmunización de ADN. Estos animales hospedantes pueden incluir, pero no se limitan a conejos, ratones y ratas, por nombrar a unos cuantos. Pueden utilizarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedante, e incluyen, pero no se limitan a adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivos, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas del suero de animales inmunizados con un antígeno, tal como un producto génico diana, o con uno de sus derivados funcionales antigénicos. Para la producción de anticuerpos policlonales, pueden inmunizarse animales hospedantes, tales como los descritos anteriormente, mediante una inyección con el producto del gen diferencialmente expresado, suplementada con adyuvantes, tal como también se describió anteriormente.

Los anticuerpos monoclonales, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos contra un antígeno concreto, pueden obtenerse mediante cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero no se limitan a la técnica del hibridoma de Kohler y Milstein, (1975, Nature, 256:495-497; y la patente de EEUU n.º 4.376.110), la técnica del hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030), y la técnica del hibridoma-EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 7796). Estos anticuerpos pueden pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulinas, que incluyen IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquiera de sus subclases. El hibridoma que produce el mAb de esta invención puede cultivarse in vitro o in vivo. La producción de altas titulaciones de mAb in vivo hace que este sea el método de producción preferido.

Además, pueden emplearse las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454) cortando los genes de una molécula de anticuerpo de ratón con la especificidad de antígeno apropiada, junto con los genes de una molécula de anticuerpo humana con la actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como los que presentan una región variable o hipervariable derivada de un mAb murino y una región constante

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de inmunoglobulina humana.

Como alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de EEUU n.º 4.946.778; Bird, 1988, Science, 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature, 334:544-546) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios de genes diferencialmente expresados. Los anticuerpos monocatenarios se forman por la unión de fragmentos de la cadena pesada y ligera de la región Fv a través de un puente de aminoácido, lo cual produce un polipéptido monocatenario.

Lo más preferiblemente, las técnicas útiles para la producción de "anticuerpos humanizados" pueden adaptarse para producir anticuerpos contra los polipéptidos, fragmentos, derivados y equivalentes funcionales descritos en la presente. Estas técnicas se describen en las patentes de EEUU n.os 5.932.448; 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; 5.530.101; 5.910.771; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.545.580; 5.661.016; y 5.770.429.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpos que reconocen epitopos específicos mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero no se limitan a fragmentos F(ab')2 que pueden producirse mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo, y fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Como alternativa, también pueden construirse bancos de expresión de Fab (Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada.

Se prefiere particularmente, por la facilidad de detección, el ensayo de "sandwich", del cual existen una serie de variaciones, todas las cuales se pretende que se incluyan en la presente invención.

Por ejemplo, en un ensayo directo típico, un anticuerpo sin marcar se inmoviliza sobre un sustrato sólido y la muestra que se va a ensayar se pone en contacto con la molécula unida. Después de un periodo de incubación adecuado se deja el tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo binario de anticuerpo-antígeno. En este punto, se añade un segundo anticuerpo marcado con una molécula indicadora capaz de inducir una señal detectable, y se incuba durante un tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo ternario de anticuerpo-antígeno-anticuerpo marcado. Cualquier material sin reaccionar se lava y se determina la presencia del antígeno mediante la observación de una señal, o puede cuantificarse mediante la comparación con una muestra control que contiene cantidades conocidas de antígeno. Las variaciones en el ensayo directo incluyen el ensayo simultáneo, en el que la muestra y el anticuerpo se añaden simultáneamente al anticuerpo unido, o un ensayo inverso, en el que el anticuerpo marcado y la muestra que se va a ensayar primero se reúnen, se incuban y se añaden al anticuerpo unido a la superficie sin marcar. Estas técnicas son muy conocidas por los expertos en la técnica y serán evidentes las posibilidades de realizar pequeñas variaciones. Tal como se emplea en la presente, un "ensayo de sandwich" incluye todas las variaciones de la técnica de dos sitios básica. Para los inmunoensayos de la presente invención, el único factor limitante es que los anticuerpos no marcados y marcados sean anticuerpos específicos de RdCVF1 o RdCVF2.

Las moléculas indicadoras que se emplean más habitualmente en este tipo de ensayo son enzimas o moléculas que contienen fluoróforos o radionúclidos. En el caso de un inmunoensayo de enzimas, una enzima se conjuga con el segundo anticuerpo, habitualmente por medio de glutaraldehído o peryodato. Sin embargo, tal como se reconocerá, existe una amplia diversidad de diferentes técnicas de acoplamiento, que son muy conocidas por los expertos en la técnica. Las enzimas que se emplean habitualmente incluyen peroxidasa de rábano, glucosa oxidasa, betagalactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos que se emplean con las enzimas específicas se eligen, en general, por la producción, tras la hidrólisis de la correspondiente enzima, de un cambio de color detectable. Por ejemplo, el fosfato de p-nitrofenilo resulta adecuado para su uso con conjugados de fosfatasa alcalina; para los conjugados de peroxidasa se emplean habitualmente 1,2-fenilendiamina o toluidina. También es posible emplear sustratos fluorogénicos, que producen un producto fluorescente, en lugar de los sustratos cromogénicos indicados anteriormente. Después se añade una disolución que contenga el sustrato apropiado al complejo ternario de anticuerpo-RdCVF1-o RdCVF2-anticuerpo marcado. El sustrato reacciona con la enzima unida al segundo anticuerpo, produciendo una señal visual cualitativa que después puede cuantificarse, habitualmente de modo espectrofotométrico, para producir una evaluación de la cantidad de Rdcvf1 o Rdcvf2 que está presente en la muestra de suero.

Como alternativa, pueden acoplarse de modo químico compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, a los anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Cuando se activan mediante iluminación con una luz de una longitud de onda concreta, el anticuerpo marcado con el fluorocromo absorbe la energía lumínica, lo cual induce un estado excitabilidad en la molécula, seguido de la emisión de luz a una longitud de onda característica. La emisión aparece como un color característico visualmente detectable con un microscopio óptico. Las técnicas de inmunofluorescencia y de EIA están bien establecidas en la técnica y son particularmente preferidas para el presente método. Sin embargo, también pueden emplearse otras moléculas indicadoras, tales como radioisótopos, moléculas quimioluminiscentes o bioluminiscentes. A los expertos en la técnica les resultará evidente cómo variar el procedimiento para ajustarse al uso requerido.

Esta invención también se refiere al uso de los polinucleótidos de la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada del gen que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que

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También pueden determinarse las diferencias en la secuencia de ADNc o genómica entre individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados, pero no en ninguno de los individuos normales, entonces es probable que la mutación sea el agente causal de la enfermedad.

Otra realización de la invención se refiere a la administración de una composición farmacéutica junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para cualquiera de los efectos terapéuticos analizados anteriormente. Estas composiciones farmacéuticas pueden consistir en Rdcvf1 o Rdcvf2, miméticos o agonistas. Las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, que puede administrarse en cualquier vehículo estéril, biocompatible, que incluye, pero no se limita a disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa y agua. Las composiciones se pueden administrar a un paciente solas o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.

Las composiciones farmacéuticas incluidas en la invención pueden administrarse mediante cualquiera de una serie de vías: por ejemplo, la administración transescleral de la proteína biorreactiva al coroide y la retina (Ambati et al. (2000), Investigative Ophthalmology and Visual Science, 41, 1186). La formulación de preparaciones oftálmicas tópicas, que incluyen disoluciones, suspensiones y ungüentos oftálmicos, es muy conocida por los expertos en la técnica (véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, capítulo 86, pp. 1581-1592, Mack Publishing Company, 1990). Están disponibles otras vías de administración, que incluyen inyecciones intracamerales (que pueden realizarse directamente en la cámara anterior o directamente en la cámara vítrea), inyecciones subconjuntivales e inyecciones retrobulbares, y los métodos y medios para producir preparaciones oftálmicas adecuadas para estas vías de administración también son muy conocidos.

Tal como se emplea en esta solicitud, "extraocular" se refiere a la superficie ocular y al espacio (externo) entre el globo ocular y el párpado. Los ejemplos de regiones extraoculares incluyen el fórnix del párpado o saco conjuntival, la superficie conjuntival y la superficie corneal. Esta localización es externa a todos los tejidos oculares y no se requiere un procedimiento invasivo para acceder a esta región. Los ejemplos de sistemas extraoculares incluyen insertos y gotas, geles o ungüentos aplicados "por vía tópica" que pueden utilizarse para administrar un material terapéutico a estas regiones. Los dispositivos extraoculares en general pueden extraerse con facilidad, incluso por el propio paciente.

Las siguientes patentes describen sistemas extraoculares que se emplean para administrar fármacos a las regiones extraoculares. Higuchi et al. describen en las patentes de EEUU n.os 3.981.303, 3.986.510 y 3.995.635, un inserto ocular biodegradable que contiene un fármaco. El inserto puede fabricarse con diferentes formas para la retención en el saco conjuntival del globo ocular, el espacio extraocular entre el globo ocular y el párpado. Se describen varios polímeros biocompatibles habituales como adecuados para su uso en la fabricación de este dispositivo. Estos polímeros incluyen alginato de cinc, poli(ácido láctico), polianhídridos y poli(ácido glicólico). Las patentes también describen dispositivos revestidos con membrana con una permeación reducida para el fármaco y cámaras huecas que contienen la formulación de fármaco.

Theeuwes, patente de EEUU n.º 4.217.898, describe depósitos microporosos que se emplean para la administración controlada de fármacos. Estos dispositivos se colocan de modo extraocular en el saco conjuntival ocular. Entre los sistemas de polímeros de interés se incluyen copolímeros de poli(cloruro de vinilo)-co-poli(acetato de vinilo). Kaufman describe, en las patentes de EEUU n.os 4.865.846 y 4.882.150, un sistema de administración de fármacos oftálmicos que contiene al menos un material bioerosionable o vehículo de ungüento para el saco conjuntival. La patente describe sistema poliméricos, tales como polilactida, poliglicólido, poli(alcohol vinílico) y colágeno reticulado, como sistemas de administración adecuados.

En el uso descrito en la presente del producto de proteína de RDCVF1 o RDCVF2 para el tratamiento de enfermedades o lesiones retinianas también resulta ventajoso que una formulación oftálmica de aplicación tópica incluya un agente para estimular la penetración o el transporte del agente terapéutico al ojo. Estos agentes son conocidos en la técnica. Por ejemplo, Ke et al., patente de EEUU n.º 5.221.696, describe el uso de materiales para potenciar la penetración de preparaciones oftálmicas a través de la córnea.

Los sistemas intraoculares son los sistemas que son adecuados para su uso en cualquier compartimento tisular dentro, entre o alrededor de las capas de tejido del propio ojo. Estas localizaciones incluyen la subconjuntival (bajo la membrana mucosa ocular adyacente al globo ocular), orbital (detrás del globo ocular), e intracameral (dentro de la cámaras del propio globo ocular). Por contraste con los sistemas extraoculares, es necesario un procedimiento invasivo que consiste en la inyección o la implantación para acceder a estas regiones.

Las siguientes patentes describen dispositivos intraoculares. Wong, patente de EEUU n.º 4.853.224, describe fármacos microencapsulados para la introducción en la cámara del ojo. Los polímeros que se emplean en este sistema incluyen poliésteres y poliéteres. Lee, patente de EEUU n.º 4.863.457, describe un dispositivo biodegradable que se implanta quirúrgicamente de modo intraocular para la liberación sostenida de agentes terapéuticos. El dispositivo está diseñado para la implantación quirúrgica bajo la conjuntiva (membrana mucosa del globo ocular). Krezancaki, patente de EEUU n.º 4.188.373, describe un vehículo farmacéutico que gelifica a la temperatura corporal humana. Este vehículo es una suspensión acuosa del fármaco y derivados sintéticos procedentes de gomas o celulosa. Haslam et al. describen, en las patentes de EEUU n.os 4.474.751 y 4.474.752, un sistema de

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Los núcleos de grageas pueden emplearse junto con revestimientos adecuados, tales como disoluciones de azúcares concentrados, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o revestimientos de grageas para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad del compuesto activo, es decir, la dosificación.

Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas, hechas de gelatina y un revestimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos en mezcla con una carga o ligantes, tales como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos líquidos o polietilenglicol líquido con o sin estabilizantes.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden formularse en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como disolución de Hanks, disolución de Ringer, o disolución salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse en forma de suspensiones para inyección oleaginosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. También pueden utilizarse polímeros amínicos policatiónicos no lipídicos para la administración. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados, que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas.

Para la administración tópica o nasal, se usan agentes penetrantes adecuados para la barrera concreta a permear en la formulación. Tales penetrantes son en general conocidos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar de una manera conocida en la técnica, por ejemplo mediante procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, formación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

La composición farmacéutica puede proporcionarse como una sal y puede formarse con muchos ácidos, que incluyen, pero no se limitan al ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros disolventes protónicos que en las correspondientes formas de base libre. En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado que puede contener cualquiera o todos los siguientes: histidina 1-50 mM, sacarosa al 0,1%-2%, y manitol al 2-7%, a un intervalo de pH de 4,5 a 5,5, que se combina con un tampón antes del uso.

Después de preparar las composiciones farmacéuticas, estas pueden introducirse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de un trastorno indicado. Para la administración de Rdcvf1 o Rdcvf2, este etiquetado incluirá la cantidad, la frecuencia y el método de administración.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el fin pretendido. La determinación de la dosis eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica.

Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede calcularse inicialmente tanto en ensayos de cultivos celulares, por ejemplo, de células neoplásicas, como en modelos animales, normalmente con ratones, conejos, perros o cerdos. También puede utilizarse un modelo animal para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración adecuados. Después, esta información puede utilizarse para determinar las dosis y las vías útiles para la administración a seres humanos.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de ingrediente activo, por ejemplo Rdcvf1 o Rdcvf2 o sus fragmentos, anticuerpos contra Rdcvf1, agonistas, que mejoran los síntomas o el trastorno. La eficacia terapéutica y la toxicidad pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población) y la LD50 (la dosis letal para 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la proporción LD50/ED50. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que muestran un alto índice terapéutico. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivos celulares y estudios en animales se emplean en la formulación de un intervalo de dosificación para el uso en el ser humano. La dosificación contenida en dichas composiciones está preferiblemente en un intervalo de concentraciones en la circulación que incluye la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración.

La dosificación exacta será determinada por el médico, a la luz de factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar unos niveles suficientes del resto activo

o para mantener el efecto deseado. Los factores que pueden tomarse en cuenta incluyen la gravedad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta, el momento y la frecuencia

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