ES2359233T3 - Proteínas homólogas de la quinasa mnk implicadas en la regulación de la homeostasis energética y en el metabolismo organular. - Google Patents

Abstract

Utilización de una molécula de ácidos nucleicos codificante de quinasa 2 de interacción con quinasa MAP (Mnk2), o de un polipéptido Mnk2 codificado en la misma, o de una molécula antisentido, un ribozima o una molécula de ARNi que reconoce específicamente una molécula de ácidos nucleicos de Mnk2, para el diagnóstico de la obesidad utilizando una muestra.

Description

La presente invención se refiere a la utilización de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de una quinasa 2 de interacción con la quinasa MAP (Mnk2) y secuencias de aminoácidos codificadas por las mismas, y a inhibidores de la quinasa Mnk2 en el diagnóstico y estudio de la obesidad y a la utilización de los inhibidores de la quinasa Mnk2 en la preparación de un agente destinado a la prevención o tratamiento de la obesidad. También se dan a conocer estudios referentes a enfermedades y trastornos relacionados con la regulación del peso corporal y la termogénesis, por ejemplo, aunque sin limitarse a ellas, enfermedades metabólicas, así como trastornos relacionados, tales como el trastorno de alimentación, la caquexia, la diabetes mellitus, la hipertensión, la enfermedad cardiaca coronaria, la hipercolesterolemia, la dislipemia, la osteoartritis, los cálculos biliares y la apnea del sueño, y trastornos relacionados con la defensa frente a las ROS, tales como la diabetes mellitus, los trastornos neurodegenerativos y el cáncer, por ejemplo cánceres de los órganos reproductivos.

Existen varias enfermedades metabólicas del metabolismo humano y animal, por ejemplo la obesidad y la pérdida severa de peso, que se relacionan con un desequilibrio energético en el que la ingesta calórica y el gasto energético se encuentran desequilibrados. La obesidad es uno de los trastornos metabólicos más prevalentes en todo el mundo. Sigue siendo una enfermedad humana todavía pobremente comprendida de creciente relevancia para la sociedad occidental. Se define la obesidad como un peso corporal más de 20% superior al peso corporal ideal, que con frecuencia resulta en una alteración significativa de la salud. Se asocia a un riesgo incrementado de enfermedad cardiovascular, hipertensión, diabetes, hiperlipemia y a una tasa de mortalidad incrementada. Aparte de un grave riesgo de enfermedad, el individuo que sufre de obesidad con frecuencia se encuentra aislado socialmente.

La obesidad se encuentra influida por factores genéticos, metabólicos, bioquímicos, psicológicos y de comportamiento. Por lo tanto, es un trastorno complejo que debe tratarse en varios frentes para conseguir un resultado clínico positivo duradero. Debido a que la obesidad no se considera un trastorno único, sino un grupo heterogéneo de condiciones con (potencialmente) múltiples causas, también se caracteriza por un nivel elevado de insulina plasmática en ayuno y una respuesta exagerada de insulina a la ingesta oral de glucosa (Koltermann, J. Clin. Invest. 65:1272-1284, 1980). En ocasiones se confirma una clara implicación de la obesidad en la diabetes mellitus de tipo 2 (Kopelman, Nature 404:635-643, 2000).

Los factores moleculares que resultan la ingesta de alimento y el equilibrio del peso corporal no se entienden por completo. Aunque se han descrito varios genes candidatos que se supone que influyen sobre el sistema o sistemas homeostáticos que regulan la masa/peso corporal, tales como la leptina, VCPI, VCPL o el coactivador de receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas, no se conoce cuáles son los diferentes mecanismos moleculares y/o moléculas que influyen sobre la obesidad o la regulación del peso corporal/masa corporal. Además, se han descrito varias mutaciones de un solo gen que resultan en obesidad en ratones, implicando factores genéticos en la etiología de la obesidad (Friedman y Leibel, Cell 69:217-220, 1990). En el ratón obeso, una única mutación génica (obese) resulta en una obesidad profunda, que se ve acompañada de diabetes (Friedman et al., Genomics 11:1054-1062, 1991).

El problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar un medio y método para modular condiciones metabólicas (patológicas) que influyen sobre la termogénesis, la regulación del peso corporal y/o los circuitos homeostáticos de la energía. Específicamente, se refiere al tratamiento de la obesidad. La solución al problema técnico al que se refiere la invención se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

La presente invención se refiere a genes con nuevas funciones en la regulación del peso corporal, la homeostasis energética, el metabolismo y la obesidad. La presente invención se refiere a un gen específico implicado en la regulación de enfermedades y trastornos relacionados con la regulación del peso corporal y específicamente la obesidad. También se dan a conocer enfermedades y trastornos relaconados con la termogénesis y las enfermedades metabólicas, así como trastornos relacionados, tales como el trastorno de alimentación, la caquexia, la diabetes mellitus, la hipertensión, la enfermedad cardiaca coronaria, la hipercolesterolemia, la dislipemia, la osteoartritis, los cálculos biliares, los cánceres de los órganos reproductivos y la apnea del sueño, y trastornos relacionados con la defensa frente a las ROS, tales como la diabetes mellitus, los trastornos neurodegenerativos y el cáncer. La presente memoria describe que los genes MnK humanos se encuentran implicados en las condiciones indicadas anteriormente, en particular las variantes del gen Mnk2 humano.

La expresión "número de acceso de GenBank" se refiere a las entradas en la base de datos de GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Benson et al., Nucleic Acids Res. 28:15-18, 2000).

Las proteína quinasas son moléculas importantes implicadas en la regulación de muchas funciones celulares. El gen de la serina/treonina quinasa LK6 de Drosophila melanogaster se ha descrito como una quinasa de vida corta que puede asociarse a los microtúbulos (J. Cell Sci. 110(2):209-219, 1997). El análisis genético en el desarrollo del ojo compuesto de Drosophila sugiere un papel en la modulación de la ruta de señalización de RAS (Genetics 156(3):1219-1230, 2000). Tal como se describe en la presente invención, los homólogos humanos más próximos de la quinasa LK6 de Drosophila son la quinasa 2 de interacción con la quinasa MAP (Mnk2, por ejemplo las variantes Mnk2a y Mnk2b) y la quinasa 1 de interacción con la quinasa MAP (Mnk1). La totalidad de las tres proteínas se localizan predominantemente en el citoplasma. Las Mnks son fosforiladas por las quinasas MAP pk42 Erk1 y Erk2 y las quinasas MAP p38. Esta fosforilación resulta inducida en respuesta a factores de crecimiento, ésteres de forbol y oncogenes tales como Ras y Mos, así como moléculas de señalización de estrés y citoquinas. La fosforilación de las proteínas Mnk estimula su actividad de quinasa del factor 4E de inicio eucariótico (EMBO J. 16:1909-1920, 1997, Mol. Cell Biol. 19:1871-1880, 1999, Mol Cell Biol. 21:743-754, 2001). La fosforilación del factor de inicio eucariótico 4E (elF4E) resulta en la regulación de la traducción en proteínas (Mol. Cell Biol. 22:5500-5511, 2001).

Existen diferentes hipótesis que describen el modo de estimulación de la traducción en proteínas por parte de las proteínas Mnk. La mayoría de publicaciones describe un efecto estimulador positivo sobre la traducción de proteínas dependiente de cap tras la activación de las quinasas de interacción con MAP quinasas. De esta manera, la activación de las proteínas Mnk podría conducir a una estimulación o regulación indirecta de la traducción en proteínas, por ejemplo mediante la acción de la fosfolipasa 2 alfa citosólica (BBA 1488:124-138, 2000).

Se han descrito inhibidores de Mnk (denominados CGP57380 y CGP052088) en la técnica anterior (ver Knauf et al., Mol. Cell. Biol. 21:5500, 2001; Tschopp et al., Mol. Cell Biol. Res. Comm. 3:205, y Slentz-Kesler et al., Genomics 69:63, 2000). CGP052088 es un derivado de estaurosporina con una IC50 de 70 nM para la inhibición de la actividad in vitro de quinasa de Mnk1. CGP57380 es un inhibidor no citotóxico de bajo peso molecular selectivo de Mnk2 (Mnk2a o Mnk2b) o de Mnk1. La adición de CGP57380 células en cultivo transfectadas con Mnk2 (Mnk2a o Mnk2b)

o con Mnk1 resultó en una fuerte reducción del eIF4E fosforilado.

Hasta el momento no se ha descrito que las quinasas Mnk se encuentren implicadas en la regulación del peso corporal y la termogénesis, y de esta manera podrían encontrarse asociadas a enfermedades metabólicas, tales como la obesidad, así como a trastornos relacionados, tales como el trastorno de alimentación, la caquexia, la diabetes mellitus, la hipertensión, la enfermedad cardiaca coronaria, la hipercolesterolemia, la dislipemia, la osteoartritis, los cálculos biliares y la apnea del sueño, y trastornos relacionados con la defensa frente a las ROS, tales como la diabetes mellitus, los trastornos neurodegenerativos y el cáncer, por ejemplo cánceres de los órganos reproductivos. En la presente memoria, los presentes inventores demuestran que las dosis génicas correctas de quinasas Mnk resultan esenciales para el mantenimiento de la homeostasis energética. Se utilizó un cribado genético para identificar que la mutación de los genes homólogos de la quinasa Mnk causan obesidad, reflejada en un incremento significativo del contenido de triglicéridos, la sustancia principal de almacenamiento de energía. En la presente memoria, los presentes inventores hacen referencia a mutaciones de las quinasas Mnk que afectan a la actividad de las proteínas desacoplantes (UCPs), conduciendo de esta manera a una actividad mitocondrial alterada. Los presentes inventores también se refieren al tratamiento de trastornos metabólicos con el inhibidor específico de Mnk CGP57380 y los derivados del mismo.

En la presente memoria, los presentes inventores demuestran que la dosis génica correcta del homólogo de Drosophila melanogaster de Mnk resulta esencial para el mantenimiento de la homeostasis energética en moscas adultas y para la actividad de la proteína desacoplante mitocondrial. Se utilizó un cribado genético para identificar que la mutación de un gen homólogo de Mnk causa obesidad en Drosophila melanogaster, reflejado en un incremento significativo del contenido de triglicéridos, la sustancia principal de almacenamiento de energía. En un segundo cribado diseñado para identificar los factores que modulan la actividad de la proteína desacoplante, los presentes inventores descubrieron que la mutación de dicho gen homólogo de Mnk causaba una reducción de la actividad de la proteína desacoplante. La memoria se basa en el resultado de que el homólogo de Drosophila de Mnk contribuye a la estabilidad y/o función membranal de los orgánulos, preferentemente de las mitocondrias. Se encontró que las mutaciones en las quinasas LK6 afectaban a la actividad de las proteínas desacoplantes (UCPs), conduciendo de esta manera a una actividad mitocondrial alterada.

Los presentes inventores demuestran que el homólogo del ratón del gen Mnk2 está regulado por el ayuno y por la obesidad inducida genéticamente. Además, el ARNm de Mnk2 se encuentra fuertemente regulado positivamente durante la diferenciación de los adipocitos in vitro (ver los Ejemplos). Se demuestra que los transcritos de Mnk2 se expresan en la mayoría de los tejidos del ratón, pero con niveles de expresión máximos en el tejido adiposo blanco (WAT) y marrón (BAT). La expresión en el tejido adiposo blanco se reduce en aproximadamente 60% en ratones en ayuno y en ratones ob/ob.

El análisis de los ratones transgénicos actina-mMnk2DN demostró que la expresión ectópica del transgén mMnk2DN (ver Ejemplos) conduce a un claro incremento del peso corporal. El efecto aparentemente es independiente de la dieta, ya que puede observarse con dieta de control, así como con dieta rica en grasas. De esta manera, los presentes inventores concluyen que MnK2 desempeñan un papel importante en la regulación del peso corporal.

Además, los presentes inventores encontraron que los niveles relativos de expresión de ambas variantes humanas de procesamiento de Mnk2 son iguales para todos los tejidos analizados. Ambas variantes de Mnk2 muestran niveles de expresión máximos en tejidos humanos relevantes para los trastornos metabólicos, es decir el tejido adiposo y el muscular. Además, ambas variantes de Mnk2 se encuentran reguladas positivamente durante la diferenciación de los adipocitos humanos. De esta manera, los presentes inventores concluyen que Mnk2 (o variantes del mismo) presenta una función en el metabolismo de los adipocitos humanos maduros.

Los presentes inventores también han encontrado que los niveles celulares de los triglicéridos en las células que sobreexpresan Mnk2 eran significativamente inferiores entre los días 4 y 12 de la adipogénesis en comparación con aquellos en células de control. Además, las células que sobreexpresaban Mnk2 eran menos efectivas en la síntesis de lípidos a partir de glucosa exógena. En consecuencia, los niveles de síntesis de lípidos estimulada por insulina eran significativamente inferiores el día 12 de la adipogénesis en comparación con los de las células de control. Los presentes inventores también encontraron que el transporte de los ácidos grasos exógenos a través de la membrana plasmática de células que sobreexpresaban Mnk2 y por lo tanto la esterificación de dichos metabolitos, eran considerablemente inferiores el día 12 de la adipogénesis en comparación con las células de control.

Los polinucleótidos codificantes de una proteína con homologías respecto a proteínas de la familia de la quinasa Mnk resultan adecuados para investigar enfermedades y trastornos tales como los indicados anteriormente. El descubrimiento de moléculas relacionadas con las quinasas Mnk satisface una necesidad de la técnica al proporcionar nuevas composiciones que resultan útiles en el diagnóstico, tratamiento y prognóstico de enfermedades y trastornos tal como se ha indicado anteriormente.

Antes de describir las presentes proteínas, secuencias de nucleótidos y métodos, se entiende que la presente invención no se encuentra limitada a la metodología, protocolos, líneas celulares, vectores y reactivos particulares indicados, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente invención presenta el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende ser limitativa del alcance de la presente invención, que se encontrará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. Aunque pueden utilizarse en la práctica de la presente invención cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los indicados en la presente memoria, se describen métodos, dispositivos y materiales preferentes.

La presente memoria da a conocer que proteínas homólogas de Mnk regulan la homeostasis energética y el metabolismo de las grasas, especialmente el metabolismo y el almacenamiento de los triglicéridos. La memoria da a conocer que las proteínas homólogas de Mnk se encuentran directa o indirectamente implicadas en la estabilidad y/o función de la membrana de los orgánulos, en particular de las mitocondrias, y de los polinucleótidos.

Las proteínas homólogas de Mnk y las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de las mismas pueden obtenerse de especies de insecto o de vertebrado, por ejemplo de mamíferos o aves. Los polipéptidos homólogos de la Mnk humana y los ácidos nucleicos codificantes de los mismos, particularmente los polipéptidos y los ácidos nucleicos codificantes de una proteína Mnk2 humana (variante de procesamiento Mnk2a, nº de acceso de Genbank AF237775, tal como se muestra en las figuras 3D y 3E, o la variante de procesamiento Mnk2b, número de acceso de GenBank AF237776 o nº NM_017572.1, tal como se muestra en las figuras 3F y 3G, nº de acceso de Genbank AF237775, es idéntica al nº anterior de acceso de Genbank XM_030637, retirado a petición de los solicitantes; ver una alineación de secuencias múltiples de Clustal W en la figura 3B, ver también las secuencias en las figuras 3D-G)

o de una proteína Mnk1 humana (nº de acceso de Genbank AB000409.1 y NM_003684.2, tal como se muestra en las figuras 3H y 3I); el nº de acceso de Genbank AB000409 es idéntico al nº anterior de acceso de Genbank XM_001600, que se eliminó a petición de los solicitantes; ver una alineación de secuencias múltiples de Clustal W en la figura 3C), son conocidos de la técnica.

La invención se refiere particularmente a una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido que contribuye a la regulación de la homeostasis energética y al metabolismo de los triglicéridos, y/o que contribuye a la estabilidad y/o función membranal de los orgánulos, en la que dicha molécula de ácidos nucleicos comprende:

(a)

las secuencias de nucleótidos de nº de acceso de Genbank AF237775 ó NM_017572.1, y/o el complemento de las mismas,

(b)

una secuencia de nucleótidos que se hibrida a 50ºC en una solución que contiene 1 X SSC y SDS al 0,1% con la molécula de ácidos nucleicos de (a), particularmente un ácido nucleico codificante de las secuencias de aminoácidos mostradas en la figura 3E ó 3G,

(c)

una secuencia correspondiente a las secuencias de (a) o (b) dentro de la degeneración del código genético,

(d)

una secuencia que codifica un polipéptido que es por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 98% y hasta 99,6% idéntico a las secuencias de aminoácidos mostradas en la figura 3E ó 3G,

(e)

una secuencia que difiere de la molécula de ácidos nucleicos de (a) a (d) por mutación y en la que dicha mutación provoca una alteración, deleción, duplicación o parada prematura en el polipéptido codificado. También se da a conocer una secuencia parcial de cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a) a

(e) que presenta una longitud de por lo menos 15 bases, preferentemente por lo menos 20 bases, más preferentemente por lo menos 25 bases, y más preferentemente por lo menos 50 bases.

La invención se basa en el resultado de que las proteínas homólogas de Mnk (en la presente memoria denominadas Mnk/Mnk2 (Mnk2a o Mnk2b) y los polinucleótidos codificantes de las mismas, se encuentran implicadas en la regulación del almacenamiento de triglicéridos y por lo tanto en la homeostasis energética. La memoria da a conocer que las proteínas homólogas de Mnk se encuentran directa o indirectamente implicadas en la estabilidad y/o función de las membranas de los orgánulos, en particular de las mitocondrias, y los polinucleótidos. La memoria describe la utilización de composiciones que comprenden los nucleótidos, proteínas o efectores de los mismos, por ejemplo anticuerpos, aptámeros, moléculas antisentido, ribozimas, moléculas de ARNi, péptidos, moléculas orgánicas de bajo peso molecular y otros receptores que reconocen la molécula de ácidos nucleicos o el polipéptido, para el diagnóstico, estudio, prevención o tratamiento de la obesidad. También se dan a conocer enfermedades y trastornos relacionados con la regulación del peso corporal y la termogénesis, por ejemplo, aunque sin limitación, enfermedades metabólicas, así como trastornos relacionados, tales como el trastorno de alimentación, la caquexia, la diabetes mellitus, la hipertensión, la enfermedad cardiaca coronaria, la hipercolesterolemia, la dislipemia, la osteoartritis, los cálculos biliares y la apnea del sueño, y trastornos relacionados con la defensa frente a las ROS, tales como la diabetes mellitus, los trastornos neurodegenerativos y el cáncer, por ejemplo los cánceres de los órganos reproductores.

La presente invención se refiere a genes con funciones nuevas en la regulación del peso corporal, la homeostasis energética, el metabolismo y la obesidad. Para encontrar genes con funciones nuevas en la homeostasis energética, el metabolismo y la obesidad, se llevó a cabo un cribado genético funcional con el organismo modelo Drosophila melanogaster (Meigen). La Drosophila melanogaster es uno de los organismos más intensivamente estudiados en Biología y ha servido como sistema modelo para la investigación de muchos procesos del desarrollo y celulares que presenta en común con los eucariotas superiores, entre ellos el ser humano (ver, por ejemplo, Adams et al., Science 287:2185-2195, 2000). El éxito de Drosophila melanogaster como organismo modelo se debe en gran parte a la potencia de los cribados genéticos directos para identificar los genes implicados en un proceso biológico (ver Johnston, Nat. Rev. Genet. 3:176-188, 2002; Rorth, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12418-12422, 1996). Un recurso para el cribado ha sido una colección propietaria de Drosophila melanogaster de líneas EP. El vector P de esta colección presenta sitios de unión Gal4-UAS fusionados con un promotor basal que puede transcribir secuencias genómicas contiguas de Drosophila tras la unión de Gal4 a sitios UAS. Esto permite que la colección de líneas EP sobreexprese las secuencias génicas endógenas flanqueantes. Además, sin la activación de los sitios UAS, es probable que la integración del elemento EP en el gen provoque una reducción de la actividad génica, permitiendo determinar su función mediante la evaluación del fenotipo de pérdida de función.

Los triglicéridos son el almacenamiento más eficiente de energía de las células, y se encuentran significativamente incrementados en los pacientes obesos. En la presente invención, se ha utilizado un cribado genético para identificar qué mutaciones de los genes homólogos de Lk6 causan cambios en el peso corporal, lo que se refleja en un cambio significativo de los niveles de triglicéridos. Con el fin de aislar los genes con una función en la homeostasis energética, se sometieron a ensayo varios miles de líneas EP para su contenido de triglicéridos tras un periodo de alimentación prolongado. Las líneas con un contenido de triglicéridos significativamente alterado se seleccionaron como candidatos positivos para el análisis posterior. En la presente invención, el contenido de triglicéridos de un grupo de moscas con el mismo genotipo tras la alimentación durante seis días se analizó utilizando un ensayo de triglicéridos tal como se describe posteriormente, en la sección de Ejemplos, a modo ejemplar y no limitativo del alcance de la invención. La alteración del contenido de triglicéridos debido a la pérdida de una función génica sugiere la presencia de actividades génicas en la homeostasis energética de un modo dependiente de la dosis que controlan la cantidad de energía almacenada en forma de triglicéridos.

Se muestra en la figura 1 el resultado del análisis del contenido de triglicéridos. En el ensayo de triglicéridos se analizaron las moscas homocigóticas para EP(3)3333 y EP(3)3576. El incremento promedio del contenido de triglicéridos de las líneas viables homocigóticas EP(3)3333 y EP(3)3576 era de aproximadamente 140% (figura 1). Por lo tanto, la muy probable pérdida de una actividad génica en el locus génico 86F7 (localización cromosómica estimada en la que se integra el vector EP de las moscas EP(3)3333 y EP(3)3576) es responsable de alteraciones del metabolismo de los triglicéridos de almacenamiento energético, representando ambos casos, por lo tanto, modelos de mosca obesa. El incremento del contenido de triglicéridos debido a la pérdida de una función génica sugiere actividades génicas en la homeostasis energética dependiente de la dosis que controlan la cantidad de energía almacenada en forma de triglicéridos.

Los ácidos nucleicos codificantes de la proteína Mnk se identificaron utilizando una técnica de rescate de plásmidos. Se aislaron las secuencias de ADN genómico que se localizaban directamente en el lado 3' de las integraciones de EP(3)3333 y EP(3)3576. Utilizando dichas secuencias genómicas aisladas, se cribaron bases de datos públicas tales como Berkeley Drosophila Genome Project (GadFly, ver también FlyBase, Nucleic Acids Research 27:85-88, 1999), confirmando de esta manera el lado de integración de EP(3)333 en la región 5' de un exón 5' del gen homólogo de Mnk y EP(3)3576 en la región 5' de un exón 5' alternativo (figura 2). La figura 2 muestra la organización molecular de este locus. La secuencia de ADN genómico se encuentra representado en el conjunto como una línea de puntos negra en el centro que incluye el sitio de integración de EP(3)3333 y EP(3)3576. Los números representan las coordenadas del ADN genómico (desde la posición 7544500 en el cromosoma 3R). Las columnas grises en las dos líneas "ADNc" representan los genes predichos (GadFly y Magpie), y los símbolos grises en la línea "elementos P" representan los sitios de integración del vector de EP. Los exones predichos del gen CG17342 se muestran como columnas gris oscuro y los intrones predichos, como columnas gris claro.

Lk6 (el gen homólogo de Mnk en Drosophila) codifica un gen predicho por los programas de análisis de secuencias de GadFly (nº de acceso GadFly CG17342). No se encuentran disponibles en la técnica datos funcionales que describan la regulación de las enfermedades de la obesidad y metabólicas para los genes mostrados en la figura 3, denominados Mnk en la presente memoria.

Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contribuye a la estabilidad y/o función membranal de los orgánulos y que representa una proteína de Drosophila que se ha encontrado que es capaz de modificar las UCPs, puede resultar preferente. Tal como se demuestra en los ejemplos adjuntos, el polipéptido indicado en la presente memoria (y molécula de ácido nucleico codificante) pudo modificar, por ejemplo potenciar un fenotipo específico del ojo de Drosophila, que se debía a la sobreexpresión del gen dUCPy de Drosophila melanogaster. La sobreexpresión de dUCPy (homólogo de las UCPs humanas) en el ojo compuesto de Drosophila condujo a un defecto claramente visible del ojo que puede utilizarse como una "lectura externa" de un "cribado de modificador" genético.

En dicho "cribado de modificador", se mutagenizan miles de genes diferentes para modificar su expresión en el ojo. En el caso de que uno de los genes mutagenizados interactúe con dUCPy y modifique su actividad, se producirá un incremento o supresión del defecto del ojo. Debido a que dichas moscas son fáciles de distinguir, pueden seleccionarse para aislar el gen interactuante. Tal como se muestra en los ejemplos adjuntos, se dedujo un gen que puede potenciar el defecto del ojo inducido por la actividad de dUCPy. Este gen se denomina LK6 en Drosophila, presentando homologías elevadas con las proteínas (y genes) Mnk humanas, tal como se ha indicado anteriormente. Se contempla que las mutaciones en los polipéptidos Mnk indicados en la presente memoria conducen a cambios fenotípicos y/o fisiológicos que pueden comprender una actividad mitocondrial modificada y alterada. Esto, a su vez, puede conducir, entre otras cosas, a alteraciones del metabolismo energético, a la termogénesis alterada y/o la homeostasis energética alterada. Tal como se muestra en los ejemplos adjuntos, se dedujo un gen que podía potenciar el defecto del ojo inducido por la actividad de dUCPy.

Las proteínas homólogas de Mnk y moléculas de ácidos nucleicos codificantes de las mismas pueden obtenerse de especies de insecto o de vertebrado, por ejemplo de mamíferos o aves. Resultan particularmente preferentes los ácidos nucleicos codificantes de homólogos de Lk6/Mnk humanos, particularmente variantes de Mnk2 (Mnk2a o Mnk2b). La presente invención describe un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de Mnk, particularmente las variantes de Mnk2 (Mnk2a o Mnk2b). Se llevó a cabo una comparación (Clustal X 1.8) entre las proteínas Mnk de diferentes especies (ser humano y Drosophila) y se muestra en la figura 3A. Basándose en las homologías, la proteína Mnk de la invención y cada proteína o péptido homólogo puede compartir por lo menos cierto nivel de actividad.

En una realización particular, la invención comprende el polinucleótido que incluye la secuencia de ácidos nucleicos del número de acceso de GenBank AF237775 o NM_017572.1. El experto en la materia apreciará que, como resultado de la degeneración del código genético, puede producirse una multitud de secuencias de nucleótidos codificantes de Mnk, algunos con una homología mínima con las secuencias de nucleótidos de cualquier gen conocido y natural. De esta manera, la invención contempla todas y cada una de las posibles variaciones de la secuencia de nucleótidos que podrían realizarse mediante la selección de combinaciones basadas en posibles elecciones de codón. Dichas combinaciones se realizan según el código genético de tripletes estándar aplicadas a las secuencias de nucleótidos de Mnk naturales, y todas dichas variaciones deben considerarse específicamente dadas a conocer. Aunque las secuencias de nucleótidos que codifican Mnk y sus variantes preferentemente son capaces de hibridarse con las secuencias de nucleótidos del Mnk natural bajo condiciones de astringencia seleccionadas apropiadamente, puede resultar ventajoso producir secuencias de nucleótidos codificantes de Mnk o de sus derivados que presenten un uso de los codones sustancialmente diferentes. Pueden seleccionarse los codones para incrementar la tasa a la que se produce la expresión del péptido en un huésped procariótico o eucariótico particular de acuerdo con la frecuencia con la que son utilizados los codones particulares por el huésped. Entre otros motivos para alterar sustancialmente la secuencia de nucleótidos codificante de Mnk y sus derivados sin alterar las secuencias de aminoácidos codificadas se incluyen la producción de transcritos de ARN que presentan propiedades más deseables, tales como una vida media más prolongada, que los transcritos producidos a partir de las secuencias naturales. La invención también comprende la producción de secuencias de ADN, o partes de las mismas, que codifican Mnk y sus derivados, completamente mediante química sintética. Tras la producción, la secuencia sintética puede insertarse en cualquiera de los muchos vectores de expresión y sistemas celulares disponibles utilizando reactivos que son bien conocidos de la técnica en el momento de presentar la presente solicitud. Además, puede utilizarse la química sintética para introducir mutaciones en una secuencia codificante de Mnk o de parte de la misma.

También pueden encontrarse comprendidas en la invención secuencias polinucleótidas que son capaces de hibridarse con las secuencias de nucleótidos reivindicadas, y en particular aquéllas mostradas en los números de acceso de GenBank AF237775 ó NM_017572.1 bajo diversas condiciones de astringencia. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión o sonda de ácidos nucleicos, tal como se enseña en Wahl G.M. y S.L. Berger, Methods Enzymol. 152:399-407, 1987, y Kimmel A.R., Methods Enzymol. 152:507-511, 1987), y pueden utilizarse a una astringencia definida. Preferentemente, la hibridación bajo condiciones astringentes se refiere a que, tras el lavado durante 1 hora con 1 x SSC y SDS al 0,1% a 50ºC, preferentemente a 55ºC, más preferentemente a 62ºC y más preferentemente a 68ºC, particularmente durante 1 hora en 0,2 x SSC y SDS al 0,1% a 50ºC, preferentemente a 55ºC, mas preferentemente a 62ºC y más preferentemente a 68ºC, se observa una señal de hibridación positiva. Entre las secuencias de ácidos nucleicos alteradas codificantes de Mnk que pueden encontrarse comprendidas en la invención se incluyen deleciones, inserciones o sustituciones de diferentes nucleótidos que resultan en un polinucleótido que codifica la misma Mnk o una funcionalmente equivalente.

Las proteínas codificadas también pueden contener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos aminoácidos, que producen una alteración silenciosa y que resultan en una Mnk funcionalmente equivalente. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos deliberadas basándose en similitudes de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipática de los residuos, con la condición de que se conserve la actividad biológica de Mnk. Por ejemplo, entre los aminoácidos de carga negativa pueden incluirse el ácido aspártico y el ácido glutámico; entre los aminoácidos de carga positiva pueden incluirse la lisina y la arginina; y entre los aminoácidos con grupos de cabeza polar sin carga que presentan valores de hidrofilicidad similares pueden incluirse leucina, isoleucina y valina, glicina y alanina, asparagina y glutamina, serina y treonina, y fenilalanina y tirosina.

Pueden resultar útiles alelos de los genes codificantes de Mnk. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "alelo" o "secuencia alélica" es una forma alternativa del gen que puede resultar de por lo menos una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos. Los alelos pueden resultar en ARNm o polipéptidos alterados cuyas estructuras o función puede alterarse o no. Cualquier gen dado puede presentar ninguna, una o muchas formas alélicas. Se asignan de manera general alteraciones mutacionales comunes, que dan lugar a alelos, a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de alteración puede producirse solo o en combinación con los demás, una o más veces en una secuencia dada. Pueden utilizarse métodos de secuenciación del ADN que son bien conocidos y generalmente disponibles de la técnica, para la práctica de cualquiera de las realizaciones de la invención. Los métodos pueden utilizar enzimas tales como el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, la ADN polimerasa Sequenase (US Biochemical Corp., Cleveland, Ohio), la polimerasa Taq (Perkin Elmer), la polimerasa termoestable de T7 (Amersham, Chicago, Il.) o combinaciones de polimerasas recombinantes y exonucleasas de prueba de lectura, tales como el sistema de amplificación ELONGASE (GIBCO/BRL, Gaithersburg, Md.). Preferentemente, el procedimiento se automatiza con aparatos tales como el Hamilton MICROLAB 2200 (Hamilton, Reno, Nev.), el termociclador Peltier (PTC200, MJ Research, Watertown, Mass.) y los secuenciadores de ADN ABI 377 (Perkin Elmer). Las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de Mnk pueden extenderse utilizando una secuencia parcial de nucleótidos y utilizando diversos métodos conocidos de la técnica para detectar secuencias cadena arriba, tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, un método que puede utilizarse, la PCR "de sitio de restricción", utiliza cebadores universales para recuperar una secuencia desconocida contigua a un locus conocido (Sarkar G., PCR Methods Applic. 2:318-322, 1993). También puede utilizarse PCR inversa para amplificar o extender secuencias utilizando cebadores divergentes basándose en una región conocida (Triglia T. et al., Nucleic Acids Res. 16:8186, 1988). Otro método que puede utilizarse es la PCR de captura, que implica la amplificación mediante PCR de fragmentos de ADN contiguos a una secuencia conocida en ADN cromosómico artificial humano y de levadura (Lagerstrom M. et al., PCR Methods Applic. 1:111-119). Otro método que puede utilizarse para recuperar secuencias desconocidas es el de Parker J.D. et al. (Nucleic Acids Res. 19:3055-3060, 1991). Además, puede utilizarse PCR, cebadores anidados y bibliotecas PROMOTERFINDER para paseos en ADN genómico (Clontech, Palo Alto, Calif.). Este procedimiento evita la necesidad de cribar bibliotecas y resulta útil para encontrarse uniones intrón/exón.

Al cribar los ADNc de longitud completa, resulta preferible utilizar bibliotecas que han sido seleccionadas según tamaño para incluir los ADNc de mayor tamaño. Además, resultan preferibles las bibliotecas con cebadores aleatorios, en el aspecto de que contendrán más secuencias que contengan las regiones 5' de los genes. La utilización de una biblioteca con cebadores aleatorios puede resultar especialmente preferible para situaciones en las que una biblioteca de oligo-d(T) no proporciona un ADNc de longitud completa. Las bibliotecas genómicas pueden resultar útiles para la extensión de la secuencia en las regiones reguladoras 5' y 3' no transcritas. Los sistemas de electroforesis capilar, que se encuentran disponibles comercialmente, pueden utilizarse para analizar el tamaño o para confirmar la secuencia de nucleótidos de los productos de secuenciación o de PCR. En particular, la secuenciación capilar puede utilizar polímeros fluidos para la separación electroforética, cuatro pigmentos fluorescentes diferentes (uno para cada nucleótido) que se activan con láser, y la detección de las longitudes de onda emitidas con una cámara con dispositivo de carga acoplada. Puede convertirse la salida/intensidad lumínica en señal eléctrica utilizando el software apropiado (por ejemplo GENOTYPER y SEQUENCE NAVIGATOR, Perkin Elmer) y el procedimiento completo desde la carga de muestras hasta el análisis informático y la visualización de los datos electrónicos puede controlarse por ordenador. La electroforesis capilar resulta especialmente preferible para la secuenciación de trozos pequeños de ADN, que puede encontrarse presentes en cantidades limitadas en una muestra particular.

Las secuencias polinucleótidas o fragmentos de las mismas que codifican Mnk o proteínas de fusión, o los equivalentes funcionales de los mismos, pueden utilizarse en moléculas de ADN recombinante para dirigir la expresión de Mnk en células huésped apropiadas. Debido a la degeneración inherente al código genético, pueden producirse otras secuencias de ADN, que codifican la misma secuencia de aminoácidos o una funcionalmente equivalente, y estas secuencias pueden utilizarse para clonar y expresar Mnk. Tal como entenderá el experto en la materia, puede resultar ventajoso producir secuencias de nucleótidos codificantes de Mnk que presenten codones no naturales. Por ejemplo, pueden seleccionarse codones preferentes para un huésped procariótico o eucariótico particular con el fin de incrementar la tasa de expresión de proteínas o para producir un transcrito de ARN recombinante que presente propiedades deseables, por ejemplo la vida media, que sea más prolongada que la de un transcrito generado a partir de la secuencia natural. Las secuencias de nucleótidos de la presente invención pueden manipularse utilizando métodos conocidos generalmente de la técnica con el fin de alterar las secuencias codificantes de Mnk por una diversidad de motivos, incluyendo, aunque sin limitación, alteraciones que modifiquen la clonación, el procesamiento y/o la expresión del producto génico. Puede utilizarse la reorganización del ADN mediante fragmentación aleatoria y el reensamblaje por PCR de los fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos para manipular las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, puede utilizarse la mutagénesis sitio-dirigida para insertar sitios de restricción nuevos, para alterar los patrones de glucosilación, para modificar las preferencias de codones, para producir variantes de procesamiento o para introducir mutaciones, y similares.

Pueden ligarse secuencias de ácidos nucleicos naturales, modificados o recombinantes codificantes de Mnk con una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para el cribado de bibliotecas de péptidos para inhibidores de las actividades de Mnk, puede resultar útil construir proteínas Mnk quiméricas que pueden ser reconocidas por un anticuerpo comercialmente disponible. También puede manipularse una proteína de fusión para contener un sitio de corte entre la secuencia codificante de Mnk y las secuencias proteicas heterólogas, de manera que pueda cortarse Mnk y purificarse respecto del grupo heterólogo. En otra realización, pueden sintetizarse secuencias codificantes de Mnk, por completo o en parte, utilizando métodos químicos bien conocidos de la técnica (ver Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-223, 1980; Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:225232, 1980). Alternativamente, pueden producirse las proteínas mismas utilizando métodos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos de Mnk o una parte de la misma. Por ejemplo, puede llevarse a cabo la síntesis de péptidos utilizando diversas técnicas de fase sólida (Roberge et al., Science 269:202-204, 1995) y puede conseguirse la síntesis automatizada, por ejemplo utilizando el sintetizador de péptidos ABI 431A (Perkin Elmer). El péptido recién sintetizado puede purificarse sustancialmente mediante cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa (por ejemplo Creighton T., Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., New York, N.Y., 1983). La composición de los péptidos sintéticos puede confirmarse mediante análisis o secuenciación de los aminoácidos (por ejemplo el procedimiento de degradación de Edman; Creighton, supra). Además, las secuencias de aminoácidos de Mnk, o de cualquier parte de las mismas, pueden alterarse durante la síntesis directa y/o combinada mediante métodos químicos utilizando secuencias de otras proteínas, o de cualquier parte de las mismas, para producir un polipéptido variante.

Con el fin de expresar una Mnk biológicamente activa, las secuencias de nucleótidos codificantes de equivalentes funcionales de Mnk, pueden insertarse en vectores de expresión apropiados, es decir un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificante insertada. Los métodos, que son bien conocidos del experto en la materia, pueden utilizarse para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes de Mnk y elementos de control transcripcional y traduccional apropiados. Entre estos métodos se incluyen técnicas in vitro de ADN recombinante, técnicas sintéticas y la recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en: Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview N.Y., 1989, y Ausubel F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989.

Entre los elementos reguladores se incluyen, por ejemplo, un promotor, un codón de iniciación, un codón de parada, un elemento regulador de la estabilidad del ARNm, y una señal de poliadenilación. La expresión de un polinucleótido puede garantizarse mediante: (i) promotores constitutivos, tales como la región promotora/intensificadora del citomegalovirus (CMV), (ii) promotores específicos de tejido, tales como el promotor insulina (ver Soria et al., Diabetes 49:157, 2000), el promotor del gen SOX2 (ver Li et al., Curr. Biol. 8:971-4, 1998), el promotor Msi-1 (ver Sakakibara et al,. J. Neuroscience 17:8300-8312, 1997), el promotor de la cadena pesada de la alfa-cardiomiosina o el promotor del factor natriurético atrial humano (Klug et al., J. Clin. Invest. 98:216-24, 1996; Wu et al., J. Biol. Chem. 264:6472-79, 1989), o (iii) promotores inducibles, tales como el sistema inducible con tetraciclina. Los vectores de expresión también pueden contener un agente de selección o un gen marcador que proporcione resistencia a antibióticos, tales como los genes de resistencia a neomicina, higromicina o puromicina. Entre estos métodos se incluyen las técnicas de ADN recombinante in vitro, las técnicas sintéticas y la recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989, y Ausubel F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. En una realización adicional de la invención, pueden ligarse secuencias de ácidos nucleicos naturales, modificadas o recombinantes codificantes de las proteínas de la invención y proteínas homólogas con una secuencia heteróloga, para codificar una proteína de fusión.

Puede utilizarse una diversidad de sistemas de vector de expresión/huésped para contener y expresar secuencias codificantes de las proteínas o las proteínas de fusión. Entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, plásmido o cósmido; levaduras transformadas con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión víricos (por ejemplo baculovirus, adenovirus, virus adenoasociados, lentivirus, retrovirus); sistemas de células vegetales transformados con vectores de expresión víricos (por ejemplo el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; el virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacteriana (por ejemplo los plásmidos Ti o PBR322) o sistemas de células animales.

Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" son aquellas regiones no traducidas de los vectores, por ejemplo intensificadores, promotores, regiones 5' y 3' no traducidas, que interactúan con proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Dichos elementos pueden presentar una resistencia y especificidad variables. Dependiendo del sistema vector y huésped utilizados, puede utilizarse cualquier número de elementos transcripcionales y traduccionales adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, durante la clonación en sistemas bacterianos, pueden utilizarse promotores inducibles tales como el promotor lacZ híbrido del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.) o el plásmido PSPORT1 (Gibco BRL) y similares. El promotor de polihedrina de baculovirus puede utilizarse en células de insecto. Los promotores e intensificadores derivados de los genomas de células vegetales (por ejemplo los genes de choque térmico, RUBISCO y de proteína de reserva) o de virus vegetales (por ejemplo promotores y secuencias líder víricos) pueden clonarse en el vector. En los sistemas celulares de mamífero, resultan preferibles los promotores de genes de mamífero o de virus de mamífero. En el caso de que resulte necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de las secuencias codificantes de Mnk, pueden utilizarse vectores basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado.

En los sistemas bacterianos, puede seleccionarse de entre varios vectores de expresión dependiendo de la utilización pretendida de Mnk. Por ejemplo, en el caso de que se requieran grandes cantidades de Mnk para la inducción de anticuerpos, pueden utilizarse vectores que controlen un nivel de expresión elevado de proteínas de fusión que se purifiquen con facilidad. Entre este tipo de vectores se incluye, aunque sin limitación, los vectores de clonación y expresión multifuncionales de E. coli, tales como el fagémico BLUESCRIPT (Stratagene), en el que la secuencia codificante de Mnk puede ligarse en el vector en el mismo marco de lectura con secuencias para la Met aminoterminal y los 7 residuos posteriores de la β-galactosidasa, de manera que se produce una proteína híbrida; los vectores pIN (Van Heeke G. y S.M. Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509, 1989) y similares. También pueden utilizarse vectores de la serie pGEX (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) para expresar polipéptidos foráneos en forma de proteínas de fusión con glutatión-S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción a perlas de glutatión-agarosa seguido de la elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas preparadas en dichos sistemas pueden diseñarse para incluir sitios de corte de heparina, trombina o proteasa factor XA, de manera que pueda separarse a voluntad el polipéptido de interés clonado del grupo GST. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden utilizarse varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, tales como el factor alfa, la alcohol oxidasa y la PGH. Para revisiones, ver Ausubel et al., supra, y Grant et al., Methods Enzymol. 153:516-544, 1987.

En el caso de que se utilicen vectores de expresión vegetales, la expresión de las secuencias codificantes de Mnk puede encontrarse controlada por cualquiera de entre varios promotores. Por ejemplo, pueden utilizarse promotores víricos tales como los promotores 35S y 19S del CaMV, solos o en combinación con la secuencia líder omega del TMV (Takamatsu N., EMBO J. 6:307-311, 1987). Alternativamente, pueden utilizarse promotores vegetales tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi G. et al., EMBO J. 3:16711680, 1984; Broglie R. et al., Science 224:838-843, 1984, y Winter J. et al., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105, 1991). Estos constructos pueden introducirse en las células vegetales mediante transformación directa del ADN o mediante transfección mediada por un patógeno. Dichas técnicas se describen en varias revisiones disponibles generalmente (ver, por ejemplo, Hobbs S. o Murry L.E., en: McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York, N.Y., 1992, páginas 191 a 196).

También puede utilizarse un sistema de insecto para expresar Mnk. Por ejemplo, en un sistema de este tipo se utiliza el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias codificantes de Mnk pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen polihedrina, y situarse bajo control del promotor polihedrina. Las inserciones con éxito de Mnk inactivan el gen polihedrina y producen un virus recombinante que no presenta proteína de cubierta. A continuación, pueden utilizarse los virus recombinantes para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que puede expresarse Mnk (Engelhard E.K. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227, 1994).

En las células huésped de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En el caso en que se utilice un adenovirus como vector de expresión, pueden ligarse secuencias codificantes de Mnk en un complejo adenovírico de transcripción/traducción que consiste del promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 ó E3 no esencial del genoma vírico puede utilizarse para obtener virus viables que sean capaces de expresar Mnk en células huésped infectadas (Logan J. y Shenk T., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659, 1984). Además, pueden utilizarse intensificadores de transcripción, tales como el intensificador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para incrementar la expresión en células huésped de mamífero.

También pueden utilizarse señales de inicio específicas para conseguir una traducción más eficiente de secuencias codificantes de Mnk. Entre dichas señales se incluyen el codón de inicio ATG y secuencias contiguas. En el caso de que se inserten secuencias codificantes de Mnk, sus codones de inicio, y secuencias cadena arriba en el vector de expresión apropiado, pueden no resultar necesarias señales adicionales de control de trascripción o de traducción. Sin embargo, en el caso de que se inserte únicamente secuencia codificante, o una parte de la misma, deberían proporcionarse señales exógenas de control de la traducción, incluyendo el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debe encontrarse en el marco de lectura correcto para garantizar la traducción de la inserción completa. Los elementos traduccionales exógenos y los codones de inicio pueden presentar diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión puede incrementarse mediante la inclusión de intensificadores que resulten apropiados para el sistema celular particular que se utilice, tales como los descritos en la literatura (Scharf

D. et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162, 1994).

Además, puede seleccionarse una cepa de célula huésped para su capacidad de modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada del modo deseada. Entre dichas modificaciones del polipéptido se incluyen, aunque sin limitación, la acetilación, la carboxilación, la glucosilación, la fosforilación, la lipidación y la acilación. El procesamiento post-traduccional que corta una forma "prepro" de la proteína también puede utilizarse para facilitar la inserción, plegamiento y/o función correctos. Pueden seleccionarse diferentes células huésped, tales como CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y WI38 que presentan maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades post-traduccionales, para garantizar la correcta modificación y procesamiento de la proteína foránea.

Para la producción de alto rendimiento duradera de las proteínas recombinantes, resulta preferente la expresión estable. Por ejemplo pueden transformarse líneas celulares que expresen Mnk establemente utilizando vectores de expresión que pueden contener orígenes víricos de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo vector o en un vector separado. Tras la introducción del vector, se deja que las células crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido antes de trasladarlas a medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es proporcionar resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de las células, que expresan con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células establemente transformadas pueden hacerse proliferar utilizando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para el tipo celular. Puede utilizarse cualquiera de entre varios sistemas de selección para recuperar las líneas de células transformadas. Entre ellas se incluyen, aunque sin limitación, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simplex (Wigler M. et al., Cell 11:223-32, 1977) y de la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy I. et al., Cell 22:817-23, 1980), que pueden utilizarse en células tk-o aprt-, respectivamente. Además, puede utilizarse la resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como base para la selección; por ejemplo, dhfr proporciona resistencia al metotrexato (Wigler M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70, 1980); npt, que proporciona resistencia a los aminoglucósidos neomicina y G-418 (Colbere-Garapin F. et al., J. Mol. Biol. 150:1-14, 1981) y als o pat, que proporcionan resistencia al clorosulfurón y a la fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murry, supra). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo trpB, que permiten a las células utilizar indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman S.C. y R.C. Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51, 1988). Recientemente, la utilización de marcadores visibles ha ganado popularidad utilizándose ampliamente marcadores tales como antocianinas, β-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, no sólo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la magnitud de la expresión transitoria o estable de proteínas atribuible a un sistema vector específico (Rhodes C.A. et al., Methods Mol. Biol. 55:121-131, 1995).

Puede incrementarse la actividad enzimática de quinasa in vivo de los polipéptidos no modificados de Mnk hacia unsustrato con estímulos apropiados, induciendo la fosforilación de Mnk. Ésta puede inducirse en el contexto natural con estímulos extracelulares o intracelulares, tales como moléculas de señalización o influencias ambientales. Puede generarse un sistema que contenga Mnk activado, sea un organismo, un tejido, un cultivo de células o un ambiente sin células, aplicando exógenamente dicho estímulo o imitando dicho estímulo mediante una diversidad de técnicas, algunas de ellas descritas adicionalmente después. Puede producirse un sistema que contenga Mnk activado (i) con el propósito de diagnosticar, estudiar, prevenir y tratar enfermedades y trastornos relacionados con la regulación del peso corporal y la termogénesis, por ejemplo, aunque sin limitación, enfermedades metabólicas tales como la obesidad, así como trastornos relacionados, tales como el trastorno de alimentación, la caquexia, la diabetes mellitus, la hipertensión, la enfermedad cardíaca coronaria, la hipercolesterolemia, la dislipemia, la osteoartritis, los cálculos biliares, y la apnea del sueño, y trastornos relacionados con la defensa frente a las ROS, tales como la diabetes mellitus, los trastornos neurodegenerativos y el cáncer, por ejemplo cánceres de los órganos reproductores, (ii) con el propósito de identificar o validar los agentes candidatos terapéuticos, los farmacéuticos o los fármacos que influyen sobre los genes de la invención o los polipéptidos codificados por los mismos, (iii) con el propósito de generar lisados celulares que contienen polipéptidos activados codificados por determinados genes, (iv) con el propósito de aislar a partir de esta fuente, polipéptidos activados codificados por determinados genes.

Puede producirse Mnk activado independientemente de los estímulos naturales para los propósitos anteriormente indicados mediante, por ejemplo, aunque sin limitación, (i) un agente que imite el estímulo natural, (ii) un agente que actúe posteriormente al estímulo natural, tal como activadores de la ruta de la quinasa MAP, éster de forbol, anisomicina, alelos activos constitutivos de las quinasas quinasa de quinasa MAP, de las quinasas de la quinasa MAP, de la quinasa MAP o de Mnk misma, tal como se encuentran descritas o pueden ser desarrolladas, (iii) mediante la introducción de sustituciones, deleciones o inserciones únicas o múltiples de aminoácidos dentro de la secuencia de Mnk para rendir formas activas constitutivas, (iv) mediante la utilización de fragmentos aislados de Mnk. Además, puede generarse Mnk enzimáticamente activo en un sistema ectópico, procariótico o eucariótico, in vivo o in vitro, mediante cotransferencia de los componentes activadores a este sistema. Estos podrían ser, por ejemplo, aunque sin limitación, componentes de la ruta de la quinasa MAP, tales como alelos activos constitutivos de las quinasas de la quinasa MAP Mek1 ó Mkk6, conjuntamente con las quinasas MAP ERK1 ó ERK2 o las isoformas de MAPK p38. Por ejemplo, puede aislarse la proteína Mnk activada en solución con un polipéptido mutante de Mek1 que contiene las sustituciones de aminoácidos S218D y S222E conjuntamente con la quinasa ERK2 aislada en presencia de adenosina trifosfato 1,0 mM y condiciones tamponadoras adecuadas, tales como ácido N-(2hidroxietil)-piperazín-N'-(2-etanosulfónico) 50 mM/hidróxido potásico, pH 7,4, cloruro de magnesio 5 mM y ditiotreitol 0,5 mM (ver la figura 14).

Aunque la presencia/ausencia de expresión de gen marcador sugiere que también se encuentra presente un gen de interés, puede resultar necesaria la confirmación de su presencia y expresión. Por ejemplo, en el caso de que se inserten secuencias codificantes de Mnk dentro de una secuencia de gen marcador, pueden identificarse células recombinantes que contienen secuencias codificantes de Mnk a partir de la ausencia de función del gen marcador. Alternativamente, puede introducirse un gen marcador en tándem con secuencias codificantes de Mnk bajo el control de un único promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección habitualmente también indica la expresión del gen en tándem. Alternativamente, pueden identificarse células huésped, que contienen las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de Mnk y que expresan Mnk, mediante una diversidad de procedimientos conocidos por el experto en la materia. Entre estos procedimientos se incluyen, aunque sin limitación, las técnicas de hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN y de bioensayo o inmunoensayo de proteínas, que incluye tecnologías basadas en membranas, soluciones o chips para la detección y/o cuantificación de ácidos nucleicos o proteínas.

La presencia de secuencias polinucleótidas codificantes de Mnk puede detectarse mediante hibridación ADN-ADN o ADN-ARN o amplificación utilizando sondas o partes o fragmentos de polinucleótidos codificantes de Mnk. Los ensayos basados en la amplificación de ácidos nucleicos implican la utilización de oligonucleótidos u oligómeros basados en las secuencias codificantes de Mnk para detectar transformantes que contienen ADN o ARN codificante de Mnk. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "oligonucleótidos" u "oligómeros" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos y de hasta aproximadamente 60 nucleótidos, preferentemente de entre aproximadamente 15 y 30 nucleótidos, y más preferentemente de entre aproximadamente 20 y 25 nucleótidos, que pueden utilizarse como sonda o amplímero.

Una diversidad de protocolos para detectar y medir la expresión de Mnk utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para la proteína son conocidos de la técnica. Entre los ejemplos se incluyen el ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA) y la separación celular activada por fluorescencia (FACS). Resulta preferente un inmunoensayo de dos sitios basado en anticuerpos monoclonales que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos frente a dos epítopos no interfirientes sobre Mnk, aunque puede utilizarse un ensayo de unión competitiva. Estos y otros ensayos se describen, entre otros sitios, en Hampton R. et al. (Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn., 1990) y Maddox D.E. et al., J. Exp. Med. 158:1211-1216, 1983).

Una amplia diversidad de marcajes y técnicas de conjugación son conocidas por el experto en la materia y pueden utilizarse en diversos ensayos de ácidos nucleicos y de aminoácidos. Entre los medios para producir sondas marcadas de hibridación o de PCR para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos codificantes de Mnk se incluyen el oligomarcaje, la traducción de muescas, el marcaje de extremos o la amplificación mediante PCR utilizando un nucleótido marcado.

Alternativamente, las secuencias codificantes de Mnk, o cualesquiera partes de las mismas, puede clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores son conocidos de la técnica, se encuentran disponibles comercialmente, y pueden utilizarse para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de una ARN polimerasa apropiada, tal como la de T7, T3 ó SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden llevarse a cabo utilizando una diversidad de kits disponibles comercialmente (Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, Mich.; Promega, Madison, Wis., y U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio).

Entre las moléculas informadoras o marcajes adecuados que pueden utilizarse se incluyen radionucleidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

Las células huésped transformadas con secuencias de nucleótidos codificantes de Mnk pueden cultivarse bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede secretarse o encontrarse contenida intracelularmente, dependiendo de la secuencia y/o del vector utilizado. Tal como entenderá el experto en la materia, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican Mnk pueden diseñarse para contener secuencias de señal que dirijan la secreción de Mnk a través de una membrana celular procariótica o eucariótica. Pueden utilizarse otras construcciones recombinantes para unir secuencias codificantes de Mnk con una secuencia de nucleótidos codificante de un dominio polipeptídico, que facilitará la purificación de las proteínas solubles. Entre estos dominios facilitadores de la purificación se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, péptidos quelantes de metales, tales como los módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, los dominios de proteína A, que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de extensión de FLAG/purificación por afinidad (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Puede utilizarse la inclusión de secuencias conectoras escindibles, tales como aquéllas específicas para el factor XA o la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, Calif.) entre el dominio de purificación y Mnk, para facilitar la purificación. Uno de dichos vectores de expresión permite la expresión de una proteína de fusión que contiene Mnk y un ácido nucleico codificante de 6 residuos de histidina antes de una tiorredoxina o de un sitio de corte de enteroquinasa. Uno de dichos vectores de expresión permite la expresión de una proteína de fusión que contiene Mnk y un ácido nucleico codificante de 6 residuos histidina antes de una tiorredoxina o un sitio de corte de enteroquinasa. Los residuos histidina facilitan la purificación en IMIAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados tal como se describe en Porath J. et al., Prot. Exp. Purif. 3:263-281, 1992), mientras que el sitio de corte de enteroquinasa proporciona un medio para purificar Mnk separándola de la proteína de fusión. Se proporciona un análisis sobre los vectores que contienen proteínas de fusión en Kroll D.J. et al. (DNA Cell Biol. 12:441-453, 1993). Además de la producción recombinante, pueden producirse fragmentos de Mnk mediante síntesis peptídica directa utilizando técnicas de fase sólida (Merrifield J., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963). La síntesis de proteínas puede llevarse a cabo utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando el sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Pueden sintetizarse químicamente diversos fragmentos de Mnk de manera separada y combinarse utilizando métodos químicos para producir la molécula de longitud completa.

Diagnóstico y terapéutica

La memoria da a conocer que determinados ácidos nucleicos y proteínas y moléculas efectoras de los mismos resultan útiles en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas implicadas, a título de ejemplo no limitativo, en trastornos metabólicos tales como la obesidad, la diabetes, los trastornos de la alimentación, los síndromes de emaciación (caquexia), las disfunciones pancreáticas, la arterioesclerosis, la enfermedad arterial coronaria (CAD) y otras enfermedades y trastornos tal como se ha indicado anteriormente. Por lo tanto, entre los usos diagnósticos y terapéuticos para las proteínas Mnk pueden incluirse, a título de ejemplo no limitativo, los siguientes: (i) terapéutica de proteínas, (ii) dianas farmacológicas de molécula pequeña, (iii) dianas de anticuerpo (terapéutico, diagnóstico, anticuerpo de direccionamiento de fármaco/citotóxico), (iv) marcador diagnóstico y/o prognóstico, (v) terapia génica (administración génica/ablación génica), (vi) herramientas de investigación, y (vii) regeneración de tejidos in vitro e in vivo (regeneración de todos dichos tejidos y tipos celulares que componen dichos tejidos, y tipos celulares derivado a partir de dichos tejidos).

Los ácidos nucleicos y proteínas dados a conocer en la memoria pueden resultar útiles en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas implicadas en diversas enfermedades y trastornos. Por ejemplo, aunque sin limitación, los ADNc codificantes de proteínas Mnk y particularmente los homólogos humanos de las mismas, pueden resultar útiles en la terapia génica, y las proteínas Mnk, y particularmente los homólogos humanos de las mismas, pueden resultar útiles al administrarse en un sujeto que necesita de las mismas. A título de ejemplo no limitativo, algunas composiciones de la memoria pueden resultar eficaces para el tratamiento de pacientes que sufren de, a título de ejemplo no limitativo, trastornos metabólicos tales como la obesidad, la diabetes, los trastornos de alimentación, los síndromes de emaciación (caquexia), las disfunciones pancreáticas, la arterioesclerosis, la enfermedad arterial coronaria (CAD) y otras enfermedades y trastornos, particularmente tal como se ha indicado anteriormente.

El ácido o ácidos nucleicos codificantes de la proteína o proteínas Mnk, o fragmentos de los mismos, además pueden resultar útiles en aplicaciones diagnósticas, en los que la presencia o la cantidad de los ácidos nucleicos o las proteínas deben evaluarse. Estos materiales resultan útiles además en la generación de anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a las nuevas sustancias de la invención para la utilización en métodos terapéuticos o diagnósticos.

Por ejemplo, en un aspecto, los anticuerpos que son específicos para Mnk pueden utilizarse directamente como antagonista, o indirectamente como mecanismo de direccionamiento o administración para llevar un agente farmacéutico a células o tejido que expresa Mnk. Los anticuerpos pueden generarse utilizando métodos que son bien conocidos de la técnica. Entre dichos anticuerpos pueden incluirse, aunque sin limitación, fragmentos Fab monocatenarios quiméricos monoclonales o policlonales, y fragmentos producidos en una biblioteca de expresión de Fab. Resultan especialmente preferentes los anticuerpos neutralizadores (es decir, aquellos que inhiben la formación de dímeros) para la utilización terapéutica.

Para la producción de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos huéspedes, incluyendo cabras, conejos, ratas, ratones, seres humanos, y otros, mediante inyección con Mnk, de cualquier fragmento u oligopéptido de la misma que presente propiedades inmunogénicas. Dependiendo de la especie del huésped, pueden utilizarse diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica. Entre dichos adyuvantes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, solución de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio y sustancias activas en superficie, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa americana y dinitrofenol. Entre los adyuvantes utilizados en el ser humano, resultan especialmente preferibles BCG (Bacille Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Resulta preferente que los péptidos, fragmentos u oligopéptidos utilizados para inducir anticuerpos contra Mnk presenten una secuencia de aminoácidos que consista de por lo menos cinco aminoácidos, y más preferentemente por lo menos 10 aminoácidos. Resulta preferible que sean idénticos a una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína natural, y pueden contener la secuencia de aminoácidos completa de una molécula natural de pequeño tamaño. Pueden fusionarse tramos cortos de aminoácidos de Mnk con los de otra proteína, tal como la hemocianina de lapa americana y anticuerpos producidos contra la molécula quimérica.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales contra Mnk utilizando cualquier técnica que permita la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Entre ellas se incluyen, aunque sin limitación, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas y la técnica del hibridoma de EBV (Köhler G. et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D. et al., J. Immunol. Methods 81:31-42, 1985; Cote R.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole S.P. et al., Mol. Cell Biol. 62:109-120, 1984).

Además, pueden utilizarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el corte y empalme de genes de anticuerpo de ratón contra genes de anticuerpo humano destinado a la obtención de una molécula con especificidad de antígeno y actividad biológica apropiadas (Morrison S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855, 1984; Neuberger M.S. et al., Nature 312:604-608, 1984; Takeda S. et al., Nature 314:452-454, 1985). Alternativamente, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios, utilizando métodos conocidos de la técnica, para producir anticuerpos monocatenarios específicos de Mnk. Pueden generarse anticuerpos con especificidad relacionada, pero de composición idiotípica diferente, mediante reorganización de cadenas procedentes de bibliotecas combinatoriales aleatorias de inmunoglobulinas (Burton D.R., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3, 1991). También pueden producirse anticuerpos mediante la inducción de la producción in vivo en la población de linfocitos o mediante cribado de bibliotecas de inmunoglobulinas recombinantes o paneles de reactivos de unión altamente específicos tal como se da a conocer en la literatura (Orlandi R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837, 1989; Winter G. et al., Nature 349:293-299, 1991).

También pueden generarse fragmentos de anticuerpo, que contienen sitios de unión específicos para Mnk. Por ejemplo, entre dichos fragmentos se incluyen, aunque sin limitación, fragmentos proteolíticos, por ejemplo los fragmentos F(ab')2 que pueden producirse mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse mediante la reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, pueden generarse fragmentos recombinantes. Por ejemplo, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab para permitir la rápida y fácil identificación de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huse W.D. et al., Science 254:1275-1281, 1989).

Pueden utilizarse diversos inmunoensayos para el cribado de identificación de anticuerpos que presenten la especificidad deseada. Son bien conocidos de la técnica numerosos protocolos para la unión competitiva y para ensayos inmunorradiométricos que utilizan anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidades establecidas. Dichos inmunoensayos típicamente implican la medición de la formación de complejo entre Mnk y su anticuerpo específico. Resulta preferente un inmunoensayo de dos sitios basado en anticuerpos monoclonales reactivo con dos epítopos Mnk no interfirientes, aunque también puede utilizarse un ensayo de unión competitiva (Maddox, supra).

Pueden utilizarse polinucleótidos de Mnk o cualquier fragmento de los mismos, o moléculas de ácidos nucleicos efectores, aptámeros, moléculas antisentido, ribozimas o moléculas de ARNi, con fines terapéuticos. En un aspecto, pueden generarse aptámeros, es decir moléculas de ácidos nucleicos, que son capaces de unión a una proteína Mnk y de modular su actividad, mediante un procedimiento de cribado y selección que implica la utilización de bibliotecas combinatoriales de ácidos nucleicos.

Pueden utilizarse moléculas antisentido contra el polinucléotido codificante de Mnk en situaciones en las que resultaría deseable para bloquear la transcripción del ARNm. En particular, pueden transformarse células con secuencias complementarias de los polinucleótidos codificantes de Mnk. De esta manera, pueden utilizarse moléculas antisentido para modular la actividad de Mnk o para conseguir la regulación de la función génica. Dicha tecnología ahora es bien conocida de la técnica y pueden diseñarse oligómeros sentido o antisentido o fragmentos de mayor tamaño de diversas localizaciones a lo largo de las regiones codificantes o de control de secuencias codificantes de Mnk. Pueden utilizarse vectores de expresión derivados de retrovirus, adenovirus, virus herpes o vaccinia, o de diversos plásmidos bacterianos, para la administración de secuencias de nucleótidos en el órgano, tejido o población celular diana. Pueden utilizarse métodos, que son bien conocidos por el experto en la materia, para construir vectores recombinantes, que expresarán moléculas antisentido complementarias de los polinucleótidos del gen codificante de Mnk. Estas técnicas se describen tanto en Sambrook et al. (supra) como en Ausubel et al. (supra). Los genes codificantes de Mnk pueden inactivarse mediante transformación de una célula o tejido con vectores de expresión que expresan niveles elevados de polinucleótidos o fragmentos de los mismos que codifican Mnk. Pueden utilizarse dichos constructos para introducir secuencias sentido o antisentido no traducibles en una célula. Incluso en ausencia de integración en el ADN, dichos vectores pueden continuar transcribiendo moléculas de ARN hasta su inactivación por nucleasas endógenas. La expresión transitoria puede durar un mes o más con un vector no replicante e incluso más en el caso de que elementos de replicación apropiados formen parte del sistema vector.

Tal como se ha indicado anteriormente, pueden obtenerse modificaciones de la expresión génica mediante el diseño de moléculas antisentido, por ejemplo ADN, ARN o análogos de ácidos nucleicos tales como APN, contra las regiones de control del gen codificante de Mnk, es decir, los promotores, intensificadores e intrones. Resultan preferentes los oligonucleotidos derivados del sitio de inicio de transcripción, por ejemplo entre las posiciones -10 y +10 desde el sitio de inicio. De manera similar, puede conseguirse la inhibición utilizando metodología de apareamiento de bases de "triple hélice". El apareamiento de triple hélice resulta útil debido a que provoca la inhibición de la capacidad de la doble hélice de abrirse suficientemente para la unión de polimerasas, factores de transcripción o moléculas reguladoras. Algunos avances terapéuticos recientes con ADN tríplex han sido descritos en la literatura (Gee J.E. et al., 1994, en: Huber B.E. y B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.). Las molécula antisentido también pueden diseñarse para bloquear la traducción del ARNm al impedir la unión de los transcritos a los ribosomas.

Los ribozimas, moléculas de ARN enzimático, también pueden utilizarse para catalizar el corte específico del ARN. El mecanismo de la acción de los ribozimas implica la hibridación específica de secuencias de la molécula de ribozima con ARN diana complementario, seguido del corte endonucleolítico. Entre los ejemplos que pueden utilizarse se incluyen moléculas de ribozima de motivo de cabeza de martillo manipuladas que pueden catalizar específica y eficientemente el corte endonucleolítico de secuencias codificantes de Mnk. Los sitios de corte de ribozima específicos dentro de cualquier diana de ARN potencial inicialmente se identifican mediante el escaneo de la molécula diana para sitios de corte de ribozima que incluyan las secuencias siguientes: GUA, GUU y GUC. Tras la identificación, pueden evaluarse secuencias cortas de ARN, de entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen diana que contiene el sitio de corte, para características estructurales secundarias que pueden convertir en inoperable el oligonucleótido. La idoneidad de las dianas candidatas también puede evaluarse mediante el ensayo de la accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios utilizando ensayos de protección frente a ribonucleasa.

Las moléculas efectoras, por ejemplo moléculas antisentido y ribozimas de la invención, pueden prepararse mediante cualquier método conocido de la técnica para la síntesis de moléculas de ácidos nucleicos. Entre ellas se incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligonucleótidos, tales como la síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Alternativamente, pueden generarse moléculas de ARN mediante transcripción in vitro e in vivo de secuencias de ADN codificantes de Mnk. Dichas secuencias de ADN pueden incorporarse en una diversidad de vectores con promotores adecuados de ARN polimerasa, tales como los de T7 o SP6. Alternativamente, estos constructos de ADNc que sintetizan ARN antisentido constitutiva o induciblemente pueden introducirse en líneas celulares, células o tejidos. Las moléculas de ARN pueden modificarse para incrementar su estabilidad intracelular y vida media. Entre las posibles modificaciones se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3' de la molécula, o la utilización de fosforotioato ó 2'-O-metilo, y no enlaces fosfodiesterasa dentro del esqueleto de la molécula. Este concepto resulta inherente en la producción de APNs y puede extenderse a todas las moléculas mediante la inclusión de bases no tradicionales, tales como inosina, queosina y wibutosina, así como formas modificadas con acetilo, metilo o tio, y formas modificadas de manera similar de adenina, citidina, guanina, timidina y uridina que no resultan fácilmente reconocidas por las endonucleasas endógenas.

La actividad de las proteínas Mnk puede someterse a ensayo por ejemplo mediante ensayos in vitro de quinasa, tal como describen Tschopp et al., supra, 2000, o cualquier otro principio de ensayo adecuado, tal como se indica

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

posteriormente. A modo de inhibidor de Mnk en el presente ensayo puede utilizarse un derivado de estaurosporina, tal como CGP57380 ó CGP052088, tal como describen Tschopp et al., supra, 2000, o Knauf et al., supra, 2001. A modo de control negativo, puede utilizarse el compuesto CGP52428, que es inactivo frente a Mnk pero que muestra una citotoxicidad similar a la de CGP052088, o cualquier otra entidad química con actividad inhibidora de quinasa con excepción de actividad contra Mnk. Además, pueden someterse a ensayo derivados de CGP57380 para la actividad contra Mnk y son sustancias para el tratamiento, profilaxis y diagnóstico de las enfermedades metabólicas tal como se ha indicado anteriormente. Los derivados de CGP57380 podrían generarse, por ejemplo, mediante modificación por medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y puede utilizarse para producir bibliotecas combinatoriales. Pueden someterse a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como la acilación, la alquilación, la esterificación, la amidificación, etc., para producir análogos estructurales.

La memoria da a conocer la utilización de inhibidores o activadores de quinasa Mnk para el tratamiento, profilaxis o diagnóstico de enfermedades metabólicas, tal como se ha indicado anteriormente. Preferentemente, aunque no exclusivamente, los inhibidores de la quinasa Mnk son derivados de estaurosporina o pirazol según la reivindicación 1 del documento EP nº A-0 819 129, que se incorpora en la presente memoria como referencia y se refiere a un derivado 4-amino-1H-pirazol[3,4-d]pirimidina de fórmula I:

imagen1

en la que:

m y n son, cada uno independientemente, un número entero entre 0 y 3 inclusive, v es 0 ó 1,

R es hidrógeno o alquilo inferior,

R1 es halógeno, ciano, trifluorometilo, hidroxi, alcoxi inferior, alcanoiloxi inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, carbamoilo, N-alquilcarbamoilo inferior o alquilo inferior que se encuentra no sustituido o sustituido con amino o con ciano, resultando posible en el caso de que se encuentren presentes varios sustituyentes R1 fenilo que aquellos sustituyentes sean idénticos o diferentes entre sí,

X es el grupo NH(CH-R7)t, en el que t es un número entero entre 0 y 3 inclusive, y R7 es hidrógeno o alquilo inferior,

o el grupo (C[R3]-R4)q, en el que q es un número entero entre 0 y 3, inclusive; R3 es hidrógeno o alquilo inferior, y R4 es hidrógeno o alquilo inferior, y R2 es halógeno, nitro, ciano, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, carbamoilo, N-alquilcarbamoilo inferior, N,N-dialquilcarbamoilo inferior, azido, amino, alquilamino inferior, dialquilamino inferior, dialquilamino inferior-alquilenamino inferior, bencilamino; amino acilado o sulfonado, presentando cada uno hasta 10 átomos de carbono; hidroxi, alcanoiloxi inferior, oxa-alcoxi inferior, alcoxi inferior que se encuentra no sustituido o sustituido con carboxi, alcoxicarbonilo inferior o con N-alquilcarbamoilo inferior, o alquilo inferior que se encuentra no sustituido o sustituido con amino, alcanoilamino inferior, benzoilamino, alcoxicarbonilamino inferior, amino sulfonado, ciano, hidroxi, alcanoiloxi inferior, alcoxicarboniloxi inferior o con alcoxi inferior, resultando posible en el caso de que se encuentren presentes varios sustituyentes R2 fenilo que los sustituyentes sean idénticos o diferentes entre sí y que dos radicales R2 vecinos también formen conjuntamente el grupo metilendioxi,

o una sal o un tautómero de dicho compuesto.

Debido a que CGP57380 no es citotóxico hasta 30 µM, esta sustancia puede utilizarse preferentemente para inhibir la actividad de quinasa, preferentemente Mnk2, y utilizarse como sustancia para el tratamiento, profilaxis y diagnóstico de enfermedades metabólicas, tal como se ha indicado anteriormente.

Se encuentran disponibles muchos métodos para introducir vectores en células o tejidos y resultan igualmente adecuados para la utilización in vivo, in vitro y ex vivo. Para la terapia ex vivo, pueden introducirse vectores en células madre obtenidas del paciente y propagarse clonalmente para el trasplante autólogo de vuelta en el mismo paciente. La administración mediante transfección y mediante inyecciones de liposomas puede realizarse utilizando métodos que son bien conocidos de la técnica. Pueden ponerse en práctica cualquiera de los métodos terapéuticos indicados anteriormente en cualquier sujeto adecuado, incluyendo, por ejemplo, mamíferos, tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos y más preferentemente, seres humanos.

Se da a conocer la administración de una composición farmacéutica, conjuntamente con un portador farmacéuticamente aceptable, para cualquiera de los efectos terapéuticos comentados anteriormente. Las composiciones farmacéuticas pueden consistir de Mnk, anticuerpos contra Mnk, miméticos, agonistas, antagonistas

o inhibidores de Mnk. Las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con por lo menos otro agente, tal como un compuesto estabilizador, que puede administrarse en cualquier portador farmacéutico biocompatible estéril, incluyendo, aunque sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Las composiciones pueden administrarse en un paciente solas o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas. Las composiciones farmacéuticas utilizadas en la presente invención pueden administrarse mediante cualquiera de entre varias vías, incluyendo, aunque sin limitación, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual o rectal.

Además de los ingredientes activos, dichas composiciones farmacéuticas pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables adecuados, comprendiendo excipientes y adyuvantes, que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden utilizarse farmacéuticamente. Pueden encontrarse detalles adicionales sobre técnicas para la formulación y administración en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.). Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden formularse utilizando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos de la técnica en dosis adecuadas para la administración oral. Dichos portadores permiten formular las composiciones farmacéuticas en forma de tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones, y similares, para la ingestión por el paciente.

Pueden prepararse composiciones farmacéuticas de una manera conocida de la técnica, por ejemplo mediante procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulado, preparación de grageas, levigado, emulsificación, encapsulado, atrapamiento o liofilización. La composición farmacéutica puede proporcionarse en forma de una sal y puede formarse con muchos ácidos, incluyendo, aunque sin limitación, ácidos hidroclórico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Tras la preparación de las composiciones farmacéuticas, pueden introducirse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una condición indicada. Para la administración de Mnk, dicho etiquetado incluiría la cantidad, frecuencia y método de administración.

Entre las composiciones farmacéuticas se incluyen composiciones en las que los ingredientes activos se encuentran contenidos en una cantidad efectiva para alcanzar el propósito pretendido. La determinación de una dosis eficaz se encuentra perfectamente comprendida dentro de los conocimientos del experto en la materia. Para cualquier compuesto pueden estimarse inicialmente las dosis terapéuticamente eficaces en ensayos de cultivo celular, por ejemplo de líneas celulares de preadipocitos, o en modelos animales, habitualmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también puede utilizarse para determinar el intervalo de concentraciones apropiado y la vía de administración. A continuación, puede utilizarse esta información para determinar las dosis y vías útiles para la administración en el ser humano. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad de ingrediente activo, por ejemplo fragmentos de Mnk, anticuerpos de Mnk, para el tratamiento de una condición específica. La eficacia y toxicidad terapéuticas pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) y la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la proporción LD50/ED50. Las composiciones farmacéuticas que muestran índices terapéuticas grandes, resultan preferentes. Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y de estudios animales se utilizan para formar un intervalo de dosis para la utilización en el ser humano. La dosis contenida en dichas composiciones preferentemente se encuentra comprendida dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis varía dentro de este intervalo dependiendo de la dosis utilizada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración. La dosis exacta será determinada por el médico a la luz de factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. La dosis y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del grupo activo o para mantener el efecto deseado. Entre los factores que pueden considerarse se incluyen la gravedad del estado de enfermedad, el estado general de salud del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta, el periodo y frecuencia de administración, la combinación o combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden administrarse cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas, dependiendo de la vida media y la tasa de eliminación de la formulación particular. Las cantidades de dosis normales pueden variar entre 0,1 y 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 gramo, dependiendo de la vía de administración. En la literatura se proporcionan, y se encuentran generalmente disponibles para los profesionales de la materia, guías para las dosis y métodos de administración particulares. El experto en la materia utilizará diferentes formulaciones para nucleótidos que para proteínas o para los inhibidores de los mismos. De manera similar, la administración de polinucleótidos o polipéptidos será específica para las células, las condiciones o las localizaciones, etcétera, particulares.

Pueden utilizarse anticuerpos que se unen específicamente a Mnk para el diagnóstico de condiciones o enfermedades caracterizadas o asociadas a la sobreexpresión o infraexpresión de Mnk, o en ensayos para el seguimiento de pacientes bajo tratamiento con Mnk, agonistas, antagonistas o inhibidores. Los anticuerpos que resultan útiles con fines diagnósticos pueden prepararse de la misma manera que la descrita anteriormente para la terapéutica. Entre los ensayos diagnósticos para Mnk se incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y un marcaje para detectar Mnk en líquidos corporales humanos o en extractos de células o tejidos. Los anticuerpos pueden utilizarse con o sin modificación, y pueden marcarse mediante la unión de los mismos, covalente o no covalentemente, con una molécula informadora. Puede utilizarse una amplia diversidad de moléculas informadoras que son conocidas de la técnica, algunas de las cuales se ha indicado anteriormente.

Se conoce de la técnica una diversidad de protocolos, incluyendo ELISA, RIA y FACS, para medir Mnk, y proporcionar una base para diagnosticar los niveles alterados o anormales de expresión de Mnk. Se establecen valores normales o estándares de expresión de Mnk mediante la combinación de líquidos corporales o extractos celulares obtenidos de sujetos mamíferos normales, preferentemente el ser humano, con anticuerpos contra Mnk bajo condiciones adecuadas para la formación de complejo. La cantidad estándar de formación de complejo puede cuantificarse mediante diversos métodos, aunque preferentemente por medios fotométricos. Se comparan con los valores estándares las cantidades de Mnk expresadas en muestras de control y en muestras de pacientes enfermos, por ejemplo procedentes de tejidos biopsiados. La discrepancia entre los valores estándares y muestrales establece los parámetros para diagnosticar la enfermedad. También puede llevarse a cabo un análisis de la expresión de Mnk determinando la actividad de la misma en formatos de ensayo bien conocidos de la técnica y descritos en mayor detalle posteriormente.

Los polinucleótidos específicos para Mnk pueden utilizarse con fines diagnósticos. Entre los polinucleótidos que pueden utilizarse se incluyen secuencias oligonucleótidas, moléculas de ARN y ADN antisentido, y APNs. Los polinucleótidos pueden utilizarse para detectar y cuantificar la expresión génica en tejidos biopsiados en los que puede correlacionarse la expresión de Mnk con enfermedad. El ensayo diagnóstico puede utilizarse para distinguir entre ausencia, presencia y exceso de expresión de Mnk, y para realizar un seguimiento de la regulación de los niveles de Mnk durante la intervención terapéutica.

La hibridación con sondas de PCR que son capaces de detectar secuencias polinucleótidas, incluyendo secuencias genómicas, codificantes de Mnk y/o moléculas estrechamente relacionadas, puede utilizarse para identificar secuencias de ácidos nucleicos que codifican Mnk. La especificidad de la sonda, si está constituida de una región altamente específica, por ejemplo nucleótidos únicos en la región 5' reguladora, o de una región menos específica, por ejemplo especialmente en la región codificante 3', y la astringencia de la hibridación o amplificación (máxima, alta, intermedia o baja) determinarán si la sonda identifica únicamente secuencias naturales codificantes de Mnk, alelos o secuencias relacionadas. También pueden utilizarse sondas para la detección de secuencias relacionadas, y deben contener preferentemente por lo menos 50% de los nucleótidos de cualquiera de las secuencias codificantes de Mnk. Las sondas de hibridación de la presente invención pueden ser de ADN o ARN y derivarse de la secuencia de nucleótidos de AF237775 ó NM_017572.1, o de una secuencia genómica que incluya promotor, elementos intensificadores e intrones de la Mnk natural. Entre los medios para producir sondas de hibridación específicas para ADNs codificantes de Mnk se incluyen la clonación de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de derivados de Mnk en vectores para la producción de sondas de ARNm. Dichos vectores son conocidos de la técnica, se encuentran disponibles comercialmente, y pueden utilizarse para sintetizar sondas de ARN in vitro por medio de la adición de las ARN polimerasas apropiadas y los nucleótidos marcados apropiados. Las sondas de hibridación pueden marcarse con una diversidad de grupos informadores, por ejemplo radionucleidos, tales como32P o 35S, o marcajes enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda mediante sistemas de acoplamiento avidina/biotina, y similares.

Pueden utilizarse secuencias polinucleótidas codificantes de Mnk para el diagnóstico de condiciones o enfermedades que se asocian a la expresión de Mnk. Entre los ejemplos de dichas condiciones o enfermedades se incluyen, aunque sin limitación, enfermedades y trastornos pancreáticos, incluyendo diabetes. También pueden utilizarse secuencias polinucleótidas codificantes de Mnk para el seguimiento del progreso de los pacientes que reciben tratamiento para enfermedades y trastornos pancreáticos, incluyendo diabetes. Las secuencias polinucleótidas codificantes de Mnk pueden utilizarse en análisis southern o northern, transferencia de puntos u otras tecnologías basadas en membranas; en tecnologías de PCR, o en ensayos de inmersión de varilla, de clavos, ELISA

o de chip, utilizando líquidos o tejidos procedentes de biopsias de pacientes para detectar la expresión alterada de Mnk. Dichos métodos cualitativos o cuantitativos son bien conocidos de la técnica.

Las secuencias de nucleótidos codificantes de Mnk pueden resultar útiles en ensayos que detectar la activación o inducción de diversas enfermedades y trastornos metabólicos, incluyendo la obesidad. También se dan a conocer diabetes, trastornos de alimentación, síndromes de emaciación (caquexia), disfunciones pancreáticas, arterioesclerosis, enfermedad arterial coronaria (CAD), trastornos relacionados con la producción de ROS y enfermedades neurodegenerativas. Las secuencias de nucleótidos codificantes de Mnk pueden marcarse mediante métodos estándares, y añadirse a una muestra líquida o de tejido procedente de un paciente bajo condiciones adecuadas para la formación de complejos de hibridación. Tras un periodo de incubación adecuado, la muestra se lavó y se cuantificó la señal y se comparó con un valor estándar. La presencia de niveles alterados de secuencias de nucleótidos codificantes de Mnk en la muestra en comparación con una muestra de control indica la presencia de la enfermedad asociada. También pueden utilizarse dichos ensayos para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico particular en estudios animales, en ensayos clínicos, o en el seguimiento del tratamiento de un paciente individual.

Con el fin de proporcionar una base para el diagnóstico de una enfermedad asociada a la expresión de Mnk, se establece un perfil normal o estándar para la expresión. Esto puede llevarse a cabo mediante la combinación de líquidos corporales o extractos celulares obtenidos de pacientes normales, animales o humanos, con una secuencia,

o un fragmento de la misma, que codifica Mnk, bajo condiciones adecuadas para la hibridación o la amplificación. Puede cuantificarse la hibridación estándar mediante la comparación de los valores obtenidos de sujetos normales con aquellos de un experimento en el que se utiliza una cantidad conocida de un polinucleótido sustancialmente purificado. Los valores estándares obtenidos de muestras normales pueden compararse con los valores obtenidos de muestras procedentes de pacientes que presentan síntomas de la enfermedad. La discrepancia entre los valores estándares y muestrales se utiliza para establecer la presencia de enfermedad. Tras establecer la presencia de enfermedad, se inicia un protocolo de tratamiento, pueden repetirse ensayos de hibridación de modo periódico para evaluar si el nivel de expresión en el paciente empieza a aproximarse al observado en el paciente normal. Los resultados obtenidos de ensayos sucesivos pueden utilizarse para demostrar la eficacia del tratamiento durante un periodo de entre varios días y algunos meses.

Con respecto a las enfermedades y trastornos metabólicos, incluyendo obesidad, diabetes, trastornos de alimentación, síndromes de emaciación (caquexia), disfunciones pancreáticas, arterioesclerosis, enfermedad arterial coronaria (CAD), trastornos relacionados con la producción de ROS, y enfermedades neurodegenerativas, la presencia de una cantidad relativamente alta de transcrito en tejido biopsiado procedente de un individuo podría indicar una predisposición para el desarrollo de la enfermedad, o podría proporcionar un medio para detectar la enfermedad antes de la aparición de los síntomas clínicos. Un diagnóstico más definitivo de este tipo podría permitir a los profesionales clínicos la utilización de medidas preventivas o un tratamiento agresivo más precozmente, previniendo de esta manera el desarrollo o la progresión adicional de las enfermedades y trastornos pancreáticos. Algunos usos diagnósticos adicionales para los oligonucleótidos diseñados a partir de las secuencias codificantes de Mnk podrían implicar la utilización de PCR. Dichos oligómeros podrían sintetizarse químicamente, generarse enzimáticamente o producirse a partir de una fuente recombinante. Los oligómeros preferentemente consisten de dos secuencias de nucleótidos, una con orientación sentido (5'.fwdarw.3') y otra antisentido (3'.rarw.5'), utilizados bajo condiciones optimizadas para la identificación de un gen o condición específica. Los mismos dos oligómeros, conjuntos anidados de oligómeros, o incluso un grupo degenerado de oligómeros podría utilizarse bajo condiciones menos restrictivas para la detección y/o la cuantificación de secuencias de ADN o ARN estrechamente relacionadas.

Entre los métodos que también podrían utilizarse para cuantificar la expresión de Mnk se incluyen el marcaje radioactivo o los nucleótidos biotinilados, la coamplificación de un ácido nucleico de control, y curvas estándares en las que se interpolan los resultados experimentales (Melby P.C. et al., J. Immunol. Methods 159:235-244, 1993; Duplaa C. et al., Anal. Biochem. 212:229-236, 1993). La velocidad de la cuantificación de muestras múltiples puede acelerarse llevando a cabo el ensayo en un formato ELISA en el que se presenta el oligómero de interés en diversas diluciones y una respuesta espectrofotométrica o colorimétrica proporciona una cuantificación rápida.

En otra realización de la invención, las secuencias de ácidos nucleicos de Mnk también pueden utilizarse para generar sondas de hibridación que resultan útiles para mapear la secuencia genómica natural. Las secuencias pueden localizarse en el mapa en un cromosoma particular o en una región específica del cromosoma utilizando técnicas bien conocidas. Entre dichas técnicas se incluyen FISH, FACS o construcciones de cromosoma artificial, tales como los cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales bacterianos, construcciones P1 bacterianas o bibliotecas de ADNc de un único cromosoma tal como se revisan en Price C.M., Blood Rev. 7:127134, 1993; y Trask B.J., Trends Genet. 7:149-154, 1991. Puede correlacionarse el FISH (tal como se describe en Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y., 1988) con otras técnicas de mapeado físico de cromosomas y datos de mapa genético. Pueden encontrarse ejemplos de datos de mapa genético en la publicación sobre el genoma de Science de 1994 (265:181f). La correlación entre la localización del gen codificante de Mnk en un mapa cromosómico físico y una enfermedad específica, o la predisposición a una enfermedad específica, podrían ayudar a delimitar la región de ADN asociada a dicha enfermedad genética.

Las secuencias de nucleótidos de la memoria pueden utilizarse para detectar diferencias entre las secuencias génicas de individuos normales, portadores o afectados. La hibridación in situ de preparaciones cromosómicas y las técnicas de mapeo físico, tales como el análisis de ligamientos utilizando marcadores cromosómicos establecidos pueden utilizarse para extender los mapas genéticos. Con frecuencia la posición de un gen en el cromosoma de otra especie de mamífero, tal como el ratón, puede revelar marcadores asociados incluso en el caso de que no se conozca el número o brazo de un cromosoma humano particular. Pueden asignarse nuevas secuencias a brazos cromosómicos o partes de los mismos mediante mapeo físico. Esto proporciona información valiosa a los investigadores en la búsqueda de genes de enfermedad utilizando la clonación posicional u otras técnicas de exploración génica. Tras localizar crudamente la enfermedad o síndrome mediante ligamiento genético en una región genómica particular, por ejemplo entre AT y 11q22-23 (Gatti R.A. et al., Nature 336:577-580, 1988), cualesquiera secuencias localizadas en dicho área podrían representar genes asociados o reguladores para su investigación posterior. Las secuencias de nucleótidos de la invención también pueden utilizarse para detectar diferencias en la localización cromosómica debidas a traslocación, inversión, etc., entre individuos normales, portadores o afectados.

Pueden utilizarse proteínas, sus fragmentos catalíticos o inmunogénicos, u oligopéptidos de los mismos, un modelo in vitro, un animal o célula genéticamente alterado, para el cribado de bibliotecas de compuestos en cualquiera de entre una diversidad de técnicas de cribado de fármacos. Pueden identificarse efectores, por ejemplo receptores, enzimas, proteínas, péptidos, ligandos o sustratos que se unen, modulan o imitan la acción de una o más de las proteínas de la invención. La proteína o fragmento de la misma utilizado en dicho cribado puede encontrarse libre en solución, fijo en un soporte sólido, sobre una superficie celular, o encontrarse localizado intracelularmente. Puede medirse la formación de complejos de unión entre las proteínas de la invención y el agente sometido a ensayo. Los agentes también podrían, directa o indirectamente, influir sobre la actividad de las proteínas de la invención. Entre los mecanismos diana pueden incluirse, por ejemplo, una actividad de quinasa, particularmente la fosforilación de proteínas o péptidos, más preferentemente, aunque sin limitación, residuos de serina y treonina. Otro mecanismo diana podría incluir la regulación de la función de la Mnk mediante modificaciones post-traduccionales, tales como la fosforilación, la desfosforilación, la acetilación, la alquilación, la ubiquitinación, el procesamiento proteolítico, o la localización subcelular o la degradación. Todavía otro mecanismo diana podría incluir la interacción de Mnk con parejas de unión a proteínas, tales como, aunque sin limitación, fosfolipasa A, receptores de estrógeno, quinasas o factores de traducción. Resultan de interés particular los ensayos de cribado para agentes que presentan una toxicidad reducida para las células de mamífero. El término "agente" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier molécula, por ejemplo proteína o farmacéutico, que presenta la capacidad de alterar o imitar la función fisiológica de una o más de las proteínas de la invención. Los agentes candidatos comprenden numerosas clases químicas, aunque típicamente son moléculas orgánicas, preferentemente compuestos orgánicos pequeños que presentan un peso molecular superior a 50 e inferior a aproximadamente 2.500 daltons. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente los enlaces de hidrógeno, y típicamente incluyen por lo menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos con frecuencia comprenden estructuras carbocíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriormente indicados.

También se encuentran agentes candidatos entre las biomoléculas, incluyendo péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, ácidos nucleicos y derivados, análogos estructuras o combinaciones de los mismos. Los agentes candidatos se obtienen de una amplia diversidad de fuentes, incluyendo bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, se encuentran disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia diversidad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos aleatorizados y oligopéptidos. Alternativamente, se encuentran disponibles o se producen fácilmente bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales. Además, se modifican fácilmente bibliotecas y compuestos naturales o producidos sintéticamente, por medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y pueden utilizarse para producir bibliotecas combinatoriales. Pueden someterse agentes farmacológicos conocidos a modificaciones químicas aleatorias o dirigidas, tales como la acilación, la alquilación, la esterificación, la amidificación, etc., para producir análogos estructurales. En el caso de que el ensayo de cribado es un ensayo de unión, pueden unirse una o más de las moléculas a un marcaje, en donde el marcaje puede proporcionar directa o indirectamente una señal detectable.

Otra técnica para el cribado de fármacos que puede utilizarse permite el cribado de alto rendimiento de compuestos que presentan una afinidad de unión adecuada a la proteína de interés, tal como se describe en la solicitud de PCT publicada WO nº 84/03564. En este método, se proporciona o sintetiza en un sustrato sólido, tal como pines de plástico o alguna otra superficie, un gran número de diferentes compuestos de ensayo de pequeño tamaño, por ejemplo aptámeros, péptidos, compuestos de bajo peso molecular, etc. Los compuestos de ensayo se hacen reaccionar con proteínas o fragmentos de las mismas, y se lavan. A continuación, las proteínas unidas se detectan mediante métodos bien conocidos de la técnica. También pueden recubrirse placas directamente con las proteínas purificadas para la utilización en las técnicas de cribado de fármaco anteriormente indicadas. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos no neutralizadores para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido. También pueden utilizarse ensayos de cribado de fármaco competitivos, en los que anticuerpos neutralizadores capaces de unirse a la proteína compiten específicamente con un compuesto de ensayo para la unión a la proteína. De esta manera, pueden utilizarse los anticuerpos para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno

o más determinantes antigénicos con la proteína.

También pueden encontrarse agentes candidatos en ensayos de quinasa en los que un sustrato de quinasa, tal como una proteína o un péptido, que puede incluir o no modificaciones tal como se describe adicionalmente después, u otros se fosforilan con la proteína o fragmentos de proteína de la invención. Puede identificarse un agente candidato terapéutico a partir de su capacidad de incrementar o reducir la actividad enzimática de las proteínas de la invención. La actividad de quinasa puede detectarse a partir de un cambio en las propiedades químicas, físicas o inmunológicas del sustrato debido a la fosforilación.

Un ejemplo podría ser la transferencia de grupos fosfato marcados con un isótopo radioactivo de una molécula donante apropiada al sustrato de la quinasa catalizado por los polipéptidos de la invención. Tras la fosforilación del sustrato puede realizarse la detección de la autorradiografía de los sustrato utilizando técnicas bien conocidas.

En todavía otro ejemplo, puede detectarse el cambio de masa del sustrato debido a su fosforilación mediante técnicas de espectrometría de masas. También podría detectarse el estado de fosforilación de un sustrato con un reactivo que discriminase entre el estado fosforilado y no fosforilado del sustrato. Este reactivo podría actuar presentando diferentes afinidades para las formas fosforilada y no fosforilada del sustrato o presentando una afinidad específica para los grupos fosfato. Este tipo de reactivo podría ser, aunque sin limitación, un anticuerpo o derivado de anticuerpo, una estructura de tipo anticuerpo recombinante, una proteína, un ácido nucleico, una molécula que contuviese un ión metálico acomplejado, una matriz de cromatografía de intercambio aniónico, una matriz de cromatografía de afinidad o cualquier otra molécula con selectividad hacia el sustrato dependiente de la fosforilación.

Dicho reactivo podría utilizarse para detectar el sustrato de quinasa, inmovilizado en un soporte sólido durante o después de una reacción enzimática. En el caso de que el reactivo sea un anticuerpo, su unión al sustrato podría detectarse mediante una diversidad de técnicas, tal como se describe en Harlow y Lane, Antibodies, CSH Lab Press, NY, 1998. En el caso de que la molécula de reactivo no fuese un anticuerpo, podría detectarse en virtud de sus propiedades químicas, físicas o inmunológicas, encontrándose endógenamente asociada a ella o construido con ella.

En todavía otro ejemplo, el sustrato de quinasa puede presentar características, diseñadas o endógenas, para facilitar su unión o detección con el fin de generar una señal que resulte adecuada para el análisis del estado de fosforilación de los sustratos. Estas características pueden ser, aunque sin limitarse a ellas, una molécula de biotina

o derivado de la misma, un grupo glutatión-S-transferasa, un grupo de seis o más residuos consecutivos de histidina, una secuencia de aminoácidos o hapteno que funciona como un epítopo etiqueta, un fluorocromo, un enzima o un fragmento de enzima. El sustrato de quinasa puede unirse a ellos o a otras características con un brazo molecular espaciador para evitar impedimentos estéricos.

En un ejemplo, el sustrato de quinasa puede marcarse con un fluoróforo. Tras la unión del reactivo al sustrato marcado en solución puede realizarse la técnica de polarización de fluorescencia tal como se encuentra descrito en la literatura (ver, por ejemplo, Deshpande S. et al., Prog. Biomed. Optics (SPIE) 3603:261, 1999; Parker G.J. et al., J. Biomol. Screen 5:77-88, 2000; Wu P. et al., Anal. Biochem. 249:29-36, 1997). En una variación del presente ejemplo, una molécula trazadora fluorescente puede competir con el sustrato para el analito para detectar la actividad de quinasa mediante una técnica que es conocida del experto en la materia como polarización de fluorescencia indirecta.

Pueden utilizarse ácidos nucleicos codificantes de proteínas para generar líneas celulares transgénicas y animales. Estos animales transgénicos resultan útiles en el estudio de la función y regulación de las proteínas in vivo. Los animales transgénicos, particularmente los animales transgénicos mamíferos, pueden servir como sistema modelo para la investigación de muchos procesos del desarrollo y celulares comunes al ser humano. Los animales transgénicos pueden construirse mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias, en las que el locus normal del gen codificante de la proteína de la invención ha sufrido una mutación. Alternativamente, se inyecta un constructo de ácidos nucleicos codificante de la proteína en oocitos y se integra aleatoriamente en el genoma. También pueden expresarse los genes de la invención o variantes de los mismos en tejidos en los que no se expresan normalmente o en tiempos anormales del desarrollo. Además, pueden integrarse aleatoriamente en el genoma variantes de los genes, a modo de constructos específicos que expresan moléculas antisentido o que expresan mutaciones negativas dominantes que bloquean o alterar la expresión de las proteínas del a invención. Puede introducirse un marcador detectable, tal como lacZ o luciferasa, en el locus de los genes de la invención, en el que la regulación positiva de la expresión de los genes de la invención resultará en un cambio fácilmente detectable de fenotipo. Entre los vectores para la integración estable se incluyen plásmidos, retrovirus y otros virus animales, cromosomas artificiales de levadura (YACs) y similares. Los constructos de ADN para la recombinación homóloga contendrán por lo menos partes de los genes de la invención con la modificación genética deseada, e incluirán regiones de homología que presentan el locus diana. Convenientemente se incluyen marcadores para la selección positiva y negativa. Los constructos de ADN para la integración aleatoria no necesitan contener regiones de homología para mediar en la recombinación. Los constructos de ADN para la integración aleatoria consisten de los ácidos nucleicos codificantes de las proteínas de la invención, un elemento regulador (promotor), un intrón y una señal de poliadenilación. Los métodos para generar células que presentan modificaciones génicas diana mediante recombinación homóloga son conocidos de la técnica. Para las células madre embrionarias (ES), puede utilizarse una línea celular ES o pueden obtenerse células embrionarias frescas a partir de un huésped, por ejemplo un ratón, rata, cobaya, etc. Dichas células se cultivan en una capa alimentadora de fibroblastos apropiada y se cultivan en presencia de factor inhibidor de leucemia (LIF). Las células ES o embrionarias pueden transfectarse y después utilizarse para producir animales transgénicos. Tras la transfección, las células ES se siembran en una placa en una capa alimentadora en un medio apropiado. Las células que contienen el constructo pueden seleccionarse mediante la utilización de un medio de selección. Tras un tiempo suficiente para que crezcan las colonias, se recolectan y se analizan para la presencia de recombinación homóloga. Las colonias que son positivas seguidamente pueden utilizarse para la manipulación embrionaria y la agregación en mórula. Brevemente, se obtienen mórulas a partir de hembras superovuladas de entre 4 y 6 semanas de edad, se retira la zona pelúcida y las mórulas se introducen en pequeñas depresiones de una placa de cultivo de tejidos. Las células ES se tripsinizan y las células modificadas se introducen en la depresión próximas a las mórulas. Al día siguiente, los agregados se transfieren al interior de cuernos uterinos de hembras pseudogestantes. A continuación, se deja que las hembras lleguen a término. La descendencia quimérica puede detectarse fácilmente a partir de un cambio de color del pelaje y posteriormente se criban para la transmisión de la mutación a la generación siguiente (generación F1). Se criba la descendencia de la generación F1 para la presencia del gen modificado y los machos y hembras que presentan la modificación se cruzan para producir progenie homocigótica. En el caso de que las alteraciones génicas causen letalidad en algún punto del desarrollo, se mantienen los tejidos u órganos en forma de injertos o trasplantes alogénicos o congénicos,

o en cultivo in vitro. Los animales transgénicos pueden ser cualquier mamífero no humano, tal como animales de laboratorio, animales domésticos, etc., por ejemplo ratones, ratas, cobayas, cerdos, ovejas, vacas, cerdos, y otros. Los animales transgénicos pueden utilizarse en estudios funcionales, cribado de fármacos y en otras aplicaciones y resultan útiles en el estudio de la función y regulación de las proteínas in vivo.

Finalmente, también se da a conocer un kit que comprende por lo menos uno de entre:

(a)

una molécula de ácidos nucleicos de Mnk2 (Mnk2a o Mnk2b) o un fragmento de la misma,

(b)

un vector que comprende el ácido nucleico de (a),

(c)

una célula huésped que comprende el ácido nucleico de (a) o el vector de (b),

(d)

un polipéptido codificado por el ácido nucleico de (a),

(e)

un polipéptido de fusión codificado por el ácido nucleico de (a),

(f)

un anticuerpo, un aptámero u otro receptor contra el ácido nucleico de (a) o el polipéptido de (d) o (e), y

(g)

un oligonucleótido antisentido del ácido nucleico de (a).

El kit puede utilizarse con fines diagnósticos o terapéuticos o para aplicaciones de cribado tal como se ha indicado anteriormente. El kit puede contener además instrucciones para el usuario.

Las figuras muestran:

La figura 1, el incremento del contenido de triglicéridos en moscas macho EP(3)3333 y EP(3)3576 causado por la integración homocigótica viable del vector P (en comparación con machos de control de EP). Se muestra la proporción entre el contenido de triglicéridos y de proteínas de los mutantes, en porcentaje (%).

La figura 2, la organización molecular del locus génico LK6 mutado. La línea negra de puntos representa la posición del ADNc (entre las posiciones 7544500 y 7559500 en el cromosoma 3R) que incluye los sitios de integración de EP(3)3333 y EP(3)3576. Las secuencias de ADN transcrito (ESTs) y los exones predichos se muestran como columnas en las dos líneas inferior. Los exones predichos del gen CG17342 (GadFly, Lk6) se muestran como columnas gris oscuro y los intrones como columnas gris claro. Lk6 codifica un gen predicho por los programas de análisis de secuencia GadFly como número de acceso Gafly CG17342.

La figura 3, la comparación entre las proteínas Mnk.

La figura 3A, la comparación (CLUSTAL X 1.8) entre las proteínas Mnk de diferentes especies, hXP_030637 se refiere a la Mnk2 humana (idéntica al nº de acceso GenBank AF237775), hXP_001600 se refiere a la Mnk1 humana (idéntica al nº de acceso Genbank AB000409.1) y AAB18789 se refiere a la proteína codificada por el gen Lk6 de Drosophila con el nº de acceso GadFly CG17342. Los huecos en la alienación se encuentran representados como:

La figura 3B muestra la comparación (CLUSTAL W 1.82) entre las proteínas Mnk2 humanas. El número de acceso Genbank XM_030637.3 es idéntico al número de acceso Genbank AF237775, y el número de acceso Genbank NM_017572.1 muestra una variante diferente de la proteína Mnk2 humana.

La figura 3C muestra la comparación (CLUSTAL W 1.82) entre las proteínas Mnk2 humanas. El número de acceso Genbank XM_001600.2 es idéntico al número de acceso Genbank AB000409.1, y el número de acceso Genbank NM_003684.2 muestra una variante diferente de la proteína Mnk1.

Figura 3D. Secuencia de ácidos nucleicos de la quinasa de interacción con la quinasa MAP humana (Mnk) 2a (SEC ID nº 1; número de acceso Genbank AF237775, idéntico al número de acceso GenBank XM_030637).

Figura 3E. Secuencia de aminoácidos de la quinasa de interacción con la quinasa MAP humana (Mnk2) 2a (SEC ID nº 2; nº de acceso GenBank AF237775, idéntico al nº de acceso GenBank XM_030637).

Figura 3F. Secuencia de ácidos nucleicos de la quinasa de interacción con la quinasa MAP humana (Mnk) 2b (SEC ID nº 3; nº de acceso GenBank AF237776 ó NM_017572).

Figura 3G. Secuencia de aminoácidos de la quinasa de interacción con la quinasa MAP humana (Mnk) 2b (SEC ID nº 4; nº de acceso Genbank AF237776 ó NM_017572).

Figura 3H. Secuencia de ácidos nucleicos de la quinasa de interacción con la quinasa MAP humana (Mnk) 1 (SEC ID nº 5; nº de acceso GenBank AB000409 ó NM_003684 ó XM_001600).

Figura 3I. Secuencia de aminoácidos de la quinasa de interacción con la quinasa MAP humana (Mnk) 1 (SEC ID nº 6; nº de acceso GenBank AB000409 ó NM_003684 ó XM_001600). La figura 4 muestra el fenotipo de los ojos inducido por la sobreexpresión de una proteína desacoplante (dUCPy) que se utilizó para descubrir factores que modulan la actividad de la proteína desacoplante. En la mosca mostrada en la parte izquierda del dibujo, dUCPy se expresa a niveles normales. En la mosca mostrada en la parte derecha de la fotografía se sobreexpresa dUCPy, y el ojo se encuentra reducido.

La figura 5 muestra la expresión del gen Mnk2.

La figura 5A muestra el análisis de PCR en tiempo real de Mnk2 en tejidos de ratón de tipo salvaje.

La figura 5B muestra la expresión del gen Mnk2 de ratón en ratones (ob/ob) en ayuno y obesos.

La figura 5C muestra la expresión del gen Mnk2 de ratón en ratones en ayuno y obesos.

La figura 5D muestra la comparación mediada por PCR en tiempo real de la expresión de Mnk2 durante la diferenciación de las células de fibroblasto de mamífero (3T3-L1) de preadipocitos a adipocitos maduros.

La figura 5E muestra la comparación mediada por PCR en tiempo real de la expresión de Mnk2 durante la diferenciación de células de fibroblasto de maífero 3T3-F442A de preadipocitos a adipocitos maduros.

La figura 5F muestra la comparación mediada por PCR en tiempo real de la expresión de Mnk2 durante la diferenciación de las células de fibroblasto TA1 de mamífero de preadipocitos a adipocitos maduros.

La figura 6 muestra la expresión del gen Mnk1 de ratón.

La figura 6A muestra el análisis de PCR en tiempo real de Mnk1 en tejidos de ratón de tipo salvaje.

La figura 6B muestra la comparación mediada por PCR en tiempo real de la expresión de Mnk1 en diferentes modelos de ratón.

La figura 6C muestra la comparación mediada por PCR en tiempo real de la expresión de Mnk1 durante la diferenciación de células de fibroblasto de mamífero 3T3-L1 de preadipocitos a adipocitos maduros.

La figura 6D muestra la comparación mediada por PCR en tiempo real de la expresión de Mnk1 durante la diferenciación de las células de fibroblasto de mamífero 3T3-F442A de preadipocitos a adipocitos maduros.

La figura 6E muestra la comparación mediada por PCR en tiempo real de la expresión de Mnk1 durante la diferenciación de células de fibroblasto TA1 de mamífero de preadipocitos a adipocitos maduros.

La figura 7 muestra las secuencias de UCPy.

La figura 7A muestra la secuencia de ácidos nucleicos codificante de la proteína UCPy de Drosophila (SEC ID nº 7). El marco de lectura abierto se encuentra subrayado. La figura 7B muestra la secuencia de aminoácidos codificante de la proteína UCPy de Drosophila (SEC ID nº 8).

Figura 8: ensayos in vitro para la determinación del almacenamiento, síntesis y transporte de triglicéridos.

La figura 8A muestra la reducción de los niveles celulares de triglicéridos (µg/mg de proteína) en células que sobreexpresan Mnk2 en comparación con células de control. Todas las muestras se analizaron por duplicado (s1: muestra 1, s2: muestra 2). El eje Y muestra los niveles celulares de triglicéridos (µg/mg de proteína) y el eje X muestra los días de diferenciación celular.

La figura 8B muestra la reducción de la síntesis de lípidos estimulada por insulina (dpm/mg de proteína) en células que sobreexpresan Mnk2 en comparación con células e control. Todas las muestras se analizaron por duplicado (s1: muestra 1, s2: muestra 2). CB: citocalasina B, ilustra la síntesis de fondo en 3T3L1, O: representa la línea base o transporte de glucosa no estimulado y por lo tanto la síntesis basal de lípidos en las células, mientras que Ins, insulina, muestra el transporte estimulado de glucosa y la síntesis consecuente de glucosa a lípido en células 3T3L1. El eje Y muestra las desintegraciones por minuto/mg de proteína (dpm/mg de proteína) y el eje X indica las proteínas anteriormente mencionadas.

La figura 8C muestra la reducción en el transporte activo (AT) de los ácidos grasos libres a través de la membrana plasmática de células que sobreexpresan Mnk2 en comparación con las células de control. Todas las muestras se analizaron por duplicado (tal como se ilustra mediante columnas apareadas con sombreado igual). PD: difusión pasiva, ilustra la línea base o el transporte no dependiente de energía de ácidos grasos exógenos a través de la membrana. AT: el transporte activo representa el transporte dependiente de energía de ácidos grasos a través de la membrana. El eje Y muestra las desintegraciones por minuto/mg de proteína (dpm/mg de proteína) y el eje X muestra las proteínas anteriormente indicadas.

La figura 9 muestra la expresión de la Mnk2 humana en diferentes tejidos humanos.

La figura 9A muestra la expresión de Mnk2A y Mnk2B humanas en diferentes tejidos humanos.

La figura 9B muestra la expresión de la Mnk2A humana y la Mnk2B humana durante la diferenciación de los adipocitos.

La figura 10 muestra la expresión ectópica del transgén de Mnk2 de ratón (mMnk2DN) en ratones transgénicos actina-mMnk2DN. Se muestra un análisis Taqman de diferentes tejidos aislados de ratones transgénicos macho actina-mMnk2DN y compañeros de camada de tipo salvaje machos. Los datos se expresan como factor de inducción de ARN respecto al tejido de tipo salvaje (wt) correspondiente. El número en la parte superior de cada columna indica el factor de inducción respecto al tejido wt correspondiente. Se muestra un experimento representativo.

La figura 11 muestra que la expresión ectópica de Mnk2 de ratón (mMnk2DN) en ratones transgénicos actinamMnk2DN conduce al incremento del peso corporal. Se muestran curvas de crecimiento de ratones transgénicos bactina-mMnk2DN macho (gráfico gris oscuro) y compañeros de camada wt macho (gráfico gris claro) con dieta rica en grasas durante un periodo de 10 semanas. Los datos se expresan como peso corporal medio en el tiempo +/- SE. Se muestra un experimento representativo con N=8 y N=10 ratones en cada grupo, respectivamente.

La figura 12 muestra los límites exón/intrón del gen Mnk2 de ratón. Los límites exón/intrón del gen Mnk2 de ratón se ilustran en esta figura. Se indican el número de exón, la posición de los exones en el ADNc (GenBank nº de acceso BC010256) y las longitudes de los intrones. Se muestran las secuencias de los intrones en minúsculas, las secuencias de los exones se muestran en mayúsculas y en negrita.

La figura 13 ilustra la deleción dirigida del gen Mnk2 de ratón mediante recombinación homóloga. La línea superior muestra el locus de tipo salvaje de Mnk2 de ratón, el gráfico en la parte intermedia muestra el vector de direccionamiento, y el gráfico en la parte inferior de la figura ilustra el locus diana. Los exones se muestran como cajas negras. Se indican los sitios de restricción, el sitio de inicio de traducción y el codón de parada. El casete PGK-NEO y el casete TK se muestran como cajas grises. Se sustituyeron 4,4 kb de la región genómica del gen Mnk2 de ratón por un casete PGK NEO. Se indica la región delecionada. Se muestra la sonda flanqueante externa utilizada para el análisis de transferencia southern con una columna negra. Los fragmentos genómicos detectados con esta sonda dentro del ADN digerido con EcoRI se muestran como flechas. Ver los ejemplos para más detalles.

La figura 14 muestra que la Mnk2a purificada puede activarse in vitro con una preparación de las quinasas Erk2 y el mutante de doble punto Mek1 S218D S222E.

Ejemplos. Aquellos que se refieren a Mnk2 son ilustrativos de la invención. Otra materia se proporciona a título informativo únicamente.

Ejemplo 1: medición del contenido de triglicéridos de moscas homocigóticas (figura 1)

Se midió el cambio del contenido de triglicéridos en Drosophila melanogaster que contenía un sistema de expresión especial (elemento EP, Rorth P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(22):12418-22, 1996). Se obtuvieron moscas mutantes a partir de una colección parental de moscas mutantes. Las moscas se criaron bajo condiciones estándares conocidas por el experto en la materia, y durante el curso del experimento, se realizaron alimentaciones adicionales con levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae). Específicamente, se investigaron moscas homocigóticas macho EP(3)3333 y EP(3)3576 en comparación con las moscas de control (figura 1). Para la determinación del contenido de triglicéridos, se incubaron moscas durante 5 minutos a 90ºC en un tampón acuoso utilizando un baño de agua, seguido de la extracción en caliente. Tras otra incubación de 5 minutos a 90ºC y centrifugación suave, se determinó el contenido de triglicéridos del extracto de moscas utilizando el ensayo de triglicéridos de Sigma (INT 336-10 ó -20) mediante la medición de los cambios de densidad óptica según el protocolo del fabricante. A modo de referencia se midió el contenido de proteínas del mismo extracto utilizando el ensayo BIORAD DC de proteínas siguiendo el protocolo del fabricante. Se repitió el ensayo varias veces. Se muestra el nivel medio de triglicéridos de la colección de EP como 100% en la figura 1. Las moscas homocigóticas EP(3)3333 y EP(3)356 mostraban constantemente un contenido de triglicéridos más alto que los controles (aproximadamente 140%). Por lo tanto, el cambio de actividad génica en el locus 86F7 (estimada), en el que el vector EP de las moscas EP(3)3333 y EP(3)3576 es homocigótico y se encuentra viablemente integrado en el locus génico Lk6, es responsable de cambios en el metabolismo de los triglicéridos de almacenamiento energético, representando por lo tanto en ambos casos un modelo de mosca obesa.

Ejemplo 2: identificación del gen de Drosophila responsable del cambio de metabolismo de los triglicéridos de almacenamiento energético (figura 2)

Se aislaron secuencias de ADN genómico que se encontraban localizadas en posición directamente contigua al sitio de integración de los vectores EP (en la presente memoria, EP(3)3333 y EP(3)3576). Utilizando dichas secuencias genómicas aisladas, se cribaron bases de datos públicas como el proyecto genoma de Drosophila de Berkeley (GadFly), confirmando de esta manera el sitio de integración viable homocigótico de los vectores EP(3)3333 y EP(3)3576. La figura 2 muestra la organización molecular de este locus génico. En la figura 2, la secuencia de ADN genómico se encuentra representada en el conjunto como una línea de puntos negra (entre las posiciones 7544500 y 7559500 en el cromosoma 3R) que incluye los sitios de integración de EP(3)3333 y EP(3)3576. Las secuencias de ADN transcrito (etiquetas de secuencia expresada, ESTs) y los exones predichos se muestran como barras en las dos líneas inferiores. Se muestran los exones predichos del gen CG17342 (GadFly, Lk6, homólogos de Mnk) como barras gris oscuro y los intrones se muestran como línea grises delgadas en la parte intermedia de la figura. Utilizando el método del rescate de plásmido, se aislaron las secuencias de ADN genómico que se encontraban directamente localizadas en posición 3' respecto al sitio de integración de EP(3)3333 y EP(3)3576. Utilizando el ADN de rescate de plásmido, se cribaron bases de datos publicas de secuencias de ADN, identificando de esta manera el sitio de integración de EP(3)3333 y EP(3)3576, provocando un incremento del contenido de triglicéridos. Se integró EP(3)333 en la región 5' de una exón 5 prima del gen CG17342 y EP(3)3576 en la región 5' de un exón 5' alternativo. Mnk codifica un gen predicho por los programas de análisis de secuencias GadFly como CG17342. Por lo tanto, la expresión de CG17342 podría encontrarse afectada por la integración viable homocigótica de EP(3)3333 y EP(3)3576, conduciendo a un incremento de los triglicéridos de almacenamiento energético y a un cambio de la actividad de proteína desacoplante.

Ejemplo 3: clonación de un gen de Drosophila melanogaster con homología respecto a las proteínas desacoplantes humanas (UCPs) (figura 7)

Se identificaron secuencias homólogas respecto a los genes UCP2 y UCP3 humanos utilizando el programa públicamente disponible BLAST de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (ver Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997). La búsqueda de homología rindió fragmentos de secuencia de una familia de genes de Drosophila con homología con las UCP. Eran claramente diferentes a las proteínas mitocondriales más próximamente relacionadas (portador oxoglutarato).

Utilizando el fragmento de secuencia de uno de dichos genes (denominado en la presente memoria dUCPy'), se generó una pareja de cebadores de PCR (superior 5'-CTAAACAAACAATTCCAAACATAG (SEC ID nº 9), inferior 5'AAAAGACATAGAAAATACGATAGT (SEC ID nº 10)) y se llevó a cabo una reacción de PCR en ADNc de Drosophila utilizando condiciones estándares de PCR. El producto de amplificación se marcó radioactivamente y se utilizó para cribar una biblioteca de ADNc preparada a partir de moscas Drosophila adultas (Stratagene). Se aisló un clon de ADNc de longitud completa, se secuenció (figura 7) y se utilizó para experimentos adicionales. Se muestra la secuencia de nucleótidos de dUCPy en la figura 7A (SEC ID nº 7); el marco de lectura deducido se muestra en la figura 7B (SEC ID nº 8).

Ejemplo 4: clonación del ADNc de dUCPy en un vector de expresión de Drosophila

Con el fin de someter a ensayo los efectos de la expresión de dUCPy en células de Drosophila, se clonó el ADNc de dUCPy en el vector de expresión pUAST (Brand A. y Perrimon N., Development 118:401-415, 1993) utilizando los sitios de restricción NotI y KpnI. El constructo de expresión resultante se inyectó en la línea germinal de embriones de Drosophila y se generaron cepas de Drosophila con una integración estable del constructo. Debido a que el vector de expresión pUAST resulta activado por el factor de transcripción de levadura Gal4, que normalmente se encuentra ausente de las células de Drosophila, dUCPy todavía no se expresa en estos animales transgénicos. En el caso de que las moscas pUAST-dUCPy se crucen con una segunda cepa de Drosophila que expresa Gal4 de un modo específico de tejido, las moscas descendientes de este apareamiento expresarán dUCPy en el tejido que expresa Gal4.

El cruce de moscas pUAST-dUCPy con una cepa que expresa Gal4 en todas las células del cuerpo (bajo el control del promotor actina) no mostró descendencia viable. Esto implica que la sobreexpresión de dUCPy en todas las células del cuerpo resulta letal. Este resultado es consistente con la premisa de que la sobreexpresión de dUCPy podría conducir a un colapso de la producción energética celular.

La expresión de dUCPy en un órgano no vital tal como el ojo (Gal4 bajo el control del promotor específico del ojo del gen "eyeless") resulta en moscas con ojos visiblemente dañados. Este fenotipo ocular fácilmente visible es la base de un cribado genético para productos génicos que pueden modificar la actividad de la UCP.

Ejemplo 5: cribado de modificador dUCPy (figura 4)

Se combinaron partes de los genomas de la cepa con expresión de Gal4 en el ojo y la cepa que portaba el constructo pUAST-dUCPy en un cromosoma utilizando la recombinación genómica. La cepa de mosca resultante presenta ojos que se encuentran permanentemente dañados por la expresión de dUCPy. Las moscas de esta cepa se cruzaron con moscas de un colección de gran tamaño de cepas mutagenizadas de mosca. En esta colección de mutantes, se integra aleatoriamente un sistema de expresión especial (elemento EP, ver Rorth, supra, 1996) en diferentes loci genómicos. El factor de transcripción de levadura Gal4 puede unirse al elemento EP y activar la transcripción de genes endógenos próximos al sitio de integración del elemento EP. Por lo tanto, la activación de los genes se produce en las mismas células (ojo) que sobreexpresan dUCPy. Debido a que la colección de mutantes contiene varios miles de cepas con diferentes sitios de integración del elemento EP, resulta posible someter a ensayo un gran número de genes para la interacción de su expresión con la actividad de dUCPy. En el caso de que un gen actúe como intensificador de la actividad de UCP, se agravará el defecto del ojo; un supresor mejorará el defecto (ver la figura 4).

Utilizando este cribado se descubrió un gen con actividad intensificadora que se encontró que era la LK6 quinasa en Drosophila.

Ejemplo 6: clonación de Lk6 de Drosophila (figura 3A)

Se clonó ADN genómico contiguo al elemento EP de rescate del defecto ocular mediante PCR inversa y se secuenció. Se utilizó esta secuencia para una búsqueda BLAST en una base de datos pública de genes de Drosophila. Se muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de Drosophila en la figura 3A (denominada dmAAB18789).

Ejemplo 7: identificación de las proteínas homólogas de LK6 de mamífero (figura 3)

Se identificaron las secuencias homólogas de la Lk6 de Drosophila utilizando el programa públicamente disponible BLAST 2.2.3 de la base de datos de proteínas no redundante del National Center for Biotechnology INformation (NCBI) (ver Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).

Por lo tanto, las proteínas homólogas de Mnk y las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de las mismas pueden obtenerse de especies de insecto o de vertebrado, por ejemplo mamíferos o aves. Resultan particularmente preferentes los polipéptidos homólogos y ácidos nucleicos de la Mnk humana, particularmente polipéptidos y ácidos nucleicos codificantes de una proteína Mnk2 humana (nº de acceso de GenBank AF237775 y NM_017572.1; el nº de acceso GenBank AF237775 es idéntico al nº de acceso GenBank anterior XM_030637, que fue retirado a petición de los solicitantes; ver una alineación de secuencias múltiples de Clustal W en la figura 3B) o los ácidos nucleicos codificantes de una proteína Mnk1 humana (nº de acceso GenBank AB000409.1 y NM_003684.2; el nº de acceso GenBank AB000409.1 es idéntico al nº de acceso GenBank anterior XM_001600, que fue retirado a petición del solicitante; ver una alineación de múltiples secuencias de Clustal W en la figura 3C).

La figura 3A muestra la alineación de las proteínas Mnk de diferentes especies, hXP_030637 se refiere a la Mnk2 humana (idéntica al nº de acceso GenBank AF237775), hXP_001600 se refiere a la Mnk1 humana (idéntica al nº de acceso GenBank AB000409.1) y dmAB18789 se refiere a la proteína codificada por el gen de Drosophila con nº de acceso GadFly CG17342.

Se identificaron los polipéptidos homólogos de ratón de la invención como los números de acceso GenBank NP_067437.1 (para la serina/treonina quinasa 2 de interacción con la quinasa MAP homóloga del ratón; Mnk2; para el ADNc nº de acceso GenBank BC010256) y los números de acceso GenBank NP_067436.1 (para la serina/treonina quinasa 1 de interacción con la quinasa MAP homóloga del ratón; Mnk1).

Ejemplo 8: expresión de los polipéptidos en tejidos de mamífero (ratón) (figuras 5 y 6)

Para analizar la expresión de los polipéptidos dados a conocer en la presente invención en tejidos de mamífero, se obtuvieron varias cepas de ratón (preferentemente las cepas de ratón C57BI/6J, C57BI/6 ob/ob y C57BI/KS db/db, que son sistemas modelo estándares en la investigación de la obesidad y la diabetes) de Harlan Winkelmann (33178 Borchen, Alemania) y se mantuvieron bajo temperatura constante (preferentemente 22ºC), 40 por ciento de humedad y un ciclo de luz/oscuridad de preferentemente 14/10 horas. Los ratones fueron alimentados con un pienso estándar (por ejemplo de ssniff Spezialitäten GmbH, número de orden ssniff M-Z V1126-000). Para el experimento de ayuno ("ratones de tipo salvaje en ayuno"), se sometieron a ayuno ratones de tipo salvaje durante 48 horas, aunque se les proporcionó agua ad libitum (ver, por ejemplo, Schnetzler et al., J. Clin. Invest. 92(1):272-80, julio de 1993; Mizuno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(8):3434-8, 16 de abril de 1996). Los animales se sacrificaron a una edad de 6 a 8 semanas. Se aislaron los tejidos animales según procedimientos estándares conocidos por el experto en la materia, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta su utilización.

Para analizar el papel de las proteínas dadas a conocer en la presente invención en la diferenciación in vitro de diferentes células en cultivo de mamífero para la conversión de preadipocitos en adipocitos, se obtuvieron células fibroblásticas de mamífero (3T3-L1) (por ejemplo Green y Kehinde, Cell 1:113-116, 1974) de la American Tissue Culture Collection (ATCC, Hanassas, VA, USA, ATCC nº CL-173). Se mantuvieron las células 3T3-L1 como fibroblastos y se diferenciaron en adipocitos tal como se encuentra descrito en la técnica anterior (por ejemplo Qiu et al., J. Biol. Chem. 276:11988-95, 2001; Slieker et al., BBRC 251:225-9, 1998). Brevemente, se sembraron células en DMEM/FCS al 10% (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) a razón de 50.000 células/pocillo por duplicado en placas de plástico de 6 pocillos y se cultivaron en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37ºC. Al alcanzar la confluencia (el denominado día 0: d0), las células se transfirieron a medio sin suero (SF) que contenía DMEM/HamF12 (3:1, Invitrogen), fetuína (300 µg/ml; Sigma, Munich, Alemania), transferrina (2 µg/ml; Sigma), pantotenato (17 µM; Sigma), biotina (1 µM; Sigma) y EGF (0,8 nM; Hoffmann-La Roche, Basel, Suiza). Se indujo la diferenciación mediante la adición de dexametasona (DEX, 1 µM; Sigma), 3-metil-isobutil-1-metilxantina (MIX, 0,5 mM; Sigma) e insulina bovina (5 µg/ml; Invitrogen). Cuatro días después de la confluencia (d4) se mantuvieron las células en medio SF que contenía insulina bovina (5 µg/ml) hasta completarse la diferenciación. En diversos puntos temporales del procedimiento de diferenciación, empezando el día 0 (día de la confluencia) y el día 2 (adición de hormona; por ejemplo dexametasona y 3-isobutil-1-metilxantina), hasta los 10 días de diferenciación, se extrajeron alícuotas adecuadas de células cada dos días.

Alternativamente, se obtuvieron células fibroblásticas de mamífero 3T3-F442A (por ejemplo Green y Kehinde, Cell 7:105-113, 1976) del Harvard Medical School, Department of Cell Biology (Boston, MA, USA). Se mantuvieron las células 3T3-F442A como fibroblastos y se diferenciaron en adipocitos tal como se ha descrito anteriormente (Djian

P. et al., J. Cell. Physiol. 124:554-556, 1985). En diversos puntos temporales del procedimiento de diferenciación, empezando el día 0 (día de la confluencia y adición de hormona, por ejemplo insulina) hasta los 10 días de diferenciación, se extrajeron alícuotas adecuadas de células cada dos días. Las células 3T3-F442A se diferenciaban in vitro ya en la etapa de confluencia tras la adición de hormona (insulina).

Se llevó a cabo el análisis Taqman de las proteínas de la invención (figuras 5 y 6). Se aisló el ARN de tejidos de ratón o de células en cultivo, utilizando reactivo Trizol (por ejemplo de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se purificó adicionalmente con el kit RNeasy (por ejemplo de Qiagen, Alemania) en combinación con un tratamiento de ADNasa siguiendo las instrucciones de los fabricantes y tal como es conocido por el experto en la materia. Se transcribió inversamente el ARN total (preferentemente utilizando la transcriptasa inversa ARNasa H Superscript II, de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se sometió a análisis Taqman preferentemente utilizando 2x de la mezcla maestra de PCR Taqman (de Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania; la mezcla contiene, según el fabricante, por ejemplo ADN polimerasa AmpliTaq Gold, AmpErasa UNG, dNTPs con dUTP, Rox de referencia pasiva y componentes tamponadores optimizados) en un sistema de detección de secuencias GeneAmp 5700 (de Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania).

Para el análisis de la expresión de Mnk2 o de Mnk1, se llevó a cabo el análisis Taqman utilizando las parejas de cebador/sonda siguientes:

cebador directo de Mnk1 de ratón (SEC ID nº 11): 5'-GCT GAG GGC CTC TGC TCC-3'; cebador inverso de Mnk1 de ratón (SEC ID nº 12): 5'-TCG CCT TCG AGC CAG G-3'; sonda Taqman de Mnk1 de ratón (SEC ID nº 13) (5/6-FAM) TGA AGC TGT CCC CTC CAT CCA AAT CTC (5/6TAMRA) cebador directo de Mnk2 Taqman-1856F (SEC ID nº 14): 5'-TGCACTTGATTGACCCCGA-3' cebador inverso de Mnk2 Taqman-1923R (SEC ID nº 15): 5'-TTTCTGATTGTCAACCCTCCAA-3' sonda Taqman de Mnk2 Taqman-1877T (SEC ID nº 16): (5/6-FAM)-CCCCATCATCCACCTGCAGTGTCC-(5/6TAMRA).

El análisis Taqman reveló que Mnk2 era el homólogo más interesante del gen Lk6 de mosca. Se muestran los resultados en las figuras 5 y 6. En comparación con Mnk1, que se expresa ubicuamente, Mnk2 mostraba su nivel de expresión máximo en los tejidos adiposos marrón y blanco (figuras 5A y 6A, respectivamente). La expresión de Mnk2 en tejido adiposo blanco se encontraba bajo control metabólico: en ratones bajo ayuno, así como obesos (ob/ob), la expresión se redujo en aproximadamente 40% de los niveles de tipo salvaje (figura 5C, ver también la figura 5B). Además, la expresión de Mnk2 resultó fuertemente inducida durante la diferenciación in vitro de 3T3-L1 (figura 5D), así como de dos sistemas modelo adicionales para la diferenciación in vitro de preadipocitos en adipocitos, las líneas celulares 3T3-F442A y TA1 (figuras 5E y 5F, respectivamente). Por el contrario, los niveles relativos de expresión de Mnk1 no cambiaron durante la diferenciación de dichas líneas celulares (figuras 6D y 6E, respectivamente).

Ejemplo 9: expresión de los polipéptidos en tejidos de mamífero (ser humano) (figura 9)

Se diferenciaron adipocitos primarios humanos en adipocitos maduros tal como se describe en Hauner et al., J. Clin. Invest. 84(5):1663-70, 1989. Brevemente, se cultivaron células en DMEM/mezcla nutritiva F12, PenStrep al 1%, biotina 17 µM, pantotenato 33 µM, suero de feto bovino no inactivado por calor al 10%. El día 0 de la diferenciación se cambió el medio a DMEM/mezcla de nutrientes F12, Pen/Strep al 1%, biotina 17 µM, pantotenato 33 µM, transferrina 0,01 mg/ml, hidrocortisona, insulina humana 20 nM, T3 0,2 nM, dexametasona 25 nM, IBMX 250 µM, rosiglitazona 3 µM. El día 4 de la diferenciación se cambió el medio a DMEM/mezcla de nutrientes F12, Pen/Strep al 1%, biotina 17 µM, pantotenato 33 µM, transferrina 0,01 mg/ml, hidrocortisona 100 nM, insulina humana 20 nM, T3 0,2 nM. En diversos puntos temporales del procedimiento de diferenciación, desde el día 0 (día de la confluencia) y el día 4 (adición de hormona) hasta los 14 días de diferenciación, se extrajeron alícuotas adecuadas de células cada dos días. Se aisló el ANR de células de un cultivo humano utilizando reactivo Trizol (por ejemplo de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se purificaron adicionalmente con el kit RNeasy (por ejemplo de Qiagen, Alemania) en combinación con un tratamiento de ADNasa siguiendo las instrucciones de los fabricantes y tal como es conocido por el experto en la materia.

Además del ARN aislado de adipocitos humanos en diferentes etapas de la diferenciación, se obtuvieron ARNs aislados de diferentes tejidos humanos, de Invitrogen Corp., Karlsruhe, Alemania: (i) ARN total de músculo esquelético adulto humano (Invitrogen Corp., número de catálogo 735030), (ii) ARN total de pulmón adulto humano (Invitrogen Corp., nº de catálogo 735020), (iii) ARN total de hígado adulto humano (Invitrogen Corp., nº de catálogo 735018), (iv) ARN total de placenta adulta humana (Invitrogen Corp., nº de catálogo 64101-1), (v) ARN total de testículo adulto humano (Invitrogen Corp., nº de catálogo 64101-1), (vi) ARN toatl de tejido adiposo normal humano (Invitrogen Corp., nº de catálogo D6005-01), (vii) ARN total de páncreas normal humano (Invitrogen Corp., nº de catálogo DG6101), (viii) ARN total de cerebro normal humano (Invitrogen Corp., nº de catálogo D6030-01). El ARN se trató con ADNasa siguiendo las instrucciones de los fabricantes (por ejemplo de Qiagen, Alemania) y tal como es conocido por el experto en la materia.

Se transcribió inversamente el ARN total (preferentemente utilizando transcriptasa inversa ARNasa H Superscript II, de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se sometió a análisis Taqman preferentemente utilizando 2x de mezcla maestra de PCR Taqman (página 66, línea 31; Weiterstadt, Alemania; ver el Ejemplo 8).

El análisis Taqman se llevó a cabo preferentemente utilizando las parejas de cebador/sonda siguientes:

Para la amplificación de la Mnk2a humana:

cebador directo de Mnk2a humana (SEC ID nº 17): 5'-cca tct ccc cct ctg tac ata gg-3'; cebador inverso de Mnk2a humana (SEC ID nº 18): 5'- ccg gct ggc gat agc tta a -3'; sonda Taqman ( SEC ID nº 19): (5/6-FAM) cac ccg tcc ccc aat caa atc taa agg (5/6-TAMRA).

Para la amplificación de la Mnk2b humana:

cebador directo de Mnk2b humana (SEC ID nº 20): 5'- TTA CTG TGA ATG AGT GAA GAT CCT GG -3'; cebador inverso de Mnk2b humana (SEC ID nº 21): 5'- ATG GCC GTT CAC CGT CC -3'; sonda Taqman (SEC ID nº 22): (5/6-FAM) CCA GGC CAG CTC CCA TCG CTG (5/6-TAMRA)

Tal como se muestra en la figura 9A, el análisis de PCR en tiempo real (Taqman) de la expresión de la proteína Mnk2a y Mnk2b en tejidos humanos reveló que ambas proteínas se expresaban en todos los tejidos analizados a niveles elevados de expresión en tejido adiposo, músculo, pulmón, testículo y placenta.

Los niveles relativos de expresión de ambas variantes de procesamiento de la Mnk2 humana eran iguales para todos los tejidos analizados. Ambas mostraban niveles de expresión máximos en tejidos relevantes para los trastornos metabólicos, es decir, el tejido adiposo y el tejido muscular.

Tal como se muestra en la figura 9B, tanto Mnk2a como Mnk2b se encuentran regulados positivamente durante la diferenciación de los adipocitos humanos. Esto sugiere una función de ambas proteínas en el metabolismo de los adipocitos maduros.

Ejemplo 10: ensayos para la determinación del almacenamiento, síntesis y transporte de los triglicéridos (figura 8)

Infección retrovírica de los preadipocitos

Se transfectaron células de empaquetamiento con plásmidos retrovíricos pLPCX que portaban el transgén de Mnk2 de ratón y un marcador de selección, utilizando el procedimiento del fosfato cálcico. Se infectaron células de control con pLPCX que no portaban transgén. Brevemente, se sembraron a una densidad de 350.000 células por cada 6 pocillos células de empaquetamiento en crecimiento exponencial en 2 ml de DMEM + FCS al 10% un día antes de la transfección. Diez minutos antes de la transfección, se añadió cloroquina directamente al medio suprayacente (concentración final: 25 µM). Se prepararon 250 µl de mezcla de transfección que consistía de 5 µg de ADN de plásmido (virus candidato:ayudante en una proporción 1:1) y CaCl2 250 mM en un tubo de plástico de 15 ml. Se añadió el mismo volumen de 2 x HBS (NaCl 280 µM, HEPES 50 µM, Na2HPO4 1,5 mM, pH 7,06) y se inyectaron burbujas de aire en la mezcla durante 15 segundos. Se añadió la mezcla de transfección gota a gota en las células de empaquetamiento, se distribuyó y se incubaron las células a 37ºC, 5% de CO2, durante 6 horas. Se lavaron las células con PBS y se intercambió el medio por 2 ml de DMEM + CS al 10% por cada 6 pocillos. Un día después de la transfección, las células se lavaron nuevamente y se incubaron durante 2 días de recolección de virus en 1 ml de DMEM + CS al 10% por cada 6 pocillos a 32ºC, 5% de CO2. A continuación, se filtró el sobrenadante a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 µm y se añadió polibreno (concentración final: 8 µg/ml). Se recubrieron las células fibroblásticas de mamífero (3T3-L1) en un estado subconfluyente con el medio preparado que contenía el virus. Las células infectadas se seleccionaron durante 1 semana con 2 µg/ml de puromicina. Tras la selección, se comprobó la expresión del transgén en las células mediante transferencia western e inmunofluorescencia. Las células sobreexpresantes se sembraron para la diferenciación.

Las células 3T3-L1 se mantuvieron como fibroblastos y se diferenciaron en adipocitos tal como se ha descrito en la técnica anterior y en el Ejemplo 8. Para analizar el papel de las proteínas dado a conocer en la presente invención, se llevaron a cabo ensayos in vitro para la determinación del almacenamiento, síntesis y transporte de los triglicéridos.

Preparación de lisados celulares para el análisis de metabolitos

Partiendo del tiempo de confluencia (D0), se cambió el medio celular cada 48 horas. Se recolectaron células y medio cada 8 horas antes del cambio del medio, de la manera siguiente. Se recolectó el medio, se lavaron las células dos veces en PBS antes del lisado en 600 µl de tampón HB (polioxietilén-10-trideciletán al 0,5%, EDTA 1 mM, NaH2PO4 0,01 M, pH 7,4). Tras la inactivación a 70ºC durante 5 minutos, se prepararon los lisados celulares en Lysing matrix B, de Bio 101 Systems (perlas de sílice de 0,1 mm, Q-Biogene, Carlsbad, USA) mediante agitación durante 2 x 45 segundos a una velocidad de 4,5 (Fastprep FP120, Bio101 Thermosavant, Holbrock, USA). Se recogieron los sobrenadantes de las células lisadas tras la centrifugación a 3.000 rpm durante 2 minutos y se almacenaron en alícuotas para el análisis posterior a -80ºC.

Cambios en los niveles celulares de triglicéridos durante la adipogénesis (figura 8A). Los lisados y medio celulares se analizaron simultáneamente en placas de 96 pocillos para el contenido de proteínas totales y de triglicéridos utilizando el reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad DC (Bio-Rad, Munich, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante y un kit enzimático modificado para triglicéridos (GPO-Trinder, Sigma). Brevemente, se ajustaron los volúmenes finales de los reactivos al formato de 96 pocillos de la manera siguiente: se incubaron 10 µl de muestra con 200 µl de reactivo A durante 5 minutos a 37ºC. Tras la determinación del glicerol (absorbancia inicial a 540 nm), se añadieron 50 µl de reactivo B, seguido de otra incubación durante 5 minutos a 37ºC (absorbancia final a 540 nm). Se calcularon las concentraciones de glicerol y triglicéridos utilizando un juego de estándares de glicerol (Sigma) para la curva estándar incluida en cada ensayo.

Tal como se muestra en la figura 8A, los presentes inventores encontraron que en células sobreexpresantes de Mnk2, los niveles celulares de triglicéridos eran significativamente inferiores entre los días 4 y 12 de adipogénesis en comparación con los presentes en células de control (figura 8A). Estos resultados indican que Mnk2 presenta como diana rutas o enzimas reguladores implicados en el metabolismo de los lípidos, que se analizaron en mayor detalle en los ensayos de síntesis de lípidos y transporte de FFA descritos posteriormente.

Síntesis de lípidos durante la adipogénesis (figura 8B)

Durante la etapa terminal de la adipogénesis (día 12), se analizaron las células para su capacidad de metabolizar los lípidos. Se estableció un protocolo modificado basado en el método de Jensen et al., JBC 275:40148, 2000, para la síntesis de lípidos. Se lavaron las células 3 veces con PBS antes de someterlas a ayuno de suero en tampón KrebsRinger-bicarbonato-Hepes (KRBH, NaCl 134 nM, KCl 3,5 mM, KH2PO4 1,2 mM, MgSO4 0,5 mM, CaCl2 1,5 mM, NaHCO3 5 mM, Hepes 10 mM, pH 7,4) suplementado con FCS al 0,1% durante 2,5 horas a 37ºC. Para la síntesis de lípidos estimulada por insulina, las células se incubaron con insulina bovina 1 µM (Sigma; portador: HCl 0,005 N) durante 45 minutos a 37ºC. Se determinó la síntesis basal de lípidos con portador solo. Se añadió D-glucosa-14C(U) (NEN Life Sciences) con una actividad final de 1 µCi/pocillo/ml en presencia de glucosa 5 mM durante 30 minutos a 37ºC. Para el cálculo de la radioactividad de fondo, se utilizó citocalasina B 25 µM (Sigma). Todos los ensayos se llevaron a cabo en pocillos por duplicado. Para terminar la reacción, las células se lavaron 3 veces con PBS helado y se lisaron en 1 ml de NaOH 0,1 N. Se evaluó la concentración de proteínas en cada pocillo utilizando el método de Biuret estándar (reactivo de ensayo de proteínas, Bio-Rad). Se separaron los lípidos totales de la fase acuosa tras la extracción durante la noche en cóctel de centelleo Insta-Fluor (Packard Bioscience), seguido del contaje de centelleo.

Los resultados de los presentes inventores demuestran claramente que las células sobreexpresantes de Mnk2 resultan menos efectivas en la síntesis de lípidos a partir de glucosa exógena. En consecuencia, los niveles de síntesis de lípidos estimulada por insulina eran significativamente inferiores el día 12 de adipogénesis que en las células de control (figura 8B). Por lo tanto, los niveles más bajos de lípidos observados en los experimentos anteriormente indicados resultan probablemente de una tasa sintética de lípidos más baja y no son el resultado de una renovación incrementada de las reservas de lípidos.

Transporte y metabolismo de los ácidos grasos libres a través de la membrana plasmática durante la adipogénesis (figura 8C)

Durante la etapa terminal de la adipogénesis (d12), se analizaron las células para su capacidad de transportar ácidos grasos de cadena larga a través de la membrana plasmática. Se estableció un protocolo modificado basado en el método de Abumrad et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6008-12, 1991) para el transporte celular de los ácidos grasos. En resumen, se lavaron las células 3 veces con PBS previamente al ayuno de suero. A continuación, se realizó una incubación en tampón KRBH suplementado con FCS al 0,1% durante 2,5 horas a 37ºC. Se inició la incorporación de ácidos grasos libres exógenos mediante la adición de medio isotópico que contenía oleato no radioactivo y (3H)-oleato (NEN Life Sciences) acomplejado con albúmina sérica con una actividad final de 1 µCi/pocillo/ml en presencia de glucosa 5 mM durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT). Para el cálculo de la difusión pasiva (PD) en ausencia de transporte activo (AT) a través de la membrana plasmática se añadieron 20 mM de floretina en medio sin glucosa (Sigma) durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT). Todos los ensayos se llevaron a cabo en pocillos por duplicado. Para terminar el transporte activo se añadieron 20 mM de floretina en medio sin glucosa a las células. Las células se lisaron en 1 ml de NaOH 0,1 N y se evaluó la concentración de proteínas en cada pocillo utilizando el método de Biuret estándar (reactivo de ensayo de proteínas, Bio-Rad). Se separaron los ácidos grasos esterificados de los ácidos grasos libres utilizando la extracción durante la noche en cóctel de centello Insta-Fluor (Packard Bioscience) seguido del contaje de centelleo.

Los presentes inventores encontraron que el transporte de ácidos grasos exógenos a través de la membrana plasmática de células sobreexpresantes de Mnk2 y por lo tanto la esterificación de estos metabolitos, era considerablemente inferior el día 12 de la adipogénesis en comparación con las células de control (figura 8C). Conjuntamente, la sobreexpresión de Mnk2 demuestra un efecto sobre el metabolismo de los triglicéridos en los tres ensayos realizados en células 3T3-L1, convirtiéndolo en una diana farmacológica potencialmente interesante para el tratamiento de trastornos metabólicos.

Ejemplo 11: generación y análisis de los animales transgénicos para Mnk2 (β-actina-mMnk2DN)

Generación de los animales transgénicos

Se aisló ADNc de Mnk2 de ratón a partir de tejido adiposo marrón de ratón (BAT) utilizando protocolos estándares conocidos por el experto en la materia. Se amplificó el ADNc mediante RT-PCR utilizando la pareja de cebadores siguiente:

cebador directo de Mnk2 (SEC ID nº 23): 5' AAG TTG GCC TTC GCG TTA GAC 3'

cebador inverso de Mnk2 (SEC ID nº 24): 5' CGA TAT GTA CAA GGA GCT AG 3'.

El ADNc de Mnk2 resultante se clonó en pBluescript KS+ (Stratagene) siguiendo protocolos estándares, resultando en un plásmido denominado pK2 +-mMnk2'. Se mutó el ADNc de pKS+-mMnk2c utilizando la mutagénesis sitio-dirigida (Stratagene) siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilizando el oligo superior de Mnk2 (SEC ID nº 25): 5' CTC CCC CAT CTC CGC ACC AGA GCT GCT CGC CCC GTG TGG GTC AG 3' y el oligo inferior de Mnk2 (SEC ID nº 26): 5' CTG ACC CAC ACG GGG CGA GCT CTG GTG CGG AGA TGG GGG AG 3', se introdujeron dos mutaciones puntuales en el ADNc, resultando en intercambios de aminoácidos en las posiciones T197 y T202 a A197 y A202 del ADNc de Mnk2.

El ADNc mutante resultante (denominado mMnk2DN) se clonó en el sitio de clonación EcoRV del vector de expresión transgénica pTG-β-actina-X-hgh-bgh-poliA. Se microinyectó el transgén β-actina-Mnk2DN en el pronúcleo macho de embriones de ratón fertilizados (preferentemente de la cepa C57/BL6/CBA F1 (Harlan Winkelmann). Los embriones inyectados se transfirieron a ratones nodriza pseudogestantes. Se detectaron los fundadores transgénicos mediante análisis de PCR utilizando el cebador directo (SEC ID nº 27): 5' GCT GCT GGT CCG AGA TGC C 3' y el cebador inverso (SEC ID nº 28): 5' GGG TCA TGC GCG ATC CCC 3'. Se establecieron dos líneas independientes de ratón transgénico que contenían el constructo β-actina-Mnk2DN y se mantuvieron en un fondo de C57/BL6. Brevemente, se retrocruzaron los animales fundadores con ratones C57/BL6 para generar ratones F1 para el análisis. Los ratones transgénicos se cruzaron continuamente con el fondo de C57/BL6.

Expresión del constructo en diferentes tejidos de ratón (figura 10) Utilizando técnicas estándares, se verificó la expresión del transgén β-actina-Mnk2DN mediante análisis Taqman utilizando el cebador directo (SEC ID nº 29): 5' CAG CGT GGT AGT ACA GGA CGT G 3', el cebador inverso (SEC ID nº 30): 5' TCC CTG TGG GCG ATG C 3' y el cebador (SEC ID nº 31): 5' CAG TGC CCT GGA CTT CCT GCA TAA CAA 3'. El análisis Taqman se llevó a cabo utilizando un panel representativo de tejidos de ratón.

Se observó la expresión del transgén bactina-Mnk2DN en los tejidos siguientes: WAT, músculo, hígado, riñón, timo, corazón, pulmón y bazo. Los niveles de expresión del transgén se encontraban 2,8 a 16,9 veces incrementados respecto a la expresión de Mnk2 en ratones de tipo salvaje, dependiendo del tejido analizado. No se detectó expresión del transgén de Mnk2 en tejido BAT (ver la figura 10).

Análisis del peso corporal de los ratones transgénicos (figura 11) Tras el destete, se sometieron ratones macho transgénicos β-actina-mMnk2DN y sus compañeros de camada de tipo salvaje (wt) en grupos de 4 a 5 animales (N=4 a N=5) a dieta de control (preferentemente Altromin C1057 mod control, dieta de grasa cruda o rica en grasas 4,5% (preferentemente Altromin C1057mod. rica en grasas, 23,5% grasa cruda). Se midió el peso corporal total de los animales cada semana durante un periodo de 12 a 16 semanas.

En cada dieta, se incrementó claramente el peso corporal medio de los ratones transgénicos β-actina-mMnk2DN en comparación con sus compañeros de camada de tipo salvaje en la dieta respectiva. En primer lugar se observaron diferencias significativas de peso corporal medio aproximadamente al final de la semana postnatal 4 con ambas dietas. Tras 10 semanas de dieta rica en grasas, el peso corporal medio de los ratones transgénicos β-actinamMnk2DN en comparación con sus compañeros de camada wt se incrementó en 8,8 g (=incremento de 23% en peso corporal medio respecto a los compañeros de camada wt) (figura 11). Se observaron diferencias similares en el peso corporal medio en ratones wt y transgénicos β-actina-mMnk2DN bajo dieta de control (datos no mostrados). De esta manera, los resultados de los presentes inventores demuestran claramente que la expresión ectópica del transgén mMnk2DN conduce a un incremento del peso corporal. El efecto aparece independientemente de la dieta proporcionada, tal como puede observarse con la dieta de control, así como con la dieta rica en grasas.

Ejemplo 11: generación y análisis de ratones mMnk2 -/- (figuras 12 y 13)

Se amplificó una sonda de 605 pares de bases de ADNc de mMnk2 (nº de acceso GenBank BC010256, posiciones 61 a 665) a partir de ADNc de tejido adiposo blanco (WAT) de ratón mediante PCR utilizando el cebador directo (SEC ID nº 32): 5' ACA TCA GCC CAC AGT GTG A 3' y el cebador inverso (SEC ID nº 33): 5' TCT CCA TTG AGT TTG ATA CCA 3'. Se utilizó esta sonda para cribar una biblioteca fágica genómica 129SVJ (obtenida de Stratagene). Se aislaron tres clones independientes y se subclonaron en el sitio NotI de pBluescript KS+ (Stratagene). Se utilizaron estos clones genómicos para el mapeo de restricción y se secuenciaron para caracterizar el locus genómico de la Mnk2 de ratón (figura 12). Se insertó un casete PGK-neomicina en el locus de la Mnk2 de ratón sustituyendo 4,4 kb de ADN genómico, delecionando de esta manera la región codificante completa de mMnk2. Brevemente, se clonó un fragmento SpeI-NotI de 8 kb en el sitio XbaI de pBluescript KS+ cadena arriba del casete PGK-neomicina, que se insertó en el sitio SmaI de pBluescript. Se amplificó un fragmento genómico de 1 kb mediante PCR utilizando la pareja de cebadores siguiente (los nucleótidos no cebadores/sitios de restricción asociados se muestran en minúscula): cebador directo de Mnk2-SA (SEC ID nº 34): EcoRI 5' cgg aat CCA CTA GCT CCT TGT ACA TAT 3'; cebador inverso de Mnk2-SA (SEC ID nº 35): ClaI 5' cca tcg atG GAA CTC GTA TTG CAT AGT AG 3'. El fragmento resultante se insertó en el sitio EcoRI/ClaI de pBluescript KS+. A modo de marcador de selección negativa se clonó un casete timidina quinasa en el sitio ClaI/XhoI del constructo de direccionamiento (figura 13). Se linearizó el constructo mediante digestión con NotI y se electroporó en células madre embrionarias (ES) de ratón. Se seleccionaron clones celulares ES mediante tratamiento con G418 y ganciclovir (preferentemente 350 µg de G418/ml y 2 µg de ganciclovir). De 600 colonias resistentes a neomicina, se identificaron mediante PCR dos clones de células ES de recombinación homóloga independientes. Se confirmaron los resultados mediante análisis de transferencia southern con ADN genómico digerido con EcoRI utilizando una sonda 3'-flanqueante (posiciones 2495-3065 del ADNc de mMnk2). Se confirmó un único suceso de integración mediante análisis de transferencia southern de ADN digerido con BamHI con una sonda de neomicina. Se agregaron las clones de células ES con embriones en el estadio de 8 células procedentes de ratones NMRI y se transfirieron los blastocitos en desarrollo a ratones pseudogestantes para generar quimeras. Las quimeras se cruzaron con ratones C57/BL6 y se genotipó la descendencia mediante PCR utilizando los cebadores siguientes: cebador Mnk2-ES (SEC ID nº 36): 5' AGA CTA GGG AGG AGG GTG GAG GA 3'; cebador Mnk2-KO (SEC ID nº 37): 5' GGT GGA TGT GGA ATG TGT GCG A 3'; cebador Mnk2-WT (SEC ID nº 38): 5' GGG GTG TAG GGG TCT GTT AGG 3'. Se utilizaron ratones heterocigóticos para cruces mutuos adicionales y se analizaron.

Ejemplo 11: cribado de moléculas de pequeño tamaño

Los compuestos que resultan adecuados para la profilaxis, tratamiento o diagnostico de trastornos metabólicos relacionados con la Mnk pueden identificarse mediante un ensayo de quinasa, un ensayo de unión o cualquier otro ensayo adecuado para medir una función asociada al polipéptido Mnk, un fragmento de polipéptido Mnk o un derivado del mismo. Este ensayo de quinasa puede basarse en la Mnk2 humana recombinante (Mnk2a o Mnk2b) o la proteína Mnk1 y un péptido marcado que comprende la secuencia diana eIF4E, una secuencia diana eIF4E recombinante marcada o una proteína eIF4E recombinante marcada como sustrato. El ensayo puede ser un ensayo de quinasa radioactiva o un ensayo basado en la utilización de un anticuerpo anti-fosfoserina que sea capaz de reconocer la fosforilación de eIF4E en Ser209.

Por ejemplo, las quinasas Mnk2a (nº de acceso Genbank AF237775; ver también las figuras 3D y 3E), Erk2 (nº de acceso GenBank M84489) y un doble mutante puntual de Mek1 (nº de acceso GenBank Q02750) que contiene las sustituciones de aminoácidos Ser218Asp y Ser222Glu (S218D S222E) se expresaron en E. coli y después se purificaron utilizando métodos conocidos por el experto en la materia. Preferentemente, en una reacción de quinasa de 50 µl se incubaron 2,0 µM de Mnk2a con 200 nM de Erk2 más 20 nM de Mek1 S218D S222E (carriles marcados 1 a 4 en la figura 14) o con 50 nM de Erk2 más 2,5 nM de Mek1 S218D S222E (carriles marcados 5 a 8 en la figura 14) en presencia de ATP 1,0 mM, Hepes 50 mM/KOH, cloruro de magnesio 5 mM y DTT 0,5 mM a 30ºC. En los puntos temporales indicados (0, 10, 20 y 40 minutos; ver la figura 14), se extrajeron muestras de la reacción, se diluyeron en tampón para muestras SDS que contenía EDTA 50 mM y se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). Las muestras de reacción separadas en SDS-PAGE se transfirieron a nitrocelulosa y se sondearon con un anticuerpo contra un fosfo-epítopo esencial para la activación de Mnk (antifosfo-Mnk Thr197/202; Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA). Se detectó el anticuerpo anti-fosfo-Mnk con un anticuerpo anti-conejo acoplado a peroxidasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tal como se ha descrito (Harlow y Lane, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1998).

A medida que progresaba la reacción, podía visualizarse la activación de Mnk2a a partir de la inmunorreactividad de Mnk con el anticuerpo anti-fosfo-Mnk (ver el panel superior en la figura 14). Además, se visualizó Mnk2a mediante tinción de Coomassie del gel. Las flechas indican la Mnk2a con tinción de Coomassie debido al retardo de su movilidad con la creciente fosforilación (ver el panel inferior de la figura 14).

La generación del fosfo-epítopo, que resulta esencial para la activación de Mnk2a, y el elevado grado de eficiencia de este procedimiento (tal como muestra el desplazamiento prácticamente complejo de la movilidad electroforética) demuestra la idoneidad de este enfoque para producir Mnk2a enzimáticamente activa.

Para la validación del ensayo pueden utilizarse inhibidores conocidos de Mnk tales como CGP57380 ó CGP025088 (ver Knauf et al., Mol. Cell. Biol. 21:5500, 2001; Tschopp et al., Mol. Cell. Biol. Res. Comm. 3:205, 2000, y Slentz-Kesler et al., Genomics 69:63, 2000). A modo de control negativo puede utilizarse CGP052088.

Alternativamente, el cribado puede comprender la utilización de sistemas de cribado basados en células, por ejemplo células procarióticas o eucarióticas que sobreexpresan proteínas Mnk. Además, pueden utilizarse animales transgénicos capaces de sobreexpresar o infraexpresar Mnk2 y/o Mnk1.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Utilización de una molécula de ácidos nucleicos codificante de quinasa 2 de interacción con quinasa MAP (Mnk2), o de un polipéptido Mnk2 codificado en la misma, o de una molécula antisentido, un ribozima o una molécula de ARNi que reconoce específicamente una molécula de ácidos nucleicos de Mnk2, para el diagnóstico de la obesidad utilizando una muestra.

2. 2.

   Utilización de una composición farmacéutica que comprende una molécula antisentido, un ribozima o una molécula de ARNi que reconoce específicamente una molécula de ácidos nucleicos de Mnk2 conjuntamente con portadores, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, para la preparación de un agente destinado al tratamiento de la obesidad.

3. 3.

   Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que la molécula de ácidos nucleicos es un ácido nucleico de Mnk2 de vertebrado o de insecto, particularmetn un ácido nucleico de Mnk2 humana, particularmente un ácido nucleico codificante del gen homólogo de Mnk en el cromosoma humano 19 denominado Mnk2 (nº de acceso GenBank XM_030637, idéntico al nº de acceso GenBank AF237775.1 y/o el número de acceso GenBank NM_017572.1).

4. 4.

   Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la molécula de ácidos nucleicos codificante de Mnk2:

   (a)

   se hibrida a 50ºC en una solución que contiene 1 x SSC y SDS al 0,1% con un ácido nucleico de Mnk2

   o la cadena complementaria del mismo, particularmente una molécula de ácidos nucleicos codificante de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos Mnk2 mostrados en la figura 3E ó 3G,

   (b)

   es degenerado respecto a la molécula de ácidos nucleicos de (a),

   (c)

   codifica un polipéptido Mnk2 que es por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 98%, y hasta 99,6% idéntico a los polipéptidos mostrados en la figura 3E ó 3G,

   (d)

   difiere de la molécula de ácidos nucleicos de (a) a (c) por mutación, y en la que dicha mutación causa una alteración, deleción, duplicación o parada prematura en el polipéptido codificado.

5. 5.

   Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la molécula de ácidos nucleicos es una molécula de ADN, particularmente un ADNc o un ADN genómico.

6. 6.

   Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha molécula de ácidos nucleicos es una molécula de ácidos nucleicos recombinante.

7. 7.

   Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la molécula de ácidos nucleicos es un vector, particularmente un vector de expresión.

8. 8.

   Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el polipéptido es un polipéptido recombinante.

9. 9.

   Utilización según la reivindicación 8, en la que dicho polipéptido recombinante es un polipéptido de fusión.

10. 10.

    Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha molécula de ácidos nucleicos se selecciona de entre sondas de hibridación, cebadores y oligonucleótidos antisentido.

11. 11.

    Utilización de un animal transgénico no humano que muestra una expresión modificada de un polipéptido Mnk2 en estudios funcionales sobre la obesidad o para el cribado de fármacos para la obesidad.

12. 12.

    Utilización según la reivindicación 11, en la que la expresión del polipéptido Mnk2 se encuentra incrementada y/o reducida.

13. 13.

    Utilización de una célula huésped recombinante que muestra una expresión modificada de un polipéptido Mnk2 en estudios funcionales sobre la obesidad o para el cribado de fármacos para la obesidad.

14. 14.

    Utilización según la reivindicación 13, en la que la célula es una célula humana.

15. 15.

    Método para identificar un (poli)péptido implicado en la obesidad en un mamífero, que comprende las etapas de:

    (a)

    poner en contacto una colección de (poli)péptidos con un polipéptido Mnk2 o un fragmento catalítico del mismo bajo condiciones que permiten la unión de dichos (poli)péptidos,

    (b)

    eliminar (poli)péptidos que no se unen, y

    (c)

    identificar (poli)péptidos que se unen a dicho polipéptido Mnk2.

16. 16.

    Método de cribado de un agente que resulta adecuado para el tratamiento de la obesidad en un mamífero mediante la modulación de la interacción del polipéptido mnk2 con una diana/agente de unión, que comprende las etapas de:

    (a)

    incubar una mezcla que comprende: (aa) un polipéptido Mnk2, o un fragmento catalítico del mismo, (ab) una diana/agente de unión de dicho polipéptido Mnk2 o fragmento catalítico del mismo, y (ac) un agente candidato

    bajo condiciones en las que dicho polipéptido Mnk2 se une específicamente a dicha diana/agente de unión con una afinidad de referencia,

    (b)

    detectar la afinidad de unión de dicho polipéptido Mnk2 o fragmento catalítico del mismo a dicha diana de unión con el fin de determinar una afinidad basada en el agente (candidato), y

    (c)

    determinar una diferencia entre la afinidad basada en el agente (candidato) y la afinidad de referencia.

17. 17. Método de cribado de un agente que resulta adecuado para el tratamiento de la obesidad en un mamífero mediante la modulación de la actividad de un polipéptido Mnk2, que comprende las etapas de:

    (a)

    incubar una mezcla que comprende: (aa) un polipéptido Mnk2 o un fragmento catalítico del mismo, (ab) un agente candidato,

    bajo condiciones en las que dicho polipéptido Mnk2 o fragmento catalítico del mismo muestra una actividad de referencia,

    (b)

    detectar la actividad de dicho polipéptido Mnk2 o fragmento catalítico del mismo con el fin de determinar una actividad basada en el agente (candidato), y

    (c)

    determinar una diferencia entre una actividad basada en el agente (candidato) y la actividad de referencia.

18. 18.

    Método según la reivindicación 16 ó 17, en el que el agente candidato se selecciona de entre péptidos y compuestos orgánicos de bajo peso molecular.

19. 19.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que se utiliza un inhibidor o activador de Mnk2 conocido a modo de control positivo para el desarrollo de un ensayo y/o la validación de agentes candidatos.

20. 20.

    Utilización de N3-(4-fluorofenil)-1H-pirazol[3,4-d]pirimidín-3,4-diamina (CGP573809 para la preparación de un agente destinado al tratamiento de la obesidad.

21. 21.

    Utilización de N3-(4-fluorofenil)-1H-pirazol[3,4-d]pirimidín-3,4-diamina (CGP57380) para el diagnóstico de la obesidad utilizando una muestra.