JPH11255648A - 血管新生阻害剤 - Google Patents
血管新生阻害剤Info
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- JPH11255648A JPH11255648A JP11001628A JP162899A JPH11255648A JP H11255648 A JPH11255648 A JP H11255648A JP 11001628 A JP11001628 A JP 11001628A JP 162899 A JP162899 A JP 162899A JP H11255648 A JPH11255648 A JP H11255648A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】環状ジスルフィド誘導体について新たな薬理作
用を見いだす。 【解決手段】一般式[I] 【化１】 ［Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 はＨまたはアルキル、ｍは０ま
たは１、ｎは１または２］の環状ジスルフィド誘導体の
血管新生に対する影響を検討したところ、鶏漿尿膜の血
管新生対し強い血管新生阻害作用を有すること、ラット
Ｎ−エチルカルバミドアデニン誘発網膜血管透過性亢進
モデルに対し強い血管透過性抑制作用を有すること、ま
た、ヒトGlioblastoma細胞からの血管内皮増殖因子の遊
離に対し強い抑制作用を有することを見出した。よっ
て、この環状ジスルフィド誘導体は、血管新生、血管透
過性または血管内皮増殖因子が関与する疾患、特に、糖
尿病性網膜症、黄斑変性症、網膜静脈閉塞症、網膜動脈
閉塞症等の網膜疾患、血管新生緑内障および血管腫等の
腫瘍の治療剤として有用であることが期待される。
用を見いだす。 【解決手段】一般式[I] 【化１】 ［Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 はＨまたはアルキル、ｍは０ま
たは１、ｎは１または２］の環状ジスルフィド誘導体の
血管新生に対する影響を検討したところ、鶏漿尿膜の血
管新生対し強い血管新生阻害作用を有すること、ラット
Ｎ−エチルカルバミドアデニン誘発網膜血管透過性亢進
モデルに対し強い血管透過性抑制作用を有すること、ま
た、ヒトGlioblastoma細胞からの血管内皮増殖因子の遊
離に対し強い抑制作用を有することを見出した。よっ
て、この環状ジスルフィド誘導体は、血管新生、血管透
過性または血管内皮増殖因子が関与する疾患、特に、糖
尿病性網膜症、黄斑変性症、網膜静脈閉塞症、網膜動脈
閉塞症等の網膜疾患、血管新生緑内障および血管腫等の
腫瘍の治療剤として有用であることが期待される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、環状ジスルフィド
誘導体を有効成分とする血管新生阻害剤、血管透過性抑
制剤または血管内皮増殖因子遊離抑制剤に関するもので
あって、網膜疾患等の眼疾患の治療に有用な薬物を提供
するものである。
誘導体を有効成分とする血管新生阻害剤、血管透過性抑
制剤または血管内皮増殖因子遊離抑制剤に関するもので
あって、網膜疾患等の眼疾患の治療に有用な薬物を提供
するものである。
【０００２】
【従来の技術】血管の恒常性は内皮細胞の有する多様な
機能によって保たれている。血管内皮細胞は、１）血液
中の栄養物などの必要な成分を組織へ輸送する仲介を
し、必要以上に多量の成分が通過することを防ぐ作用、
２）血液を凝固させずに円滑に循環させる作用、３）血
管が離断したときに出血を阻止する作用、および４）血
管の緊張を一定に保つ調節作用を有している。
機能によって保たれている。血管内皮細胞は、１）血液
中の栄養物などの必要な成分を組織へ輸送する仲介を
し、必要以上に多量の成分が通過することを防ぐ作用、
２）血液を凝固させずに円滑に循環させる作用、３）血
管が離断したときに出血を阻止する作用、および４）血
管の緊張を一定に保つ調節作用を有している。
【０００３】血管内皮細胞に産生されたプロテアーゼに
よる基底膜の分解、血管内皮細胞の遊走・増殖、血管内
皮細胞の管腔形成、基底膜の形成と周辺細胞の取り囲み
という段階で血管新生が生じる。血管新生は種々の疾
患、特に糖尿病性網膜症、黄斑変性症、網膜静脈閉塞症
や網膜動脈閉塞症等の網膜疾患、血管新生緑内障または
血管腫などの腫瘍と密接なつながりがある。血管新生は
さまざまな増殖因子やサイトカイン、アラキドン酸代謝
物、モノブチリンなどによって引き起こされると考えら
れている。これらの中でも増殖因子はもっとも重要な血
管新生因子と考えられている（医学のあゆみ，170, 536
-539 (1994) ）。
よる基底膜の分解、血管内皮細胞の遊走・増殖、血管内
皮細胞の管腔形成、基底膜の形成と周辺細胞の取り囲み
という段階で血管新生が生じる。血管新生は種々の疾
患、特に糖尿病性網膜症、黄斑変性症、網膜静脈閉塞症
や網膜動脈閉塞症等の網膜疾患、血管新生緑内障または
血管腫などの腫瘍と密接なつながりがある。血管新生は
さまざまな増殖因子やサイトカイン、アラキドン酸代謝
物、モノブチリンなどによって引き起こされると考えら
れている。これらの中でも増殖因子はもっとも重要な血
管新生因子と考えられている（医学のあゆみ，170, 536
-539 (1994) ）。
【０００４】血管新生を引き起こす増殖因子としては、
繊維芽細胞増殖因子、腫瘍増殖因子、血管内皮増殖因子
（以下「ＶＥＧＦ」と言う）などが知られている。その
中でもＶＥＧＦは受容体が血管内皮だけに存在してお
り、血管内皮に選択的に作用することが報告されている
（J. Clin. Invest., 89, 244-253 (1992)）。
繊維芽細胞増殖因子、腫瘍増殖因子、血管内皮増殖因子
（以下「ＶＥＧＦ」と言う）などが知られている。その
中でもＶＥＧＦは受容体が血管内皮だけに存在してお
り、血管内皮に選択的に作用することが報告されている
（J. Clin. Invest., 89, 244-253 (1992)）。
【０００５】網膜血管の内皮細胞は、隣接する細胞と密
着に結合し、血管内の有害物質を網膜内に移行させない
血液網膜柵の構造を有している。しかし、糖尿病など高
血糖状態が持続すると、この血液網膜柵が破綻し、血液
成分が必要以上に血管外に漏出する。この現象を血管透
過性の亢進という。血管透過性が亢進すると網膜に浮
腫、出血、硬性白斑等が生じ、糖尿病性網膜症や黄斑変
性症などの病変が現れる（糖尿病血管合併症の診断と治
療(メディカルレビュー社),17-21(1997)）。また、この
血管透過性はＶＥＧＦなどの因子により亢進されること
が報告されている（臨床眼科，52(8)，1331-1336(199
8））。
着に結合し、血管内の有害物質を網膜内に移行させない
血液網膜柵の構造を有している。しかし、糖尿病など高
血糖状態が持続すると、この血液網膜柵が破綻し、血液
成分が必要以上に血管外に漏出する。この現象を血管透
過性の亢進という。血管透過性が亢進すると網膜に浮
腫、出血、硬性白斑等が生じ、糖尿病性網膜症や黄斑変
性症などの病変が現れる（糖尿病血管合併症の診断と治
療(メディカルレビュー社),17-21(1997)）。また、この
血管透過性はＶＥＧＦなどの因子により亢進されること
が報告されている（臨床眼科，52(8)，1331-1336(199
8））。
【０００６】したがって、血管新生や血管透過性そのも
のを阻害または抑制したり、ＶＥＧＦ等の血管新生を引
き起したり、血管透過性を亢進する因子を阻害または抑
制すれば、糖尿病性網膜症等の血管新生や血管透過性が
関与する疾患を治療するのに非常に有用であることが期
待できる。
のを阻害または抑制したり、ＶＥＧＦ等の血管新生を引
き起したり、血管透過性を亢進する因子を阻害または抑
制すれば、糖尿病性網膜症等の血管新生や血管透過性が
関与する疾患を治療するのに非常に有用であることが期
待できる。
【０００７】一方、本発明の有効成分である環状ジスル
フィド誘導体（一般式[I] ）は、特開平２−１３８２７
１号公報に肝疾患治療または慢性関節リウマチなどの自
己免疫性疾患の治療剤として有用な化合物であることが
開示されている。また、特開平４−２０８２７１号公報
にはインターフェロン産生促進作用剤として開示されて
いる。しかしながら、これら公報には血管新生阻害効
果、血管透過性抑制効果、血管内皮増殖因子遊離抑制効
果または網膜症の治療効果に関する記載はない。
フィド誘導体（一般式[I] ）は、特開平２−１３８２７
１号公報に肝疾患治療または慢性関節リウマチなどの自
己免疫性疾患の治療剤として有用な化合物であることが
開示されている。また、特開平４−２０８２７１号公報
にはインターフェロン産生促進作用剤として開示されて
いる。しかしながら、これら公報には血管新生阻害効
果、血管透過性抑制効果、血管内皮増殖因子遊離抑制効
果または網膜症の治療効果に関する記載はない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】この医薬として有用な
環状ジスルフィド誘導体について、さらに新たな薬理作
用を見出すことは非常に興味のある課題である。
環状ジスルフィド誘導体について、さらに新たな薬理作
用を見出すことは非常に興味のある課題である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者等は環状ジスル
フィド誘導体の新たな薬理作用を見いだすために、血管
新生に対する環状ジスルフィド誘導体の作用、ラットＮ
−エチルカルバミドアデニン（以下、Ｎ−エチルカルバ
ミドアデニンを「ＮＥＣＡ」と言う）誘発網膜血管透過
性亢進モデルに対する環状ジスルフィドの作用、および
ヒトGlioblastoma細胞からの血管内皮増殖因子遊離に対
する環状ジスルフィド誘導体の作用について検討を行っ
た。その結果、環状ジスルフィド誘導体が血管新生阻害
作用、血管透過性抑制作用および血管内皮増殖因子遊離
抑制作用を有しており、血管新生、血管透過性または血
管内皮増殖因子が関与する疾患、特に、糖尿病性網膜
症、黄斑変性症、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症等の
網膜疾患、血管新生緑内障および血管腫等の腫瘍の治療
剤として有用であることを見出した。
フィド誘導体の新たな薬理作用を見いだすために、血管
新生に対する環状ジスルフィド誘導体の作用、ラットＮ
−エチルカルバミドアデニン（以下、Ｎ−エチルカルバ
ミドアデニンを「ＮＥＣＡ」と言う）誘発網膜血管透過
性亢進モデルに対する環状ジスルフィドの作用、および
ヒトGlioblastoma細胞からの血管内皮増殖因子遊離に対
する環状ジスルフィド誘導体の作用について検討を行っ
た。その結果、環状ジスルフィド誘導体が血管新生阻害
作用、血管透過性抑制作用および血管内皮増殖因子遊離
抑制作用を有しており、血管新生、血管透過性または血
管内皮増殖因子が関与する疾患、特に、糖尿病性網膜
症、黄斑変性症、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症等の
網膜疾患、血管新生緑内障および血管腫等の腫瘍の治療
剤として有用であることを見出した。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明は下記一般式[I] で表わさ
れる化合物またはその塩類（以下、本化合物とする）を
有効成分とする血管新生阻害剤、血管透過性抑制剤、血
管内皮増殖因子遊離抑制剤または網膜疾患治療剤を提供
するものである。
れる化合物またはその塩類（以下、本化合物とする）を
有効成分とする血管新生阻害剤、血管透過性抑制剤、血
管内皮増殖因子遊離抑制剤または網膜疾患治療剤を提供
するものである。
【００１１】
【化２】 ［式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 は同一かまたは異なって
水素原子または低級アルキル基を示す。ｍは０または１
を示す。ｎは１または２を示す。］
水素原子または低級アルキル基を示す。ｍは０または１
を示す。ｎは１または２を示す。］
【００１２】上記で規定した基をさらに詳しく説明する
と、低級アルキル基とはメチル、エチル、プロピル、イ
ソプロピル、ヘキシル等の１〜６個の炭素原子を有する
直鎖または分枝のアルキル基を示す。
と、低級アルキル基とはメチル、エチル、プロピル、イ
ソプロピル、ヘキシル等の１〜６個の炭素原子を有する
直鎖または分枝のアルキル基を示す。
【００１３】特に好ましい化合物の具体例として下記式
[II]で示される（４Ｒ）−ヘキサヒドロ−７，７−ジメ
チル−６−オキソ−１，２，５−ジチアゾシン−４−カ
ルボン酸またはその塩類が挙げられる。
[II]で示される（４Ｒ）−ヘキサヒドロ−７，７−ジメ
チル−６−オキソ−１，２，５−ジチアゾシン−４−カ
ルボン酸またはその塩類が挙げられる。
【００１４】
【化３】
【００１５】上記の塩類とは、医薬として許容される塩
類であればよく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、
カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属または
アルカリ土類金属との塩、アンモニウム塩、ジエチルア
ミン塩、トリエタノールアミン塩等の有機アミンとの塩
などが挙げられる。
類であればよく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、
カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属または
アルカリ土類金属との塩、アンモニウム塩、ジエチルア
ミン塩、トリエタノールアミン塩等の有機アミンとの塩
などが挙げられる。
【００１６】本化合物には光学異性体が存在し、また場
合によってはジアステレオ異性体が存在するが、これら
を有効成分とするものも本発明に含まれる。また、本化
合物は溶媒和物、例えば水和物の形態をとっていてもよ
い。
合によってはジアステレオ異性体が存在するが、これら
を有効成分とするものも本発明に含まれる。また、本化
合物は溶媒和物、例えば水和物の形態をとっていてもよ
い。
【００１７】一般式[I] で表わされる環状ジスルフィド
誘導体の有用性を調べるべく、本化合物の血管新生阻害
作用について検討を行った。詳細については後述の薬理
試験の項で示すが、本化合物は、in vivo（生体内）の
血管新生評価モデルである鶏漿尿膜の血管新生に対して
強い阻害作用を示すことを見出した。さらに、in vivo
のラットＮＥＣＡ誘発網膜血管透過性モデルに対して強
い血管透過性抑制作用を示すことも見出した。また、血
管新生や血管透過性が関与する疾患において血管内皮増
殖因子の遊離が観察されるが、この血管内皮増殖因子の
遊離を抑制することができれば血管内皮細胞増殖因子が
関与する疾患の有効な薬物となり得る。そこで本化合物
についての血管内皮増殖因子の遊離抑制作用についても
検討を行った結果、ヒト・グリオブラストーマ（Gliobl
astoma）細胞からの血管内皮増殖因子の遊離に対し強い
抑制作用を示すことを見出した。これらの結果より、本
化合物は、血管新生、血管透過性または血管内皮増殖因
子が関与する疾患、特に、糖尿病性網膜症、黄斑変性
症、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症等の網膜疾患、血
管新生緑内障および血管腫等の腫瘍の治療剤として有用
であることが期待される。
誘導体の有用性を調べるべく、本化合物の血管新生阻害
作用について検討を行った。詳細については後述の薬理
試験の項で示すが、本化合物は、in vivo（生体内）の
血管新生評価モデルである鶏漿尿膜の血管新生に対して
強い阻害作用を示すことを見出した。さらに、in vivo
のラットＮＥＣＡ誘発網膜血管透過性モデルに対して強
い血管透過性抑制作用を示すことも見出した。また、血
管新生や血管透過性が関与する疾患において血管内皮増
殖因子の遊離が観察されるが、この血管内皮増殖因子の
遊離を抑制することができれば血管内皮細胞増殖因子が
関与する疾患の有効な薬物となり得る。そこで本化合物
についての血管内皮増殖因子の遊離抑制作用についても
検討を行った結果、ヒト・グリオブラストーマ（Gliobl
astoma）細胞からの血管内皮増殖因子の遊離に対し強い
抑制作用を示すことを見出した。これらの結果より、本
化合物は、血管新生、血管透過性または血管内皮増殖因
子が関与する疾患、特に、糖尿病性網膜症、黄斑変性
症、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症等の網膜疾患、血
管新生緑内障および血管腫等の腫瘍の治療剤として有用
であることが期待される。
【００１８】本化合物の投与は経口でも非経口でも行う
ことができる。投与剤型としては、錠剤、カプセル剤、
散剤、顆粒剤、経皮吸収剤、注射剤、点眼剤、眼軟膏等
が挙げられ、汎用されている技術を用いて本化合物を製
剤化することができる。
ことができる。投与剤型としては、錠剤、カプセル剤、
散剤、顆粒剤、経皮吸収剤、注射剤、点眼剤、眼軟膏等
が挙げられ、汎用されている技術を用いて本化合物を製
剤化することができる。
【００１９】本化合物の投与量は症状、年齢、剤型等に
よって適宜選択できるが、経口剤であれば通常１日当り
０．１〜５０００ｍｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇを
１回または数回に分けて投与すればよい。
よって適宜選択できるが、経口剤であれば通常１日当り
０．１〜５０００ｍｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇを
１回または数回に分けて投与すればよい。
【００２０】以下に薬理試験の結果を示すが、これは本
発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範
囲を限定するものではない。
発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範
囲を限定するものではない。
【００２１】
【実施例】［１．受精卵胚漿尿膜法による血管新生阻害
効果］in vivo における血管新生評価モデルとして鶏漿
尿膜の血管新生に対する薬物の阻害効果を測定する受精
卵胚漿尿膜法がBiochem. Biophys. Res. Commun., 17 4,
1070-1076 (1991) に報告されている。そこで、上記文
献に記載された方法に準じて、環状ジスルフィド誘導体
の血管新生評価モデルに対する効果について検討を行っ
た。
効果］in vivo における血管新生評価モデルとして鶏漿
尿膜の血管新生に対する薬物の阻害効果を測定する受精
卵胚漿尿膜法がBiochem. Biophys. Res. Commun., 17 4,
1070-1076 (1991) に報告されている。そこで、上記文
献に記載された方法に準じて、環状ジスルフィド誘導体
の血管新生評価モデルに対する効果について検討を行っ
た。
【００２２】（投与用ペレットの調製） １）メチルセルロース４０００ｃＰ（０．１ｇ）を滅菌
精製水（１０ｍｌ）に溶解し１％メチルセルロース液と
する。
精製水（１０ｍｌ）に溶解し１％メチルセルロース液と
する。
【００２３】２）被験化合物をエタノール／滅菌精製水
（１／１）で溶解し４８μｍｏｌ／ｍｌの溶液を調製す
る。
（１／１）で溶解し４８μｍｏｌ／ｍｌの溶液を調製す
る。
【００２４】３）４８μｍｏｌ／ｍｌの溶液をエタノー
ル／滅菌精製水（１／１）で希釈し２４μｍｏｌ／ｍ
ｌ、１２μｍｏｌ／ｍｌ、６μｍｏｌ／ｍｌおよび３μ
ｍｏｌ／ｍｌの被験化合物溶液を調製する。
ル／滅菌精製水（１／１）で希釈し２４μｍｏｌ／ｍ
ｌ、１２μｍｏｌ／ｍｌ、６μｍｏｌ／ｍｌおよび３μ
ｍｏｌ／ｍｌの被験化合物溶液を調製する。
【００２５】４）各濃度の被験化合物溶液０．２０ｍｌ
と１％メチルセルロース液０．２０ｍｌを混合する。
と１％メチルセルロース液０．２０ｍｌを混合する。
【００２６】５）各濃度の被験化合物混合液１０μｌを
直径３ｍｍのパラフィンフィルム上で約２時間風乾し、
被験化合物ペレットを得る。
直径３ｍｍのパラフィンフィルム上で約２時間風乾し、
被験化合物ペレットを得る。
【００２７】（実験方法）受精後３日齢の孵化卵（ホワ
イトレグホン）入荷後、直ちに卵殻表面を７０％エタノ
ールで洗浄・消毒した。これら孵化卵を空気相を上にし
て６穴の培養プレートに３個づつ立てた後、ＣＯ2 イン
キュベーター（３７℃、湿度９５％、ＣＯ2 濃度５％）
内に搬入した。２０分放置した後、ＣＯ2 インキュベー
ターから孵化卵を取り出した。クリーンベンチ内で孵化
卵の空気相上部の卵殻に約１ｃｍ四方の穴をあけた。引
き続き殻膜を卵黄膜から注意深く剥離した。卵殻上の穴
に直径３５ｍｍの培養シャーレをかぶせた後、ＣＯ2 イ
ンキュベーターに再搬入し１日間培養した。４日齢孵化
卵の胚漿尿膜上（既存血管の少ないところ）にパラフィ
ンフィルム上の被験化合物ペレットをその薬物面が胚漿
尿膜に接着するように投与した。これら孵化卵を再びＣ
Ｏ2 インキュベーターに搬入し２日間培養した後、１０
％イントラリピッド約２ｍｌを胚漿尿膜内に注入し、実
体顕微鏡（×１０）にてペレット周囲の血管形成を観察
した。血管新生が認められない場合を陽性とし、血管新
生阻害率を下記の式により算出した。
イトレグホン）入荷後、直ちに卵殻表面を７０％エタノ
ールで洗浄・消毒した。これら孵化卵を空気相を上にし
て６穴の培養プレートに３個づつ立てた後、ＣＯ2 イン
キュベーター（３７℃、湿度９５％、ＣＯ2 濃度５％）
内に搬入した。２０分放置した後、ＣＯ2 インキュベー
ターから孵化卵を取り出した。クリーンベンチ内で孵化
卵の空気相上部の卵殻に約１ｃｍ四方の穴をあけた。引
き続き殻膜を卵黄膜から注意深く剥離した。卵殻上の穴
に直径３５ｍｍの培養シャーレをかぶせた後、ＣＯ2 イ
ンキュベーターに再搬入し１日間培養した。４日齢孵化
卵の胚漿尿膜上（既存血管の少ないところ）にパラフィ
ンフィルム上の被験化合物ペレットをその薬物面が胚漿
尿膜に接着するように投与した。これら孵化卵を再びＣ
Ｏ2 インキュベーターに搬入し２日間培養した後、１０
％イントラリピッド約２ｍｌを胚漿尿膜内に注入し、実
体顕微鏡（×１０）にてペレット周囲の血管形成を観察
した。血管新生が認められない場合を陽性とし、血管新
生阻害率を下記の式により算出した。
【００２８】血管新生阻害率（％）＝（陽性を示した孵
化卵数）／（試験に供した孵化卵数）×１００
化卵数）／（試験に供した孵化卵数）×１００
【００２９】（結果）被験化合物として（４Ｒ）−ヘキ
サヒドロ−７，７−ジメチル−６−オキソ−１，２，５
−ジチアゾシン−４−カルボン酸を用いた実験結果を表
１に示す。
サヒドロ−７，７−ジメチル−６−オキソ−１，２，５
−ジチアゾシン−４−カルボン酸を用いた実験結果を表
１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】表１に示したように、本化合物は低投与量
であっても血管新生を顕著に阻害した。
であっても血管新生を顕著に阻害した。
【００３２】[２．ラットＮＥＣＡ誘発網膜血管透過性
亢進モデルによる血管透過性抑制効果]in vivoにおける
血管透過性抑制効果を確認するため、まず、Arch.Ophth
almol.,107,1364-1367(1989)に準じ、ラットＮＥＣＡ誘
発網膜血管透過性亢進モデル（以下「モデルラット」と
言う）を作製した。本モデルラットを用いArch.Ophthal
mol.,100,631-634(1982)に報告されている後述の硝子体
フルオロメトリー法（ＶＦＰ法）に準じ、眼内蛍光色素
濃度を測定し、血液網膜柵の障害度を示す硝子体内漏出
指数を後述の式により算出することで、環状ジスルフィ
ド誘導体の血管透過性抑制効果について検討を行った。
亢進モデルによる血管透過性抑制効果]in vivoにおける
血管透過性抑制効果を確認するため、まず、Arch.Ophth
almol.,107,1364-1367(1989)に準じ、ラットＮＥＣＡ誘
発網膜血管透過性亢進モデル（以下「モデルラット」と
言う）を作製した。本モデルラットを用いArch.Ophthal
mol.,100,631-634(1982)に報告されている後述の硝子体
フルオロメトリー法（ＶＦＰ法）に準じ、眼内蛍光色素
濃度を測定し、血液網膜柵の障害度を示す硝子体内漏出
指数を後述の式により算出することで、環状ジスルフィ
ド誘導体の血管透過性抑制効果について検討を行った。
【００３３】（被験化合物の調製） １）メチルセルロース１００ｃＰ（０．１ｇ）を滅菌精
製水（１０ｍｌ）に溶解し、１％メチルセルロース液と
する。
製水（１０ｍｌ）に溶解し、１％メチルセルロース液と
する。
【００３４】２）被験化合物（３．６ｇ）を１％メチル
セルロース液（６０ｍｌ）に懸濁し、６０ｍｇ／ｍｌの
被験化合物溶液を調製する。
セルロース液（６０ｍｌ）に懸濁し、６０ｍｇ／ｍｌの
被験化合物溶液を調製する。
【００３５】（ＮＥＣＡ溶液の調製） １）ＮＥＣＡ（１１．５ｍｇ）をジメチルアミノスルホ
キシド（１８０μｌ）に溶解し、０．２ｍｏｌ／ｌのＮ
ＥＣＡ溶液とする。
キシド（１８０μｌ）に溶解し、０．２ｍｏｌ／ｌのＮ
ＥＣＡ溶液とする。
【００３６】２）０．２ｍｏｌ／ｌのＮＥＣＡ溶液（５
μｌ）をリン酸緩衝生理食塩水（１ｍｌ）で希釈し、１
μｍｏｌ／ｌのＮＥＣＡ溶液とする。
μｌ）をリン酸緩衝生理食塩水（１ｍｌ）で希釈し、１
μｍｏｌ／ｌのＮＥＣＡ溶液とする。
【００３７】（実験方法）正常ラットにケタミン／キシ
ラジンの７：１混合溶液（１ｍｌ／ｋｇ）を筋肉内投与
して麻酔後、ラットの硝子体内に１μｍｏｌ／ｌＮＥＣ
Ａ溶液（２．５μｌ）を注入してモデルラットを作製し
た。被験化合物（３００ｍｇ／５ｍｌ／ｋｇ）はモデル
ラット作製の４時間前、４時間後および２０時間後にそ
れぞれを経口投与した。ＮＥＣＡ溶液投与２４時間後に
眼内蛍光色素濃度および血漿中色素濃度をＶＦＰ法によ
り測定し、血液網膜柵の障害度を硝子体内漏出指数とし
て以下の式により算出した。
ラジンの７：１混合溶液（１ｍｌ／ｋｇ）を筋肉内投与
して麻酔後、ラットの硝子体内に１μｍｏｌ／ｌＮＥＣ
Ａ溶液（２．５μｌ）を注入してモデルラットを作製し
た。被験化合物（３００ｍｇ／５ｍｌ／ｋｇ）はモデル
ラット作製の４時間前、４時間後および２０時間後にそ
れぞれを経口投与した。ＮＥＣＡ溶液投与２４時間後に
眼内蛍光色素濃度および血漿中色素濃度をＶＦＰ法によ
り測定し、血液網膜柵の障害度を硝子体内漏出指数とし
て以下の式により算出した。
【００３８】尚、モデルラットのコントロールとして、
被験化合物溶液の代りに１％メチルセルロース液（５ｍ
ｌ／ｋｇ）を投与し、その他の操作は上記と同様に行っ
た。
被験化合物溶液の代りに１％メチルセルロース液（５ｍ
ｌ／ｋｇ）を投与し、その他の操作は上記と同様に行っ
た。
【００３９】正常ラットのコントロールとして被験化合
物溶液の代りに１％メチルセルロース液（５ｍｌ／ｋ
ｇ）を、ＮＥＣＡ溶液の代りに０．１％ジメチルスルホ
キシド／リン酸緩衝生理食塩水（２．５μｌ）を投与
し、その他の操作は上記と同様に行った。
物溶液の代りに１％メチルセルロース液（５ｍｌ／ｋ
ｇ）を、ＮＥＣＡ溶液の代りに０．１％ジメチルスルホ
キシド／リン酸緩衝生理食塩水（２．５μｌ）を投与
し、その他の操作は上記と同様に行った。
【００４０】硝子体内漏出指数＝(硝子体内蛍光色素濃
度−眼内自然蛍光濃度)×１０００／血漿中蛍光色素濃
度
度−眼内自然蛍光濃度)×１０００／血漿中蛍光色素濃
度
【００４１】（硝子体フルオロメトリー法（ＶＦＰ
法）） １）ラットにケタミン／キシラジンの７：１混合溶液
（１ｍｌ／ｋｇ）を筋肉内投与し、ミドリン（Mydrin）
−Ｐを点眼し散瞳する。
法）） １）ラットにケタミン／キシラジンの７：１混合溶液
（１ｍｌ／ｋｇ）を筋肉内投与し、ミドリン（Mydrin）
−Ｐを点眼し散瞳する。
【００４２】２）フルオロトロンマスターで眼内自然蛍
光濃度を測定後、１％フルオレセイン溶液（１ｍｌ／ｋ
ｇ）を陰茎静脈内投与する。
光濃度を測定後、１％フルオレセイン溶液（１ｍｌ／ｋ
ｇ）を陰茎静脈内投与する。
【００４３】３）フルオレセイン溶液投与４５分後に血
液を心臓より採血する。
液を心臓より採血する。
【００４４】４）心採血後、直ちにフルオロトロンマス
ターにて眼内蛍光色素濃度を測定し、眼内蛍光色素濃度
−装置内長さ曲線を得る。
ターにて眼内蛍光色素濃度を測定し、眼内蛍光色素濃度
−装置内長さ曲線を得る。
【００４５】５）上記３）で得た血液を遠心分離し、そ
の上清をリン酸緩衝生理食塩水で５１倍希釈し、フルオ
ロトロンマスターにて血漿中蛍光色素濃度を測定する。
の上清をリン酸緩衝生理食塩水で５１倍希釈し、フルオ
ロトロンマスターにて血漿中蛍光色素濃度を測定する。
【００４６】６）上記４）で得た眼内蛍光色素濃度−装
置内長さ曲線の蛍光色素濃度の最大ピーク（網膜位置）
より装置内長さが５ｍｍの位置の蛍光色素濃度を硝子体
内蛍光色素濃度として得る。
置内長さ曲線の蛍光色素濃度の最大ピーク（網膜位置）
より装置内長さが５ｍｍの位置の蛍光色素濃度を硝子体
内蛍光色素濃度として得る。
【００４７】（結果）被験化合物として(４Ｒ)-ヘキサ
ヒドロ-７，７-ジメチル-６-オキソ-１，２，５-ジチア
ゾシン-４-カルボン酸を用いた実験結果を以下に示す。
ヒドロ-７，７-ジメチル-６-オキソ-１，２，５-ジチア
ゾシン-４-カルボン酸を用いた実験結果を以下に示す。
【００４８】
【表２】
【００４９】表２に示したように、モデルラットに被験
化合物を投与した場合、血管網膜柵の障害度はモデルラ
ット（コントロール）に対して５０％まで減少させた。
化合物を投与した場合、血管網膜柵の障害度はモデルラ
ット（コントロール）に対して５０％まで減少させた。
【００５０】[３．ヒトGlioblastoma細胞からの血管内
皮増殖因子遊離抑制効果]血管内皮増殖因子（以下、Ｖ
ＥＧＦとする）の遊離抑制効果を確認するため、Proc.
Natl. Acad. Sci., 93, 8502-8507 (1996)に報告されて
いる無刺激状態でＶＥＧＦを遊離するヒトGlioblastoma
細胞（U87MG cell）とＨｕｍａｎ ＶＥＧＦ測定キット
−（ＩＢＬ）（免疫生物研究所製）を使用し、環状ジス
ルフィド誘導体のＶＥＧＦの遊離抑制効果について検討
を行った。
皮増殖因子遊離抑制効果]血管内皮増殖因子（以下、Ｖ
ＥＧＦとする）の遊離抑制効果を確認するため、Proc.
Natl. Acad. Sci., 93, 8502-8507 (1996)に報告されて
いる無刺激状態でＶＥＧＦを遊離するヒトGlioblastoma
細胞（U87MG cell）とＨｕｍａｎ ＶＥＧＦ測定キット
−（ＩＢＬ）（免疫生物研究所製）を使用し、環状ジス
ルフィド誘導体のＶＥＧＦの遊離抑制効果について検討
を行った。
【００５１】（ヒトGlioblastoma細胞の調製） １）１０％牛胎児血清とD-MEM・high glucose培地との混
合液（以下、培養液とする）２５ｍｌとヒトGlioblasto
ma細胞懸濁液１ｍｌ（U87MG ；ATCC製）を７５ｍｍ2 の
培養容器に加え一晩培養する。
合液（以下、培養液とする）２５ｍｌとヒトGlioblasto
ma細胞懸濁液１ｍｌ（U87MG ；ATCC製）を７５ｍｍ2 の
培養容器に加え一晩培養する。
【００５２】２）培養液の上清を捨て、新鮮な培養液２
５ｍｌを加えることにより、培養液の交換を行った。
５ｍｌを加えることにより、培養液の交換を行った。
【００５３】３）以後、培養液の交換は５日を超えない
うちに実施する。細胞が増殖し、コンフルエントに近く
なったとき、以下の操作により継代培養を行う。
うちに実施する。細胞が増殖し、コンフルエントに近く
なったとき、以下の操作により継代培養を行う。
【００５４】４）培養容器から培養液の上清を捨て、上
記細胞をリン酸緩衝生理食塩水１０ｍｌで洗浄する。
記細胞をリン酸緩衝生理食塩水１０ｍｌで洗浄する。
【００５５】５）同容器に室温でトリプシン／エチレン
ジアミン四酢酸溶液５ｍｌを加え、ヒトGlioblastoma
細胞を容器壁面から剥離する。
ジアミン四酢酸溶液５ｍｌを加え、ヒトGlioblastoma
細胞を容器壁面から剥離する。
【００５６】６）同容器にさらに培養液１０ｍｌを加
え、全体を遠心チューブに移し替える。１０００ｒｐｍ
で５分間遠心分離する。
え、全体を遠心チューブに移し替える。１０００ｒｐｍ
で５分間遠心分離する。
【００５７】７）上清を捨てリン酸緩衝生理食塩水５ｍ
ｌを加え懸濁する。
ｌを加え懸濁する。
【００５８】８）再度、１０００ｒｐｍで５分間遠心分
離し、上清を捨て、培養液５ｍｌを加え懸濁し細胞懸濁
液とする。
離し、上清を捨て、培養液５ｍｌを加え懸濁し細胞懸濁
液とする。
【００５９】（被験化合物溶液の調製） １）被験化合物（２．５ｍｇ）をエタノール（０．５ｍ
ｌ）に溶解し、エタノールと同容量のリン酸緩衝生理食
塩水（０．５ｍｌ）を加え、１．１×１０-2Ｍの溶液と
する。
ｌ）に溶解し、エタノールと同容量のリン酸緩衝生理食
塩水（０．５ｍｌ）を加え、１．１×１０-2Ｍの溶液と
する。
【００６０】２）この溶液（０．５ｍｌ）にリン酸緩衝
生理食塩水（０．５ｍｌ）を加え、５．５×１０-3Ｍの
溶液とする。
生理食塩水（０．５ｍｌ）を加え、５．５×１０-3Ｍの
溶液とする。
【００６１】３）さらにこの溶液に２５％エタノール・
リン酸緩衝生理食塩水を加え、５．５×１０-5Ｍの溶液
とする。
リン酸緩衝生理食塩水を加え、５．５×１０-5Ｍの溶液
とする。
【００６２】（実験方法）カルチャープレートに培養液
０．５ｍｌおよび細胞懸濁液（１．５×１０5cells／ｍ
ｌ）０．１ｍｌを入れ１日培養した。各ウェル（well）
の培養液の上清を取り出し、予め９５％Ｎ2 ・５％ＣＯ
2 混合ガスを吹き込み充満させておいた培養液０．５ｍ
ｌを加えた。
０．５ｍｌおよび細胞懸濁液（１．５×１０5cells／ｍ
ｌ）０．１ｍｌを入れ１日培養した。各ウェル（well）
の培養液の上清を取り出し、予め９５％Ｎ2 ・５％ＣＯ
2 混合ガスを吹き込み充満させておいた培養液０．５ｍ
ｌを加えた。
【００６３】これに５．５×１０-5Ｍの被験化合物溶液
１０μｌを加えた。終濃度は１μＭとなった。これを９
５％Ｎ2 ・５％ＣＯ2 混合ガスを充填したフレックスサ
ンプラー内で２４時間培養した後、各ウェルの上清を分
取し、Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ測定キット−（ＩＢＬ）
（免疫生物研究所製）を使用し、上清中のＶＥＧＦの濃
度を測定した。
１０μｌを加えた。終濃度は１μＭとなった。これを９
５％Ｎ2 ・５％ＣＯ2 混合ガスを充填したフレックスサ
ンプラー内で２４時間培養した後、各ウェルの上清を分
取し、Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ測定キット−（ＩＢＬ）
（免疫生物研究所製）を使用し、上清中のＶＥＧＦの濃
度を測定した。
【００６４】尚、コントロールとして、被験化合物溶液
の代りに２５％エタノール／リン酸緩衝生理食塩水１０
μｌを加え、その他の操作は上記と同様に行った。
の代りに２５％エタノール／リン酸緩衝生理食塩水１０
μｌを加え、その他の操作は上記と同様に行った。
【００６５】（結果）被験化合物として（４Ｒ）−ヘキ
サヒドロ−７，７−ジメチル−６−オキソ−１，２，５
−ジチアゾシン−４−カルボン酸を用いた実験例におい
ては、血管内皮増殖因子の遊離の量をコントロールに対
して４４％まで減少させた。
サヒドロ−７，７−ジメチル−６−オキソ−１，２，５
−ジチアゾシン−４−カルボン酸を用いた実験例におい
ては、血管内皮増殖因子の遊離の量をコントロールに対
して４４％まで減少させた。
【００６６】
【発明の効果】上記の薬理試験の結果から明らかなよう
に、本化合物は優れた血管新生阻害作用、血管透過性抑
制作用または血管内皮増殖因子遊離抑制作用を有し、血
管新生、血管透過性または血管内皮増殖因子が関与する
疾患、特に、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、網膜静脈閉
塞症、網膜動脈閉塞症等の網膜疾患、血管新生緑内障お
よび血管腫等の腫瘍の治療剤として有用であることが期
待される。
に、本化合物は優れた血管新生阻害作用、血管透過性抑
制作用または血管内皮増殖因子遊離抑制作用を有し、血
管新生、血管透過性または血管内皮増殖因子が関与する
疾患、特に、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、網膜静脈閉
塞症、網膜動脈閉塞症等の網膜疾患、血管新生緑内障お
よび血管腫等の腫瘍の治療剤として有用であることが期
待される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 285/36 Ｃ０７Ｄ 285/36 285/38 285/38 285/00
Claims (8)
- 【請求項１】下記一般式[I] で表わされる化合物または
その塩類を有効成分とする血管新生阻害剤。 【化１】 ［式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 は同一かまたは異なって
水素原子または低級アルキル基を示す。ｍは０または１
を示す。ｎは１または２を示す。］ - 【請求項２】血管新生が眼内血管新生である請求項１記
載の阻害剤。 - 【請求項３】請求項１記載の一般式[I] で示される化合
物またはその塩類を有効成分とする血管透過性抑制剤。 - 【請求項４】血管透過性が眼内血管透過性である請求項
３記載の抑制剤。 - 【請求項５】請求項１記載の一般式[I] で示される化合
物またはその塩類を有効成分とする血管内皮増殖因子遊
離抑制剤。 - 【請求項６】血管内皮増殖因子が眼内血管に存在する血
管内皮増殖因子である請求項５記載の遊離抑制剤。 - 【請求項７】請求項１記載の一般式[I] で示される化合
物またはその塩類を有効成分とする網膜疾患治療剤。 - 【請求項８】(４Ｒ)-ヘキサヒドロ-７，７-ジメチル-６
-オキソ-１，２，５-ジチアゾシン-４-カルボン酸また
はその塩類を有効成分とする請求項記載１の血管新生阻
害剤、請求項３記載の血管透過性抑制剤、請求項５記載
の血管内皮増殖因子遊離抑制剤または請求項７記載の網
膜疾患治療剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00162899A JP3533491B2 (ja) | 1998-01-09 | 1999-01-07 | 血管新生阻害剤 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10-2702 | 1998-01-09 | ||
| JP270298 | 1998-01-09 | ||
| JP00162899A JP3533491B2 (ja) | 1998-01-09 | 1999-01-07 | 血管新生阻害剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11255648A true JPH11255648A (ja) | 1999-09-21 |
| JP3533491B2 JP3533491B2 (ja) | 2004-05-31 |
Family
ID=26334888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00162899A Expired - Fee Related JP3533491B2 (ja) | 1998-01-09 | 1999-01-07 | 血管新生阻害剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3533491B2 (ja) |
-
1999
- 1999-01-07 JP JP00162899A patent/JP3533491B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3533491B2 (ja) | 2004-05-31 |
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