ES2595388T3 - Método para el tratamiento de la glomerulonefritis - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de la actividad IL-6 que es un anticuerpo, o un fragmento funcionalmente activo, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcionalmente activo interacciona selectivamente con un polipéptido de IL-6 o un polipéptido de IL-6R, para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis de la glomerulonefritis asociada con un trastorno vasculítico.

Description

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contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis. Esta unidad puede contener, por ejemplo, pero sin limitación, de 750 mg/kg a 0,1 mg/kg, dependiendo del trastorno que se está tratando, de la vía de administración y de la edad, el peso y la condición del sujeto.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables para su uso en la invención pueden tomar una amplia variedad de formas que dependen, por ejemplo, de la vía de administración.

Las composiciones para la administración oral pueden ser líquidas o sólidas. Las preparaciones líquidas orales pueden tomar la forma, por ejemplo, de suspensiones acuosas u oleosas, disoluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Las preparaciones líquidas orales pueden contener agentes suspensores, según se conoce en la técnica.

En el caso de preparaciones sólidas orales, tales como polvos, cápsulas y comprimidos, pueden incluirse vehículos, tales como almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, ligantes, agentes disgregantes y similares. Debido a la facilidad de su administración, los comprimidos y las cápsulas representan la forma de dosificación unitaria oral más ventajosa, en cuyo caso en general se emplean vehículos farmacéuticos sólidos. Además, de las formas de dosificación habituales indicadas anteriormente, los agentes activos de la invención también pueden administrarse por medios de liberación controlada y/o dispositivos de transporte. Los comprimidos y las cápsulas pueden comprender vehículos o excipientes convencionales, tales como agentes ligantes, por ejemplo, jarabe, goma arábiga, gelatina, sorbitol, tragacanto, o polivinilpirrolidona; cargas, por ejemplo, lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol o glicina; lubricantes de comprimidos, por ejemplo, estearato de magnesio, talco, polietilenglicol o sílice; disgregantes, por ejemplo, almidón de patata; o agentes humectantes aceptables, tales como laurilsulfato de sodio. Los comprimidos pueden revestirse por medio de técnicas acuosas o no acuosas convencionales según métodos muy conocidos en la práctica farmacéutica normal.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención adecuadas para la administración oral pueden presentarse como unidades discretas, tales como cápsulas, sellos o comprimidos, que contienen cada uno una cantidad predeterminada del agente activo, como polvo o gránulos, o como una disolución o una suspensión en un líquido acuoso, un líquido no acuoso, una emulsión de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. Estas composiciones pueden prepararse por medio de cualquiera de los métodos de farmacia, pero todos los métodos incluyen la etapa de poner en contacto el agente activo y el vehículo, que constituye uno o más de los ingredientes necesarios. En general, las composiciones se preparan mezclando de modo uniforme e íntimo el agente activo con los vehículos líquidos o los vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, dando forma al producto en la presentación deseada. Por ejemplo, un comprimido puede prepararse mediante compresión o moldeado, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden prepararse como disoluciones o suspensiones de los agentes activos de la invención en agua mezclada de modo adecuado con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y sus mezclas en aceites. Bajo condiciones normales de conservación y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para un uso inyectable incluyen disoluciones para inyección estériles acuosas

o no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que hacen que la composición sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores y agentes espesantes. Pueden prepararse disoluciones, dispersiones y suspensiones para una inyección improvisada a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferida, una composición farmacéutica de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en los documentos US 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Los ejemplos de implantes y módulos conocidos útiles en la presente invención incluyen: documento US 4.487.603, que describe una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; documento US 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; documento US 4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicación para administrar una medicación a una velocidad de infusión precisa; documento US 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua del fármaco; documento US 4.439.196, que describe un sistema de administración de fármacos osmótico que tiene compartimentos de múltiples cámaras; y documento US 4.475.196, que describe un sistema de administración de fármacos osmótico. Muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos son conocidos por los expertos en la técnica.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse para asegurar una distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica excluye a muchos compuestos muy hidrófilos y puede resultar preferible administrar las composiciones farmacéuticas en liposomas. Así, en una realización de la invención, los agentes activos de la invención se formulan en liposomas; en una realización más

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preferida, los liposomas incluyen un resto de transporte dirigido.

Las formulaciones de agentes activos pueden administrarse en fluorocarburos como formulaciones pulmonares, tópicas u oftalmológicas e incluyen suspensiones del agente activo en fluorocarburos, emulsiones inversas de agua en fluorocarburos, emulsiones de aceite en fluorocarburos, emulsiones múltiples, microemulsiones, geles de fluorocarburos, liposomas fluorados y túbulos fluorados.

Las composiciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitarias o de dosis múltiples, por ejemplo, en viales y ampollas selladas y, para potenciar la estabilidad, pueden conservarse en forma liofilizada que solo requiera la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes del uso. El vehículo líquido estéril puede suministrarse en un vial o ampolla separada y puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglico y polietilenglicol líquido), sus mezclas adecuadas, y aceites vegetales. De modo ventajoso, pueden incluirse agentes, tales como anestésicos locales, agentes conservantes y tamponantes, en el vehículo líquido estéril.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica pueden formularse como ungüentos, cremas, suspensiones, lociones, polvos, disoluciones, pastas, geles, vendas impregnadas, pulverizados, aerosoles o aceites, dispositivos transdérmicos, polvos secantes y similares. Estas composiciones pueden prepararse a través de métodos convencionales que contienen el agente activo. Así, también pueden comprender aditivos y vehículos convencionales compatibles, tales como conservantes, disolventes para ayudar a la penetración del fármaco, emolientes en cremas o ungüentos, y etanol o alcohol oleílico para lociones. Estos vehículos pueden estar presentes desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 98% de la composición. De forma más habitual, formarán hasta aproximadamente 80% de la composición. Solo como ilustración, una crema o ungüento se prepara mezclando cantidades suficientes de material hidrófilo y agua, que contiene aproximadamente 5-10% en peso del compuesto, en cantidades suficientes para producir una crema o un ungüento con la consistencia deseada.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración transdérmica pueden presentarse como parches discretos previstos para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un periodo prolongado de tiempo. Por ejemplo, el agente activo puede ser emitido desde el parche mediante iontoforesis.

Para aplicaciones a tejidos externos, por ejemplo, la boca y la piel, las composiciones se aplican preferiblemente como una crema o ungüento tópico. Cuando se formula como un ungüento, el agente activo puede emplearse con una base de ungüento parafínica o miscible en agua. Como alternativa, el agente activo puede formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua o una base de agua en aceite.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica en la boca incluyen comprimidos para chupar, pastillas y colutorios.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica al ojo incluyen colirios, en los que el agente activo se disuelve o se suspende en un vehículo adecuado, en especial un disolvente acuoso. También incluyen cremas o ungüentos tópicos como se indicó anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración rectal, en las que el vehículo es un sólido, se presentan de la forma más preferida como supositorios de dosis unitarias. Los vehículos adecuados incluyen manteca de cacao u otros glicéridos o materiales que se emplean habitualmente en la técnica, y los supositorios pueden formarse de modo conveniente mezclando la combinación con el vehículo o vehículos ablandados o fundidos, seguido de la utilización de moldes de enfriamiento y conformación. También pueden administrarse como enemas.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o composiciones pulverizadas. Estos pueden comprender emolientes o bases tal como se emplean habitualmente en la técnica.

La dosificación que se va a administrar de un agente activo variará según el agente activo concreto, el trastorno implicado, el sujeto, y la naturaleza y gravedad de la enfermedad, y la condición física del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta, el momento y la frecuencia de la administración, la combinación o combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción, la tolerancia/respuesta a la terapia, y la vía de administración seleccionada; un médico será, en último término, quien determine las dosificaciones apropiadas que se vayan a utilizar. Esta dosificación puede repetirse tan a menudo como sea apropiado. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz será de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg, preferiblemente de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. La frecuencia de la dosis dependerá de la semivida de la molécula de anticuerpo y de la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una semivida corta (por ejemplo, de 2 a 10 horas), podrá ser necesario administrar una o más dosis diarias. Como alternativa, si la molécula de anticuerpo tiene una semivida larga (por ejemplo, de 2 a 15 días), puede que solo sea necesario administrar una dosificación una vez diaria, una vez semanal o incluso una vez cada 1 o 2 meses. Si se desarrollan efectos secundarios, puede alterarse o reducirse la cantidad y/o la frecuencia de la dosificación, según la práctica clínica normal.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse de modo conveniente en formas de dosificación unitarias que

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contengan una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis. En particular, la dosis a la que se administra una molécula de anticuerpo de la presente invención depende de la naturaleza del trastorno que se va a tratar, del grado de la inflamación presente y de si la molécula de anticuerpo está siendo utilizada de modo profiláctico o para tratar un trastorno existente.

Para el tratamiento y/o la profilaxis de la glomerulonefritis asociada con uno o más trastornos seleccionados del grupo que consiste en el síndrome de Goodpasture, un trastorno vasculítico, la enfermedad de Wegener, la nefropatía de IgA y una enfermedad inflamatoria con implicación de la membrana basal y, en particular, en seres humanos y animales, pueden administrarse composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos a pacientes (por ejemplo, sujetos humanos) a dosificaciones terapéutica o profilácticamente eficaces (por ejemplo, dosificaciones que produzcan una reducción en la glomerulonefritis) empleando cualquier vía de administración adecuada, tal como una inyección y otras vías de administración conocidas en la técnica para productos clínicos basados en anticuerpos.

Las composiciones pueden contener del 0,1% en peso, preferiblemente del 10-60% o más en peso del agente activo de la invención, dependiendo del método de administración.

Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o puede administrarse en combinación (por ejemplo, de modo simultáneo, secuencial o por separado) con otros agentes, fármacos u hormonas.

En la presente se describe un ácido nucleico que puede administrarse como un inhibidor a través de terapia génica (véase, por ejemplo, Hoshida, T. et al., 2002, Pancreas, 25:111-121; Ikuno, Y., 2002, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2002, 43:2406-2411; Bollard, C., 2002, Blood, 99:3179-3187; Lee E., 2001, Mol. Med., 7:773-782). La terapia génica se refiere a la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En un ejemplo, este es un ácido nucleico de IL-6 o de IL-6R o sus porciones.

La administración del ácido nucleico terapéutico hacia el interior de un paciente puede ser una terapia génica in vivo (es decir, el paciente se expone directamente al ácido nucleico o a un vector que contiene el ácido nucleico) o una terapia génica indirecta ex vivo (es decir, las células primero se transforman con el ácido nucleico in vitro y luego se trasplantan al paciente).

Por ejemplo, para la terapia génica in vivo, puede administrarse un vector de expresión que contenga el ácido nucleico de IL-6 o de IL-6R de tal forma que deviene intracelular, es decir, mediante una infección empleando un vector retrovírico defectuoso o atenuado u otros vectores víricos, tal como se describe, por ejemplo, en el documento US 4.980.286, o en Robbins et al., 1998, Pharmacol. Ther., 80:35-47.

En la técnica se conocen diversos vectores retrovíricos, tales como los descritos en Miller et al. (1993, Meth. Enzymol., 217:581-599), que se han modificado para delecionar las secuencias retrovíricas que no son necesarias para la encapsulación del genoma vírico y la posterior integración en el ADN de la célula hospedante. También pueden emplearse vectores adenovíricos que son ventajosos debido a su capacidad para infectar células que no se encuentran en división, y estos vectores adenovíricos de alta capacidad se describen en Kochanek (1999, Human Gene Therapy, 10:2451-2459). Los vectores víricos quiméricos que pueden utilizarse son los descritos en Reynolds et al. (1999, Molecular Medicine Today, 1:25-31). También pueden emplear vectores híbridos y se describen en Jacoby et al. (1997, Gene Therapy, 4:1282-1283).

En la terapia génica también puede emplearse la inyección directa de ADN desnudo o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, Gene Gun®; Biolistic, Dupont) o revistiéndolo con lípidos. Pueden emplearse receptores de la superficie celular/compuestos transfectores o la encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, o la administración del ácido nucleico unido a un péptido que se sabe que entra en el núcleo o su administración unido a un ligado predispuesto a una endocitosis mediada por receptores (véase, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem., 262:4429-4432) para el transporte dirigido a tipos celulares que expresen específicamente los receptores de interés.

En la terapia génica ex vivo, un gen se traslada hacia el interior de las células in vitro empleando un cultivo de tejido, y las células se administran al paciente por medio de diversos métodos, que incluyen la inyección subcutánea, la aplicación de las células a un injerto de piel, y la inyección intravenosa de células sanguíneas recombinantes, tales como células progenitoras o pluripotenciales hematopoyéticas.

Las células en que puede introducirse el ácido nucleico de IL-6 o de IL-6R para realizar una terapia génica incluyen, por ejemplo, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos y células sanguíneas. Las células sanguíneas que pueden emplearse incluyen, por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos, células hematopoyéticas o células progenitoras y similares.

En la presente se describe una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico de IL-6 o de IL-6R, en el que dicho ácido nucleico es parte de un vector de expresión que expresa un polipéptido de IL-6 o de IL-6R, o una proteína quimérica de este, en un hospedante adecuado. En particular, este ácido nucleico tiene un promotor unido operablemente a la región codificadora del polipéptido, y dicho promotor es inducible o constitutivo (y,

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opcionalmente, específico de tejido).

Los polipéptidos de IL-6 recombinantes pueden prepararse mediante procesos muy conocidos en la técnica a partir de células hospedantes modificadas genéticamente que comprenden sistemas de expresión. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polipéptido de IL-6 o un ácido nucleico de IL-6, a células hospedantes que se modifican genéticamente con dichos sistemas de expresión, y a la producción de polipéptidos de IL-6 mediante técnicas recombinantes. También pueden emplearse sistemas de traducción sin células para producir polipéptidos recombinantes (por ejemplo, lisado de reticulocitos de conejo, lisado de germen de trigo, kits de transcripción y traducción de E. coli HY T&T y RTS 100 in vitro SP6/T7 de Roche Diagnostics Ltd., Lewes, Reino Unido, y el sistema de transcripción/traducción acoplado TNT Quick de Promega UK, Southampton, Reino Unido.

Para la producción del polipéptido de IL-6 recombinante, pueden modificarse genéticamente células hospedantes para que incorporen sistemas de expresión, o sus porciones, para ácidos nucleicos de IL-6. Esta incorporación puede realizarse empleando métodos muy conocidos en la técnica, tales como transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAD-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, cargado de legrado, introducción balística o infección (véase, por ejemplo, Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986; y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989).

Los ejemplos representativos de células hospedantes incluyen células bacterianas, por ejemplo, células de E. coli, estreptococos, estafilococos, Streptomyces y Bacillus subtilis; células fúngicas, tales como células de levadura y células de Aspergillus; células de insecto, tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales, tales como células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, HEK 293, BHK y de melanoma de Bowes; y células vegetales.

Puede emplearse una amplia diversidad de sistemas de expresión, tales como, sin limitación, sistemas cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus, tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus de vaccinia, adenovirus, virus de la viruela de las aves de corral, virus de la pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de sus combinaciones, tales como los derivados de elementos genéticos de bacteriófagos y plásmidos, tales como cósmidos y fágmidos. Los sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulan, así como engendran, la expresión. En general, puede utilizarse cualquier sistema o vector que sea capaz de mantener, propagar o expresar un ácido nucleicos para producir un polipéptido en un hospedante. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en un sistema de expresión por medio de cualquiera de las diversas técnicas conocidas y habituales, tales como las indicadas en in Sambrook et al., supra. Pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido de IL-6 para permitir la secreción de la proteína traducida hacia el lumen del retículo endoplásmico, el espacio periplásmico o el entorno extracelular. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido de IL-6 o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de IL-6 pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes o de otras fuentes biológicas por métodos muy conocidos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxilapatito, cromatografía de tamices moleculares, métodos de centrifugación, métodos de electroforesis y cromatografía de lectina. En una realización, se emplea una combinación de estos métodos. En otra realización, se emplea una cromatografía líquida de alta resolución. En otra realización, puede emplearse un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de IL-6 para depurar una muestra que comprende un polipéptido de IL-6 de dicho polipéptido o para purificar dicho polipéptido. Pueden emplearse técnicas muy conocidas en la técnica para el replegamiento, para regenerar las conformaciones nativas o activas de los polipéptidos de IL-6 cuando los polipéptidos han sido desnaturalizados durante el aislamiento y/o la purificación. En el contexto de la presente invención, pueden obtenerse polipéptidos de IL-6 a partir de una muestra biológica procedente de cualquier fuente, tal como, y sin limitación, una muestra de sangre.

Los ácidos nucleicos de IL-6 o de IL6R pueden obtenerse empleando técnicas de clonación y selección convencionales, a partir de un banco de ADNc derivado de ARNm en células humanas, empleando un análisis de marcador de secuencia expresada (EST) (Adams, M. et al., 1991, Science, 252:1651-1656; Adams, M. et al., 1992, Nature, 355:632-634; Adams, M. et al., 1995, Nature, 377, supl.:3-174). Los ácidos nucleicos de IL-6 también pueden obtenerse a partir de fuentes naturales, tales como bancos de ADN genómico, o pueden sintetizarse empleando técnicas conocidas y disponibles en el mercado. Los ácidos nucleicos de IL-6 o de IL-6R que comprenden la secuencia codificadora para los polipéptidos de IL-6 o de IL-6R pueden utilizarse para la producción recombinante de dichos polipéptidos. Los ácidos nucleicos de IL-6 o de IL-6R pueden incluir la secuencia codificadora para el polipéptido maduro solamente; o la secuencia codificadora para el polipéptido maduro en un marco de lectura con otras secuencias codificadoras, tales como las que codifican una secuencia conductora o secretora, una secuencia de pre-, pro-o prepro-proteína, una secuencia escindible u otras porciones de péptidos de fusión, tales como un marcador de afinidad o una secuencia adicional que confiere estabilidad durante la producción del polipéptido. Los marcadores de afinidad preferidos incluyen múltiples restos histidina (por ejemplo, véase Gentz

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et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824), un marcador FLAG, un marcador HA o un marcador myc. Los ácidos nucleicos de IL-6 también pueden contener secuencias no codificadoras 5’ y 3’, tales como secuencias transcritas, no traducidas, señales de corte y empalme y de poliadenilación, sitios de unión a ribosomas y secuencias que estabilizan el ARNm.

Los anteriores derivados de polipéptidos de IL-6 o de IL-6R pueden crearse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico de IL-6 o de IL-6R, de modo que dichas una o más sustituciones, adiciones o deleciones se introducen en la proteína codificada. Pueden emplearse técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica para introducir mutaciones, que incluyen, por ejemplo, la mutagénesis específica dirigida a sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se realizan sustituciones de aminoácidos conservadoras en uno o más restos aminoácidos no esenciales previstos.

Un ácido nucleico de IL-6 o de IL-6R que codifica un polipéptido de IL-6 o de IL-6R, incluyendo los homólogos y ortólogos de especies distintas a la humana, puede obtenerse mediante un proceso que comprende las etapas de una selección en un banco apropiado bajo condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada y el aislamiento de ADNc de longitud completa y clones genómicos que contienen dicha secuencia de ácido nucleico. Estas técnicas de hibridación son muy conocidas en la técnica. Un ejemplo de unas condiciones de hibridación rigurosas es cuando la hibridación prevista se realiza a una temperatura de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C empleando una disolución salina de aproximadamente 0,9 M. Sin embargo, los expertos en la técnica serán capaces de variar dichas condiciones según sea apropiado para tomar en cuenta variables tales como la longitud de la sonda, la composición de bases, el tipo de iones presentes, etc. Para un alto grado de selectividad, se emplean condiciones relativamente rigurosas, tales como unas condiciones de bajo contenido salino

o alta temperatura, para formar dúplex. Las condiciones muy rigurosas incluyen una hibridación para filtrar el ADN unido en NaHPO4 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM, a 65 °C, y un lavado en 0,1 x SSC/SDS al 0,1% SDS a 68 °C (Ausubel F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en la p. 2.10.3). Para algunas aplicaciones, son necesarias unas condiciones menos rigurosas para la formación de dúplex. Una condiciones moderadamente rigurosas incluyen un lavado en 0,2 x SSC/SDS al 0,1% a 42 °C (Ausubel et al., 1989, supra). Las condiciones de hibridación también se pueden hacer más rigurosas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida, para desestabilizar el dúplex híbrido. Así, las condiciones de hibridación concretas pueden manipularse con facilidad y, en general, se elegirán las apropiadas. En general, unas temperaturas de hibridación convenientes en presencia de formamida al 50% son: 42 °C para una sonda que es 95-100% idéntica al fragmento de un gen que codifica un polipéptido según se define en la presente, 37 °C para una identidad del 90-95%, y 32 °C para una identidad del 7090%.

Los expertos en la técnica entenderán que, en muchos casos, una secuencia de ADNc aislada será incompleta, debido a que la región codificadora para el polipéptido se ha recortado en el extremo 5’ del ADNc. Esto es consecuencia de la transcriptasa inversa, una enzima con una procesabilidad inherentemente baja (una medida de la capacidad de la enzima para permanecer unida al molde durante la reacción de polimerización), por lo que falla en completar una copia de ADN del molde de ARNm durante la síntesis de la primera hebra del ADNc.

Los métodos para obtener ADNc de longitud completa o para extender ADNc cortos son muy conocidos en la técnica, por ejemplo RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc; por ejemplo, Frohman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8998-9002). Recientes modificaciones de la técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.) han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. Esta tecnología emplea ADNc preparados a partir de ARNm extraído de un tejido elegido, seguido del acoplamiento de una secuencia adaptadora en cada extremo. Después se realiza una PCR para amplificar el extremo 5’ que falta del ADNc empleando una combinación de cebadores oligonucleotídicos específicos de gen y específicos de adaptador. Después se repite la reacción de PCR empleando cebadores anidados que se han diseñado para que se reasocien con el producto amplificado, generalmente un cebador específico de adaptador que se reasocia en un punto más 3’ en la secuencia del adaptador, y un cebador específico de gen que se reasocia en un punto más 5’ en la secuencia génica conocida. Los productos de esta reacción entonces pueden analizarse mediante secuenciación de ADN y puede construirse un ADNc de longitud completa uniendo el producto directamente al ADNc existente para producir una secuencia completa, o realizando una PCR de longitud completa separada empleando la nueva información de secuencia para el diseño del cebador 5’.

Las características preferidas de cada realización de la invención son como las de cada una de las otras realizaciones, mutatis mutandis.

La invención se describirá a continuación remitiéndose a los siguientes ejemplos, que son solo ilustrativos y no debe considerarse que limitan el alcance de la presente invención de ninguna forma.

Leyendas de las figuras

La figura 1 es una histoquímica que muestra una glomerulonefritis semilunar típica en el riñón de ratones CD1 12 semanas después de una inmunización con α3(IV)NC1 recombinante. La flecha indica una semiluna fibrosa.

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La figura 2 muestra el efecto del tratamiento con un anticuerpo anti-IL-6 sobre la proteinuria de ratones CD1 3 semanas [panel (A)], 6 semanas [panel (B)], 9 semanas [panel (C)] o 12 semanas [panel (D)] después de una inmunización con α3(IV)NC1 recombinante.

La figura 3 muestra el efecto del tratamiento con un anticuerpo anti-IL-6 sobre las anomalías renales de ratones CD1 12 semanas después de una inmunización con α3(IV)NC1 recombinante.

Ejemplo 1: Preparación de la cadena alfa 3 recombinante del colágeno de tipo IV [α3(IV)NC1]

Se preparó α3(IV)NC1 recombinante como se describe en Reynolds et al. (Reynolds et al., 2005, J. Am. Soc. Nephrol., 16:1350-1359).

Ejemplo 2: Modelo murino del síndrome de Goodpasture

Ratones CD1 fueron inmunizados con α3(IV)NC1 recombinante en CFA s.c. en la base de la cola, seguido de dos recuerdos en IFA s.c. 1 y 2 semanas después. Los ratones desarrollan anticuerpos anti-membrana basal glomerular en la circulación y depositados, una proteinuria y una glomerulonefritis proliferativa focal para la semana 6 después de la inyección, que avanza a una glomerulonefritis semilunar grave para la semana 12. La histología de un animal inmunizado muestra unas cicatrices glomerulares marcadas con semilunas fibrosas, cicatrices tubulointersticiales con atrofia tubular, e inflamación tubulointersticial en el riñón, tal como se muestra en la figura 1.

Ejemplo 3: Tratamiento con anticuerpos IL-6

Grupos de ratones of CD1 (n = 10) recibieron anticuerpos irrelevantes (control positivo) o anticuerpos monoclonales anti-IL-6 a una dosis de 30 mg/kg (subcutánea) semanal durante 12 semanas desde el día anterior a la inmunización con α3(IV)NC1 recombinante.

Los animales se colocaron en jaulas metabólicas durante 24 horas cada 3 semanas, con acceso libre a alimento y agua para permitir la recolección de orina. Se detectó la proteinuria en la orina mediante el método del ácido sulfosalicílico (Khan et al., 2005, Kidney Int., 67: 1812-1820). Los animales que recibieron el mAb anti-IL-6 mostraron una marcada reducción en la proteinuria cuando se comparan con los controles positivos, tal como se muestra en la figura 2A-D. A las 12 semanas después de la inmunización, los niveles de proteinuria en los ratones tratados con anti-IL-6 fueron solo de 8 mg/día, comparado con los 39 mg/día en los ratones tratados con el anticuerpo control irrelevante. El número de anomalías glomerulares también se redujo en ratones tratados con el anticuerpo anti-IL-6, tal como se muestra en la figura 3 (control, 29% frente a mAb anti-IL-6, 2%).

Los resultados sugieren que puede inducirse de forma fiable una glomerulonefritis autoinmunológica en el ratón CD1, y que el mAb anti-IL-6 mAb es eficaz para la prevención de las lesiones glomerulares en este modelo. Por tanto, los resultados demuestran la importancia del papel de la IL-6 en el desarrollo de una glomerulonefritis autoinmunológica experimental e indican que las estrategias dirigidas a la IL-6 pueden proporcionar una nueva estrategia para el tratamiento de la glomerulonefritis humana.

Claims (1)

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