KR20010023325A - 함지방세포-특이적 단백질 상동체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콜라겐-유사 도메인 및 구형 도메인을 포함하고 있는 단백질 패밀리의 신규한 구성원인 zsig39 에 대한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. 폴리펩티드, 및 그것을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 이량체화 또는 올리고머화에 포함되며, 그것의 연구에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 zsig39 폴리펩티드에 대한 항체를 포함한다.

Description

함지방세포-특이적 단백질 상동체{ADIPOCYTE-SPECIFIC PROTEIN HOMOLOGS}

본 발명의 한 측면으로, 본 발명은 SEQ ID NO:2 와 최소한 80 % 동일한 아미노산 잔기의 서열을 포함하고 있는 단리된 폴리펩티드를 제공하는데, 이 서열은 최소한 두 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 105-109, 128-130, 136-139, 143-146, 164-171, 176-182, 187-200, 204-210 및 226-231 에 상응하는 베타 가닥; 및 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 111-135 및 170-174 를 포함하는 수용체 결합 도메인을 포함하고 있다. 한 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 와 최소한 90 % 동일하다. 다른 구체예로, 폴리펩티드는 최소한 22 개의 콜라겐 반복단위를 가지고 있는 콜라겐-유사 도메인을 포함하고 있다. 다른 구체예에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 잔기 19-243 을 포함하고 있다. 또 다른 구체예에서 폴리펩티드는 친화성 태그, 독소, 방사성뉴클레오티드, 효소 및 플루오로포어 (fluorophore)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 부분에 아미노 말단쪽으로 또는 카르복시 말단쪽으로 공유 결합된다.

다른 측면으로, a) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 아미노산 잔기 95 에 이르는 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 아미노산 잔기 96 에 이르는 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; c) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 97 에 이르는 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; d) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 아미노산 잔기 98 에 이르는 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; e) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 98 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; f) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 99 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; g) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; 및 h) a), b), c), d), e), f) 또는 g) 와 아미노산 서열이 90 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택된 단리된 폴리펩티드가 제공된다.

다른 측면으로, a) SEQ ID NO:2 와 최소한 80 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드로서, 상기 서열은 최소한 두 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 105-109, 128-130, 136-139, 143-146, 164-171, 176-182, 187-200, 204-210 및 226-231 에 상응하는 베타 가닥; 및 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 111-135 및 170-174 를 포함하는 수용체 결합 도메인을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드; b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 16 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드; c) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 1 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드; d) 콜라겐-유사 도메인 또는 이량체화 또는 올리고머화할 수 있는 콜라겐-유사 도메인의 부분을 함유하고 있는, SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드의 부분; e) 구형-유사 도메인 또는 구형-유사 도메인의 수용체 결합 도메인을 함유하고 있는, SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드 부분; 또는 f) 콜라겐-유사 도메인 및 구형 도메인을 포함하고 있는 SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드 부분으로 이루어지는 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하고 있는 첫 번째 부분과, 다른 폴리펩티드를 포함하고 있으며 펩티드 결합에 의하여 첫 번째 부분과 결합되는 두 번째 부분으로 본질적으로 구성되는 융합 단백질이 제공된다. 한 구체예에서, 첫 번째 부분은 a) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 아미노산 잔기 95 에 이르는 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 아미노산 잔기 96 에 이르는 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; c) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 97 까지의 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; d) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 아미노산 잔기 243 에 이르는 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; f) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 98 에서 아미노산 잔기 243 에 이르는 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; 및 g) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 99 에서 아미노산 잔기 243 에 이르는 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

다른 측면으로, 본 발명에서는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 1-15 또는 1-18 의 아미노산 서열을 가지고 있는 분비 신호 서열을 포함하는 융합 단백질이 제공되며, 이 분비 신호 서열은 추가의 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된다.

다른 측면으로, 약학적으로 허용되는 부형제와 결합된 상태의, 상술된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

또한 본 발명에는 상술된 바와 같은 폴리펩티드의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.

추가의 측면으로, 본 발명에는 SEQ ID NO:2 와 최소한 80 % 동일한 아미노산 잔기의 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공되는데, 상기 서열은 최소한 두 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 105-109, 128-130, 136-139, 143-146, 164-171, 176-182, 187-200, 204-210 및 226-231 에 상응하는 베타 가닥; 및 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 111-135 및 170-174 를 포함하는 수용체 결합 도메인을 포함하고 있다. 한 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 와 최소한 90 % 동일하다. 다른 구체예로, 폴리펩티드는 최소한 22 개의 콜라겐 반복단위를 가지고 있는 콜라겐-유사 도메인을 포함하고 있다. 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA 이다.

다른 측면으로, a) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 243 에서 뉴클레오티드 962 까지의 뉴클레오티드 서열; b) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 252 에서 뉴클레오티드 962 까지의 뉴클레오티드 서열; c) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 285 에서 뉴클레오티드 482 까지의 뉴클레오티드 서열; d) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 285 에서 뉴클레오티드 485 까지의 뉴클레오티드 서열; e) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 285 에서 뉴클레오티드 488 까지의 뉴클레오티드 서열; f) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 285 에서 뉴클레오티드 491 까지의 뉴클레오티드 서열; g) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 285 에서 뉴클레오티드 926 까지의 뉴클레오티드 서열; h) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 491 에서 뉴클레오티드 926 까지의 뉴클레오티드 서열; i) a), b), c), d), e), f), g) 및 h) 와 뉴클레오티드 서열이 최소한 80 % 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드; j) a), b), c), d), e), f), g), h) 또는 i) 와 상보하는 뉴클레오티드 서열; 및 k) a), b), c), d), e), f), g), h), i) 또는 j) 의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

다른 측면으로, 본 발명에서는 a) SEQ ID NO:2 와 최소한 80 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드로서, 상기 서열은 최소한 두 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 105-109, 128-130, 136-139, 143-146, 164-171, 176-182, 187-200, 204-210 및 226-231 에 상응하는 베타 가닥; 및 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 111-135 및 170-174 를 포함하는 수용체 결합 도메인을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드; b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 16 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드; c) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 1 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드; d) 콜라겐-유사 도메인 또는 이량체화 또는 올리고머화할 수 있는 콜라겐-유사 도메인의 부분을 함유하고 있는, SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드의 부분; e) 구형-유사 도메인 또는 구형-유사 도메인의 활성 부분을 함유하고 있는, SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드 부분; 또는 f) 콜라겐-유사 도메인 및 구형 도메인을 포함하고 있는 SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드 부분으로 이루어지는 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하고 있는 첫 번째 부분과, 다른 폴리펩티드를 포함하고 있으며 펩티드 결합에 의하여 첫 번째 부분과 결합되는 두 번째 부분으로 본질적으로 구성되는 융합 단백질을 코드화하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

다른 측면으로, 본 발명에서는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 1-15 또는 1-18 의 아미노산 서열을 가지고 있으며, 추가의 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되어 있는 분비 신호 서열을 포함하는 융합 단백질을 코드화하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면은 SEQ ID NO:10 의 뉴클레오티드 1 에서 뉴클레오티드 729 를 포함하고 있는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.

또한 본 발명에서는 다음의 작동가능하게 연결되어 있는 엘레먼트들: 전사 프로모터; 상술된 바와 같은 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편; 및 전사 터미네이터를 포함하고 있는 발현벡터가 제공된다. 한 구체예에서, DNA 절편은 SEQ ID NO:2 와 최소한 90 % 동일한 폴리펩티드를 코드화한다. 다른 구체예에서, DNA 절편은 최소한 22 개의 콜라겐 반복단위를 가지고 있는 콜라겐-유사 도메인을 추가로 포함하고 있는 폴리펩티드를 코드화한다. 또 다른 구체예에서, DNA 절편은 친화성 태그에 아미노 말단쪽으로 또는 카르복시 말단쪽으로 공유 결합되어 있는 폴리펩티드를 코드화한다. 또 다른 구체예에서 DNA 절편은 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되어 있는 분비 신호 서열을 추가로 코드화한다. 다른 구체예에서, 분비 신호 서열은 SEQ ID NO:2 의 1-15 또는 1-18 의 잔기를 포함한다.

또한 본 발명에서는 그 안에 다음의 작동가능하게 연결되어 있는 엘레먼트들: 전사 프로모터; 상술된 바와 같은 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편; 및 전사 터미네이터를 포함하고 있는 발현벡터가 도입되어 있는 배양된 세포가 제공되는데, 상기 세포는 DNA 절편에 의해 코드화된 폴리펩티드를 발현한다.

다른 측면으로, 본 발명에는 그 안에 다음의 작동가능하게 연결되어 있는 엘레먼트들: 전사 프로모터; 상술된 바와 같은 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편; 및 전사 터미네이터를 포함하고 있는 발현벡터가 도입되어 있는 세포를 배양시키는 단계; 그로써 세포가 DNA 절편에 의해 코드화된 폴리펩티드를 발현하는 단계; 그리고 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계로 이루어지는, 폴리펩티드의 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 측면은 SEQ ID NO:10 의 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO:10 에 상보하는 서열의 최소한 14 개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머이다.

또 다른 측면으로 본 발명은 상술된 바와 같은 폴리펩티드의 약학적으로 유효한 양을 투여함으로써 유리 지방산 대사를 조절하는 방법이다.

에너지 평형 (에너지 대사, 영양 상태, 지질 저장 등을 포함함)은 건강의 중요한 기준이다. 이 에너지 항상성에는 음식물 섭취와 수의 (voluntary) 및 불수의 (involuntary) 작용에 필요한 에너지를 생성하기 위한 탄수화물 및 지질의 대사가 포함된다. 단백질의 대사도 에너지 생성을 유도할 수 있지만, 바람직하게는 근육의 형성 또는 회복을 유도한다. 다른 결과들 중에서도 에너지 항상성의 결핍은 지방조직의 과형성 또는 형성 부족을 유도한다.

지방의 형성 및 저장은 인슐린에 의해 조절된다. 예를 들면, 인슐린은 글루코오스가 세포안으로 수송되는 것을 자극하며, 그 세포안에서 글루코오스는 그것의 트리글리세리드로서 저장되는 것을 가능하게 하기 위한 지방산의 에스테르화에 사용되는 α-글리세로포스페이트로 대사된다. 또한, 함지방세포 (지방세포)는 유리 지방산의 함지방세포 안으로의 전달을 증강시키는 특이한 수송 단백질을 발현한다.

함지방세포는 또한 글루코오스 및 지질 대사의 항상적 제어를 조절하는 것으로 여겨진다. 이들 추가의 함지방세포에서 분비되는 단백질로는 아디프신, 보체 인자 C3 및 B, 종양 괴사 인자 α, ob 유전자 생성물 및 Acrp30 이 있다. 또한 함지방세포안에 인슐린에 의해 조절되는 분비 경로가 존재함을 시사하는 증거가 있다 [Scherer et al., J. Biol. Chem. 270(45): 26746-26749, 1995]. 지방 조직의 과도한 또는 부족한 형성에 의해 부분적으로 영향을 받는 이들 부분의 과도한 또는 부족한 분비는 비만 또는 식욕감퇴와 직접적으로 또는 간접적으로 관련된 병리학적 상태를 유도할 수 있다.

Acrp30 은 함지방세포에 의하여 독점적으로 발현되는 247 개의 아미노산으로 된 폴리펩티드이다. Acrp30 폴리펩티드는 아미노-말단 신호 서열, 공지의 상동성이 없는 27 개의 아미노산 스트레치, 22 개의 완전한 Gly-Xaa-Pro 또는 불완전한 Gly-Xaa-Xaa 콜라겐 반복 단위 및 카르복시 말단인 구형 도메인으로 구성되어 있다 [Scherer et al., 상기 동일 문헌, 및 국제 특허 출원 번호 WO96/39429]. 인슐린에 의해 조절되는 풍부한 사람 혈청 단백질인 Acrp30 은, 보체 인자 Clq 및 동면하는 시베리아산 다람쥐의 여름철 혈청 단백질 (Hib27)과, 특히 카르복시-말단의 구형 도메인 부분에 구조적인 유사성을 가지고 있다. Acrp30 의 발현은 함지방세포 분화중에 100 배 이상으로 유도된다. Acrp30 은 에너지 평형의 조절 및 시험 샘플중의 함지방세포의 존재 확인에 사용될 수 있을 것으로 제안되고 있다.

함지방세포에서 배타적으로 생성되는 것으로 여겨지는 다른 분비 단백질로는 예를 들면 apM1 이 있다 [Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 221: 286-289, 1996]. 4517 bp 의 클론은 244 아미노산 오픈 리딩 프레임과 긴 3' 미번역 영역을 가지고 있다. 단백질은 신호 서열, 아미노-말단 비-콜라겐성 서열, 22 개의 콜라겐 반복 단위 (Gly-XAA-Pro 또는 Gly-Xaa-Xaa), 및 콜라겐 X, 콜라겐 VIII 및 보체 단백질 Clq 에 대해 상동성을 가지고 있는 카르복시-말단 영역을 포함하고 있다.

보체 인자 Clq 는 세 개의 관련된 폴리펩티드 (A, B 및 C 사슬)의 6 개의 복사물로 구성되는데, 각각의 폴리펩티드는 아미노-말단 콜라겐 도메인과 유사한 부분과 카르복시-말단 구형 영역을 가지고 있으며 약 225 아미노산 길이를 가지고 있다. 6 개의 삼중 나선 영역은 중심 영역 및 6 개의 스톡 (stalk)을 형성하는 6 개의 A, 6 개의 B 및 6 개의 C 사슬의 콜라겐 도메인에 의해 형성된다. 구형의 머리 부분은 A, B 및 C 사슬의 구형 카르복시 말단 도메인의 결합에 의해 형성된다. 그러므로 Clq 는 6 개의 콜라겐-유사 스톡을 경유하여 중심의 피브릴 영역에 결합된 6 개의 구형 머리부분으로 구성된다 [Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-490, 1991]. 이런 형태는 때로 꽃다발로 언급되기도 한다. Acrp30 은 단일 형태의 폴리펩티드 사슬로부터 형성된 유사한 꽃다발 구조를 가지고 있다.

이런 현상을 연구하고 불균형의 예방 또는 치료를 위하여 에너지 항상성을 조절할 수 있는 분자들이 탐색되었다. 또한, 직접적인 에너지 항상성 조절제로서 및 연구 시약으로서, 함지방세포 분비 경로를 조절할 수 있는 분자들이 탐색되었다.

본 발명은 본원에 나타낸 바로부터 당업자들에게 드러날 이들 및 다른 용도에 사용될 수 있는 그러한 폴리펩티드를 제공한다.

도 1 은 본 발명과 HUMUPST2_1 (SEQ ID NO:3) [Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 221(2): 286-289, 1996]; C1QA_HUMAN (SEQ ID NO:4) [Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-490, 1991, Reid, Biochem. J. 179: 367-371, 1979, 및 Reid et al., Biochem. J. 203:559-569, 1982]; HP25_TAMAS (SEQ ID NO:5) [Takamatsu et al., Mol. Cell. Biol. 13:1516-1521, 1993 및 Kondo ＆ Kondo, J. Biol. Chem. 267:473-478, 1992]; HP27_TAMAS (SEQ ID NO:6) [Takamatsu et al. 및 Kondo ＆ Kondo, 상기 동일]; 및 CERL_RAT (SEQ ID NO:7) [Wada ＆ Ohtani, Brain Res. Mol. Brain Res. 9:71-77, 1991] 의 다중 배열 및 zsig39 폴리펩티드를 도시한다.

도 2 는 도 1 의 다중 배열에 도시된 6 개의 단백질을 비교하여 얻어진 % 아미노산 동일성을 보여주는 매트릭스이다.

본 발명을 상세하게 설명하기 전에 다음의 용어들을 규정하는 것이 본 발명의 이해를 도와줄 것이다.

용어 "친화성 태그" 는 본원에서, 두 번째 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 제공하기 위하여 또는 기질에 대한 두 번째 폴리펩티드의 부착을 위한 부위를 제공하기 위하여 두 번째 폴리펩티드에 부착될 수 있는 폴리펩티드 절편을 규정하기 위하여 사용된다. 원리적으로는, 그것에 대한 항체 또는 다른 특이한 결합 제제가 활용가능한 것이라면 어떤한 펩티드 또는 단백질이든지 친화성 태그로서 사용될 수 있다. 그러한 친화성 태그로는 폴리-히스티딘 관 (tract), 단백질 A [Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991], 글루타티온 S 트란스페라제 [Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988], 물질 P, Flag^TM펩티드 [Hopp et al., Biotechnology 6:1204-1210, 1988; Eastman Kodak Co., New Haven, CT 로부터 구입가능함], 스트렙트아비딘 결합 펩티드, 또는 다른 항원성 에피토프 또는 결합 도메인이 있다 [일반적인 사항은 Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991 참조]. 친화성 태그를 코드화하는 DNA 들은 상업적인 공급자들 (예컨대 파마시아 바이오테크 (Piscataway, NJ))로부터 구입할 수 있다.

용어 "대립성 변이체" 는 동일한 염색체상의 유전자좌를 차지하는 유전자의 둘 또는 그 이상의 대체 형태중 어느 하나를 말한다. 대립성 변이는 돌연변이를 통하여 자연적으로 발생하며, 집단내에서 다중형태의 표현형을 유발할 수 있다. 유전자 돌연변이는 사일런트성 (코드화된 폴리펩티드에 어떠한 변화도 없는 경우)일 수 있으며 또는 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코드화할 수도 있다. 용어 대립성 변이체는 또한 본원에서 유전자의 대립성 변이체에 의해 코드화된 단백질을 나타내기 위해서도 사용될 수 있다.

용어 "아미노-말단" 및 "카르복시-말단" 은 본원에서 폴리펩티드 및 단백질내에 있는 위치를 규정하기 위하여 사용된다. 내용이 허락되는 한, 이들 용어는 근접성 또는 상대적인 위치를 규정하기 위하여 폴리펩티드 또는 단백질의 특별한 서열 또는 부분과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 단백질내에서 참조 서열에 대해 카르복시-말단쪽으로 위치한 특정 서열은 참조 서열의 카르복시 말단에 가까운 쪽에 위치한 것이지만, 반드시 완전한 단백질의 카르복시 말단에 위치한 것은 아니다.

용어 "콜라겐 또는 콜라겐-유사 도메인" 은 일련의 반복되는 삼중 아미노산 서열, "반복단위" 또는 "콜라겐 반복단위", Gly-Xaa-Pro 또는 Gly-Xaa-Xaa 를 말하며, 여기서 Xaa 는 모든 아미노산 잔기를 말한다. 그러한 도메인은 22 개의 많은 또는 그 이상의 콜라겐 반복단위를 함유할 수 있다. 그러한 콜라겐-유사 도메인을 함유하고 있는 단편 또는 단백질은 동종성 (homomeric) 구성물 (동일한 단편 또는 단백질로 된 이량체 또는 올리고머)을 형성할 수 있다. 더욱이, 그러한 콜라겐-유사 도메인을 함유하고 있는 그러한 단편 또는 단백질은 이종성 (heteromeric) 구성물 (상이한 단편 또는 단백질로 된 이량체 또는 올리고머)을 형성할 수 있다.

용어 "보체/항-보체 쌍" 은 비-공유적으로 결합된, 적절한 조건하에서 안정한 동일하지 않은 부분들을 말한다. 예를 들어, 비오틴과 아비딘 (또는 스트렙트아비딘)이 보체/항-보체 쌍의 표준적인 구성원이다. 다른 예시적인 보체/항-보체 쌍으로는 수용체/리간드 쌍, 항체/항원 (또는 합텐 또는 에피토프) 쌍, 센스/안티센스 폴리뉴클레오티드 쌍, 등이 있다. 보체/항-보체 쌍의 후속적인 분해가 바람직한 경우에는 보체/항-보체 쌍은 바람직하게도 〈10⁹M^-1의 결합 친화성을 갖는다.

용어 "폴리뉴클레오티드 분자의 보체" 는 참조 서열에 비교할 때 상보하는 염기 서열 및 역 배향을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드 분자이다. 예를 들어 서열 5' ATGCACGGG 3' 은 5' CCCGTGCAT 3' 에 상보한다.

용어 "콘티그 (contig)" 는 다른 폴리뉴클레오티드에 대해 동일한 또는 상보하는 서열로 된 연속적인 스트레치를 가지고 있는 폴리뉴클레오티드를 규정한다. 연속적인 서열은 폴리뉴클레오티드에 대해 완전하게 또는 그것의 부분적인 스트레치를 따라 주어진 폴리뉴클레오티드 서열의 스트레치를 "중복"하는 것을 말한다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 5' -ATGGCTTAGCTT-3' 에 대한 대표적인 콘티그는 5'-TAGCTTgagtct-3' 및 3'-gtcgacTACCGA-5' 이다.

용어 "축퇴성 뉴클레오티드 서열" 은 (폴리펩티드를 코드화하는 참조 폴리뉴클레오티드 분자와 비교하여) 하나 또는 그 이상의 축퇴성 코돈을 포함하는 뉴클레오티드의 서열을 말한다. 축퇴성 코돈은 뉴클레오티드의 상이한 트리플렛을 함유하지만, 동일한 아미노산 잔기를 코드화한다 (즉, GAU 와 GAC 는 각각 Asp 를 코드화한다).

용어 "발현 벡터" 는 그것의 전사를 제공하는 추가의 절편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 절편을 포함하고 있는 선형 또는 원형의 DNA 분자를 말한다. 그러한 추가의 절편으로는 프로모터 및 터미네이터 서열이 있으며, 임의로 하나 또는 그 이상의 복제 기원, 하나 또는 그 이상의 선택가능한 마아커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 등이 있을 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스성 DNA 로부터 유도될 수 있으며, 또는 두가지 엘레먼트를 모두 함유할 수도 있다.

용어 "단리된" 은, 폴리뉴클레오티드에 적용되는 경우에는, 그것의 천연적인 유전적 환경으로부터 제거되었고, 그러므로 다른 외인성 또는 원하지 않는 코딩 서열이 없고, 유전공학적 단백질 제조 시스템에서 사용되기에 적당한 형태로 존재하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 그러한 단리된 분자들은 그것들의 천연 환경으로부터 분리되고 cDNA 및 게놈 클론을 포함하는 분자들이다. 본 발명의 단리된 DNA 분자들은 그것들이 통상적으로 결합되어 있는 다른 유전자들은 없지만, 프로모터 및 터미네이터와 같은 자연 발생적인 5' 및 3' 미번역 영역을 포함할 수도 있다. 결합된 영역들의 확인과정은 당업자에게는 명백할 것이다 [Dynan and Tijan, Nature 316:774-778, 1985 참조].

"단리된" 폴리펩티드 또는 단백질은 혈액 및 동물 조직으로부터 분리된 것과 같이, 그것의 천연 환경과는 다른 조건에서 발견되는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 바람직한 형태의 단리된 폴리펩티드는 실질적으로 다른 폴리펩티드, 특히 동물 기원의 다른 폴리펩티드가 없는 것이다. 고도로 정제된 형태, 즉 바람직하게는 95 % 이상 순수한, 보다 바람직하게는 99 % 이상 순수한 폴리펩티드를 제공하는 것이 바람직하다. 본원에서 사용되었을 때, 용어 "단리된" 은 이량체 또는 다르게는 글리코실화된 또는 유도된 형태와 같이, 대체적인 물리적 형태로 동일한 폴리펩티드가 존재하는 것을 배제하지 않는다.

용어 "작동가능하게 연결된" 은, DNA 절편에 대해 언급되는 경우, 절편들이 그것들의 의도된 목적에 일치하게 그것들이 기능할 수 있도록 배열된 것을 말한다. 예를 들어 전사는 프로모터에서 시작하여 코딩 서열을 통과하여 터미네이터까지 진행된다.

용어 "오르토로그 (ortholog)" 는 상이한 종으로부터 얻어지는 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적인 대응부분인 한 종으로부터 얻어지는 폴리펩티드 또는 단백질을 말한다. 오르토로그들 중의 서열의 차이는 종 분화의 결과이다.

"파라로그 (paralog)" 는 유기체에 의해 만들어진 다르지만 구조적으로는 관련된 단백질들이다. 파라로그는 유전자 복제를 통하여 발생하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, α-글로빈, β-글로빈, 및 미오글로빈은 상호간의 파라로그이다.

용어 "폴리뉴클레오티드" 는 5' 에서 3' 단부 쪽으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥의 중합체를 말한다. 폴리뉴클레오티드에는 RNA 및 DNA 가 포함되며, 천연 공급원으로부터 단리될 수도 있고, 시험관내에서 합성될 수도 있으며, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드의 크기는 염기쌍 ("bp" 로 약칭됨)으로서, 뉴클레오티드 ("nt")로서, 또는 킬로염기 ("kb")로서 표시된다. 문맥상 후자의 두가지 표시는 단일-가닥 또는 이중-가닥의 폴리뉴클레오티드를 나타내기도 한다. 이 용어가 이중-가닥의 분자에 적용되는 경우, 용어는 전체 길이를 나타내기 위해 사용되며, 용어 "염기쌍" 과 동등하게 이해될 것이다. 당업자에게는 이중-가닥의 폴리뉴클레오티드의 두 개의 가닥이 길이가 약간 상이할 수 있으며 그것의 단부가 효소적 절단의 결과로서 엇갈릴 수도 있고, 따라서 이중-가닥의 폴리뉴클레오티드 분자내에 있는 모든 뉴클레오티드가 쌍을 이루지 못할 수도 있음이 인지될 것이다. 그러한 쌍을 이루지 못한 단부는 일반적으로 그 길이가 20 nt 를 초과하지는 않는다.

"폴리펩티드" 는 천연적으로 생성되든지 또는 합성적으로 생성되든지에 관계없이 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기들의 중합체이다. 약 10 아미노산 잔기 이하의 폴리펩티드는 통상 "펩티드"로서 언급된다.

본원에서 사용되는 바 "프로브 및/또는 프라이머" 는 RNA 또는 DNA 일 수 있다. DNA 는 cDNA 이거나 게놈성 DNA 일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 프로브 및 프라이머는 단일 또는 이중-가닥의 DNA 또는 RNA 이며, 일반적으로 합성 올리고뉴클레오티드이지만, 클론된 cDNA 또는 게놈성 서열 또는 그것의 보체로부터 제조될 수도 있다. 분석용 프로브는 대체로 그 길이가 최소한 20 뉴클레오티드이지만, 다소 짧은 프로브 (14-17 뉴클레오티드)도 사용될 수 있다. PCR 프라이머는 최소한 그 길이가 5 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 15 또는 그 이상의 nt, 보다 바람직하게는 20-30 nt 이다. 짧은 폴리뉴클레오티드는 유전자의 작은 영역이 분석용 표적인 경우에 사용될 수 있다. 유전자의 총체적인 분석을 위해서는, 폴리뉴클레오티드 프로브는 전체 엑손 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 프로브는 많은 공급원들 (예컨대, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, and Amersham Corp., Arlington Heights, IL)로부터 구입할 수 있는 예컨대 효소, 비오틴, 방사성핵종, 플루오로포어, 화학냉광체 (chemiluminescer), 상자성 입자 등과의 검출가능한 신호를 제공하기 위하여, 당해 기술분야에 공지되어 있는 기법들을 사용하여 표지화될 수 있다.

용어 "프로모터" 는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 포함하고 있는 유전자의 부분을 말한다. 프로모터 서열은, 늘 그런 것은 아니지만, 통상 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견된다.

"단백질" 은 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하고 있는 거대분자이다. 단백질은 또한 비-펩티드성 성분, 예컨대 탄수화물 그룹을 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드성 치환체들은 그 단백질이 생성되는 세포에 의해 단백질에 첨가될 수 있으며, 세포 유형에 따라 다를 것이다. 단백질은 본원에서 그것들의 아미노산 골격 구조의 관점에서 규정되며; 탄수화물 그룹과 같은 치환체들은 일반적으로 특정되지는 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수는 있다.

용어 "수용체" 는 생체활성 분자 (즉, 리간드)에 결합하여 세포에 미치는 리간드의 효과를 중재하는 세포-결합된 단백질을 말한다. 막-결합된 수용체들은 세포외재성 리간드-결합 도메인과 전형적으로 신호 전달에 포함된 세포내재성 이펙터 도메인을 포함하고 있는 다중-도메인 구조를 특징으로 한다. 수용체에 대한 리간드의 결합은 그 결과, 이펙터 도메인과 세포내의 다른 분자(들) 사이의 상호작용을 유발하는 수용체의 형태적 변화를 초래한다. 이러한 상호작용은 계속해서 세포의 대사의 변경을 유도한다. 수용체-리간드 상호작용과 연결된 대사적 사건으로는 유전자 전사, 인산화, 탈인산화, 원형 AMP 생성의 증가, 세포 칼슘의 이동, 막지질의 이동, 세포 점착, 이노시톨 지질의 가수분해 및 인지질의 가수분해가 있다. 대부분의 핵 수용체들은 또한 아미노-말단, 교차활성화 도메인, DNA 결합 도메인 및 리간드 결합 도메인을 포함하는 다중-도메인 구조를 나타낸다. 일반적으로, 수용체들은 막에 결합되거나, 시토졸성이거나, 또는 핵에 존재할 수 있고; 단량체성이거나 (예컨대 갑상선 자극 호르몬 수용체, 베타-아드레날린작용성 수용체) 또는 다량체성 (예컨대 PDGF 수용체, 성장 호르몬 수용체, IL-3 수용체, GM-CSF 수용체, G-CSF 수용체, 에리트로포이에틴 수용체 및 IL-6 수용체) 일 수 있다.

용어 "분비 신호 서열" 은 보다 큰 폴리펩티드의 한 성분으로서, 그것이 합성되는 세포의 분비 경로를 통하여 보다 큰 폴리펩티드를 특정하는 폴리펩티드 ("분비 펩티드")를 코드화하는 DNA 서열을 말한다. 보다 큰 펩티드는 통상 분비 경로를 통한 수송중에 분비 펩티드가 제거되도록 절단된다.

"가용성 수용체" 란 세포막에 결합되지 않는 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 거의 대부분 통상적으로 경막 (transmembrane) 및 세포질성 도메인이 없는 리간드-결합 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 예컨대 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위한 또는 기질에 폴리펩티드를 부착시키기 위한 부위를 제공하기 위한 친화성 태그, 또는 면역글로불린 불변 영역 서열과 같은 추가의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 많은 세포-표면 수용체들은 단백질 가수분해에 의해 생성되거나 또는 다르게는 스플라이스된 mRNA 로부터 번역된 자연 발생적인 가용성 대응물을 가지고 있다. 수용체 폴리펩티드는 각각 경막 및 세포내 폴리펩티드 절편의 막 고착 또는 신호 변환을 제공에 충분한 부분이 부족하게 되는 경우 경막 및 세포내 폴리펩티드 절편이 실질적으로 없다고 말할 수 있다.

용어 "스플라이스 변이체" 는 본원에서 유전자로부터 전사된 RNA 의 또 다른 형태를 규정하기 위하여 사용된다. 스플라이스 변이는 전사된 RNA 분자내에 있는, 또는 가끔은 별도로 전사된 RNA 분자들 사이에 있는 또 다른 스플라이싱 부위를 사용함으로써 자연적으로 발생하며, 동일한 유전자로부터 여러개의 mRNA 가 전사되는 것을 유발할 수 있다. 스플라이스 변이체는 변경된 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화할 수 있다. 용어 스플라이스 변이체는 또한 본원에서 유전자로부터 전사된 mRNA 의 스플라이스 변이체에 의하여 코드화된 단백질을 규정하는 데에도 사용될 수 있다.

부정확한 분석 방법 (예컨대 겔 전기영동)에 의하여 측정된 중합체의 분자량 및 길이는 대략적인 값으로 이해될 것이다. 그러한 값이 "약" X 또는 "대략" X 로서 표시되는 경우, 표시된 X 의 값은 ±10 % 정도로 정확한 것으로 이해될 것이다.

본 발명은 부분적으로는 함지방세포 보체 관련 단백질 (Acrp30)에 대해 상동성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 신규한 DNA 서열의 발견을 토대로 하고 있다 [예컨대 Scherer et al., J. Biol. Chem. 270(45): 26746-26749, 1995 참조]. 폴리펩티드 Acrp30 은 SEQ ID NO:8 에 도시되어 있다. Acrp30 은 사람 apM1 (도 1 및 2 에 도시되어 있는 HUMUPST2_1, SEQ ID NO:3)과 매우 관련이 있는 것으로 여겨지는데, 가장 유의할만한 차이점은 분비 서열에서 관찰된다.

신규한 DNA 서열은 아미노-말단 신호 서열, 상동성이 없는 인접한 N-말단 영역, Gly-Xaa-Xaa 또는 Gly-Xaa-Pro 반복 단위로 구성된 절단된 콜라겐 도메인 및 카르복시-말단 구형 부분을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화한다. 신규한 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 긴 3' 미번역 영역을 함유하고 있다. 상기에서 설명된 일반적인 폴리펩티드 구조는 Acrp30 (SEQ ID NO:8) 및 HUMUPST2_1 (SEQ ID NO:3)과 그 구조가 유사하다. 또한, HUMUPST2_1 DNA 서열 (SEQ ID NO:9)은 긴 3' 미번역 영역을 가지고 있는 것을 특징으로 한다. 더욱이, Acrp30 및 도 1 에 배열된 모든 서열은, CERL_RAT (SEQ ID NO:7)를 제외하고는, 도 1 및 SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같이 zsig39 폴리펩티드의 위치 144 에 보존된 시스테인 잔기를 공유하고 있다. 배열된 단백질들의 카르복시-말단 구형 부분에서 발견되는 다른 상동성 영역들은 본원에서 다른 패밀리의 구성원들을 연구하기 위한 유용한 프라이머로서 확인된다. 예를 들어 Acrp30 은 프라이머를 사용한 연구에서 확인될 것이다. 또한, 본 발명의 zsig39 폴리펩티드는 잠정적인 세포 부착 부위, 즉 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 77-79 에 있는 RGD 모티프를 포함하고 있다. RGD 펩티드 모티프 및 점착시의 그것의 역할에 대해서는 참고문헌을 참조한다 [Ruoslahti and Pierschbacher, Cell 44: 517-518, 1986 및 d'Souza et al., Trends Biochem. Sci. 16: 246-250, 1991].

이 신규한 DNA 에 상응하는 mRNA 의 조직 분포에 대한 분석은 본원의 하기 실시예 2 에서 설명된 바와 같이 수행되었다. 한 전사물의 크기는 대략 1.2 kb 에서 관찰되었다. 신호의 세기는 소장 및 심장에서 가장 높았으며, 췌장, 골격근, 신장 및 갑상선에서 상대적으로 적었고, 태반, 폐, 간, 비장, 전립선, 난소, 결장, 위, 척수, 림프절, 기관지, 부신 및 골수에서 낮게 나타났다. 폴리펩티드는 zsig39 폴리펩티드로서 표시되었다. 돗트 블롯팅 결과 zsig39 폴리펩티드가 시상하부 핵, 해마회 (hippocampus), 연수 및 시상에서 발현되는 것으로 나타났다. 사람 소화관에 대한 돗트 블롯은 결장직장 선암종 셀라인 SW480, 소장 조직, 위조직, 정상인 결장 셀라인, FHC; 및 정상적인 태아의 소장 셀라인 FHs74 Int 에서 발현을 나타냈다.

본 발명의 신규한 zsig39 폴리펩티드는 처음에 분비된 단백질을 선택하기 위한 노력의 일환으로, 상류의 메티오닌 출발 부위,대략 13 아미노산의 소수성 영역 및 절단 부위를 특징으로 하는 분비 신호 서열에 대한 EST 데이터베이스에 대해 의문을 가짐으로써 확인되었다. 그 연구 기준을 만족시키는 EST 에 상응하는 폴리펩티드가, 공지된 리간드에 대한 상동성을 가지고 있는 분비된 단백질을 확인하기 위하여 공지의 서열과 비교되었다. 하나의 EST 서열이 발견되었고 분비된 단백질일 것으로 예상되었다. 전체 길이의 cDNA 에 의해 코드화된 신규한 폴리펩티드는 함지방세포 보체 관련 단백질 Acrp30 (SEQ ID NO:8) 및 함지방세포 분비된 단백질 apM1 (도 1 및 2 의 HUMUPSR2_1, SEQ ID NO:3)과의 상동성 관계의 확인을 가능하게 한다. 다소 더 관계가 먼 상동성이 또한 도 1 및 2 에 도시된 바와 같이, 보체 성분 Clq A 사슬, 동면하는 시베리아산 우드척의 활동상태에서 발견된 두 개의 인자 (HP25_TAMAS (SEQ ID NO:5) 및 HP27_TAMAS (SEQ ID NO:6)) 및 래트의 뇌 단백질 (CERL_RAT, SEQ ID NO:7)에 대해서도 확인되었다.

zsig39 폴리펩티드의 완전한 서열은 그것을 함유하고 있는 것으로 믿어지는 단일 클론으로부터 얻어졌는데, 이 클론은 폐 조직 라이브러리로부터 얻어졌다. 그러한 클론에 대해 또한 연구되어야 할 다른 라이브러리로는 심장, 소장, 췌장, 골격근, 신장, 갑상선, 시상하부 핵, 해마회, 연수, 시상 등이 있다.

N-말단 EST 의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1 에 설명되어 있으며, 그것의 추론되는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2 에 나타나있다. 상기에서 일반적으로 설명되는 바와 같이, zsig39 폴리펩티드는 아미노산 1 (Met) 에서 아미노산 잔기 15 (Gly)에 이르는 신호 서열을 포함하고 있다. 또 다른 신호 서열 범위는 아미노산 1 (Met) 에서 아미노산 18 (Pro)이다. 그러므로 성숙한 폴리펩티드는 아미노산 16 (Ser) 또는 19 (Leu) 에서 아미노산 243 (Ala) 에 걸쳐 있다. 성숙한 폴리펩티드내에서 아미노산 잔기 20 (Asp) 과 29 (Pro) 사이에 있는, 제한된 상동성이 알려져 있는 않은 N-말단 영역이 발견되며, 위치 28 에 있는 시스테인은 HUMUPST2_1 의 위치 36 에서 및 HP25_TAMAS 및 HP27_TAMAS 의 N-말단 영역에서 발견되는 시스테인과 유사한 구조/기능을 제공할 수 있다. 또한, 콜라겐 도메인은 아미노산 30 (Gly) 과 95 (Ala), 96 (Gly), 97 (Glu) 또는 98 (Cys) 사이에서 발견된다. 콜라겐 도메인에서, 9 개의 완전한 Gly-Xaa-Pro 및 13 또는 14 개의 불완전한 Gly-Xaa-Xaa 반복단위가 관찰된다. Acrp30 은 22 개의 완전한 또는 불완전한 반복단위를 포함한다.

zsig39 폴리펩티드는 또한 대략적인 아미노산 98 (Cys) 또는 99 (Ser) 에서 243 (Ala) 에 걸쳐 있는 카르복시-말단 구형 도메인을 포함한다. Acrp30 의 구형 도메인은 10 개의 베타 가닥 "젤리 로울" 위상을 가지고 있는 [Shapiro and Scherer, Curr. Biol. 8: 335-338, 1998] 것으로 측정되었으며, SEQ ID NO:2 에 의해 표시되는 바와 같은 zsig39 서열은 상기 구조의 모두 10 개의 베타-가닥을 함유한다 (SEQ ID NO: 2 의 아미노산 잔기 105-109, 128-130, 136-139, 143-146, 164-171, 176-182, 187-200, 204-210 및 226-231). 이들 가닥들은 각각 "A", "A'", "B", "B'", "C", "D", "E", "F", "G" 및 "H" 로 표시되었다. 또한, 아미노산 잔기 111-139 및 170-182 에 있는 두 개의 수용체 결합 루프가 나타난다. 코아 수용체 결합 영역은 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 111-135 및 170-174 를 포함하는 것으로 예상된다. 당업자들은 이들 경계가 대략적인 것이며, 공지 단백질을 사용한 배열 및 단백질 접힘에 대한 예상을 토대로 한 것임을 인지할 것이다. 아미노산 잔기 149 (Glu), 151 (Tyr), 199 (Leu) 및 227 (Phe) 은 CD40, TNFα, ACRP30 및 zsig39 를 포함한 초패밀리 (superfamily) 를 뛰어넘어 보존되는 것으로 여겨진다.

본 발명의 단백질들은 SEQ ID NO:2 와 최소한 80 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함한다. 발명의 특정 구체예에서, 서열은 SEQ ID NO:2 와 최소한 90 % 또는 95 % 동일한다.

발명의 다른 측면은 zsig39 폴리펩티드 단편들을 포함한다. 바람직한 단편으로는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 30 (Gly) 에서 아미노산 95 (Ala), 96 (Gly), 97 (Glu) 또는 98 (Cys) 에 걸쳐 있는 zsig39 폴리펩티드의 콜라겐-유사 도메인, 콜라겐-유사 도메인을 함유하고 있는 zsig39 폴리펩티드의 부분 또는 이량체화 또는 올리고머화할 수 있는 콜라겐-유사 도메인 부분이 있다. 이들 단편들은 특히 콜라겐 이량체화 또는 올리고머화의 연구에, 또는 하기에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이 융합 단백질의 형성에 유용하다. 그러한 단편들을 코드화하는 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명에 포함되는데, 그러한 것의 예시로는 (a) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 1, 198, 242, 251 또는 285 에서 뉴클레오티드 482, 485, 488 또는 491 에 이르는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자; (b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 (Gly) 에서 아미노산 잔기 96 (Gly), 97 (Glu), 98 (Cys) 에 이르는 아미노산 서열과 최소한 80 % 동일한 zsig39 폴리펩티드 단편을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (c) (a) 또는 (b) 에 상보하는 분자; 및 (d) zsig39 폴리펩티드 콜라겐-유사 도메인 단편을 코드화하는 축퇴성 뉴클레오티드 서열이 있다.

그러한 콜라겐-유사 도메인을 함유하고 있는 그러한 단편들 또는 단백질들은 동종성 구성물 (동일한 단편 또는 단백질로 된 이량체 또는 올리고머)을 형성할 수 있다. 더욱이, 그러한 콜라겐-유사 도메인을 함유하고 있는 그러한 단편들 또는 단백질들은 이종성 구성물 (상이한 단편 또는 단백질로 된 이량체 또는 올리고머)을 형성할 수 있다. 이종성 구성물의 다른 성분들로는 Acrp30 및 본원에 기술되어 있는 또는 당해 기술분야에 공지된 바와 같은 콜라겐-유사 도메인을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 다른 폴리펩티드가 있다.

다른 바람직한 단편으로는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 98 (Cys) 또는 99 (Ser) 에서 243 (Ala) 에 걸쳐 있는, 특히 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 105 에서 231 에 걸쳐 있는 zsig39 폴리펩티드의 구형 도메인, 구형-유사 도메인 또는 구형-유사 도메인의 활성 부분을 함유하고 있는 zsig39 폴리펩티드의 부분이 있다. 이들 단편들은 특히 에너지 평형 또는 신경전달, 특히 식이요법- 또는 스트레스-관련 신경전달의 연구 또는 조절에 유용하다. 항-미생물 활성 또한 그러한 단편에 존재할 수 있다. Acrp30 단백질의 구형 도메인은 삼량체의 다량체로서 조립되는 것으로 나타났다 [Shapiro and Scherer, 상기 동일 문헌]. 그러한 단편들은 또한 zsig39 및 Acrp30 및 TNFα 와 같은 다른 관련 단백질의 다량체화 및 수용체 결합의 연구에 유용할 것이다. 그러한 단편들을 코드화하는 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명에 포함되며, 그러한 것으로는 (a) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 489 또는 492 에서 뉴클레오티드 926 또는 1347 에 이르는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자; (b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 98 (Cys) 또는 99 (Ser) 에서 아미노산 잔기 243 (Ala) 에 이르는 아미노산 서열과 최소한 80 % 동일한 zsig39 폴리펩티드 단편을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (c) (a) 또는 (b) 에 상보하는 분자; 및 (d) zsig39 폴리펩티드 구형 도메인 단편을 코드화하는 축퇴성 뉴클레오티드 서열이 있다.

본 발명의 다른 zsig39 폴리펩티드 단편은 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 (Gly) 에서 243 (Ala) 에 걸쳐 있는 콜라겐-유사 도메인 및 구형 도메인을 둘다 포함한다. 그러한 단편들을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명에 포함되며, 그러한 것으로는 (a) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 285 에서 뉴클레오티드 926 또는 1347 에 이르는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자; (b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 (Gly) 에서 아미노산 잔기 243 (Ala) 에 이르는 아미노산 서열과 최소한 80 % 동일한 zsig39 폴리펩티드 단편을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (c) (a) 또는 (b) 에 상보하는 분자; 및 (d) zsig39 폴리펩티드 콜라겐-유사 도메인-구형 도메인 단편을 코드화하는 축퇴성 뉴클레오티드 서열이 있다.

zsig39 단편은 당해 기술분야에 공지되어 있는 과정에 따라 그것들의 항-미생물 성질에 대하여 평가될 수 있다 [예를 들면, Barsum et al., Eur. Respair. J. 8(5): 709-714, 1995; Sandovsky-Losica et al., J. Med. Vet. Mycol (England) 28(4): 279-287, 1990; Mehentee et al., J. Gen. Microbiol. (England) 135 (Pt. 8): 2181-2188, 1989; Segal and Savage, Journal of Medical and Veterinary Mycology 24: 477-479, 1986 참조]. 필요하다면, 이런 관점에서 zsig39 폴리펩티드 단편 성능은 프롤린-풍부 단백질, 리소자임, 히스타틴, 락토페록시다제 등과 같은, 기능적인 것으로 알려져 있는 단백질과 비교될 수 있다. 또한, zsig39 폴리펩티드 단편은 상승 효과를 확인하기 위하여 하나 또는 그 이상의 항-미생물 제제와 함께 평가될 수 있다. 당업자는 zsig39 폴리펩티드, 융합 단백질, 아고니스트, 길항체 및 항체의 항-미생물 성질이 유사하게 평가될 수 있음을 인지하게 될 것이다.

신경 전달 물질로서 또는 신경 전달 조절제로서의 본 발명의 zsig39 폴리펩티드, 융합 단백질, 아고니스트, 길항체 또는 항체 뿐만 아니라 zsig39 폴리펩티드 단편은, 또한 칼슘 이온 농도, 근육 수축, 호르몬 분비, DNA 합성 또는 세포 성장, 이노시톨 포스페이트 턴오버 (turnover), 아라키돈산염 방출, 포스포리파제-C 활성화, 위의 공복, 사람 호중구 활성화 또는 ADCC 능력, 초산화물 음이온 생성 등을 조절할 수 있다. 이들 성질에 대한 평가는 본원에서 설명되는 바와 같이 공지된 방법에 의하여 수행될 수 있다.

세포내 칼슘 수준에 미치는 zsig39 폴리펩티드, 단편, 융합물, 아고니스트 또는 길항체의 영향은 문헌에 설명된 것과 같은, 당해 기술분야에 공지된 방법에 의하여 평가될 수 있다 [Dobrzanski et al., Regulatory Peptides 45: 341-352, 1993]. 근육 수축에 미치는 zsig39 폴리펩티드, 단편, 융합물, 아고니스트 또는 길항제의 영향은 문헌에 설명된 것과 같은, 당해 기술분야에 공지된 방법에 의하여 평가될 수 있다 [Smits ＆ Lebebvre, J. Auton. Pharmacol. 14:383-392, 1994; Belloli et al., J. Vet. Pharmacol. Therap. 17:379-383, 1994; Maggi et al., Regulatory Peptides 53: 259-274, 1994]. 호르몬 분비에 미치는 zsig39 폴리펩티드, 단편, 융합물, 아고니스트 또는 길항체의 영향은 문헌에 프로락틴 방출에 대하여 설명된 것과 같은, 당해 기술분야에 공지된 방법에 의하여 평가될 수 있다 [Henriksen et al., J. of Receptor ＆ Signal Transduction Research 15(1-4): 529-541, 1995]. DNA 합성 또는 세포 성장에 미치는 zsig39 폴리펩티드, 단편, 융합물, 아고니스트 또는 길항체의 영향은 문헌에 설명된 것과 같은, 당해 기술분야에 공지된 방법에 의하여 평가될 수 있다 [Dobrzanski et al., Regulatory Peptides 45: 341-352, 1993]. 이노시톨 인산염 턴오버에 미치는 zsig39 폴리펩티드, 단편, 융합물, 아고니스트 또는 길항체의 영향은 문헌에 설명된 것과 같은, 당해 기술분야에 공지된 방법에 의하여 평가될 수 있다 [Dobrzanski et al., Regulatory Peptides 45: 341-352, 1993].

또한, 아라키돈산염 방출에 미치는 zsig39 폴리펩티드, 단편, 융합물, 아고니스트 또는 길항체의 영향은 문헌에 설명된 것과 같은, 당해 기술분야에 공지된 방법에 의하여 평가될 수 있다 [Dobrzanski et al., Regulatory Peptides 45: 341-352, 1993]. 포스포리파제-C 활성화에 미치는 zsig39 폴리펩티드, 단편, 융합물, 아고니스트 또는 길항체의 영향은 문헌에 설명된 것과 같은, 당해 기술분야에 공지된 방법에 의하여 평가될 수 있다 [Dobrzanski et al., Regulatory Peptides 45: 341-352, 1993]. 위의 공복에 미치는 zsig39 폴리펩티드, 단편, 융합물, 아고니스트 또는 길항체의 영향은 문헌에 설명된 것과 같은, 당해 기술분야에 공지된 방법에 의하여 평가될 수 있다 [Varga et al., Eur. J. Pharmacol. 286: 109-112, 1995]. 사람 호중구 활성화 및 ADCC 능력에 미치는 zsig39 폴리펩티드, 단편, 융합물, 아고니스트 또는 길항체의 영향은 문헌에 설명된 것과 같은, 당해 기술분야에 공지된 방법에 의하여 평가될 수 있다 [Wozniak et al., Immunology 78: 629-634, 1993]. 초산화물 음이온 생성에 미치는 zsig39 폴리펩티드, 단편, 융합물, 아고니스트 또는 길항체의 영향은 문헌에 설명된 것과 같은, 당해 기술분야에 공지된 방법에 의하여 평가될 수 있다 [Wozniak et al., Immunology 78: 629-634, 1993].

본 발명은 또한 zsig39 융합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질은 (1) a) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 19 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 서열과 최소한 80 % 동일한 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 폴리펩티드; b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 16 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드; c) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 1 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드; d) 콜라겐-유사 도메인 또는 이량체화 또는 올리고머화할 수 있는 콜라겐-유사 도메인의 부분을 함유하고 있는, SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드의 부분; e) 구형-유사 도메인 또는 구형-유사 도메인의 활성 부분을 함유하고 있는, SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드의 부분; 또는 f) 콜라겐-유사 도메인과 구형 도메인을 포함하고 있는, SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드의 부분으로 이루어지는 군으로부터 선택된 폴리펩티드; 및 (2) 다른 폴리펩티드를 포함한다. 다른 폴리펩티드는 대체 또는 추가의 구형 도메인, 대체 또는 추가의 콜라겐-유사 도메인, 융합 단백질의 분비를 용이하게 하기 위한 신호 펩티드 등일 수 있다. 보체의 구형 도메인은 IgG 에 결합하고, 따라서 zsig39 폴리펩티드, 단편 또는 융합물의 구형 도메인도 유사한 역할을 수행할 수 있다.

아미노산 1 (Met) 에서 아미노산 243 (Ala) 에 걸쳐 있는 zsig39 폴리펩티드; 아미노산 16 (Ser) 또는 19 (Leu) 에서 아미노산 243 (Ala) 에 걸쳐 있는 대체용 성숙한 zsig39 폴리펩티드; 또는 아미노산 1 (Met) 에서 아미노산 15 (Gly) 또는 아미노산 18 (Pro) 에 걸쳐 있는 그것들의 대체 분비 리더 단편이, 세포로부터의 단백질의 분비를 연구하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 이런 측면의 한 바람직한 구체예에서, 성숙한 폴리펩티드는 잠정적인 분비 신호 서열을 가지고 있는 융합 단백질로서 형성되고; 융합 단백질의 발현을 특정할 수 있는 조절 영역을 포함하고 있는 플라스미드가 시험 세포안으로 도입되며; 그리고 성숙한 단백질의 분비가 모니터된다. 본 발명의 이 측면의 다른 바람직한 구체예에서는, 대체 분비 리더 단편이 분비를 위해 선택된 대체 단백질과의 융합 단백질로서 형성되고; 융합 단백질의 발현을 특정할 수 있는 조절 영역을 포함하고 있는 플라스미드가 시험 세포안으로 도입되며; 그리고 단백질의 분비가 모니터된다. 모니터링은 HPLC 등과 같은 당해 기술분야에 공지되어 있는 기법들에 의하여 수행될 수 있다.

고도로 보존된 아미노산들, 특히 zsig39 폴리펩티드의 카르복시-말단 구형 도메인의 고도로 보존된 아미노산들이 새로운 패밀리 구성원들을 확인하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 역전사-중합효소 사슬 반응 (RT-PCR)이 다양한 조직 공급원으로부터 얻어지는 RNA 로부터의 보존된 모티프를 코드화하는 서열을 증폭시키기 위하여 사용될 수 있다. 특히, 보존된 서열들로부터 디자인된 고도로 축퇴성인 프라이머들이 상기 목적을 위해 유용하다. 특히, 다음의 프라이머들이 상기 목적에 대해 유용하다:

1) SEQ ID NO:2 의 아미노산 122-126 (SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 558-575 에 해당함);

2) SEQ ID NO:2 의 아미노산 131-136 (SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 588-605

에 해당함);

3) SEQ ID NO:2 의 아미노산 149-154 (SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 642-659

에 해당함);

4) SEQ ID NO:2 의 아미노산 202-207 (SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 801-818

에 해당함);

5) SEQ ID NO:2 의 아미노산 226-231 (SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 873-890

에 해당함).

본 발명은 또한 상술된 바의 폴리뉴클레오티드를 토대로 한 축퇴성 프로브를 포함한다. 상술된 폴리뉴클레오티드의 보체에 상응하는 프로브도 또한 포함된다.

본 발명의 바람직한 구체예내에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 엄격한 조건하에서, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 본원에서 구체적으로 인용되는 다른 프로브 또는 그것들에 상보하는 서열의 유사한 크기의 영역들과 혼성화할 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH 에서 특이한 서열에 대한 열적 융점 (T_m) 보다 약 5 ℃ 낮게 선택된다. T_m은 완전하게 매치된 프로브에 표적 서열의 50 % 가 혼성화하는 온도이다 (규정된 이온 강도 및 pH 에서). 전형적인 엄격한 조건은 염농도가 pH 7 에서 약 0.03 M 이고, 온도가 최소한 약 60 ℃ 인 상태이다.

당업자들은 유전자 코드의 축퇴성의 관점에서, 상당한 서열 변이가 이들 폴리뉴클레오티드 분자들 사이에서 가능하다는 것을 쉽게 인지할 것이다. SEQ ID NO:10 은 SEQ ID NO:2 의 zsig39 폴리펩티드를 코드화할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드 (아미노산 1-243)를 포함하는 축퇴성 폴리뉴클레오티드 서열이다. 당업자들은 또한 SEQ ID NO:10 의 축퇴성 서열이, T 대신 U 로 치환함으로써 SEQ ID NO:2 를 코드화하는 모든 RNA 서열을 제공한다는 것을 인지할 것이다. 그러므로, SEQ ID NO:10 의 뉴클레오티드 1, 46 또는 55 에서 뉴클레오티드 729 까지에 걸쳐 있는 zsig39 폴리펩티드-코드화 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 포함된다. 또한 본 발명에는 SEQ ID NO:10 의 유사한 영역으로부터 형성된, SEQ ID NO:1 과 관련하여 상술된 바와 같은 단편 및 융합물도 포함되며, 이 때 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 198 내지 926 은 SEQ ID NO:10 의 뉴클레오티드 1 내지 729 에 상응한다. SEQ ID NO:10 의 기호는 하기 표 1 에 요약한다.

뉴클레오티드	레졸루션	보체	레졸루션
A	A	T	T
C	C	G	G
G	G	C	C
T	T	A	A
R	A/G	Y	C/T
Y	C/T	R	A/G
M	A/C	K	G/T
K	G/T	M	A/C
S	C/G	W	A/T
W	A/T	S	C/G
H	A/C/T	D	A/G/T
B	C/G/T	V	A/C/G
V	A/C/G	B	C/G/T
D	A/G/T	H	A/C/T
N	A/C/G/T	N	A/C/G/T

주어진 아미노산에 대한 모든 가능한 코돈을 포함하는 SEQ ID NO:10 에 사용된 축퇴성 코돈을 하기 표 2 에 나타낸다.

당업자는 각각의 아미노산을 코드화하는 모든 가능한 코돈을 나타내는 촉퇴성 코돈을 결정하는데 약간의 불명료함이 도입됨을 인지할 것이다. 예를 들면, 세린에 대한 축퇴성 코돈 (WSN) 은 어떤 경우에는 아르기닌을 코드화하고 (AGR), 아르기닌에 대한 축퇴성 코돈 (MGN)은 어떤 경우에는 세린을 코드화한다 (AGY). 유사한 관계가 페닐알라닌과 로이신을 코드화하는 코돈들사이에도 존재한다. 그러므로, 축퇴성 서열에 의해 포함되는 일부의 폴리뉴클레오티드는 약간의 부정확한 아미노산을 가질수는 있지만, 당업자는 그러한 잘못된 서열을 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 참조함으로써 쉽게 확인할 수 있을 것이다.

본 발명의 다른 측면으로, 본 발명에는 약학적으로 허용되는 부형제와 결합된 정제된 zsig39 폴리펩티드를 포함하고 있는 약학 조성물이 제공된다. 이 약학 조성물은 포유동물에서 에너지 평형을 조절하기 위하여 또는 내피 세포를 손상으로부터 보호하기 위하여 사용될 것이다.

zsig39 폴리펩티드의 발현 패턴은 내피 세포 조직에서의 발현을 나타낸다. 내피 세포 보호와 관련하여, zsig39 폴리펩티드는 기관 보호에, 냉동 보존을 위하여, 허혈 및/염증으로 인한 손상을 방지하기 위한 수술 에비처리를 위하여 또는 유사한 과정에서 사용될 수 있다. 소장에서의 zsig39 폴리펩티드의 높은 발현 수준은 zsig39 폴리펩티드가 위장 조직을 허혈성 관류 손상으로부터 보호하는 내인성 인자일 수 있음을 시사한다. 허혈성 관류 손상의 래트, 토끼 및 돼지 모델은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, zsig39, 그것의 아고니스트 또는 길항체, 항체, 융합 단백질 및 단편을 평가하는데 사용될 수 있다. 골리노 등은 뉴질랜드 화이트 토끼를 사용한 허혈성 관류 손상의 심근 모델을 문헌에서 설명하고 있다 [Golino et al., Nature Medicine, 2(1): 35-40]. 뉴질랜드 화이트 토끼는 또한 (1) 귀의 중심 정맥의 허혈성 관류 모델에 및 (2) 혈류가 풍선 혈관형성 (ballon angioplasty)에 의하여 원상태로 회복되는 아테로마성 동맥경화증 대퇴 동맥 손상 모델에 사용되었다 [Winn et al., J. Clin. Invest., 92: 2042-2047, 1993; 및 Jang et al., Circulation, 92(10):3041-3050, 1995].

소화관 허혈의 래트 모델이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 체중이 225 내지 400 그람 되는 수컷의 스프라그 도울리 (Sprague Dawley) 래트가 제한 우리 (restraining cages) 안에 조용하게 앉아있는 지와 관련하여 3 회의 훈련 기간이 진행된다. 다음에, 래트를 생존 수술하고, 그 동안 경정맥 카테테르를 심어놓는다. 생존 수술을 위해서는 래트를 마취시키고, 개방 (patency)이 유지되도록 선택된 조건하에서 카테테르가 이식된다. 그런 다음 래트들은 제한 우리안에 넣어지고 하기에 설명되는 바와 같이 시험 조성물 또는 부형제를 투여받는다. 래트들은 48 시간동안 회복되도록 방치된 후 4 일후에 부형제 또는 시험 조성물로 1 일에 1 회 정맥내 거환 주사 (0.5 ml)를 투여받는다. 래트들을 바람직하게는 16 내지 24 시간동안 단식시킨 후, 마취시키고, 4 번째 주사전에 진통제를 투여한다. 4 번째 주사후 30 분 후에 각각의 래트의 복강을 작게 절개하여 열고, 상위의 장간막 동맥을 단리하여 1 시간동안 클램프로 죄어 놓는다. 복강을 클램프로 죄어놓는 동안 느슨하게 봉합하여 막아놓고, 다시 열어서 클램프를 제거하고, 다시 느슨하게 봉합하여 폐쇄시킨다. 래트들을 2 시간의 관류 기간동안 37 ℃ 가열 패드위에 유지되고 있는 보유 우리안에 넣는다. 관류 기간이 끝난 후에, 래트들을 희생시키고, 공장 (jejunal intestinal) 절편을 절개한다. 일부의 절개된 장 절편에 대하여 조직학적 평가를 하고 나머지에 대해서는 미엘로페록시다제 (MPO) 및 말타아제 활성에 대하여 분석한다.

MPO 는 조직안으로 호중구가 침입하는 양의 척도인 반면 말타아제 활성은 장 점막의 무결성 (integrity)의 척도이다. 허혈성 관류 손상은 증가된 MPO 의 수준 및 말타아제 활성의 감소된 수준과 관련된다. 따라서, 허혈성 관류 손상의 개선은 감소된 MPO 및 증가된 말타아제 활성을 초래하는 것으로 예상된다.

또한, zsig39 폴리펩티드는 시상하부 핵에서 발현되는데, 이것은 zsig39 폴리펩티드 또는 그것의 아고니스트가 만성적으로 활성인 세포에 대하여 억제성 자극체를 전달함으로써 탄도학적 이동의 내인성 억제제일 수 있음을 시사한다. 그러한 탄도학적 이동은 시상하부 핵의 병변으로부터 유발된다. zsig39 폴리펩티드, 그것의 아고니스트 또는 길항체, 항체, 융합 단백질 및 단편의 탄도학적 이동을 억제하는 효력에 대한 평가는 당해 기술분야에 공지된 기법들을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 정위 (stereotactic) 기구들이 시상하부 핵을 병변화하기 위하여 사용될 수 있으며; 만약 탄도학적 이동이 관찰된다면 zsig39 폴리펩티드, 그것의 아고니스트 또는 길항체, 항체, 융합 단백질 또는 단편들이 투여되며; 탄도학적 이동의 어떠한 조절도 주지된다.

에너지 평형을 조절하는 것과 관련하여, zsig39 폴리펩티드는 세포의 대사 반응을 조절한다. 그러한 대사적 반응으로는 지방생성 (adipogenesis), 당신생, 글리코겐 가수분해, 지질 생성, 글루코오스 흡수, 단백질 합성, 열발생, 산소 활용 등이 있다. 당해 기술분야에 공지된 또는 본원에서 설명되는 다른 방법들중에서도, 포유동물의 에너지 평형은 하나 또는 그 이상의 다음의 상기 언급된 대사적 기능을 모니터링함으로써 평가될 수 있다. 이들 대사적 기능들은 하기에서 보다 더 상세하게 설명되는 바와 같이, 당업자에게 공지되어 있는 기법들 (검정 또는 동물 모델)에 의해 모니터된다. 예를 들어, 인슐린의 당조절 효과는 간, 골격근 및 지방 조직에서 현저하게 발휘된다. 인슐린은 이들 세가지의 조직에서 인슐린의 세포 수용체와 결합하여 조직-특이적인 작용을 개시하며, 그 결과 예를 들면 글루코오스 생성의 억제 및 글루코오스 활용의 자극이 유발된다. 간에서 인슐린은 글루코오스 흡수를 자극하고, 당신생 및 글리코겐 가수분해를 억제한다. 골격근 및 지방 조직에서는, 인슐린은 글루코오스의 흡수, 저장 및 활용을 자극하기 위해 작용한다.

당해 기술분야에 인지되어 있는 방법들은 상기 언급된 대사적 기능 모두를 모니터링하기 위한 것이다. 그러므로, 당업자는 대사적 조절 기능에 대하여 zsig39 폴리펩티드, 단편, 융합 단백질, 항체, 아고니스트 및 길항체를 평가할 수 있다. 예시적인 조절 기법들은 하기에 설명된다.

지방 생성, 당신생 및 글리코겐 가수분해는 포유동물의 에너지 평형의 성분들과 상호 관련이 있으며, 예를 들면 ob/ob 마우스들 또는 db/db 마우스들을 사용하여 공지된 기법들에 의하여 평가될 수 있다. ob/ob 마우스들은 ob (비만) 유전자좌에서의 비활성화 돌연변이를 위하여 동형접합식으로 동계교배된 마우스들이다. 그러한 ob/ob 마우스들은 비정상적으로 많이 먹고 대사기능이 저하되며, 순환하는 OB 단백질의 생성이 결핍된 것으로 여겨진다. db/db 마우스들은 db (당뇨) 유전자좌에서의 비활성화 돌연변이를 위하여 동형접합식으로 동계교배된 마우스들이다. db/db 마우스들은 ob/ob 마우스들과 유사한 표현형을 나타내는데, 단 db/db 마우스들은 또한 당뇨성 표현형을 나타내기도 한다. 그러한 db/db 마우스들은 순환하는 OB 단백질의 효과에 대하여 내성인 것으로 여겨진다. 또한 이들 매개변수들을 평가하는 다양한 시험관내 방법들도 당해 기술분야에 공지이다.

인슐린-자극된 지질 생성은 예를 들면¹⁴C-아세테이트의 트리글리세리드 안으로의 통합 [Mackall et al., J. Biol. Chem. 251: 6462-6464, 1976] 또는 트리글리세리드 축적 [Kletzien et al., Mol. Pharmacol. 41: 393-398, 1992]을 측정함으로써 모니터될 수 있다.

글루코오스 흡수는 예를 들면 인슐린-자극된 글루코오스 수송에 대한 검정법으로 평가될 수 있다. 트랜스펙트되지 않고 (non-transfected), 분화된 L6 근관 (G418 없이 유지됨)이 1 g/l 의 글루코오스, 0.5 또는 1.0 % 의 BSA, 20 mM 의 Hepes, 2 mM 의 글루타민이 첨가되어 있는 DMEM 에 넣어진다. 2 내지 5 시간동안 배양된 후에, 배지는 0.5 또는 1.0 % 의 BSA, 20 mM 의 Hepes, 1 mM 의 피루브산염, 및 2 mM 의 글루타민이 함유되어 있는 새로운, 글루코오스가 없는 DMEM 배지로 교체된다. 여기에 적절한 농도의 인슐린 또는 IGF-1, 또는 시험 물질의 일련의 희석액이 첨가되고, 세포는 20 내지 30 분동안 인큐베이션된다.³H 또는¹⁴C-표지된 데옥시글루코오스가 약 50 1 M 최종 농도로 첨가되고, 세포는 대략 10 내지 30 분동안 인큐베이션된다. 그런 다음 세포는 저온 완충액 (예컨대 PBS)으로 빠르게 세정된 후, 적당한 용해제 (예컨대 1 % SDS 또는 1 N NaOH)로 용해된다. 그런 다음 세포 용해물이 신틸레이션 카운터에서 카운팅됨으로써 평가된다. 세포-결합된 방사능은, 세포를 글루코오스 수송의 억제제인 시토콜라신 b 의 존재하에 인큐베이션함으로써 측정되는 바와 같은 비-특이적인 결합을 뺀 후의 글루코오스 수송의 척도로서 취한다. 다른 방법들로는 문헌에 설명된 방법들이 있다 [Manchester et al., Am. J. Physiol. 266 (Endocrinol. Metab. 29): E326-E333, 1994 (인슐린-자극된 글루코오스 수송)].

지방산 대사는 또한 당해 기술분야에 공지된 기법들에 의하여 모니터될 수 있다. 특히, 심장에 의한 지방산의 흡수 및 대사에 대하여 모니터된다. 적당한 동물 모델 및 조직이 활용가능하다. 배양된 세포는 심장 섬유아세포 및 심근세포를 포함한다. 수립된 셀라인으로는 NIH 3T3 섬유아세포 (ATCC No. CRL-1658), CHH-1 연어 심장 세포 (ATCC No. CRL-1680) 및 H9c2 래트 심장 근아세포 (ATCC No. CRL-1446)가 있다. 심장 세포 연령으로서 지방산 대사로부터 글루코오스 대사로의 이동 (shift)이 있다는 것이 증명되었다 [Sack et al., Circulation 94: 2837-2842, 1996].

단백질 합성은 예를 들면, 시험 세포를³⁵S-메티오닌 및 잠정적인 단백질 합성의 조절제와 함께 인큐베이션한 후에³⁵S-메티오닌-표지된 단백질의 침전을 비교함으로써 평가될 수 있다.

열발생은 문헌에 발표된 방법들에 의하여 평가될 수 있다 [B. Stanley in The Biology of Neuropeptide Y and Related Peptides, W. Colmers and C. Wahlestedt (eds.), Humana Press, Ottawa, 1993, pp. 457-509; C. Billington et al., Am. J. Physiol. 260: R321, 1991; N. Zarjevski et al., Endocrinology 133: 1753, 1993; C. Billington et al., Am. J. Physiol. 266: R1765, 1994; Heller et al., Am. J. Physiol. 252(4 Pt 2): R661-667, 1987; 및 Heller et al., Am. J. Physiol. 245(3): R321-328, 1983]. 또한, 다양한 기법에 의해 측정될 수 있는 대사율은 열발생의 간접적인 척도이다.

산소 활용은 헬러 등의 방법에 의하여 평가될 수 있다 [Heller et al., Pflugers Arch 369(1): 55-59, 1977]. 이 방법은 또한 시상하부의 온도 및 대사 열 발생의 분석을 포함한다. 산소 활용 및 열조절은 또한 문헌에 소개된 바와 같이 사람에게서 평가되었다 [Haskell et al., J. Appl. Physiol. 51(4): 948-954, 1981].

불수의 (involuntary) 기능 (즉, 연수)에 포함된 심장 및 뇌 조직에서의 zsig39 폴리펩티드의 발현은 단백질이 아세틸콜린 및/또는 노르에피네프린 방출을 조절할 수 있음을 시사한다. 당해 기술분야에 공지된 또는 본원에서 설명되는 다른 방법들중에서도, 포유동물의 내피 세포 조직 보호는 내피 조직의 기능을 모니터링함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 심장 (대동맥)의 기능은 아세틸콜린 방출, 노르에피네프린 방출 또는 유사한 매개변수의 모니터링에 의해 평가될 수 있다. 이들 매개변수들은 하기에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 당업자에게 공지된 기법들 (검정 또는 동물 모델)에 의하여 모니터된다.

아세틸콜린 및 노르에피네프린 방출은 HPLC 에 의하여 모니터될 수 있다. 레비는 관상 동 (coronary sinus) 유출물에서의 노르에피네프린을 측정하는 것에 대하여 설명하였다 [Levy, Electrophysiology of the Sinoatrial and Atrioventricular Nodes, Alan R. Liss, Inc., 187-197, 1998]. 또한, 동물들은 전기적으로 심장 박동이 조율되고, 그 결과는 문헌에 설명된 바와 같이 모니터된다 [Elsner, European Heart Journal 16 (Supplement N) 52-58, 1995, Reiffel and Kuehnert, PACE 17(Part 1): 349-365, 1994].

zsig39 폴리펩티드는 또한 교감 또는 부교감 신경시스템과 관련된 조직에서의 폴리펩티드의 발현에 의해 나타나는 바와 같이 신경전달물질로서 또는 신경전달의 조절자로서도 사용될 수 있다. 이런 관점에서, zsig39 폴리펩티드는 예를 들면 뇌 등에서의 2-데옥시-글루코오스 흡수에 의해 증명되는 바와 같이, 영양물질 흡수를 조절하는 데에도 사용될 수 있다.

당해 기술분야에 공지된 또는 본원에서 설명되는 다른 방법들중에서도, 신경 전달 기능은 뇌에서의 2-데옥시-글루코오스 흡수를 모니터링함으로써 평가될 수 있다. 이 매개변수는 당업자에게 공지되어 있는 기법 (검정 또는 동물 모델), 예컨대 방사성 사진에 의하여 모니터된다. 유용한 모니터링 기법은 예컨대 킬더프 등에 의해 문헌에서 설명되었고 [Kilduff et al., J. Neurosci. 10: 2463-2475, 1990], "동면하는 심장" 을 평가하기 위해 사용된 관련 기법들도 또한 문헌에 설명되어 있다 [Gerber et al., Circulation 94(4): 651-658, 1996, Fallavollita et al., Circulation 95(7): 1900-1909, 1997].

또한, zsig39 폴리펩티드, 그것의 단편, 융합물, 아고니스트 또는 길항체는 항-미생물 또는 신경 전달물질-조절된 적용에 대해 치료적으로 유용할 수 있다. 예를 들어, 보체 성분 C1q 는 박테리아 및 바이러스와 같은 감염성 병원체에 대항하는 숙주의 방어기작에 역할을 담당한다. C1q 는 여러 가지 특수한 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, C1q 는 결합된 항체 또는 C-반응성 단백질 (CRP)과의 상호작용을 통하여 보체 캐스케이드를 야기한다. 또한, C1q 는 특정 박테리아, RNA 바이러스, 마이코플라스마, 뇨산 결정, 박테리아 내독소의 지질 A 성분 및 특정 세포내 소기관들의 막과 직접적으로 상호작용한다. C1q 수용체에 대한 C1q 결합은 식균 작용을 촉진시키는 것으로 여겨진다. C1q 는 또한 숙주 방어 시스템의 항체 형성 측면을 증강시키는 것으로 나타난다 [Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12(11): 933-941, 1993]. 그러므로, 가용성 C1q-유사 분자들은 감염성 병원체의 용해 또는 식균 작용을 촉진하는 항-미생물제로서 유용할 것이다.

본 발명의 zsig39 폴리펩티드는 또한 신경 전달을 조절하는 것으로 믿어지는 부분들과 상동성을 나타낸다. 도 1 에 도시되어 있는 바와 같이, zsig39 폴리펩티드는 다음의 단백질들과 상동한다: HP25_TAMAS (SEQ ID NO:5) [Takamatsu et al., Mol. Cell. Biol. 13:1516-1521, 1993; Kondo ＆ Kondo, J. Biol. Chem. 267: 473-478, 1992]; HP27_TAMAS (SEQ ID NO:6)[Takamatsu et al. 및 Kondo ＆ Kondo, 상기 동일]; 및 CERL_RAT (SEQ ID NO:7)[Wada ＆ Ohtani, Brain Res. Mol. Brain Res. 9:71-77, 1991]. HP25 및 HP27 은 동면하는 시베리아산 우드척의 활성 (여름철) 혈청에서 발견되는 폴리펩티드이다. CERL 은 래트의 소뇌에 존재한다. 그러므로, zsig39 폴리펩티드, 단편, 융합물, 아고니스트 또는 길항체는 예를 들면 신경전달물질 또는 그것에 대한 수용체에 결합함으로써 신경전달을 조절하는데 유용할 것이다.

방사선 혼성체 지도화는 포유동물 염색체의 고해상도의 연속적인 지도를 제조할 목적으로 개발된 체세포 유전적 기법이다 [Cox et al., Science 250:245-250, 1990]. 유전자의 서열에 대한 부분적인 또는 완전한 지식으로 염색체의 방사선 혼성체 지도화 패널과 함께 사용하기에 적당한 PCR 프라이머를 디자인하는 것이 가능해진다. 전체적인 사람 게놈을 커버하는 상업적으로 구할 수 있는 방사선 혼성체 지도화 패널, 예컨대 스탠포드 G3 RH 패널 (Stanford G3 RH Panel) 및 진브릿지 4 RH 패널 (GeneBridge 4 RH Panel) (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL)이 활용가능하다. 이들 패널은 유전자, 서열-태그 부착 (tagged) 부위 (STS), 및 관심의 영역내에 있는 다른 비다형태- 및 다형태 마아커들의 신속하고, PCR 을 토대로 한, 염색체상의 정위 및 순서 확인을 가능하게 한다. 이것은 새롭게 발견된 관심의 유전자와 기존의 지도화되어 있는 마아커 사이에 비례적인 물리적 거리를 직접적으로 수립하는 것을 포함한다. 유전자의 위치에 대한 정확한 지식은 다음 사항을 포함한 여러 가지 방법에 유용할 수 있다: 1) 서열이 기존의 콘티그의 일부인지를 측정하고, YAC-, BAC- 또는 cDNA 클론과 같은 다양한 형태의 추가의 주변 유전적 서열을 얻는 일, 2) 동일한 염색체상의 영역에 대한 결합을 보여주는 유전하는 질병에 대한 가능한 후보 유전자를 제공하는 것, 및 3) 특별한 유전자가 어떤 기능을 가질 것인지를 측정하는 것을 도와주는데 유익할 마우스와 같은 참조 모델 유기체를 위하여.

그 결과 zsig39 폴리펩티드를 코드화하는 유전자가 WICGR 방사선 혼성체 지도상에서 사람 염색체 11 결합 기의 상부로부터 549.99 cR_3000 에 위치한 것으로 나타났다. 가까운 쪽의 및 먼 쪽의 프레임워크 마아커는 각각 AFMB048ZA9 및 FB17D4 였다. 주변의 마아커들은 통합된 LDB 염색체 11 지도상에서 11q23.3 영역에 zsig39 유전자를 위치시킨다 (The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW server:http://cedar.genetics.soton.ac. uk/public_html/).

본 발명은 또한 진단 용도로 사용될 시약을 제공한다. 예를 들어, zsig39 유전자, zsig39 DNA 또는 RNA 를 포함하고 있는 프로브, 또는 그것의 하위서열이, zsig39 유전자가 염색체 11 상에 존재하는지의 여부를 측정하기 위하여 또는 돌연변이가 발생하였는지의 여부를 측정하기 위하여 사용될 수 있다. zsig39 유전자 유전자좌에서의 검출가능한 염색체상의 변형으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 이수체 (aneuploidy), 유전자 복사수의 변화, 삽입, 결실, 제한 부위 변화 및 재배열이 있다.

일반적으로, 이들 진단 방법은 (a) 환자로부터 유전자 샘플을 얻는 단계; (b) 유전자 샘플을 상술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머와 함께, 폴리뉴클레오티드가 상보하는 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화할 조건하에서 인큐베이션시킴으로써 첫 번째 반응 생성물을 제조하는 단계; 그리고 (c) 첫 번째 반응 생성물을 대조 반응 생성물과 비교하는 단계로 이루어진다. 첫 번째 반응 생성물과 대조 반응 생성물 사이의 차이는 환자의 유전자 비정상을 가리킨다. 본 발명내에서 사용하기 위한 유전자 샘플로는 게놈성 DNA, cDNA, 및 RNA 가 있다. 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는 RNA 또는 DNA 일 수 있으며, SEQ ID NO:1 의 부분, SEQ ID NO:1 의 보체, 또는 그것의 RNA 동등물을 포함할 것이다. 이런 관점에서 적당한 검정 방법으로는 당해 기술분야에 공지되어 있는 분자 유전자 기법, 예를 들면 제한 단편 길이 다형태화 (RFLP) 분석, PCR 기법을 사용하는 짧은 탠덤 반복단위 (STR) 분석, 결찰 사슬 반응 [Barany, PCR Methods and Applications 1: 5-16, 1997], 리보뉴클레아제 보호 검정, 및 기술분야에 공지되어 있는 다른 유전자 결합 분석 기법이 있다 [Sambrook et al., 상기 동일; Ausubel et al., 상기 동일; Marian, Chest 108: 255-265, 1995]. 리보뉴클레아제 보호 검정법 [Ausubel et al., 상기 동일, CH. 4] 은 RNA 프로브가 환자의 RNA 샘플에 혼성화하고 그런 다음 반응 생성물 (RNA-RNA 혼성체)이 RNase 에 노출되는 것을 포함한다. RNA 의 혼성화된 영역은 소화로부터 보호받는다. PCR 검정법내에서, 환자의 유전자 샘플은 한 쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머와 함께 인큐베이션되고, 프라이머들 사이의 영역은 증폭되며 회수된다. 회수된 생성물의 크기 또는 양의 변화는 환자의 돌연변이를 나타낸다. 사용될 수 있는 다른 PCR 기법은 단일 가닥 형태 다형태화 (SSCP) 분석법이다 [Hayashi, PCR Methods and Applications 1: 34-38, 1991].

Zsig39 폴리펩티드는 포유동물의 에너지 효율을 분석하는데 사용될 수 있다. 혈청 또는 조직 샘플중에서 발견되는 zsig39 폴리펩티드는 포유동물의 영양물을 저장하는 능력을 가리킬 수 있으며, 보다 고도로 효율적인 포유류가 비만해지는 경향이 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 하기 단계들로 이루어지는 zsig39 폴리펩티드의 검출 방법을 포함한다:

아마도 zsig39 폴리펩티드를 함유하고 있는 샘플을 고체 지지체에 부착된 항체에 노출시킴으로써 상기 항체가 zsig39 폴리펩티드의 에피토프에 결합되는 단계;

상기 고정된 항체-폴리펩티드를 세척하여 결합되지 않은 오염물을 제거하는 단계;

고정된 항체-폴리펩티드를 zsig39 폴리펩티드의 두 번째 에피토프에 대해 특정된 두 번째 항체에 노출시킴으로써,두 번째 항체가 검출가능한 표지와 결합하는 단계; 그리고

검출가능한 표지를 검출하는 단계.

시험 샘플중의 zsig39 폴리펩티드의 농도는 포유동물의 에너지 효율을 가리키는 것으로 여겨진다. 이 정보는 포유동물의 영양학적 분석을 도와줄 수 있다. 잠재적으로, 이 정보는 에너지 결핍 조직을 확인하고 및/또는 표적화하는데 유용할 것이다.

하기에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, zsig39 를 받은 마우스들은 혈청내의 유리 지방산의 수준은 감소되고 뼈중의 지방은 증가한 것으로 발견되었다. 지방산은 트리글리세리드안에 통합되고 지방으로서 저장된다. 저장된 지방은 신체의 열 손실을 방지하고 내부 기관을 보호한다. 지방은 또한 저장된 지방의 창고로서 작용한다. 지방산은 에너지 대사에 사용하기 위하여 호르몬-조절된 리파아제에 의하여 트리글리세리드로부터 방출된다. 유리 지방산 수준의 감소는 zsig39 가 유리 지방산의 흡수 및 대사에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. zsig39 는 예컨대 호르몬성 리파아제의 작용을 억제함에 의하여 지방 저장고로부터의 지방산의 방출을 억제하는 작용을 한다. zsig39 는 또한 지방산 흡수, 대사 및 저장을 증강시키는 작용을 할 수 있다. zsig39 는 독립적으로, 또는 예컨대 인슐린과 같은 다른 분자들과 협력하여 지방 용해를 억제하고, 지방산 흡수 및/또는 대사를 증강시킬 수 있다. 그러므로 본 발명은 그러한 처리가 필요한 개체에게 약학적으로 효과적인 용량의 zsig39 폴리펩티드를 투여함으로써, 그러한 처리가 요구되는 개체에서 유리 지방산 대사를 조절하는 방법을 제공한다. zsig39 폴리펩티드의 "약학적으로 효과적인 양" 은 원하는 생물학적 결과를 유도하기에 충분한 양이다. 그 결과는 질병의 신호, 증상, 또는 원인의 경감, 또는 생물학적 시스템의 어떠한 다른 원하는 변경일 수 있다. 예를 들면, zsig39 폴리펩티드, 아고니스트 또는 길항체의 효과적인 양은 임상의사 또는 다른 자질이 갖춰진 관찰자에 의해 주지되는 바 객관적인 증상의 완화 또는 주관적으로 식별 가능한 개선을 제공하는 양이다. 특히, zsig39 폴리펩티드의 그러한 효과적인 양은 혈청내 유리 지방산 수준의 감소 또는 다른 유익한 효과를 초래한다. zsig39 폴리펩티드의 효과적인 양은 치료될 질병 또는 증상에 따라 광범위하게 다를 것이다. 투여될 폴리펩티드의 양, 및 그것의 제형내의 농도는 선택되는 부형제, 투여 경로, 특정 폴리펩티드의 잠재력, 환자의 임상적인 상태, 부작용 및 제형중의 화합물의 안정성에 따라 좌우된다. 그러므로, 임상의사는 대상이 되는 환장의 임상적인 경험 또는 유사한 환자의 임상적인 경험에 따라, 투여되는 제형의 양 뿐만 아니라 제형중의 적절한 농도를 함유하고 있는 적절한 제제를 사용할 것이다. 그러한 양은 부분적으로는 환자의 치료될 특정 상태, 연령, 체중, 및 일반적인 건강 상태, 및 당업자들에게 명백한 다른 인자들에 따라 좌우될 것이다.

본 발명의 추가의 측면으로, 상술된 zsig39 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 합성된 결합 단백질 (예컨대 파지 디스플레이, 대장균 Fab, 등에 의하여 생성된 것들)이 제공된다. 그러한 항체들은, 본원에 설명된 바 다른 용도들중에서도, 항-이디오타입 항체의 제조에 유용하다. 합성된 결합 단백질들은 상업적으로 활용가능한 키트를 사용하는 파지 디스플레이에 의하여, 에컨대 뉴 잉글랜드 바이오랩스사 (New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts)로부터 구입할 수 있는 Ph.D.^TM파지 디스플레이 펩티드 라이브러리 키트를 사용하여 제조될 수 있다. 파지 디스플레이 기법은 예를 들면 미국 특허 제 5,223,409 호, 5,403,484 호 및 5,571,698 호에 설명되어 있다.

본 발명의 추가의 측면은 상술된 zsig39 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항체를 확인하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 아고니스트 또는 길항체는 본원에서 한층 더 논의되는 바와 같이 가치있는 성질을 가질 것이다. 한 구체예에서, zsig39 폴리펩티드 아고니스트를 확인하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 zsig39 폴리펩티드 아고니스트에 반응을 보이는 세포를 제공하는 단계, 그 세포를 시험 화합물의 존재하에 배양하고 zsig39 폴리펩티드의 존재하에 배양된 세포와 세포 반응을 비교하는 단계, 그리고 세포 반응이 동일한 유형인 시험 화합물을 선택하는 단계로 이루어진다.

다른 구체예에서는, zsig39 폴리펩티드의 길항체를 확인하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 zsig39 폴리펩티드에 반응하는 세포를 제공하는 단계, 첫 번째 부분의 세포를 zsig39 폴리펩티드의 존재하에 배양하는 단계, 두 번째 부분의 세포를 zsig39 폴리펩티드 및 시험 화합물의 존재하에 배양하는 단계, 그리고 세포의 첫 번째 부분과 비교하여 세포의 두 번째 부분의 세포 반응의 감소를 검출하는 단계로 이루어진다.

본원에서 설명되는 그런 검정법 외에, 샘플은 수용체 결합 또는 zsig39-의존성 세포 반응의 자극/억제를 측정하기 위하여 디자인된 다양한 검정법내에서 zsig39 활성의 억제에 대하여 시험될 수 있다. 예를 들어, zsig39-반응성 셀라인은 zsig39-자극된 세포 경로에 반응하는 리포터 유전자 구성물에 의하여 형질전환될 수 있다. 이런 유형의 리포터 유전자 구성물은 당해 기술분야에 공지이며, 일반적으로 루시페라제와 같은 검정가능한 단백질을 코드화하는 유전자에 작동가능하게 연결된 zsig39-DNA 반응 엘레먼트를 포함할 것이다. DNA 반응 엘레먼트로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 원형 AMP 반응 엘레먼트 (CRE), 호르몬 반응 엘레먼트 (HRE), 인슐린 반응 엘레먼트 (IRE) [Nasrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5273-5277, 1990] 및 혈청 반응 엘레먼트 (SRE) [Shaw et al., Cell 56: 563-572, 1989]가 있다. 원형 AMP 반응 엘레먼트는 문헌에서 개략적으로 설명된다 [Roestler et al., J. Biol. Chem. 263 (19): 9063-9066, 1988 및 Habener, Molec. Endocrinol. 4 (8): 1087-1094, 1990]. 호르몬 반응 엘레먼트에 대해서도 문헌에 설명되어 있다 [Beato, Cell 56: 335-344, 1989]. 후보 화합물, 용액, 혼합물 또는 추출물이, 리포터 유전자 발현의 zsig39 자극의 감소에 의해 증명되는 바와 같이 표적 세포에 대한 zsig39 의 활성을 억제하는 능력에 대해 시험된다. 이런 유형의 검정으로 직접적으로 세포-표면 수용체에 대한 zsig39 결합을 차단하는 화합물, 및 수용체-리간드 결합에 이어지는 세포 경로에서의 과정을 차단하는 화합물을 검출하게 될 것이다. 또는 달리, 화합물들 또는 다른 샘플들은 검출가능한 표지 (예컨대¹²⁵I, 비오틴, 양고추냉이 과산화효소, FITC, 등)로 태그를 붙인 zsig39 을 사용하여 수용체에 대한 zsig39 의 결합을 직접적으로 차단하기 위하여 시험될 수 있다. 이런 유형의 검정법에서, 수용체에 대한 표지된 zsig39 의 결합을 억제하는 샘플의 능력은 억제 능력을 가리키는 것이며, 그것은 2 차 검정을 통하여 확인될 수 있다. 결합 검정법에 사용된 수용체는 세포 수용체이거나 또는 단리된, 고정된 수용체일 수 있다.

본 발명의 추가의 측면은 인슐린을 연구하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 그러한 방법은 함지방세포를 zsig39 폴리펩티드, 그것의 단클론성 항체, 아고니스트 또는 길항체와 함께 인슐린이 있거나 없는 배양 배지중에서 인큐베이션하고, 함지방세포 단백질의 분비 또는 분화의 변화를 관찰하는 것을 포함한다.

항-미생물 보호제는 직접적으로 작용하거나 또는 간접적으로 작용할 수 있다. 막 결합 또는 작용의 기공 형성 메카니즘을 통하여 작동하는 그러한 제제들은 직접 해로운 미생물에 부착된다. 항-미생물제는 또한 미생물의 보호 물질을 파괴하거나 또는 그것의 세포벽/막을 파괴하는 효소적 메카니즘을 통하여 작용할 수 있다. 미생물 증식 또는 작용을 억제할 수 있거나 또는 상술된 어느 하나의 메카니즘에 의한 미생물 통합성을 파괴할 수 있는 항-미생물제는 그 항-미생물 활성에 민감한 미생물에 의한 세포 배양물의 오염을 방지하기 위한 방법에 유용하다. 그러한 기법들은 유효량의 상기 zsig39 폴리펩티드 또는 그것의 아고니스트 또는 길항체의 존재하에 세포를 배양하는 것을 포함한다.

또한, zsig39 폴리펩티드 또는 그것의 아고니스트는 외인성 미생물 감염, 예컨대 박테리아, 바이러스 또는 진균류 감염의 시험관내 연구에서 세포 배양 시약으로서도 사용될 수 있다. 그러한 부분들은 또한 감염의 생체내 동물 모델에서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 포유동물의 세포 대사를 연구하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 그러한 방법은 연구될 세포, 예를 들면 사람 심장 내피 세포를, zsig39 폴리펩티드, 단클론성 항체, 그것들의 아고니스트 또는 길항체의 존재 또는 부재시에 인큐베이션하고, 지방생성, 당신생, 글리코겐 가수분해, 지질생성, 글루코오스 흡수, 등의 변화를 관찰하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 측면으로 이량체화 또는 올리고머화를 연구하기 위한 방법이 제공된다. 본 발명의 그러한 방법은 콜라겐-유사 도메인을 단독으로 또는 콜라겐-유사 도메인을 포함하는 다른 폴리펩티드와 함께 함유하고 있는 zsig39 폴리펩티드, 또는 그것의 단편 또는 융합 단백질을 인큐베이션하고, 콜라겐-유사 도메인들 사이에 형성된 결합을 관찰하는 것을 포함한다. 그러한 결합은 HPLC, 원형 이색성 등에 의하여 표시된다.

앞서 설명된 바와 같이, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA 를 포함한다. DNA 및 RNA 를 단리하는 방법은 당해 기술분야에 공지이다. RNA 는 뇌종양, 심장, 태반, 지방 조직 등으로부터 단리되는 것이 일반적으로 바람직하지만, DNA 는 또한 다른 조직으로부터 얻어지는 RNA 를 사용하여 제조되거나 또는 게놈성 DNA 로서 단리될 수도 있다. 총 RNA 는 구아니딘 HCl 추출과 이어지는 CsCl 구배에서의 원심분리에 의한 단리에 의하여 제조될 수 있다 [Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979]. 폴리 (A)+ RNA 는 총 RNA 로부터 아비브와 레더의 방법을 사용하여 제조된다 [Aviv ＆ Leder Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-142, 1972]. 상보하는 DNA (cDNA) 는 공지 방법을 사용하여 폴리 (A)+ RNA 로부터 제조된다. 그런 다음 zsig39 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드가 예를 들면, 혼성화 또는 PCR 에 의하여 확인되고 단리된다.

본 발명은 추가로 다른 종으로부터 얻어지는 대응 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 (오르토로그)를 제공한다. 이들 종으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 포유동물, 조류, 양서류, 파충류, 어류, 곤충 및 다른 척추동물 및 무척추동물 종이 있다. 특히 관심의 대상이 되는 것은 쥐, 래트, 돼지, 양, 소, 개, 고양이, 말 및 다른 영장류의 단백질로부터 얻어지는 zsig39 폴리펩티드이다. 사람 단백질의 오르토로그는 본 발명에 의해 제공되는 정보 및 조성을 종래의 클로닝 기법과 조합하여 사용함으로써 클론될 수 있다. 예를 들면, cDNA 는 단백질을 발현하는 조직 또는 세포 유형으로부터 얻어지는 mRNA 를 사용하여 클론될 수 있다. mRNA 의 적당한 공급원은 노던 블롯을 본원에 개시된 서열로부터 디자인된 프로브를 사용하여 프로브함으로써 확인될 수 있다. 그런 다음 포지티브 조직 또는 셀라인의 mRNA 로부터 라이브러리가 제조된다. 그런 다음 zsig39 폴리펩티드를 코드화하는 cDNA 가 다양한 방법에 의하여, 예컨대 완전한 또는 부분적인 사람 cDNA 를 사용하거나 또는 개시된 서열을 토대로 한 축퇴성 프로브의 하나 또는 그 이상의 세트를 사용한 프로빙에 의해 단리될 수 있다. cDNA 는 또한 중합효소 사슬 반응을 사용하여, 또는 본원에 개시된 서열로부터 디자인된 프라이머를 사용하는 PCR (미국 특허 제 4,683,202 호)을 사용하여 클론될 수 있다. 추가의 방법에서, cDNA 라이브러리는 숙주 세포를 형질전환시키기 위하여 사용될 수 있으며, 관심의 cDNA 의 발현은 zsig39 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 유사한 기법이 또한 게놈성 클론의 단리에도 적용될 수 있다.

당업자들은 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 에 개시된 서열들이 사람 zsig39 DNA 및 단백질의 단일한 대립형질을 나타내며, 대립성 변이 및 대체 스플라이싱이 일어날 것으로 예상된다는 것을 인지하게 될 것이다. 이 서열의 대립성 변이체는 표준 과정에 따라 상이한 개체로부터 얻어진 cDNA 또는 게놈성 라이브러리를 프로브함으로써 클론될 수 있다. 사일런트 돌연변이를 함유하는 것과 돌연변이 결과 아미노산 서열이 변화하는 것들을 포함하여, SEQ ID NO:1 에 표시된 DNA 서열의 대립성 변이체들은, SEQ ID NO:2 의 대립성 변이체인 단백질이 그러한 것처럼 본 발명의 범주내에 있다. zsig39 폴리펩티드의 성질을 보유하고 있는, 대체적으로 스플라이스드된 mRNA 로부터 생성된 cDNA 도, 그러한 cDNA 및 mRNA 에 의해 코드화된 폴리펩티드가 그러한 것처럼 본 발명의 범주내에 포함된다. 이들 서열의 대립성 변이체 및 스플라이스 변이체들은 당해 기술분야에 공지되어 있는 표준 과정을 따라 상이한 개체 또는 조직으로부터 얻어지는 cDNA 또는 게놈성 라이브러리를 프로브함으로써 클론될 수 있다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드 및 그것의 종 오르토로그에 실질적으로 상동하는 단리된 zsig39 폴리펩티드를 제공한다. 용어 "실질적으로 상동하는" 은 본원에서 SEQ ID NO:2 에 도시된 서열 또는 그것의 오르토로그에 대하여 50 %, 바람직하게는 60 %, 보다 바람직하게는 80 % 의 서열 동일성을 가지고 있는 폴리펩티드를 규정하기 위하여 사용된다. 그러한 폴리펩티드들은 SEQ ID NO:2 또는 그것의 오르토로그에 대하여 보다 바람직하게는 최소한 90 %, 가장 바람직하게는 95 % 이상 동일할 것이다. % 서열 동일성은 종래의 방법에 의하여 측정된다 [Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616, 1986 및 Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992]. 간단하게 설명하면, 두 개의 아미노산 서열은 하기 표 3 에 나타낸 바와 같이 10 의 갭 오프닝 페널티, 1 의 갭 연장 페널티, 및 헨니코프와 헨니코프 (상기 동일한 문헌 참조)의 "블로섬 (blosum) 62" 스코어링 매트릭스를 사용하여 배열 스코어를 최적화하기 위하여 배열된다 (아미노산은 표준 한-문자 코드로 표시된다). 그런 다음 % 동일성이 다음과 같이 계산된다:

폴리뉴클레오티드 분자의 서열 동일성은 상기에서 설명된 바와 같은 비율을 사용하여 유사한 방법에 의하여 측정된다.

실질적으로 상동하는 단백질 및 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 가지는 것을 특징으로 한다. 이들 변화는 바람직하게는 보존적인 아미노산 치환인 (표 4 참조) 미약한 성질의 것이고, 다른 치환도 단백질 또는 폴리펩티드의 접힘 또는 활성에 유의할만하게 영향을 주지 않는다; 즉 전형적으로 1 내지 약 30 개의 아미노산의 작은 결실; 및 작은 아미노- 또는 카르복시-말단 연장, 예컨대 아미노-말단 메티오닌 잔기, 약 20 내지 25 잔기까지의 작은 링커 펩티드, 또는 친화성 태그. 친화성 태그를 포함하고 있는 폴리펩티드는 추가로 zsig39 폴리펩티드와 친화성 태그 사이에 단백질 가수분해성 절단 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 그러한 부위로는 트롬빈 절단 부위와 인자 Xa 절단 부위가 있다.

보존성 아미노산 치환

염기성	아르기닌 라이신 히스티딘
산성	글루탐산 아스파르트산
극성	글루타민 아스파라긴
소수성	로이신 이소로이신 발린
방향성	페닐알라닌 트립토판 티로신
작은 크기	글리신 알라닌 세린 트레오닌 메티오닌

본 발명의 단백질들은 또한 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 비-자연적으로 발생하는 아미노산들로는, 제한없이, 트란스-3-메틸프롤린, 2,4-메타노프롤린, 시스-4-히드록시-프롤린, 트란스-4-히드록시프롤린, N-메틸글리신, 알로-트레오닌, 메틸트레오닌, 히드록시에틸시스테인, 히드록시-에틸호모시스테인, 니트로글루타민, 호모글루타민, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 데히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 3,3-디메틸프롤린, tert-로이신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 및 4-플루오로페닐알라닌이 있다. 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 단백질안에 통합시키기 위한 여러 가지 방법들이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA 를 사용하여 넌센스 돌연변이를 억제하는 시험관내 시스템이 사용될 수 있다. 아미노산을 합성하고 tRNA 를 아미노아실화하는 방법들은 당해 기술분야에 공지이다. 넌센스 돌연변이를 포함하고 있는 플라스미드의 전사 및 번역은 E. coli (대장균) S30 추출물 및 상업적으로 구할 수 있는 효소 및 다른 시약들을 포함하고 있는 세포-유리 시스템에서 수행된다. 단백질은 크로마토그래피에 의해 정제된다 [Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-809, 1993; 및 Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-10149, 1993]. 두 번째 방법으로, 번역은 돌연변이된 mRNA 와 화학적으로 아미노아실화된 억제제 tRNA 를 미소주입함에 의해 개구리 난모세포에서 수행된다 [Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-19998, 1996]. 세 번째 방법에서는, E. Coli 세포가 대체될 천연 아미노산 (예컨대 페닐알라닌)이 없는 상태에서, 그리고 원하는 비-자연 발생 아미노산(들) (예컨대 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 또는 4-플루오로페닐알라닌)의 존재하에 배양된다. 비-자연적으로 발생하는 아미노산은 그것의 천연 대응물 대신에 단백질안에 통합된다 [Koide et al., Biochem. 33: 7470-7476, 1994]. 천연적으로 발생하는 아미노산 잔기들은 시험관내 화학적 변형에 의하여 비-자연적으로 발생하는 것들로 전환될 수 있다. 화학적인 변형은 추가로 치환 범위를 연장시키기 위하여 부위-특정 돌연변이생성과 결합될 수 있다 [Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993].

제한된 수의 비-보존성 아미노산, 유전자 코드에 의해 코드화되지 않는 아미노산, 비-자연적으로 발생하는 아미노산, 및 비천연 아미노산들이 zsig39 아미노산 잔기 대신 치환될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 필수 아미노산들은 예컨대 부위-특정 돌연변이 생성 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 생성과 같은 기술분야에 공지되어 있는 과정을 따라 확인될 수 있다 [Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989; Bass et al,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-4502, 1991]. 후자의 기법에서는, 단일한 알라닌 돌연변이가 분자의 모든 잔기에 도입되고, 그 결과의 돌연변이 분자는 분자의 활성에 결정적인 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 하기에서 설명되는 바와 같이 생물학적 활성 (예컨대 에너지 평형을 조절하는 능력)에 대해 시험된다 [Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996]. 리간드-수용체 또는 다른 생물학적 상호작용의 부위들은 또한, 잠재적인 접촉 부위 아미노산의 돌연변이화와 함께 결합시켜 예컨대 핵 자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화 방법을 사용함에 의해 측정되는 바와 같이, 구조의 물리적 분석에 의해 측정될 수 있다 [de Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992]. 필수 아미노산의 확인은 또한 관련된 폴리펩티드와의 상동성에 대한 분석으로부터 추론될 수 있다.

다중 아미노산 치환은 공지의 돌연변이 생성 및 스크린닝 방법, 예컨대 문헌에 설명된 방법들을 사용하여 만들어지고 시험될 수 있다 [Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241: 53-57, 1988 또는 Bowie and Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989]. 간단히 설명하면, 상기 저자들은 폴리펩티드의 둘 또는 그 이상의 위치를 동시에 랜덤화하고, 기능적인 폴리펩티드를 선택한 후, 각각의 위치에서의 허용가능한 치환의 스펙트럼을 결정하기 위하여 돌연변이된 폴리펩티드를 선택하는 방법을 설명하였다. 사용될 수 있는 다른 방법들로는 파지 디스플레이 [예컨대 Lowman et al., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Lander et al., 미국 특허 제 5,223,409 호; Huse, WIPO 공보 WO 92/06204] 및 영역-특정된 돌연변이 생성 [Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988]이 있다.

개시된 zsig39 DNA 및 폴리펩티드 서열의 변이체들은 문헌에 기재된 바와 같이 DNA 셔플링 (shuffling) 을 통하여 생성될 수 있다 [Stemmer, Nature 370: 389-391, 1994; Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751, 1994 및 WIPO 공보 WO 97/20078]. 간단하게 설명하면, 변이체 DNA 들은 모 (parent) DNA 의 무작위 단편화와 이어서 PCR 을 사용하는 재조립에 의한 시험관내 동종 재조합에 의해 생성되고, 그 결과 무작위로 도입된 점 돌연변이가 생성된다. 이 기법은 추가의 변이성을 과정에 도입시키기 위하여 모 DNA 의 패밀리, 예컨대 대립성 변이체 또는 다른 종으로부터의 DNA 를 사용함에 의해 변형될 수 있다. 원하는 활성에 대한 선택 또는 스크리닝, 및 계속되는 돌연변이 생성 및 검정의 추가의 반복으로, 해로운 변화에 대하여 동시에 선택되면서 원하는 돌연변이를 선택함으로써 서열의 신속한 "발전 (evolution)" 이 제공된다.

상술된 바와 같은 돌연변이 생성법은 클론되고 돌연변이된 폴리펩티드의 숙주 세포에서의 활성을 검출하기 위하여, 처리량이 많고 자동화된 스크리닝 방법과 병용될 수 있다. 활성 폴리펩티드 (예컨대 에너지 평형을 조절하는 능력)를 코드화하는 돌연변이된 DNA 분자들은 숙주 세포로부터 회수되어 현대적인 장비를 사용하여 빠르게 서열화될 수 있다. 이들 방법은 관심의 폴리펩티드의 개별적인 아미노산 잔기의 중요성에 대한 신속한 측정을 가능하게 하며, 미지의 구조를 가지고 있는 폴리펩티드에도 적용될 수 있다.

상기에서 논의된 방법들을 사용하여, 당업자는 SEQ ID NO:2 의 잔기 19 에서 243 까지의 잔기 또는 그것의 대립성 변이체에 실질적으로 상동하며 에너지 조절 능력 또는 야생형 단백질의 다른 성질을 보유하는 다양한 폴리펩티드들을 확인 및/또는 제조할 수 있다. 그러한 폴리펩티드들은 추가의 아미노산, 예컨대 Gly-Xaa-Pro 또는 Gly-Xaa-Xaa 유형의 추가의 콜라겐 반복 단위를 포함할 수 있다. 그러한 폴리펩티드들은 또한 일반적으로 상기에서 논의된 바와 같은 추가의 폴리펩티드 절편을 포함할 수 있다.

완전한 길이의 단백질, 그것의 단편 및 융합 단백질을 포함하여, 본 발명의 폴리펩티드들은 종래의 기법을 따라 유전공학적으로 처리된 숙주 세포에서 제조될 수 있다. 적당한 숙주 세포는 외인성 DNA 로 형질전환될 수 있으며, 배양물중에서 성장할 수 있는 그러한 유형의 세포들이며, 그 예로는 박테리아, 진균 세포, 및 배양된 고등 진핵 세포가 있다. 진핵 세포, 특히 다중세포 유기체의 배양된 세포가 바람직하다. 클론된 DNA 분자를 조작하고 외인성 DNA 를 다양한 숙주 세포안에 도입시키는 기법들은 문헌에 설명되어 있다 [Sambrook et al,. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 및 Ausubel et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987].

일반적으로, 본 발명의 zsig39 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열은 그것의 발현에 필요한 다른 유전적 엘레먼트들, 일반적으로 발현 벡터내에 포함된 전사 프로모터 및 터미네이터에 작동가능하게 연결된다. 벡터는 또한 통상적으로 하나 또는 그 이상의 선택가능한 마아커 및 하나 또는 그 이상의 복제 기원을 함유할 수 있지만, 당업자들은 특정 시스템내에 선택가능한 마아커들이 별도의 벡터상에 제공될 수 있으며, 외인성 DNA 의 복제가 숙주 세포 게놈안으로의 통합에 의하여 제공될 수 있음을 인지하게 될 것이다. 프로모터, 터미네이터, 선택가능한 마아커, 벡터 및 다른 엘레먼트들의 선택은 통상적인 기술수준 범위내에 있는 기본적인 디자인 사항이다. 많은 그러한 엘레먼트들이 문헌에 기술되어 있으며 제조회사로부터 구입할 수 있다.

숙주 세포의 분비 경로안에 zsig39 폴리펩티드를 특정하기 위하여, 분비 신호 서열 (또는 리더 서열, 프레프로 서열 또는 프레 서열로서도 언급됨)이 발현 벡터에 제공된다. 분비 신호 서열은 zsig39 폴리펩티드의 분비 신호 서열일 수 있으며, 또는 다른 분비된 단백질 (예컨대 t-PA)로부터 유도되거나 새롭게 합성될 수도 있다. 분비 신호 서열은 정확한 판독 프레임으로 zsig39 폴리펩티드 DNA 서열과 결합되고 숙주 세포의 분비 경로안에 새롭게 합성된 폴리펩티드를 특정하기 위하여 놓여진다. 분비 신호 서열은 통상적으로는 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열의 5' 쪽에 위치하지만, 특정 신호 서열은 관심의 DNA 서열의 그 밖의 곳에 위치할 수도 있다 [Welch et al., 미국 특허 제 5,037,743 호; Holland et al., 미국 특허 제 5,143,830 호].

또는 달리, 본 발명의 폴리펩티드에 함유된 분비 신호 서열은 분비 경로안에 다른 폴리펩티드를 특정하기 위해 사용된다. 본 발명은 그러한 융합 폴리펩티드를 제공한다. 신호 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 1-15 또는 1-19 로부터 유도된 분비 신호 서열이 당해 기술분야에 공지되어 있는 및 본원에서 설명되는 방법들을 사용하여 다른 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되는 경우 만들어질 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드에 함유된 분비 신호 서열은 분비 경로안에 추가의 펩티드를 특정하기 위하여 추가의 펩티드에 아미노-말단쪽으로 융합되는 것이 바람직하다. 그러한 구성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 많은 용도를 가지고 있다. 예를 들면, 이들 신규한 분비 신호 서열 융합 구성물은 정상적으로 분비되지 않는 단백질, 예컨대 수용체의 활성 성분의 분비를 특정할 수 있다. 그러한 융합은 분비 경로를 통하여 펩티드를 특정하기 위하여 생체내에서 또는 시험관내에서 사용될 수 있다.

배양된 포유동물 세포는 또한 본 발명 내에서 적당한 숙주이다. 외인성 DNA 를 포유동물 숙주 세포안에 도입시키기 위한 방법으로는 인산 칼슘-중재된 형질전환법 [Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973], 일렉트로포레이션법 [Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982], DEAE-덱스트란 중재된 형질전환법 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987], 리포솜-중재된 형질전환법 [Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15: 80, 1993], 및 바이러스 벡터 [A. Miller and G. Rosman, BioTechniques 7: 980-990, 1989; Wang and Finer, Nature Med. 2: 714-716, 1996] 가 있다. 배양된 포유동물 세포에서의 재조합 폴리펩티드의 제조는 예를 들면 문헌에 기재되어 있다 [Levinson et al., 미국 특허 제 4,713,339 호; Hagen et al., 미국 특허 제 4,784,950 호; Palmiter et al,. 미국 특허 제 4,579,821 호; 및 Ringold, 미국 특허 제 4,656,134 호]. 바람직한 배양된 포유동물 세포로는 COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) 및 차이니즈 햄스터 난소 셀라인 (예컨대 CHO-K1; ATCC No. CCL 61) 이 있다. 추가의 적당한 셀라인은 당해 기술분야에 공지이며, 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland)과 같은 공인 기탁기관으로부터 구할 수 있다. 일반적으로, SV-40 또는 사이토메갈로바이러스로부터 얻어지는 프로모터와 같은 강한 전사 프로모터가 바람직하다 (예컨대 미국 특허 제 4,956,288 호 참조). 다른 적당한 프로모터로는 메탈로티오네인 유전자로부터 얻어지는 프로모터 (미국 특허 제 4,579,821 호 및 4,601,978 호) 및 아데노바이러스 주요 후기 프로모터가 있다.

외래 DNA 가 삽입되어 있는 배양된 포유동물 세포를 선택하기 위하여 일반적으로 약물 선택이 사용된다. 그러한 세포들은 통상적으로 "형질전환체"로서 언급된다. 선택제의 존재하에 배양되었고 관심의 유전자를 그것들의 자손에게 계대시킬 수 있는 세포들은 "적당한 형질전환체"로서 언급된다. 바람직한 선택가능한 마아커는 항생물질인 네오마이신에 대한 내성을 코드화하는 유전자이다. 선택은 G-418 등과 같은 네오마이신-유형 약물의 존재하에 수행된다. 선택 시스템은 또한 관심의 유전자의 발현 수준을 증가시키기 위하여 사용될 수 있는데, 그 과정은 "증폭"으로 언급된다. 증폭은 형질전환체를 낮은 수준의 선택제의 존재하에 배양시킨 후, 도입된 유전자의 생성물을 높은 수준으로 생성하는 세포를 선택하기 위한 선택제의 양을 증가시킴으로써 수행된다. 바람직한 증폭가능한 선택가능한 마아커는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 디히드로폴레이트 환원효소이다. 다른 약물 내성 유전자 (예컨대 하이그로마이신 내성, 다중-약물 내성, 퓨로마이신 아세틸트란스페라제)도 또한 사용될 수 있다. 변경된 표현형, 예컨대 그린 형광 단백질, 또는 세포 표면 단백질, 예컨대 CD4, CD8, 제 I 부류 MHC, 태반 알칼리 포스파타제를 도입시키는 대체 마아커들이, FACS 분류 또는 자기 비이드 분리 기법과 같은 수단에 의하여 형질전환되지 않은 세포로부터 형질전환된 세포를 분류하기 위하여 사용될 수 있다.

식물 세포, 곤충 세포 및 조류 세포를 포함하여 다른 고등 진핵 세포도 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 식물 세포에서 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 아그로박테리움 리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes) 를 사용하는 것에 대해서는 싱카 등에 의하여 문헌에 설명되어 있다 [Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987]. 곤충 세포의 형질전환 및 그 안에서의 외래 폴리펩티드의 생성에 대해서도 문헌에 설명되어 있다 [Guarino et al., 미국 특허 제 5,162,222 호 및 WIPO 공보 WO 94/06463]. 곤충 세포는 통상 아우토그라파 캘리포르니카 뉴클레아폴리헤드로시스 바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) (AcNPV) 로부터 유도된 재조합 배큘로바이러스로 감염될 수 있다 [King and Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman ＆ Hall; O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; Richardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995]. 재조합 zsig39 배큘로바이러스를 만드는 두 번째 방법은 룩코브 등에 의해 설명된 트랜스포존-기초 시스템을 활용한다 [Luckow et al., J. Virol. 67: 4566-4579, 1993]. 전달 벡터를 사용하는 이 시스템은 Bac-to-Bac^TM키트 (Life Technologies, Rockville, MD) 로 시판된다. 이 시스템은 "백미드 (bacmid)" 로서 언급되는 큰 플라스미드로서 E. coli 에 보유된 배큘로바이러스 게놈안에 zsig39 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 를 이동시키기 위한 Tn7 트랜스포존을 함유하고 있는 pFastBacl^TM(Life Technologies) 이라는 전달 벡터를 활용한다 [Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71: 971-976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-1556, 1994; 및 Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543-1549, 1995]. 또한, 전달 벡터는 발현된 zsig39 폴리펩티드의 C- 또는 N-말단에서 에피토프 태그, 예컨대 Glu-Glu 에피토프 태그 [Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-7954, 1985] 를 코드화하는 DNA 와의 프레임-내 (in-frame) 융합을 포함할 수 있다. 당해 기술분야에 공지되어 있는 기법을 사용하여 zsig39 를 함유하고 있는 전달 벡터가 대장균안에 형질전환되고, 재조합 배큘로바이러스를 가리키는 중간에 삽입된 lacZ 유전자를 함유하고 있는 백미드에 대하여 스크린된다. 재조합 베큘로바이러스 게놈을 함유하고 있는 백미드 DNA 는 통상적인 기법을 사용하여 단리되고, 스포돕테라 프루기페르다 (Spodpptera frugiperda) 세포, 예컨대 Sf9 세포를 형질전환시키기 위하여 사용된다. 계속해서 zsig39 를 발현하는 재조합 바이러스가 생성된다. 재조합 바이러스 스톡은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 만들어진다.

재조합 바이러스는 숙주 세포, 전형적으로는 가을철의 조밤나방류 유충인 스포돕테라 프루기페르다로부터 유도된 셀라인을 감염시키기 위하여 사용된다 [일반적인 사항은 Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994 참조]. 다른 적당한 셀라인은 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni) 로부터 유도된 High FiveO^TM셀라인 (Invitrogen)이다 (미국 특허 제 5,300,435 호). 통상적으로 활용되는 무혈청 배지가 세포를 성장시키고 유지시키기 위하여 사용된다. 적당한 배지는 Sf9 세포에 대해서는 Sf900 II^TM(Life Technologies) 또는 ESF 921^TM(Expression System) 이고; T. ni 세포에 대해서는 Ex-cellO405^TM(JRH Biosciences, Lenexa, KS) 또는 Express FiveO^TM(Life Technologies) 이다. 세포는 대략 2-5 × 10⁵세포의 접종 밀도로부터 1-2 × 10⁶세포의 밀도로까지 성장되고, 상기 밀도에 도달하면, 0.1 내지 10, 보다 전형적으로는 거의 3 의 감염 다중도 (MOI)에서 재조합 바이러스 스톡이 첨가된다. 사용된 과정들은 일반적으로 활용가능한 실험실 매뉴얼에서 설명된다 [King and Possee, 상기 동일한 문헌; O'Reilly et al., 상기 동일한 문헌; Richardson, 상기 동일한 문헌]. 상층액으로부터 얻어지는 zsig39 폴리펩티드의 계속되는 정제는 본원에서 설명되는 방법들을 사용하여 이루어질 수 있다.

효모 세포를 포함한 진균류 세포도 또한 본 발명내에서 사용될 수 있다. 이런 관점에서 특별히 관심있는 효모 종은 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 및 피치아 메타놀리카 (Pichia methanolica)이다. 사카로마이세스 세레비시애 세포를 외인성 DNA 로 형질전환시키고 그것으로부터 재조합 폴리펩티드를 생성하는 방법은 예컨대 문헌에 개시되어 있다 [Kawasaki, 미국 특허 제 4,599,311 호; Kawasaki et al., 미국 특허 제 4,931,373 호; Brake, 미국 특허 제 4,870,008 호; Welch et al, 미국 특허 제 5,037,743 호; 및 Murray et al., 미국 특허 제 4,845,075 호]. 형질전환된 세포는 선택가능한 마아커, 통상적으로는 약물 내성 또는 특정한 영양분 (예컨대 로이신) 없이 성장하는 능력에 의해 선택된다. 사카로마이세스 세레비시애에서 사용하기에 바람직한 벡터 시스템은 카와사키 등에 의해 개시된 POT1 벡터 시스템 (미국 특허 제 4,931,373 호)인데, 이것은 형질전환된 세포가 글루코오스-함유 배지에서의 성장에 의해 선택되는 것을 가능하게 한다. 효모에서 사용하기에 적당한 프로모터 및 터미네이터로는 당분해 효소 유전자로부터 유도된 것들 (예컨대 Kawasaki, 미국 특허 제 4,599,311 호; Kingsman et al., 미국 특허 제 4,615,974 호; 및 Bitter, 미국 특허 제 4,977,092 호) 및 알코올 데히드로게나아제 유전자로부터 유도된 것들이 있다 (또한 미국 특허 제 4,990,446 호; 5,063,154 호; 5,139,936 호; 및 4,661,454 호 참조). 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스 (K. fragilis), 우스틸라고 마이디스 (Ustilago maydis), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카 (Pichia methanolica), 피치아 귈러몬디 (Pichia guillermondii) 및 칸디다 말토사 (Candida maltosa)를 포함한 다른 효모에 대한 형질전환 시스템도 당해 기술분야에 공지되어 있다 [Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465, 1986 및 Cregg, 미국 특허 제 4,882,279 호]. 아스페르길루스 세포도 문헌의 방법을 따라 활용될 수 있다 [McKnight et al., 미국 특허 제 4,935,349 호]. 아크레모니움 크리소게눔 (Acremonium chrysogenum) 을 형질전환시키는 방법은 수미노 (Sumino) 등에 의해 미국 특허 제 5,162,228 호에 기재되어 있다. 뉴로스포라 (Neurospora)를 형질전환시키는 방법은 람보비츠 (Lambowitz) 에 의해 미국 특허 제 4,486,533 호에 기재되어 있다.

재조합 단백질의 생성을 위한 숙주로서의 피치아 메타놀리카의 사용은 WIPO 공보 WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, 및 WO 98/02565 에 개시되어 있다. 피치아 메타놀리카를 형질전환시키는데 사용하기 위한 DNA 분자는 통상적으로 이중-가닥의 원형 플라스미드로서 제조될 것이며, 형질전환 전에 선형화되는 것이 바람직하다. 피치아 메타놀리카에서의 폴리펩티드 생성을 위해서는, 플라스미드의 프로모터 및 터미네이터가 피치아 메타놀리카 유전자, 예컨대 피치아 메타놀리카 알코올 활용 유전자 (AUG1 또는 AUG2)의 프로모터 및 터미네이터인 것이 바람직하다. 다른 유용한 프로모터로는 디히드록시아세틴 신타아제 (DHAS) 유전자의 프로모터, 포름산염 데히드로게나제 (FMD) 유전자의 프로모터, 및 카탈라아제 (CAT) 유전자의 프로모터가 있다. DNA 의 숙주 염색체 안으로의 통합을 용이하게 하기 위해서는, 숙주 DNA 서열이 양 끝에 있는 플라스미드의 완전한 발현 서열을 가지는 것이 바람직하다. 피치아 메타놀리카에서 사용하기에 바람직한 선택가능한 마아커는 피치아 메타놀리카 ADE2 유전자로, 이것은 포스포리보실-5-아미노이미다졸 카르복실라제 (AIRC; EC 4.1.1.21)를 코드화하며, 아데닌이 없을 때 ade2 숙주 세포가 성장하는 것을 가능하게 한다. 메탄올의 사용을 최소화하는 것이 바람직한 경우인 대규모의 산업적 과정을 위해서는, 메탄올을 활용하는 두가지 유전자 (AUG1 및 AUG2)가 모두 결실되는 것이 바람직하다. 분비된 단백질의 생성을 위해서는, 액포의 프로테아제 유전자 (PEP4 및 PRB1) 가 결핍된 숙주 세포가 바람직하다. 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 를 함유하고 있는 플라스미드의 피치아 메타놀리카 세포안으로의 도입을 용이하게 하기 위하여 일렉트로포레이션이 사용된다. 피치아 메타놀리카 세포를 2.5 내지 4.5 kV/cm, 바람직하게는 약 3.75 kV/cm 의 장 세기를 가지는 지수적으로 감속하는 펄스된 전기장, 및 1 내지 40 밀리세컨드, 가장 바람직하게는 약 20 밀리세컨드의 시간 상수 (τ)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의하여 형질전환시키는 것이 바람직하다.

박테리아 대장균, 바실루스 및 다른 속의 스트레인을 포함하여 원핵 숙주 세포도 또한 본 발명의 범주내에 있는 유용한 숙주이다. 이들 숙주를 형질전환시키고 그 안에 클론된 외래 DNA 서열을 발현시키는 기법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., 상기 동일한 문헌 참조). 대장균과 같은 박테리아에서 zsig39 폴리펩티드를 발현시킬 때, 폴리펩티드는 세포질에, 전형적으로는 불용성 과립으로서 보유될 수 있고, 또는 박테리아 분비 서열에 의해 원형질 부근의 영역에 특정될 수 있다. 전자의 경우, 세포가 용해되고, 과립이 회수되며, 예컨대 구아니딘 이소티오시아네이트 또는 우레아를 사용하여 변성된다. 그런 다음 변성된 폴리펩티드는 다시 접힐 수 있고 변성제를 희석시킴으로써, 예컨대 우레아와 환원되고 산화된 글루타티온의 조합의 용액에 대하여 투석하고, 이어서 완충된 식염수 용액에 대하여 투석함으로써 이량체화될 수 있다. 후자의 경우에, 폴리펩티드는 원형질 부근의 영역의 내용물을 방출시키기 위하여 세포를 파괴하고 (예컨대 음파처리 또는 삼투압 쇼크에 의하여) 단백질을 회수함으로써 가용성이고 기능성인 형태로 원형질 부근의 영역으로부터 회수될 수 있고, 그로써 변성 및 재접힘에 대한 필요가 없어진다.

형질전환된 (바이러스에 의한 또는 플라스미드에 의한) 숙주 세포들은 종래의 과정을 따라 영양분 및 선택된 숙주 세포의 성장에 필요한 다른 성분들을 함유하고 있는 배양 배지중에서 배양된다. 규정된 배지 및 복합 배지를 포함하여 다양한 적당한 배지가 당해 기술분야에 공지이며, 일반적으로 탄소 공급원, 질소 공급원, 필수 아미노산, 비타민 및 미네랄을 포함하고 있다. 배지에는 또한 필요에 따라 성장 인자 또는 혈청과 같은 성분들이 함유될 수 있다. 성장 배지는 일반적으로 외래적으로 첨가된 DNA 를 함유하고 있는 세포를, 예컨대 약물 선택에 의해 또는 발현 벡터상에 운반된 또는 숙주 세포안에 함께 형질전환된 선택가능한 마아커에 의해 보충된 필수 영양분의 결핍에 의해 선택하게 될 것이다.

발현된 재조합 zsig39 폴리펩티드 (또는 키메릭 zsig39 폴리펩티드)는 분획화 및/또는 종래의 정제 방법 및 배지를 사용하여 정제될 수 있다. 황산 암모늄 침전법 또는 산 또는 케이오트로프 (chaotrope) 추출법이 샘플의 분획화를 위하여 사용될 수 있다. 예시적인 정제 단계들로는 히드록시아파타이트, 크기 추출, FPLC 및 역-상 고성능 액체 크로마토그래피가 있다. 적당한 음이온 교환 배지로는 유도체화된 덱스트란, 아가로오스, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 특선 (specialty) 실리카, 등이 있다. PEI, DEAE, QAE 및 Q 유도체가 바람직하며, DEAE 패스트 플로우 세파로오스 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 가 특히 바람직하다. 적당한 크로마토그래피 배지로는 페닐, 부틸 또는 옥틸기, 예컨대 페닐-세파로오스 FF (Pharmacia), 토요퍼얼-세파로오스 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), 옥틸-세파로오스 (Pharmacia) 등으로 유도체화된 배지; 또는 암버크롬 CG 71 (Toso Haas) 등과 같은 폴리아크릴 수지가 있다. 적당한 고체 지지체로는 그것들이 사용되는 조건하에서는 불용성인 유리 비이드, 실리카-기초 수지, 셀룰로오스 수지, 아가로오스 비이드, 교차-결합된 아가로오스 비이드, 폴리스티렌 비이드, 교차-결합된 폴리아크릴아비드 수지 등이 있다. 이들 지지체들은 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기, 히드록실기 및/또는 카르보하이드레이트 부분에 의해 단백질의 부착을 허용하는 반응성 기를 사용하여 변형될 수 있다. 커플링 화학의 예로는 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 히드라자이드 활성화, 및 카르보디이미드 커플링 화학을 위한 카르복실 및 아미노 유도체가 있다. 이들 및 다른 고체 배지는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며 널리 사용되고 있고, 상업적인 공급자들로부터 구입할 수 있다. 수용체 폴리펩티드를 지지체 배지에 결합시키는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 특정한 방법의 선택은 기본적인 디자인 사항이고 부분적으로는 선택된 지지체의 성질에 의해 결정된다 [Affinity Chromatography: Principles ＆ Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988].

본 발명의 폴리펩티드는 그것들의 구조적 또는 결합 성질의 개발에 의해 단리될 수 있다. 예를 들면, 히스티딘-풍부 단백질 또는 His 태그를 가지고 있는 단백질을 정제하기 위하여 고정화된 금속 이온 흡착 (IMAC) 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 간단하게 설명하면, 겔이 먼저 2 가의 금속 이온으로 충전되어 킬레이트가 형성된다 [Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1-7, 1985]. 히스티딘-풍부 단백질들은 상이한 친화성을 가지고 있는 이 매트릭스에, 사용된 금속 이온에 따라 흡착될 것이고, pH 를 낮춰가는 경합 용출에 의하여 또는 강한 킬레이트화제를 사용함에 의하여 용출될 것이다. 다른 정제 방법으로는 렉틴 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 글리코실화된 단백질의 정제가 있다 [Methods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp.529-539]. 발명의 추가의 바람직한 구체예내에서, 관심의 폴리펩티드와 친화성 태그 (예컨대 Glu-Glu 친화성 태그, FALG 태그, 말토오스-결합 단백질, 면역글로불린 도메인)의 융합은 하기의 실시예에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 정제를 용이하게 하기 위하여 구성될 수 있다.

단백질 재접힘 과정 (및 임의로, 재산화 과정)이 유익하게 사용될 수 있다. 단백질을 오염시키는 거대분자, 특히 다른 단백질 및 핵산과 관련하여 바람직하게는 80 % 이상의 순도로, 보다 바람직하게는 90 % 이상의 순도로, 보다 더 바람직하게는 95 % 이상의 순도로, 가장 바람직하게는 약학적으로 순수한 상태로, 즉 99.9 % 이상의 순도로 정제되는 것이 좋으며, 감염성 및 발열성 제제가 없는 것이 바람직하다. 바람직한 것은, 정제된 단백질이 실질적으로 다른 단백질, 특히 동물 기원의 다른 단백질이 없는 것이다.

zsig39 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 또한 화학적 합성을 통하여 제조될 수 있다. 그러한 zsig39 폴리펩티드들은 단량체이거나 또는 다량체이며; 글리코실화되어 있거나 또는 글리코실화되어 있지 않고; 페길레이트되어 있거나 그렇지 않으며; 초기의 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.

본 발명의 단백질을 검정하기 위한 생체내 접근법은 바이러스 전달 시스템을 포함한다. 이 목적을 위한 예시적인 바이러스로는 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스 및 아데노-관련 바이러스 (AAV)가 있다. 이중 가닥의 DNA 바이러스인 아데노바이러스는 현재 이종성 핵산을 전달하기 위한 가장 잘 연구되어 있는 유전자 전달 벡터이다 [Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161-189, 1994; Douglas et al., Science ＆ Medicine 4:44-53, 1997]. 아데노바이러스 시스템은 다음과 같은 여러 가지 장점을 제공한다: 아데노바이러스는 (i) 상대적으로 큰 DNA 삽입물을 수용할 수 있다; (ii) 고역가가 될 때까지 성장할 수 있다; (iii) 광범위한 포유동물 세포 유형을 감염시킬 수 있다; 그리고 (iv) 상이한 프로모터를 가지고 있는 대다수의 활용가능한 벡터들과 함께 사용될 수 있다. 또한, 아데노바이러스가 혈류내에서 안정하기 때문에, 아데노바이러스는 정맥내 주사에 의하여 투여될 수 있다.

아데노바이러스의 게놈 부분들을 결실시킴으로써, 보다 큰 이종성 DNA 의 삽입물 (약 7 kb)이 수용될 수 있다. 이들 삽입물은 직접적인 결찰에 의하여 또는 함께 형질전환된 플라스미드와의 동종 재조합에 의하여 바이러스의 DNA 안에 통합될 수 있다. 예시적인 시스템에서, 필수 E1 유전자가 바이러스 벡터로부터 결실되었다면, 바이러스는 E1 유전자가 숙주 세포 (예를 들면 사람 293 셀라인)에 의해 제공되지 않는 한, 복제되지 않을 것이다. 무상 (intact) 동물에 정맥내 투여되는 경우 아데노바이러스는 우선적으로 간을 표적화한다. 만약 아데노바이러스 전달 시스템이 E1 유전자가 결실되어 있은 상태라면, 바이러스는 숙주 세포안에서 복제될 수 없다. 그러나, 숙주의 조직 (예컨대 간)은 이종성 단백질을 발현하고 프로세스한다 (그리고 만약 분비 신호 서열이 존재한다면 그 이종성 단백질을 분비한다). 분비된 단백질은 고도로 혈관이 신생된 간의 순환계내로 들어갈 것이고, 감염된 동물에 미치는 영향도 측정될 수 있다.

아데노바이러스 시스템은 또한 시험관내에서 단백질 제조를 위하여 사용될 수 있다. 아데노바이러스로 감염된 비-293 세포를, 이 세포가 신속하게 분할되지 않는 조건하에서 배양시킴으로써, 상기 세포는 연장된 시간동안 단백질을 생성할 수 있다. 예를 들면, BHK 세포가 세포 공장에서 집밀도에 이르기까지 성장된 다음, 관심의 분비된 단백질을 코드화하는 아데노바이러스 벡터에 노출된다. 그런 다음 세포는 혈청이 없는 조건하에서 성장됨으로써, 감염된 세포가 유의할만한 세포 분할 없이 여러 주 동안 생존하는 것이 가능하다. 또는 달리, 아데노바이러스로 감염된 293S 세포가 상대적으로 높은 세포 밀도로 현탁 배양중에 성장되어 상당한 양의 단백질이 생성될 수 있다 [Garnier et al., Cytotechnol. 15: 145-155, 1994]. 어느 쪽의 프로토콜을 사용하든지, 발현되고 분비된 이종성 단백질이 반복적으로 세포 배양 상층액으로부터 단리될 수 있다. 감염된 293S 세포 제조 프로토콜을 사용할 때에는, 분비되지 않는 단백질이 또한 효과적으로 얻어질 수 있다.

리간드-결합 폴리펩티드, 예컨대 zsig39 폴리펩티드-결합 폴리펩티드도 또한 리간드의 정제에 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 고체 지지체, 예컨대 아가로오스 비이드, 교차-결합된 아가로오스의 비이드, 유리 비이드, 셀룰로오스 수지의 비이드, 실리카-기초 수지의 비이드, 폴리스티렌 비이드, 교차-결합된 폴리아크릴아미드 비이드, 또는 사용 조건하에서 안정한 유사한 물질로 된 비이드상에 고정된다. 폴리펩티드를 고체 지지체에 결합시키는 방법은 당해 기술분야에 공지이며, 그러한 것으로는 아민 화학, 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 및 히드라자이드 활성화가 있다. 그 결과의 배지는 일반적으로 칼럼의 형태로 형성되며, 리간드를 함유하고 있는 유체는 리간드가 리간드-결합 폴리펩티드에 결합할 수 있는 시간 또는 그 이상의 시간동안 칼럼을 통하여 통과된다. 그런 다음 리간드가 리간드-수용체 결합을 파괴하기 위한 염 농도, 케이오트로픽 (chaotropic) 제제 (구아니딘 HCl), 또는 pH 의 변화를 사용하여 용출된다.

리간드-결합 수용체 (또는 항체, 보체/항-보체 쌍의 한 구성원) 또는 그것의 결합 단편, 및 상업적으로 구할 수 있는 바이오센서 기구 (BIAcore^TM, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) 를 사용하는 검정 시스템이 유익하게 사용될 수 있다. 그러한 수용체, 항체, 보체/항-보체 쌍의 구성원 또는 단편은 수용체 칩의 표면위에 고정된다. 이러한 기구의 사용은 문헌에 설명되어 있다 [Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-240, 1991 및 Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-563, 1993]. 수용체, 항체, 구성원 또는 단편은 아민 또는 술프히드릴 화학을 사용하여 흐르는 세포안에 있는 금 막에 부착되는 덱스트란 섬유에 공유 부착된다. 시험 샘플은 세포를 통과한다. 만약 리간드, 에피토프, 또는 보체/항-보체 쌍의 반대쪽 구성원이 샘플중에 존재한다면, 그것은 고정된 수용체, 항체 또는 구성원에 각각 결합할 것이고, 그 결과 배지의 굴절 지수에 변화를 초래하며, 그것은 금 막의 표면 플래즈몬 공명의 변화로서 검출된다. 이 시스템은 온- 및 오프-레이트 (on- ＆ off-rate)의 측정을 가능하게 하며, 그것으로부터 결합 친화성이 계산될 수 있고, 결합의 화학양론이 평가될 수 있다.

리간드-결합 폴리펩티드는 또한 당해 기술분야에 공지되어 있는 다른 검정법에서도 사용될 수 있다. 그러한 시스템으로는 결합 친화성을 측정하기 위한 스캐쳐드 분석 [Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949] 및 열량측정 검정법 [Cunningham et al., Science 253: 545-548, 1991; Cunningham et al., Science 245: 821-825, 1991].

당업자에게 명백한 바와 같이, 다클론성 항체들은 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 토끼, 마우스, 햄스터, 기니아피그 및 래트와 트랜스제닉 (transgenic) 동물, 예컨대 트랜스제닉 양, 소, 염소 또는 돼지와 같은 다양한 온혈 동물을 접종시킴으로써 생성될 수 있다. 항체는 또한 효모 및 진균류에서 변형된 형태로뿐만 아니라 포유동물 및 곤충 세포에서도 발현될 수 있다. zsig39 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 동물을 접종하기 위한 또한 면역 반응을 유도하기 위한 항원 (면역원)으로서 작용한다. 적당한 항원으로는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 16 에서 243 의 아미노산, SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 19 에서 243 의 아미노산, 또는 그것의 연속적인 9 에서 243 의 아미노산 잔기 단편에 의해 코드화된 zsig39 폴리펩티드들이 있다. zsig39 폴리펩티드의 면역원성은 보조제, 예컨대 명반 (수산화 알루미늄) 또는 프로인트 완전 또는 불완전 보조제를 사용함으로써 증가될 수 있다. 면역화에 유용한 폴리펩티드는 또한 융합 폴리펩티드, 예컨대 zsig39 또는 그것의 단편과 면역글로불린 폴리펩티드 또는 친화성 태그와의 융합을 포함한다. 폴리펩티드 면역원은 완전한 길이의 분자 또는 그것의 부분일 수 있다. 만약 폴리펩티드 부분이 "합텐-유사" 한 것이라면, 그러한 부분은 면역화를 위해 유익하게도 거대분자 담체 (예컨대 키호울 림펫트 헤모시아닌 (KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 파상풍 독소)에 결합 또는 연결될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "항체" 는 다클론성 항체, 친화성-정제된 다클론성 항체, 단클론성 항체, 및 항원-결합 단편, 예컨대 F(ab')₂및 Fab 단백질 가수분해성 단편을 포함한다. 유전공학적으로 처리된 무상의 항체 또는 단편, 예컨대 키메릭 항체, Fv 단편, 단일 사슬 항체 등, 및 합성 항원-결합 펩티드 및 폴리펩티드도 또한 포함된다. 비-사람 항체는 단지 비-사람 CDR 을 사람 프레임워크 및 불변 영역상에 이식함으로써, 또는 완전한 비-사람 가변 도메인을 통합시킴으로써 인간화될 수 있다 (임의로 비-사람 항체를 노출된 잔기의 대체에 의해 사람-유사 표면과 "은폐" 시키는 것, 그 결과 "서로 붙어 있는 (veneered)" 항체가 생성된다). 어떤 경우에는, 인간화된 항체가 사람 가변 영역 프레임워크 도메인내에 비-사람 잔기를 보유하고 있어서, 적절한 결합 특성이 증가될 수도 있다. 항체의 인간화를 통하여 생물학적인 반감기가 증가될 수 있으며, 사람에게 투여할 때 해로운 면역 반응에 대한 가능성이 감소된다. 본원에 유용한 항체를 생성하거나 또는 선택하기 위한 또 다른 기법들로는 림프구의 zsig39 단백질 또는 펩티드에 대한 시험관내 노출, 및 파지 또는 유사한 벡터에서의 항체 디스플레이 라이브러리의 선택 (예를 들면, 고정된 또는 표지된 zsig39 단백질 또는 펩티드를 사용함에 의해)이 있다 .

항체는 1) 만약 그것들이 역치 수준의 결합 활성을 나타내고, 및/또는 2) 그것들이 관련된 폴리펩티드 분자와 유의할만하게 교차-반응하지 않는 경우, 특이적으로 결합한 것으로 규정된다. 먼저, 본원의 항체는 만약 그것들이 zsig39 폴리펩티드, 펩티드 또는 에피토프에 10⁶mol^-1또는 그 이상, 바람직하게는 10⁷mol^-1또는 그 이상, 보다 바람직하게는 10⁸mol^-1또는 그 이상, 및 가장 바람직하게는 10⁹mol^-1또는 그 이상의 결합 친화성 (K_a)으로 결합한다면 특이적으로 결합한 것이다. 항체의 결합 친화성은 당업자에 의하여, 예컨대 스캐쳐드 분석에 의하여 쉽게 측정될 수 있다 [Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949].

둘째로, 항체는 만약 그것들이 관련된 폴리펩티드와 유의할만하게 교차-반응하지 않는다면 특이하게 결합된 것이다. 항체는 예를 들어, 그것들이 표준 웨스턴 블롯 분석 (Ausubel et al., 상기 동일한 문헌)을 사용하여 zsig39 폴리펩티드는 검출하지만 공지의 관련 폴리펩티드는 검출하지 못한다면 관련된 폴리펩티드 분자와 유의할만하게 교차-반응하지 않는다. 공지의 관련 폴리펩티드의 실예로는 오르토로그, Acrp30 (SEQ ID NO:8)과 같은 단백질 패밀리의 구성원인 동일 종으로부터 얻어지는 단백질, 도 1 에 배열된 폴리펩티드, 돌연변이 사람 zsig39 폴리펩티드, 등이 있다. 더욱이, 항체는 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 군집을 단리하기 위하여 공지의 관련된 폴리펩티드에 "대하여 스크린"될 수 있다. 예를 들면, 사람 zsig39 폴리펩티드에 대하여 발생한 항체는 불용성 매트릭스에 점착된 관련 폴리펩티드에 흡착된다; 사람 zsig39 폴리펩티드에 특이적인 항체는 적절한 완충 조건하에서 매트릭스를 통하여 흐를 것이다. 그러한 스크리닝으로 밀접하게 관련된 폴리펩티드에 대하여 교차-반응하지 않는 다클론성 및 단클론성 항체의 단리가 가능해진다 [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al., (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995]. 특이한 항체의 스크리닝 및 단리에 대해서는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 [Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984]. 그러한 검정법의 대표적인 예로는 동시발생적인 면역-전기영동, 방사성 면역검정, 방사성 면역-침전, 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA), 돗트 블롯 또는 웨스턴 블롯 검정, 억제 또는 경합 검정, 및 샌드위치 검정이 있다.

잠재적인 zsig39 폴리펩티드 결합 도메인인 "결합 단백질"을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 유전자는, 파지상에 나타난 (파지 디스플레이) 또는 박테리아, 예컨대 대장균상에 나타난 무작위 또는 특정 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 여러 가지 방법으로, 예를 들면 무작위 돌연변이생성 및 무작위 폴리뉴클레오티드 합성을 통하여 얻어질 수 있다. 또는 달리, 억제된 파지 디스플레이 라이브러리가 생성될 수도 있다. 이들 펩티드 디스플레이 라이브러리는 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 리간드 또는 수용체, 생물학적 또는 합성 거대분자, 또는 유기 또는 무기 물질일 수 있는 공지의 표적과 상호작용하는 펩티드를 스크린하는데 사용될 수 있다. 그러한 펩티드 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 기법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 (Ladner et al., 미국 특허 제 5,223,409 호; Ladner et al., 미국 특허 제 4,946,778 호; Ladner et al., 미국 특허 제 5,403,484 호 및 Ladner et al., 미국 특허 제 5,571,698 호), 펩티드 디스플레이 라이브러리 및 그러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 키트는 예를 들면 클론테크 (Clontech. Palo Alto, CA), 인비트로겐 인코퍼레이티드 (Invitrogen Inc., San Diego, CA), 뉴 잉글런드 바이오랩스, 인코퍼레이티드 (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) 및 파마시아 LKB 바이오테크놀로지 인코퍼레이티드 (Piscataway, NJ) 로부터 상업적으로 구할 수 있다. 펩티드 디스플레이 라이브러리는 zsig39 에 결합하는 단백질을 확인하기 위하여 본원에 기재된 zsig39 서열을 사용하여 스크린될 수 있다. zsig39 폴리펩티드와 상호작용하는 이들 "결합 단백질" 은 세포에 태그를 붙이기 위하여; 친화성 정제에 의하여 상동체 폴리펩티드를 단리하기 위하여 필수적으로 항체와 같이 사용될 수 있으며; 직접적으로 또는 간접적으로 약물, 독소, 방사성핵종 등에 포합된다. 이들 결합 단백질들은 또한 발현 라이브러리를 스크리닝하고 활성을 중화시키는 것과 같은 분석 방법에 사용될 수 있다. 결합 단백질은 또한 폴리펩티드의 순환하는 수준을 측정하기 위한; 잠재적인 병리학 또는 질병의 마아커로서 가용성 폴리펩티드를 검출 또는 정량하기 위한 진단 검정에 사용될 수 있다. 이들 결합 단백질의 반감기를 증가시키기 위해서는, 그것들은 포합될 수 있다. 결합 단백질들의 생물학적 성질은 아고니스트 또는 길항체로서 사용하기 위하여 이량체화 또는 다량체화에 의하여 변형될 수 있다. 결합 성질은 상술된 바와 같이 공지의 관련 폴리펩티드에 대하여 스크린될 수 있다.

zsig39 에 대한 항체 및 결합 단백질들은, 친화성 정제에 의하여 zsig39 를 단리하기 위하여; zsig39 폴리펩티드의 순환하는 수준을 측정하기 위한 진단용 검정을 위하여; 잠재적인 병리학 또는 질병의 마아커로서 가용성 zsig39 를 검출 또는 정량하기 위하여; FACS 를 사용하는 분석 방법에서; 발현 라이브러리를 스크리닝하기 위하여; 항-이디오타입 항체를 생성하기 위하여; 및 중성화하는 항체로서 또는 시험관내 및 생체내에서 zsig39 폴리펩티드 에너지 평형 조절 활성 또는 유사한 활성을 차단하기 위한 길항체로서 zsig39 를 발현하는 세포에 태그를 붙이기 위하여 사용될 수 있다. 적당한 직접적인 태그 또는 표지로는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 마아커, 화학발광 마아커, 자기 입자 등이 있으며; 간접적인 태그 또는 표지는 중간체로서 비오틴-아비딘 또는 다른 보체/항-보체 쌍을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱이, zsig39 또는 그것의 단편에 대한 항체는 시험관내에서 검정, 예컨대 웨스턴 블롯 또는 다른 공지되어 있는 검정에서 변성된 zsig39 또는 그것의 단편을 검출하기 위하여 사용될 수 있다.

본원의 항체 또는 결합 단백질은 또한 직접적으로 또는 간접적으로 약물, 독소, 방사성핵종 등에 포합될 수 있으며, 이들 포합체들은 진단 또는 치료 목적으로 생체내에서 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 상응하는 항-상보하는 분자 (예를 들면 각각 수용체 또는 항원)를 발현하는 조직 또는 기관을 확인하고 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, zsig39 폴리펩티드 또는 항-zsig39 항체, 또는 그것의 생체활성 단편 또는 부분들은 검출가능한 또는 세포독성인 분자들과 커플되어 항-보체 분자를 발현하는 세포, 조직 또는 기관을 가지고 있는 포유류에 전달된다.

적당한 검출가능한 분자들은 폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있는데, 그러한 것으로는 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 마아커, 화학발광 마아커, 자기 입자 등이 있다. 적당한 세포독성 분자들은 폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있는데, 그러한 것으로는 박테리아 또는 식물 독소 (예컨대 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 리신, 아브린 등), 및 치료용 방사성 핵종, 예를 들면 요오드-131, 레늄-188 또는 이트륨-90 이 있다 (각각은 폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 부착하거나, 또는 예컨대 킬레이트화 부분을 통하여 간접적으로 부착됨). 폴리펩티드 또는 항체는 또한 세포독성 약물, 예컨대 아드리아마이신에 포합될 수도 있다. 검출가능한 또는 세포독성인 분자의 간접적인 부착을 위해서는, 검출가능한 또는 세포독성인 분자가 보체/항-보체 쌍의 구성원과 포합될 수 있으며, 이 때 다른 구성원은 폴리펩티드 또는 항체 부분과 결합된다. 이런 목적에 대하여 비오틴/스트렙트아비딘이 예시적인 보체/항-보체 쌍이다.

다른 구체예에서, 폴리펩티드-독소 융합 단백질 또는 항체-독소 융합 단백질은 표적화된 세포 또는 조직 억제 또는 제거 (예컨대 암세포 또는 조직을 치료하기 위하여)에 사용될 수 있다. 또는 달리, 만약 폴리펩티드가 다중 기능성 도메인 (즉 활성화 도메인 또는 리간드 결합 도메인, 플러스 표적화 도메인)을 가지고 있다면, 단지 표적화 도메인만을 포함하고 있는 융합 단백질이 검출가능한 분자, 세포독성 분자 또는 관심의 세포 또는 조직 유형에 대하여 상보하는 분자를 특정하는데 적당할 것이다. 융합 단백질이 단지 상보하는 분자만을 포함하는 경우에는, 항-보체 분자가 검출가능한 또는 세포독성인 분자에 포합될 수 있다. 그러한 도메인-보체 분자 융합 단백질은 따라서 일반적인 항-보체-검출가능한/세포독성 분자 포합체의 세포/조직-특이적 전달을 위한 일반적인 표적화 비히클을 나타낸다. 본원에서 설명되는 생체활성 폴리펩티드 또는 항체 포합체들은 정맥내로, 동맥내로, DMSO 를 사용하여 혈관내로, 근육내로, 피하로, 복강내로, 또한 경피 방법에 의하여, 전기-전달에 의하여, 경구로 또는 흡입을 통하여 전달될 수 있다.

zsig39 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드들은 zsig39 활성이 증가되거나 억제되는 것이 요구되는 유전자 치료 적용분야에서 유용하다. 만약 포유류가 돌연변이된 zsig39 유전자를 가지고 있거나 또는 zsig39 유전자가 없다면, zsig39 유전자는 포유류의 세포안에 도입될 수 있다. 한 구체예에서, zsig39 폴리펩티드를 코드화하는 유전자는 생체내에서 바이러스 벡터안에 도입된다. 그러한 벡터로는 약해진 또는 결핍성 DNA 바이러스, 예컨대 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 단순 포진 바이러스 (HSV), 유두종 바이러스, 엡스타인 바아르 바이러스 (EBV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 등이 있다. 완전하게 또는 거의 완전하게 바이러스 유전자가 없는 결핍성 바이러스가 바람직하다. 결핍성 바이러스는 세포에 도입된 후에도 감염성이지 않다. 결핍성 바이러스 벡터를 사용하면 벡터가 다른 세포를 감염시킬 수 있다는 염려 없이 세포의 특이하고 국소화된 영역에 투여하는 것이 가능해진다. 특정 벡터의 예로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 결핍성 단순 포진 바이러스 1 (HSV1) 벡터 [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2: 320-330, 1991]; 약해진 아데노바이러스 벡터, 예컨대 문헌에 기재되어 있는 것과 같은 벡터 [Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90: 626-630, 1992]; 및 결핍성 아데노-관련 바이러스 벡터 [Samulski et al., J. Virol. 61: 3096-3101, 1987; Samulski et al., J. Virol. 63: 3822-3828, 1989] 가 있다.

다른 구체예에서, zsig39 유전자는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 문헌에 기재되어 있는 벡터에 도입된다 [Anderson et al., 미국 특허 제 5,399,346 호; Mann et al., Cell 33: 153, 1983; Temin et al., 미국 특허 제 4,650,764 호; Temin et al., 미국 특허 제 4,980,289 호; Markowitz et al., J. Virol. 62: 1120, 1988; Temin et al., 미국 특허 제 5,124,263 호; WIPO 공보 WO 95/07358; 및 Kuo et al., Blood 82: 845, 1993]. 또는 달리, 벡터는 리포솜을 사용하여 생체내로 리포펙션에 의하여 도입될 수 있다. 합성 양이온성 지질은 마아커를 코드화하는 유전자의 생체내 형질전환을 위하여 리포솜을 제조하는데 사용될 수 있다 [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1987; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-8031, 1988]. 특이한 기관안에 생체내로 외인성 유전자를 도입시키기 위해 리포렉션을 사용하는 것은 특별한 실제적인 장점이 있다. 특이한 세포에 대한 리포솜의 분자 수준의 표적화는 한 가지 장점을 나타낸다. 보다 구체적으로, 특정 세포에 대하여 형질전환을 특정하는 것은 한 가지 장점을 나타낸다. 예를 들어, 특정 세포 유형에 대해 형질전환을 특정하는 것은 특히 세포 이종성을 가지고 있는 조직, 예컨대 췌장, 간, 신장, 및 뇌에서 유익하다. 지질은 표적화를 목적으로 할 때 다른 분자에 화학적으로 결합될 수 있다. 표적화된 펩티드 (예컨대 호르몬 또는 신경전달물질), 단백질, 예컨대 항체, 또는 비-펩티드 분자도 리포솜에 화학적으로 결합될 수 있다.

네이키드 DNA 플라스미드로서 벡터를 도입시키기 위하여; 그런 다음 형질전환된 세포를 신체에 다시 이식하기 위하여 신체로부터 표적 세포를 제거하는 것이 가능하다. 유전자 치료용 네이키드 DNA 벡터들은 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법들, 예컨대 형질전환, 일렉트로포레이션, 미소주입, 형질변환, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산 칼슘 침전, 유전자 총의 사용 또는 DNA 벡터 트랜스포터의 사용에 의하여 원하는 숙주 세포안에 도입될 수 있다 [Wu et al., J. Biol.Chem. 267: 963-967, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621-14624, 1988].

zsig39 유전자 전사를 억제하기 위하여, 예컨대 세포 증식을 생체내에서 억제하기 위하여 안티센스 방법론이 사용될 수 있다. zsig39-코드화 폴리뉴클레오티드 (예컨대 SEQ ID NO:1 에 나타낸 바와 같은 폴리뉴클레오티드)의 절편에 상보하는 폴리뉴클레오티드는 zsig39-코드화 mRNA 에 결합하여 그러한 mRNA 의 번역을 억제하기 위하여 디자인된다. 그러한 안티센스 폴리뉴클레오티드는 세포 배양중에 또는 개체에게서 zsig39 폴리펩티드-코드화 유전자의 발현을 억제하기 위해 사용된다.

zsig39 유전자를 발현하도록 유전공학적으로 처리된 트랜스제닉 마우스들, 및 zsig39 유전자 기능이 완전히 없음을 나타내는 마우스들을 "넉아웃 마우스" 로 언급하고 [Snouwaert et al., Science 257: 1083, 1992], 제조될 수 있었다 [Lowell et al., Nature 366: 740-742, 1993]. 이들 마우스들은 zsig39 유전자 및 그로써 생체내 시스템에 코드화된 단백질을 연구하기 위하여 사용될 수 있다.

약학적으로 사용하기 위하여, 본 발명의 단백질들은 종래 방법을 따라 비경구용, 특히 정맥내 또는 피하 전달을 위해 제형된다. 정맥내 투여는 거환 주사 또는 1 내지 여러 시간의 전형적인 시간에 걸친 주입에 의해 이루어질 것이다. 일반적으로, 약학적 제형은 zsig39 단백질을, 약학적으로 허용되는 비히클, 예컨대 식염수, 완충 식염수, 물중의 5 % 덱스트로오스 등과 함께 포함할 것이다. 제형은 나아가 하나 또는 그 이상의 부형제, 보존제, 용해제, 완충제, 바이알 표면상에서의 단백질 손실을 방지하기 위한 알부민 등을 포함할 수 있다. 제형 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예컨대 문헌에 공지되어 있다 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 19^thed., 1995]. 치료적 단위용량은 일반적으로 허용되는 기준에 따라 임상의사에 의해 치료될 질환의 성질 및 심각성, 환자의 특징, 등을 고려하여 결정된다. 단위용량의 결정은 당해 기술분야의 통상적인 기술 수준내에 있다.

본 발명을 하기의 비-제한 실시예에 의하여 추가로 설명하기로 한다.

실시예 1

EST 서열의 연장

본 발명의 신규한 zsig39 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를, 먼저 EST 데이타베이스로부터 EST 를 선택하고, 여기에 기초하여 단백질 서열을 예상하고, EST 에 기초하여 예상되는 단백질에 가장 상동성인 분비된 단백질의 알려진 서열 데이타베이스를 찾음으로써 확인하였다. 알려진 분비된 단백질에 대하여 생물학적으로 흥미있는 상동성을 가지는 단백질을 잠재적으로 코드화하는 EST 들을 추가의 시험을 위해 확인하였다. 단일 EST 서열을 발견하였고, 지방세포 특이적 단백질에 상동성인 것으로 예상하였다 [예를 들면 Scherer et al., J. Biol. Chem. 270(45):26746-9, 1995]. 상응하는 cDNA 를 확인하기 위하여, 전체 코딩 서열을 포함하는 것으로 생각되는 클론을 서열화에 사용하였다. Invitrogen S.N.A.P.^TMMiniprep 키트 (캘리포니아, 산디에고의 Invitrogen, Corp.)를 제조자의 지시에 따라서 사용하여, LB + 50 ㎍/ml 의 암피실린중에서 하룻밤 배양액 5ml 를 제조하였다. ABIPRISM^TM염료 터니메이터 사이클 서열화 준비 반응 키트 (Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) (Perkin-Elmer Corp.)를 제조자의 지시에 따라서 사용하여 ABIPRISM^TM모델 377 DNA 서열기(코넥티컷, 노르워크의 Perkin-Elmer Cetus)상에서 주형을 서열화하였다. 클론함유 벡터상에 있는 M13 및 lacZ 프로모터에 대한 올리고뉴클레오티드 ZC447 (SEQ ID NO: 11), ZC976 (SEQ ID NO: 12)을 서열화 프라이머로서 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 ZC14707 (SEQ ID NO: 13), ZC14708 (SEQ ID NO: 14), ZC14760 (SEQ ID NO: 15), ZC14758 (SEQ ID NO: 16) 및 ZC14759 (SEQ ID NO: 17)을 클론으로부터 서열을 완성시키기 위해 사용하였다. 서열화 반응을 Hybaid OmniGene Temperature Cycling System(뉴욕, 우드브릿지의 National Labnet Co.)에서 수행하였다. SEQUENCHER^TM3.1 서열 분석 소프트웨어(미시간, 앤 아버의 Gene Codes Corporation)를 데이타분석을 위해 사용하였다. 그 결과의 1347 bp 서열을 SEQ ID NO:1 에 개시한다. 원래 유도된 EST 서열과 SEQ ID NO:1 에 나타낸 서열을 비교한 결과, 27 개의 염기쌍이 차이가 있었고, 그 결과 추론된 아미노산 서열들 사이에 11 개의 아미노산이 차이가 있는 것으로 나타났다. 22 개의 염기쌍 차이는 SEQ ID NO:1 의 공지 잔기에 대한 EST 서열의 미지의 "N" 잔기로부터 생성된 것이며, 그 결과 "가상의 (assumed)" 아미노산 변화가 초래됨을 주지하여야 한다.

실시예 2

조직 분포

Clontech (캘리포니아, 팔로알토)로부터의 사람 다수조직 블로팅을 사용하여 노던 블롯팅을 수행하였다. 완전한 길이의 zsig39 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 서열에 상응하는 대략 1347 bp 의 DNA 프로브를 플라스미드 DNA 의 EcoR1-NotI 소화에 의하여 만들었다. 그 결과의 단편을 프로브로서 사용하기 위하여 겔 정제하였다. 프로브를 REDIPRIME DNA 표지화 시스템 (Amersham, Arlington Heights, Illinois) 을 제조자의 명세서에 따라 사용하여³²P 로 방사성 활성 표지하였다. 프로브를 NUCTRAP 푸쉬 칼럼 (캘리포니아, 라졸라의 Stratagene Cloning Systems)을 사용하여 정제하였다. EXPRESSHYB (캘리포니아, 팔로알토의 Clontech) 용액을 예비 혼성화를 위해 사용하였고, 노던 블롯팅용 혼성화 용액으로서 사용하였다. 혼성화는 65 ℃ 에서 하룻밤동안 일어났고, 그런 다음, 블롯을 실온에서 2X SSC 와 0.1 % SDS 로 세척한 후, 65 ℃ 에서 0.1X SSC 와 0.1 % SDS 로 세척하였다. 1 개의 전사물 크기는 대략 2.8 kb 에서 관찰되었다. 신호의 강도는 소장과 심장에서 가장 높았고, 췌장, 골격근, 신장 및 갑상선에서 상대적으로 낮았으며, 태반, 폐, 간, 비장, 전립선, 난소, 결장, 위, 척수, 림프절, 기관지, 부신 및 골수에서 더 강도가 낮은 신호를 나타내었다.

추가의 노던 블롯 분석을 장관 노던 조직 블롯을 사용하여 수행하였다. 이 블롯은 사람의 대장 직장 선암종 셀라인 SW480 (캘리포니아, 팔로알토의 Clontech), 사람의 소장조직 (Clontech), 사람의 위조직 (Clontech), 사람의 장관 평활근 셀라인 (Hism; ATCC No.CRL-1692; American Type Culture Collection, 메릴랜드, 록빌, 파크론 드라이브 12301), 정상인의 대장 셀라인 (FHC; ATCC No. CRL-1831; American Type Culture Collection) 및 사람의 정상 태아 소장 셀라인 (FHs74 Int.; ATCC No. CCL241; American Type Culture Collection)으로부터의 mRNA를 사용하여 제조하였다.

총 RNA를 산 구아니디움법 [Cheomczynski et al., Anal. Biochem. 162:156-9, 1987] 에 의해 Hism, FHC 및 FHs74 Int.로부터 분리하였다. 총 RNA 를 폴리A⁺RNA 를 유지시키는 컬럼을 통과시켜 용리시킴으로써 폴리A⁺RNA 를 선택하였다[Aviv et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 69:1408-12, 1972]. 각 샘플로부터의 폴리A⁺RNA 2 ㎍ 을 2.2 M 포름알데히드와 인산 완충액중의 1.5 % 아가로스 겔중에서 완전히 분리시켰다. RNA 를 하룻밤동안 20X SSC 상에서 Nytran 멤브레인 (뉴 헴프셔, 키네의 Schleicher and Schuell)상에 옮겼다. 블롯을 0.12 쥬울에서 UV Stratalinker 2400 (캘리포니아, 라졸라의 Stratagene)에서 처리하였다. 그런 다음 블롯을 1 시간동안 80 ℃ 에서 구웠다.

노던 블롯을 성숙한 zsig39 폴리펩티드를 코드화하는 zsig39 PCR 단편 (하기 실시예 4 에서 설명됨)으로 프로브하고, 그것을 Rediprime 펠릿 키트(일리노이, 아링턴 하이트의 Amersham)를 제조자의 명세서에 따라서 사용하여³²P dCTP 로 방사선 표지하였다. 블롯을 56 ℃ 에서 하룻밤동안 EXPRESSHYB (Clontech)에서 혼성화시켰다. 블롯을 실온에서 2X SSC 및 0.1 % SDS 로 세척한 다음 65 ℃ 에서 2X SSC 및 0.1 % SDS 로 세척하고, 마지막으로 65 ℃ 에서 0.1X SSC 및 0.1 % SDS 로 세척하였다. 결과는 zsig39 가 사람의 소장 평활근 셀라인 HISM 을 제외한 모든 조직에 혼성화된 것으로 나타났다.

실시예 3

zsig39 유전자의 염색체 지도작성

zsig39 폴리펩티드를 코드화하는 유전자를, 상업적으로 활용가능한 "진브릿지 4 방사선 혼성체 패널 (GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel)"(Research Genetics, Inc., Huntsville, AL) 을 사용하여 염색체 11 에 대해 유전자 지도를 작성하였다. 진브릿지 4 방사선 혼성체 패널은 93 개의 방사선 혼성체 클론의 각각으로부터 얻어지는 PCR 할 수 있는 DNA 와, 2 개의 대조 DNA (HFL 공여체 및 A23 수용체)를 함유하고 있다. 공개적으로 활용할 수 있는 WWW 서버 (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)로 인하여 진브릿지 4 방사선 혼성체 패널을 사용하여 작성된 사람 게놈의 화이트헤드 인스티튜트/MIT 센터 포 게놈 리서취 (Whitehead Institute/MIT Center for Genome Resesrch)의 방사선 혼성체 지도 ("WICGR" 방사선 혼성체 지도)와 관련된 지도 작성이 가능해진다.

"진브릿지 4 RH 패널" 을 사용한 zsig39 유전자의 지도작성을 위해, 반응물 20 ㎕ 를 PCR 할 수 있는 96웰 미소적정 플레이트(캘리포니아, 라졸라의 Stratagene)중에 세팅하였고, "RoboCycler Gradient 96" 열 사이클러(Stratagene)에 사용하였다. 95 개의 PCR 반응물 각각은 10X KlenTaq PCR 반응 완충액(캘리포니아, 팔로알토의 Clontech Laboratories, Inc.) 2 ㎕, dNTPs 믹스(각 2.5 mM, 캘리포니아, 포스터시티의 PERKIN-ELMER) 1.6 ㎕, 센스 프라이머, ZC15002(SEQ ID NO: 18) 1 ㎕, 안티센스 프라이머, ZC15003(SEQ ID NO: 19) 1 ㎕, RediLoad(Research Genetics, Inc., Huntsville, AL) 2 ㎕, 50X Advantage KlenTaq 중합효소 믹스(Clontech Laboratories, Inc.) 0.4 ㎕, 개개의 혼성체 클론 또는 대조표준으로부터의 DNA 25 ng 및 총부피 20 ㎕ 를 위한 ddH₂O 로 구성되었다. 반응물을 등량의 미네랄오일로 뒤덮고 봉입하였다. PCR 사이클러 조건은 다음과 같았다: 95℃ 에서 5분의 변성 초기 1 사이클, 95℃ 에서 1분간의 변성 40 사이클, 64℃ 에서 어닐링 1분 및 72℃ 에서 1.5 분의 연장, 이어서 72℃ 에서 7 분의 연장 마지막 1 사이클. 반응물을 2 % 아가로오스 겔 (Life Technologies, Gaithersburg, MD)상에서 전기영동하여 분리시켰다.

그 결과, zsig39 폴리펩티드를 코드화하는 유전자는 WICGR 방사선 혼성체 지도상에서 사람 염색체 11 연결기의 상부로부터 549.99 cR_3000 에 위치하고 있는 것으로 나타났다. 주변 마아커들을 사용함으로써 통합된 LDB 염색체 11 지도(Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW server:http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/)상의 11q23.3 영역에 zsig39 유전자가 위치하고 있음을 알았다 .

실시예 4

포유동물 발현벡터 zsig39CEE/pZP9 및 zsig39NEE/pZP9 의 제조

2개의 발현벡터, zsig39CEE/pZP9 및 zsig39NEE/pZP9 를 zsig39 폴리펩티드에 대해 제조하였다. 이 구성물들은 C- 또는 N-말단 Glu-Glu 태그를 가지는 zsig39 폴리펩티드를 발현시키기 위하여 설계되었다 (SEQ ID NO: 20).

zsig39NEE/pZP9

690 bp 의 PCR-생성된 zsig-39 DNA 단편을, 주형으로서 상술된 콜로니와 PCR 프라이머로서 ZC15037 (SEQ ID NO:21) 및 ZC15038(SEQ ID NO:22)을 사용하여 제조하였다. N-말단 Glu-Glu 태그 및 제한 부위 Bam HI 및 Xba I 을 첨가한다. zsig39 단편의 PCR 증폭반응은 다음과 같았다: 94℃에서 90 초동안 진행시키고, 94 ℃ 에서 10 초동안, 34 ℃ 에서 20 초동안, 74 ℃ 에서 40초동안을 5 번 반복한 후, 94 ℃ 에서 10 초동안, 68 ℃ 에서 20 초동안, 72 ℃ 에서 40 초동안을 25 회 반복하고, 72 ℃ 에서 5 분 동안 진행시켰다. 예상된 크기, 즉 690 bp 의 밴드를 1 % 아가로오스 겔 전기영동에 의하여 가시화시킨 다음, 잘라내어 DNA 를 QUIAQUICK 칼럼 (Qiagen) 을 제조자의 지시를 따라 사용하여 겔로부터 정제하였다. 그런 다음 DNA 를 제한 효소 Bam HI 및 Xba I 을 사용하여 소화시킨 후, 추출하고 침전시켰다.

잘라놓은 DNA 를 Bam HI 및 Xba I 으로 잘라놓은 플라스미드 pZP9 내로 하위클로닝하였다. zsig39NEE/pZP9 발현벡터는 정제 보조자로서 N-말단에 부착되어 있는 Glu-Glu 에피토프 (SEQ ID NO:20) 및 TPA 리더를 통합시킨다. 플라스미드 pZP9 (메릴랜드, 록빌, 파크론 드라이브 12301 에 소재한 American Type Culture Collection 에 기탁됨, ATCC 번호 98668)는 마우스 메탈로티오네인-1 프로모터, 코딩 서열을 삽입시키기 위한 다수의 제한 부위, 중지 코돈 및 사람의 성장 호르몬 터미네이터를 가지고 있는 발현 카세트를 포함하는 포유동물 발현 벡터이다. 플라스미드는 또한 E.coli 복제 기원, SV40 프로모터, 인핸서 및 복제 기원을 가지는 포유동물 선택가능 마아커 발현 유니트, DHFR 유전자 및 SV40 터미네이터를 포함한다.

제한 효소로 소화된 N-말단 Glu-Glu-zsig39 삽입물 30 ng 과 소화된 벡터 48 ng 을 16 ℃ 에서 밤새 결찰시켰다. 각 결찰 반응물의 1 ㎕ 를 각각 제조자의 지시에 따라 DH10B 경합 세포 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)안으로 일렉트로포레이트시키고, 50 mg/ml 의 암피실린을 함유하고 있는 LB 플레이트상에 플레이팅한 후, 밤새 인큐베이션하였다. 생성된 콜로니들을 프라이머 ZC13006 (SEQ ID NO: 23) 및 ZC13007 (SEQ ID NO:24) 을 사용하여 PCR 에 의하여 스크린하였다. PCR 스크리닝을 94 ℃ 에서 4 분동안 진행시키고, 94 ℃ 에서 30 초동안, 64 ℃ 에서 20 초동안, 72 ℃ 에서 1 분동안 진행시키는 것을 25 회 반복한 후, 72 ℃ 에서 10 분동안 진행시켰다. 양성 클론을 상술된 바와 같이 LB 플레이트상에 플레이팅하였다. 양성 클론의 삽입 서열을 서열 분석에 의하여 증명하였다. 대규모의 플라스미드 제조를 제조자의 지시를 따라 QIAGEN Maxi prep 키트 (Qiagen) 를 사용하여 수행하였다.

zsig39CEE/pZP9

744 bp 의 PCR-생성된 zsig39 DNA 단편을, PCR 주형으로서 ZC15609 (SEQ ID NO:25) 및 ZC15232 (SEQ ID NO:26)을 사용하여 상술된 바와 같은 과정을 따라 제조하고, C-말단 Glu-Glu 태그 및 제한 부위 Bam HI 및 Xba I 을 첨가하였다. PCR 증폭반응은 다음과 같았다: 94℃에서 3 분동안 진행시키고, 94 ℃ 에서 30 초동안, 30 ℃ 에서 20 초동안, 72 ℃ 에서 1 분동안을 5 번 반복한 후, 94 ℃ 에서 30 초동안, 64 ℃ 에서 20 초동안, 72 ℃ 에서 1 분동안을 25 회 반복하고, 72 ℃ 에서 5 분 동안 진행시켰다. 정제된 PCR 단편을 제한 효소 Eco RI 및 Bam HI 을 사용하여 소화기킨 후, 추출하고 침전시켰다.

잘라놓은 zsig39 DNA 를 Eco RI 및 Bam HI 으로 잘라놓은 플라스미드 pZP9 내로 하위클로닝하였다. zsig39CEE/pZP9 발현벡터는 천연 zsig39 신호 펩티드를 사용하며 zsig39 폴리펩티드-코드화 폴리뉴클레오티드 서열의 C-말단에 Glu-Glu 태그 (SEQ ID NO:20) 를 부착시킨다.

제한 효소로 소화된 C-말단 Glu-Glu-zsig39 삽입물 34 ng 과 상응하는 벡터 48 ng 을 DH10B 세포안으로 결찰시키고 상술된 바와 같이 양성 클론을 스크린하였다. 양성 클론을 상술된 바와 같이 LB Amp 플레이트상에 플레이팅하였다. 양성 클론의 삽입 서열을 서열 분석에 의하여 증명하였다. 대규모의 플라스미드 제조를 제조자의 지시를 따라 QIAGEN Maxi prep 키트 (Qiagen) 를 사용하여 수행하였다.

실시예 5

zsig39NEE 및 CEE 폴리펩티드의 형질전환 및 발현

BHK 570 세포(ATCC No. CRL-10314)를 10 cm 조직배양접시에 플레이팅하고, DMEM/FBS 배지(DMEM, Gibco/BRL High Glucose(메릴랜드, 게이더스버그의 Gibco BRL), 5 % 우태아혈청(유타, 로간의 Hyclone), 2 ㎛ 의 L-글루타민(캔사스, 리넥사의 JRH Biosciences), 1 ㎛ 의 피루브산나트륨(Gibco BRL))중에서, 37 ℃, 5 % CO₂에서 배지의 약 50 내지 70 % 가 채워질 때까지 성장시켰다. 그런 다음 세포를 무혈청(SF, serum free) 배지 제제(DMEM, Gibco/BRL High Glucose(메릴랜드, 게이더스버그의 Gibco BRL), 2 mM 의 L-글루타민, 2 mM 의 피루브산나트륨, 10 ㎍/ml 의 트랜스페린, 5 ㎍/ml 의 인슐린, 10 ㎍/ml 의 페투인 및 2 ng/ml 의 셀레늄)중에서, Lipofectamine^TM(Gibco BRL)을 사용하여 플라스미드 zsig39NEE/pZP9(N-말단 Glu-Glu 태그) 또는 zsig39CEE/pZP9(C-말단 Glu-Glu 태그)로 형질전환시켰다. 16 ㎍ 의 zsig39NEE/pZP9 및 16 ㎍ 의 zsig39CEE/pZP9 를 15 ml 튜브에 별도로 희석시켜 최종 부피 총 640 ㎕ 의 SF 배지로 만들었다. 각각의 튜브에, Lipofectamine^TM(Gibco BRL) 35 ㎕ 를 SF 배지 605 ㎕ 와 혼합하였다. Lipofectamine^TM믹스를 DNA 믹스에 첨가하고 실온에서 약 30 분동안 인큐베이션하였다. 5 ml 의 SF 배지를 DNA:Lipofectamine^TM혼합물에 첨가하였다. 세포를 SF 배지 5 ml 로 세정하고, 흡인하고, DNA:Lipofectamine^TM혼합물을 첨가하였다. 세포를 37 ℃ 에서 5 시간동안 인큐베이션한 다음, DMEM/10 % FBS, 1 % PSN 배지 6.4 ml 을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37 ℃ 에서 하룻밤동안 인큐베이션하고 그 다음날 DNA:Lipofectamine^TM혼합물을 신선한 FBS/DMEM 배지로 대체하였다. 형질전환후 2 일째 되는 날, 세포를 150 mm 플레이트에 있는 선택 배지(1 ㎛ MTX 가 포함된 ESTEP #1)에 1:50, 1:100 및 1:200 비율로 나누었다. 형질전환후 5 일째 되는 날, 플레이트에 신선한 선택 배지를 재공급하였다.

콜로니의 스크리닝

형질전환후 약 10-12 일째 되는 날, 메토트렉세이트 저항 콜로니가 나타난 1 개의 150 mm 배양접시를 각 형질전환물로부터 선택하고, 배지를 흡인 제거한 후, 플레이트를 무혈청 ESTEP 2 배지(668.7 g/50 L DMEM (Gibco), 5.5 g/50 L 피루브산, 나트륨염 96 %(Mallinckrodt), 185.0 g/50 L NaHCO₃(Mallinkrodt), 5.0 mg/ml, 25 ml/50 L 인슐린, 10.0 mg/ml 및 25 ml/50 L 트랜스페린) 10 ml 로 세척하였다. 세척 배지를 흡인제거하고 5 ml 의 무혈청 ESTEP 2 로 대체하였다. 그런 다음 무혈청 ESTEP 2 에 미리 담궈둔 무균의 테플론 메쉬(캘리포니아, 로스앤젤레스의 Spectrum Medical Industries)를 세포위에 놓았다. 그런 다음, 무혈청 ESTEP 2 에 미리 담궈둔 무균의 니트로셀룰로오스 필터를 메쉬위에 놓았다. 니트로셀룰로오스상의 배향 마크가 배양접시로 옮겨졌다. 그런 다음 플레이트를 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터에서 5-6 시간동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 필터를 제거하고 배지를 흡인 제거한 후, DMEM/5 % FBS, 1X PSN(Gibco BRL) 배지로 대체하였다. 그런 다음, 필터를 50 ml 의 완충액(25 mM 트리스, 25 mM 글리신, 50 mM β-메르캅토에탄올)을 포함하는 봉입가능한 백에 넣고 10 분간 65 ℃ 의 수욕에서 인큐베이션하였다. 필터를 회전 진탕기상에서 10 % 무지방 건조 우유/PBS (Sigma)중에서 실온에서 15분간 블로킹하였다. 그런 다음 필터를 4 ℃ 에서, 회전 진탕기에서 10 % 무지방 건조 우유, 0.1 % PBS, 0.1 % TWEEN 중에서 1:1000 으로 희석시켜 항-Glu-Glu 항체-HRP 콘쥬게이트와 함께 하룻밤동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 필터를 0.1 % Tween 20 을 첨가한 PBS 중에서 실온에서 3 회 세척하였고, 1 회 세척시 5-15 분동안 세척하였다. 필터를 ECL 시약(일리노이, 아링턴 하이츠의 Amersham Corp.)으로 제조자의 지시에 따라서 현상하고 필름(Hyperfilm ECL, Amersham)에 약 35 초동안 노출시켰다.

필름을 콜로니를 포함하는 플레이트와 일렬로 배열하였다. 필름을 가이드로서 사용하여 적당한 콜로니를 선택하였다. 무균의 3 mm 콜로니 디스크(메릴랜드, 프레데릭의 PGC Scientific Corp.)를 트립신중에서 적시고 콜로니상에 놓았다. 각 구성물에 대해 12 개의 콜로니를 96웰 플레이트에 있는 선택 배지 200 ㎕ 로 옮겼다. 각 콜로니에 대해 2-배 희석을 계속해서 7 회 수행하였다. 세포를 37 ℃ 에서 1 주동안 성장시키고 희석 배수가 가장 낮은 세포의 웰이 최적의 밀도에 있을 때를 선택하고, 트립신처리한 후, 선택 배지를 함유하고 있는 12 웰 플레이트에 옮겼다. 150 mm 의 배양접시를 또한 트립신처리하고 세포의 잔여물을 모아 웨스턴 블롯 분석 및 마이코플라스마 시험을 실시하였다. 이 집합물을 저장을 위해 냉동시켰다.

클론을 12 웰 플레이트로부터 2 개의 T-75 플라스크 각각으로 직접 확장시켰다. 1 개의 플라스크는 세포성장이 계속되도록 두고, 제 2 플라스크를 무혈청 ESTEP 2 에서 성장시킨 후, 웨스턴 블롯 분석을 위해 수거하였다. 웨스턴 블롯팅 분석에 기초하여 발현 구성물 각각의 클론을 선택하고, 모으고, 대규모 배양액으로 옮겼다.

실시예 6

zsig39CEE 및 zsig39NEE 의 대규모 포유동물 발현

상기 기재된 발현과정으로부터 얻어진 zsig39CEE 를 발현하는 집밀 세포를 포함하는 1 개의 T-162 플라스크와 zsig39NEE 를 포함하는 1 개를 각각 6 개의 T-162 플라스크로 늘였다. 그 결과의 6 개의 플라스크중 1 개를 4 개의 저온 바이알을 냉동시키는 데 사용하였고, 다른 5 개의 플라스크를 Nunc 세포공장을 생성하기 위해 사용하였다.

zsig39CEE 와 zsig39NEE 의 5 개의 T-162 플라스크로부터의 세포를 사용하여 2 개의 Nunc 세포공장(10 층, VWR 로부터 시중에서 입수가능)을 개별적으로 시딩하기 위해 사용하였다. 간단히 설명하면, 상기 기재된 T-162 플라스크로부터의 세포를 트립신을 사용하여 분리시키고, 모은 다음, ESTEP 1 배지(668.7 g/50 L DMEM (Gibco), 5.5 g/50 L 피루브산, 나트륨염 96 %(Mallinckrodt), 185.0 g/50L NaHCO₃(Mallinkrodt), 5.0 mg/ml 및 25 ml/50 L 인슐린(JRH Biosciences), 10.0 mg/ml 및 25 ml/50 L 트랜스페린(JRH Biosciences), 2.5 L/50 L 우태아혈청(특성규명됨)(Hyclone), 1 ㎛ MTX, pH 가 7.05 +/-0.05 로 조정됨) 1.5 L에 첨가하고 37 ℃ 로 예열하였다. 그런 다음 세포를 포함하는 배지를 깔대기를 통해 Nunc 세포공장에 부었다. 세포공장을 37 ℃/5.0 % CO₂인큐베이터에 두었다.

80-100 % 의 집밀도에 이르렀을 때, 가시적인 오염 시험(페놀 적색 변화)을 Nunc 세포공장의 함유물에 대해 수행하였다. 어떤 오염도 발견되지 않았기 때문에, 집밀 공장으로부터의 상층액을 작은 수거용 콘데이너에 모으고, 샘플화한 다음 폐기하였다. 그런 다음 부착세포를 PBS 400 ml 로 1 회 세척하였다. 세포를 공장으로부터 분리시키기 위해, 트립신 100 ml 를 각각에 가하고 제거한 후, 세포를 잔여 트립신중에서 2 내지 5 분간 인큐베이션하였다. 세포를 ESTEP1 배지 200 ml 로 2 회 세척하여 수거하였다. 10 개의 ESTEP1 배지를 포함하는 병(각각 1.5 L, 37 ℃) 각각에 수거한 세포 40 ml 를 가하였다. 그런 다음 1 개의 1.5 L 병을 1 개의 Nunc 공장을 채우기 위해 사용하였다. 각 세포공장을 37 ℃/5.0 % CO₂인큐베이터에 두었다.

80-90 % 의 집밀도에 이르렀을 때, 가시적인 오염 시험(페놀 적색 변화)을 Nunc 세포공장에 대하여 수행하였다. 어떤 오염도 발견되지 않았기 때문에, 집밀 공장으로부터의 상층액을 작은 수거용 콘데이너로 모으고, 샘플화한 후 폐기하였다. 그런 다음 세포를 PBS 400 ml 로 1회 세척하였다. ESTEP2 배지(668.7 g/50 L DMEM (Gibco), 5.5 g/50 L 피루브산, 나트륨염 96 %(Mallinckrodt), 185.0 g/50 L NaHCO₃(Mallinkrodt), 5.0 mg/ml, 25 ml/50 L 인슐린, 10.0 mg/ml 및 25 ml/50 L 트랜스페린) 1.5 L를 각 Nunc 세포공장에 가하였다. 세포공장을 35 ℃/5.0 % CO₂에서 인큐베이션하였다.

약 48시간째에, 가시적인 오염 시험(페놀 적색 변화)을 Nunc 세포공장에 대하여 수행하였다. 각 공장으로부터의 상층액을 작은 수거용 콘테이너에 부었다. 신선한 무혈청 배지(1.5 L)를 각 Nunc 세포공장에 붓고, 이 공장을 37 ℃/5.0 % CO₂에서 인큐베이션하였다. 각 구성물에 대하여 상층액 수거물 1 ml 을 현미경 슬라이드에 옮기고, 오염여부에 대해 현미경분석을 실시하였다. 각 구성물에 대하여 작은 수거용 콘테이너의 내용물을 모으고 즉시 여과하였다. 그런 다음, 실질적으로 상기 기재된 바와 같이 48 시간째에 제 2 수거를 실시하고 세포공장을 이후 폐기하였다. 무균적으로 모은 필터 트레인 장치를 수거 상층액 (조건 배지)의 무균여과를 위해 사용하였다. 조립은 다음과 같았다: 관은 OptiCap 필터(매사추세츠, 베드포드의 Millipore Corp.) 및 Gelman Supercap 50 필터(미시간, 앤 아버의 Gelman Sciences)에 와이어로 고정시켰다. Supercap 50 필터는 또한 후드에 위치한 무균 마개 콘테이너에 부착시켰다; Millipore Opti-cap 필터의 상부에 위치하는 관을 연동펌프에 삽입하였다: 관의 유리 단부를 큰 수거용 콘테이너에 넣었다. 연동 펌프를 200 내지 300 rpm으로 작동시켜 모든 조건 배지가 0.22 ㎛ 의 최종 필터를 통과하여 무균 수집 콘데이너에 담기도록 하였다. 여과물을 정제하는 동안 4 ℃ 의 저온실에 두었다. 각 시간점에서 저장하여 놓았던 배지 샘플을 Millipore 5 kDA 컷오프 농축기(매사추세츠, 베드포드의 Millipore Corp.)로 제조자의 지시에 따라서 10 배 농축시키고, 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. 표준의 이동성의 변화는 거의 2 개의 제제사이의 외관상 크기의 차이 때문일 것이다.

zsig39CEE:

5 T-162 플라스크 = 〉0.125 mg/L, 28 kDa;

1 공장, FBS = 〉0.125 mg/L, 28 kDa;

10 공장, FBS = 〉0.125 mg/L, 28 kDa;

10 공장(#1), SF = 〉0.125 mg/L, 28 kDa; 및

10 공장(#2), SF = 〉0.125 mg/L, 28 kDa

zsig39NEE:

5 T-162 플라스크 = 0.14 mg/L, 38 kDa;

1 공장, FBS = 1.39 mg/L, 38 kDa;

10 공장, FBS = 0.14 mg/L, 38 kDa;

10 공장(#1), SF = 1.39 mg/L, 38 kDa; 및

10 공장(#2), SF = 1.39 mg/L, 38 kDa.

실시예 7

zsig39NEE 및 zsig39CEE 에 대한 정제 조건

다른 언급이 없는 한, 모든 조작은 4℃에서 수행하였다. 다음 방법을 N-말단 또는 C-말단 Glu-Glu(EE) 태그를 포함하는 zsig39 를 정제하기 위해 사용하였다. 어린 햄스터 신장(BHK) 세포로부터 조절 배지 총 25L 를 4 인치, 0.2 mM Millipore(매사추세츠, 베드포드) OptiCap 캡슐 필터 및 0.2mM Gelman(미시간, 앤 아버) Supercap 50 을 통과시켜 연속적으로 무균여과시켰다. 그런 다음, 물질을 3000 kDa 컷오프 Amicon(매사추세츠, 베드포드) S10Y3 멤브레인을 갖춘 Millipore ProFlux A30 접선방향 흐름 농축기를 사용하여 약 1.3 L 까지 농축시켰다. 농축된 물질을 다시 상술된 바와 같이 Gelman 필터로 무균여과하였다. 프로테아제 억제제의 혼합물을 농축 조절배지에 첨가하여 2.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, 미주리, 세인트루이스의 Sigma Chemical Co.), 0.001 mM 류펩틴(인디애나, 인디애나폴리스의 Boehringer-Mannheim), 0.001 mM 펩스타틴(Boehringer-Mannheim) 및 0.4 mM Pefabloc(Boehringer-Mannheim)의 최종농도로 만들었다. 하기 기재된 바와 같이 제조된 항-EE 세파로스 샘플 25.0 ml 을 배치 흡착을 위한 샘플에 첨가하고, 혼합물을 4 ℃ 에서 18.0 시간동안 Wheaton(뉴저지, 밀빌) 롤러 배양장치상에서 온화하게 교반하였다.

그런 다음, 혼합물을 5.0 x 20.0 cm Econo-칼럼(캘리포니아, 허큘레스의 Bio-Rad Laboratories)에 붓고, 겔을 30 칼럼 부피의 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하였다. 보유되지않은 관통 분획을 폐기하였다. 일단, 280 nM 에서 유출물의 흡광도는 0.05 미만이었고, 컬럼을 통과하는 흐름을 0 으로 감소시켰으며, 항-EE 세파로오스 겔을 EE 펩티드(캘리포니아, 산 호세의 AnaSpec) 0.4 mg/ml 을 포함하는 2.0 칼럼 부피의 PBS 로 배치식으로 세척하였다. 사용된 펩티드는 서열 Glu-Tyr-Met-Pro-Val-Asp (SEQ ID NO:27)를 가진다. 4 ℃ 에서 1.0 시간 후, 유출을 다시 시작하였고 용출된 단백질을 수집하였다. 이 분획을 펩티드 용출물이라고 하였다. 그런 다음, 항-EE 세파로오스 겔을 2.0 칼럼 부피의 1.0 M 글리신, pH 2.5 로 세척하였고, 글리신 세척물을 별도로 수집하였다. 필요하다면 이후의 분석을 위해 글리신-용출 분획의 pH 를 소량의 10X PBS 를 가하여 7.0 으로 조정하였고, 4 ℃ 에서 저장하였다.

펩티드 용출물을 15,000 분자량 컷오프 멤브레인 농축기(매사추세츠, 베드포드의 Millipore)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 5.0 ml 로 농축시켰다. 농축시킨 펩티드 용출물을 PBS 로 평형시킨 1.5 x 50 cm 세파덱스 G-50 칼럼(뉴저지, 피스카타웨이의 Pharmacia)상에서 BioCad Sprint HPLC(매사추세츠, 프라밍햄의 PerSeptive BioSystems)를 사용하여 흐름 속도 1.0 ml/분으로 크로마토그래피하여 유리 펩티드로부터 분리시켰다. 2 ml 분획들을 수집하고, 280 nM 에서 흡광도를 모니터하였다. 280 nM 에서 흡수되고 칼럼의 간극부피 가까이에서 용출되는 제 1 피크의 물질을 수집하였다. 이 분획이 순수한 zsig39NEE 또는 zsig39CEE 이었다. 순수한 물질을 상기 기재된 바와 같이 농축시키고 SDS-PAGE 및 항-Glu-Glu 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅으로 분석하였고, 샘플에 대해 아미노산 분석 및 N-말단 서열화를 실시하였다. 샘플의 잔여물을 분취하고, 표준 방법에 따라서 -80 ℃ 에서 저장하였다. 정제된 zsig39 NEE 의 단백질 농도는 0.65 mg/ml 이었고, 정제된 zsig39 CEE 의 단백질 농도는 0.3 mg/ml 이었다.

환원제없이 SDS-PAGE 겔상에서 zsig39NEE 에 대해 전기영동을 실시한 결과, 약 50,000 및 약 29,000 의 외관상 분자량을 가지는 2 개의 밴드가 거의 등몰량으로 쿠마찌 블루로 염색된 겔상에 존재하는 것으로 나타났다. 웨스턴 블롯상에서 이들 밴드는 항-EE 항체와 교차-반응성을 나타냈다. 외관상 분자량이 약 150,000, 약 80,000 및 약 60,000 인 다른 세 개의 밴드도 이들 조건하에서 웨스턴 블롯상에서 관찰되었다. 환원제가 있을 때에는, 외관상 분자량이 30,000 인 단지 하나의 밴드만이 쿠마찌 블루로 염색된 겔상에서 이동하는 것으로 관찰되었다. 이 밴드의 강도는 비-환원 겔상에서 관찰된 어느 하나의 밴드에 비례하여 증가되었다. 30,000 kDa 의 밴드가 또한 웨스턴 블롯상에서 항-EE 항체와의 교차-반응성을 나타내었고, 그것은 유일한 교차-반응성 단백질의 존재였다. 또한, 이 밴드의 강도는 비-환원 조건하에서의 밴드의 강도에 비례하여 증가되었다. zsig39 CEE 에 대해서도 육안으로 동일한 결과가 SDS-PAGE 및 항-EE 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의하여 얻어졌다.

항-EE 세파로오스의 제조

단백질 G-세파로오스 (뉴저지, 피스카타웨이의 Pharmacia) 100 ml 베드 부피를 500 ml 의 Nalgene 0.45 미크론 필터 유니트를 사용하여 0.02 % 아지드나트륨을 포함하는 PBS 100 ml 로 3 회 세척하였다. 겔을 6.0 부피의 200 mM 트리에탄올아민, pH 8.2(TEA, Sigma Co.)로 세척하고, 항체 900 mg 을 포함하는 동부피의 EE 항체용액을 첨가하였다. 4 ℃ 에서 하룻밤동안 인큐베이션한 후, 결합하지 않은 항체를 상기 기재된 바와 같이 5 부피의 200 mM TEA 로 수지를 세척함으로써 제거하였다. 수지를 2 부피의 TEA 에 재현탁시키고 적당한 콘테이너로 옮긴 후, TEA 에 용해시킨 디메틸피밀리미데이트-2HCl (Pierce)을 가하여 최종농도 36 mg/ml 의 겔을 만들었다. 겔을 실온에서 45 분간 좌우로 진동시키고 액체를 상기 기재된 바와 같은 필터를 사용하여 제거하였다. 그런 다음 겔상의 비특이적 부위를 200 mM TEA 중 20 mM 에탄올아민 5 부피로 실온에서 10분간 인큐베이션함으로써 블로킹하였다. 겔을 0.02 % 아지드나트륨을 포함하는 5 부피의 PBS 로 세척하고 4 ℃ 의 이 용액에 저장하였다.

실시예 8

zsig39 아미노 말단 Glu-Glu 태그부착 및 카르복시 말단 Glu-Glu 태그 부착

된 효모 발현 벡터의 제조

피치아 메타놀리카에서의 zsig39 의 발현은 WIPO 공보 WO 97/17450 에 설명된 발현 시스템을 활용한다. zsig39 를 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 함유하고 있는 발현 플라스미드를 동종 재조합을 통하여 제조한다. 발현 벡터를 C-말단 Glu-Glu-태그 부착된 (CEE) zsig39 폴리펩티드를 발현시키기 위하여 pCZR204 로부터 만들었다. pCZR204 벡터는 AUG1 프로모터와, 이어지는 αFpp 리더 서열, 계속되는 블런트-단부의 Sma I 제한 부위, 카르복시-말단 펩티드 태그 (Glu-Glu), 번역 중지 코돈, AUG1 터미네이터, ADE2 선택가능 마아커, 및 마지막으로 AUG1 3' 미번역 영역을 함유하고 있다. 또한 이 벡터에는 맥주효모균에서의 선택 및 복제에 필요한 URA3 및 CEN-ARS 서열, 및 대장균에서의 선택 및 복제에 필요한 AmpR 및 colE1 ori 서열이 포함되어 있다. 두 번째의 발현 벡터는 N-말단 Glu-Glu-태그 부착된 (NEE) zsig39 폴리펩티드를 발현시키기 위하여 zCZR204 로부터 만들었다. zCZR204 발현 벡터는 상술된 바와 같으며, 아미노 말단 Glu-GlU 태그를 가지고 있다. 이들 벡터에 삽입된 zsig39 서열은 zsig39 아미노산 서열 (SEQ ID NO:2) 의 잔기 19 (Leu) 에서 시작된다.

각각의 구성물에 대하여 두 개의 링커를 준비하여, 상술된 효모 발현 벡터안으로 zsig39 를 따라 동종 재조합하였다. 태그가 부착되지 않은 N-말단 링커 (SEQ ID NO:28)는 한 쪽 단부상에 알파 인자 프레프로 (aFpp) 코딩 서열의 70 염기쌍을 가지고 있으며, 그것은 다른 쪽에 있는 성숙한 zsig39 서열로부터의 아미노-말단 코딩 서열의 70 염기쌍에 결합한다. NEE-태그가 부착된 링커 (SEW ID NO:29)는 aFpp 코딩 서열과 zsig39 서열 사이에 있는 Glu-Glu 태그 (SEQ ID NO: 20)와 결합한다. 태그가 부착되지 않은 C-말단 링커 (SEQ ID NO: 30)는 AUG1 터미네이터 서열의 70 염기쌍을 가지고 있는 한 쪽 단부상의 zsig39 의 카르복시 말단 코딩 서열의 약 70 염기쌍을 가지고 있다. CEE-태그가 부착된 링커 (SEQ ID NO: 31)는 Glu-Glu 태그 (SEQ ID NO: 20)를 zsig39 의 C-말단 단부와 AUG1 터미네이터 영역 사이에 삽입시킨다.

NEE-태그 부착-zsig39 플라스미드의 제조

NEE-태그 부착-zsig39 플라스미드를, 100 ng 의 Sma I 소화된 pCZR204 수용체 벡터, 1 ㎍ 의 NEE-태그 부착-zsig39 링커 (SEQ ID NO: 29) 및 1 ㎍ 의 C-말단 태그 미부착 링커 (SEQ ID NO: 30) 을 맥주효모균내에서 동종 재조합시킴으로써 제조하였다.

NEE-zsig39 링커를 PCR 반응에 의하여 합성하였다. 100 ㎕ 의 최종 반응 부피에 링커, ZC13731 (SEQ ID NO: 32) 및 ZC15268 (SEQ ID NO: 33) 을 각각 1 pmol 씩, 프라이머 ZC13497 (SEQ ID NO: 34) 및 ZC15274 (SEQ ID NO: 35) 를 각각 100 pmol 씩, 10 ㎕ 의 10 × PCR 완충제 (Boehringer Mannheim), 1㎕ 의 Pwo 중합효소 (Boehringer Mannheim), 10 ㎕ 의 0.25 mM 뉴클레오티드 트리포스페이트 믹스 (Perkin Elmer) 및 dH₂O 를 첨가하였다. PCR 반응을 94 ℃ 에서 30 초동안, 50 ℃ 에서 1 분 및 72 ℃ 에서 1 분동안을 10 회 반복하고, 마지막으로 72 ℃ 에서 6 분간 진행시켰다. 그 결과 생성된 144 bp 의 이중 가닥, NEE-태그 부착된 링커를 SEQ ID NO: 29 에 표시한다.

C-말단 태그 미부착 zsig39 링커는 상술된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 ZC15273 (SEQ ID NO: 36), ZC15724 (SEQ ID NO: 37), ZC15223 (SEQ ID NO: 38) 및 ZC13734 (SEQ ID NO: 39) 를 사용하여 PCR 반응에 의하여 만들었다. 그 결과 생성된 147 bp 의 이중 가닥, C-말단 태그 미부착 링커를 SEQ ID NO: 30 에 표시한다.

CEE-zsig39 플라스미드의 제조

CEE-zsig39 플라스미드를, 100 ng 의 Sma I 소화된 pCZR204 수용체 벡터, 1 ㎍ 의 Eco RI-Bam HI zsig39 cDNA 공여체 단편, 1 ㎍ 의 N-말단 태그 미부착 zsig39 링커 (SEQ ID NO: 28) 및 1 ㎍ 의 CEE-태그 부착 링커 (SEQ ID NO: 31) 을 맥주효모균내에서 동종 재조합시킴으로써 제조하였다.

N-말단 태그 미부착 zsig39 링커는 상술된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 ZC14822 (SEQ ID NO: 40), ZC14821 (SEQ ID NO: 41), ZC15269 (SEQ ID NO: 42) 및 ZC15274 (SEQ ID NO: 43) 를 사용하여 PCR 반응에 의하여 만들었다. 그 결과 생성된 144 bp 의 이중 가닥, N-말단 태그 미부착 링커를 SEQ ID NO: 28 에 표시한다.

CEE-태그 부착 링커를 상술된 바와 같이, ZC15273 (SEQ ID NO: 44), ZC15267 (SEQ ID NO: 45), ZC14819 (SEQ ID NO: 49) 및 ZC14820 (SEQ ID NO: 47) 을 사용하여 PCR 반응에 의하여 만들었다. 그 결과 생성된 144 bp 의 이중 가닥, CEE-태그 부착 링커를 SEQ ID NO: 31 에 표시한다.

100 ㎕ 의 경합하는 효모 세포 (맥주효모균)를 상기로부터 얻어진 다양한 DNA 혼합물 10 ㎕ 와 독립적으로 혼합하고, 그것을 0.2 cm 의 일렉트로포레이션 큐벳에 옮겼다. 효모/DNA 혼합물에 0.75 kV (5 kV/cm), ∞ 오옴, 25 ㎌ 에서 전기 충격을 주었다. 각각의 큐벳에 600 ㎕ 의 1.2 M 소르비톨을 첨가하고, 효모를 2 개의 URA D 플레이트위에 있는 두 개의 300 ㎕ 분취액에 놓고 30 ℃ 에서 인큐베이션하였다.

48 시간이 지난후, 1 개의 플레이트로부터의 Ura⁺효모 형질전환체를 2.5 ml 의 H₂O 에 현탁시키고, 간단하게 회전시켜서 효모 세포를 펠릿화하였다. 세포 펠릿을 1 ml 의 용해 완충액 (2 % 의 트리톤 X-100, 1 % 의 SDS, 100 mM 의 NaCl, 10 mM 의 트리스, pH 8.0, 1 mM 의 EDTA) 중에 재현탁하였다. 500 ㎕ 의 용해 혼합물을 300 ㎕ 의 세척된 유리 비이드와 200 ㎕ 의 페놀-클로로포름이 함유되어 있는 에펜도르프 튜브에 넣고, 1 분 간격으로 2 또는 3 회 회전시킨 후, 에펜도르프 원심분리기에서 최대 속도로 5 분동안 회전시켰다. 300 ㎕ 의 수성층을 새로운 튜브에 옮기고, 600 ㎕ 의 에탄올 (EtOH)로 DNA 를 침전시킨 후, 4 ℃ 에서 10 분동안 원심분리하였다. DNA 펠릿을 100 ㎕ 의 H₂O 에 재현탁시켰다.

전기경합성 대장균 세포 (DH10B, Gibco BRL)의 형질전환을 1 ㎕ 의 효모 DNA prep 와 50 ㎕ 의 DH10B 세포를 사용하여 수행하였다. 세포에 2.0 kV, 25 ㎌ 및 400 오옴에서 전기 충격을 주었다. 일렉트로포레이션 후에, 1 ml 의 SOC (2 % 의 Bacto^TM트립톤 (Difco, Detroit, MI), 0.5 % 의 효모 추출물 (Difco), 10 mM 의 NaCl, 2.5 mM 의 KCl, 10 mM 의 MgCl₂, 10 mM 의 MgSO₄, 20 mM 의 글루코오스)를 4 개의 LB AMP 플레이트 (LB 육즙 (Lennox), 1.8 % 의 Bacto^TMAgar (Difco), 100 mg/L 암피실린)상에 있는 250 ㎕ 의 분취액중에 넣었다.

NEE 및 CEE 태그 부착 zsig39 구성물에 대한 정확한 발현 구성물을 포함하고 있는 개별적인 클론들을, zsig39 삽입물의 존재를 확인하기 위한 및 다양한 DNA 서열이 다른 DNA 서열에 정확하게 결합되었는지의 여부를 증명하기 위한 서열 분석에 의하여 확인하였다. 양성 클론의 삽입물에 대하여 서열 분석을 실시하였다. 보다 큰 규모의 플라스미드 DNA 를 Qiagen Maxi 키트 (Qiagen)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 단리하고, DNA 를 Not I 으로 소화시켜서 벡터 골격으로부터 피치아-Zsig39 발현 카세트를 분리시켰다. 그런 다음 Not I-제한 효소 소화된 DNA 단편을 피치아 메타놀리카 발현 숙주인 PMAD16 안에 형질전환시켰다. 이 과정은 100 ㎕ 의 준비된 경합 PMAD16 세포와 10 ㎍ 의 Not I 제한 소화된 zsig39 를 혼합하고, 그 혼합물을 0.2 cm 의 일렉트로포레이션 큐벳에 옮김으로써 수행하였다. 효모/DNA 혼합물에 0.75 kV, 25 ㎌, 무한 오옴에서 전기적 충격을 주었다. 큐벳에 1 ml 의 1 × 효모 니트로겐 베이스를 첨가하고, 선택을 위하여 500 ㎕ 의 분취액을 2 개의 ADE DS (0.056 % 의 -Ade -Trp -Thr 분말, 0.67 % 의 아미노산이 제거된 효모 질소 베이스, 2 % 의 D-글루코오스, 0.5 % 의 200× 트립토판, 트레오닌 용액, 및 18.22 % 의 D-소르비톨) 플레이트위에 플레이팅하고, 30 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 클론을 취하여 고수준의 zsig39 에 대하여 웨스턴 블롯에 의하여 스크린하였다. 그 결과 생성된 효모 세포를 함유하고 있는 NEE-태그 부착-zsig39 플라스미드를 PMAD16::pCZR206.14.51 및 14.61 로 표시하였고, CEE-태그 부착-zsig39 플라스미드는 PMAD16::pCZR209#1 및 #2 로 표시하였다. 그런 다음 클론들의 발효를 실시하였다.

실시예 9

피치아 메타놀리카 조절 배지로부터의 zsig39CEE 의 정제

다른 언급이 없는 한, 모든 조작은 4 ℃ 에서 수행하였다. 프로테아제 억제제의 혼합물을 피치아 배양물로부터의 조절 배지의 3000 ml 의 샘플에, 최종 농도가 각각 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA, Sigma Chemical Co.) 2.5 mM, 류펩틴 (Boehringer-Mannheim) 0.001 mM, 펩스타틴 (Boehringer-Mannheim) 0.001 mM, 및 페파블록 (Pefabloc) (Boehringer-Mannheim) 0.4 mM 이 되도록 첨가하였다. 배지의 pH 를 NaOH 의 농축 용액 (Sigma Chemical Co.)을 사용하여 7.2 로 조정하고, 인산 칼륨 (Sigma Chemical Co.)을 최종 농도가 0.05 M 이 되도록 첨가하였다. 샘플을 18,000 × g 에서 30 분동안 4 ℃ 에서, 벡크만 아반티 J251 원심분리기 (Beckman Instrument)에서 벡크만 JLA-10.5 로터 (Beckman Instrument)로 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 상술된 바와 같이 제조된 50.0 ml 의 항-EE 세파로오스 샘플을 상층액 분획에 첨가하고, 이 혼합물을 훼톤 (Wheaton, Millville, NJ) 로울러 배양 장치상에서 18.0 시간동안 4 ℃ 에서 부드럽게 교반하였다. 그런 다음 혼합물을 BHK 세포로부터의 zsig39CEE 에 대하여 상술된 바와 같이 프로세싱하였다. 순수한 물질을 상술된 바와 같이 농축하고, SDS-PAGE 에 의하여 및 항-EE 항체를 사용한 웨스턴 불롯팅에 의하여 분석한 후, 샘플을 취하여 아미노산 분석 및 N-말단 서열화를 수행하였다. 나머지 샘플을 분취하고, 본 발명자들의 표준 과정에 따라 -80 ℃ 에서 보관하였다.

쿠마찌 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔 상에서 볼 때, 제제는 외관상 분자량이 23,000 및 28,000 인 2 개의 주요 밴드 및 외관상 분자량이 21,000 및 45,000 인 2 개의 소량 성분을 포함하였다. 이들 밴드의 이동성은 환원제가 있을 때와 없을 때 동일하였다. 환원제가 없을 때 나타나는 항-EE 항체를 사용한 웨스턴 블롯상에서 가시적인 유일한 밴드는 외관상 분자량이 150,000 인 단백질이었다 (아마도 항 EE 세파로오스 칼럼으로부터 용출된 IgG 일 것이다). 대조적으로, 환원제가 존재할 때, 항-EE 항체를 사용한 웨스턴 불롯팅 결과는 외관상 분자량이 28,000, 24,000 및 23,000 인 세 개의 밴드를 나타냈다. 피치아 메타놀리카로부터 얻어지는 zsig39CEE 의 농도는 0.35 mg/ml 이었다.

실시예 10

Zsig39 항체

완전한 길이의 zsig 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 2)를 사용하여 2 마리의 암컷 뉴질랜드 백색 토끼를 면역시킴으로써 다클론성 항체를 제조하였다. 상술된 물질을 발현하는 정제된 BHK 로부터 폴리펩티드를 유도하였다. 폴리펩티드를 글루타르알데하이드를 사용하여 담체 단백질인 키호울 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 포합시켰다. 토끼에게 각각 처음에는 완전 프로인트 보조제중의 200 ㎍ 의 펩티드를 복강내 (ip) 주사에 의하여 투여한 후, 매 3 주마다 불완전 프로인트 보조제중의 100 ㎍ 의 펩티드를 추가로 (booster) ip 주사하였다. 세 번째 추가 주사를 투여하고 7 일 내지 10 일 후에, 동물들을 출혈시키고, 혈청을 수집하였다. 그런 다음 동물들에게 다시 추가로 펩티드를 투여하고 매 3 주마다 출혈시켰다.

단백질 A 세파로오스를 사용하여 혈청으로부터 zsig39 특이적 항체를 정제하였다. zsig39 항체를 항체 표적으로서 SEQ ID NO: 2 의 폴리펩티드를 사용하여 ELISA 역가를 체크함으로써 특성을 확인하였다.

실시예 11

아데노바이러스 수송을 통한 zsig39 의 생체내 투여

약 12 주된 24 마리의 수컷 및 24 마리의 암컷 C57B16/J 마우스(메인, 바 하버의 Jackson Labs)의 체중, 체온을 측정하고, 음식물 섭취를 주사(시험전 4일 내지 1일)하기 전 4일동안 매일 모니터하였다. 0 일째, 마우스를 3개의 군으로 나누고 꼬리 정맥내 주사로 0.1 ml 의 바이러스 (AdV-결여 1.8x10¹¹바이러스 입자/0.1 ml 또는 AdV-zsig39-CEE 5x10¹¹바이러스 입자/0.1 ml)를 투여하거나, 또는 전혀 주사하지 않았다. 주사는 숙주의 간에 감염을 일으키고, 바이러스에 의해 수송된 유전자의 발현은 24 시간내에 개시되고 1 내지 4 주동안 계속되어야 한다. 3 개의 군의 마우스를 시험하였다. 군 1, 미처리, n=8 각각 수컷 및 암컷. 군 2, AdV-결여 (결여된 바이러스), n=8 각각 수컷 및 암컷. 군 3, AdV-zsig39CEE, n=8 각각 수컷 및 암컷. zsig39CEE 를 함유하는 아데노바이러스의 제조는 상업적으로 구입할 수 있는 벡터를 사용하여 문헌의 과정을 따라 수행하였다 [Becker et al., Meth. Cell. Biol. 43:161-189, 1994].

동물의 체온, 체중 및 섭취한 음식의 중량을 3 주의 시험기간동안 모니터하였다. 군간의 어떠한 차이도 발견되지 않았다.

21 일째, 암컷 마우스를 경부탈구로 안락사시켜 희생시키고, 22 일째에는 수컷도 동일하게 희생시켰다. 동물을 채혈하고 검시를 위해 조직을 수거하였다.

동물을 희생시킬 때 표준 혈청화학 패널을 수행하였다. 간, 신장 및 대사 파라메터는 모두 정상범위내에 있었다. 각각의 동물로부터 얻어진 남아있는 혈청에 대하여 총 유리 지방산을 검정하였다. 결여된 바이러스를 받은 암컷 및 수컷 마우스들 (두 경우 모두 p〈0.05 %)과 zsig39 를 코드화하는 바이러스를 받은 마우스들 사이에서, 던스 멀티플 컴패리슨 시험 (Dunn's Multiple Comparisons Test) 결과, 혈청내 유리 지방산 수준에 통계학적으로 유의할만한 차이는 볼 수 없었다. Zsig39 마우스들이 더 낮은 수준을 나타냈다. 마우스들의 간, 비장, 신장, 갑상선, 심장 및 뇌의 무게를 제거후 측정하였다. 이들 조직 및 대퇴부를 조직학 연구를 위하여 보관하였다. 대퇴골의 메타피지얼 (metaphyseal) 골수에 대한 조직병리학적 분석 결과, 처리군 사이에 차이가 나타났다. 암컷 zsig39 마우스들의 메타피지얼 골수로부터 얻은 지방 스코어의 평균 % 는 결여된 아데노바이러스를 받은 수컷 마우스들의 그것보다 상당히 더 컸다(던스 멀티플 컴패리슨 시험에 의해 p〈0.05 %). 조사된 다른 조직에 대해서는 유의할만한 관찰 결과가 없었다.

전술한 설명으로부터, 본 발명의 특정 구체예가 예시의 목적으로 이 명세서에 기재되어졌지만, 다양한 변형이 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있을 것으로 인지될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의한 제한외에는 제한되지 않는다.

〈110〉 ZYMOGENETICS, INC.

〈120〉 ADIPOCYTE-SPECIFIC PROTEIN HOMOLOGS

〈130〉 2

〈150〉 US 60/056,983

〈151〉 1997-08-26

〈160〉 47

〈170〉 KOPATIN 1.5

〈210〉 1

〈211〉 1347

〈212〉 DNA

〈213〉 Homo sapiens

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (198)..(926)

〈400〉 1

gaattcggct cgagagggag cgaaccagga ctggggtgac ggcagggcag ggggcgcctg 60

gccggggaga agcgcggggg ctggagcacc accaactgga gggtccggag tagcgagcgc 120

cccgaaggag gccatcgggg agccgggagg ggggactgcg agaggacccc ggcgtccggg 180

ctcccggtgc cagcgct atg agg cca ctc ctc gtc ctg ctg ctc ctg ggc 230

Met Arg Pro Leu Leu Val Leu Leu Leu Leu Gly

1 5 10

ctg gcg gcc ggc tcg ccc cca ctg gac gac aac aag atc ccc agc ctc 278

Leu Ala Ala Gly Ser Pro Pro Leu Asp Asp Asn Lys Ile Pro Ser Leu

15 20 25

tgc ccg ggg cac ccc ggc ctt cca ggc acg ccg ggc cac cat ggc agc 326

Cys Pro Gly His Pro Gly Leu Pro Gly Thr Pro Gly His His Gly Ser

30 35 40

cag ggc ttg ccg ggc cgc gat ggc cgc gac ggc cgc gac ggc gcg ccc 374

Gln Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Ala Pro

45 50 55

ggg gct ccg gga gag aaa ggc gag ggc ggg agg ccg gga ctg ccg gga 422

Gly Ala Pro Gly Glu Lys Gly Glu Gly Gly Arg Pro Gly Leu Pro Gly

60 65 70 75

cct cga ggg gac ccc ggg ccg cga gga gag gcg gga ccc gcg ggg ccc 470

Pro Arg Gly Asp Pro Gly Pro Arg Gly Glu Ala Gly Pro Ala Gly Pro

80 85 90

acc ggg cct gcc ggg gag tgc tcg gtg cct ccg cga tcc gcc ttc agc 518

Thr Gly Pro Ala Gly Glu Cys Ser Val Pro Pro Arg Ser Ala Phe Ser

95 100 105

gcc aag cgc tcc gag agc cgg gtg cct ccg ccg tct gac gca ccc ttg 566

Ala Lys Arg Ser Glu Ser Arg Val Pro Pro Pro Ser Asp Ala Pro Leu

110 115 120

ccc ttc gac cgc gtg ctg gtg aac gag cag gga cat tac gac gcc gtc 614

Pro Phe Asp Arg Val Leu Val Asn Glu Gln Gly His Tyr Asp Ala Val

125 130 135

acc ggc aag ttc acc tgc cag gtg cct ggg gtc tac tac ttc gcc gtc 662

Thr Gly Lys Phe Thr Cys Gln Val Pro Gly Val Tyr Tyr Phe Ala Val

140 145 150 155

cat gcc acc gtc tac cgg gcc agc ctg cag ttt gat ctg gtg aag aat 710

His Ala Thr Val Tyr Arg Ala Ser Leu Gln Phe Asp Leu Val Lys Asn

160 165 170

ggc gaa tcc att gcc tct ttc ttc cag ttt ttc ggg ggg tgg ccc aag 758

Gly Glu Ser Ile Ala Ser Phe Phe Gln Phe Phe Gly Gly Trp Pro Lys

175 180 185

cca gcc tcg ctc tcg ggg ggg gcc atg gtg agg ctg gag cct gag gac 806

Pro Ala Ser Leu Ser Gly Gly Ala Met Val Arg Leu Glu Pro Glu Asp

190 195 200

caa gtg tgg gtg cag gtg ggt gtg ggt gac tac att ggc atc tat gcc 854

Gln Val Trp Val Gln Val Gly Val Gly Asp Tyr Ile Gly Ile Tyr Ala

205 210 215

agc atc aag aca gac agc acc ttc tcc gga ttt ctg gtg tac tcc gac 902

Ser Ile Lys Thr Asp Ser Thr Phe Ser Gly Phe Leu Val Tyr Ser Asp

220 225 230 235

tgg cac agc tcc cca gtc ttt gct tagt gcccactgca aagtgagctc 950

Trp His Ser Ser Pro Val Phe Ala

240

atgctctcac tcctagaagg agggtgtgag gctgacaacc aggtcatcca ggagggctgg 1010

cccccctgga atattgtgaa tgactaggga ggtggggtag agcactctcc gtcctgctgc 1070

tggcaaggaa tgggaacagt ggctgtctgc gatcaggtct ggcagcatgg ggcagtggct 1130

ggatttctgc ccaagaccag aggagtgtgc tgtgctggca agtgtaagtc ccccagttgc 1190

tctggtccag gagcccacgg tggggtgctc tcttcctggt cctctgcttc tctggatcct 1250

ccccaccccc tcctgctcct ggggccggcc cttttctcag agatcactca ataaacctaa 1310

gaaccctcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaggg cggccgc 1347

〈210〉 2

〈211〉 243

〈212〉 PRT

〈213〉 Homo sapiens

〈400〉 2

Met Arg Pro Leu Leu Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Ala Ala Gly Ser

1 5 10 15

Pro Pro Leu Asp Asp Asn Lys Ile Pro Ser Leu Cys Pro Gly His Pro

20 25 30

Gly Leu Pro Gly Thr Pro Gly His His Gly Ser Gln Gly Leu Pro Gly

35 40 45

Arg Asp Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Glu

50 55 60

Lys Gly Glu Gly Gly Arg Pro Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Asp Pro

65 70 75 80

Gly Pro Arg Gly Glu Ala Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly

85 90 95

Glu Cys Ser Val Pro Pro Arg Ser Ala Phe Ser Ala Lys Arg Ser Glu

100 105 110

Ser Arg Val Pro Pro Pro Ser Asp Ala Pro Leu Pro Phe Asp Arg Val

115 120 125

Leu Val Asn Glu Gln Gly His Tyr Asp Ala Val Thr Gly Lys Phe Thr

130 135 140

Cys Gln Val Pro Gly Val Tyr Tyr Phe Ala Val His Ala Thr Val Tyr

145 150 155 160

Arg Ala Ser Leu Gln Phe Asp Leu Val Lys Asn Gly Glu Ser Ile Ala

165 170 175

Ser Phe Phe Gln Phe Phe Gly Gly Trp Pro Lys Pro Ala Ser Leu Ser

180 185 190

Gly Gly Ala Met Val Arg Leu Glu Pro Glu Asp Gln Val Trp Val Gln

195 200 205

Val Gly Val Gly Asp Tyr Ile Gly Ile Tyr Ala Ser Ile Lys Thr Asp

210 215 220

Ser Thr Phe Ser Gly Phe Leu Val Tyr Ser Asp Trp His Ser Ser Pro

225 230 235 240

Val Phe Ala

〈210〉 3

〈211〉 244

〈212〉 PRT

〈213〉 Homo sapiens

〈400〉 3

Met Leu Leu Leu Gly Ala Val Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gly His

1 5 10 15

Asp Gln Glu Thr Thr Thr Gln Gly Pro Gly Val Leu Leu Pro Leu Pro

20 25 30

Lys Gly Ala Cys Thr Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His Pro Gly

35 40 45

His Asn Gly Ala Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro Gly Glu

50 55 60

Lys Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Leu Ile Gly Pro Lys Gly Asp Ile

65 70 75 80

Gly Glu Thr Gly Val Pro Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly

85 90 95

Ile Gln Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Gly Ala Tyr Val Tyr Arg

100 105 110

Ser Ala Phe Ser Val Gly Leu Glu Thr Tyr Val Thr Ile Pro Asn Met

115 120 125

Pro Ile Arg Phe Thr Lys Ile Phe Tyr Asn Gln Gln Asn His Tyr Asp

130 135 140

Gly Ser Thr Gly Lys Phe His Cys Asn Ile Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe

145 150 155 160

Ala Tyr His Ile Thr Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val Ser Leu Phe

165 170 175

Lys Lys Asp Lys Ala Met Leu Phe Thr Tyr Asp Gln Tyr Gln Glu Asn

180 185 190

Asn Val Asp Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu His Leu Glu Val Gly

195 200 205

Asp Gln Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Glu Gly Glu Arg Asn Gly Leu

210 215 220

Tyr Ala Asp Asn Asp Asn Asp Ser Thr Phe Thr Gly Phe Leu Leu Tyr

225 230 235 240

His Asp Thr Asn

〈210〉 4

〈211〉 245

〈212〉 PRT

〈213〉 Homo sapiens

〈400〉 4

Met Glu Gly Pro Arg Gly Trp Leu Val Leu Cys Val Leu Ala Ile Ser

1 5 10 15

Leu Ala Ser Met Val Thr Glu Asp Leu Cys Arg Ala Pro Asp Gly Lys

20 25 30

Lys Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Arg Arg Gly Arg Pro Gly Leu Lys

35 40 45

Gly Glu Gln Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Ile Arg Thr Gly Ile Gln

50 55 60

Gly Leu Lys Gly Asp Gln Gly Glu Pro Gly Pro Ser Gly Asn Pro Gly

65 70 75 80

Lys Val Gly Tyr Pro Gly Pro Ser Gly Pro Leu Gly Ala Arg Gly Ile

85 90 95

Pro Gly Ile Lys Gly Thr Lys Gly Ser Pro Gly Asn Ile Lys Asp Gln

100 105 110

Pro Arg Pro Ala Phe Ser Ala Ile Arg Arg Asn Pro Pro Met Gly Gly

115 120 125

Asn Val Val Ile Phe Asp Thr Val Ile Thr Asn Gln Glu Glu Pro Tyr

130 135 140

Gln Asn His Ser Gly Arg Phe Val Cys Thr Val Pro Gly Tyr Tyr Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Phe Gln Val Leu Ser Gln Trp Glu Ile Cys Leu Ser Ile Val

165 170 175

Ser Ser Ser Arg Gly Gln Val Arg Arg Ser Leu Gly Phe Cys Asp Thr

180 185 190

Thr Asn Lys Gly Leu Phe Gln Val Val Ser Gly Gly Met Val Leu Gln

195 200 205

Leu Gln Gln Gly Asp Gln Val Trp Val Glu Lys Asp Pro Lys Lys Gly

210 215 220

His Ile Tyr Gln Gly Ser Glu Ala Asp Ser Val Phe Ser Gly Phe Leu

225 230 235 240

Ile Phe Pro Ser Ala

245

〈210〉 5

〈211〉 215

〈212〉 PRT

〈213〉 Tamias sibricus

〈400〉 5

Met Pro Ala Gln Arg Gly Gly Ala Leu Ser Met Gly Ala Ala Gly Phe

1 5 10 15

Trp Ile Leu Val Leu Ser Ile Thr Ser Ala Leu Ala Asp Ser Asn Asn

20 25 30

Gln Gly Asn Ser Glu Pro Cys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro

35 40 45

Gly Ile Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Ala Leu Gly Pro Pro Gly

50 55 60

Pro Pro Gly Val Pro Gly Ile Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Asp

65 70 75 80

Val Glu Lys Cys Ser Ser Arg Pro Lys Ser Ala Phe Ala Val Lys Leu

85 90 95

Ser Glu Arg Pro Pro Glu Pro Phe Gln Pro Ile Val Phe Lys Glu Ala

100 105 110

Leu Tyr Asn Gln Glu Gly His Phe Asn Met Ala Thr Gly Glu Phe Ser

115 120 125

Cys Val Leu Pro Gly Val Tyr Asn Phe Gly Phe Asp Ile Arg Leu Phe

130 135 140

Gln Ser Ser Val Lys Ile Arg Leu Met Arg Asp Gly Ile Gln Val Arg

145 150 155 160

Glu Lys Glu Ala Gln Ala Asn Asp Ser Tyr Lys His Ala Met Gly Ser

165 170 175

Val Ile Met Ala Leu Gly Lys Gly Asp Lys Val Trp Leu Glu Ser Lys

180 185 190

Leu Lys Gly Thr Glu Ser Glu Lys Gly Ile Thr His Ile Val Phe Phe

195 200 205

Gly Tyr Leu Leu Tyr Gly Lys

210 215

〈210〉 6

〈211〉 236

〈212〉 PRT

〈213〉 Tamias sibricus

〈400〉 6

Met Tyr Glu Ala Gly Lys Arg Ala Ser Phe Met Gly Gly Ala Gly Ile

1 5 10 15

Trp Ile Leu Ala Leu Ser Val Leu Met His Val Val Cys Ser Met Tyr

20 25 30

Glu Ala Gly Lys Arg Ala Ser Phe Met Gly Gly Ala Gly Ile Trp Ile

35 40 45

Leu Ala Leu Ser Val Leu Met His Val Val Cys Ser Asn Val Pro Gly

50 55 60

Pro Gln Gly Pro Pro Gly Met Arg Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Lys

65 70 75 80

Pro Gly Pro Pro Gly Trp Asn Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro

85 90 95

Gly Pro Pro Gly Met Thr Val Asn Cys His Ser Lys Gly Thr Ser Ala

100 105 110

Phe Ala Val Lys Ala Asn Glu Leu Pro Pro Ala Pro Ser Gln Pro Val

115 120 125

Ile Phe Lys Glu Ala Leu His Asp Ala Gln Gly His Phe Asp Leu Ala

130 135 140

Thr Gly Val Phe Thr Cys Pro Val Pro Gly Leu Tyr Gln Phe Gly Phe

145 150 155 160

His Ile Glu Ala Val Gln Arg Ala Val Lys Val Ser Leu Met Arg Asn

165 170 175

Gly Thr Gln Val Met Glu Arg Glu Ala Glu Ala Gln Asp Gly Tyr Glu

180 185 190

His Ile Ser Gly Thr Ala Ile Leu Gln Leu Gly Met Glu Asp Arg Val

195 200 205

Trp Leu Glu Asn Lys Leu Ser Gln Thr Asp Leu Glu Arg Gly Thr Val

210 215 220

Gln Ala Val Phe Ser Gly Phe Leu Ile His Glu Asn

225 230 235

〈210〉 7

〈211〉 222

〈212〉 PRT

〈213〉 Rattus norvegicus

〈400〉 7

Met Pro Ala Pro Gly Arg Gly Pro Arg Gly Pro Leu Leu Ser Met Pro

1 5 10 15

Gly Arg Arg Gly Ala Leu Arg Glu Pro Ala Asp Phe Gly Ser Ser Leu

20 25 30

Gly Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Cys Cys Pro

35 40 45

Val Lys Met Tyr Glu Ala Gly Lys Arg Ala Ser Phe Met Gly Gly Ala

50 55 60

Gly Ile Trp Ile Leu Ala Leu Ser Val Leu Met His Val Val Cys Ser

65 70 75 80

Gly Ile Ser Val Arg Ser Gly Ser Ala Lys Val Ala Phe Ser Ala Thr

85 90 95

Arg Ser Thr Asn His Glu Pro Ser Glu Met Ser Asn Arg Thr Met Thr

100 105 110

Ile Tyr Phe Asp Gln Val Leu Val Asn Ile Gly Asn His Phe Asp Leu

115 120 125

Ala Ser Ser Ile Phe Val Ala Pro Arg Lys Gly Ile Tyr Ser Phe Ser

130 135 140

Phe His Val Val Lys Val Tyr Asn Arg Gln Thr Ile Gln Val Ser Leu

145 150 155 160

Met Gln Asn Gly Tyr Pro Val Ile Ser Ala Phe Ala Gly Asp Gln Asp

165 170 175

Val Thr Arg Glu Ala Ala Ser Asn Gly Val Leu Leu Leu Met Glu Arg

180 185 190

Glu Asp Lys Val His Leu Lys Leu Glu Arg Gly Asn Leu Met Gly Gly

195 200 205

Trp Lys Tyr Ser Thr Phe Ser Gly Phe Leu Val Phe Pro Leu

210 215 220

〈210〉 8

〈211〉 247

〈212〉 PRT

〈213〉 Homo sapiens

〈400〉 8

Met Leu Leu Leu Gln Ala Leu Leu Phe Leu Leu Ile Leu Pro Ser His

1 5 10 15

Ala Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val

20 25 30

Pro Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly

35 40 45

His Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr

50 55 60

Pro Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys

65 70 75 80

Gly Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly

85 90 95

Phe Pro Gln Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Ala Ala Tyr

100 105 110

Met Tyr Arg Ser Ala Phe Ser Val Gly Leu Glu Thr Arg Val Thr Val

115 120 125

Pro Asn Val Pro Ile Arg Phe Thr Lys Ile Phe Tyr Asn Gln Gln Asn

130 135 140

His Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Asn Ile Pro Gly Leu

145 150 155 160

Tyr Tyr Phe Ser Tyr His Ile Thr Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val

165 170 175

Ser Leu Phe Lys Lys Asp Lys Ala Val Leu Phe Thr Tyr Asp Gln Tyr

180 185 190

Gln Glu Lys Asn Val Asp Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu His Leu

195 200 205

Glu Val Gly Asp Gln Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Asp Gly Asp His

210 215 220

Asn Gly Leu Tyr Ala Asp Asn Val Asn Asp Ser Thr Phe Thr Gly Phe

225 230 235 240

Leu Leu Tyr His Asp Thr Asn

245

〈210〉 9

〈211〉 4517

〈212〉 DNA

〈213〉 Homo sapiens

〈400〉 9

ctgattccat accagagggg ctcaggatgc tgttgctggg agctgttcta ctgctattag 60

ctctgcccgg gcatgaccag gaaaccacga ctcaagggcc cggagtcctg cttcccctgc 120

ccaagggggc ctgcacaggt tggatggcgg gcatcccagg gcatccgggc cataatgggg 180

ccccaggccg tgatggcaga gatggcaccc ctggtgagaa gggtgagaaa ggagatccag 240

gtcttattgg tcctaaggga gacatcggtg aaaccggagt acccggggct gaaggtcccc 300

gaggctttcc gggaatccaa ggcaggaaag gagaacctgg agaaggtgcc tatgtatacc 360

gctcagcatt cagtgtggga ttggagactt acgttactat ccccaacatg cccattcgct 420

ttaccaagat cttctacaat cagcaaaacc actatgatgg ctccactggt aaattccact 480

gcaacattcc tgggctgtac tactttgcct accacatcac agtctatatg aaggatgtga 540

aggtcagcct cttcaagaag gacaaggcta tgctcttcac ctatgatcag taccaggaaa 600

ataatgtgga ccaggcctcc ggctctgtgc tcctgcatct ggaggtgggc gaccaagtct 660

ggctccaggt gtatggggaa ggagagcgta atggactcta tgctgataat gacaatgact 720

ccaccttcac aggctttctt ctctaccatg acaccaactg atcaccacta actcagagcc 780

tcctccaggc caaacagccc caaagtcaat taaaggcttt cagtacggtt aggaagttga 840

ttattattta gttggaggcc tttagatatt attcattcat ttactcattc atttattcat 900

tcattcatca agtaacttta aaaaaatcat atgctatgtt cccagtcctg gggagcttca 960

caaacatgac cagataactg actagaaaga agtagttgac agtgctattt tgtgcccact 1020

gtctctcctg atgctcatat caatcctata aggcacaggg aacaagcatt ctcctgtttt 1080

tacagattgt atcctgaggc tgagagagtt aagtgaatgt ctaaggtcac acagtattaa 1140

gtgacagtgc tagaaatcaa acccagagct gtggactttg ttcactagac tgtgcccttt 1200

tatagaggta catgttctct ttggagtgtt ggtaggtgtc tgtttcccac ctcacctgag 1260

agccattgaa tttgccttcc tcatgaatta aaacctcccc caagcagagc ttcctcagag 1320

aaagtggttc tatgatgaag tcctgtcttg gaaggactac tactcaatgg cccctgcact 1380

actctacttc ctcttaccta tgtcccttct catgcctttc cctccaacgg ggaaagccaa 1440

ctccatctct aagtgctgaa ctcatccctg ttcctcaagg ccacctggcc aggagcttct 1500

ctgatgtgat atccactttt tttttttttt gagatggagt ctcactctgt cacccaggct 1560

ggagtacagt gacacgacct cggctcactg cagcctcctt ctcctgggtc caagcaatta 1620

ttgtgcctca gcctcccgag tagctgagac ttcaggtgca ttccaccaca catggctaat 1680

ttttgtattt ttagtagaaa tggggtttcg tcatgttggc caggctggtc tcgaactcct 1740

ggcctaggtg atccacccgc ctcgacctcc caaagtgctg ggattacagg catgagccac 1800

catgcccagt cgatatctca ctttttattt tgccatggat gagagtcctg ggtgtgagga 1860

acacctccca ccaggctaga ggcaactgcc caggaaggac tgtgcttccg tcacctctaa 1920

atcccttgca gatccttgat aaatgcctca tgaagaccaa tctcttgaat cccatatcta 1980

cccagaatta actccattcc agtctctgca tgtaatcagt tttatccaca gaaacatttt 2040

cattttagga aatccctggt ttaagtatca atccttgttc agctggacaa tatgaatctt 2100

ttccactgaa gttagggatg actgtgattt tcagaacacg tccagaattt ttcatcaaga 2160

aggtagcttg agcctgaaat gcaaaaccca tggaggaatt ctgaagccat tgtctccttg 2220

agtaccaaca gggtcaggga agactgggcc tcctgaattt attattgttc tttaagaatt 2280

acaggttgag gtagttgatg gtggtaaaca ttctctcagg agacaataac tccagtgatg 2340

tttttcaaag attttagcaa aaacagagta aatagcattc tctatcaata tataaattta 2400

aaaaactatc tttttgctta cagttttaaa ttctgaacaa tttctcttat atgtgtattg 2460

ctaatcatta aggtattatt ttttccacat ataaagcttt gtctttttgt tgttgttgtt 2520

gtttttaaga tggagtttcc ctctgttgcc aggctagagt gcagtggcat gatctcggct 2580

tactgcaacc tttgcctccc aggtttaagc gattcttctg cctcagcctc ccgagtagct 2640

gggaccacag gtgcctacca ccatgccagg ctaatttttg tatttttagt aaagacaggg 2700

tttcaccata ttggccaggc tggtctcgaa ctcctgacct tgtgatctgc ccgcctccat 2760

tgtgttgtta tttgtgagaa agatagatat gaggtttaga gagggatgaa gaggtgagag 2820

taagccttgt gttagtcaga actctgtgtt gtgaatgtca ttcacaacag aaaacccaaa 2880

atattatgca aactactgta agcaagaaaa ataaaggaaa aatggaaaca tttattcctt 2940

tgcataatag aaattaccag agttgttctg tctttagata aggtttgaac caaagctcaa 3000

aacaatcaag acccttttct gtatgtcctt ctgttctgcc ttccgcagtg taggctttac 3060

cctcaggtgc tacacagtat agttctaggg tttccctccc gatatcaaaa agactgtggc 3120

ctgcccagct ctcgtatccc caagccacac catctggcta aatggacatc atgttttctg 3180

gtgatgccca aagaggagag aggaagctct ctttcccaga tgccccagca agtgtaacct 3240

tgcatctcat tgctctggct gagttgtgtg cctgtttctg accaatcact gagtcaggag 3300

gatgaaatat tcatattgac ttaattgcag cttaagttag gggtatgtag aggtattttc 3360

cctaaagcaa aattgggaca ctgttatcag aaataggaga gtggatgata gatgcaaaat 3420

aatacctgtc cacaacaaac tcttaatgct gtgtttgagc tttcatgagt ttcccagaga 3480

gacatagctg gaaaattcct attgattttc tctaaaattt caacaagtag ctaaagtctg 3540

gctatgctca cagtctcaca tctggtgggg gtgggctcct tacagaacac gctttcacag 3600

ttaccctaaa ctctctgggg cagggttatt cctttgtgga accagaggca cagagacagt 3660

caactgaggc ccaacagagg cctgagagaa actgaggtca agatttcagg attaatggtc 3720

ctgtgatgct ttgaagtaca attgtggatt tgtccaattc tctttagttc tgtcagcttt 3780

tgcttcatat attttagcgc tctattatta gatatataca tgtttagtat tatgtcttat 3840

tggtgcattt actctcttat cattatgtaa tgtccttctt tatctgtgat aattttctgt 3900

gttctgaagt ctactttgtc taaaaataac atacgcactc aacttccttt tctttcttcc 3960

ttcctttctt tcttccttcc tttctttctc tctctctctt tccttccttc cttcctcctt 4020

ttctctctct ctctctctct ctctcttttc ttgacagact ctcgttctgt ggccctggct 4080

ggagttcagt ggtgtgatct tggctcactg ctacctctac catgagcaat tctcctgcct 4140

cagcctccca agtagctgga actacaggct catgccactg cgcccagcta atttttgtat 4200

ttttcgtaga gacggggttt caccacattc gtcaggttgg tttcaaactc ctgactttgt 4260

gatccacccg cctcggcctc ccaaagtgct gggattacag gcatgagcca tcacacctgg 4320

tcaactttct tttgattagt gtttttgtgg tatatctttt tccatcatgt tactttaaat 4380

atatctatat tattgtattt aaaatgtgtt tcttacagac tgcatgtagt tgggtataat 4440

ttttatccag tctaaaaata tctgtctttt aattggtgtt tagacaattt atatttaata 4500

aaatggtgga atttaaa 4517

〈210〉 10

〈211〉 729

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Degenerate nucleotide sequence encoding the zsig39 polypeptide of

SEQ ID NO:2.

〈400〉 10

atgmgnccny tnytngtnyt nytnytnytn ggnytngcng cnggnwsncc nccnytngay 60

gayaayaara thccnwsnyt ntgyccnggn cayccnggny tnccnggnac nccnggncay 120

cayggnwsnc arggnytncc nggnmgngay ggnmgngayg gnmgngaygg ngcnccnggn 180

gcnccnggng araarggnga rggnggnmgn ccnggnytnc cnggnccnmg nggngayccn 240

ggnccnmgng gngargcngg nccngcnggn ccnacnggnc cngcnggnga rtgywsngtn 300

ccnccnmgnw sngcnttyws ngcnaarmgn wsngarwsnm gngtnccncc nccnwsngay 360

gcnccnytnc cnttygaymg ngtnytngtn aaygarcarg gncaytayga ygcngtnacn 420

ggnaarttya cntgycargt nccnggngtn taytayttyg cngtncaygc nacngtntay 480

mgngcnwsny tncarttyga yytngtnaar aayggngarw snathgcnws nttyttycar 540

ttyttyggng gntggccnaa rccngcnwsn ytnwsnggng gngcnatggt nmgnytngar 600

ccngargayc argtntgggt ncargtnggn gtnggngayt ayathggnat htaygcnwsn 660

athaaracng aywsnacntt ywsnggntty ytngtntayw sngaytggca ywsnwsnccn 720

gtnttygcn 729

〈210〉 11

〈211〉 17

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC447

〈400〉 11

taacaatttc acacagg 17

〈210〉 12

〈211〉 18

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC976

〈400〉 12

cgttgtaaaa cgacggcc 18

〈210〉 13

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC14707

〈400〉 13

cccactggac gacaacaaga 20

〈210〉 14

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC14708

〈400〉 14

agcacactcc tctggtcttg 20

〈210〉 15

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC14760

〈400〉 15

ccaatgtagt cacccacacc 20

〈210〉 16

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC14758

〈400〉 16

tggtgaacga gcagggacat 20

〈210〉 17

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC14759

〈400〉 17

tccccagtct ttgcttagtg 20

〈210〉 18

〈211〉 18

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15002

〈400〉 18

agggaggtgg ggtagagc 18

〈210〉 19

〈211〉 18

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 0ligonucleotide ZC 15003

〈400〉 19

tgggggactt acacttgc 18

〈210〉 20

〈211〉 6

〈212〉 PRT

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Glu-Glu affinity tag peptide

〈400〉 20

Glu Tyr Met Pro Val Asp

1 5

〈210〉 21

〈211〉 26

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15037

〈400〉 21

actcattcta gactacagca aagact 26

〈210〉 22

〈211〉 25

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15038

〈400〉 22

atgtatggat ccctggacga caaca 25

〈210〉 23

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC13006

〈400〉 23

ggctgtcctc taagcgtcac 20

〈210〉 24

〈211〉 19

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC13007

〈400〉 24

aggggtcaca gggatgcca 19

〈210〉 25

〈211〉 24

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15609

〈400〉 25

ttgtgagaat tcatgaggcc actc 24

〈210〉 26

〈211〉 25

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15232

〈400〉 26

attcaaggat ccagcaaaga caggt 25

〈210〉 27

〈211〉 6

〈212〉 PRT

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Glu-Glu peptide

〈400〉 27

Glu Tyr Met Pro Val Asp

1 5

〈210〉 28

〈211〉 144

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 N-terminal untagged linker

〈400〉 28

ttattgttta tcaatactac tattgctagc attgctgcta aagaagaagg tgtaagcttg 60

gacaagagag aactggacga caacaagatc cccagcctct gcccggggca ccccggcctt 120

ccaggcacgc cgggccacca tggc 144

〈210〉 29

〈211〉 144

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 N-terminal Glu-Glu tag linker

〈400〉 29

agcattgctg ctaaagaaga aggtgtaagc ttggacaaga gagaagaaga atacatgcca 60

atggaaggtg gtctggacga caacaagatc cccagcctct gcccggggca ccccggcctt 120

ccaggcacgc cgggccacca tggc 144

〈210〉 30

〈211〉 147

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 C-terminal untagged linker

〈400〉 30

agcatcaaga cagacagcag gttctccgga tttctggtgt actccgactg gcacagctcc 60

ccagtctttg cttagatttc ggctgcctgt ttggatattt ttataatttt tgagagtttg 120

ccaactaatg tttttctctt ctatgat 147

〈210〉 31

〈211〉 144

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 C-terminal Glu-Glu tag linker

〈400〉 31

agcatcaaga cagacagcac cttctccgga tttctggtgt actccgactg gcacagctcc 60

ccagtctttg ctggagggga ggagtatatg cctatggagt agaattccta gtattctagg 120

gctgcctgtt tggatatttt tata 144

〈210〉 32

〈211〉 51

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC13731

〈400〉 32

ggtgtaagct tggacaagag agaagaagaa tacatgccaa tggaaggtgg t 51

〈210〉 33

〈211〉 62

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15268

〈400〉 33

tgccccgggc agaggctggg gatcttgttg tcgtccagac caccttccat tggcatgtat 60

tc 62

〈210〉 34

〈211〉 44

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC13487

〈400〉 34

agcattgctg ctaaagaaga aggtgtaagc ttggacaaga gaga 44

〈210〉 35

〈211〉 51

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15273

〈400〉 35

catggtggcc cggcgtgcct ggaaggccgg ggtgccccgg gcagaggctg g 51

〈210〉 36

〈211〉 50

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15273

〈400〉 36

catcaagaca gacagcacct tctccggatt tctggtgtac tccgactggc 50

〈210〉 37

〈211〉 65

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15724

〈400〉 37

tttctggtgt actccgactg gcacagctcc ccagtctttg cttagaattc ggctgcctgt 60

ttgga 65

〈210〉 38

〈211〉 63

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15223

〈400〉 38

tggcaaactc tcaaaaatta taaaaatatc caaacaggca gccctagaat actaggaatt 60

cta 63

〈210〉 39

〈211〉 52

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC13734

〈400〉 39

atcatagaag agaaaaacat tagttggcaa actctcaaaa attataaaaa ta 52

〈210〉 40

〈211〉 40

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC14822

〈400〉 40

acggtttatt gtttatcaat actactattg ctagcattgc 40

〈210〉 41

〈211〉 62

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC14821

〈400〉 41

tcaatactac tattgctagc attgctgcta aagaagaagg tgtaagcttg gacaagagag 60

aa 62

〈210〉 42

〈211〉 63

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15269

〈400〉 42

tgccccgggc agaggctggg gatcttgttg tcgtccagtt ctctcttgtc caagcttaca 60

cct 63

〈210〉 43

〈211〉 51

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15274

〈400〉 43

catggtggcc cggcgtgcct ggaaggccgg ggtgccccgg gcagaggctg g 51

〈210〉 44

〈211〉 50

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15273

〈400〉 44

catcaagaca gacagcacct tctccggatt tctggtgtac tccgactggc 50

〈210〉 45

〈211〉 68

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC15267

〈400〉 45

atttctggtg tactccgact ggcacagctc cccagtcttt gctggtggtg aagaatacat 60

gccaatgg 68

〈210〉 46

〈211〉 58

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC14819

〈400〉 46

aacaggcagc cctagaatac taggaattct attccattgg catgtattct tcaccacc 58

〈210〉 47

〈211〉 39

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Oligonucleotide ZC14820

〈400〉 47

attataaaaa tatccaaaca ggcagcccta gaatactag 39

Claims (29)

1. SEQ ID NO:2 와 최소한 80 % 동일한 아미노산 잔기의 서열을 포함하고 있는 단리된 폴리펩티드로서, 상기 서열이

   최소한 두 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 105-109, 128-130, 136-139, 143-146, 164-171, 176-182, 187-200, 204-210 및 226-231 에 상응하는 베타 가닥; 및

   SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 111-135 및 170-174 를 포함하는 수용체 결합 도메인

   을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2 와 최소한 90 % 동일함을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 최소한 22 개의 콜라겐 반복단위를 가지는 콜라겐-유사 도메인을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
4. 제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2 의 잔기 19-243 을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
5. 제 1 항에 있어서, 친화성 태그, 독소, 방사성 뉴클레오티드, 효소 및 플루오로포어로 이루어지는 군으로부터 선택된 부분에 아미노 말단쪽으로 또는 카르복시 말단쪽으로 공유 결합된 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
6. a) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 아미노산 잔기 95 에 이르는 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드;

   b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 아미노산 잔기 96 에 이르는 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드;

   c) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 97 에 이르는 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드;

   d) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 아미노산 잔기 98 에 이르는 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드;

   e) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 98 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드;

   f) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 99 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드;

   g) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; 및

   h) a), b), c), d), e), f) 또는 g) 와 아미노산 서열이 90 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 가지고 있는 폴리펩티드

   로 이루어지는 군으로부터 선택된 단리된 폴리펩티드.
7. 본질적으로 펩티드 결합에 의하여 결합된 첫 번째 부분과 두 번째 부분으로 구성된 융합 단백질로서, 상기 첫 번째 부분은

   a) SEQ ID NO:2 와 최소한 80 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드로서, 상기 서열은 최소한 두 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 105-109, 128-130, 136-139, 143-146, 164-171, 176-182, 187-200, 204-210 및 226-231 에 상응하는 베타 가닥; 및 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 111-135 및 170-174 를 포함하는 수용체 결합 도메인을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;

   b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 16 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드;

   c) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 1 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드;

   d) 콜라겐-유사 도메인 또는 이량체화 또는 올리고머화할 수 있는 콜라겐-유사 도메인의 부분을 함유하고 있는, SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드의 부분;

   e) 구형-유사 도메인 또는 구형-유사 도메인의 수용체 결합 도메인을 함유하고 있는, SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드 부분; 또는

   f) 콜라겐-유사 도메인 및 구형 도메인을 포함하고 있는 SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드 부분

   으로 이루어지는 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하고 있으며;

   상기 두 번째 부분은 다른 폴리펩티드를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 첫 번째 부분이

   a) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서부터 아미노산 잔기 95 까지의 서열을 가지고 있는 폴리펩티드;

   b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서부터 아미노산 잔기 96 까지의 서열을 가지고 있는 폴리펩티드;

   c) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서부터 아미노산 잔기 97 까지의 서열을 가지고 있는 폴리펩티드;

   d) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서부터 아미노산 잔기 98 까지의 서열을 가지고 있는 폴리펩티드;

   e) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 30 에서부터 아미노산 잔기 243 까지의 서열을 가지고 있는 폴리펩티드;

   f) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 98 에서부터 아미노산 잔기 243 까지의 서열을 가지고 있는 폴리펩티드; 및

   g) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 99 에서부터 아미노산 잔기 243 까지의 서열을 가지고 있는 폴리펩티드

   로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
9. SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 1-15 또는 1-18 의 아미노산 서열을 가지는 분비 신호 서열을 포함하고 있는 융합 단백질로서, 상기 분비 신호 서열이 추가의 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
10. 제 1 항에 따르는 폴리펩티드를 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하고 있는 약학 조성물.
11. 제 1 항에 따르는 폴리펩티드의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체.
12. SEQ ID NO:2 와 최소한 80 % 동일한 아미노산 잔기의 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 서열이

    최소한 두 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 105-109, 128-130, 136-139, 143-146, 164-171, 176-182, 187-200, 204-210 및 226-231 에 상응하는 베타 가닥; 및

    SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 111-135 및 170-174 를 포함하는 수용체 결합 도메인

    을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2 와 최소한 90 % 동일한 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
14. 제 12 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 최소한 22 개의 콜라겐 반복단위를 가지고 있는 콜라겐-유사 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
15. 제 12 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA 인 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
16. a) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 243 에서 뉴클레오티드 962 까지의 뉴클레오티드 서열;

    b) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 252 에서 뉴클레오티드 962 까지의 뉴클레오티드 서열;

    c) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 285 에서 뉴클레오티드 482 까지의 뉴클레오티드 서열;

    d) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 285 에서 뉴클레오티드 485 까지의 뉴클레오티드 서열;

    e) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 285 에서 뉴클레오티드 488 까지의 뉴클레오티드 서열;

    f) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 285 에서 뉴클레오티드 491 까지의 뉴클레오티드 서열;

    g) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 285 에서 뉴클레오티드 926 까지의 뉴클레오티드 서열;

    h) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 491 에서 뉴클레오티드 926 까지의 뉴클레오티드 서열;

    i) a), b), c), d), e), f), g) 및 h) 와 뉴클레오티드 서열이 최소한 80 % 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드;

    j) a), b), c), d), e), f), g), h) 또는 i) 와 상보하는 뉴클레오티드 서열; 및

    k) a), b), c), d), e), f), g), h), i) 또는 j) 의 축퇴성 뉴클레오티드 서열

    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단리된 폴리뉴클레오티드.
17. 본질적으로 펩티드 결합에 의하여 결합된 첫 번째 부분과 두 번째 부분으로 구성된 융합 단백질을 코드화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 첫 번째 부분은

    a) SEQ ID NO:2 와 최소한 80 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드로서, 상기 서열은 최소한 두 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 105-109, 128-130, 136-139, 143-146, 164-171, 176-182, 187-200, 204-210 및 226-231 에 상응하는 베타 가닥; 및 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 111-135 및 170-174 를 포함하는 수용체 결합 도메인을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;

    b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 16 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드;

    c) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 1 에서 아미노산 잔기 243 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드;

    d) 콜라겐-유사 도메인 또는 이량체화 또는 올리고머화할 수 있는 콜라겐-유사 도메인의 부분을 함유하고 있는, SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드의 부분;

    e) 구형-유사 도메인 또는 구형-유사 도메인의 수용체 결합 도메인을 함유하고 있는, SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드 부분; 또는

    f) 콜라겐-유사 도메인 및 구형 도메인을 포함하고 있는 SEQ ID NO:2 에 도시된 바와 같은 zsig39 폴리펩티드 부분

    으로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

    상기 두 번째 부분은 다른 폴리펩티드를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
18. SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 1-15 또는 1-18 의 아미노산 서열을 가지는 분비 신호 서열을 포함하고 있는 융합 단백질을 코드화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 분비 신호 서열이 추가의 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
19. SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 1 에서 뉴클레오티드 729 까지의 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
20. 하기의 작동가능하게 연결된 엘레먼트들:

    전사 프로모터;

    제 1 항에 따르는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편; 및

    전사 터미네이터

    를 포함하고 있는 발현 벡터.
21. 제 20 항에 있어서, 상기 DNA 절편이 SEQ ID NO:2 와 최소한 90 % 동일한 폴리펩티드를 코드화하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
22. 제 20 항에 있어서, 상기 DNA 절편이 최소한 22 개의 콜라겐 반복 단위를 가지고 있는 콜라겐-유사 도메인을 추가로 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
23. 제 20 항에 있어서, 상기 DNA 절편이 친화성 태그에 아미노 말단쪽으로 또는 카르복시 말단쪽으로 공유 결합된 폴리펩티드를 코드화하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
24. 제 20 항에 있어서, 상기 DNA 절편이 추가로 상기 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 분비 신호 서열을 코드화하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
25. 제 20 항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 SEQ ID NO:2 의 잔기 1-15 또는 1-18 을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
26. 하기의 작동가능하게 연결된 엘레먼트들:

    전사 프로모터;

    제 1 항에 따르는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA; 및

    전사 터미네이터

    를 포함하고 있는 발현 벡터가 그 안에 도입된 배양된 세포로서, 상기 세포는 상기 DNA 절편에 의하여 코드화된 상기 폴리펩티드를 발현하는 것을 특징으로 하는 배양 세포.
27. 하기의 작동가능하게 연결된 엘레먼트들:

    전사 프로모터;

    제 1 항에 따르는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA; 및

    전사 터미네이터

    를 포함하고 있는 발현 벡터가 그 안에 도입된 세포를 배양하는 단계;

    그로써 상기 세포가 상기 DNA 절편에 의해 코드화된 상기 폴리펩티드를 발현하는 단계; 그리고

    상기 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계

    로 이루어지는, 폴리펩티드의 제조 방법.
28. SEQ ID NO:10 의 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO:10 에 상보하는 서열의 최소한 14 개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
29. 제 1 항에 따르는 폴리펩티드의 약학적으로 효과적인 양을 투여함으로써 유리 지방산 대사를 조절하는 방법.