ES2323445T3

ES2323445T3 - Marcadores polimorficos del gen lsr.

Info

Publication number: ES2323445T3
Application number: ES00903924T
Authority: ES
Inventors: Marta Blumenfeld; Lydie Bougueleret; Bernard Bihain
Original assignee: Serono Genetics Institute SA
Current assignee: Merck Biodevelopment SAS
Priority date: 1999-02-10
Filing date: 2000-02-08
Publication date: 2009-07-16
Anticipated expiration: 2020-02-08
Also published as: DE60041912D1; AU767378B2; WO2000047772A2; EP1153139B1; EP1153139A2; AU2567400A; CA2359757A1; WO2000047772A3; US7125667B2; US6479238B1; US20030190636A1; ATE427362T1

Abstract

Un polinucleótido aislado, purificado o recombinante que comprende un tramo contiguo de 8 a 50 nucleótidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1, 13, 15 o 17, o sus complementos, donde dicho tramo contiguo comprende un marcador bialélico relacionado con el receptor estimulado por lipólisis (LSR) seleccionado entre: SNP núm. 1 que está localizado en la posición 3778 del SEQ ID NO: 1 o en la posición 595 del SEQ ID NO: 13, 15 o 17; SNP núm. 2 que está localizado en la posición 15007 del SEQ ID NO: 1; y SNP núm. 3 que está localizado en la posición 19744 del SEQ ID NO: 1 o en la posición 1191 del SEQ ID NO: 13, o la posición 1134 del SEQ ID NO: 15, o en la posición 987 del SEQ ID NO: 17, donde cuando el polinucleótido comprende el SNP núm. 3, el nucleótido en el sitio del marcador bialélico SNP núm. 3 es A o T.

Description

Marcadores polimórficos del gen LSR.

Campo de la invención

La invención tiene que ver con marcadores bialélicos del gen LSR, así como con métodos y kits para detectar estos polinucleótidos. La presente invención abarca los métodos de establecimiento de asociaciones entre estos marcadores y la obesidad o los trastornos relacionados con la obesidad. La invención también tiene que ver con la secuencia genómica y los ADNc que codifican una subunidad de LSR y que comprenden un marcador bialélico de la presente invención. La invención tiene que ver adicionalmente con proteínas LSR modificadas que comprenden al menos un cambio de aminoácido resultante de los marcadores bialélicos de la presente invención así como anticuerpos que son específicos para estas proteínas LSR modificadas.

Antecedentes

La obesidad es un problema de salud pública que es grave y que está muy extendido. Un tercio de la población de los países industrializados tiene un exceso de peso de al menos un 20% con respecto al peso ideal. El fenómeno continúa empeorando, concretamente en regiones del planeta donde las economías se están modernizando. En los Estados Unidos, el número de personas obesas ha aumentado de 25% a finales de los 70 a 33% a principios de los
90.

La obesidad aumenta considerablemente el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares o metabólicas. Se estima que si toda la población tuviera un peso ideal, el riesgo de insuficiencia coronaria descendería 25% y el de insuficiencia cardíaca y el de accidentes cerebrovasculares 35%. La insuficiencia coronaria, la enfermedad ateromatosa y la insuficiencia cardíaca están en la vanguardia de las complicaciones cardiovasculares inducidas por la obesidad. Para un exceso de peso de más de 30%, la incidencia de enfermedades coronarias se duplica en sujetos de menos de 50 años de edad. Los estudios llevados a cabo para otras enfermedades son igualmente elocuentes. Para un exceso de peso de 20%, el riesgo de una presión sanguínea elevada se duplica. Para un exceso de peso de 30%, el riesgo de desarrollar una diabetes dependiente de insulina se triplica, y el de hiperlipidemia se multiplica por
seis.

La lista de enfermedades que tienen comienzos promovidos por obesidad incluye: hiperuricemia (11,4% en sujetos obesos, frente a 3,4% en la población en general), patologías digestivas, anomalías en las funciones hepáticas, e incluso ciertos cánceres.

Se caractericen los cambios fisiológicos en la obesidad por un incremento en el número de células adiposas, o por un incremento en la cantidad de triglicéridos almacenados en cada célula adiposa, o por ambos, este exceso de peso resulta principalmente de un desequilibrio entre la cantidad de calorías consumidas y la cantidad de calorías utilizadas por el organismo. Los estudios de las causas de este desequilibrio se han realizado en diversas direcciones. Algunos se han centrado en el estudio del mecanismo de absorción de los alimentos, y por lo tanto en las moléculas que controlan la ingesta de alimentos y en la sensación de saciedad. Otros estudios han caracterizado las rutas por medio de las cuales el organismo utiliza sus calorías.

Los tratamientos propuestos para la obesidad son de cinco tipos. (1) La restricción de alimentos es la más frecuentemente utilizada. Se aconseja a los individuos obesos que cambien sus hábitos dietéticos con el fin de consumir menos calorías. Aunque este tipo de tratamiento es eficaz a corto plazo, la tasa de recaída es muy elevada. (2) También se propone el uso de más calorías por medio de ejercicio físico. Este tratamiento es ineficaz cuando se aplica sólo, pero mejora la pérdida de peso en sujetos con una dieta baja en calorías. (3) La cirugía gastrointestinal, que reduce la absorción de las calorías ingeridas, es eficaz, pero ha sido virtualmente abandonada debido a los efectos secundarios que ocasiona. (4) El enfoque médico utiliza la acción anorexigénica de las moléculas implicadas a nivel del sistema nervioso central, o el efecto de las moléculas que incrementan el uso de energía incrementando la producción de calor. Los prototipos de este tipo de molécula son las hormonas tiroideas que desacoplan las fosforilaciones oxidativas de la cadena respiratoria mitocondrial. Los efectos secundarios y la toxicidad de este tipo de tratamiento hacen peligroso su uso. (5) También tiene lugar un enfoque que pretende reducir la absorción de los lípidos de la dieta mediante el secuestro de los mismos en el lúmen del tubo digestivo. No obstante, induce desequilibrios fisiológicos que son difíciles de tolerar: deficiencia en la absorción de vitaminas liposolubles, flatulencia y esteatorrea. Cualquiera que sea el enfoque terapéutico previsto, los tratamientos de la obesidad se caracterizan todos por una tasa de recaída extremadamente elevada.

Los mecanismos moleculares responsables de la obesidad en el ser humano son complejos e implican factores genéticos y medioambientales. Debido a la baja eficacia de los tratamientos actuales, es urgente definir los mecanismos genéticos que determinan la obesidad, con el fin de poder desarrollar medicamentos mejor dirigidos.

Se han estudiado más de 20 genes como posibles candidatos, ya sea porque están implicados en enfermedades de las cuales la obesidad es una de las manifestaciones clínicas, o porque son homólogos de genes implicados en la obesidad en modelos animales. Situado en la región cromosómica 7q31, el gen OB es uno de los más ampliamente estudiados. Su producto, la leptina, está implicado en los mecanismos de la saciedad. La leptina es una proteína plasmática de 16 kDa producida por adipocitos bajo la acción de diversos estímulos. Los ratones obesos de tipo ob/ob muestran una deficiencia en el gen de la leptina; esta proteína no es detectable en el plasma de estos animales. La administración de leptina obtenida mediante ingeniería genética a ratones ob/ob corrige su hiperfagia relativa y permite la normalización de su peso. Este efecto anorexigénico de la leptina pone en juego un receptor del sistema nervioso central: El receptor ob que pertenece a la familia de los receptores de citoquina de clase I. El receptor ob es deficiente en ratones obesos de la cepa db/db. La administración de leptina a estos ratones no tiene efecto sobre su ingesta de alimento y no permite una reducción sustancial de su peso. Los mecanismos por los cuales los receptores ob transmiten la señal de saciedad no son conocidos con precisión. Es posible que el neuropéptido Y esté implicado en esta ruta de señalización. Es importante especificar en esta fase que los receptores ob no son solamente reguladores del apetito. El receptor de melanocortina 4 también está implicado puesto que los ratones que pasan a carecer de este receptor son obesos (Gura, (1997)).

El descubrimiento de la leptina, y la caracterización del receptor de leptina a nivel del sistema nervioso central, abrieron una nueva ruta para la búsqueda de medicamentos contra la obesidad. No obstante, se demostró rápidamente que este modelo era decepcionante. Con una única excepción (Montague et al., (1997)), se ha demostrado que los genes que codifican la leptina o su receptor ob, son normales en sujetos humanos obesos. Además y paradójicamente, las concentraciones en plasma de leptina, la hormona de la saciedad, son anormalmente elevadas en la mayoría de los sujetos humanos obesos.

Bihain et al (Current Opinion in Lipidology (1998), vol. 9, núm. 3, páginas 221-224; Diabete and Metabolism (1995) vol. 21, núm. 2, páginas 121-126;) y Ducobu et al (Revue Medicale de Bruxelles (1997) 18 (1) 10-5) describen el gen del receptor estimulado por la lipólisis (LSR) que tiene un papel en el aclaramiento de las partículas de lípidos ricas en triglicéridos. Bihain et al (Current Opinion in Lipidology (1998), vol. 9, núm. 3, páginas 221-224) mencionan adicionalmente que el papel del LSR debe ser estudiado entre otros por un análisis del polimorfismo del gen LSR en individuos humanos con un aclaramiento de lipoproteínas deteriorado.

Claramente existe la necesidad de medicamentos novedosos que sean útiles para reducir el peso corporal en seres humanos. Tales composiciones farmacéuticas novedosas ayudarían ventajosamente a controlar la obesidad y aliviarían de ese modo muchas de las consecuencias cardiovasculares asociadas con esta afección.

El descubrimiento de nuevos genes que estén asociados con la obesidad también permitiría el diseño de herramientas diagnósticas y terapéuticas novedosas que actúen sobre el metabolismo de lípidos, útiles para la diagnosis y el tratamiento de los trastornos de obesidad.

Compendio de la invención

La invención está dirigida, entre otros, a marcadores bialélicos que están localizados en la secuencia genómica de LSR. Estos marcadores bialélicos representan herramientas útiles para identificar asociaciones estadísticamente significativas entre alelos específicos del gen LSR, y la obesidad, o un trastorno relacionado con la obesidad. Los estudios de asociación ya han demostrado que una mutación codificante en el exón 6 de LSR influye en los niveles de triglicéridos en plasma tanto en ayunas como postprandiales en niñas adolescentes obesas. Se ha asociado un SNP intrónico, localizado cerca del sitio de empalme que determina la subunidad LSR, con los niveles de insulina y glucosa. Por tanto, los marcadores bialélicos del gen LSR pueden conducir a la identificación de nuevas dianas para los medicamentos que actúan contra la obesidad o los trastornos relacionados con la obesidad. Además, se pueden utilizar para diagnosticar la susceptibilidad a la obesidad o para identificar la causa de la obesidad en un individuo.

La invención también tiene que ver con la secuencia genómica y la secuencia de ADNc que codifican las subunidades de LSR, y que comprenden un marcador bialélico de la presente invención. La invención tiene que ver adicionalmente con proteínas LSR modificadas que comprenden al menos un cambio de aminoácido resultante de los marcadores bialélicos de la presente invención así como anticuerpos que son específicos para estas proteínas LSR modificadas.

En un primer aspecto, la invención presenta, un polinucleótido aislado, purificado, o recombinante que consiste en un tramo contiguo de 8 a 50 nucleótidos de cualquiera de los SEQ ID NO: 1, 13, 15 o 17, o sus complementos, donde dicho tramo contiguo comprende un marcador bialélico relacionado con LSR seleccionado del grupo que consiste en A 15 (SNP núm.1), A17 (SNP núm.2) y A21 (SNP núm.3), donde cuando el polinucleótido comprende el SNP núm.3, el nucleótido en el sitio del marcador bialélico SNP núm. 3 es A o T.

Alternativamente, la invención presenta cualquiera de los polinucleótidos anteriores, donde dicho tramo contiguo tiene de 18 a 35 nucleótidos de longitud y dicho marcador bialélico está a 4 nucleótidos del centro de dicho polinucleótido. En una realización preferida, dicho polinucleótido consiste en dicho tramo contiguo y dicho tramo contiguo tiene 25 nucleótidos de longitud y dicho marcador bialélico está en el centro de dicho polinucleótido.

Alternativamente, la invención presenta cualquiera de los polinucleótidos anteriores, donde el extremo 3' de dicho tramo contiguo está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido. En una realización preferida, el extremo 3' de dicho tramo contiguo está localizado en el extremo 3' de dicho polinucleótido y dicho marcador bialélico está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido.

Alternativamente, la invención presenta, un polinucleótido aislado, purificado, o recombinante que consiste esencialmente en un tramo contiguo de 8 a 50 nucleótidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 13, 15, 17, o sus complementos, donde el extremo 3' de dicho tramo contiguo está localizado en el extremo 3' de dicho polinucleótido, y donde el extremo 3' de dicho polinucleótido está localizado 1 nucleótido aguas arriba de un marcador bialélico relacionado con LSR en dicha secuencia seleccionada entre A15, A17 y A21. Preferiblemente, dicho polinucleótido consiste esencialmente en una secuencia seleccionada entre las siguientes secuencias: D15, D17, D21, E14, E16 y E20.

Alternativamente, la invención presenta el uso de un polinucleótido de la invención en un análisis de hibridación, un análisis de secuenciación o un análisis de amplificación específica de un alelo.

Asimismo se describe el uso de un polinucleótido de la invención para amplificar un segmento de nucleótidos que comprenden un marcador bialélico relacionado con LSR en uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 13, 15, 17 sus complementos.

Alternativamente, la invención presenta cualquiera de los polinucleótidos descritos antes anclados a un soporte sólido.

Alternativamente, la invención presenta una matriz de polinucleótidos que comprende al menos un polinucleótido anclado a un soporte sólido. En realizaciones preferidas la matriz es direccionable.

Alternativamente, la invención presenta cualquiera de los polinucleótidos descritos antes que comprende adicionalmente una marca.

En una segunda realización, la invención presenta un método de genotipificación que comprende determinar la identidad de un nucleótido en un marcador bialélico relacionado con LSR de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1, 13, 15 o 17 o sus complementos en una muestra biológica donde el marcador bialélico se selecciona entre el SNP núm. 1, SNP núm.2 y SNP núm. 3. En una realización preferida, dicha muestra biológica deriva de un único sujeto. En una realización preferida, la identidad de los nucleótidos en dicho marcador bialélico es determinada para ambas copias de dicho marcador bialélico presente en el genoma de dicho sujeto individual. En una realización preferida, dicha muestra biológica deriva de múltiples sujetos. Una realización preferida, comprende adicionalmente amplificar una porción de dicha secuencia que comprende el marcador bialélico antes de dicha determinación. En una realización preferida, dicha amplificación se realiza mediante PCR. En una realización preferida, dicha determinación se realiza mediante un análisis de hibridación. En una realización preferida, dicha determinación se realiza mediante un análisis de secuenciación. En una realización preferida, dicha determinación se realiza mediante un análisis de microsecuenciación. En una realización preferida, dicha determinación se realiza mediante un análisis de amplificación específico de los alelos.

En un tercer aspecto, la invención presenta el uso de los métodos de genotipificación descritos previamente para determinar si un individuo se encuentra en riesgo de desarrollar obesidad o si la obesidad que padece un individuo está asociada estadísticamente con uno o más marcadores bialélicos de LSR.

En un cuarto aspecto, la invención presenta un método para determinar si un individuo se encuentra en riesgo de desarrollar obesidad o si la obesidad que padece un individuo está asociada estadísticamente con uno o más marcadores bialélicos de LSR, que comprende determinar la identidad de la base polimórfica de dichos uno o más marcadores bialélicos de LSR en una muestra de ácido nucleico obtenida de dicho individuo, donde el marcador bialélico de LSR se selecciona entre SNP núm. 1, SNP núm. 2 y SNP núm. 3.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un mapa de la secuencia genómica del LSR humano con los marcadores bialélicos validados de la presente invención indicados.

Las Figuras 2A y 2B muestran la localización cromosómica y la organización genómica del gen LSR. La Figura 2A es un diagrama esquemático del cromosoma 19 y de la organización genómica de LSR. Las longitudes del exón y el intrón en pb se indican como números normales, y en negrita, respectivamente. También se muestra la localización de USF2 adicional aguas abajo. La Figura 2B muestra los SNP de 19q13.1 e identifica aquellos utilizados para los estudios de asociación (destacados en recuadros).

Las Figuras 3A, 3B, y 3C son representaciones gráficas de un estudio de asociación de los valores de lípidos en plasma con los SNP de LSR. Las diferencias en la frecuencia del genotipo en dos grupos de niñas adolescentes que estaban separados de acuerdo con sus valores de TG (Fig. 3A), colesterol total (Fig. 3B) y ácidos grasos libres (Fig. 3C) en plasma que eran mayores o menores que la media de la población completa (Tabla 5) se analizaron mediante análisis \chi2 3 x 2. Los valores de \chi2 para cada marcador de ensayo se representan en forma de barras. El valor medio de \chi2 obtenido con los 18 marcadores al azar se muestra en forma de una línea continua; El intervalo de confianza del 99,99% calculado de esta media se muestra en forma de una línea discontinua para cada parámetro.

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Las Figuras 4A, 4B, 4C, y 4D muestran una representación gráfica del efecto de la mutación que codifica el exón 6 de LSR sobre la lipemia postprandial en niñas adolescentes obesas. Treinta y cuatro niñas adolescentes obesas mantenidas en ayunas durante la noche consumieron una comida de ensayo con alto contenido de grasa. Se determinaron los TG en plasma antes, a las 2 y a las 4 horas de esta comida. Los genotipos de los marcadores LSR núms. 1, 2, y 3 se determinaron como se describe en la presente memoria. La respuesta postprandial (media \pm ETM) como una función de la diferencia del genotipo en cada sitio polimórifico se muestra en la Fig. 4A, 4B, y 4C. La Fig. 4D es un gráfico de la respuesta lipémica postprandial teniendo en cuenta el genotipo de ambos SNP de LSR núm. 1 y núm. 3. La comparación estadística de las diferencias entre las medias se realizó primero mediante análisis de la varianza. Los resultados significativos se sometieron a ensayo después mediante una prueba de la t no emparejada. La significación de la prueba de la t se indica en el gráfico. Los datos se presentan utilizando las muestras reunidas de sujetos hetero- y homozigotos con el fin de obtener un número suficiente de sujetos en cada grupo.

Las Figuras 5A y 5B muestran el efecto de los polimorfismos de LSR sobre la relación de insulina con IMC en niñas adolescentes obesas. Se determinaron los niveles de insulina en plasma en ayunas en una población de niñas adolescentes obesas y se trazaron frente a su IMC y se generó una línea de regresión (Fig. 5A). Las frecuencias de los genotipos de los 5 marcadores de LSR se compararon basándose en si los individuos estaban por enzima o por debajo de la línea de regresión y se presentaron como un análisis de la Chi cuadrado (Fig. 5B). Los resultados demuestran que el marcador 2 de LSR influye significativamente en la relación entre la insulina y el IMC en niñas adolescentes obesas. La media y el intervalo de confianza del 99,99% de los marcadores al azar se muestran en forma de líneas continuas y líneas discontinuas, respectivamente.

Las Figuras 6A, 6B, 6C, y 6D muestran el efecto del polimorfismo de LSR sobre la tolerancia a la glucosa en niñas adolescentes obesas. Las concentraciones de glucosa e insulina se determinaron en muestras de plasma tomadas antes (t0) y 2h después (t120) de un ensayo de tolerancia a la glucosa y se calculó el incremento relativo de glucosa en plasma en comparación con el incremento de insulina en plasma y se trazó como una función del genotipo de SNP. El SNP núm. 1 se muestra en la Fig. 6A, el SNP núm. 2 en la Fig. 6B, el SNP núm. 3 en la Fig. 6C, y el SNP núm. 4 en la Fig. 6D. Los datos muestran que solamente el polimorfismo en el marcador 2 de LSR influye significativamente en la proporción del incremento relativo de glucosa en plasma con respecto al incremento relativo de insulina en
plasma.

La Figura 7 muestra la asociación de los polimorfismos de LSR con la obesidad en sujetos humanos. El genotipo de los 3 SNP de LSR se determinó en una población de adultos Caucásicos delgados (Delgados), así como en una población de niñas Caucásicas obesas (Obesas). Las comparaciones del genotipo mostraron una asociación entre los sujetos obesos y el genotipo CT/TT, AA, GG para el marcador núm. 1, núm. 2 y núm. 3, respectivamente. También se proporcionan la Chi cuadrado calculada y el cociente de posibilidades.

Breve descripción de las secuencias proporcionadas en la lista de secuencias

SEC ID NO: 1 contiene una secuencia genómica de LSR humano que comprende la región reguladora 5' (región no transcrita aguas arriba), los exones e intrones, y la región reguladora 3' (región no transcrita aguas abajo).

SEC ID NO: 2 contiene una secuencia parcial de ADN de LSR humano.

SEC ID NO: 3 contiene una secuencia parcial de ADN de LSR humano.

SEC ID NO: 4 contiene una secuencia parcial de ADN de LSR humano.

SEC ID NO: 5 contiene una secuencia parcial de ADN de LSR humano.

SEC ID Nº: 6 contiene una secuencia parcial de ADN de LSR humano.

SEC ID Nº: 7 contiene una secuencia parcial de ADN de LSR humano.

SEC ID Nº: 8 contiene una secuencia parcial de ADN de LSR humano.

SEC ID Nº: 9 contiene una secuencia parcial de ADN de LSR humano.

SEC ID Nº: 10 contiene una secuencia parcial de ADN de LSR humano.

SEC ID Nº: 11 contiene una secuencia parcial de ADN de LSR humano.

SEC ID Nº: 12 contiene una secuencia parcial de ADN de LSR humano.

SEC ID Nº: 13 contiene una secuencia de ADNc de LSR humano con la traducción de aminoácidos.

SEC ID Nº: 14 contiene una secuencia de proteínas de LSR humano.

SEC ID NO: 15 contiene un secuencia de ADNc variante de LSR humano con la traducción de aminoácidos.

SEC ID NO: 16 contiene una secuencia de proteínas variante de LSR humano.

SEC ID NO: 17 contiene un secuencia de ADNc variante de LSR humano con la traducción de aminoácidos.

SEC ID NO: 18 contiene una secuencia de proteínas variante de LSR humano.

SEC ID NO: 19 contiene un oligonucleótido de secuenciación de ADN para el CebadorPU.

SEC ID NO: 20 contiene un oligonucleótido de secuenciación de ADN para el CebadorRP.

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De acuerdo con las regulaciones referentes a las Listas de Secuencias, se han utilizado los siguientes códigos en la Lista de Secuencias para indicar las localizaciones de los marcadores bialélicos dentro de las secuencias y para identificar cada uno de los alelos presentes en la base polimórfica. El código "r" en las secuencias indica que un alelo de la base polimórfica es una guanina, mientras el otro alelo es una adenina. El código "y" en las secuencias indica que un alelo de la base polimórfica es una timina, mientras el otro alelo es una citosina. El código "m" en las secuencias indica que un alelo de la base polimórfica es una adenina, mientras el otro alelo es una citosina. El código "k" en las secuencias indica que un alelo de la base polimórfica es una guanina, mientras el otro alelo es una timina. El código "s" en las secuencias indica que un alelo de la base polimórfica es una guanina, mientras el otro alelo es una citosina. El código "w" en las secuencias indica que un alelo de la base polimórfica es una adenina, mientras el otro alelo es una timina. El código de nucleótidos del alelo original para cada marcador bialélico es el
siguiente:

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

2

En algunos casos, las bases polimórficas de los marcadores bialélicos alteran la identidad de los aminoácidos en el polipéptido codificado. Esto está indicado en la Lista de Secuencias acompañante mediante el uso de las características VARIANTE, situación de Xaa en la posición del aminoácido polimórfico, y definición de Xaa como los dos aminoácidos alternativos. Por ejemplo, si un alelo de un marcador bialélico es el codón CAC, que codifica histidina, mientras el otro alelo del marcador bialélico es CAA, que codifica glutamina, la Lista de Secuencias para el polipéptido codificado contendrá un Xaa en la localización del aminoácido polimórfico. En este caso, Xaa se definiría como histidina o glutamina.

En otros casos, Xaa puede indicar un aminoácido cuya identidad es desconocida debido a la ambigüedad de la secuencia de nucleótidos. En este caso se utiliza la característica POCO CIERTO, Xaa se sitúa en la posición del aminoácido desconocido, y Xaa se define por ser cualquiera de los 20 aminoácidos o un número limitado de aminoácidos sugeridos por el código genético.

Descripción detallada de la invención

El LSR (Receptor Estimulado por la Lipólisis), que se describe en la publicación PCT Núm. WO IB98/01257, es expresado en la superficie de las células hepáticas y se une a las lipoproteínas en presencia de ácidos grasos. El gen LSR codifica mediante empalme alternativo tres tipos de subunidades, a saber LSR \alpha, LSR \alpha' y LSR \beta. LSR también se puede unir a una citoquina, preferiblemente leptina. Como LSR está implicado en el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos, incluyendo el tejido adiposo, este gen es un buen candidato para una asociación con la obesidad y los trastornos relacionados con la obesidad. Por consiguiente, los marcadores polimórficos del gen LSR pueden ser útiles para establecer la implicación de LSR en la obesidad, y para diseñar diagnósticos y tratamientos de la obesidad. De hecho, los estudios de asociación ya han relacionado un marcador bialélico de LSR con los niveles de triglicéridos en plasma tanto en ayunas como postprandiales en niñas adolescentes obesas, y un marcador bialélico de LSR diferente con los niveles de insulina y glucosa en niñas adolescentes obesas. Se ha demostrado que una combinación de marcadores bialélicos de LSR está asociada con la obesidad en niñas adolescentes.

I. Marcadores Bialélicos Y Polinucleótidos que Comprenden los Marcadores Bialélicos Ventajas de los marcadores bialélicos de la presente invención

Los marcadores bialélicos de LSR de la presente invención ofrecen numerosas ventajas importantes sobre otros marcadores genéticos tales como los marcadores RFLP (Polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción) y VNTR (Número Variable de las Repeticiones en Tándem).

La primera generación de marcadores fueron los RFLP, que son variaciones que modifican la longitud de un fragmento de restricción. Pero los métodos utilizados para identificar y para tipificar los RFLP son relativamente un despilfarro de materiales, esfuerzo, y tiempo. La segunda generación de marcadores genéticos fueron los VNTR, que pueden ser categorizados como minisatélites o microsatélites. Los minisatélites son secuencias de ADN repetidas en tándem presentes en unidades de 5-50 repeticiones que están distribuidas a lo largo de las regiones de los cromosomas humanos que oscilan entre 0,1 a 20 kilobases de longitud. Puesto que presentan muchos posibles alelos, su contenido informativo es muy elevado. Los minisatélites se puntúan realizando transferencias Southern para identificar el número de repeticiones en tándem presentes en una muestra de ácido nucleico del individuo que está siendo sometido a ensayo. No obstante, solamente hay 10^{4} VNTR potenciales que pueden ser tipificadas mediante transferencia Southern. Por otra parte, el desarrollo y el análisis en gran número de los marcadores tanto RFLP como VNTR es costoso y lleva tiempo.

Se pueden utilizar el polimorfismo de un único nucleótido (SNP) o los marcadores bialélicos de la misma manera que los RFLP y las VNTR pero ofrecen diversas ventajas. Los SNP están densamente espaciados en el genoma humano y representan el tipo de variación más frecuente. Un número estimado de más de 10^{7} sitios están dispersos a lo largo de los 3x10^{9} pares de bases del genoma humano. Por lo tanto, los SNP se producen con una frecuencia mayor y con una uniformidad mayor que los marcadores RFLP o VNTR lo que significa que existe una posibilidad mayor de que semejante marcador se encuentre en íntima proximidad con el locus genético de interés. Los SNP son menos variables que los marcadores VNTR pero son mutacionalmente más estables.

Asimismo, las diferentes formas de un SNP caracterizado, tal como los marcadores bialélicos de la presente invención, a menudo son más fáciles de distinguir y por lo tanto pueden ser fácilmente tipificados rutinariamente. Los marcadores bialélicos tienen alelos basados en nucleótidos individuales y tienen solamente dos alelos comunes, lo que permite una detección altamente paralela y una puntuación automatizada. Los marcadores bialélicos de la presente invención ofrecen la posibilidad de una genotipificación rápida de alto rendimiento de un gran número de in-
dividuos.

Los marcadores bialélicos están densamente espaciados en el genoma, son suficientemente informativos y pueden ser analizados en gran número. Los efectos combinados de estas ventajas hacen a los marcadores bialélicos extremadamente útiles en los estudios genéticos. Los marcadores bialélicos pueden ser utilizados en los estudios de ligamiento, en los métodos de alelos compartidos, en los estudios de desequilibrio de ligamiento en poblaciones, en estudios de asociación de poblaciones de casos-control. Un importante aspecto de la presente invención es que los marcadores bialélicos permiten realizar estudios de asociación para identificar genes implicados en rasgos complejos. Los estudios de asociación examinan la frecuencia de los alelos marcadores en las poblaciones de casos y de control no relacionadas y se emplean generalmente en la detección de rasgos poligénicos o esporádicos. Los estudios de asociación se pueden realizar en una población general y no están limitados a los estudios realizados en individuos concretos en familias afectadas (estudios de ligamiento). Los marcadores bialélicos de diferentes genes se pueden escrutar en paralelo para la asociación directa con una enfermedad o una respuesta a un tratamiento. Este enfoque de múltiples genes es una herramienta poderosa para una variedad de estudios genéticos humanos ya que proporciona la potencia estadística necesaria para examinar el efecto sinérgico de múltiples factores genéticos sobre un fenotipo concreto, una respuesta a un fármaco, un rasgo esporádico, o un estado de enfermedad con una etiología genética compleja.

Gen candidato de la presente invención

Se pueden emplear diferentes enfoques para realizar estudios de asociación: estudios de asociación en todo el genoma, estudios de asociación de la región candidata y estudios de asociación del gen candidato. Los estudios de asociación en todo el genoma cuentan con el escrutinio de marcadores genéticos espaciados uniformemente y que abarcan el genoma completo. Los estudios de asociación de la región candidata cuentan con el escrutinio de marcadores genéticos espaciados uniformemente que abarcan una región identificada como ligada al rasgo de interés. El enfoque del gen candidato se basa en el estudio de marcadores genéticos específicamente derivados de genes potencialmente implicados en una ruta biológica relacionada con el rasgo de interés.

En la presente invención, el LSR está implicado en el reparto de los lípidos de la dieta en el hígado y los tejidos periféricos, incluyendo el tejido adiposo. Por consiguiente, se puede asociar un polimorfismo del gen LSR con la obesidad o con un trastorno relacionado con la obesidad. Se ha confirmado que LSR es un buen gen candidato para la obesidad mediante estudios de asociación que muestran una unión entre un marcador bialélico de LSR y los niveles de triglicéridos en plasma tanto en ayunas como postprandiales, y una asociación entre otro marcador y los niveles de insulina y glucosa, en niñas adolescentes obesas. También se ha demostrado que los marcadores de LSR están asociados directamente con la obesidad.

El análisis de los genes candidato proporciona claramente un enfoque de acceso rápido para la identificación de genes y polimorfismos de genes relacionados con un rasgo concreto cuando se encuentra disponible alguna información concerniente a la biología del rasgo. No obstante, se debe observar que todos los marcadores bialélicos descritos en la presente solicitud se pueden emplear como parte de los estudios de asociación de todo el genoma o como parte de los estudios de asociación de la región candidata.

Definiciones

Antes de describir la invención con mayor detalle, se indican las siguientes definiciones para ilustrar y definir el significado y alcance de los términos usados para describir aquí la invención.

Según se utilizan en esta memoria, de forma intercambiable, los términos "oligonucleótidos", y "polinucleótidos" incluyen las secuencias de ARN, ADN, o híbridas ARN/ADN de más de un nucleótido ya sea en forma de cadena sencilla o de dúplex. El término "nucleótido" se utiliza en la presente memoria como adjetivo para describir moléculas que comprenden secuencias de ARN, ADN, o híbridas ARN/ADN de cualquier longitud en forma de cadena sencilla o de dúplex. El término "nucleótido" también se utiliza en la presente memoria como nombre para hacer referencia a nucleótidos individuales o variedades de nucleótidos, representando una molécula, o una unidad individual de una molécula de ácido nucleico más grande, que comprende una purina o una pirimidina, un radical azúcar de ribosa o desoxirribosa, y un grupo fosfato, o un enlace fosfodiéster en el caso de los nucleótidos de un oligonucleótido o polinucleótido. El término "nucleótido" también se utiliza en la presente memoria para abarcar "nucleótidos modificados" que comprenden al menos una modificación: (a) un grupo alternativo de enlace, (b) una forma análoga de purina, (c) una forma análoga de pirimidina, o (d) un análogo de azúcar. Como ejemplos de grupos de unión análogos, purinas, pirimidinas y azúcares véase, por ejemplo, la publicación PCT Núm. WO 95/04064. Las secuencias polinucleotídicas se pueden preparar por cualquier método conocido, incluyendo la generación sintética, recombinante, ex vivo, o una combinación de las mismas, así como utilizando cualquier método de purificación conocido en la técnica.

El término "purificado" se usa en la presente memoria para describir un polinucleótido o vector polinucleotídico que se ha separado de otros compuestos incluyendo, pero sin limitación, otros ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y proteínas (tales como las enzimas usadas en la síntesis del polinucleótido), o la separación de polinucleótidos cerrados covalentemente a partir de polinucleótidos lineales. Un polinucleótido es sustancialmente puro cuando al menos aproximadamente 50, preferiblemente de 60 a 75% de una muestra manifiesta una única secuencia polinucleotídica y conformación (lineal frente a cerrada covalentemente). Un polipéptido sustancialmente puro comprende típicamente aproximadamente 50%, preferiblemente de 60 a 90% en peso/peso de muestra de ácido nucleico, más usualmente aproximadamente 95%, y preferiblemente tiene una pureza de más de aproximadamente 99%.La pureza u homogeneidad de un polinucleótido se puede indicar por una serie de medios bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis de una muestra en gel de agarosa o de poliacrilamida, seguido por la visualización de una única banda de un polinucleótido después de la tinción del gel. Para ciertos fines, puede proporcionarse una mayor resolución mediante el uso de HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica.

El término "aislado" requiere que el material sea separado de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se presenta en la naturaleza). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que aparece en la naturaleza presente en un animal viviente no está aislado, pero el mismo polinucleótido o ADN o polipéptido, separado de alguno o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dicho polinucleótido podría ser parte de un vector y/o dicho polinucleótido o polipéptido podría ser parte de una composición, y aún así estar aislado porque el vector o composición no es parte de su entorno natural.

En toda la presente memoria, la expresión "secuencia de nucleótidos" puede emplearse para designar indistintamente un polinucleótido o un ácido nucleico. Más precisamente, la expresión "secuencia de nucleótidos" abarca el propio material nucleico y de este modo no está restringido a la información de la secuencia (esto es la sucesión de letras seleccionadas entre las cuatro bases) que caracteriza bioquímicamente una molécula de ADN o ARN específica.

El término "cebador" indica una secuencia específica de oligonucleótidos que es complementaria a una secuencia diana de nucleótidos y que se usa para hibridarse con la secuencia de nucleótidos diana. Un cebador sirve como un punto de iniciación para la polimerización de los nucleótidos catalizada por la ADN-polimerasa, ARN-polimerasa, o transcriptasa inversa.

El término "sonda" denota un segmento de ácido nucleico definido (o un segmento análogo de nucleótidos, por ejemplo, APN como se define en la presente memoria más adelante) que puede usarse para identificar una secuencia polinucleotídica específica presente en una muestra, comprendiendo dicho segmento de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de polinucleótidos específica que se va a identificar.

Los términos "constructo polinucleotídico" y "polinucleótido recombinante" se utilizan indistintamente en la presente memoria para hacer referencia a polinucleótidos lineales o circulares que han sido diseñados artificialmente y que comprenden al menos dos secuencias nucleotídicas que no se encuentran como secuencias de nucleótidos contiguas en su entorno natural inicial.

El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos sin tener en cuenta la longitud del polímero. Por lo tanto, dentro de la definición de polipéptido se incluyen péptidos, oligopéptidos y proteínas. Este término tampoco especifica ni excluye las modificaciones post-expresión de los polipéptidos. Por ejemplo, los polipéptidos que incluyen la unión covalente de grupos glucosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lipídicos y similares, están expresamente englobados en el término polipéptido. También se incluyen dentro de la definición polipéptidos que pueden contener uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, aminoácidos que sólo son naturales en un sistema biológico no relacionado, aminoácidos de sistemas de mamíferos modificados etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como no natural.

El término "purificado" también se usa aquí para describir un polipéptido que ha sido separado de otros compuestos incluyendo, pero sin limitarse a ellos, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, y otras proteínas. Un polipéptido es sustancialmente puro cuando al menos aproximadamente 50%, preferiblemente 60 a 75% de una muestra presenta una única secuencia polipeptídica. Un polipéptido sustancialmente puro comprende típicamente aproximadamente 50%, preferiblemente de 60 a 90% en peso/peso de muestra de proteína, más usualmente aproximadamente 95%, y preferiblemente tiene una pureza de más de 99%. La pureza u homogeneidad de un polipéptido se indica por una serie de métodos bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis de una muestra en gel de agarosa o de poliacrilamida, seguido por la visualización de una única banda de un polipéptido después de la tinción del gel. Para ciertos fines, puede proporcionarse una mayor resolución mediante el uso de HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica.

El término "polipéptido recombinante" se utiliza en la presente memoria para hacer referencia a polipéptidos que han sido diseñados artificialmente y que comprenden al menos dos secuencias polipeptídicas que no se encuentran como secuencias polipeptídicas contiguas en su entorno natural inicial, o para hacer referencia a polipéptidos que han sido expresados a partir de un polinucleótido recombinante (supra).

Según se utiliza en la presente memoria, el término "animal no humano" se refiere a cualquier vertebrado no humano, aves y más usualmente mamíferos, preferiblemente primates, animales de granja tales como cerdos, cabras, ovejas, burros, y caballos, conejos o roedores, más preferiblemente ratas o ratones. Según se utiliza en la presente memoria, el término "animal" se utiliza para hacer referencia a cualquier vertebrado, preferiblemente mamífero. Los términos tanto "animal" como "mamífero" incluyen expresamente los sujetos humanos a menos que vayan acompañados por el término "no humano".

Según se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que comprenden al menos un dominio de unión, donde el dominio de unión del anticuerpo se forma por plegamiento de dominios variables de una molécula de anticuerpo para formar espacios de unión tridimensionales con una forma de superficie interna y distribución de carga complementarias a las características de un determinante antigénico de un antígeno, y que permite una reacción inmunológica con el antígeno. Los anticuerpos incluyen proteínas recombinantes que comprenden los dominios de unión, así como fragmentos, incluyendo los fragmentos Fab, Fab', F(ab)_{2}, y F(ab')_{2}.

Según se utiliza en la presente memoria, un "determinante antigénico" es la porción de una molécula de antígeno, en este caso un polipéptido de LSR, que determina la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo. Un "epítopo" hace referencia a un determinante antigénico de un polipéptido. Un epítopo puede comprender tan solo 3 aminoácidos en una conformación espacial que es única para el epítopo. En general, un epítopo consiste en al menos 6 de estos aminoácidos, y con más frecuencia al menos 8-10 de estos aminoácidos. Los métodos para determinar los aminoácidos que constituyen un epítopo incluyen cristalografía de rayos x, resonancia magnética nuclear bidimensional y mapeo de epítopos, por ejemplo, el método Pepscan descrito por H. Mario Geysen et al. 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3998-4002; Publicación PCT Núm. WO 84/03564; y Publicación PCT Núm. WO 84/03506.

El término "enfermedad que implica el reparto de lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos" hace referencia concretamente a la obesidad y a los trastornos relacionados con la obesidad, tales como la aterosclerosis relacionada con la obesidad, la resistencia a la insulina relacionada con la obesidad, la hipertensión relacionada con la obesidad, la hiperlipidemia asociada con la obesidad, la hipertrigliceridemia relacionada con la obesidad, el infarto de miocardio/enfermedad cardiovascular relacionada con la obesidad (principalmente para mujeres), las lesiones microangiopáticas resultantes de la diabetes de Tipo II relacionada con la obesidad, las lesiones oculares causadas por microangiopatía en individuos obesos con diabetes de Tipo II, lesiones renales causadas por microangiopatía en individuos obesos con diabetes de Tipo II, y Síndrome X.

El término "agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos" hace referencia a un fármaco o un compuesto que modula la actividad del LSR o el reparto de los lípidos de la dieta al hígado, reduciendo la ingesta de alimento en individuos obesos, reduciendo los niveles de ácidos grasos en individuos obesos, disminuyendo el peso corporal de individuos obesos, o tratando una afección relacionada con la obesidad seleccionada del grupo que consiste en aterosclerosis relacionada con la obesidad, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad, hipertensión relacionada con la obesidad, hiperlipidemia relacionada con la obesidad, hipertrigliceridemia relacionada con la obesidad, infarto de miocardio/enfermedad cardiovascular relacionada con la obesidad (principalmente para mujeres), lesiones microangiopáticas resultantes de la diabetes de Tipo II relacionada con la obesidad, lesiones oculares causadas por microangiopatía en individuos obesos con diabetes de Tipo II, lesiones renales causadas por microangiopatía en individuos obesos con diabetes de Tipo II y Síndrome X.

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El término "respuesta a un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos" se refiere a la eficacia del fármaco, incluyendo pero sin limitarse a ellas, la capacidad para metabolizar un compuesto, la capacidad para convertir un pro-fármaco en un fármaco activo, y la farmacocinética (absorción, distribución, eliminación) y la farmacodinámica (relacionada con el receptor) de un fármaco en un individuo.

El término "efectos secundarios de un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos" se refiere a los efectos adversos de la terapia debidos a extensiones de la acción farmacológica principal del fármaco o a reacciones adversas idiosincráticas debidas a una interacción del fármaco con factores únicos del anfitrión. Los "efectos secundarios de un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos" incluyen, pero sin limitación, reacciones adversas tales como toxicidades dermatológicas, hematológicas o hepatológicas y además incluyen úlceras gástricas e intestinales, alteración de la función plaquetaria, lesión renal, nefritis, rinitis vasomotora con secreciones acuosas abundantes, edema angioneurótico, urticaria generalizada y asma bronquial hasta edema laríngeo y broncoconstricción, hipotensión y choque.

Los términos "rasgo" y "fenotipo" se utilizan indistintamente en la presente memoria y hacen referencia a cualquier propiedad visible, detectable o medible de otro modo de un organismo tales como los síntomas de, o la susceptibilidad a una enfermedad por ejemplo. Típicamente los términos "rasgo" o "fenotipo" se utilizan en la presente memoria para hacer referencia a los síntomas de, o la susceptibilidad a, una enfermedad que implica el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos, más concretamente la obesidad y los trastornos relacionados con la obesidad; o para hacer referencia a una respuesta del individuo a un agente sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos; o para hacer referencia a síntomas de, o susceptibilidad a, efectos secundarios de un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos.

El término "alelo" se utiliza en la presente memoria para hacer referencia a variantes de una secuencia de nucleótidos. Un polimorfismo bialélico tiene dos formas. Típicamente el primer alelo identificado se designa como el alelo original mientras otros alelos se designan como alelos alternativos. Los organismos diploides pueden ser homocigotos o heterocigotos para una forma alélica.

El término "tasa de heterocigosis" se utiliza en la presente memoria para hacer referencia a la incidencia de individuos en una población, que son heterocigotos en un alelo concreto. En un sistema bialélico la tasa de heterocigosis es de promedio igual a 2P_{a}(1-P_{a}), donde P_{a} es la frecuencia del alelo menos común. Con el fin de resultar útil en estudios genéticos, un marcador genético debe tener un nivel adecuado de heterocigosis para permitir una probabilidad razonable de que una persona seleccionada al azar sea heterocigota.

El término "genotipo", según se utiliza en la presente memoria se refiere a la identidad de los alelos presentes en un individuo o en una muestra. En el contexto de la presente invención, un genotipo hace referencia preferiblemente a la descripción de los alelos del marcador bialélico presentes en un individuo o una muestra. El término "genotipificación" de una muestra o un individuo con relación a un marcador bialélico consiste en determinar el alelo específico o el nucleótido específico que lleva un individuo en un marcador bialélico.

El término "mutación" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a una diferencia en la secuencia de ADN entre diferentes genomas o individuos que tiene una frecuencia por debajo de 1%.

El término "haplotipo" hace referencia a una combinación de alelos presente en un individuo o una muestra. En el contexto de la presente invención, un haplotipo hace referencia preferiblemente a una combinación de alelos de marcadores bialélicos encontrados en un individuo dado y que pueden estar asociados con un fenotipo.

El término "polimorfismo" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a la existencia de dos o más secuencias genómicas alternativas o alelos entre diferentes genomas o individuos. "Polimórfico" hace referencia a la condición en la cual dos o más variantes de una secuencia genómica específica pueden ser encontradas en una población. Un "sitio polimórfico" es el locus en el que se produce la variación. Un polimorfismo de un único nucleótido es un cambio de un único par de bases. Típicamente un polimorfismo de un único nucleótido es la sustitución de un nucleótido por otro nucleótido en el sitio polimórfico. La deleción de un único nucleótido o la inserción de un único nucleótido, también da lugar a polimorfismos de un único nucleótido. En el contexto de la presente invención "polimorfismo de un único nucleótido" preferiblemente hace referencia a la sustitución de un único nucleótido. Típicamente, entre diferentes genomas o entre diferentes individuos, el sitio polimórfico puede ser ocupado por dos nucleótidos diferentes. Sin embargo, la modificación del nucleótido también puede implicar una inserción o una deleción de al menos un nucleótido, preferiblemente entre 1 y 8 nucleótidos. Este tipo de polimorfismos también se contempla en la presente invención.

Los términos "polimorfismo bialélico" y "marcador bialélico" se utilizan indistintamente en la presente memoria para hacer referencia a un polimorfismo que tiene dos alelos con una frecuencia bastante elevada en la población. Un "alelo de un marcador bialélico" hace referencia a las variantes de los polinucleótidos presentes en un sitio de un marcador bialélico. Típicamente la frecuencia del alelo menos común de los marcadores bialélicos de la presente invención ha sido validada para que sea mayor de 1%, preferiblemente la frecuencia es mayor de 10%, más preferiblemente la frecuencia es de al menos 20% (esto es una tasa de heterocigosis de al menos 0,32), incluso más preferiblemente la frecuencia es de al menos 30% (esto es una tasa de heterocigosis de al menos 0,42). Un marcador bialélico, en el que la frecuencia del alelo menos común es del 30% o más, se denomina un "marcador bialélico de alta calidad".

La localización de los nucleótidos en un polinucleótido con respecto al centro del polinucleótido se describe en la presente memoria de la siguiente manera. Cuando un polinucleótido tiene un número impar de nucleótidos, se considera que el nucleótido a una distancia igual de los extremos 3' y 5' del polinucleótido está "en el centro" del polinucleótido, y se considera que cualquier nucleótido inmediatamente adyacente al nucleótido del centro, o el propio nucleótido del centro está a "1 nucleótido del centro". Con un número impar de nucleótidos en un polinucleótido cualquiera de las cinco posiciones de nucleótidos del medio del polinucleótido podría considerarse a 2 nucleótidos del centro, y así sucesivamente. Cuando un polinucleótido tiene un número par de nucleótidos, habría un enlace y no un nucleótido en el centro del polinucleótido. De este modo, cualquiera de los dos nucleótidos centrales sería considerado "a 1 nucleótido del centro" y cualquiera de los cuatro nucleótidos del medio del polinucleótido sería considerado "a 2 nucleótidos del centro", y así sucesivamente. Para los polimorfismos que implican la sustitución, inserción o deleción de 1 o más nucleótidos, el polimorfismo, alelo o marcador bialélico está en "el centro" de un polinucleótido si la diferencia entre la distancia de los polinucleótidos sustituidos, insertados, o suprimidos del polimorfismo y el extremo 3' del polinucleótido, y la distancia de los polinucleótidos sustituidos, insertados, o suprimidos del polimorfismo y el extremo 5' del polinucleótido es cero o un nucleótido. Si la diferencia es de 0 a 3, se considera que el polimorfismo está "a 1 nucleótido del centro". Si la diferencia es de 0 a 5, se considera que el polimorfismo está "a 2 nucleótidos del centro". Si la diferencia es de 0 a 7, se considera que el polimorfismo está "a 3 nucleótidos del centro", y así sucesivamente.

El término "aguas arriba" se utiliza en la presente memoria para hacer referencia a una localización que está hacia el extremo 5' del polinucleótido desde un punto de referencia específico.

Según se utiliza en la presente memoria el término "marcador bialélico relacionado con LSR" hace referencia a un grupo de marcadores bialélicos en desequilibrio de ligamiento con el gen LSR. El término marcador bialélico relacionado con LSR incluye marcadores tanto génicos como no génicos. A menos que se especifique de otro modo, el término "marcador bialélico relacionado con LSR" abarca los marcadores bialélicos tanto validados como no validados. Se puede especificar cualquiera de los métodos de genotipificación, asociación, y determinación de la frecuencia de alelos o haplotipos descritos ya que son realizados utilizando solamente marcadores validados (p. ej. A1 a A32) o utilizando marcadores tanto validados como no validados (p. ej. A1 a A32 y A'1 a A'20). Más preferiblemente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A2, A16, A17, A24, A26, y A31, y sus complementos. Alternativamente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A21, A23, y A24 y sus complementos. En una realización especialmente preferida, el marcador bialélico es A26. Una realización alternativa es cualquier combinación de A15, A17, y A21. De nuevo, se puede especificar cualquiera de los métodos de genotipificación, asociación, y determinación de la frecuencia de alelos o haplotipos descritos ya que se realizan utilizando solamente el marcador preferido, el más preferido, o el especialmente preferido, o cualquier combinación de marcadores.

Los términos "base emparejada" y "base de Watson y Crick emparejada" se utilizan indistintamente en la presente memoria para hacer referencia a nucleótidos que pueden estar unidos por enlaces de hidrógeno entre sí en virtud de sus secuencias de una manera similar a la encontrada en el ADN de doble hélice con restos timina o uracilo unidos a restos adenina por dos enlaces de hidrógeno y restos citosina y guanina unidos por tres enlaces de hidrógeno (Véase Stryer, L., Biochemistry, 4ª edición, 1995).

Los términos "complementario" o "su complemento" se utilizan en la presente memoria para hacer referencia a la secuencia de polinucleótidos que es capaz de formar emparejamientos de bases de Watson y Crick con otra secuencia de polinucleótidos especificada en la totalidad de la región indicada. Para los fines de la presente invención, se considera que un primer polinucleótido es complementario a un segundo polinucleótido cuando cada base del primer polinucleótido está emparejada con su base complementaria del segundo polinucleótido. Las bases complementarias son, generalmente, A y T (o A y U), o C y G. "Complemento" se utiliza en la presente memoria como sinónimo de "polinucleótido complementario", "ácido nucleico complementario" y "secuencia de nucleótidos complementaria". Estos términos se aplican a pares de polinucleótidos basándose solamente en sus secuencias y no en el conjunto de condiciones concretas en las cuales se unirían realmente los dos polinucleótidos.

El término "no génico" se utiliza en la presente memoria para describir marcadores bialélicos relacionados con LSR así como polinucleótidos y cebadores que aparecen fuera de las posiciones de los nucleótidos mostradas en las secuencias genómicas del LSR humano de los SEQ ID NO: 1 a 13, 15, 17, o sus complementos. El término "génico" se utiliza en la presente memoria para describir marcadores bialélicos relacionados con LSR así como polinucleótidos y cebadores que aparecen en las posiciones de los nucleótidos mostradas en las secuencias genómicas del LSR humano de los SEQ ID NO: 1 a 13, 15, 17, o sus complementos.

Condiciones de hibridación rigurosas

A modo de ejemplo y no de limitación, los procedimientos que utilizan condiciones muy rigurosas son los siguientes: La prehibridación de filtros que contienen ADN se lleva a cabo durante 8 horas a durante la noche a 65ºC en tampón compuesto por 6X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,02%, y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante 48 h a 65ºC, la temperatura de hibridación preferida, en la mezcla de prehibridación que contiene 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 X 10^{6} cpm de sonda marcada con P^{32}. Alternativamente, la etapa de hibridación se puede realizar a 65ºC en presencia de tampón SSC, 1 x SSC correspondiente a NaCl 0,15 M y citrato de Na 0,05 M. Con posterioridad, se pueden realizar lavados del filtro a 37ºC durante 1 h en una solución que contiene 2 x SSC, PVP al 0,01%, Ficoll al 0,01%, y BSA al 0,01%, seguido de un lavado en 0,1X SSC a 50ºC durante 45 min. Alternativamente, las lavados del filtro se pueden realizar en una solución que contiene 2 x SSC y SDS al 0,1%, o 0,5 x SSC y SDS al 0,1%, o 0,1 x SSC y SDS al 0,1% a 68ºC durante intervalos de 15 minutos. Después de las etapas de lavado, las sondas hibridadas son detectables mediante autorradiografía. Otras condiciones altamente rigurosas que se pueden utilizar son bien conocidas en la técnica y se citan en Sambrook et al., 1989; y Ausubel et al., 1989.

Estas condiciones de hibridación son adecuadas para una molécula de ácido nucleico de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. No es necesario decir que las condiciones de hibridación descritas antes deben ser adaptadas a la longitud del ácido nucleico deseado, siguiendo mecanismos bien conocidos en por el experto en la técnica. Las condiciones de hibridación adecuadas se pueden adaptar por ejemplo de acuerdo con las enseñanzas descritas en el libro de Hames y Higgins (1985) o por Sambrook et al. (1989),

Variantes y fragmentos Polinucleótidos

Se describen las variantes y fragmentos de los polinucleótidos descritos en la presente memoria, concretamente de un gen LSR que contiene uno o más marcadores bialélicos de acuerdo con la invención.

Las variantes de los polinucleótidos, según se utiliza el término en la presente memoria, son los polinucleótidos que difieren de un polinucleótido de referencia. Una variante de un polinucleótido puede ser una variante natural tal como una variante alélica natural, o puede ser una variante que no se considera natural. Estas variantes no naturales del polinucleótido pueden obtenerse por técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. En general, las diferencias son limitadas, de manera que las secuencias de nucleótidos de la referencia y de la variante son muy similares en general y, en muchas regiones, idénticas.

Las variantes de los polinucleótidos incluyen, sin estar limitadas a, secuencias de nucleótidos que son idénticas al menos en un 95% a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 13, 15, y 17 o a cualquier fragmento de polinucleótidos de al menos 8 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de nucleótido de los SEQ ID NO: 1, 13, 15, y 17, y preferiblemente idénticas al menos en 99%, más concretamente al menos en 99,5%, y muy preferiblemente al menos idénticas en 99,8% a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 13, 15, y 17 o a cualquier fragmento de polinucleótidos de al menos 8 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 13, 15, y 17.

Los cambios de nucleótidos presentes en un polinucleótido variante pueden ser silenciosos, lo cual significa que no alteran los aminoácidos codificados por el polinucleótido.

Sin embargo, los cambios de nucleótidos también pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia. Las sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden ser alteradas en las regiones codificantes o no codificantes o en ambas. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas.

Los polinucleótidos pueden codificar polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función biológica o actividad que la proteína LSR madura.

Un fragmento de polinucleótido es un polinucleótido que tiene una secuencia que es enteramente la misma que parte pero no toda una secuencia de nucleótidos dada, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de un gen LSR, y sus variantes. El fragmento puede ser una porción de un exón o de un intrón de un gen LSR. También puede ser una porción de las secuencias reguladoras, preferiblemente de la secuencia del promotor, del gen LSR. Preferiblemente, tales fragmentos comprenden al menos uno de los marcadores bialélicos A1 a A32, y A'1 a A'20 y sus complementos o un marcador bialélico en desequilibrio de ligamiento con uno o más de los marcadores bialélicos A1 a A32, y A'1 a A'20.

Tales fragmentos pueden "estar libres", esto es no formando parte de o fusionados a otros polipéptidos, o pueden estar formados dentro de un único polipéptido más grande del cual forman parte o son una región. Sin embargo, varios fragmentos pueden estar comprendidos dentro de un solo polinucleótido más grande.

Opcionalmente, tales fragmentos pueden consistir en, o consistir esencialmente en un tramo contiguo que oscila de 8, 10, 12, 15, 18 o 20 a 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 o 1000 nucleótidos de longitud, o especificarse por tener 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 250, 500 o 1000 nucleótidos de longitud. Se prefieren aquellos fragmentos que contienen al menos uno de los marcadores bialélicos A1 a A32, y A'1 a A'20 del gen LSR y sus complementos que se describen en la presente memoria.

En la presente memoria se describen polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que consisten esencialmente en, o que comprenden un tramo contiguo de al menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 o 1000 nucleótidos de cualquiera de los SEQ ID NO: 1, 13, 15 o 17, o sus complementos, donde dicho tramo contiguo comprende un marcador bialélico relacionado con LSR; Opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con LSR se selecciona del grupo que consiste en A15, A17 y A21 opcionalmente, donde el extremo 3' de dicho tramo contiguo está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido; opcionalmente, donde dicho polinucleótido está anclado a un soporte sólido; y opcionalmente donde dicho polinucleótido comprende adicionalmente una marca. Una realización de la invención incluye polinucleótidos aislados, purificados, o recombinantes que consisten en un tramo contiguo de 8 a 50 nucleótidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1, 13, 15 o 17, o sus complementos, donde dicho tramo contiguo comprende un marcador bialélico relacionado con LSR; donde dicho marcador bialélico relacionado con LSR se selecciona del grupo que consiste en A15, A17 y A21 donde cuando el polinucleótido comprende A21, el nucleótido en el sitio del marcador A21 es A o T; Opcionalmente, donde dicho tramo contiguo tiene de 18 a 35 nucleótidos de longitud y dicho marcador bialélico está a 4 nucleótidos del centro de dicho polinucleótido. Opcionalmente, donde dicho polinucleótido consiste en dicho tramo contiguo y dicho tramo contiguo tiene 25 nucleótidos de longitud y dicho marcador bialélico está en el centro de dicho polinucleótido. Opcionalmente, donde el extremo 3' de dicho tramo contiguo está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido; Opcionalmente, donde el extremo 3' de dicho tramo contiguo está localizado en el extremo 3' de dicho polinucleótido y dicho marcador bialélico está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido. Opcionalmente, donde dicho polinucleótido está anclado a un soporte sólido; y opcionalmente donde dicho polinucleótido comprende adicionalmente una marca.

Una realización preferida de la invención incluye polinucleótidos aislados, purificados, o recombinantes que consisten en, esencialmente consisten en, o comprenden un tramo contiguo de 8 a 50 nucleótidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1, 13, 15 o 17, o sus complementos, donde el extremo 3' de dicho tramo contiguo está localizado en el extremo 3' de dicho polinucleótido, y donde el extremo 3' de dicho polinucleótido está localizado 1 nucleótido aguas arriba de un marcador bialélico relacionado con LSR de dicha secuencia donde el marcador bialélico relacionado con LSR se selecciona entre el SNP núm.1, el SNP núm.2 y el SNP núm.3; Opcionalmente, donde dicho polinucleótido consiste esencialmente en una secuencia seleccionada entre las siguientes secuencias: D15, D17, D21, E14, E16 y E20; opcionalmente, donde dicho polinucleótido está anclado a un soporte sólido; y opcionalmente donde dicho polinucleótido comprende adicionalmente una marca.

En la presente memoria se describen polinucleótidos aislados, purificados, o recombinantes que consisten en, o esencialmente consisten en una secuencia seleccionada entre las siguientes secuencias: B1 a B53, y C1 a C52; opcionalmente, donde dicho polinucleótido está anclado a un soporte sólido; y opcionalmente donde dicho polinucleótido comprende adicionalmente una marca.

Asimismo se describen en la presente memoria polinucleótidos aislados, purificados, o recombinantes que codifican un polipéptido que comprende un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente al menos 8 o 10 aminoácidos, más preferiblemente al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, o 100 aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 14, 16, y 18, donde dicho tramo contiguo incluye uno cualquiera de los siguientes: un resto serina en la posición 363 del SEQ ID NO: 14; un resto asparagina en la posición 363 del SEQ ID NO: 14; un resto prolina en la posición 420 del SEQ ID NO: 14; un resto arginina en la posición 420 del SEQ ID NO: 14; un resto arginina en la posición 519 del SEQ ID NO: 14; una deleción de un aminoácido en la posición 519 del SEQ ID NO: 14; un resto serina en la posición 344 del SEQ ID NO: 16; un resto asparagina en la posición 344 del SEQ ID NO: 16; un resto prolina en la posición 401 del SEQ ID NO: 16; un resto arginina en la posición 401 del SEQ ID NO: 16; un resto arginina en la posición 500 del SEQ ID NO: 16; una deleción de un aminoácido en la posición 500 del SEQ ID NO: 16; un resto serina en la posición 295 del SEQ ID NO: 18; un resto asparagina en la posición 295 del SEQ ID NO: 18; un resto prolina en la posición 352 del SEQ ID NO: 18; un resto arginina en la posición 352 del SEQ ID NO: 18; un resto arginina en la posición 451 del SEQ ID NO: 18; y una deleción de un aminoácido en la posición 451 del SEQ ID NO: 18; opcionalmente, donde dicho polinucleótido está anclado a un soporte sólido; y opcionalmente donde dicho polinucleótido comprende adicionalmente una marca.

Un ácido nucleico como se describe en la presente memoria puede ser para su uso en un análisis de hibridación, un análisis de secuenciación, un análisis de amplificación específico de los alelos, para determinar la identidad del nucleótido en un marcador bialélico relacionado con LSR en uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 13, 15, 17 o sus complementos, o para su uso en la amplificación de un segmento de nucleótidos que comprende un marcador bialélico relacionado con LSR en cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 13, 15, 17 o sus complementos; opcionalmente, donde dicho polinucleótido está anclado a un soporte sólido; y opcionalmente donde dicho polinucleótido comprende adicionalmente una marca.

Polipéptidos

Asimismo se describen variantes, fragmentos, análogos y derivados de los polipéptidos descritos en la presente memoria, incluyendo proteínas LSR modificadas.

La variante puede ser 1) una en la que uno o más restos aminoácido están sustituidos por un resto aminoácido conservado o no conservado y semejante resto aminoácido sustituido puede ser uno codificado o no por el código genético, o 2) una en la que uno o más de los restos aminoácido incluye un grupo sustituyente, o 3) una en la que un LSR modificado está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o 4) una en la que los aminoácidos adicionales se fusionan a un LSR modificado, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del LSR modificado o una secuencia de preproteína. Se considera que tales variantes están al alcance de los expertos en la técnica.

Un fragmento de polipéptido es un polipéptido que tiene una secuencia que es enteramente la misma que parte, pero no toda una secuencia de polipéptido dada, preferiblemente un polipéptido codificado por un gen LSR y sus variantes.

Tales fragmentos pueden "estar libres", esto es no formando parte de, o fusionados a, otros polipéptidos, o pueden estar comprendidos dentro de un único polipéptido más grande del cual forman parte o son una región. Sin embargo, varios fragmentos pueden estar comprendidos dentro de un solo polinucleótido más grande.

Como ejemplos ilustrativos de los fragmentos de polipéptido, se pueden mencionar aquellos que tiene de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9 o 10 a 15, 10 a 20, 15 a 40, o 30 a 55 aminoácidos de longitud. Se prefieren aquellos fragmentos que contienen al menos una sustitución o deleción de aminoácido en una proteína LSR.

Se puede fijar la atención concretamente en un grupo de polipéptidos de LSR variantes y sus fragmentos. Estas variantes incluyen un resto serina en la posición 363 del SEQ ID NO: 14; un resto asparagina en la posición 363 del SEQ ID NO: 14; un resto prolina en la posición 420 del SEQ ID NO: 14; un resto arginina en la posición 420 del SEQ ID NO: 14; un resto arginina en la posición 519 del SEQ ID NO: 14; una deleción de un aminoácido en la posición 519 del SEQ ID NO: 14; un resto serina en la posición 344 del SEQ ID NO: 16; un resto asparagina en la posición 344 del SEQ ID NO: 16; un resto prolina en la posición 401 del SEQ ID NO: 16; un resto arginina en la posición 401 del SEQ ID NO: 16; un resto arginina en la posición 500 del SEQ ID NO: 16; una deleción de un aminoácido en la posición 500 del SEQ ID NO: 16; un resto serina en la posición 295 del SEQ ID NO: 18; un resto asparagina en la posición 295 del SEQ ID NO: 18; un resto prolina en la posición 352 del SEQ ID NO: 18; un resto arginina en la posición 352 del SEQ ID NO: 18; un resto arginina en la posición 451 del SEQ ID NO: 18; y una deleción de un aminoácido en la posición 451 del SEQ ID NO: 18. Estas proteínas variantes y sus fragmentos que contienen los alelos especificados en las posiciones de aminoácidos 363, 420, y 519 del SEQ ID NO: 14 son referidas colectivamente en la presente memoria como variantes 363-Ser, 363-Asp, 420-Pro, 420-Arg, 519-Arg, y 519-Del del SEQ ID NO: 14, respectivamente. Estas proteínas variantes y sus fragmentos que contienen los alelos especificados en las posiciones de aminoácidos 344, 401, y 500 del SEQ ID NO: 16 son referidas colectivamente en la presente memoria como variantes 344-Ser, 344-Asp, 401-Pro, 401-Arg, 500-Arg, y 500-Del del SEQ ID NO: 16, respectivamente. Estas proteínas variantes y sus fragmentos que contienen los alelos especificados en las posiciones de aminoácidos 295, 352, y 451 del SEQ ID NO: 18 son referidas colectivamente en la presente memoria como variantes 295-Ser, 295-Asp, 352-Pro, 352-Arg, 451-Arg, y 451-Del del SEQ ID NO: 18, respectivamente.

En la presente memoria se describen polipéptidos aislados, purificados, o recombinantes que comprenden un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 14, 16, y 18, donde dicho tramo contiguo incluye uno cualquiera de los siguientes: un resto serina en la posición 363 del SEQ ID NO: 14; un resto asparagina en la posición 363 del SEQ ID NO: 14; un resto prolina en la posición 420 del SEQ ID NO: 14; un resto arginina en la posición 420 del SEQ ID NO: 14; un resto arginina en la posición 519 del SEQ ID NO: 14; una deleción de un aminoácido en la posición 519 del SEQ ID NO: 14; un resto serina en la posición 344 del SEQ ID NO: 16; un resto asparagina en la posición 344 del SEQ ID NO: 16; un resto prolina en la posición 401 del SEQ ID NO: 16; un resto arginina en la posición 401 del SEQ ID NO: 16; un resto arginina en la posición 500 del SEQ ID NO: 16; una deleción de un aminoácido en la posición 500 del SEQ ID NO: 16; un resto serina en la posición 295 del SEQ ID NO: 18; un resto asparagina en la posición 295 del SEQ ID NO: 18; un resto prolina en la posición 352 del SEQ ID NO: 18; un resto arginina en la posición 352 del SEQ ID NO: 18; un resto arginina en la posición 451 del SEQ ID NO: 18; y una deleción de un aminoácido en la posición 451 del SEQ ID NO: 18.

Polinucleótidos y polipéptidos

La invención tiene que ver con marcadores bialélicos, donde dichos marcadores bialélicos son de la secuencia del gen LSR. La invención tiene que ver con un marcador bialélico seleccionado del grupo de marcadores bialélicos A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos.

El grupo de marcadores bialélicos A'1 a A'20 hace referencia a los marcadores bialélicos A'1, A'2, A'3, A'4, A'5, A'6, A'7, A'8, A'9, A'10, A'11, A'12, A'13, A'14, A'15, A'16, A'17, A'18, A'19, y A'20. El grupo de marcadores bialélicos A1 a A32 hace referencia a los marcadores bialélicos A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21, A22, A23, A24, A25, A26, A27, A28, A29, A30, A31, y A32.

Los marcadores bialélicos se describen en las Tablas A y B. Su localización en el gen LSR está indicada en las Tablas A y B y también como un polimorfismo en los rasgos de los SEQ ID NO: 1-13, 15, y 17. Los pares de cebadores que permiten la amplificación de un ácido nucleico que contiene la base polimórfica de un marcador bialélico de LSR se enumeran en la Tabla 1 del Ejemplo 2.

TABLA A

3

4

5

6

7

El término "Del" hace referencia a una deleción de al menos un nucleótido. El término "Ins" hace referencia a una inserción de al menos un nucleótido.

La región reguladora 5' del gen LSR hace referencia a una región del nucleótido que está localizada aguas arriba de la región transcrita de LSR. La región reguladora 3' del gen LSR hace referencia a una región del nucleótido que está localizada aguas abajo de la región transcrita de LSR. El intrón 1 hace referencia a una región del nucleótido localizada entre el exón 1 y el exón 2 de LSR. El intrón 2 hace referencia a una región del nucleótido localizada entre el exón 2 y el exón 3 de LSR, y así sucesivamente.

Se han identificado cinco marcadores bialélicos en los exones del gen LSR, a saber A15, A19, A21, A23, A24, y A25. Tres de ellos cambian un aminoácido de la secuencia de la proteína LSR. Los cambios de aminoácidos consisten en asparagina en lugar de serina (posición 295 del SEQ ID NO: 18; posición 344 del SEQ ID NO: 16; posición 363 del SEQ ID NO: 14), arginina en lugar de prolina (posición 352 del SEQ ID NO 18; posición 401 del SEQ ID NO: 16; posición 420 del SEQ ID NO: 14), y una deleción de arginina (posición 451 del SEQ ID NO 18; posición 500 del SEQ ID NO: 16; posición 519 del SEQ ID NO: 14); Los marcadores bialélicos responsables de estas mutaciones son respectivamente A21, A23 y A24. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas LSR de los SEQ ID NO: 18, 16 y 14 se indican para proporcionar la localización exacta de estas mutaciones.

Sin desear estar ligado a ninguna teoría concreta, los autores de la invención creen que la deleción de arginina puede modular la actividad del receptor LSR. En efecto, las subunidades \alpha y \beta de LSR presentan un motivo RSRS que es probable que esté implicado en la interacción con la proteína gClqR. La deleción de arginina podría cambiar la interacción entre el receptor LSR y la proteína gClqR. Como la proteína gClqR parece ser capaz de modular la actividad del receptor LSR, la deleción podría tener consecuencias sobre la actividad de LSR. Adicionalmente, se ha demostrado que el cambio asociado con A21 está relacionado con un incremento de los niveles de triglicéridos.

En la presente memoria se describen proteínas LSR purificadas o aisladas y sus fragmentos y variantes. Se pretende que el término "proteína LSR modificada" designe una proteína LSR que, cuando se compara con las proteínas LSR nativas del SEQ ID NO: 18, 16, y 14, porta al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácidos. Más concretamente, las proteínas LSR modificadas preferidas incluyen aquellas que portan al menos una de las sustituciones o deleciones de aminoácidos mostradas:

- en el SEQ ID NO 18 y seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de S a N en la posición 295, una sustitución de P a R en la posición 352, y una deleción de R en la posición 451;

- en el SEQ ID NO 16 y seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de S a N en la posición 344, una sustitución de P a R en la posición 401, y una deleción de R en la posición 500, o

- en el SEQ ID NO 14 y seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de S a N en la posición 363, una sustitución de P a R en la posición 420, y una deleción de R en la posición 519.

Las proteínas modificadas que portan dos o más de tales sustituciones y la deleción también están dentro del alcance de la presente descripción. Otras realizaciones preferidas incluyen fragmentos de las proteínas LSR modificadas de la descripción, y concretamente aquellos que portan al menos una de las sustituciones y la deleción descritas antes. Son particularmente preferidos los fragmentos que poseen propiedades antigénicas y que comprenden al menos una de las sustituciones y la deleción descritas antes.

También se describe un ácido nucleico purificado o aislado que codifica una proteína LSR o uno de sus fragmentos, preferiblemente una proteína LSR modificada que porta al menos una sustitución o deleción mostrada en los SEQ ID NO: 14, 16 y 18 o sus variantes o fragmentos.

Además, la descripción hace referencia a una secuencia de ADNc purificada o aislada que codifica una proteína LSR modificada, una de sus variantes o uno de sus fragmentos, comprendiendo dicha secuencia de ADNc al menos un marcador bialélico de la presente descripción. Más preferiblemente, el marcador bialélico es A21, A23, y A24 y la secuencia de ADNc que codifica una proteína LSR se selecciona del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 13, 15, y 17, uno de sus fragmentos o una de sus variantes o una secuencia complementaria a estos. Más concretamente, la descripción tiene que ver con un ácido nucleico purificado o aislado que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 13, 15, y 17, uno de sus fragmentos o una de sus variantes de una secuencia complementaria a esta y que comprende al menos uno de los marcadores bialélicos mostrados:

- en el SEQ ID NO 13, A21 correspondiente a una sustitución de G por A en la posición 1191, o

- en el SEQ ID NO 15, A21 correspondiente a una sustitución de G por A en la posición 1134, o

- en el SEQ ID NO 17, A21 correspondiente a una sustitución de G por A en la posición 987.

La tabla B comprende marcadores bialélicos potenciales que pueden ser validados como se describe en "Validación de los marcadores bialélicos".

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA B

8

9

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La descripción tiene que ver con un ácido nucleico purificado o aislado que codifica una proteína LSR, una de sus variantes o fragmentos, donde dicho ácido nucleico comprende un alelo de al menos un marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A15, A17, y A21 y sus complementos. En una realización preferida, dicho ácido nucleico que codifica una proteína LSR, una de sus variantes o fragmentos se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 13, 15, y 17, una secuencia complementaria a estas o una de sus variantes o fragmentos.

Adicionalmente se describe un ácido nucleico regulador purificado o aislado del gen LSR que comprende un alelo de al menos un marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A15, A17, y A21 y sus complementos.

La descripción también tiene que ver con las secuencias que comprenden un alelo de uno de los marcadores bialélicos enumerados en la Tabla A y que se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos que tienen un tramo contiguo de, que consisten en, o que están comprendidas en, o que comprenden un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los ácidos nucleicos de las secuencias mostradas en los SEQ ID NO: 2-12, y 9-19, 9-20, 9-1, 9-3, 99-14419, 9-24, 9-6, 9-7, 9-9, LSRX9, LSRX9-110, (enumeradas en la Tabla 1) o una secuencia complementaria a estas. Alternativamente, las secuencias pueden comprender un alelo de uno de los marcadores bialélicos enumerados en la Tabla A, y se pueden seleccionar del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos que tienen un tramo contiguo de, que están comprendidas en, o que comprende, un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en 99-14424, 99-14419, 9-24, 17-1, 99-4580, y 17-2, (enumerados en la Tabla 1).

En la presente memoria se describe una secuencia de nucleótidos purificada y/o aislada que comprende una base polimórfica de un marcador bialélico localizado en la secuencia del gen LSR, donde el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos.

La secuencia tiene entre 8 y 1000 nucleótidos de longitud, y oscila preferiblemente entre 12, 15, 18 o 20 a 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 o 1000 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO 1, 13, 15, y 17 o una de sus variantes o una secuencia complementaria a esta, o se especifica que son 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 o 1000 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 1, 13, 15, y 17 o una de sus variantes o una secuencia complementaria a ésta. Estas secuencias de nucleótidos comprenden la base polimórfica del alelo 1 o el alelo 2 del marcador bialélico considerado. Opcionalmente, dicho marcador bialélico puede estar a 6, 5, 4, 3, 2, o 1 nucleótidos del centro de dicho polinucleótido o en el centro de dicho polinucleótido. Opcionalmente, el extremo 3' de dicho tramo contiguo puede estar presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido.

Opcionalmente, el marcador bialélico puede estar presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido. El extremo 3' de un polinucleótido de la invención puede estar localizado 1 nucleótido aguas arriba de un marcador bialélico del gen LSR, seleccionado entre A15, A17 y A21. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede comprender adicionalmente una marca. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede estar anclado a un soporte sólido. En una realización adicional, los polinucleótidos definidos antes se pueden utilizar solos o combinados de cualquier modo.

La presente descripción abarca polinucleótidos para su uso como cebadores y sondas en los métodos de la descripción. Estos polinucleótidos pueden consistir en, consistir esencialmente en, o comprender un tramo contiguo de nucleótidos de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 1, 13, 15 y 17 o una de sus variantes o una secuencia complementaria a esta. El "tramo contiguo" puede tener al menos 8, 10, 12, 15, 20, 25, o 30 nucleótidos de longitud. Se debe observar que los polinucleótidos de la presente invención no están limitados por tener las secuencias limítrofes exactas que rodean las bases polimórficas que se enumeran en los SEQ ID NO: 1, 13, 15, y 17. En lugar de eso, se apreciará que las secuencias limítrofes que rodean los marcadores bialélicos, o cualquiera de los cebadores o sondas de la invención que son más distantes de los marcadores, pueden ser alargadas o acortadas hasta cualquier punto compatible con su uso pretendido y la presente invención contempla específicamente tales secuencias. Se apreciará que los polinucleótidos pueden tener cualquier longitud compatible con su uso pretendido. Asimismo, se necesita que las regiones limítrofes fuera del tramo contiguo sean homólogas a las secuencias limítrofes nativas que existen realmente en los sujetos humanos. Se contempla específicamente la adición de cualquier nucleótido que sea compatible con el uso pretendido de los nucleótidos. El tramo contiguo puede incluir un marcador bialélico de LSR en dicha secuencia donde el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Opcionalmente el alelo 1 o el alelo 2 de los marcadores bialélicos descritos en las tablas A y B pueden ser especificados por estar presentes en el marcador bialélico relacionado con LSR. La descripción también hace referencia a los polinucleótidos que hibridan, en condiciones muy rigurosas, con un polinucleótido de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 1, 13, 15, y 17 o una secuencia complementaria a esta. Preferiblemente tales polinucleótidos pueden tener al menos 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, o 80 nucleótidos de longitud. Los polinucleótidos preferidos comprenden un marcador bialélico relacionado con LSR seleccionado del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Opcionalmente el alelo 1 o el alelo 2 de los marcadores bialélicos descritos en las tablas A y B pueden ser especificados por estar presentes en el marcador bialélico relacionado con LSR.

Las condiciones de restricción elevada e intermedia se describen en las "Definiciones".

Los cebadores de la presente descripción pueden ser diseñados a partir de las secuencias descritas para cualquier método conocido en la técnica. Se forma un grupo preferido de cebadores de manera que el extremo 3' del tramo contiguo de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 1, 13, 15 y 17 o una de sus variantes o una secuencia complementaria a esta se encuentre presente en el extremo 3' del cebador. Semejante configuración permite que el extremo 3' del cebador hibride con una secuencia de ácido nucleico seleccionada y aumente espectacularmente la eficacia del cebador para las reacciones de amplificación o secuenciación. Se pueden diseñar cebadores específicos de los alelos de manera que un marcador bialélico esté en el extremo 3' del tramo contiguo y el tramo contiguo esté presente en el extremo 3' del cebador. Tales cebadores específicos de los alelos tienden de cebar selectivamente una reacción de amplificación o secuenciación con tal que se utilicen con una muestra de ácido nucleico que contenga uno de los dos alelos presentes en el marcador bialélico. El extremo 3' de un cebador de la descripción puede estar localizado 1 nucleótido aguas arriba de un marcador bialélico relacionado con LSR en dicha secuencia, seleccionado entre A15, A17 y A21. Asimismo se describen cebadores en los que el extremo 3' está localizado dentro, o al menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500, o 1000 nucleótidos aguas arriba, de un marcador bialélico relacionado con LSR en dicha secuencia o en cualquier otra localización que sea apropiada para su uso pretendido en la secuenciación, amplificación o localización de secuencias o marcadores novedosos. El marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Los cebadores de amplificación preferidos se describen en la Tabla 1 y se seleccionan del grupo que consiste en B1 a B52 y dC1 a C51. Los cebadores con sus extremos 3' localizados 1 nucleótido aguas arriba de un marcador bialélico relacionado con LSR tienen una utilidad especial en los análisis de microsecuenciación. El marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Los cebadores de microsecuenciación preferidos se describen en la Tabla 3 y se seleccionan del grupo que consiste en D15, D17, D21, E14, E16 y E20.

Las sondas descritas pueden ser diseñadas a partir de las secuencias descritas para cualquier método conocido en la técnica, concretamente los métodos que permiten someter a ensayo si una secuencia concreta o un marcador descrito en la presente memoria se encuentra presente. Se puede diseñar un grupo preferido de sondas para su uso en los análisis de hibridación de la invención de cualquier manera conocida en la técnica de manera que se unan selectivamente a un alelo del marcador bialélico, pero no al otro en cualquier conjunto de condiciones de análisis concretas. Las sondas de hibridación preferidas pueden consistir en, consistir esencialmente en, o comprender un tramo contiguo de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 1, 13, 15 y 17 o sus variantes, o secuencias complementarias a estas, que oscilan de 12, 15 18 o 20 a 25, 35, 40, 50, 60, 70, a 80 nucleótidos de longitud, o se especifican por tener 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, o 50 nucleótidos de longitud e incluyen un marcador bialélico relacionado con LSR de dicha secuencia. El marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Opcionalmente el alelo 1 o el alelo 2 descritos en las Tablas A y B pueden ser especificados por estar presentes en el sitio del marcador bialélico. Opcionalmente, dicho marcador bialélico puede estar a 6, 5, 4, 3, 2, o 1 nucleótidos del centro de la sonda de hibridación o en el centro de dicha sonda. Las sondas pueden comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en 9-3, 9-24, y 9-7, y las secuencias complementarias a esta, o uno de sus fragmentos, comprendiendo dicho fragmento al menos aproximadamente 12 nucleótidos consecutivos, preferiblemente 10, 15, 20, más preferiblemente 25, 30, 40, 47, o 50 nucleótidos consecutivos y conteniendo una base polimórfica. Las sondas pueden comprender una secuencia de nucleótidos de 9-24, (enumerada en la Tabla 1), y las secuencias complementarias a esta, o uno de sus fragmentos, comprendiendo dicho fragmento al menos aproximadamente 12 nucleótidos consecutivos, preferiblemente 15, 20, más preferiblemente 25, 30, 40, 47, o 50 nucleótidos consecutivos y conteniendo una base polimórfica.

Cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente memoria puede ser marcado, si se desea, incorporando una marca detectable mediante métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, o químicos. Por ejemplo, las marcas útiles incluyen sustancias radiactivas, colorantes fluorescentes o biotina. Preferiblemente, los polinucleótidos se marcan en sus extremos 3' o 5'. También se puede utilizar una marca para capturar el cebador, con el fin de facilitar la inmovilización del cebador o un producto de extensión del cebador, tal como ADN amplificado, sobre un soporte sólido. La marca de captura se ancla a los cebadores o las sondas y puede ser un miembro de unión específica que forma un par de unión con el miembro de unión específico del reactivo de la fase sólida (p. ej. biotina y estreptavidina). Por lo tanto, dependiendo del tipo de marca que porta el polinucleótido, éste puede ser empleado para capturar o para detectar el ADN diana. Adicionalmente, se entenderá que los polinucleótidos, cebadores o sondas proporcionados en la presente memoria, pueden, a su vez, servir como marca de captura. Por ejemplo, en el caso en el que el miembro de unión del reactivo en fase sólida es una secuencia de ácido nucleico, éste se puede seleccionar de manera que se una a una porción complementaria de un cebador o sonda para de ese modo inmovilizar el cebador o la sonda en la fase sólida. En los casos en los que la propia sonda polinucleotídica sirve como miembro de unión, los expertos en la técnica reconocerán que la sonda contendrá una secuencia o "cola" que no es complementaria a la diana. En el caso en el que el propio cebador polinucleotídico sirve como marca de captura, al menos una porción del cebador estará libre para hibridar con un ácido nucleico sobre una fase sólida. Las técnicas de marcaje de ADN son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Cualquiera de los polinucleótidos, cebadores y sondas descritos en la presente memoria puede ser inmovilizado convenientemente sobre un soporte sólido. Los soportes sólidos son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen las paredes de los pocillos de una bandeja de reacción, tubos de ensayo, cuentas de poliestireno, cuentas magnéticas, tiras de nitrocelulosa, membranas, micropartículas tales como partículas de látex, glóbulos rojos de oveja (u otro animal), Duracytes® y otros. El soporte sólido no es crítico y puede ser seleccionado por un experto en la técnica. De este modo, las partículas de látex, las micropartículas, las cuentas magnéticas o no magnéticas, las membranas, los tubos de plástico, las paredes de los pocillos de microtitulación, los chips de vidrio o silicio, los glóbulos rojos de ovejas (o de otros animales adecuados) y los duracytes son todos ejemplos adecuados. Los métodos adecuados para inmovilizar ácidos nucleicos sobre fases sólidas incluyen las interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares. Un soporte sólido, según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a cualquier material que es insoluble, o se puede volver insoluble mediante una reacción posterior. El soporte sólido se puede seleccionar por su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar el reactivo de captura. Alternativamente, la fase sólida puede retener un receptor adicional que tiene la capacidad de atraer e inmovilizar el reactivo de captura. El receptor adicional puede incluir una sustancia cargada con una carga opuesta con respecto al propio reactivo de captura o con respecto a una sustancia cargada conjugada con el reactivo de captura. Como otra alternativa, la molécula receptora puede ser cualquier miembro de unión específico que esté inmovilizado sobre (anclado a) el soporte sólido y que tenga la capacidad de inmovilizar el reactivo de captura por medio de una reacción de unión específica. La molécula de receptor permite la unión indirecta del reactivo de captura a un material de soporte sólido antes de la realización del análisis o durante la realización del análisis. La fase sólida puede ser de este modo, una superficie de plástico, plástico derivatizado, metal magnético o no magnético, vidrio o silicio de un tubo de ensayo, pocillo de microtitulación, lámina, cuenta, micropartícula, chip, glóbulo rojo de oveja (o de otro animal adecuado), duracytes® y otras configuraciones conocidas por los expertos en la técnica. Los polinucleótidos descritos pueden ser anclados a o inmovilizados sobre un soporte sólido individualmente o en grupos de al menos 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20, o 25 polinucleótidos distintos de la invención a un único soporte sólido. Además, se pueden anclar polinucleótidos distintos de los descritos al mismo soporte sólido en forma de uno o más de los polinucleótidos descritos.

Se puede anclar cualquier polinucleótido proporcionado en la presente memoria en zonas solapantes o en localizaciones al azar sobre el soporte sólido. Alternativamente el polinucleótido descrito puede ser anclado en una matriz ordenada donde cada polinucleótido está anclado a una región distinta del soporte sólido que no se solapa con el sitio de anclaje de cualquier otro polinucleótido. Preferiblemente, semejante matriz de polinucleótidos ordenada se diseña para que sea "dirigible" a las distintas localizaciones verificadas y pueda ser accesible como parte de un procedimiento de análisis. La matrices de polinucleótidos dirigibles comprenden típicamente una pluralidad de sondas oligonucleotídicas diferentes que están acopladas a una superficie de un sustrato en diferentes localizaciones conocidas. El conocimiento de la localización precisa de cada localización del polinucleótido hace estas matrices "dirigibles" particularmente útiles en los análisis de hibridación. Se puede emplear cualquier tecnología de matrices dirigibles conocida en la técnica con los polinucleótidos descritos. Una realización concreta de estas matrices de polinucleótidos es conocida como Genechips®, y ha sido descrita generalmente en la Patente de los Estados Unidos 5.143.854; publicaciones PCT WO 90/15070 y 92/10092. Estas matrices pueden ser producidas generalmente utilizando métodos de síntesis mecánica o métodos de síntesis dirigidos por luz, que incorporan una combinación de métodos fotolitográficos y síntesis de oligonucleótidos en fase sólida (Fodor et al., 1991). La inmovilización de matrices de oligonucleótidos sobre soportes sólidos se ha vuelto posible por el desarrollo de una tecnología identificada generalmente como "Síntesis de Polímeros Inmovilizados a Escala Muy Grande" (VLSIPS^{TM}) en la que, típicamente, se inmovilizan sondas en una matriz de densidad elevada sobre una superficie sólida de un chip. Los ejemplos de las tecnologías VLSIPS® se proporcionan en las patentes de los Estados Unidos 5.143.854 y 5.412.087 y en las Publicaciones PCT WO 90/15070, WO 92/10092 y WO 95/11995, que describen métodos para formar matrices de oligonucleótidos por medio de técnicas tales como técnicas de síntesis dirigidas por luz. Al designar estrategias destinadas a proporcionar matrices de nucleótidos inmovilizadas sobre soportes sólidos, se desarrollaron estrategias de presentación adicionales para ordenar y presentar las matrices de oligonucleótidos sobre los chips en un intento de maximizar los patrones de hibridación y la información de la secuencia. Los ejemplos de tales estrategias de presentación se describen en las Publicaciones PCT WO 94/12305, WO 94/11530, WO 97/29212 y WO 97/31256.

La descripción también abarca el uso de cualquier polinucleótido para, o cualquier polinucleótido para su uso en, la determinación de la identidad de uno o más nucleótidos en un marcador bialélico relacionado con LSR. Además, los polinucleótidos descritos para su uso en la determinación de la identidad de uno o más nucleótidos en un marcador bialélico relacionado con LSR abarcan polinucleótidos con cualquier limitación adicional descrita en esta descripción, o los siguientes, especificados solos o en cualquier combinación. El marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o una cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos.

Opcionalmente, dicho polinucleótido puede comprender una secuencia descrita en la presente memoria. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede consistir en, o consistir esencialmente en, cualquier polinucleótido descrito en la presente memoria. Opcionalmente, dicha determinación se puede realizar por medio de un análisis de hibridación, un análisis de secuenciación, un análisis de microsecuenciación, o un análisis de amplificación específica de un alelo. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede anclarse a un soporte sólido, matriz, o matriz direccionable. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede estar marcado.

Adicionalmente, la descripción abarca el uso de cualquier polinucleótido para, o cualquier polinucleótido para su uso en, la amplificación de un segmento de nucleótidos que comprende un marcador bialélico relacionado con LSR. Además, los polinucleótidos descritos para su uso en la amplificación de un segmento de nucleótidos que comprende un marcador bialélico relacionado con LSR abarcan polinucleótidos con cualquier limitación adicional descrita en esta descripción, o los siguientes, especificados solos o en cualquier combinación. El marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede comprender una secuencia descrita en la presente memoria. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede consistir en, o consistir esencialmente en, cualquier polinucleótido descrito en la presente memoria. Opcionalmente, dicha amplificación se puede realizar mediante una PCR o una LCR. Opcionalmente, dicho polinucleótido se puede anclar a un soporte sólido, una matriz, o una metriz direccionable. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede estar marcado.

De este modo, la descripción también abarca métodos de genotipificación de una muestra biológica que comprenden determinar la identidad de un nucleótido en un marcador bialélico relacionado con LSR. Además, los métodos de genotipificación de la descripción abarcan métodos con cualquier limitación adicional descrita en esta descripción, o los siguientes, especificados solos o en cualquier combinación. El marcador bialélico relacionado con LSR está presente en uno o más de los SEQ ID NO: 1, 13, 15, y 17, y se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Opcionalmente, dicha muestra biológica deriva de un único individuo o sujeto. Opcionalmente, dicho método se realiza in vitro. Opcionalmente, dicho marcador bialélico es determinado para ambas copias de dicho marcador bialélico presente el genoma de dicho individuo. Opcionalmente, dicha muestra biológica deriva de múltiples sujetos o individuos. Opcionalmente, dicho método comprende adicionalmente amplificar una porción de dicha secuencia que comprende el marcador bialélico antes de dicha etapa de determinación. Opcionalmente, donde dicha amplificación se realiza mediante PCR, LCR, o replicación de un vector recombinante que comprende un origen de replicación y dicha porción en una célula anfitriona. Opcionalmente, donde dicha determinación se realiza por medio de un análisis de hibridación, un análisis de secuenciación, un análisis de microsecuenciación, o un análisis de amplificación específica de un alelo. Opcionalmente, dicha población de control es una población negativa para un rasgo o una población al azar. Opcionalmente, donde dicho fenotipo es una enfermedad que implica obesidad o trastornos relacionados con la obesidad. Opcionalmente, dicho trastorno relacionado con la obesidad se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, resistencia a la insulina, hipertensión, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, infarto de miocardio/enfermedad cardiovascular (principalmente para mujeres), microangiopatía en individuos obesos con diabetes de Tipo II, lesiones oculares asociadas con microangiopatía en individuos obesos con diabetes de Tipo II, lesiones renales asociadas con microangiopatía en individuos obesos con diabetes de Tipo II, y Síndrome X.

También se describen en la presente memoria kits de diagnóstico que comprenden uno o más polinucleótidos de la invención con una porción o todos los reactivos necesarios y las instrucciones para la genotipificación de un sujeto de ensayo determinando la identidad de un nucleótido en un marcador bialélico de LSR. El marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Los polinucleótidos de un kit pueden estar anclados opcionalmente a un soporte sólido, o ser una parte de una matriz o matriz direccionable de polinucleótidos. El kit puede proporcionar la determinación de la identidad del nucleótido en una posición del marcador mediante cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero no limitado a, un método de análisis de secuenciación, un método de análisis de microsecuenciación, un método de análisis de hibridación, o un método de amplificación específica de un alelo. Opcionalmente semejante kit puede incluir instrucciones para puntuar los resultados de la determinación con respecto al riesgo del sujeto de ensayo de contraer una enfermedad que afecte al reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos, más concretamente obesidad o trastornos relacionados con la obesidad, o probablemente la respuesta a un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos, o las oportunidades de padecer efectos secundarios de un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos.

II. Métodos para la Identificación De Novo De Marcadores Bialélicos

Se puede utilizar cualquiera de una variedad de métodos para escrutar el fragmento genómico en busca de SNP tales como la hibridación diferencial con sondas oligonucleotídicas, la detección de cambios en la movilidad medida mediante electroforesis en gel o la secuenciación directa del ácido nucleico amplificado. Un método preferido para identificar marcadores bialélicos implica la secuenciación comparativa de fragmentos de ADN genómico de un número apropiado de individuos no relacionados.

En una primera realización, se reúnen muestras de ADN de individuos no relacionados, después de lo cual el ADN genómico de interés es amplificado y secuenciado. Las secuencias de nucleótidos así obtenidas se analizan después para identificar los polimorfismos significativos. Una de las principales ventajas de este método reside en el hecho de que la reunión de las muestras de ADN reduce sustancialmente el número de reacciones de amplificación de ADN y de reacciones de secuenciación, que se deben llevar a cabo. Por otra parte, este método es suficientemente sensible de manera que un marcador bialélico obtenido de este modo normalmente demuestra una frecuencia suficiente de su alelo menos común como para ser útil en la realización de estudios de asociación.

En una segunda realización, las muestras de ADN no se reúnen y por lo tanto se amplifican y se secuencian individualmente. Normalmente se prefiere éste método cuando deben ser identificados marcadores bialélicos con el fin de realizar estudios de asociación en genes candidatos. Preferiblemente, se pueden escrutar regiones de genes altamente relevantes tales como regiones promotoras o regiones exónicas en busca de marcadores bialélicos. Un marcador bialélico obtenido utilizando este método puede mostrar un menor grado de información para realizar estudios de asociación, por ejemplo si la frecuencia de su alelo frecuente puede ser menor de aproximadamente 10%. Semejante marcador bialélico será sin embargo suficientemente informativo para realizar estudios de asociación y se apreciará adicionalmente que al incluir marcadores bialélicos menos informativos en los estudios de análisis genéticos de la presente invención, se puede permitir en algunos casos la identificación directa de mutaciones causales, que pueden, dependiendo de su penetrancia, ser mutaciones raras.

Lo siguiente es una descripción de los diversos parámetros de un método preferido utilizado por los autores de la presente invención para la identificación de los marcadores bialélicos descritos.

Muestras de ADN Genómico

Las muestras de ADN genómico a partir de las cuales se generan los marcadores bialélicos descritos se obtienen preferiblemente de individuos no relacionados correspondientes a una población heterogénea de antecedentes étnicos conocidos. El número de individuos de los cuales se obtienen las muestras de ADN puede variar sustancialmente, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000, preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 individuos. Normalmente se prefiere recoger muestras de ADN de al menos aproximadamente 100 individuos con el fin de tener suficiente diversidad polimórfica en una población dada para identificar tantos marcadores como sea posible y para genera resultados estadísticamente significativos.

En cuanto a la fuente del ADN genómico que se va a someter a análisis, se puede prever cualquier muestra de ensayo sin limitación concreta alguna. Estas muestras de ensayo incluyen muestras biológicas, que pueden ser sometidas a ensayo mediante los métodos descritos en la presente memoria, e incluyen fluidos corporales humanos y animales tales como sangre completa, suero, plasma, fluido cerebroespinal, orina, fluidos linfáticos, y diversas secreciones externas de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos blancos, mielomas y similares; fluidos biológicos tales como sobrenadantes de cultivos celulares; especímenes de tejido fijados incluyendo tejido tumoral y no tumoral y tejidos de los nódulos linfáticos; productos aspirados de médula ósea y especímenes de células fijadas. La fuente preferida de ADN genómico utilizada en la presente invención es sangre venosa periférica de cada donante. Los mecanismos para preparar ADN genómico a partir de muestras biológicas son bien conocidos por el experto en la técnica. Los detalles de una realización preferida se proporcionan en el Ejemplo 1. El experto en la técnica puede elegir amplificar muestras de ADN reunidas o no reunidas.

Amplificación de ADN

La identificación de marcadores bialélicos en una muestra de ADN genómico se puede facilitar por medio del uso de métodos de amplificación de ADN. Las muestras de ADN pueden ser reunidas o no reunidas para la etapa de amplificación. Las técnicas de amplificación de ADN son bien conocidas por los expertos en la técnica. Los diversos métodos para amplificar fragmentos de ADN que portan marcadores bialélicos se describen adicionalmente más adelante en "Amplificación de fragmentos de ADN que comprenden marcadores bialélicos". La tecnología de la PCR es la técnica de amplificación preferida utilizada para identificar nuevos marcadores bialélicos. Un ejemplo típico de una reacción de PCR adecuada para los fines de la presente invención se proporciona en el Ejemplo 2.

En una primera realización, los marcadores bialélicos son identificados utilizando información de la secuencia genómica generada por los autores de la presente invención. Los fragmentos de ADN genómico secuenciados se utilizan para diseñar cebadores para la amplificación de fragmentos de 500 pb. Estos fragmentos de 500 pb se amplifican a partir del ADN genómico y se exploran en busca de marcadores bialélicos. Los cebadores pueden ser diseñados utilizando el soporte lógico OSP (Hillier y Green, 1991). Todos los cebadores pueden contener, aguas arriba de las bases diana específicas, una cola oligonucleotídica común que sirve como cebador de secuenciación. Los expertos en la técnica están familiarizados con las extensiones de los cebadores, que pueden ser utilizadas para estos fines.

Los cebadores preferidos, útiles para la amplificación de la secuencia genómica que codifica el gen candidato, se centran en el promotor, los exones y los sitios de empalme del gen. Un marcador bialélico presenta una probabilidad mayor de ser una mutación causal si está localizado en estas regiones funcionales del gen.

Los cebadores preferidos incluyen las secuencias de nucleótidos descritas en la Tabla 1.

Secuenciación de ADN Genómico Amplificado e identificación de polimorfismos de un único nucleótido

Los productos de amplificación generados como se ha descrito antes, son secuenciados después utilizando cualquier método conocido y disponible para el experto en la técnica. Los métodos para secuenciar el ADN utilizando el método mediado por didesoxi (Método de Sanger) o el método de Maxam-Gilbert son ampliamente conocidos por los expertos normales en la técnica. Tales métodos son descritos por ejemplo en Sambrook et al., 1989. Los enfoques alternativos incluyen la hibridación con matrices de sondas de ADN de alta densidad como describen Chee et al. (1996).

Preferiblemente, el ADN amplificado se somete a reacciones de secuenciación con terminador didesoxi automatizadas usando un protocolo de secuenciación de ciclo de colorante-cebador. Los productos de las reacciones de secuenciación se hacen correr sobre geles de secuenciación y las secuencias se determinan utilizando el análisis de imágenes en gel. La búsqueda de polimorfismos se basa en la presencia de picos superpuestos en el patrón de electroforesis resultante de diferentes bases de ambas cadenas, dando como resultado dos bases que aparecen en la misma posición. Debido a que cada terminador didesoxi está marcado con una molécula fluorescente diferente, los dos picos correspondientes a un sitio bialélico presentan distintos colores correspondientes a dos nucleótidos diferentes en la misma posición de la secuencia. No obstante, la presencia de dos picos puede ser un artefacto debido a ruido de fondo. Para excluir semejante artefacto, las dos cadenas de ADN se secuencian y se lleva a cabo una comparación entre los picos. Para ser registrado como secuencia polimórfica, el polimorfismo tiene que ser detectado en ambas cadenas.

El procedimiento anterior permite que esos productos de amplificación, que contienen los marcadores bialélicos sean identificados. El límite de detección para la frecuencia de polimorfismos bialélicos detectados secuenciando reservas de 100 individuos es de aproximadamente 0,1% para el alelo minoritario, como se verifica secuenciando las reservas de frecuencias alélicas conocidas. No obstante, más de 90% de los polimorfismos bialélicos detectados mediante el método de reunión tienen una frecuencia para el alelo minoritario mayor de 0,25. Por lo tanto, los marcadores bialélicos seleccionados mediante este método tienen una frecuencia de al menos 0,1 para el alelo minoritario y menos de 0,9 para el alelo principal. Preferiblemente al menos 0,2 para el alelo minoritario y menos de 0,8 para el alelo principal, más preferiblemente al menos 0,3 para el alelo minoritario y menos de 0,7 para el alelo principal, de este modo, una tasa de heterocigosis mayor de 0,18, preferiblemente mayor de 0,32, más preferiblemente mayor de 0,42.

En otra realización, se detectan los marcadores bialélicos secuenciando muestras de ADN individuales, la frecuencia del alelo minoritario de semejante marcador bialélico puede ser menor de 0,1.

Validación de los marcadores bialélicos

Los polimorfismos son evaluados por su utilidad como marcadores genéticos validando que ambos alelos estén presentes en una población. La validación de los marcadores bialélicos se completa genotipificando un grupo de individuos mediante un método de la invención y demostrando que ambos alelos están presentes. La microsecuenciación es un método preferido de genotipificación de alelos. La validación mediante una etapa de genotipificación se puede realizar en muestras individuales derivadas de cada individuo del grupo o genotipificando una muestra reunida derivada de más de un individuo. El grupo puede ser tan pequeño como un individuo si ese individuo es heterocigoto para el alelo en cuestión. Preferiblemente el grupo contiene al menos tres individuos, más preferiblemente el grupo contiene cinco o seis individuos, de manera que será más probable que un único ensayo de validación de como resultado la validación de más de los marcadores bialélicos que están siendo sometidos a ensayo. Se debe observar, sin embargo, que cuando el ensayo de validación se realiza en un pequeño grupo puede dar como resultado un resultado falso negativo si como resultado de un error de muestreo ninguno de los individuos sometidos a ensayo porta uno de los dos alelos. De este modo, el procedimiento de validación es menos útil al demostrar que un resultado inicial concreto es un artefacto, de lo que es al demostrar que hay un marcador bialélico bona fide en una posición concreta de la secuencia. Todos los métodos de estudio de genotipificación, haplotipificación, asociación, e interacción de la invención pueden ser realizados opcionalmente sólo con marcadores bialélicos validados.

Evaluación de la frecuencia de los marcadores bialélicos

Los marcadores bialélicos validados son evaluados adicionalmente por su utilidad como marcadores genéticos determinando la frecuencia del alelo menos común en el sitio del marcador bialélico. A mayor frecuencia del alelo menos común mayor utilidad del marcador bialélico en estudios de asociación e interacción. La determinación del alelo menos común se completa genotipificando un grupo de individuos mediante un método descrito en la presente memoria y demostrando que ambos alelos están presentes. Esta determinación de la frecuencia mediante la etapa de genotipificación se puede realizar en muestras individuales derivadas de cada individuo del grupo o genotipificando una muestra reunida derivada de más de un individuo. El grupo debe ser suficientemente grande para que sea representativo de la población en su totalidad. Preferiblemente el grupo contiene al menos 20 individuos, más preferiblemente el grupo contiene al menos 50 individuos, muy preferiblemente el grupo contiene al menos 100 individuos. Por supuesto a mayor grupo, mayor exactitud de la determinación de la frecuencia debido al reducido error de muestreo. Para una indicación de la frecuencia para el alelo menos común de un marcador bialélico concreto de la invención, véanse las Tablas A y B. Un marcador bialélico donde la frecuencia del alelo menos común es del 30% o más se denomina un "marcador bialélico de alta calidad". Todos los métodos de estudio de genotipificación, haplotipificación, asociación, e interacción de la invención pueden ser realizados opcionalmente sólo con marcadores bialélicos de alta calidad.

En la presente memoria se describen métodos de estimación de la frecuencia de un alelo en una población que comprenden la determinación de la representación proporcional de un nucleótido en un marcador bialélico relacionado con LSR en dicha población. Además, los métodos de estimación de un alelo en una población de la invención abarcan los métodos con cualquier limitación adicional descritos en esta descripción, o los que siguen, especificados solos o en cualquier combinación. Preferiblemente, el marcador bialélico relacionado con LSR está presente en uno o más de los SEQ ID NO: 1 a 13, 15, y 17, y más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en A1 a A32 y sus complementos. Más preferiblemente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A2, A16, A17, A24, A26, y A31, y sus complementos. Alternativamente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A21, A23, y A24 y sus complementos. En una realización especialmente preferida, el marcador bialélico es A26. En otra realización especialmente preferida, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Opcionalmente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A'1 a A'20 y sus complementos. Opcionalmente, la determinación de la representación proporcional de un nucleótido en un marcador bialélico relacionado con LSR se puede completar determinando la identidad de los nucleótidos para ambas copias de dicho marcador bialélico presente en el genoma de cada individuo de dicha población y calculando la representación proporcional de dicho nucleótido en dicho marcador bialélico relacionado con LSR para la población. Opcionalmente, dicho método se realiza in vitro. Opcionalmente, la determinación de la representación proporcional se puede completar realizando un método de genotipificación de la invención sobre una muestra biológica reunida derivada de un número representativo de individuos, o cada individuo, de dicha población, y calculando la cantidad proporcional de dicho nucleótido en comparación con el total.

III. Métodos Para la genotipificación de Un Individuo En Busca de Marcadores Bialélicos

Se proporcionan los métodos para genotipificar una muestra biológica en busca de uno o más marcadores bialélicos de la presente descripción, todos los cuales se pueden realizar in vitro. Tales métodos de genotipificación comprenden determinar la identidad de un nucleótido en el sitio del marcador bialélico de LSR por cualquier método conocido en la técnica. Estos métodos encuentran uso en la genotipificación de poblaciones de control de casos en estudios de asociación así como individuos en el contexto de la detección de alelos de marcadores bialélicos que son conocidos por estar asociados con un rasgo dado, en cuyo caso ambas copias del marcador bialélico presentes en el genoma del individuo se determinan de manera que un individuo puede ser clasificado como homocigoto o heterocigoto para un alelo concretos.

Estos métodos de genotipificación se pueden realizar en muestras de ácido nucleico derivadas de un único individuo o muestras de ADN reunidas.

La genotipificación se puede realizar utilizando métodos similares a los descritos anteriormente para la identificación de los marcadores bialélicos, o utilizando otros métodos de genotipificación tales como los descritos adicionalmente más abajo. En realizaciones preferidas, se utiliza la comparación de las secuencias de los fragmentos genómicos amplificados de diferentes individuos para identificar nuevos marcadores bialélicos mientras se utiliza la microsecuenciación para la genotipificación de los marcadores bialélicos conocidos en aplicaciones de diagnóstico y estudios de asociación.

Fuente de ADN para genotipificación

Se puede utilizar cualquier fuente de ácidos nucleicos, en forma purificada o no purificada, como ácido nucleico de partida, siempre que contenga o se sospeche que contiene la secuencia de ácido nucleico específica deseada. Se puede extraer ADN o ARN de células, tejidos, fluidos corporales y similares como se ha descrito antes en "Muestras de ADN Genómico". Si bien los ácidos nucleicos para su uso en los métodos de genotipificación descritos pueden derivar de cualquier fuente de mamífero, se entiende generalmente que los sujetos de ensayo y los individuos de los cuales se toman las muestras de ácido nucleico son generalmente humanos.

Amplificación de fragmentos de ADN que comprenden los marcadores bialélicos

Se proporcionan los métodos y los polinucleótidos para amplificar un segmento de nucleótidos que comprende uno o más de los marcadores bialélicos descritos. Se apreciará que la amplificación de los fragmentos de ADN que comprenden los marcadores bialélicos puede ser utilizada en diversos métodos y para diversos fines y no está restringida a la genotipificación. Sin embargo, muchos métodos de genotipificación, aunque no todos, requieren la amplificación previa de la región de ADN que lleva el marcador bialélico de interés. Tales métodos aumentan específicamente la concentración o el número total de secuencias que abarcan el marcador bialélico o incluyen ese sitio y las secuencias localizadas lejos o cerca de él. Los análisis de diagnóstico también pueden contar con la amplificación de segmentos de ADN que llevan un marcador bialélico como se describe en la presente memoria.

La amplificación del ADN se puede lograr mediante cualquier método conocido en la técnica. El método de PCR establecido (reacción en cadena de la polimerasa) o mediante variaciones del mismo o alternativas. Los métodos de amplificación que se pueden utilizar en la presente memoria incluyen pero no están limitados a la Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR) como se describe en los documentos EP A 320 308 y EP A 439 182, Gap LCR (Wolcott, M.J., 1992), la denominada técnica "NASBA" o "3SR" descrita por Guatelli J.C. et al. (1990) y por Compton J. (1991), la amplificación Q-beta como se describe en la Solicitud de Patente Europea núm. 4544610, la amplificación por desplazamiento de la cadena como describen Walker et al. (1996) y el documento EP A 684 315 y, la amplificación mediada por diana como se describe en la Publicación PCT WO 9322461.

La LCR y la Reacción de Reparación de la Cadena son técnicas de amplificación exponencial, ambas dependen de la ADN ligasa para unir cebadores adyacentes hibridados a una molécula de ADN. En la Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR), se utilizan pares de sondas que incluyen dos sondas primarias (primera y segunda) y dos sondas secundarias (tercera y cuarta), todas las cuales se emplean en un exceso molar con respecto a la diana. La primera sonda hibrida con un primer segmento de la cadena diana y la segunda sonda hibrida con un segundo segmento de la cadena diana, siendo el primer y el segundo segmentos contiguos de manera que las sondas primarias lindan entre sí en relación 5' fosfato-3' hidroxilo, y de manera que una ligasa puede fusionar covalentemente o ligar las dos sondas en un producto fusionado. Además, se puede hibridar una tercera sonda (secundaria) a una porción de la primera sonda y se puede hibridar una cuarta sonda (secundaria) a una porción de la segunda sonda de una manera contigua similar. Por supuesto, si la diana es inicialmente de doble cadena, las sondas secundarias también hibridarán con el primer complemento de la diana en el primer caso. Una vez que la cadena ligada de las sondas primarias es separada de la cadena diana, ésta hibridará con la tercera y la cuarta sondas que pueden ser ligadas para formar un producto ligado secundario, complementario. Es importante comprender que los productos ligados son funcionalmente equivalentes a la diana o a su complemento. Mediante ciclos repetidos de hibridación y ligación, se logra la amplificación de la secuencia diana. También se ha descrito una LCR Multiplex (publicación WO 9320227). La Reacción de Reparación de la Cadena (GLCR) es una versión de la LCR en la que las sondas no son adyacentes sino separadas por
2 a 3 bases.

Para la amplificación de los ARNm, está dentro del alcance de la presente descripción transcribir inversamente el ARNm a ADNc seguido de reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR); o, utilizar una única enzima para ambas etapas como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.322.770 o, utilizar una Reacción de Reparación de la Cadena Asimétrica (RT-AGLCR) como describen Marshall R.L. et al. (1994). La AGLCR es una modificación de la GLCR que permite la amplificación del ARN.

Algunos de estos métodos de amplificación son particularmente adecuados para la detección de SNP y permiten la amplificación simultánea de una secuencia diana y la identificación del nucleótido polimórfico como se describe adicionalmente más abajo.

La tecnología de la PCR es la técnica de amplificación preferida. Una variedad de mecanismos de PCR son familiares para los expertos en la técnica. Para una revisión de la tecnología de la PCR, véase White, B.A. (1997) y la publicación titulada "PCR Methods and Applications" (1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press). En cada uno de estos procedimientos de PCR, se añaden los cebadores de la PCR de cualquier lado de las secuencias de ácido nucleico que se van a amplificar a una muestra de ácido nucleico preparada adecuadamente junto con los dNTP y una polimerasa termoestable tal como polimerasa Taq, polimerasa Pfu, o polimerasa Vent. El ácido nucleico de la muestra se desnaturaliza y los cebadores de la PCR se hibridan específicamente a secuencias de ácido nucleico complementarias de la muestra. Los cebadores hibridados se prolongan. Después de eso, se inicia otro ciclo de desnaturalización, hibridación, y prolongación. Los ciclos se repiten múltiples veces para producir un fragmento amplificado que contiene la secuencia de ácido nucleico entre los sitios del cebador. La PCR ha sido descrita adicionalmente en numerosas patentes incluyendo las Patentes de los Estados Unidos 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188.

La identificación de los marcadores bialélicos como se ha descrito antes permite el diseño de oligonucleótidos apropiados, que pueden ser utilizados como cebadores para amplificar los fragmentos de ADN que comprenden los marcadores bialélicos descritos en la presente memoria. La amplificación se puede realizar utilizando los cebadores utilizados inicialmente para descubrir nuevos marcadores bialélicos que se describen en la presente memoria o cualquier grupo de cebadores que permiten la amplificación de un fragmento de ADN que comprende un marcador bialélico descrito en la presente memoria. Los cebadores se pueden preparar mediante cualquier método adecuado. Como por ejemplo, la síntesis química directa mediante un método tal como el método del fosfodiéster de Narang S.A. et al. (1979), el método del fosfodiéster de Brown E.L. et al. (1979), el método de la dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) y el método del soporte sólido descrito en la publicación EP 0 707 592.

En algunas realizaciones la presente descripción proporciona cebadores para amplificar un fragmento de ADN que contiene uno o más marcadores bialélicos descritos en la presente memoria. Los cebadores de amplificación preferidos se enumeran en la Tabla 1. Se apreciará que los cebadores enumerados son meramente ilustrativos y que se puede utilizar cualquier otro grupo de cebadores que forme productos de amplificación que contengan uno o más marcadores bialélicos descritos en la presente memoria.

Los cebadores se seleccionan para que sean sustancialmente complementarios a las diferentes cadenas de cada secuencia específica que se va a amplificar. La longitud de los cebadores descritos en la presente memoria puede oscilar de 8 a 100 nucleótidos, preferiblemente de 8 a 50, 8 a 30 o más preferiblemente 8 a 25 nucleótidos. Los cebadores más cortos tienden a carecer de especificidad por una secuencia de ácido nucleico diana y generalmente requieren temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Los cebadores más largos son costosos de producir y a veces pueden auto-hibridarse para formar estructuras en horquilla. La formación de híbridos estables depende de la temperatura de fusión (Tm) del ADN. La Tm depende de la longitud del cebador, la fuerza iónica de la solución y el contenido de G+C. A mayor contenido de G+C del cebador, mayor es la temperatura de fusión debido a que los pares G:C están sostenidos por tres enlaces H mientras los pares A:T tienen solamente dos. El contenido de G+C de los cebadores de amplificación de la presente invención oscila preferiblemente entre 10 y 75%, más preferiblemente entre 35 y 60%, y muy preferiblemente entre 40 y 55%. La longitud apropiada para los cebadores en un grupo concreto de condiciones de análisis puede ser determinada empíricamente por un experto en la técnica.

El espaciamiento de los cebadores determina la longitud del segmento que se va a amplificar. En el contexto de la presente descripción los segmentos amplificados que llevan marcadores bialélicos pueden tener un tamaño que oscila entre al menos aproximadamente 25 pb y 35 kpb. Son típicos los fragmentos de amplificación de 25-3000 pb, son preferidos los fragmentos de 50-1000 pb y son muy preferidos los fragmentos de 100-600 pb. Se apreciará que los cebadores de amplificación para los marcadores bialélicos pueden tener cualquier secuencia que permita la amplificación específica de cualquier fragmento de ADN que lleva los marcadores. Los cebadores de amplificación pueden ser marcados o inmovilizados sobre un soporte sólido como se describe en "Polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención".

Métodos de Genotipificación de muestras de ADN para marcadores bialélicos

Para identificar el nucleótido presente en un sitio del marcador bialélico puede usarse cualquier método conocido en la técnica. Como el alelo del marcador bialélico a detectar se ha identificado y especificado en la presente invención, la detección resultará sencilla para un especialista en la técnica empleando cualquiera de varias técnicas. Muchos métodos de genotipificación requieren la amplificación previa de la región de ADN que lleva el marcador bialélico de interés. Aunque en el momento actual a menudo se prefiere la amplificación de la diana o la señal, los presentes métodos de genotipificación también incluyen métodos de detección ultrasensibles que no requieren amplificación. Los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica que pueden usarse para detectar polimorfismos bialélicos incluyen métodos tales como el análisis por transferencia puntual convencional, análisis de polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP) descrito por Orita et al. (1989), la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), el análisis de heterodúplex, la detección de la escisión errónea, y otras técnicas convencionales como describen Sheffield et al. (1991), White et al. (1992), Grompe et al. (1989 y 1993). Otro método para determinar la identidad del nucleótido presente en un sitio polimórfico particular emplea un derivado de nucleótido resistente a exonucleasa especializado como se describe en la patente de Estados Unidos 4.656.127.

Los métodos preferidos implican determinar directamente la identidad del nucleótido presente en un sitio del marcador bialélico por un ensayo de secuenciación, ensayo de amplificación con especificidad de alelo o ensayo de hibridación. A continuación se proporciona una descripción de algunos métodos preferidos. Un método muy preferido es la técnica de microsecuenciación. El término "secuenciación" se usa en la presente memoria para hacer referencia a la extensión por la polimerasa de complejos de doble cadena de cebador/molde e incluye tanto la secuenciación tradicional como la microsecuenciación.

1) Análisis de secuenciación

El nucleótido presente en un sitio polimórfico puede determinarse por métodos de secuenciación. En una realización preferida, se someten muestras de ADN a amplificación por PCR antes de la secuenciación como se ha descrito antes. Los métodos de secuenciación de ADN se describen en "Secuenciación de ADN genómico amplificado e identificación de polimorfismos de un único nucleótido".

Preferiblemente, el ADN amplificado se somete a reacciones de secuenciación con terminador didesoxi automatizadas usando un protocolo de secuenciación de ciclo de colorante-cebador. El análisis de la secuencia permite la identificación de la base presente en el sitio del marcador bialélico.

2) Análisis de microsecuenciación

En los métodos de microsecuenciación, el nucleótido en un sitio polimórfico en un ADN diana se detecta por una reacción de extensión del cebador de un solo nucleótido. Este método implica cebadores de microsecuenciación apropiados que hibridan inmediatamente aguas arriba de la base polimórfica de interés en el ácido nucleico diana. Se usa una polimerasa para prolongar específicamente el extremo 3' del cebador con un solo ddNTP (terminador de la cadena) complementario al nucleótido en el sitio polimórfico. Después se determina la identidad del nucleótido incorporado de cualquier manera adecuada.

Típicamente, las reacciones de microsecuenciación se realizan usando ddNTP fluorescentes y los cebadores de microsecuenciación prolongados se analizan por electroforesis en máquinas de secuenciación ABI 377 para determinar la identidad del nucleótido incorporado como se describe en el documento EP 412 883. Como alternativa, puede usarse electroforesis capilar para realizar un gran número de análisis simultáneamente. Un ejemplo de un procedimiento de microsecuenciación típico que se puede utilizar en el contexto de la presente descripción se proporciona en el Ejemplo 4.

Pueden usarse diferentes estrategias para el marcaje y detección de ddNTP. Se ha descrito un método de detección de fases homogéneas basado en transferencia de energía por resonancia de fluorescencia por Chen y Kwok (1997) y Chen et al. (1997), En este método, se incuban fragmentos de ADN genómico amplificados que contienen sitios polimórficos con un cebador marcado con fluoresceína en el extremo 5' en presencia de didesoxirribonucleósidos trifosfato marcados con colorante alélicos y una polimerasa Taq modificada. El cebador marcado con colorante es prolongado una base por el colorante-terminador específico para el alelo presente en la plantilla. Al final de la reacción de genotipificación, se analizan directamente las intensidades de fluorescencia de los dos colorantes en la mezcla de reacción sin separación o purificación. Todas estas etapas pueden realizarse en el mismo tubo y los cambios de fluorescencia pueden controlarse en tiempo real. Como alternativa, el cebador prolongado puede analizarse por Espectrometría de masas MALDI-TOF. La base en el sitio polimórfico se identifica por la masa añadida sobre el cebador de microsecuenciación (véase Haff y Smirnov, 1997).

La microsecuenciación puede conseguirse por el método de microsecuenciación establecido o por modificaciones o derivados de dicho método. Los métodos alternativos incluyen varias técnicas de microsecuenciación en fase sólida. El protocolo básico de microsecuenciación es el mismo que se ha descrito anteriormente, con la excepción de que el método se realiza como un ensayo de fase heterogénea, en el que el cebador o la molécula diana se inmoviliza o captura en un soporte sólido. Para simplificar la separación del cebador y el análisis de adición del nucleótido terminal, se unen oligonucleótidos a soportes sólidos o se modifican de tal manera que se permite la separación por afinidad así como la prolongación por la polimerasa. Los extremos 5' y los nucleótidos internos de los oligonucleótidos sintéticos pueden modificarse de varias formas diferentes para permitir diferentes estrategias de separación de afinidad, por ejemplo, biotinilación. Si se usa un solo grupo de afinidad sobre los oligonucleótidos, los oligonucleótidos pueden separarse del reactivo terminador incorporado. Esto elimina la necesidad de separación física o por tamaños. Más de un oligonucleótido puede separarse del reactivo terminador y analizarse simultáneamente si se usa más de un grupo de afinidad. Esto permite el análisis de varias especies de ácido nucleico o más información sobre la secuencia de ácido nucleico por reacción de prolongación. No es necesario que el grupo de afinidad esté en el oligonucleótido de cebado, sino que puede estar presente, como alternativa, en el molde. Por ejemplo, la inmovilización puede realizarse a través de una interacción entre el ADN biotinilado y pocillos de microtitulación recubiertos con estreptavidina o partículas de poliestireno recubiertas con avidina. De la misma manera, pueden unirse oligonucleótidos o moldes a un soporte sólido en un formato de alta densidad. En semejantes reacciones de microsecuenciación en fase sólida, los ddNTP incorporados pueden ser radiomarcados (Syvänen, 1994) o unidos a fluoresceína (Livak y Hainer, 1994). La detección de los ddNTP radiomarcados puede conseguirse por técnicas basadas en centelleo. La detección de ddNTP unidos a fluoresceína puede basarse en la unión de anticuerpo antifluoresceína conjugado con fosfatasa alcalina, seguido de incubación con un sustrato cromogénico (tal como fosfato de p-nitrofenilo). Otros posibles pares de indicador-detección incluyen: los ddNTP unidos a dinitrofenilo (DNP) y producto conjugado de fosfatasa alcalina anti-DNP (Harju et al., 1993) o ddNTP biotinilado y estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante con o-fenilendiamina como sustrato (Publicación WO 92/15712). Como otro procedimiento de microsecuenciación en fase sólida alternativo, Nyren et al. 1993 describieron un método basado en la detección de actividad ADN polimerasa por un ensayo de detección de pirofosfato inorgánico luminométrico enzimático (ELIDA).

Pastinen et al. (1997) describen un método para la detección múltiple de un polimorfismo de un solo nucleótido en el que se aplica el principio de minisecuenciación en fase sólida a un formato de matriz de oligonucleótidos. Más adelante se describen con más detalle matrices de alta densidad de sondas de ADN unidas a un soporte sólido (chips de ADN).

En un aspecto se proporcionan los polinucleótidos y los métodos para la genotipificación de uno o más marcadores bialélicos descritos realizando un análisis de microsecuenciación. Los cebadores de microsecuenciación preferidos incluyen las secuencias de nucleótidos Núm. D15, D17, D21, E14, E16 y E20.

Se apreciará que los cebadores de microsecuenciación enumerados en el Ejemplo 4 son meramente ilustrativos y que se puede utilizar cualquier cebador que tenga un extremo 3' inmediatamente adyacente al nucleótido polimórfico. De manera similar, se apreciará que puede realizarse un análisis de microsecuenciación para cualquier marcador bialélico o cualquier combinación de marcadores bialélicos descritos. Un aspecto es un soporte sólido que incluye uno o más cebadores de microsecuenciación enumerados en el Ejemplo 4, o fragmentos que comprenden al menos 8, al menos 12, al menos 15, o al menos 20 nucleótidos consecutivos del mismo y que tienen un extremo 3' inmediatamente aguas arriba del correspondiente sitio del marcador bialélico, para determinar la identidad de un nucleótido en un sitio de un marcador bialélico. Preferiblemente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos.

3) Análisis de detección de emparejamientos erróneos basados en polimerasas y ligasas

En un aspecto se proporcionan los polinucleótidos y los métodos para determinar el alelo de uno o más marcadores bialélicos descritos en una muestra biológica, mediante análisis de detección de emparejamientos erróneos basados en polimerasas y/o ligasas. Estos análisis se basan en la especificidad de las polimerasas y ligasas. Las reacciones de polimerización establecen requerimientos particularmente restrictivos sobre el emparejamiento correcto de bases del extremo 3' del cebador de amplificación y la unión de dos oligonucleótidos hibridados a una secuencia de ADN diana es bastante sensible a los emparejamientos erróneos próximos al sitio de ligación, especialmente en el extremo 3'. Los métodos, cebadores y diversos parámetros para amplificar fragmentos de ADN que comprenden los marcadores bialélicos descritos se han descrito adicionalmente antes en "Amplificación de fragmentos de ADN que comprenden marcadores bialélicos".

Amplificación específica de alelos

La discriminación entre los dos alelos de un marcador bialélico también puede conseguirse por amplificación específica de alelos, una estrategia selectiva, por la que uno de los alelos se amplifica sin la amplificación del otro alelo. Esto se consigue situando la base polimórfica en el extremo 3' de uno de los cebadores de amplificación. Debido a las formas de extensión desde el extremo 3' del cebador, un emparejamiento erróneo en o cerca de esta posición tiene un efecto inhibidor sobre la amplificación. Por lo tanto, en condiciones de amplificación apropiadas, estos cebadores sólo dirigen la amplificación en su alelo complementario. El diseño del cebador específico del alelo apropiado y de las condiciones de análisis correspondientes están dentro del conocimiento del experto en la técnica.

Métodos basados en la ligación/amplificación

El "Análisis de Ligación a Oligonucleótidos" (OLA) usa dos oligonucleótidos que se diseñan de manera que sean capaces de hibridarse a secuencias contiguas de una sola cadena de una molécula diana. Uno de los oligonucleótidos se biotinila, y el otro se marca de forma detectable. Si se encuentra la secuencia complementaria precisa en una molécula diana, los oligonucleótidos hibridarán de tal forma que sus extremos estén contiguos, y se creará un sustrato de ligación que puede capturarse o detectarse. El OLA puede detectar SNP y puede combinarse ventajosamente con PCR como describen Nickerson et al. (1990), En este método, se usa PCR para conseguir la amplificación exponencial del ADN diana, que después se detecta usando OLA.

Otros métodos que son particularmente adecuados para la detección de polimorfismos de un solo nucleótido incluyen la LCR (reacción en cadena de la ligasa), Reacción de Reparación de la Cadena (GLCR) que se han descrito antes en "Amplificación de fragmentos de ADN que comprenden marcadores bialélicos". Como se ha mencionado antes la LCR usa dos pares de sondas para amplificar exponencialmente una diana específica. Las secuencias de cada pareja de oligonucleótidos se seleccionan de manera que permitan al par hibridarse con las secuencias contiguas de la misma cadena de la diana. Dicha hibridación forma un sustrato para una ligasa dependiente del molde. De acuerdo con la presente descripción, la LCR puede realizarse con oligonucleótidos que tienen las secuencias proximal y distal de la misma cadena de un sitio del marcador bialélico. En una realización, el oligonucleótido se diseñará de forma que incluya el sitio del marcador bialélico. En dicha realización, las condiciones de reacción se seleccionan para que los oligonucleótidos puedan ligarse juntos sólo si la molécula diana contiene o carece del nucleótido específico que es complementario al marcador bialélico del oligonucleótido. En una realización alternativa, los oligonucleótidos no incluirán el marcador bialélico, de tal forma que cuando se hibriden con la molécula diana, se cree un "hueco" como se describe en el documento WO 90/01069. Después, este hueco se "carga" con dNTP complementarios (como los mediados por ADN polimerasa), o con un par adicional de oligonucleótidos. Por lo tanto, al final de cada ciclo, cada cadena individual tiene un complemento capaz de servir como diana durante el siguiente ciclo y se obtiene la amplificación exponencial de forma específica para el alelo de la secuencia deseada.

El Genetic Bit Analysis® mediado por ligasa/polimerasa es otro método para determinar la identidad de un nucleótido en un sitio seleccionado previamente en una molécula de ácido nucleico (documento WO 95/21271). Este método implica la incorporación de un nucleósido trifosfato que es complementario al nucleótido presente en el sitio seleccionado previamente sobre el extremo de una molécula cebadora, y su posterior ligación con un segundo oligonucleótido. La reacción se controla detectando un marcador específico unido a la fase sólida de la reacción o por detección en solución.

4) Métodos de Análisis de Hibridación

Un método preferido para determinar la identidad del nucleótido presente en un sitio del marcador bialélico implica la hibridación del ácido nucleico. Las sondas de hibridación, que pueden ser utilizadas convenientemente en tales reacciones, incluyen preferiblemente las sondas definidas en la presente memoria. Puede usarse cualquier análisis de hibridación incluyendo hibridación de Southern, hibridación Northern, hibridación de transferencia puntual e hibridación en fase sólida (véase Sambrook et al., 1989).

Hibridación se refiere a la formación de una estructura dúplex mediante dos ácidos nucleicos monocatenarios debido al emparejamiento de bases complementarias. Puede producirse hibridación entre cadenas de ácido nucleico exactamente complementarias o entre cadenas de ácido nucleico que contienen regiones minoritarias de emparejamientos erróneos. Pueden diseñarse sondas específicas que hibridan con una forma de marcador bialélico y no con la otra y, por lo tanto, que son capaces de discriminar entre diferentes formas alélicas. Las sondas con especificidad de alelo a menudo se usan por parejas, mostrando un miembro de un par un emparejamiento perfecto con una secuencia diana que contiene el alelo original y mostrando el otro un emparejamiento perfecto con la secuencia diana que contiene el alelo alternativo. Las condiciones de hibridación deben ser suficientemente rigurosas como para que haya una diferencia significativa en la intensidad de hibridación entre alelos, y preferiblemente una respuesta esencialmente binaria, con lo que una sonda hibrida sólo con uno de los alelos. Las condiciones de hibridación rigurosas, con especificidad de secuencia, bajo las cuales una sonda hibridará sólo con la secuencia diana exactamente complementaria son bien conocidas en la técnica (Sambrook et al., 1989). Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan de manera que estén aproximadamente 5ºC por debajo del punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una concentración iónica y pH definidos. Aunque estas hibridaciones pueden realizarse en solución, se prefiere emplear un ensayo de hibridación en fase sólida. El ADN diana que comprende un marcador bialélico de la presente invención puede amplificarse antes de la reacción de hibridación. La presencia de un alelo específico en la muestra se determina detectando la presencia o ausencia de dúplex híbridos estables formados entre la sonda y el ADN diana. La detección de dúplex híbridos puede realizarse por varios métodos. Se conocen bien varios formatos de ensayos de detección que utilizan marcadores detectables unidos a la diana o a la sonda para permitir la detección de los dúplex híbridos. Típicamente, los dúplex de hibridación se separan de los ácidos nucleicos no hibridados y después se detectan las marcas unidas a los dúplex. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden emplear etapas de lavado para lavar el ADN diana o la sonda en exceso. Son adecuados formatos de análisis heterogéneos convencionales para detectar los híbridos usando las marcas presentes en los cebadores y sondas.

Dos análisis desarrollados recientemente permiten la discriminación de alelos basada en la hibridación sin necesidad de separaciones o lavados (véase Landegren U. et al., 1998). En ensayo TaqMan aprovecha la actividad nucleasa 5' de la ADN polimerasa Taq para digerir una sonda de ADN hibridada específicamente con el producto de amplificación que se acumula. Las sondas TaqMan se marcan con un par colorante donador-aceptor que interacciona por transferencia de energía por fluorescencia. La escisión de la sonda TaqMan por la polimerasa en avance durante la amplificación disocia el colorante donador del colorante aceptor de inactivación, aumentando en gran medida la fluorescencia del donador. Todos los reactivos necesarios para detectar dos variantes alélicas pueden ensamblarse al principio de la reacción y los resultados se controlan en tiempo real (véase Livak et al., 1995). En un procedimiento basado en hibridación homogénea alternativa, se usan balizas moleculares para las discriminaciones de alelos. Las balizas moleculares son sondas oligonucleotídicas con forma de horquilla que indican la presencia de ácidos nucleicos específicos en soluciones homogéneas. Cuando se unen a sus dianas experimentan una reorganización conformacional que restaura la fluorescencia de un fluoróforo extinguido internamente (Tyagi et al., 1998).

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Los polinucleótidos proporcionados en la presente memoria se pueden utilizar en análisis de hibridación para la detección de alelos de marcadores bialélicos en muestras biológicas. Estas sondas se caracterizan por comprender preferiblemente entre 8 y 50 nucleótidos, y por ser suficientemente complementarias a una secuencia que comprende un marcador bialélico de la presente invención como para hibridar con el mismo y preferiblemente por ser suficientemente específicas como para poder discriminar la secuencia diana para una sola variación de nucleótido. Preferiblemente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. El contenido de GC en las sondas oscila normalmente entre 10 y 75%, preferiblemente entre 35 y 60%, y más preferiblemente entre 40 y 55%. La longitud de estas sondas puede oscilar de 10, 15, 20, o 30 a al menos 100 nucleótidos, preferiblemente de 10 a 50, más preferiblemente de 18 a 35 nucleótidos. Una sonda particularmente preferida tiene una longitud de 25 nucleótidos. Preferiblemente, el marcador bialélico está a una distancia menor de 4 nucleótidos del centro de la sonda polinucleotídica. En sondas particularmente preferidas, el marcador bialélico está en el centro de dicho polinucleótido. Las sondas más cortas pueden carecer de especificidad por una secuencia de ácido nucleico diana y generalmente requieren temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Los cebadores más largos son costosos de producir y a veces pueden auto-hibridarse para formar estructuras en horquilla. Los métodos para la síntesis de sondas oligonucleotídicas han sido descritos antes y se pueden aplicar a las sondas descritas.

Preferiblemente las sondas se marcan o inmovilizan sobre un soporte sólido. Las marcas y soportes sólidos se describen adicionalmente en "Polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención". Las sondas de detección son generalmente secuencias de ácido nucleico o análogos de ácido nucleico no cargados tales como, por ejemplo ácidos nucleicos peptídicos que se describen en la Solicitud de Patente Internacional WO 92/20702, análogos de morfolino que se describe en las Patentes de los Estados Unidos Numeradas 5.185.444; 5.034.506 y 5.142.047. La sonda puede tener que volverse " no prolongable" ya que no se pueden añadir dNTP adicionales a la sonda. Los propios análogos normalmente no son prolongables y las sondas de ácido nucleico se pueden volver no prolongables modificando el extremo 3' de la sonda de manera que el grupo hidroxilo ya no sea capaz de participar en la elongación. Por ejemplo, el extremo 3' de la sonda puede ser funcionalizado con la marca de captura o detección para consumir de ese modo o bloquear de otro modo el grupo hidroxilo. Alternativamente, el grupo hidroxilo 3' simplemente puede ser escindido, remplazado o modificado.

Las sondas de la presente descripción son útiles para numerosos fines. Se pueden utilizar en la hibridación de Southern a ADN genómico o en la hibridación Northern a ARNm. Las sondas también se pueden utilizar para detectar productos de amplificación por PCR. Por medio del ensayo de la hibridación con una sonda con especificidad de alelo, se puede detectar la presencia o ausencia de un alelo marcador bialélico en una muestra dada.

Dentro de los "ensayos de hibridación" se incluyen específicamente hibridaciones paralelas de alto rendimiento en formato de matriz y se describen más adelante.

5) Hibridación con Matrices Direccionables de Oligonucleótidos

Los ensayos de hibridación basados en matrices de oligonucleótidos se basan en las diferencias en estabilidad de hibridación de oligonucleótidos cortos con variantes de secuencia diana perfectamente emparejadas y desemparejadas. Se consigue un acceso eficaz a la información sobre el polimorfismo a través de una estructura básica que comprende matrices de alta densidad de sondas oligonucleotídicas unidas a un soporte sólido (el chip) en posiciones seleccionadas. Cada chip de ADN puede contener de miles a millones de sondas de ADN sintéticas individuales dispuestas en un patrón de tipo rejilla y miniaturizarse hasta el tamaño de un dime.

La tecnología del chip ya se ha aplicado con éxito en numerosos casos. Por ejemplo, se ha realizado la selección de mutaciones en el gen BRCA1, en cepas mutantes de S. cerevisiae, y en el gen de la proteasa del virus VIH-1 (Hacia et al., 1996; Shoemaker et al., 1996;Kozal et al., 1996). Pueden producirse chips de diversos formatos para su uso en la detección de polimorfismos bialélicos en una base adaptada por Affymetrix (GeneChip®), Hyseq (HyChip y HyGnostics) y Protogene Laboratories.

En general, estos métodos emplean matrices de sondas oligonucleotídicas que son complementarias a segmentos de secuencia de ácido nucleico diana de un individuo, incluyendo dichas secuencias diana un marcador polimórfico. El documento EP 785280 describe una estrategia de enlosamiento para la detección de polimorfismos de un solo nucleótido. En resumen, las matrices generalmente pueden "enlosarse" para un gran número de polimorfismos específicos. Por "enlosamiento" se entiende generalmente la síntesis de una serie definida de sondas oligonucleotídicas que se obtiene a partir de una secuencia complementaria a la secuencia diana de interés, así como variaciones preseleccionadas de esa secuencia, por ejemplo, sustitución de una o más posiciones dadas con uno o más miembros de la serie base de monómeros, es decir, nucleótidos. En la solicitud PCT Núm. WO 95/11995 se describen adicionalmente estrategias de enlosamiento. En un aspecto particular, las matrices se enlosan para un número de secuencias marcadoras bialélicas identificadas específicas. En particular, la matriz se enlosa para incluir varios bloques de detección, siendo específico cada bloque de detección para un marcador bialélico específico o una serie de marcadores bialélicos. Por ejemplo, un bloque de detección puede enlosarse para incluir varias sondas que abarcan el segmento de secuencia que incluye un polimorfismo específico. Para asegurar sondas que son complementarias a cada alelo, las sondas se sintetizan en pares que difieren en el marcador bialélico. Además de las sondas que difieren en la base polimórfica, dentro del bloque de detección generalmente también se enlosan sondas monosustituidas. Estas sondas monosustituidas tienen bases en y hasta un cierto número de bases en cualquier dirección desde el polimorfismo, sustituidas con los demás nucleótidos (seleccionados entre A, T, G, C y U). Típicamente, las sondas en un bloque de detección enlosado incluirán sustituciones de las posiciones de secuencia hasta y que incluyen las que están separadas por 5 bases del marcador bialélico. Las sondas monosustituidas proporcionan controles internos para la matriz enlosada, para distinguir la hibridación real de la hibridación cruzada artefactual. Después de completar la hibridación con la secuencia diana y de lavar la matriz, la matriz se explora para determinar la posición de la matriz con la que hibrida la secuencia diana. Después se analizan los datos de hibridación de la matriz explorada para identificar el alelo o alelos del marcador bialélico que están presentes en la muestra. La hibridación y la exploración pueden realizarse como se describe en la publicación PCT Núm. WO 92/10092 y WO 95/11995 y en la patente de Estados Unidos Núm. 5.424.186.

De esta manera, en algunas realizaciones los chips pueden comprender una matriz de secuencias de ácido nucleico de fragmentos de aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En una realización preferida, el chip puede comprender una sonda como se define en "Polinucleótido de la invención". En realizaciones adicionales, el chip puede comprender una matriz que incluye al menos una de las secuencia seleccionadas del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 2-12 y SEQ ID NO: 1 y las secuencias complementarias a esta, o uno de sus fragmentos de al menos aproximadamente 8 nucleótidos consecutivos, preferiblemente 10, 15, 20, más preferiblemente 25, 30, 40, 47, o 50 nucleótidos consecutivos. En algunas realizaciones, el chip puede comprender una matriz de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más de estos polinucleótidos de la invención. Los soportes sólidos y los polinucleótidos unidos a los soportes sólidos se describen adicionalmente en "Polinucleótidos y polipéptidos".

6) Sistemas Integrados

Otra técnica que puede usarse para analizar polimorfismos incluye sistemas integrados multicomponente que miniaturizan y compartimentan procesos tales como PCR y reacciones de electroforesis capilar en un solo dispositivo funcional. Se describe un ejemplo de esta técnica en la patente de Estados Unidos 5.589.136, que describe la integración de la amplificación por PCR y la electroforesis capilar en chips.

Pueden preverse sistemas integrados principalmente cuando se usan sistemas de microfluidos. Estos sistemas comprenden un patrón de microcanales diseñados en una oblea de vidrio, silicio, cuarzo o plástico incluida en un microchip. El movimiento de las muestras se controla por fuerzas eléctricas, electro-osmóticas o hidrostáticas aplicadas a través de diferentes áreas del microchip para crear válvulas microscópicas funcionales y bombas sin partes móviles. Variando el voltaje se controla el flujo de líquido en intersecciones entre los canales micromecanizados y cambios en el caudal de líquido para el bombeo a través de diferentes secciones del microchip.

Para la genotipificación de marcadores bialélicos, el sistema de microfluidos puede integrar amplificación de ácidos nucleicos, microsecuenciación, electroforesis capilar y un método de detección tal como detección de fluorescencia inducida por láser.

IV. Métodos de Análisis Genético Utilizando los Marcadores Bialélicos descritos

Se encuentran disponibles diferentes métodos para el análisis genético de rasgos complejos (véase Lander y Schork, 1994). La búsqueda de los genes de susceptibilidad a la enfermedad se realiza utilizando dos métodos principales: el enfoque del ligamiento en el que se busca la evidencia de cosegregación entre un locus y un supuesto locus del rasgo utilizando estudios familiares, y el enfoque de la asociación en el que se busca la evidencia de una asociación estadísticamente significativa entre un alelo y un rasgo o un alelo causante de un rasgo (Khoury et al., 1993). En general, los marcadores bialélicos descritos encuentran uso en cualquier método conocido en la técnica para demostrar una correlación estadísticamente significativa entre un genotipo y un fenotipo. Los marcadores bialélicos se pueden utilizar en métodos de análisis de ligamiento paramétricos y no paramétricos. Preferiblemente, los marcadores bialélicos descritos se utilizan para identificar los genes asociados con rasgos detectables utilizando estudios de asociación, un enfoque que no requiere el uso de familias afectadas y que permite la identificación de genes asociados con rasgos complejos y esporádicos.

El análisis genético utilizando los marcadores bialélicos descritos se puede realizar a cualquier escala. Se puede utilizar el grupo completo de marcadores bialélicos descrito o cualquier subgrupo de los marcadores bialélicos descritos. Adicionalmente, se puede utilizar cualquier grupo de marcadores genéticos incluyendo un marcador bialélico descrito. Un grupo de polimorfismos bialélicos que se podría utilizar como marcadores genéticos combinados con los marcadores bialélicos descritos ha sido descrito en la Publicación WO 98/20165. Como se ha mencionado antes, se debe observar que los marcadores bialélicos descritos pueden ser incluidos en cualquier mapa genético completo o parcial del genoma humano.

En la presente memoria se describen métodos de detección de una asociación entre un genotipo y un fenotipo, que comprenden las etapas de a) genotipificar al menos un marcador bialélico relacionado con LSR en un población positiva para el rasgo de acuerdo con un método de genotipificación descrito; b) genotipificar dicho marcador bialélico relacionado con LSR en una población de control de acuerdo con un método de genotipificación descrito; y c) determinar si existe una asociación estadísticamente significativa entre dicho genotipo y dicho fenotipo. Además, los métodos de detección de una asociación entre un genotipo y un fenotipo abarcan métodos sin limitación alguna descritos en esta descripción, o los siguientes, especificados solos o en cualquier combinación. Preferiblemente, el marcador bialélico relacionado con LSR está presente en uno o más de los SEQ ID NO: 1 a 13, 15, y 17, y más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en A1 a A32 y sus complementos. Más preferiblemente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A2, A16, A17, A24, A26, y A31, y sus complementos. Alternativamente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A21, A23, y A24 y sus complementos. El marcador bialélico puede ser A26. En otra realización especialmente preferida, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A 15, A 17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Opcionalmente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A'1 a A'20 y sus complementos. Opcionalmente, dicha población de control es una población negativa para el rasgo, o una población al azar. Opcionalmente, se puede realizar cada una de dichas etapas de genotipificación a) y b) sobre una única muestra biológica reunida derivada de cada una de dichas poblaciones. Opcionalmente, se realiza cada una de dichas genotipificaciones de las etapas a) y b) por separado sobre muestras biológicas derivadas de cada individuo en dicha población o una de sus submuestras. Opcionalmente, dicho fenotipo es una enfermedad que implica el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos, más concretamente obesidad y trastornos relacionados con la obesidad, o una respuesta a un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos, o los efectos secundarios para un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos. Opcionalmente, dicho trastorno relacionado con la obesidad se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, resistencia a la insulina, hipertensión, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, infarto de miocardio/enfermedad cardiovascular (principalmente para mujeres), microangiopatía en individuos obesos con diabetes de Tipo II, lesiones oculares asociadas con microangiopatía en individuos obesos con diabetes de Tipo II, lesiones renales asociadas con microangiopatía en individuos obesos con diabetes de Tipo II, y Síndrome X.

Asimismo se describen métodos de estimación de la frecuencia de un haplotipo para un grupo de marcadores bialélicos en una población, que comprenden las etapas de: a) genotipificar al menos dos marcadores bialélicos relacionados con LSR para cada individuo en dicha población o una de sus submuestras, de acuerdo con un método de genotipificación descrito en la presente memoria; y b) aplicar un método de determinación del haplotipo a las identidades de los nucleótidos determinados en las etapas a) para obtener una estimación de dicha frecuencia. Además, los métodos de estimación de la frecuencia de un haplotipo abarcan métodos con cualquier limitación adicional descrita en esta descripción, o los siguientes, especificados solos o en cualquier combinación. Preferiblemente, el marcador bialélico relacionado con LSR está presente en uno o más de los SEQ ID NO: 1 a 13, 15, y 17, y más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en A1 a A32 y sus complementos. Más preferiblemente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A2, A16, A17, A24, A26, y A31, y sus complementos. Alternativamente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A21, A23, y A24 y sus complementos. El marcador bialélico puede ser A26. En otra realización especialmente preferida, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Opcionalmente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A'1 a A'20 y sus complementos. Opcionalmente, dicho método de determinación del haplotipo se selecciona del grupo que consiste en amplificación por PCR asimétrica, amplificación por PCR doble de alelos específicos, el algoritmo de Clark, o un algoritmo de esperanza-maximización. Opcionalmente, dicho segundo marcador bialélico es un marcador bialélico relacionado con LSR que es distinto de dicho primer marcador bialélico. Preferiblemente dicho segundo marcador está presente en uno o más de los SEQ ID NO: 1 a 13, 15, y 17, y más preferiblemente dicho segundo marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A1 a A32 y sus complementos. Más preferiblemente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A2, A16, A17, A24, A26, y A31, y sus complementos. Alternativamente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A21, A23, y A24 y sus complementos. El marcador bialélico puede ser A26. En otra realización especialmente preferida, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Opcionalmente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A'1 a A'20 y sus complementos.

Asimismo se describen métodos de detección de una asociación entre un haplotipo y un fenotipo, que comprenden las etapas de: a) estimar la frecuencia de al menos un haplotipo en una población positiva para el rasgo, de acuerdo con un método de la invención para estimar la frecuencia de un haplotipo; b) estimar la frecuencia de dicho haplotipo en una población de control, de acuerdo con un método de la invención para estimar la frecuencia de un haplotipo; y c) determinar si existe una asociación estadísticamente significativa entre dicho haplotipo y dicho fenotipo. Además, los métodos de detección de una asociación entre un haplotipo y un fenotipo descritos en la presente memoria abarcan métodos con cualquier limitación adicional descritos en esta descripción, o los siguientes. Preferiblemente, el marcador bialélico relacionado con LSR está presente en uno o más de los SEQ ID NO: 1 a 13, 15, y 17, y más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en A1 a A32 y sus complementos. Más preferiblemente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A2, A16, A17, A24, A26, y A31, y sus complementos. Alternativamente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A21, A23, y A24 y sus complementos. El marcador bialélico puede ser A26. En otra realización especialmente preferida, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Opcionalmente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A'1 a A'20 y sus complementos. Opcionalmente, dicha población de control es una población negativa para el rasgo, o una población al azar. Opcionalmente, dicho fenotipo es una enfermedad que implica el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos, más concretamente obesidad y trastornos relacionados con la obesidad, o una respuesta a un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos, o los efectos secundarios para un agente que actúa sobre el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos. Opcionalmente, dicho trastorno relacionado con la obesidad se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, resistencia a la insulina, hipertensión, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, infarto de miocardio/enfermedad cardiovascular (principalmente para mujeres), microangiopatía en individuos obesos con diabetes de Tipo II, lesiones oculares asociadas con microangiopatía en individuos obesos con diabetes de Tipo II, lesiones renales asociadas con microangiopatía en individuos obesos con diabetes de Tipo II, y Síndrome X. Opcionalmente, dicho método comprende las etapas adicionales de determinar el fenotipo en dichas poblaciones positivas para el rasgo y de control antes de la etapa c).

También se describen métodos de asociación empleados para examinar la asociación entre cualquier marcador bialélico relacionado con LSR, solo o como parte de un haplotipo, con un fenotipo que implica un trastorno que da como resultado una desorganización del metabolismo normal de carbohidratos o lípidos, el transporte o almacenamiento, incluyendo trastornos relacionados con la insulina, los triglicéridos, y la leptina, en particular una enfermedad cardiovascular (incluyendo aterosclerosis), hipertensión, obesidad, hiperinsulinemia, resistencia a la insulina y síndromes y enfermedades relacionados incluyendo cualquiera de los descritos en esta solicitud.

Análisis de ligamiento

El análisis de ligamiento se basa en el establecimiento de una correlación entre la transmisión de marcadores genéticos y la de un rasgo específico a lo largo de todas las generaciones de una familia. De este modo, el propósito del análisis de ligamiento es detectar loci marcadores que muestran cosegregación con un rasgo de interés en las genealogías.

Métodos paramétricos

Cuando se encuentran disponibles datos de generaciones sucesivas existe la oportunidad de estudiar el grado de ligamiento entre pares de loci. Las estimaciones de la fracción de recombinación permiten ordenar los loci y colocarlos en un mapa genético. Con loci que son marcadores genéticos, se puede establecer un mapa genético, y después se puede calcular la fuerza del ligamiento entre los marcadores y los rasgos y utilizarla para indicar las posiciones relativas de los marcadores y genes que afectan a esos rasgos (Weir, 1996). El método clásico para el análisis de ligamiento es el método de puntuación del logaritmo de la relación (lod) (véase Morton, 1955; Ott, 1991). El cálculo de las puntuaciones lod requiere la especificación del modo de herencia para la enfermedad (método paramétrico). Generalmente, la longitud de la región candidata identificada utilizando el análisis de ligamiento está entre 2 y 20 Mb. Una vez que una región candidata es identificada como se ha descrito antes, el análisis de individuos recombinantes utilizando marcadores adicionales permite la delineación adicional de la región candidata. Los estudios de análisis de ligamiento se han basado generalmente en el uso de un máximo de 5.000 marcadores microsatélites, limitando de ese modo la resolución máxima teórica obtenible del análisis de ligamiento a aproximadamente 600 kb de media.

El análisis de ligamiento se ha aplicado con éxito para mapear rasgos genéticos simples que muestran claros patrones de herencia Mendeliana y que tienen una elevada penetrancia (esto es, la razón entre el número portadores positivos del rasgo del alelo a y el número total de portadores de a en la población). No obstante, el análisis de ligamiento paramétrico adolece de una variedad de desventajas. Primero, está limitado por su dependencia de la elección de un modelo genético adecuado para cada rasgo estudiado. Además, como ya se ha mencionado, la resolución obtenible utilizando el análisis de ligamiento es limitada, y se requieren estudios complementarios para refinar el análisis de las regiones de 2Mb a 20Mb típicas identificadas inicialmente a través del análisis de ligamiento. Además, se ha demostrado que los enfoques de análisis de ligamiento paramétricos son difíciles cuando se aplican a rasgos genéticos complejos, tales como aquellos debidos a la acción combinada de múltiples genes y/o factores medioambientales. Es muy difícil modelar estos factores adecuadamente en un análisis de puntuación lod. En tales casos, se necesitan un esfuerzo y un coste demasiado grandes para reclutar el número adecuado de familias afectadas requerido para la aplicación de análisis de ligamiento a estas situaciones, como han comentado recientemente Risch, N. y Merikangas, K. (1996).

Métodos no paramétricos

La ventaja de los denominados métodos no paramétricos para el análisis de ligamiento es que no requieren especificación del modo de herencia para la enfermedad, tienden a ser más útiles para el análisis de rasgos complejos. En los métodos no paramétricos, se intenta probar que el patrón de herencia de una región cromosómica no coincide con la segregación Mendeliana al azar demostrando que los parientes afectados heredan copias idénticas de la región más a menudo de lo esperado por casualidad. Los parientes afectados deben mostrar "alelos compartidos" en exceso incluso en presencia de penetrancia incompleta y herencia poligénica. En el análisis de ligamiento no paramétrico el grado de coincidencia en un locus marcador en dos individuos puede ser medido por el número de alelos idénticos en estado (IBS) o por el número de alelos idénticos por descendencia (IBD). El análisis de pares sib afectados es un caso especial bien conocido y es la forma más simple de estos métodos.

Los marcadores bialélicos descritos en la presente memoria se pueden utilizar en métodos de análisis de ligamiento paramétricos y no paramétricos. Preferiblemente se pueden utilizar los marcadores bialélicos en métodos no paramétricos que permiten el mapeo de genes implicados en rasgos complejos. Los marcadores bialélicos descritos en la presente memoria pueden ser utilizados en métodos IBD e IBS para mapear genes que afectan a un rasgo complejo. En tales estudios, sacando ventaja de la elevada densidad de marcadores bialélicos, se pueden reunir diversos loci de marcadores bialélicos adyacentes para lograr la eficacia obtenida por los marcadores multi-alélicos (Zhao et al.,
1998).

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Estudios de asociación de poblaciones

La presente descripción comprende métodos para identificar si el gen LSR está asociado con un rasgo detectable utilizando los marcadores bialélicos descritos en la presente memoria. En una realización la presente descripción comprende métodos para detectar una asociación entre un alelo de un marcador bialélico o un haplotipo de un marcador bialélico y un rasgo. Adicionalmente, la descripción comprende métodos para identificar un alelo que causa un rasgo en desequilibrio de ligamiento con cualquier descripción de alelo del marcador bialélico.

Como se ha descrito antes, se pueden emplear enfoques alternativos para realizar estudios de asociación: estudios de asociación genética en todo el genoma, estudios de asociación de la región candidata y estudios de asociación del gen candidato. En una realización preferida, los marcadores bialélicos descritos en la presente memoria se utilizan para realizar estudios de asociación de genes candidato. El análisis de los genes candidato proporciona claramente un enfoque de acceso rápido para la identificación de genes y polimorfismos de genes relacionados con un rasgo concreto cuando se encuentra disponible alguna información concerniente a la biología del rasgo. Adicionalmente, los marcadores bialélicos descritos pueden ser incorporados en cualquier mapa de marcadores genéticos del genoma humano con el fin de realizar estudios de asociación en todo el genoma.

Los marcadores bialélicos descritos pueden ser incorporados adicionalmente en cualquier mapa de una región candidata específica del genoma (un cromosoma específico o un segmento cromosómico específico por ejemplo).

Como se ha mencionado antes, los estudios de asociación se pueden realizar en la población general y no están limitados a los estudios realizados en individuos relacionados de familias afectadas. Los estudios de asociación son extremadamente valiosos ya que permiten el análisis de rasgos esporádicos o multifactoriales. Por otra parte, los estudios de asociación representan un método poderoso para el mapeo a escala fina permitiendo un mapeo mucho más fino de los alelos que causan rasgos que los estudios de ligamiento. Los estudios basados en genealogías a menudo sólo estrechan la localización del alelo que causa el rasgo. Los estudios de asociación que utilizan los marcadores bialélicos de la presente invención se pueden utilizar por lo tanto para refinar la localización de un alelo causante de un rasgo en una región candidata identificada mediante métodos de Análisis de Ligamiento. Por otra parte, una vez que un segmento de un cromosoma de interés ha sido identificado, la presencia de un gen candidato tal como un gen candidato descrito, en la región de interés puede proporcionar un atajo en la identificación del alelo que causa el rasgo. Los marcadores bialélicos descritos se pueden utilizar para demostrar que un gen candidato está asociado con un rasgo.

Determinación de la frecuencia de un alelo de un marcador bialélico o de un haplotipo de un marcador bialélico en una población

Los estudios de asociación exploran las relaciones entre las frecuencias para los grupos de alelos entre loci.

Determinación de la frecuencia de un alelo en una población

Las frecuencias alélicas de los marcadores bialélicos en una población se pueden determinar utilizando uno de los métodos descritos antes en el encabezamiento "Métodos para la genotipificación de un individuo en busca de marcadores bialélicos", o cualquier procedimiento de genotipificación adecuado para este propósito pretendido. Las muestras de genotipificación reunidas o las muestras individuales pueden determinar la frecuencia de un alelo de un marcador bialélico en una población. Un modo de reducir el número de genotipificaciones requeridas es utilizar muestras reunidas. Un obstáculo principal en el uso de muestras reunidas son las condiciones de exactitud y reproducibilidad para determinar las concentraciones exactas de ADN en la creación de las reservas. La genotipificación de muestras individuales, que proporciona una mayor sensibilidad, reproducibilidad y exactitud, es el método preferido. Preferiblemente, cada individuo es genotipificado por separado y se aplica el recuento de genes simples para determinar la frecuencia de un alelo de un marcador bialélico o de un genotipo en una población dada.

Determinación de la frecuencia de un haplotipo en una población

La fase gamética de los haplotipos es desconocida cuando los individuos diploides son heterocigotos en más de un locus. Utilizando la información genealógica en familias a veces se puede inferir la fase gamética (Perlin et al., 1994). Cuando no se encuentra disponible información genealógica se pueden utilizar diferentes estrategias. Una posibilidad es que se pueden eliminar del análisis los diploides heterocigotos en múltiples sitios, manteniendo solamente los individuos homocigotos y los heterocigotos en un solo sitio, pero este enfoque podría conducir a una posible desviación en la composición de la muestra y a la infraestimación de los haplotipos de baja frecuencia. Otra posibilidad es que se pueden estudiar independientemente cromosomas únicos, por ejemplo, mediante amplificación por PCR asimétrica (véase Newton et al, 1989; Wu et al., 1989) o mediante aislamiento de un único cromosoma mediante dilución limitante seguida de amplificación por PCR (véase Ruano et al., 1990). Adicionalmente, se puede haplotipificar una muestra en busca de marcadores bialélicos suficientemente próximos mediante doble amplificación por PCR de alelos específicos (Sarkar, G. y Sommer S.S., 1991). Estos enfoques no son completamente satisfactorios debido a su complejidad técnica, al coste adicional que suponen, a su carencia de generalización a una gran escala, o a las posibles desviaciones que introducen. Para superar estas dificultades, se puede utilizar un algoritmo para inferir la fase de genotipos de ADN amplificados por PCR introducido por Clark A.G. (1990). En resumen, el principio consiste en empezar a rellenar una lista preliminar de haplotipos presentes en la muestra examinando los individuos inequívocos, esto es, los homocigotos completos y los heterocigotos en un único sitio. Después se escrutan otros individuos de la misma muestra en cuanto a la posible aparición de haplotipos reconocidos previamente. Para cada identificación positiva, se añade el haplotipo complementario a la lista de haplotipos reconocidos, hasta que la información de la fase para todos los individuos se resuelve o se identifica como no resuelta. Este método asigna un único haplotipo a cada individuo multiheterocigoto, a la vez que son posibles diversos haplotipos cuando hay más de un sitio heterocigoto. Alternativamente, se pueden utilizar métodos que estiman las frecuencias de los haplotipos en una población sin asignar haplotipos a cada individuo. Preferiblemente, se utiliza un método basado en el algoritmo de esperanza-maximización (EM) (Dempster et al., 1977) que conduce a estimaciones de la máxima probabilidad de las frecuencias de los haplotipos bajo la suposición de las proporciones de Hardy-Weinberg (apareamiento al azar) (véase Excoffier L. y Slatkin M., 1995). El algoritmo EM es un enfoque de la máxima probabilidad iterativo generalizado para la estimación que es útil cuando los datos son ambiguos y/o incompletos. El algoritmo EM se utiliza para resolver heterocigotos en haplotipos. Las estimaciones de haplotipos se describen adicionalmente más abajo en el encabezamiento "Métodos estadísticos". Se puede utilizar cualquier otro método conocido en la técnica para determinar o para estimar la frecuencia de un haplotipo en una población.

Análisis de Desequilibrio de Ligamiento

El desequilibrio de ligamiento es la asociación de alelos no al azar en dos o más loci y representa una potente herramienta para mapear genes implicados en rasgos de enfermedades (véase Ajioka R.S. et al., 1997). Los marcadores bialélicos, debido a que están densamente espaciados en el genoma humano y pueden ser genotipificados en mayor número que otros tipos de marcadores genéticos (tales como los marcadores RFLP o VNTR), son particularmente útiles en los análisis genéticos basados en el desequilibrio de ligamiento.

Cuando una mutación de enfermedad se introduce primero en una población (por una nueva mutación o la inmigración de un portador de la mutación), ésta reside necesariamente en un único cromosoma y por tanto en un único haplotipo "de fondo" o "ancestral" de marcadores ligados. Por consiguiente, existe un desequilibrio completo entre estos marcadores y la mutación de enfermedad: se encuentra la mutación de enfermedad solamente en presencia de un grupo específico de alelos marcadores. A lo largo de las siguientes generaciones se producen recombinaciones entre la mutación de enfermedad y estos polimorfismos marcadores, y gradualmente se disipa el desequilibrio. El ritmo de esta disipación es una función de la frecuencia de recombinación, de manera que los marcadores más próximos al gen de la enfermedad manifestarán niveles superiores de desequilibrio que aquellos que están más lejos. Cuando no se deshacen por recombinación, los haplotipos "ancestrales" y el desequilibrio de ligamiento entre los alelos marcadores en diferentes loci pueden ser rastreados no solamente a lo largo de las generaciones sino también a lo largo de las poblaciones. El desequilibrio de ligamiento se observa normalmente como asociación entre un alelo específico en un locus y otro alelo específico en un segundo locus.

Se espera que el patrón o curva de desequilibrio entre los locis de la enfermedad y el marcador muestre un máximo que se produzca en el locus de la enfermedad. Por consiguiente, la cantidad de desequilibrio de ligamiento entre un alelo de enfermedad y los marcadores genéticos íntimamente ligados puede producir una información valiosa referente a la localización del gen de la enfermedad. Para un mapeo a escala fina de un locus de enfermedad, es útil tener un cierto conocimiento de los patrones del desequilibrio de ligamiento que existe entre los marcadores de la región estudiada. Como se ha mencionado antes la resolución del mapeo obtenida por medio del análisis del desequilibrio de ligamiento es mucho mayor que la de los estudios de ligamiento. La elevada densidad de marcadores bialélicos combinada con el análisis de desequilibrio de ligamiento proporciona herramientas potentes para el mapeo a escala fina. Los diferentes métodos para calcular el desequilibrio de ligamiento se describen más abajo en el encabezamiento "Métodos estadísticos".

Estudios de control de casos basados en poblaciones de asociaciones rasgo-marcador

Como se ha mencionado antes, la aparición de pares de alelos específicos en diferentes loci del mismo cromosoma no es al azar y la desviación del azar se denomina desequilibrio de ligamiento. Los estudios de asociación se centran en las frecuencias de población y se basan en el fenómeno de desequilibrio de ligamiento. Si un alelo específico en un gen dado está asociado directamente con un rasgo particular, su frecuencia estará estadísticamente aumentada en una población afectada (positiva para el rasgo), en comparación con la frecuencia en una población negativa para el rasgo o en una población de control aleatoria. Como consecuencia de la existencia de desequilibrio de ligamiento, la frecuencia de todos los demás alelos presentes en el haplotipo que lleva el alelo causante del rasgo también estará aumentada en individuos positivos para el rasgo en comparación con individuos negativos para el rasgo o controles aleatorios. Por lo tanto, la asociación entre el rasgo y cualquier alelo (específicamente un alelo marcador bialélico) en el desequilibrio de ligamiento con el alelo causante del rasgo será suficiente para sugerir la presencia de un gen relacionado con el rasgo en esa región particular. Las poblaciones para el control de casos se pueden genotipificar en busca de marcadores bialélicos para identificar las asociaciones que localizan estrechamente un alelo causante de un rasgo. Cualquier marcador en desequilibrio de ligamiento con un marcador dado asociado con un rasgo estará asociado con el rasgo. El desequilibrio de ligamiento permite analizar las frecuencias relativas en poblaciones de casos-control de un número limitado de polimorfismos genéticos (específicamente marcadores bialélicos) como alternativa a la selección de todos los polimorfismos funcionales posibles para encontrar alelos causantes de rasgos. Los estudios de asociación comparan la frecuencia de alelos marcadores en poblaciones de casos-control no relacionadas, y representan herramientas poderosas para la disección de rasgos complejos.

Poblaciones de casos-control (criterios de inclusión)

Los estudios de asociación basados en la población no se refieren a la herencia familiar, sino que comparan la prevalencia de un marcador genético particular, o una serie de marcadores, en poblaciones de casos-control. Son estudios de casos-control basados en la comparación de individuos de casos no relacionados (afectados o positivos para el rasgo) e individuos de control no relacionados (no afectados, negativos para el rasgo o aleatorios). Preferiblemente, el grupo de control se compone de individuos no afectados o negativos para el rasgo. Además, el grupo de control es étnicamente correspondiente a la población de casos. Además, el grupo de control preferiblemente corresponde a la población de casos para el factor de confusión conocido principal para el rasgo en estudio (por ejemplo, coincide en edad en caso de un rasgo dependiente de la edad). Idealmente, los individuos de las dos muestras se emparejan de tal manera que es de esperar que difieran únicamente en su estado de enfermedad. En lo siguiente, "población positiva para el rasgo", "población de casos" y "población afectada" se usan indistintamente.

Una importante etapa en la disección de rasgos complejos utilizando estudios de asociación es la elección de poblaciones con casos-control (véase Lander y Schork, 1994). Una etapa importante en la elección de poblaciones de casos-control es la definición clínica de un rasgo o fenotipo dado. Cualquier rasgo genético puede analizarse por el método de asociación propuesto en la presente memoria por medio de la selección cuidadosa de los individuos a incluir en los grupos fenotípicos positivo y negativo para el rasgo. A menudo son útiles cuatro criterios: fenotipo clínico, edad de inicio, historia familiar y gravedad. El procedimiento de selección para rasgos continuos o cuantitativos (tales como, por ejemplo, la presión sanguínea) implica la selección de individuos en extremos opuestos de la distribución fenotípica del rasgo en estudio, para incluir en estas poblaciones positiva para el rasgo y negativa para el rasgo individuos con fenotipos no solapantes. Preferiblemente, las poblaciones de casos-control consisten en poblaciones fenotípicamente homogéneas. Las poblaciones positivas para el rasgo y negativas para el rasgo consisten en poblaciones fenotípicamente uniformes de individuos, representando cada uno entre 1 y 98%, preferiblemente entre 1 y 80%, más preferiblemente entre 1 y 50%, y más preferiblemente entre 1 y 30%, muy preferiblemente entre 1 y 20% de la población total en estudio, y se seleccionan entre individuos que presentan fenotipos no solapantes. Cuanto más clara es la diferencia entre los dos fenotipos del rasgo, mayor es la probabilidad de detectar una asociación con marcadores bialélicos. La selección de los fenotipos drásticamente diferentes pero relativamente uniformes permite comparaciones eficaces en estudios de asociación y la posible detección de diferencias marcadas a nivel genético, siempre que los tamaños de muestra de las poblaciones en estudio sean suficientemente significativos.

En realizaciones preferidas, se recluta un primer grupo de entre 50 y 300 individuos positivos para el rasgo, preferiblemente aproximadamente 100 individuos, de acuerdo con sus fenotipos. En estos estudios se incluye un número similar de individuos negativos para el rasgo.

En la presente invención, los ejemplos típicos de criterios de inclusión incluyen obesidad y trastornos relacionados con la obesidad. Más concretamente, los criterios de inclusión pueden estar basados en el "IMC" (peso/altura^{2} (kg/m^{2})). Preferiblemente, los individuos positivos para el rasgo presentan un IMC que está en el 3% máximo.

Análisis de Asociación

La estrategia general para realizar estudios de asociación usando marcadores bialélicos derivados de una región que lleva un gen candidato es explorar dos grupos de individuos (poblaciones de casos-control) para medir y comparar estadísticamente las frecuencias de alelos de los marcadores bialélicos de la presente descripción en los dos grupos.

Si se identifica una asociación estadísticamente significativa con un rasgo para al menos uno o más de los marcadores bialélicos analizados, se puede suponer que: el alelo asociado es directamente responsable de causar el rasgo (el alelo asociado es el alelo causante del rasgo), o más probablemente, el alelo asociado está en desequilibrio de ligamiento con al alelo causante del rasgo. Las características específicas del alelo asociado con respecto a la función del gen candidato normalmente proporcionan una perspectiva adicional a la relación entre el alelo asociado y el rasgo (causal o en desequilibrio de ligamiento). Si la evidencia indica que muy probablemente el alelo asociado dentro del gen candidato no es el alelo causante del rasgo pero está en desequilibrio de ligamiento con el alelo causante del rasgo real, se puede encontrar el alelo causante del rasgo secuenciando las proximidades del marcador asociado.

Los estudios de asociación normalmente se realizan en dos etapas sucesivas. En una primera fase, en las poblaciones positivas para el rasgo y negativas para el rasgo se determinan las frecuencias de un número reducido de marcadores bialélicos del gen candidato. En una segunda fase del análisis, se refina adicionalmente la posición de los loci genéticos responsables del rasgo dado usando una mayor densidad de marcadores de la región relevante. No obstante, si el gen candidato en estudio tiene una longitud relativamente pequeña, como es el caso para muchos de los genes candidatos analizados incluidos en la presente invención, puede ser suficiente una única fase para establecer asociaciones significativas.

Análisis del Haplotipo

Como se ha descrito anteriormente, cuando aparece por primera vez un cromosoma que lleva un alelo de una enfermedad en una población como resultado de mutación o migración, el alelo mutante necesariamente reside en un cromosoma que tiene una serie de marcadores ligados: el haplotipo ancestral. Este haplotipo puede rastrearse a través de poblaciones y puede analizarse su asociación estadística con un rasgo dado. Los estudios de asociación de complementación de un solo punto (alélico) con estudios de asociación de múltiples puntos también denominados estudios de haplotipo aumentan la potencia estadística de los estudios de asociación. De esta manera, un estudio de asociación de haplotipo permite definir la frecuencia y el tipo de haplotipo portador ancestral. El análisis del haplotipo es importante ya que aumenta la potencia estadística de un análisis que implica marcadores individuales.

En una primera etapa de un análisis de frecuencia de haplotipo, se determina la frecuencia de los posibles haplotipos basándose en diversas combinaciones de los marcadores bialélicos identificados de la invención. Después se compara la frecuencia de haplotipo para poblaciones distintas de individuos positivos para el rasgo y de control. El número de individuos positivos para el rasgo que deberían someterse a este análisis para obtener resultados estadísticamente significativos normalmente varía entre 30 y 300, variando el número preferido de individuos entre 50 y 150. Se aplican las mismas consideraciones al número de individuos no afectados (o control aleatorio) usados en el estudio. Los resultados de este primer análisis proporcionan frecuencias de haplotipo en poblaciones de casos-control, para cada frecuencia de haplotipo evaluada, se calculan un valor de p y un cociente de posibilidades. Si se encuentra una asociación estadísticamente significativa, puede conseguirse una aproximación del riesgo relativo de que un individuo que lleva el haplotipo dado esté afectado con el rasgo en estudio.

Análisis de interacción

Los marcadores bialélicos de la presente invención también pueden usarse para identificar patrones de marcadores bialélicos asociados con rasgos detectables resultantes de interacciones poligénicas. El análisis de la interacción genética entre alelos en loci no ligados requiere una genotipificación individual usando las técnicas descritas en la presente memoria. El análisis de la interacción alélica entre una serie seleccionada de marcadores bialélicos con un nivel apropiado de significación estadística puede considerarse un análisis de haplotipo. El análisis de interacción consiste en estratificar las poblaciones de casos-control con respecto a un haplotipo dado para los primeros loci y realizar un análisis de haplotipo con los segundos loci con cada subpoblación.

Los métodos estadísticos utilizados en los estudios de asociación se describen adicionalmente más abajo.

Ensayo de ligamiento en presencia de asociación

Los marcadores bialélicos descritos en la presente memoria se pueden utilizar adicionalmente en TDT (ensayo de transmisión/desequilibrio). El TDT somete a ensayo el ligamiento y la asociación y no resulta afectado por la estratificación de la población. El TDT requiere datos de individuos afectados y sus parientes o datos de hermanos no afectados en lugar de parientes (véase Spielmann S. et al., 1993; Schaid D.J. et al., 1996, Spielmann S. y Ewens W.J., 1998). Tales ensayos combinados reducen generalmente los errores de falsos-positivos producidos por análisis separados.

Métodos estadísticos

En general, se puede usar cualquier método conocido en la técnica para someter a ensayo si un rasgo y un genotipo muestran una correlación estadísticamente significativa.

1) Métodos en el análisis de ligamiento

Los métodos estadísticos y los programas de ordenador útiles para el análisis de ligamiento son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase Terwilliger J.D. y Ott J., 1994; Ott J., 1991).

2) Métodos para estimar las frecuencias de haplotipo en una población

Como se ha descrito antes, cuando se puntúan genotipos, a menudo no es posible distinguir los heterocigotos de manera que las frecuencias de haplotipo no se pueden inferir fácilmente. Cuando no se conoce la fase gamética, las frecuencias de haplotipo pueden ser estimadas a partir de datos genotípicos multilocus. Se puede utilizar cualquier método conocido por los expertos en la técnica para estimar las frecuencias de haplotipo (véase Lange K., 1997; Weir, B.S., 1996). Preferiblemente, las frecuencias de haplotipo de probabilidad máxima se computan utilizando un algoritmo de Esperanza-Maximización (EM) (véase Dempster et al., 1977; Excoffier L. y Slatkin M., 1995). Este procedimiento es un procedimiento iterativo destinado a obtener estimaciones de la probabilidad máxima de las frecuencias de haplotipo de datos de genotipos multi-locus cuando la fase gamética es desconocida. Las estimaciones del haplotipo se realizan normalmente aplicando el algoritmo EM utilizando por ejemplo el programa EM-HAPLO (Hawley M.E. et al., 1994) o el programa Arlequin (Schneider et al., 1997). El algoritmo EM es un enfoque de la probabilidad máxima iterativo generalizado para la estimación y se describe brevemente más abajo.

En la siguiente parte de este texto, los fenotipos estarán referidos a genotipos multi-locus con una fase desconocida. Los genotipos estarán referidos a genotipos multi-locus con fases conocidas.

Supongamos una muestra de individuos no relacionados N tipificados para marcadores K. Los datos observados son los fenotipos del locus K con una fase desconocida que pueden clasificarse en diferentes fenotipos F. Supongamos que los autores de la presente invención tienen H haplotipos posibles esenciales (en el caso de los marcadores bialélicos K, H=2^{K}).

Para el fenotipo j, supongamos que son posibles c_{j} genotipos. Los autores de la presente invención tiene de este modo la siguiente ecuación

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donde Pj es la probabilidad del fenotipo j, h_{k} y h_{l} son los dos haplotipos constitutivos del genotipo i. En el equilibrio de Hardy-Weinberg, pr(h_{k},h_{l}) pasa a ser:

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Las etapas sucesivas del algoritmo E-M se pueden describir como sigue:

Partiendo de valores iniciales de las frecuencias de los haplotipos, indicados como p^{(0)}_{1}, p^{(0)}_{2}, ..... p^{(0)}_{H}, estos valores iniciales sirven para estimar las frecuencias de genotipo (etapa de Esperanza) y después estimar otro grupo de frecuencias de los haplotipos (etapa de Maximización), indicados como p^{(0)}_{1}, p^{(0)}_{2}, ..... p^{(0)}_{H}, estas dos etapas se repiten hasta que los cambios en los grupos de frecuencias de los haplotipos son muy pequeños.

Un criterio de parada puede ser que la diferencia máxima entre las frecuencias de los haplotipos entre dos repeticiones sea menor de 10^{-7}. Estos valores se pueden ajustar de acuerdo con la precisión deseada de las estimaciones.

En detalle, a una repetición dada, la etapa de Esperanza consiste en calcular las frecuencias de los genotipos mediante la siguiente ecuación:

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donde el genotipo i se produce en el fenotipo j, y donde h_{k} y h_{l} constituyen el genotipo i. Cada probabilidad es derivada de acuerdo con las ec.1, y ec.2 descritas antes.

Después la etapa de Maximización estima simplemente otro grupo de frecuencias de haplotipos dadas las frecuencias de los genotipos. Este enfoque también es conocido como método de recuento de genes (Smith, 1957).

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donde \delta_{it} es una variable indicadora que cuenta el número de haplotipo en el tiempo t del genotipo i. Toma los valores 0, 1 o 2.

Para asegurar que la estimación obtenida finalmente es la estimación de la probabilidad máxima se requieren diversos valores de salida. Las estimaciones obtenidas se comparan y si son diferentes se conservan las estimaciones que conducen a la mejor probabilidad.

3) Métodos para calcular el desequilibrio de ligamiento entre marcadores

Se pueden utilizar numerosos métodos para calcular el desequilibrio de ligamiento entre dos posiciones genéticas cualesquiera, en la práctica el desequilibrio de ligamiento se mide aplicando un ensayo de asociación estadística a los datos del haplotipo tomados de una población.

El desequilibrio de ligamiento entre cualquier par de marcadores bialélicos que comprende al menos uno de los marcadores bialélicos de la presente invención (M_{i}, M_{j}) que tiene alelos (a_{i}/b_{i}) en el marcador M_{i} y alelos (a_{j}/b_{j}) en el marcador M_{j} se puede calcular para cada combinación de alelos (a_{i}, a_{j}; a_{i}, b_{j}; b_{i}, a_{j} y b_{i}, b_{j}), de acuerdo con la fórmula de Piazza:

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donde:

\theta4 = - - = frecuencia de genotipos que tienen el alelo a_{i} en M_{i} y no tienen el alelo a_{j} en M_{j}

\theta3 = - + frecuencia de genotipos que no tienen el alelo a_{i} en M_{i} y tienen el alelo a_{j} en M_{j}

\theta2 = + - = frecuencia de genotipos que tienen el alelo a_{i} en M_{i} y no tienen el alelo a_{j} en M_{j}.

El desequilibrio de ligamiento (LD) entre pares de marcadores bialélicos (M_{i}, M_{j}) también se puede calcular para cada combinación de alelos (ai,aj; ai,bj; b_{i},a_{j} y b_{i},b_{j}), de acuerdo con la estimación de la probabilidad máxima (MLE) para delta (el coeficiente de desequilibrio genotípico compuesto), como describe Weir (Weir B.S., 1996). El MLE para el desequilibrio de ligamiento compuesto es:

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donde n_{1} = \Sigma fenotipo (a_{i}/a_{i}, a_{j}/a_{j}), n_{2} = \Sigma fenotipo (a_{i}/a_{i}, a_{j}/b_{j}), n_{3} = \Sigma fenotipo (a_{i}/b_{i}, a_{j}/a_{j}), n4= \Sigma fenotipo (a_{i}/b_{i}, a_{j}/b_{j}) y N es el número de individuos de la muestra.

Esta fórmula permite estimar el desequilibrio de ligamiento entre alelos cuando solamente se encuentran disponibles datos del genotipo, y no del haplotipo.

Otro método para calcular el desequilibrio de ligamiento entre marcadores es el siguiente. Para un par de marcadores bialélicos, M_{i} (a_{i}/b_{i}) y M_{j} (a_{j}/b_{j}), que se ajustan al equilibrio de Hardy-Weinberg, se pueden estimar las cuatro posibles frecuencias de haplotipo en una población dada de acuerdo con el enfoque descrito antes.

La estimación del desequilibrio gamético entre ai y aj es simplemente:

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donde pr(a_{i}) es la probabilidad del alelo a_{i} y pr(a_{j}) es la probabilidad del alelo a_{j} y donde pr(haplotipo (a_{i}, a_{j})) se estima como en la Ecuación 3 anterior.

Para un par de marcadores bialélicos solamente es necesaria la medida del desequilibrio para describir la asociación entre M_{i} y M_{j}.

Después se calcula el valor normalizado de lo anterior como sigue:

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El experto en la técnica apreciará fácilmente que se pueden utilizar otros métodos de cálculo de LD sin experimentación indebida.

El desequilibrio de ligamiento entre un grupo de marcadores bialélicos que tienen una tasa de heterocigosis adecuada se puede determinar genotipificando entre 50 y 1000 individuos no relacionados, preferiblemente entre 75 y 200, más preferiblemente alrededor de 100.

4) Ensayo de asociación

Los métodos para determinar la significación estadística de una correlación entre un fenotipo y un genotipo, en este caso un alelo en un marcador bialélico o un haplotipo formado por tales alelos, pueden ser determinados mediante cualquier ensayo estadístico conocido en la técnica y requiriéndose cualquier umbral aceptado de significación estadística. La aplicación de métodos y umbrales de significación concretos son bien conocidos por los expertos normales en la técnica.

El ensayo de asociación se realiza determinando la frecuencia de un alelo de un marcador bialélico en poblaciones con casos y de control y comparando estas frecuencias con un ensayo estadístico para determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa en la frecuencia que indique una correlación entre el rasgo y el alelo del marcador bialélico en estudio. De un modo similar, el análisis del haplotipo se realiza estimando las frecuencias de todos los posibles haplotipos para un grupo de marcadores bialélicos dado en poblaciones con casos y de control, y comparando estas frecuencias con un ensayo estadístico para determinar si existe una correlación estadísticamente significativa entre el haplotipo y el fenotipo (rasgo) en estudio. Se puede utilizar cualquier herramienta estadística útil para someter a ensayo la asociación estadísticamente significativa entre un genotipo y un fenotipo. Preferiblemente el ensayo estadístico empleado es un ensayo de chi cuadrado con un grado de libertad. Se calcula un valor de P (el valor de P es la probabilidad de que pueda ocurrir por casualidad una estadística tan grande o más grande que la observada).

Significación estadística

En las realizaciones preferidas, la significación con fines diagnósticos, ya sea como base positiva para ensayos diagnósticos adicionales o ya sea como punto de partida preliminar para una terapia preventiva temprana, el valor de p relacionado con una asociación de marcadores bialélicos es preferiblemente aproximadamente 1 x 10^{-2} o menos, más preferiblemente aproximadamente 1 x 10^{-4} o menos, para un análisis de un único marcador bialélico y aproximadamente 1 x 10^{-3} o menos, aún más preferiblemente 1 x 10^{-6} o menos y muy preferiblemente de aproximadamente 1 x 10^{-8} o menos, para un análisis de haplotipo que implique varios marcadores. Se cree que estos valores son aplicables a cualquiera de los estudios de asociación que impliquen combinaciones de un único o múltiples marcadores.

El experto puede utilizar el intervalo de valores mostrado antes como punto de partida con el fin de llevar a cabo estudios de asociación con los marcadores bialélicos de la presente invención. Al hacerlo, se pueden revelar asociaciones significativas entre los marcadores bialélicos de la presente invención y la obesidad o los trastornos relacionados con la obesidad y utilizarlas con fines diagnósticos y de escrutinio de fármacos.

Permutación fenotípica

Con el fin de confirmar la significación estadística del primer análisis de haplotipo de la primera fase descrito antes, sería adecuado realizar análisis adicionales en los cuales los datos de genotipificación de individuos de casos-contol sean reunidos y aleatorizados con respecto al fenotipo del rasgo. Cada dato de genotipificación individual se asigna al azar a dos grupos, que contienen el mismo número de individuos que las poblaciones de casos-control utilizadas para recopilar los datos obtenidos en la primera fase. Se realiza preferiblemente un análisis de haplotipo de la segunda fase sobre estos grupos artificiales, preferiblemente para los marcadores incluidos en el haplotipo del análisis de la primera fase que muestra el mayor coeficiente de riesgo relativo. Este experimento se reitera preferiblemente al menos entre 100 y 10000 veces. Las reiteraciones repetidas permiten la determinación del porcentaje de haplotipos obtenidos con un nivel de valores p de significación por debajo de aproximadamente 1x10^{-3}.

Evaluación de la asociación estadística

Para estudiar el problema de los falsos positivos se pueden realizar análisis similares con las mismas poblaciones de casos-control en regiones genómicas al azar. Se comparan los resultados en las regiones al azar y de la región candidata.

5) Evaluación de factores de riesgo

La asociación entre un factor de riesgo (en epidemiología genética el factor de riesgo es la presencia o ausencia de un cierto alelo o haplotipo en loci marcadores) y una enfermedad se mide mediante el cociente de posibilidades (OR) y mediante el riesgo relativo (RR). Si P(R^{+}) es la probabilidad de desarrollar la enfermedad para individuos con R y P(R^{-}) es la probabilidad de los individuos sin el factor de riesgo, el riesgo relativo es simplemente el cociente de las dos posibilidades, esto es:

RR = P(R^{+})/P(R^{-})

En los estudios de casos-control, no se pueden obtener medidas directas del riesgo relativo debido al diseño del muestreo. Sin embargo, el cociente de posibilidades permite una buena aproximación del riesgo relativo para enfermedades de baja incidencia y se puede calcular:

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F^{+} es la frecuencia de la exposición al factor de riesgo en los casos y F^{-} es la frecuencia de la exposición al factor de riesgo en los controles. F^{+} y F^{-} se calculan utilizando las frecuencias alélicas o de haplotipos del estudio y dependen adicionalmente del modelo genético esencial (dominante, recesivo, aditivo...).

Se puede estimar adicionalmente el riesgo atribuible (AR) que describe la proporción de individuos de una población que muestran un rasgo debido a un factor de riesgo dado. Esta medida es importante en la cuantificación del papel de un factor específico en la etiología de una enfermedad y en términos del impacto en la salud pública de un factor de riesgo. La relevancia para la salud pública de esta medida se encuentra en la estimación de la proporción de casos de enfermedad en la población que podrían ser evitados si la exposición de interés estuviera ausente. La AR se determina como sigue:

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AR es el riesgo atribuible a un alelo de un marcador bialélico o a un haplotipo de un marcador bialélico. P_{E} es la frecuencia de exposición a un alelo o un haplotipo en una población en general; y RR es el riesgo relativo que es aproximado al cociente de posibilidades cuando el rasgo en estudio tiene una incidencia relativamente baja en la población general.

Identificación de Marcadores Bialélicos En Desequilibrio de Ligamiento Con los Marcadores Bialélicos descritos

Una vez que se ha identificado un primer marcador bialélico en una región genómica de interés, el práctico experto en la técnica, utilizando las enseñanzas de la presente descripción puede identificar fácilmente marcadores bialélicos adicionales en desequilibrio de ligamiento con este primer marcador. Como se ha mencionado antes cualquier marcador en desequilibrio de ligamiento con un primer marcador asociado con un rasgo estará asociado con el rasgo. Por lo tanto, una vez que se ha demostrado una asociación entre un marcador bialélico dado y un rasgo, el descubrimiento de los marcadores bialélicos adicionales asociados con este rasgo es de gran interés con el fin de aumentar la densidad de marcadores bialélicos en esta región concreta. El gen o la mutación causales se encontrarán en las proximidades del marcador o grupo de marcadores que muestran la correlación más alta con el rasgo.

La identificación de marcadores adicionales en desequilibrio de ligamiento con un marcador dado implica: (a) amplificar un fragmento genómico que comprende un primer marcador bialélico de una pluralidad de individuos; (b) identificar los segundos marcadores bialélicos de la región genómica que alberga dicho primer marcador bialélico, (c) llevar a cabo un análisis de desequilibrio de ligamiento entre dicho primer marcador bialélico y dichos segundos marcadores bialélicos; y (d) seleccionar dichos marcadores bialélicos que están en desequilibrio de ligamiento con dicho primer marcador. También se contemplan las subcombinaciones que comprenden las etapas (b) y (c).

Los métodos para identificar los marcadores bialélicos y para realizar el análisis de desequilibrio de ligamiento se describen en la presente memoria y se pueden llevar a cabo por un experto en la técnica sin experimentación indebida. Se pueden utilizar los métodos para identificar marcadores bialélicos que están en desequilibrio de ligamiento con los marcadores bialélicos específicos A1 a A32 y que se espera que presenten características similares en términos de su respectiva asociación con un rasgo dado.

Estudios de Mapeo: Identificación de Mutaciones Funcionales

Una vez que se ha confirmado la asociación positiva con un marcador bialélico de la presente descripción, el gen candidato asociado puede ser explorado en busca de mutaciones comparando las secuencias de un número seleccionado de individuos positivos para el rasgo y negativos para el rasgo. En una realización preferida, se exploran en busca de mutaciones regiones funcionales tales como los exones y los sitios de empalme, los promotores y otras regiones reguladoras del gen candidato. Preferiblemente, los individuos positivos para el rasgo llevan el haplotipo que se ha demostrado que está asociado con el rasgo y los individuos negativos para el rasgo no llevan el haplotipo o alelo asociado con el rasgo. El procedimiento de detección de la mutación es esencialmente similar al utilizado para la identificación del sitio bialélico.

El método utilizado para detectar tales mutaciones comprende generalmente las siguientes etapas: (a) amplificación de una región del gen candidato que comprende un marcador bialélico o un grupo de marcadores bialélicos asociado con el rasgo a partir de las muestras de ADN de pacientes positivos para el raso y controles negativos para el rasgo; (b) secuenciación de la región amplificada; (c) comparación de las secuencias de ADN de pacientes positivos para el rasgo y controles negativos para el rasgo; y (d) determinación de las mutaciones específicas de pacientes positivos para el rasgo. Se contemplan específicamente las subcombinaciones que comprenden las etapas (b) y (c). Preferiblemente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A1 a A32 y sus complementos. Más preferiblemente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A2, A16, A17, A24, A26, y A31, y sus complementos. Alternativamente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A21, A23, y A24 y sus complementos. El marcador bialélico puede ser A26. En otra realización especialmente preferida, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. Opcionalmente, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A'1 a A'20 y sus complementos.

Se prefiere que los polimorfismos candidato sean verificados después mediante exploración de una población mayor de casos y controles por medio de cualquier procedimiento de genotipificación tales como los descritos en la presente memoria, preferiblemente utilizando una técnica de microsecuenciación en un formato de ensayo individual. Los polimorfismos son considerados como mutaciones candidatas cuando están presentes en casos y controles a frecuencias compatibles con los resultados de asociación esperados.

Marcadores Bialélicos de la Descripción en Métodos de Diagnóstico Genético

Los marcadores bialélicos descritos en la presente memoria también se pueden utilizar para desarrollar ensayos diagnósticos capaces de identificar individuos que expresan un rasgo detectable como resultado de un genotipo específico o individuos cuyo genotipo los coloca en riesgo de desarrollar un rasgo detectable en un momento posterior.

Los expertos en la técnica del tratamiento y diagnóstico de la obesidad o los trastornos relacionados con la obesidad entenderán por supuesto que la presente descripción no está destinada a proporcionar una identificación absoluta de individuos que podrían estar en riesgo de desarrollar una enfermedad concreta que implique obesidad y trastornos relacionados con la obesidad sino más bien a indicar un cierto grado o probabilidad de desarrollar una enfermedad. No obstante, esta información es extremadamente valiosa ya que puede, en ciertas circunstancias, ser utilizada para iniciar tratamientos preventivos o para permitir que un individuo que porta un haplotipo significativo prevea signos de advertencia tales como síntomas menores. En las enfermedades en las que los ataques pueden ser extremadamente violentos y algunas veces fatales si no se tratan a tiempo, el conocimiento de una predisposición potencial, incluso si esta predisposición no es absoluta, podría contribuir de una manera muy significativa a la eficacia del tratamiento.

Las técnicas de diagnóstico de la presente invención pueden emplear una variedad de metodologías para determinar si un sujeto de ensayo tiene un patrón de marcadores bialélicos asociado con un aumento del riesgo de desarrollar obesidad o si el individuo padece obesidad como resultado de una mutación concreta, incluyendo métodos que permiten el análisis de los cromosomas del individuo para la haplotipificación, tales como estudios familiares, análisis de ADN de un único espermatozoide o híbridos somáticos. El rasgo analizado utilizando los presentes diagnósticos pueden ser la obesidad y los trastornos relacionados con la obesidad.

Otro aspecto de la presente invención hace referencia a un método para determinar si un individuo se encuentra en riesgo de desarrollar obesidad o de si un individuo expresa la obesidad como consecuencia de poseer un alelo causante de obesidad concreto. Estos métodos implican determinar si una muestra de ácido nucleico obtenida del individuo contiene uno o más alelos de uno o más marcadores bialélicos indicativos de riesgo de desarrollar obesidad o indicativos de que el individuo expresa la obesidad como resultado de poseer un alelo causante de obesidad concreto.

Preferiblemente, en tales métodos diagnósticos, se obtiene una muestra de ácido nucleico del individuo y esta muestra se somete a genotipificación utilizando los métodos descritos antes en "Métodos de Genotipificación de Muestras de ADN En Busca de Marcadores Bialélicos". Los diagnósticos se pueden basar en un único marcador bialélico o en un grupo de marcadores bialélicos. En cada uno de estos métodos, se obtiene una muestra de ácido nucleico del sujeto de ensayo y se determina el patrón del marcador bialélico de uno o más de los marcadores bialélicos SNP núm.1, SNP núm.2 y SNP núm.3.

En una realización, se lleva a cabo una amplificación por PCR en la muestra de ácido nucleico para amplificar las regiones en las cuales se han identificado los polimorfismos asociados con la obesidad. Los productos de amplificación se secuencian para determinar si el individuo posee uno o más polimorfismos de LSR asociados con la obesidad. Los cebadores utilizados para generar los productos de amplificación pueden comprender los cebadores enumerados en la Tabla 1. Alternativamente, la muestra de ácido nucleico es sometida a reacciones de microsecuenciación como se ha descrito antes para determinar si el individuo posee uno o más polimorfismos de LSR asociados con la obesidad resultantes de una mutación o un polimorfismo en el gen LSR. Los cebadores utilizados en las reacciones de microsecuenciación pueden incluir los cebadores enumerados en la Tabla 4. En otra realización, la muestra de ácido nucleico se pone en contacto con una o más sondas oligonucleotídicas específicas del alelo que hibridan específicamente con uno o más alelos LSR asociados con la obesidad. Las sondas utilizadas en el análisis de hibridación pueden incluir las sondas enumeradas en la Tabla 3. En otra realización, la muestra de ácido nucleico se pone en contacto con un segundo oligonucleótido de LSR capaz de producir un producto de amplificación cuando se utiliza con el oligonucleótido específico del alelo en una reacción de amplificación. La presencia de un producto de amplificación en la reacción de amplificación indica que el individuo posee uno o más alelos de LSR asociados con la obesidad.

Como se describe en la presente memoria, los diagnósticos se pueden basar en un único marcador bialélico o en un grupo de marcadores bialélicos. El marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos.

Los kits de diagnóstico comprenden cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención.

Estos métodos diagnósticos son extremadamente valiosos ya que pueden, en ciertas circunstancias, ser utilizados para iniciar tratamientos preventivos o para permitir que un individuo que porta un haplotipo significativo prevea signos de advertencia tales como síntomas menores.

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Los diagnósticos, que analizan y pronostican la respuesta a un fármaco o los efectos secundarios de un fármaco, se pueden utilizar para determinar si un individuo debe ser tratado con un fármaco concreto. Por ejemplo, si el diagnóstico indica la probabilidad de que un individuo responda positivamente a un tratamiento con un fármaco concreto, el fármaco puede ser administrado al individuo. Por el contrario, si el diagnóstico indica que es probable que un individuo responda negativamente al tratamiento con un fármaco concreto, se puede prescribir una línea de tratamiento alternativa. Una respuesta negativa puede ser definida como la ausencia de una respuesta eficaz o la presencia de efectos secundarios tóxicos.

Las pruebas clínicas con fármacos representan otra aplicación para los marcadores descritos en la presente memoria. Se pueden identificar uno o más marcadores indicativos de respuesta a un agente que actúa frente a una enfermedad relacionada con la obesidad o a efectos secundarios de un agente que actúa contra una enfermedad relacionada con la obesidad utilizando los métodos descritos antes. Después de eso, se pueden escrutar los participantes potenciales en las pruebas clínicas de semejante agente para identificar aquellos individuos que responden muy probablemente de manera favorable al fármaco y excluir aquellos que probablemente experimentan efectos secundarios. De ese modo, se puede medir la eficacia de un tratamiento con un fármaco en individuos que responden positivamente al fármaco, sin disminuir la medida como resultado de la inclusión de individuos que es poco probable que respondan positivamente en el estudio y sin arriesgarse a problemas de seguridad no deseables.

Vectores recombinantes

El término "vector" se usa en la presente memoria para designar una molécula de ADN o ARN circular o linear, que es bicatenaria o monocatenaria, y que comprende al menos un polinucleótido de interés que se pretende transferir a una célula anfitriona o a un organismo anfitrión unicelular o multicelular.

En la presente memoria se describen vectores recombinantes que comprenden uno cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente memoria.

Se describe una familia de vectores recombinantes que comprenden un polinucleótido regulador derivado de la secuencia genómica de LSR, o un polinucleótido codificante derivado de la secuencia genómica de LSR o de una secuencia de ADNc, comprendiendo dicho polinucleótido al menos uno de los marcadores bialélicos de la presente invención.

El marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos.

Más concretamente se describen vectores recombinantes que comprenden un polinucleótido descrito en "Polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención", "Polinucleótidos", o "Polipéptidos."

Se puede utilizar un vector recombinante para amplificar el polinucleótido insertado en una célula anfitriona adecuada, amplificándose este polinucleótido cada vez que el vector recombinante replica.

Los vectores recombinantes pueden consistir en vectores de expresión que comprenden un polinucleótido regulador o codificante de la invención, o ambos, conteniendo dicho polinucleótido al menos un bialélico de la presente invención. Los vectores de expresión se pueden emplear para expresar un polipéptido de LSR, preferiblemente un LSR modificado descrito en la presente invención, que después puede ser purificado y, por ejemplo utilizado en análisis de escrutinio de ligandos o como inmunógeno con el fin de producir anticuerpos específicos dirigidos contra una proteína LSR modificada. Los vectores de expresión se pueden utilizar para construir animales transgénicos y también para terapia génica. La expresión requiere que en los vectores se proporcionen las señales apropiadas, incluyendo dichas señales diversos elementos reguladores, tales como potenciadores/promotores tanto de fuentes virales como procedentes de mamífero, que dirigen la expresión de los genes de interés en las células anfitrionas. Generalmente se incluyen en los vectores de expresión, marcadores dominantes de selección del fármaco para establecer clones celulares permanentes, estables, que expresan los productos, ya que son elementos que ligan la expresión de los marcadores de selección del fármaco a la expresión del polipéptido.

Los vectores de expresión pueden incluir ácidos nucleicos que codifican una proteína LSR, preferiblemente una proteína LSR modificada que porta al menos una sustitución o deleción mostrada en los SEQ ID NO: 14, 16 y 18 o sus variantes o fragmentos, bajo el control de una secuencia reguladora seleccionada entre los polinucleótidos reguladores de LSR, o alternativamente bajo el control de una secuencia reguladora exógena.

Por consiguiente, los vectores de expresión se pueden seleccionar del grupo que consiste en: (a) una secuencia reguladora de LSR que comprende un marcador bialélico de la invención y que conduce la expresión de un polinucleótido codificante conectado operablemente a este; (b) la secuencia codificante de LSR que comprende un marcador bialélico de la invención y que está conectado operablemente a secuencias de regulación permitiendo su expresión en una célula anfitriona y/o un organismo anfitrión adecuado. El marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos.

Un vector de expresión recombinante puede comprender un polinucleótido seleccionado del siguiente grupo de polinucleótidos:

a) un polinucleótido de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 1, 13, 15 y 17 o una de sus variantes o uno de sus fragmentos que comprende al menos un marcador bialélico de la invención;

b) un ácido nucleico que codifica una proteína LSR o uno de sus fragmentos, preferiblemente una proteína LSR modificada que porta al menos una sustitución o deleción mostrada en los SEQ ID NO: 14, 16 y 18 o sus variantes o fragmentos.

Alguno de los elementos que se pueden encontrar en los vectores se describen con más detalle en las siguientes secciones.

1) Características generales de los vectores de expresión:

Un vector recombinante puede comprender, pero sin limitarse a ellos, un YAC (cromosoma artificial de levadura), un BAC (cromosoma artificial bacteriano), un fago, un fagémido, un cósmido, un plásmido, o incluso una molécula lineal de ADN que puede consistir en un ADN cromosómico, no cromosómico, semi-sintético o sintético. Un vector recombinante de este tipo puede comprender una unidad transcripcional que comprende un conjunto de:

(1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión de los genes, por ejemplo promotores o potenciadores. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, usualmente de aproximadamente 10 a 300 pb de longitud que actúan sobre el promotor para aumentar la transcripción;

(2) una secuencia estructural o codificante que está transcrita en el ARNm y finalmente traducida a un polipéptido, estando dicha secuencia estructural o codificante ligada operativamente a los elementos reguladores descritos en (1); y

(3) secuencias apropiadas de inicio y terminación de la transcripción. Las unidades estructurales destinadas al uso en sistemas de expresión de levadura o eucariotas preferiblemente incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula anfitriona. Como alternativa, cuando una proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un resto N-terminal. Este resto puede ser o no escindido posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación, marcadores de selección que permiten la transformación de la célula anfitriona y un promotor derivado de un gen de alta expresión para dirigir la transcripción de una secuencia estructural aguas abajo. La secuencia estructural heteróloga es ensamblada en una fase apropiada con las secuencias de iniciación y terminación de la traducción, y preferiblemente una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida hacia el espacio periplásmico o el medio extracelular. En un ejemplo específico donde el vector está adaptado para transfectar y expresar secuencias deseadas en células anfitrionas de mamífero, los vectores preferidos comprenderán un origen de replicación en el anfitrión deseado, un promotor y potenciador adecuado, y también cualquier sitio de unión a ribosomas necesario, sitio de poliadenilación, sitio donador y aceptor de corte y empalme, secuencias terminadoras de la transcripción, y secuencias no transcritas limítrofes 5'. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo de origen SV40, promotor temprano, potenciador, sitios de corte y empalme y de poliadenilación, se pueden usar para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

2) Elementos reguladores Promotores

Las regiones adecuadas del promotor usadas en los vectores de expresión se eligen teniendo en cuenta la célula anfitriona en la que es expresado el gen heterólogo. El promotor particular empleado para controlar la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés no se considera importante, con tal de que sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula elegida. Así, cuando se elige como objetivo una célula humana, es preferible colocar la región codificante de ácido nucleico adyacente a un promotor y bajo el control del mismo, que es capaz de ser expresado en una célula humana, tal como, por ejemplo, un promotor humano o viral.

Un promotor adecuado puede ser heterólogo con respecto al ácido nucleico para el que controla la expresión o, como alternativa, puede ser endógeno para el polinucleótido nativo que contiene la secuencia codificante a expresar. Adicionalmente, el promotor es generalmente heterólogo con respecto a las secuencias del vector recombinante dentro de las cuales ha sido insertada la estructura artificial de la secuencia promotora/codificante.

Las regiones del promotor se pueden seleccionar a partir de cualquier gen objetivo usando, por ejemplo, vectores CAT (cloramfenicol-transferasa) y más preferiblemente vectores pKK232-8 y pCM7.

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Los promotores bacterianos preferidos son los promotores de ARN-polimerasa, LacI, LacZ, bacteriófago T3 o T7, los promotores gpt, lambda PR, PL y trp (EP 0036776), el promotor de polihedrina, o el promotor de proteína p10 de baculovirus (Kit Novagen) (Smith et al., 1983; O'Reilly et al., 1992), el promotor lambda PR o también el promotor trc.

Los promotores eucarióticos incluyen el inmediato temprano de CMV, timidina-quinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, los LTR de retrovirus, y la metalotioneina-L de ratón. La selección de un vector y promotor convenientes es bien conocida dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica.

La elección de un promotor está bien dentro de la capacidad de un especialista en el campo de la ingeniería genética. Por ejemplo, se puede hacer referencia al libro de Sambrook et al. (1989) o también a los procedimientos descritos por Fuller et al. (1996).

Otros elementos reguladores

Cuando se emplea un inserto de ADNc, se desea típicamente incluir una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación adecuada del transcrito del gen. La naturaleza de la señal de poliadenilación no se cree que sea crucial para la práctica satisfactoria de la invención, y se puede emplear cualquiera de tales secuencias como la hormona de crecimiento humano y las señales de poliadenilación de SV40. También se contempla como un elemento del casete de expresión un terminador. Estos elementos pueden servir para aumentar los niveles de mensajero y minimizar la lectura de otras secuencias desde el casete.

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada descrita antes, más preferiblemente el polinucleótido regulador del gen LSR, un polinucleótido que codifica el polipéptido LSR o ambos, y que comprende un marcador bialélico como se describe en la presente memoria se puede utilizar para transformar un anfitrión apropiado para permitir la expresión del polipéptido o polinucleótido deseado.

3) Marcadores de selección

Estos marcadores deben conferir un cambio identificable a la célula que permita la fácil identificación de las células que contienen el constructo de expresión. Los genes del marcador seleccionable para la selección de células anfitrionas transformadas son preferiblemente dihidrofolato-reductasa o resistencia a la neomicina para el cultivo de células eucarióticas, TRP1 para S. cerevisiae o resistencia a tetraciclina, rifampicina o ampicilina en E. coli, o levan-sacarasa para las micobacterias, siendo este último marcador un marcador de selección negativo.

4) Vectores preferidos Vectores bacterianos

Como un ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para su uso en bacterias pueden comprender un marcador de selección y un origen de replicación bacteriano procedente de plásmidos disponibles en el mercado que comprenden elementos genéticos de pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suecia), y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, Estados Unidos).

Se conocen gran cantidad de otros vectores adecuados por los especialistas en la técnica, y están disponibles en el mercado, tal como los siguientes vectores bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); pQE-30 (QIAexpress).

Vectores de bacteriófagos

El vector del bacteriófago P1 puede contener insertos grandes que oscilan de aproximadamente 80 a aproximadamente 100 kb.

La construcción de vectores del bacteriófago P1 tales como p158 o p158/neo8 se describen notablemente por Sternberg (1992, 1994). Los clones de P1 recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos de LSR pueden ser diseñados para insertar grandes polinucleótidos de más de 40 kb (Linton et al., 1993). Para generar ADN de p1 para experimentos transgénicos, un protocolo preferido es el protocolo descrito por McCormick et al. (1994). En resumen, se hace crecer E. coli (preferiblemente la cepa NS3529) que alberga el plásmido P1 durante la noche en un medio de caldo adecuado que contiene 25 \mug/ml de kanamicina. El ADN de P1 se prepara a partir de E. coli mediante lisis alcalina utilizando el kit Qiagen Plasmid Maxi (Qiagen, Chatsworth, CA, Estados Unidos), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN de P1 se purifica a partir del producto lisado bacteriano en dos columnas Qiagen-tip 500, utilizando los tampones de lavado y elución contenidos en el kit. Después se realiza una extracción con fenol/cloroformo antes de precipitar el ADN con etanol del 70%. Después de solubilizar el ADN en TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM), se evalúa la concentración del ADN mediante espectrofotometría.

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Cuando el objetivo es expresar un clon de P1 que comprende secuencias de nucleótidos de LSR en un animal transgénico, típicamente en ratones transgénicos, es deseable separar las secuencias del vector del fragmento de ADN de P1, por ejemplo escindiendo el ADN de P1 en sitios raros de corte en el poliligador de P1 (SfiI, NotI o SalI). El inserto de P1 se purifica después de las secuencias del vector en un gel de agarosa de campo pulsado, usando métodos similares a los referidos originalmente para el aislamiento de ADN a partir de YAC (Schedl et al., 1993a; Peterson et al., 1993). En esta fase, el ADN del inserto purificado resultante puede ser concentrado, si es necesario, en un Millipore Ultrafree-MC Filter Unit (Millipore, Bedford, MA, EEUU-límite de peso molecular 30.000) y después sometido a diálisis frente a un tampón de microinyección (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4; EDTA 250 \muM) que contiene NaCl 100 mM, espermina 30 \muM, espermidina 70 \muM en una membrana de microdiálisis (tipo VS, 0,025 \muM de Millipore). La integridad del inserto de ADN de P1 purificado se evalúa mediante electroforesis en agarosa al 1% (Sea Kem GTG; FMC Bio-products) gel de campo pulsado y tinción con bromuro de etidio.

Vectores de baculovirus

Un vector adecuado para la expresión de un polipéptido de LSR modificado, preferiblemente un polipéptido de LSR que porta al menos una sustitución o deleción mostrada en los SEQ ID NO: 14, 16 y 18, o sus fragmentos o variantes es un vector de baculovirus que puede ser propagado en células de insecto y en líneas celulares de insecto. Un sistema de vector anfitrión adecuado específico es el vector de transferencia de baculovirus pVL1392/1393 (Pharmingen) que se usa para transfectar la línea celular SF9 (ATCC Núm. CRL 1711) que procede de Spodoptera frugiperda.

Otros vectores adecuados para la expresión de polipéptidos de LSR en un sistema de expresión de baculovirus incluyen los descritos por Chai et al. (1993), Vlasak et al. (1983) y Lenhard et al. (1996).

Vectores víricos

En un ejemplo específico, el vector procede de un adenovirus. Los vectores de adenovirus preferidos son los descritos por Feldman y Steg (1996) o Ohno et al. (1994). Otro adenovirus recombinante preferido es el adenovirus humano tipo 2 o 5 (Ad 2 o Ad 5) o un adenovirus de origen animal (solicitud de patente francesa Núm. FR-93.05954).

Generalmente, se entiende que los vectores de retrovirus y vectores de virus adenoasociados son sistemas de administración de genes recombinantes de elección para la transferencia de polinucleótidos exógenos in vivo, particularmente a mamíferos, incluyendo seres humanos. Estos vectores proporcionan una eficaz liberación de genes a las células, y los ácidos nucleicos transferidos están integrados de forma estable en el ADN cromosómico del anfitrión.

Los retrovirus particularmente preferidos para la preparación o construcción de vehículos retrovirales de liberación de genes in vitro o in vivo de la presente invención incluyen retrovirus seleccionados del grupo que consiste en virus inductores de focos en células del visón, virus del sarcoma murino, virus de la reticuloendoteliosis y virus del sarcoma de Rous. Los virus de la leucemia murina particularmente preferidos incluyen los virus 4070A y los 1504A, Abelson (ATCC No VR-999), Friend (ATCC No VR-245), Gross (ATCC No VR-590), Rauscher (ATCC No VR-998) y el Virus de la leucemia murina de Moloney (ATCC No VR-190; Solicitud PCT Núm. WO 94/24298). Los virus del sarcoma de Rous particularmente preferidos incluyen la cepa Bryan de alto título (ATCC Núms. VR-334, VR-657, VR-726, VR-659 y VR-728). Otros vectores retrovirales preferidos son los descritos en Roth et al. (1996), Solicitud PCT Núm. WO 93/25234, Solicitud PCT Núm. WO 94/06920, Roux et al., 1989, Julan et al., 1992 y Neda et al., 1991.

Otro sistema más de vector vírico que se contempla consiste en el virus adeno-asociado (AAV). El virus adeno-asociado es un virus defectuoso presente en la naturaleza que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un virus del herpes, como virus coadyuvante para una replicación eficaz y un productivo ciclo vital (Muzyczka et al., 1992). Es también uno de los pocos virus que pueden integrar su ADN en células que no se dividen, y presenta una alta frecuencia de integración estable (Flotte et al., 1992; Samulski et al., 1989; McLauhlin et al., 1989). Una característica ventajosa de los AAV proviene de su reducida eficacia para transducir células primarias con respecto a células trans-
formadas.

Vectores de BAC

El sistema de clonación de cromosoma artificial bacteriano (BAC) (Shizuya et al., 1992) ha sido desarrollado para mantener establemente grandes fragmentos de ADN genómico (100-300 kb) en E. coli. Un vector de BAC preferido consiste en el vector pBeloBAC11 que ha sido descrito por Kim et al. (1996). Se preparan genotecas de BAC con este vector utilizando ADN genómico de tamaño seleccionado que ha sido digerido parcialmente utilizando enzimas que permiten la ligación en los sitios Bam HI o HindlII del vector. Flanqueando estos sitios de clonación se encuentran los sitios de inicio de la transcripción de la AR polimerasa de T7 y SP6 que pueden ser utilizados para generar sondas finales mediante transcripción de ARN o métodos de PCR. Después de la construcción de una genoteca de BAC en E. coli, el ADN de BAC es purificado de la célula anfitriona en forma de un círculo superenrollado. La conversión de estas moléculas circulares en una forma lineal precede tanto la determinación del tamaño como la introducción de los BAC en las células receptoras. El sitio de clonación está flanqueado por dos sitios Not I, permitiendo que los segmentos clonados sean separados por corte del vector mediante digestión con Not I. Alternativamente, el inserto de ADN contenido en el vector pBeloBAC11 puede ser linealizado mediante tratamiento del vector BAC con la enzima disponible en el mercado lambda terminasa que conduce a la escisión en el único sitio cosN, pero este método de escisión da como resultado un clon BAC completo que contiene tanto el ADN del inserto como las secuencias de BAC.

5) Administración de vectores recombinantes

Con el fin de efectuar la expresión de los polinucleótidos descritos, estos constructos deben ser liberadas en una célula. Esta administración puede realizarse in vitro, como en los procedimientos de laboratorio para transformar líneas celulares, o in vivo o ex vivo, como en el tratamiento de ciertas patologías.

Un mecanismo es la infección vírica en la que la estructura artificial de expresión es encapsulada en una partícula vírica infecciosa.

Se contemplan también varios métodos no víricos para la transferencia de polinucleótidos a células de mamífero cultivadas, e incluyen, sin que estén limitados a ellos, precipitación de fosfato de calcio (Graham et al., 1973;Chen et al., 1987;), DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporación (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), microinyección directa (Harland et al., 1985), liposomas cargados con ADN (Nicolau et al., 1982; Fraley et al., 1979), y transfección mediada por receptores (Wu y Wu, 1987; 1988). Algunas de estas técnicas pueden adaptarse con éxito para el uso in vivo o ex vivo.

Una vez que el polinucleótido de expresión ha sido liberado a la célula, puede ser integrado de manera estable en el genoma de la célula receptora. Esta integración puede hacerse en lugar cognado y en orientación vía recombinación homóloga (reemplazamiento del gen) o puede ser integrado en un lugar aleatorio, no específico (aumento del gen). En otros ejemplos más, el ácido nucleico puede mantenerse de forma estable en la célula como un segmento de ADN episómico separado. Tales segmentos de ácido nucleico o "episomas" codifican las secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación independiente del ciclo de la célula anfitriona o en sincronía con dicho ciclo.

Un ejemplo específico para un método para administrar una proteína o péptido en el interior de una célula de un vertebrado in vivo comprende la etapa de introducir una preparación que comprende un portador fisiológicamente aceptable y un polinucleótido desnudo que codifica operativamente el polipéptido de interés en el espacio intersticial de un tejido que comprende la célula, por el cual el polinucleótido desnudo se capta hacia el interior de la célula y tiene un efecto fisiológico. Esto es particularmente aplicable para la transferencia in vitro pero puede aplicarse también in vivo.

Se describen composiciones para usar in vitro e in vivo que comprenden un polinucleótido "desnudo" en la solicitud PCT Núm. WO 90/11092 (Vical Inc.) y también en la solicitud PCT Núm. WO 95/11307 (Institut Pasteur, INSERM, Universidad de Ottawa), así como en los artículos de Tascon et al. (1996) y de Huygen et al. (1996).

En otro ejemplo más, la transferencia de un polinucleótido desnudo de la invención, incluyendo un constructo polinucleotídico descrito en la presente memoria, al interior de las células, puede realizarse con un bombardeo de partículas (biolística), siendo dichas partículas microproyectiles recubiertos de ADN acelerados hasta una velocidad elevada, que permite que perforen las membranas celulares y entren en las células sin destruirlas, tal como describen Klein et al. (1987),

En otro ejemplo, el polinucleótido de la invención puede ser atrapado en un liposoma (Ghosh y Bacchawat, 1991;Wong et al., 1980; Nicolau et al., 1987).

En un ejemplo específico, se describe una composición para la producción in vivo de una proteína o un polipéptido de LSR descrito en la presente memoria. Esta comprende un polinucleótido desnudo que codifica operativamente este polipéptido, en solución en un portador fisiológicamente aceptable, y adecuado para la introducción en un tejido para hacer que las células del tejido expresen dicha proteína o polipéptido.

La cantidad de vector a ser inyectada al organismo anfitrión deseado varía según el sitio de inyección. Como dosis indicativa, se inyectará entre 0,1 y 100 \mug del vector en un cuerpo animal, preferiblemente un cuerpo de mamífero, por ejemplo un cuerpo de ratón.

En otro ejemplo del vector, éste puede ser introducido in vitro en una célula anfitriona, preferiblemente en una célula anfitriona previamente recogida del animal a ser tratado y más preferiblemente una célula somática tal como una célula del músculo. En una etapa posterior, la célula que se ha transformado con el vector que codifica el polipéptido de LSR deseado o el fragmento deseado de los mismos se reintroduce en el cuerpo del animal para administrar la proteína recombinante dentro del cuerpo por vía local o sistémica.

Anfitriones celulares

También se describen en la presente memoria una célula anfitriona que ha sido transformada o transfectada con uno de los polinucleótidos descritos allí, y más precisamente un polinucleótido que comprende:

- un polinucleótido regulador o codificante del gen LSR; y

- al menos un marcador bialélico de la presente invención.

Se incluyen células anfitrionas que son transformadas (células procarióticas) o que son transfectadas (células eucarióticas) con un vector recombinante tal como uno de los descritos antes.

Generalmente, una célula anfitriona recombinante comprende uno cualquiera de los polinucleótidos o de los vectores recombinantes descritos que se describen en la presente memoria.

El marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A15, A17, y A21 o cualquiera de sus combinaciones, y sus complementos. En una realización adicional, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A'1 a A'20 y sus complementos.

Otro anfitrión celular recombinante se caracteriza porque su genoma o fondo genético (incluyendo cromosoma, plásmidos) está modificado por el ácido nucleico que codifica un polipéptido de LSR, preferiblemente una proteína LSR modificada que porta al menos una sustitución o deleción mostrada en los SEQ ID NO: 14, 16, y 18 o sus variantes o fragmentos.

Son células anfitrionas preferidas usadas como receptoras de vectores de expresión las siguientes:

a) Células anfitrionas procarióticas: cepas de Escherichia coli (esto es cepa DH5-\alpha), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y cepas de especies como Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.

b) Células anfitrionas eucariotas: células HeLa (ATCC Núm.CCL2; Núm.CCL2.1; Núm. CCL2.2), células Cv I(ATCC Núm. CCL70), células COS (ATCC Núm. CRL1650; Núm. CRL1651), células Sf-9 (ATCC Núm. CRL1711). células C127 (ATCC Núm. CRL-1804), 3T3 (ATCC Núm. CRL-6361), CHO (ATCC Núm. CCL-61), células 293 de riñón (ATCC Núm. 45504; Núm. CRL-1573) y BHK (ECACC Núm. 84100501; Núm. 84111301)

c) Otras células anfitrionas de mamífero:

: La expresión del gen LSR en mamíferos, y típicamente en ser humano, se puede volver defectuosa, o alternativamente puede proseguir con la inserción de una secuencia genómica o de ADNc de LSR con la sustitución de la contraparte del gen LSR en el genoma de una célula animal por un polinucleótido de LSR de acuerdo con la invención. Estas alteraciones genéticas se pueden generar mediante eventos de recombinación homóloga.

Un tipo de célula anfitriona que se puede usar son los zigotos de mamíferos, tales como los zigotos murinos. Por ejemplo, pueden someterse cigotos murinos a microinyección con una molécula de ADN de interés purificada, por ejemplo, una molécula de ADN purificada que se haya ajustado previamente a un intervalo de concentración de 1 ng/ml -para insertos de BAC- 3 ng/\mul -para insertos de bacteriófago P1 - en Tris-HCl 10 mM a pH 7,4, EDTA 250 \muM que contiene NaCl 100 mM, espermina 30 \muM y espermidina 70 \muM. Cuando el ADN a ser microinyectado tiene un tamaño grande, se pueden usar poliaminas y altas concentraciones de sal con el fin de evitar la rotura mecánica de este ADN, como describen Schedl et al (1993b).

Cualquiera de los polinucleótidos descritos puede ser introducido en una línea celular pluripotencial embrionaria (ES), preferiblemente una línea celular ES de ratón. Las líneas celulares ES se derivan de células pluripotentes, inmaduras, de la masa interior de la célula de los blastocitos de pre-implantación. Las líneas celulares ES preferidas son las siguientes: ES-E14TG2a (ATCC Núm. CRL-1821), ES-D3 (ATCC Núm. CRL1934 y Núm. CRL-11632), YS001 (ATCC Núm. CRL-11776), 36.5 (ATCC Núm. CRL-11116). Para mantener las células ES en un estado inmaduro, se cultivan en presencia de células alimentadoras de crecimiento inhibido que proporcionan las señales apropiadas para preservar este fenotipo embrionario y sirven como una matriz para la adherencia de las células ES. Son células alimentadoras preferidas los fibroblastos embrionarios primarios que se establecen a partir de tejidos de embriones del día 13 al día 14 de prácticamente cualquier cepa de ratón, que se mantienen en cultivo, como describen Abbondanzo et al. (1993) y su crecimiento es inhibido por irradiación, como describe Robertson (1987), o por la presencia de una concentración inhibidora de LIF, como describen Pease y Williams (1990).

Los constructos en las células anfitrionas pueden usarse de una forma convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante.

Después de la transformación de un anfitrión adecuado y el crecimiento del anfitrón hasta una densidad apropiada de células, el promotor seleccionado es inducido por medios apropiados, tales como subida de la temperatura o inducción química, y se cultivan las células durante un periodo adicional.

Las células se recogen típicamente por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se retiene para posterior purificación.

Las células microbianas empleadas en la expresión de las proteínas se pueden romper por cualquier método conveniente, incluyendo ciclo de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica, o el uso de agentes para lisado de las células.

Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Animales transgénicos

Los términos "animales transgénicos" o "animales anfitriones" se utilizan en la presente memoria para designar animales que tienen su genoma manipulado genéticamente y artificialmente con el fin de incluir uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Los animales preferidos son los mamíferos no humanos e incluyen aquellos que pertenecen a un género seleccionado entre Mus (p. ej. ratones), Rattus (p. ej. ratas) y Oryctogalus (p. ej. conejos) que tienen su genoma alterado artificialmente y genéticamente por la inserción de un ácido nucleico como se describe en la presente memoria.

Los animales transgénicos incluyen en una pluralidad de sus células una secuencia de ADN recombinante o sintético clonado, más específicamente uno de los ácidos nucleicos purificados o aislados que comprenden:

- una secuencia codificante de LSR, un polinucleótido regulador de LSR o una secuencia de ADN que codifica un polinucleótido antisentido como se describe en la presente memoria; y

- al menos un marcador bialélico como se describe en la presente memoria.

Un animal transgénico puede contener en sus células somáticas y/o en sus células de línea germinal un polinucleótido seleccionado del siguiente grupo de polinucleótidos:

Los animales transgénicos contienen de este modo secuencias específicas de material genético exógeno tales como las secuencias de nucleótidos descritas antes con detalle.

Estos animales transgénicos pueden ser buenos modelos experimentales para estudiar las diversas patologías relacionadas con la diferenciación celular, en particular las que tienen que ver con los animales transgénicos en cuyo genoma han sido insertadas una o varias copias de un polinucleótido que codifica una proteína LSR nativa y que comprenden al menos un marcador bialélico de la presente invención, o alternativamente una proteína LSR modificada que comprende al menos una sustitución o deleción descrita en la presente descripción.

Los animales transgénicos pueden expresar un polipéptido deseado de interés bajo el control de un polinucleótido regulador del gen LSR que comprende al menos un marcador bialélico de la presente invención, que conduce a buenos rendimientos en la síntesis de esta proteína de interés, y finalmente una expresión de esta proteína de interés específica del tejido.

El diseño de los animales transgénicos se puede realizar de acuerdo con los mecanismos convencionales bien conocidos por los expertos en la técnica. Para más detalles referentes a la producción de animales transgénicos, y específicamente de ratones transgénicos, se puede hacer referencia a las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.873.191, presentada el 10 de Oct., 1989, 5.464.764 presentada el 7 de Nov., 1995 y 5.789.215, presentada el 4 de Ag., 1998.

Los animales transgénicos son producidos por la aplicación de procedimientos que dan como resultado un animal con un genoma que tiene material genético exógeno incorporado. El procedimiento implica obtener el material genético, o una porción del mismo, que codifica un polinucleótido codificante de LSR, un polinucleótido regulador de LSR o una secuencia de ADN que codifica un polinucleótido antisentido de LSR tal como se describe en la presente memoria, comprendiendo dicho polinucleótido al menos un marcador bialélico como se describe en la presente memoria.

Se inserta un polinucleótido recombinante en una línea celular pluripotencial embrionaria o ES. La inserción se realiza preferiblemente utilizando la electroporación, tal como describen Thomas et al. (1987), Las células sometidas a electroporación se escrutan (p. ej. mediante selección por medio de marcadores seleccionables, mediante PCR o mediante análisis de transferencia Southern) para encontrar células positivas que tienen integrado el polinucleótido recombinante exógeno en su genoma, preferiblemente por medio de un evento de recombinación homóloga. Un método de selección positiva-negativa ilustrativo que se puede utilizar de acuerdo con la invención es descrito por Mansour et al. (1988).

Después, las células positivas son aisladas, clonadas e inyectadas en blastocistos de 3,5 días de edad de ratones, tal como describe Bradley (1987). Los blastocistos se insertan después en un animal anfitrión hembra y se deja que se desarrollen a término.

Alternativamente, las células ES positivas se ponen en contacto con embriones de 2,5 días de edad en fase de 8-16 células (mórula) tal como describen Wood et al. (1993) o Nagy et al. (1993), siendo internalizadas las células ES para colonizar extensamente el blastocisto que incluye las células que darán lugar a la línea germinal:

La descendencia del anfitrión hembra se somete a ensayo para determinar cuáles animales son transgénicos, p. ej. incluyen la secuencia de ADN exógena insertada y cuáles son de tipo salvaje.

Líneas celulares recombinantes derivadas de los animales transgénicos de la invención

Se pueden obtener células anfitrionas recombinantes de un animal transgénico descrito en la presente memoria.

Las líneas celulares recombinantes pueden ser establecidas in vitro a partir de células obtenidas de cualquier tejido de un animal transgénico como se describe en la presente memoria, por ejemplo mediante transfección de cultivos de células primarias con vectores que expresan genes onc tales como el antígeno T grande de SV40, como describen Chou (1989) y Shay et al. (1991),

Método para producir un polipéptido de LSR modificado

Actualmente es fácil producir proteínas en grandes cantidades mediante técnicas de ingeniería genética por medio de vectores de expresión tales como plásmidos, fagos o fagémidos. El polinucleótido que codifica una proteína LSR modificada o uno de sus fragmentos o variantes que comprende al menos una sustitución o deleción mostrada en los SEQ ID NO: 14, 16, y 18 es insertado en un vector de expresión apropiado con el fin de producir el polipéptido de interés in vitro.

De este modo, se describe en la presente memoria un método para producir una proteína LSR modificada o uno de sus fragmentos o variantes que comprende al menos una sustitución o deleción mostrada en los SEQ ID NO: 14, 16, y 18, donde dicho método comprende las etapas de:

a) cultivar, en un medio de cultivo apropiado, una célula anfitriona previamente transformada o transfectada con el vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína LSR modificada;

b) recoger el medio de cultivo acondicionado de este modo o lisar el anfitrión celular, por ejemplo mediante sonicación o mediante choque osmótico;

c) separar o purificar, a partir de dicho medio de cultivo, o a partir del sedimento del producto lisado de células anfitrionas resultante el polipéptido de interés recogido de este modo.

d) Opcionalmente caracterizar el polipéptido de interés producido.

En un ejemplo específico del método anterior, la etapa a) está precedida por una etapa en la que el ácido nucleico que codifica la proteína LSR modificada es insertado en un vector apropiado, opcionalmente después de una escisión apropiada de este ácido nucleico amplificado con una o varias endonucleasas de restricción. El ácido nucleico que codifica la proteína LSR modificada puede ser seleccionado de un grupo que consiste en los SEQ ID NO: 1, 13, 15 y 17 o uno de sus fragmentos y comprende al menos uno de los marcadores bialélicos A1 a A32. El ácido nucleico que codifica una proteína LSR modificada puede ser el producto resultante de una reacción de amplificación utilizando un par de cebadores de acuerdo con la invención (por SDA, TAS, 3SR NASBA, TMA etc.).

Los polipéptidos pueden ser caracterizados por medio de unión sobre una columna de cromatografía de inmunoafinidad sobre la cual se han inmovilizado previamente anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos a un polipéptido de LSR que comprende una sustitución o una deleción mostrada en los SEQ ID NO: 14, 16, y 18.

Los polipéptidos o péptidos obtenidos de este modo pueden ser purificados, por ejemplo mediante cromatografía de líquidos de alta resolución, tal como una HPLC de fase reversa y/o intercambio catiónico, como describen Rougeot et al. (1994). La razón para preferir esta clase de purificación de péptidos o proteínas es la carencia de subproductos encontrados en las muestras de elución que hace la proteína o péptido purificado resultante más adecuado para un uso terapéutico.

La purificación de las proteínas o péptidos recombinantes también se puede llevar a cabo mediante el paso por una columna de cromatografía de afinidad de Níquel o Cobre. La columna de cromatografía de Níquel puede contener resina Ni-NTA (Porath et al., 1975).

En un primer ejemplo específico, los polipéptidos derivados de una proteína LSR modificada y que comprende al menos una sustitución o deleción descrita en la presente descripción se utilizan para preparar anticuerpos policlonales o monoclonales para la proteína LSR modificada. En un ejemplo preferido, los polipéptidos se unen preferiblemente covalentemente o no covalentemente a una molécula portadora, tal como albúmina de suero humana o bovina (HSA o BSA).

En un segundo ejemplo específico, un polipéptido puede consistir en una molécula de fusión entre, por un lado, una proteína LSR modificada o uno de sus fragmentos o variantes, y por otro lado, una MBP (Proteína de Unión a Maltosa) y GST (Glutatión S Transferasa) o con una etiqueta tal como una etiqueta Strep, una etiqueta Bio y una etiqueta epitópica del péptido flag.

La proteína LSR modificada o uno de sus fragmentos o variantes puede ser expresada en exceso y purificada en un sistema bacteriano tal como E. coli como describen Kiefer et al. (1996) y Tucker et al. (1996), incorporada en la presente memoria como referencia. La proteína LSR modificada, o uno de sus fragmentos o variantes, que codifica la secuencia puede ser fusionada en su extremo N con GST (Glutatión S Transferasa) o MBP (Proteína de Unión a Maltosa) y en su extremo C con una etiqueta de poli-histidina, una etiqueta Bio o una etiqueta Strep para facilitar la purificación de la proteína expresada. La etiqueta Bio tiene 13 restos aminoácido de longitud, es biotinilada in vivo en E. coli, y por lo tanto se unirá tanto a avidina como a estreptavidina. la etiqueta Strep tiene 9 restos aminoácido de longitud y se une específicamente a estreptavidina, pero no a avidina. Luego, se puede llevar a cabo una etapa de purificación por afinidad basada en la interacción de una cola de poli-histidina con iones metálicos inmovilizados, de una etiqueta Bio biotinilada con avidina monomérica, de la etiqueta Strep con estreptavidina, del segmento GST con la glutatión, o del segmento MBP con maltosa. Eventualmente se puede insertar tiorredoxina entre el extremo C del receptor y la etiqueta y se podría incrementar el nivel de expresión. Se purifica por cromatografía de afinidad. Después se puede separar el segmento MBP, GST o etiqueta.

Anticuerpos que se Unen a Polipéptidos de LSR

Se puede utilizar cualquier polipéptido de LSR o proteína completa para generar anticuerpos capaces de unirse específicamente a proteínas LSR o sus fragmentos como se ha descrito. Las composiciones de anticuerpo descritas en la presente memoria son capaces de unirse específicamente o se unen específicamente a las variantes 363-Ser, 363-Asp, 420-Pro, 420-Arg, 519-Arg, o 519-Del del SEQ ID NO: 14; las variantes 344-Ser, 344-Asp, 401-Pro, 401-Arg, 500-Arg, o 500-Del del SEQ ID NO: 16; o las variantes 295-Ser, 295-Asp, 352-Pro, 352-Arg, 451-Arg, o 451-Del del SEQ ID NO: 18 para la proteína LSR. Con el fin de que una composición de anticuerpo se una específicamente a una variante concreta de LSR ésta debe demostrar al menos una afinidad de unión de 5% o 10%, preferiblemente al menos 15%, o 20%, más preferiblemente al menos 25%, 50%, o 100% mayor para la proteína completa de esa variante concreta de LSR que para la proteína LSR completa con la inserción o deleción del aminoácido alternativo en la posición del aminoácido nombrada en la variante. Semejante afinidad de unión puede ser medida mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo ELISA, RIA, u otros análisis de unión basados en anticuerpos.

En un ejemplo preferido las composiciones de anticuerpos son capaces de unirse selectivamente, o se unen selectivamente a un fragmento que contiene un epítopo de un polipéptido que comprende un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, o 100 aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 14, 16, y 18, donde dicho epítopo comprende uno de los siguientes: un resto serina en la posición 363 del SEQ ID NO: 14; un resto asparagina en la posición 363 del SEQ ID NO: 14; un resto prolina en la posición 420 del SEQ ID NO: 14; un resto arginina en la posición 420 del SEQ ID NO: 14; un resto arginina en la posición 519 del SEQ ID NO: 14; una deleción de un aminoácido en la posición 519 del SEQ ID NO: 14; un resto serina en la posición 344 del SEQ ID NO: 16; un resto asparagina en la posición 344 del SEQ ID NO: 16; un resto prolina en la posición 401 del SEQ ID NO: 16; un resto arginina en la posición 401 del SEQ ID NO: 16; un resto arginina en la posición 500 del SEQ ID NO: 16; una deleción de un aminoácido en la posición 500 del SEQ ID NO: 16; un resto serina en la posición 295 del SEQ ID NO: 18; un resto asparagina en la posición 295 del SEQ ID NO: 18; un resto prolina en la posición 352 del SEQ ID NO: 18; un resto arginina en la posición 352 del SEQ ID NO: 18; un resto arginina en la posición 451 del SEQ ID NO: 18; y una deleción de un aminoácido en la posición 451 del SEQ ID NO: 18; Opcionalmente, donde dicha composición de anticuerpo es policlonal o
monoclonal.

Asimismo se contempla el uso de polipéptidos que comprenden un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente al menos 12, 15, 20, 25, 50, o 100 aminoácidos de un polipéptido de LSR en la fabricación de anticuerpos, donde dicho tramo contiguo comprende uno de los siguientes: un resto serina en la posición 363 del SEQ ID NO: 14; un resto asparagina en la posición 363 del SEQ ID NO: 14; un resto prolina en la posición 420 del SEQ ID NO: 14; un resto arginina en la posición 420 del SEQ ID NO: 14; un resto arginina en la posición 519 del SEQ ID NO: 14; una deleción de un aminoácido en la posición 519 del SEQ ID NO: 14; un resto serina en la posición 344 del SEQ ID NO: 16; un resto asparagina en la posición 344 del SEQ ID NO: 16; un resto prolina en la posición 401 del SEQ ID NO: 16; un resto arginina en la posición 401 del SEQ ID NO: 16; un resto arginina en la posición 500 del SEQ ID NO: 16; una deleción de un aminoácido en la posición 500 del SEQ ID NO: 16; un resto serina en la posición 295 del SEQ ID NO: 18; un resto asparagina en la posición 295 del SEQ ID NO: 18; un resto prolina en la posición 352 del SEQ ID NO: 18; un resto arginina en la posición 352 del SEQ ID NO: 18; un resto arginina en la posición 451 del SEQ ID NO: 18; y una deleción de un aminoácido en la posición 451 del SEQ ID NO: 18. En un ejemplo preferido tales polipéptidos son útiles en la fabricación de anticuerpos para detectar la presencia y ausencia de los diversos polipéptidos variantes de LSR descritos en la presente memoria.

Son particularmente útiles para preparar anticuerpos los animales o mamíferos no humanos, de tipo salvaje o transgénicos, que expresan una especie diferente de LSR de aquella a la que se desea unir el anticuerpo, y los animales que no expresan LSR (es decir, un animal con el gen LSR inactivado como se describe en la presente memoria). Los animales con el gen LSR inactivado reconocerán todas o la mayoría de las regiones expuestas de LSR como antígenos foráneos, y por lo tanto producirán anticuerpos con una mayor gama de epítopos de LSR. Además, los polipéptidos más pequeños con sólo 10 a 30 aminoácidos pueden ser útiles para obtener una unión específica a las variantes de LSR de la invención. Además, el sistema inmunitario humoral de los animales que producen una especie de LSR que se parece a la secuencia antigénica preferiblemente reconocerá las diferencias entre las especies de LSR nativo del animal y la secuencia antigénica, y producirá anticuerpos contra esos sitios únicos en la secuencia antigénica. Semejante técnica será particularmente útil en la obtención de anticuerpos que se unen específicamente a las variantes de LSR.

Los anticuerpos se pueden preparar a partir de hibridomas de acuerdo con la técnica descrita por Kohler y Milstein en 1975. Los anticuerpos policlonales se pueden preparar mediante inmunización de un mamífero, especialmente un ratón o un conejo, con un polipéptido de acuerdo con la invención que está combinado con un coadyuvante de inmunidad, y después mediante purificación de los anticuerpos específicos contenidos en el suero del animal inmunizado sobre una columna de cromatografía de afinidad sobre la cual se ha inmovilizado previamente el polipéptido que ha sido utilizado como antígeno.

Asimismo se describen anticuerpos dirigidos contra una proteína LSR modificada o uno de sus fragmentos o variantes, que porta al menos una sustitución o deleción como se describe en la presente memoria. En un ejemplo concreto, dichos anticuerpos son capaces de discriminar entre una proteína LSR nativa y una modificada. Opcionalmente, los anticuerpos son producidos por la técnica del trioma y por el hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983).

Asimismo se describen fragmentos de anticuerpos Fv de cadena sencilla quiméricos (Patente de los Estados Unidos Núm. 4.946.778; Martineau et al., 1998), fragmentos de anticuerpos obtenidos por medio de genotecas de presentación en fagos (Ridder et al., 1995) y anticuerpos humanizados (Reinmann et al., 1997; Leger et al., 1997). Asimismo se pueden utilizar ratones transgénicos, u otros organismos tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos, incluyendo por ejemplo, anticuerpos humanizados dirigidos contra una proteína LSR modificada o uno de sus fragmentos o variantes, que porta al menos una sustitución o deleción como se describe en la presente memoria.

Las preparaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo con cualquier protocolo son útiles en inmunoensayos cuantitativos que determinan concentraciones de sustancias que llevan antígenos en muestras biológicas; también se usan semi-cuantitativamente o cualitativamente para identificar la presencia de un antígeno en una muestra biológica. Los anticuerpos también pueden usarse en composiciones terapéuticas para destruir células que expresan la proteína o para reducir los niveles de la proteína en el cuerpo.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden ser marcados, por medio de una marca radiactiva, fluorescente o enzimática.

Por consiguiente, también se describe un método para detectar específicamente la presencia de un polipéptido LSR modificado descrito en la presente memoria en una muestra biología, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:

a) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo policlonal o monoclonal dirigido contra una proteínas LSR modificada o uno de sus fragmentos o variantes, que porta al menos una sustitución o deleción como se describe en la presente memoria.

b) detectar el complejo antígeno-anticuerpo formado.

Asimismo se describe un kit diagnóstico para detectar in vitro la presencia de un polipéptido LSR modificado descrito en la presente memoria en una muestra biológica, donde dicho kit comprende:

a) un anticuerpo policlonal o monoclonal dirigido contra una proteína LSR modificada o uno de sus fragmentos o variantes, que porta al menos una sustitución o deleción como se describe en la presente memoria, opcionalmente marcado;

b) un reactivo que permite la detección de los complejos antígeno-anticuerpo formados, portando opcionalmente dicho reactivo una marca, o pudiendo reconocerse a sí mismo mediante un reactivo marcado, más particularmente en el caso en el que el anticuerpo monoclonal o policlonal mencionado anteriormente no está marcado por sí mismo.

Polinucleótido para su uso en una estrategia antisentido

En la presente memoria se describe una composición terapéutica que comprende ventajosamente un fragmento oligonucleotídico de la secuencia de ácido nucleico de LSR que comprende un alelo de al menos uno de los marcadores bialélicos A2, A15, A16, A17, A21, A23, A24, A26, y A31 como herramienta antisentido que inhibe la expresión del gen LSR que tiene el correspondiente alelo. Los métodos preferidos que utilizan polinucleótidos antisentido de acuerdo con la presente invención son los procedimientos descritos por Sczakiel et al. (1995),

Los polinucleótidos antisentido preferidos son complementarios a una secuencia de los ARNm de LSR que contiene el codón de inicio de la traducción ATG o un sitio donador o aceptor de empalme.

Los ácidos nucleicos antisentido deben tener una longitud y una temperatura de fusión suficientes para permitir la formación de un dúplex intracelular que tenga suficiente estabilidad para inhibir la expresión del ARNm de LSR en el dúplex. Las estrategias para diseñar ácidos nucleicos antisentido adecuados para su uso en la terapia génica son descritos por Green et al., (1986) e Izant y Weintraub, (1984).

En algunas estrategias, las moléculas antisentido se obtienen invirtiendo la orientación de la región codificante de LSR con respecto a un promotor con el fin de transcribir la cadena opuesta a la que se transcribe normalmente en la célula. Las moléculas antisentido se pueden transcribir utilizando sistemas de transcripción in vitro tales como los que emplean la polimerasa de T7 o SP6 para generar el transcrito. Otro enfoque implica la transcripción de los ácidos nucleicos antisentido de LSR in vivo conectando operablemente el ADN que contiene la secuencia antisentido a un promotor en un vector de expresión adecuado.

Alternativamente, las estrategias antisentido adecuadas son aquellas descritas por Rossi et al. (1991), en las Solicitudes Internacionales Núms. WO 94/23026, WO 95/04141, WO 92/18522 y en la Solicitud de Patente Europea Núm. EP 0 572 287 A2.

Una alternativa a la tecnología antisentido consiste en utilizar ribozimas que se unirán a una secuencia diana por medio de su cola de polinucleótidos complementaria y que escindirá el ARN correspondiente hidrolizando su sitio diana (esto es "ribozimas cabeza de martillo"). En resumen, el ciclo simplificado de una ribozima cabeza de martillo consiste en (1) unión específica de la secuencia al ARN diana por medio de secuencias antisentido complementarias; (2) hidrólisis específica del sitio del motivo escindible de la cadena diana; y (3) liberación de los productos de escisión, que da lugar a otro ciclo catalítico. En efecto, el uso de polinucleótidos antisentido de cadena larga (al menos 30 bases de longitud) o ribozimas con largos brazos antisentido es ventajoso. Un sistema de liberación preferido para las ribozimas antisentido se logra uniendo covalentemente estas ribozimas antisentido a grupos lipófilos o utilizar liposomas como vector conveniente. Las ribozimas antisentido se preparan como describen Sczakiel et al. (1995),

Ejemplos Ejemplo 1 Identificación de Marcadores bialélicos: Extracción de ADN

Los donantes no estaban relacionados y estaban sanos. Presentaban una diversidad suficiente como para ser representativa de una población francesa heterogénea. Se extrajo el ADN de 100 individuos y se sometió a ensayo para la detección de los marcadores bialélicos.

Se tomaron 30 mL de sangre venosa periférica de cada donante en presencia de EDTA. Las células se recogieron (sedimento) después de centrifugar durante 10 minutos a 2000 rpm. Los glóbulos rojos se lisaron mediante una solución de lisis (volumen final 50 mL: Tris 10 mM pH 7,6; MgCl_{2} 5 mM NaCl 10 mM). La solución se centrifugó (10 minutos, 2000 rpm) tantas veces como fue necesario para eliminar los glóbulos rojos residuales presentes en el sobrenadante, tras la resuspensión del sedimento en la solución de lisis.

El sedimento de los glóbulos blancos se lisó durante la noche a 42ºC con 3,7 ml de solución de lisis compuesta por:

- 3 ml TE 10-2 (Tris-HCl 10 mM, EDTA 2 mM)/NaCl 0,4 M

- 200 \muL al SDS 10%

- 500 \muL proteinasa K (2 mg proteinasa K en TE 10-2/NaCl 0,4 M).

Para la extracción de las proteínas, se añadió 1 mL de NaCl saturado (6M) (1/3,5 v/v). Tras una agitación vigorosa, la solución se centrifugó durante 20 minutos a 10.000 rpm.

Para la precipitación del ADN, se añadieron de 2 a 3 volúmenes de etanol del 100% al sobrenadante anterior, y la solución se centrifugó durante 30 minutos a 2000 rpm. La solución de ADN se enjuagó tres veces con etanol del 70% para eliminar las sales, y se centrifugó durante 20 minutos a 2000 rpm. El sedimento se secó a 37ºC, y se resuspendió en 1 ml de TE 10-1 o 1 mL de agua. La concentración de ADN se evaluó midiendo la DO a 260 nm (1 unidad DO = 50 \mug/mL ADN).

Para determinar la presencia de proteínas en la solución de ADN, se determinó la razón DO 260/DO 280. Solamente se utilizaron las preparaciones de ADN que tenían una razón DO 260/DO 280 entre 1,8 y 2 en los siguientes ejemplos descritos más abajo.

La reserva se constituyó mezclando cantidades equivalentes de ADN de cada individuo.

Ejemplo 2 Identificación de Marcadores bialélicos: Amplificación de ADN Genómico Mediante PCR

La amplificación de secuencias genómicas específicas de las muestras de ADN del ejemplo 1 se llevó a cabo en la reserva de ADN obtenida previamente. Además, se amplificaron de un modo similar muestras de 50 individuos.

Los análisis de PCR se realizaron utilizando el siguiente protocolo:

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Cada par de los primeros cebadores se diseñó utilizando la información de la secuencia del gen LSR descrito en la presente memoria y el soporte lógico OSP (Hillier & Green, 1991). Este primer par de cebadores tenía aproximadamente 20 nucleótidos de longitud y tenía las secuencias descritas en la Tabla 1 en las columnas marcadas como PU y RP.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

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Preferiblemente, los cebadores contenían una cola oligonucleotídica común aguas arriba de las bases específicadas elegidas como diana para la amplificación que era útil para la secuenciación.

Los cebadores PU contienen la siguiente secuencia PU 5' adicional: TGTAAAACGACGGCCAGT; los cebadores RP contienen las siguiente secuencia RP 5' adicional: CAGGAAACAGCTATGACC. El cebador que contiene la secuencia RP 5' adicional se enumera en el SEQ ID NO 19. El cebador que contiene la secuencia RP 5' adicional se enumera en el SEQ ID NO 20.

La síntesis de estos cebadores se realizó siguiendo el método de la fosforamidita, en un sintetizador GENSET UFPS 24.1.

La amplificación del ADN se realizó en un termociclador Genius II. Después de calentar a 95ºC durante 10 min, se realizaron 40 ciclos. Cada ciclo comprendía: 30 seg a 95ºC, 54ºC durante 1 min, y 30 seg a 72ºC. Para la prolongación final, 10 min a 72ºC finalizaron la amplificación. Las cantidades de los productos de amplificación obtenidos se determinaron en placas de microtitulación de 96 pocillos, utilizando un fluorómetro y Picogreen como agente intercalador (Molecular Probes).

Ejemplo 3 Identificación de Marcadores bialélicos: Secuenciación de ADN Genómico Amplificado e Identificación de polimorfismos

La secuenciación del ADN amplificado obtenido en el Ejemplo 2 se llevó a cabo en secuenciadores ABI 377. Las secuencias de los productos de amplificación se determinaron utilizando reacciones con el terminador didesoxi automatizado con un protocolo de secuenciación cíclica con terminadores coloreados. Los productos de las reacciones de secuenciación se hicieron pasar sobre geles de secuenciación y las secuencias se determinaron utilizando el análisis de imágenes del gel (soporte lógico ABI Prism DNA Sequencing Analysis (versión 2.1.2) y el lector automatizado de nucleótidos del "Diagrama" mencionado antes).

Los datos de la secuencia se evaluaron adicionalmente utilizando el soporte lógico para el análisis de polimorfismos mencionado antes diseñado para detectar la presencia de marcadores bialélicos entre los fragmentos amplificados reunidos. La búsqueda de polimorfismos se basó en la presencia de picos superpuestos en el patrón de electroforesis resultante de diferentes bases que aparecían en la misma posición como se ha descrito antes.

Se analizaron los 53 fragmentos de amplificación. En estos 53 fragmentos, se detectaron 31 marcadores bialélicos. La localización de estos marcadores bialélicos es la que se muestra en la Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

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Ejemplo 4 Validación de los Polimorfismos Por Medio de Microsecuenciación

Los marcadores bialélicos identificados en el ejemplo 3 fueron confirmados adicionalmente y sus respectivas frecuencias fueron determinadas por medio de microsecuenciación. La microsecuenciación se llevó a cabo para cada muestra de ADN individual descrita en el Ejemplo 1.

La amplificación del ADN genómico de las individuos se realizó mediante PCR como se ha descrito antes para la detección de los marcadores bialélicos con el mismo grupo de cebadores de PCR (Tabla 1).

Los cebadores preferidos utilizados en la microsecuenciación tenían aproximadamente 19 nucleótidos de longitud e hibridaron inmediatamente aguas arriba de la base polimórfica considerada. De acuerdo con la descripción, los cebadores utilizados en la microsecuenciación se detallan en la Tabla 3.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

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33

Mis 1 y Mis 2 hacen referencia respectivamente a cebadores de microsecuenciación que hibridaban con la cadena no codificante el gen LSR o con la cadena codificante del gen LSR.

Se ha desarrollado un cebador de microsecuenciación concreto, esto es E24, para el marcador bialélico A24. En efecto, como este polimorfismo corresponde a una deleción de tres nucleótidos AGG, el análisis de microsecuenciación necesita ser adaptado. La variante por deleción se detecta como sigue.

Los genotipos esperados se representan en diagramas como se muestra más abajo con la secuencia proximal del marcador bialélico A24.

En un alelo del marcador bialélico A24, el trinucleótido AGG está presente y está en negrita. Los nucleótidos subrayados corresponden a las posibles posiciones de nucleótidos detectadas por el análisis de microsecuenciación.

1000

En el otro alelo del marcador bialélico A24, el trinucleótido AGG está suprimido.

1001

El polinucleótido "Cr" está comprendido en el SEQ ID NO 1. Comienza en la posición 20573 y termina en la posición 20618. Los polinucleótidos Cr1 y Cr2 comprenden respectivamente el alelo 1 y el alelo 2 del marcador bialélico A24 (véase la Tabla 2). Los polinucleótidos W1 y W2 tienen respectivamente la secuencia complementaria del polinucleótido Cr1 y Cr2. Los polinucleótidos MIS1 y MIS2 corresponden al cebador de microsecuenciación E23 con un nucleótido T (MIS1) o un nucleótido C en su extremo 5' (MIS2).

Este análisis de microsecuenciación detecta directamente una "C" o una "T". La incorporación de "T" en la dirección inversa se corresponde con una "A" en la dirección directa que representa el alelo que comprende el trinucleótido AGG mientras la incorporación de una "C" se traduce a una "G" en la cadena directa y da positivo en el ensayo para el alelo que tiene la deleción del trinucleótido AGG.

La reacción de microsecuenciación se realizó como sigue:

La reacción de microsecuenciación se realizó como sigue: se añadieron 5 \mul de productos de PCR a 5 \mul de mezcla de purificación (2U SAP (fosfato alcalino Shrimp) (Amersham E70092X)); 2U de Exonucleasa I (Amersham E70073Z); y 1 \mul de tampón SAP (Tris-HCl 200 mM pH 8, MgCl_{2} 100 mM) a una placa de microtitulación. La mezcla de reacción se incubó 30 minutos a 37ºC, y se desnaturalizó 10 minutos a 94ºC después de eso. Después se añadieron a cada pocillo 20 \mul de mezcla de reacción de microsecuenciación que contenía: 10 pmoles de oligonucleótido de microsecuenciación (nucleótidos de 19 unidades, GENSET, síntesis bruta, 5 DO), 1 U de Termosequenase (Amersham E79000G), 1,25 \mul de tampón para Thermosequenase (Tris HCl 260 mM pH 9,5, MgCl_{2} 65 mM), y los dos ddNTP fluorescentes apropiados complementarios a los nucleótidos en el sitio polimórfico correspondiente a ambas bases polimórficas (TAMRA-ddTTP 11,25 nM; ROX-ddCTP 16,25 nM; REG-ddATP 1,675 nM; RHO-ddGTP 1,25 nM; Perkin Elmer, Dye Terminator Set 401095). Después de 4 minutos a 94ºC, se llevaron a cabo 20 ciclos de PCR de 15 seg a 55ºC, 5 seg a 72ºC, y 10 seg a 94ºC en un termociclador Tetrad PCTC-225 (MJ Research). Los terminadores coloreados no incorporados se separaron después mediante precipitación con etanol. Las muestras se resuspendieron finalmente en tampón de carga de formamida-EDTA y se calentaron durante 2 min a 95ºC antes de ser cargados en un gel de secuenciación de poliacrilamida. Los datos se recogieron por medio de un secuenciador de ADN ABI PRISM 377 y se procesaron usando el soporte lógico GENESCAN (Perkin Elmer).

Tras el análisis en gel, los datos se procesaron automáticamente con un soporte lógico que permite la determinación de los alelos de los marcadores bialélicos presentes en cada fragmento amplificado.

El soporte lógico evalúa factores tales como si las intensidades de las señales resultantes de los procedimientos de microsecuenciación anteriores son débiles, normales, o saturadas, o si las señales son ambiguas. Además, el soporte lógico identifica los picos significativos (de acuerdo con los criterios de forma y altura). Entre los picos significativos, los picos correspondientes al sitio elegido como diana se identifican basándose en su posición. Cuando se detectan dos picos significativos para la misma posición, cada muestra se clasifica como de tipo homocigoto o heterocigoto basándose en la proporción de la altura.

Ejemplo 5 Preparación de Composiciones de Anticuerpo para Variantes de LSR

Se aísla la proteína o el polipéptido sustancialmente puros de células transfectadas o transformadas que contienen un vector de expresión que codifica la proteína LSR o una de sus porciones. La concentración de proteína en la preparación final se ajusta, por ejemplo por concentración en un dispositivo de filtro Amicon, hasta el nivel de unos pocos microgramos/mL. Después se puede preparar el anticuerpo monoclonal o policlonal para la proteína como sigue:

A. Producción de un Anticuerpo Monoclonal mediante Fusión con un Hibridoma

El anticuerpo monoclonal para los epítopos de la proteína LSR o una de sus porciones se puede preparar a partir de hibridomas murinos de acuerdo con el método clásico de Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256:495 (1975) o métodos derivados del mismo. Véase también Harlow, E., y D. Lane. 1988. Antibodies A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, págs. 53-242.

En resumen, se inocula repetidamente un ratón con unos pocos microgramos de proteína LSR o una de sus porciones a lo largo de un período de unas pocas semanas. Después el ratón se sacrifica, y las células productoras del anticuerpo del bazo se aíslan. Las células del bazo se fusionan por medio de polietilenglicol con células de mieloma de ratón, y las células no fusionadas en exceso se destruyen mediante crecimiento del sistema en medio selectivo que comprende aminopterina (medio HAT). Las células fusionadas con éxito se diluyen y las alícuotas de la dilución se colocan en pocillos de una placa de microtitulación donde continúa el crecimiento del cultivo. Los clones productores de anticuerpos se identifican mediante detección de anticuerpo en el fluido sobrenadante de los pocillos mediante procedimientos de inmunoanálisis, tales como ELISA, como describen originalmente Engvall, E., Meth. Enzymol. 70:419 (1980), y métodos derivados del mismo. Los clones positivos seleccionados se pueden expandir y su anticuerpo monoclonal producto se puede cosechar para su uso. Los procedimientos detallados para la producción de anticuerpos monoclonales son descritos por Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, Nueva York. Sección 21-2.

B. Producción de un Anticuerpo Policlonal mediante Inmunización

Se puede preparar antisuero policlonal que contiene anticuerpos para epítopos heterogéneos en la proteína LSR o una de sus porciones inmunizando un animal no humano adecuado con la proteína LSR o una porción de la misma, que puede estar no modificada o modificada para potenciar la inmunogenicidad. Un animal no humano adecuado es preferiblemente un mamífero no humano seleccionado normalmente entre un ratón, una rata, un conejo, una cabra, o un caballo. Alternativamente, se puede utilizar una preparación bruta que ha sido enriquecida en concentración de LSR para generar anticuerpos. Tales proteínas, fragmentos o preparaciones se introducen en el mamífero no humano en presencia de un coadyuvante apropiado (p. ej. hidróxido de aluminio, RIBI, etc.) que es conocido en la técnica. Además la proteína, fragmento o preparación pueden ser tratados previamente con un agente que incrementará la antigenicidad, tales agentes son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, albúmina de suero bovina metilada (mBSA), albúmina de suero bovina (BSA), antígeno de superficie de la Hepatitis B, y hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH). El suero del animal inmunizado se recoge, se trata y se somete a ensayo de acuerdo con los procedimientos conocidos. Si el suero contiene anticuerpos policlonales para epítopos no deseados, se pueden purificar los anticuerpos policlonales mediante cromatografía de inmunoafinidad.

La producción eficaz de anticuerpos policlonales es afectada por muchos factores relacionados tanto con el antígeno como con la especie de anfitrión. Asimismo, los animales anfitriones varían la respuesta al sitio de inoculación y a la dosis, dando como resultado las dosis inadecuadas o excesivas de antígeno los antisueros con un título bajo. Las dosis pequeñas (nivel de ng) de antígeno administradas en múltiples sitios intradérmicos parecen ser las más fiables. Los mecanismos para producir y procesar antisueros policlonales son conocidos en la técnica, véase por ejemplo, Mayer y Walker (1987). Se puede encontrar un protocolo de inmunización eficaz para conejos en Vaitukaitis, J. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab 33:988-991 (1971).

Se pueden administrar inyecciones de refuerzo a intervalos regulares, y recoger el antisuero cuando el título de anticuerpo del mismo, determinado semi-cuantitativamente, por ejemplo, mediante doble inmunodifusión en agar frente a concentraciones conocidas del antígeno, comienza a caer. Véase, por ejemplo, Ouchterlony, O. et al., Cap. 19 en: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell (1973). La concentración de anticuerpo en la meseta está normalmente en el intervalo de 0,1 a 0,2 mg/ml de suero (aproximadamente 12 \muM). La afinidad de los antisueros por el antígeno se determina preparando curvas de unión competitiva, como describen por ejemplo, Fisher, D., Cap. 42 en: Manual of Clinical Immunology, 2ª Ed. (Rose y Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980).

Las preparaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo con cualquier protocolo monoclonal o policlonal son útiles en inmunoanálisis cuantitativos que determinan concentraciones de sustancias que llevan antígenos en muestras biológicas; también se usan semi-cuantitativamente o cualitativamente para identificar la presencia de un antígeno en una muestra biológica. Los anticuerpos también pueden usarse en composiciones terapéuticas para destruir células que expresan la proteína o para reducir los niveles de la proteína en el cuerpo.

Ejemplo 6 Asociación de un Polimorfismo de LSR Frecuente con TG en Plasma elevados en Adolescentes Obesos

Se determinó la asociación de SNP seleccionados con los valores clínicos relacionados con trastornos metabólicos. Este ejemplo y los siguientes son meramente ilustrativos y no indican que no haya otras asociaciones significativas entre marcadores, valores clínicos, y enfermedad metabólica. Sin embargo, proporcionan ejemplos de métodos útiles para identificar asociaciones significativas útiles en diagnósticos, medicina preventiva, y farmacogenómica.

1. Selección de Marcadores

Se seleccionaron cinco marcadores basándose en los siguientes tres criterios: 1) cobertura equidistante del gen LSR; 2) en los genes USF2 y LIPE; y 3) frecuencia del alelo >10 %. Que los SNP den como resultado un cambio de un aminoácido en la proteína LSR no es un criterio; muchos marcadores intrónicos también pueden modular la función génica afectando a la estabilidad del ARNm, la tasa de empalme o la producción de variantes de corte y empalme. Las posiciones de los cinco marcadores se indican mediante recuadros abiertos en la Fig. 2B. Los marcadores 1, 2, y 3 son A15, A17, y A21, respectivamente. Tres de los marcadores están localizados en el gen LSR (marcadores 1-3). Los marcadores núm. 1 y núm. 3 están dentro de las regiones codificantes. El polimorfismo en el sitio del marcador núm. 1 no se traduce en una variación en el nivel de proteína (Val \rightarrow Val). El marcador núm. 3 causa la sustitución Ser \rightarrow Asn en el dominio extracelular del receptor que contiene el supuesto sitio de unión a la lipoproteína. El marcador núm. 2 está localizado en el intrón 3, 137 pb aguas arriba del sitio de corte empalme que genera las diferentes isoformas de LSR. Los marcadores núm. 4 y núm. 5 se encontraron en los intrones del gen USF2 gene y el gen LIPE, respectivamente. Las localizaciones relativas de USF2 y LIPE con respecto a LSR se muestran en la Fig 2A.

Como control, se seleccionaron 18 marcadores al azar distribuidos en diversas regiones genómicas. La localización cromosómica, la frecuencia del alelo, y el ensayo de equilibrio de Hardy-Weinberg de esos marcadores se proporcionan en la Tabla 4. Todos los marcadores utilizados en estos estudios estaban en equilibrio de Hardy-Weinberg (Tabla 4). El control de calidad utilizando sitios polimórficos conocidos insertados en cada placa de genotipificación se realizó sistemáticamente; los resultados indicaron una exactitud de > 98%. La lectura automática del genotipo en los 23 SNO diferentes utilizados para este estudio condujo a una genotipificación inequívoca en un 96,7% de los casos. Los genotipos inequívocos no se consideraron para el análisis. El porcentaje de genotipificación ambigua existente para cada marcador se da en la Tabla 4, que comienza en la siguiente página.

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2. Selección de Sujetos

Los sujetos participantes en el estudio fueron 161 niñas Caucásicas no relacionadas que vivían en la región de Paris. Niñas obesas atendidas en el programa de reducción de peso en la clínica Margency o en el Hospital Saint Vincent de Paul. Todos los sujetos desarrollaron una obesidad grave en la primera infancia definida por un IMC que excedía el percentil 98º de la población.

En el momento de la admisión se registraron los pesos y las alturas, se tomaron muestras de sangre, se aisló la capa leucocitaria para la preparación del ADN y se separó el plasma para el análisis bioquímico. Se determinaron los TG, el colesterol total y FFA en plasma, utilizando kits enzimáticos disponibles en el mercado y siguiendo las instrucciones del fabricante. La toma de muestras de sangre y el ensayo de estos sujetos se realizaron antes de cualquier tratamiento para la reducción de peso.

3. Extracción de ADN

Se centrifugaron muestras de sangre 20 minutos a 2.000 rpm (centrífuga Beckman Allegra 6, rotor GH-3.8A). La capa media de leucocitos se separó y se lavó 2 veces en grandes volúmenes de Tris HCl 10 mM, pH 7,6 que contenía MgCl_{2} 5 mM y NaCl 10 mM (se formó un re-sedimento centrifugando 15 minutos a 2400 rpm). Al sedimento celular se añadieron 3 mL de Tris HCl 10 mM, pH 7,6 que contenía EDTA 1 mM y NaCl 0,4 mM, 200 \muL de SDS al 10% (p/v), y 500 \muL de proteinasa K (1 mg/mL). Después de mezclar vigorosamente sometiendo a vórtice, se colocaron los tubos en un baño de agua con sacudimiento a 42ºC durante 5 h. Después los tubos se enfriaron sobre hielo durante 10 min. Para precipitar las proteínas, se añadió 1 mL de NaCl 5 M seguido de vórtice durante 20 seg. Los productos precipitados se sedimentaron mediante centrifugación durante 20 min a 3750 rpm sin interrupción, y se separó el sobrenadante. Para precipitar el ADN, se añadió isopropanol (5 mL) al sobrenadante, seguido de recentrifugación a 3750 rpm durante 20 min. El sobrenadante se descartó y se añadieron 5 mL de etanol del 70% al sedimento de ADN. Después de dejar 6 h o durante la noche a 4ºC, las muestras se centrifugaron a 3500 rpm durante 5 min. El sobrenadante se vertió y se descartó, y el sedimento se dejó secar al aire. Una vez seco, se añadieron 1,5 mL de Tris HCl 10 mM que contenía EDTA 10 mM y las muestras se incubaron a la temperatura ambiente sobre una plataforma con balanceo para rehidratar el ADN. La concentración de ADN se evaluó y se almacenó el ADN a -20ºC.

4. Características Clínicas

Las características clínicas de los sujetos se describen en la Tabla 5. Estos valores son para las muestras de plasma recogidas tras una noche de ayuno sin normalización de la comida ingerida la noche antes de la admisión en el laboratorio clínico. Se ha demostrado que en estas condiciones de TG en plasma pueden variar considerablemente de día en día en el mismo individuo (21).

TABLA 5 Características de las Niñas Obesas

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5. Identificación de SNP

El amplicón de interés incluía los exones e intrones de los genes LSR, USF_{2} y LIPE. Se generaron marcadores al azar a partir de amplicones derivados de secuencias de BAC de las regiones genómicas indicadas (Tabla 1). Los cebadores de PCR se utilizaron para amplificar la correspondiente secuencia genómica en una reserva de ADN de 100 individuos no relacionados (donantes de sangre de origen francés).

La reacción de PCR (25 mL) contenía 2 \etag/\muL de ADN reunido, MgCl_{2} 2 mM, 200 \muM de cada dNTP, 2,9 \etag/\muL de cada cebador, 0,05 unidades/\muL de ADN polimerasa Ampli Taq Gold, Perkin Elmer, Foster City, CA) y 1\timestampón de PCR (Tris HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM). Las reacciones de amplificación se realizaron en un Termociclador PTC200 MJ Research, con desnaturalización inicial a 95ºC durante 30 seg, recocido a 54ºC durante 1 min, y prolongación a 72ºC durante 30 seg. Después del ciclo, se realizó una etapa de elongación final a 72ºC durante 10 min.

Los productos de la amplificación de las muestras de ADN reunido se secuenciaron en ambas cadenas mediante secuenciación automatizada fluorescente en un secuenciador ABI 377 (Perkin Elmer), utilizando un análisis de ciclos con cebador colorante y una extracción de la secuencia de ADN con el soporte lógico de Análisis de secuenciación de ADN de ABI Prism. Los análisis de los datos de la secuencia se procesaron automáticamente con AnaPolys (Genset, Paris, Francia), un programa de soporte lógico diseñado para detectar la presencia de SNP entre fragmentos amplificados reunidos. La búsqueda de polimorfismos se basa en la presencia de picos superpuestos en el patrón de electroforesis de ambas cadenas, dando como resultado dos bases que aparecen en la misma posición. El límite de detección para la frecuencia de los SNP detectados microsecuenciando reservas de 100 individuos es de aproximadamente 10% para el alelo minoritario, como se verifica secuenciando las reservas de frecuencias alélicas conocidas. No obstante, más de 90% de los SNP detectados mediante el método de reunión tienen una frecuencia para el alelo minoritario mayor de 20%.

6. Genotipificación

La genotipificación de las muestras de ADN individuales se realizó utilizando un procedimiento de microsecuenciación. Los productos de amplificación que contenían los SNP se obtuvieron realizando reacciones de PCR similares a las descritas para la identificación de SNP (y supra). Después de la purificación de los productos de amplificación, se preparó la mezcla de reacción de microsecuenciación añadiendo en un volumen final de 20 \muL: 10 \rhomoles de cebador de microsecuenciación (que hibrida inmediatamente aguas arriba de la base polimórfica), 1 U de Thermosequenase (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) o TaqFS (Perkin Elmer) y los 2 ddNTP fluorescentes apropiados (Perkin Elmer, Dye Terminator Set) complementarios a los nucleótidos del sitio polimórfico de cada SNP sometido a ensayo. Después de 4 minutos a 94ºC; se llevaron a cabo 20 ciclos de microsecuenciación de 15 seg a 55ºC, 5 seg a 72ºC, y 10 seg a 94ºC en un GeneAmp PCR System (PE Applied Biosystem). Después de la reacción, los cebadores 3' prolongados se precipitaron para separar los ddNTP fluorescentes no incorporados y se analizaron mediante electroforesis en secuenciadores ABI 377. Tras el análisis en gel con el soporte lógico GENESCAN (Perkin Elmer), se procesaron automáticamente los datos con AnaMIS (Genset), un programa de soporte lógico que permite la determinación de los alelos de los SNP presentes en cada fragmento de amplificación basado en la razón de intensidad fluorescente. Los datos del genotipo se recopilaron y se verificaron para una puntuación exacta con 32 muestras duplicadas.

7. Análisis estadístico

Las frecuencias alélicas y el ensayo de \chi2 de las proporciones de Hardy Weinberg se realizaron a medida que los datos eran recogidos (Hill, W.G. (1974) en Heredity, (Edimburgo), págs. 229-239; Terwilliger, J.O. (1994) Handbook for Human Genetic Linkage (John Hopkins University Press, Baltimore); Schneider et al. (1997) Arlequin: A software for population genetic data analysis, 1.1 edición (Genetics and Biometry Laboratory, Department of Anthropology, Universidad de Ginebra, Ginebra)). Las diferencias en las frecuencias de los genotipos en los sujetos obesos separados de acuerdo con el fenotipo secundario fueron analizadas utilizando el análisis \chi^{2} 3 x 2. Se calcularon dos valores de desequilibrio de ligamiento del locus (D) a partir de los datos genotípicos desfasados para los pares de SNP localizados en el locus 19q13 (Hill, W.G. (1974) in Heredity, (Edimburgo), pp. 229-239; Terwilliger, J.O. (1994) Handbook for Human Genetic Linkage (John Hopkins University Press, Baltimore)) y fueron sometidos a ensayo en cuanto a la significación de las estimaciones de las frecuencias de los cuatro haplotipos que se obtuvieron a partir del rendimiento del programa de ordenador EH (Schneider et al. (1997) Arlequin: A software for population genetic data analysis, 1.1 edición (Genetics and Biometry Laboratory, Department of Anthropology, Universidad de Ginebra, Ginebra)). Se calculó D' como D/D_{max} usando D_{max} positiva y negativa obtenidas de los productos de frecuencia del alelo. Se utilizó el lenguaje de programación SAS para construir, analizar y formatear bases de datos para la entrada en otros programas de ordenador de ligamiento genético.

8. Comparación de las Frecuencias Genotípicas

Las frecuencias de los genotipos (para los marcadores de ensayo y de control) de los sujetos que tenían valores de TG en plasma, colesterol total, y FFA por encima del valor medio de la población se compararon con las frecuencias de los genotipos de los sujetos con valores por debajo de la media. El valor de \chi2 obtenido para cada uno de los 5 marcadores candidato se muestra en la Figura 3. Solamente la frecuencia del genotipo de SLSR SNP núm. 3 muestra una diferencia significativa entre los dos grupos de sujetos obesos, y solamente para estos sujetos con TG en plasma por encima o por debajo de la media de la población (Fig. 3A). Este valor de \chi2 excedía el intervalo de confianza del 99,99% de la \chi2 media obtenida con los marcadores al azar y la de cualquier \chi2 obtenida con los 18 marcadores al azar. La media y el intervalo de confianza del 99,99% de los marcadores al azar se muestran en forma de líneas continuas y líneas discontinuas, respectivamente. No se observaron cambios significativos en la frecuencia de los genotipos de los marcadores LSR cuando la población obesa se separó de acuerdo con los niveles de colesterol total o FFA. Estos datos sugieren que la mutación G \rightarrow A en la base 19739, causante de una sustitución Ser \rightarrow Asn (resto aminoácido 363), influye selectivamente en los niveles de TG en plasma en niñas adolescentes obesas.

En niñas adolescentes, los niveles de TG en plasma normales oscilan entre 37 y 131 mg/dl (20); la hipertrigliceridemia es >130 mg/dl TG. Una comparación de la frecuencia del genotipo de los individuos hipertrigliceridémicos con respecto a aquellos con TG normales demostró que 33% de los individuos hipertrigliceridémicos (n = 35) tenía al menos un alelo A, mientras solamente el 16% de los individuos normotrigliceridémicos (n = 125) tenía el alelo A (\chi2 = 4,5, p < 0,04). El cálculo del cociente de proporciones de ser hipertrigliceridémico para las niñas obesas como consecuencia directa de la mutación de LSR volvió a un valor de 2,5.

El polimorfismo SNP núm. 3 de LSR que causa una mutación de asparagina por serina en el dominio externo de la proteína LSR, está en íntima proximidad con el supuesto dominio de unión a la lipoproteína de LSR. De este modo, este polimorfismo del gen LSR parece causar una mutación en la proteína LSR que disminuye la actividad de LSR como receptor de lipoproteínas. Puesto que LSR sirve principalmente para la separación de lipoproteínas ricas en TG, es probable por consiguiente que el deterioro de esta función debido a un polimorfismo genético cause la hiperlipidemia en niñas adolescentes obesas. Aunque este resultado se encontró en estudios con niñas adolescentes, no existe una razón a priori para sospechar que no se encontrará un resultado similar en niños adolescentes, o que no se encuentra también presente un efecto similar en adultos de ambos sexos.

Ejemplo 7 Asociación de un Polimorfismo de LSR Frecuente con Lipemia Postprandial en Adolescentes Obesos

En este estudio, se determinaron los TG en plasma tanto en ayunas como postprandiales para 34 niñas adolescentes obesas admitidas en centros de investigación clínica. Los valores de TG en plasma se midieron en un laboratorio de investigación. Excepto cuando se indica de otro modo, los materiales o métodos fueron los mismos que los descritos para el Ejemplo 6, anterior.

1. Selección de Sujetos y Ensayo

Se admitieron un subgrupo de los sujetos descritos en el Ejemplo 6 (n = 34) en la clínica la noche antes del ensayo. Consumieron una comida de ensayo convencional normal, y no se les permitió nada más que agua durante 12 h. A las 8:00 AM, se recogió plasma y los individuos consumieron una comida de ensayo con elevado contenido de grasa convencional en 15 min. La comida de ensayo con alto contenido de grasa proporcionó 1000 kcal, contenía 62% de grasa (grasa 29% saturada, 27% monoinsaturada y 44% poliinsaturada), 29% carbohidratos y 9% proteínas y consistió en pan y mantequilla, huevos con mahonesa, queso, ensalada con aceite de girasol, y salsa de manzana. Las muestras de sangre se recogieron antes, y a las 2 y 4 horas de esta comida.

Todos los padres de las niñas obesas proporcionaron su consentimiento firmado para el ensayo biológico y el uso del ADN para el análisis genético. Todos los análisis se realizaron anónimamente de acuerdo con la norma de la French Comission Nationale Informatique et Libertés. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Consullatif de Protection des Personnes Participants à la Recherche Clinique.

2. Comparación de las Frecuencias Genotípicas

El efecto del genotipo de LSR (Marcadores núm. 1, 2 y 3) sobre la respuesta de triglicéridos postprandial a la comida de ensayo se muestra en la Fig.4 A-C. Los sujetos que eran homocigotos GG (Ser) para el marcador núm. 3 tenían un nivel de TG en plasma significativamente inferior tanto antes como 4 h después de la comida (Fig. 4C). Las diferencias de genotipo en el marcador núm. 2 de LSR no tenían efecto detectable sobre la lipemia en ayunas y postprandial (Fig. 4B). Interesantemente, el marcador de LSR núm. 1 parecía ejercer una influencia significativa sobre los niveles de TG en plasma en ayunas (Fig. 4A).

Para determinar si el aparente efecto de ayuno del genotipo en el marcador núm. 1 era independiente del marcador núm. 3 de LSR, los autores de la invención trazaron la respuesta de TG en plasma, teniendo en cuenta el genotipo tanto del marcador núm. 1 como del núm. 3 (Fig. 4D). Los polimorfismos del marcador núm. 1 de LSR no tuvieron influencia sobre la respuesta postprandial de individuos que tenían el genotipo GG normal en el marcador núm. 3. Sin embargo, no se encontró ningún individuo que combinara el alelo frecuente en el marcador núm. 1 y el alelo raro en el marcador núm. 3. De este modo, no es posible determinar si tales asociaciones agravarían o reducirían la respuesta anómala a los lípidos observada en sujetos con la mutación Asn.

La explicación más simple de la influencia del marcador num. 1 de SNP en los valores de lípidos en plasma en ayunas es que este marcador está en desequilibrio de ligamiento con el marcador núm. 3 y simplemente traduce, aunque en un grado menor, la anomalía de función causada por la sustitución del aminoácido. Para someter a ensayo esta posibilidad, se determinó el grado de desequilibrio de ligamiento entre los 5 marcadores de ensayo. Los datos muestran que los 3 marcadores del gen LSR están en desequilibrio de ligamiento (datos no mostrados). Por lo tanto no es sorprendente que aunque es silencioso a nivel de proteína, el marcador núm. 1 influye significativamente en los TG en plasma en virtud del ligamiento con el marcador núm. 3. Esto también explica por qué ninguno de los 161 sujetos tuviera el genotipo CC y AG o AA para el marcador núm. 1 y núm. 3, respectivamente.

3. Análisis de la Secuencia

El ADN genómico de los sujetos homocigotos para la sustitución Ser (n = 12) o Asn (n = 3) se amplificó mediante PCR y todos los exones de LSR se secuenciaron en ambas direcciones. No se detectó ninguna otra mutación codificante además de la sustitución Ser\rightarrowAsn. De este modo, la influencia del marcador núm. 3 sobre los TG en plasma parece resultar directamente de la mutación que causa en la proteína LSR. El SNP núm. 3 parece influir directamente en los TG en plasma tanto en ayunas como postprandiales per se, sin señalizar simplemente la presencia de otra mutación no identificada.

4. Significación e Hipótesis

Aunque no pretenden estar limitados en modo alguno, los autores de la presente invención tienen las hipótesis de que la mutación del exón 6 de LSR que separa un grupo con funcionalidad alcohol e introduce un aminoácido alcalino reduce la eficacia del receptor y disminuye la velocidad de eliminación de los TG de la dieta. El hecho de que esta mutación esté asociada con niveles inferiores de TG en plasma en ayunas y 4 h postprandiales, pero no afecte significativamente a los TG en plasma medidos 2 h después de la comida, coincide con esta interpretación. Los autores de la presente invención tiene la hipótesis de que en el momento del pico postprandial (2 h), los niveles de TG en plasma están determinados en su mayor parte por la tasa de liberación de quilomicrones por el intestino y la tasa de hidrólisis de TG por la lipoproteína lipasa y posiblemente también por la lipasa hepática. Al cabo de 4 h, sin embargo, parecen jugar un papel significativo mecanismos alternos que cuentan con la absorción celular de los remanentes de quilomicrones (Karpe, et al. (1997) J. Lipid Res. 38, 2335-2343).

El estudio actual establece que al menos en niñas adolescentes obesas, los polimorfismos del gen LSR influyen significativamente en el metabolismo de lipoproteínas ricas en TG. De este modo, la evidencia genética actual apoya la noción de que el receptor de LDL y el LSR contribuyen a la eliminación de lipoproteínas. Los defectos en el receptor de LDL causan primeramente la hipercolesterolemia, mientras los defectos del LSR influyen en la hipertrigliceridemia en niñas adolescentes obesas sin hipercolesterolemia. Aunque la mutación funcional del receptor de LDL causa una hipercolesterolemia masiva en la mayoría de los individuos afectados, la mutación del gen LSR solamente incrementaba 2,5 veces la probabilidad de ser hipertrigliceridémica en niñas adolescentes obesas. Además, numerosos individuos con la mutación tienen niveles bajos de TG y por el contrario aproximadamente dos tercios de los sujetos obesos con hipertrigliceridemia no muestran anomalías a nivel del gen LSR. Claramente, los factores medioambientales y otros genes también influyen en los niveles de TG en plasma. Con la disponibilidad de una genotipificación a gran escala, será posible analizar simultáneamente la influencia de aquellos genes y determinar de ese modo la importancia relativa de unos sobre otros.

En mujeres, la hipertrigliceridemia, que es la anomalía lipídica más común observada en supervivientes de infarto de miocardio (Goldstein et al. (1973) J. Clin. Invest. 52, 1533-1543), es considerada un factor de riesgo independiente de enfermedad cardiovascular (Austin, et al. (1998) Am. J. Cardiol. 81, 7B-12B). De este modo, la genotipificación del marcador núm. 3 de LSR puede proporcionar una herramienta de diagnóstico para pronosticar el riesgo de complicación cardiovascular en sujetos obesos (y potencialmente incluso en sujetos no obesos).

Los autores de la presente invención también postulan que es posible que los polimorfismos de LSR contribuyan a la hipertrigliceridemia solamente en sujetos con un peso corporal excesivo. En efecto, la disminución de la expresión de LSR puede revelar el efecto funcional de pequeñas mutaciones en la proteína LSR que de otro modo permanecerían en silencio. Respecto a esto, es interesante observar que el aclaramiento defectuoso de quilomicrones que se produce en la hiperlipidemia de tipo III a menudo es rápidamente corregido mediante la reducción de peso (Mahley, R.W., y Rall, Jr., S.C. (1995) en The Molecular Basis of Inherited Disease, eds. Scriver, et al. (McGraw Hill Inc., New York), págs. 1953-1980). Puesto que LSR no se une a \beta-VLDL aisladas de un sujeto con hiperlipidemia de tipo III y con el fenotipo apoE2/2 (Yen, et al. (1994) Biochemistry 33, 1172-1180.), esto sugiere que la expresión reducida de LSR debida
a un peso corporal excesivo causa, junto con isoformas apoE anormales, la aparición de hiperlipidemia de tipo III.

Para el conocimiento de los autores de la presente invención, este estudio es el primer informe que saca ventaja de la tecnología de los SNP para validar la función de genes identificados recientemente. En la actualidad, la evidencia más definitiva para asignar una función a un gen se obtiene por medio de tecnologías de transgénicos e inactivaciones de genes. Aunque este enfoque ha proporcionado una información definitiva e incalculable, también tiene limitaciones significativas (Breslow, J.L. (1994) Annu. Rev. Physiol. 56, 797-810). En efecto, la inactivación de genes vitales a menudo causa mortalidad embrionaria o neonatal (Herz, et al. (1992) Cell 71, 411 -421. Asimismo, sigue siendo difícil extrapolar los datos en ratones a la fisiología humana. Por ejemplo, los ratones con una deficiencia para el receptor de LDL son bastante menos hipercolesterolémicos que los sujetos humanos homocigotos para la hipercolesterolemia familiar (Brown & Goldstein (1986) Science 232, 34-47; Ishibashi, et al. (1993) J. Clin Invest 92, 883-893). Finalmente, con el progreso del proyecto genoma, la identificación de genes proseguirá a un ritmo que excede la posibilidad de producción de transgénicos u organismos con genes inactivados, incluso cuando se prevea a nivel industrial. Claramente, existe la necesidad de un método experimental que permita la rápida evaluación de la función de un gen en un contexto directamente relevante para la patología humana. El estudio referido toma LSR como ejemplo para demostrar que el análisis sistemático de SNP que incluyen un gran número de marcadores de control al azar, permite someter a ensayo la función de un gen recientemente identificado en el contexto de una patología directamente relevante para los seres humanos.

Ejemplo 8 Asociación de un Polimorfismo de LSR Frecuente con los Niveles de Insulina y Glucosa en Adolescentes Obesas Insulina

En niños obesos, la insulina se correlaciona fuerte y positivamente con el IMC, coincidiendo con los estudios anteriores (Fig 5A). La asociación de los polimorfismos de LSR con estas variables se determinó utilizando un análisis similar al descrito antes (Ejemplo 6).

La población obesa se dividió en poblaciones separadas basándose en si el individuo estaba por encima o por debajo de la línea de regresión de insulina-IMC; las frecuencias del genotipo de cada grupo se compararon (Fig 5B). Los resultados demuestran que el polimorfismo de LSR muestra una asociación con los niveles de insulina relativos al IMC. Las frecuencias de los genotipos del marcador núm. 2 fueron significativamente diferentes en sujetos con razones de insulina a IMC elevadas (p<0,03). El valor de \chi^{2} excedió por mucho el definido por la distribución de marcadores al azar. Los sujetos homocigotos para el alelo A, tuvieron razones de Insulina a IMC significativamente superiores que los sujetos que eran heterocigotos u homocigotos para el alelo G: 0,571+/-,058 y 0,505+/-0,058 (p<0,05) respec-
tivamente.

De este modo, los datos indican que en individuos homocigotos para el alelo A, el nivel de insulina circulante normalizado para el IMC es superior que en aquellos con el alelo G. Esto sugiere que LSR juega un papel previamente insospechado en la determinación de los niveles de insulina en plasma, y también puede influir en el nivel de resistencia a la insulina en niñas adolescentes obesas: De nuevo, no existe razón para sospechar que no se podrían encontrar resultados similares para niños adolescentes, o adultos de ambos sexos.

Respuesta a la Glucosa

Para validar adicionalmente la asociación del marcador núm. 2 de LSR con la sensibilidad a la insulina, un subgrupo de 120 niños obesos mantenidos en ayunas durante la noche recibió 50 g de glucosa per os. Se midieron las concentraciones de glucosa e insulina en plasma en muestras recogidas antes y 2 horas después de este ensayo.

Los sujetos con genotipo AA para el marcador núm. 2 mostraron un incremento significativamente mayor de glucosa en plasma con respecto a la insulina que aquellos que eran GG (Fig 6 B). Los sujetos heterocigotos para el marcador núm. 2 tuvieron una respuesta intermedia. En el grupo en el que eran AA para el marcador núm. 2, 7 individuos de 54 tuvieron niveles de glucosa en plasma a las 2 h mayores de 120 mg/dl. En el grupo AG/GG solamente 2 de 66 tuvieron valores mayores de 120 mg/dl (p<0,05). Las diferencias de genotipo en el sitio de los marcadores núms. 1, 3, o 4 no influyeron significativamente en los cambios de glucosa a insulina después de la carga de glucosa (Fig 6A, 6C, y 6D).

Se acuerdo con la asociación del marcador núm. 2 con las razones de insulina a IMC (Fig. 5), los sujetos homocigotos para el alelo A a nivel del marcador núm. 2 de LSR tuvieron un incremento significativamente mayor en glucosa con respecto a insulina que aquellos heterocigotos u homocigotos para el alelo G (Fig. 6). Esto indica que los individuos con una razón de insulina a peso corporal relativamente mayor (Fig 5), también son aquellos con un grado de intolerancia a la glucosa relativamente mayor. De este modo, la genotipificación del marcador 2 de LSR permite la predicción no solamente de la razón de insulina a IMC, sino también del nivel de tolerancia a la glucosa. Esto indica que este marcador es un factor predictivo significativo del riesgo de desarrollar diabetes de Tipo II a una edad más tardía y de este modo es útil para la medicina preventiva y de diagnóstico.

Los supuestos mecanismos moleculares por medio de los cuales los productos del gen LSR influyen en la sensibilidad a la insulina son dobles (aunque los autores de la presente invención no desean estar limitados por las siguientes hipótesis). Primero, LSR es un receptor que experimenta cambios conformacionales tras la unión de FFA. La secuencia primaria de LSR es compatible con una función de señalización del receptor por medio de fosforilación. Se ha demostrado que la concentración de FFA en el sistema portal influye significativamente en el riesgo de desarrollar diabetes de Tipo II. Por lo tanto los autores de la presente invención especulan que la unión de FFA a LSR causa la señalización de la célula que disminuye la eficacia de señalización con insulina del receptor de insulina. Segundo, la subunidad \alpha' de LSR se une a la leptina con una elevada afinidad y causa la movilización de LSR desde las vesículas intracelulares a la superficie celular. Se ha demostrado previamente que la leptina modula la sensibilidad a la insulina (Science, Nature). De este modo, es posible que el polimorfismo a nivel del marcador núm. 2 de LSR indique una disfunción del receptor en su capacidad para unirse a la leptina, para unirse a FFA o para señalizar la célula.

Ejemplo 9 Asociación de Polimorfismos Frecuentes de LSR con la Obesidad en Adolescentes

Todos los sujetos (caso y control) fueron hembras Caucásicas. Los sujetos en el grupo de casos desarrollaron un exceso de peso corporal grave durante la infancia (IMC> percentil 98º (n=138)), mientras los sujetos de control permanecieron delgados durante toda la madurez (IMC 18-23 (n= 78)). Todos los sujetos que participaron en este estudio vivían en las regiones de Paris o Bruselas. Algunas características clínicas de los casos y los controles se resumen en la Tabla 5 (anterior).

El genotipo de los marcadores 1, 2, y 3 de LSR se determinó para las poblaciones de sujetos delgados y obesos. El análisis de la asociación de los genotipos demostró que los sujetos obesos tenían una frecuencia mucho mayor de genotipos CT/TT, AA, GG en los marcadores núm. 1, núm. 2 y núm. 3, respectivamente. Esta asociación de genotipos se encontró con una frecuencia de 23% en el grupo de obesos, y con una frecuencia de 2,5% en el grupo de delgados.

La estimación de la probabilidad de que esta diferencia en la frecuencia se produjera al azar se determinó mediante análisis de la Chi cuadrado. La Chi cuadrado calculada fue 15,98 (p<0,00008). De este modo, es poco probable que la asociación de genotipo definida antes se produzca con una frecuencia mayor en la población de obesos por casualidad. Es más probable que este polimorfismo indique la presencia de una disfunción del receptor que aumente directamente la oportunidad de que un individuo se vuelva obeso.

La estimación de la probabilidad de que los SNP se correspondan con la obesidad e indiquen una disfunción del receptor se determinó calculando el cociente de posibilidades. Este cálculo dio una estimación de 11,5. De este modo, es 11,5 veces más probable que los individuos que son CT/TT+AA+GG para los marcadores 1, 2 y 3 de LSR se vuelvan obesos que aquellos individuos con un genotipo diferente para estos marcadores. De este modo, la genotipificación de los marcadores núm. 1, núm. 2 y núm. 3 de LSR permite una predicción de la probabilidad de que un individuo se vuelva obeso. Los mecanismos moleculares por medio de los cuales LSR podría causar obesidad han sido descritos previamente, e incluyen 1) unión de FFA del plasma, 2) procesamiento de los lípidos de la dieta, 2) procesamiento de leptina, 3) señalización de leptina, 4) modulación de sensibilidad a la insulina, y 5) transporte de leptina a través de la barrera hematoencefálica.

En General:

Los datos de los autores de la presente invención muestran por primera vez que el análisis de polimorfismos de SNP proporciona una herramienta fácilmente accesible para someter a ensayo la función pronosticada de un gen recientemente identificado directamente en el contexto de la patología humana relevante. Adicionalmente, el análisis de SNP realizado en el contexto de una densa red de datos fenotípicos secundarios puede conducir al descubrimiento de funciones previamente no sospechadas y a la formulación de nuevas hipótesis fisiológicamente relevantes.

Los datos presentados en la presente memoria proporcionan argumentos genéticos que validan la hipótesis de que LSR contribuye de una manera cuantitativamente significativa al aclaramiento en plasma de los TGRL. En niñas, el defecto de esta función causa directamente obesidad masiva en la primera infancia. No obstante, sigue siendo posible que el aclaramiento defectuoso de los lípidos de la dieta también conduzca a obesidad de comienzo tardío. En efecto los ratones con un defecto de oxidación de lípidos en el hígado desarrollan obesidad e hiperlipidemia a la edad de 6 meses. La influencia del gen LSR en la aparición de obesidad en la primera infancia está ligada a un papel previamente no sospechado del producto del gen LSR en la regulación de la señalización de insulina. Es sorprendente que un único gen, expresado principalmente en el hígado, influya directamente en 3 de los 4 síntomas que caracterizan el Síndrome X. Este síndrome altamente prevalente se asocia con la obesidad, resistencia a la insulina, hipertrigliceridemia e hipertensión. El valor predictivo de los marcadores de LSR para la hipertensión y en la determinación de la aparición del síndrome X en adultos obesos también puede ser investigado utilizando estudios de asociación similares.

Referencias

Abbondanzo SJ et al., 1993, Methods in Enzymology, Academic Press, Nueva York, págs. 803-823.

Ajioka R.S. et al., Am. J. Hum. Genet., 60:1439-1447, 1997

Austin, M.A., Hokanson, J.E., Edwards, K.L. (1998) Am. J. Cardiol. 81, 7B-12B

Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y

Beaucage et al., Tetrahedron Lett 1981, 22: 1859-1862

Bradley A., 1987, Production and analysis of chimaeric mice. En: E.J. Robertson (Ed.) Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach. IRL Press, Oxford, pág. 113.

Breslow, J.L. (1994) Annu. Rev. Physiol. 56, 797-810

Brown EL, Belagaje R, Ryan MJ, Khorana HG, Methods Enzymol 1979; 68:109-151

Brown & Goldstein (1986) Science 232, 34-47

Chai H. et al., 1993, Biotechnol. Appl. Biochem., 18:259-273

Chee et al., 1996, Science, 274:610-614.

Chen et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7: 2745-2752.

Chen y Kwok Nucleic Acids Research 25:347-353 1997

Chen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94/20 10756-10761, 1997;

Chou J.Y., 1989, Mol. Endocrinol., 3: 1511-1514.

Clark A.G. Mol. Biol. Evol., 7:111-122, 1990

Compton J. Nature. 1991 Mar 7; 350(6313): 91-92.

Dempster et al., J. R. Stat. Soc., 39B: 1-38, 1977

Excoffier L. y Slatkin M., Mol. Biol. Evol., 12(5): 921-927, 1995

Feldman y Steg, 1996, Medecine/Sciences, synthese, 12:47-55

Flotte et al., 1992, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 7: 349-356.

Fodor et al., Science, 251:767-777, 1991

Fraley et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3348-3352.

Fuller S.A. et al., 1996, Immunology in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. Eds, John Wiley & Sons, Inc., USA

Goldstein et al. (1973) J. Clin Invest 52, 1533-1543

Ghosh y Bacchawat, 1991, Targeting of liposomes to hepatocytes, IN: Liver Diseases, Targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands. Wu et al. Eds., Marcel Dekeker, Nueva York, págs. 87-104.

Gopal, 1985, Mol. Cell. Biol., 5: 1188-1190.

Graham et al., 1973, Virology, 52: 456-457.

Green et al., Ann. Rev. Biochem. 55:569-597 (1986)

Grompe, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 865855-5892

Grompe, M. Nature Genetics 1993; 5:111-117

Guatelli J C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 35: 273-286.

Gura, Science 275: 751 (1997)

Hacia JG, et al., Nat Genet 1996;14(4):441-447

Haff L.A. y Smirnov I.P., Genome Research, 7:378-388, 1997

Hames BD y Higgins SJ, 1985, "Nucleic acid hybridization: a practical approach", Hames y Higgins Ed., IRL Press, Oxford.

Harju L, et al., 1993, Clin Chem., 39(11 Pt 1): 2282-2287.

Harland et al., 1985, J. Cell. Biol., 101: 1094-1095.

Hawley M.E. et al., Am. J. Phys. Anthropol., 18:104, 1994

Herz, J., Clouthier, D.E., & Hammer R.E. (1992) Cell 71, 411-421

Hill, W.G. (1974) en Heredity, (Edimburgo), págs. 229-239

Hillier L. y Green P. Methods Appl., 1991, 1: 124-8.

Huygen et al., 1996, Nature Medicine, 2(8):893-898

Ishibashi, et al. (1993) J. Clin Invest 92, 883-893.

Izant JG, Weintraub H, Cell 1984 Abr;36(4):1007-15

Julan et al., 1992, J. Gen. Virol. 73: 32513255.

Karpe, et al., (1997) J. Lipid Res. 38, 2335-2343

Khoury J. et al., Fundamentals of Genetic Epidemiology, Oxford University Press, NY, 1993

Kiefer H et al., 1996, Biochemistry, 35(50):16077-16084.

Kim U. -J., et al., 1996, Genomics, 34: 213-218.

Klein et al., 1987, Nature, 327, 70-73.

Kohler G. y Milstein C., 1975, Nature, 256: 495.

Kozal MJ, et al., Nat Med 1996; 2(7):753-759

Kozbor et al., 1983, Hybridoma, 2(1):7-16.

Landegren U. et al., Genome Research, 8:769-776, 1998

Lander y Schork, Science, 265, 2037-2048, 1994

Lange K., Mathematical and Statistical Methods for Genetic Analysis, Springer, Nueva York, 1997

Leger OJ, et al., 1997, Hum Antibodies, 8(1): 3-16

Lenhard T. et al., 1996, Gene, 169:187-190

Linton M.F. et al., 1993, J. Clin. Invest., 92: 3029-3037.

Livak KJ y Hainer JW, 1994, Hum. Mutat., 3(4): 379-385.

Mahley, R. W., y Rall, Jr., S.C. (1995) en The Molecular Basis of Inherited Disease, eds. Scriver, C.R., Beaudet, A.L., Sly, W.S. & Valle, D. (McGraw Hill Inc., Nueva York), págs. 1953-1980.

Mansour SL et al., 1988, Nature, 336: 348-352.

Marshall R.L. et al. PCR Methods and Applications 4:80-84, 1994

Martineau P, Jones P, Winter G, 1998, J Mol Biol, 280(1):117-127

McCormick et al., 1994, Genet. Anal. Tech. Appl., 11: 158-164.

McLaughlin BA et al., 1996, Am. J. Hum. Genet. 59: 561-569.

Montague et al., Nature 387:903 (1997)

Morton N.E., Am. J. Hum. Genet., 7:277-318, 1955

Muzyczka et al., 1992, Curr. Topics in Micro. and Immunol., 158: 97-129.

Nagy A. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8424-8428.

Narang SA, Hsiung HM, Brousseau R, Methods Enzymol 1979;68:90-98

Neda et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 1414314146.

Newton et al., Nucleic Acids Res., 17:2503-2516, 1989

Nickerson D.A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:8923-89271990

Nicolau et al., 1982, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190.

Nyren P. et al., 1993, Anal. Biochem., 208(1): 171-175.

O'Reilly et al., 1992, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual. W.H. Freeman y Co., Nueva York

Ohno et al., 1994, Science, 265:781-784

Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989;86: 2776-2770

Ott J., Analysis of Human Genetic Linkage, John Hopkins University Press, Baltimore, 1991

Pastinen et al. Genome research 7:606-614, 1997

Pease S. y William R.S., 1990, Exp. Cell. Res., 190: 209-211.

Perlin et al., Am. J. Hum. Genet., 55:777-787, 1994

Peterson et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7593-7597.

Porath J et al., 1975, Nature, 258(5536): 598-599.

Potter et al., 1984, Proc Natl Acad Sci USA;81(22):7161-5

Reimann KA, et al., 1997, AIDS Res Hum Retroviruses. 13(11): 933-943

Ridder R, Schmitz R, Legay F, Gram H, 1995, Biotechnology (N Y), 13(3):255-260

Risch, N. y Merikangas, K. Science, 273:1516-1517, 1996

Robertson E., 1987, Embryo-derived stem cell lines. En: E.J. Robertson Ed. Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach. IRL Press, Oxford, pág. 71.

Rossi et al., Pharmacol. Ther. 50:245-254, (1991)

Roth J.A. et al., 1996, Nature Medicine, 2(9):985-991

Rougeot, C. et al., Eur. J. Biochem. 219 (3): 765-773, 1994

Roux et al., 1989, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86: 90799083.

Ruano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6296-6300, 1990

Sambrook, J. Fritsch, E. F., y T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, Nueva York.

Samulski et al., 1989, J. Virol., 63: 3822-3828.

Sarkar, G. y Sommer S.S., Biotechniques, 1991

Schaid D.J. et al., Genet. Epidemiol., 13:423-450, 1996

Schedl A. et al., 1993a, Nature, 362: 258-261.

Schedl et al., 1993b, Nucleic Acids Res., 21: 4783-4787.

Schneider et al. (1997) Arlequin: A software for population genetic data analysis, 1.1 edición (Genetics and Biometry Laboratory, Department of Anthropology, Universidad de Ginebra, Ginebra)

Sczakiel G. et al., 1995, Trends Microbiol., 1995, 3(6):213-217

Shay J.W. et al., 1991, Biochem. Biophys. Acta, 1072: 1-7.

Sheffield, V.C. et al, Proc. Natl. Acad. Sci.

Shizuya et al., 1992, Porc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8794-8797.

Shoemaker DD, et al., Nat Genet 1996;14:450-456

Smith, Ann. Hum. Genet., 21:254-276, 1957

Spielmann S. y Ewens W.J., Am. J. Hum. Genet., 62:450-458, 1998

Spielmann S. et al., Am. J. Hum. Genet., 52:506-516, 1993

Sternberg N.L., 1992, Trends Genet., 8: 1-16.

Sternberg N.L., 1994, Mamm. Genome, 5: 397-404.

Syvanen AC. et al., 1994, Clin Chim Acta., 226(2): 225-236.

Tacson et al., 1996, Nature Medicine, 2(8):888-892.

Terwilliger J.D. y Ott J., Handbook of Human Genetic Linkage, John Hopkins University Press, Londres, 1994

Thomas K.R. et al., 1986, Cell, 44: 419-428.

Thomas K.R. et al., 1987, Cell, 51: 503-512.

Tucker J, Grisshammer R, Biochem J 1996;317(Pt 3):891-899

Tur-Kaspa et al, 1986, Mol. Cell. Biol., 6: 716-718.

Tyagi et al., Nature Biotechnology, 16:49-53, 1998

Vlasak R. et al., 1983, Eur. J. Biochem., 135:123-126

Walker et al. Clin. Chem. 42:9-13, 1996

Weir, B.S., Genetic data Analysis II: Methods for Discrete population genetic Data, Sinauer Assoc., Inc., Sunderland, MA, USA, 1996

White, B.A. Molecular Cloning to Genetic Engineering, Ed. en Methods in Molecular Biology 67: Humana Press, Totowa (1997)

White, M.B. et al., Genomics 12:301-306 (1992)

Wolcott, M.J., Clin. Mcrobiol. Rev. 5:370-386, 1992

Wong et al., 1980, Gene, 10: 87-94.

Wood S.A. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 4582-4585.

Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2757, 1989

Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem, 262: 4429-4432.

Wu y Wu, 1988, Biochemistry, 27: 887-892.

Yen et al., 1994, Biochemistry, 33: 1172-1180.

Zhao et al., Am. J. Hum. Genet., 63:225-240, 1998.

<110> GENSET

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> MARCADORES POLIMÓRFICOS DEL GEN LSR

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> 57.WO1

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/119,592

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-02-10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/144,784

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-07-20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> Patent.pm

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23187

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> exón

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<222> 2001..2356

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<223> exón 1

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<220>

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<221> exón

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<222> 3540..3884

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<223> exón2

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<220>

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<221> exón

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<222> 12163..12282

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<223> exón 3

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<220>

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<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15144..15200

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 4

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15765..15911

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 5

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19579..19752

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19899..19958

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 7

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20056..20187

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 8

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20329..20957

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 9

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21047..21187

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 10

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> señal_poliA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21168..21173

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AATAAA

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..2000

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región reguladora 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 22324..23187

\vskip0.400000\baselineskip

<223> homología con el gen USF2 en ref: embl Y07661

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 523..544

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 17-2

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1047..1068

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 17-2, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 946..963

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-4576

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1385..1402

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-4576, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1096..1115

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-19

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1616..1635

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-19, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1602..1621

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-20

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2074..2093

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-20, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2036..2053

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-4557

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2563..2580

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-4557, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2084..2102

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2483..2500

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-1, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2470..2489

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-21, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2062..2081

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-21

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3455..3474

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-3

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3882..3901

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-3, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3775..3792

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-4558

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4336..4356

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-4558, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4902..4920

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-14419, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4444..4463

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-14419

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6638..6655

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-4577

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unióncebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7072..7089

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-4577, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7995..8012

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-4559

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8576..8593

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-4559, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9622..9639

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-3148

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10023..10040

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-3148, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9964..9981

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-4560

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10546..10563

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-4560, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10996..11015

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-14411, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10492..10512

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-14411

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 11972..11990

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-4561

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12481..12501

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-4561, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12005..12023

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-4

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12417..12436

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-4, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14102..14119

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-4562

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14543..14563

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-4562, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14431..14448

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-3149

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14848..14865

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-3149, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14748..14767

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-22

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15198..15218

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-22, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14748..14767

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-24

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15333..15351

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-24, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15002..15019

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-5

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15333..15351

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-5, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15640..15657

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 16072..16089

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-6, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15800..15817

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-4563

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 16179..16199

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-4563, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19295..19312

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-3150

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19729..19746

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-3150, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19420..19438

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-7

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19824..19841

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-7, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19798..19815

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-8

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20137..20155

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-8, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19913..19931

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-9

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20329..20346

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-9, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20139..20157

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-4564

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20582..20599

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-4564, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20238..20256

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-10

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20645..20662

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-10, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20410..20424

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-26

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20690..20706

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-26, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20569..20588

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-23

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21243..21262

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-23, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20583..20604

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-11

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21015..21034

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-11, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20584..20601

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-15285, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20139..20158

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-15285

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20642..20659

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-15287, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20207..20227

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-15287

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20691..20709

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-15286, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20238..20257

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-15286

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20943..20960

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 9-2

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21295..21312

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 9-2, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21013..21031

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-15284, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20582..20602

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-15284

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21019..21038

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-14407, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20571..20589

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-14407

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21079..21097

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo 99-15283, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20638..20655

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba 99-15283

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21013..21032

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba LSRi9f15s

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21195..21214

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba LSRi10r14s

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20354..20372

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba LSRx9f14s (17-1)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20570..20591

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba LSRx9f14s

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20811..20832

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo LSRx9r13s (17-1), complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 818

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 17-2-297: base polimórfica G o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1243

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-19-148: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1374

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-19-256: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1401

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-19-307: base polimórfica A o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1535

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-19-442: deleción de base polimórfica de C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1788

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-20-187: base polimórfica A o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2391

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-1-308: base polimórfica G o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3778

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-3-324: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4498

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14419-424: base polimórfica G o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15007

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-24-260: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15233

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-24-486: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15826

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-6-187: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19567

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-7-148: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19744

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-7-325: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19786

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-7-367: base polimórfica A o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20158

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-9-246: base polimórfica G o C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20595

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LSRX9-BM (17-1-240): deleción de base polimórfica de AGG

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21108

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LSRX10-BM: base polimórfica G o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 606

\vskip0.400000\baselineskip

<223> base polimórfica potencial C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5141

\vskip0.400000\baselineskip

<223> inserción de base polimórfica potencial de G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7428

\vskip0.400000\baselineskip

<223> inserción de base polimórfica potencial de C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8394

\vskip0.400000\baselineskip

<223> base polimórfica potencial C o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8704

\vskip0.400000\baselineskip

<223> base polimórfica potencial T o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9028

\vskip0.400000\baselineskip

<223> base polimórfica potencial G o A

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9950

\vskip0.400000\baselineskip

<223> deleción de base polimórfica potencial de GAATGAAA

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9977

\vskip0.400000\baselineskip

<223> base polimórfica potencial T o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10021

\vskip0.400000\baselineskip

<223> base polimórfica potencial A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 11878

\vskip0.400000\baselineskip

<223> base polimórfica potencial C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19040

\vskip0.400000\baselineskip

<223> deleción de base polimórfica potencial de G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21363

\vskip0.400000\baselineskip

<223> base polimórfica potencial A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21449

\vskip0.400000\baselineskip

<223> base polimórfica potencial C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21451

\vskip0.400000\baselineskip

<223> base polimórfica potencial G o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21454

\vskip0.400000\baselineskip

<223> base polimórfica potencial A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21455

\vskip0.400000\baselineskip

<223> base polimórfica potencial G o A

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21569

\vskip0.400000\baselineskip

<223> base polimórfica potencial T o A

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21683

\vskip0.400000\baselineskip

<223> deleción de base polimórfica potencial de C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21694

\vskip0.400000\baselineskip

<223> inserción de base polimórfica potencial de T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21728

\vskip0.400000\baselineskip

<223> deleción de base polimórfica potencial de G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 799..817

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 17-2-297.mis1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 819..837

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 17-2-297.mis2

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1224..1242

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-19-148.mis1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1244..1262

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 9-19-148.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1330..1373

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-19-256.mis1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1375..1393

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 9-19-256.mis2

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1382..1400

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-19-307.mis1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1402..1420

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 9-19-307.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1516..1534

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-19-442.mis1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1769..1787

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-20-187.mis1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1789..1807

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 9-20-187.mis2

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2372..2390

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-1-308.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2392..2410

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 9-1-308.mis2

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3759..3777

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-3-324.mis1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3779..3797

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 9-3-324.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4979..4997

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14419-424.mis2

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4999..5017

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 99-14419-424.mis1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14988..15006

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-24-260.mis1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15008..15026

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 9-24-260.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15214..15232

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-24-486.mis1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15234..15252

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 9-24-486.mis2

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15807..15825

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-6-187.mis1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15827..15845

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 9-6-187.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19548..19566

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-7-148.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19568..19586

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 9-7-148.mis2

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19725..19743

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-7-325.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19745..19763

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 9-7-325.mis2

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19767..19785

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-7-367.mis1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19787..19805

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 9-7-367.mis2

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20139..20157

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-9-246.mis1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20159..20177

\vskip0.400000\baselineskip

<223>complemento 9-9-246.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20576..20594

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LSRX9-BM-mis1(17-1-240) potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20596..20614

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento LSRX9-BM.mis2(17-1-240)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21089..21107

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LSRX10-BM.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21109..21127

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento LSRX10-BM.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 587..605

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial606.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 607..625

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial606.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5122..5140

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial5141.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5142..5160

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial5141.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7409..7427

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial7428.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7429..7447

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial7428.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8375..8393

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial8394.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8395..8413

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial8394.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8685..8703

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial8704.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8705..8723

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial8704.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9009..9027

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial9028.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9029..9047

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial9028.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9931..9949

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial9950.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9951..996

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial9950.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9958..9976

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial9977.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9978..9996

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial9977.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10002..10020

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial10021.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10022..10040

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial10021.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 11859..11877

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial11878.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 11879..11897

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial1878.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19021..19039

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial19040.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19041..19059

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial9090.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21344..21362

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial21363.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21364..21382

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial21363.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21430..21448

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial21449.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21450..21468

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial21449.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21432..21450

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial21451.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21452..21470

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial21451.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21435..21453

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial21454.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21455..21473

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial21454.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21436..21454

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial21455.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21456..21474

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial21455.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21550..21568

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial21569.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21570..21588

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial21569.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21664..21682

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial21683.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21684..21702

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial21638.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21675..21693

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial21694.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21695..21713

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial21694.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21709..21727

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitiopotencial21728.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21729..21747

\vskip0.400000\baselineskip

<223> complemento sitiopotencial21728.mis2 potencial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

37

39

40

41

42

43

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 465

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 373

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14410-373: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 350..372

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14410-373.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 374..392

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14410-373.mis2 real, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..21

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 445..465

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo, complemento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 408

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 353

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14424-353: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 334..352

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14424-353.mis1 real

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 354..376

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14424-353.mis2 potencial, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..20

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 388..408

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo, complemento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 452

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14418-322: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 299..321

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14418-322.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 323..345

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14418-322.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..20

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 434..452

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo, complemento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 465

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14417-126: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 103..125

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14417-126.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 127..149

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14417-126.mis2 potencial, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 334

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14417-334: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 311..333

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14417-334.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 335..357

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14417-334.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..21

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 447..465

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo, complemento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 462

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14415-106: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 83..105

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14415-106.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 107..125

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14415-106.mis2 real, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..20

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 443..462

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo, complemento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 477

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14413-250: base polimórfica A o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 227 299

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14413-250.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 251..273

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14413-250.mis2 potencial, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 383

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14413-383: base polimórfica G o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 360..382

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14413-383.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 384..402

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14413-383.mis2 real, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..20

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 457..477

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo, complemento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 476

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4575-226: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 207..225

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-9575-226.mis1 real

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 227..249

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4575-226.mis2 potencial, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..19

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 458..476

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo, complemento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 489

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 296

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4580-296: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 273..295

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4580-296.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 297..315

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4580-296.mis2 real, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..20

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 470..489

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo, complemento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 523

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 424

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4567-424: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 401..423

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4567-424.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 425..443

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4567-424.mis2 real

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..18

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 503..523

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo, complemento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 542

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 477

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14420-477: base polimórfica G o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 454..476

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14420-477.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 478..500

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-14420-477.mis2 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..19

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 522..542

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo, complemento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 599

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 359

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4582-359: base polimórfica G o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 336..358

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4582-359.mis1 potencial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 360..378

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4582-359.mis2 real, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4582-62: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 43..61

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4582-62.mis1 real

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 63..85

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-4582-62.mis2 potencial, complemento

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..19

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas arriba

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 582..599

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de amplificación aguas abajo, complemento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

55

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2158

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 595

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-3-324: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 940

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-6-187: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1191

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-7-325: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1362

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-9-246: base polimórfica G o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1658

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LSRX9f13-BM: deleción de base polimórfica de AGG

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2079

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LSRX9f19-BM: base polimórfica G o T

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

58

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 649

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 363

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-7-325: aminoácido polimórfico Ser o Asn

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 420

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-9-246: aminoácido polimórfico Pro o Arg

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 519

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LSRX9f13-BM: deleción de aminoácido polimórfico de Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm

60

61

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2101

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 595

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-3-324: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 883

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-6-187: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1134

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-7-325: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1305

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-9-246: base polimórfica G o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1601

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LSRX9f13-BM: deleción de base polimórfica de AGG

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2022

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LSRX9f14-BM: base polimórfica G o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

63

64

65

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 630

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-7-325: aminoácido polimórfico Ser o Asn

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 401

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-9-246: aminoácido polimórfico Pro o Arg

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 500

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LSRX9f13-BM: deleción de aminoácido polimórfico de Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

67

68

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1954

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 595

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-3-324: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 987

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-7-325: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1158

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-9-246: base polimórfica G o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1454

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LSRX9f13-BM: deleción de base polimórfica de AGG

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1875

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LSRX9f14-BM: base polimórfica G o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

70

71

72

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 581

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-7-325: aminoácido polimórfico Ser o Asn

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 352

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9-9-246: aminoácido polimórfico Pro o Arg

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 451

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LSRX9f13-BM: deleción de aminoácido polimórfico de Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

74

75

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico de secuenciación RP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtaaaacga cggccagt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico de secuenciación RP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggaaacag ctatgacc

\hfill

18

Claims

1. Un polinucleótido aislado, purificado o recombinante que comprende un tramo contiguo de 8 a 50 nucleótidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1, 13, 15 o 17, o sus complementos, donde dicho tramo contiguo comprende un marcador bialélico relacionado con el receptor estimulado por lipólisis (LSR) seleccionado entre: SNP núm. 1 que está localizado en la posición 3778 del SEQ ID NO: 1 o en la posición 595 del SEQ ID NO: 13, 15 o 17; SNP núm. 2 que está localizado en la posición 15007 del SEQ ID NO: 1; y SNP núm. 3 que está localizado en la posición 19744 del SEQ ID NO: 1 o en la posición 1191 del SEQ ID NO: 13, o la posición 1134 del SEQ ID NO: 15, o en la posición 987 del SEQ ID NO: 17, donde cuando el polinucleótido comprende el SNP núm. 3, el nucleótido en el sitio del marcador bialélico SNP núm. 3 es A o T.

2. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho tramo contiguo tiene de 18 a 35 nucleótidos de longitud y dicho marcador bialélico está a 4 nucleótidos del centro de dicho polinucleótido.

3. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho polinucleótido consiste en dicho tramo contiguo y dicho tramo contiguo tiene 25 nucleótidos de longitud y dicho marcador bialélico está en el centro de dicho polinucleótido.

4. Un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el extremo 3' de dicho tramo contiguo está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido.

5. Un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho marcador bialélico está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido.

6. Un polinucleótido aislado, purificado o recombinante que comprende un tramo contiguo de 8 a 50 nucleótidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 13, 15 o 17, o sus complementos, donde el extremo 3' de dicho tramo contiguo está localizado en el extremo 3' de dicho polinucleótido, y donde el extremo 3' de dicho polinucleótido está localizado 1 nucleótido aguas arriba de un marcador bialélico relacionado con LSR seleccionado entre: SNP núm. 1 que está localizado en la posición 3778 del SEQ ID NO: 1 o en la posición 595 de los SEQ ID NO: 13, 15 o 17; SNP núm. 2 que está localizado en la posición 15007 del SEQ ID NO: 1; y SNP núm. 3 que está localizado en la posición 19744 del SEQ ID NO: 1 o en la posición 1191 del SEQ ID NO: 13 o en la posición 1134 del SEQ ID NO: 15, o en la posición 987 del SEQ ID NO: 17.

7. El uso de un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un análisis de hibridación, un análisis de secuenciación, o un análisis de amplificación específica de un alelo.

8. Un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 anclado a un soporte sólido.

9. Una matriz de polinucleótidos que comprende al menos un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Una matriz de acuerdo con la reivindicación 9, donde dicha matriz es direccionable.

11. Un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende adicionalmente una marca.

12. Un método de genotipificación que comprende determinar la identidad de un nucleótido en un marcador bialélico relacionado con LSR de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 1, 13, 15 o 17 o sus complementos en una muestra biológica, donde el marcador bialélico relacionado con LSR se selecciona entre: SNP núm. 1 que está localizado en la posición 3778 del SEQ ID NO: 1 o en la posición 595 de los SEQ ID NO: 13, 15 o 17; SNP núm. 2 que está localizado en la posición 15007 del SEQ ID NO: 1; y SNP núm. 3 que está localizado en la posición 19744 del SEQ ID NO: 1 o en la posición 1191 del SEQ ID NO: 13, o en la posición 1134 del SEQ ID NO: 15, o en la posición 987 del SEQ ID NO: 17.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicha muestra biológica deriva de un único sujeto.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde la identidad de los nucleótidos en dicho marcador bialélico es determinada para ambas copias de dicho marcador bialélico presentes en el genoma de dicho sujeto individual.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicha muestra biológica deriva de múltiples sujetos.

16. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, que comprende adicionalmente amplificar una porción de dichas secuencias que comprenden el marcador bialélico antes de dicha determinación.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicha amplificación se realiza mediante PCR.

\newpage

18. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, donde dicha determinación se realiza mediante un análisis de hibridación, un análisis de secuenciación, un análisis de microsecuenciación, o un análisis de amplificación específico de un alelo.

19. Un método para determinar si un individuo está en riesgo de desarrollar obesidad o si la obesidad que padece un individuo está asociada estadísticamente con uno o más marcadores bialélicos de LSR, que comprende:

-: determinar la identidad de la base polimórfica de dichos uno o más marcadores bialélicos de LSR en una muestra de ácido nucleico obtenida de dicho individuo,

donde el marcador bialélico de LSR se selecciona entre: SNP núm. 1 que está localizado en la posición 3778 del SEQ ID NO: 1 o en la posición 595 de los SEQ ID NO: 13, 15 o 17; SNP núm. 2 que está localizado en la posición 15007 del SEQ ID NO: 1; y SNP núm. 3 que está localizado en la posición 19744 del SEQ ID NO: 1 o en la posición 1191 del SEQ ID NO: 13, o en la posición 1134 del SEQ ID NO: 15, o en la posición 987 del SEQ ID NO: 17.