PT1033134E - Composições que inibem a proliferação de músculo liso e processo de diagonóstico da arteriosclerose - Google Patents

Description

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Canpo Técnico d pguillts ifr;%l.;:li dll ;:

Xn3-Eiaora do ixissiwgxi de íiuiuil® iil-S que compreende c i.p*1i uí Urâusurito génip:;:: I mais abundante na obesidade) como o componente activo, um método de diagnóstico aa arteriosclerose íaterosclerose) que n:ttl;li .til -.-.:1 nxsilisx c citado apMl em uma amostra. Utiliza-se um kit de diagnóstico da arteriosclerose uti consiste em um anticorpo r o citado apMl como o componente activo. fe t P d P t: © da d ! P1 ê Ê do conhecimento geral que, na sociedade moderna, a obesidade ou : rn n guoutltuio excessiva de ipurdutu corporal, está associada ao desenvolvimento de diabetes mellitus, hiperlipidémia, hipPrt^unuutí..,· e doenças ateroscleróticas inclusive de angina cte peito e de infarto miocárdico. À çiitsçtçltdiú estão asscciaazs não tu uns a; factores guMnltng nas tlisi·ái; factores ambientais. xixie:i i i:n:ugg:3 3 n xu::.:: de moceics :-.01:.1::::-:::.0 :1. 1::::: leptina e ziM-itm outros genes relacionados com a obesidade. Sxipxxxs n gxxito dussns giuti sssunt dtxntsdixs siris utut:vxini di susX11 liUS. l no u s lsim Xdx .1:::1::u tn ui nbn n 1 ds dl ηs dxunus:, d 1 li:11::1 x

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f F V" !·'!' fundamentais no aa diabetes mellicor e da aterosclerose por armazenagem de gordura. Não apenas a pesquisa d-s genes relacionados com a obesidade mas tambdít a tentativa de esclarecimento sobre genes específicos expressos pelos tecidos adipcsos devido a supernutrição e sobre as influências desses transcritos gênicos no indivíduo parecem ser de notável significado para o desenvolvimento das etiologias das citadas doenças e o estabelecimento de modalidades terapêuticas relevantes. 0 objectivo da presente invenção consiste em revelar os genes relacionados com a obesidade e os secs produtos de expressão que deverão ser úteis para elucidação da patogênese de várias dcenças relacionadas com a obesidade, principalmente doenças ateroscleróticas como angina de peito, infarto miocárdico, etc., e estabelecimento de modalidades terapêuticas pertinentes e para estabelecer métodos terapêuticos e de diagnóstico dessas doenças mediante a utilização desses genes e de produtos de expressão.

Os inventores tis presente invenção conduziram estudos intensivos para atingir o objectivo anterior e evidenciar antecipadamente que a acumulação de gordura, principalmente de gordura visceral na cavidade abdominal, está intimamente associada a intolerância I glucose, híperlípídémia e hipertensão. Além disso, através de análises da sequenciação em grande escala dos genes expressos no teu. . adiposo, os mesmos inventores esclareceram que muitos genes relacionados com a ssprisbáb do proteínas são expressos no tecido adiposo o que, princípaIntente na gordura visceral, pode observar-se a expressão de diversos genes de bioactivas. Em adição á clonagem Φί,ψΜΜηs genes conhecidos, os iovbvotorãb forais bem sucedidos na clonagem de um gene apMl de uma proteína semelhante ao colagénio específico do tecido adiposo [Biochem. Biophys. Res. i^Vví:·.; n., 221, 286-289

Descobriu-se que esse gere apMl constituído por 244 restos de aminoácidos codifica a proteína relacionada com a secreção (apMl), contem um motivo de 66 restos (G-X-Y) semelhante ao colagénio, e apresenta homologia com o subcomponente Clq do sistema complemento e colagénio X e VII. Contudo, a fisiológica desse gene e do seu produto de expressão apMl permaneceu por saber.

Na "ensuring iesearch" (pesquisa ess que se assegura a conformidade com as exigências de todos os níveis da sociedade como universidade, governo, indústria e negócios), os inventores realizaram uma série de estudos quanto à expressão ao referido gene apMl pela aplicação de técnicas da engenharia genética, preparação de um anticorpo contra o produto de expressão apMl, estabelecimento de um sistema de analise do apMl utilizando o referido anticorpo, e relayão da concentração sanguínea do apMl determinada mediante a utilização do citado sistema de análise com a distribuição da gordura corporal ou as várias doenças. A investigação conduziu a -m. novo achado, entre outras coisas* que o apMl apresentã actividade inibidoia do crescimento de músculo liso e que a concentração sanguínea do apMl reflecte rigorosamente a alteração aterosclerótica.

Além disso, os inventores obtiveram um novo achado pelo qual c ápâO. é eficaz prevenção e tratamento de restenoses pós-angioplastias, como restenose após angioplastia coronária angioplasty (PTCA)} utilizando um "stent", e ípsm:o a isso, na profilaxia e terapia de doenças aterosclerótícas acompanhadas por angiopatia, como angina de peito e infarto miocárdico. A presente rnmmrígim desenvolveu-se a partir dam bases do achado anterior.

De acordo com a presente invenção, prepara-se uma composição inibidora do crescimento de músculo liso que compreende uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacológico de pelo menos um membro escolhido de entre o grupo constituído por apMl e um seu sai em associação com um veículo aceitável sob o pcnto de vista farmacêutico.

Mim disso, a presente invenção, proviaencia uma composição terapêutica e profiláctica para restenoses pós-an-gioplastias que compreende uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacológico de pelo menos um membro escolhido de entre o grupo constituído por apMl e um seu sal em associação com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Apresenta-se também de acordo com a presente invenção uma composição profiláctica e terapêutica para a arteriosclerose que consiste em uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacológico de pelo menos um membro escolhido de entre o grupo constituído pelo apMl e um seu sal i-;m coa uns veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Apresenta-se também de acordo cou a presente irpmrnòM um Mooom de diagnóstico da arteriosclerose que consiste cm quantificar o npHl mm ama mnmíoomn com um mnrdmuroo amri^apml o comparar o valor assim encontrado com os valores determinados em indivíduos iniiidôotí» e em doentes iram arteriosclerose. & composição ínibídora do crescimento de músculo liso de acordo com a presente irrithipiS: é eficaz, pela sua actividade ínibídora do crescimento de músculo liso, na profilaxia e terapia de doenças ateroscleróticas acompanhadas por angiopatia, como angina de peito, infarto miocárdico inclusive de trombose, infarto cerebral, etc. e no controlo da progressão dessas doenças ateroscleróticas. De facto, o apMl como componente activo da composição de acordo com a presente invenção apresenta a capacidade de inibir a expressão das moléculas de adesão celular que promovem o aparecimento da arteriosclerose, designadamente a VCAM-1 [(vascular cell adhesion molecule-1) molécula de adesão das células vasculares-1], ELAM [(endotheliai leukocyte adhesion molecule) molécula de adesão endotelial de leucócitos], ICAM-...n, [ (intercelular adhesion molecule-1) molécula de adesão intercelular-1], e o resto. E devido a essa acção que a composição da presente invenção antagoniza o desencadeamento de várias doenças ateroscleróticas.

Consequentemente, a presente invenção fornece ainda mas composição farmacêutica para inibir a expressão de moléculas do adesão nas células endoteliais 'M&c&XãtMS.* 0 facto do apMl inibir a expressão das citadas moléculas de adíiiSíãx; das uá-.Ufias índica que a ou aa proas a: ti piiitprto pode estar indicada para a profilaxia e a terapia da asma iruítirritt que e uma aoença relacionada com a :it Mltiipãi eosinofílíca ãdicrliíisl h alergia tipo I e também conhecida por ser trrs Ροοηρο associada à iiptiitii rrrriTriiibiitdt ae VCAM-1, por exemplo.

Além disso, devido ao facto das citadas ICAM-1 e 8FJ&8 serem conhecidas por serem moléculas de adesão relacionadas com a inflamação, a composição & presente invenção qu* compreende o apMl como um componente activo pode ser indicada corno um agente anti-inflooâtèoio ou una composição terapêutica para a artrite reumatóide, por exemplo, tirando--se proveito do referido efeito míbidor sobre a expressão ae moléculas de adesão.

Além disso, a composição da presente invenção é eficaz na prevenção e tratamento de restenoses pós-angioplastias, por exemplo nos casos de PTCA que utilizam "stents". Assim, após uma cirurgia tendo em vista a neovascularização contra a estencse da artéria coronária na angina de peito ou no infarto miocárdico, a reperfusão pós-isquémica e a lesão das células endoteliais vasculares provoca a expressão de moléculas de adesão nas células endoteliais vasculares e consequente proliferação de células de músculo liso para induzir uma restenose. A composição da presente invenção inibe essa expressão das moléculas de adesão e o crescimento de células de músculo liso contribuindo desse modo para a prevenção de restenoses isquémicas após angioplastias. 0 método de diagnóstico da arteriosclerose de acordo com o presente irlvoróékí utiliza um novo marcador, que ê a potência de crescimento do músculo liso (capacidade de •mó·,:. Ou OÚUCCdo lioso & ifitBtl Aiói:· .. c; método Oh diagnóstico da presente invenção realiza-se determinando e c nível de apMl em amostra com um anticorpo especifico contra apMl. para como o a activo da composição de acordo com a presente preparação da composição utilizando o ;ppul como um componente activo, a produção de um anticorpo contra apMl, e o doseamento do apMl descrevem-se seguidamente uru série.

Na presente memória descritiva a designação ae aminoácídos, péptídos, sequências nucleotídícas, ácidos nucleicos, etc. utilizando abreviaturas edtá em conformidade com as regras de nomenclatura recomendadas por IUPAC-IU3 (IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem. , 13.8., 9 (1984)), "The Guidelines for Drafting of Specifications Etc. Containing Nucleotide Sequence or latino Acid Sequence Information" (Edited by the Japanese Patent Office, June, 1998) e as convenções deste relevante campo da arte. 0 apMl pode preparar-se sob a fcrma de uma proteína recombinante pela aplicação de técnicas de engenharia genética estabelecidas [por exemplo Science, 22.4, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 13..Q., 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 80, 5990 (1983)]. Nesse caso, pode utilizar-se um gene, como o gene apMl, que foi previamente desenvolvido pelos presentes inventores [Biochem. Biophys. Res, Commun., 221, 286-289 (1996)).

Como uma alternativa, pode produzir-se o apMl pelo atuuis convencional de síntese química qp acorao com a informação respeitante è sequência de aminoácídos codificada pele òlttdo gene.

Mais especialmente, a produção do apMl peia aplicâçic de aédniο® ana-snhdiia aenética consiste em construir cru ACN recombinante por meio ér? qual pode expressar-se em uma célula visada, hospedeira o gene cuuu codifica a o ADN na célula hospedeira para obter transformante e cultivando o transformante.

Corno célula hospedeira, como a mencionada antes, pode utilizar-se céluiíss derivadas de eucariotas e de procariotas. As células de eucariotas incluem células de vertebrados e células microrganismos eucariotas. Na qualidade de células de um vertebrado, utilízam-se frequentemente a linha de células de macaco COS [Cell, .23., 175 (1981)], a linha de células ovaricas de hánster chinês e a correspondente linha de células deficiente em di-hidrofolato-redutase [Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 17, 4216 (1980)j e similares embora essas não sejam escolhas exclusivas.

Como vector de expressão proveniente de um vertebrado, podem utilizar-se na generalidade um vector com uma sequência promotora localizada a montante do gene a produzir, o sitio de "splice" (o sitio de processamento) do ARN (precursor), un> sitio poliadenilação e uma sequência de término da transcrição, entre outros. Se necessário, o vector pode ainda ter origem na replicação. Como exemplo de um tai vector de expressão, pode mencionar-se pSV2dhfr que contem ("harboring") um promotor inicial de SV40 (Mol. Cell. Bioi., 1, 854 (1981)).

Como microrganismos eucariotas, utilizam-se geralmente leveduras e, entre elas, podem utilizar-se vantajosamente leveduras do fêrurro Saccharomyces. Como vector de expressão proveniente de um microrganismo eucariota como uma levedura, PCfbP :.;t. 1 í 177 pA;S72 que poa··: u.) um promotor do gene da 1 pó IcMs :pii, âeat

Sei., 172. entre hospedeiro procariota, utílizam-se na generalidade frequentemente Escherichia coli e Bacillus subtiliis. Quando esses procariotas se usam como isaptdci. ror, é vantajoso seleccionar um vector plasmidial que possa ser replicado no microrganismo hospedeiro e a fim de que o gene visado se possa expressar no vector, utilizar um plasmídeo de etprhht&v que apresente uma região ptcdtqotg e uma sequência õQ (Shine-Dalgano) a montante do gene e, ainda, um codâo de iniciação (por exemplo ATG) necessário para o início da síntese das proteínas. Como referido utiliza-se geralmente Escherichia coli corno o hospedeiro, E, coli Eli;., e como o vector utiliza-se geralmente pBR322 ou um seu produto de modificação. Contudo, estas não são escoihas ««clusiva# uma vez que as diversas estirpes bacterianas e vectores que se conhecem podem também utilizar-se. Exemplos do promotor que se pode utilizar são promotor do triptofano (trp), promotor ipp, promotor lac, e promotor PL/PR. A introdução do ADN recombinante resultante na célula hospedeira para transformação pode realizar-se do modo habitual. 0 transformante obtido pode cultivar-se de um modo convencional, por meio do qual a proteína recombinante visada se expressa, proauz, e acumula ou segrega extra-celularmente ou sobre a membrana celular. 0 meio de cultura paúM escolher-se de um modo \.smo d® entre a vários meios m utilização habitual de acordo com a déltd.t escolhida. A oplliuts· do transf ormante pode realizar-se na ausência de condições apropriadas determinada célula hospedeira.

Se necessário, o apMl obtido do modo ontobibm podo isolar-se e purificar-se por meio de varias técnicas de separação utilizando as suas características físicas, químicas e outras [Biochemical Data Book LI, 1175-1259, First , ist impressíon, 23 pqrttíp 19s§(. publicado por Tokyo

Kagaku Dojin, K.K.; Bicchemistry, 25 (25), 8274 (1986); Eur. ·'; Biochem., 163, 313 (1987), etc.], muts especialmente, as referidas separação e purificação podem conseguir-se utilizando um tratamento de reconstituição convencional, tratamento com um agente precipitante ("saiting-out") de proteínas, centrifugação, método do choque osmótico por pressão, sonicaçâo, uitrafiltração, diversos tipos de cromatografia líquida como cromatografia utilizando peneires moleculares (filtração por gel), cromatografia por adsorção, cromatografia por troca iónica, cromatografia por afinidade, cromatograf ia líquida de alta resolução (I-IPLC) , etc., aiálise e outros, quando utilizados quer individualmente quer em associação.

Alternativamente, o apMl mencionado antes pode produzir--se também pelo processo geral da síntese química com base na informação da sequência de aminoácidos. 0 processo inclui os métodos convencionais de fase líquida e de fase sólida da síntese de péptídos. Mais detalhadamente, cada um desses métodos inclui uma suposta técnica de amplificação por etapas que consiste em condensar os apiicuáçi-diOS doa componentes, em após outro, tendo oe: vista a da cadeia de acoíodo com a da sequência de mist.okçsdo#,. e a técnica ae condensação de fragmentos que compreende a síntese poèbio dos mápticuííS dos fragmentos OCUc:niM::uu:on:) cada em οοριοη;: restos ae aminoácidos e o acoplamento consecutivo aos mesmos um sp-éc outro ae acordo com a referida isfòm&çdec A reacção de condensação para utilização no método anterior da síntese de péptidos pode também realizar-se de um modo convencional. Por exemplo, c método que se pede utilizar í-fô&lui o método da azida, o método de um anidrido de ácido misto, o método DCC, o tíáttdt dt um éster activado, o d-átddd redox, o método da DPPA (difenilfosforil azida}, o método DCC + um ociiiitw (por exemplo, 1-hidroxibenzotriazolo, N-hídroxi-succinimida, ou N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida), e o método de Woodward, entre outros. 0 solvente que se pode utilizar naqueles itééódot pode seleccionar-se também de um modo apropriado entre aqueles solventes que se conhecem bem por se utilizarem em reacções de condensação na formação de péptidos. Como exemplos específicos, podem mencionar-se N,N-d.imetilformamida (DMF), sulfóxído dimetílico (DMSO), hexafosforamida, dioxano, tetra--hidrofurano (THF), acetato de etilo, etc., inclusive as suas misturas.

Na conduta das reacções de síntese dos péptidos, os grupos carboxílicos de aminoácidos ou de péptidos que se pretende não estejam envolvidos nas reacções respectivas podem proteger-se geralmente por esterificação, por exemplo sob a forma de um éster alquílico inferior, por exemplo éster metálico, éster etílico ou éster ter-butílico, ou um è&tèr aralquíiíco, por exemplo éster benzílíco, éster p-metoxiben-zílíco ou p-nitrobenzílico.

Os aminoácidos que possuem um grupo funcional na cadeia lateral, por exemplo c ' ? hiárd&iio de um resto de tírosina, podtm proteger-se com grupos acetilo, benzilo, ·5·1ο·χ loarbon :; Xof tst-"biiti lo to Sibirrárdó, embora essa protecção não seja necessariamente indispensável. diéo disso, o grupo guooddlno de um resto de rrei:·:.:::··:·:;, por exemplo, poae proteger-se com um grupo protector apropriado como nitro, tosilo, p-metoxibenzenossulfonilo, metileno-2-sulfonilo, benziloxicarbonílo, isoborniloxicarbo- ni.lo ou adamantiloxicarbonilo.

As reacções para eliminar esses grupos protectores cios amínoácidos ou dos péptidos protegidos, ou das proteínas finais, podem também realizar-se por técnicas convencionais, por exemplo por m* método e redução catalítica ou por um método que utiliza uma solução aquosa de amoníaco/sódio metálico, ácido fluorídrico, ácido bromídrico, ácido clorídrico, ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido fórmico, ou ácido metanossulfóníco. 0 apMl assim obtido pode purificar-se por técnicas várias mencionadas antes na presente memória descritiva, por exemplo as técnicas utilizadas habitualmente na química dos péptidos, como cromatografia de troca iónica, cromatografia de partilha, cromatografia de perrneação em gele, distribuição em contra-corrente, e assim por diante. 1. composição de acordo com a presente invenção compreende c apMl ou um seu sél sob o ponto de vista farmacológico como um componente activo. 0 sal inclui derivados d* metais alcalinos, de metais e de amónio, como sais de sódio, potássio, lítio, cálcio, oaonèódog bário e amónio. Esses sais podem preparar-se por métodos conhecidos na arte. 0 sai mencionado antes inclui ainda sais de iOiiçlo de ácido que se podem preparar fazendo reagir o apMl com um ácido orgânico ou inorgânico apropriado de um modo conhecido per se. Exemplos dos sais de adição de ácido são cloridratos, bromidratos, sulfatos, bissulfatos, acetatos, cxalatos, valeratos, oleatos, lauratos, boratos, benzoatcs, lactatos, fosfatos, p-toluenossulfonatos i -ΐ.·> i ecsj , citratos, Iççccu, fumaratos, ííositatbbr tartaratos, sulfonatos, glicolatos, ascorbatos, benzenossulfonatos, napsilatos e sais A composição de acordo com a presente invenção na generalidade prepara-se e apresenta-se para ut.ilit».; *sob a forma de uma preparação farmacêutica que contem uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacológico do referido componente activo em associação com um veículo farmacêutico apropriado, 0 veiculo que se pode utilizar nessa preparação farmacêutica inclui diversos diiuentes o/oç. excipientes, cccu diluentes ("fillers", "volume builders") , aglutinantes, humectantes, desaqregantes, tensioactivos, lubrificantes.

Esses veículos utilizam-se de un modo convencional de acordo com a forma posológica unitária pretendido.

As formas posológicas unitárias da preparação farmacêutica podem seleccionar-se a partir de uma grande variedade de acordo com os objectivos terapêuticos. Exemplos caracterí sticos incluem formas sólidas como casíprit-idesn pílulas, pós finos, grânulos e cápsulas, e formas líquidas como uma pçzbtclçç uma sUspenStltj uma emulsão, um xarope e um elixir. Essas preparações classificam-se, mediante a via cç administração, cm , , ' Kia, preparações pffibbPtbrissãb, preparações tt&KStêSsis, preparações ccc rccuc;, :η.ΐν·:.·.:η U·;. i.ou, cccprcc; 0-:0¾ SuMcisduMs, poiftpças, pudccdo cada uma delas formular-se e moidar-se cu preparar-se ae outro modo ufiliuâcdc msc tèccleu fcccuciucicu estabelecida. .dièc; disso, essas preparações farmacêuticas podem incluir diversos aditivos que se podem formular sob a forma preparações farmacêuticas comuns, como um estabilizante, agentes antibacteríanos, um tampão, um agente Pu isotonízação, um agente quelante, um agente regulador de pH e um surfactante, cada um deles em uma concentração apropriada. 0 estabilizante inclui albumina sérica humana e aqueles L-aminoácidos, hídratos de carbono e derivados do celulose que se utilizam convencionalmente. Esses estabil.izantes podem utilizar-se individualmente ou em uívíiociuçlo com um agente tensioactivo. Uma tal associação pode contribuir especíalmente para uma estabilidade p&forçádai do a activo.

Os L-aminoácidos podem incluir glicina, cisteína, acido glutâmico e outros, embora sem caracter especialmente limitativo.

Os hídratos de carbono podem incluir monossacáridos como glucose, manose, galactose e frutose; álcoois derivados de açúcares como manitol, inositol e xilitol; dissacáridos como sacarose, maltose e lactose; e polissacáridos como dextrano, hidroxipropílamido, sulfato de condroitina e ácido hialurónico embora sem carácter especialmente limitativo; inclusive os seus derivados. CúMi agentes tensioactívos podem utilizar-se os iérd e os não iónicos embora sem carácter especialmente de polioxietilenoglicol e sorbitano, ésteres alquilicos de políoxietileno, ésteres de sorbitano cm·. acilo, e glicéridos de ácidos gordos.

Os derivados de celulose podem incluir metilcelulose, etilcelulose, hidroxietilceiulose, hidroxipropilcelulose, hídroxipropí lmetí 1 celulose, carboximetilcelulose embora &<m carácter limitativo e outros.

Os hidratos de carbono podem otllitar-as: pelo menos na concentração aproximada de C,0001 mg, preferivelmente entre aproxímadamente 0,01 e 10 mg por 1 pg do componente a*n?*vo* â albumina sérioo humana pode utilizar-se pelo em uma concentração próxima de 0,0001 mg, preferivelmente entre aproxímadamente 0,001 e 0,1 mg por I pg do componente activo. Os aminoácidos podem utilizar-se entre aproxímadamente SbOól e 10 mg por 1 pg do componente activo. Os derivados de celulose podem utilizar-se pelo menos em uma concentração próxima de 0,00001 mg, preferivelmente entre aproxímadamente 0,001 e 0,1 mg por 1 pg do componente activo. A proporção do componente activo na preparação farmacêutica da presente invenção pode escolher-se substancialmente entre amplos limites. Geralmente, o componente activo contribui para valores de aproxímadamente 0,00001-70% em peso, preferivelmente aproxímadamente 0,0001 a 51 em peso da preparação final. O tampão que eventualmente se pode incorporar na preparação farmacêutica inclui êcíéò bórico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido l«-mlácido glptlhi/ftò e os saís correspondentes (por exemplo sais derivados de metais alcalinos ou de metais alcalino-teirosos como sais do obdi.ò, ρϋόόΡΰΙΰ, cálcio e bsgnbMs? < o pqec.v.e do isotò;·:áo inclui cloreto de sódio, ci.oroto do potássio, íipdiOárç:» s gl io^riou, inclui edetato de sódio e ácido cítrico. A expressão preparação farmacêutica de acorco com a presente invenção engloba não apenas preparações líquidas mas também preparações liofilizadas para reconstituição extemporânea, enquanto preparadas utilizando preparações líquidas secas por congelação, tendo em vista o prolongamento dos prazos de validade. As preparações liofilizadas são para se administrarem após dissolução em água ou em uma «oloçáo tampão inclusive de uma solução de soro fisiológico.

Na moldagem de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção sob a forma de comprimidos, podem utilizar-se, como veículo, diversos excipientes como lactose, sacarose, clcreto de sódio, glucose, ureia, amido, carbonato de cálcio, caulino, celulose cristalina, ácido ilHclcs e fosfato de potássio; aglutinantes como água, etanol, propanol, xarope simples, solução de glucose, solução de amido, solução de gelatina, carbcximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, metilcelulose e polivinilpirrolidona; desagregantes como carboximetilcelulose sódica, carboximetilcelulose calcica, hidroxipropilcelulose de baixa substituiqão, "dry starch" (um amido modificado), alginato de sódio, agar em pó, lamínaran (um polissacárido proveniente da Laminaria japonica Aresch) em pó, carbonato de hidrogénio e sódio e carbonato de cálcio; tensioactivos como éster de ácido gordo de poli-(oxietileno)-sorbitano, sulfato de laurilo e sM£è e monoglicéridc de estearilo; inibldores de desagregação como sacarose, estearina, manteiga de cacau e um óleo hidrogenado; promotores de absorção uma base de amónio quaternário e sulfato de iatrilo e sódio; humectantes como glicerina e amido; adsorventes como amido, lactose, tatlihvç bentonite e ácido silícico coloidal; e lubrificantes ser'.; talco sais de ácido esteárico, em pi e polietilenoglicol.

Além do ruais, se necessário, podem revestir-se os comprimidos obtidos com materiais de revestimento convencionais para se obterem comprimidos revestidos com açúcar, comprimidos revestidos com gelatina, comprimidos entéricos, comprimidos revestidos com uma película ou comprimidos de duas camadas ou de múltiplas camadas.

As? pílulas podem preparar-se utilizando, momo veículo, excipientes como glucose, lacsose, amido, manteiga de cacau, um óleo ígipy] hidrogenado, caulino e talco; aglutinantes como goma-arábica an pó, goma tragacanta em pó, gelatina e etanol, e desagregantes como laminaran e agar.

As cápsulas preparam-se geralmente mediante formulação do componente activo com um veiculo ou veículos como os mencionados antes a título de exemplo e acondicionamento da composição em cápsulas utilizando invólucros de gelatina dura ou cápsulas moles, por exemplo.

Una preparação líquida para administração oral inclui soluções, emulsões, suspensões, xaropes e elixires. Cada uma dessas preparações pode preparar-se utilizando um diluente inerte convencional, por exemplo um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacológico inclusive a água. À preparação Liquida podem ainda acrescentar-se diversos agentes auxiliares como um agente molhante , um agente emulsíonante e/ou um. agente espessante, podendo preparar-se a referida preparação líquida utilizando wm técnica estabelecida.

Uma |>í:fôpa:5Usç:Is> Líquida para parentéríca, por exemplo uma solução aquosa ou odio estéril, emulsão ou suspensão, pode utilizando um diluente como álcool isostearílico âlasp.l isostearílico políoxilado, ésteres de ácido gordo políetoxílado de scrbítano e óleos vegetais como o azeite. Ά preparação rrqurçç pode acrescentar-se um éster orgânico que se possa ou administrar por perfusâo, como o oleato de etilo. A essas preparações podem ainda acrescentar-se um agente solubilizante, «s tampão, um agente moIhante, um emulsionante, um espessante, um ecnservante, um dispersante e outros aditivos.

Essas preparações farmacêuticas podem esterilizar-se por filtração de um filtro anti-bactérias, incorporação de um bactericida, tratamento por irradiação, tratamento por aquecimento, 0¾ por um me taca similar. disso, cada uma dessas preparações farmacêuticas pode preparar-se sob a forma de ura» composição sólida estéril, que se pode dissolver em água esterilizada ou em um meio apropriado que se pode esterilizar por esterilização extemporânea.

Supositórios e preparações vaginais podem preparar-se utilizando polietilenoglicol, manteiga de cacau, um álcool superior, um éster de um álcool superior, gelatina ou um glicérido semi-síntético como veiculo ou base.

Pomadas bem como pastas, cremes e geles podem prepararas^ «tilum di luente 00 dllusmtos ç;çaa «élidsfc de r branca, parafina, glicerina, derivados de aei;ala;n;ç propi lenoglícol, síl ícones, bentonite, e óleos vegetais como o azeite,

Preparações farmacêuticas para adm.: rr: st :aa:;:i::· fenaaanaaai çç sublingual podem preparar-se utilizando usa excipiente cr.; axciipiedld'® padria bem conhecidos de um modo caavaaaiaaal.

Ai do disso, se necessário, podam adicionar-se à farmacêutica Se accrdo com a presente invenção agentes corantes, terfursc o, edulcorantes ou outras composições farmacêuticas. 0 método de administração da referida preparação farmacêutica não é especialmente restrito devendo apenas seleccionar-se criteriosamente em referência à forma posológica, antecedentes do doente inclusive idade e sexo, gravidade da doença, e outras condições. Por exemplo, comprimidos, pílulas, soluções, suspensões, emulsões, grânulos, e cápsulas administram-se oralmente. As injecções administram-se intravenosarnente quer individuaimente quer em associação com uma perfusão comum como a de glucose e aminoácidos, e se necessário administram-se individualmente por via intramuscular, intradérmica, subcutânea ou intraperitoneal. Os supositórios introduzem-se no recto, enquanto as preparações vaginais se administram no interior da vagina. As preparações transnasais administram-se nas narinas, as preparações sublinguais na cavidade oral, e as pomadas destinam-se a absorção transdérmica. A quantidade do componente activo a incluir na referida preparação farmacêutica e a posologia não são especialmente limitadas polo que podem escolher-se entre amplos de acordo com o efeito terapêutico aguardado, o método de o tempo de tratamento, factores do doente como idade e sexo. Habitualmente, selecciona-se a posologia de voclo que a concentração sanguínea dõ ctApcmenae activo seja de preferência dprotiAtdotAvrí;*: i a 26S pg/ml, mais aproximadamente 10 a 20 gg/m.'L Essa preparação pode administrar-se de ima só vez oa em algumas poucas doses por dia.

Seguidamente descreve-se detalhadamente a da anticorpo especifico contra apMl. 0 anticorpo especifico contra o apMl pode produzir-se como um antisoro iisttiaorpc; policlonal) ou um anticorpo monoclonai mediante a utilização do apMl, um leu fragmento ou uma proteína complexa que o contenha sob a forma de um hapteno via um imunogénio.

Gs peritos experienr.es na arte connecem perfeitamente s tecnologia para gerar esses anticorpos. 0 anticorpo de acordo com a presente .httunção pode também produzir-se de acordo com um ?®éfodo conhecido [por exemplo Biochemical Experiments Séries: "Methods for Ί mitur· >:: í ocher u- ; Research", Japanese Biochemical Society (ed.) (1986)],

Mais especialmente, o anticorpo monoclonai anti-apMl pode produzir-se mediante, per exemplo, um processo que consiste em construir uma célula por (hibridoma) entre um plasmócito (imunócito) proveniente de mamífero imunizado com o citado imunogénio e uma célula plasmacítoma proveniente de um mamífero, em seleccionar um clone que produz o pretendido anticorpo que reconhece o apMl, e em cultivar o clone. 0 apMl que se pode utilizar como um IdidhddÉh ie ta té.aslçd. anterior não é especialmente restrito pelo que pode ser uma qualquer das conhecidas espécies apMl reccmbinantes preparadas pela tecnologia do ADN recombinante, ca péptido que :;:C,v5Ul sua sequência 1 P . de ou a ccrresponaente proteína conjugada que uss grupo qrcshéticct d aptU mencionado íicas é vdPtiteláo por ser .im factor te secreção específico ao tecido adiposo, podendo a qualquer protètut que possup :ur;a aCtividada ou :v; i' cão equivalente, por exemplo GEP 28 (proteína de :g_"ão gelatina de 28 kPbi,· utilizar-se igualmente como o referido imunogénio. ϋ mamífero que se pretende imunizar na técnica anterior com o referido imunogénio não está especialmente restringido, podendo escolher-se de preferência tendo em atenção a compatibilidade com a ííáiula de plasmacitoma a utilizar na fusão celular. Geralmente utiliza-se vantajosamente a de murganho, rato ou coelho. A imunização da referido mamífero realiza-se utilizando um método rotineiro, por exemplo Injectando o citado imunogénio por via intravenosa, i?iiraàé£&Le&, subcutânea, ou intraperitoneal. Preferivelmente, administra-se o imunogénio individualmente ou eventualmente em associação com um adjuvante comum a um animal de laboratório, como o murganho, algumas vezes por dia a intervalos de 2 a 14 dias, em uma dose total de aproximadamente 100 a 500 pg/murganho. Como imunogénio, e preferível utilizar esplenócitos isolados aproximadamente 3 dias após a última imunização.

Quanto à célula de plasmacitoma de mamífero como a outra célula precursora a submeter a fusão com o imunócito, pode utilizar-se uma qualquer das diversas células já conhecidas, psr exemplo p3 [Nature, 25£, 495-497 (1975) f, p3-Ul [Current Topics in Microbíoiogy and £1, 1-7 (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol., 6, 511-519 (1976)], MPC-11 çV í , 8, »!?.·$' ] , BFÃ/0 ΓύρΙηΤίρ 2?6, 269-270 amMyt* FO [J. Immunol. Meth., 35, 1-21 (1980)], x63.6.5.3. [J. IlíiãbUtrj,, XãJ;, 1548-1550 it ?'· 9: ; , bltA [J. Exp. 131-133 148, 313-323 ClfTi;: ] , etc. e células de mieloma como as R210 murinas .¾. reacção de fusão celular entre o referido imunócito e a célula de plasmacitoma pode realizar-se na generalidade de acordo com o método de Milstein et al. in

Enzyxnology, Vol. 73, p. 3 i: ) ], por exemplo. Mais especial mente, pode a de fusão anterior *": um meio usual na presença de um indutor de fusão vulgar, como polietilenoglicol (PEG), vírus Sendai çhJv'; ou similar. Para conseguir um melhor rendimento de fusão, pode eventualmente adicionar-se òo meio um agente ttvllitr como sulfóxido dimetílico. A proporção para utilização entre o imunócito e a s de piasmacitoma não difere da proporção vulgarmente utilizada neste tipo de técnica. Assim, por exemplo, utiliza-se geralmente o imunócito em uma proporção de aproximadamente 1 a 10 vezes quanto maior a quantidade da célula de plasmacitoma. Exemplos do meio Útil para a fusão celular são o RPMI-1640 e o MEM, que se utilizam na generalidade para a proliferação de células de plasmacitoma, e outros meios que se utilizam para a cultura de células deste tipo. Habitualmente prefere-se que nas formulações dos meios se prescinda do componente sérico como o soro fetal de (FCS) . A fusão consegue-se utilizando uma técnica que consiste em misturar intimamente quantidades pré-determinadas do referido imsnécitò e da célula de no citado meio e em adicionar uma solução de PEG, por exemplo um FEG com molecular médio de aproximadamente 1000 a 6000 , que se aqueceu previamente até aproximadamente 37 °C, ao meio habitualmente em uma concentração de aproximadamente 30 a 60% p/v , adição essa acompanhada por agitação. Consequentemente, e apropriado remoção do sobrenadante repetem-se até à obtenção ao hibridoma pretendido. 0 hibridoma assim gerado pode isolar-se mcKtycttd cultura em om meio de selecção vulgar, como o HAT (um meio que contem hipoxantina, aminopterina, e timidína) . Essa oa.ltnr-s utiliza o meio HAT realiza-se durante o tempo suficiente para destruir as outras células (células que não fundiram, etc.) além do hibridoma pretendido, habitualmente durante alguns aias até poucas semanas. No hibridoma resultante pesquisa-se o clone produtor do anticorpo pretendido utilizando o vulgar método de diluição limitativo, seguindo-se a pte&Lçio do anticorpo monoclonal. A pesquisa do clone pretendido que produz o anticorpo pode realizar-se utilizando os diversos métodos do processo de detecção rotineiro de anticorpos, como o método ELISA [Engvall, E., Meth. Enzymol., 70, 419-439 (1980)], o método da placa, o método da mancha, o método de aglutinação, o método de Ouchterlony e o radioirnunodoseamento (RIA) [Hybridoma Techniques and Monoclonal Antibodies, publicado por R&D Planning, K.K., pág. 30-53, 5 de Março, 1982]. Tendo essa pesquisa por objectivo pode utilizar-se c iiiah&bèhlb mencionado na presente memória descritiva. 0 hibridoma mstm obtido que produz o anticorpo monoclonal pretendido que reconhece o apMl pode subcuitivar--se em um meio it&sstis e pode lohcbêit dotisitts: um longo período em azoto líquido. A Ciiiciititií do anticorpo pretendido a partir tn dibtidc::ds anterior pode realizar-sê por um método dontibbe em cultivar o hlbi:: 1:1 chie de \:.c modo d'Otihs;l.bÔ ο «ίο :'"rbiisrh o anticorpo no da o® por um método com consiste em. inocular em ui mamífero compatível o hibridoma P»:;;':S 3 levar a multiplicá-lo o m colher o anticorpo no fluido da ascite. O primeiro método é apropriado para a pióspdr.opâp d® um imtí&úWpQ de porem.® o n Slti.:®.® método é apropriado para a produção em massa do anticorpo. Θ anticorpo assim obtido pode jurrfirar-se por técnica convencional como precipitação, filtração em gele, cromatcgrafia de afinidade, e outras. Gesse ohiésb-ns® o pretendido anticorpo monoclonal anti-apMl que especificamente se ao apMl. A presente invenção proporciona ainda uma técnica para o doseamento do apMl em uma amostra e através da mesma técnica um método de diagnóstico da arteriosclerose. 0 diagnóstico da arteriosclerose de acordo com a presente invenção consiste em determinar a quantidade de apMl em uma amostra de sangue ou de urina de um doente com o anticorpo anti-apMl utilizando uma técnica de imunodosearnento em fase líquida ou fase sólida e comparar a valor determinado com o valor correspondente em doentes com arteriosclerose e o valor correspondente em pessoas saudáveis para ver se o nível de apMl na amostra € superior ou inferior ao nível das pessoas saudáveis.

0 método de · -svav-e®v.® preferido é o ELISA a irrnr®® em sanduíche.

Seguidamente descreve-se detalhadamente o método anterior. 0 sei; principio baseia-se no método do ligado a uma enzima. Assim, de um mudo característico esse método consiste em semear um anticorpo monocional anti-apMl humano (o primeiro anticorpo) em urra placa de 96 cavidades ("wells") e, para impedir a adsorção não específica, a cabo um bloqueio (imobilização). A essa placa imobilizada com apMl humano ou a amostra em ensaio e deixa-se reagir (a primeira reacção), Concluída a lavagem da placa, adiciona-se o anticorpo anti-apMl humano (o segundo anticorpo) que reage (a segunda reacção). Lava-se a placa e adiciona-se o anticorpo anti-IgG de coelho marcado com HRP (o terceiro anticorpo) e deixa-se reagir (..¾ terceira resi&cç&l. Concluída a lavagem da placa, adiciona-se o substrato e realiza-se a reacção enzímática (a quarta z-mz-çM·®)'* Seguidamente, lê-se a actividade sob a forma de absorvência no comprimento de onda de 492 ran.

Na técnica anterior, e também possível utilizar o anticorpo policlonal como o primeiro anticorpo e o anticorpo monocional como o segundo anticorpo.

No método anterior, quanto mais elevada é a concentração de apMl na solução padrão ou na amostra em ensaio utilizada, mais elevada é a actividade enzímática (absorvência) detectada. Mediante a èobsixuçâo de uma curva padrão (curva de c^.Iibraçâ:c;·) através do representação gráfica dos péltittõ da absorvência das soluções padrão e a comparação da absorvência da amostra em ehaart com a ourma* poae determinar-se facilmente a quantidade de apMl presente na amostra onsatíá popa diagnosticar se o ckaembís pes ou olo arteriosclerose. iòiioã do mais, o anterior diadaôsttoo do de acordo com a presente invenção pode realizar-se móis: kit e o

Seguidamente descrevem-se detalhadamente método de detecção da quantidade de apMl presente na amostra em. mommtoo

No tèmicã ensaio que utiliza o kit, a amostra em ensaio & preferivelmente uma amostra d® drint mu uma tttdstro de sangue (especialmente orna amostra de soro ou de plasma proveniente de sangue em jejum;, podendo essa amostra octer--se e preparar-se a partir do indivíduo submetido a exame de um modo rotineiro. 0 kit consiste em um anticorpo rnonoclonal ou policlonal anti-apMl (anticorpo anti-apMl) como um componente essencial, preferivelmente uma sua associação com o anticorpo policlonal anti-apMl ou o anticorpo rnonoclonal, respectivamente, conforme o caso, ou uma associação dos referidos anticorpos monoclonaks. 0 anticorpo rnonoclonal referido antes utiliza-se preferivelmente enquanto imobilizado mediante acoplamento pràvto a um veiculo sobre uma placa. Como alternativa, o citado anticorpo pode utilizar-se directamente sob a forma de um gele de afinidade ou utilizar-se como um geie preparado em um recipiente ou um tubo de ensaio que se poae manualmente e centrifugar, proporcionando ele próprio a da fracção ligada ao gele sem afinidade È também preferível equilibrar previamente a referida placa iimáã com o anticorpo ou o gclc com uma cfttmgit!

tampão apropriada, por exemplo tampão Tris-HCl 0,01 M (pH com o anticorpo ou ao gele pode adicionar-se um conservante vulgar como a azida sódíca

Mais preferivelmente, como um cpíísp^íí^ír·:.* adicional do kit, fornece-se um anticorpo policlonal anti-apMl humano marcado como o segundo anticorpo para o método ELISA. Se necessário, o kit pode ainda englobar um estabilizante como paoarose cu pruiutiús. sêtúvtâ ύονίρη púou opí οοΐΐούΐνηοό:.®, 0 conservante selecciona-se de entre substâncias que não afectem o resultado do ensaio com o kit e inclui solução diluída de azida de sódio como um exemplo representativo.

Além disso, o kit pode englobar eventualmente uma substância solúvel em ou míscível com água como a glicerina, um álcool, igii eôls.·# glicoéteres ou similares e, para desengordurar, um solvente orgânico misto como dietílíco, mttáni&l-èfM dietílico, ou clorofórmio-metanol.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra um mapa de um plasmídeo que utiliza uma enzima de restrição que contém a sequência nucleotídica do gene apMl. A Fig. 2 mostra uma curva padrão construída utilizando um apMl recombinante. A Fig. 3 representa um gráfico que mostra a capacidade do apMl antagonizar o músculo i;.m como determinado de acordo com c Exemplo 3. A Fig. 4 mostra ecquv;v.i · 0000:-0:os níveis Scspgp.tpccs de apMl em doentes com doenças das artérias coronárias e em iuíicúliíiup·:;: iusngâvvls q&Miâft determinados PP acordo coro o Exemplo 4. uig. 5 representa um gráfico ορρ mostra c efeito inibidor do apMl

Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção quanto a outros detalhes e não devem Ifeitar o âmbito da mesma

Produção de um apMl recombinante ilí ÈXpTMBBài'· d·':'? mtbl á® RgmPori chiá CXÚ.i I) Método PCR aplicado ao apMl A sequência de nucleótidos do gene apMl e a sequência de aminoácidos codificada desse modo depositaram-se no GenBank sob o número de admissão D45371. A região codificante (CDS) apresenta-se como a sequência desde o 27° até ao 761° da sequência nucleotídica. A sua sequência de aminoácidos deduzida apresenta-se sob a forma de um número de identificação descrito como SEQ ID NO: 1. Nessa sequência, os restos do Io a-c 14° constituem um péptido sinal e os restos do 15" ao 144® representam o apMl maduro.

Amplificou-se o gene apMl por PCR utilizando o plasmídio doado pelo Dm, Funahashi, The Second Department of Internai Medicine, Osaka University School of Medicine como sss molde. Dá Fig. l apresenta-se o matt do plò.-b: Dm ·'·· DDiiisâSáô uma ísásxsss de restrição que contem a sequência Do nucleótidos uc 'i ··· ··.< ·· ·· ' ··

Desenhando de forma que a sequência 693bp desde o 69° ; Ί&Ϊ* DòqpDímPo de cDos :4-0 apDl: acr amplificada em um sitio Ndel na extremidade é em um sítio BarrtHI na extremidade 3', produziram-se "primers" (iniciadores) de PCR utilizando um sintetizador automático de

MilL As sequências dos "primers" ae PCR t-Stlo apresentadas sob a forma d® em número de descrito tsffi Sv ID NO: 3 ("forward") (inicial) e eCe 4 ("reverse") (reverso). 2) Subclonagem do gene apel d® vector pT7 Blue T (Novagen) subclonou-se o produto do PCR obtido na fase 1) anterior e confirmou-se que rdk· se observou qualquer mutação na sua sequência nucleotídica (pT7- 3) Construção de un vector de expressão

Submeteu-se o vector de expressão pET3c (Novagen) a digestão com Ndel e BamHI para recuperar un fragmento de aproximadamente 4600 bp. Por outro lado, a pT7-apMl obtida na fase 1) anterior submeteu-se a digestão com Ndel e BamHI para recuperar un fragmento de aproximadamente 700 bp. Ligaram-se esses fragmentos e denominou-se o vector de expressão assim obtido por pET3c-apMi. 4) Expressão na Escherichia coli A estirpe hospedeira de E. coli iL2i (PI3; pLtnrd transformou-se com o pET3c-apMl construído na fase 3) eetteioí e cultivou-se em ãxTkkiwiÇ (16 g m 10 e de extracto de levedura, e 5 g de NaCl) - Quando o organismo entrou na fase " . . ' para induzir a produção de ura apMl. Colheram-se amostras ds :;k.luids d® g. colí antes e após a pelo IPTG e cáo corpo de inclusão ía fracção insolúvel de E. coli) após a referida indpçiis pelo IPTG e submeteram-se è de "SDS-PAGE" e ao método de "Western blotting" para confirmar a expressão do 5) Resultados e Discussão 0 produto de expteèBâò ta E. coli, obtido pelo mo ao anterror, foi uma proteína de 230 restos correspondente a ate :""s , excepto a sequência sinal, a aiiciúètcia de aminoácidos do apMl, que resulta da adição do derivado Met proveniente do códão de ;.n e pi:; no )1- te; e λ na i „ Essa sequência de aminoácidos apresenta-se sob a forma de um número de identificação descrito como SEQ ID NO: 2. A E, coli obtida pela técnica anterior analisou-se por SDS-PAGE. Como resultado, pôde confirmar-se uma banda de aproximadamente 30 kD na célula de E. coli e no corpo de inclusão após indução por IPTG.

Seguidamente, realizou-se o método de Weçtern blotting utilizando dois tipos de anticorpos [anticorpos policlonais (péptidos «iptéficoslf . Ambos os anticorpos reagiram com a referida «Ma de aproximadamente 33 kD, ao psSõO que não se detectou qualquer reacção com a E. coli hospedeira. A anterior iusndo de aproximadamente 30 kD separou-se para investigar a sequência dos seus 1C restos de aminoácidos no Obteve-se urna ãepyÉncla igual à expeotávelf observado a delecAO da Met do N-terminal em uma pequena à partir dos resultados anteriores tornou-se claro que c «pNl recombinante tinha sido expresso como uma proteína de aproximadamente 30 kD. A maioria doa apMl recombinantes expressos tinham sido acumulados lr>tiul.8 corno um corpo de inclusão. (2) Purificação do apMl recombinante proveniente da E. coli A pitrtíiíSidtdí:; do apMl recombinante proveniente da E Λ coli realizou-se utilizando a seguinte técnica de 5 fases. A estirpe hospedeira de E, coli BL21(DE3)pLysS (Novagen) transformada pelo vector de expressão pET3c-apMl cultivou-se previamente em 2xT.Y.Ainp.Cm. (16 g de triptona, 10 g de extracto de levedura, OOggbbl de cloranfenicol, e 5 g NaCl) (à temperatura de 37 °C, cultura agitada manualmente). No dia seguinte, diluiu-se a cultura com 100 volumes de 2xT.Y.Amp. e a a incubação prosseguiu. Decorridas 2 a 3 horas de incubação quando a £0¾¾¾ do fluido da cultura atingiu 0,3 a 0,0 adicionou-se IPTG em uma concentração final de 0,4 mM para horas após a adição do IPTG, centrifugou-se o fluido da cultura 05000 rpm, 20 minutos, 4 · e armazenou-se o pequeno aglomerado esférico ("pellet") de E. coli assim obtido 23 Preparação de um corpo de inclusão a partir de E, coli 50 & "C durante X-100

Suspendeu-se o jmUbi:. de E. cbi. 1 ο:;: flib-nOb 8,0) e tratou-se com lisozima à temperatura de 37 Ϊ hora. Obb·;!:ç ; /:u.o·'· :-ou /aga/a) em ma 1' ias.;, de 0,2%. Submeteu-se essõ solução a sonicação (Branson Sonifier, controlo de saída 5,30 segundos) e centrifugou-se 12:&PD r , 30 minutos, 4 °C) e recuperou-se o pellet. Suspendeu-se esse pellet em 25 ml de 8,0) e submeteu-se & suspensão a sonicação (em oma/iç/ism iguais às anteriores).

Centrifugou-se a /olma&j resultante e lavou-se o pellet utilizando técnicas igualo às descritas antes. Retomou-se o pellet assim obtido como o corpo de inclusão. 3) O "refolding" do corpo de inclusão

Solubilizou-se o corpo de inclusão com uma pequena quantidade de cloridrâto de guanídína 7M, Tris-HCl 100mM (pH 8,0) e 2ME 1%. A solução resultante foi introduzida gota a gota em um volume 200 vezes maior de ureia 2M, Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) para diluição e deixou-se em repouso durante 3 noites a temperatura de 4 °C. 4) Concentração da solução submetida a "refolding" Cíunlrifuuòu-'vs:u (9000 rpm, 30 minutos, temperatura 4 e a solução após a operação anterior de refolding e concentrou-se o sobrenadante até aproximadamente 1/1.00 por ultracentrifugação utilizando uma membrana /0:-10 Amicon. Submeteu-se a diall;» o . . resultante cmnmns Tris- -HC1 /0 mM (pH 8,0) a (iiuaa 0,4 5 yrtt. filtrou-se o diaiisado cte 5) HPLC ae troca aníónica em A amostra obtida na fase 4) anterior purificou-se fraccionadamente por cromatografía liquida de alta rescldqilt (HPLC) de troca aniónica por meio de DEAE-5PW (Tosoh Corporation). Como tampão inicial, utilizou-se Tris-HCl 20 m (pH 7,2), a realizou-se a eluição em um gradiente de NaCl (0 -> li; NaCl/60 ml) scb monitorização da absorvência a 280 nm. Recolheu-se o eluato em fracções de 1 ml e analisou-se cada uma p%iM técnica de SDS-PAGE. 6) Resultados e Discussão

Uma vez que o apMl recombinante foi expresse sob a forma de corpo de inclusão na E. coli, a sua purificação realizou--se por sclubilização e refolding desse corpo de inclusão. Como resultado solubilizou-se o apMl recombinante e separou--se em uma coluna de troca aniónica. Reuniram-se ("pooled") as fracções que apresentaram um pico (fracções Nos 30-37) e analisaram-se pela técnica de SDS-PAGE. Como resultado, observou-se uma banda de aproximadamente 30 kD. Nessa análise, detectou-se urra ténue banda de "smear" na formação de base ("background") mas como a maioria das proteínas considerou-se ser c apMl recombinante. Essa banda de aproximadamente BOkD (o apMl recombinante) utilizou-se como o antígénio na imunização subsequente te coelhos e de murganhos. íii d® nntiddrptw ptiiiotonti® s un·::.:·.:,; ; çua atui (Π aaçaa áa a&tlearpc íx'··:· ·:*. ·>:··-:·.: y ·. ... .y. v:;. . y.·. y.;. <.v -:· .y, -.y. ·:·- '2 x-y;·'·, ·.··. la:: ··:·.' Çv>·:··;·;·i., - ..--,.-::.--.1.:- .-...- <:·::· :· : .v p «..···..· p v. coelhos com essa mistura 8 vezes a intervalos de 2 semanas para obter um anticorpo policional anti-apMl (Códigos de v. .-:í o; >·· t ·<:'·>. .-.v.x c-.;v:v 'i >’··: j '?>:· ' Ç·: >·> 1 2) Preparação do anticorpo monoclonal

Missurcu-se o apMl recombinante, 20 com adjuvante integral em uma proporção de 1:1 e Imunizaram-se murganhos com essa mistura 3 matas a intervalos de 2 semanas. Seguidamente, realizou-se a imunização final sem o adjuvante 3 dias antes da fusão celular. A fusão celular entre células de baço cte murganho e células de mieloma realizou-se pelo método PEG e seleccionou-se o hibridoma em meio HAT. A pesquisa de uma linha de células produtoras de anticorpos apMl realizou-se por ELISA utilizando urra imunoplaca revestida com o antigénio (apMl recombinante), e clonou-se o hibridoma pelo método da diluição limite.

No processo anterior, obtiveram-se 11 linhas de hibridomas produtoras de anticorpos anti-apMl denominadas KOC091Q1- KOC09111. De entre esses hibridomas, depositou-se um no National Institute of Bioscience and Human Technology, The Ministry of International Trade and Industry, Japan (NIBH, Ktgtth i 1-1-3, TéPhxdut-mshi, Ibaraki, Japão) a pttttr de 8 de Junho de 1998 (data original do depósito) í$ código de i :)·:{"-'J ii:: c a çi·:; ri Toldo Ã-O depositante: * tendo- “SS depositado o pedido dc conversão um depósito de acordo com c r ·: oe Budapeste e partir ae ^ óo do:;t obro de IfM·. 3 número de admissão do depósito final ê FELM BP-6542. 3s hibridomas como clones específicos administraram-se sucessivamente por via intraperitoneal a murganhos tratados ο::«ν:.:.:.:¾¾ό7 e com pristano e colheu-se o fluido asdilJ-OD it&âiféB de identificação: ANOC9101-9111). O antiscro de coelho (anticorpo policlonal) e o fluído ascítíco murino (anticorpo monoclonal) purificaram-se sucessivamente utilizando uma coluna de proteína A. 4) Expressão do apM] em células ariliiis

Utilizando EcoRT excisou-se cADN do apMl e inseriu-se no sitio EcoRI do vector de expressão pClneo (Promega Corp.s. A célula COS-1 {ATCC GRL 1650) foi transfectada com pClneo-apMl anterior utilizando LlipofectAMINE, GIBCO BRL, e decorridas 72 horas colheram-se sucessivamente o sobrenadante da cultura e as células. 5) Método Western blotting para detectar o apMl

Primeiramente, submeteram-se o extracto de um tecido adiposo, células COS-1, o çobrenadante da cultura de células COS-1, plasma de humanos saudáveis, e o apMl recorabinante a SME (+) SDS-PAGE e transferiram-se para uma membrana de nitrocelulose,

Essa membrana reagiu com o anticorpo com HRP, e realizou-se a detecçâo com ECL (reagente 0« detecção do método Western blot,

Como resultado, detectou-se uma banda de aproximadamente 35 do aaiposo, â e plasma de hutíotr observou relativamente às células sobrenadante da cultura de células pcb saudáveis pClneo/COS-1 não se ou ao

No sobrenadante da cultura de células p€il./CDOS·”' 1 * pôde confirmar-se uma banda de 35 kD embora flftobd dto&ol&do fraca quanto a intensidade para se distinguir facilmente,

Exemplo 2

Determinação do apMl em amostras 1) Método Western blotting para detectar o apMl

Diiuiu-se plasma de humanos saudáveis na proporção de 1:10 com PBS e submeteram-se 5 μ! desça diluição a 2ME(+),(-)SDS-PAGE e transferiram-se para um filtro de nitrocelulose. Concluído o bloqueio, o filtro reagiu com uma diluição dez vezes maior do anticorpo policlonal anti-apMl (OCT9101-9105) ou 5 qd/ml de anticorpo monoclonal anti-apMl i'í;}X-··I.e ainda com o anticorpo IgG anti-coelho marcado com HRP ou o anticorpo IgG anti-murino marcado com HRP, e procede&-se à detecção com ECL.

Como resultado, confirmar-se, em todos os anticorpos policlonais, uma banda do apMl de aproximadamente 35 kD no caso de ilínôfl e outra de aproximadamente 70 kA no caso de 2ME (-) . De entre os anticorpos ΒΜϋ€3:ίϋ;§ e ANOC9108 reagiram com a banda de apMl. 3s resultados anteriores sugeriram que como anticorpos ANOC9108 são apropriados. 2) Construção do sistema ELISA para a detecção do apMl A superfície de uma irnunoplaca revestiu-se com o anticorpo monoclonal anti-apMl (ANOC9108) e, após o bloqueio de cada cavidade r''Wvllw1f adicionaram-se o padrão de apMl e a amostra t incubaram-se. lavou-se cada uma das cavidades, adicionou-se uma diluição do anticorpo policlonal anti-apMl (OCT9104}. e incubou-se. Seguidamente lavou-se cada uma das cavidades da placa, adicionou-se urra diluição do anticorpo IgG anti-coelhc marcado com HRP e incubou-se. Seguidamente lavou-se cada uma das cavidades, adicionou-se OPD a cada uma desças cavidades para coloração ("staining") e determinou-se a absorvência a 492 nm. Tal como o apMl padrão, utilizou-se o apMl recombinante expresso na E. coli, purificado e quantificado quanto fe proteínas mediante um doseamento de proteínas utilizando BSA como referência.

Consequentemente, o valor da detecção com a anterior associação Se ANOC9108 e OCT9104 foi 0,1 ng/ml-20 ng/ml. 3) Filtração em gele e técnica de Western blotting aplicada ao plasma de humanos saudáveis

Quando se apreciou platasà de humanos saudáveis pelo anterior sistema ELISA para a detecção ao apMl não obteve, a partir do resultado da análise Western blotting, a concentração expectável. Desse rr.odo, submeteu-se o j: * de humanos saudáveis a filtração em gvip Superose 12 (Pharmacia) e submeteu-se cada mm das fracçoes a SDS-PAGE s analísou-se por Western blotting com ANOC9104. Submeteram-se :;r···:r caiiortí·. ae peso a flitraçai:· em em ccAdivlts igUiSift às anteriores e compararam-se as suas localizações com a lov.iil iv. de eluição do tpHl,

Como resultado, observou-se que o apdl foi de um modo geral eluído nas fracções correspondentes a não menos do que 298 kD da massa - Os achados anteriores sugeriram que sangue c apMl está associado a outros componentes oato formar grandes moléculas não lo^fatio-oas o 290 kD da massa molecular de modo que c sítio cfe reconhecimento do anticorpo está dissimulado. Consequentemente, com o conhecimento que o plasma for tratado com um aoopão qm contem SD3, ao anticorpo pode ser possibilitado reagir com o apMl, realizou-se o seguinte estudo. 4) Tratamento de uma amostra de plasma

Is. temperatura de ebulição aqueceu-se o plasma em um tampão que continha SDS (dodecil sulfato de sódio, um detergente forte carregado negativamente) e estudaram-se as condições do tratamento (tempo de ebulição, proporção da mistura entre o plasma e o tampão com SDS). Quanto ao tempo de ebulição, diluiu-se o plasma de humanos saudáveis dez vezes com tampão ea SDS e aqueceu-se á temperatura de ubulicáu durante 10 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 3 kinuiú:\U 5 minutos, ou 1% minutos, e oòiíldirids a dilui,pis final âti 5000 vezes a partir do plasma original, realizou-se c doseamento do apMl. Quanto à proporção da fc&stUM entre c plasma e o com SDS, aqueceu-se à temperatura de nouUuãc· áurãoãu 5 miu:.ã: uA uma ii. lo:,; Λ o d-C 2, 3, 5, 10 ou 20 vezes de piururu de humanos icuduvel\5 em tampão com SDS e, concluída a diXuipIu Idual até. 10 000 οριρρρ 3 doseamento do apdil -

Como consequência, pãdã o apãc para níveis de ordem iguais aos dos resultados de Western blotting de ui arma de humanos .¾ comparação das diferentes condições anteriores de tratamento sugeriu que era apropriado iilloir o plasma dez vezes em tampão com SDS e a diluíççp a temperatura de ebulição durante 5 minutos. !··. \ .... :·: .... ..d·. ··,··..··.·.···:>v .λ····\ ·!.·«: ?'·. '· v .>i* .n.v.lul v.v.l; ;:s :.M.h

Devido aos achados que os limites de detecção do método ELISA para a detecção do à$Ml são 70 ng/ml - e que a eoncuntrpusu do apMl no sangue é da ordem dos pg, considerou--se que se pode diluir e soro antes do doseamento.

Consequentemente, a fim de determinar o factor de diluição adequado, d:i I ο i o~uu e dârio o plasma tratado ccss SDS e em cada diluição doseou-se o apMl. Portanto, tratou-se o soro de humanos com SDS e, seguidamente, diluiu-se LOO-lOdlíD vezes em série e doseou-se o apMl.

Como resultado, entre os limites das determinações desse método ELISA, detectou-se o apMl na proporção do factor de diluição, e apreciando a absorvência, entre outros factores, considerou-se apropriado realizar os ensaios em uma diluição próxima de 5000 vezes. 6) Estudo das condições de colheita das amostras & colheita de sangue em indivíduos saudáveis realizou-se sob diversas condições: soro, heparina e EDTA, e investigaram-se as diferenças do título do apMl d® acordo com as diferenças nas condições de colheita do sangue. Assim, a colmits áé uor;:ç:.íd LuLllíirai-ova Kit 10 ihdividudsí sad:dái?:fs'ii® e tratou-se cada amostra de soro (plasma) com SDS e doseou-se o vezes.

Como resultado, os níveis de apMl no sangue nos 10 indivíduos saudáveis mostraram sobretudo ausência de qualquer desconformidade devida à diferença no Mtoáo de colheita de sangue. /: fetudo das condições de armazenagem das amostras

As condições de armazenagem das amostras para os doseamentos do apMl estudaram-se com amostra de plasma e ae plasma tratado coa SDS. No que respeita às condições de armazenagem do plasma, trataram-se amostras conservadas em repouso à temperatura de 4 a temperatura ambiente, ou à temperatura de 37 °C durante 1, 2, 3 e 6 dias, respectivamente, com SDS e, para investigar a influência do procedimento de congelamento-descongelamento sobre c plasma, submeteram-se amostras a 1, 2, 4 e 8 ciclos de congelamento--descongelamento, respectivamente, trataram-se com SDS, e doseou-se o apMl nas diluições finais de 5000 vezes. Como para as amostras tratadas com SDS, diluiu-se o plasma 10 vezes com tampão SDS, aqueceu-se a temperatura de ebulição durante 5 minutes, diluiu-se '10 vezes, e submeteu-se a um ensaio igual ao anterior.

Consequentemente, nas condições Λ . ; g , observou-se uma pequena influencia sobre os valores determinados de apMl. Ao mesmo tempo investigou-se também a influência do procedimento congelamento-descongelamento utilizando amostras de plasma e de plasma tratado com SDS, observou-se «ma influência insignificante. de

Nos valores de apMl determinados nos soros circadiana. No que diz respeito à ci.urnaf ensaiou-se a mesma amostra 8 vezes e calculou-se o CV. Como para a circadiana, doseou-se a mesma amostra 4 vezes em dias diferentes e calculou-se o CV.

Consequentemente, o CV da variação diurna foi ae 5% e o dv da variação circadiana foi de 10%.

Submeteram-se soros porcinos, bovinos, equinos, caprinos, e murinos ("rat." e "mouse"· ao dèbada ELISA para a detecção do apMl e estudou-se a especificidade do ensaio. Tratou-se o soro proveniente de cada espécie animal com tampão SDS e doseou-se o apMl em diluições finais sucessivas de 100 a 8100 vezes.

Como resultado, observou-se a ocorrência de uma sensibilidade cruzada de aproximadamente 10% enrre os soros bovino e equino, basicamente não se observou qualquer sensibilidade cruzada entre cutras espécies animais.

Cultivou-se una placa de plástico com células da f CnÇiÍk:· de e deíxou-se repausa durante ,5 ea DMEM (Gibco) a aue «a adieiçtãvúV: FBS a idt (Gibco), ; /ml da penicilina e 100 aç/dX oa adadaddddldddd o, à ratura de 37 °C.

De acordo com a captação de [metil quantíficou-se a síntese de ADN nas células de musculatura -vUí: St ·:::; i ;:: :: : : : 7 Π L .1 C 3 S )

Dessa forma, trataram-se as células cultivadas sobre uma placa de 96 cavidades oom 10 u%fmi de apMl e/ou, como controlo, 10 ng/rnl de HB-EGF (factor de crescimento do tipo EGF que se liga a heparína recombinante humana, R&D Systems) em FBS a 2%-DMEM durante 20 horas. Seguidamente, adicionas-se [metil 'Ti i-timidina, 1 pCi/cavidade, durante mais de 5 horas. Trataram-se seguidamente as células com tripsina e, utilizando m\ sistema automático ae colheita de removeram-se da superfície de um filtro de fibra de vidro. Seguidamente, determinou-se directamente a totalidaae captada de [metil JH]-timidina utilizando um contador de partículas beta.

Os resultados estão apresentados na Fig. 3. Esse gráfico de barras construiu-se representando graficamente em ordenadas a proporção relativa entre a síntese de ADN e o controlo adição ao fármaco em ensaio), a adição de apMl (a presente invenção), a âdiçílo de HB-EGF (controlo), e a âdiçàò de apMl+HB-EGF ;·» presente :irclttçcc) em abcissas.

É evidente a partir desse gráfico que o apMl antagoniza a síntese de ADN de células humanas qq Túyc::;;:|.q lisq (crescimento de músculo rimó) * Desse modo, mediante a adição -1¾ apMl, a síntese de MM Cimtmlú pode ser significativamente iy<Ts:CHTn Inibida e mesmo o ê&m&m cn ADN inibida. do crescimento do músculo liso.

Determinação o níveis de apMl no sangue em doentes com /VvmiÍca arterxac coronária

Em 24 machos e 10 fêmeas doentes que por angiografia coronária se verificou possuírem uma estenose não inferior a 75% (designada por CAD(+}) e 66 machos e 39 fêmeas doentes com uma estenose inferior o 75% (designada por CAD(-)), precedeu-se à colheita de sangue e determinou-se a concentração plasmática do apMl pelo método da presente invenção como descrito no Exemplo 2.

Ao mesmc tempo, realizou-se uma Ç/tplturuçso por tomografia computadorizada (CT) ao nível umbilical de cada doente e calculou-se a área gorda visceral [visceral fat area (VFA), cm2] a partir dos achados da CT.

Representando graficamente em ordenadas o nível (pg/ml) plasmático do apMl e em abcissas a VFA, analisou-se a correlação entre o valor determinado e o valor calculado pelo teste t de Student ("unpaired t-test") para os valores mito diferentes de CMH-H e de CMH-K Os resultados estão apresentados na Fig. 4. A partir do gráfico é evidente que os níveis do apMl nos doentes oots doença arterial £P>:ro:r:iâriP [grupo O&Pi-l·} ] foram invariavelmente baixos independentemente da magnitude da área da gordura visceral (VFA), o que Indica que o apMl é eficaz no diagnósti co de uma estenose arterial coronária svshçad» a sua

Observou-se t&íÉsám que c apMl é um importante marcador no ap.-sne progressão da arteriosclerose, c que sugere tv iXidadsi na terapêutica da doença. 0 efeito inibidor do apMi sobre o aparecimento da arteriosclerose

Em um meio de cultura de células endoteliais vasculares cultivaram-se {CO2 a 5%, 37 °C) cêl'alâS endoteliais vasculares aórticas humanas (HAEC; fornecidas por Clontech) semeadas em uma placa de 96 cavidades. Utilizando "Bíocoat" (designação comercial) de Becton Dickinson, a cultura prosseguiu ãté o seu crescimento se ter tornado confluente, período depois do qual se substituiu o meio por TCM 199 [Tissue culture médium 199; Osaka Uníversity Microfeiti. research-Nakalai Tesque] + 0,5% de FCS (soro fetal de vitela; Japan Blomaterials) + 3% de BSA (albumina bovina sérica;

Sigma).

Em seguida, adicionoir;-se o apMl recombinante obtido no Exemplo 1 em quantidades variadas, isto é 1, 5, 10, 25 e 50 pg/ml, e incubou-se o sistema mais 18 horas. Seguidamente, adicionou-se 0 TNF-a (factor de necrose tumoral a, R&D; 10 U/ml) recombinante humano e incubou-se 0 sistema durante miâ 6 horas (o grupo experimental adicionado ao apMl).

Como controlo, preparou-se grupo sem adição do referido apMl recombinante (estimulação do TNF-a apenas).

Utilizando o método ELISA nas células [Takami, S., et ai., Círculation, .9.1 (8), 721-7213 cltfBÇ ] analisou-se se o apMl suprime a expressão das proteínas das de adesão, desígnadamente VCAM-1 (vascular cell adhesíon ICAM-1 (íntercellular adhesion «©Iscui-fe4*!! sobre a superfície

Como um das HAEC através da anterior do vlnl-u. anticorpo anti-ICAM-1 utilizou-se ο β,5B5 DAKQ.

Comparou-se o grupo a que se adicionou o apMl com o grupo sem o apMl e avaliou-se a diferença quanto à significância estatística pelo Teste de Student.

Os resultados relativos âc VCAM-1 apresentam-se na Fig.

Na 5, a abrissa representa o nível de adição do apMl 1 ; -indica ausência de enquanto a ordenada representa o nível de expressão relativo da proteína da molécula de adesão ÇVCAM-1) em cada grupo experimental ou grupo de controlo, considerando-se como a unidade (1) 0 nível de expressão de VCAM-1 sobre a superfície celular das HAFC na ausência de estimulação com o TNF-a. 0 que se segue pode deduzir-se a partir da Fig. 5. Assim, começando na concentração de 1 pg/ml, o apMl inibiu a expressão aumentada pelo TNF-α da molécula de adesão VCAM-1 nas HAEC significativamente ip<:0f05) e de um modo dependente da dose.

Observou-se também que a expressão das outras principais Aclicuitu de adesão ELAMI e CAM-1 foi inibida de ,¾ modo similar pelo apMl.

Tem sido relatado que lesões em células endoteliais vasculares e a resultante ddésio de monócitos são factores Pârdínâl® na patogénese da arteriosclerose [Ross, Nature, 362 801-804 (11115 j s O achado que o apMl inibiu a cas moléculas de adesão determinantes no aparecimento da arteriosclerose (VCAM-1, ELAM, j.CAM i, stc. ) indica que 0 apMl actua de um modo inibi dor sobre o aparecimento da arteriosclerose, sendo assim eficaz como profiláctico da arteriosclerose. APLICABILIDACE 1¾ A presente invenção permite a obtenção de uma composição iníbidora de crescimento de pAsaúlo liso e uma composição para a inibição da expressão de moléculas de adesão em células endoteliais vasculares, as quais compreendem ambas o apMl como um componente activo. Essas composições de acordo com a presente invenção são úteis no campo farmacêutico. Além disso, a presente invenção proporciona um método de doseamento do apMl que consiste na utilização de um anticorpo específico para apMl e através do qual se pode estabelecer um novo método de diagnóstico da arteriosclerose.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS A11 tsiika Pharmaceutical Co., Ltd. <120>Composição iníbidora do crescimento de músculo liso, um método de diagnóstico de arteriosclerose e um kit para esse fim / è -A ::A v-.'d-; ff.,, í:‘

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,.. .· Λ,.............·: · v‘ 88 V ir r ·; :; V· >; V " V F; ΐ f l-is Mp $!$ CU! TV IV Thr oh; .;,v 1 < Fn * 0·^ ¥>: Lee Lee : rv <Τ ' 1 Fs-íí Ess GEt .o. :· 8: Eos Th.ç- EEs TV t:,s; E 1 :« Et ί i ri ·;> F Ã' ΕΕϊ 25. .-.- .%· Eh? Vs VE 0E ; >E ;È:' 8' v) S ; y .8 U g: tsr F1 Ti; Vtti s s: E: Eís thr V 1 'y GíS t:ss Gjp ::.y '8 Lus EEv A E Vi· hVEÊÍ lés 1 i s Ets F :rt. y p 00 m vi 0 200 ás ρ O sí :IS í- i1·' ÈE v ic T t s G\ψ V 1 l-.fí! Etr ··;. j 8: ξ ií yt · :¾ •:F ;! ' < óci E Es 02 12 EE Ρ ί·. -X Vs GAs Ha %E s J v E ?i. tps E tu E í vi •y> ^ · ·' ”: y .;h. | y EEp Mr IV K SE SE ν'-si V" Vs Bér 0: .: ¾ h ;v. Eis Vt TV Ees &: l E; fEc- y-·-,. s ,Λ ¥ã.í Eis U Ç: s ee íV i 1E rf» ESS LvhE ;-. È’ ;: 20 iè 1 Έ Ar §; ?¥>?* Tti; 5 Ι,Ρΰ l Vi V Ç; Τρτ 88.¾ h. C1 r E sil. A.ss 5 EO m : 55, Ty - Ers y j ρ -5 Si EÉ r tEy Eíi TV IV v,, ir :$ h: i ! 8 F f E :S ! 1 Lsí:: tos ;S| 14 D ·; ϊ' : fyr t': tv -χ Tel χ E: s í g: EEs VE Tpç Ès t lis S th EsE. Eys W 145 150 E 55 160 ,ν. ν> i<r£ FV Evs Eys Asp Eps A Is Met Err Phe Thr T γ y à.v ;.N Gill Jy;; 155 :í to ; Tt 0 5 SV ESS VS SV Vr C :‘8 : et À ;·:· ί-' tv ;j. EE 8: .·. Vai Leu Leu H ç t Leu 180 i 85 130 0 ί ϊί :· 2·:' 2 (Β S 0:¾¾ G Eí5 tsj E> l £ £ h, i ··· ,: y. í; Í T G i y Giu Arg .2·;.' :;· ;·.· 0 88 y β v. £ ΐ: 8:: : >: Vs ?V V* s ΰ V:: E\ Vy:: sus Ess 5er τ .., Thr -Gly Phe 210 21 ã h.vh-.· Εί:« Leu Tyr Hís Asp Thr As R 225 220 < 21X >2 9 ao printer CfoGRard; da PCR para o apMl â do primer (reverse) da PCR para o apMl AAGGATCCTC AGTTGGTGTC ATGGTAGAG 29

Lisboa, 29 de Junho de 2007

Claims (5)

1. Utilização do factor de apMl do tecido adiposo de um seu sal aceitável sob o poirco de vista IsvsmadcâboiCô para a fabricação de uma composição destinada a inibir o ÇlSiUtditS:.;:?';tu tk? titiâtuid liso.

2. Utilização do factor de seereçào apMl especifico do tecido adiposo ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacológico para a fabricação de uma composição destinada a profilaxia ou ao tratamento terapêutico da arteriosclerose.

3. Utilização do factor de secreção apMl específico do tecido adiposo ou de um seu sal aceitável sob o ponto ae vista farmacológico para a fabricação de uma composição destinada à profilaxia ou ao tratamento terapêutico da restenose pós-angioplastia.

4. Utilização de um anticorpo dirigido contra o factor de secreção apMl específico do tecido adipcso para a fabricação de um agente de diagnóstico para a arteriosclerose.

5. Processo de diagnóstico da arteriosclerose, que compreende a quantificação do apMl em uma amostra in vitro com um anticorpo e a comparação dc valor assim encontrado com os valores avaliados indivíduos saudáveis e doentes de arteriosclerose. Lisboa, 29 di« Junho de 2007