JP3538711B2 - 平滑筋増殖抑制組成物、動脈硬化症診断方法及びそのキット - Google Patents

平滑筋増殖抑制組成物、動脈硬化症診断方法及びそのキット

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JP3538711B2
JP3538711B2 JP2000517735A JP2000517735A JP3538711B2 JP 3538711 B2 JP3538711 B2 JP 3538711B2 JP 2000517735 A JP2000517735 A JP 2000517735A JP 2000517735 A JP2000517735 A JP 2000517735A JP 3538711 B2 JP3538711 B2 JP 3538711B2
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arteriosclerosis
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cells
smooth muscle
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佑次 松沢
安一 大本
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Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】
技術分野 本発明は、脂肪組織特異的分泌因子ａｐＭ１（Adipos
e Most Abundant Gene Transcript 1）を有効成分とす
る平滑筋増殖抑制組成物、検体中の該ａｐＭ１を測定す
る動脈硬化症の診断方法及び該ａｐＭ１に対する抗体を
有効成分とする動脈硬化症診断キットに関する。 背景技術 現代社会において、脂肪の過剰蓄積である肥満が、糖
尿病、高脂血症、高血圧や、更に狭心症、心筋梗塞等の
動脈硬化疾患の発症に関与していることは周知の事実で
ある。該肥満の原因には様々な遺伝因子と環境因子の双
方が関与している。 最近、レプチンを始めとする多くの肥満遺伝子が動物
モデルから単離された。之等単離された遺伝子群はヒト
の肥満成立に関与すると考えられる一方で、現代人の過
剰な食物摂取、運動不足等の環境因子もまた、脂肪蓄積
を介して糖尿病や動脈硬化疾患等の他の重要な要因と考
えられる。 肥満遺伝子の検索のみでなく、過栄養状態において脂
肪組織でどのような遺伝子の発現が誘導され、それが個
体にどのような影響を与えるのかを明らかにするアプロ
ーチが、上記疾患の病因解明や治療技術の確立に非常に
重要な意味があると考えられる。 本発明の目的は、肥満に関連する各種疾患、殊に、狭
心症、心筋梗塞等の動脈硬化症の病因解明、治療技術の
確立に有用な肥満関連遺伝子及びその発現物を解明し、
之等を利用して各種疾患の治療、診断技術を確立するこ
とにある。 本発明者らは上記目的より鋭意研究を重ねた結果、先
に、脂肪の中でも腹腔内内臓脂肪の蓄積が耐糖能異常、
高脂血症、高血圧等と密接に結びつくことを明らかにし
た。また、脂肪組織発現遺伝子の大規模シークエンス解
析により、脂肪組織には多くの分泌蛋白質遺伝子が発現
しており、特に内臓脂肪において様々な生理活性物質遺
伝子の発現が見られることも明らかにした。更に、之等
既知の遺伝子に加えて、新たに脂肪組織特異的コラーゲ
ン様蛋白ａｐＭ１遺伝子のクローニングにも成功した(B
iochem.Biophys.Res.Commun., 221, 286-289(1996))。 このａｐＭ１遺伝子は、２４４アミノ酸からなる分泌
蛋白質（ａｐＭ１）をコードしており、６６アミノ酸の
コラーゲン様モチーフ（Ｇ−Ｘ−Ｙ）をもち、補体系の
Ｃ１ｑやコラーゲンＸ、VIIとホモロジーを有してい
た。しかしながら、該遺伝子及びその発現物ａｐＭ１の
生理機能は、未知であった。 本発明者らは、引続く研究において、上記ａｐＭ１遺
伝子の遺伝子工学的手法による発現、該発現物ａｐＭ１
に対する抗体の作製、該抗体を利用したａｐＭ１の測定
系の確立、該測定によるａｐＭ１血中濃度と体脂肪分布
乃至各種疾患との関連等について一連の検討を行った結
果、殊にａｐＭ１が平滑筋増殖抑制作用を有するという
事実及びその血中濃度が動脈硬化症をよく反映するとい
う事実を新たに発見した。 また、本発明者らは、ａｐＭ１がステント経皮経管冠
動脈血管拡張術（ＰＴＣＡ）等の血管再建術後の再狭窄
の予防及び治療に有効であり、ひいては例えば狭心症や
心筋梗塞等の血管障害を伴う動脈硬化症等の予防及び治
療にも有効であることを見いだした。本発明はかかる知
見に基づいて完成されたものである。 発明の開示 本発明によれば、ａｐＭ１及びその塩から選ばれる少
なくとも１種の薬学的有効量を、製剤学的に許容される
担体と共に含有する平滑筋増殖抑制組成物が提供され
る。 また本発明によれば、ａｐＭ１及びその塩から選ばれ
る少なくとも一種の薬学的有効量を、製剤学的に許容さ
れる担体と共に含有する血管再建術後の再狭窄の予防及
び治療組成物が提供される。 また本発明によれば、ａｐＭ１及びその塩から選ばれ
る少なくとも１種の薬学的有効量を、製剤学的に許容さ
れる担体と共に含有する動脈硬化症予防及び治療組成物
が提供される。 更に、本発明によれば、検体中のａｐＭ１を、ａｐＭ
１に対する抗体を用いて測定し、測定値を健常者及び動
脈硬化症患者の測定値と対比して動脈硬化症を診断する
動脈硬化症の診断方法が提供される。 加えて、本発明によれば、ａｐＭ１に対する抗体を有
効成分として含む動脈硬化症の診断用キット、及び該診
断に有効なａｐＭ１に対するモノクローナル抗体が提供
される。 本発明に係わる平滑筋増殖抑制組成物は、その有する
平滑筋増殖抑制作用を通じて、例えば狭心症、血栓症を
含む心筋梗塞、脳梗塞等の血管障害を伴う動脈硬化症の
予防及び治療や、かかる動脈硬化症の進展の予防に有効
である。事実、本発明組成物の有効成分とするａｐＭ１
は、動脈硬化の発症を規定する細胞接着分子であるＶＣ
ＡＭ−１(Vascular Cell Adhesion Molecule-1)、ＥＬ
ＡＭ(Endothelial Leukocyte Adhesion Molecule)、Ｉ
ＣＡＭ−１(Intercelular Adhesion Molecule-1)等の発
現を抑制する作用を奏し得る。このことから、本発明組
成物は、各種動脈硬化症の発症に抑制的に働くのであ
る。 また、このことから本発明は、血管内皮細胞における
接着分子の発現を抑制する医薬組成物をも提供するもの
である。 ａｐＭ１が上記細胞接着分子の発現を抑制するという
事実より、本発明組成物は、例えばＶＣＡＭ−１の発現
量の上昇に関連する疾患として知られている、好酸球浸
潤に伴われるＩ型アレルギー反応と関連する気管支喘息
等の予防及び治療にも適応可能である。 また、上記ＩＣＡＭ−１及びＥＬＡＭは炎症に関連す
る接着分子としても知られているので、ａｐＭ１を有効
成分とする本発明組成物は、かかる装着分子の発現の抑
制を通じて、例えば抗炎症剤としてや、慢性関節リウマ
チ治療剤としても適応できると考えられる。 更に、本発明組成物は、例えばステント経皮経管冠動
脈血管拡張術（stent PTCA）等の血管再建術後の再狭窄
の予防や治療にも有効である。即ち、狭心症や心筋梗塞
における冠動脈狭窄に対する血管再建術施術後には、虚
血再灌流及び血管内皮細胞障害により、血管内皮細胞に
対する接着分子が発現し、平滑筋細胞の増殖が生じ、再
狭窄が発症する。本発明組成物は、この接着分子の発現
及び平滑筋細胞の増殖を抑制することによって、血管再
建術後の虚血再狭窄のむ予防にも有効である。 本発明により提供される動脈硬化症の診断方法は、平
滑筋の増殖能（平滑筋細胞のＤＮＡ合成能）という新し
い指標を利用するものであり、これは、検体中のａｐＭ
１量を該ａｐＭ１に対する特異抗体を用いて測定、定量
することにより実施される。 以下、本発明組成物において有効成分とするａｐＭ１
の製造、これを有効成分とする本発明組成物の調製、該
ａｐＭ１に対する抗体の製造、及び該ａｐＭ１の測定に
つき、順次説明する。 尚、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配
列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの
規定(IUPAC-IUB Communication on Biological Nomencl
ature, Eur.J.Biochem., 138, 9(1984)）、「塩基配列
又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイド
ライン」（平成１０年６月、特許庁編）及び当該分野に
おける慣用記号に従うものとする。 ａｐＭ１は、例えば通常の遺伝子工学的手法〔例え
ば、Science, 224, 1431 (1984); Biochem.Biophys.Re
s.Comm., 130, 692 (1985); Proc.Natl.Acad.Sci., US
A., 80, 5990(1983)等参照〕により組換え蛋白として製
造することができる。上記においてａｐＭ１遺伝子とし
ては、本発明者らが先に確立したものを使用できる(Bio
chem.Biophys.Res.Commun., 221, 286-289 (1996))。 また、該ａｐＭ１は、上記遺伝子によりコードされる
アミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成手法によ
り製造することもできる。 遺伝子工学的手法を採用したａｐＭ１の製造は、より
詳細には、所望蛋白をコードする遺伝子が宿主細胞中で
発現できる組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導
入して形質転換し、該形質転換体を培養することにより
行われる。 ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のい
ずれも用いることができる。該真核生物の細胞には、脊
椎動物、真核微生物等の細胞が含まれる。脊椎動物細胞
としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞(Cell, 2
3, 175(1981))やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞及
びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株(Proc.Natl.Aca
d.Sci., USA., 77, 4216 (1980))等がよく用いられる
が、これらに限定される訳ではない。 脊椎動物の発現ベクターとしては、通常発現しようと
する遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのス
プライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等
を保有するものを使用できる。これは更に必要により複
製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例として
は、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳ
Ｖ２dhfr(Mol.Cell.Biol., 1, 854(1981))等を例示でき
る。 また、真核微生物としては、酵母が一般によく用いら
れ、中でもサッカロミセス属酵母が有利に利用できる。
酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば酸
性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有する
ｐＡＭ８２（Proc.Natl.Acad.Sci., USA., 80, 1(198
3))等を利用できる。 原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によ
く用いられる。これらを宿主とする場合、例えば宿主菌
中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクタ
ー中に所望遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流に
プロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガー
ノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン
（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを利用する
のが好ましい。上記宿主としての大腸菌としては、エシ
エリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｋ１２株等がよく用
いられ、ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２及びその
改良ベクターがよく用いられるが、これらに限定されず
公知の各種の菌株及びベクターも利用できる。プロモー
ターとしては、例えばトリプトファン(trp)プロモータ
ー、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬ／
ＰＰプロモーター等を使用できる。 かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿主細胞への
導入方法及びこれによる形質転換方法は、一般的方法に
従うことができる。 得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養
により形質転換体の細胞内、細胞外乃至細胞膜上に目的
とする組換え蛋白が表現、生産、蓄積乃至分泌される。
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に
応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、その
培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。 上記の如くして得られるａｐＭ１は、所望によりその
物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作
（「生化学データーブックII」、1175-1259頁、第１版
第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Bi
ochemistry, 25(25), 8274(1986); Eur.J.Biochem., 16
3,313(1987)等参照)により分離、精製できる。より具体
的には、例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処
理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破
砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾
過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマト
グラフィー、透析法、これらの組合せ等により分離、精
製できる。 上記ａｐＭ１は、また、そのアミノ酸配列情報に従っ
て、一般的な化学合成法により製造することができる。
該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合
成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳し
くは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個
ずつ逐次結合させ鎖を延長させていく所謂ステップワイ
ズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグ
メントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリ
ング反応させるフラグメント・コンデンセーション法と
を包含する。 上記ペプチド合成法に採用される縮合反応も、常法に
従うことができる。該方法には、例えば、アジド法、混
合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元
法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣ
Ｃ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−
ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノル
ボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッド
ワード法等が包含される。 これら各方法に利用できる溶媒も、この種ペプチド縮
合反応に使用されることのよく知られている一般的なも
のから適宜選択することができる。その例としては、例
えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサ
ン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及び
これらの混合溶媒等を挙げることができる。 尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しな
いアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一
般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチ
ルエステル、第３級ブチルエステル等の低級アルキルエ
ステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジ
ルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル等のアラルキ
ルエステル等として保護することができる。 また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシ
ン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジル
オキシカルボニル基、第３級ブチル基等で保護されても
よいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。 更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニト
ロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、
メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニ
ル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチル
オキシカルボニル基等の適当な保護基により保護するこ
とができる。 上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に
得られる蛋白質におけるこれら保護基の脱保護反応もま
た、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモ
ニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、
トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を
用いる方法等に従って実施することができる。 かくして得られるａｐＭ１は、前記した各種の方法、
例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲル
クロマトグラフィー、向流分配法等のペプチド化学の分
野で汎用される方法に従い、適宜その精製を行うことが
できる。 本発明に係わる組成物は、ａｐＭ１又はその製剤学的
に許容される塩を有効成分とする。かかる塩には、例え
ばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグ
ネシウム、バリウム、アンモニウム等のアルカリ金属
塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩等が包含さ
れる。これらの塩は当業界で周知の方法により調製され
る。更に、上記塩には、ａｐＭ１と適当な有機酸乃至無
機酸とを常法に従い反応させて得られる酸付加塩も包含
される。代表的酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化
水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、
蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸
塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスル
ホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、
フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グ
リコール酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸
塩及びナプシレート等を例示できる。 本発明に関わる組成物は、一般には、上記有効成分の
薬学的有効量を適当な医薬担体と共に含む医薬製剤形態
に調製され、実用される。 上記医薬製剤に利用できる担体としては、製剤の使用
形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合
剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤或
は賦形剤等を例示できる。これらは得られる製剤の投与
単位形態に応じて適宜選択使用できる。 医薬製剤の投与単位形態としては、各種の形態が治療
目的に応じて選択できる。その代表的なものには、錠
剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体
投与形態や、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシ
ル等の液剤投与形態が含まれる。これらは投与経路に応
じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下
剤、軟膏剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、
調合、成形乃至調製することができる。上記医薬製剤に
は、また通常の医薬製剤に使用し得る各種の成分、例え
ば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、
ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜添加できる。 上記安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや
通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示
できる。之等は単独で又は界面活性剤等と組合せて使用
できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性を
より向上させ得る場合がある。 上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、これには例え
ばグリシン、システィン、グルタミン酸等が包含され
る。 上記糖類としても特に限定はなく、例えばグルコー
ス、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マン
ニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコー
ル、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラ
ン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫
酸、ヒアルロン酸等の多糖類等及びそれらの誘導体等を
使用できる。 界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性及び非
イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには例
えば、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキ
ルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル
系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリ
ド系等が包含される。 セルロース誘導体としても特に限定はなく、メチルセ
ルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロ
ース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナ
トリウム等が挙げられる。 糖類の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１
ｍｇ以上、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇの範囲から
選ばれるのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効
成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ以上、好ましくは
約０．０００１〜０．０１ｍｇの範囲から選ばれるのが
適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分
１μｇ当り約０．０００１ｍｇ以上、好ましくは約０．
００１〜０．１ｍｇの範囲から選ばれるのが適当であ
る。アミノ酸は、有効成分１μｇ当り約０．００１〜１
０ｍｇの範囲から選ばれるのが適当である。また、セル
ロース誘導体の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０
０００１ｍｇ以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍ
ｇの範囲から選ばれるのが適当である。 本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲
から適宜選択でき、通常約０．００００１〜７０重量
％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲から
選ばれるのが適当である。 更に、上記医薬製剤中に適宜添加することができる緩
衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−
アミノカプロン酸、グルタミン酸及び／又はそれらに対
応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、
カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やア
ルカリ土類金属塩）等を例示できる。等張化剤として
は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン
等を例示できる。またキレート剤としては、エデト酸ナ
トリウム、クエン酸等を例示できる。 本発明医薬製剤には、液剤に加えて、該液剤を凍結乾
燥化し保存し得る状態にした後、用時水、生理的食塩水
等を含む緩衝液等に溶解して適当な濃度に調製して使用
される用時溶解剤も包含される。 本発明医薬製剤を錠剤の形態に成形するに際しては、
前記担体として、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、
ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリ
ン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形
剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブド
ウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチル
セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセ
ルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；カルボキ
シメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセル
ロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロ
ース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン
末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウ
ム等の崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エ
ステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノ
グリセリド等の界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオ
バター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウ
ム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリ
セリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリ
ン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製
タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリ
コール等の滑沢剤等を使用できる。 更に錠剤は、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例
えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコー
ティング錠或は二重錠乃至多層錠とすることができる。 丸剤の形態に成形するに際しては、担体として例えば
ブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カ
オリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガン
ト末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン、
カンテン等の崩壊剤等を使用できる。 カプセル剤は、常法に従い通常有効成分を上記で例示
した各種の担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質
カプセル等に充填して調製される。 経口投与用液剤は、慣用される不活性希釈剤、例えば
水を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁
液、シロップ、エリキシル等を包含する。該液剤には更
に湿潤剤、乳剤、懸濁剤等の助剤を含ませることがで
き、これらは常法に従い調製される。 非経口投与用液剤、例えば滅菌水性乃至非水性溶液、
エマルジョン、懸濁液等への調製に際しては、希釈剤と
して例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリ
ルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコー
ル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及び
オリーブ油等の植物油等を使用できる。該液剤にはまた
注入可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチル等
を配合することもできる。これらには更に通常の溶解補
助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散
剤等を添加することもできる。 医薬製剤の滅菌は、例えばバクテリア保留フィルター
を通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理及び加
熱処理等により実施できる。また、医薬製剤は使用直前
に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる
滅菌固体組成物形態に調製して、使用直前に滅菌するこ
ともできる。 坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、担
体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、
高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチ
ン及び半合成グリセライド等を使用できる。 ペースト、クリーム、ゲル等の軟膏剤の形態に成形す
るに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パ
ラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレン
グリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベン
トナイト及びオリーブ油等の植物油等を使用できる。 経鼻又は舌下投与用製剤は、周知の標準賦形剤を用い
て、常法に従い調製することができる。 尚、本発明医薬製剤中には、必要に応じて着色剤、保
存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品等を含有さ
せることもできる。 上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製
剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等
に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁
剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、注射
剤は単独で又はブドウ糖やアミノ酸等の通常の補液と混
合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、
皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与
され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与さ
れ、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投
与される。 上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量及びそ
の投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与
法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件等に応じ
て広範囲より適宜選択される。通常好ましくは、血中に
おける有効成分濃度が約１〜２００μｇ／ｍｌ、より好
ましくは約１０〜２０μｇ／ｍｌ程度となる量を目安と
して決定されるのがよい。該製剤は１日に１回又は数回
に分けて投与することができる。 以下、ａｐＭ１に対する特異抗体の製造につき詳述す
れば、該ａｐＭ１に対する特異抗体は、ａｐＭ１、その
断片乃至之等をハプテンとして含む複合蛋白を免疫抗原
として利用して、抗血清（ポリクローナル抗体）及びモ
ノクローナル抗体として製造することができる。 これら抗体の製造方法自体は、当業者によく理解され
ているところであり、本発明抗体の製法もこれら常法に
従うことができる(例えば続生化学実験講座「免疫生化
学研究法」、日本生化学会編（1986）等参照)。 より詳しくは、ａｐＭ１に対するモノクローナル抗体
は、例えば上記免疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞
（免疫細胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞
(hybridoma)を作成し、これよりａｐＭ１を認識する所
望抗体を産生するクローンを選択し、該クローンの培養
により製造できる。 上記において用いられる免疫抗原としてのａｐＭ１と
しては、特に限定はなく、既に公知の遺伝子組換え技術
に従い製造された組換えａｐＭ１、その一部のアミノ酸
配列を有するペプチド、之等と他の担体との複合物等の
いずれでもよい。尚、上記ａｐＭ１は、脂肪組織特異的
分泌因子として知られており、これと同等の活性乃至作
用を有する蛋白、例えばＧＢＰ２８(Gelatin-binding p
rotein of 28 kDa)もまた、上記免疫抗原として同様に
利用することができる。 上記方法において免疫抗原で免疫される哺乳動物とし
ては、特に制限はなく、細胞融合に使用する形質細胞腫
細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般
にはマウス、ラツト、兎等が有利に用いられる。 免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳
動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等により投与す
ることにより行われる。好ましくは、免疫抗原を、所望
により通常のアジュバントと併用して、供試動物に２〜
１４日毎に数回、総投与量が約１００〜５００μｇ／マ
ウス程度となるように投与することにより行われる。免
疫抗原としては、上記最終投与の約３日後に摘出した脾
臓細胞を使用するのが好ましい。 更に、上記免疫細胞と融合される他方の親細胞として
の哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々
のもの、例えばｐ３(p3/x63-Ag8)〔Nature, 256,495-49
7(1975)〕、ｐ３−Ｕ１〔Current Topics in Microbiol
ogy and Immunology, 81, 1-7(1978)〕、ＮＳ−１〔Eu
r.J.Immunol., 6, 511-519(1976)〕、ＭＰＣ−１１〔Ce
ll, 8, 405-415(1976)〕、ＳＰ２／０〔Nature, 276,26
9-270(1978)〕、ＦＯ〔J.Immunol.Meth., 35,1-21(198
0)〕、×６３．６．５．３．〔J.Immunol., 123,1548-1
550(1979)〕、Ｓ１９４〔J.Exp.Med., 148,313-323(197
8)〕等や、ラットにおけるＲ２１０〔Nature, 277,131-
133(1979)〕等の骨髄腫細胞等を使用できる。 上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、公知
の方法、例えばMilsteinらの方法〔Method in Enzymolo
gy, Vol.73, pp.3(1981)〕等に準じて行うことができ
る。より具体的には、上記融合反応は、通常の融合促進
剤、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、センダイ
ウイルス(ＨＶＪ)等の存在下に、通常の培地中で実施で
きる。培地には更に融合効率を高めるためにジメチルス
ルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加することもで
きる。 免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通常の方法
と変りはなく、例えば形質細胞腫細胞に対して免疫細胞
を約１〜１０倍用いるのが普通である。融合反応時の培
地としては、形質細胞腫細胞の増殖に通常使用される各
種のもの、例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培
地、その他のこの種細胞培養に一般に利用されるものを
例示できる。通常之等培地は牛胎児血清(ＦＣＳ)等の血
清補液を抜いておくのがよい。 融合は上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量を、
上記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰ
ＥＧ溶液、例えば平均分子量１０００〜６０００程度の
ものを、通常培地に約３０〜６０w/v％の濃度で加えて
混ぜ合せることにより行われる。以後、適当な培地を逐
次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰返すことに
より所望のハイブリドーマが形成される。 得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別
用培地、例えばＨＡＴ培地(ヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む培地)で培養することにより
行われる。ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリ
ドーマ以外の細胞(未融合細胞等)が死滅するのに充分な
時間、通常数日〜数週間行えばよい。かくして得られる
ハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とする
抗体の検索及び単一クローン化に供される。 目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法〔Engv
all,E., Meth.Enzymol., 70, 419-439(1980)〕、プラー
ク法、スポット法、凝集反応法、オクテロニー(Ｏuchte
rlony)法、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)法等の一般に
抗体の検出に用いられている種々の方法〔「ハイブリド
ーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニ
ング発行、第30-53頁、昭和57年3月5日〕に従い実施で
き、この検索には前記免疫抗原が利用できる。 かくして得られるａｐＭ１を認識する所望のモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で
継代培養することができ、また液体窒素中で長期間保存
することができる。 上記ハイブリドーマからの所望抗体の採取は、該ハイ
ブリドーマを、常法に従って培養してその培養上清とし
て得る方法やハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳
動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が
採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適
しており、後者の方法は、抗体の大量生産に適してい
る。 上記のごとくして得られる抗体は、更に塩析、ゲル濾
過法、アフィニティクロマトグラフィー等の通常の手段
により精製することができる。かくして、ａｐＭ１に特
異反応性を有する所望のａｐＭ１モノクローナル抗体が
得られる。 本発明はまた、検体中のａｐＭ１の測定技術、これに
よる動脈硬化症の診断法をも提供するものである。 上記動脈硬化症の診断は、患者の血液又は尿より得ら
れた検体中のａｐＭ１量をａｐＭ１に対する抗体を用い
る液相系又は固相系免疫検定法により測定し、測定値を
動脈硬化症患者の同値及び正常者の同値と対比すること
により、即ち検体におけるａｐＭ１量値が健常人のそれ
に比して高いか低いかを判定することにより行われる。 ここで免疫検定法としては、サンドイッチ法を用いる
ＥＬＩＳＡ法が好ましい。 この方法につき詳述すれば、その原理は酵素抗体法に
基づいている。即ち、この方法によれば、例えば、まず
９６ウエルプレートに抗ヒトａｐＭ１モノクローナル抗
体（第１抗体）を固相化し、更に非特異吸着を防ぐため
にブロッキングを行う(固相化反応)。次に、上記モノク
ローナル抗体固相化プレートにヒトａｐＭ１標準液又は
検体を加えて反応させる(第１反応)。プレートを洗浄
後、抗ヒトａｐＭ１抗体(第２抗体)を加えて反応させる
(第２反応)。プレートを洗浄し、ＨＲＰ標準抗ウサギＩ
ｇＧ抗体(第３抗体)を加えて反応させる(第３反応)。プ
レートを洗浄後、基質を加えて酵素反応を行い(第４反
応)、活性を波長４９２ｎｍにおける吸光度として読み
とる。 上記においては、第１抗体としてポリクローナル抗体
を、第２抗体としてモノクローナル抗体を用いることも
できる。 上記方法に従えば、用いる標準液又は検体中のａｐＭ
１濃度が高いほど、強い酵素活性（吸光度）が認められ
る。上記標準液の吸光度をプロットして標準曲線（検量
線）を作製し、検体の吸光度を該検量線と対比させれ
ば、検体中のａｐＭ１を簡便に読みとることができ、か
くして、検体が動脈硬化症に罹患しているか否かの診断
が行い得る。 更に、本発明に係わる上記動脈硬化症の診断は、特定
のキットの利用により簡便に実施可能であり、本発明は
かかるキットをも提供する。 以下、本発明キット及びこれを利用して検体中のａｐ
Ｍ１量を検出する方法につき詳述する。 本発明キットを利用した検定法において、検体として
は尿又は血液（特に空腹時の血清又は血漿）が好まし
く、之等は被検者より採取、採血後、常法に従い調製で
きる。 本発明に係わるキットは、ａｐＭ１に対するモノクロ
ーナル抗体又はポリクローナル抗体（抗ａｐＭ１抗体）
を必須成分として、これとａｐＭ１に対するポリクロー
ナル抗体又はモノクローナル抗体のそれぞれとの組合わ
せ、或いは上記モノクローナル抗体どうしの組合わせを
含有するのが好ましい。 上記モノクローナル抗体は、好ましくは予め固定化さ
れたプレート上の担体と結合された固相化されたプレー
ト形態として用いられるのがよい。また、アフィニィテ
イゲル形態としてそのまま用いることでき、また該ゲル
を振とう及び遠心分離が可能であってアフィニィティゲ
ル非結合フラクションの抽出可能な適当な容器及至テス
トチューブに調製して用いることもできる。 また予め適当な緩衝液、例えば０．０１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．４)＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ等の緩衝
液で上記固相化プレート又はゲルを平衡化しておくこと
も好ましい。更に上記固相化プレート又はゲルには、例
えばアジ化ナトリウム等の通常の保存剤を含ませること
ができる。 更なる本発明キット成分としてＥＬＩＳＡのための第
２抗体として、標識した抗ヒトａｐＭ１ポリクローナル
抗体を供給するのがより好ましい。尚、本発明キットに
は、必要に応じてサッカロースやウシ血清蛋白質等の安
定化剤及び／又は保存剤を添加配合することができる。
この保存剤はキットの使用に際し、実験値に影響を与え
ないものから選択され、例えば代表的には希釈したアジ
化ナトリウム等を例示できる。 また本発明キットには、水溶性もしくは水と混和し得
るグリセリン、アルコール類、グリコール類、グリコエ
ーテル類、等を含有させること、及び脱脂質のためのエ
タノールとジエチルエーテル、メタノールとジエチルエ
ーテル、クロロホルムとメタノールのような混合有機溶
媒等を含有させることもできる。 図面の簡単な説明 図１は、ａｐＭ１遺伝子の塩基配列を含むプラスミド
の制限酵素地図を示す。 図２は、組換えａｐＭ１を用いて作製したスタンダー
ドカーブを示す。 図３は実施例３に従って測定されたａｐＭ１の平滑筋
抑制作用を示すグラフである。 図４は実施例４に従って測定された冠動脈疾患患者及
び健常人の血中ａｐＭ１レベルを示すグラフである。 図５は実施例５に従って測定された接着分子の細胞表
面での発現レベルをａｐＭ１が濃度依存的に抑制するこ
とを示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態 以下、本発明をより詳しく説明するため実施例を挙げ
るが、本発明は之等に限定されない。 実施例１ 組換えapM1の製造 （１）apM1の大腸菌での発現 1）apM1 PCR apM1遺伝子の塩基配列及び該遺伝子配列でコードされ
るアミノ酸配列は、ジーンバンク(gene bank)にアクセ
ッション番号Ｄ４５３７１として登録されている。その
コーディング領域(ＣＤＳ)は、配列番号２７〜７６１番
目に示されている。その推定アミノ酸配列は配列番号１
に示すとおりである。該配列において、１−１４番目は
シグナルペプチドであり、１５−２４４番目が成熟型ap
M1である。 apM1遺伝子は、阪大第二内科船橋先生より供与された
プラスミドを鋳型としてPCR法により増幅した。apM1遺
伝子の塩基配列を含むプラスミドの制限酵素地図を、図
１に示す。 PCRプライマーは、apM1遺伝子の塩基配列のうち、69
〜761番の693bpを増幅し、その5'末端にNdeIサイトを、
3'末端にBamHIサイトを増設するように設計し、自動Ｄ
ＮＡ合成機により製造した。このPCRプライマーの配列
は、配列番号３(forward)及び４(reverse)に示す通りで
ある。 2）apM1遺伝子のサブクローニング 上記1)で得られたPCR産物をpT7 Blue T-Vector(ノバ
ゲン(Novagen)社製)にサブクローニングし、その塩基配
列(pT7-apM1)に変異がないことを確認した。 3）発現ベクターの構築 発現ベクターpET3c(ノバゲン社製)をNdeI及びBamHIで
消化し、約4600bpの断片得た。また、上記1)で得たpT7-
apM1をNdeI及びBamHIで消化し、約700bpの断片を得た。
これらの断片をライゲーションし、得られた発現ベクタ
ーをpET3c-apM1とした。 4）大腸菌での発現 宿主大腸菌であるBL21(DE3)pLysSを、上記3)で得たpE
T3c-apM1でトランスフォームし、2xT.Y.Amp.(トリプト
ン１６ｇ、酵母抽出物１０ｇ及びＮａＣｌ５ｇ)で培養
した。菌体が対数増殖期に入ったところでIPTG（イソプ
ロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加し、
組換えapM1の生産を誘導した。IPTGによる誘導前後の大
腸菌及びIPTG誘導後のインクルージョンボディー(大腸
菌の不溶性画分)をサンプリングし、SDS-PAGE及びウエ
スタンブロッティングによりapM1の発現を確認した。 5）結果及び考察 上記に従い大腸菌で発現した発現物は、apM1のアミノ
酸配列において、シグナル配列を除いた１５番Glyから2
44番Asnまでの230アミノ酸で、N端に開始コドン由来のM
etが付加されている。そのアミノ酸配列は、配列番号２
に示されるとおりである。 前述の方法で得られた大腸菌をSDS-PAGEで分析したと
ころ、IPTG誘導後の大腸菌及びインクルージョンボディ
ーにおいて約30kDのバンドが確認できた。 次に、2種類の抗体(ポリクローナル抗体(合成ペプチ
ド))でウエスタンブロッティングを行ったところ、両方
の抗体ともにその約30kDのバンドと反応しており、宿主
大腸菌とは全く反応は認められなかった。 また、この約30kDのバンドを切り出してN端10アミノ
酸の配列を確認したところ、予想された配列と同じであ
り、マイナー成分としてN端のMetがはずれているものも
確認された。 以上の結果から、約30kDの蛋白質として組換えapM1が
発現していることが明らかとなった。また発現した組換
えapM1の殆どは、インクルージョンボディーとして菌体
内に蓄積されていた。 （２）組換えapM1の大腸菌からの精製 組換えapM1の大腸菌からの精製は、以下の5つのステ
ップにて行った。 1）大腸菌の培養 発現ベクターpET3c-apM1でトランスフォームした大腸
菌BL21(DE3)pLysS(ノバゲン社製)を2xT.Y.Amp.Cm.(トリ
プトン16g、酵母抽出物10g、クロラムフェニコール25μ
g/ml及びＮａＣｌ5g)で前培養(37℃、振盪培養)し、翌
日、その培養液を100倍量の2xT.Y.Amp.で希釈して更に
培養した。2〜3時間培養して培養液のOD550が0.3〜0.5
になったところで、最終濃度0.4mMのIPTGを添加し、組
換えapM1の生産を誘導した。IPTG添加後約3〜5時間で培
養液を遠心分離(5000rpm、20分、4℃)し、得られた大腸
菌の沈殿を凍結保存した。 2）大腸菌からのインクルージョンボディーの調製 大腸菌の沈殿を50mM Tris-HCl(pH8.0)に懸濁し、リゾ
チームで37℃、1時間処理した後、最終濃度0.2％のトリ
トンＸ−１００(TritonX-100, 片山化学社製)を添加し
た。その溶液を超音波処理(BRANSON SONIFIER, output
control 5, 30sec.)し、遠心分離（12000rpm、30分、4
℃）して沈殿を回収した。その沈殿を0.2％ TritonX-10
0を添加した50mM Tris-HCl(pH8.0)25mlに懸濁し、超音
波処理(同上条件)を行った。 得られた溶液を遠心分離し、沈殿を再度同様の操作で
洗浄し、得られた沈殿をインクルージョンボディーとし
た。 3）インクルージョンボディーのリフォールディング インクルージョンボディーを少量の7M塩酸グアニジ
ン，100mM Tris-HCl(pH8.0),1％ 2MEに可溶化した。そ
の溶液を200倍量の2M Urea,20mM Tris-HCl(pH8.0)に滴
下して希釈し、4℃で3晩放置した。 4）リフォールディング溶液の濃縮 リフォールディングした溶液を遠心分離(9000rpm、30
分間、4℃）し、得られた上清をアミコンYM-10メンブラ
ンを用いた限外濾過で約100倍に濃縮した。その濃縮液
を20mM Tris-HCl(pH8.0)にて透析し、0.45μmのフィル
ターで濾過した。 5）DEAE-5PWによる陰イオン交換HPLC 上記4)で得られたサンプルをDEAE-5PW(東ソー社製)に
よる陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に
より分離、精製した。開始バッファーは20mM Tris-HCl
(pH7.2)で、溶出は1M NaClのグラジェント(0→1M NaCl/
60ml)で行い、280nmの吸収でモニターした。フラクショ
ンは1mlずつ行い、各フラクションをSDS-PAGEして分析
した。 6）結果および考察 組換えapM1は、大腸菌にインクルージョンボディーと
して発現していたので、精製に際してはインクルージョ
ンボディーの可溶化及びリフォールディングを行った。
その結果、組換えapM1は可溶化され、陰イオン交換カラ
ムで分離された。そのピークのフラクション(フラクシ
ョンNo.30-37)をSDS-PAGEで分析したところ、約30kDの
バンドが観察された。このとき、バックグラウンドに薄
くスメアなバンドが確認されたが、蛋白質の殆どは組換
えapM1であると考えられたので、この約30kDのハンド
(組換えapM1)を、引き続くウサギ及びマウスの免疫のた
めの抗原として用いた。 （３）apM1に対するポリクローナル抗体及びモノクロー
ナル抗体の作製 1）ポリクローナル抗体の作製 組換えapM1 100μg/bodyを等量のコンプリートアジュ
バントと混合して5匹のウサギに２週間おきに8回免疫し
て、抗apM1ポリクローナル抗体(認識番号;OCT9101〜OCT
9105)を得た。 2）モノクローナル抗体の作製 組換えapM1 20μg/bodyを等量のコンプリートアジュ
バントと混合してマウスに2週間おきに3回免疫し、細胞
融合の3日前にアジュバントなしで最終免疫した。マウ
ス脾臓リンパ球とミエローマ細胞の細胞融合はPEG法に
て行い、HAT培地でハイブリドーマを選択した。 apM1抗体産生株のスクリーニングは、抗原(組換えapM
1)をコーティングしたイムノプレートを用いたELISAで
行い、限界希釈法でハイブリドーマをクローニングし
た。 かくして、KOCO9101-KOCO9111と名付けたapM1抗体産
生ハイブリドーマ１１株を得た。その内の一つのハイブ
リドーマ（受託者が付した識別のための表示：KOCO910
8）は、１９９８年６月８日（原寄託日）に、日本国茨
城県つくば市東１丁目１番３号に住所を有する通商産業
省工業技術院生命工学技術研究所に受託されており、１
９９８年１０月７日に原寄託よりブダペスト条約に基づ
く寄託への移管請求が受領された。その受託番号はＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６５４２である。 シングルクローンになったハイブリドーマをプリスタ
ン処理したマウス腹腔内に投与して腹水を得た(認識番
号;ANOC9101〜9111)。 3）抗体の精製 得られたウサギ抗血清(ポリクローナル抗体)及びマウ
ス腹水(モノクローナル抗体)は、プロテインAカラムで
精製した。 4）apM1の動物細胞での発現 apM1のcDNAをEcoRIで切り出し、発現ベクターpCIneo
(プロメガ社製)のEcoRIサイトに挿入した。このpCIneo-
apM1をGIBCO BRL社のLlipofectAMINEを用いてCOS-1細胞
(ATCC CRL1650)にトランスフェクションし、72時間後の
培養上清及び細胞を回収した。 5）apM1のウエスタンブロッティング 最初に、脂肪組織抽出液、COS-1細胞、COS-1細胞培養
上清、健常人血漿、組換えapM1を、2ME(+)でSDS-PAGE
し、ニトロセルロースメンブランにトランスファーし
た。 このメンブランをapM1モノクローナル抗体(ANOC9104)
と反応させ、次いでHRP標識抗体と反応させた後、ECL
(アマシャム社製ウエスタンブロッティング検出試薬）
を用いて検出を行った。 その結果、脂肪組織抽出液、pCIneo-apM1/COS-1細胞
及び健常人血漿で約35kDのバンドが確認できたが、pCIn
eo/COS-1細胞及びpCIneo/COS-1細胞培養上清では確認で
きなかった。 pCIneo-apM1/COS-1細胞培養上清では、非常に薄く見
えにくいけれども、35kDのバンドを確認できた。 実施例２ 検体中apM1の測定 1）apM1のウエスタンブロッティング 健常人血漿をPBSで10倍に希釈し、その5μlを2ME
(+)、(-)でSDS-PAGEしてニトロセルロースフィルターに
トランスファーした。そのフィルターをブロッキングし
た後に1000倍希釈した抗apM1ポリクローナル抗体(OCT91
01〜9105)或いは5μg/mlに調製した抗apM1モノクローナ
ル抗体(ANOC9101〜9111)と反応させ、ついでHRP標識抗
ウサギIgG抗体又はHRP標識抗マウスIgG抗体と反応させ
て、ECLにより検出した。 その結果、全てのポリクローナル抗体で2ME(+)の場合
約35kDの、また2ME(-)の場合約70kDの、apM1のバンドが
確認できた。また、モノクローナル抗体の場合、ANOC91
04及びANOC9108がapM1のバンドと強く反応した。このこ
とから、ELISAに用いるモノクローナル抗体は、ANOC910
4及びANOC9108が適当であると考えられた。 2）apM1 ELISAの作製 apM1モノクローナル抗体(ANOC9108)をイムノプレート
にコーティングし、各ウエルをブロッキングした後、ap
M1のスタンダード及びサンプルを添加してインキュベー
トした。プレートの各ウエルを洗浄し、希釈したapM1ポ
リクローナル抗体(COT9104)を添加してインキュベート
した。プレートの各ウエルを洗浄し、希釈したHRP標識
抗ウサギIgG抗体を添加してインキュベートした。プレ
ートの各ウエルを洗浄し、OPDを用いてウエルを発色さ
せ、492nmの吸収を測定した。スタンダードのapM1に
は、大腸菌に発現した組換えapM1を精製し、BSAを標準
としたプロテインアッセイで蛋白質量を定量したものを
用いた。 その結果、上記ANOC9108とOCT9104との組合せの検出
範囲は、0.1ng/ml〜20ng/mlであった。 3）正常人血漿のゲル濾過及びウエスタンブロッティン
グ 上記のapM1 ELISAで正常人血漿を測定したところ、ウ
エスタンブロッティングの結果から考えられる濃度が得
られなかった。そこで、正常人血漿をSuperose12(ファ
ルマシア社製)を用いてゲル濾過し、各フラクションをS
DS-PAGEして、ANOC9104を用いたウエスタンブロッティ
ングで分析した。また、分子量マーカーを同一条件でゲ
ル濾過し、apM1の溶出した位置と比較検討した。 その結果、apM1は分子量290kD以上のフラクションに
ブロードに溶出していた。このことから、血中のapM1は
他の血漿成分と会合して290kD以上の大きな分子を形成
し、そのために抗体の認識部位がマスクされているもの
と考えられた。そこで、SDSを含むバッファーで血清を
処理すれば抗体が反応できるようになるのではと考え、
次の検討を行った。 4）血漿サンプルの処理 血漿をSDSを含むバッファーで煮沸処理し、それらの
処理条件(煮沸時間、SDSバッファーとの混合比)につい
て検討した。煮沸時間については、SDSバッファーで10
倍に希釈した正常人血漿を10秒、30秒、1分、3分、5
分、10分間それぞれ煮沸し、血漿原液から最終5000倍に
希釈してapM1を測定した。SDSバッファーとの混合比に
ついては、正常人血漿を2倍、3倍、5倍、10倍、20倍量
のSDSバッファーにそれぞれ希釈したものを5分間煮沸
し、最終10000倍に希釈してapM1を測定した。 その結果、正常血漿のウエスタンブロッティングの結
果と一致する程度のレベルでapM1が検出できた。そのと
きの処理条件を検討したところ、血漿をSDSバッファー
で10倍に希釈して5分間煮沸処理するのが適当であると
考えられた。 5）血漿サンプルの希釈 apM1 ELISAの検出範囲が70pg/ml〜20ng/mlであり、ap
M1の血中濃度がμgオーダーであることから、血清(血
漿)は希釈して測定する必要があるので、適正な希釈倍
率を求めるためにSDS処理した血漿を段階希釈してapM1
を測定した。即ち、正常人血漿をSDS処理し、それを最
終200倍から10万倍まで段階希釈してapM1の測定を行っ
た。 その結果、ELISAの測定範囲内であれば希釈倍率に比
例してapM1が検出され、その吸光度等からして最終5000
倍程度で測定することが適当であることが判った。 6）採血条件の検討 正常人の血液を血清、ヘパリン、EDTAの各採血条件で
採血し、apM1を測定して採血条件の違いによるapM1の測
定値について検討した。即ち、正常人10名についてそれ
ぞれ採血し、血清(血漿)をSDS処理して最終5000倍に希
釈してapM1の測定を行った。 その結果、試験した正常人10名の血液中apM1測定値
は、これら血液の採血法による違いを、ほとんど認めら
れなかった。 ７）サンプルの保存条件の検討 apM1測定検体の保存条件の検討を、血漿およびSDS処
理後のサンプルについて行った。血漿の保存条件として
は、4℃、室温、37℃で1日、2日、3日、6日間放置した
ものを、また、血漿の凍結融解による影響については、
1回、2回、4回、8回の凍結融解を繰り返したものをそれ
ぞれSDS処理し、最終5000倍に希釈してapM1の測定を行
った。SDS処理後のサンプルについては、血漿をSDSバッ
ファーで10倍に希釈して5分間煮沸処理し、その溶液を1
0倍に希釈したものについて同様の実験を行った。 その結果、上記条件ではapM1の測定値には殆ど影響は
見られなかった。また、同様に凍結融解に関しても血漿
およびSDS処理後のサンプルで行ったが、殆ど影響はな
かった。 8）日内変動、日差変動の検討 正常人の血清(血漿)中apM1の測定における日内変動お
よび日差変動について検討した。日内変動については、
同一の検体を８重に測定してCV値を求めた。また、日差
変動については、同一の検体を日を変えて4回繰り返し
測定しCV値を求めた。 その結果、日内変動についてはCV値が5%以内で、日差
変動に関してはCV値が10%以内であった。 9）特異性の検討 ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラット、マウスの血清につ
いてapM1 ELISAを行い、測定系の特異性について検討し
た。それぞれの動物の血清をSDSバッファーで処理し、
最終100倍から8100倍まで段階希釈してapM1の測定を行
った。 その結果、ウシ、ウマにおいて10%程度のクロスが確
認されたが、その他の動物においては殆ど確認されなか
った。 実施例３ ａｐＭ１の平滑筋増殖抑制作用 ヒト動脈平滑筋細胞(クローンテック社製)を、プラス
チック製プレートに１×１０4／cm2の濃度で播種し、１
０％ＦＢＳ(ギブコ社製)、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン
及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤ
ＭＥＭ（ギブコ社製）中で一夜放置し、３７℃で５％Ｃ
Ｏ2及び９５％空気中で培養した。 ヒト動脈平滑筋細胞によるＤＮＡ合成を、〔メチル3
Ｈ〕−チミジン取り込み量にて測定した(４回繰り返
し)。 即ち、９６ウエルプレートに播種した細胞を、２％Ｆ
ＢＳ添加ＤＭＥＭ中で、１０μｇ／ｍｌのａｐＭ１及び
／又は対照のため１０ｎｇ／ｍｌのＨＢ−ＥＧＦ（組換
えヒトヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子、Ｒ＆Ｄシステ
ムズ社製）を用いて２４時間処理した。次いで、〔メチ
ル3Ｈ〕−チミジンを１μＣｉ／ウエルで５時間添加し
た。処理細胞をトリプシン処理し、ガラス繊維フィルタ
ー上に自動細胞収穫機を用いて取り出し、その後、〔メ
チル3Ｈ〕−チミジン取り込み量を直接β−カウンター
にて測定した。 結果を図３に示す。該図は、縦軸に相対ＤＮＡ合成比
をとり、コントロール(control，何等の供試薬剤を用い
ない場合)、ａｐＭ１添加の場合(本発明)、ＨＢ−ＥＧ
Ｆ添加の場合(対照)及びａｐＭ１＋ＨＢ−ＥＧＦ添加の
場合(本発明)の各結果を棒グラフにて示したものであ
る。 該図より、ａｐＭ１がヒト平滑筋細胞のＤＮＡ合成
（平滑筋の増殖）を抑制する作用を奏することが明らか
である。即ち、ａｐＭ１の添加によれば、コントロール
のＤＮＡ合成を有意（ｐ＜０．００１）に抑制してお
り、またＨＢ−ＥＧＦ添加により促進されるＤＮＡ合成
の場合においても、これを有意（ｐ＜０．００１）に抑
制することが明らかとなった。 このことから、ａｐＭ１は平滑筋増殖抑制組成物とし
て有効であることが判る。 実施例４ 冠動脈疾患患者の血中ａｐＭ１レベルの測定 冠動脈造影により７５％以上狭窄があると認められた
患者（ＣＡＤ(+)と表示する）男性２４名及び女性１０
名及び７５％までの狭窄しかない患者（ＣＡＤ(-)と表
示）男性６６名及び女性３９名につき、それらの各血液
を採取し、血漿中のａｐＭ１レベルを、実施例２に記載
した本発明方法に従い測定した。 同時に、各患者の臍の高さの位置でＣＴをとり該ＣＴ
より各患者の腹腔内脂肪面積（VFA, Visceral Fat Are
a, cm2）を算出した。 血漿ａｐＭ１レベル(μｇ／ｍｌ)を縦軸とし、ＶＦＡ
を横軸として、上記各測定値及び算出値の関連を、ＣＡ
Ｄ(+)とＣＡＤ(+)以外の値で対応しないｔ−検定により
評価した。その結果を図４に示す。 該図より、冠動脈疾患を有する患者（ＣＡＤ(+)）群
のａｐＭ１レベルは、腹腔内脂肪面積（ＶＦＡ）の大小
に関わりなく低く、このことから、ａｐＭ１が高度の冠
動脈狭窄の存在の診断に有効であることが判った。 また、ａｐＭ１が動脈硬化症の発症、進展の指標とし
て重要であり、その治療への応用における有用性が示唆
された。 実施例５ ａｐＭ１の動脈硬化症発症抑制作用 ９６ウエルプレートに播種したヒト大動脈血管内皮細
胞(HAEC: Human Arotic Vascular Endothelial Cells，
クロネティクス社より購入)を、血管内皮細胞培地中で
培養（５％ＣＯ2下、３７℃）した。ベクトンディッキ
ンソン社製「バイオコート」を用い、コンフリューエン
ト(confluent)になるまで培養し、その後培地をＴＣＭ
１９９(tissue culture medium:大阪大学微生物研究、
ナカライテスク社)＋０．５％ＦＣＳ（ウシ胎児血清：
日本生物材料社製）＋３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミ
ン：シグマ社製）に変更した。 次いで、実施例１で得られた組換えａｐＭ１の１、
５、１０、２５及び５０μｇ／ｍｌを添加し、更に１８
時間培養し、その後、ヒト組換えＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ社
製、Tumor Necrosis Factor-α：10U/ml）を添加し、６
時間培養した（ａｐＭ１添加の実験群）。 また、対照群として、上記組換えａｐＭ１無添加群
（ＴＮＦ−α刺激のみ）を設けた。 上記ＴＮＦ−αによる刺激でＨＡＥＣ表面に発現する
ＶＣＡＭ−１(Vascular Cell Adhesion Molecule-1)、
ＥＬＡＭ(Endothelial Leukocyte Adhesion Molecule)
及びＩＣＡＭ−１(Intercelular Adhesion Molecule-1)
の接着分子蛋白発現レベルをａｐＭ１が抑制するかどう
かを、cell-ELISA法（Takami,S., et al., Circuation,
97(8), 721-728(1988))に従って検討した。尚、ＩＣＡ
Ｍ−１抗体としては、DAKO社の６．５Ｂ５を用いた。 ａｐＭ１添加群と無添加群とを比較して有意差検定
を、ステューデント・テスト(Student test)により行っ
た。 ＶＣＡＭ−１についての結果を図５に示す。 図５において、横軸はａｐＭ１添加量（μｇ／ｍｌ、
−は無添加を示す）を、縦軸はＴＮＦ−α無刺激の場合
にＨＡＥＣがその細胞表面に発現する接着分子蛋白（Ｖ
ＣＡＭ−１）の発現量を基準（１）として、各実験群及
び対照群における同接着分子蛋白発現量の相対値を示
す。 図５より、以下のことが判る。即ち、ａｐＭ１は１μ
ｇ／ｍｌの濃度から濃度依存適に、ＨＡＥＣにおいてＴ
ＮＦ−α刺激により増加した接着分子ＶＣＡＭ−１の発
現を有意に抑制した（ｐ＜０．０５）。 また、他の主要な接着分子であるＥＬＡＭＩ及びＣＡ
Ｍ−１の発現も、ａｐＭ１が同様に抑制することが確認
された。 血管内皮細胞の損傷とそれに伴われる単球の接着は、
動脈効果の発症に重要であることが報告されている（Ro
ss,R., Nature, 362(6423), 801-804(1993)）。この動
脈効果の発症過程を規定する接着分子（ＶＣＡＭ−１、
ＥＬＡＭ、ＩＣＡＭ−１など）の発現をａｐＭ１が抑制
したという事実は、該ａｐＭ１が動脈硬化の発症に抑制
的に作用することを意味するものであり、このことか
ら、ａｐＭ１は動脈硬化症の予防剤として有効であるこ
とが明らかとなった。 産業上の利用の可能性 本発明によれば、ａｐＭ１を有効成分とする平滑筋増
殖抑制組成物、血管内皮細胞における接着分子発現抑制
組成物が提供され、これは医薬品分野で有用である。ま
た、本発明によれば、ａｐＭ１に特異的な抗体を利用し
たａｐＭ１の測定技術が提供され、これによって、動脈
硬化症の新しい診断方法が確立できる。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 43/00 １０５ 15/00 ＺＮＡＣ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特表2001−512746（ＪＰ，Ａ) 国際公開96／39429（ＷＯ，Ａ２) ＭＡＥＤＡ， Ｋ．， ｅｔ ａ ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ ｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．，221, ｐｐ．286−289 （1996) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/00 - 15/02 C12P 21/00 - 21/08 G01N 33/00 - 33/577 A61K 38/00 - 38/42 A61P 9/00 - 43/00 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】脂肪組織特異的分泌因子apM1に対する抗体
    を有効成分として含有する動脈硬化症の診断薬。
  2. 【請求項２】脂肪組織特異的分泌因子apM1に対するモノ
    クローナル抗体生産能を有し、FERM BP-6542として寄託
    されているハイブリドーマKOCO9108。
  3. 【請求項３】ハイブリドーマＫＯＣＯ９１０８が産生す
    る脂肪組織特異的分泌因子apM1に対するモノクローナル
    抗体。
  4. 【請求項４】脂肪組織特異的分泌因子apM1に対する抗体
    を有効成分として含有する動脈硬化症の診断用キット。
  5. 【請求項５】検体中の脂肪組織特異的分泌因子apM1を、
    脂肪組織特異的分泌因子apM1に対する抗体を用いて測定
    し、測定値を健常者及び動脈硬化症患者の測定値と対比
    して動脈硬化症を診断する動脈硬化症の診断方法。
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