JPH06500765A - 食細胞の受容体蛋白質およびその抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 食細胞の受容体蛋白質およびその抗体 発明の背景 米国政府は、国立錠生研究所助成金第５ＲＯＩＨＬ３３５１６−０３本発明の技 術的分野は、アテローム性動脈硬化症の診断および治療のための装置および方法 、就中、アテローム性動脈硬化症の溶血斑に付随する、受容体蛋白質またはその モノクローナル抗体を用いた装置および方法である。

アテローム性動脈硬化症は、動脈、特に比較的大きい動脈の肥厚および硬化を発 症する疾病であって、血漿コレステロールおよび低密度リボ蛋白質（ＬＤＬ）の 沈着の結果として形成される、動脈内腔側の繊維性溶血斑あるいは病変部の出現 が特徴的である。

動脈硬化症溶血斑の枢要な構成細胞は、単核球起源の食細胞性マクロファージに 由来する泡沫細胞である。マ在し、この蛋白質が、血流中のＬＤＬに親和性を有 していて、受容体を介したそのような物質の摂取、すなわちエンドサイト−シス に直接関わっている。

また、これらの細胞には、化学的に修飾されたＬＤＬ。

例えばアセチル化ＬＤＬ（Ａｃ−ＬＤＬ）、アセトアセチル化ＬＤＬ（＾ｃＡｃ −ＬＤＬ）、および酸化ＬＤＬ（Ｏｘ−ＬＤＬ）はもとより、限られた範囲なが ら他の負に荷電した高分子と結合してエンドサイト−シスを行う能力もある。こ の受容体活性は、特定の条件下で単核球およびマクロファージに誘発できること が知られており、泡沫細胞の形成に、ひいては動脈硬化症溶血斑の形成に関与す るとされている［ゴールドスタイン（にｏｌｄｓｔｅｉｎ）ら：プロシーディン グス・サブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンセズ・サブ・ザ・ユ ナイテド・ステーツ・サブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、第７６巻（１９８０年）３３３〜３ ３７ページ：ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら：アニュアル・レビューズ・サブ・バイ オケミストリー（Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ）、第５２巻（１９８ ３年）２２２〜２２６ベージ］。

この溶血斑、およびそれに伴う沈着から生じた動脈内腔の損傷あるいは変形は、 血流の閉塞をもたらし、未治療のまま放置すれば、最終的には、関連する多数の 症状、例えば狭心症、脳虚血症、腎性高血圧、虚血性心疾患、卒中、およびその 他の臓器の疾病に至る。冠動脈硬化症は、今なお米国その他の工業的先進諸国に おける死亡原因の筆頭にあげられている。

不幸にも、これらの疾病を確実に発見できる現存の診断法は皆無である。初期段 階のアテローム性動脈硬化症および関連する血管性疾患は、しばしば臨床的徴候 が皆無である。生活様式の改善、薬物療法、およびその他の手段は、アテローム 性動脈硬化症による病変がもたらす血管の閉塞、あるいは各種臓器に対するスト レスを遅延または減少させるために存在するのであるから、アテロ−ム性溶血斑 の早期発見かなされるならば、それが最も効果的であり得る時期に予防的介入を 可能にするのに少なからぬ価値があるものと思われる。

動脈造影法は、進行した血管性疾病を診断するための慣用の手段である。この方 法には、放射線を透過させない物質を血流中にカテーテルで注入して、動脈内の 閉塞物を造影することが必要である。ところが、感染、動脈の穿孔、不整脈、卒 中、心筋梗塞などを生じる機会が多いことから、無視し得ない程の発病率がもた らされる可能性がある。それに伴う危険性が高いことから、動脈造影法は、進行 した、あるいは急性のアテローム性動脈硬化症の患者向は以外には使用されない のが通例であって、この方法を予防的手段に用いることはできないでいる。

血管の損傷および疾病の診断の目的には、より侵襲的でない各種の手法が用いら れている。そのような手法としては、血量計測法、熱像法、超音波走査法などが ある−これらの方法の総覧には、リーズ（Ｌｅｅｓ）およびマイヤーズ（ｌｌｅ ｙｅｒｓ）の論文［アドバンセズ・イン・インターナ／ｌ／−メディシ７（Ａｄ ｖ、　Ｉｎｔｅｒｎ−Ｍｅｄ、）、第２７巻（１９８２年）４７５〜５０９ペー ジ］を参照のこと。しかしながら、これらの造影手法のどれ一つとして、臨床的 に広く許容されている訳ではない。

血管損傷の診断のための池の非侵襲的方法としては、アテローム性動脈硬化症の 病巣部を認志し、これに結合し、またはこれに取り込まれることができる、注入 可能かつ探知可能な藁剤の、患者の血管系に対する投与がある。このような方法 としては、ヘマトポルフィリン［スビアーズ（Ｓｐｅａｒｓ）に対する米国特許 第４．５７７、６３６号明細書に記載］、モノクローナル抗体［タカノ（Ｔａｋ ａｎｏ）に対するヨーロッパ特許公開公報第８５．４０２．３５９号明細書］、 あるいは誘導により加熱可能な磁性粒子［ゴートン（Ｇｏｒｄｏ口）に対する米 国特許第４．３５９．４５３号明細書］の投与がある。

ＬＤＬがアテローム性動脈硬化症の溶血斑に沈着することは公知であるから、溶 血斑を標的として、標識ＬＤＬを用いる方法が利用されている［例えば、リーズ （Ｌｅｅｓ）に対する米国特許第４．６４７．４４５号明細書、および同じ（第 ４、６６０．５６３号明細書を参照］。これらの方法の短所は、患者の血液から ＬＤＬを単離してこれを標識するのに、数日間を必要とするのが通例であること にある。診断およびその後の処置におけるこのような遅延は、重篤な患者にとっ て好ましくないことがしばしばである。更に、ＬＤＬの供給源として供血者の血 液が用いられる場合は、ウィルス感染という危険も追加的に生じ得る。

上記により、初期の非狭窄性かつ非血行障害性のアテローム性動脈硬化症の動脈 病変部を探知し、定位し、かつ治療することが可能な、より非侵襲的な手法、お よびより効果的な試薬に対する必要性が存在する。

したがって、本発明の目的は、アテローム性動脈硬化症、および池の関連疾患の 早期発見のための方法を提供することにある。また、血管系の異常部域、すなわ ちアテローム性動脈硬化症の素因となる部域の探知と定位の決定的な手掛かりで ある、動脈溶血斑の構成細胞を同定することも本発明の目的の一つである。本発 明の更に別の目的は、非侵襲的な探知方法を提供することである。

更にまた、本発明は、動脈溶血斑を定位し、その形成の度合を定量する装置およ び方法の提供をも目的とする。

アテローム性動脈硬化症の治療方法の提供も本発明の目的の一つである。

発明の要約 本明細書においては、アテローム性動脈硬化症の発見および治療を目的とする、 受容体蛋白質、その抗体、および、前記受容体蛋白質および抗体を用いた方法お よび装置を開示する。ＬＤＬの化学的に修飾された形態、例えばアセチルＬＤＬ （Ａｃ−ＬＤＬ）と結合できる、新規受容体蛋白質が発見されている。この受容 体蛋白質は、マクロファージ、および溶血環形成構成細胞の表面に見出される。

本明細書において、「溶血環形成構成細胞」なる用語は、溶血斑に付随し、また はその生成に関与する細胞、例えば泡沫細胞、マクロファージ、および単核球を 包含するのに用いられる。

新規の受容体蛋白質は、以下これを［食細胞受容体蛋白質」または単に「受容体 蛋白質」と称するが、５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動法） における見かけの分子量は約２２０．０００ダルトン（２２０ｋＤ）であって、 Ａｃ−ＬＤＬに対する結合親和性が約０．５μｇ／ｌである。更に、それぞれ５ ＤＳ−ＰＡＧＥでの見かけの分子量が約７７ｋＤであるサブユニットの三量体で あって、アスパラギン（Ａｓｐ）に結合した糖鎖を有することが特徴的である。

更に、この新規受容体蛋白質には、αヘリックスコイルによる３重コイルのドメ インを伴う、細胞膜をまたぐ領域すなわちドメインばかりでなく、細胞外のコラ ーゲンドメインが含まれている。本明細書において、「コラーゲンドメイン」な る用語は、コラーゲンまたはその類似物質のそれと酷似したアミノ酸配列の部域 、またはその一部を包含するのに用いられる。このコラーゲンドメインは、前記 ３個のサブユニットのそれぞれに見出される。

本発明には、実質的に純粋な食細胞受容体蛋白質、および、その活性断片、類似 物質、および誘導体が含まれる。本発明の好適実施例には、そのアミノ酸配列が 、食細胞受容体蛋白質の１サブユニツトのアミノ酸配列に充分に重複していて、 その結果、これを更に２個と、あるいは食細胞受容体蛋白質のサブユニット２個 とで三量体を形成した場合に、ＬＤＬの化学的に修飾された形態と結合するよう なポリペプチドが含まれている。本発明にはまた、その活性断片、誘導体、およ びサブユニットを暗号化しているＤＮＡ配列も含まれる。

本発明は、食細胞の受容体またはその特定の部分との親和性を有する結合試薬を も包含する。好適実施例においては、前記食細胞受容体蛋白質との特異的な親和 性を有する結合剤としてのモノクローナル抗体が開示される。

このような装置は、受容体蛋白質、あるいはその断片または類似物質がそれに対 する親和性を有する、各種の分子を結合させるのにも用いることができるものと 思われる。

本発明の一面では、支持体に結合させた複数の食細胞受容体蛋白質、あるいはそ の断片または類似物質が含まれる、検定または精製を目的とする装置が開示され る。

本発明はまた、支持体に結合させた、食細胞受容体蛋白質との親和性を有する複 数の結合試薬が含まれる、検定または精製用の装置をも包含する。

本発明の他の一面では、食細胞受容体蛋白質、およびそれに対する結合試薬の診 断特性を利用した方法も開示される。例えば、アテローム性動脈硬化症の溶血斑 を探知する方法が記載される。この方法においては、結合試薬を何らかの標識手 段と結合させて、複合体を形成させる。次いで、複合体を被験者の血管系に投与 すると、これが溶血斑または溶血環形成構成細胞に結合した食細胞受容体蛋白質 と結合する。次いで、動脈硬化症の溶血斑の存在を示すものとして、被験者の血 管系における標識手段の存在と位置とを判定するのである。

本発明にはまた、治療法としての効用もある。例えば、一実施例には、溶血斑へ の治療剤の選択的送達を利用した、アテローム性動脈硬化症の治療方法が含まれ ている。

このような応用においては、治療剤を食細胞受容体蛋白質との特異的親和性を有 する結合剤と結合させ、このようにして複合治療剤を形成させる。次いで、複合 体を被験者の血管系に投与すると、これが受容体蛋白質と結合し、溶血斑または 溶血環形成構成細胞に治療剤を送達するのである。

本発明の更に別の一面としては、食細胞受容体蛋白質の拮抗剤を利用した、血管 性疾病の治療のための方法が開示される。

以下、図面を添えた若干数の実施例を用いて本発明を説明するが、本発明の対象 範囲から逸脱することな（、各種の変更、追加、および削除を加え得ることは明 白であると言える。

図面の説明 本発明自体はもとより、本発明の前記およびその他の目的、その様々な特徴は、 添付の図面とともにこれを読解するならば、以下の説明から更に充分に理解する ことができる。すなわち、 第１図は、（Ａ）銀染色による、（Ｂ）リガンドプロット法による、（Ｃ）免疫 プロット法による、部分的に精製した食細胞受容体蛋白質の非還元性ＳＤＳゲル を示す写真であり、 第２図は、食細胞受容体蛋白質とそのドメインの概略図であり、 第３図人ないしＣは、第２図に示した蛋白質の一部の最初の代表的核酸配列およ び対応するアミノ酸配列の概略図であり、 第４図人ないしＤは、この蛋白質の別の重複部分の複合的核酸配列および対応す るアミノ酸配列の概略図であり、 第５図は、免疫沈降法、非還元性５ＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで、（Ａ）オートラジ オグラフィー、またはＣＢ）リガンドプロット法を施し、あるいは、（Ｃ）免疫 親和性による精製を行った後で、非還元性５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色を施し た食細胞受容体蛋白質を示す写真であり、 第６図は、還元性５ＤＳ−ＰＡＧＥ法の前に、（Ｂ）シアリダーゼ、または（Ｃ ）エンドグリコシダーゼＦを用いて消化した受容体蛋白質の免疫沈降させた７７ ｋＤサブユニツトを示す写真であり、 第７図は、（Ａ）対照抗体と、あるいは（Ｂ、　Ｃ）ＩｇＧ−Ｄｉとともに温室 したウシ肝臓の食細胞受容体蛋白質の免疫組織化学による位置を示す写真であり 、第８図は、（Ａ）マクロファージによる、過剰な未標識＾ｃ−ＬＤＬの（１） 不在下で、あるいは（２）存在下で蛍光標識したＡｃ−ＬＤＬ取り込みの能力を 示す蛍光写真像、および（Ｂ）食細胞受容体蛋白質がトリプシン消化に感受性が あることを示す写真であり、 第９図は、ヒト単核球（ＰＭＡ−）またはマクロファージ（ＰＭＡ＋）の細胞系 統における、食細胞受容体蛋白質と食細胞受容体を介した細胞性エンドサイト− シスとの同時誘導を示すリガンドプロット法の結果を示す写真であり、第１０図 は、親和性を利用して精製した受容体蛋白質に対するＡｃ−ＬＤＬの結合の（Ａ ）結合親和性、および（Ｂ）特異性を示すグラフであり、 第１１図は、異なる濃度の多数の競合物質によるＡｃ−ＬＤＬ受容体活性の阻害 能力を示すグラフであり、第１２図は、一定の濃度の異なる競合物質によるＡｃ −ＬＤＬ受容体活性の阻害能力を示すグラフであり、第１３図は、各種の細胞お よび組織形態から単離したＲＮＡ、およびコラーゲンドメインを暗号化している ＤＮＡプローブを用いたノーチンプロット法のオートラジオグラフィー像の写真 であり、 第１４図ＡないしＤは、ヒト食細胞受容体蛋白質の一サブユニットの代表的核酸 配列、および対応するアミノ酸配列を示す概略図である。

詳細な説明 食細胞受容体蛋白質は、各種の組織で発現に差がある。

確立された精製法を用いて各種の臓器から、特に、哺乳類の肝臓および肺の標本 から単離される。これらの方法としては、例えば、分画遠心分離法、単離膜分画 に対する界面活性剤による抽出、イオン交換または排除クロマトグラフィー、ゲ ルクロマトグラフィーなどがある。

これらに代えて、受容体蛋白質に特異的な親和性を有する抗体による精製法を用 いることもできる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーなる方法を用い て受容体蛋白質を精製することもできるが、これは、抗体をカラム内に固定化さ れた基質、すなわち支持体に結合させる方法である。抗受容体蛋白質抗体を用い れば、受容体蛋白質を不均質溶液から免疫沈降させることもできる。この方法を 用いると、哺乳類の泡沫細胞、および溶血斑形成構成細胞、例えばマクロファー ジから受容体蛋白質を単離することもできる。

これらの単離法を用いて、食細胞受容体蛋白質は、少なくともほぼ均質といえる までに精製されている。この蛋白質は、５ＯＳ−ＰＡＧＥにおける見かけの分子 量が約２２０ｋＤであって（第１図人）、Ａｃ−ＬＤＬに対する結合親和性があ る。

それぞれ見かけの分子量が約７７ｋＤの、間−と思われる３個のサブユニットか らなり（第１図および第２図）、いずれも明らかに、第２図に示したような多数 の異なるドメイン（すなわち、システィンに富むドメイン、コラーゲンドメイン 、アスパラギンに結合した糖のドメイン、膜横断ドメイン、および細胞質ドメイ ン）が含まれている。

以下に詳細に説明する通り、この蛋白質のアミノ酸配列の大部分は、これを暗号 化している遺伝子の核酸配列から解明されたものである。ところが、複数のヌク レオチドトリプレット（コドン）が１種類のアミノ酸を暗号化できることから、 １種類の蛋白質を多数の異なるヌクレオチド配列が暗号化できることになる。そ れゆえ、本明細書に開示のペプチド断片は、上記のものと機能的には同等で、公 知の合成方法を用いて調製できる核酸配列もまた、これを暗号化することができ る。したがって、本発明は、このような機能的に同等なヌクレオチド配列を包含 するものとする。加えて、技術の習熟者は、受容体蛋白質のアミノ酸配列を知れ ば、本発明の受容体蛋白質と実質的に同一の生物学的活性を有する、その機能的 に同等な類似物質を合成手法または生合成手法を用いて調製できるものと思われ る。とりわけ、蛋白質の断片、特に細胞外ドメインの部分は、不適当な実験手段 によることなく、本明細書の開示内容に合わせてこれを得ることが可能である。

したがって、本発明の対象範囲には、ここに示されたアミノ酸配列および対応す る核酸配列はもとより、実質的に同じ食細胞受容体蛋白質としての生物学的活性 を有する分子に対する機能的に同等のアミノ酸配列（および対応する核酸配列） も含まれるものとする。例えば、本発明の一実施例には、食細胞受容体蛋白質の サブユニットのアミノ酸配列と充分に重複するアミノ酸配列を有するポリペプチ ドであって、その結果、これを同様な他の２個とともに、あるいはこの食細胞受 容体蛋白質の２個のサブユニットとともに三量体を形成させた場合に、ＬＤＬの 化学的に修飾された形態と結合するようなポリペブチまたはその断片を暗号化し ている核酸配列を用い、適当な微生物または哺乳類を宿主細胞として、蛋白質、 その断片、あるいはその類似物質を製造することができる。

例えば、この配列を、ある種の発現系、例えば真核生物（酵母または哺乳類）ま たは原核生物（細菌）である宿主細胞を形質転換させ、あるいはこれにＤＮＡ移 入を行うのに適したベクターに挿入することができる。このような標準的手法に 従うことによって、周知の蛋白質、例えばインシュリン、インターフェロン、ヒ ト成長因子その他が製造されている。同様の手法、あるいはその明らかな改良を 、本発明に従って食細胞受容体蛋白質、およびその断片または類似物質を調製す るのに用いることも可能である。

上記の組換えＤＮＡ法を用いると、食細胞受容体蛋白質の少なくとも一部を暗号 化している若干数のクローンが調製される。第３クローンは、少なくとも、膜に またがる（ＴＭ）ドメイン、およびコラーゲン（Ｃａｌ）ドメインはもとより、 多数の糖結合可能部位を含むアスパラギン（＾ｓｎ）結合筒ドメイン（Ｎ結合筒 ）を暗号化している。第３クローンの核酸配列、および対応するアミノ酸配列を 第３図人ないしＣに示す。図中、第１の下線を付したアミノ酸配列は、膜横断ド メインのそれであり、第２の下線を付した配列は、コラーゲンドメインのそれ、 そして、上部に傍線を付した、第８２〜８４．１０１〜１０３．１４２〜１４５ ．１８３〜１８６．２２０〜〜２２２．２４８〜２５０、および２６６〜２６８ 番目の残基は、アスパラギン結合筒ドメイン内の糖結合可能部位である。

第７．１２、および１３クローンには、これらのドメインのいくつかまたは全部 はもとより、システィンに富む（システィンリッチ）ドメインの少なくとも一部 が含まれている。これらのクローンを組み合わせた核酸配列、および対応するア ミノ酸配列を第４図人ないしＤに示す。

第１４図Ａおよび第１４図Ｂは、同様のＤＮＡ法を用いて判定された、ヒト食細 胞受容体蛋白質の少なくとも一部の代表的な核酸配列および対応するアミノ酸配 列を示す。

第１表に、第３図人ないしＣ１第４図人ないしＤｌおよび第１４図ＡないしＤに 示したアミノ酸に対する略記号を掲載する。

第２表に、食細胞受容体蛋白質のアミノ酸配列中の各種ドメインの位置を示す。

各種の脱グリコジル酵素を用いた処理による判定から、各サブユニットには、少 な（とも１個のアスパラギン結合糖鎖が含まれている（第６図）。アスパラギン 結合筒ドメインなる名称は、第３図人ないしＣに示すｃＤＮ＾配列から推定され る、アスパラギンと結合した糖が付着し得る部位の存在、および、そのいくつか は蛋白質の配列中にアスパラギンを検出することができず、アスパラギンの原子 団は実際にはグリコジル化されていることが示唆さ本例々のアミノ酸の分子量に 基づく。

れるという知見に基づく。そのアミノ酸配列の分析によれば、これらのドメイン は、一種のαヘリックスのコイルによる３重コイル構造をなすように思われる。

第３４１〜４５３番目の残基に対するシスティンリッチドメインなる名称は、多 数のシスティンなるアミノ酸が含まれているという事実に基づく。更に、このド メインは、最も遠位の外部ドメインであり、また他のいくつかの既知の細胞表面 受容体にも、システィンに富むリガンド結合ドメインが含まれていることから、 このドメインもまた、リガンド結合ドメインとして作用することができる。

ところか、コラーゲンドメインが正に荷電しており、またリガンドは、しばしば 負に荷電していることから、コラーゲンドメインは代替的に、あるいは追加的に リガンド結合に参加する可能性がある。同じことは、アスパラギン結合糖ドメイ ンのαヘリックスコイルによる３重コイルの一部または全部についても該当する ことが考えられる。

食細胞受容体蛋白質の膜横断ドメインには、下記のアミノ酸配列が含まれている Ｔｈ　ｒ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ　−Ｉ　１　ｅ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅ ｕ−Ｉ　ｌｅ−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ −Ｋ　１ｅ−Ｉ　１ｅ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−ＶａＬ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ コラーゲンドメインには下記のアミノ酸配列が含まれている。

Ｇ　１　ｙ−Ｐ　ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ｐ　ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｙ−Ｇ　 １　ｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｙ−Ａｓｐ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｐ　ｒｏ−Ｐｒｏ −Ｇ　１　ｙ−Ｇ　１　ｎ−Ａｓｎ−Ｇ１　ｙ−Ｉ　１ｅ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　１ｙ −Ｐｈｅ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　１　ｙ−Ｌｅｕ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｇ　１　ｙ−Ｔｈ　ｒ −Ｐ　ｒｏ−Ｇ　１　ｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇ　１　ｙ−Ａ　５ｐ−Ａ　ｒｇ− Ｇ１　ｙ−Ｉ　１ｅ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｙ−ｖａ　ｌ− Ａ　ｒｇ−Ｇ　１　ｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　１　ｙ−Ｐｒｏ−１１ｅ　ｔ　− Ｇ　１　ｙ−Ｌｙｓ　−Ｔｈ　ｒ−Ｇｌ　ｙ−しｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ −Ａｓｎ−ＧＬｙ−ＧＩｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−３ｅｒ −Ｇｌｙ コラーゲン様のドメイン（コラーゲンドメイン）の発見は、食細胞受容体が三量 体であるという事実と整合する。

コラーゲンドメインは、このようなドメインを有する分子（例えばコラーゲン、 Ｃ１ｑ、アセチルコリンエステラーゼ、血清マンノース結合蛋白質、肺表面活性 蛋白質など）において、三重らせんをなす三量体を形成することが知られている 。このことは、アスパラギン結合糖ドメインのαヘリックスコイルによる三重コ イルにも該当する。

第２図に提示した受容体の方向性（Ｎ末端が内側で、Ｃ末端が外側である）の根 拠は、ｌ）ｌ［ｉにまたがるドメインが１個しか存在しないこと、２）Ｎ末端の シグナル配列が存在しない（おそらく、膜横断ドメインは膜に挿入されるための シグナルでもある）こと、３）アスパラギン結合糖ドメインおよびコラーゲンド メインは、他の蛋白質で細胞質性であるとの知見が皆無であることから、細胞外 ドメインであると考えられること、４）膜横断ドメインを囲む荷電したアミノ酸 には、Ｎ末端を内側、Ｃ末端を外側とする蛋白質と整合する極性があることであ る。

食細胞受容体蛋白質には若干数の細胞外ドメインが存在し、特定のドメインまた はその一部を認識かつそれと結合し、おそらくそれによって、受容体の活性を変 化させるような試薬として設定することが可能である。そのような試薬としては 、例えば各種の薬剤、および結合分子がある。受容体蛋白質に対する親和性を有 する結合蛋白質としては、例えば抗体、好ましくはモノクローナル抗体がある。

精製蛋白質またはその断片、あるいはその類似物質を、好ましくはフロイントの アジュバントとともに適当な宿主哺乳類、例えばウサギ、ヤギ、あるいはマウス に注射するなど、周知の実験手順を用いて、精製された食細胞受容体蛋白質また はその一部に対して出現させた抗血清、あるいは、その抗血清から精製された抗 体を調製することが可能であるが、好ましくは、広く公知の細胞融合なる手法を 適用して［コーラ−（Ｇ、　Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン、（Ｃ，１ｌｉ ｌｓｔｅｉ口）：ヨーロピアン・ジャーナル・サブ・イミュノロジ−（Ｅｕｒ、 　Ｊ、　Ｉａ＋ｍｕｎｏ１．）、第６巻（１９７６年）５１．Ｌ〜５１９ページ 、シャル７ン（ｌ　Ｓｈｕｌｍａｎ）ら　ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、第２ ７６巻（１９７８年）２６９〜２７０ページを参照、引用により本発明に組み込 まれる］、この抗体を産生ずるハイブリドーマを入手し、ハイブリドーマからモ ノクローナル抗体を誘導し、（選択的に）モノクローナル抗体に蛋白質分解を施 して活性断片、例えばＦａｂを得ることによって、食細胞受容体蛋白質に対して 調製されたモノクローナル抗体、あるいは前記抗体の活性断片を生成させること が可能である。

例えば、哺乳類のリンパ球（好ましくはマウス牌臓細胞）を入手し、このリンパ 球が抗体を産生ずるように仕向け（例えば、問題とする特定の抗原で予め哺乳類 を感作することによる）、リンパ球を骨髄！！（または他の長寿命の）細胞と融 合させてハイブリッド細胞を形成させ、次いで、選択したハイブリッド細胞のコ ロニーを生体内または生体外で培養して、単一クローンに由来し、それよって、 モノクローナル抗体を調製することができる。

上記に代えて、蛋白質合成装置内での合成によって、適当な特異性を有する抗体 の１分子、あるいはその活性類似物質または断片を製造し、あるいは、遺伝子工 学的に加工した細胞における組み換え手段を用いてこれを製造することもできる 。

免疫感作剤との抗体反応を目的とする、酵素結合免疫吸収検定法（いわゆるＥＬ ＩＳＡ法）その池を用いて、感作された動物から血清試料を取り出し、これを分 析することができる。抗体力価を示す動物をと殺して、肺臓をホモジナイズする 。これに代えて、膵臓細胞を抽出し、栄養培地で培養することによって、生体外 で抗体分泌細胞を増殖させることもできる。次いで、膵臓細胞を骨髄腫（または 他の長寿命の）細胞と融合させる。上記の要領で形成されたハイブリドーマをふ るい分けて、受容体蛋白質と反応する抗体産生細胞系統を選定するのである。こ のような受容体蛋白質産生細胞系統からは、（例えばプリスタンによる免疫刺激 後の）腹水腫を誘発させ、プロティンＡ−セファロースによるアフィニティーク ロマトグラフィーを用いた腹水液から前記抗体を精製するなど、各種の手法を用 いることによって、上記の受容体蛋白質産生細胞系統から大量の抗体産生物を入 手することが可能である。

ハイプリドーマ形成の一般的な方法の更に詳細な説明については、例えば、オオ イ（Ｏｌ）およびヘルツエンベルク（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ）の「免疫グロブリ ン産生ハイブリッド細胞系統（ＩｍｍｕｎｏｇＬｏｂｕＬｉｎ−Ｐｒｏｄｕｃｉ ｎｇ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ）Ｊなる論文［ミシェル（１１ｉｓ ｈｅｌｌ）およびシイジ（Ｓｈｉｉｇｉ）ｌ：。

［精選細胞免疫学の方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ ｕｌａｒＩｗｍｕｎｏｌｏｇｙ月、フリーマン（ｌＦ、Ｈ，Ｆｒｅｅａ＋ａｎ　 ＆　Ｃｏ、）（１９８０年）、３５１〜３７２ページ］、および、スケアス（Ｓ ｃｅａｒｃｅ）およびアイゼンパー０２．　（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ）の「モ／ りａ−ナル抗体の産生（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ月なる論文［「酵素学の方法（ｌｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ月、第１０３巻（１９８３年）、４５９〜４６９ページ］ を参照のこと（これらは引用によって本発明に組み込まれる）。動物の抗体ばか りか、ヒトの抗体（例えば、ヒト−ヒト、あるいはヒトー動物ノハイブリドーマ から得られたそれ）を利用することもできる。ヒトのハイブリドーマ形成の手法 に関しては、例えば、ロイストン（Ｒｏｙｓｔｏｎ）らに対する米国特許第４、 ４５１．５７０号明細書、ラザラス（Ｌａｚａｒｕｓ）らに対する米国特許第４ ．５２９．６９４号明細書、およびズロウスキー（Ｚｕｒａｗｓｋｉ）らの［予 定特異性を有する抗体を合成する連続増殖するヒト細胞系統（Ｃｏｎｔｉｎｕｏ ｕｓｌｙ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｈｕｍａｎ　Ｃｅ１ｌＬｉｎｅｓ　Ｓ ｙｎｔｈｅｔｉｚｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｉ ｎｇＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）Ｊなる論文［「モノクローナル抗体（ｌｌｏｎｏ ｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）Ｊ、ニューヨーク所在プレナム・プレス（ ＰｌｅｎｕｓＰｒｅｓｓＸ１９８０年）所収］を参照のこと（これらも引用によ って本発明に組み込まれる）。

本発明に開示のモノクローナル抗体からは、多数の手法を用いて活性断片を導（ ことができる。例えば、蛋白質分解酵素、例えばペプシンを用いて精製モノクロ ーナル抗体を開裂し、次いで、ＨＰＬＣゲル濾過法を施すことができる。次いで 、膜濾過法または類似の方法を用いて、所望の断片、例えばＦａｂ断片を含有す る適当な断片を回収かつ濃縮することができる。活性断片単離の一般的手法に関 する更に詳細な説明については、例えば、コラ（Ｋｈａｗ）らの論文［ジャーナ ル・サブ・ニュークリアー・メゾ４　シン（Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、）、第 ２３巻（１９８２年）Ｌ、　ＯＬｌ〜ｉ、　０１９ページ（引用により本発明に 組み込まれる）〕を参照のこと。

各種の手法を用いて、本発明に用いられる抗体および断片を放射性のタグ、例え ば放射性同位元素で標識することができる。例えば、生物学的活性のある分子を 、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の環状無水物、あるいはブロモアセ チル：アミ／ベンジル＝エチルアミンジアミン四酢酸（ＢＡＢＥ）との結合を経 由して放射性同位元素で標識することもできる［ナトウィッチ（Ｈｎａｔｗｉｃ ｈ）ら：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２０巻（１９８３年）６１３〜６ １５ページ、およびミアーズ（ｌｌｅａｒｅｓ）ら：アナリティカル・バイオケ ミストν、−（Ａｎａｌ、　Ｂ、１ｏｃｈｅｔ）、第１４２巻（１９８４年）６ ８〜７８ページ（本明細書中に援用する））。

本発明の食細胞受容体蛋白質、および結合蛋白質は、これを各種の診断および治 療目的に使用することができる。単純な実施例では、哺乳類であるのが好ましい 真核細胞から、あるいは、前記蛋白質を産生ずるよう組換え手段を用いて加工し た真核または原核細胞から、可溶性の受容体蛋白質を採取かつ精製し、放射能標 識した状態、または未標識の状態の双方において競合的結合検定法にこれを用い て、受容体の存在が検査される。精製および検定を目的として、受容体蛋白質、 あるいはその断片または類似物質、あるいはそれに結合する蛋白質を不活性支持 体に固定化することも可能である。例えば、受容体蛋白質のコラーゲンドメイン を不活性支持材料に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーなる方法に 用い、脂質、および脂質含有物質、例えば内毒素を単離することができる。

本発明に開示の試薬を利用すれば、放射線免疫検定法、酵素免疫検定法、不均質 および均質検定法、酵素結合免疫吸収検定法（ＥＬＩＳＡ法）、および類似の検 定法など、各種検定手法が実行できる。

受容体蛋白質に親和性を宵する化学的に修飾されたＬＤＬその他の分子（被験体 ）の検定は、例えば下記の要領でこれを実施することができる。初めに、（被験 体の濃度が未知である）試料を既知量の固定された受容体蛋白質（またはその類 似物質、あるいはその蛋白質の抗原決定基を含有する一部）と接触させ、その間 に試料中の被験体を受容体蛋白質と結合させる。次いで、固定された支持体を、 その未結合部位に結合する既知量の放射能標識した被験体で処理する。次いで、 過剰な標識を洗浄すれば、支持体に残留する標識の量は、当初に試料に存在した 被験体の量に反比例する。

固相支持体、例えばポリスチレンのビーズ、あるいはプラスチック製微量滴定用 ウェルに固定した受容体蛋白質を用いれば、上記に代わる被験体検定法を構成す ることが可能である。被験体を含有する試料を受容体蛋白質とともに、結合に充 分な時間だけ温室する。次いで、支持体を洗浄して、未結合被験体をすべて除去 する。結合した被験体の検出には、放射能標識した、あるいは酵素に結合させた 被験体と反応する、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を成分とする 展開用試薬を用いることができる。これに代えて、標識した受容体蛋白質を使用 することも可能である［免疫検定法の更に詳細な説明は、例えばロイド（Ｒｏｉ ｔｔ）の著書［基礎免疫学（ＥｓｓｅｎｔｉａｌＩ＋ｕｗｕｎｏ１ｏｇｙ）Ｊ、 １３７〜１７１ページ、ブラックウェル・プレｘ　（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｐｒ ｅｓｓ）出版（１９８０年）を参照のこと（本明細書中に援用する）〕。

固相支持体への受容体蛋白質の固定は、未精製の化学的に修飾されたＬＤＬの精 製のための手段（あるいはその追加的段階）としても有用であり得る。同様に、 受容体蛋白質に特異的なモノクローナル抗体の固定を、受容体蛋白質の精製はも とより、この蛋白質の発現細胞の認識および単離に用いることができる。

本発明を、各種血管障害の治療に有用な多数の治療剤の形成手段とすることがで きる。このような化合物の一部としては、マクロファージおよび単核球の親和性 部位を占拠するものと期待される拮抗性化合物または結合試薬があるが、これら は、化学的に修飾されたＬＤＬの結合を阻害Ｌ、それゆえ、泡沫細胞の発生およ び溶血斑の形成の阻害剤と１−で作用するのである。蒋用な拮抗性化合物として は、化学的に修飾されたＬＤＬの結合部位を有する受容体蛋白質それ自体または その一部（すなわちＩＩＩ　１２！ることもある。例えば、受容体蛋白質に対す る親和性を外ドメイン）に特異的な、抗体、および好ましくは、モノクローナル 抗体（あるいはその活性断片、類似物質、および誘導体）がある。有用なその他 の拮抗剤としては、泡沫細胞へとその形態形成を触発することなく受容体蛋白質 に結合できる、Ａｅ−ＬＤＬまたは被験体の類似物質がある。

受容体蛋白質、あるいは、少なくとも１個の細胞外ドメインを含有するその断片 は、化学的に修飾されたＬＤＬその他の被験体を、マクロファージ、単核球、あ るいは泡沫細胞に直接作用することな（血流から除去するものと思われる隔離剤 としても有用であり得る。

受容体蛋白質は、アテローム性動脈硬化症を治療するための高度に特異的な薬剤 送達系の設計にも有用である可能性がある。泡沫細胞の受容体蛋白質が様々な分 子を細胞内に取り込むことができることを利用して、抗ウィルス剤、代謝産物、 抗代謝産物、その他の治療剤を、溶血正中の泡沫細胞の細胞膜を越えて送達する ことができる。そのような場合、受容体蛋白質が認識する高分子に治療剤を結合 させて、この複合体が溶血正中の泡沫細胞と結合され、最終的には細胞内に取り 込まれるようにすることができると思われる。この目的に役立つ高分子としては 、０ｘ−ＬＤＬ、　Ａｃ−ＬＤＬ、および＾ｃＡｃ−ＬＤＬがある。合成され、 あるいは遺伝子工学的に形成された高分子を用いることも可能であろう。

受容体蛋白質の拮抗剤が血管性疾病の治療に有用であ細書中に援用する　月を用 い、ウシの肝臓５００ｑか有する結合性の分子、例えば抗体、および、より好ま しくはモノクローナル抗体を、対象者の血管系に投与することができる。この拮 抗剤は、溶血斑形成構成細胞、例えばマクロファージ、泡沫細胞、および単核球 に見出される受容体蛋白質と結合し、それによって、前記構成細胞が血管性疾病 、例えば溶血斑の（一層の）発達に寄与するのを防止し、あるいは阻害するもの と思われる。拮抗剤は、受容体蛋白質と結合し、かつこれを阻害することが可能 な、いかなる天然の、あるいは生合成による、あるいは合成された分子であって も良い。

次に、図解による特定の実施例との関連において、本発明を説明する。しかしな がら、本発明の精神または対象範囲から逸脱することな（、各種の変更、追加、 および削除をなし得ることは当然明白である。

裏鳳豊１ ウシの組織から取り出した食細胞受容体蛋白質を、マレイル−ＢＳＡアフィニテ ィークロマトグラフィー（１−ＢＳＡ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフ ィー（ＨＡＰ）、および分離用ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動法（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）を併用して、２．０００倍以上に濃縮する（ 第３表、方法■）。この操作は４℃にて行う。

基本的にはシュナイダ−（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）らの方法［ジャーナル・サブー バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ−Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｔ　）、第２２５巻（１９８０年）１１．４４２〜１１．４４７ページ（ 重刷ら膜蛋白質を調製する。この蛋白質を、ｌｄ塩化カルシウム、０．１５Ｍ塩 化ナトリウム、および１　ｍＭＰＭｓＦ（Ａ緩衝液）を溶かしたｐＨ８の１０１ 厘トリス−塩酸緩衝液５０ｈｆに懸濁させる。これに超音波処理を２回施し、次 いで、２０％トリトンＸ−１００を５５ｍｇ加え、３０分間撹拌しつつ溶解させ る。

不溶の物質は、遠心分離［３３，０００ｒｐ■、１時間、ベックマン（Ｂｅｃｋ ｌｌａｎ）社製３５型ローター使用］によってこれを除去する。上清（５０抛ｌ ｔ）を、予め１％トリトンＸ−１００含有のＡ緩衝液で平衡に達させておいた、 Ｉ−ＢＳＡ結合セファロース４Ｂカラム［ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 社製、９．８　ｘ　１２ｃ■、ゲル１厘１につきＭ−ＢＳＡ約１０■９含有］に 通す。同じ緩衝液を用いて１晩洗浄し、次いで、２カラム容の４０ｍ１ｌオクチ ルグルコシド含有Ａ１１ｌｌ液を用いて洗浄する。Ｂ緩衝液（１Ｍ塩化ナトリウ ム、２抛麗トリス−塩酸、１ｕｌｌ塩化カルシウム、ｌ　＠１ｌＰｌ［ｓＦ、お よび４０１１Ｍオクチルグルコシドを含有、ｐＨ８）を用いて、受容体蛋白質を 溶出させる。

実施例２ シュナイダーらの方法［前出］、およびダニエル（Ｄａｎｉｅｌ）らの方法［ジ ャーナル・サブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５８巻（１９８３年）４ ．６０６〜４．６１１ページ］（それぞれを本明細書中に援用する　）に従い、 フィルター結合検定法およびリガンドブロフト検定法を、多少変更を加えて実施 した。

ポリ核酸アフィニティークロマトグラフィーを用いて、リガンドの結合特異性も 測定した。４０ｍＭオクチルグルコシド含有のＡ緩衝液４ｖａｌに溶かした、１ ５０ｎｇのＡｃ−ＬＤＬ結合活性を有する、Ｍ−ＢＳＡで精製した蛋白質を、ポ リ核酸結合アガロースカラム（ＡＣ−ＰＯＬＹシリーズの充填済みカラ基本的に はクリーガー（Ｋｒｉｅｇｅｒ）の論文［セル（Ｃｅｌｌ）、下で”Ｉ−Ａｃ− ＬＤＬ（１■ｌにつき＾ｃ−ＬＤＬ　２　ｍｇ）の減成を測定することによって 、細胞性の食細胞受容体蛋白質の活性を検定した。

実施例３ 実施例１の要領で得られた分画に１ついて、実施例２に記載の要領でＡｃ−ＬＤ Ｌ結合能を試験した。Ａｃ−ＬＤＬ結合活性を有する分画（１００＠７’）を蓄 え、限外濾過［ダイアフロー（Ｄｉａｆｌｏ）膜第ＰＭ３０番、アミコア　（Ａ ＠１ｃｏｎ）社製］を行って、これを濃縮する（３５ｍｔ’）。ＰＤＩＯなる脱 塩カラム（ファルマシア社製）を用いて、試料緩衝液を、２５ｍＭリン酸カルシ ウム、４０口１オクチルグルコシド、１　ｓＭＰＭｓＦからなるｐＨ６，８の溶 液に変える。次いで、Ｍ−ＢＳＡによるアフィニティークロマトグラフィーで精 製した分画（５０ｎｌ）を、ウシトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）−ＨＡなるカラ ム［エルーケー・ビー（ＩＪＢ）社製、２．５　ｘ　Ｌ３ｃｍｌに流速を毎時７ ５ａ＋１として通す。４０ｍＭオクチルグルコシド含有のリン酸緩衝液の濃度勾 配（２５ｍＭ〜３５０ｍＭ）を用いて蛋白質を溶出させる。

２２０ｋＤの蛋白質を１００〜２００ｍＭのリン酸濃度分画から回収し、レムリ （Ｌａｅｉｍｌｉ）の論文［ネーチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、第ルによる非還元 性５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、これを更に精製する。第１図は、この非還元性ゲ ルにおける精製分画の銀染色像（Ａ：第１〜３列）、およびＡｃ−ＬＤＬリガン ドブロフト像（Ｂ：第４〜６列）を示す。Ａｃ−ＬＤＬとの結合活性を有する２ ２０ｋＤの蛋白質を精製する。ｌ５ＣＯ−１７５０なる電気泳動濃縮装置を用い 、０．１％ＳＤＳ、　１０ｍＭ＋−リス−塩酸緩衝液からなる９Ｈ８の溶液中に 、この蛋白質をゲルから溶出させる。第３表は、方法■による上記の結果を要約 したものである。

ウシにおける他の臓器または細胞からの２２０ｋＤ蛋白質の部分的精製を、全段 階をより小規模に実行した以外はウシ肝臓におけると基本的に同じ手順に従って 、実施した。

免疫プロット法およびリガンドブロフト法を用いて、ウシの各種臓器における２ ２０ｋＤ蛋白質の分布、およびＡｃ−ＬＤＬに対する結合活性を調べた。抗体結 合性およびリガンド結合性蛋白質の、染色の度合と電気泳動移動度（２２０ｋＤ ）とには密接な相関関係がある。リガンド結合活性および２２０ｋＤ蛋白質の量 は、肝臓、肺、膵臓、および副腎で多いが、これらは、生体内でＡｃ−ＬＤｌ、 を効率的に取り込乳Ｊ茎 むことが知られている臓器である。腸管は、Ａｃ−ＬＤＬを僅かに取り込むのみ であり、２２０ｋＤ蛋白質の含量は極めて僅かであって、結合活性も僅かである に過ぎない。

Ｍ−ＢＳ＾アフィニティークロマトグラフィーとＩｇＧ−Ｄｉ免疫アフィニティ ークロマトグラフィーとを併用して、食細胞受容体蛋白質を２３８．０００倍に 精製した（第３表、方法■）。操作はすべて４℃にて実施した。ウシ肝臓または 肺５００ｑからａｔ−ＢＳ＾アフィニティークロマトグラフィーで精製し、Ｂ緩 衝液ＬＯＯｍｇに溶かした蛋白質に、Ｃ緩衝液１００ｍｆｆ［０，１％ＳＯＳ、 ０．１％チオキシコール酸ナトリウム、１％／ニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ２ Ｏ、ｐｌ（８の５０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液、１５０ｎＭ塩化ナトリウム、お よび１　ｍＭＰＩＩｓＦ含有コを加え含有口の試料を、下記の要領で調製したＩ ｇＧ−Ｄｉを結合サセたセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）に流速を毎時５ ０ｍｊ’として通しくゲル１ｍｌにつき抗体４１１ｇ、１ｘ２ｃ■）、１晩再循 環させる。Ｃ緩衝液５抛１．　Ｄ緩衝液５０ｍ１（Ｑ−’１％）　！Ｊ　）　７ Ｘ−１００，１抛麗トリス−塩酸、ｐＨ８）、２Ｍ塩化ナトリウム含有り緩衝液 ５抛ｌ、およびＥｔｌｋ＆液２０ｍ１（ｌｈｌ　トリス−塩酸含有、ｐＨ８の４ ｈ＋Ｍオクチルグルコシド溶液）を連続的に用いて、カラムを洗浄する。次いで 、２Ｍグアニジンチオシアナート含有Ｅ緩衝液２０■ｌを用いて、結合した蛋白 質を溶出させる。溶出後、ＰＤＩＯなるカラム（ファルマシア製）を用いて、緩 衝液を４０１ＩＭオクチルグルコシド含有Ａｌｌ！衡液に変える。蛋白質の貯蔵 は、−７０℃にて行う。方法■による結果は、第３表に要約しである。

実施例５ 基本的には、オオイ（Ｏｌ）らの論文（前出、引用により本発明に組み込まれる ）に記載の要領で、マウス骨髄腫細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）を、分離 用５Ｏ３−ＰＡＧＥｅ用１．’で精製した受容体蛋白質で免疫感作しておいた、 マウス膵臓細胞と融合させて、ハイブリドーマを形成させる。初回注射には受容 体蛋白質１５■９を用い、追加免疫には１０■ｑを用いる。抗体分泌ハイブリド ーマの同定には、パイシーゲル（Ｂｅｉｓｉｅｇｅｌ）らの論文［ジャーナル・ サブーバイオロジカルーケミストリー、第２５６巻（１９８１年）１１．９２３ 〜１１．９３１ページ（本明細書中に援用する　月に記載の要領で、ヒドロキシ ア、パタイト（ＨＡｒ’）で精製した蛋白質の塗膜を施した９６ウエルプレート を用いて、酵素免疫検定法を行い、次いで、ファン（Ｔｓａｎｇ）らの論文［メ ソッズ・イン・エンザイモロジー、第９２巻（１９８３年）３７７〜３９０ペー ジ（引用により本発明に組み込まれる）］に記載の要領で、免疫プロット法を用 いた。次いで、ハイブリドーマに限界希釈を２回施し、０．１％ウシ胎児血清、 および１％ニュートリド−７（Ｎｕｔｒｉｄｏａ＋ａ）−ＮＳを含有するＲＰＭ Ｉ−１６４０なる培養液で培養する。ＩｇＧ−Ｄｉなるモノクローナル抗体、お よび別の明らかに無関係な２８７ｋＤの蛋白質を認識する対照抗体を、ｌ［ＡＰ ｓｎ緩衝キット［バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）社製］を用いたアフィゲル（＾ ｆｆｉｇｅｌ）プロティンＡによるクロマトグラフィーを用いて、培養液から単 離した。

実施例６ 実施例１の要領で単離した部分的精製の受容体蛋白質に、ファンらの方法（前出 ）の要領で、５ＯＳ−ＰＡＧＥおよび免疫プロット法を施す。第１図Ｃ（第７列 ）に示した免疫プロット像は、ゲルを用いて精製された未還元の２２０ｋＤウシ 蛋白質に対して出現させたＩｇＧ−Ｄｉは２２０ｋＤウシ蛋白質を認識すること を証明している。ＩｇＧ−Ｄｉとの結合、およびＡｃ−ＬＤＬに対するリガンド 吸収活性は、還元によって失免疫化学的手法を用いて、２２０ｋＤ蛋白質の細胞 形態別特異性および組織分布、およびＡｃ−ＬＤＬ受容体とのその関係も調べた 。基本的にはコザルスキー（Ｋｏｚａｒｓｋｙ）らの論文［ジャーナル・サブ・ セル・バイオロジー（Ｊ−Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．　）、第１０２巻（１９８６年） 　１．５６７−１．５７５ページ（本明細書中に援用する　）］に記載の要領で 、実施例３の要領で得られたモノクローナル抗体を用い、かつ、ヨードビーズ［ Ｉｏｄｏｂｅａｄｓ　：ピアス（Ｐｅａｒｃｅ）社製］を用いて放射性ヨウ素化 しておいたウシ肝臓または肺の、ＨＡＰで精製の結合性蛋白質（蛋白質１ｍｖに つき２〜１０ｍｇのＡｃ−ＬＤＬ結合活性）を用いて、免疫沈降法を実施した。

ＩｇＧ−Ｄｉ、あるいはＴ２Ｄ２なる対照抗体を用いたｌ！ｓＩ標識標本におけ る免疫沈降法の結果を第５図に示す。ＩｇＧ−Ｄｉは、見かけの分子量が２２０ ｋＤ、　１５０ｋＤ、　７７ｋＤである３種類の１２５１標識ウシ標本種を特異 的に沈澱させる（第５図Ａ１第１列）。

免疫沈降法によって沈澱した２２０ｋＤの蛋白質をリガンドブロフト法を用いて 回収すると、これが＾ｃ−ＬＤＬ結合活性を保持していることが示される（第５ 図Ｂ１第５列）。

裏鼻豊旦 ＩｇＧ−Ｄｉで沈澱させ、免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製 した食細胞受容体蛋白質は、非還元性５ＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量と して２２０ｋＤ、　１５０ｋＤ、および７７ｋＤを示した。還元後、これらは７ ７ｋＤの帯域に分解する（第５図Ａ１第１列および第４列）。免疫沈降法または 免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いて得られた２２０ｋＤおよびＬ５ ０ｋＤの蛋白質を、分離用ゲルから個別に回収し、次いで還元すると、それぞれ の見かけの質量もまそれぞれ７７ｋＤサブユニツトの二量体および二量体である ことが示される。

この７７、０００ダルトンのサブユニットに（実施例７の要領で）免疫沈降法を 施し、次いで、エルグ−（Ｅｌｄｅｒ）らの論文［プロシーディンゲス・サブ・ ザ・ナシ３ナル・アカデミ−・サブ・サイエンセズ・サブ・ザ・ユナイテド・ス テー７・サブ・アメリカ、第７９巻（１９８２年）４．５４０〜４．５４４ペー ジ（本明細書中に援用する　）］に記載の要領で、シアリダーゼ［米国インディ アナ州インディアナホ１７ス所在、ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）社製］、またはエンドグリコシダーゼＦ［米国マサチ ューセッツ州ボストン所在、ジェンザイム（ＧＥＮＺＹＭＥ）社製］による消化 を施して、この受容体蛋白質の炭水化物特性を調べる。次いで、得られた蛋白質 に還元性条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥを施す（第６図）。処理後のその見かけの分 子量は、シアリダーゼ処理後は約５　ｋＤ、エンドグリコシダーゼ処理後は約１ ３ｋＤ減少し、アスパラギンに結合した糖鎖、およびシアル酸の存在が示された 。

免疫アフィニティークロマトグラフィーで精製後の活性もまた、非還元性５Ｏ８ −ＰＡＧＥによれば、見かけの分子量として２２０ｋＤ、　１５０ｋＤ、および ７７ｋＤを示した（第５図Ｃ１第７列）。

実施例９ 下記の要領で、ウシ肝臓試料について免疫化学的研究を実施した。クリオスタン トを用いて一２０℃にて組織切片（６開）を切り出し、スライドグラス上に置い て１時間空気乾燥させ、９５％冷メタノールで固定する。切片を、ＩｇＧ−Ｄｉ なるモノクローナル抗体（６ＩＩｇ／■ｌ）、または対照マウスＩｇＧとともに 温室する。アダムンン（Ａｄａｍｓｏ口）らの論文［ジャーナル・サブ・イミュ ノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、第１３０巻（１９８３年）２０３〜２０ ７ページ（本明細書中に援用する　）］に記載の要領で、ペルオキシダーゼを結 合させたヒツジの抗マウスＩｇＧＦａｂを用いて、３．３’−ジアミノベンジジ ン四塩酸塩による染色を施すことによって、ＩｇＧの結合が視覚化される。メチ ルグリーン〔シグマ（Ｓｉｇ■ａ〕社製］を用いて切片に対比染色を施す。

第７図に、抗つシ２２０ｋＤ蛋白質モノクローナル抗体であるＩｇＧ−ＤＩを用 いた、凍結肝切片に対する免疫組織化学的分析の結果を示す。２２０ｋＤ結合蛋 白質の分布は、食細胞受容体蛋白質活性に関する前記の記述と一致する。すなわ ち、洞様構造部（矢印）に特異的であるが、肝細胞（Ｈ）には存在せず、免疫染 色され（第７図ＢおよびＣ）、中央の静脈（ＣＶ）を直接囲む部域では、極めて 僅かに染色されるに過ぎない。Ｐは門脈部を示す。

Ｘ胤五刊 マクロファージによるアセチルＬＤＬ取り込みの能力を調べるため、その細胞培 養を実施した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いた気管支洗浄によって（１肺 あたりＰＢＳ　１リツトル）、ウシ肺胞マクロファージを採集する。これを、１ ０％ウシ胎児血清含有のＲＰＭＩ−１６４０なる培養液とともに５７′０こで６ 時間、ＣＯ□通気インキュベータ中で培養し、ＰＢＳを用いて６回洗浄して、未 粘着細胞を除去する。

キックスリー（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ）らの論文［プロシーディンゲス・サブ・ザ・ ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンセズ・サブ・ザ・ユナイテド・ステー ツ・サブーアメリカ、第８１巻（１９８４年）５．４５４〜５．４５８ページ（ 本明細書中に援用する　）］に記載の要領で、１．１°−ジオクタデシル−３， ３，３’　、　３’−テトラメチルインドカルボシアニン（ＤｉＩ）で標識した 蛍光Ａｃ−ＬＤＬの取り込みを行わせた。

免疫プロット法用に、■５〇−培養皿２枚に分は取った細胞を、・トリプシン（ ０，０５％）またはＰＢＳとともに、３７℃にて５分間温室し、これを削り落と して回収する。遠心分離を施して浮遊細胞を回収し、削り落とした細胞と混合す る。次いで、水冷Ａ緩衝液１（１ｗｊ！に細胞を懸濁させる。

Ｍ−ＢＳＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて細胞膜から部分的に精製 した２２０ｋＤ蛋白質に、実施例６に記載の要領で免疫ブロフト法を施す。トリ バンブルー染色（浮遊細胞に対して）、あるいは、１晩温置後のＤｉＩ−Ａｃ− ＬＤＬ取り込みの回復（粘着細胞に対して）のいずれかによって測定した細胞の 生存度は、穏やかなトリプシン消化によっても著しく影響されることはなかった 。

Ａｃ−ＬＤＬ受容体活性（蛍光ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬの蓄積、第８図Ａ）、およ び２２０ｋＤ蛋白質（ｒｇＧ−ＤＬを用いた免疫プロット像、第８図Ｂ、第Ａ列 ）の同時発現もまた、培養ウシ肺胞マク込みは、過剰な未標識Ａｃ−ＬＤＬの存 在によって遮断された（第８図Ａ）。２２０ｋＤ蛋白質の免疫学的検出は、予め マクロファージを低濃度で致死以下量のトリプシン（０，０５％）で３７℃にて ５分間処理することによって、妨げられた（第８図Ｂ、第８列）。健全な細胞に おけるこの蛋白質の感受性は、２２０ｋＤ蛋白質には、少なくとも部分的には細 胞表面に富山しているものがあることを示唆している。

実施例１１ ＴＨＰ−１なるヒト単核球性白血病細胞系統を、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰ１ １１−１６４０培地で培養した。２００ｎＭのホルボール−１２−ミリステート −１３−アセテ−）　（ＰＩＡ）の存在下での３日間の培養によって、ＴＨＰ− １細胞をマクロファージ様細胞に分化するよう誘導する。ＰＩＩＡで処理または 未処理の細胞１０’個から回収した、１ｔ−ＢＳＡアフィニティークロマトグラ フィーで精製の膜蛋白質に、実施例１の要領で、Ａｃ−ＬＤＬリガンドプロット 法、およびフィルター結合検定法を施す。

ヒトのこの細胞系統においては、Ａｃ−ＬＤＬ受容体活性および２２０ｋＤ結合 蛋白質の同時的な、かつ協調的に調節される発現が認められた。第９図は、受容 体活性（Ｉｔｓ　（−Ａｃ−ＬＤＬの減成を検定）のホルボールエステルによる 誘導が細胞膜蛋白質の”　Ｉ　−Ａｃ−ＬＤＬ結合活性の相当程度の増大（フィ ルター結合検定法による）、および、２２０ｋＤ食細胞受容体蛋白質の活性の劇 的な量的増加（リガンドブロフト検定法による）を伴うことを示している。免疫 アフィニティークロマトグラフィーで精製した受容体蛋白質は、０、５ｍｇ／　 ｌＥ＋／（０，８ｎＭ）という見かけの解離定数で＋　２５１−Ａｃ−ＬＤＬと 結合する（第１０囚人）。＋２５１−＾ｃ−ＬＤＬの最大結合度は、約１．４ｙ ａｑ／　１１９であツタ。

免疫アフィニティークロマトグラフィーで精製した受容体蛋白質・リン脂質複合 体を各種濃度の被験競合物質中で予め３０分間温１してから、”’　Ｉ−Ａｃ− ＬＤＬを４℃にて１時間添加する（２１ｇ／！１１の蛋白質）ことによって、Ａ ｃ−ＬＤＬとの結合の競合関係を測定した。比較的有効な被験競合物質は、ＬＤ Ｌ、マレイル−６Ｓ＾、フコイダン、ポリ硫酸ビニル、および、プリンヌクレオ チドである、ポリ［イノシン酸］、ポリ［イノシン酸−シチジル酸］、およびポ リ［グアニル酸］であった（第１０図Ｂ）。

精製受容体は、０ｘ−ＬＤＬとも結合が可能である。この活性は、第４表に示さ れている。０ｘ−ＬＤＬは、シニタインブＬ／　−／　ｈ　＋　−（Ｓｔｅｉｎ ｂｒｅｃｈｅｒ）らの方法［プロシーディンゲス・サブ・ザ・ナショナル・アカ デミ−・サブ・サイエンセズーサブ・ザ・ユナイテド・ステーツ・サブ・アメリ カ、第８１巻（１９８４年）３．８８３〜３．８８７ページ（本明細書中に援用 する　）］を用いてこれを調製した。

＋２５１−Ｏｘ−ＬＤＬを用いたリポソーム再構成検定法を用い、競合物質（Ａ ｅ−ＬＤＬ　１　ｃａｌあたり２００μｇ）の存在下での結合活性を競合物質の 不在下での活性から減じることによって、比活性を測定する。これらの結果は、 食細胞受容体蛋白を示している。

実施例１２ ＲＰ−３００［米国カリフォルニア州エメリービル所在、ブラウンリー・ラボラ トリ−（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）社製］による逆相ＨＰＬＣ を用いて、食細胞受容体蛋白質を更に精製した。７０％ギ酸に受容体を溶解させ る。次いで、室温にて１晩、臭化シフ　：／　（ＣＮＢｒ　：溶液１０ｈｆに対 して２５即）を用いてこれを開裂し、多数の開裂断片の形成をみた。

ＲＰ−３００のカラムによるクロマトグラフィーを用いて、これらの断片を分離 した。

断片の１個を単離し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ）社（米国カリフォルニア州フォスター・シティ−所在）製アミ ノ酸配列決定装置を用いて自動アミノ酸分析を実施した。これによって、下記の アミノ酸配列が判明した。

Ａｒｇ−丁１ｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ− Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−＾５ｎ−Ｐｈｅ− Ｇｌｎマッグイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ）のゲル電気泳動／免疫プロット法［ ジャーナル・°サブ・バイオロジカル・ケミストリ−１第２６２巻（１９８７年 ）　１０．０３５〜１０．０３８ページ］を用いて、第２の配列（下記）を類似 のＣＮＢｒ消化から得た。

Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−＾５ｎ−Ｘ−１１ｅ−Ｘ−＾ｓｎ−＾ｓｐ−Ｌｅｕ− Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ 式中、Ｘは、この位置のアミノ酸残基が不特定であることを示す［第３クローン のアミノ酸配列におけるこれらの残基（その下の傍点で示す）の相対的位置につ いては、第３図Ａ−Ｃを参照のこと］。

実施例１３ クローンの形成および同定に関する方法は、別途記載のない限り、例えばマニア ナイス（菖ａｎｉａｔｉｓ）らの著作［「分子クローニング：１研究用モデル（ 麗ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｉ［ｏｄｅ １月（１９８２年）、コールドスプリングハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）］、およびデービス（Ｄ ａｖｉｓ）らの著作［「分子生物学の基礎的方法（Ｂａｓｉｃ　１ｌｅｔｈｏｄ ｓ　ｉｎ　１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ月（１９８８年）、米国ニュ ーヨーク所在、エルゼビア・サイエンティフィク・パブリッシング（Ｅｌｓｅｖ ｉｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）社］に記載の標準的方 法である。

Ａ、　ｃＤＮ＾ライブラリーの調製 チョムシンスキー（Ｃｈｏａ＋ｃｚｙｎｓｋｉ）の論文［アナリティカル・バイ オケミストリー、第１６２巻（１９８７年）１５６ページ］に記載の要領で、酸 性チオシアン酸グアニジウム／フェノール／クロロホルムによる抽出法を用いて 、ウシの肺からポリ（Ａ　）　”ｍＲＮＡ’Ｅ単離し、無作為開始位置のｃＤＮ Ａのライブラリーを構築するのに用いた。ウシ肺マクロファージｍＲＮへ〇μす 、および任意のへキサヌクレオチド５μすを用い、ガブラー（ＧｕｂＬｅｒ）お よびホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）の方法［ジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻（１９ ８３年ル６３ページ］に従って二本鎖ｃＤＮＡを合成する。このようにして合成 されたｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩアダプター（ファルマシア社製）に結合させ、次 いテ、５Ｗ６０番ローター［ベックマン・インスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ　 Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社製］を用い、５０．００Ｏｒｐ■にて３時間の遠心 分離を施して、５％から２０％までの酢酸カリウム密度勾配上にサイズ分画する 。次いで、分子の重量が（アガロースによる電気泳動で）８００塩基対にほぼ等 しいかそれ以上の分画のｃＤＮＡを、ＥｃｏＲ１で切断したλｚａｐなるプラス ミド［ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製］に結合させ、パッケージ ングを行い、更にこれを用いて、ＸＬ−１ブルー（Ｂｌｕｅ）なる細胞（ストラ タジーン社より）に感染させる。１．５　ｘ　１０’個の一法クローンが得られ 、これを増殖させた。

これと同等の方法を用いて、ヒト単核球性白血病の細胞系統であるＴＨＰ−１か らヒトｃＤＮＡライブラリーを調製した。

Ｂ、ライブラリーのふるい分け、およびｃＤＮＡクローンの単離 ５−フルオロデオキシウリジン（Ｆ）を含有する４１量体オリゴヌクレオチドの プローブのプール２個を用いて、ＲＩＱＵＬＮＳＤＮＥＡＮＬＬＤ＾ なるアミノ酸配列に従って、クローンおよびヒトのライブラリーのふるい分けを 行った［ハーベナー（Ｈａｂｅｎｅｒ）ら：プロシーデインダス・サン・ザ・ナ ショナル・アカデミ−・サン・サイエンセズ・サン・ザ・ユナイテド・ステーク ・サン・アメリカ、第８５巻（１９８８年）１，７３５〜１．７３９ベージ］。

これらのプールを、セリンにおけるコドンの用いられ方に従って分割する。プー ル■は、５’　−ＡＴＦＣＡＧＴＡＦＦＴ（Ｆ／Ｇ）匹■匹）ＧＡＦＡ＾ＦＧＡ ＧＧＣ（Ｆ／Ｇ）ＡＡＦＦＴ（Ｆ／Ｇ）ＦＴ（Ｆ／Ｇ）ＧＡＧＡＦＧＣ−３゜な る配列からなる。プール■は、上記のプールＩの配列の下線のヌクレオチド［Ｔ Ｃ（Ｆ／Ｇ）］がＡＧＦとなっている。

＋１２ｐで末端標識したプローブを用い、３７℃でのハイブリッド形成、および ６倍のＳＳＣ中で［マニアナイスら：前出、４４７ベージ］０．１％ＳＤＳを用 いた５０℃での洗浄によって、各プールについて５　ｘ　１０５個のプラークの ふるい分けを行った。陽性と思われるクローンを精製し、生体内で切断してピコ ブルー（ｐブルースクリプト）由来のプラスミドを形成させる［ショート：前出 ］。サチンプロット／１イブリツド形成法［サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）　：ジ ャーナル・サン・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、菖ｏＬ、　Ｂｉｏｌ、）、 第９８巻（１９７５年）５０３ページ］を用い、 Ａ（Ａ／Ｇ）　（Ａ／Ｇ）ＴＴＮＧＣ（Ｃ／Ｔ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（＾／Ｇ　 ）ＴＣなる１７量体オリゴヌクレオチドのプール４個を用いて、挿入片をふるい 分ける。上記配列中の下線の位置（Ｎ）には、それぞれについて異なるヌクレオ チドが配置される。

プール■は、 ＡＴ（Ｆ／＾）ＣＡ（Ｇ／Ａ）ＴＡＦＦＴＴ匹ＴＧＡＦＡＡＦＧＡ（Ｇ／Ａ）Ｇ Ｃなる配列で構成され、プール■は、プール■の下線の位置（ＴＣ）に、ＡＧＦ が配置されている。

陽性のウシのクローンを５種類選出し、サンが一法［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ） ら：プロシーディングス・サン・ザ・ナショナル・アカデミ−・サン・サイエン セズ・オプ・ザ・ユナイテド・ステーク・サン・アメリカ、第７４巻（１９７７ 年）５．４６３ページ］に従って、配列決定を行った。これらのクローンは、ペ プチド配列に対応する１種類のヌクレオチド配列を有する。第３図ＡないしＣは 、第３クローンの核酸配列、およびそれから推定される対応アミノ酸配列を示し 、第４図ＡないしＤは、第７、第１２、および第１３クローンを組み合わせた核 酸配列、および推定される対応ＤＮＡ配列を示す。ヒトｃＤＮＡライブラリーに も、同等な方法を用いてウシｃＤＮＡから得られたプローブを用いてふるい分け を施した。第１４図ＡおよびＢは、ヒトのクローンから得られた核酸配列、およ び推定される対応アミノ酸配列を示す。

Ｃ６配列の分析 ウシｃＤＮＡクローンの配列決定によって、単離されたｃＤＮＡは、２種類の異 なるｍＲＮＡに由来することが示された。

これらのｍＲＮＡは、ともに同一の、３４７個のアミノ酸からなるＮ末端ドメイ ン［１Ｉｅｔ’−Ａｒｇ”’］を暗号化している。こノ酸１個の変化を生じるこ とがない。２種類のｉ＋ＲＮＡの相違は、３４８番目のアミノ酸から始まる。第 ３クローンの配列（第３図人ないしＣ）は、更に２個だけアミノ酸が続イテから 終止コドンが認められる（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−５ＴＯＰ）。

対照的に、第７クローンの配列は（第４図人ないしＤ）、更に１０６個のアミノ 酸が続く。

第３クローンには、その５′末端の３５個の非暗号化塩基、暗号化領域のｉ、　 ０４７個の塩基、および、その３′末端の９６５個の非暗号化塩基が含まれる（ 第３図人ないしＣ）。暗号化領域では（本印は暗号化領域の両端を示す）、第１ 〜５０番目のアミノ酸残基が細胞質ドメイン（Ｃｙ）を、第５１〜７６番目の残 基がここに提案の膜横断ドメイン（ＴＩ）を、第７７〜２７１番目の残基がここ に提案のアスパラギン結合ドメインを、第２７２〜３４３番目の残基がここに提 案のコラーゲンドメイン（Ｃｏｔ）を、第３４４〜３４９番目の残基がここに提 案のＣ末端ドメイン（（ニーｔｅｒｉｉ）を表している。第３図人ないしＣでは 、Ｔｌｌドメインの残基には下線を（第１下線領域）、アスパラギン結合糖鎖部 位には上部に傍線を、Ｃａｌドメインには下線を（第２下線領域）を付しである 。厘本は、開始コドンのメチオニンであり、抗ペプチド抗体を形成させるのに用 いられるペプチドを構成する、最初の１９個のアミノ酸には、その下に傍点を付 した（　Ｓｅ　ｔ　ｌ　３８は例外であって、これは後にＬｙｓと決定された） 。

第７クローン（第４図人ないしＤ）には、５゛例の非暗号化塩基がなく、暗号化 領域の１．３５９個の塩基、およびその３°末端の２１１個の非暗号化塩基が含 まれている。

Ｄ、ｃＤＮＡクローンの発現 第３クローンの発現ベクターとしてｐＸＡｃＬＤＬＲ３なるベクターを、ＢＡＭ 　ＨｌおよびＸｈｏｌを用いてｐブルースクリプト生成物（すなわち、λｚａｐ ベクターの生体内切除生成物）から第３クローンの配列を摘出することによって 、調製した。次いで、得られたＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で予め切断しておい たｐｃＤＮＡｌなるプラスミド［インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社よ り］に結合させる。

０日目に、サルのＣ（）Ｓ　１６なる系統の細胞［米国メリーランド州ロックビ ル所在、アメリカ模式菌培養収集（ＡＴＣＣ）より入手可能のＣＯ３７細胞系統 に由来、マサチューセッツ工科大学生物部門所属、ハウスマン氏（Ｄ、　Ｈａｕ ｓ■ａｎ）より贈与］を、１０％ウシウシ血清、ペニシリン、およびストレプト マイシン含有のＤＩＩＥＩ標準細胞培養液［ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製］を入れ た１、０（ｔｍｍ培養皿１個につき１．５　ｘ　１０’個宛移植する。１日目に 、標準的方法［シード（Ｓｅｅｄ）ら：プロシーディングス・サン・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・サン・サイエンセズ・サン・ザ・ユナイテド・ステーク・サ ン・アメリカ、第８４巻（１９８７年）３．３６５〜３．３６９ベージ］に従っ て、細胞にＤＮＡ移入を施す。簡潔に述べると、１０％ニューシーラム［Ｎｕｓ ｅｒｕｍ　：コラボラティグ６リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ）社製］含有ＤＩＩＥｉ１４　＊（ｌを既に含有する培養皿のそれぞ れに、開Ａ移入用反応混液を添加する。混液の組成は、ＤＥＡＥデキストラン溶 液（ファルマシア社製）Ｌｏμｆ（４０ｍｇ／　ｗｌ）、１ｈＭりｏｏキン（シ グマ・ケミカル社製＞４０ｕｌ、および第３クローン発現ベクターであるｐＸＡ ｃＬＤＬＲ３を４μ９である。ＤＮＡ移入用培養液中の最終濃度は、ニューシー ラム１０％、ＤＥＡＥデキストラン１００ｕｔｉ／ｍｅ、りｏｏキン１０ｈｌｌ 、およびベクターＤＮＡ　４　ａｔｉ／　ｍｌである。３７℃にて４時間製置後 、ＤＮＡ移入用培養液を除去し、細胞を、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＩＩ ＳＯ）含有［（ＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ　：　１３７ｓ＋１塩化ナトリウム 、５ｍＭ塩化カリウム、０．７ｍｌリン酸水素ナトリウム、６ｍＭデキストロー ス、２１ｄのＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，１）で２分間処理する。ＨＢＳ−Ｄ菖ＳＯ 溶液を除去し、細胞を再び標準培養液（１０％ウシウシ血清および抗生物質含有 のＤＩＥＭ）に移す。２日目に、ＤＮＡ移入された細胞を、トリプシン処理によ って回収する。これを６ウ工ル培養皿に、１ウエルあたりの細胞数を１ｘｌＯ’ として再移植して、４日目に検定を実施、あるいは１ウエルあたりの細胞数を０ ．８ｘｌＯ’として再移植して、５日目に検定を実施した。

Ｅ、受容体活性の検定 クリーガー（前出）の標準検定法を用いて、異なる濃度の各種未標識競合物質の 不在下（三重測定）または存在下（単一測定）で、ＤＮＡ移入された単一細胞層 が”’　Ｉ　−Ａｃ−ＬＤＬ１■ｌあたり蛋白質５ａｙを減成する能力を測定し た。

結果を第１１図に示す。第３クローンを含まぬ、ＤＣＤＮＡを移入した対照細胞 においては、減成されたＡｅ−ＬＤＬの量は、ｐＡｃＬＤＬ３を移入した細胞に よって減成されたそれの５％に過ぎなかった。この実験は、高親和性のＡｃ−Ｌ ＤＬ受容体活性は、第３クローンが含まれる発現ベクター（ｐＸＡｃＬＤＩ、Ｒ ３）を移入された細胞で発現されることを証明している。

別の実験では、４００μｇ／■ｌの競合物質を用いたこと以外は上記の要領で細 胞を調製し、かつ検定を実施した。

阻害剤には、ポリ［イノシン酸］、ポリ［シチジル酸］、ＬＤＬ。

Ａｃ−ＬＤＬ、　ｖレイル化ウシ血清アルブミン（Ｍ−ＢＳＡ）、０ｘ−ＬＤＬ 。

ＢＳＡ、およびポリ硫酸ビニル（ＰＶＳ）を用いた。結果を第１２図に示す。こ の実験もまた、第３クローンは、第３クローン含有ベクターであるｐＸＡｃＬＤ ＬＲ３を移入された細胞で高親和性のＡｃ−ＬＤＬ受容体活性を発現できること を示している。

Ｆ、　Ａｃ−ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡによる組織および細胞形態に特異的な発現 Ａｃ−ＬＤＬを暗号化しているクローンの発現の態様が生来の受容体の発現のそ れを反映しているかどうかを決定するため、これらのクローンが異なる細胞およ び組織形態において発現される能力を調べた。第３クローンのコラーゲンドメイ ン暗号化断片をプローブに用いて、標準的ノーザン（ＲＮＡ）ブロットノ）イブ リッド形成法を実施する。

２００ｎＭのホルボール− を加え、あるいは加えずに、ＴＨＰ−１細胞を３日間培養して、マクロファージ 様の細胞に分化するよう誘導する［コダマ（Ｋｏｄａａ＋ａ）ら：プロシーデイ ングス・サン・ザ・ナショナル・アカデミ−・サン・サイエンセズーサンーザー ユナイテドーステーツ・サンーアメリカ、第８５巻（１９８８年１２月）９．２ ３８ページ］。前記の要領で［コダマ、前出］、ウシ肺胞マクロファージを調製 する。これらの細胞から、またウシの各種臓器からポリ（＾）　”ＲＮＡ（３μ ９）を単離し、硝酸セルロース膜に吸収させる。第３クローンのコラーゲン様ド メインを暗号化している配列が含まれる、ｐＪＡＬ　５なるサブクローンのＸｂ ａ　１／Ｓｐｈ　１なる断片をｓｔｐで放射能標識し、４０％ホルムアミドの存 在下で４２℃にてハイブリッド形成させ、０．１％ＳＤＳ含有ＳＳＣを用いて、 ５５℃にて洗浄する◇ 得られた結果を第１３図（Ａ）に示す。Ｃｏｌドメインを暗号化しているＲＮＡ 配列は、肺胞マクロファージおよび肺におけると同様に、ＴＨＰ−１のＰＭＡＣ ＋）の（分化した）マクロファージにも検出される。このＲＮＡ発現の態様は、 生体内での受容体発現の態様と同じである。

同じ組織標本における受容体活性を同時に測定するために、これらのウシの組織 から受容体蛋白質を精製した（１臓器あたり５ｇ）。組織をホモジナイズし、ｍ ｌ−ＢＳＡのアフィニティークロマトグラフィーで精製し、抗ウシ受容体モノク ローナル抗体であるＩｇＧ−Ｄｉを用いて、前記の要領で［コダマ、前出］免疫 プロット法を実施した。

上記の免疫プロット分析の結果を第１２図（Ｂ）に示す。

ノーチンプロット法による上記の結果から期待された通出されない。

前述の説明および実施例から、各種の適切な哺乳類組織からは、Ａｃ−ＬＤＬに 高親和性を有する受容体蛋白質を単離、かつほぼ均質なまでに精製し得ることが 理解できる。

この受容体蛋白質に対して、その同定および更なる精製の際の一部となり得るモ ノクローナル抗体の造出が可能であり、これはまた、受容体蛋白質を含有する細 胞構造、例えばアテローム性動脈硬化症の溶血斑の探知方法にも有用である。加 えて、食細胞受容体蛋白質の少なくとも一部を暗号化しているＤＮＡクローンを 調製することができ、しかもこれらのクローンは、各種の組織形態において、生 来の受容体と同様の異なる発現の態様を示す。更に、発現された蛋白質は、食細 胞受容体蛋白質と同様の活性を有する。

本発明は、他の特定の形態においても、その精神または基本的特徴から逸脱する ことなくこれを具体化することができる。したがって、本実施例は、いかなる意 味においても、これを具体的に示すものとして、かつ制約するものではないとし て考慮されなければならず、本発明の対象範囲は、前述の説明によらずして添付 の請求範囲によって示され、したがって、この請求範囲と同等の意味および範囲 内に属するすべての変更は、これに包含されるものと解される。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アセチル化低密度リポ蛋白質との結合が可能な、実質的に純粋な受容体蛋白 質であって、 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける見かけの分子量が約２２０，０００ダ ルトンであること、および、アセチル化低密度リポ蛋白質に対する親和性を有す ること を特徴とする蛋白質。 ２．アセチル化低密度リポ蛋白質との結合が可能な請求項１記載の受容体蛋白質 の活性断片、類似物質、または誘導体。 ３．糖蛋白質であることを特徴とする請求項１記載の受容体蛋白質。 ４．アスパラギンと結合した糖鎖を有する請求項３記載の受容体蛋白質。 ５．ポリアクリルアミドゲルにおける見かけの分子量がそれぞれ約７７，０００ ダルトンであるサブユニットの三量体からなることを特徴とする請求項１記載の 受容体蛋白質。 ６．それぞれのサブユニットが、アスパラギンと結合した糖鎖を有する請求項５ 記載の受容体蛋白質。 ７．アセチル化低密度リポ蛋白質に対して１ｍｌあたり約０．５ｕｑの親和性を 有することを特徴とする請求項１記載の受容体蛋白質。 ８．ポリ硫酸ビニル、マレイル−ＢＳＡ、フコイダン、および、ポリ［イノシン 酸ーシチジル酸］、ポリ［イノシン酸］、およびポリ［グアニル酸］なるプリン ポリヌクレオチドからなる一群から選択される負に荷電した高分子と結合可能で あることを特徴とする請求項１記載の受容体蛋白質。 ９．食細胞受容体蛋白質との結合能力を有することを特徴とする結合試薬であっ て、 前記受容体蛋白質が、そのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける見かけの分 子量が約２２０，０００ダルトンであり、かつアセチル化低密度リポ蛋白質に対 する親和性を有すること を特徴とする結合試薬。 １０．試薬が、食細胞受容体蛋白質との反応する能力を保持する抗体、断片、類 似物質、およびその誘導体からなる一群から選択される生物学的活性分子である 請求項９記載の結合試薬。 ｎ．モノクローナル抗体からなる請求項９記載の結合試薬。 １２．標識手段からなる請求項９記載の結合試薬。 １３．標識手段が放射性同位元素からなる請求項１２記載の抗体。 １４．検定または精製を目的とする装置であって、支持体と、 それぞれアセチル化低密度リポ蛋白質との結合能力を有することを特徴とする、 前記支持体に結合させた複数の結合試薬と からなる装置。 １５．試薬がそれぞれ、食細胞受容体蛋白質と反応する能力を保持する抗体、断 片、類似物質、およびその誘導体からなる一群から選択される生物学的活性分子 である請求項１４記載の装置。 １６．試薬がモノクローナル抗体からなる請求項１５記載の装置。 １７．検定または精製を目的とする装置であって、支持体と、 それぞれＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける見かけの分子量が約２２０， ０００ダルトンであり、かつアセチル化低密度リポ蛋白質との結合能力を有する ことを特徴とする、前記支持体に結合させた複数の受容体蛋白質と からなる装置。 １８．受容体蛋白質が、酸化低密度リポ蛋白質との結合が可能な前記受容体蛋白 質の活性断片、類似物質、および誘導体からなる一群から選択される請求項１７ 記載の装置。 １９．対象者の血管系におけるアテローム住動脈硬化症の溶血斑の探知方法であ って、 前記溶血斑に随伴するマクロファージに結合した食細胞受容体蛋白質に対する特 異的親和性を有する結合剤を標識手段と待合させて、複合体を形成させる段階前 記複合体を前記対象者の血管系に投与する段階と、前記複合体の前記結合剤を前 記食細胞受容体蛋白質に結合させる段階と、 前記対象者の血管系において前記複合体の前記標識手段の存在および位置を探知 する段階とからなる探知方法。 ２０．結合剤を標識手段と結合させる段階に、それぞれ食細胞受容体蛋白質と反 応する能力を保持する抗体、断片、類似物質、およびその誘導体からなる一群か ら選択される結合試薬に前記標識手段を結合させる段階が含まれる請求項１９記 載の探知方法。 ２１．結合剤を標識手段と結合させる段階に、前記標識手段をモノクローナル抗 体と結合させる段階が更に含まれる請求項２０記載の探知方法。 ２２．結合剤を標識手段と結合させる段階に、結合試薬を放射性同位元素と結合 させる段階が更に含まれ、かつ、探知する段階に、生体外での放射能探知手段を 用いて前記放射性同位元素を探知する段階が含まれる請求項１９記載の探知方法 。 ２３．対象者の血管系におけるアテローム性動脈硬化症の溶血斑に選択的に治療 剤を送達する方法であって、前記溶血斑に随伴する溶血斑形成構成細胞表面の食 細胞受容体蛋白質に対する特異的親和性を有する結合剤を治療剤と結合させて、 複合体を形成させる段階と、前記受容体蛋白質と結合して、これによって前記治 療剤を前記溶血斑形成構成細胞および前記溶血斑に送達する前記複合体を、前記 対象者の血管系に投与する段階と からなる送達方法。 ２４．結合させる段階に、酸化低密度リポ蛋白質が含まれる結合剤に治療剤を待 合させる段階が更に含まれる請求項２３記載の送達方法。 ２５．結合させる段階に、アセチル化低密度リポ蛋白質が含まれる結合剤に治療 剤を結合させる段階が更に含まれる請求項２３記載の送達方法。 ２６．結合させる段階に、食細胞受容体蛋白質に対する特異的親和性を有する抗 体が含まれる結合剤に治療剤を結合させる段階が更に含まれる請求項２３記載の 送達方法。 ２７．結合させる段階に、モノクローナル抗体が含まれる結合剤に治療剤を結合 させる段階が更に含まれる請求項２６記載の送達方法。 ２８．結合させる段階に、それぞれ食細胞受容体蛋白質と反応する能力を保持す る抗体、断片、類似物質、およびその誘導体からなる一群から選択される結合剤 に治療剤を結合させる段階が更に含まれる請求項２６記載の送達方法。 ２９．血管性疾病の治療方法であって、食細胞受容体蛋白質の拮抗剤が含まれる 治療剤を対象者の血管系に投与する段階と、 前記拮抗剤を溶血斑形成構成細胞表面上の前記受容体蛋白質に結合させて、前記 溶血斑形成構成細胞の血管性疾病に対する寄与を阻害する段階とからなる治療方 法。 ３０．投与する段階に、受容体蛋白質に対する特異的親和性を有する結合性の分 子を血管系に投与する段階が含まれる請求項２９記載の治療方法。 ３１．投与する段階に、受容体蛋白質に対する特異的親和性を有する抗体が含ま れる結合性の分子を血管系に投与する段階が更に含まれる請求項３０記載の治療 方法。 ３２．投与する段階に、受容体蛋白質に対する特異的親和性を有するもノクロー ナル抗体が含まれる抗体を血管系に投与する段階が含まれる請求項３１記載の治 療方法。 ３３．食細胞受容体蛋白質の少なくとも１サブユニットのアミノ酸配列と充分に 重複していて、その結果、前記食細胞受容体蛋白質の、１またはそれ以上の追加 的ポリペプドまたは生来のサブユニットと組み合わされた場合に、ＬＤＬの化学 的に修飾された形態と結合するアミノ酸配列からなるポリベブド。 ３４．請求項１または２に記載の蛋白質の少なくとも一部を暗号化している配列 からなるＤＭＡ配列。 ３５．請求項３３記載のポリベチドサブユニットの少なくとも一部を暗号化して いる配列からなるＤＭ配列。