JP3594318B2 - 抗ヒトスカベンジャーレセプター抗体 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、マクロファージの同定や定量及び動脈硬化症の診断に有効なヒトスカベンジャーレセプター（以下「ｈＳＲ」という場合がある）に対する抗体（以下、抗ヒトスカベンジャーレセプター抗体といい、抗ｈＳＲ抗体という場合がある）に関する。
【０００２】
【従来技術】
動脈硬化は、コレステロールとリポ蛋白質との複合体である低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）の変性体を取り込んだマクロファージが泡沫細胞に変化して血管内皮細胞下に蓄積することにより惹起されると考えられている。スカベンジャーレセプターはマクロファージの細胞膜に存在し、変性したＬＤＬと結合してそれを細胞内に取り込む際に機能する蛋白質である。
【０００３】
更にスカベンジャーレセプターは、生体内で種々の変性物、ウィルス等の異物、エンドトキシンなどの生理活性物質の除去に関与している可能性がある。従って、スカベンジャーレセプターの作用機作を解明することは、動脈硬化の発症機構を解明し、さらにその診断、予防及び治療法、並びにそれらのための試薬や医薬を開発するために重要であると考えられる。
【０００４】
また、マクロファージ及び網内系の機能の解明にも重要である。これらの解明に重要な役割を果たすものとして、スカベンジャーレセプターに対する抗体が挙げられる。
ウシスカベンジャーレセプター遺伝子並びにウシスカベンジャーレセプターに対する抗体は児玉等によって報告されている（Ｔ． Ｋｏｄａｍａ等； Ｎａｔｕｒｅ， ３４３ ： ５７０−５７２． １９９０）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ヒトスカベンジャーレセプターの遺伝子は、ウシスカベンジャーレセプター遺伝子に次いで児玉等によりクローニングされた。ヒトスカベンジャーレセプターはウシスカベンジャーレセプター遺伝子と同様、Ｉ型とＩＩ型が存在し、そのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号： １ 又は配列番号： ２ に示すとおりである。これらの遺伝子はいずれも新規なものである。
【０００６】
このヒトスカベンジャーレセプターの作用機作を解明することが、ヒトの動脈硬化症の発症機構の解明、さらにはその診断、予防、治療へとつながる。このためには抗ヒトスカベンジャーレセプター抗体が有用となるが、この抗体は未だ知られていない。本発明はこの抗体を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記ヒトスカベンジャーレセプター蛋白及び配列番号： １ に示すアミノ酸配列情報の一部を利用して合成したペプチドを抗原として用い、常法に従い抗ヒトスカベンジャーレセプター抗体を作製した。
【０００８】
そしてこの抗体を用いてマクロファージの同定を行った結果、マクロファージに対し極めて高い結合特異性を示した。このことは当該抗体がマクロファージの細胞膜上に存在するヒトスカベンジャーレセプターに対し、極めて高い特異性を有する抗体であることを意味するものであり、この知見に基づき本発明を完成した。
即ち本発明は、抗ヒトスカベンジャーレセプター抗体に関する。更に詳しくは▲１▼マクロファージには特異的に結合するが、▲２▼マクロファージ系細胞以外の単核食細胞には結合しない性質を有する抗ヒトスカベンジャーレセプター抗体に関する。
【０００９】
さらに本発明は配列番号： １ 又は配列番号： ２ に示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその一部からなるペプチドを用いて哺乳動物を免疫したのち、その動物の血液中より抗体を単離することを特徴とする前記の抗ヒトスカベンジャーレセプター抗体の製法に関し、さらには配列番号： １ 又は配列番号： ２ に示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその一部からなるペプチドを抗原として利用して免疫した哺乳動物の脾細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞ラインとからの細胞融合によって形成されたハイブリドーマを培養し、その培養上清より前記の抗体を単離することを特徴とする抗ヒトスカベンジャーレセプターモノクローナル抗体の製法に関する。
【００１０】
本発明はまた抗ヒトスカベンジャーレセプター抗体を摘出されたヒト組織と反応せしめることを特徴とするヒト諸組織におけるマクロファージの同定およびそれらの分布を検索する方法に関する。
【００１１】
【具体的な説明】
本発明の抗体は上記した如く、▲１▼マクロファージに特異的に結合するが、▲２▼マクロファージ系細胞以外の単核食細胞には結合しない性質を有するＩｇＧに属する抗体である。
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の製造方法自体は、当業者によく知られた方法であり、例えばモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製法は、オーイ等の方法（Ｖｅｒｎｏｎ Ｔ． ＯＩ；ＳＥＬＥＣＴＥＤ ＭＥＴＨＯＤ ＩＮ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， ｐｐ３５１−３７２． Ｆｒｅｅｍａｎ， １９８０） 等が知られている。
【００１２】
本発明の抗体は、配列番号： １（ヒトスカベンジャーレセプターＩ型）又は配列番号： ２（ヒトスカベンジャーレセプターＩＩ型）に示すアミノ酸配列からなる蛋白或いは当該配列の一部、例えば配列番号： １ に示すアミノ酸配列の第１９９〜２０９からなるペプチド（以下 ｈＳＲ Ｉ−１ とする）、同第３２５〜３４２からなるペプチド（以下 ｈＳＲ Ｉ−２ とする）、同第４０１〜４１９からなるペプチド（以下 ｈＳＲ Ｉ−３ とする）又は配列番号： ２ に示すアミノ酸配列の第３４２〜３５８からなるペプチド（以下 ｈＳＲ ＩＩ−１ とする）のいずれかとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） 等のごとき高分子物質とをコンジュゲートして作成した抗原を用いて、上記の如き自体公知の抗体の製法に従って製造することができる。
【００１３】
モノクローナル抗体を作製する場合には、例えば上記の如くして作製した抗原をマウスに投与し、免疫されたマウスの脾細胞を取り出し、これとマウス骨髄腫瘍細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する。次いで得られたハイブリドーマを培養し、培養上清より抗ｈＳＲ抗体を回収することができる。
【００１４】
【実施例】
以下に実施例によって本願発明を詳細に説明するが、本願発明はこれらに限定されるものではない。
【００１５】
実施例１． ポリクローナル抗体
（１） 抗原の調製及び免疫
配列番号： １ に示されるアミノ酸配列の第１９９〜２０９からなる部分ペプチド「 ｈＳＲ Ｉ−１」、同第３２５〜３４２からなる部分ペプチド「 ｈＳＲ Ｉ−２」、同第４０１〜４１９からなる部分ペプチド「 ｈＳＲ Ｉ−３」並びに配列番号： ２ に示されるアミノ酸配列の第３４２〜３５８からなる部分ペプチド「 ｈＳＲ ＩＩ−１」をそれぞれペプチド合成機（アプライド バイオシステムズ社／モデル４３０Ａ） を用いて常法に従い合成した。
【００１６】
これらの部分ペプチドをそれぞれウシ血清アルブミンとｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ） を用いて、常法に従いコンジュゲートし抗原を作製した。これらの抗原それぞれ５００μｇ をフロイントの完全アジュバントと共に２ 〜３ヶ月齢のウサギの皮下に投与し、以後３週間おきに４回追加投与して免疫した。
【００１７】
（２） 抗体価の測定
各免疫後１週間目に耳静脈より採血し、血清中の抗ｈＳＲ抗体価を以下に示すＥＬＩＳＡ 法で調べた。即ち、９６穴の ＥＬＩＳＡ用プレートに特異抗原 （上記部分ペプチド「 ｈＳＲ Ｉ−１」、「 ｈＳＲ Ｉ−２」、「 ｈＳＲ Ｉ−３」又は「 ｈＳＲ ＩＩ−１」がそれぞれ１０μｇ／ｍｌとなるように ０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３ で希釈した溶液） を５０μｌ／穴ずつ分注し、４℃で一晩放置して抗原をプレート穴底面にコートした。
【００１８】
次いでリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂａｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ／ＰＢＳ）で洗浄後、３％ゼラチンでプレート底面上の蛋白質結合性残基をコートした。上記プレートに段階希釈した試料（ウサギ抗血清、又は精製抗体）を１００μｌ／穴ずつ分注し、室温で１時間放置した。次いでＰＢＳで４回洗浄したのち、第２次抗体としてヤギの抗ウサギＩｇＧの２０００倍或いは３０００倍希釈を１００μｌ／穴ずつ分注し、室温で１時間放置した。
【００１９】
ＰＢＳで洗浄後、基質液（Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ １２ｇ、サリチル酸１ｇ 、クエン酸１水和物 ３．８ｇ、３０％Ｈ_２Ｏ_２ ０．５ｍｌを水１リットルで溶解したもの、ｐＨ ６．０） １ｍｌあたり３ｍｇの割合で溶解したｏ−フェニレンジアミン１００μｌ を加え（使用直前に調整）、室温遮光し、１０〜２０分間放置してから反応停止液（８Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４） ２５μｌ／穴添加した。次いで発色を ＯＤ ４９２ｎｍ と ＯＤ ６１０ｎｍ で吸光度測定した。判定においては、陰性コントロール（正常ウサギ血清）との差が０．０５以上のものを陽性とした。
【００２０】
この結果、ｈＳＲ Ｉ−１、ｈＳＲ Ｉ−２、ｈＳＲ Ｉ−３及び ｈＳＲ ＩＩ−１の抗原に対する抗血清は、それぞれ対応する抗原に対して １：１０，０００、 １：１００，０００ 、 １：１０，０００及び１：１０，０００の力価を示した。
ＩｇＧの精製が必要な場合には、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−セファロースカラムなどに通塔した。
【００２１】
実施例２． モノクローナル抗体
（１） 免 疫
配列番号： １ に示されるアミノ酸配列の第３２５〜３４２からなる部分ペプチド「 ｈＳＲ Ｉ−２」をペプチド合成機（アプライド バイオシステムズ社／モデル４３０Ａ） を用いて常法に従い合成した。この部分ペプチドをＭＢＳを用いて、常法に従ってサイログロブリンとコンジュゲートして抗原とし、この１００μｇ をフロイントの完全アジュバントとともに６週齢のＢＡＬＢ／ｃ 雄マウスに皮下投与した。３週間後に前記抗原１０μｇ を前記アジュバントとともに腹腔内に投与した。
【００２２】
（２） 細胞融合
第２回目の免疫から３日後に、マウスの脾臓を摘出し、脾細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。この脾細胞 １×１０^８ 個を ３×１０^７ 個の８−アザグアニン耐性骨髄細胞腫 Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０） とポリエチレングリコール （平均分子量；４０００ダルトン） を用いて融合した。細胞は９６穴マイクロプレート５枚に分配した。２４時間後に、上清の半分をＨＡＴ培地で置き換え、さらに１週間後には上清をＨＡＴ培地で置き換えた。２〜３週間後にはＨＡＴ耐性細胞（ハイブリドーマ）が増殖するのが観察された。
【００２３】
（３） ハイブリドーマの選択及びモノクローン化
マイクロプレート中の培養上清１０μｌ を ｈＳＲ Ｉ−２部分ペプチドをコートしたマイクロプレートに入れ、室温で１時間放置後、ＰＢＳで４回洗浄した。そこへ１０００倍に希釈したペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体を加え、１時間室温で反応させた。次いで３回の洗浄後、ｏ−フェニレンジアミンを加えて発色させ、その発色度を測定して、 ｈＳＲ Ｉ−２と強く反応する抗体を分泌するハイブリドーマを選択した。モノクローン化はこの選択したハイブリドーマをフィーダー細胞にマウス胸腺或いは脾細胞を用い、限界希釈法に２度かけることによって行った。
【００２４】
（４） 抗 ｈＳＲ Ｉ−２抗体の製造
（４）−１． ｉｎ ｖｉｔｒｏ法
上記（３） で得られたハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ） を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、その培養上清より常法にしたがって回収した。
（４）−２． ｉｎ ｖｉｖｏ 法
２， ６， １０， １４−テトラメチルペンタデカンをマウス腹腔内に投与し、その４日後に、上記（３） で得たハイブリドーマ ５×１０^６ 個を腹腔内に投与した。投与後４〜１０日で、高濃度の抗体を有する腹水が得られた。この腹水からの抗体の回収は硫酸アンモニウム塩析法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム法、プロテインＡ−セファロースカラム法のごとき常法により行うことが出来る。
【００２５】
実施例３． 抗ｈＳＲ抗体の特異性
ヒト剖検例および手術時に得られた大動脈の粥状硬化病変部について、免疫組織学的検索を以下のとおり行った。
ヒト大動脈を過ヨウ素酸−リジン−パラホルムアルデヒド固定し、ＯＣＴ（Ｍｉｌｅｓ， Ｅｌｋｈａｒｔ， ＩＮ） で包埋した。次いでドライアイス−アセトンで凍結し、６μｍ の凍結切片とした。切片を正常ウサギ血清、ＥＢＭ１１（抗ヒトマクロファージモノクローナル抗体、Ｄａｋｏｐａｔｔｓ， Ｎｏ．Ｍ７１８ Ｄｅｎｍａｒｋ） 或いは抗ｈＳＲ Ｉ−２抗体（ＩｇＧ 、ポリクローナル抗体）とそれぞれ室温で１時間反応させた。
【００２６】
この後、ペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ又は同じく抗ウサギＩｇＧを２次抗体として用い、それぞれ室温で１時間反応させた後、３， ３′−ジアミノキシベンチジン四塩酸塩で発色させ、ヘマトキシリンで核を染色した。なお、脂質はオイルレッドＯを用いて染色した。
この結果、粥状硬化病変部の内膜に抗ｈＳＲ Ｉ−２抗体陽性細胞が認められた（図１−Ｄ）。この抗ｈＳＲ Ｉ−２抗体陽性細胞は、ＥＢＭ１１ 陽性細胞であるとともに（図１−Ｃ）、脂質の蓄積を伴っていることが明らかとなり（図１−Ｂ）、当該細胞がマクロファージの性質を示すことを認めた。このスカベンジャーレセプター陽性細胞の存在は、用いた粥状硬化病変部組織８検体全てに認められた。
【００２７】
抗ｈＳＲ Ｉ−２抗体は動脈硬化病変部のマクロファージのみならず、肝のクッパー細胞、肺胞マクロファージ等とも陽性の反応を示した。抗ｈＳＲ Ｉ−２抗体陽性細胞は、マクロファージ／モノサイト特異的抗体である ＥＢＭ１１陽性細胞と一致することから、マクロファージ系の細胞のみを認識していることが証明された。
【００２８】
実施例４． 抗ヒトスカベンジャーレセプター （ｈＳＲ） 抗体を用いた細胞内のヒトスカベンジャーレセプター （ｈＳＲ） の局在の観察
ヒト肺胞マクロファージについて、抗ｈＳＲ抗体を用いてｈＳＲの細胞内局在を、免疫電子顕微鏡法により観察した。
先ず、肺胞洗浄法により採取したヒト肺胞マクロファージをプラスチックシャーレ（３５ｍｍ） 内で無血清の培養液 （ＲＰＭＩ１６４０／日水製薬製）を用いて１時間培養した後、２％過ヨウ素酸−リジン−パラホルムアルデヒドで１時間固定し、さらに ０．１％グルタールアルデヒドで１０分間固定した。
【００２９】
次いで、実施例１において作製した抗ｈＳＲ Ｉ−１抗体、抗ｈＳＲ Ｉ−２抗体、抗ｈＳＲ Ｉ−３抗体及び抗ｈＳＲ ＩＩ−１抗体をそれぞれ一次抗体として用い、また、二次抗体としてペルオキシダーゼをコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ〔Ｆ（ａｂ’）_２〕（Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）を用い、それぞれ室温で１時間反応させた後、３， ３′−ジアミノキシベンチジン四塩酸塩で発色させた。そしてオスミウム酸で再固定し、アルコール系列で脱水し、そのままエポン樹脂をシャーレに流し込んで電子顕微鏡用標本とした。
【００３０】
超薄切片作製後は、無染色のまま電子顕微鏡（ＪＥＯＬ２０００ＥＸ／日本電子製）で観察した。また、一次抗体を抗ｈＳＲ抗体の代わりに正常ウサギＩｇＧとしたものをＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌとして同様に処理し、電子顕微鏡で観察した。この結果、抗ｈＳＲ Ｉ−１抗体、抗ｈＳＲ Ｉ−２抗体、抗ｈＳＲ Ｉ−３抗体及び抗ｈＳＲ ＩＩ−１抗体を用いたものは、それぞれ図２のＢ、図２のＣ、図２のＤ及び図２のＥに順次示す如く、全てのヒトマクロファージ細胞膜に反応が認められ、一部についてはエンドソームの膜にも発現の局在が観察されたが、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌには観察されながった（図２のＡ）。
【００３１】
なお、好中球の細胞表面にはスカベンジャーレセプター（ｈＳＲ） が存在しないことを、抗ｈＳＲ Ｉ−１抗体を一次抗体として用いたと同様の方法により行い、図２のＦに示す如きＮｅｇａｔｉｖｅの結果から確認した。
抗ｈＳＲ Ｉ−３抗体は、ｈＳＲタイプＩのシステインリッチなＣ末端ペプチド特異的抗体であり、抗ｈＳＲ ＩＩ−１抗体はｈＳＲタイプＩＩのＣ末端ペプチド特異的抗体であることから、マクロファージにはｈＳＲタイプＩとタイプＩＩの双方が発現していることが明らかとなった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の抗ｈＳＲ抗体は、マクロファージ特異性の極めて高いものであり、これを用いてマクロファージの同定や定量などに利用することができる。すなわち、本抗体を病理・組織学的検討に用いることによって、動脈硬化の進展の程度を検索することが可能となる他、マクロファージの出現を特徴とする病態の解析に用いることができる。例えば、スカベンジャーレセプターは、脳への発現も知られており、脳における蓄積性疾患の解析に利用し得る。
【００３３】
また、本発明の抗ｈＳＲ抗体は、抗体アフィニティーを用いた蛋白精製のために用いることができ、ｈＳＲの精製および分析に用いることができる。
本発明の抗ｈＳＲ抗体は、ｈＳＲのリガンド結合部位に対する抗体であり、リガンドの結合に影響を与えることができる。この特徴を利用することによって、スカベンジャーレセプターを介するコレステロール蓄積の抑制に用いることができる。
【００３４】
【配列表】

【００３５】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の抗体がマクロファージに特異的に結合することを示す、生物の形態を表す図面に代わる写真である。
【図２】図２は、本発明の抗体を用いてヒトスカベンジャーレセプターの細胞内局在を免疫電子顕微鏡法により観察した結果を示し、生物の形態を示す図面に代わる写真である。

Claims (11)

1. 配列番号：１に示すアミノ酸配列中のアミノ酸位置第401〜419のアミノ酸配列に特異的に結合する、ヒトスカベンジャー受容体Ｉ型に対する抗体。
2. 配列番号：２に示すアミノ酸配列中のアミノ酸位置第342〜358のアミノ酸配列に特異的に結合する、ヒトスカベンジャー受容体II型に対する抗体。
3. ポリクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
4. モノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
5. 請求項３に記載のポリクローナル抗体の製造方法において、
   下記ペプチド（ａ）又は（ｂ）のいずれか：
   （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸位置401〜419から成るアミノ酸配列を有するペプチド、
   （ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸位置342〜358から成るアミノ酸配列を有するペプチド、
   を抗原として用いてヒト以外の哺乳動物を免疫した後その動物の血液中より抗体を単離することを特徴とする方法。
6. 請求項４に記載のモノクローナル抗体の製造方法において、
   下記ペプチド（ａ）又は（ｂ）のいずれか：
   （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸位置401〜419から成るアミノ酸配列を有するペプチド、
   （ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸位置342〜358から成るアミノ酸配列を有するペプチド、
   を抗原として用いて免疫した哺乳動物の脾細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞ラインとからの細胞融合によって形成されたハイブリドーマを培養し、その培養上清より抗体を単離することを特徴とする方法。
7. 請求項１又は２に記載の抗体と摘出されたヒト組織とを反応せしめることを特徴とするヒト諸組織におけるマクロファージの同定およびそれらの分布を検索する方法。
8. 請求項２に記載の抗体を用いることを特徴とするによる、ヒトスカベンジャー受容体の同定方法。
9. 請求項１に記載の抗体、及び請求項２に記載の抗体を用いることを特徴とするによる、ヒトスカベンジャー受容体の同定方法。
10. 請求項２に記載の抗体を含んで成る、ヒトスカベンジャー受容体の同定キット。
11. 請求項１に記載の抗体、及び請求項２に記載の抗体をを含んで成る、ヒトスカベンジャー受容体の同定キット。

Images