ES2298267T3 - Nuevo marcador asociado a tumores. - Google Patents

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ES2298267T3 ES01973176T ES01973176T ES2298267T3 ES 2298267 T3 ES2298267 T3 ES 2298267T3 ES 01973176 T ES01973176 T ES 01973176T ES 01973176 T ES01973176 T ES 01973176T ES 2298267 T3 ES2298267 T3 ES 2298267T3
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Robert Canfield
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Abstract

El anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599).

Description

Nuevo marcador asociado a tumores.
A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones por autor y fecha. Pueden encontrarse citas para estas publicaciones presentadas alfabéticamente al final de la memoria descriptiva e inmediatamente antes de las reivindicaciones. Las descripciones de estas publicaciones en su totalidad describen el estado de la técnica.
Antecedentes de la invención
El descubrimiento seminal por Kohler y Milstein (Kohler, G. y Milstein, C, 1975) de "hibridomas" de ratón capaces de secretar anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos contra antígenos predefinidos marcó el comienzo de una nueva era en la inmunología experimental. Se salvaron muchos problemas asociados con los antisueros. La selección clonal y la inmortalidad de las líneas celulares de hibridoma aseguraba la monoclonalidad y la disponibilidad permanente de productos de anticuerpo. Sin embargo, a nivel clínico, el uso de estos anticuerpos está claramente limitado por el hecho de que son proteínas extrañas y actúan como antígenos en seres humanos.
Desde el informe de Kohler y Milstein (Kohler, G. y Milstein, C, 1975), la producción de anticuerpos monoclonales de ratón se ha convertido en una rutina. Sin embargo, la aplicación de anticuerpos monoclonales xenogénicos para diagnósticos in vivo y terapia a menudo está asociada con efectos indeseables tales como una respuesta de inmunoglobulina humana anti-ratón. Además, los anticuerpos monoclonales tienen un gran potencial como herramientas para formar imágenes. Además, el tratamiento terapéutico ha motivado la búsqueda de medios para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (humAbs) (Levy, R., y Miller RA., 1983). Sin embargo, el progreso en esta área se ha visto obstaculizado por la ausencia de mielomas humanos adecuados como compañeros de fusión con características similares a las de las células de mieloma de ratón (Posner MR, et al., 1983). El uso del virus Epstein-Barr (EBV) ha resultado ser bastante eficaz para la inmortalización de linfocitos humanos (Kozbor D, y Roder J., 1981; Casual O, 1986), pero tiene ciertas limitaciones tales como un bajo porcentaje de secreción de anticuerpos, una clonogenicidad deficiente de líneas secretoras de anticuerpo e inestabilidad cromosómica que requiere una subclonación frecuente. Las líneas celulares linfoblastoides humanas indiferenciadas parecen ser más atractivas. A diferencia de lo que ocurre con las células de mieloma diferenciadas, estas líneas celulares se adaptan fácilmente a las condiciones de cultivo, aunque aún no se han resuelto los problemas de bajo rendimiento y de secreción inestable (Glassy MC, 1983; Ollson L, et al., 1983). Los mejores compañeros de fusión posibles son células de mieloma singénicas con una maquinaria de síntesis de proteínas bien desarrollada (Nilsson K. y Ponten J., 1975). Sin embargo, debido a las dificultades de cultivo, pocas líneas se han acondicionado para el crecimiento in vitro y la capacidad de producir híbridos viables (Goldman-Leikin RE, 1989). Los mielomas existentes tienen bajo rendimiento de fusión y un lento crecimiento de híbridos, aunque la producción de anticuerpos monoclonales es relativamente estable (Brodin T, 1983). La inestabilidad genética es un inconveniente importante de los híbridos interespecie. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se usa un mieloma de ratón como compañero de inmortalización. La producción de híbridos de células humanas-de ratón no es difícil, y estas células tienen características de crecimiento in vitro similares a las de los hibridomas convencionales de ratón-ratón (Teng NNH, 1983). Sin embargo, la eliminación espontánea de cromosomas humanos reduce considerablemente la probabilidad de secreción de mAb estables (Weiss MC, y Green H., 1967). Para mejorar las características de crecimiento y la estabilidad de la producción de anticuerpos monoclonales humanos, se usan como compañeros de fusión heterohíbridos entre células de mieloma de ratón y linfocitos humanos (Oestberg L, y Pursch E., 1983) así como heteromielomas (Kozbor D, et. al., 1984).
El documento W099/4792 describe la producción de anticuerpos monoclonales contra, por ejemplo, cánceres, antígenos asociados a enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes por medio del aislamiento de linfocitos de ganglios linfáticos (o de sangre periférica) y su inmortalización por su fusión con compañeros de fusión de hibridoma humano MFP-2, dando como resultado tetromas productores de anticuerpo.
El documento EP1006184 describe proteínas de interacción con receptores IGF-1 de mamífero (IIP), así como anticuerpos contra estos IIP.
No se entiende bien el papel de la inmunidad humoral en el cáncer. Numerosos datos demuestran la presencia de anticuerpos antitumorales con especificidad de tumor en pacientes con cáncer. Estos anticuerpos pueden participar en posibles respuestas antitumorales protectoras que pueden eliminar las células tumorales por medio de cualquiera de varios mecanismos fisiológicos. Los anticuerpos antitumorales creados en el laboratorio por inmunización de animales que tienen tejidos malignos ofrecen una gran promesa en el diagnóstico y formación de imágenes, pero tiene inconvenientes graves en la aplicación clínica porque estos anticuerpos por sí mismos pueden provocar fuertes reacciones inmunes y carecen de funciones biológicas importantes. Hasta hace muy poco, no se disponía de anticuerpos completamente humanos dirigidos a antígenos asociados con tumores porque las líneas de las células compañeras de fusión humanas necesarias para construir hibridomas humanos capaces de crear anticuerpos humanos en grandes cantidades no eran adecuadas.
La idea general de desarrollar anticuerpos monoclonales completamente humanos usando linfocitos B directamente a partir de pacientes con cáncer se describió hace algunos años. Sin embargo, esta idea sólo pudo ponerse en práctica hace poco, cuando se desarrolló la línea celular compañera de fusión apropiada. Ahora es posible capturar linfocitos B específicos productores de estos anticuerpos y mantenerlos en cultivo, recogiendo los anticuerpos de interés.
La presente invención comprende una línea celular compañera de fusión única que se fusiona con linfocitos humanos procedentes de ganglios linfáticos, bazo, amígdalas o sangre periférica. La línea celular permite la inmortalización de células B con especificidad de cáncer por medio de la técnica de hibridoma. Los híbridos resultantes han resultado ser productores estables de sustancias inmunes humanas denominadas inmunoglobulinas y representan una fuente fiable de anticuerpos humanos para inmunoterapia. Usando una línea celular compañera de fusión patentada, que se denominó MFP-2, se establecieron algunos hibridomas productores de anticuerpos humanos con especificidad por cáncer humano de mama y de próstata, y de esta manera se crearon varios anticuerpos monoclonales con inmunorreactividad específica hacia cánceres humanos de mama y de próstata. Estos anticuerpos reaccionaban tanto con las líneas celulares de cánceres humanos como con tejidos tumorales primarios. Estos anticuerpos completamente humanos tienen especificidad por líneas de células cancerosas humanas así como por tejidos cancerosos humanos. Se identificaron dianas antigénicas para algunos de estos anticuerpos. También se desarrolló un sistema de fusión de hibridoma que permite capturar linfocitos humanos de ganglio linfático o de sangre periférica que secreten anticuerpos específicos contra antígenos de cánceres. Estos anticuerpos completamente humanos pueden usarse para ayudar a identificar nuevos antígenos asociados a tumores, o pueden emplearse para el tratamiento de diagnóstico in vivo e inmunoterapéutico de cánceres.
Las posibles ventajas de los anticuerpos monoclonales humanos incluyen la posibilidad de identificar la diana molecular del anticuerpo. Esta diana podría resultar ser una molécula realmente nueva o una molécula conocida cuya asociación con el cáncer es nueva de por sí. Hace algunos años, los científicos del Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer crearon el método SEREX, que permite la identificación de nuevos antígenos asociados a tumores a través de los anticuerpos espontáneos presentes en la sangre de los pacientes con cáncer. Su tarea se centró específicamente en la identificación de nuevos marcadores tumorales. La presente invención se centró inicialmente en el desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos capaces de diferenciar un tejido canceroso de un tejido normal. La identidad de la diana molecular era secundaria para esta misión.
En la presente invención, se identificaron dianas moleculares para algunos de los anticuerpos y se demostró que eran específicas sólo para las células cancerosas. Una de las dianas que aparecía era la proteína que contenía el dominio PDZ localizada tanto en el citosol como en la membrana celular de células de cáncer de mama humano. Esta proteína, denominada GIPC o TIP-2 (clon 2 de la proteína de interacción con Tax) está implicada en el tráfico de vesículas y en la formación de redes de proteínas. Tiene varias propiedades, tales como la capacidad de unirse a la proteína de interacción con RGS-Ga, dominio C, la unión al oncogén tax de HTLV-1 y la unión tanto a la a-actinina como al transportador 1 de glucosa. El papel fisiológico preciso de esta proteína no se conoce, aunque presenta una sobreexpresión consistente en células de cáncer de mama, con una expresión insignificante, si presenta alguna, en células de cáncer de próstata y no presenta expresión en fibroblastos humanos. Aunque esta proteína se describió previamente (2), no se conocía su asociación con el cáncer. Tampoco se sabía que se produjera una respuesta de anticuerpos espontánea a este marcador en pacientes con cáncer de mama.
Una ventaja de la presente invención es que el establecimiento de la asociación de TIP-2 con la transformación maligna permite la aplicación de este antígeno/proteína como un marcador de diagnóstico, tanto in vitro como in vivo, para un análisis inmunohistopatológico así como para el ensayo inmunoquímico. Esta proteína puede encontrarse en la circulación en pacientes con cáncer. Esta proteína también podría servir como diana molecular para fines terapéuticos dada su expresión específica en tumores primarios. Esta proteína también puede usarse como un marcador de tumores soluble para el diagnóstico de cánceres, la progresión de cánceres y el seguimiento del tratamiento de cánceres en pacientes con cáncer de mama y pacientes con cáncer de próstata. Como esta proteína se expresa en la superficie de células cancerosas, puede usarse como diana para la liberación dirigida por anticuerpos específicos de liposomas cargados con fármacos, o fármacos conjugados con anticuerpos, profármacos, toxinas o inhibidores del crecimiento celular. Una vez demostrada la relevancia de TIP-2 para la supervivencia celular, este nuevo marcador puede considerarse un candidato para el desarrollo de vacunas para la inmunoterapia de cánceres.
Pueden usarse anticuerpos contra TIP-2 obtenidos a partir de linfocitos de pacientes con cáncer de mama como vector para el diagnóstico (para formar imágenes) in vivo e inmunoterapia (por ejemplo, para la administración de liposomas cargados de fármaco, o conjugados radioinmunes o inmunotóxicos al sitio del tumor). Los anticuerpos monoclonales totalmente humanos contra TIP-2 pueden usarse y se usarán para aislar cantidades preparativas de TIP-2 a partir de células de cáncer de mama o tumores primarios y para crear anticuerpos de ratón de alta afinidad para el objetivo de diagnóstico y uso terapéutico, y se ha demostrado su valor biológico. La presente invención también proporciona una base para el posible desarrollo de inmunoensayos específicos o un kit inmunohistoquímico para la detección y medición de este nuevo marcador tumoral.
Una ventaja de la presente invención es que pueden usarse anticuerpos humanos dirigidos a TIP-2 como herramienta inmunoabsorbente para el aislamiento y caracterización adicional de la estructura química de esta proteína (composición de aminoácidos, secuencia de proteínas, modificación).
Otra ventaja de la presente invención es un inmunoabsorbente preparado basándose en anticuerpos monoclonales humanos anti-TIP-2 que permite el aislamiento de este antígeno y su uso para el desarrollo de anticuerpos monoclonales de ratón de alta afinidad y especificidad que pueden usarse para crear mejores herramientas para el inmunoensayo de TIP-2.
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Otra ventaja de la presente invención es que, conociendo la secuencia de ADN para TIP-2 y su asociación con el cáncer, se hace posible investigar diferentes tejidos, normales y cancerosos, para la expresión de este marcador.
Otra ventaja de la presente invención es que, como se dispone de anticuerpos monoclonales humanos contra TIP-2 y hay una gran posibilidad de crear anticuerpos no humanos que sean incluso más eficaces para ciertos fines de diagnóstico y terapéuticos, es muy probable que TIP-2 pueda usarse como diana potencial para inmunoterapia y para diagnóstico (por medio de la formación de imágenes) in vivo.
Otra ventaja de esto es que como TIP-2 se identificó por medio de anticuerpos creados de manera natural en pacientes con cáncer de mama, su existencia confirma la hipótesis de que este antígeno puede ser inmunogénico en seres humanos y, por lo tanto, puede considerarse un candidato de partida para el desarrollo de una vacuna contra el cáncer.
Compendio de la invención
Se describe una célula de heteromieloma que no produce ningún anticuerpo y es capaz de producir una célula de trioma que no produce ningún anticuerpo cuando se fusiona con una célula linfoide humana; donde la célula de trioma producida de esta manera puede producir una célula de tetroma que produce un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión específica por un antígeno cuando se fusiona con una segunda célula linfoide humana y dicha segunda célula linfoide humana produce un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica por el antígeno, con la condición de que la célula de heteromieloma no es B6B11 (número de acceso de la ATCC HB-12481).
También se describe una célula de trioma que no produce ningún anticuerpo obtenida por fusión de una célula de heteromieloma con una célula linfoide humana.
También se describe una célula de tetroma capaz de producir un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión específica por un antígeno, obtenida por fusión de la célula de trioma descrita anteriormente que no produce ningún anticuerpo con una célula linfoide humana capaz de producir un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica por el antígeno.
La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal producido por el tetroma descrito anteriormente.
También se describe un método para generar la célula de trioma descrita anteriormente, que comprende: (a) fusionar una célula de heteromieloma que no produce ningún anticuerpo con una célula linfoide humana con lo que se forman células de trioma; (b) incubar las células de trioma formadas en la etapa (a) en condiciones permisivas para la producción de anticuerpos por las células de trioma; y (c) seleccionar una célula de trioma que no produzca ningún anticuerpo.
Además, se describe un método para generar células de tetroma, que comprende: (a) fusionar la célula de trioma descrita con una célula linfoide humana, con lo que se forman células de tetroma; (b) incubar las células de tetroma formadas en la etapa (a) en condiciones permisivas para la producción de anticuerpos por las células de tetroma; y (c) seleccionar una célula de tetroma capaz de producir un anticuerpo monoclonal.
También se describe un método para producir un anticuerpo monoclonal, que comprende (a) fusionar una célula linfoide capaz de producir un anticuerpo con la célula de trioma descrita anteriormente, con lo que se forman células de tetroma; (b) incubar la célula de tetroma formada en la etapa (a) en condiciones permisivas para la producción de anticuerpos por las células de tetroma; (c) seleccionar una célula de tetroma capaz de producir el anticuerpo monoclonal; y (d) cultivar la célula de tetroma de la etapa (c) para producir el anticuerpo monoclonal.
También se describe un método para producir un anticuerpo monoclonal específico para un antígeno asociado con una afección dada en un sujeto, que comprende: (a) fusionar una célula linfoide capaz de producir anticuerpos con la célula de trioma descrita anteriormente, con lo que se forman células de tetroma; (b) incubar la célula de tetroma formada en la etapa (a) en condiciones permisivas para la producción de anticuerpos por las células de tetroma; (c) seleccionar una célula de tetroma productora de un anticuerpo monoclonal; (d) poner en contacto el anticuerpo monoclonal de la etapa (c) con (1) una muestra de un sujeto con la afección dada o (2) una muestra de un sujeto sin la afección dada, para formar un complejo entre el anticuerpo monoclonal y la muestra; (e) detectar cualquier complejo formado entre el anticuerpo monoclonal y la muestra; (f) determinar la cantidad de complejo formado en la etapa (e); y (g) comparar la cantidad de complejo determinada en la etapa (f) para la muestra del sujeto con la afección dada con la cantidad determinada en la etapa (f) para la muestra del sujeto sin la afección dada, indicando una mayor cantidad de formación de complejo para la muestra del sujeto con la afección dada que se ha producido un anticuerpo monoclonal específico para un antígeno específico para la afección.
Además, se describe un método para identificar un antígeno asociado con una afección dada en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto el anticuerpo monoclonal producido por el método descrito anteriormente con la muestra, en condiciones permisivas para la formación de un complejo entre el anticuerpo monoclonal y la muestra; (b) detectar cualquier complejo formado en la etapa (a); y (c) aislar cualquier complejo detectado en la etapa (b), para identificar de esta manera el antígeno asociado con la afección en la muestra.
La presente invención proporciona además un método para diagnosticar una afección dada en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo monoclonal producido por el método descrito anteriormente en condiciones permisivas para la formación de un complejo entre el anticuerpo monoclonal y la muestra; y (b) detectar la formación de cualquier complejo formado entre el anticuerpo monoclonal y la muestra, indicando la detección del complejo formado de esta manera la presencia de un antígeno específico para la afección dada en la muestra, y proporcionando de esta manera un diagnóstico de la afección dada en el sujeto.
La presente invención describe además una composición que comprende un anticuerpo monoclonal descrito por el método descrito en este documento y un vehículo adecuado.
Además, la presente invención también describe una composición terapéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal de esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Además, la presente invención también describe un método para el tratamiento de una afección dada en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la composición terapéutica descrita anteriormente eficaz para tratar la afección en el sujeto.
La presente invención también describe un método para la prevención de una afección dada en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la composición terapéutica descrita anteriormente eficaz para prevenir la afección en el sujeto.
La presente invención proporciona el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-1599.
La presente invención proporciona una célula de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de esta invención.
La presente invención describe una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal de esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención describe una vacuna que comprende el anticuerpo monoclonal de esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-1598.
La presente invención proporciona una célula de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de esta invención.
La presente invención describe una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal de esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención describe una vacuna que comprende el anticuerpo monoclonal de esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona un método in vitro para detectar células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, o un fragmento Fab de un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, donde dicho epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma denominado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599), estando marcado dicho anticuerpo o fragmento Fab de manera detectable, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno que comprende el anticuerpo o fragmento Fab marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células de la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo marcado/fragmento Fab no unido en el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno formado en la etapa (a); y (c) determinar la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno por medio de la detección del marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
La presente invención proporciona un método in vitro para detectar células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, o un fragmento Fab de un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, donde dicho epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma denominado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599), reconociéndose dicho anticuerpo por el anticuerpo o fragmento Fab en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno que comprende el anticuerpo o fragmento Fab marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células de la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab no unido en el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno formado en la etapa (a); (c) poner en contacto el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno de la etapa (b) con un segundo anticuerpo que se une específicamente al complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno, estando marcado de manera detectable dicho segundo anticuerpo, en condiciones apropiadas para permitir que el segundo anticuerpo marcado se una al complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno; (d) retirar cualquier segundo anticuerpo marcado no unido en el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno producido en (c); y (e) determinar la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno unido al segundo anticuerpo marcado por medio de la detección del marcador del segundo anticuerpo, indicando la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno células cancerosas humanas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
La presente invención proporciona un método in vitro para detectar el antígeno TIP-2 en la superficie de células cancerosas en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo en el antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma denominado PTA-1598, estando marcado de manera detectable dicho anticuerpo o fragmento Fab del mismo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 presente en la superficie de células de la muestra; b) retirar cualquier anticuerpo marcado/fragmento Fab no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y (c) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 por medio de la detección del marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 células cancerosas humanas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
La presente invención proporciona un método in vitro para detectar el antígeno TIP-2 en la superficie de células cancerosas en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma denominado PTA-1598 o un fragmento Fab del mismo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células de la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo o fragmento Fab del mismo no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); (c) poner en contacto el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 de la etapa (b) con un segundo anticuerpo que se une específicamente al complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2, uniéndose dicho segundo anticuerpo de manera detectable, en condiciones apropiadas para permitir que el segundo anticuerpo marcado se una al complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2; (d) retirar cualquier segundo anticuerpo marcado no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 producido en (c); y (e) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 unido al segundo anticuerpo marcado por medio de la detección del marcador del segundo anticuerpo, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 células cancerosas humanas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
La presente invención proporciona un método in vitro para detectar el antígeno TIP-2 en la superficie de células cancerosas en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo en el antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma denominado PTA-1599 o un fragmento Fab del mismo, pudiendo marcarse de manera detectable dicho anticuerpo o fragmento Fab del mismo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo marcado no unido en el complejo de anticuerpo 27.B1-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y (c) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 por medio de la detección del marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 células cancerosas humanas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
La presente invención proporciona un método in vitro para detectar el antígeno TIP-2 en la superficie de células cancerosas en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo en el antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado PTA-1599, o un fragmento Fab del mismo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.B1/Fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab del mismo no unido en el complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); (c) poner en contacto el complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 de la etapa (b) con un segundo anticuerpo que se une específicamente al complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2, estando dicho segundo anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones adecuadas para permitir que dicho segundo anticuerpo se una al complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2; (d) retirar cualquier segundo anticuerpo marcado no unido en el complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 producido en (c); y (e) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 unido al segundo anticuerpo marcado por medio de la detección del marcador del segundo anticuerpo, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 células cancerosas humanas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
La presente invención proporciona un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto por medio de la detección de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende: (a) poner en contacto una muestra de sangre periférica obtenida a partir del sujeto con un anticuerpo dirigido a un epítopo en el antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma denominado PTA-1598 o un fragmento Fab del mismo, pudiendo marcarse de manera detectable dicho anticuerpo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo marcado/fragmento Fab no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y (c) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 por medio de la detección del marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 un diagnóstico de cáncer en el sujeto.
La presente invención proporciona un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto por medio de la detección de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende: (a) poner en contacto una muestra de sangre periférica obtenida a partir del sujeto con un anticuerpo dirigido a un epítopo en el antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598, o un fragmento Fab del mismo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.F7/Fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); (c) poner en contacto el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 de la etapa (b) con un segundo anticuerpo que se une específicamente al complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2, uniéndose dicho segundo anticuerpo de manera detectable, en condiciones apropiadas para permitir que el segundo anticuerpo marcado se una al complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2; (d) retirar cualquier segundo anticuerpo marcado no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 producido en (c); y (e) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 unido al segundo anticuerpo marcado por medio de la detección del marcador del segundo anticuerpo, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 un diagnóstico de cáncer en el sujeto.
La presente invención proporciona un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto por medio de la detección de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende: (a) poner en contacto una muestra de sangre periférica obtenida a partir del sujeto con un anticuerpo dirigido a un epítopo en el antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma denominado PTA-1599, pudiendo marcarse de manera detectable dicho anticuerpo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo marcado/fragmento Fab del mismo no unido en el complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y (c) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 por medio de la detección del marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 un diagnóstico de cáncer en el sujeto.
La presente invención proporciona un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto por medio de la detección de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende: (a) poner en contacto una muestra de sangre periférica obtenida a partir del sujeto con un anticuerpo dirigido a un epítopo en el antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1/fragmento Fab producido por el hibridoma designado PTA-1599, o un fragmento Fab del mismo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.B1/Fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab del mismo no unido en el complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); (c) poner en contacto el complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 de la etapa (b) con un segundo anticuerpo que se une específicamente al complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2, estando dicho segundo anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones adecuadas para permitir que dicho segundo anticuerpo se una al complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2; (d) retirar cualquier segundo anticuerpo marcado no unido al complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 producido en (c); y (e) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 unido al segundo anticuerpo marcado por medio de la detección del marcador del segundo anticuerpo, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 un diagnóstico de cáncer en el sujeto.
La presente invención proporciona un método in vivo para detectar células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en un sujeto, que comprende determinar la presencia de un anticuerpo 27.F7 o 27.B1 marcado de manera detectable administrado previamente unido a la superficie de células en el sujeto, estando dirigido dicho anticuerpo a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 o por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1.
La presente invención proporciona el uso de un liposoma que lleva un conjugado de material exógeno, donde un anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599) o el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) se acoplan a la superficie externa del liposoma para la preparación de un medicamento para tratar cánceres por medio de la administración dirigida del material exógeno a células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en el sujeto humano descrito, como un método para tratar cánceres en un sujeto humano provocando una respuesta inmune específica, que comprende administrar al sujeto una proteína antigénica TIP-2 entera o un fragmento peptídico de TIP-2 al sujeto.
Se describe un método para tratar cánceres en un sujeto humano por medio de la inducción de la apoptosis de células cancerosas, que comprende administrar al sujeto una proteína antigénica TIP-2 entera o un fragmento peptídico de TIP-2.
Se describe un método para tratar cánceres en un sujeto humano provocando una respuesta inmune específica, que comprende: (a) retirar células dendríticas de dicho sujeto; (b) poner en contacto las células dendríticas de la etapa (a) con una proteína antigénica TIP-2 entera o un fragmento peptídico de TIP-2; y (c) reintroducir las células dendríticas de la etapa (b) en dicho sujeto.
Se describe un método para tratar cánceres en un sujeto humano por medio de la inducción de la apoptosis de células cancerosas, que comprende administrar al sujeto una proteína antigénica TIP-2 entera o un fragmento peptídico de TIP-2.
La presente invención proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal 27.F7 o un anticuerpo monoclonal 27.B1 o un fragmento peptídico de los mismos dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cánceres en un sujeto humano por inmunización pasiva. Se proporciona un péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos Lys Leu Leu Gly Gly Gln Ile Gly Leu.
Se describe un péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos Ser Leu Leu Gly Cys Arg His Tyr Glu Val.
La presente invención describe un método para la investigación inmunohistoquímica de una sección tisular de una muestra de tumor para determinar la presencia de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende: (a) poner en contacto la sección tisular de la muestra de tumor con un anticuerpo marcado de manera detectable dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598, pudiendo marcarse de manera detectable dicho anticuerpo/fragmento Fab, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la sección tisular; (b) retirar cualquier anticuerpo marcado/fragmento Fab no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y (b) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 por medio de la detección del marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 células cancerosas humanas que llevan antígeno TIP-2 en la muestra.
La presente invención proporciona un kit para detectar la presencia de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en una muestra, que comprende: (a) un soporte sólido que tiene una pluralidad de sondas unidas covalentemente que pueden ser iguales o diferentes, comprendiendo cada sonda un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, donde el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599); y (b) una forma de determinar la presencia del complejo de anticuerpo monoclonal/fragmento Fab-antígeno TIP-2.
La presente invención proporciona un método para detectar la presencia del antígeno TIP-2 en un fluido biológico, que comprende: (a) poner en contacto una muestra del fluido biológico con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598, pudiendo marcarse de manera detectable dicho anticuerpo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la muestra; (c) retirar cualquier anticuerpo marcado no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y (d) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 por medio de la detección del marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 la existencia del antígeno TIP-2 en el fluido biológico.
La presente invención proporciona un método para detectar la presencia del antígeno TIP-2 en un fluido biológico, que comprende: (a) poner en contacto una muestra del fluido biológico con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado PTA-1599, estando dicho anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.B1/Fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la muestra; (c) retirar cualquier anticuerpo marcado no unido en el complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y (d) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 por medio de la detección del marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 la existencia del antígeno TIP-2 en el fluido biológico.
La presente invención proporciona un método para la investigación inmunohistoquímica de secciones tisulares de una muestra de tumor para determinar la presencia de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende: (a) poner en contacto la sección tisular de la muestra de tumor con un anticuerpo marcado de manera detectable/fragmento Fab dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado PTA-1599, estando dicho anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para unir el anticuerpo al antígeno TIP-2 en la superficie de cualquier célula de la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo marcado no unido a las células de la muestra; y (c) determinar la presencia de anticuerpo 27.B1 unido a las células en la muestra, indicando la presencia del anticuerpo 27.B1 unido a las células la existencia de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra de tumor.
La presente invención describe un método para controlar la progresión de cánceres, donde las células cancerosas son células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, en un sujeto, que comprende: (a) administrar a un sujeto al que se le ha diagnosticado cáncer un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598, estando dicho anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para unir el anticuerpo contra el antígeno TIP-2 a la superficie de cualquier célula del sujeto; (b) determinar la presencia del anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a la superficie de las células en el sujeto de acuerdo con el método descrito anteriormente de detección del antígeno TIP-2 en la superficie de células cancerosas presentes en una muestra; (c) comparar la presencia del anticuerpo marcado de manera detectable/fragmento Fab 27.F7 unido a las células en la etapa (b) con la presencia del anticuerpo 27.F7 marcado de manera detectable unido a las células en (i) el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, donde una presencia de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células mayor en la etapa (b) que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, indica progresión del cáncer en el sujeto y una presencia de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células menor en la etapa (b) que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento indica la regresión del cáncer en el sujeto.
La presente invención describe un método para controlar la progresión de cánceres, donde las células cancerosas son células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, en un sujeto, que comprende: (a) administrar a un sujeto al que se le ha diagnosticado cáncer un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado PTA-1599, estando dicho anticuerpo/fragmento Fab marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para unir el anticuerpo contra el antígeno TIP-2 a la superficie de cualquier célula del sujeto; (b) determinar la presencia del anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a la superficie de células en el sujeto de acuerdo con el método descrito anteriormente para detectar el antígeno TIP-2 en la superficie de células cancerosas presentes en una muestra; (c) comparar la presencia del anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) con la presencia del anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en (i) el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, donde una presencia de anticuerpo 27.B1 unido de manera detectable/fragmento Fab unido a las células mayor en la etapa (b) que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, indica progresión del cáncer en el sujeto y una presencia de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células menor en la etapa (b) que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento indica regresión del cáncer en el sujeto.
La presente invención describe un método para controlar la progresión de cánceres, donde las células cancerosas son células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, en un sujeto, que comprende: (a) administrar a un sujeto al que se le ha diagnosticado un cáncer un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598, estando dicho anticuerpo/fragmento Fab marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para unir el anticuerpo contra el antígeno TIP-2 a la superficie de cualquier célula del sujeto; (b) determinar la cantidad de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a la superficie de células en el sujeto de acuerdo con el método descrito anteriormente para detectar el antígeno TIP-2 en la superficie de células cancerosas presentes en una muestra; (c) comparar la cantidad de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) con la presencia del anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en (i) el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, donde una cantidad de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células mayor en la etapa (b) que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, indica progresión del cáncer en el sujeto y una cantidad de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células menor en la etapa (b) que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento indica la regresión del cáncer en el sujeto.
La presente invención describe un método para controlar la progresión de cánceres, donde las células cancerosas son células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, en un sujeto, que comprende: (a) administrar a un sujeto al que se le ha diagnosticado cáncer un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado PTA-1599, estando dicho anticuerpo/fragmento Fab marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para unir el anticuerpo contra el antígeno TIP-2 a la superficie de cualquier célula del sujeto; (b) determinar la cantidad de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a la superficie de las células del sujeto de acuerdo con el método descrito anteriormente de PTA-1599; (c) comparar la cantidad de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) con la presencia del anticuerpo 27.B1 marcado de manera detectable unido a las células en (i) el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, donde una cantidad de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células mayor en la etapa (b) que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, indica progresión del cáncer en el sujeto y una cantidad de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células menor en la etapa (b) que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento indica regresión del cáncer en el sujeto.
Se describe un método para diagnosticar cáncer asociado con la expresión del antígeno TIP-2 en un sujeto humano, que comprende: (a) obtener ARNm a partir de una muestra de sangre periférica del sujeto; (b) preparar ADNc a partir del ARNm de la etapa (a); (c) amplificar el ADN que codifica el antígeno TIP-2 presente en el ADNc preparado en la etapa (b) por medio de una reacción en cadena de la polimerasa utilizando al menos dos cebadores oligonucleotídicos, donde cada uno de los cebadores hibrida de manera específica con ADN que codifica el antígeno TIP-2; y (d) detectar la presencia de cualquier ADN amplificado resultante, siendo la presencia de dicho ADN amplificado diagnóstica para el cáncer asociado con la expresión del antígeno TIP-2.
Se describe un método para diagnosticar cáncer asociado con la expresión del antígeno TIP-2 en un sujeto humano, que comprende: (a) obtener ARNm a partir de una muestra de sangre periférica del sujeto; (b) preparar ADNc a partir del ARNm de la etapa (a); (c) amplificar el ADN que codifica el antígeno TIP-2 presente en el ADNc preparado en la etapa (b) por medio de una reacción en cadena de la polimerasa utilizando al menos dos cebadores oligonucleotídicos, donde cada uno de los cebadores hibrida de manera específica con ADN que codifica el antígeno TIP-2; y (d) determinar la cantidad de cualquier ADN amplificado resultante; y (e) comparar la cantidad de ADN amplificado determinada en la etapa (d) con cantidades estándar determinadas previamente de ADN amplificado, siendo indicativa cada cantidad estándar de un estadio particular de cáncer asociado con la expresión del antígeno TIP-2.
La presente invención describe además una vacuna que comprende un anticuerpo monoclonal producido por el método descrito en este documento y un vehículo adecuado.
La presente invención también describe una vacuna que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal de esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención describe además un método para tratar una afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la vacuna descrita anteriormente eficaz para unir el antígeno asociado con la afección, tratándose de esta manera la afección en el sujeto.
Finalmente, la presente invención describe un método para prevenir una afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la vacuna descrita anteriormente eficaz para unir el antígeno asociado con la afección, con lo que se previene la afección en el sujeto.
Breve descripción de las figuras
Figuras 1A-1C Distribución de células de acuerdo con el número de cromosomas. El eje X indica la cantidad de cromosomas. El eje Y indica el porcentaje de células con el número apropiado de cromosomas. Los datos representan las medias basadas en el análisis de más de 50 placas de metafase para cada línea: P3.X63.Ag8.653 Fig. 1A, RPMI 8226 Fig. 1B, B6B11 Fig. 1C.
Figura 2 Fragmento de cariotipo de bandas G de la línea B6B11. Las flechas indican material genético supuestamente de origen humano; parte 3p del cromosoma 3 y del cromosoma 19.
Figura 3 Eficacia de fusión de B6B11 con esplenocitos recién aislados y cultivados. Se aislaron SPL en LSM, inmediatamente después de fusionar una parte de las células con células B6B11 y los SPL restantes se cultivaron in vitro durante 7-9 días en RPMI-C que contenía FCS al 15% en presencia de ConA, LPS, PHA, PWM o sin mitógenos, y después estas células también se fusionaron con B6B11. PWM en la concentración de 5 \mug/ml influyó eficazmente en la eficacia de fusión.
Figuras 4A-4D Histogramas de ADN de células 653 (Fig. 4A) y 8226 (Fig. 4B), heteromieloma B6B11 (Fig. 4C) e híbridos de B6B11-esplenocito (Fig. 4D). La cantidad de ADN de B6B11 constituye aproximadamente 100% de la cantidad total de ADN de 653 más ADN de 8226. El contenido de ADN del híbrido B6B11-SPL es mayor que el de B6B11.
Figuras 5A-5B Producción de inmunoglobulina por hibridomas (tetromas) derivados de la fusión de PBL con MFP-2. La figura 5A muestra los resultados de fusionar suspensiones recientes de linfocitos con MFP-2. La figura 5B muestra los resultados de fusionar suspensiones de linfocitos congeladas/descongeladas con MFP-2. Los rectángulos oscuros indican la producción de IgM. Los rectángulos grises indican la producción de IgG. El eje Y indica la densidad óptica a A_{490} para diferentes muestras de hibridoma (tetromas) generadas a partir de la fusión con la línea de trioma MFP-2 (eje X). La línea discontinua indica la densidad óptica a A_{490} para una dilución 1:500 de anticuerpo IgM. La línea discontinua indica la densidad óptica a A_{490} para una dilución 1:500 de anticuerpo IgG.
Figura 6 Producción de anticuerpo anti-tiroglobulina por linfocitos de ganglio linfático de cáncer de tiroides fusionados con células MFP-2 como compañeros de fusión. El eje Y indica la densidad óptica a A_{405} (DO_{405}) para diferentes muestras de hibridoma (tetromas) generadas a partir de la fusión con la línea de trioma MFP-2 (eje X). Treinta y tres tetromas produjeron anticuerpos que reaccionaron positivamente contra la tiroglobulina; ocho presentaron una reactividad particularmente alta.
Figura 7 Análisis de citometría de flujo de células fijadas y vivas tratadas con fhMAb anti-TIP-2. Verde = control; rojo = células tratadas con anticuerpos.
Figura 8 Análisis de transferencia de Western de cristalizados de cáncer de mama y de próstata con respecto a la presencia de TIP-2. Como control negativo se usaron dos líneas celulares de fibroblastos humanos no transformadas. Como marcador se usaron los anticuerpos monoclonales humanos anti-TIP-2 27.B1 y 27.F7. A cada línea se le aplicaron 7 mg de proteína de lisado celular total. En células de cáncer de mama puede observarse la fuerte expresión de TIP-2.
Figura 9 Tinción con inmunofluorescencia de células humanas fijadas con formalina con anticuerpos monoclonales humanos anti-TIP-2 27.B1 y 27.F7. Las barras de tamaño representan 20 mm. En esta y en otras figuras con tinción de inmunofluorescencia, el rojo es una tinción de contraste con yoduro de propidio de los núcleos celulares y el verde es la tinción con el anticuerpo marcado con FITC. Se realizó microscopía confocal para las células de cáncer de mama SK-BR-3.
Figura 10 Tinción de inmunofluorescencia de tejidos de mama humana normales y cancerosos usando anticuerpo monoclonal humano anti-TIP-2 27.B1. Panel superior - diferentes casos de adenocarcinoma ductal invasivo; panel inferior - tejido de mama normal. Las barras de tamaño representan 20 mm.
Figura 11 Tinción de inmunofluorescencia de tejidos de próstata humana usando anticuerpo monoclonal humano anti-TIP-2 27.B1. Panel superior - diferentes casos de adenocarcinoma de próstata; panel inferior - hipertrofia prostática benigna como control negativo. Las barras de tamaño representan 20 mm.
Figura 12 Igual que la Fig. 4, pero con fhMAb 27.F7.
Figura 13 Igual que la Fig. 5, pero con fhMAb 27.F7.
Figura 14 Tinción de inmunofluorescencia de ganglios linfáticos con extensión metastásica de cáncer de mama. En este experimento se usaron anticuerpos monoclonales anti-TIP-2 27.B1 y 27.F7. Las barras de tamaño representan 20 mm.
Figura 15 Secciones fijadas con formalina y congeladas recientemente de adenocarcinoma de mama usando dos anticuerpos anti-TIP-2 27.B1 y 27.F7. Las barras de tamaño representan 20 mm.
Figura 16 Tinción de inmunofluorescencia de carcinoma intraductal de mama masculino y seminoma usando fhMAb 27.B1 y 27.F7. Las barras de tamaño representan 20 mm.
Figura 17 Tinción de inmunofluorescencia de cáncer de mama y otros tejidos cancerosos y normales usando fhMAbs 27.F7 y 27.B1. Las barras de tamaño representan 20 mm.
Figura 18 Vista esquemática del sistema de señalización de proteína G
Figura 19 Reguladores del sistema de señalización G y proteínas que contienen el dominio PDZ.
Figura 20 Principio de la tecnología SEREX.
Figura 21 Inmunización de ratones contra TIP-2 usando inmunoprecipitación con anticuerpo anti-TIP-2 humano y transferencia de Western.
Figura 22 Inmunorreactividad de antisuero anti-TIP-2 policlonal de ratón con TIP-2 de un lisado de células SK-BR-3. Como control positivo se usó el anticuerpo humano 27.F7.
Figura 23 Tinción inmunohistoquímica de adenocarcinoma de mama usando suero inmune de ratón inmunizado con TIP-2. Las barras de tamaño representan 20 mm.
Figura 24 Análisis de K_{a} para el anticuerpo anti-TIP-2 27.F7 y cálculo del número de copias de TIP-2 presente en células SK-BR-3.
Figura 25 Expresión de TIP-2 en epitelio de mama normal y canceroso.
Figura 26 Acoplamiento de anticuerpo anti-TIP-2 27.F7 a liposomas.
Figura 27 Precipitación con alcohol de TIP-2 procedente de suero de sangre humana con adiciones conocidas de lisado de células SK-BR-3.
Figura 28 La liberación del antígeno TIP-2 en medio de cultivo celular de células SK-BR-3 tratadas con diferente concentración de taxol. Las líneas son las siguientes (de izquierda a derecha): 1) lisado de células SK-BR-3 preparado a partir de aproximadamente 70.000 células; 2) calle vacía; 3) taxol, 88 \muM añadido a una placa de tejidos de 35 mm que contenía aproximadamente 250.000 células; 4) igual con taxol, 44 \muM; 5) igual con taxol, 22 \muM; 7) igual con taxol, 11 \muM; 8) igual con taxol, 5,5 \muM; 9) lisado celular preparado a partir de células que no se trataron con taxol; 10) lisado preparado a partir de los restos residuales de células muertas después del tratamiento con taxol, 88 \muM.
Figura 29 La secuencia de aminoácidos de la proteína GIPC/TIP-2. En cursiva, la secuencia de aminoácidos de TIP-2 sólo. Están subrayados dos péptidos identificados como agentes de unión de alto HLA-*A0201 (cálculo teórico).
Figura 30 La secuencia de ARNm de GIPC. La parte de la secuencia correspondiente a TIP-2' está subrayada.
Figuras 31A-1-A-4 Antígenos proteicos identificados por anticuerpos monoclonales humanos naturales creados a partir de células B de pacientes con cáncer de mama y de próstata.
Figuras 32A-F Secuencia de ARNm humano para el gen KIAA0338, cds parcial.
Figuras 33A-D Secuencia de ARNm de alfa-actinina no muscular humana, cds completo - la segunda isoforma de alfa-actinina no muscular denominada ACTN4 (actinina-4).
Figuras 34A-C Actinina de Homo sapiens, secuencia de ARNm de alfa 4 (ACTN4).
Figura 35A-C Secuencia de ARNm de la proteína de ensamblaje a la cubierta de clatrina AP50.
Figura 36A-C Secuencia de ARNm de la proteína de unión C-terminal a GLUT1 de Homo sapiens (GLLTTLCBP).
Figura 37 Secuencia de proteína GAM asociada a gp130.
Figura 38 Potenciador amino-terminal de secuencia de ARNm de split (AES) de Homo sapiens.
Figura 39A-B Antiquitina 1 (antiquitina = homólogo de proteína de turgor 26g), secuencia de ARNm.
Figura 40 Subunidad de 41 kD de complejo proteico ARP2/3 (P41 -ARC), secuencia de ARNm.
Figura 41a Secuencia de ARNm de seb4D de H. sapiens.
Figura 41b Secuencia de ARNm de seb4B de H. sapiens.
Figura 42A-C Secuencia de ARNm de lamina A/C (LMNA) de Homo sapiens.
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Descripción detallada de la invención
Se describe una célula de heteromieloma que no produce ningún anticuerpo y que puede producir una célula de trioma que no produce ningún anticuerpo cuando se fusiona con una célula linfoide humana; donde la célula de trioma producida de esta manera puede producir una célula de tetroma que produce un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión específica por un antígeno cuando se fusiona con una segunda célula linfoide humana y dicha segunda célula linfoide humana produce un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica por el antígeno, con la condición de que la célula de heteromieloma no es B6B11 (número de acceso de la ATCC HB-12481).
También se describe una célula de trioma que no produce ningún anticuerpo obtenido por fusión de una célula de heteromieloma con una célula linfoide humana. En una realización de esta invención, la célula de heteromieloma es la célula designada B6B11 (número de acceso de la ATCC HB-12481). En otra realización, el trioma es una célula de tipo B6B11. Para los fines de esta invención, una célula de tipo B6B11 incluye una célula que es sustancialmente idéntica a la célula B6B11 a nivel genético y funcionalmente equivalente a la misma. De esta manera, las células de tipo B6B11 incluyen específicamente clones u otras células derivadas de B6B11 incluyendo mutantes de B6B11 y de clones de la misma. En ciertas realizaciones de esta invención, la célula linfoide humana es una célula de mieloma. En otras realizaciones de esta invención, la célula linfoide humana es un esplenocito o una célula de ganglio linfático (linfocito). De acuerdo con ciertas realizaciones de esta invención, la célula de trioma es la célula denominada MFP-2 (número de acceso de la ATCC 12482).
También se describe una célula de tetroma capaz de producir un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión específica por un antígeno, obtenida por fusión de la célula de trioma descrita anteriormente que no produce ningún anticuerpo con una célula linfoide humana capaz de producir un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica por el antígeno. La célula linfoide humana puede ser un linfocito de sangre periférica, un esplenocito, una célula de ganglio linfático, una célula B, una célula T, un linfocito de amígdala, un monocito, un macrófago, una célula eritroblastoide o una célula de placa de Peyer. En una realización de esta invención, la célula de trioma es la célula designada MFP-2 (número de acceso de la ATCC HB-12482).
De acuerdo con ciertas realizaciones, el antígeno es un antígeno asociado a un tumor, un antígeno con especificidad de célula, un antígeno con especificidad de tejido, una enzima, un ácido nucleico, una inmunoglobulina, una toxina, un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno eucariota. En una realización, el antígeno es un antígeno de mamífero, de insecto, fúngico, de E. coli o de Klebsiella.
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La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal producido por el tetroma descrito anteriormente. La presente invención también describe un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo monoclonal producido por el tetroma descrito. El ácido nucleico puede incluir, pero sin limitación ADN, ARN, ADNc, análogos de oligonucleótidos, vectores, vectores de expresión o sondas. Además, la presente invención contempla la expresión del ácido nucleico que codifica el anticuerpo monoclonal introducido en una célula hospedadora capaz de expresar el anticuerpo monoclonal o partes del mismo.
La presente invención también describe ácidos nucleicos aislados incluyendo todo o parte de las regiones de unión de anticuerpo de dichos anticuerpos monoclonales y el uso de dicho ácido nucleico para expresar partes de dichos anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monocatenarios per se o anticuerpos monocatenarios de presentación por fagos (anticuerpo sFv-a).
Además, pueden usarse ácidos nucleicos que codifican todo o parte de dichos ácidos nucleicos para transfectar células de mamífero tales como células de mieloma de ratón o células CHO para aumentar la producción de dicho anticuerpo monoclonal o parte del mismo.
También se describe un método para generar la célula de trioma descrita anteriormente, que comprende: (a) fusionar una célula de heteromieloma que no produce ningún anticuerpo con una célula linfoide humana con lo que se forman células de trioma; (b) incubar las células de trioma formadas en la etapa (a) en condiciones permisivas para la producción de anticuerpos por las células de trioma; y (c) seleccionar una célula de trioma que no produzca ningún anticuerpo.
De acuerdo con una realización, la célula de heteromieloma de la etapa (a) se denomina B6B11 (número de acceso de la ATCC HB-12481). De acuerdo con otras realizaciones, la célula linfoide humana es un linfocito de ganglio linfático o un esplenocito. De acuerdo con ciertas realizaciones, el método comprende además seleccionar una célula de trioma capaz de crecer en medio sin suero. Otras realizaciones comprenden seleccionar una célula de trioma que puede fusionarse con un linfocito de sangre periférica o linfocito de ganglio linfático. También se proporciona una célula de trioma generada por el método descrito anteriormente.
Además, se describe un método para generar una célula de tetroma, que comprende: (a) fusionar la célula de trioma descrita anteriormente con una célula linfoide humana, con lo que se forman células de tetroma; (b) incubar la célula de tetroma formada en la etapa (a) en condiciones permisivas para la producción de anticuerpos por las células de tetroma; y (c) seleccionar una célula de tetroma capaz de producir un anticuerpo monoclonal. De acuerdo con una realización, la célula de trioma de la etapa (a) se denomina MFP-2 (número de acceso de la ATCC HB-12482). De acuerdo con una realización, la célula linfoide humana es un linfocito de sangre periférica, un esplenocito, una célula de ganglio linfático, una célula B, una célula T, un linfocito de amígdala, un monocito, un macrófago, una célula eritroblastoide o una célula de placa de Peyer. En algunas realizaciones, la célula linfoide humana produce anticuerpos que tienen afinidad de unión específica por un antígeno y la célula de tetroma produce un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión específica por dicho antígeno. De acuerdo con ciertas realizaciones, el antígeno es un antígeno asociado a tumores, un antígeno con especificidad de célula, un antígeno con especificidad de tejido, una enzima, un ácido nucleico, una inmunoglobulina, una toxina, un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno eucariota. En algunas realizaciones, el antígeno es un antígeno de mamífero, de insecto, de E. coli o de Klebsiella. También se proporciona una célula de tetroma generada por el método descrito anteriormente.
También se describe el heteromieloma B6B11 de la línea celular compañera de fusión de hibridoma humano y el trioma MFP-2 de la línea celular compañera de fusión de hibridoma humano. Estas líneas celulares de hibridoma se depositaron el 17 de marzo de 1998 en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.S. según las estipulaciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento Internacional de Depósitos de Microorganismos con Propósitos de Procedimientos de Patente. Estos hibridomas se han acordado con los nº de Acceso de la ATCC HB-12481 y HB-12482 respectivamente.
También se describe un método para producir un anticuerpo monoclonal que comprende (a) fusionar una célula linfoide capaz de producir un anticuerpo con la célula de trioma descrita, con lo que se forma una célula de tetroma; y (b) incubar la célula de tetroma formada en la etapa (a) en condiciones que permitan la producción de anticuerpos por la célula de tetroma para producir de esta manera el anticuerpo monoclonal.
También se describe un método para producir un anticuerpo monoclonal específico para un antígeno asociado con una afección dada en un sujeto, que comprende: (a) fusionar una célula linfoide capaz de producir un anticuerpo con la célula de trioma descrita anteriormente, con lo que se forman células de tetroma; (b) incubar la célula de tetroma formada en la etapa (a) en condiciones permisivas para la producción de anticuerpos por las células de tetroma; (c) seleccionar una célula de tetroma productora de un anticuerpo monoclonal; (d) poner en contacto el anticuerpo monoclonal de la etapa (c) con (1) una muestra de un sujeto con la afección dada o (2) una muestra de un sujeto sin la afección dada en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo monoclonal y la muestra; (e) detectar el complejo formado entre el anticuerpo monoclonal y la muestra; (f) determinar la cantidad de complejo formado en la etapa (e); y (g) comparar la cantidad de complejo determinada en la etapa (f) para la muestra del sujeto con la afección con una cantidad determinada en la etapa (f) para la muestra del sujeto sin la afección, indicando una mayor cantidad de formación de complejo para la muestra del sujeto con la afección que se ha producido un anticuerpo monoclonal específico para el antígeno específico para la afección.
En una realización, la etapa (a) comprende además congelar la célula linfoide. De acuerdo con una realización, la etapa (c) comprende además incubar la célula de tetroma seleccionada en condiciones que permitan la replicación celular. De acuerdo con ciertas realizaciones, la replicación de tetroma se realiza in vitro o in vivo. De acuerdo con una realización, la célula de trioma es la célula denominada MFP-2 (nº de Acceso de la ATCC HB-12482). La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal específico para un antígeno asociado con una afección, identificado por el método descrito. La presente invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo monoclonal descrito. El ácido nucleico puede incluir, pero sin limitación ADN, ARN, ADNc, análogos de oligonucleótidos, vectores, vectores de expresión o sondas. Además, la presente invención contempla la expresión del ácido nucleico que codifica el anticuerpo monoclonal introducido en una célula hospedadora capaz de expresar el anticuerpo monoclonal o partes del mismo.
La presente invención también describe ácidos nucleicos aislados incluyendo todo o parte de las regiones de unión de anticuerpo de dichos anticuerpos monoclonales y el uso de dicho ácido nucleico para expresar partes de dichos anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monocatenarios per se o anticuerpos monocatenarios de presentación por fagos (anticuerpo sFv-a).
Además, pueden usarse ácidos nucleicos que codifican todo o una parte de dichos ácidos nucleicos para transfectar células de mamífero tales como células de mieloma de ratón o células CHO para aumentar la producción de dicho anticuerpo monoclonal o parte del mismo.
De acuerdo con una realización de esta invención, la afección dada está asociada con un cáncer, un tumor, una toxina, un agente infeccioso, una disfunción enzimática, una disfunción hormonal, una enfermedad autoinmune, una disfunción autoinmune, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno eucariota, rechazo de un tejido trasplantado, envenenamiento o intoxicación con veneno. Además, la afección puede ser cualquier otra anomalía, incluyendo la producida por una infección, cáncer, disfunción autoinmune, enfermedad cardiovascular o trasplante. En una realización de esta invención, la afección dada es septicemia, sepsis, choque séptico, viremia, bacteremia o fungemia. En ciertas realizaciones de esta invención, el cáncer puede ser, pero sin limitación, cáncer de pulmón, cáncer hepático, leucemia, linfoma, neuroblastoma, glioma, meningioma, cáncer óseo, cáncer de tiroides, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de mama o cáncer de próstata. De acuerdo con ciertas realizaciones de esta invención, el agente infeccioso puede ser, pero sin limitación, el virus Hanta, HTLV I, HTLV II, VIH, virus del herpes, virus de la gripe, virus Ébola, papilomavirus humano, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, bacilo del ántrax o criptococo. De acuerdo con ciertas realizaciones de esta invención, la toxina es la toxina tetánica, del ántrax, botulínica, veneno de serpiente o veneno de araña. En una realización de esta invención, el tumor es benigno. En otra realización, la disfunción enzimática es una hiperactividad o sobreproducción de la enzima. En otra realización, la disfunción hormonal es una hiperactividad o sobreproducción de la hormona. En otras realizaciones de esta invención, la disfunción inmune está mediada por CD3 o CD4. En otras realizaciones de esta invención, la enfermedad autoinmune es lupus, tiroidosis, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplantes o artritis reumatoide. En otras realizaciones de la invención, la afección es cualquier anomalía. En otras realizaciones, la afección es la situación normal.
Además, se describe un método para identificar un antígeno asociado con una afección dada en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto el anticuerpo monoclonal producido por el método descrito anteriormente con la muestra en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo monoclonal y la muestra; (b) detectar cualquier complejo formado en la etapa (a); y (c) aislar el complejo detectado en la etapa (b), identificando de esta manera el antígeno asociado con la afección en la muestra.
En una realización del método descrito anteriormente, la afección es un tumor.
En otra realización del método identificado anteriormente, el antígeno no se conocía previamente.
También se describe un antígeno tumoral identificado por el método descrito anteriormente, donde el antígeno no se conocía previamente.
También se proporciona un método para diagnosticar un tumor en una muestra, que comprende detectar la presencia del antígeno tumoral identificado por el método descrito anteriormente donde la afección es un tumor, indicando la presencia de dicho antígeno la presencia de un tumor en el sujeto.
Esta invención proporciona el método descrito anteriormente, donde la detección comprende: (a) obtener una muestra apropiada que contiene el antígeno tumoral a partir del sujeto; (b) poner en contacto la muestra con un anticuerpo que puede unirse específicamente al antígeno tumoral en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y el antígeno; y (c) detectar el complejo formado, detectando de esta manera la presencia del antígeno tumoral.
En ciertas realizaciones de esta invención, el método comprende además separar el anticuerpo monoclonal del complejo de anticuerpo monoclonal-antígeno. En algunas realizaciones, la separación es por fraccionamiento por tamaño, por ejemplo, la fraccionamiento por tamaño realizada por electroforesis en gel de poliacrilamida o en gel de agarosa.
De acuerdo con ciertas realizaciones de esta invención, la afección dada está asociada con un cáncer, un tumor, una toxina, un agente infeccioso, una disfunción enzimática, una disfunción hormonal, una enfermedad autoinmune, una disfunción inmune, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno eucariota, rechazo de un tejido trasplantado, envenenamiento o intoxicación con veneno. Además, la afección puede ser cualquier otra anomalía, incluyendo una resultante de una infección, cáncer, disfunción autoinmune, enfermedad cardiovascular o trasplante. En una realización de esta invención, la afección es septicemia, sepsis, choque séptico, viremia, bacteremia o fungemia. En algunas realizaciones de esta invención, el cáncer puede ser, pero sin limitación, cáncer de pulmón, cáncer hepático, leucemia, linfoma, neuroblastoma, glioma, meningioma, cáncer óseo, cáncer de tiroides, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de mama o cáncer de próstata. De acuerdo con algunas realizaciones de esta invención, el agente infeccioso puede ser, pero sin limitación, virus Hanta, HTLV I, HTLV II, VIH, virus del herpes, virus de la gripe, virus Ébola, papilomavirus humano, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, bacilo del ántrax o criptococo. De acuerdo con algunas realizaciones de esta invención, la toxina es la toxina tetánica, del ántrax, botulínica, veneno de serpiente o veneno de araña. En una realización de esta invención, el tumor es benigno. En otras realizaciones, la disfunción enzimática es una hiperactividad o sobreproducción de la enzima. En otras realizaciones, la disfunción hormonal es una hiperactividad o sobreproducción de la hormona. En otras realizaciones de esta invención, la disfunción inmune está mediada por CD3 o CD4. En otras realizaciones de esta invención, la enfermedad autoinmune es lupus, tiroidosis, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplantes o artritis reumatoide. En otras realizaciones de la invención, la afección es cualquier anomalía. En otras realizaciones, la afección es la situación normal.
La presente invención además proporciona un método para diagnosticar una afección en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo monoclonal producido por el método descrito anteriormente en condiciones permisivas para la formación de un complejo entre el anticuerpo monoclonal y la muestra; y (b) detectar la formación de cualquier complejo formado entre el anticuerpo monoclonal y la muestra, indicando la detección positiva de dicho complejo la presencia de un antígeno específico para la afección en la muestra que se correlaciona con el diagnóstico de la afección en el sujeto.
De acuerdo con una realización de esta invención, el anticuerpo monoclonal se acopla a un marcador detectable. En una realización de esta invención, el marcador detectable es un radiomarcador, un fluoróforo o molécula fluorescente, una enzima, un ligando, un marcador colorimétrico o una perla magnética.
De acuerdo con algunas realizaciones de esta invención, la afección dada es o está asociada con un cáncer, un tumor, una toxina, un agente infeccioso, una disfunción enzimática, una disfunción hormonal, una enfermedad autoinmune, una disfunción inmune, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno eucariota, rechazo de un tejido trasplantado, envenenamiento o intoxicación con veneno. Además, la afección puede ser cualquier otra anomalía, incluyendo la resultante de una infección, cáncer, disfunción autoinmune, enfermedad cardiovascular o trasplante. En ciertas realizaciones de esta invención, la afección es septicemia, sepsis, choque séptico, viremia, bacteremia o fungemia. En algunas realizaciones de esta invención, el cáncer puede ser, pero sin limitación, cáncer de pulmón, cáncer hepático, leucemia, linfoma, neuroblastoma, glioma, meningioma, cáncer óseo, cáncer de tiroides, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de mama o cáncer de próstata. De acuerdo con otras realizaciones de esta invención, el agente infeccioso puede ser, pero sin limitación, virus Hanta, HTLV I, HTLV II, VIH, virus del herpes, virus de la gripe, virus Ébola, papilomavirus humano, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, bacilo del ántrax o criptococo. De acuerdo con algunas realizaciones de esta invención, la toxina es la toxina tetánica, del ántrax, botulínica, de veneno de serpiente o de veneno de araña. En una realización de esta invención, el tumor es benigno. En otras realizaciones, la disfunción enzimática es una hiperactividad o sobreproducción de la enzima. En otras realizaciones, la disfunción hormonal es una hiperactividad o sobreproducción de la hormona. En otras realizaciones de esta invención, la disfunción inmune está mediada por CD3 o CD4. En otras realizaciones de esta invención, la enfermedad autoinmune es lupus, tiroidosis, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplantes o artritis reumatoide. En otras realiza-
ciones de la invención, la afección es cualquier anomalía. En otras realizaciones, la afección es la situación normal.
La presente invención describe además una composición que comprende un anticuerpo monoclonal producido por el método descrito en este documento y un vehículo adecuado.
Además, la presente invención también describe una composición terapéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal de esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con ciertas realizaciones de esta invención, la afección es cáncer y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para inhibir el crecimiento o eliminar el cáncer. De acuerdo con ciertas realizaciones, la afección es una infección y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para inhibir el crecimiento o destruir el agente infeccioso. De acuerdo con ciertas realizaciones de esta invención, la afección está asociada con una toxina y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para reducir la cantidad o destruir la toxina. En otras realizaciones, la afección es una enfermedad autoinmune y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para reducir la cantidad o destruir el anticuerpo dañino o una o más subunidades del mismo. En otras realizaciones, la afección es una enfermedad cardiovascular y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para reducir la afección. En otras realizaciones, la afección es un rechazo de trasplantes, y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para reducir la afección.
De acuerdo con ciertas realizaciones de esta invención, el anticuerpo monoclonal está acoplado a un compuesto efector. En ciertas realizaciones de esta invención, el compuesto efector es un agente citotóxico, fármaco, enzima, colorante o radioisótopo. En ciertas realizaciones de esta invención, el anticuerpo monoclonal está acoplado a un vehículo. De acuerdo con otras realizaciones de esta invención, el vehículo es un liposoma.
Además, la presente invención también describe un método para el tratamiento de una afección dada en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la composición terapéutica descrita anteriormente eficaz para tratar la afección en el sujeto. De acuerdo con una realización de esta invención, la composición terapéutica se administra a un segundo sujeto.
De acuerdo con una realización de esta invención, la afección dada es o está asociada con un cáncer, un tumor, una toxina, un agente infeccioso, una disfunción enzimática, una disfunción hormonal, una enfermedad autoinmune, una disfunción inmune, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno eucariota, rechazo de un tejido trasplantado, envenenamiento o intoxicación con veneno. Además, la afección puede ser cualquier otra anomalía, incluyendo la resultante de una infección, cáncer, disfunción autoinmune, enfermedad cardiovascular o trasplante. En una realización de esta invención, la afección dada es septicemia, sepsis, choque séptico, viremia, bacteremia o fungemia. En ciertas realizaciones de esta invención, el cáncer puede ser, pero sin limitación, cáncer de pulmón, cáncer hepático, leucemia, linfoma, neuroblastoma, glioma, meningioma, cáncer óseo, cáncer de tiroides, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de mama o cáncer de próstata. De acuerdo con una realización de esta invención, el agente infeccioso puede ser, pero sin limitación virus Hanta, HTLV I, HTLV II, VIH, virus del herpes, virus de la gripe, virus Ébola, papilomavirus humano, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, bacilo del ántrax o criptococo. De acuerdo con ciertas realizaciones de esta invención, la toxina es la toxina tetánica, del ántrax, botulínica, veneno de serpiente o veneno de araña. En una realización de esta invención, el tumor es benigno. En otra realización, la disfunción enzimática es una hiperactividad o sobreproducción de la enzima. En otra realización más, la disfunción hormonal es una hiperactividad o sobreproducción de la hormona. En otras realizaciones de esta invención, la disfunción inmune está mediada por CD3 o CD4. En otras realizaciones de esta invención, la enfermedad autoinmune es lupus, tiroidosis, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplantes o artritis reumatoide. En otras realizaciones de la invención, la afección es cualquier anomalía. En otras realizaciones, la afección es la situación normal.
Finalmente, la presente invención describe un método para prevenir una afección dada en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la composición terapéutica descrita anteriormente eficaz para prevenir la afección en el sujeto. En una realización de esta invención, el sujeto previamente presentaba la afección. De acuerdo con una realización de esta invención, la composición terapéutica se administra a un segundo sujeto.
De acuerdo con ciertas realizaciones de esta invención, la afección es o está asociada con un cáncer, un tumor, una toxina, un agente infeccioso, una disfunción enzimática, una disfunción hormonal, una enfermedad autoinmune, una disfunción inmune, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno eucariota, rechazo de un tejido trasplantado, envenenamiento o intoxicación con veneno. Además, la afección puede ser cualquier otra anomalía, incluyendo una debida a infección, cáncer, disfunción autoinmune, enfermedad cardiovascular o trasplante. En ciertas realizaciones de esta invención, la afección es septicemia, sepsis, choque séptico, viremia, bacteremia o fungemia. En algunas realizaciones de esta invención, el cáncer puede ser, pero sin limitación, cáncer de pulmón, cáncer hepático, leucemia, linfoma, neuroblastoma, glioma, meningioma, cáncer óseo, cáncer de tiroides, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de mama o cáncer de próstata. De acuerdo con una realización de esta invención, el agente infeccioso puede ser, pero sin limitación, virus Hanta, HTLV I, HTLV II, VIH, virus del herpes, virus de la gripe, virus Ébola, papilomavirus humano, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, bacilo del ántrax o criptococo. De acuerdo con algunas realizaciones de esta invención, la toxina es la toxina tetánica, del ántrax, botulínica, de veneno de serpiente o de veneno de araña. En una realización de esta invención, el tumor es benigno. En otras realizaciones, la disfunción enzimática es una hiperactividad o sobreproducción de la enzima. En otras realizaciones, la disfunción hormonal es una hiperactividad o sobreproducción de la hormona. En otras realizaciones de esta invención, la disfunción inmune está mediada por CD3 o CD4. En otras realizaciones de esta invención, la enfermedad autoinmune es lupus, tiroidosis, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplantes o artritis reumatoide. En otras realizaciones de la invención, la afección es cualquier anomalía. En otras realizaciones, la afección es la situación normal.
También se describe la producción de anticuerpos para antígenos que no están asociados con una afección dada, sino que constituyen de manera más apropiada un componente del repertorio entero de anticuerpos en el sistema inmune de un ser humano.
Además se describe la identificación de nuevos antígenos relevantes para una afección dada en un sujeto y el uso de los mismos para el diagnóstico y tratamiento de la afección dada en el sujeto. También se proporciona la identificación del repertorio de anticuerpos naturales en sujetos normales y sujetos que tienen una patología. En una realización, la afección puede ser destoxificación (neutralización) de veneno. Por ejemplo, la afección puede ser el resultado de mordeduras o exposición al veneno de escorpión, araña, serpiente cascabel o sapo venenoso. Se proporcionan anticuerpos para actuar como antídoto para estas afecciones.
La célula de trioma también puede fusionarse con macrófagos, monocitos, linfocitos T y células eritroblastoides. Las células de hibridoma resultantes de estas fusiones pueden producir factores del crecimiento, citoquinas, enzimas y hemoglobina.
Como se usa en este documento, un hibridoma humano-murino (el "hibridoma de inmortalización") es una línea celular inmortal que resulta de la fusión de un mieloma murino u otra célula tumoral murina con una célula linfoide humana derivada de un sujeto normal. Como se describe más adelante en este documento, por medio de una selección cuidadosa y mutación, puede obtenerse un hibridoma de inmortalización que proporcione mejor estabilidad cromosómica, tenga características humanas, y que no secrete inmunoglobulina. La capacidad de secreción de anticuerpos de dicho trioma resultante puede proporcionarse por la tercera fusión celular que típicamente se obtiene a partir de células B de un individuo humano inmunizado, o con células B que se han inmortalizado.
Como se usa en este documento, una célula "B6B11" es una célula híbrida producida por la fusión del mieloma de ratón 653 y el mieloma humano RPMI 8226.
Como se usa en este documento, una célula "de tipo B6B11" es una célula híbrida producida por la fusión de una célula relacionada con el mieloma de ratón 653 y una célula relacionada con el mieloma humano RPMI 8226.
Como se usa en este documento, una célula "MFP" es una célula híbrida producida por la fusión de una célula B6B11 y un linfocito humano. Las células de tipo B6B11 comparten propiedades y características funcionales con células de heteromieloma B6B11.
Como se usa en este documento, una célula "de tipo MFP" es una célula híbrida producida por la fusión de una célula de tipo B6B11 y un linfocito humano. Las células de tipo MFP comparten propiedades y características funcionales con células de trioma MFP.
Como se usa en este documento, hibridoma "sin secreción" o "sin producción" se refiere a un hibridoma que puede reproducirse de manera continua y que, por lo tanto, es inmortal, y que no produce inmunoglobulina.
Como se usa en este documento, un hibridoma "que tiene características humanas" se refiere a un hibridoma que retiene cromosomas de origen humano detectables tales como los que producen antígeno HLA humano que puede expresarse en la superficie celular.
Como se usa en este documento, células linfoides "inmunizadas contra un determinante predefinido" se refiere a células linfoides procedentes de un sujeto que ha estado expuesto a un antígeno que tiene el determinante. Por ejemplo, puede inducirse que un sujeto produzca (a partir de sus células B linfoides) anticuerpos contra los determinantes antigénicos de diversos tipos de sangre, por exposición, por medio de transfusiones o por medio de una gestación previa, o contra los determinantes antigénicos de virus específicos o de bacterias por exposición a través de infecciones previas o vacunaciones.
Como se usa en este documento, "línea celular" se refiere a diversas realizaciones que incluyen, pero sin limitación, células individuales, células recogidas y cultivos que contienen células siempre que procedan de células de la línea celular a la que se ha hecho referencia, que pueden no ser precisamente idénticas a las células o cultivos ancestrales y cualquier línea celular mencionada incluye estas variantes.
Como se usa en este documento, "trioma" se refiere a una línea celular que contiene componentes genéricos que se originan en tres linajes celulares separados originalmente. Estos triomas son células inmortalizadas estables, procedentes de la fusión de un hibridoma humano-murino con una célula linfoide humana. Como se usa en este documento, "tetroma" se refiere a una línea celular que contiene componentes genéricos procedentes de cuatro linajes celulares separados originalmente. Estos tetromas son células productoras de anticuerpos inmortalizadas estables que se producen por fusión de un trioma con una célula linfoide humana que es capaz de producir anticuerpos.
Como se usa en este documento, "de manera autóloga" se refiere a una situación en la que el mismo sujeto es tanto la fuente de inmunoglobulina celular como la diana para las células o la inmunoglobulina o la composición terapéuti-
ca.
Como se usa en este documento, "de manera heteróloga" se refiere a una situación en la que un sujeto es la fuente de células o inmunoglobulina y otro sujeto es la diana para la célula, inmunoglobulina o composición terapéutica.
En la práctica de cualquiera de los métodos de la invención o preparación de cualquiera de las composiciones farmacéuticas, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad que es capaz de unirse a un antígeno asociado con la afección. Por consiguiente, la cantidad eficaz variará con el sujeto a tratar así como con la afección a tratar. Para los fines de esta invención, los métodos de administración incluyen, pero sin limitación, administración cutánea, subcutánea, intravenosa, parenteral, oral, tópica o por aerosol.
Como se usa en este documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado" incluye cualquiera de los vehículos aceptados farmacéuticamente convencionales tales como solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua o una emulsión de triglicéridos, diversos tipos de agentes humectantes, liposomas, comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas y fantasmas de glóbulos rojos. Un ejemplo de una emulsión de triglicéridos aceptable útil en la administración intravenosa e intraperitoneal de los compuestos es la emulsión de triglicéridos conocida en el mercado como Intralipid®.
Típicamente, estos vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Estos vehículos también pueden incluir aromatizantes y aditivos colorantes u otros ingredientes.
Esta invención también proporciona composiciones farmacéuticas capaces de unirse a un antígeno asociado con la afección junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos adecuados. Estas composiciones son formulaciones líquidas, liofilizadas o secadas de otra manera e incluyen diluyentes de diversos contenidos de tampón (por ejemplo, Tris-HCI, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para prevenir la absorción en superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), agentes solubilizantes (por ejemplo, glicerol polietilenglicerol), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito sódico), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), sustancias para impartir volumen o modificadores de la tonicidad (por ejemplo, lactosa, manitol), unión covalente de polímeros tales como polietilenglicol al compuesto, formación de complejos con iones metálicos, o incorporación del compuesto en o sobre preparaciones en forma de partículas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o sobre liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos o esferoblastos. Estas composiciones influirán en el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de eliminación in vivo del compuesto o la composición.
Las composiciones de liberación controlada o sostenida incluyen la formulación en depósitos lipófilos (por ejemplo, ácidos grasos, ceras, aceites). También se incluyen en la invención composiciones en forma de partículas recubiertas con polímeros (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas) y el compuesto acoplado a anticuerpos dirigidos contra receptores, ligandos o antígenos con especificidad de tejido, o acoplados a ligandos de receptores con especificidad de tejidos. Otras realizaciones de las composiciones de la invención incorporan recubrimientos protectores en forma de partículas, inhibidores de proteasa o potenciadores de la infiltración para diversas vías de administración, incluyendo la vía parenteral, pulmonar, nasal y oral.
Cuando se administran, los compuestos a menudo se eliminan rápidamente de la circulación y, por lo tanto, pueden inducir una actividad farmacológica con una duración relativamente corta. Por consiguiente, pueden requerirse inyecciones frecuentes de dosis relativamente grandes de compuestos bioactivos para mantener la eficacia terapéutica. Se sabe que compuestos modificados por la unión covalente de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona o poliprolina presentan vidas medias sustancialmente mayores en la sangre después de la inyección intravenosa que los correspondientes compuestos no modificados (Abuchowski et al., 1981; Newmark et al., 1982; y Katre et al., 1987). Estas modificaciones también pueden aumentar la solubilidad del compuesto en solución acuosa, eliminar la agregación, aumentar la estabilidad física y química del compuesto y reducir en gran medida la inmunogenicidad y reactividad del compuesto. Como resultado, puede conseguirse la actividad biológica deseada in vivo por medio de la administración de dichos aductos de polímero-compuesto con menos frecuencia o en dosis menores que en el caso del compuesto no modificado.
La unión de polietilenglicol (PEG) a compuestos es particularmente útil debido a que PEG tiene una toxicidad muy baja en mamíferos (Carpenter et al., 1971). Por ejemplo, se aprobó un aducto de PEG de adenosina desaminasa en los Estados Unidos para uso en seres humanos para el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia combinada severa. Una segunda ventaja proporcionada por la conjugación de PEG es la de la reducción eficaz de la inmunogenicidad y antigenicidad de compuestos heterólogos. Por ejemplo, un aducto de PEG de una proteína humana podría ser útil para el tratamiento de enfermedades en otras especies de mamíferos sin el riesgo de desencadenar una respuesta inmune severa. El vehículo incluye un dispositivo de microencapsulación para reducir o prevenir una respuesta inmune del hospedador contra el compuesto o contra las células que pueden producir el compuesto. El compuesto de la presente invención también puede liberarse microencapsulado en una membrana, tal como un liposoma.
Los polímeros tales como PEG pueden unirse convenientemente a uno o más restos aminoacídicos reactivos en una proteína tal como el grupo alfa-amino del aminoácido amino terminal, los grupos épsilon amino de cadenas laterales de lisina, los grupos sulfhidrilo de cadenas laterales de cisteína, los grupos carboxilo de cadenas laterales de aspartilo y glutamilo, el grupo alfa-carboxilo del aminoácido carboxi terminal, cadenas laterales de tirosina, o a derivados activados de cadenas de glicosilo unidas a ciertos restos de asparagina, serina o treonina.
Se han descrito numerosas formas activadas de PEG adecuadas para la reacción directa con proteínas. Los reactivos de PEG útiles para la reacción con grupos amino de proteínas incluyen ésteres activos de derivados de ácido carboxílico o carbonato, particularmente aquellos en los que los grupos salientes son N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenol, imidazol o 1-hidroxi-2-nitrobenceno-4-sulfonato. Los derivados de PEG que contienen grupos maleimido o haloacetilo son reactivos útiles para la modificación de grupos sulfhidrilo libres de proteínas. Análogamente, los reactivos de PEG que contienen grupos amino hidrazina o hidrazida son útiles para la reacción con aldehídos generados por oxidación con peryodato de grupos carbohidrato en proteínas.
Se describe la producción de anticuerpos monoclonales humanos dirigidos a antígenos asociados con tumores, células tumorales, agentes infecciosos, antígenos con especificidad de infección, y autoantígenos que usan un compañero de fusión celular modificado, línea celular de trioma y linfocitos humanos obtenidos a partir de ganglios linfáticos, bazo, placas de Peyer, o cualquier otro tejido linfático o sangre periférica de los sujetos humanos.
Los anticuerpos se seleccionan usando células cultivadas, antígenos purificados, células y tejidos humanos primarios y bibliotecas combinatorias relevantes para la investigación de anticuerpos, incluyendo células y tejidos obtenidos a partir de un donante autólogo de células linfoides.
La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une específicamente y forma un complejo con el antígeno TIP-2 situado en la superficie de células cancerosas humanas, siendo el antígeno TIP-2 un antígeno al que se une específicamente el anticuerpo monoclonal 27.B1. De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invención, el anticuerpo monoclonal de la invención es un anticuerpo monoclonal murino, un anticuerpo monoclonal quimérico, un anticuerpo monoclonal humanizado o un anticuerpo monoclonal humano. En una realización de la presente invención, el anticuerpo monoclonal de la invención puede unirse al epítopo que se reconoce específicamente por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma que tiene el nº de Acceso de la ATCC PTA-1599.
La presente invención proporciona el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma que tiene nº de Acceso de la ATCC PTA-1599.
La presente invención proporciona una célula de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de esta invención. En una realización de la invención, la célula de hibridoma tiene el nº de Acceso de la ATCC PTA-1599.
El hibridoma 27.B1 se depositó el 28 de marzo de 2000 con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va, Estados Unidos, según las estipulaciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional de Depósitos de Microorganismos con Propósitos de Procedimientos de Patente. A 27.B1 se le concedió el número de acceso de la ATCC PTA-1599.
En una realización de esta invención, un anticuerpo monoclonal de la invención se marca con un marcador detectable. En otra realización de la invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, marcador fluorescente o marcador quimioluminiscente. En otra realización de la invención, el anticuerpo monoclonal se conjuga con un agente terapéutico. En otra realización de la invención, el agente terapéutico es un radioisótopo, toxina, toxoide o agente quimioterapéutico. En otra realización de la invención, el anticuerpo monoclonal se conjuga con un agente formador de imágenes. En otra realización más de la invención, el agente formador de imágenes es un radioisótopo.
La presente invención describe una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal de esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona una vacuna que comprende el anticuerpo monoclonal de esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invención, el anticuerpo monoclonal de la invención es un anticuerpo monoclonal murino, un anticuerpo monoclonal quimérico, un anticuerpo monoclonal humanizado o un anticuerpo monoclonal humano. En una realización de la presente invención, el anticuerpo monoclonal de la invención puede unirse al epítopo que se reconoce específicamente por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma que tiene el nº de Acceso de la ATCC PTA-1598.
La presente invención proporciona el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma que tiene el nº de Acceso de la ATCC PTA-1598.
La presente invención proporciona una célula de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de esta invención. En una realización de la invención, la célula de hibridoma tiene el nº de Acceso de la ATCC PTA-1598.
El hibridoma 27.F7 se depositó el 28 de marzo de 2000 en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va, Estados Unidos, según las estipulaciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional de Depósitos de Microorganismos con Propósitos de Procedimientos de Patente. A 27.F7 se le concedió el número de acceso de la ATCC PTA-1598.
En una realización de esta invención, un anticuerpo monoclonal de la invención se marca con un marcador detectable. En otra realización de la invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, marcador fluorescente o marcador quimioluminiscente. En otra realización de la invención, el anticuerpo monoclonal se conjuga con un agente terapéutico. En otra realización de la invención, el agente terapéutico es un radioisótopo, toxina, toxoide o agente quimioterapéutico. En otra realización de la invención, el anticuerpo monoclonal se conjuga con un agente formador de imágenes. En otra realización más de la invención, el agente formador de imágenes es un radioisótopo.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal de esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención describe una vacuna que comprende el anticuerpo monoclonal de esta invención y un ve-
hículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona un método in vitro para detectar células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, o un fragmento Fab de un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599), estando marcado de manera detectable dicho anticuerpo o fragmento Fab, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno que comprende el anticuerpo o fragmento Fab marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab marcado no unido en el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno formado en la etapa (a); y (c) determinar la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno detectando el marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno la existencia de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
Como se usa en este documento, "anticuerpo/fragmento Fab" se refiere a un anticuerpo o al fragmento Fab de los anticuerpos.
En la práctica de cualquiera de los métodos de la invención, el anticuerpo no unido o su fragmento se retira habitualmente por medio de un lavado minucioso de la muestra que se está ensayando.
En la práctica de cualquiera de los métodos de la invención, es más económico preparar primero el fragmento y después marcarlo con el marcador de interés.
En una realización de esta invención, el marcador detectable se selecciona entre el grupo que consiste en un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
En una realización de esta invención, la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, biopsia de mama, tejido, ganglios linfáticos, tejido prostático, tejidos de metástasis de mama y de próstata, medios de cultivo y otros tumores en los que TIP-2 puede ser un antígeno asociado.
En una realización de esta invención, TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
En una realización de esta invención, la muestra es medio de cultivo.
La presente invención proporciona un método in vitro para detectar células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, o un fragmento Fab de un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599) en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno que comprende el anticuerpo o fragmento Fab unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab no unido en el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno formado en la etapa (a); (c) poner en contacto el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno de la etapa (b) con un segundo anticuerpo que se une específicamente al complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno, estando dicho segundo anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para permitir que el segundo anticuerpo marcado se una al complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno; (d) retirar cualquier segundo anticuerpo marcado no unido al complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno producido en (c); y (e) determinar la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno unido al segundo anticuerpo marcado detectando el marcador del segundo anticuerpo, indicando la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno la existencia de células cancerosas humanas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
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En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
En una realización de esta invención, la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, biopsia de mama, tejido, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejidos de metástasis de mama y próstata, medio de cultivo y otros tumores en los que TIP-2 puede ser un antígeno asociado.
En una realización de esta invención, TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
La presente invención proporciona un método in vitro para detectar el antígeno TIP-2 en la superficie de células cancerosas en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo en el antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598, estando marcado de manera detectable dicho anticuerpo o fragmento Fab del mismo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; b) retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab marcado no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y (c) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 detectando el marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 la existencia de células cancerosas humanas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
En una realización de esta invención, el marcador detectable se selecciona entre el grupo que consiste en un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
En una realización de esta invención, la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, biopsia de mama, tejido, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejidos de metástasis de mama y próstata, medio de cultivo y otros tumores en los que TIP-2 puede ser un antígeno asociado.
En una realización de esta invención, TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
La presente invención proporciona un método in vitro para detectar el antígeno TIP-2 sobre la superficie de células cancerosas en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 donde dicho epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598 o un fragmento Fab del mismo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo o fragmento Fab del mismo no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); (c) poner en contacto el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 de la etapa (b) con un segundo anticuerpo que se une específicamente al complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2, estando dicho segundo anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones adecuadas para permitir que dicho segundo anticuerpo se una al complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2; (d) retirar cualquier segundo anticuerpo marcado no unido al complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 producido en (c); y (e) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 unido al segundo anticuerpo marcado detectando el marcador del segundo anticuerpo, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 la existencia de células cancerosas humanas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
En una realización de esta invención, la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, biopsia de mama, tejido, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejidos de metástasis de mama y próstata, medio de cultivo y otros tumores en los que TIP-2 puede ser un antígeno asociado.
En una realización de esta invención, TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
La presente invención proporciona un método in vitro para detectar el antígeno TIP-2 sobre la superficie de células cancerosas en una muestra que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado PTA-1598 o fragmento Fab del mismo, estando marcado de manera detectable dicho anticuerpo o fragmento Fab del mismo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo marcado no unido en el complejo de anticuerpo 27.B1-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y (c) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 detectando el marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 la existencia de células cancerosas humanas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
En una realización de esta invención, el marcador detectable se selecciona entre el grupo que consiste en un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma humano, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
En una realización de esta invención, la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, biopsia de mama, tejido, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejidos de metástasis de mama y próstata, medio de cultivo y otros tumores en los que TIP-2 puede ser un antígeno asociado.
En una realización de esta invención, TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
La presente invención proporciona un método in vitro para detectar el antígeno TIP-2 en la superficie de células cancerosas en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo en el antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado PTA-1599, o un fragmento Fab del mismo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab del mismo no unido en el complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); (c) poner en contacto el complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 de la etapa (b) con un segundo anticuerpo que se une específicamente al complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2, estando dicho segundo anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones adecuadas para permitir que dicho segundo anticuerpo se una al complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2; (d) retirar cualquier segundo anticuerpo marcado no unido al complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 producido en (c); y (e) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 unido al segundo anticuerpo marcado detectando el marcador del segundo anticuerpo, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 la existencia de células cancerosas humanas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma humano, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
En una realización de esta invención, la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, biopsia de mama, tejido, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejidos de metástasis de mama y próstata, medio de cultivo y otros tumores en los que TIP-2 puede ser un antígeno asociado.
En una realización de esta invención, TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
La presente invención proporciona un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto detectando células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende: (a) poner en contacto una muestra de sangre periférica obtenida a partir del sujeto con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598 o un fragmento Fab del mismo, estando dicho anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab marcado no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y (c) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 detectando el marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 el diagnóstico de un cáncer en el sujeto.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, el sujeto es un ser humano.
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En una realización de esta invención, el cáncer es melanoma humano, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, leucemia mieloide, carcinoma de mama, carcinoma de colon, carcinoma de endometrio, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, carcinoma cervical, osteosarcoma, carcinoma testicular y linfoma.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
En una realización de esta invención, la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, biopsia de mama, tejido, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejidos de metástasis de mama y próstata, medio de cultivo y otros tumores en los que TIP-2 puede ser un antígeno asociado.
En una realización de esta invención, TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
La presente invención proporciona un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto detectando células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende: a) poner en contacto una muestra de sangre periférica obtenida a partir del sujeto con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598 o un fragmento Fab del mismo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); (c) poner en contacto el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 de la etapa (b) con un segundo anticuerpo que se une específicamente al complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2, estando dicho segundo anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones adecuadas para permitir que dicho segundo anticuerpo se una al (A) complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2; (d) retirar cualquier segundo anticuerpo marcado no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 producido en (c); y (a) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 unido al segundo anticuerpo marcado detectando el marcador del segundo anticuerpo, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 el diagnóstico de un cáncer en el sujeto.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, el sujeto es un ser humano.
En una realización de esta invención, el cáncer es melanoma humano, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, leucemia mieloide, carcinoma de mama, carcinoma de colon, carcinoma de endometrio, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, carcinoma cervical, osteosarcoma, carcinoma testicular y linfoma.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
En una realización de esta invención, la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, biopsia de mama, tejido, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejidos de metástasis de mama y próstata, medio de cultivo y otros tumores en los que TIP-2 puede ser un antígeno asociado.
En una realización de esta invención, TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
La presente invención proporciona un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto detectando células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende: (a) poner en contacto una muestra de sangre periférica obtenida a partir del sujeto con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado PTA-1599, estando dicho anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab marcado no unido en el complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y (c) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 detectando el marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 el diagnóstico de un cáncer en el sujeto.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, el sujeto es un ser humano.
En una realización de esta invención, el cáncer es melanoma humano, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, leucemia mieloide, carcinoma de mama, carcinoma de colon, carcinoma de endometrio, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, carcinoma cervical, osteosarcoma; carcinoma testicular y linfoma.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
En una realización de esta invención, la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, biopsia de mama, tejido, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejidos de metástasis de mama y próstata, medio de cultivo y otros tumores en los que TIP-2 puede ser un antígeno asociado.
En una realización de esta invención, TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
La presente invención proporciona un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto detectando células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende: (a) poner en contacto una muestra de sangre periférica obtenida a partir del sujeto con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1/fragmento Fab producido por el hibridoma designado PTA-1599 o fragmento Fab del mismo, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de células presentes en la muestra; (b) retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab no unido en el complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); (c) poner en contacto el complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 de la etapa (b) con un segundo anticuerpo que se une específicamente al complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2, estando dicho segundo anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones adecuadas para permitir que dicho segundo anticuerpo marcado se una al complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2; (d) retirar cualquier segundo anticuerpo marcado no unido al complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 producido en (c); y (e) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 unido al segundo anticuerpo marcado detectando el marcador del segundo anticuerpo, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab-antígeno TIP-2 el diagnóstico de un cáncer en el sujeto.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, el sujeto es un ser humano.
En una realización de esta invención, el cáncer es melanoma humano, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, leucemia mieloide, carcinoma de mama, carcinoma de colon, carcinoma de endometrio, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, carcinoma cervical, osteosarcoma, carcinoma testicular y linfoma.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
En una realización de esta invención, la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, biopsia de mama, tejido, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejidos de metástasis de mama y próstata, medio de cultivo y otros tumores en los que TIP-2 puede ser un antígeno asociado.
En una realización de esta invención, TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
La presente invención proporciona un método in vivo para detectar células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en un sujeto, que comprende determinar la presencia de un anticuerpo 27.F7 marcado de manera detectable administrado previamente unido a la superficie de células en el sujeto, estando dirigido dicho anticuerpo a un epítopo del antígeno TIP-2 o fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, el sujeto es un ser humano.
En una realización de esta invención, el cáncer es melanoma humano, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, leucemia mieloide, carcinoma de mama, carcinoma de colon, carcinoma de endometrio, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, carcinoma cervical, osteosarcoma, carcinoma testicular y linfoma.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
En una realización de esta invención, en la etapa (b) se detecta la presencia del anticuerpo 27.F7 o un fragmento Fab del mismo unido a la superficie de las células en el sujeto, siendo el medio para detectar el marcador detectable un dispositivo de formación de imágenes.
En una realización de esta invención, el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por resonancia magnética.
En una realización de esta invención, el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por inmunoescintografía de rayos X.
La presente invención proporciona un método in vivo para detectar células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en un sujeto, que comprende determinar la presencia de un anticuerpo/fragmento Fab de 27.B1 marcado de manera detectable administrado previamente unido a la superficie de células en el sujeto, estando dirigido dicho anticuerpo a un epítopo del antígeno TIP-2 o fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, el sujeto es un ser humano.
En una realización de esta invención, el cáncer es melanoma humano, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, leucemia mieloide, carcinoma de mama, carcinoma de colon, carcinoma de endometrio, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, carcinoma cervical, osteosarcoma, carcinoma testicular y linfoma.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
En una realización de esta invención, la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, biopsia de mama, tejido, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejidos de metástasis de mama y próstata, medio de cultivo y otros tumores en los que TIP-2 puede ser un antígeno asociado. En una realización de esta invención, en la etapa (b) se detecta la presencia del anticuerpo 27.B1 o fragmento del mismo unido a la superficie de células en el sujeto, siendo el medio para detectar el marcador detectable un dispositivo de formación de imágenes.
En una realización de esta invención, el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por resonancia magnética.
En una realización de esta invención, el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por inmunoescintografía de rayos X.
La presente invención proporciona el uso de un liposoma que lleva un conjugado de material exógeno, donde un anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27-F7 (nº de Designación de la ATCC PTA-1598) o un anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de Acceso de la ATCC PTA-1599) se acopla con una superficie exterior del liposoma para la preparación de un medicamento para tratar un cáncer a través de la liberación dirigida de material exógeno a células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 de un sujeto humano. En una realización de esta invención, el material exógeno se selecciona entre el grupo que consiste en fármacos anticancerosos, radioisótopos, toxinas, antibióticos, profármacos, enzimas y compuestos quimioterapéuti-
cos.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células de melanoma humano, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma de pulmón, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
En una realización de esta invención, el material exógeno se selecciona entre el grupo que consiste en fármacos anticancerosos, radioisótopos, toxinas, antibióticos, profármacos, enzimas y compuestos quimioterapéuticos.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células de melanoma humano, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma de pulmón, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
Se describe un método para tratar cánceres en un sujeto humano provocando una respuesta inmune específica que comprende administrar al sujeto la proteína antigénica TIP-2 entera o un fragmento peptídico de TIP-2 al sujeto.
En el método descrito anteriormente, el TIP-2 entero o los péptidos derivados de TIP-2 pueden (1) inyectarse directamente o (2) acoplarse con una proteína de soporte o (3) en una mezcla con un adyuvante o (4) modificarse de otra manera (tal como por acoplamiento a toxoide tetánico) para estimular la respuesta inmune dirigida a todas las células que llevan TIP-2.
En una realización, la respuesta inmune específica es citolisis dependiente del complemento de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2.
En una realización, la respuesta inmune específica es la activación de células asesinas naturales hacia células cancerosas que llevan TIP-2.
En una realización, el fragmento peptídico del antígeno TIP-2 comprende la secuencia de aminoácidos Lys Leu Leu Gly Gly Gln Ile Gly Leu.
En una realización, el fragmento peptídico del antígeno TIP-2 comprende la secuencia de aminoácidos Ser Leu Leu Gly Cys Arg HisTyr Glu Val.
Se describe un método para tratar cánceres en un sujeto humano induciendo la apoptosis de células cancerosas, que comprende administrar al sujeto una proteína antigénica TIP-2 entera o un fragmento peptídico de TIP-2 al suje-
to.
Se describe un método para tratar cánceres en un sujeto humano provocando una respuesta inmune específica, que comprende: (a) retirar células dendríticas de dicho sujeto; (b) poner en contacto las células dendríticas de la etapa (a) con una proteína antigénica TIP-2 entera o un fragmento peptídico de TIP-2; y (c) introducir de nuevo las células dendríticas de la etapa (b) en dicho sujeto.
En el método descrito anteriormente, las células dendríticas presentarán el antígeno al sistema inmune autólogo y, por lo tanto, inducirán anticuerpos en el sujeto.
En una realización, el fragmento peptídico del antígeno TIP-2 comprende la secuencia de aminoácidos Lys Leu Leu Gly Gly Gln Ile Gly Leu.
En una realización, el fragmento peptídico del antígeno TIP-2 comprende la secuencia de aminoácidos Ser Leu Leu Gly Cys Arg His Tyr Glu Val.
En una realización, la respuesta inmune específica es citolisis dependiente del complemento de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2.
En una realización, la respuesta inmune específica es la activación de células asesinas naturales hacia células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2.
En una realización, la respuesta inmune específica es la producción de anticuerpos en el sujeto contra la proteína antigénica TIP-2 entera o el fragmento peptídico de TIP-2.
En el método descrito anteriormente, los anticuerpos inyectados al paciente con el fin de provocar una respuesta inmune al cáncer pueden ser totalmente humanos, humanizados o fragmentos de los mismos, pueden estar acoplados directa o indirectamente a una toxina, un fármaco o un profármaco, una enzima, un radionúclido, o a liposomas que tienen la carga útil de un fármaco, toxina, profármaco, enzima o radionúclido. Tales anticuerpos pueden provocar la respuesta inmune por activación de células efectoras (células asesinas naturales y macrófagos), provocando ADCC; pueden activar el complemento, provocando CDC, o pueden actuar directamente por apoptosis. Tales anticuerpos también pueden inducir la cascada de anticuerpos anti-idiotípicos, donde Ab2 (miméticos del antígeno, en este caso TIP-2) provocarán una respuesta inmune anti-TIP-2 aún más fuerte por inducción de Ab3 (miméticos de Ab1 original anti-TIP-2).
Se describe un método para tratar cánceres en un sujeto humano induciendo la apoptosis de células cancerosas, que comprende administrar una proteína antigénica TIP-2 entera o un fragmento peptídico de TIP-2 al sujeto.
La presente invención proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal 27.F7 o un anticuerpo monoclonal 27.B1 o un fragmento peptídico de los mismos dirigido a un epítopo o a un antígeno TIP- 2 para la preparación de un medicamento para tratar cánceres en un sujeto humano por inmunización pasiva.
En una realización de esta invención, el anticuerpo induce la apoptosis de células que llevan el antígeno TIP-2.
Se proporciona un péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos Lys Leu Leu Gly Gly Gln Ile Gly Leu.
Se proporciona un péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos Ser Leu Leu Gly Cys Arg His Tyr Glu Val.
La presente invención describe un método para la investigación inmunohistoquímica de una sección de tejido de una muestra tumoral para determinar la presencia de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende: (a) poner en contacto la sección de tejido de la muestra tumoral con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598, estando dicho anticuerpo/fragmento Fab marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de las células en la sección de tejido; (b) retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab marcado no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y (c) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 detectando el marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 células cancerosas humanas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
En una realización de esta invención, la sección de tejido es un tejido congelado recientemente conservado o tejido fijado con formalina.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma, y el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano.
La presente invención proporciona un kit para detectar la presencia de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en una muestra, que comprende: (a) un soporte sólido que tiene una pluralidad de sondas unidas covalentemente que pueden ser iguales o diferentes, comprendiendo cada sonda un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo donde el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599); y (b) un medio para determinar la presencia del complejo de anticuerpo monoclonal/fragmento Fab-antígeno TIP-2.
En una realización de esta invención, el medio para determinar la presencia del complejo de anticuerpo monoclonal/fragmento Fab-antígeno TIP-2 es un segundo anticuerpo marcado de manera detectable que se une específicamente al anticuerpo monoclonal dirigido al epítopo del antígeno TIP-2.
En una realización de esta invención, el anticuerpo monoclonal dirigido al epítopo del antígeno TIP-2 es el anticuerpo monoclonal humano 27.F7 dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598.
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\global\parskip0.900000\baselineskip
En una realización de esta invención, el anticuerpo monoclonal dirigido al epítopo del antígeno TIP-2 es el anticuerpo monoclonal humano 27.B1 dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado PTA-1599.
En una realización de esta invención, el anticuerpo monoclonal dirigido al epítopo del antígeno TIP-2 es un anticuerpo monoclonal murino dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma designado PTA-1599.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
En una realización de esta invención, la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, biopsia de mama, tejido, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejidos de metástasis de mama y próstata, medio de cultivo y otros tumores en los que TIP-2 puede ser un antígeno asociado.
En una realización de esta invención, la muestra es medio de cultivo.
En una realización de esta invención, la muestra es una muestra tumoral.
La presente invención proporciona un método para detectar la presencia del antígeno TIP-2 en un fluido biológico, que comprende: (a) poner en contacto una muestra del fluido biológico con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598, estando dicho anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la muestra; (c) retirar cualquier anticuerpo marcado no unido en el complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y (d) determinar la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 detectando el marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab-antígeno TIP-2 el antígeno TIP-2 en el fluido biológico.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
En una realización de esta invención, el fluido biológico se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo y fluido linfático.
En una realización de esta invención, TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
En una realización de esta invención, el fluido biológico es medio de cultivo.
En una realización de esta invención, el anticuerpo monoclonal dirigido al epítopo del antígeno TIP-2 es el anticuerpo monoclonal humano 27.F7 dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598.
En una realización de esta invención, el anticuerpo monoclonal dirigido al epítopo del antígeno TIP-2 es el anticuerpo monoclonal humano 27.B1 dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado PTA-1599.
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En una realización de esta invención, el anticuerpo monoclonal dirigido al epítopo del antígeno TIP-2 es un anticuerpo monoclonal murino dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2.
En una realización de esta invención, el antígeno TIP-2 está presente en células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en el fluido biológico.
La presente invención describe un método para la investigación inmunohistoquímica de secciones de tejido de una muestra de tumor para determinar la presencia de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende: (a) poner en contacto la sección de tejido de la muestra de tumor con un anticuerpo marcado de manera detectable dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado PTA-1599, estando dicho anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para unir el anticuerpo al antígeno TIP-2 sobre la superficie de cualquier célula de la muestra; y (b) retirar cualquier anticuerpo marcado no unido a las células de la muestra; (c) determinar la presencia de anticuerpo 27.B1 unido a las células de la muestra, indicando la presencia del anticuerpo 27.B1 unido a las células la existencia de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra de tumor.
En una realización de esta invención, la sección de tejido es tejido congelado recientemente conservado o tejido fijado con formalina.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
En una realización de esta invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En una realización de esta invención, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
La presente invención describe un método para controlar la progresión del cáncer, donde las células cancerosas son células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, en un sujeto, que comprende: (a) administrar a un sujeto al que se le ha diagnosticado cáncer un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598, estando dicho anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para unir el anticuerpo al antígeno TIP-2 en la superficie de cualquier célula del sujeto; (b) determinar la presencia del anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a la superficie de las células del sujeto de acuerdo con el método de la reivindicación 23; (c) comparar la presencia del anticuerpo/fragmento Fab de 27.F7 marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) con la presencia de anticuerpo 27.F7 marcado de manera detectable unido a las células (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, donde una presencia de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) mayor que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, indica progresión del cáncer en el sujeto y una presencia de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de forma detectable unido a las células en la etapa (b) menor que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento indica regresión del cáncer en el sujeto.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
En una realización de esta invención, en la etapa (b) se detecta la presencia del anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a la superficie de las células en el sujeto por un medio para detectar el marcador detectable que es un dispositivo de formación de imágenes.
En una realización de esta invención, el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por resonancia magnética.
En una realización de esta invención, el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por inmunoescintografía de rayos X.
La presente invención describe un método para controlar la progresión de un cáncer, donde las células cancerosas son células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, en un sujeto, que comprende: (a) administrar a un sujeto al que se le ha diagnosticado un cáncer un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado PTA-1599, estando dicho anticuerpo/fragmento Fab marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para unir el anticuerpo al antígeno TIP-2 en la superficie de cualquier célula del sujeto; (b) determinar la presencia del anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a la superficie de las células en el sujeto de acuerdo con el método de la reivindicación 23; (c) comparar la presencia del anticuerpo/fragmento Fab 27.B1 marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) con la presencia del anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, donde una presencia del anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) mayor que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, indica progreso del cáncer en el sujeto y una presencia del anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) menor que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento indica regresión del cáncer en el sujeto.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
En una realización de esta invención, en la etapa (b) se detecta la presencia del anticuerpo 27.B1 unido a la superficie de las células en el sujeto, siendo el medio para detectar el marcador detectable un dispositivo de formación de imágenes.
En una realización de esta invención, el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por resonancia magnética.
En una realización de esta invención, el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por inmunoescintografía de rayos X.
La presente invención describe un método para controlar la progresión de un cáncer, donde las células cancerosas son células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, en un sujeto, que comprende: (a) administrar a un sujeto al que se le ha diagnosticado un cáncer un anticuerpo dirigido a un epítopo en el antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado PTA-1598, donde dicho anticuerpo/fragmento Fab está marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para unir el anticuerpo al antígeno TIP-2 en la superficie de cualquiera de las células del sujeto; (b) determinar la cantidad de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a la superficie de las células del sujeto de acuerdo con el método de la reivindicación 23; (c) comparar la cantidad de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) con la presencia de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en (i) el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, donde una cantidad de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) mayor que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, indica progresión del cáncer en el sujeto y una cantidad de anticuerpo 27.F7/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) menor que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento indica regresión del cáncer en el sujeto.
En el método descrito anteriormente, dada la alta heterogeneidad de las células tumorales, algunas células pueden tener más cantidad de antígeno, y otras menos. La cantidad de antígeno puede determinar los diferentes estadios de la enfermedad, es decir, puede diferenciar entre una lesión precancerosa y una cancerosa.
En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
En una realización de esta invención, en la etapa (b) se detecta la cantidad de anticuerpo 27.F7 unido a la superficie de las células en el sujeto, siendo el medio para detectar el marcador detectable un dispositivo de formación de imágenes.
En la realización descrita anteriormente de la invención, puede realizarse una estimación de la cantidad acumulada del anticuerpo marcado con radionúclidos usando un dispositivo de formación de imágenes.
Las fórmulas ayudan a determinar si la acumulación es específica o no.
En una realización de esta invención, el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por resonancia magnética.
En una realización de esta invención, el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por inmunoescintografía de rayos X.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
La presente invención describe un método para controlar la progresión del cáncer, donde las células cancerosas son células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, en un sujeto, que comprende: (a) administrar a un sujeto al que se le ha diagnosticado un cáncer un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose el epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado PTA-1599, estando marcado de manera detectable dicho anticuerpo/fragmento Fab, en condiciones apropiadas para unir el anticuerpo al antígeno TIP-2 en la superficie de cualquier célula del sujeto; (b) determinar la cantidad de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a la superficie de las células en el sujeto de acuerdo con el método de la reivindicación 27; (c) comparar la cantidad de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) con la presencia de anticuerpo 27.B1 marcado de manera detectable unido a las células en (i) el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, donde una cantidad de anticuerpo 27.B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) mayor que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento, indica progresión del cáncer en el sujeto y una cantidad de anticuerpo 27-B1/fragmento Fab marcado de manera detectable unido a las células en la etapa (b) menor que (i) en el momento del diagnóstico o (ii) después del tratamiento indica regresión del cáncer en el sujeto. En una realización de esta invención, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, enzima, tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
En una realización de esta invención, en la etapa (b) se detecta la cantidad del anticuerpo 27-B1/fragmento Fab unido a la superficie de las células en el sujeto, siendo el medio para detectar el marcador detectable un dispositivo de formación de imágenes.
En una realización de esta invención, el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por resonancia magnética.
En una realización de esta invención, el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por inmunoescintografía de rayos X.
En una realización de esta invención, las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
En una realización de esta invención, las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma pulmonar, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
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Se describe un método para diagnosticar cánceres asociados con la expresión del antígeno TIP-2 en un sujeto humano, que comprende: (a) obtener ARNm de una muestra de la sangre periférica del sujeto; (b) preparar ADNc a partir del ARNm de la etapa (a); (c) amplificar el ADN que codifica el antígeno TIP-2 presente en el ADNc preparado en la etapa (b) por una reacción en cadena de la polimerasa utilizando al menos dos cebadores de oligonucleótidos, donde cada uno de los cebadores hibrida específicamente con el ADN que codifica el antígeno TIP-2 y (d) detectar la presencia de cualquier ADN amplificado resultante, siendo la presencia de dicho ADN amplificado el diagnóstico para el cáncer asociado con la expresión del antígeno TIP-2.
En el método descrito anteriormente, como se conoce la estructura del ácido nucleico de TIP-2, un especialista en la técnica puede medir la expresión del ARNm de TIP-2 por Transferencia de Northern, ya que se conoce la secuencia completa de ARNm y por lo tanto puede producirse el ADNc de tamaño completo. Otra manera de medir la expresión es por PCR cuantitativa usando cebadores de 18-21 unidades basándose en la secuencia conocida de ARNm. Un especialista en la técnica también puede sintetizar cebadores específicos o preparar el ADNc de tamaño completo. La secuencia de ARNm de tamaño completo de GIPC (Proteína de Interacción con GAIP, extremo C) se muestra en la Figura 24, con la parte correspondiente a la secuencia de TIP-2 subrayada.
En una realización, la presencia de cualquier ADN amplificado en la etapa (d) se detecta usando una sonda oligonucleotídica marcada que hibrida específicamente con el ADN amplificado.
En una realización, la sonda marcada está radiomarcada con ^{32}P o ^{33}P.
Se describe un método para diagnosticar un cáncer asociado con la expresión del antígeno TIP-2 en un sujeto humano, que comprende: (a) obtener ARNm de una muestra de sangre periférica del sujeto; (b) preparar ADNc a partir del ARNm de la etapa (a); (c) amplificar el ADN que codifica el antígeno TIP-2 presente en el ADNc preparado en la etapa (b); (d) determinar la cantidad de cualquier ADN amplificado resultante; y (e) comparar la cantidad de ADN amplificado determinada en la etapa (d) con las cantidades convencionales determinadas previamente de ADN amplificado, donde cada cantidad convencional es indicativa de un estadio particular del cáncer asociado con la expresión del antígeno TIP-2.
En una realización, el estadio es cáncer precanceroso o displasia benigna.
En una realización, el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en un tumor, cáncer en los ganglios linfáticos y cáncer metastásico.
El sistema de establecimiento de estadios de los cánceres más usado es el que se basa en el denominado sistema TNM (T, tumor; N, ganglios; y M, metástasis). El estadio 0 equivale a la enfermedad de Paget sin un tumor o carcinoma in situ, sin ganglios linfáticos implicados y sin metástasis. El estadio 1 es un tumor con un tamaño no superior a 2 cm sin metástasis ni ganglios linfáticos implicados. El estadio II es un tumor mayor de 5 cm con implicación de ganglios linfáticos auxiliares, sin metástasis distante. El estadio III es igual que el estadio II con una serie de ganglios linfáticos implicados fijados entre sí o a otras estructuras y en casos avanzados ganglios linfáticos en las glándulas mamarias. El estadio IV es la enfermedad más avanzada con un tumor de cualquier tamaño, implicación masiva de ganglios linfáticos y cualquier metástasis distante.
Como se usa en este documento, "proteína antigénica TIP-2 entera" comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 23.
La presente invención también describe una vacuna que comprende un anticuerpo monoclonal producido por el método descrito en este documento y un vehículo adecuado.
La presente invención también describe una vacuna que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal de esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con ciertas realizaciones de esta invención, la afección es cáncer y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para inhibir el crecimiento o eliminar el cáncer. De acuerdo con ciertas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de tiroides o cáncer de próstata. De acuerdo con ciertas realizaciones, la afección es una infección y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para inhibir el crecimiento o destruir al agente infeccioso. De acuerdo con ciertas realizaciones, el agente infeccioso es virus Hanta, HTLV I, HTLVII, VIH, virus del herpes, virus de la gripe, virus Ébola, papilomavirus humano, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, bacilo del ántrax o criptococo. De acuerdo con ciertas realizaciones, la afección está asociada con una toxina y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para reducir la cantidad o destruir la toxina. De acuerdo con ciertas realizaciones, la toxina es la toxina tetánica, del ántrax, botulínica, veneno de serpiente o veneno de araña. De acuerdo con ciertas realizaciones, la afección es una enfermedad autoinmune y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para reducir la cantidad o destruir el anticuerpo perjudicial. En ciertas realizaciones de esta invención, la enfermedad autoinmune es lupus, tiroiditis, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplantes o artritis reumatoide.
De acuerdo con ciertas realizaciones de esta invención, el anticuerpo monoclonal se acopla con una molécula efectora. De acuerdo con otra realización de esta invención, la molécula efectora es un agente citotóxico, fármaco, enzima, tinte o radioisótopo. En otra realización de esta invención, el anticuerpo monoclonal se acopla con un vehículo. De acuerdo con otra realización de esta invención, el vehículo es un liposoma.
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La presente invención describe además un método para tratar una afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la vacuna descrita anteriormente eficaz para unirse al antígeno asociado con la afección, tratando de esta manera la afección en el sujeto.
La presente invención describe además un método para prevenir una afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la vacuna descrita anteriormente eficaz para unirse al antígeno asociado con la afección, previniendo de esta manera la afección en el sujeto. En una realización de la invención, el sujeto presentaba previamente la afección. En otra realización de la invención, la vacuna se administra a un segundo sujeto.
De acuerdo con una realización de la invención, la afección está asociada con un cáncer, un tumor, una toxina; un agente infeccioso, una disfunción enzimática, una disfunción hormonal, una enfermedad autoinmune, una disfunción inmune, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno eucariótico, o rechazo de un tejido transplantado. En otra realización de la invención, la afección es septicemia, sepsis, choque séptico, viremia, bacteremia o fungemia. De acuerdo con otra realización de la invención, el cáncer es cáncer de tiroides, cáncer de mama o cáncer de próstata. En otra realización de la invención, el agente infeccioso es virus Hanta, HTLV I, HTLV II, VIH, virus del herpes, virus de la gripe, virus Ébola, papilomavirus humano, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, bacilo del ántrax o criptococo. De acuerdo con otra realización de la invención, la toxina es la toxina tetánica, del ántrax, botulínica, veneno de serpiente o veneno de araña. En una realización adicional de la invención, el tumor es benigno. En otra realización más de la invención, la disfunción enzimática es una hiperactividad o sobreproducción de la enzima. De acuerdo con una realización adicional de la invención, la disfunción hormonal es una hiperactividad o sobreproducción de la hormona. En otra realización de la invención, la disfunción inmune está mediada por CD3 o CD4. En una realización adicional de la invención, la enfermedad autoinmune es lupus, tiroiditis, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplantes o artritis reumatoide.
También se describe una vacuna que comprende una proteína antigénica TIP-2 entera o una forma peptídica de TIP-2 y un vehículo adecuado.
También se describe una vacuna que comprende una cantidad eficaz de una proteína antigénica TIP-2 entera o una forma peptídica de TIP-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la afección es cáncer y la cantidad de proteína antigénica TIP-2 entera o una forma peptídica de TIP-2 es suficiente para inhibir el crecimiento o eliminar el cáncer. De acuerdo con ciertas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de tiroides o cáncer de próstata. De acuerdo con ciertas realizaciones, la afección es una infección y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para inhibir el crecimiento o destruir el agente infeccioso. De acuerdo con ciertas realizaciones, el agente infeccioso es virus Hanta, HTLV I, HTLV II, VIH, herpes virus, virus de la gripe, virus Ébola, papilomavirus humano, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, bacilo del ántrax o criptococo. De acuerdo con ciertas realizaciones, la afección está asociada con una toxina y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para reducir la cantidad o destruir la toxina. De acuerdo con ciertas realizaciones, la toxina es la toxina tetánica, del ántrax, botulínica, veneno de serpiente o veneno de araña. De acuerdo con ciertas realizaciones, la afección es una enfermedad autoinmune y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para reducir la cantidad o destruir el anticuerpo perjudicial. En ciertas realizaciones, la enfermedad autoinmune es lupus, tiroiditis, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplantes o artritis reumatoide.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la proteína antigénica TIP-2 entera o forma peptídica de TIP-2 se acopla con una molécula efectora. De acuerdo con otra realización, la molécula efectora es un agente citotóxico, fármaco, enzima, tinte o radioisótopo. En una realización de esta invención, el anticuerpo monoclonal se acopla con un vehículo. De acuerdo con otra realización de esta invención, el vehículo es un liposoma.
La presente invención también describe un método para tratar una afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la vacuna descrita anteriormente eficaz para unirse al antígeno asociado con la afección, tratando de esta manera la afección en el sujeto.
La presente invención también describe un método para prevenir una afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la vacuna descrita anteriormente eficaz para unirse al antígeno asociado con la afección, previniendo de esta manera la afección en el sujeto. En una realización de la invención, el sujeto mostraba previamente la afección. En otra realización de la invención, la vacuna se administra a un segundo sujeto.
De acuerdo con una realización de la invención, la afección está asociada con un cáncer, un tumor, una toxina, un agente infeccioso, una disfunción enzimática, una disfunción hormonal, una enfermedad autoinmune, una disfunción inmune, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno eucariótico o rechazo de un tejido transplantado. En otra realización de la invención, la afección es septicemia, sepsis, choque séptico, viremia, bacteremia o fungemia. De acuerdo con otra realización de la invención, el cáncer es cáncer de tiroides, cáncer de mama o cáncer de próstata. En otra realización de la invención, el agente infeccioso es virus Hanta, HTLV I, HTLV II, VIH, virus del herpes, virus de la gripe, virus Ébola, papilomavirus humano, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, bacilo del ántrax o criptococo. De acuerdo con otra realización de la invención, la toxina es la toxina tetánica, del ántrax, botulínica, veneno de serpiente o veneno de araña. En una realización adicional de la invención, el tumor es benigno. En otra realización más de la invención, la disfunción enzimática es una hiperactividad o sobreproducción de la enzima. De acuerdo con una realización adicional de la invención, la disfunción hormonal es una hiperactividad o sobreproducción de la hormona. En otra realización de la invención, la disfunción inmune está mediada por CD3 o CD4. En una realización adicional de la invención, la enfermedad autoinmune es lupus, tiroiditis, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplantes o artritis reumatoide.
También se describe una vacuna que comprende células dendríticas que se han retirado de un paciente y se han puesto en contacto con una proteína antigénica TIP-2 entera o una forma peptídica de TIP-2 y un vehículo adecuado.
También se describe una vacuna que comprende una cantidad eficaz de células dendríticas que se han retirado de un paciente y se han puesto en contacto con una proteína antigénica TIP-2 entera o una forma peptídica de TIP-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la afección es cáncer y la cantidad de células dendríticas que se han retirado de un paciente y se han puesto en contacto con la proteína antigénica TIP-2 entera o una forma peptídica de TIP-2 es suficiente para inhibir el crecimiento o eliminar el cáncer. De acuerdo con ciertas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de tiroides o cáncer de próstata. De acuerdo con ciertas realizaciones, la afección es una infección y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para inhibir el crecimiento o destruir el agente infeccioso. De acuerdo con ciertas realizaciones, el agente infeccioso es virus Hanta, HTLV I, HTLV II, VIH, virus del herpes, virus de la gripe, virus Ébola, papilomavirus humano, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, bacilo del ántrax o criptococo. De acuerdo con ciertas realizaciones, la afección está asociada con una toxina y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para reducir la cantidad o destruir la toxina. De acuerdo con ciertas realizaciones, la toxina es la toxina tetánica, del ántrax, botulínica, veneno de serpiente o veneno de araña. De acuerdo con ciertas realizaciones, la afección es una enfermedad autoinmune y la cantidad de anticuerpo monoclonal es suficiente para reducir la cantidad o destruir el anticuerpo perjudicial. En ciertas realizaciones, la enfermedad autoinmune es lupus, tiroiditis, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplantes o artritis reumatoide.
De acuerdo con ciertas realizaciones, las células dendríticas que se han retirado de un paciente y se han puesto en contacto con la proteína antigénica TIP-2 entera o la forma peptídica de TIP-2 se acoplan con una molécula efectora. De acuerdo con otra realización, la molécula efectora es un agente citotóxico, fármaco, enzima, tinte o radioisótopo. En otra realización de esta invención, el anticuerpo monoclonal se acopla con un vehículo. De acuerdo con otra realización, el vehículo es un liposoma.
La presente invención también describe un método para tratar una afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la vacuna descrita anteriormente eficaz para unirse al antígeno asociado con la afección, tratando de esta manera la afección en el sujeto,
La presente invención también describe un método para prevenir una afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de la vacuna descrita anteriormente eficaz para unirse al antígeno asociado con la afección, previniendo de esta manera la afección en el sujeto. En una realización de la invención, el sujeto mostraba previamente la afección. En otra realización de la invención, la vacuna se administra a un segundo sujeto.
De acuerdo con una realización de la invención, la afección está asociada con un cáncer, un tumor, una toxina, un agente infeccioso, una disfunción enzimática, una disfunción hormonal, una enfermedad autoinmune, una disfunción inmune, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno eucariótico o rechazo de un tejido transplantado. En otra realización de la invención, la afección es septicemia, sepsis, choque séptico, viremia, bacteremia o fungemia. De acuerdo con otra realización de la invención, el cáncer es cáncer de tiroides, cáncer de mama o cáncer de próstata. En otra realización de la invención, el agente infeccioso es virus Hanta, HTLV I, HTLV II, VIH, virus del herpes, virus de la gripe, virus Ébola, papilomavirus humano, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, bacilo del ántrax o criptococo. De acuerdo con otra realización de la invención, la toxina es la toxina tetánica, del ántrax, botulínica, veneno de serpiente o veneno de araña. En una realización adicional de la invención, el tumor es benigno. En otra realización más de la invención, la disfunción enzimática es una hiperactividad o sobreproducción de la enzima. De acuerdo con una realización adicional de la invención, la disfunción hormonal es una hiperactividad o sobreproducción de la hormona. En otra realización de la invención, la disfunción inmune está mediada por CD3 o CD4. En una realización adicional de la invención, la enfermedad autoinmune es lupus, tiroiditis, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplantes o artritis reumatoide.
La invención se entenderá mejor tras la sección de Detalles Experimentales que se muestra a continuación. Sin embargo, un especialista en la técnica apreciará fácilmente que los métodos específicos y los resultados analizados son meramente ilustrativos de la invención que se describe con más detalle en las reivindicaciones que se muestran posteriormente.
Detalles experimentales Primera serie de experimentos Ejemplo 1 Construcción de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales Introducción
Pueden producirse células B6B11 o células de tipo B6B11 por medio de la fusión de células de mieloma de ratón con células de mieloma humano seleccionadas para que no secreten anticuerpo. La generación específica y aplicación del heteromieloma B6B11 se describe en este documento más adelante. B6B11 se obtuvo fusionando el mieloma sensible a HAT de ratón y resistente a G-418 conocido como X63.Ag8.653 con el subclón de mieloma humano RPMI 8226 seleccionado para la ausencia de secreción de cadenas ligeras lambda. La fusión de esplenocitos humanos y células B6B11 tuvo como resultado una frecuencia de fusión de 30-50 híbridos por 10^{7} células. Esto es similar a la frecuencia de formación de hibridomas murinos. Los híbridos se clonan fácilmente por dilución limitante, producen anticuerpos durante al menos 10 meses y se cultivan en medio sin suero. Se obtuvieron dos clones que secretaron IgM humana reactiva contra lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram-negativas. Estos clones se obtuvieron por fusión de esplenocitos inmunizados in vitro con las células B6B11. Se sabe que el mAb murino anti-lípido A previene el desarrollo del choque séptico (Shnyra AA, et al., 1990). Los mAb humanos tienen aplicaciones clínicas importantes.
Resultados
Heteromieloma B6B11. El heteromieloma B6B11 se generó por fusión con PEG del mieloma de ratón 653 (sensible a HAT, G-418) con RPMI 8226 humano, que se seleccionó para la ausencia de secreción de cadenas lambda. Los híbridos se seleccionaron en presencia de HAT y G-418. La selección con respecto a la resistencia a 8-Ag se realizó aumentando gradualmente la concentración de 8-Ag desde 2 \mug/ml a 20 \mug/ml durante 2,5-3 semanas. La población de híbridos sensibles a HAT 653x8226 se clonó dos veces. Los clones se ensayaron con respecto a la capacidad de producir híbridos con linfocitos humanos. Se seleccionó un clon, denominado B6B11. Las células B6B11 murieron en medio que contenía aminopterina, durante un periodo de 5-6 días; no se detectaron revertientes durante más de 18 meses. En RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal (FCS) al 10%, la línea tenía un tiempo de duplicación de aproximadamente 25-30 horas, la densidad máxima en matraces de 75 cm^{2} era de aproximadamente 1,5x10^{6} células/ml (en un volumen de 30 ml). El medio de cultivo de B6B11 se ensayó con respecto a la presencia de inmunoglobulina humana por medio de un inmunoensayo ligado a enzima (ELISA) usando inmunoglobulina de conejo anti-humana. B6B11 presentaba secreción de IgG, IgM o IgA. La tinción de las preparaciones celulares con MAH-L,H por la técnica PAP no detectó ni cadena pesada ni cadena ligera citoplásmica de inmunoglobulina humana.
Cariotipo. La figura 1 ilustra la distribución de células parentales y B6B11 por el contenido cromosómico. El análisis cromosómico de las células de heteromieloma indicó que el número cromosómico varía de 60 a 82.
La figura 2 muestra un fragmento del cariotipo de bandas G de células B6B11. Los cromosomas de ratón normales constituyen aproximadamente 84% del cariotipo. Hay varios cromosomas reordenados. Hay algunos marcadores para cromosomas de mieloma de ratón así como cromosomas de heteromieloma (quiméricos de humano-ratón) reordenados. En todas las placas en metafase de B6B11 examinadas estaba representado un cromosoma telocéntrico grande. Esto sugería que la parte proximal de este cromosoma contiene material genético de ratón y la parte distal contiene material genético humano del cromosoma 3 (3p21.1-3p ter). La localización del material humano se realizó como se ha descrito (33). En algunas de las células B6B11 analizadas, se había delecionado el cromosoma 19 humano y el cromosoma 7 humano.
Fusión de Células B6B11 Con Linfocitos Humanos. La fusión de células B6B11 con linfocitos de sangre periférica (PBL) recién aislados y linfocitos esplénicos (SPL) se realizó como se describe en este documento más adelante en la Sección de Procedimientos Experimentales. La fusión de linfocitos de sangre periférica (PBL) y linfocitos de sangre periférica (PBL) tratados con mitógeno pokeweed (PWM) produjo un rendimiento de hibridoma bajo (1-5 híbridos por 10^{7} linfocitos), mientras que la fusión con linfocitos esplénicos (SPL) y linfocitos esplénicos (SPL) tratados con mitógeno pokeweed (PWM) produjo 30-60 híbridos por 10^{7} células (véase la Tabla 1). Después de la fusión, las células se sembraron a una densidad de 1,5x10^{5} células por pocillo. Las variaciones en las relaciones de células de 1:1 a 1:2 (heteromieloma:linfocito) no tuvieron ningún efecto sobre la eficacia de fusión para PBL o SPL. Sin embargo, la eficacia de fusión se redujo espectacularmente a relaciones de B6B11:linfocitos de 1:4 a 1:8.
TABLA 1 
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1 
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Los efectos de la estimulación de esplenocitos con diversos mitógenos sobre la eficacia de la fusión se ilustran en la Figura 3. El tratamiento con PWM aumentó significativamente la eficacia de la hibridación de SPL en comparación con el tratamiento con ConA, el tratamiento con PHA, el tratamiento con LPS o SPL sin tratamiento. La eficacia de la fusión era dependiente del momento de adición de HAT. Cuando HAT se añadía inmediatamente después de la fusión, el rendimiento se reducía a 10-15 híbridos por 10^{7} linfocitos (para SPL).
La clonación de híbridos con SPL y PBL (estimulados y no estimulados) indicó que PBL no podía usarse para la formación de hibridomas. La clonación se realizó 4-6 semanas después de la fusión en medio acondicionado epitelial (ECM) al 50% (preincubado durante 24 horas a 37ºC en placas de 96 pocillos) y RPMI 1640 al 50% que contenía FCS al 15%. Los resultados se determinaron en 2-2,5 semanas. La eficacia de clonación (1,5-2 células por pocillo) fue de 50-80% para SPL y de 10-30% para PBL. El ELISA usando inmunoglobulina de conejo anti-humana y MAH-L,H indicó que la producción de inmunoglobulina total estaba presente en 90-95% de los híbridos en crecimiento con PBL y 80-85% con los hibridomas de SPL. Basándose en SPL, se seleccionó con respecto a la estimulación con PWM y la inmunización in vitro.
Para aumentar la eficacia de hibridación, se trataron esplenocitos con Leu-Ome 2,5 mM y se fusionaron con células B6B11 a una relación de 1:1 ó 1:2 (B6B11:SPL) (véase la Tabla 2). El efecto sobre este tratamiento fue evidente después de 18-24 horas de cultivo con PWM; los SPL sin tratamiento con Leu-Ome presentaron blastos sólo después de tres días. La eficacia de hibridación de SPL tratados con Leu-Ome fue algo mayor (80%) en comparación con los SPL no tratados (72%). Este tratamiento aumentó considerablemente (93%) el número de híbridos de secreción de Ig.
TABLA 2
3
Las células de heteromieloma se fusionaron con esplenocitos tratados con Leu-Ome inmunizados con Re 595 de Salmonella minnesota (Re595) en presencia de PWM y medio acondicionado de timocitos de ratón (TCM) (Tabla 3). Los sobrenadantes de cultivo de hibridoma se ensayaron con respecto a los anticuerpos bacterianos a diferentes fases de crecimiento de híbridos: (1) después de la transferencia de poblaciones que responden a placas de 24 pocillos y (2) después de la clonación y posterior expansión clonal. Se seleccionaron dos clones independientes que producían anticuerpos antibacterianos. Un ELISA usando lipopolisacárido (LPS) inmovilizado o Re595 inmovilizado y LPS en solución determinó que los anticuerpos producidos por los dos clones reaccionaban con LPS.
Un ELISA realizado usando isotipos monoclonales de ratón anti-humano de Re595 inmovilizado y conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón con peroxidasa absorbido con inmunoglobulina humana, determinó que el isotipo de anticuerpo era IgM-kappa. Los dos clones se adaptaron a medio sin suero (SFM) reemplazando gradualmente el medio de crecimiento que contenía FCS al 10%. La densidad máxima después del cultivo en SFM era de aproximadamente 1,2x10^{6} células/ml. Las células adaptadas a SFM se clonaron como se ha descrito anteriormente. La eficacia y el tiempo de clonación fueron similares a los de las células cultivadas en medio RPMI 1640 suplementado con suero.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3
4
Análisis de ADN. La figura 4 ilustra la distribución del contenido de ADN por líneas parentales, heteromieloma B6B11 e híbrido H6B11-esplenocito. El ADN de las células de heteromieloma consiste en 78,7% del ADN parental total. El contenido de ADN de las células híbridas de B6B11-esplenocito es 3% mayor que el de las células B6B11.
Discusión
Se generó una línea celular compañera para la producción de anticuerpos monoclonales humanos por hibridación somática de X63.Ag8.653 de ratón y células de mieloma RPMI 1640 humanas. La adaptación a un medio con 8-Ag, la posterior clonación y selección por eficacia de hibridación condujo a un clon heterohíbrido que se denominó B6B11. La fusión entre líneas heterohíbridas y linfocitos proporcionó híbridos productores esencialmente estables (Raison RL, et al., 1982). Se desconocen los mecanismos subyacentes a este fenómeno. Se sugiere que los cromosomas humanos o sus fragmentos retenidos en la línea compañera después de la primera fusión modifican el medio intracelular de tal manera que se estabilizan los cromosomas de los linfocitos humanos o los fragmentos después de la segunda fusión (Oestberg L, y Pursch E., 1983). El gran número de cromosomas, la presencia de cromosomas marcadores híbridos y el aumento del contenido de ADN observado en los experimentos descritos en este documento confirmó la naturaleza híbrida de las células B6B11. También aumentó el contenido de ADN de las células híbridas B6B11-SPL. El ensayo inmunocitoquímico de las cadenas pesada y ligera intracelulares y el ensayo ELISA de la secreción de inmunoglobulina demostraron que las células B6B11 ni producen inmunoglobulinas ni cadenas pesadas o ligeras. La fusión de B6B11 con SPL produjo más híbridos que la fusión con PBL (30-50 por 10^{7} SPL en comparación con 1-5 por 10^{7} PBL). La eficacia de clonación con SPL fue de 50-80% en comparación con 10-30% obtenido con PBL. De esta manera, los SPL fueron el compañero de fusión más preferible. El medio de cultivo estaba acondicionado por células endoteliales; que se consideraron cruciales para la viabilidad y clonogenicidad de los híbridos. En el caso de híbridos B6B11-PBL, se detectó secreción de inmunoglobulina en hasta 95% de los híbridos. Para aumentar el rendimiento de los híbridos secretores de inmunoglobulina después de la fusión con SPL (hasta 93%) se usó Leu-Ome. Casi todos los híbridos secretaban anticuerpos de especificidad desconocida. La producción de anticuerpo por los híbridos B6B11 fue estable durante al menos 10 meses. Los híbridos se adaptaban fácilmente al medio sin suero, facilitando de esta manera la producción de anticuerpos ex-vivo.
Se obtuvieron dos clones productores de anticuerpo (con una especificidad probablemente similar al LPS de Re595 de S. minnesota) después de la fusión de SPL inmunizados con células B6B11. Como se demuestra en este documento, el heteromieloma humano-ratón, B6B11, es útil para producir anticuerpos monoclonales humanos contra diversos antígenos. Una sensibilización apropiada in vitro de los linfocitos también tiene una importancia crítica para generar anticuerpos humanos.
Procedimientos Experimentales
Cultivo de Células. Se transfectaron células de mieloma de ratón resistentes a 8-azaguanina (8-Ag) conocidas como X63.Ag8.653 (653) con el plásmido pBgl-neoR (Dr. A. Ibragimov) como se describe a continuación. Las células de mieloma se mantuvieron en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal (FCS) al 10%, L-glutamina 4 mM, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales y vitaminas (Flow Laboratories). Antes de la fusión, las células se pasaron 3 veces en presencia de 20 ng/ml de 8-Ag (Sigma) y 500 ng/ml de G-418 (Gibco).
La línea celular de mieloma humano RPMI 8226 (8226) se cultivó en medio RPMI 1640 con los suplementos mencionados anteriormente (RPMI 1640 regular). El heteromieloma híbrido B6B11 se cultivó en RPMI 1640 regular con FCS al 10% o en medio sin suero que representaba una mezcla 1:1 de modificación por Iscove de medio de Dulbecco (IMDM) y HAM F-12 (Flow Laboratories) suplementado con la fracción nº 5 de albúmina de suero bovino, 2 mg/ml, (BSA) (Sigma), insulina bovina, 5 \mug/ml (Serva), transferrina humana, 5 \mug/ml (Sigma), progesterona, 6 ng/ml (Gibco) e hidrocortisona, 60 ng/ml (Gibco). Los hibridomas se adaptaron a este medio sin suero (SFM) por medio de un reemplazo gradual del medio de crecimiento que contenía FCS al 10%. Todas las células se cultivaron en una atmósfera humidificada de 5,5% de CO_{2}/94,5% de aire a 37ºC.
Los linfocitos de sangre periférica (PBL) humanos se aislaron usando medio de separación de linfocitos (LSM) (Flow Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los bazos recogidos en la autopsia antes de que transcurrieran 2 horas desde la muerte (la edad de los varones era de 50-60 años) se homogeneizaron y los esplenocitos (SPL) se aislaron en LSM.
Producción de Células de Mieloma 653 Resistentes a Geneticina (G-418). Las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca^{++} o Mg^{++}. A la suspensión celular se le añadió ADN del plásmido pBgl-neoR linealizado por BamHI (construido por P.Chumakov, Institute of Molecular Biology of the Academy of Sciences of the USSR, Moscú, Unión Soviética). Antes de añadir el ADN a la suspensión celular, el ADN se extrajo dos veces con fenol usando fenol-éter a 4ºC, se precipitó con etanol al 96% y se secó en condiciones estériles.
La transfección se realizó por electroporación a 4ºC usando una unidad construida por L. Chernomordik (Institute of Electrical Chemistry of the Academy of Sciences of the USSR, Moscú, Unión Soviética). Se combinaron aproximadamente 4x10^{6} células de mieloma 653 y 3,5 \mug de ADN plasmídico en una cámara de electroporación de 80 \mul. La concentración final de ADN fue de 44 \mug/ml). Se pasó un impulso de corriente eléctrica de 1,7 Kv/cm a través de la cámara durante 100 \musegundos. Después de dejar en reposo durante 10 minutos, las células se transfirieron a 0,5 ml de medio completo en pocillos de 16 mm^{2} a 5x10^{3} y 2x10^{4} células/pocillo. Después de 36 horas, se añadieron 0,5 ml de medio que contenía 1 mg/ml de Geneticina (G-418) a una concentración final de 0,5 mg/ml. Posteriormente, se cambió 50% del volumen del medio cada 2 días durante 12 días.
Producción de heteromieloma. Se mezclaron células 653 resistentes a G-418 con células 8226 a una relación 1:1 y se sedimentaron. Se añadió polietilenglicol al 50% (v/v) (PEG) 3350 (Sigma) (200-300 \mul por 4-5x10^{7} células) durante 1 minuto con agitación constante. Se añadieron varias partes de RPMI 1640 sin suero (RPMI-S^{-}) durante 5 minutos (primero 10 ml), 1 minuto (10 ml) y 1 minuto (30 ml). Las células se sedimentaron, se resuspendieron en RPMI 1640 regular con FCS al 20%, hipoxantina (1 x 10^{4} M), aminopterina (4 x 10^{7} M), timidina (1,6 x 10^{5} M) (HAT, Flow Laboratories) y 500 ng/ml de G-418 y se sembraron en placas de 96 pocillos (Linbro) a una densidad de 10^{5} células por pocillo. A las dos semanas, el medio (la mitad del volumen) se reemplazó con medio que contenía hipoxantina (2 x 10^{4} M), timidina (3,2 x 10^{5} M) (HT, Flow Laboratories) y G-418 (500 \mug/ml). El procedimiento se repitió después de dos semanas.
Producción de anticuerpos monoclonales humanos. Se realizó la fusión de células B6B11 con linfocitos humanos por el método descrito anteriormente con las siguientes modificaciones. Los linfocitos se mezclaron con B6B11 a una relación 1:1 o 1:2, se sedimentaron, se lavaron con RPMI 1640-S- y se incubaron con PEG (600 nl por 10^{5} células) durante 3 minutos con constante agitación. Las partes de RPMI-S- añadido fueron las siguientes: 10 ml/10 minutos, 10 ml/5 minutos, 10 ml/1 minuto. Las células se sedimentaron, se resuspendieron en RPMI regular suplementado con FCS al 15% y se sembraron en placas de 96 pocillos (1,5 x 10^{5} células por pocillo). Se añadió medio HAT después de 24 horas. El medio de crecimiento (la mitad del volumen) se reemplazó por HAT nuevo en 7-9 días. El medio HAT se reemplazó por medio HT a los 15-18 días.
Clonación. Se clonaron células parentales de heteromieloma e hibridoma por el método de dilución limitante en medio acondicionado con células humanas umbilicales o endoteliales aórticas (Antonov AS, et al., 1986) (donación de Dr. A. Antonov) (ECM). Se incubaron 100 \mul/pocillo en placas de 96 pocillos a 37ºC durante una noche. Las células se sembraron a aproximadamente 1 a 2 células por pocillo. El medio de cultivo se ensayó con respecto a la presencia de anticuerpos a las 2,5-3 semanas.
Inmunización in vitro . Se resuspendieron linfocitos recién aislados en RPMI-S- que contenía L-leucina metil éster (Leu-OMe) 2,5 mM (Borrebaeck, CAK, et al., 1987) a una concentración final de 10^{7} células por ml. Después de 40 minutos de incubación a temperatura ambiente, las células se lavaron 3 veces con RPMI-S- y se resuspendieron en RPMI 1640 regular suplementado con FCS al 15%. Como fuente de linfoquinas se usó medio acondicionado por timocitos de ratón (TCM) (Reading CL, 1982). A la suspensión celular se le añadió mitógeno pokeweed (PWM) (Flow Laboratories) a una concentración final de 5 \mug/ml, TCM (25%) y antígeno en diferentes concentraciones. La suspensión celular (4-6 x 10^{6} células/ml) se transfirió a matraces (30 ml/75 cm^{2} de matraz). La fusión se realizó después de 7-9 días de cultivo. Se usaron concanavalina A (ConA) (Flow 5-10 \mug/ml), fitohemaglutinina (PHA) (Flow, 5-10 \mug/ml) y lipopolisacárido (LPS) (SIGMA, 10-15 \mug/ml) en lugar de PWM. Como antígeno se usó Re595 de S. minnesota (donación de Dr. 0. Luderitz, Max Plank Institute fur Immunologie, Feiburg, Alemania). Las bacterias se cultivaron en medio que contenía 16 g/l de caldo tríptico de soja (TSB), Difco), 16 g/l de infusión cerebro-cardíaca (BHI) (Difco) y 4 g/l de extracto de levadura (YE) (DIFCO) durante 18 horas a 37ºC con agitación constante y después se inactivaron con calor. La concentración de antígeno varió de 10^{7}-10^{10} células/ml.
Determinación de anticuerpos y producción de Ig no específica. Se usó un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) para ensayar los sobrenadantes del hibridoma con respecto a la presencia de anticuerpos contra Re595 de Salmonella minnesota y LPS.
Selección de mAb reactivos contra bacterias. Se cubrieron placas de 96 pocillos con glutaraldehído (1%, 100 \mul por pocillo) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con agua destilada 3 veces. Las bacterias se resuspendieron en tampón carbonato amónico 50 mM (pH 9,6) y se transfirieron a placas (5x10^{7} células en 100 \mul por pocillo), se centrifugaron a 780 x g durante 30 minutos y se lavaron con agua destilada 4 veces. Los sobrenadantes ensayados (100 \mul) se suplementaron con Tween 20 al 0,1% (Fluka), se pusieron en pocillos que contenían bacterias y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después el medio se retiró y los pocillos se lavaron con agua destilada. Se añadió inmunoglobulina de conejo anti-humana purificada por afinidad conjugada con fosfatasa alcalina (RAH-AP), diluida en solución tamponada con Tris (TBS, 50 mM, pH 7,4), que contenía Tween 20 al 0,1%, a 1 \mug en 100 \mul por pocillo. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente y 6 lavados con agua destilada, se añadieron 100 \mul de 4-nitrofenil-fosfato (1 mg/ml, Sigma) en tampón de dietanolamina (dietanolamina al 10%, MgCl_{2} 0,5 mM, pH 9,8). Después de una hora, los resultados se leyeron usando un multiscan (Flow Laboratories) a 405 nm. El control negativo era medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con FCS al 15%.
Selección de mAb reactivos contra lipopolisacáridos. Se purificó LPS a partir de Re595 de Salmonella minnesota como se ha descrito (Galanos G, et al., 1969). La preparación de LPS se sonicó y se transfirió a las placas a 2,5 \mugpor pocillo en tampón carbonato amónico 5 mM (pH 9,6). Después de una incubación de una noche a temperatura ambiente, se realizaron los procedimientos descritos anteriormente para determinar mAb reactivos contra bacterias.
Selección de producción no específica de mAb. Se evaluó la producción no específica de inmunoglobulina y cadenas separadas después de la adición de 100 \mul de inmunoglobulina de conejo anti-humana (10 \mug/ml en tampón fosfato, PBS, pH 7,2) o 100 \mul/pocillo (10 ng/ml en PBS) de anticuerpos monoclonales de ratón contra las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina humana (MAH-L,H) (Rokhlin OV, 1989) (donación de O. Rochlin, CRC, Moscú). Los procedimientos posteriores se realizaron como se ha descrito anteriormente.
Determinación del isotipo de anticuerpos secretados. El isotipo de los anticuerpos humanos se determinó por ELISA usando las cadenas ligera y pesada murinas anti-humanas (MAH-L,H) e inmunoglobulina de cabra anti-ratón (25 \mug/ml) conjugada con peroxidasa y absorbida con inmunoglobulina humana.
Determinación de la producción de cadenas ligeras o pesadas citoplásmicas. La producción de cadenas ligeras y/o pesadas citoplásmicas en hibridomas, B6B11 y las líneas celulares parentales se estimó inmuncitoquímicamente usando el sistema de peroxidasa-antiperoxidasa (PAP). Se secaron al aire frotis de células, se fijaron durante 45 segundos con formaldehído al 10% (v/v) y acetona al 45% (v/v) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 6,6) y se incubaron con MAH-L,H (200 \mul, 5-10 mg/ml). Después se añadió 1 ml inmunoglobulina de conejo anti-ratón (38 mg/ml en PBS). Todas las incubaciones fueron de 30 minutos. Los lavados se realizaron usando PBS durante 10 minutos.
Análisis cromosómico. Se obtuvieron preparaciones de cromosomas en metafase por medio de la siguiente técnica. Se añadió colchicina a las células durante el crecimiento exponencial (1,5-2 horas para las líneas parentales y células B6B11). Después, las células se tripsinizaron y se tiñeron para el bandeo G como se ha descrito (Seabright S., 1971) (10-15 placas de cada línea). Para contar el número de cromosomas, se analizaron al menos 50 figuras en metafase para cada línea celular.
Análisis de ADN por citometría de flujo. Para estimar el contenido de ADN, las células (1x10^{6}) se fijaron con 1 ml de etanol al 70%, se lavaron, se incubaron durante 2-3 horas con 0,3 mg/ml Ribonucleasa A (Serva) en solución de Hank (pH 7,4) y se tiñeron durante 2 horas con yoduro de propidio (0,05 mg/ml, Sigma) en solución de Hank. El contenido de ADN se midió en un citoflurómetro FACS-II (Becton Dickinson). La fluorescencia se excitó por un láser de ion argón a 488 nm (Modelo 164-05, Spectra-Physics) a una potencia de 400 mW y se registró detrás de un filtro de interferencia de paso largo de 600 nm (Ditric Optica).
Líneas Parentales. La línea de mieloma 653 se mantuvo en DMEM suplementado con FCS al 10%, 20 ng/ml de 8-Azaguanina y 500 \mug/ml de G-418. La línea de mieloma 8226 productora de cadenas lambda de Ig humana se cultivó en RPMI-C que contenía FCS al 10%. Para crear un heteromieloma, se seleccionó un clon de la línea 8226 no productor por clonación en ECM (2 células por pocillo). Se estimó la producción de cadenas lambda a 2-2,5 semanas usando MAH-L. La frecuencia de clones no secretores fue de 1x10^{-3}.
Ejemplo 2 Trioma MFP-2, un compañero de fusión para generar anticuerpos monoclonales humanos Introducción
Se obtuvo una línea celular de fibroma precursora por hibridación de la línea celular de mieloma humana disponible en el mercado RPMI 8226 y mieloma de ratón X63.Ag8.653 resistente tanto a 8-Azaguanina (8-Ag) como a Geneticina 418 (G-418). Uno de los clones resultantes, B6B11, se seleccionó en presencia de G-418. B6B11 se cultivó en presencia de concentraciones crecientes de 8-Ag y es resistente tanto a G-418 como a 8-Ag (Véase el Ejemplo 1).
Aunque B6B11 puede usarse para preparar hibridomas humanos por fusión con linfocitos derivados de ganglio linfático humano o linfocitos derivados de bazo, B6B11 no pudo fusionarse con linfocitos de sangre periférica (PBL) humana o produjo un rendimiento muy bajo de híbridos (Véase el Ejemplo 1).
Para solucionar este problema, B6B11 se fusionó con linfocitos de ganglio linfático humano y se obtuvieron varios híbridos. Las células resultantes se analizaron con respecto a la producción de inmunoglobulina humana o la producción de cadenas de inmunoglobulina separadas. Los clones que no sintetizaban inmunoglobulina o cadenas de inmunoglobulina se seleccionaron para una evaluación adicional en términos de la capacidad de fusión y el potencial de secreción de anticuerpos. Se determinó que estos híbridos eran bastante estables. Estos productos de fusión se denominaron células "compañeras de fusión modificadas" (MFP). Estas células MFP como producto de la fusión del hibridoma B6B11 y linfocitos se denominan en este documento células de "trioma" porque, en esencia, son el producto de tres células fusionadas. Uno de los clones, MFP-2, presentó una eficacia muy elevada para fusionarse con linfocitos de sangre periférica así como para fusionarse con linfocitos humanos de cualquier origen variado (es decir, ganglios linfáticos, bazo, placas de Peyer, etc.). MFP-2 se seleccionó basándose en sus características superiores y estabilidad como compañero de fusión y se usó en los experimentos descritos más adelante.
Los productos de las fusiones entre las células de trioma MFP y los linfocitos se denominan en este documento células de "tetroma" porque, en esencia, son el producto de cuatro células fusionadas.
Resultados
Producción de Inmunoglobulina. Para demostrar que la línea celular compañera de fusión de hibridoma humano (trioma), MFP-2, puede fusionarse con linfocitos humanos y producir altos rendimientos de híbridos con una producción de inmunoglobulina estable, se realizaron experimentos usando linfocitos humanos de diferentes fuentes.
La línea celular de heteromieloma, B6B11 (precursor de MFP-2), puede fusionarse con alta eficacia con linfocitos de ganglio linfático y de bazo. (Véase el Ejemplo 1). Hasta 90% de los híbridos resultantes produjeron IgG o IgM. Sin embargo, B6B11 no pudo fusionarse con linfocitos derivados de sangre periférica (PBL). La línea celular de trioma, MFP-2, (resultante de una fusión entre B6B11 y linfocitos de ganglio linfático humano) solucionó este problema y presentó una alta eficacia de fusión con PBL, produciendo un alto porcentaje de producción de inmunoglobulina por los híbridos de tetroma resultantes. La capacidad de MFP-2 de fusionarse con PBL se ensayó de dos maneras: (1) por fusión con linfocitos aislados recientemente en suspensión y (2) por fusión con linfocitos descongelados que se habían almacenado en estado congelado durante diversos periodos de tiempo. (Véase los procedimientos experimentales). Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 5.
La eficacia de la fusión fue de 10^{5} (1 híbrido por 10^{5} linfocitos). Se obtuvieron treinta poblaciones de hibridoma primario (tetroma) y se analizaron con respecto a la capacidad de secretar inmunoglobulina. (Probablemente una población de hibridoma primaria será una mezcla de dos o más clones individuales). Veintisiete poblaciones (90%) produjeron IgM a un nivel 5 veces mayor que el nivel de fondo. Veinticuatro poblaciones (80%) secretaron IgE a un nivel 5 veces mayor que el nivel de fondo. La fusión de MFP-2 con suspensiones de linfocitos que se habían congelado y descongelado también produjo híbridos productores de inmunoglobulina. Noventa por ciento y 11% de estas poblaciones de hibridoma produjeron IgM e IgG humanas respectivamente. La eficacia de fusión, en sí misma, no se vio afectada por el procedimiento de congelación-descongelación. Estos resultados demuestran que pueden usarse tanto PBL recién aislados como congeladas para generar hibridomas humanos capaces de producir anticuerpos.
Identificación de antígenos asociados a tumores y producción de anticuerpos específicos usando el compañero de fusión de MFP-2: anticuerpos monoclonales humanos contra tiroglobulina. En este experimento se generaron anticuerpos anti-tiroglobulina humanos por fusión de MFP-2 usando ganglios linfáticos de pacientes a los que se les había diagnosticado adenocarcinoma de tiroides. Se escindió un ganglio linfático periclavicular usando cirugía de linfadenectomía de una paciente del sexo femenino con cáncer de tiroides, se aislaron linfocitos y se fusionaron con MFP-2, generando células de tetroma.
Los hibridomas resultantes (tetromas) se ensayaron con respecto a la producción de anticuerpos humanos reactivos contra tiroglobulina usando un procedimiento de inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA). Se usó tiroglobulina humana purificada para recubrir una placa de microtitulación. Los resultados se muestran en la Figura 6. Treinta y tres de 144 tetromas presentaron una respuesta contra el antígeno de tiroglobulina. Ocho de éstos fueron particularmente fuertes. (Véase la Figura 6). De esta manera, los tetromas derivados de ganglio linfático de esta paciente con cáncer de tiroides producían anticuerpos anti-tiroglobulina. Éste era un resultado inesperado y sorprendente porque la paciente no tenia ninguna historia conocida de enfermedad autoinmune (es decir, anticuerpos antitiroideos). Esto sugiere que los anticuerpos producidos en este paciente contra la tiroglobulina se inducían por la presencia de células cancerosas de adenocarcinoma de tiroides. Se sabe que las células cancerosas de adenocarcinoma de tiroides secretan tiroglobulina. Este experimento demuestra que las células tumorales pueden inducir una respuesta inmune humoral contra antígenos asociados a tumores y que las células productoras de anticuerpos pueden identificarse e inmortalizarse por medio de las técnicas descritas en este documento usando el compañero de fusión MFP-2 para producir anticuerpos monoclonales antitumorales humanos.
Producción de anticuerpos monoclonales humanos contra antígenos asociados a cánceres de mama. En otro experimento, se produjeron anticuerpos monoclonales humanos contra antígenos asociados a cáncer usando ganglio linfático y linfocitos de sangre periférica procedentes de pacientes con cáncer de mama. Se escindieron ganglios linfáticos axilares de pacientes con cáncer de mama que se sometieron a mastectomía o lumpectomía. Se fusionaron linfocitos aislados de estos ganglios linfáticos a MFP-2 y los tetromas resultantes se sometieron a una selección contra las líneas celulares de cáncer de mama MCF7, SK-BR-3, ZR-75-1. Casi todos los tetromas producían IgG o IgM (aproximadamente 85% y 10% respectivamente). Sorprendentemente, casi 15% de los tetromas ensayados contra las líneas celulares de cáncer de mama produjeron anticuerpos dirigidos específicamente contra células cancerosas. Los sobrenadantes de tetromas se ensayaron de dos formas: (1) en células vivas en el ensayo CELISA (ELISA celular) y(2) por transferencia de Western usando lisados celulares. El intervalo de peso molecular de los antígenos específicos reconocidos por los anticuerpos monoclonales humanos fue de 25 a 160 kDA. Para delinear la naturaleza de la diana antigénica, se realiza inmunoprecipitación seguida de microsecuenciación. Además, se usan bibliotecas combinatorias de péptidos aleatorios para identificar las dianas moleculares de los anticuerpos con especificidad de cáncer.
En un paciente con cáncer de mama en Estadio IV, no estaban disponibles los ganglios linfáticos de forma que se fusionaron PBL a MFP-2 y se obtuvieron 156 tetromas. Los tetromas se analizaron con respecto a la producción de inmunoglobulina así como con respecto a la producción de anticuerpo con especificidad de cáncer. Se produjo IgM por 28 tetromas; 87 tetromas produjeron IgG. Cuatro de los anticuerpos IgM y siete de los anticuerpos IgG se identificaron como reactivos contra antígenos celulares; tres anticuerpos IgM y cuatro anticuerpos IgG fueron específicos para células de cáncer de mama. El resto de los tetromas presentó inmunorreactividad contra otros tipos celulares incluyendo líneas celulares de cáncer de próstata humano, fibroblastos diploides humanos y fibroblastos de piel humana. Estos últimos anticuerpos probablemente estaban dirigidos a antígenos comunes (comunes para células normales y cancerosas).
Los PBL se aislaron a partir de la sangre de un paciente que recibió 77 ciclos de quimioterapia que razonablemente sería de esperar que tuvieran un efecto de depresión del sistema inmune del paciente. Sin embargo, este paciente aún producía anticuerpos anticancerosos adecuados para la fusión con MFP-2.
Se generaron tetromas humanos a partir de la fusión de MFP-2 y linfocitos de cáncer de próstata y se ensayaron con respecto a la presencia de anticuerpos con especificidad de PSA así como anticuerpos dirigidos a las líneas de células de cáncer de próstata LNCaP, DU-145 y PC-3.
Producción de anticuerpos humanos contra antígenos asociados a enfermedades infecciosas. Las enfermedades infecciosas van acompañadas comúnmente por una respuesta inmune humoral y celular bien desarrollada. Los pacientes con ciertas infecciones a menudo contienen grandes números de células productoras de anticuerpos específicas. Una aplicación importante de la inmunoterapia de anticuerpos descrita por la presente invención es la producción de anticuerpos monoclonales humanos contra citoquinas proinflamatorias que están implicadas en el choque séptico. Entre estas dianas se encuentran citoquinas tales como el factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha) y la interleuquina-la (IL-la). Otras dianas incluyen otras citoquinas y linfoquinas, agentes infecciosos y sus toxinas, incluyendo la toxina tetánica, toxina del ántrax, toxina botulínica y lípido A. La sangre periférica de pacientes infectados con bacterias, hongos, protozoos o virus típicamente contiene células productoras de anticuerpos circulantes que pueden aislarse y usarse como fuente para la fusión con MFP-2. Por ejemplo, pueden fusionarse PBL de pacientes con choque séptico, infección por virus Hanta, VIH, HTLV-I, HTLV-II, influenza, hepatitis o virus del herpes con MFP-2 y las células de tetroma resultantes pueden seleccionarse contra los antígenos respectivos. En el SIDA, en particular, pueden inmortalizarse linfocitos de los pacientes usando las técnicas descritas en este documento para generar grandes cantidades de anticuerpos anti-VIH para uso en inmunoterapia pasiva de una manera autóloga o heteróloga.
Producción de anticuerpos humanos contra enfermedades autoinmunes. Una consideración general para el uso de anticuerpos monoclonales humanos en enfermedades autoinmunes es bloquear los autoanticuerpos o bloquear las células T CD4+ que están implicadas en una citotoxicidad celular autoinmune. En una estrategia, se generan anticuerpos monoclonales humanos contra células CD4^{+} después de la fusión con la célula de trioma MFP-2. Las células de tetroma resultantes que producen anticuerpos anti-CD4 se usan para reducir o disminuir el nivel de células T CD4+, aliviando de esta manera el ataque celular autoinmune. En otra estrategia, se usa MFP-2 para generar células de tetroma capaces de producir anticuerpos anti-idiotípicos dirigidos contra autoanticuerpos específicos. Por ejemplo, la tiroiditis autoinmune es una disfunción autoinmune en la que hay un alto título de anticuerpos anti-tiroglobulina en el plasma de un paciente. Se aíslan linfocitos derivados de PBL a partir de estos pacientes para fusión con MFP-2. Las células de tetroma resultantes se seleccionan para determinar las que son capaces de producir anticuerpos con una respuesta inmune anti-idiotípica sustancial dirigida contra los autoanticuerpos reactivos con tiroglobulina. Estos anticuerpos anti-idiotípicos después se usan para modular la enfermedad autoinmune reduciendo o disminuyendo el nivel de anticuerpos anti-tiroglobulina. Esta estrategia puede usarse de forma autóloga o heteróloga. En una estrategia autóloga, las células productoras de anticuerpos anti-idiotípicos se identifican en sangre periférica del paciente a tratar, después se aíslan y se fusionan con MFP-2 y, después de la selección con respecto a anticuerpos anti-anti-tiroglobulina específicos, se administran de forma pasiva al paciente original. En una estrategia heteróloga, los anticuerpos anti-anti-tiroglobulina se administran a un paciente diferente.
Otras aplicaciones: Prevención del rechazo de órganos transplantados, coagulación sanguínea. Entre otras aplicaciones de anticuerpos monoclonales humanos, está la prevención del rechazo del transplante de órganos bloqueando las células T a través del marcador OKT-3 (anti-CD3). Los anticuerpos contra moléculas de adhesión (anticuerpos anti-integrina) también previenen la migración de células inmunes, que es importante, por ejemplo, en la artritis reumatoide. La coagulación sanguínea puede modularse, por ejemplo, en la isquemia cardiaca aguda después de una angioplastia coronaria, usando anticuerpos monoclonales humanos contra GPIIb/IIIa de plaquetas. La infusión intravenosa de inmunoglobulinas ayuda a neutralizar la agregación de plaquetas u otras células sanguíneas mediada por el receptor de Fc (por ejemplo, púrpura trombocitopénica).
Además, esta estrategia puede usarse para destoxificar o neutralizar la exposición a toxinas o a venenos. Estas exposiciones incluyen, pero sin limitación, mordeduras de serpiente, araña o sapo venenoso o picaduras de véspula o de escorpión. El antisuero de caballo usado actualmente para neutralizar el veneno de serpiente cascabel produce la enfermedad del suero en el 30% de los casos.
Hay una escasez de inmunoglobulina humana natural necesaria para estos tipos de tratamientos. El sistema de producción de anticuerpos monoclonales humanos descrito en este documento facilita la producción, in vitro, de cantidades ilimitadas de inmunoglobulinas humanas que pueden seleccionarse para ajustarse a la necesidad particular. Por ejemplo, en el caso de inmunoglobulina que bloquea los receptores de Fc, en lugar de tratar al paciente con la preparación de inmunoglobulinas reunida donde solo una pequeña fracción de las moléculas poseen las cualidades requeridas, puede producirse la preparación de inmunoglobulina de las moléculas con las propiedades requeridas usando el compañero de fusión descrito en este documento.
Discusión
Desde hace mucho tiempo ha existido la necesidad de anticuerpos monoclonales humanos para el diagnóstico, tratamiento y control de cánceres. Los intentos de emplear xenoanticuerpos en ensayos clínicos no han producido resultados prometedores. Los anticuerpos no humanos de ratones, por ejemplo, ocasionan la aparición de una respuesta inmune humana anti-ratón, la sensibilización a proteínas extrañas que puede producir finalmente una reacción anafiláctica, y la falta de un efecto biológico ya que las propiedades efectoras de los xenoanticuerpos pueden desacoplar los componentes del sistema inmune humano. Los anticuerpos monoclonales humanos tienen numerosas ventajas. Una de ellas es que los anticuerpos monoclonales humanos pueden identificar los antígenos asociados a los tumores (TAA) que son inmunogénicos solo en humanos, mientras que los xenoanticuerpos en la mayoría de los casos reconocen los antígenos y epítopos antigénicos que expresan inmunodominancia en un hospedador y a menudo son los epítopos con especificidad de tejido. Otra ventaja es la interacción bien desarrollada de los anticuerpos monoclonales humanos con los componentes efectores (tales como el complemento) del sistema inmune del hospedador. Además, la reacción alérgica y/o anafiláctica contra los anticuerpos monoclonales humanos inyectables es poco preocupante porque los anticuerpos monoclonales humanos son singénicos en seres humanos. Como alternativa, se ha intentado crear anticuerpos tales como anticuerpos quiméricos (parcialmente humanos y parcialmente murinos), donde la parte Fc de la inmunoglobulina murina se sustituyó por la IgG-Fc humana. Los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que se han injertado las regiones CDR de los anticuerpos murinos específicos. Se han creado anticuerpos humanos monocatenarios (Fc) en fagos usando bibliotecas de presentación de fagos. Un inconveniente de estas estrategias es que los anticuerpos resultantes no son naturales; no se han producido como parte de una respuesta inmune natural contra un cáncer o agente infeccioso.
El uso de las técnicas de hibridomas descritas en este documento y la disponibilidad de la línea celular compañera de fusión de trioma MFP-2 descrita en este documento facilita la identificación, inmortalización y expansión ex-vivo de células productoras de anticuerpos que se producen in vivo como resultado de respuestas inmunes humorales naturales contra un antígeno. Como estas células forman parte de la respuesta del sistema inmune natural, los anticuerpos producidos por estas células encajan con los otros componentes del sistema inmune y pueden proporcionar una respuesta biológica eficaz y específica.
Se han descrito varios antígenos específicos de cáncer de mama que son dianas potenciales para la inmunoterapia de cánceres, incluyendo HER2/neu, Mucina 1 y Mucina 2, p53, c-myc, antígenos sanguíneos T, Tn y sialil-Tn, la forma truncada de EGF, el antígeno Y de Lewis y otros. También se ha descrito la presencia de anticuerpos circulantes contra estos antígenos en pacientes con cáncer. (G. Moller, 1995). Los ganglios linfáticos son sitios importantes de estas células productoras de anticuerpo. Por medio del aislamiento de linfocitos de ganglios linfáticos (o sangre periférica) y de su inmortalización por fusión con el compañero de fusión de hibridoma humano MFP-2, pueden obtenerse híbridos (tetromas), que producen anticuerpos dirigidos contra antígenos asociados con cánceres. Como se ha descrito anteriormente, se identifican células productoras de anticuerpos monoclonales específicos y pueden producirse de una forma no restringida, ex-vivo (usando biorreactores, ratones SCID, etc.). Los anticuerpos pueden usarse terapéuticamente como inmunoterapia pasiva de forma autóloga en el mismo sujeto o heteróloga en un sujeto diferente. Incluso puede tratarse otro cáncer, siempre que haya un antígeno tumoral solapante.
El uso singénico o alogénico de un anticuerpo monoclonal humano puede ser muy eficaz ya que dicho anticuerpo puede infundirse muchas veces sin el riesgo o amenaza de desarrollar una respuesta inmune anti-xenogénica. Los anticuerpos infundidos, dependiendo de sus funciones efectoras, pueden iniciar la citolisis dependiente del complemento de las células tumorales diana, o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (por células NK o CTL), o proporcionar un efecto citotóxico directo por medio de apoptosis.
Sumario
Se obtuvo una sola línea celular compañera de fusión, MFP, que puede usarse para generar anticuerpos monoclonales humanos específicos. Estos anticuerpos monoclonales pueden basarse in vivo en una respuesta inmune natural contra agentes infecciosos, células cancerosas o una disfunción autoinmune, o pueden basarse in vitro por inmunización de células linfoides humanas in vitro.
Los métodos descritos en este documento para generar anticuerpos monoclonales específicos pueden usarse para proporcionar una inmunoterapia humoral adoptiva como un procedimiento autólogo o como un procedimiento heterólogo. Los linfocitos aislados de un paciente con cáncer o una enfermedad infecciosa se inmortalizan por fusión con MFP-2. Los tetromas resultantes, productores de anticuerpos dirigidos contra los antígenos respectivos, se seleccionan in vitro. Después de la selección, estas células productoras de anticuerpos se expanden y pueden producirse anticuerpos usando un biorreactor o un ratón con deficiencia inmune (por ejemplo, ratón desnudo o ratón SCID). Estos anticuerpos después pueden usarse para el tratamiento del donante original o como un procedimiento de inmunoterapia adoptiva autóloga o para el tratamiento de un sujeto diferente como un procedimiento de inmunología adoptiva heteróloga.
Los anticuerpos desarrollados también pueden aplicarse tanto a diagnósticos invasivos (formación de imágenes, inmunoescintografía) como a terapia (dirección de fármacos, radioinmunoterapia, citolisis dependiente del complemento, ADCC, citolisis apoptótica, etc.).
Esta estrategia también proporciona un método para la identificación de nuevos marcadores tumorales o nuevos antígenos de agentes infecciosos. El sistema inmune responde a las células cancerosas o agentes infecciosos produciendo anticuerpos dirigidos contra diferentes componentes de la formación extraña y puede reconocer diferentes neo-epítopos. La fusión de la inmunoglobulina reactiva con el antígeno o el agente infeccioso o reactiva con el tumor con MFP-2 puede usarse para identificar nuevos marcadores tumorales o antígenos infecciosos. Estos anticuerpos son importantes en el tratamiento contra cánceres o agentes infecciosos específicos, y en la generación de imágenes y técnicas de diagnóstico específicas. Los intentos previos de generar anticuerpos antitumorales o anti-infecciosos humanos requirieron una inmunización forzada o artificial de un sujeto con un antígeno purificado o aislado. En la presente invención, el antígeno puede ser desconocido; el material de partida para desarrollar anticuerpos es el conjunto de linfocitos inmunocompetentes que se desarrolló como parte de la respuesta inmune natural contra los antígenos extraños presentados en su forma natural y en su entorno natural in vivo. En una aplicación autóloga, puede realizarse una selección usando un tejido autólogo de interés (por ejemplo, biopsias de tumores) que aumentará las probabilidades de seleccionar el anticuerpo correcto. Además, pueden usarse glóbulos blancos y células plasmáticas sanguíneas autólogas para seleccionar anticuerpos citotóxicos del mismo donante.
De esta manera, el compañero de fusión de MFP (1) permite la fusión con linfocitos de sangre periférica produciendo altos niveles de híbridos; (2) permite la consideración de una inmunoterapia humoral adoptiva en una base individual (selección de los anticuerpos contra células tumorales o agentes infecciosos derivados del mismo donante del que se obtuvieron los linfocitos y el tratamiento autólogo del paciente); (3) permite la fusión con los linfocitos del donante sometidos a inmunización in vitro; (4) permite el uso de linfocitos congelados o linfocitos procedentes de plasmaféresis como fuente de células productoras de anticuerpos.
Procedimientos Experimentales
El compañero de fusión de hibridoma MFP-2 se desarrolló como una línea celular de trioma por fusión del heteromieloma no productor B6B11 con linfocitos humanos aislados del ganglio linfático paraclavicular.
Aislamiento de linfocitos. Se escindieron ganglios linfáticos paraclaviculares de un paciente al que se le había diagnosticado cáncer de tiroides metastásico durante la cirugía y se pusieron en medio de conservación estéril RPMI 1640 suplementado con L-glutamina (4 mM), aminoácidos no esenciales (solución madre 100X), vitaminas (solución madre 100X), piruvato sódico (1 mM) y Gentamicina (concentración 2x). El tejido de ganglio linfático se transfirió a una placa TC de cultivo de tejidos de 100 mm en el mismo medio y se fragmentó suavemente con tijeras y pinzas. El tejido fragmentado se pasó a través de una tamiz metálico (malla 50) usando una mano de mortero de vidrio. La suspensión se transfirió a tubos cónicos estériles de 15 ml que contenían medio de separación de linfocitos (Histopaque 1.077 Sigma) como una capa subyacente en una relación de 2:1 (suspensión de linfocitos:Histopaque). Después de la centrifugación a 400 X g durante 20 minutos, se formó un anillo opaco en el borde entre las capas. Los glóbulos rojos (RBC) estaban presentes como un sedimento en la parte inferior del tubo. Si no estaban presentes RBC en la suspensión de linfocitos de partida (que es una situación bastante normal en el caso de los ganglios linfáticos), podía eliminarse la etapa de separación. El anillo opaco que contenía linfocitos se recogió cuidadosamente usando una pipeta Pasteur y se diluyó 10 veces con RPMI 1640 sin suero regular. Las células se centrifugaron a 300 X g durante 10 minutos y se lavaron dos veces con medio.
La suspensión de linfocitos final se diluyó con medio y las células se contaron usando Azul Tripán al 0,05%. La viabilidad celular después del aislamiento normalmente era de 95%. El rendimiento total era de aproximadamente 4 X 10^{7} células.
Preparación de B6B11. El heteromieloma B6B11 se cultivó en RPMI 1640 con suero bovino cósmico al 10% (Hyclone), y una serie convencional de suplementos (L-Glu, aminoácidos no esenciales 4 mM, vitaminas, piruvato sódico) sin antibióticos. Antes de la fusión, las células se cultivaron en presencia de 8-Ag (20 (\mug/ml) para evitar la reversión de las células sensibles a HAT al tipo silvestre. Las células se cultivaron a una densidad de 10% en fase de crecimiento logarítmica.
Fusión celular. Tanto las células B6B11 como los linfocitos de ganglios linfáticos se lavaron tres veces por centrifugación a 300 X g durante 5 minutos para retirar cualquier proteína residencial en el medio. Las células se mezclaron a una relación de 5:1 (linfocito:mieloma) y se centrifugaron a 300 X g durante 10 minutos. El sobrenadante se retiró de forma cuidadosa y completa y el sedimento se "aspiró" suavemente y se añadieron 100 \mul de solución de PEG/DMSO calentada a temperatura ambiente a la mezcla celular que se agitó suavemente durante 3 minutos. Después se añadieron 15 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y PBS (1:1) (de una solución madre 10x, Cellgro) como se indica a continuación: 10 ml lentamente en 10 minutos, y después 5 ml durante 5 minutos, después 10 ml de medio completo (medio para el cultivo de células) durante 5 minutos y finalmente 5 ml durante 1 minuto. El volumen total fue de 30 ml. Después, se añadieron 600 \mul de solución HT (de solución madre 10x) y 1 gota (aproximadamente 20-30 \mul) de DMSO al tubo. La suspensión celular se mezcló en un tubo, se transfirió a una placa Petri (100x 15) y se incubó en un incubador de CO_{2} a 37ºC durante una noche. Después, las células se recogieron, se sedimentaron a 300 X g durante 10 minutos y se resuspendieron en medio completo suplementado con solución de HAT y solución de HT (ambas procedentes de una solución madre 50X) y después se cultivaron en placas de 96 pocillos en un volumen de 200 \mul a aproximadamente 250.000 células por pocillo. Dos veces por semana, 50% de los medios se reemplazaron por medio nuevo. Las células se cultivaron en presencia de HAT y HT durante 14-20 días antes de la selección con respecto a la producción de anticuerpos.
Selección ELISA de inmunoglobulina no específica. Las placas ELISA se recubrieron con IgG policlonal de cabra anti-humana (con especificidad de Fc) (Sigma), IgM de cabra anti-humana (específica de \mu) (Sigma) o cadenas H de Ig(G+M+A) de cabra anti-humana (Sigma) en 100 \mul de tampón de cultivo en placa (carbonato sódico 0,1 M, pH 9,0) a 100 ng por pocillo. Las placas se sellaron con Parafilm o con cubiertas de cierre hermético y se incubaron durante una noche a 4ºC. El antígeno se retiró por lavado con agua destilada dos veces. Se retiraron gotas residuales de agua y se añadieron 200 \mul de solución de bloqueo (leche desnatada y deshidratada al 0,4% en PBS) a los pocillos. El medio de cultivo celular completo sirvió como control negativo. Como control positivo se usó suero humano (1:2000). Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente o durante una noche a 4ºC. Las placas se lavaron cuatro veces con agua destilada y se añadieron a los pocillos anticuerpos secundarios (iguales que los anticuerpos de captura pero conjugado con HRP) diluidos en leche al 0,4%/PBS a 1:2000. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, los pocillos se lavaron cuatro veces con H_{2}O y se añadió sustrato de peroxidasa (ortofenilendiamina en tampón fosfato-citrato con peróxido) a las placas. La reacción de color se detuvo añadiendo 20 \mul de ácido sulfúrico al 10%. La lectura colorimétrica se realizó en un lector Multiscan a A_{492}. Las muestras que presentaron un aumento de al menos tres veces con respecto al nivel de fondo se consideraron células productoras de inmunoglobulina.
Ensayo para la presencia intracelular (sin secreción) de inmunoglobulinas o sus cadenas individuales. Las células que no secretaron inmunoglobulina en el medio de cultivo del sobrenadante se ensayaron con respecto a la presencia de material inmunorreactivo con inmunoglobulina intracelular. Se recubrieron placas ELISA con cadena kappa de cabra anti-humana (Sigma), cadena lambda de cabra-anti-humana (Sigma) e IgH de cabra anti-humana (G,M,A) como se ha descrito anteriormente. Las células se cultivaron en matraces de 75 cm^{2} a una densidad de 10^{6} células por ml, se recogieron y se lavaron 3 veces con HBSS. Las células se resuspendieron en PBS y se rompieron por sonicación (8x15 segundos a 25 MHz en hielo). La suspensión se centrifugó durante 15 minutos a 10.000 X g y el sobrenadante se usó para el ensayo de inmunoglobulinas. Se usó un equivalente de 2 X 10^{6} células. Como control negativo se usaron fibroblastos de ratón 3T3 a la misma cantidad de proteína equivalente. El resto del protocolo fue como se ha descrito anteriormente para el ensayo de sobrenadantes de hibridoma. Los clones que mostraron una señal igual a las células de control o menor se eligieron como candidatos potenciales para la fusión con linfocitos de sangre periférica humana. Estos clones de trioma se diseñaron como series de moléculas de fusión modificadas (MFP-S) y se numeraron secuencialmente (MFP-1, MFP-2, MFP-3, etc.). Se seleccionaron seis triomas no productores y no secretores para el análisis adicional.
Selección de mutantes de MFP resistentes a 8-Ag. Para usar las células de trioma MFP como compañeros de fusión, las células MFP se pusieron en medio completo que contenía cantidades crecientes de 8-Ag. La resistencia a 8-Ag se determina por la enzima HGPRT impedida o su ausencia. Por lo tanto, la selección se centró en células que sobrevivieron en presencia de 8-Ag. Después de 5 a 10 pases a las menores concentraciones de 8-Ag (5 \mug/ml), los supervivientes se cultivaron en medio con una mayor concentración (10 \mug/ml). Esto se repitió hasta que se alcanzó una concentración de 20 \mug/ml. Después de 5-6 pases en presencia de 8-Ag (20 \mug/ml), las células se ensayaron con respecto a su viabilidad en medio HAT. Ninguna de las células cultivadas en 8-Ag sobrevivió después de 3 días de cultivo en presencia de HAT.
Eficacia de fusión. Los clones de MFP se ensayaron con respecto a la capacidad de fusionarse con linfocitos de ganglio linfático y PBL. MFP-2 produjo aproximadamente 2-3 híbridos x 10^{5} linfocitos de ganglio linfático y 0,7-1,5 híbridos por 10^{5} PBL. La proporción de secreción de inmunoglobulina para los híbridos creados usando MFP-2 variaba entre 0,5 y 15 \mug/ml sin disminución durante 7 meses.
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Segunda serie de experimentos
1.
La línea celular de trioma MFP-2 usada para la fusión con linfocitos B de sangre periférica humana y linfocitos B de ganglio linfático humano también puede usarse para la fusión con sangre periférica humana y células T de ganglio linfático, produciéndose híbridos estables.
2.
La línea celular de trioma MFP-2 puede usarse para la fusión con linfocitos de sangre periférica y de ganglio linfático de dos especies de primate: mono rhesus (Macaque mulatta) y babuino (Papio hamadryas) produciendo híbridos productores de inmunoglobulina de mono. Esto tiene una posible aplicación para el desarrollo de anticuerpos monoclonales de mono contra diferentes agentes infecciosos para ensayarlos en modelos de primate.
3.
La línea celular compañera de fusión de trioma MFP-2 se adaptó al cultivo en medio sin proteínas con unas características de crecimiento no diferentes de las obtenidas cuando se cultivaba en medio que contenía suero o sin suero (medio suplementado con proteínas).
4.
Se dedujo que, como MFP-2 puede cultivarse en medio sin proteínas, los hibridomas obtenidos serían relativamente fáciles de adaptar al mismo medio sin proteínas.
5.
Cuatro de seis hibridomas se adaptaron satisfactoriamente a medio sin proteínas sin cambiar las características de crecimiento y sin perder la producción de anticuerpos. Esta característica de MFP-2 se suma a la ventaja de esta línea celular en el desarrollo de hibridomas capaces de crecer en medio sin proteínas.
6.
Se han desarrollado 27 hibridomas humanos, productores de anticuerpos monoclonales humanos contra antígenos asociados con mama y próstata, usando MFP-2 y linfocitos B de ganglio linfático y de sangre periférica procedentes de pacientes con cáncer de mama y próstata.
7.
23 hibridomas humanos proceden de pacientes con cáncer de mama y 4 proceden de pacientes con cáncer de próstata.
8.
Hibridomas derivados de cáncer de próstata:
1.
El hibridoma (32-BB) produce IgM, anticuerpo lambda que reacciona específicamente con dos líneas celulares de adenocarcinoma de próstata humano y con una línea celular de adenocarcinoma de mama humano y se dirige a un antígeno desconocido que con mucha probabilidad tiene una naturaleza no proteica (la transferencia de Western es negativa, aunque puede ser que el antígeno sea una proteína pero el determinante antigénico sea conformacional y lábil).
2.
El hibridoma (32-F6) también produce IgM, anticuerpo lambda reactivo con células de adenocarcinoma de próstata y de mama y que reconoce el antígeno proteico con un peso molecular de 60 kDa.
3.
El hibridoma (39-A7) también es IgM, anticuerpo lambda dirigido a una diana proteica desconocida específica para el adenocarcinoma de mama y de próstata.
4.
El hibridoma (50-1B3) produce IgM, anticuerpo kappa dirigido contra adenocarcinoma de mama y de próstata a una diana molecular de naturaleza desconocida.
9.
Los hibridomas asociados con cáncer de mama son los siguientes:
1.
El hibridoma (13-42), IgM, kappa reconoce el antígeno proteico con un peso molecular de \sim42 kDa que está presente tanto en la superficie como dentro de la célula de adenocarcinoma (de mama y de próstata) pero no en los fibroblastos normales humanos.
2.
El hibridoma (13-74), IgM, kappa reacciona con el antígeno proteico de \sim65 kDa específico para las células de adenocarcinoma de mama y expresado en la superficie celular así como intracelularmente.
3.
El hibridoma (13-82), IgM, kappa es reactivo con el antígeno proteico intracelular específico sólo para células de adenocarcinoma de mama y de próstata pero no para fibroblastos cutáneos humanos.
4.
El hibridoma (13-2C1), IgM kappa es reactivo con una proteína de \sim100 kDa que está presente tanto en adenocarcinoma como en fibroblastos normales.
5.
El isotipo del hibridoma (22-3E9) no está determinado, reconoce varias dianas proteicas (que pueden estar relacionadas) de peso molecular 35, 45 y 250 kDa que están presentes tanto en adenocarcinoma como en fibroblastos. El antígeno está principalmente en la superficie de las células. Reacciona específicamente con lesiones cancerosas primarias.
6.
El hibridoma (22-6E7), IgM, lambda, el antígeno se desconoce, el anticuerpo es reactivo sólo con células de adenocarcinoma de mama en cultivo.
7.
El hibridoma (22-8D11), IgM, lambda, el antígeno es desconocido, reacciona con células de adenocarcinoma humano de mama y de próstata en cultivo.
8.
El hibridoma (27-F7), IgM, kappa, reacciona sólo con células de adenocarcinoma de mama en cultivo. El antígeno es una proteína de interacción con TAX 2 con un peso molecular de aproximadamente 35-40 kDa.
9.
El hibridoma (27-B1), al igual que 27-F7, muestra una alta reactividad específica con las lesiones cancerosas de tumores primarios, ausencia de reactividad con el tejido conjuntivo o con células epiteliales mamarias normales.
10.
El isotipo del anticuerpo del hibridoma (36-G7) no se ha determinado; la especificidad es igual que la de 27-B1.
11.
El hibridoma (27-F10), IgG, lambda, reactivo con la proteína de aproximadamente 200 kDa en células de adenocarcinoma de mama.
12.
El hibridoma (33-2F10), IgM, kappa, se desconoce el antígeno, reactivo con células de adenocarcinoma de mama.
13.
El hibridoma (33-2H6), IgM, lambda, reconoce una proteína de 65 kDa de células de adenocarcinoma de mama y de próstata, pero no de fibroblastos cutáneos humanos.
14.
El hibridoma (59-3G7), IgM, lambda, es reactivo con una proteína de 70 kDa lamina A o C de células de adenocarcinoma. No se ha ensayado la reactividad cruzada con otras células.
15.
El hibridoma (59-2F6), IgG, lambda, reacciona sólo con células de adenocarcinoma de mama con antígeno desconocido.
16.
El hibridoma (69-C12), IgM, kappa, reactivo principalmente con células de adenocarcinoma de mama dirigidas a una proteína de 50 kDa.
17.
El hibridoma (76-2F6), IgM, lambda, reactivo con un antígeno desconocido sólo en células de adenocarcinoma de mama.
18.
El hibridoma (83-3A6), isotipo no determinado, reactivo sólo o con células de adenocarcinoma de mama.
\newpage
19.
El hibridoma (85-E1), IgM, lambda, reactivo sólo con células de adenocarcinoma de mama que expresan Her2/neu; antígeno aún no identificado.
20.
El hibridoma (88-1D8), isotipo aún no determinado, reconoce antígenos proteicos en células de cáncer de mama; los pesos moleculares varían - 70, 90 y 100 kDa.
21.
El hibridoma (89) de isotipo no determinado, reactivo sólo con células de adenocarcinoma negativas para Her2/neu; el antígeno no se conoce.
22.
El hibridoma (100-1F4), IgM, kappa, sólo reactivo con células de adenocarcinoma de mama; el antígeno no se conoce.
23.
El hibridoma (100-2H3) similar a 100-1F4.
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Tercera serie de experimentos Ejemplo I Desarrollo de Anticuerpos Monoclonales Completamente Humanos Introducción
La presente invención comprende una sola línea celular compañera de fusión que se fusiona con linfocitos humanos derivados de ganglios linfáticos, bazo, amígdalas o sangre periférica. Se ha demostrado que los híbridos resultantes son productores estables de sustancias inmunes humanas denominadas inmunoglobulinas y representan una fuente fiable de anticuerpos humanos para inmunoterapia. Usando esta línea celular compañera de fusión, que se denominó MFP-2, se han desarrollado varios anticuerpos monoclonales con reactividad específica hacia cáncer de mama y de próstata humano
Resultados Tecnología de hibridoma
Se desarrollaron anticuerpos monoclonales completamente humanos (fhMAb) por medio de la tecnología de hibridoma usando la línea celular compañera de fusión patentada MFP-2 y linfocitos de ganglio linfático (LNL) humanos aislados a partir del ganglio linfático de una paciente del sexo femenino con cáncer de mama en estadio IV que se sometió a mastectomía y linfadenectomía. La fusión de MFP-2 con LNL produjo varios clones productores de anticuerpos específicamente reactivos con líneas celulares de cáncer de mama establecidas SK-BR-3, MCF-7 y ZR-75-1. Dos de los anticuerpos denominados 27.F7 y 27.B1 reaccionaron específicamente con la diana proteica de estas células con un peso molecular de aproximadamente 43 kD, como se demostró por el análisis de transferencia de Western de los lisados celulares tanto en condiciones reducidas como en condiciones no reducidas. Las líneas celulares de hibridoma se adaptaron al crecimiento en medio sin suero alcanzando la densidad de 1,5x10^{6} células por ml en matraces/placas TC en la fase estacionaria. La línea celular 27.F7 también pudo cultivarse en un biorreactor de fibras huecas alcanzando la densidad de 20-25x10^{6}/ml y la línea celular 27.B1 se cultivó eficazmente en matraces giratorios. La producción de los anticuerpos fue 17 \mug/ml/10^{6} células/24 horas para 27.F7 y 49 \mug/ml/10^{6} células/24 horas para 27.B1. Los dos anticuerpos eran IgM, \kappa. Para estudios adicionales de la diana molecular para estos anticuerpos, las células se cultivaron en cantidades usando medios sin suero y la purificación se realizó usando cromatografía de exclusión molecular de Sephacryl^{TM} S-200 (Ata Resolución) donde la IgM aparecía en el volumen muerto.
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Ejemplo II Unión de Anticuerpos a Líneas de Células Cancerosas
Los anticuerpos producidos reaccionaban tanto con las líneas de células cancerosas humanas como con los tejidos tumorales primarios. Se identificaron dianas antigénicas para algunos de estos anticuerpos. Dos anticuerpos, 27.F7 y 27.B1, se dirigían al mismo antígeno, que se identificó como la proteína de interacción con Tax, clon 2 (TIP-2). Los anticuerpos 27.B1 y 27.F7 fueron reactivos con tres líneas de células cancerosas de mama humanas: MCF-7, SK-BR-3 y ZR-1-75, tienen una reactividad muy pequeña o nula con células de cáncer de próstata humanas y negativa con fibroblastos humanos.
Resultados Ensayo Elisa
El ensayo ELISA celular demostró la unión de 27.F7 y 27.B1 a líneas de células cancerosas de mama humanas de una manera específica y la falta de unión a piel humana o fibroblastos normales.
Citometría de Flujo
Los estudios de citometría de flujo revelaron que la diana antigénica es accesible en la superficie de células vivas así como en el citosol de células fijadas con formaldehído. Sin embargo, el patrón de unión del anticuerpo a las células fue diferente, indicando que estos anticuerpos probablemente reconocen diferentes epítopos de un solo antígeno. El anticuerpo 27.B1 reaccionaba con la superficie de las células cancerosas de mama SK-BR-3 y MCF-7 y no reaccionaba con células de cáncer de próstata vivas PC-3 y LNCaP ni con fibroblastos humanos vivos (Fig. 7). Sin embargo, cuando se usaron células fijadas con formaldehído en el análisis de citometría de flujo, se demostró que el anticuerpo 27.B1 reaccionaba con líneas celulares de cáncer de mama y con células de cáncer de próstata LNCaP, aunque era negativo para fibroblastos humanos. El anticuerpo 27.F7 mostró un patrón de reactividad diferente: reaccionaba con los fibroblastos primarios fijos, aparentemente con algún epítopo intracelular. Se usaron lisados celulares preparados a partir de tres líneas celulares de cáncer de mama (SK-BR-3, MCF-7 y ZR-75-1), tres líneas celulares de cáncer de próstata (LNCaP, PC-3 y Du-145) y dos líneas celulares de fibroblastos humanos (Hs556.Sk y Hs143.We)
Transferencia de Western
El análisis de transferencia de Western demostró que los dos anticuerpos 27.F7 y 27.B1 reaccionaban con la proteína de aproximadamente 43 kD que aparece en una mancha de transferencia como una banda doble. Esta proteína se expresa profundamente en las tres líneas celulares de cáncer de mama, no se expresa en las dos líneas celulares de fibroblastos humanos y se expresa muy débilmente en células de cáncer de próstata PC-3 y Du-145. Las células LNCaP expresan un nivel despreciable o muy bajo de esta proteína (Fig. 8).
Estudios Inmunocitoquímicos e Histoquímicos
Los estudios inmunocitoquímicos e histoquímicos realizados usando líneas celulares humanas establecidas y lesiones metastásicas primarias de tejidos tumorales de varios pacientes con cáncer de mama y de próstata demostraron un patrón muy específico de inmunotinción de células de cáncer de mama y de próstata (Fig. 9), tumores primarios (Fig. 10, 11, 12 y 13) y lesiones metastásicas en los ganglios linfáticos (Fig. 14). Tanto los tejidos tumorales recién congelados como los fijados fueron positivos cuando se inmunotiñeron con anticuerpos 27.B1 y 27.F7 (Fig. 15). De los 10 casos de cáncer de mama ensayados en inmunohistoquímica con fhMAb 27.B1, los 10 fueron positivos mientras que el número correspondiente de muestras epiteliales de mama normal dieron un resultado negativo. Aparte de estos dos tipos de cáncer, también se observó una tinción positiva de cáncer de mama masculino y seminoma (Fig. 16).
De otros tejidos ensayados con respecto a la presencia de inmunorreactividad 27.B1/27.F7, tales como la mucosa de colon normal, cáncer de colon, cáncer renal, glomérulos renales normales, hígado normal y tejidos pulmonares tanto normales como cancerosos, todos fueron negativos (Fig. 17). Al mismo tiempo, la inmunotinción del epitelio de mama normal, ganglios linfáticos no afectados e hiperplasia prostática benigna fue negativa. Esto sugiere la especificidad de cáncer de mama/próstata para estos fhMAbs.
Discusión
Dos de los anticuerpos desarrollados, tanto IgM como kappa, son reactivos con un antígeno con especificidad de cáncer denominado GIPC o TIP-2. GIPC representa la proteína de interacción GAIP (proteína de interacción con Ga, regulador de la señalización G), dominio C, y TIP-2 se refiere a la proteína de interacción con Tax, clon 2. La presencia de esta proteína se asoció sólo con células de cáncer de mama, mientras que las células de cáncer de próstata tenían una cantidad muy pequeña o nula. Los fibroblastos humanos fueron negativos con respecto a la presencia del antígeno GIPC/TIP-2. El análisis de Scatchard del número de copias del antígeno TIP-2 en células SK-BR-3 (células positivas para TIP-2) reveló aproximadamente 300.000 copias por célula. Los estudios de inmunohistoquímica descubrieron que tanto 27.F7 como 27.B1 tiñen positivamente tres tipos principales de cáncer de mama: lobular invasivo, ductal invasivo, y adenocarcinoma in situ. Estos anticuerpos también tiñen el cáncer de próstata, mientras que el epitelio de mama normal y la hiperplasia prostática benigna (BPH) eran negativos. Los anticuerpos también eran negativos en tejido pulmonar normal y canceroso, mucosa de colon normal y cáncer de colon y tejido renal normal y canceroso. Por lo tanto, el marcador GIPC/TIP-2 es un marcador inmunohistoquímico valioso para la evaluación histopatológica de la muestra de tejido canceroso.
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Ejemplo III Identificación del Antígeno
Basándose en los anticuerpos descritos anteriormente, se ha identificado un nuevo antígeno asociado con tumores específico para el adenocarcinoma de mama y de próstata como GIPC (Proteína de Interacción con Tax 2). El método usado para identificar este nuevo antígeno asociado a tumores fue SEREX (análisis serológico de antígenos por clonación de expresión recombinante o respuestas de anticuerpo espontáneas a antígenos asociados con tumores) (SErological analysis of antigens by REcombinant EXpression cloning or spontaneous antibody responses to tumor-associated antigens) (Fig. 20). Este método se desarrolló originalmente en el Instituto Ludwig para identificar dianas proteicas específicas para los anticuerpos encontrados en el plasma o suero de pacientes con cáncer (1). La invención describe una proteína de 43 kDa que pertenece a las denominadas proteínas que contienen el dominio PDZ. Los dominios PDZ son motivos proteicos de 80-100 aminoácidos donde una característica distintiva es el consenso repetido de GLGF. El dominio PDZ (denominado posteriormente proteína de densidad postsináptica de mamífero PSD-95, proteína Dlg grande de disco de Drosophila y una proteína de unión estrecha de mamífero ZO-1) se encuentra en más de 50 proteínas, que en su mayor parte parecen no estar relacionadas entre sí. Estas proteínas están implicadas comúnmente en redes de señalización tales como las rutas de señalización mediadas por la proteína G. Se encuentran dominios PDZ, por ejemplo, en moléculas de señalización tales como Dlg, óxido nítrico sintasa (NOS), proteína tirosina fosfatasa, guanilato quinasas asociadas a la membrana (MAGUK), y similares.
La mayoría de las proteínas que contienen el dominio PDZ están asociadas con el citoesqueleto y aparentemente están implicadas con la formación de complejos proteicos multiméricos (2,3). La única proteína que contiene el dominio PDZ asociada con el cáncer de colon humano se describió por Scanlan et al. (4,5). Este antígeno, NY-Co-38/PDZ-73, se identificó a través de autoanticuerpos IgG desarrollados en pacientes con cáncer de colon. Los mismos autores también describieron algunas isoformas con especificidad de tejido de PDZ-73, que parecen ser formas truncadas que contienen uno o dos dominios PDZ (la forma PDZ-73 original tiene tres dominios). La función de estas proteínas no se conoce, aunque lleva la similitud estructural con la familia de proteínas MAGUK. Se cree que el dominio PDZ, aunque su función particular no está clara, participa en la interacción proteína-proteína y en la formación de grandes redes proteicas.
TIP-2 se identificó recientemente por Rousset et al. (1) como una de 6 proteínas celulares de función desconocida que interaccionan con el extremo C de la oncoproteína Tax a través de su dominio PDZ. Como el motivo C-terminal S/TXV es importante para la interacción con el dominio PDZ, se dedujo que la oncoproteína Tax conserva la interacción con TIP-2 aunque se haya reemplazado la valina crítica C-terminal, por ejemplo, por alanina, mientras que todas las demás proteínas que contienen el dominio PDZ de unión a Tax pierden su potencial de unión.
Resultados
TIP-2 se identificó por selección de anticuerpos derivados de células B de pacientes con cáncer de mama en un biblioteca de expresión de ADNc preparada a partir de la línea celular de cáncer mama humana SK-BR-3. En resumen, se aisló ARN poli(A)+ a partir de las células, se transcribió en ADNc y se unió al fago pseudolítico lambda, dando como resultado aproximadamente 5x10^{5} recombinantes. El fago se amplificó en E. coli Y1090 y después transfirió a membranas de nitrocelulosa, que se trataron con anticuerpos humanos. Después de la exposición a los anticuerpos, las membranas se trataron con anticuerpos policlonales anti-cadena u de conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante. Los clones de ADNc positivos se convirtieron en formas plasmídicas por escisión in vivo, y el ADN plasmídico se purificó y se sometió a un análisis de la secuencia. La secuencia resultante se sometió a una búsqueda de homología usando una base de datos del Gene Bank. Se desarrollaron dos anticuerpos monoclonales humanos (27.F7 y 27.B1) a partir de células B de ganglio linfático de pacientes con cáncer de mama y se identificaron como anticuerpos reactivos con TIP-2 - sin embargo, aparentemente con diferentes epítopos.
Uno de los anticuerpos, 27.F7, se produjo en un biorreactor en grandes cantidades y se usó para la inmunoprecipitación de TIP-2 a partir del lisado de células SK-BR-3. El precipitado produjo 2 bandas con el peso molecular característico de TIP-2 y correspondientes a las bandas reconocidas por anticuerpos anti-TIP-2 en la transferencia de Western de lisados celulares. La tira de membrana de nitrocelulosa que contenía bandas de TIP-2 se implantó por vía subcutánea en ratones Balb/C para inmunizarlos. Después de dos implantaciones, los ratones desarrollaron una respuesta inmune significativa a TIP-2 según se demostró por análisis de transferencia de Western de los sueros de ratones frente a los lisados de células SK-BR-3 (Fig. 21 y 28). El suero inmune de estos ratones fue positivo en inmunohistoquímica de tejidos tumorales reales (Fig. 23). Estos ratones se usarán para un desarrollo adicional de anticuerpos monoclonales de ratón anti-TIP-2.
Usando fhMAb27.F7 se realizó una estimación de su afinidad y también del número de moléculas de TIP-2 sobre la superficie de SK-BR-3. Se descubrió que hay dos subseries de moléculas TIP-2 (que corresponden a los datos de la transferencia de Western) que tienen diferente afinidad por 27.F7. Una subserie (isoforma) de TIP-2 está presente a aproximadamente 60.000 copias por célula y se une a 27.F7 con la K_{a}=4,2x10^{11} M^{-1} y otra está presente a 230.000 copias por célula con la K_{a}=3,3x10^{9} M^{-1} (Fig. 24). El análisis de transferencia de Western usando lisado de células cancerosas de mama humana así como lisados de tumor primario demostró una fuerte expresión de TIP-2 en todas las lesiones tumorales y ninguna indicación de este antígeno en epitelios de mama normales no afectados (Fig. 25). Estos datos fueron coherentes con los estudios de inmunohistoquímica de la sección tisular de los mismos casos clínicos (datos no mostrados).
Acoplamiento de 27.F7 a Liposomas
Para explorar la posibilidad de usar el anticuerpo anti-TIP-2 como vector para la administración de liposomas, se ensayaron algunos métodos diferentes del acoplamiento de 27.F7 a liposomas. Dado el hecho de que los anticuerpos eran IgM, \kappa, eran de esperar problemas de isotipo con la química de acoplamiento de IgM a liposomas. Uno de los protocolos resultó ser el más eficaz produciendo una alta relación de acoplamiento de anticuerpo a los liposomas y conservando el anticuerpo intacto y reactivo con TIP-2 como se ha demostrado por transferencia de Western (Fig. 26).
Identificación de TIP-2 en Pacientes con Cáncer de Mama
También se intentaron realizar experimentos para identificar TIP-2 en suero o plasma de pacientes con cáncer de mama. La base lógica para esta suposición es que como TIP-2 se expresa en la superficie de las células, alguna parte de él puede ir a la circulación o incluso si esto no ocurre, puede aparecer en el suero de los pacientes con la enfermedad en un estadio avanzado como resultado de la necrosis del tumor o como resultado de un tratamiento quimioterapéutico. Como no hay ningún ensayo ELISA para esta prueba, se ensayaron sueros de pacientes con respecto a TIP-2 usando transferencia de Western de la muestra de suero entera y fhMAb27.F7 como marcador. Este método no funcionó debido a un problema técnico: la abundancia de albúmina de suero humano (HSA) en suero humano enmascara la región del gel en el que sería de esperar que se localizara TIP-2. Añadiendo a la muestra de suero el lisado celular SK-BR-3 (que contenía TIP-2) se demostró que TIP-2 podía identificarse tanto en suero humano como en plasma humano por transferencia de Western. Para realizar la identificación de TIP-2 en suero se realizó un fraccionamiento en alcohol por etapas del suero humano con adiciones del lisado de células SK-BR-3 para identificar la concentración de alcohol suficiente para precipitar TIP-2. Se demostró (Fig. 27) que TIP-2 puede precipitar completamente por alcohol al 10%, mientras que la HSA y las inmunoglobulinas (la proteína principal constituyente del suero humano) aún permanecían en la solución. Esto puede llevar a la identificación de TIP-2 en suero usando la transferencia de Western de una forma más fácil. Un ensayo inmunoenzimático de dos sitios, usando anticuerpos de ratón de la alta afinidad, proporcionaría otra manera de identificación del antígeno TIP-2.
Discusión
Una de las dianas que aparecía es el dominio PDZ que contenía proteína localizada tanto en el citosol como en la membrana celular de células cancerosas de mama humanas. Esta proteína, denominada GIPC o TIP-2 (proteína de interacción con Tax, clon 2), está implicada en el tráfico de vesículas y en la formación de redes proteicas. Tiene varias propiedades tales como la capacidad de unirse a la proteína de interacción con RGS-Ga, dominio C, capacidad de unión al oncogén tax de HTLV-1 y capacidad de unión a la a-actinina y al transportador de glucosa 1. Aunque no se conoce en papel fisiológico preciso de esta proteína, muestra una sobreexpresión consistente en células de cáncer de mama, con una expresión insignificante, si presenta alguna, en células de cáncer de próstata, y sin expresión en fibroblastos humanos. GIPC/TIP-2 es una proteína de 42 kDa que está presente en una transferencia de Western en forma de un doblete, probablemente porque tiene dos fases de lectura abierta en su extremo N. El número de copias por célula cancerosa de mama humana SK-BR-3 es bastante alto, de aproximadamente 300.000 copias por célula. Dos anticuerpos completamente humanos a través de los cuales se identificó este antígeno pertenecen al isotipo de IgM y tienen diferente especificidad de epítopo. Uno de los anticuerpos, 27.B1, tiene una inmunorreactividad significativa con la superficie de células positivas para TIP-2, mientras que otro, 27.F7, sólo reacciona con las células fijas, es decir, intracelularmente. 27.B1 también expresa una profunda capacidad de internalización, mientras que 27.F7 no lo hace. El ensayo de 27.B1 con respecto a su efecto biológico en presencia y ausencia del complemento reveló que este anticuerpo puede producir el efecto citolítico/citostático celular sin el complemento. Lo más probable es que el mecanismo de este efecto sea una apoptosis.
La proteína identificada aquí se describió recientemente como GIPC (Proteína de Interacción con GAIP, extremo C), una proteína que se une a través de su dominio PDZ al motivo C terminal de las proteínas diana (6). En este caso, la proteína diana es GAIP (Proteína de Interacción con G_{ai3}), una proteína RGS (Reguladores de la Señalización G) anclada a la membrana, que interacciona con la subunidad a_{i3} de la proteína G y potencia su actividad GTP-asa, facilitando la desactivación de la proteína G (Fig. 18, 19) (7). GIPC es la única proteína descrita hasta la fecha que se une al extremo C de GAIP. El significado funcional de esta interacción no se conoce. Recientemente, Rousset et al. (8) aislaron un ADNc de GIPC incompleto usando la proteína transactivadora Tax de HTLV-1 como cebo. Llamaron a esta forma de GIPC TIP-2 por Proteína de Interacción con Tax (Tax Interacting Protein), clon 2, y demostraron que esta forma interacciona eficazmente con el extremo C de la oncoproteína Tax. La oncoproteína Tax no es la única oncoproteína que se une al dominio PDZ a través de su extremo C. La oncoproteína E6 del virus del papiloma humano (HPV) (9) y la oncoproteína E4 del adenovirus D de tipo 9 (Ad9) también tienen motivos C terminales que se unen al dominio PDZ (10). Esta unión podría ser un mecanismo subyacente en el desarrollo de cánceres asociados a HPV o como en el caso de la oncoproteína E4 de tumores mamarios (Ad9 es excepcional en la inducción de tumores mamarios sólo dependientes de estrógenos en ratas hembra [11]). En el caso de las tres oncoproteínas, la región C terminal es crucial para inducir el potencial de transformación (8,9,10). Como el motivo C-terminal S/TXV es importante para la interacción con el dominio PDZ; se dedujo que la oncoproteína Tax conserva la interacción con TIP-2 aunque se reemplace la valina C terminal crítica, por ejemplo, con alanina, mientras que todas las demás proteínas que contienen el dominio PDZ al unión a Tax pierden su potencial de unión. TIP-2 se identificó por selección de anticuerpos derivados de células B de pacientes con cáncer de mama en una biblioteca de expresión de ADNc preparada a partir de la línea de células de cáncer de mama humano SK-BR-3. En resumen, se aisló ARN poli(A)+ a partir de las células, se transcribió en ADNc y se unió al fago pseudolítico lambda, dando como resultado aproximadamente 5x10^{5} recombinantes. El fago se amplificó en E. coli Y1090 y después se transfirió a membranas de nitrocelulosa, que se trataron con anticuerpos humanos. Después de la exposición a los anticuerpos, las membranas se trataron con anticuerpos policlonales de conejo anti-cadena u conjugados con peroxidasa de rábano picante. Los clones de ADNc positivos se convirtieron en formas plasmídicas por escisión in vivo, y el ADN plasmídico se purificó y se sometió a un análisis de la secuencia (Fig. 8). La secuencia resultante se sometió a una búsqueda de homología usando una base de datos del Gene Bank. Dos anticuerpos monoclonales humanos (27.F7 y 27.B1) desarrollados a partir de las células B de ganglios linfáticos de pacientes con cáncer de mama se identificaron como anticuerpos reactivos con TIP-2, sin embargo, aparentemente, con diferentes epítopos.
La información del bases de datos del GeneBank/Proteínas para esta proteína es la siguiente: referencia NCBI - NP005707.1PGGLUT1CBP; ARNm de GIPC de proteína de interacción RGS-GAIP de Homo sapiens, cds completo (AF0889816); ARNm de proteína de interacción con Tax 2 de Homo sapiens, cds parcial (AF028824). La presente invención demuestra que este antígeno, la Proteína de Interacción con Tax 2, (TIP-2), puede servir como un marcador distintivo y específico para el adenocarcinoma de mama y de próstata.
Resumen de Experimentos
Usando una línea celular compañera de fusión específica, MFP-2, se desarrollaron dos anticuerpos completamente humanos contra antígenos asociados con el cáncer de mama y el cáncer de próstata. Los dos antígenos fueron reactivos con una diana proteica de 42 kDa que se identificó por medio de la tecnología SEREX como la proteína de interacción con Ga, la proteína de interacción con el extremo C o la proteína de interacción con Tax, clon 2. Esta proteína se sobreexpresa específicamente en tres líneas celulares de cáncer de mama humano, SK-BR-3, MCF-7 y ZR-1-75, tiene una expresión muy pequeña o nula en las líneas de cáncer de próstata humano, PC-3, LNCaP y DU-145, y no tiene expresión en dos líneas celulares de fibroblastos humanas. Se descubrió que el antígeno TIP-2 se expresaba en todos los tejidos de cáncer de mama y en la mayoría de los cánceres de próstata. Los epitelios de mama normales fueron negativos para la tinción con anticuerpos anti-TIP-2, así como el tejido de hiperplasia prostática benigna (BPH). Dos anticuerpos monoclonales completamente humanos contra el antígeno GIPC/TIP-2 se dirigieron contra diferentes epítopos y dieron un patrón distintivo de inmunorreactividad con células de cáncer de mama humano. El anticuerpo 27.F7 era reactivo tanto con células cancerosas fijadas con formalina como con células cancerosas vivas de las líneas SK-BR-3 y MCF-7, mientras que el anticuerpo 27.B1 reaccionaba con células SK-BR-3 vivas y fijadas y sólo con células MCF-7 fijadas. Por otra parte, el anticuerpo 27.B1 mostraba una rápida internalización, mientras que 27.F7 no se internalizaba. Además, cuando se ensayó con respecto al efecto citolítico/citostático en presencia y ausencia del complemento, parecía ser que 27.F7 no producía ningún efecto citotóxico sobre las células, mientras que 27.B1 produce un efecto citotóxico que no es dependiente del complemento. El análisis de Scatchard del número de copias de antígeno GIPC/TIP-2 por célula demostró que este antígeno está presente en un número de copias bastante elevado alcanzando unas 300.000 copias por célula. Esto incluye el número total de moléculas de TIP-2, tanto en la superficie como el citosol. Usando uno de los anticuerpos humanos, 27.F7, como cebo de inmunoprecipitación, se aisló una pequeña cantidad de TIP-2 y se pudieron inducir varios anticuerpos monoclonales de ratón contra este antígeno. Todos los anticuerpos reaccionan en transferencia en Western con la banda proteica que corresponde a TIP-2, y también proporcionan una tinción distintiva y positiva específica de células cancerosas y tejidos de tumor primario. Usando anticuerpos humanos se demostró que normalmente GIPC/TIP-2 no se secreta o se desprende de las células cancerosas, pero puede encontrarse en el medio de cultivo sólo como resultado de la destrucción celular. El tratamiento de células SK-BR-3 con cantidades crecientes de Taxol demostró que el antígeno TIP-2 se liberaba en el medio de una manera dependiente de la dosis, indicando de esta manera que este marcador es valioso para el control de la necrosis natural o inducida por quimioterapia de lesiones tumorales.
Bibliografía para la tercera serie de experimentos
1. Sahin U, Tureci O, Schmitt H, Cochlovius B, et al. Human neoplasms elicit multiple specific immune responses in the autologous host. Proc.Natl.Acad.Sci USA 92:11810-11813, 1995.
2. Saras J, Heldin CH. PDZ domains bind carboxy-terminal sequences of target proteins TIBS 21:455-458, 1996.
3. Kennedy MB. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends Biochem Sci. 20:350, 1995.
4. Scanlan MJ, Chen Y-T, Williamson B, Gure AO, Stockert, JD, Gordan O, Tureci O, Sahin U, Pfreundschuh M, Old LJ. Characterization of human colon cancer antigens recognized by autologous antibodies. Int.J.Cancer 76: 652-658, 1998.
5. Scanlan MJ, Williamson B, Jungbluth A, Stockert E, Arden KC, Viars CS, Gure AO, Gordan JD, Chen Y-T, Old LJ. Isoforms of the human PDZ-73 protein exhibit differential tissue expression. Biochimica et Biophysica Acta 1445: 39-52, 1999.
6. De Vries L, Lou X, Zhao G, Zheng B, Farquhar MG. GIPC, a PDZ domain containing protein, interacts specifically with the C terminus of RGS-GAIP. Proc. Natl.Acad.Sci.USA 95:12340-12345, 1998.
7. Berman DM, Gilman AG. Mammalian RGS proteins: barbarians at the gate. J.Biol.Chem. 273:1269-1272, 1998.
8. Rousset R, Fabre S, Desbois C, Bantignies F, Jalinot P. The C-terminus of the HTLV-1 Tax oncoprotein mediates interaction with the PDZ domain of cellular proteins. Oncogene 16:643-654, 1998.
9. Kyono T, Hiraiwa A, Fujita M, Hayashi Y, Akiyama T, Ishibasahi M. Binding of high risk papillomavirus E6 oncoproteins to the human homologue of the Drosophila discs large tumor suppressor protein. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:11612-11616, 1997.
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11. Shenk T. in Fields Virology, eds. Fields BN, Knipe DM, Howley PM (Lippinscott, Philadelphia), Vol.2. pp. 2111-2148, 1996.
Cuarta serie de experimentos
Antígenos Proteicos Identificados por Anticuerpos Monoclonales Humanos Naturales Desarrollados a partir de Células B de Pacientes con Cáncer de Mama y de Próstata.
Introducción
Además de IGIPC/TIP-2, el método descrito en la tercera serie de experimentos (anterior) puede usarse para identificar otros antígenos proteicos, incluyendo los indicados a continuación.
Ejemplo I ARNm Humano para el gen KIAA0338, cds parcial
El anticuerpo monoclonal completamente humano (fhMAb) 13.42 reconoce el ARNm humano de un antígeno desconocido que se conoce para el gen denominado KIAA0338 (secuencia mostrada en la Fig. 32). El peso molecular (PM) calculado para este marcador asociado con cánceres de mama es de 103,5 kDa, aunque en transferencia de Western muestra la proteína de peso molecular \sim 40 kDa. Se dedujeron tres péptidos de unión a MHC I a partir de la secuencia; estos péptidos pueden considerarse candidatos para una vacuna peptídica.
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Ejemplo II ARNm de alfa-actinina no muscular humana, cds completo; ARNm de actinina, alfa 4 (ACTN4) de Homo sapiens
fhMAb 13.2C1 reconoce la alfa actinina no muscular de PM 105 kDa (secuencia mostrada en la Fig. 33) que se encuentra en muchos tejidos humanos, pero hay informes sobre la asociación de este marcador con cánceres de mama. Se han deducido tres péptidos restringidos al MHC l, que pueden considerarse candidatos de vacuna peptídica para cáncer de mama. fhMAb 13.2C1 también reconoce el ARNm de la actinina alfa 4 (ACTN4) de Homo sapiens (secuencia mostrada en la Fig. 34).
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Ejemplo III ARNm de la Proteína de Ensamblaje a la Cubierta de Clatrina Humana 50 (AP50)
fhMAb 22.8D11 está dirigido contra el marcador asociado con cáncer de mama y cáncer de próstata que es la proteína de ensamblaje a la cubierta de clatrina humana 50 (AP50) con PM de 50 kDa. Aunque se notificó la presencia de su ARNm (secuencia mostrada en la Fig. 34) en algunos tejidos humanos incluyendo tumores ováricos, el producto proteico parece estar asociado con el cáncer de mama y de próstata. Según el conocimiento de los presentes inventores, no se había notificado con anterioridad que este marcador estuviera asociado con estos tipos de cánceres. Se han deducido cuatro péptidos restringidos al MHC I por su posible significado como candidatos de vacunas peptídicas.
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Ejemplo IV ARNm de proteína GAM asociada a gp 130 de Homo sapiens; potenciador amino-terminal de ARNm de split (AES); ARNm de antiquitina 1
fhMAb 33.2H6 está dirigido contra la proteína GAM asociada a gp 130 humana con un PM de \sim 22 kDa. No se ha notificado previamente que esta proteína sea un antígeno asociado al cáncer de mama, aunque su ARNm (secuencia mostrada en la Fig. 37) se encontró en tumores ováricos. Su potenciador amino terminal humano homólogo del ARNm de split (AES) (secuencia mostrada en la Fig. 38) tiene una función desconocida, pero se ha propuesto como un antígeno de cáncer humano candidato. Se ha deducido un péptido de unión al MHC-l como posible candidato de vacuna peptídica. El mismo anticuerpo era reactivo con la antiquitina 1 (PM \sim 55 kDa) - homólogo de la proteína turgor 26g (secuencia mostrada en la Fig. 39). Se encontró un ARNm parcial para este antígeno en varios tejidos humanos, sin embargo, nunca se presentó antes para su asociación con el cáncer de mama. Se han deducido tres péptidos restringidos al MHC I a partir de la secuencia de aminoácidos de esta proteína.
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Ejemplo V Subunidad de 41 KD del Complejo Proteico ARP2/3 (P41-ARC), ARNm
fhMAb 39.A7 está dirigido contra la subunidad de 41 kDa del complejo proteico ARP2/3 (P41-ARC). No se sabía que esta proteína estuviera asociada con el cáncer de mama anteriormente. Se ha deducido un péptido restringido al MHC l como candidato para una vacuna basada en péptidos (secuencia mostrada en la Figura 40).
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Ejemplo VI ARNm de seb4D de Homo sapiens; ARNm de seb4B de Homo sapiens
fhMAb 50.1B3 reconoce la proteína en tejidos de cáncer de mama y de próstata que se identificaron como el antígeno seb4B/4D con un PM \sim 25 kDa. Tampoco se sabía que esta proteína estuviera asociada específicamente con el cáncer de mama. La función es desconocida, aunque su ARNm se encontró en varios tejidos humanos normales. Se han deducido dos péptidos restringidos al MHC I a partir de la secuencia primaria de esta proteína (secuencia mostrada en las Figs. 41 a 41 b).
Ejemplo VII ARNm de lamina A/C (LMNA) de Homo sapiens
fhMAb 59.3G7 es reactivo con la lamina A/C humana, una proteína de filamentos intermedios, cuyo ARNm se encontró en muchos tejidos humanos. El PM de esta proteína es \sim 65 kDa. Esta proteína se identificó anteriormente por diferentes grupos de investigación a través del anticuerpo sérico encontrado en pacientes con cáncer. Se considera sobreexpresada en adenocarcinomas de mama así como en algunos otros tipos de cáncer. Se han deducido tres péptidos restringidos al MHC l como candidatos potenciales para vacunas basadas en péptidos (secuencia mostrada en la Figura 42A-C).
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<110> The Trustees of Columbia University in the City of New York
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<120> Nuevo Marcador Asociado a Tumores
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<130> B5648- CA
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<140> 01973176.9
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<141> 18-09-2001
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<150> US09/664,958
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<151> 18-09-2000
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<160> 58
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<170> Patent In versión 3.1
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<210> 1
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<211> 333
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<212> PRT
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<213> Humana
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<213> Humana
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\sa{Ser Leu Leu Gly Cys Arg His Tyr Glu Val}
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<211> 6263
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<212> PRT
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<213> Humana
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<212> PRT
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<213> Humana
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Humana
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\sa{Lys Leu Leu Gly Gly Gln Ile Gly Leu}
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<212> PRT
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<213> Humana
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\sa{Ser Leu Leu Gly Cys Arg His Tyr Glu Val}
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<211> 10
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
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\sa{Tyr Leu Ser Gln Glu His Gln Gln Gln Val}
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<210> 49
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
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<400> 49
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\sa{Tyr Leu Ser Gln Glu His Gln Gln Gln Val}
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<210> 50
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<212> PRT
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<213> Humana
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\sa{Lys Val Met Asp Arg Pro Gly Asn Tyr Val}
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Leu Ile Glu Gln Trp Asn Pro Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Humana
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
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\sa{Ile Ile Thr Ala Phe Asn Phe Pro Val}
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<210> 53
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Humana
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
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\sa{Phe Glu Gln Glu Asn Asp Trp Trp Val}
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<210> 54
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<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
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<400> 54
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\sa{Tyr Leu Gly Ala Lys Pro Trp Cys Leu}
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<210> 55
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Humana
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Humana
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<400> 56
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\sa{Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Glu Arg Leu}
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<212> PRT
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<213> Humana
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\sa{Lys Leu Val Arg Ser Val Thr Val Val}
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Humana
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<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Leu Ala Asp Ala Leu Gln Glu Leu}
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Claims (87)

1. El anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599).
2. La célula de hibridoma denominada 27.B1 (nº de Acceso ATCC PTA-1599).
3. El anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598).
4. La célula de hibridoma denominada 27.F7 (nº de Acceso ATCC PTA-1598).
5. Un método in vitro para detectar células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en una muestra, que comprende:
(a)
poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, o un fragmento Fab de un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599), estando dicho anticuerpo o fragmento Fab marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno que comprende el anticuerpo o fragmento Fab marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de las células de la muestra;
(b)
retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab marcado no unido en el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno formado en la etapa (a); y
(c)
determinar la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno por medio de la detección del marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
6. El método de la reivindicación 5, en el que la muestra es una sección de tejido de una muestra tumoral.
7. El método de la reivindicación 6, en el que la sección de tejido es tejido congelado recientemente o tejido fijado con formalina.
8. El método de la reivindicación 5 ó 6, en el que el marcador detectable se selecciona entre el grupo que consiste en un isótopo radiactivo, una enzima, un tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
9. El método de la reivindicación 5 ó 6, en el que las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
10. El método de la reivindicación 5 ó 6, en el que las células cancerosas se seleccionan entre el grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma de pulmón, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
11. El método de la reivindicación 5 ó 6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
12. El método de la reivindicación 5 ó 6, en el que el epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598).
13. El método de la reivindicación 5 ó 6, en el que el epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599).
14. El método de la reivindicación 5 ó 6, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
15. El método de la reivindicación 5, en el que la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, tejido de biopsia de mama, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejidos de metástasis de mama y próstata, y medio de cultivo.
16. El método de la reivindicación 5, en el que TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
17. El método de la reivindicación 5, en el que la muestra es medio de cultivo.
18. Un método in vitro para detectar células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en una muestra, que comprende:
(a)
poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, o un fragmento Fab de un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599) y donde el epítopo se reconoce por el anticuerpo o el fragmento Fab en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno que comprende el anticuerpo o fragmento Fab unido a cualquier antígeno TIP-2 sobre la superficie de células en la muestra;
(b)
retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab no unido en el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno formado en la etapa (a);
(c)
poner en contacto el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno de la etapa (b) con un segundo anticuerpo que se une específicamente al complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno, estando dicho segundo anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones adecuadas para permitir que dicho segundo anticuerpo se una al complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno;
(d)
retirar cualquier segundo anticuerpo marcado no unido en el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno producido en (c); y
(e)
determinar la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno unido al segundo anticuerpo marcado detectando el marcador del segundo anticuerpo, indicando la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno la presencia de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en la muestra.
19. El método de la reivindicación 18, en el que el marcador detectable es un isótopo radiactivo, una enzima, un tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
20. El método de la reivindicación 18, en el que las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
21. El método de la reivindicación 18, en el que las células cancerosas se seleccionan entre el grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma de pulmón, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
22. El método de la reivindicación 18, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
23. El método de la reivindicación 18, en el que el epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598).
24. El método de la reivindicación 18, en el que el epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599).
25. El método de la reivindicación 18, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
26. El método de la reivindicación 18, en el que la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, tejido de biopsia de mama, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejido de metástasis de mama y próstata, y medio de cultivo.
27. El método de la reivindicación 18, donde TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
28. Un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto detectando células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende:
(a)
poner en contacto una muestra de sangre periférica obtenida a partir del sujeto con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599), estando dicho anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 sobre la superficie de las células en la muestra;
(b)
retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab marcado no unido en el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y
(c)
determinar la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 detectando el marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, indicando la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 un diagnóstico del cáncer en el sujeto.
29. El método de la reivindicación 28, en el que el marcador detectable es un isótopo radiactivo, una enzima, un tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
30. El método de la reivindicación 28, en el que el sujeto es un ser humano.
31. El método de la reivindicación 28, en el que el cáncer es melanoma humano, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, leucemia mieloide, carcinoma de mama, carcinoma de colon, carcinoma de endometrio, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, carcinoma cervical, osteosarcoma, carcinoma testicular o linfoma.
32. El método de la reivindicación 28, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
33. El método de la reivindicación 28, en el que el epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598).
34. El método de la reivindicación 28, en el que el epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599).
35. El método de la reivindicación 28, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
36. El método de la reivindicación 28, en el que TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
37. Un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto detectando células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2, que comprende:
(a)
poner en contacto una muestra de sangre periférica obtenida a partir del sujeto con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599), en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo unido a cualquier antígeno TIP-2 en la superficie de las células en la muestra;
(b)
retirar cualquier anticuerpo/fragmento Fab no unido en el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a);
(c)
poner en contacto el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 de la etapa (b) con un segundo anticuerpo que se une específicamente al complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2, estando dicho segundo anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones adecuadas para permitir que dicho segundo anticuerpo se una al complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2;
(d)
retirar cualquier segundo anticuerpo marcado no unido al complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 producido en (c); y
(e)
determinar la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 unido al segundo anticuerpo marcado detectando el marcador del segundo anticuerpo, indicando la presencia de complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 un diagnóstico de cáncer en el sujeto.
38. El método de la reivindicación 37, en el que el marcador detectable es un isótopo radiactivo, una enzima, un tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
39. El método de la reivindicación 37, en el que el sujeto es un ser humano.
40. El método de la reivindicación 37, en el que el cáncer es melanoma humano, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, leucemia mieloide, carcinoma de mama, carcinoma de colon, carcinoma de endometrio, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, carcinoma cervical, osteosarcoma, carcinoma testicular y linfoma.
41. El método de la reivindicación 37, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
42. El método de la reivindicación 37, en el que el epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598).
43. El método de la reivindicación 37, en el que el epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599).
44. El método de la reivindicación 37, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
45. El método de la reivindicación 37, en el que TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
46. Un método de diagnóstico in vivo para detectar células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en un sujeto, que comprende determinar la presencia de un anticuerpo marcado de manera detectable administrado previamente unido a la superficie de células en el sujeto, estando dirigido dicho anticuerpo a un epítopo del antígeno TIP-2 o un fragmento Fab del mismo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599).
47. El método de la reivindicación 46, en el que el marcador detectable es un isótopo radiactivo, una enzima, un tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
48. El método de la reivindicación 46, en el que el sujeto es un ser humano.
49. El método de la reivindicación 46, en el que el cáncer es melanoma humano, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, leucemia mieloide, carcinoma de mama, carcinoma de colon, carcinoma de endometrio, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, carcinoma cervical, osteosarcoma, carcinoma testicular o linfoma.
50. El método de la reivindicación 46, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
51. El método de la reivindicación 46, en el que el epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598).
52. El método de la reivindicación 46, en el que el epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599).
53. El método de la reivindicación 46, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
54. El método de la reivindicación 46, en el que la presencia del anticuerpo o un fragmento Fab del mismo unido a la superficie de células en el sujeto se detecta usando un dispositivo de formación de imágenes.
55. El método de la reivindicación 54, en el que el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por resonancia magnética.
56. El método de la reivindicación 54, en el que el dispositivo de formación de imágenes es un dispositivo de formación de imágenes por inmunoescintografía de rayos X.
57. Uso de un liposoma que lleva un conjugado de material exógeno, donde un anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o un anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599) se acopla a una superficie exterior del liposoma, para la fabricación de un medicamento para tratar cánceres por medio de la liberación dirigida del material exógeno a células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 de un sujeto humano.
58. El uso de la reivindicación 57, en el que el material exógeno se selecciona entre el grupo que consiste en fármacos anticancerosos, radioisótopos, toxinas, antibióticos, profármacos, enzimas y compuestos quimioterapéuti-
cos.
59. El uso de la reivindicación 57, en el que las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células de melanoma humano, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma de pulmón, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular o células de linfoma.
60. Uso del anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o del anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599), o un fragmento peptídico del mismo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, para la preparación de un medicamento para tratar cánceres en un sujeto humano por inmunización pasiva.
61. El uso de la reivindicación 60, en el que el anticuerpo induce la apoptosis de células que llevan el antígeno TIP-2.
62. Un kit para detectar la presencia de células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en una muestra, que comprende:
(a)
un soporte sólido que tiene una pluralidad de sondas unidas covalentemente que pueden ser iguales o diferentes, comprendiendo cada sonda un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, o fragmento Fab de dicho anticuerpo, donde el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599); y
(b)
un reactivo para detectar la presencia del complejo de anticuerpo monoclonal/fragmento Fab-antígeno TIP-2.
63. El kit de la reivindicación 62, en el que el reactivo para detectar el complejo de anticuerpo monoclonal/fragmen-
to Fab-antígeno TIP-2 es un segundo anticuerpo marcado de manera detectable que se une específicamente al anticuerpo monoclonal dirigido al epítopo del antígeno TIP-2.
64. El kit de la reivindicación 62, en el que el anticuerpo monoclonal dirigido al epítopo del antígeno TIP-2 es el anticuerpo monoclonal humano 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598).
65. El kit de la reivindicación 62, en el que el anticuerpo monoclonal dirigido al epítopo del antígeno TIP-2 es el anticuerpo monoclonal humano 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599).
66. El kit de la reivindicación 63, en el que el marcador detectable es un isótopo radiactivo, una enzima, un tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
67. El kit de la reivindicación 62, en el que las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
68. El kit de la reivindicación 62, en el que las células cancerosas se seleccionan entre un grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma de pulmón, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
69. El kit de la reivindicación 62, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
70. El kit de la reivindicación 62, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
71. El kit de la reivindicación 62, en el que la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, médula ósea, tejido de biopsia de mama, ganglios linfáticos, tejido de próstata, tejido de metástasis de mama y próstata, y medio de cultivo.
72. El kit de la reivindicación 62, en el que la muestra es medio de cultivo.
73. El kit de la reivindicación 62, en el que la muestra es una muestra tumoral.
74. Un método para la detección in vitro de la presencia del antígeno TIP-2 en un fluido biológico, que comprende:
(a)
poner en contacto una muestra del fluido biológico con un anticuerpo dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2, o un fragmento Fab del anticuerpo, reconociéndose dicho epítopo por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598) o por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599), estando dicho anticuerpo marcado de manera detectable, en condiciones apropiadas para producir un complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 que comprende el anticuerpo marcado de manera detectable unido a cualquier antígeno TIP-2 presente en la muestra;
\newpage
(b)
retirar cualquier anticuerpo marcado no unido en el complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 formado en la etapa (a); y
(c)
determinar la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 detectando el marcador del anticuerpo marcado de manera detectable, donde la presencia del complejo de anticuerpo/fragmento Fab-antígeno TIP-2 indica la presencia del antígeno TIP-2 en el fluido biológico.
75. El método de la reivindicación 74, en el que el marcador detectable es un isótopo radiactivo, una enzima, un tinte, biotina, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente.
76. El método de la reivindicación 74, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
77. El método de la reivindicación 74, en el que el epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598).
78. El método de la reivindicación 74, en el que el epítopo se reconoce por el anticuerpo monoclonal 27.B1 producido por el hibridoma designado 27.B1 (nº de designación ATCC PTA-1599).
79. El método de la reivindicación 76, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal murino.
80. El método de la reivindicación 74, en el que el fluido biológico se selecciona entre el grupo que consiste en suero, plasma, saliva, lágrimas, descarga mucosa, orina, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo y fluido linfático.
81. El método de la reivindicación 74, en el que TIP-2 se concentra a partir de la muestra por precipitación con alcohol antes de la etapa (a).
82. El método de la reivindicación 74, en el que el fluido biológico es medio de cultivo.
83. El método de la reivindicación 74, en el que el anticuerpo monoclonal dirigido al epítopo del antígeno TIP-2 es el anticuerpo monoclonal humano 27.F7 producido por el hibridoma designado 27.F7 (nº de designación ATCC PTA-1598).
84. El método de la reivindicación 74, en el que el anticuerpo monoclonal dirigido al epítopo del antígeno TIP-2 es un anticuerpo monoclonal murino dirigido a un epítopo del antígeno TIP-2.
85. El método de la reivindicación 74, en el que el antígeno TIP-2 está presente en células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 en el fluido biológico.
86. El método de la reivindicación 85, en el que las células cancerosas que llevan el antígeno TIP-2 son células cancerosas humanas.
87. El método de la reivindicación 85, en el que las células cancerosas se seleccionan entre el grupo que consiste en células de melanoma, células de carcinoma de células basales, células de carcinoma de células escamosas, células de neuroblastoma, células de glioblastoma multiforme, células de leucemia mieloide, células de carcinoma de mama, células de carcinoma de colon, células de carcinoma endometrial, células de carcinoma de pulmón, células de carcinoma de ovario, células de carcinoma de próstata, células de carcinoma cervical, células de osteosarcoma, células de carcinoma testicular y células de linfoma.
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