FR2635267A1 - Anticorps monoclonaux et procede pour les produire - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des anticorps monoclonaux, utiles pour diagnostiquer et traiter des cancers des ovaires, du poumon ou du foie. Pour produire ces anticorps, on immunise un animal, successivement, avec deux antigènes, l'un dérivé de cellules humaines indifférenciées et l'autre de cellules tumorales. On isole ensuite de l'animal les cellules productrices d'anticorps, et on les fait fusionner avec des cellules myélomateuses, ce qui donne des hybridomes parmi lesquels on sélectionne ceux qui produisent les anticorps désirés. On clone les hybridomes choisis et on récupère les anticorps qu'ils produisent.

Description

Anticorps monoclonal et procédé pour le produire Cette invention concerne

de nouveaux anticorps monoclonaux qui réagissent sélectivement avec certains antigènes associés à des tumeurs, ainsi qu'un nouveau procédé de production d'anticorps monoclonaux qui réagissent sélectivement avec des antigènes associés à des tumeurs. Les anticorps monoclonaux qui reconnaissent spécifiquement des antigènes associés à des tumeurs sont utilisés comme réactifs de diagnostic pour des tumeurs ou dans la thérapie de tumeurs par médicaments projectiles, o l'on met à profit une réaction antigène-anticorps

impliquant les antigènes associés aux tumeurs.

Dans l'art antérieur (par exemple le brevet US 4609548), on obtient ces anticorps monoclonaux en immunisant des animaux avec les antigènes associés à des tumeurs pour obtenir des cellules productrices d'anticorps, en fusionnant ces cellules avec des cellules myélomateuses pour préparer des hybridomes (cellules fusionnées), et en

cultivant ces hybridomes.

Lorsque l'antigène associé à la tumeur (marqueur de tumeur) spécifique de la tumeur cible est un antigène identifié, on peut utiliser l'antigène, après purification, pour immuniser les animaux, et obtenir effectivement un

anticorps qui reconnaisse spécifiquement cet antigène.

Toutefois, si l'antigène associé à la tumeur n'est pas identifié, on peut difficilement appliquer ce procédé. En particulier, quand l'antigène associé à la tumeur n'est pas identifié, l'antigène ne peut pas être purifié et il n'y a pas d'autre choix que d'utiliser un antigène obtenu par homogénéisation des cellules de tumeur. Cet antigène contient d'autres antigènes, et il est très rare de produire sélectivement un anticorps reconnaissant spécifiquement

l'antigène associé à la tumeur.

En conséquence, en immunisant un animal avec l'antigène dérivé de cellules de tumeur, on obtient qu'avec une très faible probabilité un anticorps spécifique pour

l'antigène associé à la tumeur.

Par exemple, la publication de la demande de brevet européen n 145949-A2 décrit des anticorps monoclonaux qui réagissent spécifiquement avec des antigènes associés à des tumeurs tels que le cancer des ovaires, le cancer du rein, le cancer de l'utérus, le cancer du colon, le cancer du sein et le cancer du cerveau, et que l'on obtient par un procédé semblable à celui décrit dans le brevet US 4609548 cité plus haut. Toutefois, ces publications ne décrivent pas du tout un anticorps monoclonal qui réagirait spécifiquement avec le cancer des ovaires et le cancer du poumon, et on n'en

trouve presque nulle part ailleurs de description. La

publication de la demande de brevet européen n0 145949-A2, citée cidessus, présente un anticorps monoclonal "MH94" qui présente une réaction dans le cas du cancer des ovaires ou du cancer des poumons. Cet anticorps monoclonal présente également une réactivité vis-à-vis de cellules de tissus normaux. La demanderesse a entrepris des recherches poussées afin d'obtenir un anticorps reconnaissant spécifiquement un antigène associé à une tumeur, non identifié, et en conséquence, elle a découvert un nouveau procédé de production efficace d'un anticorps monoclonal qui peut reconnaitre un antigène associé à une tumeur, non identifié. Grâce à ce nouveau procédé, la demanderesse a réussi à produire un anticorps monoclonal qui peut reconnaitre des antigènes non-identifiés, associés au cancer des ovaires chez la femme et au cancer du poumon chez l'homme, ainsi qu'un antigène associé au cancer du foie chez l'homme. Selon un aspect de la présente invention, on fournit un procédé de production d'un anticorps monoclonal, qui comporte l'immunisation d'un animal avec un antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées, une immunisation supplémentaire de cet animal avec un antigène dérivé de cellules tumorales, l'isolement des cellules productrices d'anticorps à partir de cet animal, la fusion des cellules productrices d'anticorps avec des cellules myélomateuses pour préparer des hybridomes, la sélection, parmi ces hybridomes, de celui qui produit l'anticorps monoclonal désiré, la culture de l'hybridome sélectionné, et la récupération de l'anticorps monoclonal secrété par l'hybridome. L'antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées (désigné ci-après par "antigène HI") est utilisé dans la première immunisation du procédé de cette invention. Les cellules humaines indifférenciées, connues également sous le nom de "cellules humaines totipotentes", ne sont pas complètement différenciées en cellules ou organes humains ayant une fonction, mais ont la capacité d'être différenciées en organes ou cellules ayant une fonction. En particulier, ces cellules ne sont pas différenciées en organes comme le coeur, le foie et le

cerveau, ou en cellules sanguines comme les lymphocytes.

Les cellules humaines indifférenciées existent, par exemple, dans les embryons humains ages de 7 à 15 semaines (ci-après désignés par "EH"), dans le liquide amniotique humain au premier stade de la grossesse et dans la moelle osseuse humaine, et c'est chez les embryons humains âgés de 7 à 15 semaines, et de préférence de 7 à 10 semaines, qu'elles sont le plus abondantes. Quand l'embryon humain dépasse 15 semaines d'âge, les cellules humaines indifférenciées se différencient en organes, et deviennent, du point de vue antigénique, identiques à des cellules d'adulte. Ces cellules différenciées ne peuvent donc pas être utilisées pour le propos de cette invention. On peut obtenir légalement des embryons humains, en respectant les règles stipulées par la Société Japonaise d'Obstétrique et

de Gynécologie.

Le procédé de préparation de l'antigène HI n'est pas particulièrement limité. Un exemple caractéristique du procédé de préparation de l'antigène HI à partir de EH est

présenté plus bas.

Il est possible d'homogénéiser tout ou partie des

tissus de EH et d'utiliser le surnageant comme un antigène.

Mais pour diminuer la sélectivité des cellules productrices d'anticorps, produites par immunisation avec l'antigène, il est préférable de séparer de l'EH les organes différenciés comme l'intestin grêle et le foie, d'homogénéiser le reste et d'utiliser le surnageant obtenu comme antigène. De préférence, afin d'utiliser comme antigène non-seulement les antigènes de surface présents sur les cellules d'EH, mais également les composants situés à l'intérieur des cellules, on ajoute divers agents tensio-actifs pour rompre les membranes cellulaires et solubiliser les cellules. Le résultat de cette solubilisation des cellules est que tous les composants des cellules indifférenciées peuvent être utilisés comme antigène. Pour solubiliser les cellules, on peut utiliser dans cette invention les agents tensio-actifs

utilisés classiquement pour la solubilisation de cellules.

Des exemples particuliers d'agents tensio-actifs englobent les agents tensio-actifs non-ioniques tels que

polyoxyéthylène-dodécyl-éther, polyoxyéthylène-2-méthyl-

dodécyl-éther, polyoxyéthylène-heptaméthylhexyl-éther,

polyoxyéthylène-1-octylphényl-éther, polyoxyéthylène-

nonylphényl-éther, polyoxyéthylène-ester d'acide gras et

polyoxyéthylène-ester de sorbitol; les agents tensio-

actifs anioniques tels que bromure de cétyl-triméthyl-

ammonium, bromure de tétradécyl-ammonium et chlorure de dodécylpyridinium; les agents tensio-actifs cationiques comme dodécylsulfate de sodium, dodécylsulfonate de sodium

et dodécyl-N-sarcosinate de sodium; et les agents tensio-

actifs amphotères comme palmitoyl-lysolécithine, dodécyl-

N-bétaine et dodécyl-béta-alanine.

On peut utiliser directement comme antigène HI un produit brut de cellules indifférenciées solubilisées, obtenues par solubilisation de cellules humaines indifférenciées selon le procédé ci-dessus, mais de préférence, on soumet ce produit à une centrifugation de façon à éliminer les composants insolubles avant de l'utiliser comme antigène. Si les composants insolubles restent mélangés dedans, l'antigène présente une faible capacité de production d'anticorps, et son emploi pour

l'immunisation n'est pas souhaitable.

Dans cette invention, on peut utiliser des animaux que l'on utilise généralement pour l'immunisation. Des exemples particuliers englobent des mammifères tels que souris, rat, lapin, chèvre, mouton, bovin et cheval. On préfère la souris et le rat, du point de vue de la facilité d'obtention des cellules myélomateuses qui seront fusionnées avec les cellules productrices d'anticorps (cellules B) obtenues par immunisation. Les races de souris et de rat ne sont pas particulièrement limitées, et peuvent englober les races de souris A, AKR, BALB/c, BDP, CBA, CE, C3H, C57BL, C57BR,

C57L, DBA, FL, HTH, HTI, LP, NZB, NZW, RF, RIII, SJL, SWR,

WB, et 129 et les races de rat Lou, Lewis, Sprague-Dawley, ACI, BN et Fischer. Du point de vue de la compatibilité lors de la fusion avec les cellules myélomateuses que l'on va décrire, les souris de race BALB/c et les rats de race Lou sont les animaux que l'on préfère par-dessus tout pour les immuniser. L'Age des souris et des rats est de préférence de à 12 semaines, mieux encore de 6 à 8 semaines. S'ils ont moins de 5 semaines, l'immunisation est difficile. S'ils ont plus de 12 semaines, l'efficacité de l'immunisation a tendance à diminuer. L'immunisation d'un animal avec l'antigène HI, selon cette invention, peut être effectuée selon un procédé connu d'immunisation, par exemple les procédés décrits en détail par D. M. Weir: "Handbook of Experimental Immunology", Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978) et par E. A. Kabat et M. M. Mayer: "Experimental Immunochemistry", édité par

Charles C. Thomas, Springfield, Illinois (1964).

Des procédés d'immunisation que l'on peut convenablement utiliser dans cette invention sont spécifiquement indiqués ci-dessous. L'antigène HI peut être administré par voie intrapéritonéale ou par voie intraveineuse. Pour augmenter l'efficacité de l'immunisation, on administre de préférence l'antigène à la

fois par voie intrapéritonéale et par voie intraveineuse.

Pour augmenter particulièrement l'efficacité de l'immunisation, on préfère administrer l'antigène par voie intrapéritonéale dans la première partie du mode opératoire d'immunisation, ct par voie intraveineuse dans la dernière partie de l'immunisation ou bien seulement dans la partie finale de l'immunisation. Le programme d'immunisation ne peut pas être généralisé, en raison des différences entre les types d'animaux et entre les animaux individuels à immuniser. Généralement, on administre l'antigène HI en 3 à 6 fois, de préférence en 3 à 4 fois, à intervalles de 2 à 6 semaines, de préférence de 3 à 4 semaines. Si l'on augmente excessivement le nombre d'opérations d'administration, on gaspille l'antigène HI, qui présente une certaine valeur et si l'on élargit l'intervalle entre les opérations d'administration, l'activité des cellules diminuera, ce qui n'est pas souhaitable. La quantité d'antigène HI utilisée pour l'immunisation ne peut pas être déterminée de façon générique, parce qu'elle variera en fonction des types d'animaux à immuniser, des différences entre les animaux individuels, etc... En général, il conviendra d'en utiliser

de 0,05 à 5 ml, de préférence de 0,1 à 0,5 ml.

Une condition importante dans le procédé de cette invention est qu'après l'immunisation ci-dessus avec l'antigène HI, les animaux sont en plus immunisés avec un antigène dérivé de cellules tumorales (appelé ci-après antigène "CT"). Le résultat de l'immunisation avec l'antigène HI est que des cellules productrices d'anticorps du type correspondant à l'antigène HI sont formées dans les animaux immunisés. En les immunisant en plus avec un antigène CT spécifique, on peut faire croître sélectivement, à partir des cellules productrices d'anticorps, des clones de ces cellules qui reconnaitront spécifiquement l'antigène CT. En conséquence, on peut augmenter l'efficacité de fusion entre les cellules productrices d'anticorps et les cellules myélomateuses, fusion cellulaire qui sera décrite ci-après. Ensuite, en cultivant un hybridome obtenu par cette fusion cellulaire, on peut produire avec un bon rendement l'anticorps

monoclonal souhaité.

Le procédé précédemment connu d'immunisation supplémentaire comporte l'immunisation d'un animal avec un

antigène CT, et puis encore avec le même type d'antigène CT.

Selon ce procédé, les cellules productrices d'anticorps que l'on fait croître par immunisation supplémentaire se limitent à celles qui sont produites en proportion relativement élevée lors de l'immunisation précédente. En conséquence, si un anticorps produit par les cellules productrices d'anticorps ne reconnait pas spécifiquement un antigène associé à une tumeur dans l'antigène CT,

l'immunisation supplémentaire perd tout son sens.

L'antigène CT utilisé lors de l'immunisation supplémentaire dans cette invention peut être choisi de façon appropriée parmi les antigènes dérivant de cellules

d'une tumeur correspondant à l'anticorps monoclonal désiré.

Par exemple, si l'on désire obtenir un anticorps monoclonal présentant une réactivité spécifique sur le cancer des ovaires chez la femme, on utilisera l'antigène CT du cancer des ovaires chez la femme. On peut préparer l'antigène CT en utilisant des cellules cancéreuses connues et disponibles comme celles de cancers humains de l'estomac, du foie, du poumon, de la vessie, du pancréas, du rein et du gros intestin, en fonction de l'anticorps monoclonal désiré. Dans la préparation de l'antigène CT à partir des cellules tumorales, on peut rompre les cellules cancéreuses et les utiliser directement. De préférence, on solubilise les

cellules cancéreuses en utilisant les mêmes agents tensio-

actifs que ceux décrits ci-dessus, et après centrifugation pour éliminer les matières insolubles, on utilise le surnageant comme antigène pour l'immunisation supplémentaire. On peut effectuer l'immunisation supplémentaire par voie intrapéritonéale ou par voie intraveineuse. On préfère cette dernière voie dans le but d'augmenter l'efficacité de

l'immunisation supplémentaire.

De préférence, l'immunisation supplémentaire est effectuée après un délai de 1 à 6 semaines, de préférence de 2 à 4 semaines ou mieux encore de 2 à 3 semaines, après la

fin de l'immunisation des animaux avec l'antigène HI.

Habituellement, on effectue l'immunisation supplémentaire une fois, et de préférence des cellules de rate contenant des cellules productrices d'anticorps sont prélevées sur des animaux immunisés après un délai de 1 à 10 jours de préférence de 2 à 5 jours et mieux encore de 2 à 3 jours, après l'immunisation supplémentaire. L'effet de l'immunisation supplémentaire est faible si celle-ci est effectuée plus tard que 6 semaines, ou plus tôt qu'une semaine, après l'immunisation précédente. En outre, si le moment du prélèvement des cellules de rate se situe plus tard que 10 jours à compter de l'immunisation supplémentaire, il existe une tendance à la formation de cellules qui produisent un anticorps contre l'antigène CT utilisé dans l'immunisation supplémentaire. Si ce prélèvement a lieu avant i jour à compter de l'immunisation supplémentaire, l'effet de cette dernière a tendance à être faible. La quantité convenable d'antigène CT utilisée au moment de l'immunisation supplémentaire diffère selon le type et la taille de l'animal immunisé, et ne peut pas être déterminée de façon générale. Pour des souris, elle est généralement de 0,05 à 5 ml, de préférence de 0,1 à 0,5 ml et mieux encore de 0,1 à 0,2 ml. L'administration d'une quantité d'antigène plus importante que celle nécessaire diminue l'efficacité de l'immunisation et n'est pas

souhaitable pour l'animal immunisé.

En ce qui concerne l'isolement de cellules productrices d'anticorps à partir de la rate, le prélèvement aseptique de cellules sur l'animal immunisé peut être effectué selon des procédés connus, par exemple les procédés décrits par Koehler et al., Nature, 256, 495 (1975), Koehler et al., Eur. J. Immunol. 6, 511 (1977), Milstein et al., Nature 266, 550 (1977) et Walsh, Nature 266, 495 (1977). Par exemple, un procédé général peut consister à hacher les cellules, à filtrer le produit haché sur une grille en acier inoxydable, à faire flotter le filtrat sur du milieu essentiel minimal d'Eagle (MEM), et à

séparer les cellules productrices d'anticorps.

Afin d'obtenir un anticorps monoclonal, les cellules productrices d'anticorps sont fusionnées avec des cellules

myélomateuses pour donner des hybridomes.

Les cellules myélomateuses utilisées dans la fusion cellulaire ne sont pas particulièrement limitées. On peut les choisir parmi les lignées de cellules myélomateuses utilisées fréquemment en fusion cellulaire, par exemple des cellules myélomateuses provenant de souris et des cellules myélomateuses humaines. Des exemples particuliers englogent X63-Ag8(X63), NSI-Ag4/l(NSI), P3X63-Ag8Ul(P3U1),

X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Agl4(SP2/0), MPCll-

45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO et BU.1, provenant de souris; et U2666AR(SKO-007), GM1500.6TG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LON-HMy2(HMy2), et 8226AR/NIP4-1 (NP41) qui sont des cellules humaines (les désignations misés entre parenthèses sont des abréviations). De préférence, la lignée de cellules myélomateuses est une lignée de cellules

déficientes en HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-

transférase), pour laquelle -une technique de sélection d'hybridome après fusion cellulaire a déjà été mise au point. Les lignées de cellules citées en exemple ci-dessus

sont toutes déficientes en HGPRT.

La fusion des cellules productrices d'anticorps avec les cellules myélomateuses peut être effectuée selon un procédé connu, tel qu'un procédé chimique impliquant le mélange des cellules productrices d'anticorps avec les cellules myelomateuses dans une solution à concentration élevée d'un polymère tel que des polyéthylène-glycols, ou bien un procédé physique utilisant une stimulation électrique. Elle peut être effectuée dans des conditions qui ne font pas décroître de façon importante le taux de survie des cellules (voir par exemple D. M. Weir: Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978) et E. A. Kabat et M. M. Mayer: Experimental Immunochemistry, édité par Charles C. Thomas, Springfield, Illinois (1964)). Par exemple, le procédé chimique mentionné ci-dessus est généralement mis en oeuvre selon le mode opératoire suivant. On utilise une solution à concentration élevée d'un polyéthylène-glycol présentant une masse moléculaire de 1500 à 6000 de préférence de 2000 à 4000 et on mélange à une température de à 40'C, de préférence de 35 à 38'C, les cellules productrices d'anticorps avec les cellules myélomateuses,

pendant 1 à 10 minutes, de préférence 5 à 8 minutes.

Il n'y a pas de restrictions particulières sur le procédé de sélection des hybridomes obtenus par fusion il cellulaire. Habituellement, on utilise le procédé de

sélection à l'HAT (hypoxanthine-aminoputérine-thymidine).

Les détails du procédé de sélection à l'HAT sont décrits par Koehler et al.: Nature, 256, 485 (1975) et par Milstein et al.: Nature, 226, 550 (1977). Ce procédé est efficace pour obtenir des hybridomes en utilisant des cellules myélomateuses déficientes en HGPRT qui ne peuvent pas survivre en présence d'aminoputérine. En particulier, en cultivant les hybridomes obtenus par fusion cellulaire dans un milieu HAT (milieu contenant de l'hypoxanthine, de l'aminoputérine et de la thymidine), les hybridomes qui présentent également une résistance à l'aminoputérine survivent sélectivement dans le milieu et y prolifèrent. Le clonage des hybridomes peut être effectué par des procédés connus tels que le procédé à la méthylcellulose, le procédé à l'agarose doux et le procédé de dilution limite (voir par exemple B. M. Barbara et M. S. Stanley: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Le procédé de dilution limite convient particulièrement. Selon ce procédé, on dépose sur une micro-plaque des cellules pourvoyeuses comme une lignée de cellules de fibroblaste dérivée d'un embryon de rat, des cellules de rate de souris normales, des cellules de thymus ou des cellules d'ascite. D'autre part, on dilue les hybridomes dans un milieu jusqu'à une concentration de 0,2 à 0,5 cellule pour 0,2 ml, et on dépose la suspension diluée d'hybridome à raison de 0, 1 ml par puits. Selon une fréquence pré-établie, par exemple tous les 3 jours, on remplace environ 1/3 du milieu par du milieu frais. Lorsque l'on poursuit la culture pendant environ 2 semaines, des clones d'hybridomes prolifèrent. En cultivant les hybridomes ainsi sélectionnés, on peut produire avec un bon rendement un anticorps monoclonal. De préférence, avant la culture, on sélectionne les hybridomes afin de choisir des

hybridomes qui produisent l'anticorps monoclonal souhaité.

Cette sélection peut être réalisée selon des procédés connus, comme l'EIE (essai immuno-enzymatique) en phase

solide, l'EIE en phase liquide, l'ERI (essai radio-

immunologique) en phase solide, l'ERI en phase liquide, et une technique de détection d'anticorps par fluorescence. Puisque dans cette invention, il existe une possibilité qu'il se forme un anticorps contre un antigène tout à fait inconnu, il est préférable d'utiliser le procédé EIE en phase solide. Selon ce procédé, l'antigène associé aux

cellules tumorales est fixé à chacun des puits de la micro-

plaque, puis on ajoute le surnageant contenant l'hybridome pour provoquer une réaction antigène-anticorps. Les puits sont ensuite lavés, et on ajoute un anticorps marqué comme un anticorps anti-IgG de souris, marqué à la peroxydase, ou un anticorps anti-IgM de souris, marqué à la peroxydase. Les puits sont encore lavés, et on ajoute du peroxyde d'hydrogène en tant que substrat et un agent colorant. On mesure alors l'absorbance, ainsi que l'activité. Selon ce procédé, on peut obtenir des hybridomes produisant l'anticorps monoclonal souhaité. Cette sélection peut être effectuée avant ou après le clonage des hybridomes,

mentionné ci-dessus.

Dans la présente invention, le procédé de culture des hybridomes n'est pas particulièrement limité, et peut être le même que le procédé ordinaire de culture d'hybridome. Par exemple, on peut cultiver les hybridomes dans le même milieu que celui utilisé dans le mode opératoire de clonage indiqué ci-dessus. Pour obtenir l'anticorps monoclonal en grandes quantités, il est possible d'injecter les hybridomes dans la cavité abdominale de souris, et d'extraire l'anticorps

monoclonal des ascites. Dans ce procédé, un immuno-

suppresseur est injecté par voie intrapéritonéale à des souris de la même souche que celle qui a donné des hybridomes, afin de désactiver les cellules T. Ensuite, 10 à 107 cellules de clone sont mises en suspension dans un milieu exempt de sérum, et introduites par voie intrapéritonéale. Habituellement, au bout de 10 à 20 jours, l'abdomen des souris gonfle et on prélève les ascites sur les souris. Ce procédé permet d'obtenir l'anticorps monoclonal en une concentration qui est au moins 100 fois

plus grande que celle obtenue par culture.

Il n'y a pas de restriction particulière sur le procédé de purification de l'anticorps monoclonal obtenu selon ce procédé. Par exemple, on peut utiliser les méthodes de purification décrite par Weir: Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, II, III, cité ci-dessus. Des procédés généraux englobent le relarguage au sulfate d'ammonium, la filtration sur gel, la chromatographie par échange d'ions

et la chromatographie d'affinité.

L'anticorps monoclonal peut être purifié par relarguage avec du sulfate d'ammonium, répété 3 à 4 fois, de préférence 3 à 6 fois. Cependant, avec ce procédé, le

rendement en anticorps monoclonal purifié est très faible.

On peut purifier l'anticorps monoclonal, jusqu'à une pureté élevée, en le soumettant à un relarguage avec du sulfate d'ammonium 1 ou 2 fois, et en le purifiant ultérieurement selon un ou plusieurs procédés, de préférence 2, choisis parmi la filtration sur gel, la chromatographie par échange d'ions et la chromatographie d'affinité. La combinaison du relarguage au sulfate d'ammonium avec les autres méthodes peut être par exemple: (1) relarguage au sulfate d'ammonium, chromatographie par échange d'ions et filtration sur gel; (2) relarguage au sulfate d'ammonium, chromatographie par échange d'ions et chromatographie d'affinité; ou (3) relarguage au sulfate d'ammonium, filtration sur gel et chromatographie d'affinité, dans

l'ordre indiqué dans chaque cas.

La combinaison (3) convient le mieux pour l'obtention, avec un haut rendement, d'un anticorps

monoclonal de pureté élevée.

L'hybridome produisant l'anticorps monoclonal ci-

dessus peut être emmagasiné à l'état congelé, dans l'azote

liquide ou dans un congélateur à -80 C ou au-dessous.

Des exemples spécifiques d'hybridomes ainsi produits englobent l'hybridome 5F11 et l'hybridome 6H13, déposés au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba, Ibaraki- ken, Japon, sous les numéros FERM BP-1997 et FERM BP-2525, d'après le traité

de Budapest.

Des exemples de nouveaux anticorps monoclonaux produits selon le procédé de cette invention, que l'on vient de décrire, sont (i) un anticorps monoclonal (I) produit par un hybridome (par exemple l'hybridome 5F11 (FERM BP-1997)) préparé par fusion de cellules productrices d'anticorps, provenant d'une souris immunisée avec un antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées (antigène HI) et en plus avec un antigène CT dérivé de cellules de cancer humain des ovaires, avec des cellules myélomateuses de souris; et (ii) un anticorps monoclonal (II) produit par un hybridome (par exemple l'hybridome 6H13 (FERM BP-2525)) préparé par fusion de cellules productrices d'anticorps, provenant d'une souris immunisée avec un antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées (antigène HI) et en plus avec un antigène CT dérivé de cellules de cancer humain du foie,

avec des cellules myélomateuses de souris.

Les caractéristiques de ces anticorps monoclonaux (I)

et (II) sont décrites en détails ci-dessous.

Anticorps monoclonal (I) L'anticorps monoclonal (I) présente les

caractéristiques suivantes de réaction.

(a) Il réagit avec un antigène composé d'un protéine contenant un acide sialique et présentant une masse

moléculaire d'environ 600 kD.

(b) Il ne réagit pratiquement pas avec des cellules humaines de cancer du foie, de la vessie, ou du gros intestin, ni avec des cellules cancéreuses humaines nerveuses ou d'embryon, ni avec les surnageants de culture de ces cellules, ni avec les composants, solubilisés par des tensio-actifs non-ioniques, des produits de rupture de ces cellules. (c) Il ne réagit pratiquement pas avec les leucocytes humains normaux, ni avec les cellules normales humaines de la vésicule biliaire, de la rate, du côlon et de l'oesophage, ni avec les cellules normales humaines rénales, placentaires,musculaires, hépatiques, intestinales, pancréatiques, cérébrales, osseuses, ni avec les composants, solubilisés par des tensio- actifs non

ioniques, des produits de rupture de ces cellules.

(d) Il ne réagit pratiquement pas avec le sérum humain

normal.

(e) Sa réactivité avec un antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées est telle que l'absorbance mesurée dans un procédé d'EIE en phase solide est d'environ 2 à environ 5 fois celle mesurée par le même procédé pour cet

antigène seul.

L'anticorps monoclonal (I) fourni par la présente invention réagit fortement avec un antigène composé d'une glycoprotélne contenant un acide sialique et présentant une masse moléculaire d'environ 600 kD (kilodaltons), et on peut donc l'utiliser pour identifier et doser des substances présentant comme composant la glycoprotéine contenant un acide sialique. Une glycoprotéine contenant un acide sialique est une protéine qui contient un acide sialique dans la partie de chaîne à acide sialique. Quand cette protéine est traitée avec une solution à 40 % de neuraminidase, sa réactivité avec l'anticorps monoclonal est perdue, et lorsqu'elle est traitée avec de la trypsine A concentration élevée, sa réactivité avec l'anticorps monoclonal demeure. On pense donc que cet anticorps monoclonal (I) reconnaît la partie liée de la chaîne A acide sialique, ainsi que la chaine peptidique de cette

glycoprotéine contenant un acide sialique.

La masse moléculaire de cette glycoprotéine contenant un acide sialique est mesurée par électrophorèse SDS-PAGE et par immuno-buvard (immunoblotting). La glycoprotéine contenant un acide sialique existe dans les cellules cancéreuses ovariennes humaines et dans les cellules cancéreuses pulmonaires humaines, et/ou elle est libérée dans le sang par ces cellules. On a déterminé que l'anticorps monoclonal (I) de cette invention réagit fortement avec des cellules de cancer ovarien épithélial humain, des cellules de cancer pulmonaire humain, les surnageants de culture de ces cellules, les composants de ces cellules solubilisés par des tensio-actifs non ioniques, le sérum d'un patiente présentant un cancer épithélial des ovaires, et le sérum d'un patient présentant

un cancer du poumon.

On a aussi déterminé que l'anticorps monoclonal (I) de cette invention ne réagit pratiquement pas avec des antigènes associés à une tumeur qui ne contiennent ni ne libèrent de glycoprotéine contenant un acide sialique, comme des cellules de cancer humain de la vessie ou du gros intestin, des cellules cancéreuses humaines hépatiques ou nerveuses, des cellules embryonnaires humaines cancéreuses, les surnageants de culture de ces cellules et

les composants, solubilisés par des tensio-actifs non-

ioniques, des produits de rupture de ces cellules.

On a également déterminé que l'anticorps monoclonal (I) de cette invention ne réagit pratiquement pas avec la plupart des cellules humaines normales, par exemple les leucocytes humains normaux, les cellules normales humaines rénales, musculaires, hépatiques, intestinales, cérébrales ou osseuses, les cellules humaines normales de vésicule biliaire, de placenta, de rate, de côlon, de pancréas ou d'oesophage, ni avec les composants, solubilisés par des tensio-actifs non-ioniques, des produits de rupture de ces cellules, ni avec les sérums humains normaux. Cependant, l'anticorps monoclonal (I) réagit faiblement avec l'antigène (antigène HI) dérivé de cellules humaines indifférenciées, utilisé comme immunogène. En particulier, sa réactivité avec un antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées est telle que l'absorbance mesurée par un procédé d'EIE en phase solide est d'environ 2 à environ 5 fois celle mesurée, par le même procédé, pour cet antigène

seul.

En outre, l'anticorps monoclonal (I) réagit faiblement avec les cellules humaines normales de poumons, d'ovaires ou de glande thyroïde. En particulier, sa

réactivité avec les composants, solubilisés par des tensio-

actifs non-ioniques, des produits de rupture de cellules normales humaines de poumons, d'ovaires ou de glande thyroïde est telle que l'absorbance mesurée par un procédé d'EIE en phase solide est d'environ 2 fois à environ 5 fois celle mesurée, par le même procédé, pour les seuls

composants solubilisés.

On suppose que cette réactivité est due à une réaction croisée. Toutefois, la faible réactivité ci-dessus de l'anticorps monoclonal (I) de cette invention vis-à-vis de l'antigène HI et des cellules normales humaines de poumons, d'ovaires ou de glande thyroïde est beaucoup plus faible que sa réactivité vis-à-vis de la glycoprotéine contenant un acide sialique, et ne constitue pas un obstacle pratique à la détection de la glycoprotéine contenant un acide

sialique à l'aide de l'anticorps monoclonal (I).

Dans la présente invention, la réactivité des anticorps monoclonaux vis-àvis de divers antigènes est déterminée par essais immuno-enzymatiques en phase solide (voir par exemple D. M. Weir: Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978)) et par le procédé au CAB (Essai au complexe avidinebiotinylperoxidase de raifort sur tranche de paraffine fixée à la formaline (Hsu et al.:

J. Histochem. Cytochem., 29, 577 (1981)).

- En ce qui concerne la réactivité de l'anticorps

monoclonal avec les composants, solubilisés par des tensio-

actifs non-ioniques, des produits de rupture des cellules soumises à l'essai, l'expression "l'anticorps ne réagit pratiquement pas" signifie que l'absorbance mesurée dans l'EIE en phase solide est inférieure au quintuple de celle (valeur pour l'essai à blanc) mesurée pour les seuls composants solubilisés, selon le même procédé. L'expression "l'anticorps réagit fortement" signifie que l'absorbance mesurée par le procédé cidessus est supérieure à 30 fois la

valeur pour l'essai à blanc.

L'anticorps monoclonal (I) de cette invention est

rattaché à une classe d'IgM.

Un exemple convenable d'antigène HI utilisé dans la production de l'anticorps monoclonal (I) est un composant

solubilisé que l'on obtient en traitant, avec les tensio-

actifs non-ioniques mentionnés plus haut, un produit de rupture de cellules d'un embryon humain agé de 7 à 10 semaines. Un exemple convenable d'antigène dérivé de cellules de cancer humain des ovaires est un composant

solubilisé que l'on obtient en traitant, avec les tensio-

actifs non-ioniques mentionnés ci-dessus, un produit de

rupture de cellules de cancer humain des ovaires.

AnticorsR monoclonal (II) L'anticorps monoclonal (II) présente les

caractéristiques suivantes de réaction.

(a) Il réagit avec un antigène composé d' foetoprotéine. (b) Il ne réagit pratiquement pas avec des cellules de cancer humain des ovaires, du poumon, de la vessie, du gros intestin, des cellules humaines cancéreuses nerveuses ou d'embryon, les surnageants de culture de ces cellules

et les composants, solubilisés par des tensio-actifs non-

ioniques, des produits de rupture de ces cellules.

(c) Il ne réagit pratiquement pas avec des cellules humaines normales de la glande thyroide, de la vésicule biliaire, du placenta, de la rate, du côlon, du pancréas, de l'oesophage, des leucocytes humains normaux, des cellules humaines normales rénales, musculaires, pulmonaires, hépatiques, intestinales, cérébrales ou osseuses, ni avec

les composants, solubilisés par des tensio-actifs non-

ioniques, des produits de rupture de ces cellules.

(d) Il ne réagit pratiquement pas avec un sérum humain normal. (e) Sa réactivité avec un antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées est telle que l'absorbance, mesurée par un procédé d'EIE en phase solide est d'environ 2 fois à environ 5 fois celle mesurée, par le même procédé,

pour cet antigène seul.

L'anticorps monoclonal (II) fourni par cette $

invention réagit fortement avec un antigène d' h-

foetoprotélne, et on peut donc l'utiliser pour identifier et doser des substances contenant l'0-foetoprotéIne comme

composant. Quand un échantillon authentique d <-

foetoprotéIne est traité avec une solution à 40 % de neuraminidase, sa réactivité avec l'anticorps monoclonal est perdue. Au contraire, quand il est traité avec de la trypsine, sa réactivité n'est pas perdue, même si la concentration de la trypsine est élevée. Il apparait donc que l'anticorps monoclonal (II) reconnait la partie acide

sialique de la chaîne de l'0-foetoprotéIne. On sait que l'0-

foetoprotéIne existe dans les cellules de cancer humain du foie, et/ou est libérée dans le sang par ces cellules (voir T. M. Chu: "Alphafetoprotein' dans "Biochemical Markers for Cancer", Maareel Dekker, New York (1982)). On a déterminé que l'anticorps monoclonal (II) réagit fortement avec des cellules de cancer humain du foie, un surnageant de culture de cellules de cancer humain du foie, et les

composants, solubilisés par des tensio-actifs non-

ioniques, d'un produit de rupture de cellules de cancer du foie, ainsi qu'avec le sérum d'un patient présentant un

cancer du foie.

On a déterminé d'autre part que l'anticorps monoclonal (II) ne réagit pratiquement pas avec des

antigènes associés à une tumeur qui ne contiennent pas d'&-

foetoprotéine ni n'en libèrent, par exemple des cellules de cancer humain des ovaires ou du gros intestin, des cellules cancéreuses humaines nerveuses ou d'embryon, les surnageants de culture de ces cellules et les composants, solubilisés par des tensio-actifs non-ioniques, des

produits de rupture de ces cellules.

On a également déterminé que l'anticorps monoclonal (II) de cette invention ne réagit pratiquement pas avec la plupart des cellules humaines normales, par exemple des leucocytes humains normaux, des cellules humaines normales de rein, de vésicule biliaire, de placenta, de rate, de côlon, de pancréas ou d'oesophage, des cellules humaines normales musculaires, hépatiques, cérébrales, osseuses, ou

des composants, solubilisés par des tensio-actifs non-

ioniques, des produits de rupture de ces cellules, pas plus qu'avec du sérum humain normal. Toutefois, l'anticorps monoclonal (II) réagit faiblement avec l'antigène (antigène HIY dérivé de cellules humaines indifférenciées, utilisé comme immunogène. En particulier, sa réactivité avec un antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées est telle que l'absorbance mesurée par le procédé d'EIE en phase solide est d'environ 2 fois à environ 5 fois celle mesurée,

par le même procédé, pour cet antigène seul.

En outre, en raison d'une réaction croisée fondée sur une similitude des cellules, l'anticorps monoclonal (II) réagit faiblement avec un extrait de cellule hépatique humaine normale. Cependant, cette faible réactivité de l'anticorps monoclonal (II) avec l'antigène HI et les cellules hépatiques humaines normales est beaucoup plus faible que sa réactivité avec l'&-foetoprotéIne et ne gêne pratiquement pas la détection d'cfoetoprotéine à l'aide de

l'anticorps monoclonal (II).

La réactivité de l'anticorps monoclonal (II) avec les

composants, solubilisés par des tensio-actifs non-

ioniques, d'un produit de rupture de cellules hépatiques humaines normales est telle que l'absorbance, mesurée par EIE en phase solide, est d'environ 2 fois à environ 5 fois celle mesurée, par le même procédé, pour les composants

solubilisés seuls.

Un exemple convenable de l'antigène HI utilisé dans la production de l'anticorps monoclonal (II) est un composant solubilisé que l'on obtient en traitant un produit de rupture de cellules d'un embryon humain, âgé de 7 à 10 semaines, avec les tensio-actifs non-ioniques mentionnés plus haut. Un exemple convenable de l'antigène dérivé de cellules cancéreuses hépatiques humaines est un composant solubilisé que l'on obtient en traitant un produit de rupture de cellules cancéreuses hépatiques humaines avec les tensio-actifs non-ioniques mentionnés plus haut. Les anticorps monoclonaux (I) et (II) présentent la propriété de pouvoir reconnaître spécifiquement, respectivement, une

glycoprotéine contenant un acide sialique et l'x-

foetoprotéIne. Grâce à cette propriété, on peut utiliser l'anticorps monoclonal (I) pour diagnostiquer un cancer des ovaires ou un cancer du poumon avec une très bonne Justesse, en mesurant la concentration d'antigène dans les fluides corporels par le radio-immuno-essai décrit par D. M. Weir: Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978), ou bien par EIE en phase solide ou par une technique de dosage d'anticorps faisant appel à la fluorescence, ou encore par visualisation de la radioactivité de l'anticorps monoclonal (I) marqué par des radio-isotopes. On peut également l'utiliser en immunothérapie, les tissus cancéreux ovariens ou pulmonaires étant pris comme cible, ou dans une-thérapie par médicaments projectiles, avec un complexe d'anticorps monoclonal et d'agent anticancéreux, qui véhicule spécifiquement l'agent anti-cancéreux jusqu'à la tumeur cancéreuse des ovaires ou du poumon. L'anticorps monoclonal (II) peut être utilisé pour le diagnostic et le traitement

du cancer du foie selon des procédés semblables.

Les exemples suivants illustrent plus précisément la

présente invention.

EXEMPLE 1

(1) Préparation d'un antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées (antiène HI) On s'est procuré légalement, selon les règles stipulées par la Société Japonaise d'Obstétrique et de Gynécologie, un embryon mort âgé de 7 à 10 semaines. On enlève de l'embryon le foie et les intestins différenciés, et on ajoute à l'embryon traité 150 ml d'un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4), contenant 0,1 % de NP-40. On homogénéise le mélange, puis on l'agite toute une nuit à 4C pour rompre les cellules, et on sépare les composants insolubles par centrifugation à 10.000 t/mn pendant 1 heure. On fait passer le surnageant à travers un filtre Millipore (0,4}bm; produit de Japan Millipore Co.), puis on l'utilise comme antigène. La concentration en protéines de l'antigène est

de 10 mg/ml.

(2) Préparation d'un antigène dérivé d'un cancer des

ovaires (antigène CT) pour l'immunisation supplémentaire.

On rompt des tissus cancéreux ovariens humains dans du sérum physiolique tamponné au phosphate 0,1 M STP contenant 0,1 % de NP-40, et on agite le tout pendant une nuit à 4C pour solubilisation et extraction. On soumet l'extrait à

une centrifugation pour éliminer les composants insolubles.

On fait passer l'extrait résultant sur un filtre Millipore (0,45Am; produit de Japan Millipore Co.), puis on dilue le filtrat avec du STP 0,1 M de façon que sa concentration en

protéines devienne de 5 mg/ml.

(3) Immunisation de souris BALB/c On administre par voie intrapéritonéale l'antigène obtenu au point (1) ci-dessus à des souris de race BALB/c, en 3 fois, en une quantité de 0,1 à chaque fois, à intervalles de 2 semaines. A titre d'injection finale, on administre aux mêmes souris, par voie intraveineuse, 0,1 ml de l'antigène obtenu au point (1). Deux semaines après cette injection finale, on administre aux mêmes souris, par voie intraveineuse, 0,1 ml de l'antigène CT préparé au point (2), de façon à réaliser une immunisation supplémentaire des

souris.

(4) Fusion cellulaire Trois jours après l'immunisation supplémentaire, on prélève des cellules de râte sur les souris immunisées. Les cellules de rate sont hachées, écrasées et égouttées sur une grille en acier inoxydable, puis mises en suspension dans un MEM d'Eagle, ce qui donne une suspension de cellules de rate. Cette suspension est lavée 3 fois, ainsi que des cellules myélomateuses de souris NS-1, avec du MEM exempt de sérum, et on mélange les deux en un rapport de 10:1. On soumet le mélange à une centrifugation à 800 t/min pendant minutes. On désintègre le culot de centrifugation, et on ajoute progressivement 1 ml d'une solution à 44 % de polyéthylène-glycol 2.000 dans du MEM. Le mélange est incubé à 37 'C pendant 8 minutes, pour que s'effectue la fusion cellulaire. Huit minutes plus tard, on ajoute 1 ml de

MEM. On ajoute ensuite du MEM à raison de 2 ml par minute.

Quand le volume total du mélange atteint 10 ml, on soumet ce

mélange à une centrifugation à 1000 t/min pendant 5 minutes.

On élimine le surnageant. Le culot de cellules obtenu est mis en suspension dans du milieu RPMI 1650 contenant 10 % de sérum foetale de bovin (SFB), de façon que la concentration de NS-1 soit de 10 cellules par ml. La suspension est déposée sur une micro-plaque à 96 puits, à raison de 0,1 ml par puits. Un jour plus tard, on ajoute, à raison de 0,1 ml par puits, du milieu RPMI 1640 à 10 % de SFB, contenant de l'hypoxanthine (1.10 M),5de l'aminoputérine (4.10-7 M) et de la thymidine (1,6.10 M) (milieu que l'on appelera "milieu HAT"). Ensuite, on remplace, tous les 3 à 4 jours, la moitié du milieu par du milieu HAT, afin de sélectionner des hybridomes à l'aide du milieu HAT. En 10 à 14 jours, les hybridomes prolifèrent dans presque tous les puits. A ce

moment, le taux d'apparition d'hybridome est de 18,7 %.

(5) Sélection de cellules productrices d'anticorps On s'est procuré les antigènes CT suivant: SK-MES-1, ME 180 et MBI, dérivés de cancer humain de poumons; LI-7, HuH-7 et HC-4, dérivés de cancer humain du foie; HuB-4, HuB-15, Hu-15N et HuB-40, dérivés de cancer humain de la vessie; SK-N-FI, SK-N-AS et SK-N-DZ, dérivés de cancer humain des nerfs; CO-3, dérivé de 'cancer humain du gros

intestin; MEC, dérivé de cancer humain des ovaires.

D'autre part, on s'est procuré les cellules humaines normales suivantes: cellules humaines de rein, de glande thyroïde, de vesicule biliaire, de rate, de poumon, de foie, de côlon, de pancréas, d'oesophage et de cerveau, leucocytes, cellules placentaires, musculaires, intestinales, osseuses, et cellules humaines indifférenciées. Des cellules SK-MES-1 sont rompues dans du STP 0,1 M contenant 0,1 % de NP-40 et on agite le tout pendant une nuit à 4'C pour une solubilisation et une extraction des cellules. On soumet l'extrait à une centrifugation et on élimine les composants insolubles. On dilue l'extrait avec du STP 0,1 M, de façon que sa concentration en protéines

soit de 0,5 mg/ml. On dépose l'extrait dilué sur une micro-

plaque à 96 puits, à raison de 50 > /puits, pour un essai immunoenzymatique. On fait ensuite incuber la plaque à 37'C pendant 2 heures. On lave la plaque 3 fois avec du STP contenant 0,05 % de Tween 80 (STP-T80). On ajoute dans chaque puits 50 jll d'albumine de sérum bovin à 0,1 % (ASB), et on conserve la plaque à 4 C (plaque à cellules tumorales fixées) . Selon le même mode opératoire, on prépare des plaques à antigène CT fixes et des plaques à cellules normales fixées, en utilisant les antigènes CT et les cellules normales indiquées ci-dessus. La plaque conservée

à cellules tumorales fixées est lavée 3 fois avec du STP-T-

, et le surnageant de culture obtenu au point (4) ci-

dessus est ajouté à raison de 50 JL par puits. On fait incuber la plaque à 37'C pendant 1 heure, puis on la lave 3 fois avec du STP-T-80. Un anticorps anti-IgG de souris, marqué à la peroxydase de raifort, est dilué 1000 fois, puis ajouté à la microplaque, à raison de 50 4l/puits, puis on réalise une incubation à 37'C pendant 1 heure. On lave la plaque 3 fois avec du STP-T-80, et on ajoute à la plaque, à raison de 100/A1/puits, une solution colorante contenant 60 ml de tampon citrate- phosphate 0,02 M (pH 8,0), 5 Xl de solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène et 50 mg d'ABTS, de façon à provoquer une coloration. On arrête ensuite la réaction en ajoutant une solution à 0,25 % de HF, et on mesure l'absorbance de la solution à 510 nm afin de déterminer la réactivité de l'anticorps produit par les cellules productrices d'anticorps avec chacun des antigènes testés. Le taux de conversion lors de la réaction avec

l'antigène CT est de 15,3 %.

(6) Clona&e des hybridomes Les hybridomes des puits qui présentent une réactivité selon le point (5) ci-dessus sont enlevés et dilués avec du milieu RPMI 1640, contenant 10 % de sérum

foetale de bovin. Le mélange est déposé sur une micro-

plaque, à raison de 0,5 cellule par puits. Des cellules intrapéritonéales de souris, utilisées comme cellules nourricières, sont déposées sur la micro-plaque en une densité de 2.106/ml et cultivées. Tout en remplaçant le

milieu, on poursuit la culture pendant environ 2 semaines.

Dans les puits dans lesquels des colonies d'hybridomes apparaissent, on dose les anticorps selon le procédé indiqué au point (5) ci-dessus, et les hybridomes qui présentent une réaction positive vis-à-vis de l'antigène CT sont sélectionnés et clones à nouveau. L'hybridome 5F11 obtenu a été déposé au Fermentation Research Institute,

Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japon, sous le numéro FERM BP-

1997. (7) Préparation d'un anticorps monoclonal Du Pristan (produit de Aldrich Co.) est administré par voie intrapéritonéale à des souris de race BALB/c, agées de plus de 7 semaines, en une quantité de 0,5 ml. Plus d'une semaine après, on a inoculé par voie intrapéritonéale des cellules d'hybridome 5F11 ayant proliféré, à raison de 1 à 9.105 cellules par souris. Une semaine après, le poids corporel des souris ayant reçu l'inoculation d'hybridomes 5F11 commence brutalement à augmenter, et cette

augmentation de poids atteint un maximum en 10 à 15 jours.

- On prélève les ascites sur les souris, lorsque le poids

corporel de celle-ci est approximativement à son maximum.

On soumet ces ascites à une centrifugation à 3000 t/min pendant 10 minutes, pour obtenir, par souris, de 5 à 15 ml

de liquide ascitique contenant un anticorps monoclonal.

(8) Purification de l'anticorps monoclonal A partir de 10 ml du liquide ascitique obtenu au point (7) ci-dessus, on purifie l'anticorps monoclonal selon le procédé Hudson et al. (Practical Immunilogy, Blackwell Sci. Pub., 1976). Une solution aqueuse saturée de sulfate

d'ammonium (10 ml) est ajoutée à 10 ml du liquide ascitique.

On laisse reposer le mélange, puis on le soumet à une centrifugation. Le culot est dissous dans 5 ml de tampon phosphate 0,1 M, et on dialyse la solution contre 500 ml de tampon phosphate 0,1 M. Après la dialyse, le dialysat est centrifugé à 10000 t/min pendant 10 minutes, et l'on obtient un surnageant. On fait passer le surnageant sur une colonne de Sépharose DEAE (produit de Pharmacia Co.). On lave la colonne avec du tampon phosphate, puis on la soumet à un gradien linéaire de concentrations de sel pour éluer des fractions d'anticorps. On fait encore passer les fractions

d'anticorps obtenues sur une colonne de Séphadex G-

(un produit de Pharmacia Co.), et l'on obtient 153p.g

d'anticorps monoclonal 5F11.

(9) Réactivité de l'anticorps monoclonal (a) Réactivité avec des extraits de cellules L'anticorps monoclonal obtenu au point (8) ci-dessus est dilué avec du tampon phosphate, jusqu'à une concentration de 10 ug/ml. En utilisant la solution obtenue au lieu du surnageant de culture du point (8), on répète ce mode opératoire sur les plaques à antigènes CT fixés, les plaques à cellules normales fixées et les plaques à antigènes HI fixés, préparées au point (5). On détermine les réactivités de l'anticorps monoclonal avec des extraits des antigènes CT, des cellules normales et de l'antigène HI, et

les résultats sont donnés dans le tableau 1.

(b) Réactivité avec les surnageants de culture de cellules Les cellules à antigène CT indiquées au point (5) ont été soumises à une culture et conditionnées dans un milieu exempt de sérum (GIT, milieu Daigo T, produit par Japan Pharmaceutical Co., Ltd.). On concentre chacun des surnageants de culture, de façon que la concentration de

protéines soit de 1 mg/ml, de la même façon qu'au point (5).

On obtient des plaques auxquelles ont été fixés les surnageants de culture de cellules à antigène CT. Les réactivités de l'anticorps monoclonal ont été déterminées selon le même procédé qu'au point (9), (a), sur les plaques auxquelles sont fixés les surnageants de culture de cellules à antigène CT. Les résultats sont donnés dans le

tableau 2.

* (c) Réactivité avec des cellules On a étudié les réactivités d'anticorps monoclonaux avec des cellules à antigène CT et des cellules normales,

préparées au point (5) ci-dessus, en utilisant l'immuno-

coloration de tissus (Hsu et al.: J. Histochem. Cytochem., 29, 577-581, 1981), selon le procédé ABC sur tranches minces de paraffine. On prépare ces tranches de paraffine en fixant des cellules avec de la formaline à 10 % de tampon phosphate, en les noyant dans de la paraffine, en découpant la masse en tranches et en fixant ces tranches à des lames de verre. La paraffine est ensuite éliminée pendant 20 minutes, puis les tranches sont lavées avec du STP et ensuite plongées dans une solution à 0,25 % de trypsine, à 37'C pendant 1 heure. Après immersion, elles sont lavées avec du STP et encore plongées dans une solution à 0,3 % de peroxyde d'hydrogène, à température ambiante pendant 30 minutes, puis on effectue un masquage avec du sérum de chèvre normale (SCN), et on fait réagir le produit avec l'anticorps monoclonal en une concentration de 1 mg/ml, pendant 1 heure. Après la réaction, on lave les tranches avec du STP. Un anticorps caprin anti-IgG de souris, marqué à la biotine (produit de Tago Co.) est dilué jusqu'à une concentration 20 fois plus faible, et mis à réagir. On lave les tranches, puis on les fait réagir avec 0,5 ml de la solution ABC préparée avec une trousse VECTASTAIN ABC. On lave encore les tranches avec du STP. On les fait encore réagir avec une solution à 0,005 % de H202-diaminobenzidine tétrachlorydrate (DAB). On les lave encore avec du STP, puis on les colore avec du Vert de méthyle à 1 %, et on les enrobe dans de la gélatine glycérolée. Après enrobage, on observe les échantillons au microscope optique. A partir du degré de coloration des cellules, on détermine la réactivité des cellules avec l'anticorps monoclonal. Les résultats

sont donnés dans le tableau 3.

(10) Classe d'immunoalobuline de l'anticorps monoclonal On ajoute 1 % d'agarose à du STP 1/15 M et on fait bouillir le mélange pour obtenir une solution. On fait ensuite solidifier cette solution, en une épaisseur de 1 mm, sur une lame de verre. On y forme des trous, d'un diamètre de 3 mm, & intervalle de 3 mm. Dans chacun des trous, on dépose 15 Sl de sérum anti-Ig de souris d'une certaine classe, et 15 pl d'une solution de l'anticorps monoclonal obtenu au point (8) ci-dessus, et on laisse reposer la lame

de verre dans une boite humide pendant 10 heures.

L'anticorps monoclonal obtenu au point (8) ci-dessus présente une précipitation, caractérisant une réaction

antigène-anticorps, dans le sérum anti-IgM de souris.

(11) Identification d'un antiène reconnu par l'anticorps monoclonal Une solution à 5 % d'acrylamide, contenant 0,1 % de dodécylsulfate de sodium (DSS) et 0,1 % de persulfate de sodium, est placée entre 2 plaques de verre (10 cm x 10 cm) dans un dispositif d'électrophorèse sur plaque (fabriqué par ATTO Co., Ltd.), et solidifiée, de façon à préparer 2 plaques pour électrophorèse ou DSS. 10 /1 de l'antigène CT obtenu au point(2) sont ajoutés à 40l 1 d'une solution de dodécylsulfate de sodium 2mM contenant 0,01 % de Bleu de Bromo-phényle (un produit de Sigma Co.), et on chauffe le mélange à 100 C pendant 1 minute. Après chauffage, on ajoute le mélange à chacune des plaques d'électrophorèse au DSS. On fait passer dans les plaques un courant de 5 mA pendant 10 heures, pour effectuer l'électrophorèse. Après le passage du courant, l'une des plaques est colorée avec du Bleu Brillant de Coomassie (un produit de Sigma Co.), et on mesure la masse moléculaire. On prend une membrane de nitrocellulose sur laquelle on transfère l'autre plaque, à l'aide d'un dispositif & buvard (fabriqué par ATTO Co., Ltd.). On la fait ensuite réagir avec l'anticorps monoclonal, puis avec un anticorps anti-IgM de souris, marqué au HRP. On colore la membrane de nitrocellulose à l'aide d'une solution colorante, et on détecte une bande d'un antigène. A ce moment, la masse moléculaire de l'antigène est d'environ 600000. On traite cet antigène avec une solution de neuraminidase à 40 %, à 37 C pendant 30 minutes, et on prépare, de la même façon qu'au point (5), une plaque sur laquelle sont fixées des cellules tumorales. Lorsqu'on examine la réaction de l'anticorps avec l'antigène, la réactivité de l'anticorps disparaît. Ceci conduit à l'hypothèse selon laquelle l'antigène contient une chaine d'acide sialique, et cette chaine d'acide sialique est

constituée par un acide sialique.

EXEMPLE 2

On prépare un antigène HI selon le même procédé que dans l'exemple 1, au point (1). On prépare ensuite un antigène CT, à partir de cellules d'un cancer hépatique humain, selon le même procédé que dans l'exemple 1, au point (2). De la même façon que dans l'exemple 1, au point (3), on fait subir à des souris, avec ces antigènes, une première immunisation et une immunisation supplémentaire. Après l'immunisation supplémentaire, on effectue une fusion cellulaire comme dans l'exemple 1 au point (4), et on sélectionne, à partir des hybridomes, des cellules productrices d'anticorps, comme dans l'exemple 1, au point (5). A ce moment, le taux de fusion est de 18,6 %, et le taux de conversion de la réaction est de 15,3 %. L'hybridome 6H13, de réactivité positive, a été déposé au Fermentation Research Institute, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japon, sous le numéro FERM BP-2525. Cet hybridome 6H13 a été cloné selon le même procédé que dans l'exemple 1, au point (6), et on a obtenu et purifié un anticorps monoclonal à partir de l'hybridome 6H13, selon les mêmes procédés que dans l'exemple 1, aux points (7) et (8). On a mesuré la réactivité de cet anticorps monoclonal comme dans l'exemple 1, au point (9), et les résultats sont donnés dans les

tableaux 1 à 3.

EXEMPLE 3

On prépare un antigène HI selon le même procédé que dans l'exemple 1, au point (1). Puis on prépare un antigène CT selon le même procédé que dans l'exemple (1), au point

(2), à partir de cellules de cancer humain de la vessie.

Avec ces antigènes, on réalise sur des souris une première immunisation et une immunisation supplémentaire, de la même façon que dans l'exemple 1, au point (3). Après l'immunisation supplémentaire, on effectue la fusion cellulaire comme dans l'exemple 1, au point (4). A partir des hybridomes, on sélectionne des cellules productrices d'anticorps, selon le même procédé que dans l'exemple 1, au point (5). A ce moment, le taux de fusion est de 18,2 % et

le taux de conversion de la réaction est de 14,3 %.

L'hybridome de réactivité positive est cloné selon le même procédé que dans l'exemple 1, au point (6), et à partir de l'hybridome obtenu 6G12, on obtient et on purifie un anticorps monoclonal, selon les mêmes procédés que dans l'exemple 1, au point (7) et (8). On mesure la réactivité de l'anticorps monoclonal obtenu de la même façon que dans l'exemple 1, aux points (9), et les résultats sont donnés

dans les tableaux 1 à 3.

- 32 -

Taleeau 1 (extraits) Anticorps monoclonal ype de - 5Fll 6H13 6G12 Type de cellules -' Cancer_ __.SK-MES-1 0,49 0;01 0;01 Cancer du ME 180 0,43 ot l 0,01 poum on

________ 0;47 0,01 0,01

11%------------------------[------

LI-7 0,01 0146 0,01

Cancer du HuH-7 0,01 0,48 0,01 HC-4 0;01 0,45 Ol01 Cellu- __________ _______ __ __ ____ ___ les H 4 0,01 0 01 0,52

Cancer. . ....

tUrno- de 12 HuEB-15 0,01 0,01 0146 rales vessie __________________ Hu15N 0O01 0.01 0.48 HuB-40 O.01 0,01 0,49

SK-N-F1 0;01 0;01 001

Cancer des SK-N-AS 0,01 0,01 0,01 nerfs

SK-N-DZ 0,01 0701 0,01

Cancer du CO-3 0,01 0,01 0,01 Gros Intestin Cancer des.EC 0;50 0;01 0,01 ovaires otO ap %se Dum. q

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Tab.eau 3' (cellules) Anticorps monoclonal

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Type de cellules:-.. _ Cancer du

ME 180. ....

pcumon

Cancer du L.I-7 - -

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SK-.-DZ

Cancer du gros Intestin 0-3 Cancer des

o,'a - -resúC-- -

Note: trs forte coloraticn -:fi/ble colin-aticn -:as de coloration

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EXEMPLE COMPARATIF 1

(1) Prépa!ration d'un antigène HI Avec 150 ml de tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) contenant 0,1 % de NP-40, on a traité un embryon humain mort, âgé de 7 à 10 semaines, obtenu légalement selon les règles stipulées par la Société Japonaise d'Obstétrique et de Gynécologie. Le mélange est homogénéisé, puis agité pendant 1 nuit à 4 C, et on élimine les composants insolubles par centrifugation à 10000 t/min pendant 1 heure. On fait passer le surnageant de centrifugation sur un filtre Millipore de 0,5JLm (fabriqué par Japan Millipore Co.) et on l'utilise comme antigène HI. La concentration de

protéines de l'antigène HI est de 15 mg/ml.

(2) Immunisation de souris BALB/c On administre par voie intrapéritonéale l'antigène HI obtenu au point (1) à des souris, à 3 reprises, avec un

intervalle de 2 semaines, à raison de 0,1 ml à chaque fois.

A la fin, on administre 0,1 ml de ce même antigène aux souris, par voie intraveineuse. Trois jours après l'administration finale, on saigne les souris à blanc et on

recueille leur sang.

(3) Purification de l'anticorp On laisse reposer le sang obtenu au point (2) à la température ambiante pendant 2 heures pour le faire coaguler, et on recueille le sérum. On traite le sérum à 3 reprises avec du sulfate d'ammonium en solution saturée à 33 %, afin de provoquer une précipitation, puis on le dialyse contre du sérum physiologique tamponné au phosphate 0,15 M (pH 7,4) pour obtenir un anticorps purifié. Sa concentration de proétines est de 1,5 mg/ml. On utilise

l'anticorps après l'avoir dilué au dixième avec du STP.

(4) Etude de la spécificité de réaction de l'anticorps On se procure les antigène CT suivants: SK-MES-1, ME et MBI, dérivés de cancer humain des poumons; LI-7, HuH-7 et HC-4, dérivés de cancer humain du foie; HuB-4, HuB-15, Hu-15N et HuB-40, dérivés de cancer humain de la vessie; SK-N-FI, SK-N-AS et SK-N-DZ, dérivés de cancer humain des nerfs; CO-3, dérivé de cancer humain du gros intestin; NEC, dérivé de cancer humain des ovaires; on se procure également des cellules humaines normales. On rompt des cellules SK-MES-1 dans du STP 0,1 M, contenant 0,1 Z de NP-40, et on agite toute une nuit à 4 C pour effectuer leur solubilisation et leur extraction. On soumet l'extrait à une centrifugation pour éliminer les composants insolubles. On dilue ensuite l'extrait avec du STP 0,1 M, de façon que sa concentration de protéine devienne de 0,5 mg/ml. On dépose l'extrait dilué sur une micro-plaque de 96 puits pour EIE, à raison de 50 pl par puits. On fait ensuite incuber la micro-plaque à 30 C pendant 2 heures, puis on la lave 3 fois avec du STP contenant 0,05 % de Tween 80 (T-80-STP). On ajoute 0,1 Z d'albumine de sérum bovin (ASB) à raison de 50)I par puits, et on laisse reposer cette micro-plaque à 4 C (plaque à antigène CT fixé). De la même façon, on prépare des plaques à cellules tumorales fixées, en utilisant diverses cellules tumorales de culture. La plaque mise en réserve, à antigène CT fixé, est lavée 3 fois avec du T-80STP, et l'anticorps purifié obtenu au point (3) est ajouté à raison de 50> 1 par puits. On fait incuber la plaque à 37 C pendant 1 heure,

puis on la lave 3 fois avec du T-80-STP. Un anticorps anti-

IgG de souris, marqué au HRP, est dilué jusqu'à une concentration 1000 fois plus faible, et ajouté à raison de "Ll par puits. On fait encore incuber la plaque à 37'C pendant 1 heure, et on la lave 3 fois avec du T80-STP. On ajoute une solution colorante, contenant 60 ml de tampon citrate-phosphate 0,02 M (pH 8,0), 5 k'1 de peroxyde d'hydrogène et 50 mg d'ABTS, à raison de 100 / par puits, pour provoquer une coloration. On arrête la réaction avec une solution à 0,25 % de HF, et on mesure l'absorbance à

510 nm.

L'anticorps résultant présente une réactivité avec toutes les cellules tumorales et toutes les cellules normales testées. Il est difficilement possible d'isoler un anticorps utile, qui réagisse spécifiquement davantage avec les antigènes CT qu'avec l'anticorps ci-dessus.

EXEMPLE COMPARATIF 2

L'immunisation supplémentaire, la fusion cellulaire, la sélection de cellules productrices d'anticorps, le clonage des hybridomes, la préparation d'un anticorps monoclonal et la purification de l'anticorps monoclonal sont effectués de la même façon que dans l'exemple 1, sauf que l'on utilise l'antigène CT, préparé comme dans l'exemple 1 au point (2), à la place de l'antigène HI

utilisé pour l'immunisation dans l'exemple 1 au point (3).

L'anticorps monoclonal obtenu n'a pas de spécificité pour le cancer des ovaires, mais réagit fortement avec tous les

antigènes CT dérivés de tumeurs et les cellules normales.

EXEMPLE DE REFERENCE

Application de l'anticorps monoclonal (EIE en phase

solide à immunosuppression).

On se procure des cellules NEC dérivées d'un cancer humain des ovaires, et des cellules SK-MES-1, ME 180 et MBI,

dérivées d'un cancer humain des poumons.

On rompt les cellules NEC dans du STP 0,1 M contenant 0,1 % de NP-40 et on agite pendant une nuit à 4 C pour réaliser une solubilisation et une extraction. On soumet l'extrait à une centrifugation pour éliminer les composants insolubles. On dilue l'extrait avec du STP 0,1 M de façon que sa concentration en protéines soit de 0,5 mg/ml. On dépose l'extrait dilué sur une micro-plaque à 96 puits pour EIE, à raison de 50 A.l par puits. On fait ensuite incuber la plaque à 37'C pendant 2 heures, puis on la lave à 3 reprises avec du T-80-STP. On dépose de l'albumine de sérum bovin à 0,1 % sur la plaque, à raison de 50 1l par puits, et on met la plaque en réserve à 4 C (plaque à antigène CT fixé). De la même façon que ci-dessus, on prépare des plaques à cellules tumorales fixées, en utilisant divers cellules tumorales de culture. La plaque à cellules tumorales

fixées, mise en réserve, est lavée à 3 reprises avec du T-

80-STP, et on dépose sur la plaque, à raison de 50 jÀl par puits, l'anticorps monoclonal obtenu dans l'exemple 1 au point (4) et le sérum d'un patient portant une tumeur ou du sérum humain normal. On fait incuber la plaque à 37'C

pendant 1 heure, puis on la lave à 3 reprises avec du T-80-

STP. Un anticorps anti-IgM de souris marqué au HRP, est dilué jusqu'à une concentration 1000 fois plus faible, et ajouté à raison de 50/Al par puits. On fait incuber la plaque à 37 C pendant 1 heure, puis on la lave à 3 reprises avec du T-80-STP. On ajoute sur la plaque, à raison de 100 Al par puits, une solution colorante contenant 60 ml de tampon citratephosphate 0,02 M (pH 8,0), 5 1l de peroxyde d'hydrogène et 50 mg d'ABTS. Après coloration, on ajoute une solution à 0,25 % de HF pour arrêter la réaction. On mesure l'absorbance à 510 nm, et on détermine la réactivité de

l'anticorps. Les résultats sont donnés dans le tableau 4.

Tableau 4

_____________________________________________________

| |iSérums de ISérums de ISérums de |Sérums | |Ipatientes Ipatients Ipatients |humainsi | |Iprésentant iprésentantiprésentant Inormaux| | lun cancer |un cancer Ides tumeurs| | Ides ovaires|du poumon Ibénignes INombre de | isujets à I I Itest | 49 | 42 2 j O | Ipositif I ú I INombre de | Isujets à I Itest | 0 | 0 | 38 | 62

négatif 1.

IProportion| Ide cas Ipositifs I 100 100 5 0

----------I à----------- à---------- à--------- à-à I------

Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Anticorps monoclonal, caractérisé en ce que: (a) il réagit avec un antigène composé d'une glycoprotéine contenant un acide sialique et présentant une masse moléculaire d'environ 600 kD, (b) il ne réagit pratiquement pas avec des cellules de cancer humain du foie, des cellules de cancer humain de la vessie, des cellules cancéreuses nerveuses humaines, des cellules de cancer humain du gros intestin, des cellules cancéreuses embryonnaires humaines, les surnageants de culture de ces cellules, les composants, solubilisés par des tensio-actifs non-ioniques, des produits de rupture de ces cellules, (c) il ne réagit pratiquement pas avec des cellules rénales humaines normales, des cellules humaines normales de vésicule biliaire, des leucocytes humains normaux, des cellules placentaires humaines normales, des cellules humaines normales de rate, des cellules musculaires humaines normales, des cellules hépatiques humaines normales, des cellules humaines normales du côlon, des cellules intestinales humaines normales, des cellules pancréatiques humaines normales, des cellules humaines normales de l'oesophage, des cellules cérébrales humaines normales, des cellules osseuses humaines normales, et les

composants, solubilisés par des tensio-actifs non-

ioniques, des produits de rupture de ces cellules, (d) il ne réagit pratiquement pas avec du sérum humain normal, et (e) il présente, avec un antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées, une réactivité telle que l'absorbance, mesurée selon le procédé EIE en phase solide, est d'environ 2 à environ 5 fois celle mesurée, par le même procédé, pour l'antigène dérivé de cellules humaines

indifférenciées, seul.

2. Anticorps monoclonal conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que sa réactivité avec des composants, solubilisés par des tensio-actifs non-ioniques, des produits de rupture de cellules pulmonaires humaines normales, de cellules ovariennes humaines normales ou de cellules humaines normales de glande thyroïde est telle que l'absorbance mesurée par EIE en phase solide est d'environ 2 fois à environ 5 fois celle mesurée pour les composants

solubilisés seuls, par le même procédé.

3. Anticorps monoclonal conforme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est produit par un hybridome formé fusion cellulaire de cellules productrices d'anticorps et de cellules myélomateuses de souris, les dites cellules productrices d'anticorps étant obtenues à partir de souris immunisées avec un antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées et ensuite avec un antigène dérivé de

cellules de cancer humain des ovaires.

4. Anticorps monoclonal conforme à la revendication 3, caractérisé en ce que l'antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées est constitué de composants, solubilisés par des tensio-actifs non-ioniques, d'un produit de rupture de cellules d'un embryon humain âgé de 7 à 10 semaines, et l'antigène dérivé de cellules d'un cancer des ovaires est constitué des composants, solubilisés par des tensio-actifs non-ioniques, d'un produit de rupture de

cellules d'un cancer humain des ovaires.

5. Anticorps monoclonal conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène composé d'une glycoprotéine contenant un acide sialique et présentant une masse moléculaire d'environ 600 kD est choisi parmi des cellules de cancer épithélial humain des ovaires, des cellules de cancer humain des poumons, les surnageants de culture de ces cellules, le sérum d'une patiente humaine présentant un cancer épithélial des ovaires et le sérum d'un

patient humain présentant un cancer des poumons.

6. Anticorps monoclonal conforme à la revendication 1,

caractérisé en ce qu'il appartient à la classe IgM.

7. Anticorps monoclonal conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'hybridome présente les

caractéristiques de l'hybridome FERM BP-1997.

8. Anticorps monoclonal, caractérisé en ce que:

(a) il réagit avec un antigène composé d' -

foetoprotélne, (b) il ne réagit pratiquement pas avec des cellules d'un cancer humain des ovaires, des cellules d'un cancer humain des poumons, des cellules d'un cancer humain de la vessie, des cellules d'un cancer humain des nerfs, des cellules d'un cancer humain du gros intestin, des cellules cancéreuses embryonnaires humaines, les surnageants de culture de ces cellules et les composants, solubilisés par des tensio-actifs nonioniques, des produits de rupture de ces cellules, (c) il ne réagit pratiquement pas avec des cellules rénales humaines normales, des cellules humaines normales de glande thyroïde, des cellules humaines normales de vésicule des leucocytes humains normaux, des cellules placentaires humaines normales, des cellules humaines normales de rate, des cellules musculaires humaines normales, des cellules pulmonaires humaines normales, des cellules hépatiques humaines normales, des cellules humaines normales de colon, des cellules intestinales humaines normales, des cellules pancréatiques humaines normales, des cellules humaines normales de l'oesophage, des cellules cérébrales humaines normales, des cellules osseuses humaines normales, et des composants, solubilisés par des tensio-actifs non-ioniques, des produits de rupture de ces cellules, (d) il ne réagit pratiquement avec du sérum humain normal, et (e) il présente, avec un antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées, une réactivité telle que l'absorbance mesurée par le procédé EIE en phase solide est d'environ 2 fois à environ 5 fois celle mesurée, par le même procédé, pour l'antigène dérivé de cellules humaines

indifférenciées, seul.

9. Anticorps monoclonal conforme à la revendication 8, caractérisé en ce que sa réactivité avec les composants, solubilisés par des tensio-actifs non-ioniques, d'un produit de rupture de cellules hépathiques humaines normales est telle que l'absorbance mesurée par EIE en phase solide est d'environ 3 fois à environ 5 fois celle mesurée,

par le même procédé, sur les composants solubilisés seuls.

10. Anticorps monoclonal conforme à la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est produit par un hybridome que l'on obtient en immunisant une souris avec un antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées et en plus avec un antigène dérivé de cellules de cancer humain du foie, en obtenant des cellules productrices d'anticorps à partir de la souris, et en fusionnant ces cellules productrices

d'anticorps avec des cellules myélomateuses de souris.

11. Anticorps monoclonal conforme à la revendication 10, caractérisé en ce que l'antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées est constitué des composants, solubilisés par des tensio-actifs non-ioniques, d'un produit de rupture de cellules d'un embryon humain âgé de 7 à 10 semaines, et l'antigène dérivé de cellules de cancer humain du foie est constitué des composants, solubilisés par des tensio-actifs non-ioniques, d'un produit de rupture

de cellules de cancer humain du foie.

12. Anticorps monoclonal conforme à la revendication 8,

caractérisé en ce qu'il appartient à la classe IgM.

13. Anticorps monoclonal conforme à la revendication 10, caractérisé en ce qu'il présente les caractéristiques de

l'hybridome FERM BP-2525.

14. Procédé de production d'un anticorps monoclonal, caractérisé en ce qu'il comporte l'immunisation d'un animal avec un antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées, l'immunisation supplémentaire de cet animal avec un antigène dérivé de cellules tumorales, l'isolement de cellules productrices d'anticorps à partir de l'animal, la fusion des cellules productrices d'anticorps avec des cellules myélomateuses pour préparer des hybridomes, la sélection, parmi les hybridomes, de celui qui produit l'anticorps monoclonal désiré, la culture de l'hybridome sélectionné, et la récupération de

l'anticorps monoclonal par l'hybridome.

15. Procédé conforme à la revendication 14, caractérisé

en ce que l'animal immunisé est une souris ou un rat.

16. Procédé conforme à la revendication 14, caractérisé en ce que les cellules myélomateuses sont des cellules

myélomateuses dérivées d'une souris ou d'un être humain.

17. Procédé conforme à la revendication 14, caractérisé en ce que l'immunisation de l'animal avec l'antigène dérivé de cellules humaines indifférenciées est effectuée 3 à 6

fois, à intervalles de 2 à 6 semaines.

18. Procédé conforme à la revendication 14, caractérisé en ce que l'immunisation supplémentaire avec l'antigène dérivé de cellules tumorales est effectuée 1 à 6 semaines après l'immunisation finale de l'animal avec l'antigène

dérivé de cellules humaines indifférenciées.