WO2005002617A2 - Utilisation de compositions contenant une forme soluble d'hla-g dans le traitement de pathologies du sang - Google Patents

Utilisation de compositions contenant une forme soluble d'hla-g dans le traitement de pathologies du sang Download PDF

Info

Publication number
WO2005002617A2
WO2005002617A2 PCT/FR2004/001663 FR2004001663W WO2005002617A2 WO 2005002617 A2 WO2005002617 A2 WO 2005002617A2 FR 2004001663 W FR2004001663 W FR 2004001663W WO 2005002617 A2 WO2005002617 A2 WO 2005002617A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hla
cells
soluble
isoform
blood
Prior art date
Application number
PCT/FR2004/001663
Other languages
English (en)
Other versions
WO2005002617A3 (fr
Inventor
Catherine Menier
Edgardo Delfino Carosella
Nathalie Rouas-Freiss
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
Priority to JP2006516337A priority Critical patent/JP2007520428A/ja
Priority to EP04767507A priority patent/EP1638596A2/fr
Priority to US10/562,659 priority patent/US20070020703A1/en
Publication of WO2005002617A2 publication Critical patent/WO2005002617A2/fr
Publication of WO2005002617A3 publication Critical patent/WO2005002617A3/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • compositions containing a soluble form of HLA-G in the treatment of pathologies of the blood and of the circulatory system (anemias and ischemias).
  • MHC antigens are divided into several classes, class I antigens (HLA-A, HLA-B and HLA-C) which have 3 globular domains ( ⁇ l, ⁇ 2 and ⁇ 3), and whose ⁇ 3 domain is associated with ⁇ 2 microglobulin, class II antigens (HLA-DP, HLA-DQ and HLA-DR) and class III antigens (complement).
  • class I antigens include, in addition to the abovementioned antigens, other antigens, called non-classical class I antigens, and in particular the HLA-E, HLA-F and HLA-G antigens.
  • this gene comprises 8 exons, 7 introns and a 3 'untranslated end; the 8 exons correspond respectively to: exon 1: signal sequence, exon 2: extracellular domain ⁇ 1, exon 3: extracellular domain ⁇ 2, exon 4: extracellular domain ⁇ 3, exon 5: transmembrane region, exon 6: cytoplasmic domain I, exon 7: cytoplasmic domain II (untranslated), exon 8: cytoplasmic domain III (untranslated) and 3 'untranslated region (GERAGHTY et al., supra; ELLIS et al., J. Im unol., 1990, 144, 731-735 ; KIRSZENBAUM M.
  • exon 1 signal sequence
  • exon 2 extracellular domain ⁇ 1
  • exon 3 extracellular domain ⁇ 2
  • exon 4 extracellular domain ⁇ 3
  • exon 5 transmembrane region
  • exon 6 cytoplasmic domain I
  • exon 7 cytoplasmic domain II (un
  • HLA-G gene differs from other class I genes in that the translation termination codon, in phase, is located at the second codon of exon 6; consequently, the cytoplasmic region of the protein encoded by this HLA-6.0 gene is shorter than that of the cytoplasmic regions of the HLA-A, -B and -C proteins.
  • HLA-G antigens are mainly expressed by cytotrophoblastic cells of the placenta and are considered to play a role in the protection of the fetus (absence of rejection by the mother).
  • the HLA-G antigen is monomorphic, it may also be involved in the growth or function of placental cells (KONATS et al., Science, 1990, 248, 220-223).
  • Other research concerning this non-classical class I antigen has shown that the primary transcript of the HLA-G gene can be spliced in several ways and produces at least 3 distinct mature AR ⁇ m: the primary transcript of HLA-G provides a complete copy (Gl) of 1200 bp, a fragment of 900 bp (G2) and a fragment of 600 bp (G3).
  • the Gl transcript does not include exon 7 and corresponds to the sequence described by ELLIS et al. (cited above), that is to say that it codes for a protein which comprises a signal sequence, three external domains, a transmembrane region and a cytoplasmic sequence.
  • AR ⁇ m G2 does not include exon 3, that is to say that it codes for a protein in which the domains ⁇ l and ⁇ 3 are directly joined;
  • AR ⁇ G3 contains neither exon 3 nor exon 4, that is to say that it codes for a protein in which the ⁇ 1 domain and the transmembrane sequence are directly joined.
  • the splicing which prevails for obtaining the HLA-G2 antigen involves the joining of an adenine (A) (originating from the domain coding for ⁇ 1) with an AC sequence (originating from the domain coding for ⁇ 3), which leads to the creation of an AAC codon (asparagine) in place of the GAC codon (aspartic acid), encountered at the start of the sequence coding for the ⁇ 3 domain in HLA-G 1.
  • AAC codon asparagine
  • GAC codon aspartic acid
  • HLA-G molecule plays a fundamental role in protecting the fetus from a maternal immune response (induction of immune tolerance). Some of the inventors have confirmed this role: the HLA-G molecules, expressed on the surface of the trophoblasts, effectively protect fetal cells from lysis by natural killer ( ⁇ K) cells. maternal (CAROSELLA ED et al., CR Acad. Sci., 318, 827-830; CAROSELLA ED et al; Immunol. Today, 1996, 407-409).
  • HLA-G mRNA the HLA-G4 transcript, which does not include exon 4; the HLA-G5 transcript, which includes intron 4, between exons 4 and 5, thus causing a modification of the reading frame, during the translation of this transcript and in particular the appearance of a stop codon, after l amino acid 21 of intron 4; the HLA-G6 transcript, having intron 4, but having lost exon 3 (KIRSZENBAUM M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209-4213; European Application EP 0 677 582; KIRSZENBAUM M.
  • HLA-G mRNAs which potentially encode 7 isoforms of HLA-G including 4 membranes (HLA-G1, G2, G3 and G4) and 3 soluble (HLA-G5, G6 and G7).
  • HLA-G antigen is restricted to privileged immune sites and in particular to the feto-maternal interface.
  • membrane-bound protein HLA-G1 is mainly expressed by extraviral cytotrophoblast cells in which it protects the fetus from immune cells of maternal origin.
  • Both membrane-bound isoforms and soluble isoforms are immunotolerant, that is, they inhibit cytolysis mediated by NK cells and CTLs as well as the alloproliferative T response; in addition, they induce apoptosis in T cells and NK CD8 + cells.
  • the HLA-G protein exercises its function locally, both when it is expressed on the surface of cells and when it is secreted (action to distance); it thus ensures the immunosurveillance of the organism (Teyssier Em. Et al., Nat. Immunol, 1995, 14, 262-270).
  • these soluble isoforms of HLA-G are present in the erythroid cells of the placental vessels of the 1 st trimester of pregnancy as well as during the early vascularization of the embryo and throughout erythropoiesis.
  • the inventors have shown that the soluble isoforms of HLA-G also exert non-immunological functions. It is therefore an object of the invention to provide new applications of the soluble isoforms of HLA-G, directly linked to their non-immunological functions, in particular in pathologies of the blood circulation such as anemia or 'ischemia.
  • a subject of the present invention is therefore the use of a composition comprising at least one soluble HLA-G isoform and at least one pharmaceutically acceptable vehicle, for the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies of the blood circulation .
  • pathologies of the blood circulation is meant both pathologies of the blood and pathologies of the circulatory system (means of circulation).
  • said pathology is selected from the group consisting of anemias and ischemias.
  • the inventors have shown the interest of soluble isoforms of HLA-G: 1. in the proliferation, differentiation and maturation of erythroblasts into reticulocytes.
  • compositions are in one of the following forms: - liquid form, suitable for parenteral or oral administration, - solid form, suitable for parenteral administration after dissolution or suspension, or oral administration.
  • excipients suitable for these two forms are preferably: water,
  • the present invention also relates to a method for detecting and optionally sorting cells with a non-immunological function expressing a soluble isoform of HLA-G (cells of erythrocyte and endothelial lines) in a biological sample, which method is characterized in that that it comprises at least the following steps: (a) bringing the biological sample to be tested into contact with a panel of antibodies selected from the group consisting of antibodies directed against the following markers: soluble HLA isoform -G, CD71, CD34 and CD45, and (b) detecting and optionally sorting cells corresponding to different stages of differentiation of erythrocyte or endothelial lines, according to their expression profile for the markers defined in (a).
  • the biological sample comprises: (a) bringing the biological sample to be tested into contact with a panel of antibodies selected from the group consisting of antibodies directed against the following markers: isoform soluble in HLA-G, CD71, CD34 and CD45, (a ') the selection of cells expressing the soluble isoform of HLA-G and (b) the detection of the cell type using the marker CD71.
  • the biological sample is advantageously: a blood sample (detection of circulating erythroid cell cells) or a bone marrow sample.
  • HSC hematopoietic stem cells
  • P-Sp / AGM para-aortic splanchnopleura / aorta-gonad-mesonephros intra-embryonic region
  • - Erythroid cells first hematopoietic cells to appear during intraembryonic life, which will give rise to mature red blood cells.
  • yolk sac yolk sac
  • islets of blood that appear in the yolk sac as groups of cells between 15 and 24 days from development of the embryo and which differentiate into endothelial cells from the external cells of the clusters and into hematopoietic cells from the internal cells.
  • Hemangioblast common precursor of endothelial cells and hematopoietic cells present in the yolk sac.
  • Primary hematopoietic organs embryonic liver, fetal bone marrow.
  • the cells of said biological sample are permeabilized; this step allows the antibodies to effectively access the markers to be detected, which are secreted in the cytoplasm, before their passage into the general circulation (case of the soluble isoforms of HLA-G).
  • the soluble isoform of HLA-G is expressed in all the cells of the erythroid line and in all the hematopoietic organs, from the embryo to the adult, whereas it is not found in mature erythrocytes.
  • no expression of a soluble isoform of HLA-G is observed in the hematopoietic stem cells (HSC) CD34 + CD45 + ; this implies that the soluble isoform of HLA-G has no action on multipotent stem cells.
  • HSC hematopoietic stem cells
  • the soluble isoform of HLA-G is produced in vitro during the differentiation of the erythroid line, whatever the stage of maturation.
  • the soluble HLA-G isoform is involved in the proliferation and / or maturation of the precursors of the erythroid line.
  • the soluble HLA-G isoform is expressed in endothelial cells at an early stage in the embryo, whereas it is not found in the endothelial cells of mature vessels. In particular, it is detected in the budding vessels of the chorionic villi and of the juxta-allantoic part of the yolk sac.
  • FIG. 1 illustrates the specificity of the antibody 5A6G7 vis-à-vis the soluble forms of HLA-G.
  • Figure 1A illustrates the results obtained by Western blot. The specificity of the 5A6G7 antibody was tested on the M8-pcDNA, M8-HLA-Gl, M8-HLA-G5 and M8-HLA-G6 lines; in parallel, the 4H84 antibody (McMaster et al., J. immunol., 1998 and Paul et al., Hum.
  • the 4H84 antibody reveals 3 bands corresponding to HLA-G 1, HLA-G5, and HLA-G6; the 5A6G7 antibody reveals 2 bands corresponding to HLA-G5 and HLA-G6.
  • the M8-pcDNA line, not expressing HLA-G, is not labeled with either the 4H84 antibody or the 5A6G7 antibody.
  • Figure 1B shows the results obtained by immunocytochemistry. The specificity of the 5A6G7 antibody was tested on the M8-pcDNA, M8-HLA-G1, and M8-HLA-G5 lines, in parallel with the 4H84 antibody and an isotypic control. Positive markings are characterized by a gray color.
  • line 1 the line M8-pcDNA, not expressing HLA-G, is neither marked by the antibody 4H84, nor by the antibody. 5A6G7.
  • lane 2 the line M8-HLA-G1 which does not have the epitope recognized by the antibody 5A6G7 is only marked by the antibody 4H84.
  • lane 3 the M8-HLA-G5 line is labeled with the two antibodies 4H84 and 5A6G7. (magnification x40).
  • Figure IC illustrates the results obtained by immunofluorescence analyzed by confocal microscopy.
  • the specificity of the 5A6G7 antibody was tested on the lines M8-pcDNA, M8-HLA-G1, M8-HLA-G5, FO and FO-HLA-G6. As expected, the M8-HLA-G5 and FO-HLA-G6 cells are labeled with the antibody 5A6G7B12; whereas the M8-pcDNA, M8-HLA-G1 and FO cells which do not have the epitope recognized by the antibody 5A6G7 are not labeled.
  • the 4H84 antibody is a reference antibody which specifically recognizes all of the HLA-G isoforms.
  • soluble isoforms HLA-G5 and G6 in the erythroblasts of the trophoblasts of the first trimester of pregnancy
  • a expression of the soluble isoforms by the cytotrophoblastic islets (cell island trophoblast or CIT) but not by the PVTs ( perivillous trophoblast), determined by immunohistochemical analysis using the antibody 5A6G7 on sections of trophoblasts embedded in paraffin
  • b analysis of the expression of the following markers: HLA-G5 / 6, CD34, CD71 and CD45 on the developing vessels, present in the trophoblast of the first trimester by immunohistochemistry
  • c immunohistochemical staining of a differentiated vessel from trophoblast sections of a 32-day embryo with antibodies directed against HLA-G5 / G6 (5A6G7), CD34 (which marks the endothelial cells (ED) of the vessels, CD71 which identifies erythroid cells (ER)
  • HLA-G5 is detected in erythroid cells which come from the yolk sac and are present in the lumen of the sinusoids (capillaries of the embryo).
  • the endothelial cells are CD45 +.
  • Some cells associated with hepatocytes are CD34 + and CD45 + and can be considered as the first progenitor cells from the AGM.
  • - Figure 4 illustrates the stage of the embryo, the fetus of children and adults analyzed by immunohistochemistry.
  • EXAMPLE 1 Production of a Monoclonal Antibody Called 5A6G7, Directed Specifically against Soluble Isoforms of HLA-G 1.1 Obtaining Ascites The monoclonal antibody 5A6G7 is produced using conventional protocols from splenocytes of Balb / c immunized mice by a synthetic 21-mer peptide corresponding to the C-terminal part encoded by intron 4 of the soluble forms of HLA-G, the sequence of which is: SKEGDGGIMSVRESRSLSEDL (SEQ ID NO: 1), coupled to the ovalbumin carrier protein (OVA).
  • OVA ovalbumin carrier protein
  • the 5A6G7 monoclonal antibody is purified from ascites using protein A-Sepharose affinity chromatography and can be used both for detection, titration and purification of soluble forms of HLA-G.
  • HLA-G5 and HLA-G6 The criteria required to obtain an antibody with good specificity are as follows: - detection of proteins of 37 kDa HLA-G5 and 28 Da HLA-G6 but not of the others HLA-G isoforms and other HLA class I molecules present in protein lysates from M8 cells (cells from the M8 melanoma cell line) transfected respectively by the pcDNA vector alone, HLA-G 1 cDNAs , -G2, -G3, -G4, -G5, or -G6; M8-pcDNA, M8- HLA-G1, M8-HLA-G5 and M8-HLA-G6 are cells derived from the melanoma cell line M8, transfected with the empty vector, HLA-G1, HLA-G5, or HLA- G6, respectively.
  • FO and FO-HLA-G6 are cells from the FO melanoma cell line, transfected by the empty vector or HLA-G6, respectively.
  • This monoclonal antibody makes it possible to discriminate significantly between the soluble HLA-G proteins generated by unhooking the membrane HLA-G forms which do not contain the epitope encoded by intron 4 and the HLA-G5 / -G6 proteins produced from Alternative spliced mRNAs which contain intron 4.
  • Example 2 Detection of soluble HLA-G in circulating cells of chorionic vessels originating from placenta at the first trimester stage
  • the antibody 4H84 is a reference antibody which recognizes all the isoforms of HLA-G.
  • Monoclonal antibodies directed against the CD71 transferrin receptor (Novocastra Laboratories, UK) were used to identify erythroid cells.
  • the monoclonal antibodies directed against CD34 (Novocastra Laboratories) and CD45 (Dako, FR) make it possible to detect hematopoietic progenitor cells whereas only the monoclonal antibody directed against CD34 makes it possible to recognize endothelial progenitor cells. 2.L3.
  • Erythroid cell cultures Cultures of erythroid cells (1.10 5 umbilical cord blood cells or bone marrow cells) are spread on a semi-solid medium containing methylcellulose, 10% MCL (lymphocytic conditioned medium) (Stem cell , Vancouver) and 2 U / ml EPO (Roche, FR). These cultures are incubated at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 , for 14 days. 2-phase liquid culture is used and is defined as follows.
  • the cells are isolated by centrifugation on a gradient of Ficoll 1077 (SIGMA), and cultured at a density of 10 6 cells / ml in minimal alpha essential medium ( ⁇ -MEM, Sigma) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS, Sigma), 1 ⁇ g / ml of cyclosporin A (Novartis) and 10% of medium recovered from cultures of bladder carcinoma cell lines 5637 negative for HLA-G (ATCC n ° HTB-9). The cultures are incubated for 7 days at 37 ° C., under an atmosphere of 5% CO 2 , in air with 98% humidity.
  • SIGMA Ficoll 1077
  • phase II culture After this phase I culture, the non-adherent cells are recovered, washed, and seeded at a density of 0.4 ⁇ 10 6 cells / ml in ⁇ -MEM, 30% FCS, 1% bovine serum albumin, 10 "5 M of ⁇ -mercaptoethanol, 15 mM of L-glutamine, 10 " 6 M of dexamethasone, and 1 U / ml of recombinant erythropoietin (Epo, Roche) for 5-6 days (called phase II culture). 2.1.4.
  • Immunohistochemical analysis Dewaxed tissue sections are subjected to high temperature epitope recovery treatment in 10 mM sodium citrate buffer (pH 6.0) using a commercial microwave device to optimize the immunoassay -reactivity. Tissue sections were permeabilized using PBS IX with 0.1% saponin and 10 mM Hepes buffer. Peroxidase activity endogenous is inhibited by treating the sections for 5 minutes at room temperature with 3% hydrogen peroxide in water. Non-specific fixation is avoided by adding 50 mM Tris, 3% BSA (Sigma), 40% human serum for 20 minutes before staining with the primary antibody for 30 minutes at room temperature.
  • the expression of the HLA-G protein is then evaluated on a series of tissue sections or cells using the universal biotin detection system UltraTech HRP (Immunotech, Coulter, France), according to the manufacturer's instructions.
  • the immunocytochemical analysis of the expression of HLA-G by the BFU-E cells is carried out on cytocentrifuged BFU-E cells, which were recovered from the cultures in semi-solid medium and washed in PBS, before the centrifugation. 2.2 Results As shown in FIG. 2a, the proteins HLA-G5 and HLA-G6 are localized in the cells of extravoid trophoblasts.
  • these soluble HLA-G molecules were detected by staining using the 5A6G7 monoclonal antibodies either in cells in close contact with budding vessels associated with cytotrophoblasts, or in cells devoid of axes villous, or either in cells located in the lumen of mature vessels ( Figures 2b and 2c).
  • This new cellular localization of HLA-G is confirmed by using another anti-HLA-G antibody, the reference monoclonal antibody 87G.
  • the reference monoclonal antibody 87G In order to identify more precisely these cells expressing the protein
  • HLA-G which morphologically resemble erythroblasts
  • an immunohistochemical analysis was performed on a series of trophoblast sections included in paraffin from 32-day embryos by detection of the following markers: the transferrin receptor CD71: expressed from erythroids (BFU-E, burst-forming unit) to reticulocytes CD34: expressed by both endothelial and hematopoietic progenitor cells - CD45: expressed from pro hematopoietic progenitor cells to mature cells of lymphoid and myeloid lines the soluble proteins HLA-G5 and HLA-G6.
  • BFU-E burst-forming unit
  • CD34 expressed by both endothelial and hematopoietic progenitor cells
  • CD45 expressed from pro hematopoietic progenitor cells to mature cells of lymphoid and myeloid lines the soluble proteins HLA-G5 and HLA-G6.
  • EXAMPLE 3 Identification of the Soluble HLA-G5 Isoform in Fetal Erythroblasts
  • the organ in which erythroblasts are the main constituents to know the liver which is the main producer of red cells in the fetus, was used.
  • 3.1.1 Tissues and monoclonal antibodies Proteins are extracted from the liver obtained from 2 separate embryos of 9 and 12 weeks respectively. The tissues to which the analyzes relate are those described in Example 2. The monoclonal antibody 5A6G7 described in Example 1 is used for the immunohistochemical analysis.
  • the proteins are then electro-transferred onto a nitrocellulose membrane (Hybond-C extra).
  • the membrane is then treated against non-specific bonds with 5% of freeze-dried skimmed milk in PBS containing 0.2% of Tween 20 (PBST) overnight at 4 ° C. After washing in PBST, the membrane is incubated with anti-mouse antibodies conjugated to HRP for 30 minutes at room temperature and washed in PBST.
  • the HLA-G proteins are detected by chemiluminescence (ECL Plus Kit) (Menier et al., Hum. Immunol, 2003, 64, 315-326).
  • EXAMPLE 4 Distribution of the Soluble HLA-G5 Isoform to All the Embryonic and Fetal Hematopoietic Organs
  • the distribution of the soluble HLA-G5 Isoform to all the embryonic and fetal hematopoietic organs was analyzed by performing immunohistochemical experiments on sections of embryos and fetal tissue embedded in paraffin, using monoclonal antibodies against HLA-G5, CD71, CD34 or CD45.
  • Materials and Methods The tissues analyzed come from embryonic and fetal hematopoietic organs as described in Example 2.
  • the monoclonal antibodies directed against HLA-G5 (5A6G7) and the markers CD71, CD34 and CD45 of Example 1 were used under the conditions specified in Example 2.
  • HLA-G + cells also express the CD71 receptor and this co-localization exists throughout the duration of embryonic and fetal development: in the yolk sac, in the 16 day embryo, in all the hematopoietic organs of '' a 32-day embryo, in the liver of 12, 34 and 36 weeks, in the bone marrow of 12, 14 and 16 weeks), as well as in the bone marrow in adults. They are therefore indeed a marker for the erythroid line. These results therefore illustrate the role of the soluble isoform of HLA-G in erythropoiesis as a marker in the differentiation of the erythroid line.
  • the detection antibody a biotinylated W6 / 32 monoclonal antibody (Leinco Technologies Inc., Ballwin) recognizing a monomorphic determinant of the heavy chains of HLA class I associated with microglobulin B2, previously diluted 1/250, was incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • HLA-G5 concentration of HLA-G5 is understood between 25.5 ng / ml and 44.3 ng / ml.
  • An immunocytochemical analysis of the corresponding cells confirms that the two-phase liquid culture allows the differentiation of the erythroid cells which are positive for CD71 and co-express CD36 (thrombospondin receptor and marker for identifying the CFU-E and erythroblast stages of erythroid line) at 3-1 of the second culture phase. From these results, it can therefore be concluded that the HLA-G5 molecules detected by ELISA in culture supernatants were indeed produced by erythroid cells during their differentiation.
  • Example 6 Adult bone marrow erythroblasts express HLA-G5
  • HLA-G5 is detected in BFU cells -E by immunocytochemical analysis using several anti-HLA-G monoclonal antibodies such as 5A6G7, MEM-G / 9, and 4H84. In addition, during an immunochemical analysis on sections of bone included in paraffin, HLA-G5 is then localized in erythroblasts from adult bone marrow.
  • EXAMPLE 7 Expression of the Soluble HLA-G Isoform by the Embryonic Endothelial Cells
  • the soluble HLA-G isoform is also identified in the endothelial cells in the budding vessels in two places: in the mesenchymal heart of the chorionic villi and in the juxta-allantoid part of the yolk sac of the early embryo. In each case, the HLA-G isoform co-locates with the CD34 marker.
  • the presence of the soluble isoform of HLA-G in the endothelial cells of the budding vessels of chorionic villi and of the juxta-allantoid part of the yolk sac shows its involvement in the angiogenic process.
  • Example 8 Effect of HLA-G5 on Erythroid Differentiation
  • the effect of HLA-G5 on erythroid differentiation was analyzed on an erythroleukemic line (K562, ATCC) expressing or not HLA-G5, namely: a K562 line. transfected with an HLA-G5 expression plasmid and secreting HLA-G5 (K562- ⁇ cDNA-HLA-G5) and, as a control, a K562 line transfected with the empty vector (K562-pcDNA).
  • glycophorin A and CD36 differentiation markers which appear in the last stages of erythroid differentiation (erythroblast, reticulocyte, mature red blood cell) was analyzed by flow cytometry using commercial antibodies directed against these markers. The results are illustrated below:
  • HLA-G5 is made up of a greater number of mature erythroid cells, which express in greater quantity markers of erythrocyte differentiation.
  • the effect of HLA-G5 on erythroid differentiation is confirmed by co-culture experiments between the two lines, in order to verify that the HLA-G5 form secreted by K562-pcDNA-HLA-G5 induces the differentiation of the line. K562-pcDNA.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Utilisation de compositions contenant une forme soluble d'HLA-G dans le traitement de pathologies du sang et du système circulatoire (anémies et ischémies).

Description

UTILISATION DE COMPOSITIONS CONTENANT UNE FORME SOLUBLE D'HLA-G DANS LE TRAITEMENT DE PATHOLOGIES DU SANG. La présente invention est relative à l'utilisation de compositions contenant une forme soluble d 'HLA-G dans le traitement de pathologies du sang et du système circulatoire (anémies et ischémies). Les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), se divisent en plusieurs classes, les antigènes de classe I (HLA-A, HLA-B et HLA-C) qui présentent 3 domaines globulaires (αl, α2 et α3), et dont le domaine α3 est associé à la β2 microglobuline, les antigènes de classe II (HLA-DP, HLA-DQ et HLA-DR) et les antigènes de classe III (complément). Les antigènes de classe I comprennent, outre les antigènes précités, d'autres antigènes, dits antigènes de classe I non classiques, et notamment les antigènes HLA-E, HLA-F et HLA-G. La séquence du gène HLA-G (gène HLA-6.0) a été décrite par GERAGHTY et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84. 9145-9149) : il comprend 4396 paires de bases et présente une organisation intron/exon homologue à celle des gènes HLA-A, -B et -C. De manière plus précisé, ce gène comprend 8 exons, 7 introns et une extrémité non traduite 3' ; les 8 exons correspondent respectivement à : exon 1 : séquence signal, exon 2 : domaine extracellulaire αl, exon 3 : domaine extracellulaire α2, exon 4 : domaine extracellulaire α3, exon 5 : région transmembranaire, exon 6 : domaine cytoplasmique I, exon 7 : domaine cytoplasmique II (non traduit), exon 8 : domaine cytoplasmique III (non traduit) et région 3' non traduite (GERAGHTY et al., précité; ELLIS et al., J. Im unol., 1990, 144, 731-735 ; KIRSZENBAUM M. et al., Oncogeny of hematopoiesis. Aplastic anémia Eds. E. Gluckman, L. Coulombel, Col- loque INSERM/John Libbey Eurotext Ltd). Toutefois, le gène HLA-G diffère des autres gènes de classe I, en ce que le codon de terminaison de traduction, en phase, est localisé au niveau du deuxième codon de l'exon 6 ; en conséquence, la région cytoplasmique de la protéine codée par ce gène HLA-6.0 est plus courte que celle des régions cytoplasmiques des protéines HLA-A, -B et -C. Ces antigènes HLA-G sont essentiellement exprimés par les cellules cytotrophoblastiques du placenta et sont considérés comme jouant un rôle dans la protection du fœtus (absence de rejet par la mère). En outre, dans la mesure où l'antigène HLA-G est monomorphique, il peut également être impliqué dans la croissance ou la fonction des cellules placentaires (KONATS et al., Science, 1990, 248, 220-223). D'autres recherches concernant cet antigène non classique de classe I (ISHITAΝI et al., Proc. Νatl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3947-3951) ont montré que le transcrit primaire du gène HLA-G peut être épissé de plusieurs manières et produit au moins 3 ARΝm matures distincts : le transcrit primaire d'HLA-G fournit une copie complète (Gl) de 1 200 pb, un fragment de 900 pb (G2) et un fragment de 600 pb (G3). Le transcrit Gl ne comprend pas l'exon 7 et correspond à la séquence décrite par ELLIS et al. (précité), c'est-à-dire qu'il code une protéine qui comprend une séquence signal, trois domaines externes, une région transmembranaire et une séquence cytoplasmique. L'ARΝm G2 ne comprend pas l'exon 3, c'est-à-dire qu'il code une protéine dans laquelle les domaines αl et α3 sont directement joints ; l'ARΝ G3 ne contient ni l'exon 3, ni l'exon 4, c'est-à-dire qu'il code une protéine dans laquelle le domaine αl et la séquence transmembranaire sont directement joints. L'épissage qui prévaut pour l'obtention de l'antigène HLA-G2 entraîne la jonction d'une adénine (A) (provenant du domaine codant αl) avec une séquence AC (issue du domaine codant α3), ce qui entraîne la création d'un codon AAC (asparagine) à la place du codon GAC (acide aspartique), rencontré au début de la séquence codant le domaine α3 dans HLA-G 1. L'épissage généré pour l'obtention de HLA-G3 n'entraîne pas la formation d'un nouveau codon dans la zone d'épissage. Les Auteurs de cet article ont également analysé les différentes pro- téines exprimées : les 3 ARΝm sont traduits en protéine dans la lignée cellulaire .221 -G. Les Auteurs de cet article concluent à un rôle fondamental de la molécule HLA-G dans la protection du fœtus vis-à-vis d'une réponse immune maternelle (induction d'une tolérance immune). Certains des Inventeurs ont confirmé ce rôle : les molécules HLA-G, exprimées à la surface des trophoblastes protègent effectivement les cellules fœtales de la lyse par les cellules natural killer (ΝK) maternelles (CAROSELLA E.D. et al., C.R. Acad. Sci., 318, 827-830 ; CAROSELLA E.D. et al ; Immunol. Today, 1996, 407-409). En outre, certains des Inventeurs ont montré l'existence d'autres formes épissées d'ARNm d'HLA-G : le transcrit HLA-G4, qui n'inclut pas l'exon 4 ; le transcrit HLA-G5, qui inclut l'intron 4, entre les exons 4 et 5, provoquant ainsi une modification du cadre de lecture, lors de la traduction de ce transcrit et en particulier l'apparition d'un codon stop, après l'acide aminé 21 de l'intron 4 ; le transcrit HLA- G6, possédant l'intron 4, mais ayant perdu l'exon 3 (KIRSZENBAUM M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209-4213 ; Demande Européenne EP 0 677 582 ; KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol, 1995, 43, 237-241 ; MOREAU P. et al., Human Immunol. 1995, 43, 231-236) ; et le transcrit HLA-G7 qui inclut l'intron 2, provoquant ainsi une modification du cadre de lecture, lors de la traduction de ce transcrit et l'apparition d'un codon stop après l'acide aminé 2 de l'intron 2 ; ils ont également montré que ces différents transcrits sont exprimés dans plusieurs types de cellules humaines fœtales et adultes, notamment dans les lymphocytes (KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol, 1995, précité ; MOREAU P. et al., Human Immunol. 1995, précité). Il existe donc au moins 7 ARNms HLA-G différents qui codent potentiellement 7 isoformes d'HLA-G dont 4 membranaires (HLA-G1, G2, G3 et G4) et 3 solubles (HLA-G5, G6 et G7). La distribution de l'antigène HLA-G est restreinte à des sites immuns privilégiés et notamment à l'interface fœto-maternelle. Il est maintenant bien établi que la protéine HLA-G1, liée à la membrane est principalement exprimée par les cellules du cytotrophoblaste extraviUeux dans lesquelles elle protège le fœtus des cellules immunes d'origine maternelle. Aussi bien les isoformes liées à la membrane que les isoformes solubles sont immunotolérantes, à savoir qu'elles inhibent la cytolyse médiée par les cellules NK et les CTL ainsi que la réponse T alloproliférative ; en outre, elles induisent une apoptose dans les cellules T et les cellules NK CD8+. Ainsi la protéine HLA-G exerce sa fonction localement, aussi bien lorsqu'elle est exprimée à la surface des cellules que lorsqu'elle est sécrétée (action à distance) ; elle assure ainsi l'immunosurveillance de l'organisme (Teyssier Em. Et al., Nat. Immunol, 1995, 14, 262-270). Des études antérieures ont montré que l'expression des molécules HLA-G à la surface de cellules cibles obtenues par transfection avec des vecteurs comprenant l'ADN génomique de HLA-G, générant potentiellement tous les transcrits alternatifs, permet de protéger lesdites cellules cibles de l'activité lyrique des cellules NK de la couche déciduale de l'endomètre maternel (CHUMBLEY G. et al., Cell Immunol, 1994, 155, 312-322 ; DENIZ G. et al., J Immunol, 1994, 152, 4255-4261). Les Inventeurs, poursuivant leurs travaux ont montré que certaines tumeurs solides exprimaient l'antigène HLA-G, que selon les lignées tumorales, le profil d'expression des isoformes d'HLA-G membranaires et solubles était différent et que la présence des formes membranaires HLA-G1-G4 protégeait les cellules tumorales de la lyse induite par les cellules NK (Demande FR 2 775 294). En outre, certains des Inventeurs ont montré l'intérêt des formes solubles d'HLA-G dans le traitement des états pathologiques inflammatoires de la peau (Demande Internationale PCT WO 00/78337). La Demanderesse a maintenant trouvé, de manière surprenante, d'autres localisations des formes solubles d'HLA-G. En particulier, ces isoformes solubles d'HLA-G sont présentes dans les cellules érythroïdes des vaisseaux placentaires du 1er trimestre de la grossesse ainsi qu'au cours de la vascularisation précoce de l'embryon et pendant toute l'érythropoïèse. Ainsi, de manière surprenante, les Inventeurs ont montré que les isoformes solubles d'HLA-G exercent également des fonctions non-immunologiques. C'est donc un but de l'invention de pourvoir à de nouvelles applications des isoformes solubles d'HLA-G, directement liées à leurs fonctions non- immunologiques, en particulier dans les pathologies de la circulation sanguine telles que l'anémie ou l'ischémie. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'une composition comprenant au moins une isoforme soluble d'HLA-G et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies de la circulation du sang. Au sens de la présente invention, on entend par pathologies de la circulation du sang aussi bien les pathologies du sang que les pathologies du système circulatoire (moyens de circulation). Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ladite pathologie est sélectionnée dans le groupe constitué par les anémies et les ischémies. En effet, les Inventeurs ont montré l'intérêt des isoformes solubles d'HLA-G : 1. dans la prolifération, la différenciation et la maturation des érythroblastes en réticulocytes. L'apport d'HLA-G peut stimuler la maturation des érythroblastes circulants, que l'on peut observer dans certaines des pathologies du système circulatoire (K. N. Wagner et al., Development, 2000, 127, 4949-4958 ; M. Ogawa et al., Blood, 1997, 50, 6, 1081-1092) et 2. dans la néo-vascularisation (processus angiogénique). Conformément à l'invention, lesdites compositions se présentent sous l'une des formes suivantes : - forme liquide, adaptée à une administration parentérale ou orale, - forme solide, adaptée à une administration parentérale après mise en solution ou en suspension, ou à une administration orale. Les excipients adaptés à ces deux formes sont de préférence : eau,
ΝaCl, dextrose, glycérol, éthanol ou une combinaison de ces produits. D'autres substances telles que des agents mouillants, des agents émulsifiants ou des tampons peuvent avantageusement être ajoutés. La présente invention a également pour objet un procédé de détection et éventuellement de tri de cellules à fonction non-immunologique exprimant une isoforme soluble d'HLA-G (cellules des lignées érythrocytaires et endothéliales) dans un échantillon biologique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : (a) la mise en contact de l'échantillon biologique à tester, avec un panel d'anticorps sélectionné dans le groupe constitué par des anticorps dirigés contre les marqueurs suivants : isoforme soluble d'HLA-G, CD71, CD34 et CD45, et (b) la détection et éventuellement le tri de cellules correspondant à différents stades de différenciation des lignées érythrocytaires ou endothéliales, en fonction de leur profil d'expression des marqueurs définis en (a). Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, il comprend : (a) la mise en contact de l'échantillon biologique à tester, avec un panel d'anticorps sélectionné dans le groupe constitué par des anticorps dirigés contre les marqueurs suivants : isoforme soluble d'HLA-G, CD71, CD34 et CD45, (a') la sélection des cellules exprimant l'isoforme soluble d'HLA-G et (b) la détection du type de cellules à l'aide du marqueur CD71. En effet, on peut distinguer les cellules endothéliales exprimant HLA-G et les cellules de la lignée érythroïde exprimant HLA-G, par le fait que uniquement ces dernières expriment le marqueur CD71. Conformément à l'invention l'échantillon biologique est avantageusement : un échantillon de sang (détection de cellules de la lignée érythroïde circulantes) ou un échantillon de moelle osseuse. Définitions - Hématopoïèse primitive : dans la vésicule vitelline, dans les premiers stades du développement ; reconstitution érythromyéloïde à court terme. - Production de cellules souches hématopoïétiques (CSH) : la région intra-embryonnaire splanchnopleura para-aortique/aorte-gonade-mésonéphros (P- Sp/AGM) produit les CSH, correspondant aux précurseurs multipotents et capables d'auto-renouvellement qui vont ensuite coloniser le foie fœtal et le thymus. - Hématopoïèse définitive : commence dans la moelle osseuse à partir du second trimestre de la vie intra-embryonnaire et continue pendant toute la vie adulte. - Cellules érythroïdes : premières cellules hématopoïétiques à apparaître au cours de la vie intraembryonnaire, qui donneront naissance aux globules rouges matures. - Vésicule vitelline (yolk sac) : îlots de sang qui apparaissent dans la vésicule vitelline sous la forme de groupes de cellules entre 15 et 24 jours de développement de l'embryon et qui se différencient en cellules endothéliales à partir des cellules externes des amas (clusters) et en cellules hématopoïétiques à partir des cellules internes. - Hémangioblaste : précurseur commun des cellules endothéliales et des cellules hématopoïétiques présent dans la vésicule vitelline. - Organes hématopoïétiques primaires : foie embryonnaire, moelle osseuse fœtale. - Vaisseaux bourgeonnants : dans les villosités chorioniques et la partie juxta-allantoïdienne de la vésicule vitelline. Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, préalablement à l'étape a), les cellules dudit échantillon biologique sont perméabilisées ; cette étape permet aux anticorps d'accéder effectivement aux marqueurs à détecter, qui sont sécrétés dans le cytoplasme, avant leur passage dans la circulation générale (cas des isoformes solubles d'HLA-G).
Ainsi, on obtient des profils de distribution caractéristiques de cellules, comme illustré ci-après :
Figure imgf000009_0001
En résumé : - l'isoforme soluble d'HLA-G est exprimée dans l'ensemble des cellules de la lignée érythroïde et dans tous les organes hématopoïétiques, de l'embryon à l'adulte, alors que l'on ne la retrouve pas dans les erythrocytes matures. En outre on n'observe pas d'expression d'une isoforme soluble d'HLA-G dans les cellules souches hématopoïétiques (CSH) CD34+ CD45+ ; ceci implique que l'isoforme soluble d'HLA-G n'a aucune action sur les cellules souches multipotentes. On peut également noter que l'isoforme soluble d'HLA-G est produite in vitro lors de la différenciation de la lignée érythroïde, quel que soit le stade de maturation. Ces résultats confirment que l'isoforme soluble d'HLA-G est impliquée dans la prolifération et/ou la maturation des précurseurs de la lignée érythroïde. - l'isoforme soluble d'HLA-G est exprimée dans les cellules endothéliales à un stade précoce chez l'embryon, alors que l'on ne la retrouve pas dans les cellules endothéliales des vaisseaux matures. En particulier, elle est détectée dans les vaisseaux bourgeonnants des villosités chorioniques et de la partie juxta- allantoïdienne de la vésicule vitelline. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre la spécificité de l'anticorps 5A6G7 vis-à-vis des formes solubles d'HLA-G. La figure 1 A illustre les résultats obtenus par Western blot. La spécificité de l'anticorps 5A6G7 a été testée sur les lignées M8-pcDNA, M8-HLA- Gl, M8-HLA-G5 et M8-HLA-G6 ; en parallèle, l'anticorps 4H84 (McMaster et al., J. immunol., 1998 et Paul et al., Hum. Immunol., 2000) a été utilisé : l'anticorps 4H84 révèle 3 bandes correspondant à HLA-G 1, HLA-G5, et HLA-G6 ; l'anticorps 5A6G7 révèle 2 bandes correspondant à HLA-G5 et HLA-G6. La lignée M8-pcDNA, n'exprimant pas HLA-G, n'est marquée ni par l'anticorps 4H84 ni par l'anticorps 5A6G7. La figure 1B montre les résultats obtenus par immunocytochimie. La spécificité de l'anticorps 5A6G7 a été testée sur les lignées M8-pcDNA, M8-HLA-G1, et M8-HLA-G5, en parallèle avec l'anticorps 4H84 et un contrôle isotypique. Les marquages positifs sont caractérisés par une couleur grisée. Pour chacune des trois lignées l'anticorps utilisé pour les marquages est indiqué en haut, ligne 1 : la lignée M8-pcDNA, n'exprimant pas HLA-G, n'est marquée ni par l'anticorps 4H84, ni par l'anticorps 5A6G7. ligne 2 : la lignée M8-HLA-G1 qui ne possède pas l'épitope reconnu par l'anticorps 5A6G7 n'est marquée que par l'anticorps 4H84. ligne 3 : la lignée M8-HLA-G5 est marquée par les deux anticorps 4H84 et 5A6G7. (grossissement x40). La figure IC illustre les résultats obtenus par immunofluorescence analysée en microscopie confocale. La spécificité de l'anticorps 5A6G7 a été testée sur les lignées M8-pcDNA, M8-HLA-G1, M8-HLA-G5, FO et FO-HLA-G6. Comme attendu, les cellules M8-HLA-G5, et FO-HLA-G6 sont marquées par l'anticorps 5A6G7B12 ; alors que les cellules M8-pcDNA, M8-HLA-G1 et FO qui ne possèdent pas l'épitope reconnu par l'anticorps 5A6G7 ne sont pas marqués. L'anticorps 4H84 est un anticorps de référence reconnaissant spécifiquement toutes les isoformes HLA-G. - la figure 2 illustre la présence des isoformes solubles HLA-G5 et G6 dans les érythroblastes des trophoblastes du premier trimestre de la grossesse, a : expression des isoformes solubles par les îlots cytotrophoblastiques (cell island trophoblast ou CIT) mais pas par les PVT (trophoblaste périvilleux), déterminée par analyse immunohistochimique en utilisant l'anticorps 5A6G7 sur des sections de trophoblastes incluses dans de la paraffine ; b : analyse de l'expression des marqueurs suivants : HLA-G5/6, CD34, CD71 et CD45 sur les vaisseaux en développement, présents dans le trophoblaste du premier trimestre par immunohistochimie ; c : coloration immunohistochimique d'un vaisseau différencié à partir de sections de trophoblaste d'un embryon de 32 jours avec des anticorps dirigés contre HLA-G5/G6 (5A6G7), CD34 (qui marque les cellules endothéliales (ED) des vaisseaux, CD71 qui identifie les cellules érythroïdes (ER) et CD45 qui cible à la fois les cellules myéloïdes et les cellules lymphoïdes. - la figure 3 illustre le fait qu'HLA-G5 est présent dans les cellules érythroïdes du foie fœtal : a : identification de l'isoforme soluble HLAG5 par passage des protéines totales extraites de deux foies fœtaux (9 semaines et 12 semaines) sur un gel SDS-PAGE, suivi d'une immunoempreinte (immunoblotting) avec l'anticorps 5A6G7. Les cellules M8 transfectées avec l'ADN d'HLAG-5 (M8-HLA-G5) ou avec le vecteur contrôle seul (M8-pcDNA) sont utilisées respectivement comme contrôles positif et négatif ; b : analyse immunohistochimique d'un foie d'embryon de 32 jours avec les anticorps dirigés contre : HLA-G5 ; CD34 et CD 45. HLA-G5 est détectée dans les cellules érythroïdes qui proviennent de la vésicule vitelline et sont présents dans la lumière des sinusoïdes (capillaires de l'embryon). Les cellules endothéliales sont CD45+. Quelques cellules associées aux hépatocytes sont CD34+ et CD45+ et peuvent être considérées comme les premières cellules progénitrices en provenance de l'AGM. - la figure 4 illustre le stade de l'embryon, du fœtus des enfants et des adultes analysés par immunohistochimie.
Exemple 1 : Production d'un anticorps monoclonal dénommé 5A6G7, dirigé spécifiquement contre les isoformes solubles d'HLA-G 1.1 Obtention d'ascites L'anticorps monoclonal 5A6G7 est produit en utilisant des protocoles classiques à partir de splénocytes de souris Balb/c immunisées par un peptide de 21 -mer synthétique correspondant à la partie C-terminale codée par l'intron 4 des formes solubles d'HLA-G, dont la séquence est : SKEGDGGIMSVRESRSLSEDL (SEQ ID NO : 1), couplé à la protéine porteuse ovalbumine (OVA). 1.2 Phase de purification de l'anticorps monoclonal 5A6G7 L'anticorps monoclonal 5A6G7 est purifié à partir d'ascites en utilisant la chromatographie d'affinité à la protéine A-Sépharose et peut à la fois servir à la détection, la titration, et la purification des formes solubles d'HLA-G. 1.3 Test de spécificité pour les HLA-G5 et HLA-G6 solubles Les critères requis pour obtenir un anticorps ayant une bonne spécificité sont les suivants : - détection des protéines de 37 kDa HLA-G5 et de 28 Da HLA-G6 mais pas des autres isoformes HLA-G et des autres molécules de HLA de classe I présentes dans les lysats de protéines à partir de cellules M8 (cellules issues de la lignée cellulaire de mélanome M8) transfectées respectivement par le vecteur pcDNA seul, des ADNc de HLA-G 1, -G2, -G3, -G4, -G5, ou -G6 ; M8-pcDNA, M8- HLA-G1, M8-HLA-G5 et M8-HLA-G6 sont des cellules issues de la lignée cellulaire de mélanome M8, transfectée avec le vecteur vide, HLA-G1, HLA-G5, ou HLA-G6, respectivement. FO et FO-HLA-G6 sont des cellules issues de la lignée cellulaire de mélanome FO, transfectée parle vecteur vide ou HLA-G6, respectivement. - aucune détection des protéines HLA-A, -B, -C et -E par analyse de type Western-blot (immunoempreinte) des lysats de protéines à partir de lignées cellulaires humaines exprimant des types HLA de classe 1 différents ; - immunoprécipitation de la protéine HLA-G5 de 37 kDa à partir de surnageant cellulaire de M8-HLA-G5 ; - coloration immunocytochimique spécifique des cellules M8-HLA- G5 et M8-HLA-G6 mais pas des autres cellules transfectées par M8-pcDNA, -HLA- Gl, -G3, et -G4, ni par des cellules mononucléaires du sang périphérique provenant de plusieurs donneurs adultes en bonne santé exprimant des types de HLA de classe I distincts ; - coloration immunohistochimique de sections tissulaires de trophoblastes inclus dans de la paraffine mais pas des coupes tissulaires d'adulte normal inclus dans de la paraffine (c'est-à-dire peau, foie, rein, duodénum). Cet anticorps monoclonal permet notablement de discriminer entre les protéines HLA-G solubles générées par décrochage des formes HLA-G membranaires qui ne contiennent pas l'épitope codé par l'intron 4 et les protéines HLA-G5/-G6 produites à partir d'ARNm épissés de façon alternative qui contiennent l'intron 4. Exemple 2 : Détection des HLA-G solubles dans les cellules circulantes des vaisseaux chorioniques provenant de placenta au stade du premier trimestre L'anticorps monoclonal (5A6G7) décrit dans l'exemple 1, a permis d'étudier la répartition tissulaire des isoformes solubles d'HLA-G sur des coupes de tissus. Lors d'une analyse préliminaire, le tissu placentaire au stade du premier trimestre a été analysé. 2.1 Matériels et méthodes 2.1.1 Tissus Les tissus embryonnaires et fœtaux humains ont été analysés à partir de lamelles archivées provenant de grossesses extra-utérines, de fausses-couches et d'avortements à partir de fœtus anormaux (essentiellement trisomies 21 et 18). Le stade de développement de l'embryon est estimé sur la base de plusieurs critères anatomiques selon la classification de Carnegie (O'Rahilly et al., 1987). Au total, 19 embryons, 6 fœtus et 5 adultes ont été sélectionnés et un total de 56 tissus, ont été analysés par immunohistochimie comme illustré à la figure 4. 2.1.2 Anticorps monoclonaux - L'anticorps 5A6G7 a été préparé comme précisé à l'exemple 1. - L'anticorps 4H84 est un anticorps de référence qui reconnaît toutes les isoformes d'HLA-G. - Les anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur CD71 de la transferrine (Laboratoires Novocastra, UK) ont été utilisé pour identifier les cellules érythroïdes. - Les anticorps monoclonaux dirigés contre CD34 (Laboratoires Novocastra) et CD45 (Dako, FR) permettent de détecter les cellules progénitrices hématopoïétiques alors que seul l'anticorps monoclonal dirigé contre CD34 permet de reconnaître les cellules progénitrices endothéliales. 2.L3. Cultures de cellules érythroïdes Des cultures de cellules érythroïdes (1.105 cellules du sang de cordon ombilical ou de cellules de moelle osseuse) sont étalées sur un milieu semi- solide contenant de la méthylcellulose, 10 % de MCL (milieu conditionné lymphocytaire) (Stem cell, Vancouver) et 2 U/ml d'EPO (Roche, FR). Ces cultures sont incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2, pendant 14 jours. La culture liquide à 2 phases est utilisée et est définie comme suit. Sommairement, les cellules (du cordon ombilical par exemple) sont isolées par centrifugation sur gradient de Ficoll 1077 (SIGMA), et mises en culture à une densité de 106 cellules/ml dans du milieu essentiel minimal alpha (α-MEM, Sigma) supplémenté par 10 % de sérum de veau fœtal (FCS, Sigma), 1 μg/ml de cyclosporine A (Novartis) et 10 % de milieu récupéré de cultures des lignées cellulaires de carcinome de vessie 5637 négatives pour HLA-G (ATCC n° HTB-9). Les cultures sont incubées pendant 7 jours à 37°C, sous une atmosphère à 5 % de CO2, dans de l'air avec 98 % d'humidité. Après cette culture de phase I, les cellules non-adhérentes sont récupérées, lavées, et ensemencées à une densité de 0,4x 106 cellules/ml dans du α-MEM, 30 % FCS, 1% d'albumine sérique bovine, 10"5M de β-mercaptoéthanol, 15 mM de L-glutamine, 10"6M de dexaméthasone, et 1 U/ml d'érythropoïétine recombinante (Epo, Roche) pendant 5-6 jours (dénommée culture de phase II). 2.1.4. Analyse immunohistochimique Des coupes de tissus déparaffinées sont soumises à un traitement de récupération d'épitope à haute température dans du tampon citrate de sodium à 10 mM (pH 6,0) en utilisant un appareil à micro-ondes du commerce pour optimiser l'immuno-réactivité. Des coupes de tissus ont été perméabilisées en utilisant du PBS IX avec 0,1% de saponine et 10 mM de tampon Hépès. L'activité de la peroxydase endogène est inhibée en traitant les coupes pendant 5 minutes à température ambiante avec 3% d'eau oxygénée dans de l'eau. La fixation non-spécifique est évitée par ajout de 50 mM de Tris, 3% de BSA (Sigma), 40% de sérum humain pendant 20 minutes avant coloration avec l'anticorps primaire pendant 30 minutes à température ambiante. L'expression de la protéine HLA-G est ensuite évaluée sur une série de coupes tissulaires ou des cellules en utilisant le système de détection universel à la biotine UltraTech HRP (Immunotech, Coulter, France), selon les instructions du fabricant. L'analyse immunocytochimique de l'expression d'HLA-G par les cellules BFU-E est réalisée sur des cellules BFU-E cytocentrifugées, qui ont été récupérées à partir des cultures en milieu semi-solide et lavées dans du PBS, avant la centrifugation. 2.2 Résultats Comme le montre la figure 2a, les protéines HLA-G5 et HLA-G6 sont localisées dans les cellules de trophoblastes extraviUeux. De plus et de façon surprenante, ces molécules HLA-G solubles ont été détectées par coloration à l'aide des anticorps monoclonaux 5A6G7 soit dans des cellules en contact étroit avec des vaisseaux bourgeonnants associés à des cytotrophoblastes, soit dans des cellules dépourvues d'axes villeux, ou soit dans des cellules situées dans la lumière de vaisseaux matures (Figures 2b et 2c). Cette nouvelle localisation cellulaire des HLA-G est confirmée en utilisant un autre anticorps anti-HLA-G, l'anticorps monoclonal 87G de référence. Afin d'identifier plus précisément ces cellules exprimant la protéine
HLA-G, qui ressemblent morphologiquement à des érythroblastes, une analyse immunohistochimique a été réalisée sur une série de coupes de trophoblastes inclus dans de la paraffine provenant d'embryons de 32 jours par détection des marqueurs suivants : le récepteur de la transferrine CD71 : exprimé des érythroïdes (BFU-E, burst-forming unit) aux réticulocytes le CD34 : exprimé à la fois par les cellules progénitrices endothéliales et hématopoïétiques - le CD45 : exprimé à partir des cellules pro génitrices hématopoïétiques jusqu'aux cellules matures des lignées lymphoïdes et myéloïdes les protéines solubles HLA-G5 et HLA-G6. Les résultats montrent que les isoformes solubles sont exprimées par toute la sous-population de cellules érythroïdes CD71+ alors que peu de cellules HLA- G+ co-expriment le marqueur de cellule souche CD34 (Figures 2b et 2c). Au contraire, les cellules endothéliales des vaisseaux chorioniques matures sont CD34+, HLA-G", CD71 " et CD45" (Figure 2c). Ces résultats permettent effectivement de conclure à la présence des isoformes solubles d'HLA-G dans les cellules hématopoïétiques appartenant à la lignée érythropoïétique.
Exemple 3 : Identification de l'isoforme soluble HLA-G5 dans les érythroblastes fœtaux Afin de caractériser l'isoforme soluble d'HLA-G présente dans les cellules _- érythroïdes fœtales, l'organe dans lequel les érythroblastes sont les constituants principaux, à savoir le foie qui est le producteur principal d'hématies dans le fœtus, a été utilisé. 3.1 Matériels et méthodes 3.1.1 Tissus et anticorps monoclonaux Les protéines sont extraites du foie obtenu à partir de 2 embryons distincts respectivement de 9 et 12 semaines. Les tissus sur lesquels portent les analyses sont ceux décrits dans l'exemple 2. L'anticorps monoclonal 5A6G7 décrit à l'exemple 1 est utilisé pour l'analyse immunohistochimique. 3.1.2 Analyse Western blot Des foies fœtaux de 9 et 12 semaines ont été broyés et lysés dans 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 150mM de NaCl, 1% de Nonidet P-40 (Sigma) contenant des inhibiteurs de protéase et du tampon froid pendant 1 heure. Les lysats de cellules transfectées par M8-HLA-G5 et M8-pcDNA étaient utilisés comme respectivement témoins positif et négatif envers HLA-G5. Après centrifugation à 15 000g à 4°C pendant 30 minutes, les surnageants étaient supplémentés par du tampon Leammli 6X. Les échantillons sont chauffés pendant 10 minutes à 95°C avant d'être chargés sur un gel SDS-PAGE à 12%. Les protéines sont alors électro-transférées sur une membrane en nitrocellulose (Hybond-C extra). La membrane est ensuite traitée contre les liaisons non-spécifiques par 5% de lait lyophilisé écrémé dans du PBS contenant 0,2% de Tween 20 (PBST) pendant une nuit à 4°C. Après lavage dans du PBST, la membrane est incubée avec des anticorps anti-souris conjugué à HRP pendant 30 minutes à température ambiante et lavée dans du PBST. Les protéines HLA-G sont détectées par chimio-luminescence (ECL Plus Kit) (Menier et al., Hum. Immunol, 2003, 64, 315- 326). 3.2 Résultats Par analyse Western Mot en utilisant l'anticorps monoclonal 5A6G7, une protéine de 37 kDa, qui correspond au poids moléculaire de la chaîne lourde de HLA-G5 (Figure 3) est identifiée. Les transfectants M8-pcDNA et M8-HLA-G5 sont utilisés respectivement comme témoins positif et négatif envers HLA-G5. Ce résultat montre que l'isoforme soluble d' HLA-G détectée dans les érythroblastes fœtaux est l'isoforme HLA-G5. En accord avec ce résultat, une analyse immunohistochimique a permis de détecter de nombreuses cellules HLA-G+ (incubation avec l'anticorps monoclonal 5A6G7) dans du tissu hépatique fœtal inclus dans de la paraffine, comme détaillé dans 1 ' exemple suivant.
Exemple 4 : Répartition de l'isoforme soluble HLA-G5 à tous les organes hématopoïétiques embryonnaires et fœtaux La répartition de l'isoforme soluble HLA-G5 dans tous les organes hématopoïétiques embryonnaires et fœtaux a été analysée en réalisant des expériences immunohistochimiques sur des coupes d'embryons et de tissu fœtal inclus dans de la paraffine, à l'aide des anticorps monoclonaux dirigés contre HLA-G5, CD71, CD34 ou CD45. 4.1 Matériels et méthodes Les tissus analysés proviennent d'organes hématopoïétiques embryonnaires et fœtaux tels que décrits dans l'Exemple 2. Les anticorps monoclonaux dirigés contre HLA-G5 (5A6G7) et les marqueurs CD71, CD34 et CD45 de l'exemple 1 ont été utilisés dans les conditions précisées à l'exemple 2. 4.2 Résultats On observe la co-localisation d'HLA-G et du récepteur CD71 dans tous les organes hématopoïétiques embryonnaires et fœtaux : la vésicule vitelline, la splanchnopleure para-aortique/Aorta-Gonado-Mesonephros (SpP/AGM), le foie, la rate et la moelle osseuse ; ces résultats confirment que les cellules HLA-G sont des érythroblastes.
Figure imgf000018_0001
Ces résultats montrent que les cellules HLA-G+ expriment également le récepteur CD71 et cette co-localisation existe pendant toute la durée du développement embryonnaire et fœtal : dans la vésicule vitelline, dans l'embryon de 16 jours, dans tous les organes hématopoïétiques d'un embryon de 32 jours, dans le foie de 12, 34 et 36 semaines, dans la moelle osseuse de 12, 14 et 16 semaines), ainsi que dans la moelle osseuse chez l'adulte. Elles sont donc bien un marqueur de la lignée érythroïde- Ces résultats illustrent donc le rôle de l'isoforme soluble d'HLA-G dans l'érythropoïèse en tant que marqueur dans la différenciation de la lignée érythroïde. Par ailleurs, ces résultats montrent qu'aucune cellule souche hématopoïétique CD34+ n'est présente dans la vésicule vitelline d'un embryon de 16 jours contrairement aux cellules souches érythroïdes CD71+. En effet, les cellules souches hématopoïétiques CD34+, CD45+ sont toutes HLA-G". Ceci montre que HLA-G n'intervient pas sur les cellules souches multipotentes. Exemple 5 : Les érythroblastes sanguins du cordon ombilical expriment HLA-G5 Pour déterminer si l'isoforme HLA-G5 est produite directement par les érythroblastes ou bien fixée à la surface cellulaire de l'érythroblaste par l'intermédiaire de récepteurs HLA-G spécifiques, après sa production par d'autres cellules, le sang du cordon ombilical a été choisi comme source d' érythroblastes. 5.1 Matériels et méthodes 5.1.1 Tissus Les unités de sang de cordon ombilical (p/CB) ont été obtenues lors d'accouchements à terme normaux, après le consentement éclairé des mères, à l'Unité Obstétrique de l'Hôpital Robert Debré, à Paris (France). 5.1.2 Essais de cellules formant des colonies d' érythroïdes (BFU-E) en milieu semi-solide voir exemple 2, chapitre cultures de cellules érythroïdes. 5.1.3 Maturation de cellules progénitrices dans la culture liquide à 2 phases Voir exemple 2, chapitre cultures de cellules érythroïdes. La concentration en HLA-G5 dans les surnageants est évaluée par un ELISA qui mesure spécifiquement les HLA-G5/-G6. 5.1.4 Test ELIS A Les concentrations en HLA-G5 sont mesurées dans des surnageants de cultures liquides à deux phases à la fin des phases I et II (méthode de type « sandwich »). Des plaques de microtitration de 96 puits (Corning Costar, France) sont recouvertes d'anticorps monoclonaux 5A6G7. Après 5 lavages dans du tampon phosphate salé (PBS) contenant 0,2% de Tween 20 et 0,1% d'albumine sérique de veau (BSA, Sigma), les plaques sont saturées en PBS contenant 1% de BSA et 0,1% de Tween 20 pendant 2 heures à 37°C. Après 5 lavages dans du PBS avec 0,2% de Tween 20, 100 μl d'échantillon est ajouté dans chaque puits et testé en duplicat. Après incubation pendant 1 heure à 37°C, les boites sont lavées 5 fois dans du PBST (Phosphate Buffer Saline Tween). L'anticorps de détection, un anticorps monoclonal W6/32 biotinylé (Leinco Technologies Inc., Ballwin) reconnaissant un déterminant monomorphique des chaînes lourdes de HLA de classe I associées à la microglobuline B2, préalablement dilué 1/250, a été incubé pendant 1 heure à 37°C. Après lavage dans du PBST, la révélation est réalisée par incubation dans de la streptavidine AMDEX™ conjuguée à la peroxydase de raifort (Amersham) pendant 1 heure à 37°C, puis avec du substrat TMB (3, 3', 5, 5'-tétraméthylbenzidine, Sigma) à température ambiante. La réaction est stoppée par l'ajout d'HCl IN. Les densités optiques sont mesurées à 450 nm. Les courbes d'étalonnage sont réalisées en utilisant des dilutions en série d'HLA-G5 soluble recombinante purifiée. La concentration en HLA-G5 est déterminée à partir de la valeur de densité optique selon la courbe d'étalonnage. Les résultats sont exprimés comme les moyennes du duplicate. La limite de détection par test ELIS A est de 5 ng/ml. 5.2 Résultats Quelle que soit le stade de la culture, c'est à dire à partir de la cellule la plus primitive (BFU-E) jusqu'à la cellule érythroïde la plus différenciée (réticulocyte), la concentration en HLA-G5 est comprise entre 25,5 ng/ml et 44,3 ng/ml. Une analyse immunocytochimique des cellules correspondantes confirme que la culture liquide à deux phases permet la différentiation des cellules érythroïdes qui sont positives pour le CD71 et co-expriment le CD36 (récepteur à la thrombospondine et marqueur pour identifier les stades CFU-E et érythroblastes de la lignée érythroïde) à 3-1 de la seconde phase de culture. D'après ces résultats, on peut donc en conclure que les molécules HLA-G5 détectées par ELISA dans des surnageants de culture étaient bien produites par les cellules érythroïdes au cours de leur différenciation. Exemple 6 : Les érythroblastes de la moelle osseuse adulte expriment HLA-G5 Le maintien de l'expression de l'isoforme HLA-G5 dans la lignée érythropoïétique au cours de la vie chez l'adulte a été étudié. Etant donné que Phématopoïèse est localisée dans la moelle osseuse chez l'adulte, les cellules BFU-E ont été collectées à partir de culture semi-solide de cellules progénitrices hématopoïétiques de moelle osseuse (voir exemple 2). 6.1 Matériels et méthodes 6.1.1. Anticorps monoclonaux Les anticorps monoclonaux suivants ont été utilisés pour détecter les HLA-G : 4H84 est dirigé contre le peptide 61-83 du domaine al de HLA- G et reconnaît la chaîne lourde de HLA-G libre ; - MEM-G/09 (Exbio, Praha, République Tchèque). Tous ces anticorps réagissent avec une molécule de HLA-G associée à β2m correctement repliée. 6.1.3 Méthodes La technique de culture des cellules BFU-E en milieu semi-solide et l'analyse immunochimique ont été utilisées telles que décrites à l'exemple 2. 6.2 Résultats L'isoforme soluble HLA-G5 est détectée dans les cellules BFU-E par analyse immunocytochimique en utilisant plusieurs anticorps monoclonaux anti- HLA-G tels que 5A6G7, MEM-G/9, et 4H84. En outre, lors d'une analyse immunochimique sur des coupes d'os inclus dans de la paraffine, HLA-G5 est alors localisée dans les érythroblastes à partir de moelle osseuse d'adulte. Exemple 7 : Expression de l'isoforme soluble d'HLA-G par les cellules endothéliales embryonnaires L'isoforme soluble d'HLA-G est aussi identifiée dans les cellules endothéliales dans les vaisseaux bourgeonnants à deux endroits : dans le cœur mésenchymal des villosités chorioniques et dans la partie juxta-allantoïde de la vésicule vitelline de l'embryon précoce. Dans chaque cas, l'isoforme HLA-G co-localise avec le marqueur CD34. La présence de l'isoforme soluble d'HLA-G dans les cellules endothéliales des vaisseaux bourgeonnants de villosité chorioniques et de la partie juxta-allantoïde de la vésicule vitelline montre son implication dans le processus angiogénique. Exemple 8 : Effet d'HLA-G5 sur la différenciation érythroïde L'effet d'HLA-G5 sur la différenciation érythroïde a été analysée sur une lignée érythroleucémique (K562, ATCC) exprimant ou non HLA-G5, à savoir : une lignée K562 transfectée avec un plasmide d'expression d'HLA-G5 et sécrétant HLA-G5 (K562-ρcDNA-HLA-G5) et à titre de contrôle, une lignée K562 transfectée par le vecteur vide (K562-pcDNA). L'expression des marqueurs de différenciation glycophorine A (GPA) et CD36 qui apparaissent aux dernières étapes de la différenciation érythroïde (érythroblaste, réticulocyte, globule rouge mature) a été analysée, en cytométrie de flux à l'aide d'anticorps commerciaux dirigés contre ces marqueurs. Les résultats sont illustrés ci-après :
Figure imgf000022_0001
* les valeurs entre parenthèse correspondent à l'intensité moyenne de fluorescence. Les résultats d'immunomarquage montrent que la lignée sécrétant
HLA-G5 est constituée par un nombre plus important de cellules érythroïdes matures, lesquelles expriment en plus grande quantité des marqueurs de différenciation érythrocytaire. L'effet d'HLA-G5 sur la différenciation érythroïde est confirmé par des expériences de co-culture entre les deux lignées, afin de vérifier que la forme HLA-G5 sécrétée par K562-pcDNA-HLA-G5 induit la différenciation de la lignée K562-pcDNA. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Utilisation d'au moins une isoforme soluble d'HLA-G, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies de la circulation du sang. 2°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites pathologies sont sélectionnées dans le groupe constitué par les anémies et les ischémies. 3°) Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ladite isoforme soluble d'HLA-G est sous la forme d'une composition comprenant en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 4°) Utilisation selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite composition est sous forme liquide. 5°) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite composition est sous forme solide. 6°) Procédé de détection et éventuellement de tri de cellules des lignées érythrocytaires et endothéliales selon leur stade de différenciation, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la mise en contact de l'échantillon biologique à tester avec des anticorps dirigés contre les marqueurs suivants : isoforme soluble d'HLA-G, CD71,
CD34 et CD45, et b) la détection et éventuellement le tri de cellules correspondant à différents stades de différenciation des lignées érythrocytaires ou endothéliales, en fonction de leur profil d'expression des marqueurs définis en a). 7°) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la mise en contact de l'échantillon biologique à tester, avec un panel d'anticorps sélectionnés dans le groupe constitué par des anticorps dirigés contre les marqueurs suivants : isoforme soluble d'HLA-G, CD71, CD34 et CD45, a') la sélection des cellules exprimant l'isoforme soluble d'HLA-G, et c) la détection du type de cellules à l'aide du marqueur CD71. 8°) Procédé de détection selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est sélectionné dans le groupe constitué par un échantillon de sang ou un échantillon de moelle osseuse. 9°) Procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que préalablement à l'étape a), les cellules dudit échantillon biologique sont perméabilisées.
SEQUENCE LISTING
<110> COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE MENIER, Catherine ROUAS-FREISS, Nathalie CAROSELLA, Edgardo, D.
<120> utilisation de compositions contenant une forme soluble d'HLA-G dans le traitement de pathologies du sang.
<130> F263PCT101
<150> F 0307871 <151> 2003-06-30
<160> 1
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL SEQUENCE
<220>
<223> HLA-G5/-G6
<400> 1
Ser Lys Gl u Gl y Asp Gl y Gl y Il e Met Ser Val Arg Gl u Ser Arg ser 1 5 10 15
Leu Ser Gl u Asp Leu 20
PCT/FR2004/001663 2003-06-30 2004-06-29 Utilisation de compositions contenant une forme soluble d'hla-g dans le traitement de pathologies du sang WO2005002617A2 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006516337A JP2007520428A (ja) 2003-06-30 2004-06-29 血液疾患の治療におけるｈｌａ−ｇの可溶形を含む組成物の使用
EP04767507A EP1638596A2 (fr) 2003-06-30 2004-06-29 Utilisation de compositions contenant une forme soluble d' hla-g dans le traitement de pathologies du sang
US10/562,659 US20070020703A1 (en) 2003-06-30 2004-06-29 Use of compositions comprising a soluble form of hla-g in the treatment of blood diseases

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0307871A FR2856599A1 (fr) 2003-06-30 2003-06-30 Utilisation de compositions contenant une forme soluble d'hla-g dans le traitement de pathologies du sang.
FR0307871 2003-06-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2005002617A2 true WO2005002617A2 (fr) 2005-01-13
WO2005002617A3 WO2005002617A3 (fr) 2005-05-19

Family

ID=33515512

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2004/001663 WO2005002617A2 (fr) 2003-06-30 2004-06-29 Utilisation de compositions contenant une forme soluble d'hla-g dans le traitement de pathologies du sang

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20070020703A1 (fr)
EP (1) EP1638596A2 (fr)
JP (1) JP2007520428A (fr)
FR (1) FR2856599A1 (fr)
WO (1) WO2005002617A2 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010012912A2 (fr) * 2008-08-01 2010-02-04 Commissariat A L'energie Atomique Utilisation d'une forme soluble d'hla-g dans le traitement des proliferations anormales des lymphocytes b

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2554293A1 (fr) 2004-01-30 2005-08-18 Great Lakes Chemical Corporation Procedes et systemes de production, compositions, agents tensioactifs, unites monomeres, complexes metalliques, esters phosphoriques, glycols, mousses a formation de pellicule aqueuse (type afff) et stabilisateurs de mousse
US8318656B2 (en) 2007-07-03 2012-11-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production processes and systems, compositions, surfactants, monomer units, metal complexes, phosphate esters, glycols, aqueous film forming foams, and foam stabilizers
FR2967579B1 (fr) * 2010-11-23 2013-11-22 Ets Francais Du Sang Utilisation d'une isoforme d'hla-g comme agent anti-resorption osseuse
CA2833173C (fr) * 2011-04-20 2023-09-05 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Cellules deficientes en beta-2 microglobuline
EP2730588A1 (fr) 2012-11-12 2014-05-14 Intelectys Anticorps et fragments de ceux-ci dirigés contre le domaine alpha-3 de protéine HLA-G, procédés et moyens pour leur préparation et leurs utilisations
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
EP3434688A1 (fr) * 2017-07-24 2019-01-30 Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives Transcrits et isoformes hla-g et leurs utilisations
WO2020069133A1 (fr) 2018-09-27 2020-04-02 Tizona Therapeutics Anticorps anti-hla-g, compositions comprenant des anticorps anti-hla-g et procédés d'utilisation d'anticorps anti-hla-g

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0677582A1 (fr) * 1994-03-18 1995-10-18 Commissariat A L'energie Atomique ( Cea) Transcrits du gène de CMH de classe I HLA-G et leurs applications
WO1996017085A1 (fr) * 1994-11-30 1996-06-06 Thomas Jefferson University Procede d'identification de cellules f×tales
US6511807B1 (en) * 1994-12-06 2003-01-28 Barry E. Rothenberg Genetic method of identifying hemochromatosis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0677582A1 (fr) * 1994-03-18 1995-10-18 Commissariat A L'energie Atomique ( Cea) Transcrits du gène de CMH de classe I HLA-G et leurs applications
WO1996017085A1 (fr) * 1994-11-30 1996-06-06 Thomas Jefferson University Procede d'identification de cellules f×tales
US6511807B1 (en) * 1994-12-06 2003-01-28 Barry E. Rothenberg Genetic method of identifying hemochromatosis

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GERAGHTY D E: "PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC FOR THE NEW CLASS 1 ANTIGEN HLA-G AND THEIR USE TO EXAMINE EXPRESSION IN TROPHOBLAST CELLS" FASEB JOURNAL, FED. OF AMERICAN SOC. FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY, BETHESDA, MD, US, vol. 4, no. 7, 26 avril 1990 (1990-04-26), page A2216, XP002007027 ISSN: 0892-6638 *
LE DISCORDE, M. ÄREPRINT AUTHORÜ ET AL: "HLA-G: Immunotolerance in normal and pathological physiology. Original Title: HLA-G: Immunotolerance en physiologie normale et pathologique ." PATHOLOGIE BIOLOGIE, (FEVRIER, 2002) VOL. 50, NO. 1, PP. 45-51. PRINT. CODEN: PABIAQ. ISSN: 0369-8114., 2002, XP002270782 *
MENIER C ET AL: "Nonclassical HLA-G5 class I soluble molecule is present in the erythropoietic lineage from early embryo through to adulthood: Potential role in erythroblast differentiation and in angiogenesis." TISSUE ANTIGENS, vol. 62, no. 4, octobre 2003 (2003-10), page 341, XP008044241 & 3RD INTERNATIONAL CONFERENCE ON HLA-G; PARIS, FRANCE; JULY 07-09, 2003 ISSN: 0001-2815 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010012912A2 (fr) * 2008-08-01 2010-02-04 Commissariat A L'energie Atomique Utilisation d'une forme soluble d'hla-g dans le traitement des proliferations anormales des lymphocytes b
WO2010012912A3 (fr) * 2008-08-01 2010-08-05 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Utilisation d ' une forme soluble d ' hla-g dans le traitement des hemopathies malignes de la cellule b.

Also Published As

Publication number Publication date
US20070020703A1 (en) 2007-01-25
EP1638596A2 (fr) 2006-03-29
JP2007520428A (ja) 2007-07-26
FR2856599A1 (fr) 2004-12-31
WO2005002617A3 (fr) 2005-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Menier et al. Erythroblasts secrete the nonclassical HLA-G molecule from primitive to definitive hematopoiesis
King et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast.
De Simone et al. The costimulatory molecule B7 is expressed on human microglia in culture and in multiple sclerosis acute lesions
EP0677582B1 (fr) Transcrits du gène de CMH de classe I HLA-G et leurs applications
Sato et al. Vascular endothelial growth factor receptor 1 signaling facilitates gastric ulcer healing and angiogenesis through the upregulation of epidermal growth factor expression on VEGFR1+ CXCR4+ cells recruited from bone marrow
Estienne et al. Androgen‐dependent expression of FcγRIIB2 by thyrocytes from patients with autoimmune Graves' disease: a possible molecular clue for sex dependence of autoimmune disease
WO2005002617A2 (fr) Utilisation de compositions contenant une forme soluble d&#39;hla-g dans le traitement de pathologies du sang
JP2007523640A (ja) 免疫応答を誘導または調節する方法
EP1189627B1 (fr) Compositions contenant des formes solubles d&#39;hla-g dans le traitement de pathologies inflammatoires de la peau
EP0917538B1 (fr) Cellules eucaryotes exprimant a leur surface au moins une isoforme d&#39;hla-g et leurs applications
CA2461692A1 (fr) Utilisation d&#39;une proteine de la famille des crmps pour le traitement des maladies liees au systeme immunitaire
WO1991012332A1 (fr) Anticorps monoclonaux reconnaissant un peptide associe a un antigene majeur d&#39;histocompatibilite
JPWO2008126940A1 (ja) 新規ｔ細胞
EP1163522B1 (fr) Detection d&#39;une activite superantigenique induite par msrv-1 dans un echantillon biologique
WO2001096564A2 (fr) Isoforme d&#39;hla-g (hla-g7) et ses applications
Takahashi et al. Further characterization of the PW peptide family that inhibits neuron differentiation in Hydra
EP1684788B1 (fr) Peptide augmentant la capacite fusiogene d&#39;une gamete
WO2003018048A1 (fr) Utilisation de molecules solubles hla de classe 1 pour inhiber l&#39;angiogenese
JP2007534946A (ja) 幹細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体の使用
Dargemont et al. Overproduction and secretion of β 2-microglobulin by a rat thymic epithelial cell line that expresses MHC class I heavy chain
Becker Mechanisms of tissue-specific T cell tolerance in diabetes
CA2106193A1 (fr) Moyens pour le diagnostic in vitro de constituants de granules cytoplasmiques et applications biologiques
NEUTROPHIL-ACTIVATING Society for Dermatological Research
FR2722207A1 (fr) Methode pour generer une population de cellules presentant a leur surface une forte densite d&#39;un pepride exogene specifique associe azx molecules du cmh; population de cellules
JP2011139691A (ja) 羊膜由来多能性幹細胞の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006516337

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007020703

Country of ref document: US

Ref document number: 10562659

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004767507

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004767507

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10562659

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2004767507

Country of ref document: EP