JPWO2008126940A1 - 新規t細胞 - Google Patents
新規t細胞 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2008126940A1 JPWO2008126940A1 JP2009509387A JP2009509387A JPWO2008126940A1 JP WO2008126940 A1 JPWO2008126940 A1 JP WO2008126940A1 JP 2009509387 A JP2009509387 A JP 2009509387A JP 2009509387 A JP2009509387 A JP 2009509387A JP WO2008126940 A1 JPWO2008126940 A1 JP WO2008126940A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- positive
- cells
- lag
- cell
- negative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 106
- 101150059401 EGR2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 106
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims abstract description 80
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 189
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims description 136
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 claims description 121
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 83
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 25
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 22
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 claims description 20
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 14
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 12
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- 208000027932 Collagen disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 abstract description 7
- 230000017274 T cell anergy Effects 0.000 abstract description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 4
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 141
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 141
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 57
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 31
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 21
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 15
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 10
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 10
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 9
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 9
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 8
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 7
- -1 NGF1-B Proteins 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 7
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 6
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 6
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 6
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 6
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 6
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 5
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 210000001986 peyer's patch Anatomy 0.000 description 5
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 5
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 4
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 4
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 4
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 4
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 102000001183 RAG-1 Human genes 0.000 description 3
- 108060006897 RAG1 Proteins 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 3
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 3
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 101000883515 Homo sapiens Chitinase-3-like protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 102000006707 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087408 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 2
- 102000054350 human CHI3L1 Human genes 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 2
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 101150020927 Aire gene Proteins 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 108010051748 Early Growth Response Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 101100065087 Mus musculus Egr2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100288498 Mus musculus Large1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001137986 Mus musculus Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108700042075 T-Cell Receptor Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000038627 Zinc finger transcription factors Human genes 0.000 description 1
- 108091007916 Zinc finger transcription factors Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100001129 embryonic lethality Toxicity 0.000 description 1
- 210000003372 endocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000023105 myelination Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 1
- 210000001202 rhombencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000010119 systemic immune function Effects 0.000 description 1
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Obesity (AREA)
- Neurology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
Abstract
本発明は、従来から知られていた制御性T細胞であるCD4陽性CD25陽性の制御性T細胞単独では自己免疫疾患を十分にコントロールできないことから、自己免疫疾患を十分にコントロールすることができるCD4陽性CD25陽性の制御性T細胞以外の制御性T細胞を探索することを課題とする。本発明の発明者らは、T細胞アナジー(不応性)に関連する転写因子であると報告されたEgr−2遺伝子と制御性T細胞との関連を検討することにより、新規のT細胞を単離し、その作用を明らかにすることにより、上記の課題を解決することができることを示した。
Description
本発明は、哺乳動物由来の新規のT細胞集団を提供することに関する。より具体的には、本発明は哺乳動物由来の新規の制御性T細胞集団を提供することに関する。
生体は、免疫系により、自己と非自己を精密に区別している。生物の免疫系は、本来、自己の構成タンパク質に対しては寛容(トレランス)の状態となっているが、何らかの条件により自己タンパク質に対する免疫応答が生じることがあり、このような自己に対する免疫応答の結果、自己免疫疾患が生じる。現在、自己免疫疾患としては、膠原病、関節リウマチなどが知られているが、動脈硬化や癌、神経変性疾患においても、自己免疫応答が関与していることが明らかにされつつあるなど、広範な疾患の病態に自己免疫応答が関与していると考えられている。
このような自己免疫疾患の治療には、副腎皮質ホルモンの投与や免疫抑制剤の投与など、抗原非特異的な治療方法が用いられている。しかしながら、これら現在適用されている治療方法では、全身的に高度の免疫抑制が引き起こされるため、日和見感染などの重大な問題もまた、生じている。このような状況は、臓器移植後の免疫抑制剤の投与に際しても同様に生じている。そのため、自己免疫疾患の治療や臓器移植による治療の現場においては、自己免疫疾患を引き起こす自己抗原に特異的な免疫抑制療法や、移植抗原に特異的な免疫抑制療法が強く求められている。
最近、自己抗原に特異的な自己免疫寛容の形成において、制御性T細胞(レギュラトリーT細胞、regulatory T cell)が重要であることが分かってきた。
哺乳動物のT細胞は、リンパ球の一種であり、骨髄で産生された前駆細胞が胸腺での選択を経て分化成熟したもののことをいう。末梢血中のリンパ球の70〜80%がT細胞であることが知られている。このT細胞は、細胞表面のマーカー分子としてCD4またはCD8などを発現することを特徴としている。そして、CD4を発現したT細胞はリンフォカインを産生するなどして、他のT細胞の機能発現を誘導したりB細胞の分化成熟、抗体産生を誘導したりするヘルパーT細胞として機能する。一方、CD8陽性T細胞は、ウイルス感染細胞などを破壊するCTL(キラーT細胞)として機能する。
このようなT細胞とは別に、他のT細胞の活性を抑制する働きを有するCD4陽性制御性T細胞が存在することが示されている。これまでに知られている制御性T細胞としては、細胞表面にCD4分子、CD25分子を発現し、転写因子Foxp3を発現する制御性T細胞(Foxp3 Treg細胞)(非特許文献1)が最も一般的であることが知られていた。一方、このFoxp3 Treg細胞以外に、IL−10を産生する制御性T細胞(TR1細胞)(非特許文献2)、TGFβを産生する制御性T細胞(TH3細胞)(非特許文献3)、などの存在も示唆されていたが、これらの細胞の細胞表面抗原の発現プロファイルは未知であり、その実体は明らかになっていなかった。
これらの制御性T細胞は、他のT細胞の活性を抑制する働きを有し、結果として生体内で自己免疫寛容を担っていることが予想されていた。しかしながら、機能的Foxp3遺伝子を欠損したマウスの場合や、胸腺での中枢性免疫寛容を担うAire遺伝子を欠損したマウスの場合でも、中枢神経、関節、小腸、内分泌腺などには明らかな障害を認めない(非特許文献4)。このことから、CD4陽性CD25陽性の制御性T細胞単独では、自己免疫疾患を十分にコントロールできない可能性が予想された。
Egr−2(Early Growth Response Gene−2)遺伝子は、Krox20、NGF1−B、Zfp−25、Zfp−6、NGF1−β(nerve growth factor inducible gene 1−β)とも呼ばれる全長2862bp(CDSは393−1655)である分子であり、Zinc−finger型転写因子としてマウス、ヒトよりクローニングされた遺伝子である(非特許文献5;非特許文献6)。この遺伝子は、T細胞アナジー(不応性)に関連する転写因子であると報告された遺伝子である(非特許文献7)。しかしながら、上述した既知の制御性T細胞の中には、これと関連するものはなかった。
Sakaguchi S.,et al.,J Immunol 1995;155:1151−1164 Groux H.A,et al.,Nature 1997;389:737−742 Chen Y.,et al.,Science 1994;265:1237−1240 Chen Z.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2005,102,14735−14740 Chavrier P,et al.,Mol.Cell.Biol.8 1988,pp.1319−1326 Joseph LJ,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 1988,7164−716 Safford M.et al.,Nat.Immunol.,2005,6,472−480
このような自己免疫疾患の治療には、副腎皮質ホルモンの投与や免疫抑制剤の投与など、抗原非特異的な治療方法が用いられている。しかしながら、これら現在適用されている治療方法では、全身的に高度の免疫抑制が引き起こされるため、日和見感染などの重大な問題もまた、生じている。このような状況は、臓器移植後の免疫抑制剤の投与に際しても同様に生じている。そのため、自己免疫疾患の治療や臓器移植による治療の現場においては、自己免疫疾患を引き起こす自己抗原に特異的な免疫抑制療法や、移植抗原に特異的な免疫抑制療法が強く求められている。
最近、自己抗原に特異的な自己免疫寛容の形成において、制御性T細胞(レギュラトリーT細胞、regulatory T cell)が重要であることが分かってきた。
哺乳動物のT細胞は、リンパ球の一種であり、骨髄で産生された前駆細胞が胸腺での選択を経て分化成熟したもののことをいう。末梢血中のリンパ球の70〜80%がT細胞であることが知られている。このT細胞は、細胞表面のマーカー分子としてCD4またはCD8などを発現することを特徴としている。そして、CD4を発現したT細胞はリンフォカインを産生するなどして、他のT細胞の機能発現を誘導したりB細胞の分化成熟、抗体産生を誘導したりするヘルパーT細胞として機能する。一方、CD8陽性T細胞は、ウイルス感染細胞などを破壊するCTL(キラーT細胞)として機能する。
このようなT細胞とは別に、他のT細胞の活性を抑制する働きを有するCD4陽性制御性T細胞が存在することが示されている。これまでに知られている制御性T細胞としては、細胞表面にCD4分子、CD25分子を発現し、転写因子Foxp3を発現する制御性T細胞(Foxp3 Treg細胞)(非特許文献1)が最も一般的であることが知られていた。一方、このFoxp3 Treg細胞以外に、IL−10を産生する制御性T細胞(TR1細胞)(非特許文献2)、TGFβを産生する制御性T細胞(TH3細胞)(非特許文献3)、などの存在も示唆されていたが、これらの細胞の細胞表面抗原の発現プロファイルは未知であり、その実体は明らかになっていなかった。
これらの制御性T細胞は、他のT細胞の活性を抑制する働きを有し、結果として生体内で自己免疫寛容を担っていることが予想されていた。しかしながら、機能的Foxp3遺伝子を欠損したマウスの場合や、胸腺での中枢性免疫寛容を担うAire遺伝子を欠損したマウスの場合でも、中枢神経、関節、小腸、内分泌腺などには明らかな障害を認めない(非特許文献4)。このことから、CD4陽性CD25陽性の制御性T細胞単独では、自己免疫疾患を十分にコントロールできない可能性が予想された。
Egr−2(Early Growth Response Gene−2)遺伝子は、Krox20、NGF1−B、Zfp−25、Zfp−6、NGF1−β(nerve growth factor inducible gene 1−β)とも呼ばれる全長2862bp(CDSは393−1655)である分子であり、Zinc−finger型転写因子としてマウス、ヒトよりクローニングされた遺伝子である(非特許文献5;非特許文献6)。この遺伝子は、T細胞アナジー(不応性)に関連する転写因子であると報告された遺伝子である(非特許文献7)。しかしながら、上述した既知の制御性T細胞の中には、これと関連するものはなかった。
Sakaguchi S.,et al.,J Immunol 1995;155:1151−1164 Groux H.A,et al.,Nature 1997;389:737−742 Chen Y.,et al.,Science 1994;265:1237−1240 Chen Z.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2005,102,14735−14740 Chavrier P,et al.,Mol.Cell.Biol.8 1988,pp.1319−1326 Joseph LJ,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 1988,7164−716 Safford M.et al.,Nat.Immunol.,2005,6,472−480
本発明は、従来から知られていた制御性T細胞であるCD4陽性CD25陽性の制御性T細胞単独では自己免疫疾患を十分にコントロールできないことから、自己免疫疾患を十分にコントロールすることができるCD4陽性CD25陽性の制御性T細胞以外の制御性T細胞を探索することを課題とする。
本発明の発明者らは、T細胞アナジー(不応性)に関連する転写因子であると報告されたEgr−2遺伝子と制御性T細胞との関連を検討することにより、新規のT細胞を単離し、その作用を明らかにすることにより、上記の課題を解決することができることを示した。
具体的には、本発明においては、CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG−3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来の新規なT細胞を単離しそして提供することにより、上記の課題を解決することができる。
本発明において単離されたCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の特性を有する新規のT細胞は、制御性T細胞としての機能を有することが示される。具体的には、制御性T細胞としての機能とは、他のT細胞の活性化反応を抑制することであり、その特性としてはアナジー(不応性)が含まれる。
これらの細胞は、哺乳動物のいずれか(例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコなど)に由来するものであり、いずれの哺乳動物から単離してもよい。
本発明はまた、哺乳動物のリンパ球集団またはT細胞集団から、(i)CD4が陽性である細胞(CD4+)を採取する工程、(ii)CD25が陰性である細胞(CD25−)を採取する工程、(iii)CD45RBが陰性(低陽性)である細胞(CD45RB−(low))またはCD45ROが陽性である細胞(CD45RO+)を採取する工程、そして(iv)LAG−3が陽性である細胞(LAG3+)を採取する工程、を、(i)〜(iv)の工程を順不同で行うことにより、CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG−3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のT細胞を単離する方法を提供することができる。
この方法において、哺乳動物は、いずれの哺乳動物(例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコなど)であってもよい。
本発明において、哺乳動物のリンパ球集団またはT細胞集団を末梢血から採取してからそのまま(i)〜(iv)の工程を行ってもよく、あるいは哺乳動物のリンパ球集団またはT細胞集団を末梢血から採取し、そのリンパ球集団またはT細胞集団を増殖させてから(i)〜(iv)の工程を行ってもよい。
本発明においてはまた、(i)〜(iv)の工程を行うことにより単離した本発明のT細胞集団をそのまま使用してもよく、あるいは(i)〜(iv)の工程を行うことにより単離した本発明のT細胞集団を増殖してから使用してもよい。
本発明においてはまた、CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のT細胞を含む、医薬組成物を提供することができる。この医薬組成物を投与することにより、炎症を引き起こす病原性T細胞の機能的抑制を誘導することができることから、本発明の医薬組成物は、抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患を治療するために使用することができる。本発明における自己抗原に対する免疫反応に起因または抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患には、例えば自己免疫疾患(例えば、関節リウマチ、膠原病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、1型糖尿病など)または移植臓器拒絶などが含まれる。
本発明においては、上述したCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のT細胞の細胞数を増加させるための化合物をスクリーニングする方法もまた、提供する。上述した作用を有する目的化合物をスクリーニングする方法は:
(a)CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のT細胞を、被検化合物の存在下にて培養する工程;
(b)培養したT細胞中でのEgr−2遺伝子の発現の変化またはLAG−3遺伝子の発現の変化を測定する工程;
(c)Egr−2遺伝子の発現の増加またはLAG−3遺伝子の発現の増加を導く化合物を、CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG−3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する哺乳動物由来のT細胞を増加させる化合物として選択する工程;
からなることを特徴とする。
具体的には、本発明においては、CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG−3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来の新規なT細胞を単離しそして提供することにより、上記の課題を解決することができる。
本発明において単離されたCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の特性を有する新規のT細胞は、制御性T細胞としての機能を有することが示される。具体的には、制御性T細胞としての機能とは、他のT細胞の活性化反応を抑制することであり、その特性としてはアナジー(不応性)が含まれる。
これらの細胞は、哺乳動物のいずれか(例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコなど)に由来するものであり、いずれの哺乳動物から単離してもよい。
本発明はまた、哺乳動物のリンパ球集団またはT細胞集団から、(i)CD4が陽性である細胞(CD4+)を採取する工程、(ii)CD25が陰性である細胞(CD25−)を採取する工程、(iii)CD45RBが陰性(低陽性)である細胞(CD45RB−(low))またはCD45ROが陽性である細胞(CD45RO+)を採取する工程、そして(iv)LAG−3が陽性である細胞(LAG3+)を採取する工程、を、(i)〜(iv)の工程を順不同で行うことにより、CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG−3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のT細胞を単離する方法を提供することができる。
この方法において、哺乳動物は、いずれの哺乳動物(例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコなど)であってもよい。
本発明において、哺乳動物のリンパ球集団またはT細胞集団を末梢血から採取してからそのまま(i)〜(iv)の工程を行ってもよく、あるいは哺乳動物のリンパ球集団またはT細胞集団を末梢血から採取し、そのリンパ球集団またはT細胞集団を増殖させてから(i)〜(iv)の工程を行ってもよい。
本発明においてはまた、(i)〜(iv)の工程を行うことにより単離した本発明のT細胞集団をそのまま使用してもよく、あるいは(i)〜(iv)の工程を行うことにより単離した本発明のT細胞集団を増殖してから使用してもよい。
本発明においてはまた、CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のT細胞を含む、医薬組成物を提供することができる。この医薬組成物を投与することにより、炎症を引き起こす病原性T細胞の機能的抑制を誘導することができることから、本発明の医薬組成物は、抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患を治療するために使用することができる。本発明における自己抗原に対する免疫反応に起因または抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患には、例えば自己免疫疾患(例えば、関節リウマチ、膠原病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、1型糖尿病など)または移植臓器拒絶などが含まれる。
本発明においては、上述したCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のT細胞の細胞数を増加させるための化合物をスクリーニングする方法もまた、提供する。上述した作用を有する目的化合物をスクリーニングする方法は:
(a)CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のT細胞を、被検化合物の存在下にて培養する工程;
(b)培養したT細胞中でのEgr−2遺伝子の発現の変化またはLAG−3遺伝子の発現の変化を測定する工程;
(c)Egr−2遺伝子の発現の増加またはLAG−3遺伝子の発現の増加を導く化合物を、CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG−3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する哺乳動物由来のT細胞を増加させる化合物として選択する工程;
からなることを特徴とする。
本発明の制御性T細胞により、局所的な免疫寛容を誘導することができることから、これまでは免疫抑制剤の投与など全身的に免疫機能を抑制する処置を行うことによる副作用に悩まされていた自己免疫疾患や移植臓器拒絶などの種々の疾患を、患者体内において上述したような副作用を引き起こすことなく、治療することができる。
本発明の発明者らはまず、T細胞アナジー(不応性)に関連する転写因子であると報告された遺伝子、Egr−2遺伝子が、制御性T細胞の活性と関連があるかどうかの検討を行った。具体的には、CD4+T細胞にEgr−2遺伝子を導入し、その形質を導入したT細胞をマウスに移入したところ、外来性抗原に対する遅延型過敏反応が顕著に抑制されることが明らかになった。このことから、Egr−2遺伝子が、制御性T細胞の活性と関連があることが示された。さらに、抗原特異的T細胞レセプターをEgr−2遺伝子と共導入することにより、その抑制能は増強され、抗原特異的抑制誘導が可能であることも合わせて示された。
この知見に基づいて、Egr−2遺伝子を導入したT細胞の遺伝子発現プロファイルを詳細に検討したところ、この細胞は制御性T細胞に関連する細胞表面分子LAG−3についてのmRNA発現と、細胞表面でのそのタンパク質の発現が亢進していることが分かった。このような特徴を手掛かりとしてマウス脾臓内に存在する細胞についてEgr−2の高発現細胞集団を探索したところ、CD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性のT細胞において、Egr−2のmRNA発現量が極めて高いことが明らかになった。
このような細胞表面抗原特性を有するT細胞はこれまでに全く知られていないことから、本願発明者らは、CD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性の特徴を有する新規なT細胞集団が、T細胞の免疫寛容誘導機構に重要な役割を果たし、そして自己免疫疾患を十分にコントロールすることができる制御性T細胞であると考え、詳細な解析を行った。
この細胞の特徴として、抗炎症作用の強いサイトカインとして知られるIL−10が高発現しており、また細胞自体の特性として、in vitroにおいてCD4陽性CD45RB高発現のナイーブT細胞の細胞分裂を抑制し、またin vivoでは、RAG1−/−マウスへCD4陽性CD45RB高発現のナイーブT細胞を移入する腸炎モデルにおいてCD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性T細胞を移入することにより腸炎の発症を抑制することが明らかになった。これらの細胞特性から、CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG3陽性(LAG3+)の細胞表面抗原特性を有するT細胞は、制御性T細胞であることが示唆された。
また、上述のマウスの知見に基づいて、ヒト扁桃腺内に存在する細胞についてEgr−2の高発現細胞集団を探索したところ、CD4陽性CD25陰性CD45RO陽性LAG−3陽性のT細胞において、Egr−2のmRNA発現量が極めて高いことが明らかになった。マウスの場合にCD45RB陰性(低陽性)のメモリーT細胞集団は、ヒトの場合にCD45RO蛍光強度が増強している一集団として分取することも出来ることが知られていたが、ヒトから上述のT細胞が得られたことは、この従来の知見と整合していた。また、このCD4陽性CD25陰性CD45RO陽性LAG−3陽性のT細胞は、マウスのCD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性のT細胞と同様に、IL−10が高発現していることも示された。
そして、本発明の発明者らは、これらの細胞がEgr−2の発現量が極めて高いという特徴を有することにちなんで、この細胞を「Egr−2 Treg細胞」と命名した。
本発明において得られた「Egr−2 Treg細胞」を、これまでも知られていた制御性T細胞「Foxp3 Treg細胞」(CD4陽性CD25陽性Foxp3陽性T細胞)と比較した。その結果、本発明の「Egr−2Treg細胞」においてはFoxp3遺伝子の高い発現は見られず、一方従来から知られていた制御性T細胞「Foxp3 Treg細胞」ではEgr−2遺伝子の高発現が見られない、という対照的な特徴を示すことが明らかになった。この結果から、本発明の「Egr−2 Treg細胞」と従来技術の「Foxp3 Treg細胞」とは、相互に異なる独立したT細胞集団と考えられた。
機能的Foxp3遺伝子を欠損するscurfyというマウスは、様々な臓器への炎症性細胞浸潤を伴った自己免疫様疾患を引き起こし、生後4週以内に死亡することが知られている。このscurfyマウスの脾臓内のT細胞を検討したところ、本発明の「Egr−2 Treg細胞」と同じCD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性の特徴を有するT細胞サブセットが顕著に増殖していることが示された。この細胞表面抗原プロファイルを有するT細胞サブセットを回収し、in vitroにおいて機能を調べた。その結果、この細胞は、in vitroにおいてCD4陽性CD45RB高発現のナイーブT細胞の細胞分裂を抑制し、またin vivoにおいては腸炎を引き起こすCD4陽性CD45RB高発現のナイーブT細胞を移入したRAG1−/−マウスへ移入したところ腸炎の発症を抑制する活性を有することが明らかになった。このような細胞表面抗原プロファイルの共通性および細胞の機能の共通性から判断して、scurfyマウスにおけるCD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性の特徴を有するT細胞サブセットは、「Egr−2 Treg細胞」であると考えられる。scurfyマウスはFoxp3遺伝子を欠損するにも関わらず、「Egr−2 Treg細胞」がscurfyマウスにおいて顕著に存在していることから判断して、「Egr−2 Treg細胞」はFoxp3遺伝子からは独立した特徴を有していることが裏付けられた。
一方、Egr−2遺伝子ノックアウトマウスは、菱脳の形成障害、末梢神経の髄鞘化障害等の症状を発症し、胎児期に死亡する、胎生致死の特徴を有することが知られている(Genes Dev.7 1993,pp.2071−2084)。そこで、本発明者らは、レトロウィルスベクターを用いてEgr−2遺伝子の発現を抑制するsh−RNA配列を骨髄細胞中で発現した、骨髄キメラマウスを作製した。このマウスは、骨髄移植後、約4週間で死亡し、組織学的に検討したところ腸炎を発症していることが明らかになった。このように、Egr−2遺伝子の欠損により、本来生体内に存在しているはずのCD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性の細胞が減少し、その結果として腸炎などの制御性T細胞の機能低下に伴う臨床症状を発現することが示された。
これらの知見を総合すると、CD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性のT細胞またはCD4陽性CD25陰性CD45RO陽性LAG−3陽性のT細胞がin vitroまたはin vivoにおいて活性を有する制御性T細胞の本体であり、その分化のために転写因子であるEgr−2遺伝子が重要な役割を果たしている一方、この制御性T細胞は、Foxp3遺伝子による機能制御とは独立していることが示された。
以上の知見に基づき、本発明はその一態様において、新規の制御性T細胞として、CD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性のT細胞またはCD4陽性CD25陰性CD45RO陽性LAG−3陽性のT細胞、「Egr−2 Treg細胞」を提供する。この細胞は、上述したように、これまで知られていた制御性T細胞である「Foxp3 Treg細胞」とは異なるT細胞サブセットに属する細胞集団である。
本発明において「Egr−2」という場合、ヒト「Egr−2」についてはGenBankアクセッション番号P11161により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、マウス「Egr−2」についてはGenBankアクセッション番号NP_034248により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、ラット「Egr−2」についてはGenBankアクセッション番号NP_446085により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、それぞれいう。
本発明においてEgr−2遺伝子の発現の有無を検出する場合、Egr−2遺伝子から発現されたmRNAまたはそれから作成したcDNAを鋳型として、ヒトの場合gcaccagctgtctgacaaca tctac(SEQ ID NO:1)をフォワードプライマーとしてそしてagcaaagctgctgggatatg g(SEQ ID NO:2)をリバースプライマーとして、マウスの場合agccgtttccctgtcctctg(SEQ ID NO:3)をフォワードプライマーとしてそしてgtccctcaccacctccactt(SEQ ID NO:4)をリバースプライマーとして、一般的なPCRプロトコルにしたがって増幅させることにより検出することができる。
一方、本発明において「LAG−3」という場合、ヒト「LAG−3」についてはGenBankアクセッション番号NP_002277により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、マウス「LAG−3」についてはGenBankアクセッション番号NP_032505により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、ラット「LAG−3」についてはGenBankアクセッション番号NP_997678により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、それぞれいう。
本発明においてLAG−3遺伝子の発現の有無を検出する場合、LAG−3遺伝子から発現されたmRNAまたはそれから作成したcDNAを鋳型として、ヒトの場合atctgcaggaacagcagctc aa(SEQ ID NO:5)をフォワードプライマーとしてそしてagggatccaggtgacccaaa g(SEQ ID NO:6)をリバースプライマーとして、マウスの場合ttgcttctgggactgctttg(SEQ ID NO:7)をフォワードプライマーとしてそしてgccactgtctggttgatgtt g(SEQ ID NO:8)をリバースプライマーとして、一般的なPCRプロトコルにしたがって増幅させることにより検出することができる。
一方、本発明において「Foxp3」という場合、ヒト「Foxp3」についてはGenBankアクセッション番号NP_054728により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、マウス「Foxp3」についてはGenBankアクセッション番号NP_473380により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコートするヌクレオチド配列のことを、それぞれいう。
本発明においてFoxp3遺伝子の発現の有無を検出する場合、Foxp3遺伝子から発現されたmRNAまたはそれから作成したcDNAを鋳型として、マウスの場合cagctgcctacagtgcccct ag(SEQ ID NO:9)をフォワードプライマーとしてそしてcatttgccagcagtgggtag(SEQ ID NO:10)をリバースプライマーとして、一般的なPCRプロトコルにしたがって増幅させることにより検出することができる。
上述した「Egr−2 Treg細胞」は、CD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3の4種類の細胞表面抗原について、CD4が陽性であること、CD25が陰性であること、CD45RBが陰性(低陽性)またはCD45ROが陽性であること、そしてLAG−3が陽性であることを指標として、生体から採取される白血球集団またはT細胞集団の中から単一の細胞集団として単離することができる。具体的には、本発明の「Egr−2 Treg細胞」は、CD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3についてセルソーターにて選別することにより、単離することができる。CD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3の発現に基づく選別は、どのような順番で行ってもよい。
ヒトにおいては「Egr−2 Treg細胞」の供給源となるT細胞集団は、生体の末梢血から得られたリンパ球集団またはT細胞集団を使用することができる。具体的には、末梢血を血液成分分離装置を用いて体外循環(アフェレーシス)を行い末梢血単核球を分離し、さらにCD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3の4種類の抗体で染色を行い、セルソーターを用い「Egr−2 Treg細胞」を単離・採取することができる。また、セルソーターの代わりに、Isolex、CliniMACSなどの磁気細胞分離装置を用いて、「Egr−2 Treg細胞」を分離採取することもできる。
上述したリンパ球集団またはT細胞集団を、そのまま上述したCD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3についてセルソーターの処理に供して「Egr−2 Treg細胞」を単離してもよいが、細胞数が不足する場合には、上述したリンパ球集団またはT細胞集団を所望の程度まで増殖させた後に、上述したCD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3についてセルソーターの処理に供して「Egr−2 Treg細胞」を単離してもよい。その様な場合、リンパ球集団またはT細胞集団をCD3・CD28共刺激、TGF−betaおよびIL−2存在下で培養することにより増殖させることが出来る。
さらに、上述したCD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3についてセルソーターの処理により単離された「Egr−2 Treg細胞」を、そのまま使用することもできるが、細胞数が不足する場合には、単離された「Egr−2 Treg細胞」をCD3・CD28共刺激、TGF−betaおよびIL−2存在下で培養することによりさらに増殖させることもできる。
また、強力な臓器移行性が求められる治療に関しては、上記手法にて単離した「Egr−2 Treg細胞」に、臓器特異的抗原に対するT細胞レセプター遺伝子をレトロウイルスベクターで導入することでより抗原特異的な治療効果を増強することが出来る。
本発明において細胞表面抗原CD4が陽性である細胞は、細胞をCD4に対する抗体を使用するセルソーターにより明確にCD4蛍光強度が増強している一集団であることに基づいて分取することにより、単離することができる。CD4に対する抗体としては、ヒトの場合Allophycocyanin(APC)標識抗CD4抗体(BD bioscience社、Beckman Coulter社、AbD Serotec社などから入手可能)、マウスの場合FITC標識抗CD4抗体(BD bioscience社、Beckman Coulter社、BioLegend社などから入手可能)を利用することができる。
本発明において細胞表面抗原CD25が陰性である細胞は、細胞をCD25に対する抗体を使用するセルソーターにより明確にCD25蛍光強度が増強している一集団を除去した集団であることに基づいて分取することにより、単離することができる。CD25に対する抗体としては、ヒトの場合Allophycocyanin−Cyanin−7(APC−Cy7)標識抗CD25抗体(BD bioscience社、BioLegend社などから入手可能)、マウスの場合APC標識抗CD25抗体(BD bioscience社、BioLegend社などから入手可能)を利用することができる。
本発明において細胞表面抗原CD45RBが陰性(低陽性)である細胞は、細胞をCD45RBに対する抗体を使用するセルソーターによりCD4陽性細胞のうち相対的にCD45RBを強発現している70%の細胞を除去すること(以下本文中における「CD45RB ex low」と同義とする)に基づいて分取することにより、単離することができる。CD45RBに対する抗体としては、ヒトの場合Phycoerythrin(PE)標識抗CD45RB抗体(BD bioscience社、AbD Serotec社、BioLegend社などから入手可能)、マウスの場合Fluorescein isothiocyanate(FITC)標識抗CD45RB抗体(BD bioscience社、BioLegend社、Dako社などから入手可能)を利用することができる。尚、ヒトの場合CD45RB陰性(低陽性)の細胞集団は、CD45RO蛍光強度が増強している一集団として分取することも出来る。この場合、細胞をCD45RBに対する抗体を使用するセルソーターにより明確にCD45RO蛍光強度が増強している一集団であることに基づいて分取することにより、単離することができる。CD45ROに対する抗体としては、ヒトの場合PE標識抗CD45RO抗体(BD bioscience社などから入手可能)を利用することができる。
本発明において細胞表面抗原LAG−3が陽性である細胞は、細胞をLAG−3に対する抗体を使用するセルソーターにより明確にLAG−3蛍光強度が増強している一集団であることに基づいて分取することにより、単離することができる。LAG−3に対する抗体としては、ヒトの場合ATTO 488標識抗LAG−3抗体(Alexis Biochemicals社などから入手可能)、マウスの場合PE標識抗LAG−3抗体(BD pharmingen社などから入手可能)を利用することができる。
上述したように、本発明の「Egr−2 Treg細胞」は、制御性T細胞として局所的な免疫寛容を引き起こす機能を有することから、本発明は、単離された「Egr−2 Treg細胞」を構成成分として含む、自己抗原に対する免疫反応に起因または抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患、例えば、種々の自己免疫疾患、移植臓器拒絶など、を治療するための医薬組成物を提供することができる。
本発明の単離された「Egr−2 Treg細胞」を、例えば種々の自己免疫疾患、移植臓器拒絶などを治療するための医薬組成物において利用する場合、2×106cells/kgから4×106cells/kgの細胞懸濁液100mlから500mlを経静脈的に投与することにより行うことができる。このようにして投与した本発明の単離された「Egr−2 Treg細胞」は、血流に乗って全身に運ばれ、局所的な免疫寛容を誘導することができる。
本発明において「抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患」という場合、主として移植臓器拒絶などの疾患のことをいうが、これらには限定されない。また、「自己抗原に対する免疫反応に起因する種々の疾患」という場合、主として関節リウマチ、膠原病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、1型糖尿病などの自己免疫疾患のことをいう。
本発明はまた、本発明の単離された「Egr−2 Treg細胞」の増殖を誘導することができる化合物をスクリーニングする方法もまた、提供する。具体的には、(a)本発明の「Egr−2 Treg細胞」を、被検化合物の存在下にて培養する工程;(b)培養した「Egr−2 Treg細胞」中でのEgr−2遺伝子の発現の変化またはLAG3遺伝子の発現の変化を測定する工程;(c)Egr−2遺伝子の発現の増加またはLAG3遺伝子の発現の増加を導く化合物を、本発明の「Egr−2 Treg細胞」を増加させる化合物として選択する工程;からなる、「Egr−2 Treg細胞」を増加させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
このような化合物は、in vitroにおいて単離された「Egr−2 Treg細胞」を増殖させる際に利用することもでき、またはin vivoで「Egr−2 Treg細胞」を増殖させることにより免疫寛容を誘導するために利用することもできる。
この知見に基づいて、Egr−2遺伝子を導入したT細胞の遺伝子発現プロファイルを詳細に検討したところ、この細胞は制御性T細胞に関連する細胞表面分子LAG−3についてのmRNA発現と、細胞表面でのそのタンパク質の発現が亢進していることが分かった。このような特徴を手掛かりとしてマウス脾臓内に存在する細胞についてEgr−2の高発現細胞集団を探索したところ、CD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性のT細胞において、Egr−2のmRNA発現量が極めて高いことが明らかになった。
このような細胞表面抗原特性を有するT細胞はこれまでに全く知られていないことから、本願発明者らは、CD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性の特徴を有する新規なT細胞集団が、T細胞の免疫寛容誘導機構に重要な役割を果たし、そして自己免疫疾患を十分にコントロールすることができる制御性T細胞であると考え、詳細な解析を行った。
この細胞の特徴として、抗炎症作用の強いサイトカインとして知られるIL−10が高発現しており、また細胞自体の特性として、in vitroにおいてCD4陽性CD45RB高発現のナイーブT細胞の細胞分裂を抑制し、またin vivoでは、RAG1−/−マウスへCD4陽性CD45RB高発現のナイーブT細胞を移入する腸炎モデルにおいてCD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性T細胞を移入することにより腸炎の発症を抑制することが明らかになった。これらの細胞特性から、CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG3陽性(LAG3+)の細胞表面抗原特性を有するT細胞は、制御性T細胞であることが示唆された。
また、上述のマウスの知見に基づいて、ヒト扁桃腺内に存在する細胞についてEgr−2の高発現細胞集団を探索したところ、CD4陽性CD25陰性CD45RO陽性LAG−3陽性のT細胞において、Egr−2のmRNA発現量が極めて高いことが明らかになった。マウスの場合にCD45RB陰性(低陽性)のメモリーT細胞集団は、ヒトの場合にCD45RO蛍光強度が増強している一集団として分取することも出来ることが知られていたが、ヒトから上述のT細胞が得られたことは、この従来の知見と整合していた。また、このCD4陽性CD25陰性CD45RO陽性LAG−3陽性のT細胞は、マウスのCD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性のT細胞と同様に、IL−10が高発現していることも示された。
そして、本発明の発明者らは、これらの細胞がEgr−2の発現量が極めて高いという特徴を有することにちなんで、この細胞を「Egr−2 Treg細胞」と命名した。
本発明において得られた「Egr−2 Treg細胞」を、これまでも知られていた制御性T細胞「Foxp3 Treg細胞」(CD4陽性CD25陽性Foxp3陽性T細胞)と比較した。その結果、本発明の「Egr−2Treg細胞」においてはFoxp3遺伝子の高い発現は見られず、一方従来から知られていた制御性T細胞「Foxp3 Treg細胞」ではEgr−2遺伝子の高発現が見られない、という対照的な特徴を示すことが明らかになった。この結果から、本発明の「Egr−2 Treg細胞」と従来技術の「Foxp3 Treg細胞」とは、相互に異なる独立したT細胞集団と考えられた。
機能的Foxp3遺伝子を欠損するscurfyというマウスは、様々な臓器への炎症性細胞浸潤を伴った自己免疫様疾患を引き起こし、生後4週以内に死亡することが知られている。このscurfyマウスの脾臓内のT細胞を検討したところ、本発明の「Egr−2 Treg細胞」と同じCD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性の特徴を有するT細胞サブセットが顕著に増殖していることが示された。この細胞表面抗原プロファイルを有するT細胞サブセットを回収し、in vitroにおいて機能を調べた。その結果、この細胞は、in vitroにおいてCD4陽性CD45RB高発現のナイーブT細胞の細胞分裂を抑制し、またin vivoにおいては腸炎を引き起こすCD4陽性CD45RB高発現のナイーブT細胞を移入したRAG1−/−マウスへ移入したところ腸炎の発症を抑制する活性を有することが明らかになった。このような細胞表面抗原プロファイルの共通性および細胞の機能の共通性から判断して、scurfyマウスにおけるCD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性の特徴を有するT細胞サブセットは、「Egr−2 Treg細胞」であると考えられる。scurfyマウスはFoxp3遺伝子を欠損するにも関わらず、「Egr−2 Treg細胞」がscurfyマウスにおいて顕著に存在していることから判断して、「Egr−2 Treg細胞」はFoxp3遺伝子からは独立した特徴を有していることが裏付けられた。
一方、Egr−2遺伝子ノックアウトマウスは、菱脳の形成障害、末梢神経の髄鞘化障害等の症状を発症し、胎児期に死亡する、胎生致死の特徴を有することが知られている(Genes Dev.7 1993,pp.2071−2084)。そこで、本発明者らは、レトロウィルスベクターを用いてEgr−2遺伝子の発現を抑制するsh−RNA配列を骨髄細胞中で発現した、骨髄キメラマウスを作製した。このマウスは、骨髄移植後、約4週間で死亡し、組織学的に検討したところ腸炎を発症していることが明らかになった。このように、Egr−2遺伝子の欠損により、本来生体内に存在しているはずのCD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性の細胞が減少し、その結果として腸炎などの制御性T細胞の機能低下に伴う臨床症状を発現することが示された。
これらの知見を総合すると、CD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性のT細胞またはCD4陽性CD25陰性CD45RO陽性LAG−3陽性のT細胞がin vitroまたはin vivoにおいて活性を有する制御性T細胞の本体であり、その分化のために転写因子であるEgr−2遺伝子が重要な役割を果たしている一方、この制御性T細胞は、Foxp3遺伝子による機能制御とは独立していることが示された。
以上の知見に基づき、本発明はその一態様において、新規の制御性T細胞として、CD4陽性CD25陰性CD45RB陰性LAG−3陽性のT細胞またはCD4陽性CD25陰性CD45RO陽性LAG−3陽性のT細胞、「Egr−2 Treg細胞」を提供する。この細胞は、上述したように、これまで知られていた制御性T細胞である「Foxp3 Treg細胞」とは異なるT細胞サブセットに属する細胞集団である。
本発明において「Egr−2」という場合、ヒト「Egr−2」についてはGenBankアクセッション番号P11161により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、マウス「Egr−2」についてはGenBankアクセッション番号NP_034248により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、ラット「Egr−2」についてはGenBankアクセッション番号NP_446085により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、それぞれいう。
本発明においてEgr−2遺伝子の発現の有無を検出する場合、Egr−2遺伝子から発現されたmRNAまたはそれから作成したcDNAを鋳型として、ヒトの場合gcaccagctgtctgacaaca tctac(SEQ ID NO:1)をフォワードプライマーとしてそしてagcaaagctgctgggatatg g(SEQ ID NO:2)をリバースプライマーとして、マウスの場合agccgtttccctgtcctctg(SEQ ID NO:3)をフォワードプライマーとしてそしてgtccctcaccacctccactt(SEQ ID NO:4)をリバースプライマーとして、一般的なPCRプロトコルにしたがって増幅させることにより検出することができる。
一方、本発明において「LAG−3」という場合、ヒト「LAG−3」についてはGenBankアクセッション番号NP_002277により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、マウス「LAG−3」についてはGenBankアクセッション番号NP_032505により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、ラット「LAG−3」についてはGenBankアクセッション番号NP_997678により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、それぞれいう。
本発明においてLAG−3遺伝子の発現の有無を検出する場合、LAG−3遺伝子から発現されたmRNAまたはそれから作成したcDNAを鋳型として、ヒトの場合atctgcaggaacagcagctc aa(SEQ ID NO:5)をフォワードプライマーとしてそしてagggatccaggtgacccaaa g(SEQ ID NO:6)をリバースプライマーとして、マウスの場合ttgcttctgggactgctttg(SEQ ID NO:7)をフォワードプライマーとしてそしてgccactgtctggttgatgtt g(SEQ ID NO:8)をリバースプライマーとして、一般的なPCRプロトコルにしたがって増幅させることにより検出することができる。
一方、本発明において「Foxp3」という場合、ヒト「Foxp3」についてはGenBankアクセッション番号NP_054728により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列のことを、マウス「Foxp3」についてはGenBankアクセッション番号NP_473380により示されるアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれをコートするヌクレオチド配列のことを、それぞれいう。
本発明においてFoxp3遺伝子の発現の有無を検出する場合、Foxp3遺伝子から発現されたmRNAまたはそれから作成したcDNAを鋳型として、マウスの場合cagctgcctacagtgcccct ag(SEQ ID NO:9)をフォワードプライマーとしてそしてcatttgccagcagtgggtag(SEQ ID NO:10)をリバースプライマーとして、一般的なPCRプロトコルにしたがって増幅させることにより検出することができる。
上述した「Egr−2 Treg細胞」は、CD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3の4種類の細胞表面抗原について、CD4が陽性であること、CD25が陰性であること、CD45RBが陰性(低陽性)またはCD45ROが陽性であること、そしてLAG−3が陽性であることを指標として、生体から採取される白血球集団またはT細胞集団の中から単一の細胞集団として単離することができる。具体的には、本発明の「Egr−2 Treg細胞」は、CD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3についてセルソーターにて選別することにより、単離することができる。CD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3の発現に基づく選別は、どのような順番で行ってもよい。
ヒトにおいては「Egr−2 Treg細胞」の供給源となるT細胞集団は、生体の末梢血から得られたリンパ球集団またはT細胞集団を使用することができる。具体的には、末梢血を血液成分分離装置を用いて体外循環(アフェレーシス)を行い末梢血単核球を分離し、さらにCD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3の4種類の抗体で染色を行い、セルソーターを用い「Egr−2 Treg細胞」を単離・採取することができる。また、セルソーターの代わりに、Isolex、CliniMACSなどの磁気細胞分離装置を用いて、「Egr−2 Treg細胞」を分離採取することもできる。
上述したリンパ球集団またはT細胞集団を、そのまま上述したCD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3についてセルソーターの処理に供して「Egr−2 Treg細胞」を単離してもよいが、細胞数が不足する場合には、上述したリンパ球集団またはT細胞集団を所望の程度まで増殖させた後に、上述したCD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3についてセルソーターの処理に供して「Egr−2 Treg細胞」を単離してもよい。その様な場合、リンパ球集団またはT細胞集団をCD3・CD28共刺激、TGF−betaおよびIL−2存在下で培養することにより増殖させることが出来る。
さらに、上述したCD4、CD25、CD45RBまたはCD45RO、およびLAG−3についてセルソーターの処理により単離された「Egr−2 Treg細胞」を、そのまま使用することもできるが、細胞数が不足する場合には、単離された「Egr−2 Treg細胞」をCD3・CD28共刺激、TGF−betaおよびIL−2存在下で培養することによりさらに増殖させることもできる。
また、強力な臓器移行性が求められる治療に関しては、上記手法にて単離した「Egr−2 Treg細胞」に、臓器特異的抗原に対するT細胞レセプター遺伝子をレトロウイルスベクターで導入することでより抗原特異的な治療効果を増強することが出来る。
本発明において細胞表面抗原CD4が陽性である細胞は、細胞をCD4に対する抗体を使用するセルソーターにより明確にCD4蛍光強度が増強している一集団であることに基づいて分取することにより、単離することができる。CD4に対する抗体としては、ヒトの場合Allophycocyanin(APC)標識抗CD4抗体(BD bioscience社、Beckman Coulter社、AbD Serotec社などから入手可能)、マウスの場合FITC標識抗CD4抗体(BD bioscience社、Beckman Coulter社、BioLegend社などから入手可能)を利用することができる。
本発明において細胞表面抗原CD25が陰性である細胞は、細胞をCD25に対する抗体を使用するセルソーターにより明確にCD25蛍光強度が増強している一集団を除去した集団であることに基づいて分取することにより、単離することができる。CD25に対する抗体としては、ヒトの場合Allophycocyanin−Cyanin−7(APC−Cy7)標識抗CD25抗体(BD bioscience社、BioLegend社などから入手可能)、マウスの場合APC標識抗CD25抗体(BD bioscience社、BioLegend社などから入手可能)を利用することができる。
本発明において細胞表面抗原CD45RBが陰性(低陽性)である細胞は、細胞をCD45RBに対する抗体を使用するセルソーターによりCD4陽性細胞のうち相対的にCD45RBを強発現している70%の細胞を除去すること(以下本文中における「CD45RB ex low」と同義とする)に基づいて分取することにより、単離することができる。CD45RBに対する抗体としては、ヒトの場合Phycoerythrin(PE)標識抗CD45RB抗体(BD bioscience社、AbD Serotec社、BioLegend社などから入手可能)、マウスの場合Fluorescein isothiocyanate(FITC)標識抗CD45RB抗体(BD bioscience社、BioLegend社、Dako社などから入手可能)を利用することができる。尚、ヒトの場合CD45RB陰性(低陽性)の細胞集団は、CD45RO蛍光強度が増強している一集団として分取することも出来る。この場合、細胞をCD45RBに対する抗体を使用するセルソーターにより明確にCD45RO蛍光強度が増強している一集団であることに基づいて分取することにより、単離することができる。CD45ROに対する抗体としては、ヒトの場合PE標識抗CD45RO抗体(BD bioscience社などから入手可能)を利用することができる。
本発明において細胞表面抗原LAG−3が陽性である細胞は、細胞をLAG−3に対する抗体を使用するセルソーターにより明確にLAG−3蛍光強度が増強している一集団であることに基づいて分取することにより、単離することができる。LAG−3に対する抗体としては、ヒトの場合ATTO 488標識抗LAG−3抗体(Alexis Biochemicals社などから入手可能)、マウスの場合PE標識抗LAG−3抗体(BD pharmingen社などから入手可能)を利用することができる。
上述したように、本発明の「Egr−2 Treg細胞」は、制御性T細胞として局所的な免疫寛容を引き起こす機能を有することから、本発明は、単離された「Egr−2 Treg細胞」を構成成分として含む、自己抗原に対する免疫反応に起因または抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患、例えば、種々の自己免疫疾患、移植臓器拒絶など、を治療するための医薬組成物を提供することができる。
本発明の単離された「Egr−2 Treg細胞」を、例えば種々の自己免疫疾患、移植臓器拒絶などを治療するための医薬組成物において利用する場合、2×106cells/kgから4×106cells/kgの細胞懸濁液100mlから500mlを経静脈的に投与することにより行うことができる。このようにして投与した本発明の単離された「Egr−2 Treg細胞」は、血流に乗って全身に運ばれ、局所的な免疫寛容を誘導することができる。
本発明において「抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患」という場合、主として移植臓器拒絶などの疾患のことをいうが、これらには限定されない。また、「自己抗原に対する免疫反応に起因する種々の疾患」という場合、主として関節リウマチ、膠原病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、1型糖尿病などの自己免疫疾患のことをいう。
本発明はまた、本発明の単離された「Egr−2 Treg細胞」の増殖を誘導することができる化合物をスクリーニングする方法もまた、提供する。具体的には、(a)本発明の「Egr−2 Treg細胞」を、被検化合物の存在下にて培養する工程;(b)培養した「Egr−2 Treg細胞」中でのEgr−2遺伝子の発現の変化またはLAG3遺伝子の発現の変化を測定する工程;(c)Egr−2遺伝子の発現の増加またはLAG3遺伝子の発現の増加を導く化合物を、本発明の「Egr−2 Treg細胞」を増加させる化合物として選択する工程;からなる、「Egr−2 Treg細胞」を増加させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
このような化合物は、in vitroにおいて単離された「Egr−2 Treg細胞」を増殖させる際に利用することもでき、またはin vivoで「Egr−2 Treg細胞」を増殖させることにより免疫寛容を誘導するために利用することもできる。
実施例1:
本実施例においては、T細胞アナジーに関連すると予想される転写因子Egr−2が、どのような機序でT細胞の抑制能に関連しているのかを明らかにすることを目的として、T細胞にEgr−2遺伝子を導入して、Egr−2形質転換T細胞の作用を調べた。
まず、cDNAライブラリより得られたFull lengthのEgr2 cDNAをレトロウイルスベクターpMX(Onishi M,et al.,1996 Exp.Hematol.24:324−329)に導入し、pMX−Egr2−IRES−GFPレトロウイルスベクターを作製した(図1)。同様の手法にて、Foxp3、DOTAE、DOTBEを導入したレトロウイルスベクターを作製した(DOTAE、DOTBEはそれぞれニワトリ卵白アルブミン(OVA)に対する特異的T細胞レセプターα鎖、β鎖に対応するcDNAである)。尚、Egr2およびFoxp3はGFP(green fluorescent protein)発現により移入遺伝子の発現を評価するため、レトロウイルスベクターにIRES(internal ribosomal entry site)/GFPを共導入したものを作製した。また、コントロールとしてmock pMX−IRES−GFPベクターを使用した(図1)。各プラスミドはパッケージング細胞株のPLAT−E細胞にトランスフェクションすることにより遺伝子組み換えレトロウイルス産生細胞を得た。ついでその培養上清より得られたレトロウイルスをRetroNectin(Takara,Japan)を用い脾細胞に感染させた。
このようにして得られたMock(pMX−IRES−GFP)またはEgr2(pMX−Egr2−IRES−GFP)レトロウイルスベクターをマウス脾臓細胞に感染させてEgr2を発現させ、得られたマウスCD4陽性脾細胞をフローサイトメーターを用い、GFP発現を指標に各4群(negative、low、mid、high)に分け分離採取した(図2)。そして、図2にて分離採取した各4群のそれぞれの細胞よりcDNA合成を行い、Egr2 mRNA、およびLAG−3 mRNAレベルにおける発現をリアルタイムPCR法にて検討した(図3)。尚、mRNA発現はβ−アクチンにて標準化した相対的発現量である。以下、リアルタイムPCR法は同様の手法を用いて解析を行った。その結果、Egr2の発現とともにLAG−3も発現増強を認めた(図3)。
さらに、in vivoにおけるEgr2の抑制能評価のため、ニワトリ卵白アルブミン(OVA)に対する遅延型過敏反応を検討した。具体的には、OVA200μgと完全フロイントアジュバント(complete Freund’s adjuvant、CFA、ChondrexまたはBD Difco)を混和したものをBalb/c マウス(6〜8週齢)の尾部に皮内注射した。初回免疫の6日後に、単離した脾単核細胞(Balb/c マウス(6〜8週齢))に先述のpMX−Egr2−IRES−GFP、pMX−Foxp3−IRES−GFP、pMX−DOTAE、pMX−DOTBEレトロウイルスをそれぞれ感染させ72時間後、MACSカラム(Miltenyi Biotec)を用いてCD8、−CD11b、−CD19陽性細胞をビオチン化抗CD8抗体、CD11b抗体、CD19抗体及びストレプトアビジン結合マグネットビーズによりnegative selectionし、CD4陽性細胞を濃縮させた後、1×107cells/mouseをOVA免疫されたマウス尾部より静脈注射にて移入した。各実験群は、Mock(pMX−IRES−GFP)、DO11.10(pMX−DOTAE、pMX−DOTBE)、Fxp3(pMX−Foxp3−IRES−GFP)、Egr2(pMX−Egr2−IRES−GFP)の各レトロウイルスを図表の如く感染させた(各群n=12匹)。各レトロウイルス感染細胞移入48時間後、右足底部にOVA20μg/PBS100μlを追加免疫し、同時に左足底部にPBS100μlを投与、追加免疫24時間後にΔフットパッド(右フットパッド厚−左フットパッド厚)mmを計測し遅延型過敏反応の指標(Δフットパッド(再免疫24時間後‐再免疫前)mm)とした。
この結果、Egr2はFoxp3と同様、遅延型過敏反応を抑制した。また、OVA特異的T細胞レセプターを共移入することによりその抑制効果は著しく増強され、抗原特異的免疫抑制が可能なことが示された(図4)。
さらに、図2と同実験条件にてEgr2(pMX−Egr2−IRES−GFP)とDO11.10(pMX−DOTAE、pMX−DOTBE)を共移入したマウスの追加免疫24時間後の脾単核細胞をフローサイトメトリーにて分離解析した。脾単核細胞はフローサイトメトリーにてリンパ球およびCD4陽性細胞gate後、DO11.10T細胞レセプター特異抗体KJ1−26抗体およびGFPにて展開し、図中の如く各細胞集団を分離採取した。また、図3中にて分離採取した細胞よりcDNA合成を行い、Egr2 mRNA、LAG−3 mRNA、およびFoxp3 mRNAレベルにおける発現をリアルタイムPCR法にて検討した。この結果、移入した細胞はpMX−Egr2−IRES−GFPによりEgr2を過剰発現するとともに、LAG−3の発現も増強され、OVA特異的T細胞レセプターが共発現することにより、LAG−3も発現がさらに著しく増強され、Egr−2の抑制能には抗原特異的なT細胞レセプターシグナルが重要であることも示された(図5、図6)。
以上のことにより、Egr2がin vivoにおいて制御性T細胞様の活性誘導をすることが示された。また、Egr2形質転換T細胞が、LAG−3を顕著に発現し、Egr2の発現量とLAG−3の発現量が正相関を示し、さらにLAG−3発現は抗原特異的T細胞レセプターにより増強されることが明らかになった。
実施例2:
本実施例においては、Egr−2遺伝子を発現するT細胞を採取することを目的として細胞分取を行った。
マウス脾単核細胞をCD4−Cy7APC、CD25−APC、CD45RB−FITC、LAG−3−PEを用いてフローサイトメーターにて解析をおこなった。その結果、LAG−3表面抗原はCD4陽性細胞のうちCD25陰性の細胞(図7a)CD45RB陰性からCD45RB弱陽性の細胞(図7b)に発現の増強を認めた(Egr−2 Treg細胞)。尚、Foxp3−TregはCD4陽性、CD25陽性T細胞群と定義され、Egr2−Tregとは異なった細胞集団である。
さらに、CD4陽性T細胞をLAG−3発現の有無によりフローサイトメーターを用いて分離採取し、cDNA合成後、リアルタイムPCR法にてLAG−3 mRNA、Egr2 mRNA、Foxp3 mRNA、およびIL−10 mRNA発現を検討したところ、LAG−3発現細胞でのEgr2 mRNA、IL−10 mRNA、LAG−3 mRNAの発現増強を認めた(図8)。また、Foxp3発現はLAG発現と有意な相関は示さなかった。
次に、CD4陽性CD45RB ex low細胞群にてgateした細胞を、LAG−3、CD25にて展開し、CD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)、CD4+ CD25− LAG3− CD45RB ex low、CD4+ CD25+ CD45RB ex lowの3群の細胞集団を分離採取した(図9)。
図9にて分離採取した細胞よりcDNA合成を行い、リアルタイムPCR法にてEgr2 mRNAおよびFoxp3 mRNAの発現につき検討した。その結果、CD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)においてEgr2発現が最も強く、Foxp3発現では同様の発現傾向は認められなかった(図10)。
さらに、CD4陽性CD25陰性細胞群にてgateした細胞をLAG−3、CD45RBにて展開し、図示の如く各細胞群をフローサイトメーターにて分離採取、cDNA合成後、リアルタイムPCR法にてEgr2 mRNAおよびFoxp3 mRNAの発現につき検討した。その結果、CD4+ CD25− LAG−3+ CD45RB ex lowにおいてEgr2発現が最も強く、既知のFoxp3−Tregとは異なったEgr2−Tregが存在することが示された(図11、図12)。
実施例3:
本実施例においては、II型コラーゲン誘導関節炎発症モデルを用いてEgr2−Tregの検討を行った。
DBA−1Jマウス(6〜8週齢)の尾部にウシ由来II型コラーゲンと完全フロイントアジュバント(complete Freund’s adjuvant、CFA、ChondrexまたはBD Difco)を混和したものを皮内注射し(day0)、その後II型コラーゲンの追加免疫(day21)を行うことによりII型コラーゲン誘導関節炎発症誘発を行った。関節炎誘発後、図11と同様の手法により各細胞群を分離採取しリアルタイムPCR法による解析を行った。その結果、II型コラーゲン免疫後もCD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)は存在し、免疫後「Egr2−Treg」におけるIL−10発現のさらなる増強を認めた(図13)。尚、Egr−2は関節炎発症後も高発現を維持していた。
実施例4:
本実施例においては、C57BL/6マウスの脾細胞を用いてin vitroにおけるCD4+ CD25− LAG−3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)の抑制能につき検討した。
ナイーブT細胞サブセットとしてCFSEラベルしたCD4+ CD25− CD45RB highの細胞集団(Thy1.1+)5×104cellsを、抗原提示細胞として1500rad放射線照射した脾細胞(Thy1.2+)1×105cellsを用いた。抑制性細胞として、CD4+ CD25− CD45RB ex low細胞集団(Thy1.2+)をLAG−3発現によりhigh、low、negaの3群に分け分離採取した(各群5×104cells)(図14)。各細胞群を図中の如く可溶性CD3抗体存在下に72時間共培養し、Thy1.1+CD4+にてgateした細胞のCFSE発現減弱をCD4+ CD25− CD45RB highの細胞集団分裂増殖の指標として評価を行った。
その結果、Egr−2 Treg細胞は、ナイーブT細胞サブセット(CD45RBhi細胞)の細胞分裂を抑制し、その抑制能はLAG−3発現に依存することが明らかになった(図15)。
実施例5:
本実施例においては、Rag1−/−マウスにC57BL/6マウス脾臓CD4+ CD25− CD45RBhi細胞1×105cellsを腹腔内投与し、炎症性腸炎発症モデルを作製した。
腸炎は体重減少および組織像にて評価した。体重は細胞移入日(day0)を100%とした。各群は、CD4+ CD25− CD45RBhi細胞1×105cellsのみ、CD4+ CD25− CD45RBhi細胞1×105cells+CD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)細胞1×105cellsおよび、PBSのみ(control)の3群にて評価した。RAG1−/−マウスにおいて、C57BL/6マウス脾臓CD4+ CD25− CD45RBhi細胞投与により生じる腸炎を、CD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)細胞の共移入により抑制することが出来た(図16)。また、大腸の組織像においても、CD4+ CD25− CD45RBhi細胞投与単独投与において認められた炎症細胞浸潤、腸管壁肥厚などの所見が、CD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)細胞の共移入により改善していることが認められた(図17)。
実施例6:
現在Foxp3は抑制性T細胞のマスター遺伝子と考えられている。そこで、本実施例においては、そのFoxp3の機能的遺伝子を欠損しているScurfyマウスを使用してEgr2−Tregに関する検討を行った。
まず、Foxp3の機能的遺伝子を欠損しているScurfyマウスの脾細胞をCD4−Cy7APC、CD25−APC、CD45RB−FITC、LAG−3−PEを用いてフローサイトメーターにて解析をおこなった。その結果、フローサイトメーターにて解析にてScurfyマウスの脾細胞にもCD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)細胞が存在することが示された(図18)。
また、ナイーブT細胞サブセットとしてCFSEラベルしたC57BL/6マウスCD4+ CD25− CD45RB highの細胞集団(Thy1.1+)5×104cellsを、抗原提示細胞として1500rad放射線照射C57BL/6マウスのwhole splenocyte(Thy1.2+)1×105cellsを用いた。抑制性細胞としては、ScurfyマウスCD4+ CD25− CD45RB ex low細胞集団(Thy1.2+)2.5×104cellsを用いた。各細胞群を図中の如くsoluble CD3抗体存在下に72時間共培養し、Thy1.1+CD4+にてgateした細胞のCFSE発現減弱をCD4+ CD25− CD45RB highの細胞集団分裂増殖の指標として評価を行った。また、同条件にて培養上清中にLAG−3中和抗体を加えた系も検討した。その結果、機能的Foxp3遺伝子を欠損したScurfyマウスのEgr2−Treg細胞はin vitroにおける抑制能を有し、その抑制能はLAG−3中和抗体にて減弱することが示された(図19)。
さらに、Rag1−/−マウスにC57BL/6マウス脾臓CD4+ CD25− CD45RBhi細胞1×105cellsを腹腔内投与し、炎症性腸炎発症モデルを作製した。腸炎は体重減少および組織像にて評価した。体重は細胞移入日(day0)を100%とした。各群は、C57BL/6マウス脾臓CD4+ CD25− CD45RBhi細胞1×105cellsのみ、C57BL/6マウス脾臓CD4+ CD25− CD45RBhi細胞1×105cells+ScurfyマウスCD4+ CD25− LAG−3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)細胞1×105cellsおよび、PBSのみ(control)の3群にて評価した。その結果、in vivoにおいてもRag1−/−マウスの炎症性腸炎発症モデルにおける腸炎を抑制することが示された(図20)。
以上のことより、Egr2−Treg細胞はFoxp3の機能に依存せず抑制能を発揮する新規抑制性T細胞集団であり、その抑制能はLAG−3を介していることが示された。
実施例7:
本実施例においては、Egr2遺伝子の機能を解析する為、shRNA−Egr2レトロウイルスを作製し、Egr2遺伝子をsilencingし、マウスのフェノタイプ解析を行った。
具体的には、5FUを投与したC57BL/6マウスの骨髄細胞を採取し、shRNA−Egr2レトロウイルスを感染させた後、放射線照射C57BL/6マウスに移入することで、shRNA−Egr2骨髄キメラマウスを作製した(図21)。その結果、Egr2遺伝子発現がsilencingされることにより、LAG−3発現は抑制され、shRNA−Egr2骨髄キメラマウスは腸管の著しい肥厚を認めた(写真は骨髄移植30日後のマウス大腸)(図22)。また、骨髄移植後、著しい腸炎を発症し約4週間で死亡した。
実施例8:
本実施例においては、本発明のEgr2−Treg細胞が、生体内でどのような機序で誘導されるかを明らかにすることを目的として、Egr2−Treg細胞の誘導実験を行った。
C57BL/6マウスまたはB細胞欠損マウスであるμMTマウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)の脾臓およびパイエル板を小さな組織片に細かく切断し、IV型コラゲナーゼ(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)からCD4+のT細胞を採取し、この細胞について実施例2に記載する様に、PE−抗LAG−3モノクローナル抗体(LAG−3−PE)およびFITC−抗CD45RBモノクローナル抗体(CD45RB−FITC)を用いてフローサイトメーターにて解析をおこなった。その結果、C57BL/6マウスでは脾臓由来の細胞およびパイエル板由来の細胞ともに、本発明のEgr2−Treg細胞と同じ表現型(すなわち、LAG−3+CD45RB ex low)を有するT細胞が存在するが、μMTマウスでは、LAG−3+ CD45RB ex lowを有するT細胞が存在しないことが明らかになった(図23)。
この結果から、生体内におけるEgr2−Treg細胞の分化誘導に際して、B細胞が何らかの機能を果たしている可能性が示されたので、本実施例においてはさらに、B細胞欠損マウスであるμMTマウスに対してC57BL/6マウス脾臓から採取したB細胞を移植して、本発明のEgr2−Treg細胞がμMTマウス生体内で誘導されるかどうかを検討した。
C57BL/6マウスのB細胞は、C57BL/6マウスから採取した脾臓の単一細胞懸濁液をB細胞単離キット(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)を製造者のプロトコルに従って使用するMACSにより、ネガティブ選択をすることによって精製した。MACSでソートされたB細胞の精製度は、>98%であった。このように精製された2×107B細胞をμMTマウスの静脈内に注射した。対照マウスには、PBSを注射した。細胞移植後9週間後に、マウスを犠死させ、そして脾臓細胞をフローサイトメトリーにより解析した。
その結果、C57BL/6マウスのB細胞を移植したμMTマウスでは、本発明のEgr2−Treg細胞と同じ表現型(LAG−3+ CD45RB ex low)を有するT細胞が、μMTマウスと比較して有意に増加することが明らかになった(図23)。従って、生体内における本発明のEgr2−Treg細胞の分化誘導に際しては、B細胞の存在が必要不可欠であることが明らかになった。
実施例9:
次いで、Foxp3+Treg細胞が分化誘導のために胸腺間質細胞により発現される自己−ペプチド/MHCとのより高い親和性のアゴニスト性相互作用を必要とされることが知られていたことから、本実施例においては、CD4+ CD25− LAG3+ T細胞が、Foxp3+ Treg細胞と同様の胸腺の選択プロセスを通じて、分化誘導されるのかどうかを調べた。
TCRトランスジェニックOT−IIマウス(Taconic)およびRIP−mOVAマウス(Jackson Laboratory)を使用して、膵島および胸腺中でラットインスリン遺伝子プロモータの調節下で膜結合型のOVAを発現すると同時に、I−Abとの関連でOVAペプチドを認識するトランスジェニックTCR(Vα2およびVβ5.1/5.2)も発現する、RIP−mOVA/OT−II二重−トランスジェニックマウスを作出した。このRIP−mOVA/OT−II 二重−トランスジェニックマウスにおいて、CD4+ CD25− LAG3+ T細胞の頻度は、CD4+ CD25+ Treg細胞の頻度がこれらの臓器中で増加したのとは対照的に、胸腺および脾臓において増加しなかった(図24)。この図において、上パネルおよび下パネルのプロットはそれぞれ、CD4+ Vβ5.1/5.2+およびCD4+ CD25− Vβ5.1/5.2+T細胞についてゲートされたものである。
一方、OT−IIトランスジェニックマウスは、脾臓およびパイエル板において正常マウスと同等数のCD4+ CD25− LAG3+ T細胞を含有したが、I−Eα鎖−特異的I−Ab−拘束性トランスジェニックTCRを発現するTEaトランスジェニックマウスは、特に脾臓において、CD4+ CD25− LAG3+ T細胞をほとんど有さなかった(図25)。
さらに、TEaマウスは、組織学的検討においても脾臓濾胞中に非常に少数のEgr−2−発現細胞しか含有しなかった(図26)。この図において、それぞれのバーは、1つの濾胞からの測定数を示す。このデータは、各群3匹のマウスから集めたものである。
すべてのエラーバーは、標準偏差を示す;2つのアスタリスクは、P<0.01であることを示す。
これらの結果を合わせると、Egr2−Treg細胞は、胸腺における自己抗原ペプチド/MHC複合体との高い親和性相互作用が分化に必要であるFoxp3−Tregとは分化誘導の形態が全く異なる抑制性T細胞であることも明らかとなった。興味深いことに、TEaトランスジェニックマウスは、本発明者の飼育環境下において、10週齢で自然発生的な大腸炎を発症し、この動物をマウスを大腸炎モデルとして使用することができた(図27)。この図において、TEaマウスの大腸、CD4+ CD25− LAG3+ T細胞の養子導入を受けたTEaマウスの大腸、そして正常のTea同腹子の大腸(対照)の代表的な肉眼的写真(左)およびヘマトキシリン−エオジン組織切片(右)を示す。そして、TEaトランスジェニックマウスに正常なC57BL/6マウスからCD4+ CD25− LAG3+ T細胞を移植すると、TEaトランスジェニックマウスにおける大腸炎の自然発症が顕著に抑制されることが示された(図27)。これらの知見から、CD4+ CD25− LAG3+ T細胞が、大腸炎誘導性T細胞応答を調節するための治療能力を有することが示唆される。
実施例10:
本実施例においては、実施例2において得られたマウスの知見に基づいて、ヒト扁桃腺由来細胞から、Egr−2遺伝子を発現するT細胞を採取することを目的として細胞分取を行った。
ヒト扁桃腺由来細胞をCD4−Cy7APC、CD25−APC、CD45RO−FITC、LAG−3−PEを用いてフローサイトメーターにて解析をおこなった。CD45RB陰性(低陽性)の細胞集団は、ヒトの場合にはCD45RO蛍光強度が増強している一集団として分取することも出来ることが知られていたため、実施例2において使用したCD45RB−FITCの代わりに、本実施例においてはCD45RO−FITCを使用した。
その結果、LAG−3表面抗原はCD4陽性細胞のうちCD25陰性の細胞(図28a)CD45RO陽性の細胞(図28b)に発現の増強を認めた(Egr−2 Treg細胞)。
さらに、CD4陽性T細胞をLAG−3発現の有無によりフローサイトメーターを用いて分離採取し、cDNA合成後、リアルタイムPCR法にてLAG−3 mRNA、Egr2 mRNA、Foxp3 mRNA、およびIL−10 mRNA発現を検討したところ、LAG−3発現細胞でのEgr2 mRNA、IL−10 mRNA、LAG−3 mRNAの発現増強を認めた(図29)。また、Foxp3発現はLAG発現と有意な相関は示さなかった。
本実施例においては、T細胞アナジーに関連すると予想される転写因子Egr−2が、どのような機序でT細胞の抑制能に関連しているのかを明らかにすることを目的として、T細胞にEgr−2遺伝子を導入して、Egr−2形質転換T細胞の作用を調べた。
まず、cDNAライブラリより得られたFull lengthのEgr2 cDNAをレトロウイルスベクターpMX(Onishi M,et al.,1996 Exp.Hematol.24:324−329)に導入し、pMX−Egr2−IRES−GFPレトロウイルスベクターを作製した(図1)。同様の手法にて、Foxp3、DOTAE、DOTBEを導入したレトロウイルスベクターを作製した(DOTAE、DOTBEはそれぞれニワトリ卵白アルブミン(OVA)に対する特異的T細胞レセプターα鎖、β鎖に対応するcDNAである)。尚、Egr2およびFoxp3はGFP(green fluorescent protein)発現により移入遺伝子の発現を評価するため、レトロウイルスベクターにIRES(internal ribosomal entry site)/GFPを共導入したものを作製した。また、コントロールとしてmock pMX−IRES−GFPベクターを使用した(図1)。各プラスミドはパッケージング細胞株のPLAT−E細胞にトランスフェクションすることにより遺伝子組み換えレトロウイルス産生細胞を得た。ついでその培養上清より得られたレトロウイルスをRetroNectin(Takara,Japan)を用い脾細胞に感染させた。
このようにして得られたMock(pMX−IRES−GFP)またはEgr2(pMX−Egr2−IRES−GFP)レトロウイルスベクターをマウス脾臓細胞に感染させてEgr2を発現させ、得られたマウスCD4陽性脾細胞をフローサイトメーターを用い、GFP発現を指標に各4群(negative、low、mid、high)に分け分離採取した(図2)。そして、図2にて分離採取した各4群のそれぞれの細胞よりcDNA合成を行い、Egr2 mRNA、およびLAG−3 mRNAレベルにおける発現をリアルタイムPCR法にて検討した(図3)。尚、mRNA発現はβ−アクチンにて標準化した相対的発現量である。以下、リアルタイムPCR法は同様の手法を用いて解析を行った。その結果、Egr2の発現とともにLAG−3も発現増強を認めた(図3)。
さらに、in vivoにおけるEgr2の抑制能評価のため、ニワトリ卵白アルブミン(OVA)に対する遅延型過敏反応を検討した。具体的には、OVA200μgと完全フロイントアジュバント(complete Freund’s adjuvant、CFA、ChondrexまたはBD Difco)を混和したものをBalb/c マウス(6〜8週齢)の尾部に皮内注射した。初回免疫の6日後に、単離した脾単核細胞(Balb/c マウス(6〜8週齢))に先述のpMX−Egr2−IRES−GFP、pMX−Foxp3−IRES−GFP、pMX−DOTAE、pMX−DOTBEレトロウイルスをそれぞれ感染させ72時間後、MACSカラム(Miltenyi Biotec)を用いてCD8、−CD11b、−CD19陽性細胞をビオチン化抗CD8抗体、CD11b抗体、CD19抗体及びストレプトアビジン結合マグネットビーズによりnegative selectionし、CD4陽性細胞を濃縮させた後、1×107cells/mouseをOVA免疫されたマウス尾部より静脈注射にて移入した。各実験群は、Mock(pMX−IRES−GFP)、DO11.10(pMX−DOTAE、pMX−DOTBE)、Fxp3(pMX−Foxp3−IRES−GFP)、Egr2(pMX−Egr2−IRES−GFP)の各レトロウイルスを図表の如く感染させた(各群n=12匹)。各レトロウイルス感染細胞移入48時間後、右足底部にOVA20μg/PBS100μlを追加免疫し、同時に左足底部にPBS100μlを投与、追加免疫24時間後にΔフットパッド(右フットパッド厚−左フットパッド厚)mmを計測し遅延型過敏反応の指標(Δフットパッド(再免疫24時間後‐再免疫前)mm)とした。
この結果、Egr2はFoxp3と同様、遅延型過敏反応を抑制した。また、OVA特異的T細胞レセプターを共移入することによりその抑制効果は著しく増強され、抗原特異的免疫抑制が可能なことが示された(図4)。
さらに、図2と同実験条件にてEgr2(pMX−Egr2−IRES−GFP)とDO11.10(pMX−DOTAE、pMX−DOTBE)を共移入したマウスの追加免疫24時間後の脾単核細胞をフローサイトメトリーにて分離解析した。脾単核細胞はフローサイトメトリーにてリンパ球およびCD4陽性細胞gate後、DO11.10T細胞レセプター特異抗体KJ1−26抗体およびGFPにて展開し、図中の如く各細胞集団を分離採取した。また、図3中にて分離採取した細胞よりcDNA合成を行い、Egr2 mRNA、LAG−3 mRNA、およびFoxp3 mRNAレベルにおける発現をリアルタイムPCR法にて検討した。この結果、移入した細胞はpMX−Egr2−IRES−GFPによりEgr2を過剰発現するとともに、LAG−3の発現も増強され、OVA特異的T細胞レセプターが共発現することにより、LAG−3も発現がさらに著しく増強され、Egr−2の抑制能には抗原特異的なT細胞レセプターシグナルが重要であることも示された(図5、図6)。
以上のことにより、Egr2がin vivoにおいて制御性T細胞様の活性誘導をすることが示された。また、Egr2形質転換T細胞が、LAG−3を顕著に発現し、Egr2の発現量とLAG−3の発現量が正相関を示し、さらにLAG−3発現は抗原特異的T細胞レセプターにより増強されることが明らかになった。
実施例2:
本実施例においては、Egr−2遺伝子を発現するT細胞を採取することを目的として細胞分取を行った。
マウス脾単核細胞をCD4−Cy7APC、CD25−APC、CD45RB−FITC、LAG−3−PEを用いてフローサイトメーターにて解析をおこなった。その結果、LAG−3表面抗原はCD4陽性細胞のうちCD25陰性の細胞(図7a)CD45RB陰性からCD45RB弱陽性の細胞(図7b)に発現の増強を認めた(Egr−2 Treg細胞)。尚、Foxp3−TregはCD4陽性、CD25陽性T細胞群と定義され、Egr2−Tregとは異なった細胞集団である。
さらに、CD4陽性T細胞をLAG−3発現の有無によりフローサイトメーターを用いて分離採取し、cDNA合成後、リアルタイムPCR法にてLAG−3 mRNA、Egr2 mRNA、Foxp3 mRNA、およびIL−10 mRNA発現を検討したところ、LAG−3発現細胞でのEgr2 mRNA、IL−10 mRNA、LAG−3 mRNAの発現増強を認めた(図8)。また、Foxp3発現はLAG発現と有意な相関は示さなかった。
次に、CD4陽性CD45RB ex low細胞群にてgateした細胞を、LAG−3、CD25にて展開し、CD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)、CD4+ CD25− LAG3− CD45RB ex low、CD4+ CD25+ CD45RB ex lowの3群の細胞集団を分離採取した(図9)。
図9にて分離採取した細胞よりcDNA合成を行い、リアルタイムPCR法にてEgr2 mRNAおよびFoxp3 mRNAの発現につき検討した。その結果、CD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)においてEgr2発現が最も強く、Foxp3発現では同様の発現傾向は認められなかった(図10)。
さらに、CD4陽性CD25陰性細胞群にてgateした細胞をLAG−3、CD45RBにて展開し、図示の如く各細胞群をフローサイトメーターにて分離採取、cDNA合成後、リアルタイムPCR法にてEgr2 mRNAおよびFoxp3 mRNAの発現につき検討した。その結果、CD4+ CD25− LAG−3+ CD45RB ex lowにおいてEgr2発現が最も強く、既知のFoxp3−Tregとは異なったEgr2−Tregが存在することが示された(図11、図12)。
実施例3:
本実施例においては、II型コラーゲン誘導関節炎発症モデルを用いてEgr2−Tregの検討を行った。
DBA−1Jマウス(6〜8週齢)の尾部にウシ由来II型コラーゲンと完全フロイントアジュバント(complete Freund’s adjuvant、CFA、ChondrexまたはBD Difco)を混和したものを皮内注射し(day0)、その後II型コラーゲンの追加免疫(day21)を行うことによりII型コラーゲン誘導関節炎発症誘発を行った。関節炎誘発後、図11と同様の手法により各細胞群を分離採取しリアルタイムPCR法による解析を行った。その結果、II型コラーゲン免疫後もCD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)は存在し、免疫後「Egr2−Treg」におけるIL−10発現のさらなる増強を認めた(図13)。尚、Egr−2は関節炎発症後も高発現を維持していた。
実施例4:
本実施例においては、C57BL/6マウスの脾細胞を用いてin vitroにおけるCD4+ CD25− LAG−3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)の抑制能につき検討した。
ナイーブT細胞サブセットとしてCFSEラベルしたCD4+ CD25− CD45RB highの細胞集団(Thy1.1+)5×104cellsを、抗原提示細胞として1500rad放射線照射した脾細胞(Thy1.2+)1×105cellsを用いた。抑制性細胞として、CD4+ CD25− CD45RB ex low細胞集団(Thy1.2+)をLAG−3発現によりhigh、low、negaの3群に分け分離採取した(各群5×104cells)(図14)。各細胞群を図中の如く可溶性CD3抗体存在下に72時間共培養し、Thy1.1+CD4+にてgateした細胞のCFSE発現減弱をCD4+ CD25− CD45RB highの細胞集団分裂増殖の指標として評価を行った。
その結果、Egr−2 Treg細胞は、ナイーブT細胞サブセット(CD45RBhi細胞)の細胞分裂を抑制し、その抑制能はLAG−3発現に依存することが明らかになった(図15)。
実施例5:
本実施例においては、Rag1−/−マウスにC57BL/6マウス脾臓CD4+ CD25− CD45RBhi細胞1×105cellsを腹腔内投与し、炎症性腸炎発症モデルを作製した。
腸炎は体重減少および組織像にて評価した。体重は細胞移入日(day0)を100%とした。各群は、CD4+ CD25− CD45RBhi細胞1×105cellsのみ、CD4+ CD25− CD45RBhi細胞1×105cells+CD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)細胞1×105cellsおよび、PBSのみ(control)の3群にて評価した。RAG1−/−マウスにおいて、C57BL/6マウス脾臓CD4+ CD25− CD45RBhi細胞投与により生じる腸炎を、CD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)細胞の共移入により抑制することが出来た(図16)。また、大腸の組織像においても、CD4+ CD25− CD45RBhi細胞投与単独投与において認められた炎症細胞浸潤、腸管壁肥厚などの所見が、CD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)細胞の共移入により改善していることが認められた(図17)。
実施例6:
現在Foxp3は抑制性T細胞のマスター遺伝子と考えられている。そこで、本実施例においては、そのFoxp3の機能的遺伝子を欠損しているScurfyマウスを使用してEgr2−Tregに関する検討を行った。
まず、Foxp3の機能的遺伝子を欠損しているScurfyマウスの脾細胞をCD4−Cy7APC、CD25−APC、CD45RB−FITC、LAG−3−PEを用いてフローサイトメーターにて解析をおこなった。その結果、フローサイトメーターにて解析にてScurfyマウスの脾細胞にもCD4+ CD25− LAG3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)細胞が存在することが示された(図18)。
また、ナイーブT細胞サブセットとしてCFSEラベルしたC57BL/6マウスCD4+ CD25− CD45RB highの細胞集団(Thy1.1+)5×104cellsを、抗原提示細胞として1500rad放射線照射C57BL/6マウスのwhole splenocyte(Thy1.2+)1×105cellsを用いた。抑制性細胞としては、ScurfyマウスCD4+ CD25− CD45RB ex low細胞集団(Thy1.2+)2.5×104cellsを用いた。各細胞群を図中の如くsoluble CD3抗体存在下に72時間共培養し、Thy1.1+CD4+にてgateした細胞のCFSE発現減弱をCD4+ CD25− CD45RB highの細胞集団分裂増殖の指標として評価を行った。また、同条件にて培養上清中にLAG−3中和抗体を加えた系も検討した。その結果、機能的Foxp3遺伝子を欠損したScurfyマウスのEgr2−Treg細胞はin vitroにおける抑制能を有し、その抑制能はLAG−3中和抗体にて減弱することが示された(図19)。
さらに、Rag1−/−マウスにC57BL/6マウス脾臓CD4+ CD25− CD45RBhi細胞1×105cellsを腹腔内投与し、炎症性腸炎発症モデルを作製した。腸炎は体重減少および組織像にて評価した。体重は細胞移入日(day0)を100%とした。各群は、C57BL/6マウス脾臓CD4+ CD25− CD45RBhi細胞1×105cellsのみ、C57BL/6マウス脾臓CD4+ CD25− CD45RBhi細胞1×105cells+ScurfyマウスCD4+ CD25− LAG−3+ CD45RB ex low(Egr2−Treg)細胞1×105cellsおよび、PBSのみ(control)の3群にて評価した。その結果、in vivoにおいてもRag1−/−マウスの炎症性腸炎発症モデルにおける腸炎を抑制することが示された(図20)。
以上のことより、Egr2−Treg細胞はFoxp3の機能に依存せず抑制能を発揮する新規抑制性T細胞集団であり、その抑制能はLAG−3を介していることが示された。
実施例7:
本実施例においては、Egr2遺伝子の機能を解析する為、shRNA−Egr2レトロウイルスを作製し、Egr2遺伝子をsilencingし、マウスのフェノタイプ解析を行った。
具体的には、5FUを投与したC57BL/6マウスの骨髄細胞を採取し、shRNA−Egr2レトロウイルスを感染させた後、放射線照射C57BL/6マウスに移入することで、shRNA−Egr2骨髄キメラマウスを作製した(図21)。その結果、Egr2遺伝子発現がsilencingされることにより、LAG−3発現は抑制され、shRNA−Egr2骨髄キメラマウスは腸管の著しい肥厚を認めた(写真は骨髄移植30日後のマウス大腸)(図22)。また、骨髄移植後、著しい腸炎を発症し約4週間で死亡した。
実施例8:
本実施例においては、本発明のEgr2−Treg細胞が、生体内でどのような機序で誘導されるかを明らかにすることを目的として、Egr2−Treg細胞の誘導実験を行った。
C57BL/6マウスまたはB細胞欠損マウスであるμMTマウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)の脾臓およびパイエル板を小さな組織片に細かく切断し、IV型コラゲナーゼ(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)からCD4+のT細胞を採取し、この細胞について実施例2に記載する様に、PE−抗LAG−3モノクローナル抗体(LAG−3−PE)およびFITC−抗CD45RBモノクローナル抗体(CD45RB−FITC)を用いてフローサイトメーターにて解析をおこなった。その結果、C57BL/6マウスでは脾臓由来の細胞およびパイエル板由来の細胞ともに、本発明のEgr2−Treg細胞と同じ表現型(すなわち、LAG−3+CD45RB ex low)を有するT細胞が存在するが、μMTマウスでは、LAG−3+ CD45RB ex lowを有するT細胞が存在しないことが明らかになった(図23)。
この結果から、生体内におけるEgr2−Treg細胞の分化誘導に際して、B細胞が何らかの機能を果たしている可能性が示されたので、本実施例においてはさらに、B細胞欠損マウスであるμMTマウスに対してC57BL/6マウス脾臓から採取したB細胞を移植して、本発明のEgr2−Treg細胞がμMTマウス生体内で誘導されるかどうかを検討した。
C57BL/6マウスのB細胞は、C57BL/6マウスから採取した脾臓の単一細胞懸濁液をB細胞単離キット(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)を製造者のプロトコルに従って使用するMACSにより、ネガティブ選択をすることによって精製した。MACSでソートされたB細胞の精製度は、>98%であった。このように精製された2×107B細胞をμMTマウスの静脈内に注射した。対照マウスには、PBSを注射した。細胞移植後9週間後に、マウスを犠死させ、そして脾臓細胞をフローサイトメトリーにより解析した。
その結果、C57BL/6マウスのB細胞を移植したμMTマウスでは、本発明のEgr2−Treg細胞と同じ表現型(LAG−3+ CD45RB ex low)を有するT細胞が、μMTマウスと比較して有意に増加することが明らかになった(図23)。従って、生体内における本発明のEgr2−Treg細胞の分化誘導に際しては、B細胞の存在が必要不可欠であることが明らかになった。
実施例9:
次いで、Foxp3+Treg細胞が分化誘導のために胸腺間質細胞により発現される自己−ペプチド/MHCとのより高い親和性のアゴニスト性相互作用を必要とされることが知られていたことから、本実施例においては、CD4+ CD25− LAG3+ T細胞が、Foxp3+ Treg細胞と同様の胸腺の選択プロセスを通じて、分化誘導されるのかどうかを調べた。
TCRトランスジェニックOT−IIマウス(Taconic)およびRIP−mOVAマウス(Jackson Laboratory)を使用して、膵島および胸腺中でラットインスリン遺伝子プロモータの調節下で膜結合型のOVAを発現すると同時に、I−Abとの関連でOVAペプチドを認識するトランスジェニックTCR(Vα2およびVβ5.1/5.2)も発現する、RIP−mOVA/OT−II二重−トランスジェニックマウスを作出した。このRIP−mOVA/OT−II 二重−トランスジェニックマウスにおいて、CD4+ CD25− LAG3+ T細胞の頻度は、CD4+ CD25+ Treg細胞の頻度がこれらの臓器中で増加したのとは対照的に、胸腺および脾臓において増加しなかった(図24)。この図において、上パネルおよび下パネルのプロットはそれぞれ、CD4+ Vβ5.1/5.2+およびCD4+ CD25− Vβ5.1/5.2+T細胞についてゲートされたものである。
一方、OT−IIトランスジェニックマウスは、脾臓およびパイエル板において正常マウスと同等数のCD4+ CD25− LAG3+ T細胞を含有したが、I−Eα鎖−特異的I−Ab−拘束性トランスジェニックTCRを発現するTEaトランスジェニックマウスは、特に脾臓において、CD4+ CD25− LAG3+ T細胞をほとんど有さなかった(図25)。
さらに、TEaマウスは、組織学的検討においても脾臓濾胞中に非常に少数のEgr−2−発現細胞しか含有しなかった(図26)。この図において、それぞれのバーは、1つの濾胞からの測定数を示す。このデータは、各群3匹のマウスから集めたものである。
すべてのエラーバーは、標準偏差を示す;2つのアスタリスクは、P<0.01であることを示す。
これらの結果を合わせると、Egr2−Treg細胞は、胸腺における自己抗原ペプチド/MHC複合体との高い親和性相互作用が分化に必要であるFoxp3−Tregとは分化誘導の形態が全く異なる抑制性T細胞であることも明らかとなった。興味深いことに、TEaトランスジェニックマウスは、本発明者の飼育環境下において、10週齢で自然発生的な大腸炎を発症し、この動物をマウスを大腸炎モデルとして使用することができた(図27)。この図において、TEaマウスの大腸、CD4+ CD25− LAG3+ T細胞の養子導入を受けたTEaマウスの大腸、そして正常のTea同腹子の大腸(対照)の代表的な肉眼的写真(左)およびヘマトキシリン−エオジン組織切片(右)を示す。そして、TEaトランスジェニックマウスに正常なC57BL/6マウスからCD4+ CD25− LAG3+ T細胞を移植すると、TEaトランスジェニックマウスにおける大腸炎の自然発症が顕著に抑制されることが示された(図27)。これらの知見から、CD4+ CD25− LAG3+ T細胞が、大腸炎誘導性T細胞応答を調節するための治療能力を有することが示唆される。
実施例10:
本実施例においては、実施例2において得られたマウスの知見に基づいて、ヒト扁桃腺由来細胞から、Egr−2遺伝子を発現するT細胞を採取することを目的として細胞分取を行った。
ヒト扁桃腺由来細胞をCD4−Cy7APC、CD25−APC、CD45RO−FITC、LAG−3−PEを用いてフローサイトメーターにて解析をおこなった。CD45RB陰性(低陽性)の細胞集団は、ヒトの場合にはCD45RO蛍光強度が増強している一集団として分取することも出来ることが知られていたため、実施例2において使用したCD45RB−FITCの代わりに、本実施例においてはCD45RO−FITCを使用した。
その結果、LAG−3表面抗原はCD4陽性細胞のうちCD25陰性の細胞(図28a)CD45RO陽性の細胞(図28b)に発現の増強を認めた(Egr−2 Treg細胞)。
さらに、CD4陽性T細胞をLAG−3発現の有無によりフローサイトメーターを用いて分離採取し、cDNA合成後、リアルタイムPCR法にてLAG−3 mRNA、Egr2 mRNA、Foxp3 mRNA、およびIL−10 mRNA発現を検討したところ、LAG−3発現細胞でのEgr2 mRNA、IL−10 mRNA、LAG−3 mRNAの発現増強を認めた(図29)。また、Foxp3発現はLAG発現と有意な相関は示さなかった。
現在、自己免疫疾患や移植臓器拒絶などの、望まれない抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患を治療するためには、免疫抑制剤の投与など全身的に免疫機能を抑制する処置を必要としており、それに伴う重症感染症を含めた副作用が大きな問題となっていたが、本発明の制御性T細胞を投与することにより、局所的な免疫寛容を誘導することができることから、患者体内において上述したような副作用を引き起こすことなく、自己抗原に対する免疫反応に起因するかまたは望まれない抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する、自己免疫疾患や移植臓器拒絶などの種々の疾患を治療することができる。
[配列表]
[配列表]
Claims (15)
- CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来の単離されたT細胞。
- 制御性T細胞としての機能を有する、請求項1に記載の単離されたT細胞。
- 制御性T細胞としての機能が、T細胞免疫寛容(トレランス)の誘導機能である、請求項1または2に記載の単離されたT細胞。
- 哺乳動物がヒトである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の単離されたT細胞。
- 哺乳動物のリンパ球集団またはT細胞集団から、
(i)CD4が陽性である細胞(CD4+)を採取する工程;
(ii)CD25が陰性である細胞(CD25−)を採取する工程;
(iii)CD45RBが陰性(低陽性)である細胞(CD45RB−(low))またはCD45ROが陽性である細胞(CD45RO+)を採取する工程;そして
(iv)LAG−3が陽性である細胞(LAG3+)を採取する工程;
を、(i)〜(iv)の工程を順不同で行うことにより、CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG−3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のT細胞を単離する方法。 - 哺乳動物のリンパ球集団またはT細胞集団を末梢血から採取してからそのまま(i)〜(iv)の工程を行う、請求項5に記載の哺乳動物由来のT細胞を単離する方法。
- 哺乳動物のリンパ球集団またはT細胞集団を末梢血から採取し、そのリンパ球集団またはT細胞集団を増殖させてから(i)〜(iv)の工程を行う、請求項5に記載の哺乳動物由来のT細胞を単離する方法。
- 前記(i)〜(iv)の工程を行うことにより単離した本発明のT細胞集団をそのまま使用する、請求項5〜7のいずれか1項に記載の哺乳動物由来のT細胞を単離する方法。
- 前記(i)〜(iv)の工程を行うことにより単離した本発明のT細胞集団を増殖してから使用する、請求項5〜7のいずれか1項に記載の哺乳動物由来のT細胞を単離する方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項5〜9のいずれか1項に記載の哺乳動物由来のT細胞を単離する方法。
- CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG−3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来の単離されたT細胞を含む医薬組成物。
- 自己抗原に対する免疫反応に起因するかまたは抗原−抗体反応により抗原が排除されることに起因する種々の疾患を治療するための、請求項11に記載の医薬組成物。
- 自己免疫疾患または移植臓器拒絶を治療するための、請求項12に記載の医薬組成物。
- 自己免疫疾患が、関節リウマチ、膠原病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、1型糖尿病などから選択される、請求項13に記載の医薬組成物。
- (a)CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG−3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する、哺乳動物由来のT細胞を、被検化合物の存在下にて培養する工程;
(b)培養したT細胞中でのEgr−2遺伝子の発現の変化またはLAG−3遺伝子の発現の変化を測定する工程;
(c)Egr−2遺伝子の発現の増加またはLAG−3遺伝子の発現の増加を導く化合物を、CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG3+)の細胞表面抗原特性を有する哺乳動物由来のT細胞を増加させる化合物として選択する工程;
からなる、CD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RB陰性(低陽性)(CD45RB−(low))、およびLAG−3陽性(LAG−3+)またはCD4陽性(CD4+)、CD25陰性(CD25−)、CD45RO陽性(CD45RO+)、およびLAG−3陽性(LAG−3+)の細胞表面抗原特性を有する哺乳動物由来のT細胞を増加させる化合物のスクリーニング方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007102669 | 2007-04-10 | ||
JP2007102669 | 2007-04-10 | ||
PCT/JP2008/057460 WO2008126940A1 (ja) | 2007-04-10 | 2008-04-10 | 新規t細胞 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2008126940A1 true JPWO2008126940A1 (ja) | 2010-09-24 |
Family
ID=39864027
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009509387A Withdrawn JPWO2008126940A1 (ja) | 2007-04-10 | 2008-04-10 | 新規t細胞 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPWO2008126940A1 (ja) |
WO (1) | WO2008126940A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PT2113254E (pt) * | 2008-04-28 | 2012-11-26 | Txcell | Composições para o tratamento de um estado inflamatório auto-imune |
EP2558123B1 (en) * | 2010-04-13 | 2023-08-09 | Immunovative Therapies, Ltd. | Uses and compositions for inhibition of treg cells, comprising t helper cells and chaperonine-rich cell lysate |
JPWO2016084412A1 (ja) * | 2014-11-28 | 2017-10-05 | 国立大学法人 東京大学 | B細胞活性化の抑制剤及び自己免疫疾患の治療剤 |
JP7277255B2 (ja) * | 2018-05-31 | 2023-05-18 | 佳寛 大矢 | インビトロでの制御性t細胞の特異性評価方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PT1897548E (pt) * | 2003-02-28 | 2013-11-19 | Univ Johns Hopkins | Regulação de células t |
JP2007538000A (ja) * | 2004-01-08 | 2007-12-27 | リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・カリフオルニア | 制御性t細胞は自己免疫を抑制する |
-
2008
- 2008-04-10 JP JP2009509387A patent/JPWO2008126940A1/ja not_active Withdrawn
- 2008-04-10 WO PCT/JP2008/057460 patent/WO2008126940A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2008126940A1 (ja) | 2008-10-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11326147B2 (en) | Redirected, genetically-engineered T regulatory cells and their use in suppression of autoimmune and inflammatory disease | |
Scapigliati et al. | Fish lymphocytes: an evolutionary equivalent of mammalian innate-like lymphocytes? | |
US11111294B2 (en) | T cell receptors and immune therapy using the same | |
US20230321150A1 (en) | Pd-l1 expressing hematopoietic stem cells and uses | |
JP2021184729A (ja) | 新規t細胞受容体およびそれを用いた免疫療法 | |
ES2684493T3 (es) | Un polipéptido SAP para uso en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios y enfermedad del injerto contra el huésped | |
JP6346602B2 (ja) | ヒトリンパ器官由来の抑制性ストローマ細胞の単離および使用 | |
US20100178700A1 (en) | Novel thymic cellular populations and uses thereof | |
JPWO2008126940A1 (ja) | 新規t細胞 | |
Bosco et al. | Peripheral T cells in the thymus: have they just lost their way or do they do something? | |
JPWO2020158924A1 (ja) | 母児間免疫寛容を誘導する方法 | |
FR2864546A1 (fr) | Methode d'identification et de preparation de lymphocytes t regulateurs/suppresseurs, compositions et utilisations | |
Iacovelli et al. | Lymphoid EVA1 expression is required for DN1-DN3 thymocytes transition | |
TWI790162B (zh) | 新穎t細胞受器及使用其之免疫治療 | |
Wagers | Enhancing Regulatory T Cell Therapy Efficacy for Acute GVHD Prevention | |
Milward | Investigation of the cell biology of human regulatory T cells in the context of transplantation | |
Divitio | Recipient dendritic cells dictate allograft fate | |
McIntire | HLA-G as an environmental modulator of human pregnancy | |
FRUTH et al. | H. 3 Expression ofT cell specific proteinase-t (TSP-t) in T cell subsets and its role in T cell effector function |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20110705 |