JP2021184729A - 新規ｔ細胞受容体およびそれを用いた免疫療法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＣＯＬ６Ａ３抗原に対する抗原認識コンストラクトを提供する。【解決手段】任意の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含んでなる抗原認識コンストラクトである。前記抗原認識コンストラクトをコードする核酸、これらの核酸を含んでなるベクター、抗原認識コンストラクトを発現する組換え細胞、および本発明の化合物を含んでなる医薬組成物が提供される。【選択図】図２

Description

本発明は、ＣＯＬ６Ａ３抗原に対する抗原認識コンストラクトに関する。本発明は、特に、腫瘍発現抗原ＣＯＬ６Ａ３に対して選択的かつ特異的な、新規Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの分子を提供する。本発明のＴＣＲ、およびそれに由来するＣＯＬ６Ａ３抗原結合断片は、がん性疾患を発現するＣＯＬ６Ａ３の診断、治療、および予防に有用である。さらに、本発明の抗原認識コンストラクトをコードする核酸、これらの核酸を含んでなるベクター、抗原認識コンストラクトを発現する組換え細胞、および本発明の化合物を含んでなる医薬組成物が提供される。

コラーゲンは様々な組織の完全性を維持する上で役割を果たす、タンパク質のスーパーファミリーである。コラーゲンは細胞外マトリックスタンパク質であり、それらの共通の構造要素として三重らせんドメインを有する。コラーゲンＶＩは、ミクロフィブリルの主要構成要素である。コラーゲンＶＩの基本的な構造単位は、αｌ（ＶＩ）、α２（ＶＩ）、およびα３（ＶＩ）コラーゲン鎖のヘテロ三量体である。αｌ（ＶＩ）およびα２（ＶＩ）鎖は、それぞれＣＯＬ６Ａ１およびＣＯＬ６Ａ２遺伝子によってコードされる。ＣＯＬ６Ａ３遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＶＩ型コラーゲンのα３サブユニット（α３（ＶＩ）コラーゲン鎖）である（Ｂｅｒｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００２Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｕｒｏｌ６：１９３−８）。ＣＯＬ６Ａ３の遺伝子発現は、乳がんの進行に関連し大腸がんでは上昇する（Ｓｍｉｔｈ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．"Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｓｔｒｏｍａ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ"Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．２００９；１００：１４５２−１４６４；Ｔｉｌｍａｎ Ｇ ｅｔ ａｌ"Ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ，ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ：ｅｖｉｄｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｂｏｔｈ ｓｔｒｏｍａｌ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ"Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ．２００７；６：８０）ことが以前示されており、結腸直腸がんの予後マーカーであることが示されている（Ｑｉａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．"Ｓｔｒｏｍａ ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＯＬ６Ａ３ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ"Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５ Ｏｃｔ６；６（３０）：２９９２９−２９９４６）。ＣＯＬ６Ａ３遺伝子はヒトゲノムの２ｑ３７に位置し、４４のエクソンを含む。ＣＯＬ６Ａ３タンパク質は、３１７７個のアミノ酸を有し、１２個のフォンヴィレブランド因子Ａ型（ｖＷＡ）ドメイン、１個のフィブロネクチン３型ドメイン、および１個のＢＰＴＩ／クニッツファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤（ＫＵ）ドメインを含む。

Ｔ細胞ベースの免疫療法標的は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示される腫瘍関連または腫瘍特異的タンパク質に由来する、ペプチドエピトープに相当する。これらの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来するペプチドであり得て、それらは各腫瘍細胞内で発現され、同一起源の非改変細胞内と比較して、通常、上方制御される。

細胞性免疫応答の特異的要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊できる。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からのＴ細胞の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲｉＰ）に由来する、通常は８〜１０アミノ酸残基の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）保有ペプチドのクラスＩ分子を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。

ＴＣＲは、シグナル伝達媒介に関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質に関連する、免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質である。ＴＣＲはαβおよびγδ形態で存在し、それらは構造的に類似しているが、かなり異なる解剖学的位置と、恐らくは機能とを有する。天然のヘテロ二量体αβＴＣＲの細胞外部分は２つのポリペプチドからなり、そのそれぞれは膜近位定常ドメインおよび膜遠位可変ドメインを有する。定常ドメインおよび可変ドメインのそれぞれは、鎖内ジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似した、高度に多型性のループを含有する。ＴＣＲ遺伝子治療の使用は、いくつかの現在のハードルを克服する。それは、患者自身のＴ細胞に所望の特異性を与えて、十分な数のＴ細胞を短期間で生成できるようにし、それらの枯渇を回避する。ＴＣＲは、中央記憶Ｔ細胞または幹細胞の特徴を有するＴ細胞に形質導入され、それは移植時におけるより良好な持続性と機能を確実にしてもよい。ＴＣＲ操作Ｔ細胞は、化学療法または照射によってリンパ球減少症になったがん患者に注入され、効率的な生着を可能にするが、免疫抑制は阻害する。

がん治療のための分子標的薬の開発が進歩しているものの、当該技術分野において、がん細胞に高度に特異的な分子を特異的に標的化する新たな抗がん剤を開発する必要性がなおもある。

本明細書は、新規ＣＯＬ６Ａ３ ＴＣＲ、各組換えＴＣＲコンストラクト、核酸、ベクター、および開示されるようなＣＯＬ６Ａ３エピトープに特異的に結合する宿主細胞と；がんの治療においてこのような分子を使用する方法とを提供することによって、必要性に対処する。

本発明の目的は、配列番号３、９、１５、２１、２７、および３３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または好ましくは１００％の配列同一性を有する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含んでなる抗原認識コンストラクトによって、第１の態様において解決される。

別の追加的または代替的実施形態では、抗原認識コンストラクトは、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメイン配列をさらに含んでなってもよい。可変ドメイン内で、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、ポリペプチド鎖の可変（Ｖ）領域に見いだされ、ＣＤＲ３は、Ｖの一部と、多様性（Ｄ）および連結（Ｊ）領域の全てを含む。ＣＤＲ３は最も可変性であり、抗原を特異的かつ選択的に認識することに関与する主要ＣＤＲである。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列は、ヒト可変鎖対立遺伝子のＣＤＲ配列から選択されてもよい。

天然α−βヘテロ二量体ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を有する。各鎖は可変領域、連結領域、および定常領域を含んでなり、β鎖は通常、可変領域と連結領域の間の短い多様性領域もまた含有するが、この多様性領域はしばしば連結領域の一部と見なされる。各可変領域はフレームワーク配列に埋め込まれた３つのＣＤＲ（相補性決定領域）を含んでなり、そのうちの１つはＣＤＲ３と命名される超可変領域である。それらのフレームワークによって、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列によって、ならびに部分的に定義されたＣＤＲ３配列によって区別される、数種類のα鎖可変（Ｖα）領域および数種類のβ鎖可変（Ｖβ）領域がある。Ｖα型は、ＩＭＧＴ命名法では固有のＴＲＡＶ番号によって示され、Ｖβ型は固有のＴＲＢＶ番号によって示される。

したがって、１つの追加的または代替的実施形態では、本発明の抗原認識コンストラクトは、以下の表１に示すように組み合わされたＣＤＲ１、ＣＤＲ２および、ＣＤＲ３配列を含んでなり、それはＣＤＲ３配列と共にそれぞれの可変鎖対立遺伝子を提示する。したがって、少なくとも１つの、好ましくは３つ全てのＣＤＲ配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる本発明の抗原認識コンストラクトが好ましい。好ましくは、本発明の抗原認識コンストラクトは、本明細書で開示される本発明のＴＣＲ可変領域の一個体の各ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含んでなる。

「特異性」または「抗原特異性」または所与の抗原「に特異的な」という用語は、本明細書の用法では、抗原がＨＬＡ、好ましくはＨＬＡ Ａ２による場合、抗原認識コンストラクトが、前記抗原に、好ましくはＣＯＬ６Ａ３抗原に、より好ましくは高い結合活性で、特異的に結合し得ることを意味する。ＴＣＲを発現し、そしてＨＬＡを提示するＣＯＬ６Ａ３と接触したＴ細胞が、以下で提供される本明細書の抗原でパルス処理されたＣＯＬ６Ａ３エピトープなどの低濃度（例えば、約１０〜１１ｍｏｌ／ｌ、１０〜１０ｍｏｌ／ｌ、１０〜９ｍｏｌ／ｌ、１０〜８ｍｏｌ／ｌ、１０〜７ｍｏｌ／ｌ、１０〜６ｍｏｌ／ｌ、１０〜５ｍｏｌ／ｌ）のＣＯＬ６Ａ３抗原標的細胞との同時培養時に、少なくとも約２００ｐｇ／ｍｌ以上（例えば、２５０ｐｇ／ｍｌ以上、３００ｐｇ／ｍｌ以上、４００ｐｇ／ｍｌ以上、５００ｐｇ／ｍｌ以上、６００ｐｇ／ｍｌ以上、７００ｐｇ／ｍｌ以上、１０００ｐｇｍｌ以上、２，０００ｐｇ／ｍｌ以上、２，５００ｐｇ／ｍｌ以上、５，０００ｐｇ／ｍｌ以上）のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を分泌する場合、例えば、抗原認識コンストラクトとしてのＴＣＲは、ＣＯＬ６Ａ３抗原に対する「抗原特異性」を有すると見なされてもよい。代案としては、またはそれに加えて、ＴＣＲを発現する細胞が、低濃度のＣＯＬ６Ａ３抗原でパルス処理された標的細胞との同時培養時に、ＩＦＮ−γの非形質導入バックグラウンドレベルの少なくとも２倍量のＩＦＮ−γを分泌する場合、ＴＣＲは、ＣＯＬ６Ａ３に対する「抗原特異性」を有すると見なされてもよい。上記のようなこのような「特異性」は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて分析され得る。

本発明の１つの代替的または追加的実施形態では、抗原認識コンストラクトは、ＣＯＬ６Ａ３抗原に選択的に結合し；好ましくはＣＯＬ６Ａ３抗原は、配列番号５８〜６７、最も好ましくは配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質エピトープまたはペプチド、またはその変異型であり、変異型は、３つ以下、好ましくは２つ、最も好ましくは１つ以下のアミノ酸位置のアミノ酸欠失、付加、挿入または置換である。

「選択性」または「選択的に認識／結合する」という用語は、好ましくは１つの特異的エピトープのみを選択的に認識しまたはそれに結合し、好ましくは別のエピトープに対する交差反応性を示さないかまたは実質的に示さない、ＴＣＲまたは抗体などの抗原認識コンストラクトの特性を指すものと理解される。好ましくは「選択性」または「選択的に認識／結合する」は、好ましくは１つの特異的エピトープのみを選択的に認識しまたはそれに結合し、好ましくは別のエピトープに対する交差反応性を示さないかまたは実質的に示さない、抗原認識コンストラクト（例えばＴＣＲ）を意味し、前記エピトープは１つのタンパク質に固有であり、その結果、抗原認識コンストラクトは、その他のエピトープおよびその他のタンパク質に対して交差反応性を示さないかまたは実質的に示さない。

本発明によるコンストラクトを認識する抗原は、好ましくは抗体、またはその誘導体または断片、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはその誘導体または断片から選択される。本発明の抗体またはＴＣＲの誘導体または断片は、好ましくは、親分子の抗原結合／認識能力、特に上で説明したようなその特異性および／または選択性を保持しなければならない。そのような結合機能は、本明細書で定義されるＣＤＲ３領域の存在によって保持されてもよい。

本発明の一実施形態では、本発明のＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ依存性様式でＣＯＬ６Ａ３抗原を認識できる。「ＭＨＣクラスＩ依存性様式」は、本明細書の用法では、ＴＣＲが、ＭＨＣクラスＩ分子の文脈内で、ＣＯＬ６Ａ３抗原への結合時に免疫応答を誘発することを意味する。ＭＨＣクラスＩ分子は、例えば、ＨＬＡ−Ａ分子などの当該技術分野で公知の任意のＭＨＣクラスＩ分子であり得る。本発明の好ましい実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２分子である。

本発明は、コンストラクトを認識する一本鎖抗原と、コンストラクトを認識する二本鎖との双方を提供する。

本発明は、特に抗原認識コンストラクトとしてのＴＣＲ、またはその断片または誘導体を提供する。ＴＣＲは、好ましくはヒトＴＣＲであり、それはヒトＴＣＲ遺伝子座から生じ、したがってヒトＴＣＲ配列を含んでなるものとして理解される。さらに、本発明のＴＣＲは、ヒト起源であること、そしてＣＯＬ６Ａ３抗原を特異的に認識することを特徴としてもよい。

本発明の別の実施形態は、それに加えてまたは代案として、免疫応答を誘導する上述の抗原認識コンストラクトを提供し、好ましくは免疫応答は、インターフェロン（ＩＦＮ）γレベルの増加によって特徴付けられる。

本発明のＴＣＲは、一本鎖αまたはβ、またはγおよびδ、分子として、または代案としては、αおよびβ鎖、またはγおよびδ鎖の双方から構成される、二本鎖コンストラクトとして提供されてもよい。

本発明の抗原認識コンストラクトは、ＴＣＲαまたはγ鎖；および／またはＴＣＲβまたはδ鎖を含んでなってもよく；ＴＣＲαまたはγ鎖は、配列番号３、１５、および２７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含んでなり、および／またはＴＣＲβまたはδ鎖は、配列番号９、２１、および３３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含んでなる。

最も好ましくは、本開示が、本明細書で開示されるＴＣＲ鎖（表１を参照されたい）のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３領域の任意の１つ、２つまたは全てを含んでなる抗原認識コンストラクトに言及するいくつかの追加的な実施形態では、３つ、２つ、好ましくは１つのみの修飾アミノ酸残基を有する各ＣＤＲ配列を含んでなる抗原認識コンストラクトが、好ましくあってもよい。修飾されたアミノ酸残基は、アミノ酸の挿入、欠失または置換から選択されてもよい。最も好ましくは、３つ、２つ、好ましくは１つの修飾アミノ酸残基は、それぞれのＣＤＲ配列の最初または最後のアミノ酸残基である。修飾が置換である場合、いくつかの実施形態では、置換は保存的アミノ酸置換であることが好ましい。

本発明の抗原認識コンストラクトが、二本鎖ＴＣＲなどの少なくとも２つのアミノ酸鎖またはその抗原結合断片から構成される場合、抗原認識コンストラクトは、第１のポリペプチド鎖中の配列番号３に記載のアミノ酸配列、および第２のポリペプチド鎖中の配列番号９に記載のアミノ酸配列；第１のポリペプチド鎖中の配列番号１５に記載のアミノ酸配列、および第２のポリペプチド鎖中の配列番号２１に記載のアミノ酸配列；第１のポリペプチド鎖中の配列番号２７に記載のアミノ酸配列、および第２のポリペプチド鎖中の配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含んでなってもよい。前述の二本鎖ＴＣＲ、またはその抗原結合断片のいずれか１つが、本発明の好ましいＴＣＲである。いくつかの態様において、本発明の二本鎖ＴＣＲのＣＤＲ３は変異していてもよい。上記の配列番号９〜２８のＣＤＲ３配列の変異は、好ましくは３つ以下、好ましくは２つ、そして最も好ましくは１つ以下のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖はＴＣＲαまたはγ鎖であってもよく、第２のポリペプチド鎖はＴＣＲβまたはδ鎖であってもよい。αβまたはγδＴＣＲの組み合わせが好ましい。

ＴＣＲ、またはその抗原結合断片は、いくつかの実施形態では、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖、またはγ鎖とδ鎖から構成される。このような二本鎖ＴＣＲは各鎖内に可変領域を含んでなり、可変領域はそれぞれ１つのＣＤＲ１、１つのＣＤＲ２、および１つのＣＤＲ３配列を含んでなる。ＴＣＲは、配列番号４および配列番号１０、または配列番号１６および配列番号２２（Ｒ４Ｐ３Ｆ９）；または配列番号２８および配列番号３４（Ｒ４Ｐ３Ｈ３）の可変鎖アミノ酸配列（Ｒ４Ｐ１Ｄ１０）に含まれるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の配列を含んでなる。

本発明のいくつかの実施形態は、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖から構成されるＴＣＲ、またはその断片に関し、前記ＴＣＲは、それぞれ配列番号４および１０、またはそれぞれ１６および２２；またはそれぞれ２８および３４に記載のαおよびβ鎖から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または好ましくは１００％の配列同一性を有する可変領域配列を含んでなる。

本発明のＴＣＲは、例えば、ヒト、ラット、サル、ウサギ、ロバ、またはマウスなどの任意の哺乳類などの任意の適切な生物種に由来する、定常領域をさらに含んでなってもよい。本発明の一実施形態では、本発明のＴＣＲは、ヒト定常領域をさらに含んでなる。いくつかの好ましい実施形態では、本発明のＴＣＲの定常領域は、例えば、好ましくはマウス配列である、ＴＣＲ発現および安定性を増加させてもよい異種配列の導入によって、わずかに修飾されてもよい。

本発明のいくつかの実施形態は、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖から構成されるＴＣＲ、またはその断片に関し、前記ＴＣＲは、それぞれ配列番号５および１１、またはそれぞれ１７および２３；またはそれぞれ２９および３５に記載のαおよびβ鎖から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または好ましくは１００％の配列同一性を有する定常領域配列を含んでなる。

本発明のＴＣＲαまたはγ鎖は、配列番号１、１３、および２５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ１；および／または配列番号２、１４、および２６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ２をさらに含んでなってもよい。

本発明によれば、ＴＣＲβまたはδ鎖は、配列番号１、１９、および３１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ１；および／または配列番号８、２０、および３２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ２をさらに含んでなってもよい。

抗原認識コンストラクトは、さらなる実施形態では、ＴＣＲ結合断片を含んでなってもよく、前記結合断片は、任意選択的に、配列番号１、２、３、または７、８、９または１３、１４、１５、または１９、２０、２１、または２５、２６、２７または３１、３２、３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列から選択されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含んでなる。

本発明のさらなる実施形態では、本明細書で前述した抗原認識コンストラクトは、少なくとも１つのＴＣＲα鎖配列および１つのＴＣＲβ鎖配列から構成される、ＴＣＲまたはその断片であり、前記ＴＣＲα鎖配列は、配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列は、配列番号７〜９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり；または前記ＴＣＲα鎖配列は、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列は、配列番号１９〜２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり；または前記ＴＣＲα鎖配列は、配列番号２５〜２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列は、配列番号３１〜３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなる。

本発明のさらなる実施形態では、本明細書で前述した抗原認識コンストラクトは、少なくとも１つのＴＣＲα鎖配列および１つのＴＣＲβ鎖配列を含んでなる、ＴＣＲまたはその断片であり、前記ＴＣＲα鎖配列は、配列番号４のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、または前記ＴＣＲα鎖配列は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、または前記ＴＣＲα鎖配列は、配列番号２８のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列は、配列番号３４のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなる。

本発明のさらなる実施形態では、本明細書で前述した抗原認識コンストラクトは、ＴＣＲまたはその断片であり、配列番号５、１１、１７、２３、２９、および３５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＴＣＲ定常領域をさらに含んでなり、好ましくは前記ＴＣＲは、少なくとも、１つのＴＣＲαおよび１つのＴＣＲβ鎖配列から構成され、前記ＴＣＲα鎖配列は、配列番号５、１７、および２９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する定常領域を含んでなる。

配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＴＣＲ鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＴＣＲ鎖とを含んでなる、本明細書で前述した抗原認識コンストラクトもまた開示される。本発明はまた、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＴＣＲ鎖と、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＴＣＲ鎖とを含んでなるＴＣＲも提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ＴＣＲである抗原認識コンストラクトを提供し、それは、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＴＣＲ鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＴＣＲ鎖とを含んでなる。

本明細書の用法では、「マウス」または「ヒト」という用語は、抗原認識コンストラクト、またはＴＣＲ、または本明細書に記載のＴＣＲの任意の構成要素（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変領域、定常領域、α鎖、および／またはβ鎖）に言及する場合、それぞれ、マウスまたはヒト非再構成型ＴＣＲ遺伝子座に由来するＴＣＲ（またはその構成要素）を意味する。

本発明の一実施形態では、キメラＴＣＲが提供され、ＴＣＲ鎖は複数の生物種からの配列を含んでなる。好ましくは、本発明のＴＣＲは、α鎖のヒト可変領域と、例えば、マウスＴＣＲα鎖のマウス定常領域とを含んでなる、α鎖を含んでなってもよい。

一実施形態では、本発明のＴＣＲは、上記の実施形態に従ったヒト可変領域と、ヒト定常領域とを含んでなるヒトＴＣＲである。

本発明のＴＣＲは、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）として提供されてもよい。ｓｃＴＣＲは、第１のＴＣＲ鎖（例えば、α鎖）の可変領域のポリペプチドと、全（完全長）第２のＴＣＲ鎖（例えば、β鎖）のポリペプチドとを含んでなり得て、または逆もまた然りである。さらに、ｓｃＴＣＲは、任意選択的に、２つ以上のポリペプチドを一緒に連結する、１つまたは複数のリンカーを含んでなり得る。リンカーは、例えば、本明細書に記載されるように、２つの一本鎖を一緒に結合するペプチドであり得る。また、ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−１５などのヒトサイトカインに融合された本発明のｓｃＴＣＲも提供される。

本発明による抗原認識コンストラクトはまた、少なくとも２つのｓｃＴＣＲ分子を含んでなる多量体複合体の形態で提供され得て、前記ｓｃＴＣＲ分子は、それぞれ、少なくとも１つのビオチン部分に融合され、前記ｓｃＴＣＲは、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって相互連結され前記多量体複合体が形成できるようにする。多量体ＴＣＲを作製するための同様のアプローチもまた可能であり、本開示に含まれる。本発明のｓｃＴＣＲを２つを超えて含んでなる、より高次の多量体複合体もまた提供される。

本発明の目的で、ＴＣＲは、少なくとも１つのＴＣＲαまたはγおよび／またはＴＣＲβまたはδ可変ドメインを有する部分である。一般に、それらはＴＣＲα可変ドメインとＴＣＲβ可変ドメインの双方を含んでなる。それらは、αβヘテロ二量体であってもよく、または一本鎖形態であってもよい。養子療法における使用のために、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの双方を有する完全長鎖として形質移入されてもよい。所望ならば、導入されたジスルフィド結合が、それぞれの定常ドメインの残基間に存在してもよい。

好ましい実施形態では、抗原認識コンストラクトは、ヒトＴＣＲ、その断片または誘導体である。ヒトＴＣＲまたはその断片または誘導体は、対応するヒトＴＣＲ配列の５０％超を含んでなるＴＣＲである。好ましくは、ＴＣＲ配列のごく一部のみが人工起源であり、またはその他の生物種に由来する。しかし、例えば、ヒト起源に由来して定常ドメインにマウス配列を有するものなどのキメラＴＣＲが有利であることが知られている。したがって、それらの定常ドメインの細胞外部分にマウス配列を含有する、本発明によるＴＣＲが特に好ましい。

したがって、本発明の抗原認識コンストラクトが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）依存的様式、好ましくはＨＬＡ−Ａ０２依存的様式で、その抗原を認識できることもまた好ましい。「ＨＬＡ依存的様式」という用語は、本発明の文脈では、抗原ペプチドが前記ＨＬＡによって提示される場合にのみ、抗原認識コンストラクトが抗原に結合することを意味する。

本発明による抗原認識コンストラクトは、一実施形態では好ましくは免疫応答を誘導し、好ましくは免疫応答は、インターフェロン（ＩＦＮ）γレベルの増加によって特徴付けられる。

例えば、実施例セクションおよび表１に記載のＲ４Ｐ１Ｄ１０、Ｒ４Ｐ３Ｆ９、およびＲ４Ｐ３Ｈ３から選択されるＴＣＲのいずれか１つなどの、本明細書に記載のＴＣＲ（またはその機能性変異型）のいずれかの機能性部分を含んでなるポリペプチドもまた、本発明によって提供される。「ポリペプチド」という用語は、本明細書の用法では、オリゴペプチドを含み、１つまたは複数のペプチド結合によって連結されたアミノ酸の一本鎖を指す。本発明のポリペプチドに関して、機能性部分は、機能性部分が、好ましくは本明細書の表２で開示されるようなＣＯＬ６Ａ３抗原およびペプチドＡ１〜Ａ９（配列番号５９〜６７）に特異的に結合するという条件で、それがその一部である連続アミノ酸を含んでなるＴＣＲ（またはその変機能性異型）の任意の部分であり得る。「機能性部分」という用語は、ＴＣＲ（またはその機能性変異型）に関して使用される場合、本発明のＴＣＲ（またはその機能性変異型）の任意の部分または断片を指し、その部分または断片は、それがその一部である（親ＴＣＲまたはその親機能性変異型）、ＴＣＲ（またはその機能性変異型）の生物学的活性を保持する。機能性部分は、例えば、ＴＣＲ（またはその機能性変異型）の部分を包含する親ＴＣＲ（またはその機能性変異型）と同様の程度に、同一程度に、またはより高い程度に、ＣＯＬ６Ａ３抗原に（ＨＬＡ−Ａ２依存的様式で）特異的に結合する能力を保持し、またはがんを検出し、治療し、または予防する。親ＴＣＲ（またはその機能性変異型）に関して、機能性部分は、例えば、約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上の親ＴＣＲの可変配列（またはその機能性変異型）を含んでなり得る。

機能性部分は、部分のアミノまたはカルボキシ末端に、または両端端に、追加的なアミノ酸を含んでなり得て、追加的なアミノ酸は、親ＴＣＲまたはその機能性変異型のアミノ酸配列中に見いだされない。望ましくは、追加的なアミノ酸は、例えば、ＣＯＬ６Ａ３抗原に特異的に結合する；および／またはがん検出し、がんを治療または予防するなどの能力を有する、機能性部分の生物学的機能に干渉しない。より望ましくは、追加的なアミノ酸は、親ＴＣＲまたはその機能性変異型の生物学的活性と比較して、生物学的活性を増強する。

ポリペプチドは、本発明のＴＣＲまたはその機能性変異型のα鎖および／またはβ鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および（好ましくは）ＣＤＲ３の１つまたは複数を含んでなる機能性部分などの、本発明のＴＣＲまたはその機能性変異型のαおよびβ鎖のどちらかまたは双方の機能性部分を含んでなり得る。本発明の一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、９、１５、２１、２７、および３３のアミノ酸配列を含んでなる機能性部分（本発明のＴＣＲの可変領域のＣＤＲ３）、またはそれらの組み合わせを含んでなり得る。本発明の一実施形態では、本発明のポリペプチドは、例えば、上記のＣＤＲ領域の組み合わせを含んでなる、本発明のＴＣＲの可変領域またはその機能性変異型を含んでなり得る。この点において、ポリペプチドは、配列番号４、１０、１６、２２、２８、および３４のいずれかのアミノ酸配列（本発明のＴＣＲのα鎖またはβ鎖の可変領域）を含んでなり得る。

場合によっては、本発明のコンストラクトは、配列番号１〜３６のいずれかに記載の配列（ＣＤＲ配列、定常領域および可変領域、および完全長配列）、またはその機能性断片を含んでなる、１つまたは２つのポリペプチド鎖を含んでなってもよく、例えば、免疫グロブリンまたはその一部をコードするアミノ酸配列などのその他のアミノ酸配列をさらに含んでなり、本発明のタンパク質は融合タンパク質であり得る。この点において、本発明はまた、少なくとも１つの他のポリペプチドと共に、本明細書に記載される本発明のポリペプチドの少なくとも１つを含んでなる融合タンパク質も提供する。もう１つのポリペプチドは、融合タンパク質の別個のポリペプチドとして存在し得るか、または本明細書に記載される本発明のポリペプチドの１つと共にフレーム（タンデム）で発現されるポリペプチドとして存在し得る。もう１つのポリペプチドとしては、免疫グロブリン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣ分子、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄなどのＣＤ１分子をはじめとするが、これに限定されるものではない、任意のペプチド分子またはタンパク分子、またはその一部が挙げられる。

融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの１つまたは複数のコピーおよび／またはもう１つのポリペプチドの１つまたは複数のコピーを含んでなり得る。例えば、融合タンパク質は、本発明のポリペプチドおよび／またはもう１つのポリペプチドの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のコピーを含んでなり得る。融合タンパク質を作製する適切な方法は、当該分野で公知であり、例えば、組換え方法が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＴＣＲ（およびその機能性部分および機能性変異型）、ポリペプチド、およびタンパク質は、α鎖およびβ鎖を連結し、γ鎖およびδ鎖を連結するリンカーペプチドを含んでなる、単一タンパク質として発現されてもよい。この点において、本発明のＴＣＲ（およびその機能性変異型および機能性部分）、ポリペプチド、およびタンパク質は、本発明のＴＣＲの可変領域のアミノ酸配列を含んでなり、リンカーペプチドをさらに含んでなってもよい。リンカーペプチドは、宿主細胞内で、組換えＴＣＲ（その機能性部分および機能性変異型を含む）、ポリペプチド、および／またはタンパク質の発現を有利に促進してもよい。リンカーペプチドは、任意の適切なアミノ酸配列を含んでなってもよい。一本鎖ＴＣＲコンストラクトのためのリンカー配列は、当該技術分野で周知である。このような一本鎖コンストラクトは、１つまたは２つの定常ドメイン配列をさらに含んでなってもよい。リンカーペプチドを含むコンストラクトの宿主細胞による発現に際して、リンカーペプチドもまた切断されて、分離したα鎖とβ鎖、および分離したγ鎖とδ鎖がもたらされてもよい。

既に上述したように、本発明のＴＣＲの結合機能性は、抗体のフレームワークにおいて提供されてもよい。その様々な文法的形態における「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子を指すために、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原結合部位またはパラトープを含有する分子を指すために、本明細書で使用される。このような分子は、免疫グロブリン分子の「抗原結合断片」とも称される。本発明は、本明細書に記載の抗原に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合部分をさらに提供する。抗体は、当該技術分野で公知の任意のタイプの免疫グロブリンであり得る。例えば、抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプであり得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなどの哺乳類から単離されたおよび／または精製された抗体などの天然抗体であり得る。代案としては、抗体は、例えば、ヒト化抗体またはキメラ抗体などの遺伝子改変抗体であり得る。抗体は、単量体または重合体形態であり得る。

本発明はまた、本明細書に記載の任意の抗体の抗原結合部分を提供する。抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、二特異性抗体、および三特異性抗体などの少なくとも１つの抗原結合部位を有する任意の部分であり得る。合成ペプチドを介して軽抗体鎖のＶドメインに連結される抗体重鎖の可変（Ｖ）ドメインを含んでなる切断型Ｆａｂ断片からなる、一本鎖可変領域断片（ｓＦｖ）抗体フラグメントが、ルーチン組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡ技術によって調製され得るが、本発明の抗体断片は、これらの例示的なタイプの抗体断片に限定されない。また、抗体、またはその抗原結合部分は、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、および元素粒子（例えば、金粒子）などの検出可能な標識を含んでなるように修飾され得る。場合によっては、ＴＣＲ ＣＤＲ３配列は、配列番号３、９、１５、２１、２７、および３３に提供されるＣＤＲ９配列と比較して、好ましくは３つ以下のアミノ酸残基で、好ましくは２つのみ、最も好ましくは１つのみのアミノ酸位置で、わずかに修飾されてもよい。好ましくは、抗体は、表１で本発明のＴＣＲについて示されるように、ＣＤＲ３、好ましくは、組み合わされたＣＤＲ１〜ＣＤＲ３領域の全てを含んでなる。

抗体を作製する適切な方法は、当該技術分野で公知である。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，５，５１１−５１９（１９７６），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、およびＣ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，８ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２０１１））に記載される。あるいは、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｈａｓｋａｒｄ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ,Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２），３６１−６７（１９８４）、およびＲｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１，１４０−６７（１９８６））、バクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５−８１（１９８９）を参照されたい）などのその他の方法が当該分野で公知である。さらに、非ヒト動物において抗体を生産する方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、および米国特許第５，７１４，３５２号明細書、および米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号明細書に記載される。

本発明のいくつかの実施形態はまた、可溶性ＴＣＲである、ＴＣＲまたはその機能性断片およびポリペプチドにも関する。本明細書の用法では、「可溶性Ｔ細胞レセプター」という用語は、天然ＴＣＲのヘテロ二量体切断変異型を指し、それはジスルフィド結合によって連結されているが、天然タンパク質の膜貫通および細胞質ゾルドメインを欠く、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の細胞外部分を含んでなる。「可溶性Ｔ細胞受容体α鎖配列および可溶性Ｔ細胞受容体β鎖配列」という用語は、膜貫通および細胞質ドメインを欠くＴＣＲα鎖およびβ鎖配列を指す。可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列（アミノ酸または核酸）は、天然ＴＣＲ中の対応する配列と同一であってもよく、または対応する天然ＴＣＲ配列と比較して、変異型の可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖配列を含んでなってもよい。「可溶性Ｔ細胞受容体」という用語は、本明細書の用法では、変異型または非変異型の可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖配列を有する、可溶性ＴＣＲを包含する。変異型は、可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖配列の可変領域または定常領域にあってもよく、アミノ酸欠失、挿入、置換変異、ならびにアミノ酸配列を変化させない核酸配列変化が挙げられるが、これに限定されるものではない。いずれにしても、本発明の可溶性ＴＣＲは、それらの親分子の結合機能を保持する。

上記の問題は、本発明の抗原認識コンストラクトをコードする核酸、または前述のタンパク質またはポリペプチドコンストラクトのいずれかによってさらに解決される。核酸は、好ましくは、（ａ）本発明による抗原認識コンストラクトをコードする鎖を有し；（ｂ）（ａ）の鎖に相補的な鎖を有し；（ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）に記載の分子にハイブリダイズする鎖を有する。ストリンジェントな条件は、特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ"から当業者に知られている。それに加えて、核酸は、タンパク質に対応する核酸配列を発現するために、特に哺乳類／ヒト細胞における発現のために必要なさらなる配列を任意選択的に有する。使用される核酸は、細胞内のペプチドに対応する核酸配列の発現を可能にするのに適したベクターに含まれ得る。しかし、核酸は、それら自体がそれらの細胞表面に対応タンパク質を産生するように、樹状細胞などの古典的抗原提示細胞に限定されなくてもよい抗原提示細胞を形質転換するためにも使用され得る。

「核酸」は、本明細書の用法では、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸分子」を含み、一般にＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味し、それは、合成されたまたは天然原料から取得された（例えば、単離および／または精製された）一本鎖または二本鎖であり得て、天然、非天然または改変ヌクオチドを含有し得て、未修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見いだされるリン酸ジエステルの代わりに、ホスホロアミデート結合またはホスホロチオエート結合などの天然、非天然または改変ヌクレオチド間結合を含有し得る。

好ましくは、本発明の核酸は組換え体である。本明細書の用法では、「組換え体」という用語は、（ｉ）天然または合成核酸断片を生きている細胞内で自己複製し得る核酸分子に連結することで、生きている細胞の外部に構築される分子、または（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されるものの複製から生じる分子を指す。本明細書の目的のために、自己複製は生体外複製または生体内複製であり得る。核酸は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質、またはその機能性部分または機能性変異型のいずれかをコードする任意のヌクレオチド配列を含んでなり得る。

さらに、本発明は、上記の本発明による核酸を含んでなるベクターを提供する。望ましくは、ベクターは、発現ベクターまたは組換え発現ベクターである。「組換え発現ベクター」という用語は、本発明の文脈では、適切な宿主細胞におけるｍＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドの発現を可能にする核酸コンストラクトを指す。本発明の組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得て、任意の適切な宿主を形質転換または形質移入するために使用され得る。適切なベクターとしては、例えば、プラスミドおよびウイルスなどの、増殖および拡張のために、または発現またはその双方のために、設計されたものなどのベクターが挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ、およびｐＭＡＭｎｅｏが挙げられる。好ましくは、組換え発現ベクターは、例えば、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである。組換え発現ベクターは、その中にベクターが導入され、その中で本発明の核酸の発現が実施されてもよい、宿主細胞のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に特異的な、転写および翻訳開始および終止コドンなどの制御配列を含んでなる。さらに、本発明のベクターは、形質転換または形質移入された宿主の選択を可能にする、１つまたは複数のマーカー遺伝子を含んでもよい。組換え発現ベクターは、天然または規範的プロモーターを含んでなり得て、それは本発明のコンストラクトをコードするヌクレオチド配列に、または本発明のコンストラクトをコードするヌクレオチド配列と相補的なまたはそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列に、作動可能に連結される。プロモーターの選択肢としては、例えば、強いプロモーター、弱いプロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、および発達特異的プロモーターが挙げられる。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーターであり得る。本発明の組換え発現ベクターは、一過性発現、安定発現のどちらか、またはその双方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現または誘導的発現のために作製され得る。

本発明はまた、本発明による抗原認識コンストラクトを含んでなる宿主細胞にも関する。具体的には、本発明の宿主細胞は、上記の本明細書中に記載されるような核酸またはベクターを含んでなる。宿主細胞は、例えば、植物、動物、真菌、または藻類などの真核細胞であり得て、または例えば、細菌または原虫など原核細胞であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞、すなわち、例えばヒトなどの生物から直接単離された細胞であり得る。宿主細胞は、接着細胞または懸濁細胞、すなわち、懸濁状態で増殖する細胞であり得る。組換えＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質を生成する目的のために、宿主細胞は、好ましくは哺乳類細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞は任意の細胞型であり得て、任意の種類型に由来し得て、任意の発達段階であり得るものの、宿主細胞は好ましくは、末梢血白血球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。より好ましくは、宿主細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、例えば、一次Ｔ細胞などの培養Ｔ細胞などの任意のＴ細胞；または例えば、ジャーカット、ＳｕｐＴ１などの培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞；または哺乳類から得られたＴ細胞、好ましくはヒト患者由来のＴ細胞またはＴ細胞前駆体であり得る。哺乳類から得られた場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、またはその他の組織または体液をはじめとするが、これに限定されるものではない多数の起源から得られ得る。Ｔ細胞はまた、富化または精製され得る。好ましくは、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。より好ましくは、Ｔ細胞はヒトから単離されたＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性および／またはＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞（ＴＩＬ）、記憶Ｔ細胞、未感作Ｔ細胞などをはじめとするが、これに限定されるものではない、任意のＴ細胞型であり得て、任意の発達段階のものであり得る。好ましくは、Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞である。

好ましくは、本発明の宿主細胞は、リンパ球、好ましくはＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性Ｔ細胞などのＴリンパ球である。宿主細胞は、さらに好ましくは、ＣＯＬ６Ａ３発現腫瘍細胞に特異的な腫瘍反応性Ｔ細胞である。

本発明のさらなる一態様は、医療で使用するための本明細書で開示された抗原認識コンストラクト、核酸、ベクター、医薬組成物および／または宿主細胞に関する。医療における使用は、好ましい一実施形態では、悪性または良性腫瘍疾患などの腫瘍疾患の診断、予防および／または治療における使用を含む。腫瘍疾患は、例えば、前記腫瘍疾患のがんまたは腫瘍細胞におけるＣＯＬ６Ａ３の発現によって特徴付けられる腫瘍疾患である。

抗原認識コンストラクトおよびそれに由来するその他の物質の前述の医療用途に関して、治療および／または診断されるがんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門がん、肛門管がん、または肛門直腸がん、眼がん、肝臓内胆管がん、関節がん、頸部がん、胆嚢がん、または胸膜がん、鼻がん、鼻腔がん、または中耳がん、口腔がん、膣がん、外陰部がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、口腔咽頭がん、卵巣がん、陰茎がん、膵臓がん、腹膜がん、大網がん、および腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、尿管がん、および膀胱がんなどの任意のがんであり得る。好ましいがんは、子宮頸部、口腔咽頭、肛門、肛門管、肛門直腸、膣、外陰部、または陰茎のがんである。特に好ましいがんは、胃腸がんおよび胃がんなどのＣＯＬ６Ａ３陽性がんである。

本発明のコンストラクト、タンパク質、ＴＣＲ抗体、ポリペプチドおよび核酸は、特に免疫療法、好ましくは養子Ｔ細胞療法における使用のためのものである。本発明の化合物の投与は、例えば、前記患者への本発明のＴ細胞の注入を伴い得る。好ましくは、このようなＴ細胞は患者の自己Ｔ細胞であり、本発明の核酸または抗原認識コンストラクトで生体外形質導入されたものである。

国際公開第２０１６／０１１２１０号パンフレットは、ＮＫ細胞およびＴ細胞をはじめとする養子療法のための操作された細胞、細胞を含有する組成物、およびそれらを対象に投与する方法を開示する。細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および共刺激受容体などの抗原に特異的に結合する、遺伝子操作された抗原受容体を含有し得る。

本発明の目的はまた、
ａ．適切な宿主細胞を提供するステップと、
ｂ．本明細書で開示される発明による抗原認識コンストラクトをコードするコード配列を含んでなる遺伝子コンストラクトを提供するステップと、
ｃ．前記遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するステップと、
ｄ．前記適切な宿主細胞によって前記遺伝子コンストラクトを発現させるステップと
を含んでなる、細胞株を発現するＣＯＬ６Ａ３特異的抗原認識コンストラクトを製造する方法によっても解決される。

方法はさらに、前記適切な宿主細胞上で、前記抗原認識コンストラクトを細胞表面提示させるステップをさらに含んでなってもよい。

その他の好ましい実施形態では、遺伝子コンストラクトは、前記コード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含んでなる、発現コンストラクトである。

好ましくは、前記抗原認識コンストラクトは、哺乳類起源、好ましくはヒト起源である。本発明の方法で使用するための好ましい適切な宿主細胞は、ヒト細胞、特にヒトＴリンパ球などの哺乳類細胞である。本発明で使用するためのＴ細胞は、上記の本明細書中で詳述される。

前記抗原認識コンストラクトが修飾ＴＣＲであり、前記修飾が標識または治療活性物質などの機能ドメインの付加である実施形態もまた、本発明に包含される。さらに、内在性膜貫通領域の代わりに代案の膜アンカードメインなどの代案のドメインを有する、ＴＣＲが包含される。

望ましくは、遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するための形質移入システムは、レトロウイルスベクターシステムである。このようなシステムは、当業者に周知である。

一実施形態における、細胞からの抗原認識コンストラクトの単離および精製の追加的方法ステップ、任意選択的に、Ｔ細胞中の翻訳された抗原認識コンストラクト断片の再構成もまた、本発明に含まれる。

本発明の代案の態様では、Ｔ細胞は、上記の本明細書に記載されるように、腫瘍細胞に特異的であり高い結合活性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を製造する方法によって提供され、入手され、または入手可能である。このようなＴ細胞は、本発明の方法で使用される宿主細胞、例えば、ヒトまたは非ヒトＴ細胞、好ましくはヒトＴＣＲに依存する。

本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質（その機能性変異型を含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）、および抗体（その抗原結合部分を含む）は、単離および／または精製され得る。「単離された」という用語は、本明細書の用法では、その天然環境から取り出されていることを意味する。そして「精製された」という用語は、本明細書の用法では、純度が上昇していることを意味し、「純度」は相対的用語であり、必ずしも絶対的な純度として解釈されるべきではない。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり得て、６０％、７０％ｏ、８０％、９０％、９５％を超え得て、または１００％であり得る。

本明細書で以後、集合的に「本発明のＴＣＲ材料」と称される、本発明の抗原認識コンストラクト、ＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質（その機能性変異型を含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）、および抗体（その抗原結合部分を含む）は、医薬組成物などの組成物に調合され得る。この点において、本発明は、本明細書に記載の抗原認識コンストラクト、ＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、機能性部分、機能性変異型、核酸、発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）、および抗体（その抗原結合部分を含む）のいずれかと、薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または安定剤とを含んでなる、医薬組成物を提供する。本発明のＴＣＲ材料のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、例えば、ポリペプチドおよび核酸などの２つ以上の発明のＴＣＲ材料、または、２つ以上の異なるＴＣＲ（その機能性部分および機能性変異型を含む）を含んでなり得る。代案としては、医薬組成物は、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどの化学療法剤のような別の薬学的に活性な薬剤または薬物と組み合わされた、発明のＴＣＲ材料を含んでなり得る。好ましくは、担体は、薬学的に許容可能な担体である。医薬組成物に関して、担体は、検討中の特定の本発明のＴＣＲ材料のために従来使用されているもののいずれかであり得る。このような薬学的に許容される担体は当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。薬学的に許容可能な担体は、使用条件下で有害な副作用または毒性がないものであることが好ましい。

したがって、本明細書に記載される本発明の任意の生成物および本発明のＴＣＲ材料、具体的には任意のタンパク質、核酸または宿主細胞を含んでなる医薬組成物もまた提供される。好ましい実施形態では、医薬組成物は、免疫療法、好ましくは養子細胞療法のためのものである。

好ましくは、本発明のＴＣＲ材料は、例えば静脈内などの注射によって投与される。本発明のＴＣＲ材料が本発明のＴＣＲ（またはその機能性変異型）を発現する宿主細胞である場合、注射用細胞のための薬学的に許容可能な担体は、例えば、生理食塩水（水中の約０．９０％ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中の約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、または水１リットルあたり約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬＲ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中の約５％デキストロース、または乳酸リンゲル液などの任意の等張性担体を含んでもよい。一実施形態では、薬学的に許容可能な担体にはヒト血清卵白が添加されている。

本発明の目的のために、投与される本発明のＴＣＲ材料の量または用量（例えば、本発明のＴＣＲ材料が１つまたは複数の細胞である場合は細胞数）は、妥当な時間枠にわたり対象または動物において、例えば、治療的または予防的応答などの影響を及ぼすのに十分であってもよい。例えば、本発明のＴＣＲ材料の用量は、投与時から例えば１２〜２４時間以上などの約２時間以上の期間において、がん抗原に結合し、またはがんを検出し、治療または予防するのに十分であるべきである。特定の実施形態では、期間はさらに長くなり得る。用量は、特定の本発明のＴＣＲ材料の有効性および動物（例えば、ヒト）の病状、ならびに治療される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定されるであろう。

本発明の医薬組成物、ＴＣＲ（それらの機能的変異型を含む）、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、または細胞集団は、がんまたはＣＯＬ６Ａ３陽性前がんを治療または予防する方法で使用され得ることが検討される。本発明のＴＣＲ（およびその機能性変異型）は、ＣＯＬ６Ａ３抗原と特異的に結合すると考えられ、その結果、ＴＣＲ（または関連する発明のポリペプチドまたはタンパク質およびその機能性変異型）は、細胞によって発現されると、本発明のＣＯＬ６Ａ３抗原を発現する標的細胞に対する免疫応答を媒介できる。この点において、本発明は、本明細書に記載の医薬組成物、特にＴＣＲ（およびその機能性変異型）である抗原認識コンストラクト、ポリペプチド、またはタンパク質；本明細書に記載のＴＣＲ（およびその機能性変異型）とポリペプチドとタンパク質とのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、任意の核酸または組換え発現ベクター；または本明細書に記載の本発明のコンストラクト（およびその機能性変異型）またはポリペプチドまたはタンパク質のいずれかをコードする組換えベクターを含んでなる、任意の宿主細胞または細胞集団のいずれかを哺乳類において病状を治療または予防するのに有効な量で、哺乳類に投与するステップを含んでなる、哺乳類における病状、特にがんを治療または予防する方法を提供し、病状は、がん、好ましくはＣＯＬ６Ａ３陽性がんである。

本発明で有用な薬学的に許容可能な担体または希釈剤の例としては、ＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン）、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ乳清または脱脂乳などのタンパク質含有作用物質などの安定剤および緩衝剤（例えばリン酸緩衝液）が挙げられる。

「治療する」および「予防する」という用語、ならびにそれから生じる用語は、本明細書の用法では、必ずしも１００％または完全な治療または予防を暗示しない。むしろ、当業者が潜在的利益または治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療または予防がある。この点において、本発明の方法は、哺乳類における病状の任意の量の任意のレベルの治療または予防を提供し得る。さらに、本発明の方法によって提供される治療または予防は、例えば、治療または予防されるがんなどの１つまたは複数の病状または病状の症状の治療または予防を含み得る。例えば、治療または予防としては、腫瘍退縮の促進が挙げられる。また、本明細書の目的のために、「予防」は、病状または症状またはその病状の発生を遅延させることを包含し得る。

本発明はまた、少なくとも１つの化学療法剤および／または放射線療法と組み合わせて、本明細書のＴＣＲ、核酸、または宿主細胞を投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法にも関する。

ａ）細胞を前記対象から単離するステップと；
ｂ）細胞を本発明の抗原認識コンストラクトをコードする少なくとも１つのベクターで形質転換して、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供される。

ａ）細胞を健常ドナーから単離するステップと；
ｂ）細胞を本発明の抗原認識コンストラクトをコードするベクターで形質転換して、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供される。

ａ）生物学的サンプルを本明細書の抗原認識コンストラクトに接触させるステップと；
ｂ）抗原認識コンストラクトの生物学的サンプルへの結合を検出するステップと
を含んでなる、生物学的サンプルにおいてがんを検出する方法もまた提供される。

いくつかの実施形態では、がんを検出する方法は、生体外、生体内または原位置で実施される。

哺乳類において病状の存在を検出する方法もまた提供される。方法は、（ｉ）哺乳類由来の１つまたは複数の細胞を含んでなるサンプルを、本発明のＴＣＲ（およびその機能性変異型）、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体、またはその抗原結合部分、または本明細書に記載される医薬組成物のいずれかに接触させ、それによって複合体を形成し、複合体を検出するステップを含んでなり、複合体の検出は、哺乳類における病状の存在の指標となり、病状は、ＣＯＬ６Ａ３陽性悪性腫瘍などのがんである。

哺乳類における病状を検出する本発明の方法に関して、細胞サンプルは、全細胞、その溶解産物、または例えば、核または細胞質画分、全タンパク質画分、または核酸画分などのホールセル溶解産物の画分を含んでなる、サンプルであり得る。

本発明の検出方法の目的のために、接触は哺乳類に関して生体外または生体内で行われ得る。好ましくは、接触は生体外である。

また、複合体の検出は、当該技術分野で公知の多数の様式を通じて行い得る。例えば、本明細書に記載される、本発明の抗原認識コンストラクト（およびその機能性変異型）、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、または抗体またはＴＣＲ、またはその抗原結合部分は、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、および元素粒子（例えば、金粒子）などの検出可能な標識で標識され得る。

宿主細胞または細胞集団が投与される本発明の方法の目的のために、細胞は哺乳類にとって同種異系または自己由来の細胞であり得る。好ましくは、細胞は哺乳類に対して自己由来である。

本発明のＴＣＲ材料の前述の医療用途に関して、治療および／または診断されるがんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門がん、肛門管がん、または肛門直腸がん、眼がん、肝臓内胆管がん、関節がん、頸部がん、胆嚢がん、または胸膜がん、鼻がん、鼻腔がん、または中耳がん、口腔がん、膣がん、外陰部がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、口腔咽頭がん、卵巣がん、陰茎がん、膵臓がん、腹膜がん、大網がん、および腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、尿管がん、および膀胱がんのいずれかなどの任意のがんであり得る。好ましいがんは、子宮頸部、口腔咽頭、肛門、肛門管、肛門直腸、膣、外陰部、または陰茎のがんである。特に好ましいがんは、胃腸がんまたは胃がんなどのＣＯＬ６Ａ３陽性がんである。

一般に、本発明は、本発明によって開示されるような抗原認識コンストラクト、核酸、ベクター、医薬組成物および／または宿主細胞を投与するステップを含んでなる、腫瘍または腫瘍疾患に罹患している対象を治療する方法を提供する。好ましくは、対象は、このような治療を必要とする対象である。好ましい実施形態では対象は、ＣＯＬ６Ａ３陽性の腫瘍または腫瘍疾患に罹患している哺乳類対象、好ましくはヒト患者である。

添付の図面および配列を参照しながら、本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、それでもなおそれらに限定されるものではない。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体が参照により援用される。

ＣＯＬ６Ａ３−００２ペプチド（配列番号５８）、様々なＣＯＬ６Ａ３−００２の１〜９位アラニンまたはグリシン置換変異型（配列番号５９〜６７）、またはＮＹＥＳＯ１−００１対照ペプチド（配列番号６８）が負荷された、Ｋ５６２−Ａ２標的細胞（Ｈｉｒａｎｏ Ｎ．ｅｔ ａｌ；Ｂｌｏｏｄ．２００６ Ｆｅｂ １５；１０７（４）：１５２８−３６を参照されたい）との同時インキュベーション後における、それぞれＴＣＲ Ｒ４Ｐ１Ｄ１０のαおよびβ鎖ＲＮＡ（表１）で電気穿孔された、１人のドナーのヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ放出（左軸）およびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２四量体染色（右軸）である。 標的細胞ＣＯＬ６Ａ３−００２ペプチド（配列番号５８）、同種であるが無関係のペプチドＡＧＲＮ−００１、ＣＬＡＳＰ−００１、ＣＯＬ６Ａ１−００１、ＣＯＬ６Ａ２−００１、ＣＯＬ６Ａ３−００６、ＣＯＬ６Ａ３−００８、ＣＯＬ６Ａ３−０１４、ＶＷＡ２−００１、ＶＷＦ−００１（配列番号４９〜５７）またはＮＹＥＳＯ１−００１対照ペプチド（配列番号６８）が負荷された、Ｋ５６２−Ａ２との同時インキュベーション後における、それぞれＴＣＲ Ｒ４Ｐ１Ｄ１０のαおよびβ鎖ＲＮＡ（表１）で電気穿孔された、１人のドナーのヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ放出（左軸）およびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２四量体染色（右軸）である。電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独（Ｅ単独）が、対照の役割を果たす。

それぞれ、ＴＣＲ Ｒ４Ｐ１Ｄ１０またはＲＮＡ ＮＹＥＳＯ１−００１特異的対照ＴＣＲ １Ｇ４のαおよびβ鎖（表１）で電気穿孔された、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５細胞のＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２四量体およびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体染色である。模擬電気穿孔Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５細胞が、対照の役割を果たす。 それぞれ、ＴＣＲＲ４Ｐ１Ｄ１０ｏｒＮＹＥＳＯ１−００１特異的対照ＴＣＲ１Ｇ４（表１）のαおよびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔された、ＳＵＰ−Ｔ１細胞のＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２四量体およびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体染色である。模擬電気穿孔ＳＵＰ−Ｔ１細胞が、対照の役割を果たす。 それぞれ、ＴＣＲ Ｒ４Ｐ１Ｄ１０またはＮＹＥＳＯ１−００１特異的対照ＴＣＲ１Ｇ４（表１）のαおよびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔された、１人のドナーのヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２四量体およびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体染色である。模擬電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞が、対照の役割を果たす。 それぞれ、標的細胞ＣＯＬ６Ａ３−００２ペプチド（配列番号５８）、様々なＣＯＬ６Ａ３−００２の１〜９位アラニンまたはグリシン置換変異型（配列番号５９〜６７）、またはＮＹＥＳＯ１−００１対照ペプチド（配列番号６８）が負荷された、Ｋ５６２−Ａ２との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ Ｒ４Ｐ３Ｆ９（表１）のαおよびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔された、１人のドナーのヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ放出である。 それぞれ、標的細胞ＣＯＬ６Ａ３−００２ペプチド（配列番号５８）、同種であるが無関係のペプチドＡＧＲＮ−００１、ＣＬＡＳＰ−００１、ＣＯＬ６Ａ１−００１、ＣＯＬ６Ａ２−００１、ＣＯＬ６Ａ３−００６、ＣＯＬ６Ａ３−００８、ＣＯＬ６Ａ３−０１４、ＶＷＡ２−００１、ＶＷＦ−００１（配列番号４９〜５７）またはＮＹＥＳＯ１−００１対照ペプチド（配列番号６８）が負荷されたＫ５６２−Ａ２との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ Ｒ４Ｐ３Ｆ９（表１）のαおよびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔された１人のドナーのヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ放出である。模擬電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｅ単独）が、対照の役割を果たす。 それぞれ、ＴＣＲ Ｒ４Ｐ３Ｆ９またはＮＹＥＳＯ１−００１特異的対照ＴＣＲ １Ｇ４のαおよびβ鎖ＲＮＡ（表１）で電気穿孔された、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５細胞のＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２四量体およびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体染色である。模擬電気穿孔Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５細胞が、対照の役割を果たす。 それぞれ、ＴＣＲ Ｒ４Ｐ３Ｆ９またはＮＹＥＳＯ１−００１特異的対照ＴＣＲ １Ｇ４のαおよびβ鎖ＲＮＡ（表１）で電気穿孔された、ＳＵＰ−Ｔ１細胞のＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２四量体およびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体染色である。模擬電気穿孔ＳＵＰ−Ｔ１細胞が、対照の役割を果たす。 それぞれ、標的細胞ＣＯＬ６Ａ３−００２ペプチド（配列番号５８）、様々なＣＯＬ６Ａ３−００２の１〜９位アラニンまたはグリシン置換変異型（配列番号５９〜６７）またはＮＹＥＳＯ１−００１対照ペプチド（配列番号６８）が負荷されたＫ５６２−Ａ２との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ Ｒ４Ｐ３Ｈ３のαおよびβ鎖ＲＮＡ（表１）で電気穿孔された１人のドナーのヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ放出である。 それぞれ、標的細胞ＣＯＬ６Ａ３−００２ペプチド（配列番号５８）、同種であるが無関係のペプチドＡＧＲＮ−００１、ＣＬＡＳＰ−００１、ＣＯＬ６Ａ１−００１、ＣＯＬ６Ａ２−００１、ＣＯＬ６Ａ３−００６、ＣＯＬ６Ａ３−００８、ＣＯＬ６Ａ３−０１４、ＶＷＡ２−００１、ＶＷＦ−００１（配列番号４９〜５７）またはＮＹＥＳＯ１−００１対照ペプチド（配列番号６８）が負荷されたＫ５６２−Ａ２との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ Ｒ４Ｐ３Ｈ３のαおよびβ鎖ＲＮＡ（表１）で電気穿孔された１人のドナーのヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ放出である。模擬電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｅ単独）が、対照の役割を果たす。 それぞれ、ＴＣＲ Ｒ４Ｐ３Ｈ３またはＮＹＥＳＯ１−００１特異的対照ＴＣＲ １Ｇ４のαおよびβ鎖ＲＮＡ（表１）で電気穿孔された、ＳＵＰ−Ｔ１細胞のＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２四量体およびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体染色である。模擬電気穿孔ＳＵＰ−Ｔ１細胞が、対照の役割を果たす。

表1：本発明のTCR配列

表2：本発明のペプチド配列

一態様では、アロ反応性設定を使用して自己免疫寛容を回避し、自己由来設定、すなわち、患者に由来するＴ細胞と比較してより高い結合活性を有する、Ｔ細胞をもたらす。このような設定の例としては、そのそれぞれが参照によりその内容全体が援用される、アロＨＬＡ反応性ペプチド特異的Ｔ細胞の生体外生成（Ｓａｄｏｖｎｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｗｉｌｄｅ ｅｔ ａｌ．２０１２）、およびヒトＭＨＣまたはヒトＴＣＲについて遺伝子組換えであるマウスの免疫化（Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１０）が挙げられる。

アロ反応性設定から高結合活性Ｔ細胞を単離するために、告知に基づく同意を得た後に、ＨＬＡ−Ａ＊０２陰性健常ドナーからのＰＢＭＣを使用する。ＣＯＬ６Ａ３−００２を含有する、組換えビオチン化ＨＬＡ−Ａ＊０２クラスＩ単量体およびＡ２蛍光性四量体は、ＭＢＬＩ（マサチューセッツ州のＷｏｂｕｒｎ）から入手される。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した抗ＣＤ２０ＳＡと共に、ＰＢＭＣを室温で１時間培養し、洗浄して、ビオチン化ＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２単量体と共に室温で３０分間培養し、洗浄して、２４ウェルプレート内の００２％ヒトＡＢ血清添加ＲＰＭＩに、３×１０^６細胞／ウェルで播種する。インターロイキン７（ＩＬ−７；ミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を１日目に１０ｎｇ／ｍＬで添加し、ＩＬ−２（英国ヘアフィールドのＣｈｉｒｏｎ）を４日目に１０Ｕ／ｍＬで添加した。５週間にわたり、細胞を新鮮なＰＢＭＣで毎週再刺激し、応答性細胞と１：１の比で混合して、２４ウェルプレートに３×１０^６／ウェルで播種した。

高結合活性Ｔ細胞を得るために、およそ１０^６のＰＢＭＣをＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２四量体フィコエリトリン（ＰＥ）（ＭＢＬＩから得た）と共に、３７°Ｃで３０分間培養し、それに続いて抗ＣＤ８イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）／アロフィコシアニン（ＡＰＣ）と共に４°Ｃで２０分間培養し、蛍光活性化細胞分類がそれに続いた。ウェル当たり、２×１０^５個の選別された細胞、フィーダーとしての２×１０^６個の照射Ａ２陰性ＰＢＭＣ、２×１０^４個のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ／ｍＬ（ノルウェイ国オスロのＤｙｎａｌ）、およびＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍＬ）を使用して、選別された四量体陽性細胞を２４ウェルプレート内で増殖させた。次に、このようにして得られた高結合活性Ｔ細胞を使用して、単細胞５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）などの当該技術分野で公知の技術を用いて、ＴＣＲを同定し単離した。次に、アミノ酸／ＤＮＡ配列決定と発現ベクターへのクローニングのために、非重複ＴＣＲ ＤＮＡを分析した。

それぞれ、腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖をコードする３つのＣＯＬ６Ａ３−００２特異的ＴＣＲ（Ｒ４Ｐ１Ｄ１０、Ｒ４Ｐ３Ｆ９、およびＲ４Ｐ３Ｈ３、表２を参照されたい）を健常ドナーのＴ細胞から単離し、増幅した。健常ドナー由来の細胞は、以前記載された方法に従って生体外で刺激した（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｎｏｖ １５；１７１（１０）：４９７４−８）。ＣＯＬ６Ａ３ペプチド提示は、以前記載されたようにして行った。（Ｈｉｒａｎｏ Ｎ．ｅｔ ａｌ；Ｂｌｏｏｄ．２００６ Ｆｅｂ １５；１０７（４）：１５２８−３６）。ＨＬＡ−Ａ＊０２多量体を用いて標的特異的細胞を単細胞ソートし、次に引き続くＴＣＲ単離のために使用した。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載されるように、標準法によって５’ＲＡＣＥを通じてＴＣＲ配列を単離した。ＴＣＲ Ｒ４Ｐ１Ｄ１０、Ｒ４Ｐ３Ｆ９、およびＲ４Ｐ３Ｈ３のαおよびβ可変領域を配列決定し、さらなる機能特性解析のためにクローン化した。Ｒ４Ｐ１Ｄ１０およびＲ４Ｐ３Ｈ３は、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性ドナーに由来し、Ｒ４Ｐ３Ｆ９は、ＨＬＡ−Ａ＊０２陰性ドナーに由来する（アロ反応性設定）。

表3：COL6A3-002およびNYESO1-001 TCRのSPR親和性

実施例１：Ｔ細胞受容体Ｒ４Ｐ１Ｄ１０
例えば、方法についてその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，５１９，１００８号明細書に記載されているように、以前記載されているように、ＴＣＲ Ｒ４Ｐ１Ｄ１０のαおよびβ鎖をクローン化した。ＴＣＲ Ｒ４Ｐ１Ｄ１０は、ＨＬＡ−Ａ２提示ＣＯＬ６Ａ３−００２に限定されている（上記の表３を参照されたい）。

表4：R4P1D10 α鎖の特性：

表5：R4P1D10 β 鎖の特性：

Ｒ４Ｐ１Ｄ１０はＣＯＬ６Ａ３−００２を特異的に認識するが、それは、このＴＣＲを再発現するヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞が、それぞれＣＯＬ６Ａ３−００２ペプチドまたはＣＯＬ６Ａ３−００２のアラニンおよびグリシン置換変異型（図１）、あるいはＣＯＬ６Ａ３−００２と高度の配列類似性を示す異なるペプチド（図２）のいずれかが負荷されたＨＬＡ−Ａ＊０２＋標的細胞との同時インキュベーション時にＩＦＮγを放出し、ＨＬＡ−Ａ＊０２四量体に結合するためである。ＮＹＥＳＯ１−００１ペプチドが、陰性対照として使用される。

Ｒ４Ｐ１Ｄ１０の再発現は、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５ジャーカット細胞（図３）、ＳＵＰ−Ｔ１細胞（図４）、およびヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞（図５）において、ＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２四量体の選択的結合をもたらすが、ＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体の選択的結合はもたらさない。各細胞型について、ＮＹＥＳＯ１−００１特異的ＴＣＲ１Ｇ４の再発現および模擬発現が対照として使用される。

以前記載された方法（Ｗｉｌｌｃｏｘ ＢＥ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，Ｎｏｖ；８（１１）：２４１８−２３）に従って可溶性ＴＣＲとして表される、Ｒ４Ｐ１Ｄ１０のＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）結合解析、およびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２複合体は、Ｋ_Ｄ＝１６μＭの親和性を明らかにする（表３）。１Ｇ４ ＴＣＲおよびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１のＳＰＲ結合データが対照として使用される。

実施例２：Ｔ細胞受容体Ｒ４Ｐ３Ｆ９
例えば、方法についてその全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，５１９，１００号明細書に記載されているように、以前記載されているように、ＴＣＲ Ｒ４Ｐ３Ｆ９ のαおよびβ鎖をクローン化した。ＴＣＲＲ４Ｐ３Ｆ９は、ＨＬＡ−Ａ２提示ＣＯＬ６Ａ３−００２に限定されている（上記の表３を参照されたい）。

表6：R4P3F9 α鎖の特性

表7：R4P3F9 β鎖の特性

Ｒ４Ｐ３Ｆ９はＣＯＬ６Ａ３−００２を特異的に認識するが、それは、このＴＣＲを再発現するヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞が、それぞれ、ＣＯＬ６Ａ３−００２ペプチドまたはＣＯＬ６Ａ３−００２のアラニンおよびグリシン置換変異型（図６）またはＣＯＬ６Ａ３−００２との高度な配列類似性を示す異なるペプチド（図７）のいずれかが負荷されたＨＬＡ−Ａ＊０２＋標的細胞との同時インキュベーション時に、ＩＦＮγを放出するためである。ＮＹＥＳＯ１−００１ペプチドが、陰性対照として使用される。

Ｒ４Ｐ３Ｆ９の再発現は、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５ジャーカット細胞（図８）およびＳＵＰ−Ｔ１細胞（図９）においてＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２四量体の選択的結合をもたらすが、ＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体の選択的結合はもたらさない。各細胞型について、ＮＹＥＳＯ１−００１特異的ＴＣＲ１Ｇ４の再発現および模擬発現が対照として使用される。

以前記載された方法（Ｗｉｌｌｃｏｘ ＢＥ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，Ｎｏｖ；８（１１）：２４１８−２３）に従って可溶性ＴＣＲとして表される、Ｒ４Ｐ３Ｆ９のＳＰＲ結合解析、およびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２複合体は、Ｋ_Ｄ＝６２μＭの親和性を明らかにする（表３）。１Ｇ４ ＴＣＲおよびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１のＳＰＲ結合データが、対照として使用される。

実施例３：Ｔ細胞受容体Ｒ４Ｐ３Ｈ３
例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，５１９，１００号明細書に記載されているように、以前記載されているように、ＴＣＲ Ｒ４Ｐ３Ｈ３のαおよびβ鎖をクローン化した。ＴＣＲ Ｒ４Ｐ３Ｈ３は、ＨＬＡ−Ａ２提示ＣＯＬ６Ａ３−００２に限定されている（上記の表３を参照されたい）。

表8：R4P3H3 α鎖の特性

表9：R4P3H3 β鎖の特性

Ｒ４Ｐ３Ｈ３はＣＯＬ６Ａ３−００２を特異的に認識するが、それはこのＴＣＲを再発現するヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞が、それぞれ、ＣＯＬ６Ａ３−００２ペプチドまたはＣＯＬ６Ａ３−００２のアラニンおよびグリシン置換変異型（図１０）またはＣＯＬ６Ａ３−００２との高度な配列類似性を示す異なるペプチド（図１１）のいずれかが負荷されたＨＬＡ−Ａ＊０２＋標的細胞との同時インキュベーション時に、ＩＦＮγを放出するためである。ＮＹＥＳＯ１−００１ペプチドが、陰性対照として使用される。

Ｒ４Ｐ３Ｈ３の再発現は、ＳＵＰ−Ｔ１細胞において、ＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２四量体の選択的結合をもたらすが、ＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体の選択的結合はもたらさない（図１２）。ＮＹＥＳＯ１−００１特異的ＴＣＲ１Ｇ４の再発現および模擬発現が対照として使用される。

以前記載された方法（Ｗｉｌｌｃｏｘ ＢＥ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，Ｎｏｖ；８（１１）：２４１８−２３）に従って可溶性ＴＣＲとして表される、Ｒ４Ｐ３Ｈ３のＳＰＲ結合解析、およびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３−００２複合体は、Ｋ_Ｄ＝１０２μＭの親和性を明らかにする（表３）。１Ｇ４ ＴＣＲおよびＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１のＳＰＲ結合データが、対照として使用される。

Claims (15)

1. 配列番号３、９、１５、２１、２７、および３３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含んでなる抗原認識コンストラクト。
2. 前記抗原認識コンストラクトが、ＣＯＬ６Ａ３抗原ペプチドに特異的におよび／または選択的に結合できる、請求項１に記載の抗原認識コンストラクト。
3. 前記抗原認識コンストラクトが、抗体、またはその誘導体または断片、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはその誘導体または断片である、請求項１または２に記載の抗原認識コンストラクト。
4. 前記ＴＣＲαまたはγ鎖が、配列番号３、１５、および２７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含んでなり、および／または前記ＴＣＲβまたはδ鎖が、配列番号９、２１、および３３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含んでなる、ＴＣＲα鎖またはγ鎖および／またはＴＣＲβまたはδ鎖を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
5. 前記ＴＣＲαまたはγ鎖が、配列番号１、１３、および２５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ１；および／または配列番号２、１４、および２６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ２をさらに含んでなる、請求項４に記載の抗原認識コンストラクト。
6. 前記ＴＣＲβまたはδ鎖が、配列番号７、１９、および３１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ１；および／または配列番号８、２０、および３２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ２をさらに含んでなる、請求項４または５に記載の抗原認識コンストラクト。
7. 配列番号４、１０、１６、２２、２８、および３４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＴＣＲ可変鎖領域を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
8. ＴＣＲ結合断片を含んでなり、前記結合断片が、任意選択的に、配列番号１、２、３、または７、８、９または１３、１４、１５、または１９、２０、２１、または２５、２６、２７または３１、３２、３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列から選択されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトをコードする核酸。
10. 請求項９に記載の核酸を含んでなるベクター。
11. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトまたは請求項９に記載の核酸または請求項１０に記載のベクターを含んでなる宿主細胞、または任意選択的に、リンパ球、好ましくはＴリンパ球またはＴリンパ球前駆体、より好ましくはＣＤ４またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である宿主細胞。
12. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、または請求項９に記載の核酸、または請求項１０に記載のベクター、または請求項１１に記載の宿主細胞、および薬学的に許容可能な担体、安定剤および／または賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
13. 医療で使用するための、任意選択的に増殖性疾患の診断、予防、および／または治療で使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、または請求項９に記載の核酸、または請求項１０に記載のベクター、または請求項１１に記載の宿主細胞、または請求項１２に記載の医薬品組成物。
14. ａ．適切な宿主細胞を提供するステップと、
    ｂ．請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトをコードするコード配列を含んでなる遺伝子コンストラクトを提供するステップと、
    ｃ．前記遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するステップと、
    ｄ．前記適切な宿主細胞によって前記遺伝子コンストラクトを発現させるステップと
    を含んでなる、細胞株を発現するＣＯＬ６Ａ３特異的抗原認識コンストラクトを製造する方法。
15. 前記適切な宿主細胞からの前記抗原認識コンストラクトの単離および精製と、任意選択的に、Ｔ細胞内の前記抗原認識コンストラクトの再構成とをさらに含んでなる、請求項１４に記載の方法。

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