DE102016115246B3 - Neue t-zellrezeptoren und deren verwendung in immuntherapie - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Antigen-erkennende Konstrukte gegen COL6A3-Antigene. Die Erfindung stellt in Besonderem neue auf T-Zellrezeptoren (TCR) basierte Moleküle, die selektiv und spezifisch für das in Tumoren exprimierte Antigen COL6A3 sind, zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen TCR und von ihnen abgeleitete COL6A3 Antigen-bindende Fragmente sind in der Diagnose, der Behandlung und der Vorbeugung von COL6A3-exprimierenden Krebserkrankungen von Nutzen. Weiterhin werden Nukleinsäuren, die die erfindungsgemäßen Antigen-erkennende Konstrukte kodieren, Vektoren, die diese Nukleinsäuren umfassen, rekombinante Zellen, die die Antigen-erkennenden Konstrukte exprimieren, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen, zur Verfügung gestellt.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Antigen-erkennende Konstrukte gegen COL6A3 Antigene. Die Erfindung stellt in Besonderem neue auf T-Zellrezeptoren (TCR) basierte Moleküle, die selektiv und spezifisch für das in Tumoren exprimierte Antigen COL6A3 sind, zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen TCR und von ihnen abgeleitete COL6A3 Antigen-bindende Fragmente sind in der Diagnose, der Behandlung und der Vorbeugung von COL6A3-exprimierenden Krebserkrankungen von Nutzen. Weiterhin werden Nukleinsäuren, die die erfindungsgemäßen Antigen-erkennende Konstrukte kodieren, Vektoren, die diese Nukleinsäuren umfassen, rekombinante Zellen, die die Antigen-erkennenden Konstrukte exprimieren, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen, zur Verfügung gestellt.
  • BESCHREIBUNG
  • Kollagene sind eine Superfamilie von Proteinen, die eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität von verschiedenen Geweben spielen. Kollagene sind extrazelluläre Matrixproteine und haben eine dreifach helikale Domäne als ihr gemeinsames strukturelles Element. Kollagen VI ist eine strukturelle Hauptkomponente der Mikrofibrillen. Die grundlegende Struktureinheit von Kollagen VI ist ein Heterotrimer der alpha 1(VI), alpha 2(VI) und alpha 3(VI) Kollagenketten. Die alpha 1(VI)- und alpha 2(VI)-Ketten werden durch die Gene COL6A1 und COL6A2 kodiert. Das Protein, das von dem Gen COL6A3 kodiert wird, ist die alpha 3 Untereinheit des Typ VI Kollagens (alpha 3(VI)-Kollagenkette) (Bertini et al., 2002 Eur. J. Paediatr. Neurol 6: 193–8). Es wurde zuvor gezeigt, dass die Expression des Gens COL6A3 mit der Progression von Brustkrebs assoziiert ist und in Darmkrebs erhöht ist (Smith MJ, et al. ”Analysis of differential gene expression in colorectal cancer and stroma using fluorescence-activated cell sorting purification” British journal of cancer. 2009; 100: 1452–1464; Tilman G et al ”Human periostin gene expression in normal tissues, tumors and melanoma: evidences for periostin production by both stromal and melanoma cells” Mol Cancer. 2007; 6: 80) und als prognostischer Marker des kolorektalen Karzinoms (Qiao J et al. ”Stroma derived COL6A3 is a potential prognosis marker of colorectal carcinoma revealed by quantitative proteomics” Oncotarget. 2015 Oct 6; 6(30): 29929–29946). Das Gen COL6A3 ist auf 2q37 im menschlichen Genom lokalisiert und enthält 44 Exons. Das Protein COL6A3 hat 3177 Aminosäuren und enthält 12 Domänen des Von-Willebrand-Faktors Typ A (vWA), eine Fibronektin Typ 3-Domäne und eine Domäne der BPTI/Kunitz-Familie der Serinproteaseinhibitoren (KU).
  • Die Ziele der T-Zell-basierenden Immuntherapie repräsentieren Peptidepitope, die von tumorassoziierten oder tumorspezifischen Proteinen abgeleitet sind, die durch Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) präsentiert werden. Diese tumorassoziierten Antigenen (TAA) können Peptide aus sämtlichen Proteinklassen, wie Enzyme, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, etc. sein, welche exprimiert werden und, im Vergleich zu unveränderten Zellen der gleichen Herkunft, in dem jeweiligen Tumor gewöhnlich hochreguliert sind.
  • Spezifische Elemente von Zellimmunantworten sind in der Lage, Tumorzellen spezifisch zu erkennen und sie zu zerstören. Die Isolierung von T-Zellen aus Tumor-infiltrierenden Zellpopulationen oder aus dem peripheren Blut weist darauf hin, dass solche Zellen bei dem natürlichen Immunschutz gegen Krebs eine wichtige Rolle spielen. Eine wichtige Rolle bei dieser Antwort spielen insbesondere CD8-positive T-Zellen, die Moleküle der Klasse I des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) erkennen, die mit Peptiden beladen sind, die gewöhnlich 8 bis 10 Aminosäurereste von Proteinen oder defekten ribosomalen Produkten (DRIPS), die im Zytosol lokalisiert sind, haben. Die MHC-Moleküle des Menschen werden auch als humane Leukozyten-Antigene (HLA) bezeichnet.
  • Ein TCR ist ein heterodimeres Zelloberflächenprotein der Superfamilie der Immunglobuline, die mit den invariablen Proteinen des CD3-Komplexes, der in Vermittlung der Signaltransduktion involviert ist, assoziiert. TCRs existieren in αβ- und γδ-Formen, die strukturell ähnlich sind, aber ziemlich unterschiedliche anatomische Positionen und – vermutlich – Funktionen haben. Der extrazelluläre Anteil der nativen heterodimerischen αβTCR besteht aus zwei Polypeptiden, von welchen beide eine membranproximale konstante Domäne und eine membrandistale variable Domäne besitzen. Alle konstanten und variablen Domänen enthalten eine Intraketten-Disulfidbindung. Die variablen Domänen enthalten hochgradig polymorphe Schleifen, analog zu den komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) von Antikörper. Die Verwendung der TCR-Gentherapie überwindet eine Reihe von aktuellen Hürden. Es erlaubt, die eigenen T-Zellen des Patienten mit den erwünschten Spezifitäten auszustatten und eine ausreichende Anzahl von T-Zellen in einer kurzen Zeit, was deren Erschöpfung vermeidet, zu generieren. Der TCR wird in zentrale T-Gedächtniszellen oder T-Zellen mit Stammzelleigenschaften transduziert, was eine bessere Persistenz und Funktion nach dem Transfer sicherstellt. TCR-modifizierte T-Zellen werden Krebspatienten, die durch Chemotherapie oder Bestrahlung lymphopenisch geworden sind, per Infusion verabreicht, was eine effiziente Transplantation erlaubt, jedoch eine Immunsuppression inhibiert.
  • Obwohl in der Entwicklung von molekularen-zielgerichteten Arzneimitteln für die Krebstherapie Fortschritte gemacht wurden, besteht die Notwendigkeit, neue Krebsmittel, die spezifisch gegen Moleküle, die hochspezifisch für Krebszellen sind, gerichtet sind, zu entwickeln. Die vorliegende Beschreibung spricht diese Notwendigkeit an, indem neue COL6A3 TCRs, entsprechende rekombinante TCR-Konstrukte, Nukleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen, die spezifisch an COL6A3-Epitop(e), wie offenbart, und Verfahren zur Verwendung solcher Moleküle bei der Krebsbehandlung zur Verfügung gestellt werden.
  • Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Antigen-erkennendes Konstrukt, welches zumindest eine komplementaritätsbestimmende Region (CDR) 3 mit einer Sequenzidentität von zumindest 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder bevorzugt 100% Sequenzidentität zu einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 3, 9, 15, 21, 27 und 33, umfasst, gelöst.
  • In einer weiteren oder einer alternativen Ausführungsform kann das Antigen-erkennende Konstrukt zusätzlich eine CDR1 und/oder eine CDR2-Domänsequenz umfassen. Innerhalb der variablen Domäne befinden sich CDR1 und CDR2 in der variablen (V) Region einer Polypeptidkette und CDR3 schließt etwas von V-Segment, die gesamten D (diversity)- und J (joining)-Segmente ein. CDR3 ist die variabelste und die Haupt-CDR, welche für die spezifische und selektive Erkennung eines Antigens verantwortlich ist. CDR1- und CDR2-Sequenzen können von einer CDR-Sequenz einer humanen variablen Kette des Allels ausgewählt werden.
  • Native alpha-beta heterodimere TCRs besitzen eine alpha-Kette und eine beta-Kette. Jede Kette umfasst variable, verbindende und konstante Segmente und die beta-Kette umfasst normalerweise auch ein kurzes Diversitätssegment zwischen dem variablen und verbindenden Segment, aber das Diversitätssegment wird oft als Teil des J-Segments gesehen. Jedes variable Segment umfasst drei CDRs (komplementaritätsbestimmende Regionen), die in eine Gerüstsequenz eingebettet sind, eine davon ist die hypervariable Region, genannt CDR3. Es gibt verschiedene Arten von variablen Segmenten (Vα) der alpha-Kette und verschiedene Arten von variablen Segmenten (Vβ) der beta-Kette, die sich durch ihr Gerüst, CDR1- und CDR2-Sequenzen, und durch eine teilweise definierte CDR3-Sequenz auszeichnen. Die Vα-Arten werden in der IMGT-Nomenklatur durch eine einzigartige TRAV-Nummer gekennzeichnet, Vβ-Arten werden durch eine einzigartige TRBV-Nummer gekennzeichnet.
  • Daher umfasst das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt in einer zusätzlichen oder alternativen Ausführungsform CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen in einer Kombination wie in der Tabelle 1 unterhalb gezeigt, welche das entsprechende Allel der variablen Kette zusammen mit der CDR3-Sequenz zeigen. Daher sind die erfindungsgemäßen Antigen-erkennende Konstrukte bevorzugt, die zumindest eine, bevorzugt alle drei CDR-Sequenzen: CDR1, CDR2 und CDR3, umfassen. Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt die entsprechenden CDR1 bis CDR3 eines individuellen hier offenbarten variablen TCR-Segment der vorliegenden Erfindung.
  • Der Begriff ”Spezifizität” oder ”Antigenspezifizität” oder ”spezifisch für” ein gegebenes Antigen, wie hier verwendet, bedeutet, dass das Antigen-erkennende Konstrukt spezifisch an das Antigen binden kann, bevorzugt ein COL6A3-Antigen, weiter bevorzugt mit einer hohen Avidität, wenn das Antigen ein HLA, bevorzugt HLA A2 ist. Beispielsweise kann ein TCR als Antigen-erkennendes Konstrukt angesehen werden, das eine ”Antigenspezifizität” für ein COL6A3-Antigene besitzt, wenn T-Zellen, die den TCR exprimieren und mit einem COL6A3-präsentierenden HLA in Kontakt gebracht werden, mindestens etwa 200 pg/ml oder mehr (z. B., 250 pg/ml oder mehr, 300 pg/ml oder mehr, 400 pg/ml oder mehr, 500 pg/ml oder mehr, 600 pg/ml oder mehr, 700 pg/ml oder mehr, 1000 pg ml oder mehr, 2000 pg/ml oder mehr, 2500 pg/ml oder mehr, 5000 pg/ml oder mehr) Interferon γ (IFN-γ) nach Ko-Kultivierung mit Zielzellen, die mit niedrigen Konzentrationen eines COL6A3-Antigens, wie zum Beispiel den COL6A3-Epitopen und den Antigenen, die hier zur Verfügung gestellt werden, gepulst wurden (z. B., etwa 10–11 mol/l, 10–10 mol/l, 10–9 mol/l, 10–8 mol/l, 10–7 mol/l, 10–6 mol/l, 10–5 mol/l) sekretieren. Alternativ oder zusätzlich kann ein TCR als eine ”Antigenspezifizität” für COL6A3 besitzend angesehen werden, wenn die T-Zellen, die den TCR exprimieren, mindestens doppelt so viel IFN-γ sekretieren, wie der nicht transduzierte Hintergrund von IFN-γ nach Ko-Kultivierung mit den Zielzellen, die mit niedrigen Konzentrationen eines COL6A3-Antigens gepulst wurden. Eine solche ”Spezifizität”, wie oben beschrieben, kann – beispielsweise – mit einem ELISA analysiert werden.
  • In einer alternativen oder zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung bindet das Antigen-erkennende Konstrukt selektiv an ein COL6A3-Antigen; wobei das COL6A3 Antigen bevorzugt ein Proteinepitop oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, wie in den SEQ ID NO: 58 bis 67, am meisten bevorzugt SEQ ID NO: 58, oder eine Variante davon ist, wobei die Variante eine Aminosäuredeletion, Addition, Insertion oder Substitution von nicht mehr als drei, bevorzugt zwei und am meisten bevorzugt nicht mehr als eine Aminosäureposition ist.
  • Der Begriff ”Selektivität” oder ”selektive Erkennung/Bindung” wird so verstanden, dass auf eine Eigenschaft des Antigen-erkennenden Konstrukts, so wie einen TCR oder Antikörper, bevorzugt nur ein spezifisches Epitop selektiv zu erkennen oder zu binden und bevorzugt keine oder im Wesentlichen keine Kreuzreaktivität zu einem anderen Epitop zu zeigen, referenziert wird. Bevorzugt bedeutet der Begriff ”Selektivität” oder ”selektive Erkennung/Bindung”, dass das Antigen-erkennende Konstrukt (z. B. ein TCR) ein spezifisches Epitop selektiv erkennt oder bindet und bevorzugterweise keine oder im Wesentlichen keine Kreuzreaktion mit einem anderen Epitop zeigt, wobei das Epitop einzigartig für ein Protein ist, so dass das Antigen-erkennende Konstrukt keine oder im Wesentlichen keine Kreuzreaktion mit einem anderen Epitop und einem anderen Protein zeigt.
  • Das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt wird bevorzugt aus einem Antikörper oder einem Derivat oder einem Fragment davon, oder einem T-Zellrezeptor (TCR) oder einem Derivat oder einem Fragment davon ausgewählt. Ein Derivat oder Fragment eines Antikörpers oder eines TCRs gemäß der Erfindung sollte bevorzugt die Fähigkeit des Stammmoleküls an ein Antigen zu binden oder es zu erkennen, im Besonderen seine Spezifizität und/oder Selektivität, wie oben erklärt, behalten. Eine solche Bindungsfunktionalität kann durch das Vorhandensein einer CDR3-Region, wie hier beschrieben, erhalten werden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung sind die erfindungsgemäßen TCRs in der Lage, COL6A3-Antigene in einer Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I-abhängigen Weise zu erkennen. ”MHC Klasse I-abhängige Weise”, wie hier verwendet, bedeutet, dass der TCR eine Immunreaktion nach der Bindung an ein COL6A3-Antigen im Zusammenhang mit einem MHC-Klasse-I-Molekül auslöst. Das MHC-Klasse-I-Molekül kann jedes in der Technik bekannte MHC-Klasse-I-Molekül sein, z. B. HLA-A-Moleküle. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das MHC-Klasse-I-Molekül ein HLA-A2-Molekül.
  • Die Erfindung stellt sowohl einzelkettige Antigen-erkennende Konstrukte als auch doppelkettige Antigen-erkennende Konstrukte zur Verfügung.
  • Die Erfindung stellt im Besonderen ein TCR als Antigen-erkennendes Konstrukt oder ein Fragment oder Derivat davon zur Verfügung. Der TCR ist bevorzugt menschlich, was so verstanden werden soll, dass er von einem menschlichen TCR-Lokus generiert wurde, und daher menschliche TCR-Sequenzen umfasst. Des Weiteren kann der TCR dadurch charakterisiert werden, dass er menschlicher Herkunft ist und spezifisch das COL6A3 Antigen erkennt.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt zusätzlichen oder alternativ ein Antigenerkennendes Konstrukt, wie oben beschrieben, zur Verfügung, welches eine Immunantwort auslöst, bevorzugt wenn die Immunantwort dabei durch einen Anstieg des Interferon (IFN) γ-Niveaus charakterisiert wird.
  • Die erfindungsgemäßen TCRs können als Einzelkette α oder β, oder γ und δ, Moleküle oder alternativ als doppelkettige Konstrukte zusammengesetzt aus sowohl dem α- und β-Strang, als auch dem γ- und δ-Strang, zur Verfügung gestellt werden.
  • Das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt kann eine TCR α- oder γ-Kette; und/oder eine TCR β- oder δ-Kette umfassen; wobei die TCR α- oder γ-Kette einen CDR3 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 3, 15 und 27 umfasst, und/oder wobei die TCR β- oder δ-Kette einen CDR3 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 9, 21 und 33 umfasst.
  • Am meisten bevorzugt ist, in einigen zusätzlichen Ausführungsformen, in welchen die Offenbarung sich auf Antigen-erkennende Konstrukte, die eine beliebige, zwei oder alle CDR1- bis CDR3-Regionen der hier offenbarten TCR-Ketten umfassen (siehe Tabelle 1) beziehen, diejenigen Antigen-erkennenden Konstrukte bevorzugt sind, die die jeweilige CDR-Sequenz mit drei, zwei oder bevorzugt nur einem modifizierten Aminosäurerest umfassen. Ein modifizierter Aminosäurerest kann aus einer Aminosäureninsertion, -deletion oder -substitution ausgewählt werden. Am meisten bevorzugt ist, dass die drei, zwei und bevorzugt ein modifizierter Aminosäurerest der erste oder letzte Aminosäurerest der jeweiligen CDR-Sequenz ist. Wenn die Modifikation eine Substitution ist, dann ist es in einigen Ausführungsformen bevorzugt, dass die Substitution eine konservative Aminosäuresubstitution ist.
  • Wenn das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt aus zumindest zwei Aminosäureketten besteht, wie ein doppelkettiger TCR, oder Antigen-bindendes Fragment davon, kann das Antigen-erkennende Konstrukt in einer ersten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und in einer zweiten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 9; oder in einer ersten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 15 und in einer zweiten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 21; oder in einer ersten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 27 und in einer zweiten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 33 umfassen. Jeder beliebige der zuvor genannten doppelkettigen TCRs oder Antigen-bindende Fragmente davon sind bevorzugte TCRs der vorliegenden Erfindung. In einigen Ausführungsformen kann der CDR3 des erfindungsgemäßen doppelkettigen TCRs mutiert sein. Mutationen der CDR3-Sequenzen gemäß SEQ ID NOs: 9 bis 28, wie oben zur Verfügung gestellt, enthalten bevorzugt eine Substitution, Deletion, Addition oder Insertion von nicht mehr als drei, bevorzugt zwei und am meisten bevorzugt nicht mehr als einen Aminosäurerest. In einigen Ausführungsformen kann die erste Polypeptidkette eine TCR α- oder γ-Kette und die zweite Polypeptidkette kann eine TCR β- oder δ-Kette sein. Bevorzugt ist die Kombination eines αβ oder γδ TCR.
  • Der TCR oder das Antigen-bindende Fragment davon ist in einigen Ausführungsformen aus einer TCR α- und einer TCR β-Kette oder γ- und δ-Kette zusammengesetzt. Ein solcher doppelkettige TCR umfasst innerhalb jeder Kette variable Regionen und diese variablen Regionen umfassen jeweils eine CDR1-, eine CDR2- und eine CDR3-Sequenz. Die TCRs umfassen die CDR1- bis CDR3-Sequenzen wie in der Aminosäuresequenz der variablen Kette von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 10 (R4P1D10) oder SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 22 (R4P3F9); oder SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 34 (R4P3H3) umgefasst.
  • Einige Ausführungsformen der Erfindung betreffen einen TCR oder ein Fragment davon, umfassend eine TCR α- und eine TCR β-Kette, wobei der TCR Sequenzen der variablen Region mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder bevorzugt 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den α- und β-Ketten gemäß SEQ ID NO: 4 bzw. 10 oder 16 bzw. 22; oder 28 bzw. 34 umfasst.
  • Die erfindungsgemäßen TCRs können des Weiteren eine konstante Region, die von einer beliebigen geeigneten Spezies, so wie einem Säugetier, z. B. Mensch, Ratte, Affe, Kaninchen, Esel oder Maus stammt, umfassen. In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst der erfindungsgemäße TCR des Weiteren eine menschliche konstante Region. In einigen bevorzugten Ausführungsformen kann die konstante Region des erfindungsgemäßen TCRs geringfügig modifiziert sein, beispielsweise durch die Einführung von heterologen Sequenzen, bevorzugt Maussequenzen, welche die TCR-Expression und -Stabilität erhöhen können.
  • Einige Ausführungsformen der Erfindung betreffen einen TCR oder ein Fragment davon, bestehend aus einer TCR α- und einer TCR β-Kette, wobei der TCR die konstante Region mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder bevorzugt 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den α- und β-Ketten gemäß SEQ ID NO: 5 bzw. 11 oder 17 bzw. 23; oder 29 bzw. 35 umfasst.
  • Die erfindungsgemäße TCR α- oder γ-Kette kann weiterhin einen CDR1 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 1, 13 und 25; und/oder einen CDR2 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 2, 14 und 26 umfassen.
  • Entsprechend der Erfindung kann die TCR β- oder δ- Kette weiterhin einen CDR1 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 7, 19 und 31; und/oder einen CDR2 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 8, 20 und 32 umfassen.
  • Das Antigen-erkennende Konstrukt kann in einer weiteren Ausführungsform ein Bindungsfragment eines TCRs umfassen, und wobei das Bindungsfragment CDR1 bis CDR3 optional ausgewählt aus den CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nos. 1, 2, 3 oder 7, 8, 9 oder 13, 14, 15 oder 19, 20, 21 oder 25, 26, 27 oder 31, 32, 33 umfasst.
  • In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Antigen-erkennende Konstrukt, wie hier beschrieben, ein TCR oder ein Fragment davon, der aus zumindest einer TCR α- und einer TCR β-Kettensequenz gebildet ist, wobei die TCR α-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 bis 3 umfasst, und die TCR β-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 7 bis 9 umfasst; oder wobei die TCR α-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 13 bis 15 umfasst, und die TCR β-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 19 bis 21 umfasst; oder wobei die TCR α-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 25 bis 27 umfasst, und die TCR β-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 31 bis 33 umfasst.
  • In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Antigen-erkennende Konstrukt, wie hier beschrieben, ein TCR oder ein Fragment davon, der aus zumindest einer TCR α- und einer TCR β-Kettensequenz gebildet ist, wobei die TCR α-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 4 umfasst, und wobei die TCR β-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 10 umfasst; oder wobei die TCR α-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 16 umfasst, und wobei die TCR β-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 22 umfasst; oder wobei die TCR α-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 28 umfasst, und wobei die TCR β-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 34 umfasst.
  • In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Antigen-erkennende Konstrukt, wie hier beschrieben, ein TCR oder ein Fragment davon, des Weiteren umfassend eine konstante Region von TCR mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 5, 11, 17, 23, 29 und 35, bevorzugt ist, dass der TCR aus mindestens einer TCR α- und einer TCR β-Kettensequenz besteht, wobei die TCR α-Kettensequenz eine konstante Region mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 5, 17 und 29 umfasst.
  • Offenbart werden auch Antigen-erkennende Konstrukte, wie hier beschrieben, umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 6 und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 12. Die Erfindung stellt auch einen TCR umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 18, und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 24 zur Verfügung. In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Antigen-erkennende Konstrukte, die ein TCR sind, und eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 30 und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 36 umfassen, zur Verfügung.
  • Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet der Begriff ”murin” oder ”menschlich (human)”, wenn er auf ein Antigen-erkennendes Konstrukt oder eine beliebige Komponente der hier beschriebenen TCRs (z. B. komplementaritätsbestimmende Region (CDR), variable Region, konstante Region, α-Kette, und/oder β-Kette) bezogen wird, einen TCR (oder eine Komponente davon), der von einem nicht veränderten TCR-Locus der Maus bzw. des Menschen abgeleitet ist.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden chimerische TCRs zur Verfügung gestellt, wobei die TCR-Ketten Sequenzen von mehreren Spezies umfassen. Es ist bevorzugt, dass ein erfindungsgemäßer TCR eine α-Kette umfassend eine menschliche variable Region einer α-Kette und zum Beispiel eine murine konstante Region einer murinen TCR α-Kette umfasst.
  • In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäße TCR ein menschlicher TCR umfassend menschliche variable Regionen entsprechend den obigen Ausführungsformen und menschliche konstante Regionen.
  • Der erfindungsgemäße TCR kann auch als einzelkettiger TCR (single chain; scTCR) zur Verfügung gestellt werden. Ein scTCR kann ein Polypeptid einer variablen Region einer ersten TCR-Kette (z. B., eine alpha-Kette) und ein Polypeptid einer kompletten (voller Länge) zweiter TCR-Kette (z. B., einer beta-Kette), oder vice versa sein. Des Weiteren kann der scTCR optional einen oder mehrere Linker enthalten, welche die beiden oder mehreren Polypeptide verbinden. Der Linker kann zum Beispiel ein Peptid sein, welches die zwei Einzelketten verlinkt, wie hier beschrieben. Auch wird ein erfindungsgemäßer scTCR, der an ein menschliches Zytokine, wie IL-2, IL-7 oder IL-15, gekoppelt ist, bereitgestellt.
  • Das erfindungsgemäße Antigen-bindende Konstrukt kann auch in der Form eines multimerischen Komplexes zur Verfügung gestellt werden, welcher zumindest 2 scTCR-Moleküle umfasst, wobei die scTCR-Moleküle alle an zumindest eine Biotineinheit gekoppelt sind, und wobei die scTCRs durch die Wechselwirkungen zwischen Biotin und Streptavidin untereinander verbunden sind, um die Bildung des multimeren Komplexes zu ermöglichen. Ähnliche Herangehensweisen für die Erzeugung von multimeren TCRs sind auch möglich und in dieser Offenbarung enthalten. Auch werden multimere Komplexe höherer Ordnung, umfassend mehr als zwei erfindungsgemäße scTCR bereitgestellt.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein TCR eine Einheit, die zumindest eine TCR alpha oder gamma und/oder TCR beta oder delta variable Domäne besitzt. Generell umfassen sie sowohl eine TCR alpha variable Domäne als auch eine TCR beta variable Domäne. Sie können αβ Heterodimere oder im Einzelkettenformat vorliegen. Für die Verwendung in der adoptiven Therapie kann ein αβ heterodimerischer TCR zum Beispiel transfiziert sein, denn Ketten voller Länge sowohl zytoplasmatische als auch transmembrane Domänen besitzen. Wenn es gewünscht ist, kann eine Disulfidbindung zwischen den Resten der entsprechenden konstanten Domänen vorhanden sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen-erkennende Konstrukt ein humaner TCR oder ein Fragment oder Derivat davon. Ein humaner TCR oder ein Fragment oder ein Derivat davon ist ein TCR, welcher mehr als 50% der korrespondierenden humanen TCR-Sequenz umfasst. Es ist bevorzugt, dass nur ein kleiner Teil der TCR-Sequenz künstlich ist oder von anderen Spezies abgeleitet ist. Es ist jedoch bekannt, dass chimerische TCRs, z. B. abgeleitet von menschlicher Herkunft mit murinen Sequenzen in den konstanten Domänen, vorteilhaft sind. Deshalb sind TCRs gemäß der vorliegenden Erfindung, welche murine Sequenzen in dem extrazellulären Teil ihrer konstanten Domänen enthalten, besonders bevorzugt.
  • Somit ist es auch bevorzugt, dass das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt in der Lage ist, sein Antigen in einer humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-abhängigen Weise, bevorzugt in einer HLA-A02-abhängigen Weise, zu erkennen. Der Begriff ”HLA-abhängige Weise” bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass das Antigen-erkennende Konstrukt nur an das Antigen bindet, wenn das antigenische Peptid durch das HLA präsentiert wird.
  • Das Antigen-erkennende Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung induziert in einer Ausführungsform vorzugsweise eine Immunantwort, wobei vorzugsweise die Immunantwort durch den Anstieg des Interferon-(IFN) γ-Spiegels charakterisiert ist.
  • Ebenfalls wird ein Polypeptid durch die Erfindung bereitgestellt, das einen funktionellen Teil eines beliebigen der im Kontext der Erfindung beschriebenen TCRs (oder funktioneller Varianten davon) umfasst, beispielsweise eines der aus R4P1D10, R4P3F9 und R4P3H3 ausgewählten TCRs, wie in den Beispielen und Tabelle 1 angegeben. Der Begriff ”Polypeptid”, wie er im Kontext der Erfindung verwendet wird, schließt Oligopeptide ein und bezieht sich auf eine einzelne Kette von Aminosäuren, die durch eine oder mehrere Peptidbindungen verbunden sind. In Bezug auf die erfindungsgemäßen Polypeptide kann der funktionelle Teil ein beliebiger Teil sein, der zusammenhängende Aminosäuren des TCRs (oder einer funktionellen Variante davon) umfasst, von denen er ein Teil ist, vorausgesetzt, dass der funktionelle Teil spezifisch an ein COL6A3-Antigen bindet, vorzugsweise wie hier in Tabelle 2 offenbart, sowie an die Peptide A1 bis A9 (SEQ ID NOs: 59-67). Der Begriff „funktioneller Teil”, wenn er in Bezug auf einen TCR (oder eine funktionelle Variante davon) verwendet wird, bezieht sich auf einen beliebigen Teil oder ein Fragment des TCR (oder einer funktionellen Variante davon) der Erfindung, wobei dieses Teil oder Fragment die biologische Aktivität des TCRs (oder funktionellen Variante davon), von denen es sich um einen Teil handelt (der übergeordnete TCR oder die übergeordnete funktionelle Variante davon), beibehält. Funktionelle Abschnitte umfassen beispielsweise jene Teile eines TCR (oder eine funktionelle Variante davon), die die Fähigkeit beibehalten, spezifisch an ein COL6A3-Antigen (in einer HLA-A2-abhängigen Weise) zu binden oder Krebs zu erkennen, zu behandeln oder zu verhindern, dies in einem ähnlichen Ausmaß, im gleichen Ausmaß oder in einem höheren Ausmaß, als das übergeordnete TCR (oder funktionelle Variante davon). In Bezug auf das übergeordnete TCR (oder eine funktionelle Variante davon) kann der funktionelle Teil beispielsweise etwa 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% oder mehr der variablen Sequenzen des übergeordneten TCRs (oder funktionelle Variante davon) umfassen.
  • Der funktionelle Abschnitt kann zusätzliche Aminosäuren am Amino- oder Carboxyterminus des Abschnitts oder an beiden Enden umfassen, wobei in der Aminosäuresequenz des übergeordneten TCR oder der funktionellen Variante keine zusätzlichen Aminosäuren gefunden werden. Wünschenswerterweise stören die zusätzlichen Aminosäuren nicht die biologische Funktion des funktionellen Abschnitts, z. B. spezifisch an COL6A3-Antigene zu binden; und/oder die Fähigkeit, Krebs zu erkennen, zu behandeln oder zu verhindern usw. Noch wünschenswerter ist es, wenn die zusätzlichen Aminosäuren die biologische Aktivität im Vergleich zu der biologischen Aktivität des übergeordneten TCRs oder der funktionellen Variante davon erhöhen.
  • Das Polypeptid kann einen funktionellen Abschnitt von einer oder beiden der α- und β-Ketten der erfindungsgemäßen TCRs oder funktionellen Varianten davon umfassen, wie einen funktionellen Abschnitt, der eines von mehreren von CDR1, CDR2 und (vorzugsweise) CDR3 der variablen Region(en) der α-Kette und/oder β-Kette eines erfindungsgemäßen TCRs oder einer funktionellen Variante umfasst. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das Polypeptid einen funktionellen Abschnitt umfassen, der die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27 und 33 (CDR3 der variablen Regionen des TCRs der Erfindung) oder eine Kombination davon umfasst. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das erfindungsgemäße Polypeptid beispielsweise die variable Region des erfindungsgemäßen TCRs oder einer funktionellen Variante davon umfassen, die eine Kombination der oben dargelegten CDR-Bereiche umfasst. In dieser Hinsicht kann das Polypeptid die Aminosäuresequenz von einer beliebigen Sequenz mit SEQ ID NO: 4, 10, 16, 22, 28 und 34 (die variablen Regionen einer α- oder β-Kette des erfindungsgemäßen TCRs) umfassen.
  • In einigen Fällen kann das erfindungsgemäße Konstrukt eine oder zwei Polypeptidketten umfassen, die eine Sequenz gemäß einer der SEQ ID NO: 1 bis 36 (CDR-Sequenzen, konstante und variable Regionen und Volllängensequenzen) oder funktionelle Fragmente davon umfassen, und ferner andere Aminosäuresequenzen, z. B. eine Aminosäuresequenz, die für ein Immunglobulin oder einen Teil davon kodiert umfassen, dann kann das erfindungsgemäße Protein ein Fusionsprotein sein. In dieser Hinsicht stellt die Erfindung auch ein Fusionsprotein bereit, das mindestens eines der im Kontext der Erfindung beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide zusammen mit mindestens einem anderen Polypeptid umfasst. Das andere Polypeptid kann als separates Polypeptid des Fusionsproteins vorliegen oder kann als Polypeptid vorliegen, das im Rahmen (im Tandem) mit einem der im Kontext der Erfindung beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide exprimiert wird. Das andere Polypeptid kann jedes peptidische oder proteinhaltige Molekül oder einen Teil davon einschließen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein Immunglobulin, CD3, CD4, CD8, ein MHC-Molekül, ein CD1-Molekül, z. B. CD1a, CD1b, CD1c, CD1d usw.
  • Das Fusionsprotein kann eine oder mehrere Kopien des erfindungsgemäßen Polypeptids und/oder eine oder mehrere Kopien des anderen Polypeptids umfassen. Beispielsweise kann das Fusionsprotein 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr Kopien des erfindungsgemäßen Polypeptids und/oder des anderen Polypeptids umfassen. Geeignete Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen sind in der Technik bekannt und umfassen beispielsweise rekombinante Verfahren. In einigen Ausführungsformen der Erfindung können die TCRs (und funktionelle Abschnitte und funktionelle Varianten davon), Polypeptide und Proteine der Erfindung als ein einzelnes Protein exprimiert werden, das ein Linkerpeptid umfasst, das die α-Kette und die β-Kette sowie die γ-Kette und die δ-Kette verbindet. In dieser Hinsicht können die TCRs (und funktionelle Varianten und funktionelle Abschnitte davon), Polypeptide und Proteine der Erfindung, die die Aminosäuresequenzen der variablen Regionen des erfindungsgemäßen TCRs umfassen und können ferner ein Linkerpeptid umfassen. Das Linkerpeptid kann vorteilhafterweise die Expression eines rekombinanten TCRs (einschließlich funktioneller Abschnitte und funktioneller Varianten davon), eines Polypeptids und/oder eines Proteins in einer Wirtszelle erleichtern. Das Linkerpeptid kann jede geeignete Aminosäuresequenz umfassen. Linker-Sequenzen für einzelkettige TCR-Konstrukte sind im Stand der Technik gut bekannt. Ein solches Einzelkettenkonstrukt kann außerdem eine, oder zwei konstante Domänsequenzen umfassen. Bei der Expression des Konstrukts einschließlich des Linkerpeptids durch eine Wirtszelle kann das Linkerpeptid auch gespalten werden, was zu getrennten α- und β-Ketten und getrennten γ- und δ-Ketten führt.
  • Wie bereits oben erwähnt, kann die Bindungsfunktionalität des erfindungsgemäßen TCRs im Rahmen eines Antikörpers bereitgestellt werden. Der Begriff „Antikörper” in seinen verschiedenen grammatischen Formen wird im Kontext der Erfindung verwendet, um sich auf Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen zu beziehen, d. h. Moleküle, die eine Antigenbindungsstelle oder ein Paratop enthalten. Solche Moleküle werden auch als ”Antigen-bindende Fragmente” von Immunglobulinmolekülen bezeichnet. Die Erfindung stellt ferner einen Antikörper oder einen Antigen-bindende Abschnitt davon bereit, der spezifisch an die hier beschriebenen Antigene bindet. Der Antikörper kann in jeder Form von Immunglobulin vorliegen, welche in der Technik bekannt ist. Beispielsweise kann der Antikörper beliebiger Klasse z. B., IgA, IgD, IgE, IgG, IgM usw. angehören. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein. Der Antikörper kann ein natürlich vorkommender Antikörper sein, z. B. ein Antikörper, der aus einem Säugetier, wie z. B. Maus, Kaninchen, Ziege, Pferd, Huhn, Hamster, Mensch usw., isoliert und/oder gereinigt wird. Alternativ kann der Antikörper ein gentechnisch veränderter Antikörper sein, z. B. ein humanisierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper. Der Antikörper kann in Form eines Monomers oder Polymers vorliegen.
  • Die Erfindung stellt auch Antigen-bindende Abschnitte von einem beliebigen der im Kontext der Erfindung beschriebenen Antikörper bereit. Der Antigen-bindende Abschnitt kann jeder Abschnitt sein, der mindestens eine Antigen-bindende Stelle wie Fab, F(ab')2, dsFv, sFv, Diabodies und Triabodies aufweist. Ein einzelkettiges Antikörperfragment des Fragments (sFv) der variablen Region-, das aus einem verkürzten Fab-Fragment, das die variable (V)-Domäne einer schweren Antikörperkette umfasst, die mit einer V-Domäne einer leichten Antikörperkette über ein synthetisches Peptid verbunden ist, kann mit routinemäßigen rekombinanten DNA-Technologieverfahren erzeugt werden. In ähnlicher Weise können Disulfid-stabilisierte Fragmente (dsFv) der variablen Region durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden, die Antikörperfragmente der Erfindung sind jedoch nicht auf diese beispielhaften Typen von Antikörperfragmenten beschränkt. Auch kann der Antikörper oder der Antigenbindende Abschnitt davon so modifiziert werden, um einen detektierbaren Marker wie z. B. einem Radioisotop, einem Fluorophor (z. B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE)), einem Enzym (z. B. alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase) und Elementpartikeln (z. B. Goldpartikel) zu enthalten. In einigen Fällen kann die TCR-CDR3-Sequenz leicht modifiziert sein, vorzugsweise jedoch nicht in mehr als 3 Aminosäureresten, vorzugsweise nur in zwei und am meisten bevorzugt nur in einer Aminosäureposition, verglichen mit den in SEQ ID Nos: 3, 9, 15, 21, 27 und 33 bereitgestellten CDR3-Sequenzen. Vorzugsweise umfassen die Antikörper die CDR3, vorzugsweise alle CDR1 bis CDR3-Regionen in der Kombination, wie für den TCR der Erfindung in Tabelle 1 angegeben ist.
  • Geeignete Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel werden Standardverfahren der Hybridomtechnik- in z. B. Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol, 5, 51 1–519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), und C. A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 8 Ed., Garland Publishing, New York, NY (2011)) beschrieben. Alternativ sind andere Verfahren, so wie EBV-Hybridomtechniken (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361–67 (1984), und Roder et al, Methods Enzymol, 121, 140–67 (1986)), und Bakteriophagen Vektorexpressionssysteme (siehe, z. B., Huse et al., Science, 246, 1275–81 (1989)) im Stand der Technik bekannt. Des Weiteren sind Verfahren zur Produktion von Antikörpern in nicht menschlichen Tieren z. B. in den US-Patenten 5 545 806 , 5 569 825 und 5 714 352 , und in der US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2002/0197266 beschrieben.
  • Einige Ausführungsformen der Erfindung beziehen sich auch auf TCRs oder funktionelle Fragmente und Polypeptide davon, die lösliche TCRs sind. Im Kontext der Erfindung bezieht sich der Begriff „löslicher T-Zellrezeptor” auf heterodimere trunkierte Varianten von nativen TCRs, die extrazelluläre Anteile der TCR α-Kette und β-Kette umfassen, die durch eine Disulfidbindung verbunden sind, aber denen die transmembranen und zytosolischen Domänen des nativen Proteins fehlen. Die Begriffe „α-Kettensequenz des löslichen T-Zell-Rezeptors- und β-Kettensequenz des löslichen T-Zell-Rezeptors-” beziehen sich auf TCR α-Ketten- und β-Kettensequenzen, denen die transmembranen und zytosolischen Domänen fehlen. Die Sequenz (Aminosäure oder Nukleinsäure) der löslichen TCR α-Ketten und β-Ketten kann mit den entsprechenden Sequenzen in einem nativen TCR identisch sein oder können α-Ketten und β-Ketten-Variantsequenzen des löslichen TCRs im Vergleich zu entsprechenden nativen TCR-Sequenzen umfassen. Der Begriff „löslicher T-Zellrezeptor”, wie er hier verwendet wird, umfasst lösliche TCRs mit variablen oder nicht-variablen löslichen TCR α-Ketten- und β-Kettensequenzen. Die Variationen können in den variablen oder konstanten Regionen der löslichen TCR-α-Ketten- und β-Kettensequenzen vorliegen und können Aminosäuremutationen in Form von Deletion, Insertion, Substitution sowie Änderungen an der Nukleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenz nicht verändern, einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Lösliche erfindungsgemäße TCRs behalten auf alle Fälle die Bindungsfunktionalität ihrer Elternmoleküle.
  • Das obige Problem wird ferner durch eine Nukleinsäure gelöst, die für ein Antigenerkennendes Konstrukt der Erfindung oder irgendeines der vorgenannten Protein- oder Polypeptid-Konstrukte kodiert. Die Nukleinsäure hat vorzugsweise (a) einen Strang, der für ein erfindungsgemäßes Antigen-erkennendes Konstrukt kodiert; (b) einen Strang, der komplementär zum Strang in (a) ist; oder (c) einen Strang, der unter stringenten Bedingungen mit einem Molekül hybridisiert, wie in (a) oder (b) beschrieben. Strenge Bedingungen sind dem Fachmann insbesondere aus Sambrook et al, ”Molecular Cloning” bekannt. Darüber hinaus weist die Nukleinsäure gegebenenfalls weitere Sequenzen auf, die zur Expression der dem Protein entsprechenden Nukleinsäuresequenz, insbesondere zur Expression in einer Säugetier-/menschlichen Zelle, notwendig sind. Die verwendete Nukleinsäure kann in einem Vektor enthalten sein, der geeignet ist, die Expression der Nukleinsäuresequenz, die dem Peptid entspricht, in einer Zelle zu ermöglichen. Jedoch können die Nukleinsäuren auch verwendet werden, um eine antigenpräsentierende Zelle zu transformieren, die nicht auf klassische antigenpräsentierende Zellen, wie beispielsweise dendritische Zellen, beschränkt sein kann, so dass sie selbst die entsprechenden Proteine auf ihrer Zelloberfläche produzieren.
  • Der Begriff „Nukleinsäure”, wie er im Kontext der Erfindung verwendet wird, schließt „Polynukleotid”, „Oligonukleotid” und „Nukleinsäuremolekül” ein und bedeutet im Allgemeinen ein Polymer von DNA oder RNA, das einzelsträngig oder doppelsträngig, synthetisiert oder aus natürlichen Quellen (z. B. isoliert und/oder gereinigt) erhalten werden kann, die natürliche, nicht natürliche oder veränderte Nukleotide enthalten können und eine natürliche, nicht natürliche oder veränderte Internukleotidbindung enthalten können, wie eine Phosphoramidatbindung oder eine Phosphorothioatbindung anstelle der Phosphodiester zwischen den Nukleotiden eines unmodifizierten Oligonukleotids.
  • Es ist bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Nuldeinsäuren rekombinant sind. Wie er im Kontext der Erfindung verwendet wird, bezieht sich der Begriff „rekombinant” auf (i) Moleküle, die außerhalb lebender Zellen konstruiert werden, indem sie natürliche oder synthetische Nukleinsäuresegmente zu Nukleinsäuremolekülen verbinden, die sich in einer lebenden Zelle replizieren können, oder (ii) Moleküle, die aus der wie oben in (i) beschriebenen Replikation entstehen. Für die Zwecke der Erfindung kann die Replikation eine in vitro-Replikation oder eine in vivo-Replikation sein. Die Nukleinsäure kann jede Nukleotidsequenz umfassen, die für beliebige der TCRs, Polypeptide oder Proteine oder funktionelle Abschnitte oder funktionelle Varianten davon, die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, kodiert.
  • Weiterhin stellt die Erfindung einen Vektor bereit, der eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung, wie oben beschrieben, umfasst. Wünschenswerterweise ist der Vektor ein Expressionsvektor oder ein rekombinanter Expressionsvektor. Der Begriff ”rekombinanter Expressionsvektor” bezieht sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf ein Nukleinsäurekonstrukt, das die Expression einer mRNA, eines Proteins oder Polypeptids in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht. Der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung kann jeder geeignete rekombinante Expressionsvektor sein und kann verwendet werden, um jeden geeigneten Wirt zu transformieren oder zu transfizieren. Geeignete Vektoren umfassen diejenigen, die für die Vermehrung und Expansion oder für die Expression oder für Beides, wie Plasmide und Viren, entwickelt sind. Beispiele von tierischen Expressionsvektoren enthalten pEUK-Cl, pMAM und pMAMneo. Es ist bevorzugt, dass der rekombinante Expressionsvektor ein viraler Vektor, z. B. ein retroviraler Vektor, ist. Der rekombinante Expressionsvektor umfasst regulatorische Sequenzen, wie Transkriptions- und Translationsinitiations- und Terminationscodons, die spezifisch für den Typ der Wirtszelle (z. B. Bakterium, Pilz, Pflanze oder Tier) sind, in die der Vektor eingeführt werden soll und in der die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durchgeführt werden kann. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Vektor ein oder mehrere Markergene enthalten, die die Selektion von transformierten oder transfizierten Wirten ermöglichen. Der rekombinante Expressionsvektor kann einen nativen oder normativen Promotor umfassen, der operativ mit der Nukleotidsequenz verknüpft ist, die für die erfindungsgemäßen Konstrukte oder die Nukleotidsequenz kodiert, die komplementär zu der Nuldeotidsequenz ist oder mit dieser hybridisiert, die für die erfindungsgemäßen Konstrukte kodiert. Die Selektionen von Promotoren umfassen z. B. starke, schwache, induzierbare, gewebespezifische und entwicklungsspezifische Promotoren. Der Promoter kann ein nicht viraler Promoter oder ein viraler Promoter sein. Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können entweder für transiente Expression, für eine stabile Expression oder für beide konzipiert sein. Auch können die rekombinanten Expressionsvektoren für die konstitutive Expression oder für die induzierbare Expression hergestellt werden.
  • Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die ein Antigen-erkennendes Konstrukt gemäß der Erfindung umfasst. Im Speziellen umfasst die erfindungsgemäße Wirtszelle eine Nukleinsäure oder einen Vektor, wie oben beschrieben. Die Wirtszelle kann eine eukaryotische Zelle, z. B. Pflanze, Tier, Pilze oder Algen oder sie kann eine prokaryotische Zelle z. B. Bakterien oder Protozoen sein. Die Wirtszelle kann eine kultivierte Zelle oder eine primäre Zelle sein, d. h. direkt aus einem Organismus, z. B. einem Menschen, isoliert werden. Die Wirtszelle kann eine adhärente Zelle oder eine suspendierte Zelle sein, d. h. eine Zelle, die in Suspension wachst. Zur Herstellung eines rekombinanten TCRs, Polypeptids oder Proteins ist die Wirtszelle vorzugsweise eine Säugetierzelle. Am meisten bevorzugt ist, dass die Wirtszelle eine menschliche Zelle ist. Während die Wirtszelle von einem beliebigen Zelltyp, kann aus irgendeiner Art von Gewebe stammen und von irgendeiner Entwicklungsstufe sein kann, ist die Wirtszelle vorzugsweise ein peripherer Blutleukozyt (PBL) oder eine periphere mononukleäre Blutzelle (PBMC). Es ist weiter bevorzugt, dass die Wirtszelle eine T-Zelle ist. Die T-Zelle kann jede T-Zelle sein, wie eine kultivierte T-Zelle, z. B. eine primäre T-Zelle oder eine T-Zelle aus einer kultivierten T-Zelllinie, z. B. Jurkat, SupT1 usw., oder eine T-Zelle, die aus einem Säugetier erhalten wird, vorzugsweise eine T-Zelle oder T-Zell-Vorläufer von einem menschlichen Patienten. Wenn sie von einem Säugetier erhalten wird, kann die T-Zelle aus zahlreichen Quellen einschließlich, aber nicht beschränkt auf Blut, Knochenmark, Lymphknoten, Thymus oder anderen Geweben oder Flüssigkeiten erhalten werden. T-Zellen können auch angereichert oder aufgereinigt sein. Bevorzugt ist die T-Zelle eine menschliche T-Zelle. Es ist weiter bevorzugter, dass die T-Zelle eine T-Zelle ist, die aus einem Menschen isoliert wurde. Die T-Zelle kann jede beliebige Art von T-Zelle und in jeder Entwicklungsstufe sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf CD4-positive und/oder CD8-positive, CD4-positive T-Helfer-Zellen, z. B. Th1- und Th2-Zellen, CD8- positive T-Zellen (z. B. zytotoxische T-Zellen), Tumor-infiltrierende Zellen (TILs), T-Gedächtnis-Zellen, naive T-Zellen und dergleichen. Bevorzugt ist die T-Zelle eine CD8-positive T Zelle oder eine CD4-positive T-Zelle.
  • Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Wirtszelle ein Lymphozyt, vorzugsweise ein T-Lymphozyt, wie eine CD4-positive oder CD8-positive T-Zelle. Die Wirtszelle ist weiterhin vorzugsweise eine tumorreaktive T-Zelle, die fair COL6A3-exprimierende Tumorzellen spezifisch ist.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die im Kontext der Erfindung offenbarten Antigen-erkennenden Konstrukte, Nukleinsäuren, Vektoren, pharmazeutischen Zusammensetzungen und/oder Wirtszellen zur Verwendung in der Medizin. Die Verwendung in der Medizin umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform die Verwendung bei der Diagnose, Prävention und/oder Behandlung einer Tumorerkrankung, wie einer malignen oder gutartigen Tumorerkrankung. Die Tumorerkrankung ist beispielsweise eine durch die Expression von COL6A3 charakterisierte Tumorerkrankung in einer Krebs- oder Tumorzelle der Tumorerkrankung.
  • In Bezug auf die oben erwähnten medizinischen Anwendungen der Antigen-erkennenden Konstrukte und anderer daraus abgeleiteter Materialien kann der zu behandelnde und/oder zu diagnostizierende Krebs jegliche Krebsart sein, einschließlich eines akuten lymphatischen Krebses, einer akuten myeloischen Leukämie, eines alveolären Rhabdomyosarkoms, eines Knochenkrebses, Hirntumors, Brustkrebses, Krebses des Anus, Analkanals oder Anorektums, Krebses des Auges, Krebses des intrahepatischen Gallenganges, Krebses der Gelenke, Krebses des Halses, der Gallenblase oder des Pleuras, Krebses der Nase, des Nasenhohlraums oder des Mittelohres, Krebses der Mundhöhle, Krebses der Vagina, Krebses der Vulva, chronischer lymphatischen Leukämie, chronischer myeloischen Krebses, Darmkrebses, Speiseröhrenkrebses, Gebärmutterhalskrebses, gastrointestinalen Karzinoidtumors, Glioms, Hodgkin-Lymphoms, Krebs des Hypopharynx, Nierenkrebses, Kehlkopfkrebses, Leberkrebses, Lungenkrebses, des bösartigen Mesothelioms, Melanoms, multiplen Myeloms, Krebses des Nasopharynx, Non-Hodgkin-Lymphoms, Krebses des Oropharynx, Eierstockkrebses, Krebses des Penis, Bauchspeicheldrüsenkrebses, des Peritoneums, Omentums und Mesenterialkrebses, Pharynxkrebses, Prostatakrebses, Rektumkarzinoms, Nierenkrebses, Hautkrebses, Dünndarmkrebses, Weichgewebskrebses, Magenkrebses, Hodenkrebses, Schilddrüsenkrebses, Krebses des Uterus, Harnleiterkrebses und Harnblasenkrebses. Eine bevorzugte Krebsart ist Krebs ist Krebs des Gebärmutterhalses, Oropharynx, Anus, Analkanal, Anorektum, Vagina, Vulva oder Penis. Eine besonders bevorzugte Krebsart ist ein COL6A3-positiver Krebs, umfassend gastrointestinalen und Darmkrebs.
  • Die Konstrukte, Proteine, TCR-Antikörper, Polypeptide und Nukleinsäuren der Erfindung sind insbesondere zur Verwendung in der Immuntherapie, vorzugsweise in der Adoptiv-T-Zelltherapie geeignet. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann beispielsweise die Infusion von erfindungsgemäßen T-Zellen in den Patienten einbeziehen. Vorzugsweise sind solche T-Zellen autologe T-Zellen des Patienten, die in vitro mit einem Nukleinsäure- oder Antigen-erkennenden Konstrukt der vorliegenden Erfindung transduziert wurden.
  • Die Aufgabe der Erfindung wird auch durch ein Verfahren zur Herstellung einer Expressionszelllinie des COL6A3-spezifischen Antigen-erkennenden Konstruktes gelöst, das Verfahren umfassend
    • a. Bereitstellung einer geeigneten Wirtszelle,
    • b. Bereitstellung eines genetischen Konstrukts umfassend eine kodierende Sequenz, die ein Antigen-erkennende Konstrukt gemäß der hier offenbarten Erfindung kodiert,
    • c. Einführung des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle, und
    • d. Expression des genetischen Konstrukts durch die geeignete Wirtszelle.
  • Das Verfahren kann ferner einen Schritt der Zelloberflächenpräsentation des Antigenerkennenden Konstrukts auf der geeigneten Wirtszelle umfassen.
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das genetische Konstrukt ein Expressionskonstrukt, das eine Promotorsequenz umfasst, die operativ mit der kodierenden Sequenz verknüpft ist.
  • Vorzugsweise ist das Antigen-erkennende Konstrukt des Saugetier-Ursprungs, vorzugsweise des menschlichen Ursprungs. Die bevorzugte geeignete Wirtszelle zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung ist eine Säugetierzelle, wie eine menschliche Zelle, insbesondere ein menschlicher T-Lymphozyt. T-Zellen für die Verwendung in der Erfindung sind oben ausführlich beschrieben.
  • Ebenfalls sind von der Erfindung Ausführungsformen umfasst, wobei das Antigen-erkennende Konstrukt ein modifiziertes TCR ist, wobei die Modifikation die Zugabe von funktionellen Domänen ist, wie beispielsweise eine Markierung oder eine therapeutisch wirksame Substanz. Weiterhin sind TCRs mit alternativen Domänen wie einer alternativen Membran-Anker-Domäne anstelle der endogenen Transmembranregion umfasst.
  • Wünschenswerterweise ist das Transfektionssystem zum Einführen des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle ein retrovirales Vektorsystem. Solche Systeme sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist in einer Ausführungsform der zusätzliche Verfahrensschritt der Isolierung und Reinigung des Antigen-erkennenden Konstrukts aus der Zelle und gegebenenfalls der Rekonstitution der translatierten Fragmente des Antigenerkennenden Konstrukts in einer T-Zelle.
  • In einem alternativen Aspekt der Erfindung wird eine T-Zelle bereitgestellt, die durch ein Verfahren zur Herstellung eines T-Zellrezeptors (TCR) erhalten wird, der für Tumorzellen spezifisch ist und eine hohe Avidität aufweist, wie oben beschrieben. Eine solche T-Zelle hängt von der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Wirtszelle ab, beispielsweise einer menschlichen oder nicht-menschlichen T-Zelle, vorzugsweise einem humanen TCR.
  • Die erfindungsgemäßen TCRs, Polypeptide, Proteine (einschließlich funktionelle Varianten davon), Nukleinsäuren, rekombinante Expressionsvektoren, Wirtszellen (einschließlich Populationen davon) und Antikörper (einschließlich Antigenbindungsabschnitte davon) können isoliert und/oder aufgereinigt werden. Der Begriff „isoliert”, wie er im Kontext der Erfindung verwendet wird, bedeutet ”aus der natürlichen Umgebung entfernt”. Der Begriff „aufgereinigt”, wie er im Kontext der Erfindung verwendet wird, bedeutet in eine höhere Reinheit überführt, wobei „Reinheit” ein relativer Begriff ist und nicht notwendigerweise als absolute Reinheit aufgefasst werden soll. Die Reinheit kann beispielsweise etwa 50% sein, kann größer als 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder kann 100% sein.
  • Die erfindungsgemäßen Antigen-erkennenden Konstrukte, TCRs, Polypeptide, Proteine (einschließlich funktioneller Varianten davon), Nukleinsäuren, rekombinante Expressionsvektoren, Wirtszellen (einschließlich Populationen davon) und Antikörper (einschließlich Antigen-Bindungsabschnitten davon), von denen alle gemeinsam im Folgenden als „erfindungsgemäße TCR-Materialien” bezeichnet werden, können in einer Zusammensetzung, wie einer pharmazeutische Zusammensetzung, formuliert werden. In dieser Hinsicht stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die jegliches der Antigen-erkennenden Konstrukte, TCRs, Polypeptide, Proteine, funktionelle Abschnitte, funktionelle Varianten, Nukleinsäuren, Expressionsvektoren, Wirtszellen (einschließlich Populationen davon) und Antikörper (einschließlich Antigen-bindende Abschnitte davon umfasst), die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff und/oder Stabilisator. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die ein beliebiges der erfindungsgemäßen TCR-Materialien enthalten, können mehr als ein erfindungsgemäßes TCR-Material umfassen, z. B. ein Polypeptid und eine Nukleinsäure oder zwei oder mehr verschiedener TCRs (einschließlich funktioneller Abschnitte und funktionelle Varianten davon). Alternativ kann die pharmazeutische Zusammensetzung ein erfindungsgemäßes TCR-Material in Kombination mit anderem(n) pharmazeutischen Wirkstoff(en) oder Arzneimittel(n) wie chemotherapeutischen Mitteln, z. B. Asparaginase, Busulfan, Carboplatin, Cisplatin, Daunorubicin, Doxorubicin, Fluorouracil, Gemcitabin, Hydroxyharnstoff, Methotrexat, Paclitaxel, Rituximab, Vinblastin, Vincristin usw. umfassen. Bevorzugt ist der Träger ein pharmazeutisch akzeptabler Träger. In Bezug auf pharmazeutische Zusammensetzungen kann der Träger irgendeiner von denen sein, die üblicherweise für das jeweilige erfindungsgemäße TCR-Material verwendet werden. Solche pharmazeutisch akzeptablen Träger sind dem Fachmann gut bekannt und stehen der Öffentlichkeit leicht zur Verfügung. Es ist bevorzugt, dass der pharmazeutisch akzeptable Träger einer ist, der unter den Verwendungsbedingungen keine nachteiligen Nebenwirkungen oder Toxizität aufweist.
  • So wird auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die jedes der im Kontext beschriebenen Produkte der Erfindung und TCR-Materialien der Erfindung umfasst, insbesondere alle Proteine, Nukleinsäuren oder Wirtszellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die pharmazeutische Zusammensetzung für die Immuntherapie, vorzugsweise Adoptivzelltherapie vorgesehen.
  • Es ist bevorzugt, dass das erfindungsgemäße TCR-Material durch Injektion, z. B. intravenös, verabreicht wird. Wenn das erfindungsgemäße TCR-Material eine Wirtszelle ist, die das erfindungsgemäße TCR (oder eine funktionelle Variante davon) exprimiert, kann der pharmazeutisch akzeptable Träger für die Zellen zur Injektion jeden isotonischen Träger, wie z. B. normale Kochsalzlösung (etwa 0,90% w/v, NaCl in Wasser, etwa 300 mOsm/l NaCl in Wasser oder etwa 9,0 g NaCl pro Liter Wasser), NORMOSOL R-Elektrolytlösung (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), etwa 5 % Dextrose im Wasser oder Ringer-Laktat enthalten. In einer Ausführungsform wird der pharmazeutisch akzeptable Träger mit humanem Serumalbumin ergänzt.
  • Für die Zwecke der Erfindung kann die Menge oder Dosis (z. B. Anzahl von Zellen, wenn das erfindungsgemäße TCR-Material eine oder mehrere Zellen ist) des erfindungsgemäßen TCR-Materials ausreichend sein, um z. B. eine therapeutische oder prophylaktische Antwort in dem Subjekt oder Tier über einen angemessenen Zeitrahmen zu beeinflussen. Beispielsweise sollte die Dosis des erfindungsgemäßen TCR-Materials ausreichend sein, um an ein Krebsantigen zu binden oder Krebs in einer Zeitspanne von etwa 2 Stunden oder länger, z. B. 12 bis 24 oder mehr Stunden, von der Zeit an, an der es verabreicht wurde, zu detektieren, zu behandeln oder zu verhindern. In bestimmten Ausführungsformen kann der Zeitraum noch länger sein. Die Dosis wird durch die Wirksamkeit des speziellen erfindungsgemäßen TCR-Materials und den Zustand des Tieres (z. B. Menschen) sowie des Körpergewichtes des zu behandelnden Tieres (z. B. Menschen) bestimmt.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, TCRs (einschließlich funktioneller Varianten davon), Polypeptide, Proteine, Nukleinsäuren, rekombinante Expressionsvektoren, Wirtszellen oder Populationen von Zellen in Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Krebs oder COL6A3-positiver Krankheitsvorstufe verwendet werden können Es wird angenommen, dass die erfindungsgemäßen TCRs (und funktionelle Varianten davon) spezifisch an das COL6A3-Antigen binden, so dass das TCR (oder verwandte erfindungsgemäße Polypeptid oder Protein und funktionelle Varianten davon), wenn es durch eine Zelle exprimiert wird, in der Lage ist, eine Immunantwort gegen eine Zielzelle zu vermitteln, die die COL6A3-Antigene der Erfindung exprimiert. In dieser Hinsicht stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung eines Zustands, insbesondere Krebses, bei einem Säugetier bereit, umfassend die Verabreichung an das Säugetier einer der pharmazeutischen Zusammensetzungen, Antigen-erkennende Konstrukte, insbesondere TCRs (und funktionelle Varianten davon), Polypeptide oder Proteine, die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, einer beliebigen Nukleinsäure oder einen beliebigen rekombinanten Expressionsvektor, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die für einen beliebigen der TCRs (und funktionelle Varianten davon) kodiert, Polypeptide, Proteine, die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, oder eine beliebige Wirtszelle oder Population von Zellen, die einen rekombinanten Vektor umfassen, der ein beliebiges der im Kontext beschriebenen Konstrukte der Erfindung (und funktionelle Varianten davon) kodiert, Polypeptide oder Proteine in einer Menge, die wirksam ist, um den Zustand in dem Säugetier zu behandeln oder zu verhindern, wobei der Zustand Krebs, vorzugsweise COL6A3-positiver Krebs ist.
  • Beispiele für pharmazeutisch akzeptable Träger oder Verdünnungsmittel, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Stabilisatoren wie SPGA, Kohlenhydrate (z. B. Sorbit, Mannit, Stärke, Saccharose, Glukose, Dextran), Proteine wie Albumin oder Casein, Protein enthaltende Mittel, wie Rinderserum oder Magermilch und Puffer (z. B. Phosphatpuffer).
  • Die Begriffe „behandeln” und „verhindern” sowie Wörter, die daraus stammen, wie sie im Kontext der Erfindung verwendet werden, bedeuten nicht notwendigerweise 100%-ige oder vollständige Behandlung oder Prävention. Vielmehr gibt es unterschiedliche Behandlungs- oder Vorbeugunggrade, von denen der durchschnittliche Fachmann den potentiellen Nutzen oder therapeutischen Effekt erkennt. In dieser Hinsicht können die erfindungsgemäßen Verfahren jede beliebige Menge jeder beliebigen Behandlungs- oder Vorbeugungsstufe eines Zustandes bei einem Säugetier bereitstellen. Weiterhin kann die Behandlung oder Vorbeugung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren bereitgestellt wird, die Behandlung oder Vorbeugung einer oder mehrerer Zustande oder Symptome des zu behandelnden oder vorzubeugenden Zustands, z. B. Krebs, einschließen. Zum Beispiel kann die Behandlung oder Vorbeugung die Förderung der Regression eines Tumors einschließen. Auch kann die ”Vorbeugung” für die Zwecke der Erfindung die Verzögerung des Beginns des Zustandes oder eines Symptoms oder eines Zustandes davon umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Krebs, umfassend die Verabreichung eines TCR, einer Nukleinsäure oder einer Wirtszelle der vorliegenden Beschreibung in Kombination mit mindestens einem chemotherapeutischen Mittel und/oder einer Strahlentherapie.
  • Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs bei einem Subjekt, der diese benötigt, umfassend:
    • a) Isolierung einer Zelle aus dem Subjekt;
    • b) Transformieren der Zelle mit mindestens einem Vektor, der ein Antigen-erkennendes Konstrukt der vorliegenden Erfindung kodiert, um eine transformierte Zelle zu erzeugen;
    • c) Vermehrung der transformierten Zelle, um eine Vielzahl von transformierten Zellen zu erzeugen; und
    • d) Verabreichen der Vielzahl von transformierten Zellen an das Subjekt.
  • Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs bei einem Subjekt, der diese benötigt, umfassend:
    • a) Isolierung einer Zelle von einem gesundem Spender
    • b) Transformieren der Zelle mit mindestens einem Vektor, der ein Antigen-erkennendes Konstrukt der vorliegenden Erfindung kodiert, um eine transformierte Zelle zu erzeugen;
    • c) Vermehrung der transformierten Zelle, um eine Vielzahl von transformierten Zellen zu erzeugen; und
    • d) Verabreichen der Vielzahl von transformierten Zellen an das Subjekt.
  • Ebenfalls wird ein Verfahren zum Nachweis von Krebs in einer biologischen Probe bereitgestellt, das Verfahren umfassend:
    • a) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einem Antigen-erkennenden Konstrukt der vorliegenden Beschreibung;
    • b) Nachweisen der Bindung des Antigen-erkennenden Konstrukts mit der biologischen Probe.
  • In einigen Ausführungsformen wird das Verfahren zum Nachweis von Krebs in vitro, in vivo oder in situ durchgeführt.
  • Ebenfalls vorgesehen ist ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Zustandes bei einem Säugetier. Das Verfahren umfasst (i) Inkontaktbringen einer Probe, die eine oder mehrere Zellen aus dem Säugetier umfasst, mit einem beliebigen der erfindungsgemäßen TCRs (und funktionellen Varianten davon), Polypeptiden, Proteinen, Nukleinsäuren, rekombinanten Expressionsvektoren, Wirtszellen, Populationen von Zellen, Antikörpern oder Antigen-bindenden Abschnitten davon oder mit pharmazeutischen Zusammensetzungen, die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, wodurch ein Komplex gebildet wird und der Komplex nachgewiesen wird, wobei der Nachweis des Komplexes das Vorhandensein des Zustandes in dem Säugetier anzeigt, wobei der Zustand Krebs ist, so wie eine COL6A3-positive bösartige Erkrankung.
  • In Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines Zustandes bei einem Säugetier kann die Probe von Zellen eine Probe sein, die ganze Zellen, Lysate davon oder einen Anteil der gesamten Zelllysate, z. B. eine nukleare oder zytoplasmatische Fraktion, eine ganze Proteinfraktion oder eine Nukleinsäurefraktion umfasst.
  • Für die Zwecke des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens kann das Inkontaktbringen in vitro oder in vivo in Bezug auf das Säugetier erfolgen. Bevorzugt ist das Inkontaktbringen in vitro.
  • Auch kann der Nachweis des Komplexes durch eine beliebige Anzahl von in der Technik bekannten Möglichkeiten erfolgen. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Antigenerkennenden Konstrukte (und funktionelle Varianten davon), Polypeptide, Proteine, Nukleinsäuren, rekombinante Expressionsvektoren, Wirtszellen, Populationen von Zellen oder Antikörpern oder TCRs oder Antigen-bindende Abschnitte davon, die im Kontext beschrieben sind, mit einem detektierbaren Marker wie z. B. einem Radioisotop, einem Fluorophor (z. B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE)), einem Enzym (z. B. alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase) und Elementpartikeln (z. B. Goldpartikel) markiert werden.
  • Für die Zwecke der erfindungsgemäßen Verfahren, bei denen Wirtszellen oder Populationen von Zellen verabreicht werden, können die Zellen Zellen sein, die in Bezug auf Säugetier allogen oder autolog sind. Es ist bevorzugt, dass die Zellen zu dem Säugetier autolog sind.
  • In Bezug auf die oben erwähnten medizinischen Anwendungen des TCR-Materials kann der zu behandelnde und/oder zu diagnostizierende Krebs jegliche Krebsart sein, einschließlich eines akuten lymphatischen Krebses, einer akuten myeloischen Leukämie, eines alveolären Rhabdomyosarkoms, eines Knochenkrebses, Hirntumors, Brustkrebses, Krebses des Anus, Analkanal oder Anorektum, Krebses des Auges, Krebses des intrahepatischen Gallenganges, Krebses der Gelenke, Krebses des Halses, Gallenblase oder Pleura, Krebses der Nase, Nasenhohlraum oder des Mittelohres, Krebses der Mundhöhle, Krebses der Vagina, Krebses der Vulva, chronischer lymphatischen Leukämie, chronischer myeloischen Krebs, Darmkrebses, Speiseröhrenkrebses, Gebärmutterhalskrebses, gastrointestinalen Karzinoidtumors, Glioms, Hodgkin-Lymphoms, Krebses des Hypopharynx, Nierenkrebses, Kehlkopfkrebses, Leberkrebses, Lungenkrebses, bösartigen Mesotheliomes, Melanoms, multiplen Myeloms, Krebses des Nasopharynx, Non-Hodgkin-Lymphoms, Krebses des Oropharynx, Eierstockkrebses, Krebses des Penis, Bauchspeicheldrüsenkrebses, Peritoneums, Omentums und Mesenterialkrebses, Pharynxkrebses, Prostatakrebses, Rektumkarzinoms, Nierenkrebses, Hautkrebses, Dünndarmkrebses, Weichgewebskrebses, Magenkrebses, Hodenkrebses, Schilddrüsenkrebses, Krebses des Uterus, Harnleiterkrebses und Harnblasenkrebses. Eine bevorzugte Krebsart ist Krebs ist Krebs des Gebärmutterhalses, Oropharynx, Anus, Analkanal, Anorektum, Vagina, Vulva oder Penis. Eine besonders bevorzugte Krebsart ist ein COL6A3-positiver Krebs, so wie gastrointestinaler Krebs und Darmkrebs.
  • Im Allgemeinen stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts bereit, das an einem Tumor oder einer Tumorerkrankung leidet, umfassend die Verabreichung der Antigen-erkennenden Konstrukte, Nukleinsäuren, Vektoren, pharmazeutischen Zusammensetzungen und/oder Wirtszellen, wie durch die vorliegende Erfindung offenbart. Vorzugsweise ist das Subjekt ein Subjekt, das eine solche Behandlung benötigt. Der Gegenstand in bevorzugten Ausführungsformen ist ein Säugetier-Subjekt, vorzugsweise ein menschlicher Patient, der an einem Tumor oder einer Tumorerkrankung leidet, die COL6A3-positiv ist.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen mit Referenz zu den begleitenden Abbildungen und Sequenzen beschrieben, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist zitierte Literatur durch Referenz vollständig eingeschlossen. In den Abbildungen und den Sequenzen:
  • : IFNγ-Freisetzung (linke Achse) und HLA-A* 02/COL6A3-002 Tetramerfärbung (rechte Achse) menschlicher primärer CD8+ T-Zellen eines Spenders, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R4P1D10 (Tabelle 1) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit K562-A2 Zielzellen (siehe Hirano N. et al; Blood. 2006 Feb 15; 107 (4): 1528–36) beladen mit COL6A3-002 Peptid (SEQ ID NO: 58), verschiedenen Substitutionsvarianten von COL6A3-002 Alanin oder Glycin an den Positionen 1–9 von (SEQ ID NO: 59–67), oder dem NYESO1-001 Kontrollpeptid (SEQ ID NO: 68).
  • : IFNγ-Freisetzung (linke Achse) und HLA-A*02/COL6A3-002 Tetramerfärbung (rechte Achse) menschlicher primärer CD8+ T-Zellen eines Spenders, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R4P1D10 (Tabelle 1) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit K562-A2 Zielzellen beladen mit COL6A3-002 Peptid (SEQ ID NO: 58), homologen aber nicht verwandten Peptiden AGRN-001, CLASP-001, COL6A1-001, COL6A2-001, COL6A3-006, COL6A3-008, COL6A3-014, VWA2-001, VWF-001 (SEQ ID NO: 49–57) oder dem NYESO1-001 Kontrollpeptid (SEQ ID NO: 68). Elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten nur als Kontrolle (nur E).
  • : HLA-A*02/COL6A3-002-Tetramer bzw. HLA-A*02/NYESO1-001-Tetramerfärbung von J.RT3-T3.5-Zellen, die mit einer alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R4P1D10 oder NYESO1-001-spezifischen Kontrolle-TCR 1G4 (Tabelle 1) elektroporiert wurden. Pseudo-elektroporierte J.RT3-T3.5-Zellen dienten als Kontrolle.
  • : HLA-A*02/COL6A3-002-Tetramer bzw. HLA-A*02/NYESO1-001-Tetramerfärbung von SUP-T1, die mit einer alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R4P1D10 oder NYESO1-001-spezifischen Kontrolle-TCR 1G4 (Tabelle 1) elektroporiert wurden. Mock-elektroporierte SUP-T1-Zellen dienten als Kontrolle.
  • : HLA-A*02/COL6A3-002-Tetramer bzw. HLA-A*02/NYESO1-001-Tetramerfärbung von humanen primären CD8+ T-Zellen eines Spenders, die mit einer alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R4P1D10 oder NYESO1-001-spezifischen Kontrolle-TCR 1G4 (Tabelle 1) elektroporiert wurden. Mock-elektroporierte primäre CD8+ Zellen dienten als Kontrolle.
  • : IFNγ-Freisetzung menschlicher primärer CD8+ T-Zellen eines Spenders, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R4P3F9 (Tabelle 1) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit K562-A2-Zielzellen, COL6A3-002 Peptid (SEQ ID NO: 58), verschiedenen COL6A3-002 Alanin oder Glycin Substitutionsvarianten an den Positionen 1–9 von (SEQ ID NO: 59–67), oder dem NYESO1-001 Kontrollpeptid (SEQ ID NO: 68).
  • : IFNγ-Freisetzung menschlicher primärer CD8+ T-Zellen eines Spenders, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R4P3F9 (Tabelle 1) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit K562-A2 Zielzellen, COL6A3-002 Peptid (SEQ ID NO: 58), homologen, aber nicht verwandten Peptiden AGRN-001, CLASP-001, COL6A1-001, COL6A2-001, COL6A3-006, COL6A3-008, COL6A3-014, VWA2-001, VWF-001 (SEQ ID NO: 49–57) oder dem NYESO1-001 Kontrollpeptid (SEQ ID NO: 68). Mock-elektroporierte primäre CD8+ Zellen dienten als Kontrolle (nur E).
  • : HLA-A*02/COL6A3-002-Tetramer und HLA-A*02/NYESO1-001-Tetramerfärbung von J.RT3-T3.5 Zellen, die mit einer alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R4P3F9 oder NYESO1-001-spezifischen Kontrolle-TCR 1G4 (Tabelle 1) elektroporiert wurden. Mock-elektroporierte J.RT3-T3.5 Zellen dienten als Kontrolle.
  • : HLA-A*02/COL6A3-002-Tetramer bzw. HLA-A*02/NYESO1-001-Tetramerfärbung von SUP-T1-Zellen, die mit einer alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R4P3F9 oder NYESO1-001-spezifischen Kontrolle-TCR 1G4 (Tabelle 1) elektroporiert wurden. Mock-elektroporierte SUP-T1-Zellen dienten als Kontrolle.
  • : IFNγ-Freisetzung menschlicher primärer CD8+ T-Zellen eines Spenders, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R4P3H3 (Tabelle 1) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit K562-A2 Zielzellen, beladen mit dem COL6A3-002 Peptid (SEQ ID NO: 58), verschiedenen COL6A3-002 Alanin oder Glycin Substitutionsvarianten an den Positionen 1–9 von (SEQ ID NO: 59–67), oder dem NYESO1-001 Kontrollpeptid (SEQ ID NO: 68).
  • : IFNγ-Freisetzung menschlicher primärer CD8+ T-Zellen eines Spenders, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R4P3H3 (Tabelle 1) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit K562-A2 Zielzellen, beladen mit dem COL6A3-002 Peptid (SEQ ID NO: 58), homologen, aber nicht verwandten Peptiden AGRN-001, CLASP-001, COL6A1-001, COL6A2-001, COL6A3-006, COL6A3-008, COL6A3-014, VWA2-001, VWF-001 (SEQ ID NO: 49–57) oder dem NYESO1-001 Kontrollpeptid (SEQ ID NO: 68). Mockelektroporierte primäre CD8+ Zellen dienten als Kontrolle (nur E).
  • : HLA-A*02/COL6A3-002-Tetramer und HLA-A*02/NYESO1-001-Tetramerfärbung von SUP-T1-Zellen, die mit einer alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R4P3H3 oder NYESO1-001-spezifischen Kontrolle-TCR 1G4 (Tabelle 1) elektroporiert wurden. Mock-elektroporierte SUP-T1-Zellen dienten als Kontrolle. Tabelle 1: Erfindungsgemäße TCR-Sequenzen
    Figure DE102016115246B3_0002
    Figure DE102016115246B3_0003
    Figure DE102016115246B3_0004
    Figure DE102016115246B3_0005
    Figure DE102016115246B3_0006
    Tabelle 2: Erfindungsgemäße Peptidsequenzen
    Figure DE102016115246B3_0007
    Figure DE102016115246B3_0008
  • BEISPIELE
  • In einem Aspekt werden allo-reaktive Bedingungen verwendet, um Selbstverträglichkeit zu umgehen und T-Zellen mit einer höheren Avidität zu erhalten, wenn sie mit T-Zellen verglichen werden, die aus autologen Einstellungen, d. h. Patienten, abgeleitet sind. Beispiele für solche Einstellungen umfassen die in vitro-Erzeugung von allo-HLA-reaktiven, peptidspezifischen T-Zellen (Sadovnikova et al. 1998; Savage et al. 2004; Wilde et al. 2012), und Immunisierung von Mäusen, die für menschliches MHC oder menschliches TCR transgen sind (Stanislawski et al. 2001; Li et al. 2010), von denen jede durch Referenz vollständig eingeschlossen wird.
  • Um hochavide T-Zellen aus allo-reaktiver Einstellung zu isolieren, werden PBMCs von HLA-A*02-negativen gesunden Spender nach Erhalt einer informierten Zustimmung verwendet. Rekombinante biotinylierte HLA-A*02-Klasse-I-Monomere und A2-Fluoreszenz-Tetramere, die COL6A3-002 enthalten, werden von MBLI (Woburn, MA) erhalten. PBMCs werden mit anti-CD20SA, die in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur verdünnt wurden, inkubiert, gewaschen und mit den biotinylierten HLA-A*02/COL6A3-002-Monomeren für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gewaschen und mit 3 × 106 Zellen/Well in 24-Well-Platten in RPMI mit 10% humanem AB-Serum plattiert. Interleukin 7 (IL-7; R & D Systems, Minneapolis, MN) wurde am Tag 1 bei 10 ng/ml zugegeben und IL-2 (Chiron, Harefield, Vereinigtes Königreich) wurde am Tag 4 bei 10 U/ml zugegeben. Über einen Zeitraum von 5 Wochen wurden die Zellen wöchentlich mit frischen PBMCs restimuliert, mit Responderzellen im Verhältnis 1:1 gemischt und mit 3 × 106/Well in 24-Well-Platten plattiert.
  • Um hochavide T-Zellen zu erhalten, wurden etwa 106 PBMCs mit HLA-A*02/COL6A3-002 Tetramer-Phycoerythrin (PE) (erhalten von MBLI) für 30 Minuten bei 37°C inkubiert, gefolgt von anti-CD8-Fluoresceinisothiocyanat (FITC)/Allophycocyanin (APC) für 20 Minuten bei 4°C, gefolgt von einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung. Die sortierten Tetramerpositiven Zellen wurden in 24-Well-Platten unter Verwendung von 2 × 105 sortierten Zellen, 2 × 106 bestrahlten A2-negativen PBMCs als Feeder, 2 × 104 CD3/CD28 beads/mL (Dynal, Oslo Norwegen) und IL-2 (1000 U/mL) expandiert. Die so erhaltenen T-Zellen mit hoher Avidität wurden dann verwendet, um TCRs unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren zu identifizieren und zu isolieren, wie z. B. Einzelzelle 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Nicht-redundante TCR-DNAs wurden dann bezüglich der Aminosäure-/DNA-Sequenzbestimmung und Klonierung in Expressionsvektoren analysiert.
  • Drei COL6A3-002-spezifische TCRs (R4PID10, R4P3F9 und R4P3H3, siehe Tabelle 2), jede kodierende tumorspezifische TCR-alpha- und TCR-beta-Ketten wurden aus T-Zellen von gesunden Spender isoliert und amplifiziert. Zellen von gesunden Spender wurden in vitro nach einem zuvor beschriebenen Verfahren stimuliert (Walter et al., 2003 J Immunol., Nov 15; 171(10): 4974–8). Die COL6A3-Peptidpräsentation wurde, wie zuvor beschrieben, durchgeführt (Hirano N. et al; Blood. 2006 Feb 15; 107(4): 1528–36). Zielspezifische Zellen wurden mit HLA-A*02-Multimeren einzelzellig sortiert und dann für die anschließende TCR-Isolierung verwendet. TCR-Sequenzen wurden über 5'-RACE durch Standardverfahren, wie z. B. in Molecular Cloning a laboratory manual fourth edition by Green and Sambrook beschrieben, isoliert. Die alpha- und beta-variablen Regionen der TCRs R4P1D10, R4P3F9 und R4P3H3 wurden sequenziert und für eine weitere funktionelle Charakterisierung kloniert.
  • R4P1D10 und R4P3H3 werden von HLA-A*02-positiven Spender abgeleitet und R4P3F9 wird von einem HLA-A*02-negativen Spender (allo-reaktive Einstellung) abgeleitet. Tabelle 3: SPR-Affinität von COL6A3-002 und NYESO1-001 TCRs
    TCR Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) für HLA-A02/COL6A3-002-Komplex in μM Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) für HLA-A02/NYESO1-001-Komplex in μM
    R4P1D10 16 Keine Bindung
    R4P3F9 62 Keine Bindung
    R4P3H3 102 Keine Bindung
    1G4 Keine Bindung 7
  • Beispiel 1: T-Zellrezeptor R4P1D10
  • Die TCR R4P1D10 alpha- und beta-Ketten wurden, wie es zuvor, beispielsweise im US-Patent 8 519 100 beschrieben ist, kloniert, das hiermit durch Referenz in seiner Gesamtheit in Bezug auf die Verfahren aufgenommen wird.
  • TCR R4P1D10 ist auf das HLA-A2-präsentierte COL6A3-002 beschränkt (siehe Tabelle 3 oben). Tabelle 4: Merkmale der R4P1D10 alpha-Kette:
    Figure DE102016115246B3_0009
    Tabelle 5: Merkmale der R4P1D10 beta-Kette:
    Figure DE102016115246B3_0010
    Figure DE102016115246B3_0011
  • R4P1D10 erkennt spezifisch COL6A3-002, weil menschliche primäre CD8+ T-Zellen, welche diesen TCR erneut exprimieren, nach der Ko-Inkubation mit HLA-A*02+ Zielzellen IFNγ freisetzen bzw. HLA-A*02-Tetramere binden, sie sind entweder mit COL6A3-002-Peptid- oder Alanin- und Glycin-Substitutionsvarianten von COL6A3-002 ( ) oder verschiedenen Peptiden, die einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit zu COL6A3-002 zeigen ( ), beladen. Das NYESO1-001 Peptid wird als negative Kontrolle verwendet.
  • Die Re-Expression von R4P1D10 führt zu einer selektiven Bindung von HLA-A*02/COL6A3-002-Tetrameren, aber nicht von HLA-A*02/NYESO1-001-Tetrameren in der Zelllinie J.RT3-T3.5 Jurkat ( ), SUP-T1-Zellen ( ) und primären humanen CD8+ T-Zellen ( ). Für jeden Zelltyp wird die Re-Expression des NYESO1-001-spezifischen TCR 1G4 und die Mock-Expression als Kontrolle verwendet.
  • SPR (Surface Plasmon Resonance, Oberflächenplasmonresonanz)-Bindungsanalyse für R4P110, exprimiert als löslicher TCR gemäß einem zuvor beschriebenen Verfahren (Willcox BE et al., 1999 Protein Sci., Nov; 8 (11): 2418–23), und der HLA-A*02/COL6A3-002-Komplex zeigt eine Affinität von KD = 16 μM (Tabelle 3). SPR-Bindungsdaten für 1G4 TCR und HLA-A*02/NYESO1-001 werden als Kontrolle benutzt.
  • Beispiel 2: T-Zellrezeptor R4P3F9
  • Die TCR R4P3F9 alpha- und beta-Ketten wurden, wie zuvor, beispielsweise im US-Patent 8 519 100 beschrieben ist, kloniert, das durch Referenz in seiner Gesamtheit in Bezug auf die Verfahren aufgenommen wird.
  • TCR R4P3F9 ist auf das HLA-A2-präsentierte COL6A3-002 beschränkt (siehe Tabelle 3 oben). Tabelle 6: Merkmale der R4P3F9 alpha-Kette
    Figure DE102016115246B3_0012
    Tabelle 7: Merkmale der R4P3F9 beta-Kette
    Figure DE102016115246B3_0013
    Figure DE102016115246B3_0014
  • R4P3F9 erkennt spezifisch COL6A3-002 als menschliche primäre CD8+ T-Zellen, diese setzen TCR IFNγ nach Ko-Inkubation mit HLA-A*02+ Zielzellen frei, die entweder mit COL6A3-002-Peptid- oder Alanin- und Glycin-Substitutionsvarianten geladen wurden, erneut exprimieren, COL6A3-002 ( ) oder verschiedene Peptide, die einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit zu COL6A3-002 zeigen ( ). Das NYESO1-001 Peptid wird als negative Kontrolle verwendet.
  • Die Re-Expression von R4P3F9 führt zu einer selektiven Bindung von HLA-A*02/COL6A3-002-Tetramern, aber nicht von HLA-A*02/NYESO1-001-Tetrameren in J.RT3-T3.5 Jurkat Zellen ( ) und SUP-T1-Zellen ( ). Für jeden Zelltyp wird die Re-Expression des NYESO1-001-spezifischen TCR 1G4 und die Mock-Expression als Kontrolle verwendet.
  • SPR-Bindungsanalyse für R4P3F9, exprimiert als lösliches TCR gemäß einem zuvor beschriebenen Verfahren (Willcox BE et al., 1999 Protein Sci., Nov; 8 (11): 2418–23), und der HLA-A*02/COL6A3-002 Komplex zeigt eine Affinität von KD = 62 μM (Tabelle 3). SPR-Bindungsdaten für 1G4 TCR und HLA-A*02/NYESO1-001 werden als Kontrolle benutzt.
  • Beispiel 3: T-Zell Rezeptor R4P3H3
  • Die TCR R4P3H3 alpha- und beta-Ketten wurden, wie zuvor, beispielsweise im US-Patent 8 519 100 beschrieben ist, kloniert, das durch Referenz in seiner Gesamtheit aufgenommen wird.
  • TCR R4P3H3 ist auf das HLA-A2-präsentierte COL6A3-002 beschränkt (siehe Tabelle 3 oben). Tabelle 8: Merkmale der R4P3H3 alpha-Kette
    Figure DE102016115246B3_0015
    Tabelle 9: Merkmale der R4P3H3 beta-Kette
    Figure DE102016115246B3_0016
    Figure DE102016115246B3_0017
  • R4P3H3 erkennt spezifisch COL6A3-002 als menschliche primäre CD8+ T-Zellen, diese setzen TCR IFNγ nach Ko-Inkubation mit HLA-A*02+ Zielzellen frei, die entweder mit COL6A3-002-Peptid- oder Alanin- und Glycin-Substitutionsvarianten geladen wurden, erneut exprimieren, COL6A3-002 ( ) oder verschiedene Peptide, die einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit zu COL6A3-002 zeigen ( ). Das NYESO1-001 Peptid wird als negative Kontrolle verwendet.
  • Die Re-Expression von R4P3H3 führt zu einer selektiven Bindung von HLA-A*02/COL6A3-002-Tetrameren, aber nicht von HLA-A*02/NYESO1-001-Tetrameren in SUP-T1-Zellen ( ). Die Re-Expression des NYESO1-001-spezifischen TCR 1G4 und die Mock-Expression werden als Kontrolle verwendet.
  • SPR-Bindungsanalyse für R4P3H3, exprimiert als lösliches TCR gemäß einem zuvor beschriebenen Verfahren (Willcox BE et al., 1999 Protein Sci., Nov; 8(11): 2418–23), und der HLA-A*02/COL6A3-002 Komplex zeigt eine Affinität von KD = 102 μM (Tabelle 3). SPR-Bindungsdaten für 1G4 TCR und HLA-A*02/NYESO1-001 werden als Kontrolle benutzt. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure DE102016115246B3_0018
    Figure DE102016115246B3_0019
    Figure DE102016115246B3_0020
    Figure DE102016115246B3_0021
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    Figure DE102016115246B3_0040
    Figure DE102016115246B3_0041
    Figure DE102016115246B3_0042
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    Figure DE102016115246B3_0046
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (15)

  1. Ein Antigen-erkennendes Konstrukt, umfassend zumindest eine komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) 3 mit einer Sequenzidentität von zumindest 50% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID NOs. 3, 9, 15, 21, 27 und 33.
  2. Das Antigen-erkennende Konstrukt nach Anspruch 1, wobei das Antigen-erkennendes Konstrukt in der Lage ist, spezifisch und/oder selektiv an ein COL6A3 Antigenpeptid zu binden.
  3. Das Antigen-erkennende Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Antigen-erkennende Konstrukt ein Antikörper oder ein Derivat oder ein Fragment davon ist, oder ein T-Zellrezeptor (TCR) oder ein Derivat oder ein Fragment davon ist.
  4. Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend eine TCR α- oder γ-Kette; und/oder eine TCR β- oder δ-Kette; wobei die TCR α- oder γ-Kette einen CDR3 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 3, 15 und 27 umfasst, und/oder wobei die TCR β- oder δ-Kette einen CDR3 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 9, 21 und 33 umfasst.
  5. Das Antigen-erkennende Konstrukt nach Anspruch 4, wobei die TCR α- oder γ-Kette zusätzlich einen CDR1 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 1, 13 und 25; und/oder eine CDR2 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 2, 14 und 26 umfasst.
  6. Das Antigen-erkennende Konstrukt nach Anspruch 4 oder 5, wobei die TCR β- oder δ-Kette zusätzlich einen CDR1 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 7, 19 und 31; und/oder einen CDR2 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 8, 20 und 32 umfasst.
  7. Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend eine variable Kettenregion des TCRs mit einer Sequenzidentität von mindestens 50% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 4, 10, 16, 22, 28 und 34.
  8. Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend ein Bindungsfragment eines TCRs, und wobei das Bindungsfragment CDR1 bis CDR3 optional ausgewählt aus den CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nos. 1, 2, 3 oder 7, 8, 9 oder 13, 14, 15 oder 19, 20, 21 oder 25, 26, 27 oder 31, 32, 33 umfasst.
  9. Nukleinsäure, die ein Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.
  10. Vektor umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 9.
  11. Wirtszelle umfassend ein Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Nukleinsäure nach Anspruch 9 oder einen Vektor nach Anspruch 10, optional ist die Wirtszelle ein Lymphozyt, bevorzugt ein T-Lymphozyt oder T-Lymphozytvorläufer, weiter bevorzugt eine CD4 oder CD8 positive T-Zelle.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder die Nukleinsäure nach Anspruch 9 oder den Expressionsvektor nach Anspruch 10 oder die Wirtszelle nach Anspruch 11 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Stabilisator und/oder Hilfsstoff.
  13. Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Nukleinsäure nach Anspruch 9 oder ein Expressionsvektor nach Anspruch 10 oder eine Wirtszelle nach Anspruch 11 oder die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Verwendung in der Medizin, optional zur Verwendung in der Diagnose, Vorbeugung und/oder der Behandlung einer proliferativen Erkrankung.
  14. Verfahren zur Herstellung einer Zelllinie, die das COL6A3-spezifische Antigen-erkennende Konstrukt exprimiert, umfassend a. Bereitstellung einer geeigneten Wirtszelle, b. Bereitstellung eines genetischen Konstrukts umfassend eine kodierende Sequenz, die das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert, c. Einführung des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle, d. Expression des genetischen Konstrukts durch die geeignete Wirtszelle.
  15. Das Verfahren nach Anspruch 14, weiterhin umfassend die Isolierung und Aufreinigung des Antigen-erkennenden Konstrukts aus der geeigneten Wirtszelle und, optional, Rekonstitution des Antigen-erkennenden Konstrukts in eine T-Zelle.
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