CN113412277A - 针对含有g12r突变的ras的hla第ii类限制性t细胞受体 - Google Patents

针对含有g12r突变的ras的hla第ii类限制性t细胞受体 Download PDF

Info

Publication number
CN113412277A
CN113412277A CN202080010373.0A CN202080010373A CN113412277A CN 113412277 A CN113412277 A CN 113412277A CN 202080010373 A CN202080010373 A CN 202080010373A CN 113412277 A CN113412277 A CN 113412277A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
leu
ser
val
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080010373.0A
Other languages
English (en)
Inventor
拉米·约瑟夫
玛丽亚·R·帕克赫斯特
安娜·帕塞托
史蒂文·A·罗森伯格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
US Department of Health and Human Services
Original Assignee
US Department of Health and Human Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by US Department of Health and Human Services filed Critical US Department of Health and Human Services
Publication of CN113412277A publication Critical patent/CN113412277A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开一种经分离或经纯化的T细胞受体(TCR)，其中所述TCR对于在位置12处的甘氨酸经精氨酸取代的突变人类RAS氨基酸序列具有抗原特异性。还提供相关多肽及蛋白质，以及相关核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体及药物组合物。还公开检测哺乳动物中癌症存在的方法，及治疗或预防哺乳动物的癌症的方法。

Description

针对含有G12R突变的RAS的HLA第II类限制性T细胞受体
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2019年1月22日提交的美国临时专利申请第62/795,203号的权益，该申请通过引用整体并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在政府支持下由美国国立卫生研究院、国立癌症研究所在项目编号ZIABC010984下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
以电子方式提交的材料的引用并入
与本文同时提交并标识如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表通过引用整体并入本文：一个名为“746666_ST25.txt”的74,093字节ASCII(文本)文件，日期为2020年1月21日。
发明背景
一些癌症可具有极有限的治疗选择，尤其在癌症变得转移及不可切除时。尽管在诸如手术、化学疗法及辐射疗法等治疗中取得一定进展，但许多癌症(例如胰脏癌、结肠直肠癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌及前列腺癌)的预后可能较差。因此，存在对于其他癌症治疗的未满足需求。
发明内容
本发明的一实施方案提供经分离或经纯化的T细胞受体(TCR)，其中TCR对在位置12处的甘氨酸经精氨酸取代的突变人类RAS氨基酸序列具有抗原特异性，其中突变人类RAS氨基酸序列是突变人类Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)、突变人类Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)或突变人类神经母细胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)氨基酸序列，且其中位置12分别是参照野生型(WT)人类KRAS蛋白、WT人类HRAS蛋白或WT人类NRAS蛋白所定义。
本发明的另一实施方案提供包括本发明的TCR的功能部分的经分离或经纯化的多肽，其中所述功能部分包括以下氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:1-3的全部、(b)SEQ ID NO:4-6的全部、(c)SEQ ID NO:7-9的全部、(d)SEQ ID NO:10-12的全部、(e)SEQ ID NO:1-6的全部或(f)SEQ ID NO:7-12的全部。
本发明的再一实施方案提供包括至少一种本发明多肽的经分离或经纯化的蛋白质。
本发明实施方案另外提供与本发明的TCR、多肽及蛋白质相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体及药物组合物。
本发明的一实施方案提供自5’至3’包括第一核酸序列及第二核苷酸序列的经分离或经纯化的核酸，其中第一及第二核苷酸序列分别编码以下SEQ ID NO的氨基酸序列：13及14；14及13；15及16；16及15；30及31；31及30；32及33；33及32；34及35；35及34；36及37；37及36；41及42；42及41；43及44；44及43；45及46；46及45；47及48；48及47；49及50；50及49；51及52；或52及51。
本发明实施方案另外提供检测哺乳动物癌症的存在的方法、治疗或预防哺乳动物的癌症的方法、诱导哺乳动物中针对癌症的免疫反应的方法、产生表达对SEQ ID NO:39的肽具有抗原特异性所述的TCR的宿主细胞的方法及产生本发明的TCR、多肽及蛋白质的方法
附图的简要说明
图1是展示在共培养4270TCR转导细胞与自体DC后检测的干扰素γ(IFNγ)阳性斑点数/2×104(2E4)个细胞的图形。在共培养之前，使用WT RAS肽(正方形)或G12R RAS肽(圆)的连续稀释液(ng/mL)将自体DC脉冲化。
图2是展示在共培养4270TCR转导细胞与COS7细胞后检测的IFNγ浓度(pg/mL)的图形。在共培养之前，使用所指示HLA分子中的一者转染COS7细胞且然后使用G12R RAS肽脉冲化。HLA-DRA01:01是DRB1*11:01、DRB1*15:01、DRB3*02:02、DRB4*01:01及DRB5*01中的每一者的异二聚体的第二成员。
图3是展示在共培养4268TCR转导细胞与自体DC后检测的IFNγ阳性斑点数/2E4个细胞的图形。在共培养之前，使用WT RAS肽(正方形)或G12R RAS肽(圆)的连续稀释液(ng/mL)将自体DC脉冲化。
图4是展示在共培养4268TCR转导细胞与COS7细胞后检测的IFNγ浓度(pg/mL)的图形。在共培养之前，使用所指示HLA分子中的一者转染COS7细胞且然后使用G12R RAS肽脉冲化。HLA-DRA01:01是DRB1*11:01、DRB1*12:01、DRB3*02、DRB4*01及DRB5*01中的每一者的异二聚体的第二成员。
发明的详细描述
RAS家族蛋白属小GTPase的大家族。不受限于特定理论或机制，据信，在突变时，RAS蛋白可参与许多人类癌症的肿瘤形成早期的信号转导。单一氨基酸取代可活化蛋白质。突变RAS蛋白产物可组成型活化。突变RAS蛋白可表达于各种人类癌症(例如胰脏癌(例如胰脏癌瘤)、结肠直肠癌、肺癌(例如肺腺癌)、子宫内膜癌、卵巢癌(例如上皮卵巢癌)及前列腺癌)中的任一者中。人类RAS家族蛋白包含KRAS、HRAS及NRAS。
KRAS亦称为GTPase KRas、V-Ki-Ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因或KRAS2。存在KRAS的两种转录变体：KRAS变体A及KRAS变体B。WT KRAS变体A具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。WT KRAS变体B具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在下文中，除非另外指定，否则所提及的“KRAS”(突变或未突变(WT))是指变体A及变体B二者。在活化时，突变KRAS结合至5'-三磷酸鸟苷(GTP)且将GTP转化成5'-二磷酸鸟苷(GDP)。
HRAS是RAS蛋白家族的另一成员。HRAS亦称为Harvey大鼠肉瘤病毒致癌蛋白、V-Ha-Ras Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物或Ras家族小GTP结合蛋白H-Ras。WT HRAS具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
NRAS是RAS蛋白家族的再一成员。NRAS亦称为GTPase NRas、V-Ras神经母细胞瘤RAS病毒致癌基因同系物或NRAS1。WT NRAS具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
本发明的一实施方案提供经分离或经纯化的TCR，其中TCR对在位置12处的甘氨酸经精氨酸取代的突变人类RAS氨基酸序列具有抗原特异性，其中突变人类RAS氨基酸序列是突变人类KRAS、突变人类HRAS或突变人类NRAS的氨基酸序列，且其中位置12分别是参照WT人类KRAS蛋白、WT人类HRAS蛋白或WT人类NRAS蛋白所定义。在下文中，除非另外指定，否则所提及的“TCR”亦是指TCR的功能部分及功能变体。
突变人类RAS氨基酸序列可为突变人类KRAS氨基酸序列、突变人类HRAS氨基酸序列或突变人类NRAS氨基酸序列。WT人类KRAS、NRAS及HRAS蛋白的氨基酸序列各自具有188或189个氨基酸残基的长度且彼此具有高度一致性。举例而言，WT人类NRAS蛋白的氨基酸序列与WT人类KRAS蛋白的氨基酸序列86.8％一致。WT人类NRAS蛋白及WT人类KRAS蛋白的氨基酸残基1-86 100％一致。WT人类HRAS蛋白的氨基酸序列与WT人类KRAS蛋白的氨基酸序列86.3％一致。WT人类HRAS蛋白及WT人类KRAS蛋白的氨基酸残基1-94 100％一致。在下文中，除非另外指定，否则所提及“RAS”(突变或未突变(WT))共同地是指KRAS、HRAS及NRAS。
在本发明的一实施方案中，突变人类RAS氨基酸序列包括在位置12处的甘氨酸经精氨酸取代的人类RAS氨基酸序列，其中位置12是参照相应WT RAS蛋白所定义。WT RAS蛋白可为WT KRAS蛋白(SEQ ID NO:17或18)、WT HRAS蛋白(SEQ ID NO:19)或WT NRAS蛋白(SEQID NO:20)中的任一者，因为如上文所阐释，WT人类NRAS蛋白及WT人类KRAS蛋白的氨基酸残基1-86 100％一致，且WT人类HRAS蛋白及WT人类KRAS蛋白的氨基酸残基1-94 100％一致。因此，WT KRAS、WT HRAS及WT NRAS蛋白中的每一者的位置12的氨基酸残基相同，即甘氨酸。
突变人类RAS氨基酸序列在位置12处的甘氨酸经精氨酸取代。就此而言，本发明实施方案提供对含有G12R突变的任一人类RAS蛋白、多肽或肽氨基酸序列具有抗原特异性的TCR。
RAS的突变及取代在本文中是参照相应WT RAS蛋白的氨基酸序列所定义。因此，RAS的突变及取代在本文中是参照以下形式所阐述：存在于WT RAS蛋白中的特定位置(即位置12)的氨基酸残基，随后是位置编号，随后是在所论述特定突变或取代中代替该残基的氨基酸残基。RAS氨基酸序列(例如RAS肽)可包括少于全长WT RAS蛋白的所有氨基酸残基的氨基酸残基。因此，位置12在本文中是参照WT全长RAS蛋白(即SEQ ID NO:17-20中的任一者)所定义，且应理解，相应残基在RAS氨基酸序列的特定实例中的实际位置可有所不同。在位置是根据SEQ ID NO:17-20中的任一者所定义时，术语“G12”是指通常存在于SEQ ID NO:17-20中的任一者的位置12的甘氨酸，且“G12R”指示，通常存在于SEQ ID NO:17-20中的任一者的位置12的甘氨酸由精氨酸代替。举例而言，在RAS氨基酸序列的特定实例是(例如)TEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLI(SEQ ID NO:25)(对应于SEQ ID NO:17的邻接氨基酸残基2至24的实例性WT KRAS肽)时，“G12R”是指SEQ ID NO:25中的加下划线甘氨酸经缬氨酸取代，但SEQ ID NO:25中的加下划线甘氨酸的实际位置是11。含有G12R突变的人类RAS氨基酸序列在下文中称为“G12R RAS”。
含有G12R突变的全长RAS蛋白的实例陈述于下文表1中。
表1
突变全长RAS蛋白 SEQ ID NO:
G12R KRAS变体A 21
G12R KRAS变体B 22
G12R HRAS 23
G12R NRAS 24
在本发明的一实施方案中，TCR对上文所阐述含有G12R突变的RAS肽具有抗原特异性，其中G12R RAS肽具有任一长度。在本发明的一实施方案中，G12R RAS肽具有任一适于结合至本文所阐述的任一HLA第II类分子的长度。举例而言，TCR可对含有G12R突变的RAS肽具有抗原特异性，该RAS肽具有约11至约30个氨基酸残基、约12至约24个氨基酸残基或约18至约20个氨基酸残基的长度。G12R RAS肽可包括突变RAS蛋白中包含G12R突变的任何邻接氨基酸残基。在本发明的一实施方案中，TCR可对含有G12R突变的RAS肽具有抗原特异性，该突变RAS肽具有以下长度：约30个氨基酸残基、约29个氨基酸残基、约28个氨基酸残基、约27个氨基酸残基、约26个氨基酸残基、约25个氨基酸残基、约24个氨基酸残基、约23个氨基酸残基、约22个氨基酸残基、约21个氨基酸残基、约20个氨基酸残基、约19个氨基酸残基、约18个氨基酸残基、约17个氨基酸残基、约16个氨基酸残基、约15个氨基酸残基、约14个氨基酸残基、约13个氨基酸残基、约12个氨基酸残基、约11个氨基酸残基或前述值中的任两者的范围。可由本发明的TCR识别的含有G12R突变的具体肽的一实例是MTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLI(SEQ ID NO:39)。在本发明的一实施方案中，TCR对SEQ ID NO:39的突变人类RAS氨基酸序列具有抗原特异性。在本发明的一实施方案中，TCR对SEQ IDNO:40的野生型人类RAS氨基酸序列不具有抗原特异性。
在本发明的一实施方案中，本发明的TCR能够识别由HLA第II类分子呈递的G12RRAS。就此而言，TCR可在结合至HLA第II类分子背景内的G12R RAS时诱发免疫反应。本发明的TCR能够识别由HLA第II类分子呈递的G12R RAS且可结合至除G12R RAS外的HLA第II类分子。
在本发明的一实施方案中，HLA第II类分子是HLA-DR异二聚体。HLA-DR异二聚体是包含α链及β链的细胞表面受体。HLA-DRα链是由HLA-DRA基因编码。HLA-DRβ链是由HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因或HLA-DRB5基因编码。由HLA-DRB1基因编码的分子的实例可包括(但不限于)HLA-DR1、HLA-DR2、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR5、HLA-DR6、HLA-DR7、HLA-DR8、HLA-DR9、HLA-DR10、HLA-DR11、HLA-DR12、HLA-DR13、HLA-DR14、HLA-DR15、HLA-DR16及HLA-DR17。HLA-DRB3基因编码HLA-DR52。HLA-DRB4基因编码HLA-DR53。HLA-DRB5基因编码HLA-DR51。在本发明的一实施方案中，HLA第II类分子是HLA-DRB5:HLA-DRA异二聚体。在一特别优选的实施方案中，HLA第II类分子是由HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01等位基因(即HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01异二聚体)表达。
在本发明的另一实施方案中，HLA第II类分子是HLA-DQ异二聚体。HLA-DQ异二聚体是包含α链及β链的细胞表面受体。HLA-DQα链是由HLA-DQA1基因编码。HLA-DQA1等位基因可包括DQA1*01:01、DQA1*01:02、DQA1*01:03、DQA1*01:04、DQA1*02:01、DQA1*03:01、DQA1*03:02、DQA1*03:03、DQA1*04:01、DQA1*05:01、DQA1*05:05及DQA1*06:01。HLA-DQβ链由HLA-DQB1基因编码。HLA-DQB1等位基因可包括HLA-DQB1*02:01、HLA-DQB1*02:02、HLA-DQB1*02:03、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:04、HLA-DQB1*03:05、HLA-DQB1*04:01、HLA-DQB1*04:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*05:02、HLA-DQB1*05:03、HLA-DQB1*05:04、HLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*06:02、HLA-DQB1*06:03、HLA-DQB1*06:04、HLA-DQB1*06:05及HLA-DQB1*06:09。在本发明的一实施方案中，HLA第II类分子是HLA-DQA1:HLA-DQB1异二聚体。在一特别优选的实施方案中，HLA第II类分子是由HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01等位基因(即HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01异二聚体)表达。
本发明的TCR可提供多种优点中的任一者或多者，包括在由细胞表达时用于过继性细胞转移。G12R RAS是由癌细胞表达且未由正常、非癌性细胞表达。不受限于特定理论或机制，据信，本发明的TCR有利地破坏癌细胞且同时最小化或消除对正常、非癌性细胞的破坏，由此减小(例如藉由最小化或消除)毒性。此外，因G12R突变可能发生于肿瘤形成早期，故G12R RAS突变可表达于实质上所有患者癌细胞上。本发明的TCR可有利地且成功地治疗或预防不对其他类型治疗(例如化学疗法、手术或辐射)具有反应的G12R RAS阳性癌症。另外，本发明的TCR可高度亲合性地识别G12R RAS，其可使得能够识别未操纵肿瘤细胞(例如未进行以下处理的肿瘤细胞：经干扰素(IFN)-γ处理、经编码G12R RAS及HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01中的一或两者、G12R RAS及HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01中的一或两者的载体转染、经G12R RAS肽脉冲化或其组合)。此外，HLA-DRB5*01等位基因以约18％的频率表达于人类群体中，且HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01以约11％表达于美国高加索种族人中。因此，本发明的TCR可增加免疫疗法合格癌症患者的数量以包含表达HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01等位基因及HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01等位基因中的一或两者且可能不适用于使用识别由其他MHC分子所呈递G12R RAS的TCR的免疫疗法的患者。基于在美国各种癌症中的HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01及HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01等位基因的频率及G12R RAS表达的估计，据估计，每年有大于约1000名胰脏癌患者潜在地适用于使用一种本发明的TCR的治疗。举例而言，KRAS G12R突变表达于大于约8％的胰脏癌患者中。
本文所用的词组“抗原特异性”意指，TCR可以高亲合力特异性结合至且免疫性识别G12R RAS。举例而言，在与(a)经低浓度G12R RAS肽(例如约0.05ng/mL至约10ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、8ng/mL、10ng/mL或由前述值中的任两者界定的范围)脉冲化的抗原阴性、HLA第II类分子阳性靶细胞或(b)引入编码G12R RAS的核苷酸序列以便表达G12R RAS的靶细胞的抗原阴性、HLA第II类分子阳性靶细胞一起共培养后，若约1×104至约1×105个表达TCR的T细胞分泌至少约200pg/mL或更多(例如200pg/mL或更多、300pg/mL或更多、400pg/mL或更多、500pg/mL或更多、600pg/mL或更多、700pg/mL或更多、1000pg/mL或更多、5,000pg/mL或更多、7,000pg/mL或更多、10,000pg/mL或更多、20,000pg/mL或更多或由前述值中的任两者界定的范围)的IFN-γ，则TCR可考虑对G12R RAS具有“抗原特异性”。在与经较高浓度G12R RAS肽脉冲化的抗原阴性、HLA第II类分子阳性靶细胞一起共培养后，表达本发明的TCR的细胞亦可分泌IFN-γ。HLA第II类分子可为本文所阐述的任一HLA第II类分子(例如HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01异二聚体或HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01异二聚体)。
替代地或另外，在与(a)经低浓度G12R RAS肽脉冲化的抗原阴性、HLA第II类分子阳性靶细胞或(b)引入编码G12R RAS的核苷酸序列从而靶细胞表达G12R RAS的抗原阴性、HLA第II类分子阳性靶细胞一起共培养后，若与由阴性对照表达的IFN-γ量相比表达TCR的T细胞分泌至少两倍多的IFN-γ，则TCR可视为对G12R RAS具有“抗原特异性”。阴性对照可为(例如)(i)表达TCR且与(a)经相同浓度的不相关肽(例如具有来自G12R RAS肽的不同序列的一些其他肽)脉冲化的抗原阴性、HLA第II类分子阳性靶细胞或(b)引入编码不相关肽的核苷酸序列以便靶细胞表达不相关肽的抗原阴性、HLA第II类分子阳性靶细胞一起共培养的T细胞；或(ii)与(a)经相同浓度G12R RAS肽脉冲化的抗原阴性、HLA第II类分子阳性靶细胞或(b)引入编码G12R RAS的核苷酸序列以便靶细胞表达G12R RAS的抗原阴性、HLA第II类分子阳性靶细胞一起共培养的未转导T细胞(例如衍生自不表达TCR的PBMC)。由阴性对照的靶细胞表达的HLA第II类分子与由与所测试T细胞一起共培养的靶细胞表达的HLA第II类分子相同。HLA第II类分子可为本文所阐述的任一HLA第II类分子(例如HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01异二聚体或HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01异二聚体)。可藉由本领域内已知方法(例如酶联免疫吸附分析(ELISA))测量IFN-γ分泌。
替代地或另外，在与(a)经低浓度G12R RAS肽脉冲化的抗原阴性、HLA第II类分子阳性靶细胞或(b)引入编码G12R RAS的核苷酸序列以便靶细胞表达G12R RAS抗原的阴性、HLA第II类分子阳性靶细胞一起共培养后，与分泌IFN-γ的阴性对照T细胞的数量相比，若至少两倍多数量的表达TCR的T细胞分泌IFN-γ，则TCR可视为对G12R RAS具有“抗原特异性”。HLA第II类分子、肽浓度及阴性对照可如本文针对本发明的其他方面所阐述。可藉由本领域内已知方法(例如ELISPOT)测量分泌IFN-γ的细胞数。
替代地或另外，在使用表达G12R RAS的靶细胞刺激之后，若表达TCR的T细胞上调一或多种T细胞活化标记物的表达(如例如藉由流式细胞术所测量)，则TCR可视为对G12RRAS具有“抗原特异性”。T细胞活化标记物的实例包括4-1BB、OX40、CD107a、CD69及在抗原刺激时上调的细胞介素(例如肿瘤坏死因子(TNF)、介白素(IL)-2等)。
本发明的一实施方案提供包括两种多肽(即多肽链)的TCR，所述多肽是(例如)TCR的阿尔法(α)链、TCR的贝塔(β)链、TCR的伽马(γ)链、TCR的德尔塔(δ)链或其组合。本发明的TCR的多肽可包括任一氨基酸序列，条件是TCR对G12R RAS具有抗原特异性。在一些实施方案中，TCR是非天然的。
在本发明的一实施方案中，TCR包括两条多肽链，所述多肽链中的每一者包括含有TCR的互补决定区(CDR)1、CDR2及CDR3的可变区。在本发明的一实施方案中，TCR包括：第一多肽链，其包括含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1(4268TCR的α链的CDR1)、含有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的CDR2(4268TCR的α链的CDR2)及含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3(4268TCR的α链的CDR3)；及第二多肽链，其包括含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1(4268TCR的β链的CDR1)、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR2(4268TCR的β链的CDR2)及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR3(4268TCR的β链的CDR3)。
在本发明的另一实施方案中，TCR包括：第一多肽链，其包括含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1(4270TCR的α链的CDR1)、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR2(4270TCR的α链的CDR2)及含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR3(4270TCR的α链的CDR3)；及第二多肽链，其包括含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1(4270TCR的β链的CDR1)、含有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的CDR2(4270TCR的β链的CDR2)及含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3(4270TCR的β链的CDR3)。
就此而言，本发明的TCR可包括选自SEQ ID NO:1-12的氨基酸序列中任一者或多者。在本发明的一实施方案中，TCR包括以下氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:1-3的全部、(b)SEQID NO:4-6的全部、(c)SEQ ID NO:7-9的全部、(d)SEQ ID NO:10-12的全部、(e)SEQ ID NO:1-6的全部或(f)SEQ ID NO:7-12的全部。在一特别优选的实施方案中，TCR包括以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:1-6的全部或(ii)SEQ ID NO:7-12的全部。
在本发明的一实施方案中，TCR包括含有上述CDR的TCR的可变区的氨基酸序列。就此而言，TCR可包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:13(具有N端信号肽的4268TCR的α链的可变区)；SEQ ID NO:14(具有N端信号肽的4268TCR的β链的可变区)；SEQ ID NO:15(具有N端信号肽的4270TCR的α链的可变区)；SEQ ID NO:16(具有N端信号肽的4270TCR的β链的可变区)；SEQ ID NO:43(不具有N端信号肽的4268TCR的α链的可变区)；SEQ ID NO:44(不具有N端信号肽的4268TCR的β链的可变区)；SEQ ID NO:41(不具有N端信号肽的4270TCR的α链的可变区)；SEQ ID NO:42(不具有N端信号肽的4270TCR的β链的可变区)；SEQ ID NO:13及14二者；SEQ ID NO:15及16二者；SEQ ID NO:41及42二者；或SEQ ID NO:43及44二者。优选地，TCR包括以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:13及14二者；(ii)SEQ ID NO:15及16二者；(iii)SEQ ID NO:41及42二者；或(iv)SEQ ID NO:43及44二者。
本发明的TCR可进一步包括α链恒定区及β链恒定区。恒定区可衍生自任一适宜物种，例如人类或小鼠。在本发明的一实施方案中，TCR进一步包括鼠类α及β链恒定区或人类α及β链恒定区。如本文中所使用，在提及TCR或本文所阐述TCR的任一组分(例如CDR、可变区、恒定区、α链和/或β链)时，术语“鼠类”或“人类”意指分别衍生自小鼠或人类的TCR(或其组分)，即分别源自小鼠T细胞或人类T细胞或由其一次性表达的TCR(或其组分)。
本发明的一实施方案提供包括人类可变区及鼠类恒定区的嵌合TCR，其中TCR对在位置12处的甘氨酸经精氨酸取代的突变人类RAS氨基酸序列具有抗原特异性。鼠类恒定区可提供任一或多种优点。举例而言，鼠类恒定区可减弱本发明的TCR与引入本发明的TCR的宿主细胞的内源性TCR的失配。替代地或另外，与具有人类恒定区的相同TCR相比，鼠类恒定区可增加本发明的TCR的表达。嵌合TCR可包括SEQ ID NO:28(WT鼠类α链恒定区)、SEQ IDNO:29(WT鼠类β链恒定区)或SEQ ID NO:28及29二者的氨基酸序列。优选地，本发明的TCR包括SEQ ID NO:28及29二者的氨基酸序列。嵌合TCR可包括本文所阐述的任一鼠类恒定区与如本文针对本发明的其他方面所阐述的任一CDR区的组合。就此而言，TCR可包括以下氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:1-3及28的全部；(b)SEQ ID NO:4-6及29的全部；(c)SEQ ID NO:7-9及28的全部；(d)SEQ ID NO:10-12及29的全部；(e)SEQ ID NO:1-6及28-29的全部；或(f)SEQ ID NO:7-12及28-29的全部。在本发明的另一实施方案中，嵌合TCR可包括本文所阐述的任一鼠类恒定区与本文针对本发明的其他方面所阐述的任一可变区的组合。就此而言，TCR可包括以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:13及28二者；(ii)SEQ ID NO:14及29二者；(iii)SEQ ID NO:15及28二者；(iv)SEQ ID NO:16及29二者；(v)SEQ ID NO:13-14及28-29的全部；或(vi)SEQ ID NO:15-16及28-29的全部。
在本发明的另一实施方案中，TCR包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:34(具有WT鼠类恒定区及N端信号肽的4268TCRα链)、SEQ ID NO:35(具有WT鼠类恒定区及N端信号肽的4268TCRβ链)、SEQ ID NO:36(具有WT鼠类恒定区及N端信号肽的4270TCRα链)、SEQ ID NO:37(具有WT鼠类恒定区及N端信号肽的4270TCRβ链)、SEQ ID NO:49(具有WT鼠类恒定区且不具有N端信号肽的4268TCRα链)、SEQ ID NO:50(具有WT鼠类恒定区且不具有N端信号肽的4268TCRβ链)、SEQ ID NO:51(具有WT鼠类恒定区且不具有N端信号肽的4270TCRα链)、SEQID NO:52(具有WT鼠类恒定区且不具有N端信号肽的4270TCRβ链)、SEQ ID NO:34-35二者、SEQ ID NO:36-37二者、SEQ ID NO:49-50二者或SEQ ID NO:51-52二者。
在本发明的一个实施方案中，TCR包括含有可变区及恒定区的α链及含有可变区及恒定区的β链。就此而言，TCR可包括(a)包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的α链(具有N端信号肽的4268TCR的α链)，其中：(i)SEQ ID NO:30的位置180处的X是Thr或Cys；(ii)SEQ IDNO:30的位置244处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)SEQ ID NO:30的位置246处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)SEQ ID NO:30的位置247处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b)包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的β链(具有N端信号肽的4268TCR的β链)，其中SEQ ID NO:31的位置198处的X是Ser或Cys；(c)包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的α(具有N端信号肽的4270TCR的α链)，其中：(i)SEQ IDNO:32的位置188处的X是Thr或Cys；(ii)SEQ ID NO:32的位置252处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)SEQ ID NO:32的位置254处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)SEQ ID NO:32的位置255处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(d)包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列的β链(具有N端信号肽的4270TCR的β链)，其中SEQ ID NO:33的位置191处的X是Ser或Cys；(e)(a)及(b)二者；(f)(c)及(d)二者；(g)包括SEQ ID NO:45的氨基酸序列的α链(不具有N端信号肽的4268TCR的α链)，其中：(i)SEQ ID NO:45的位置161处的X是Thr或Cys；(ii)SEQ ID NO:45的位置225处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)SEQ ID NO:45的位置227处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)SEQ ID NO:45的位置228处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(h)包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β链(不具有N端信号肽的4268TCR的β链)，其中SEQ ID NO:46的位置178处的X是Ser或Cys；(i)包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的α链(不具有N端信号肽的4270TCR的α链)，其中：(i)SEQ ID NO:47的位置168处的X是Thr或Cys；(ii)SEQ ID NO:47的位置232处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)SEQ ID NO:47的位置234处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)SEQ ID NO:47的位置235处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(j)包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的β链(不具有N端信号肽的4270TCR的β链)，其中SEQ ID NO:48的位置171处的X是Ser或Cys；(k)(g)及(h)二者；或(l)(i)及(j)二者。
在本发明的一实施方案中，TCR包括经取代的恒定区。就此而言，TCR可包括本文所阐述的任一TCR的氨基酸序列，其中在α及β链中的一或两者的恒定区中具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。优选地，TCR包括鼠类恒定区，其中在α及β链中的一或两者的鼠类恒定区中具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代。在一特别优选的实施方案中，TCR包括鼠类恒定区，其中在α链的鼠类恒定区中具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代且在β链的鼠类恒定区中具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，与包括未取代(野生型)恒定区的亲代TCR相比，包括经取代恒定区的TCR有利地提供以下优点中的一或多者：增加的G12R RAS+靶识别、增加的宿主细胞表达、减弱的内源性TCR失配及增加的抗肿瘤活性。一般而言，TCRα及β链的鼠类恒定区的经取代氨基酸序列SEQ ID NO:26及27分别对应于未取代鼠类恒定区氨基酸序列SEQ ID NO:28及29的全部或一部分，其中SEQ ID NO:26与SEQ ID NO:28相比具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代且SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:29相比具有一个氨基酸取代。就此而言，本发明的一实施方案提供包括以下氨基酸序列的TCR：(a)SEQ ID NO:26(α链的恒定区)，其中(i)位置48处的X是Thr或Cys；(ii)位置112处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)位置114处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)位置115处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b)SEQ ID NO:27(β链的恒定区)，其中位置57处的X是Ser或Cys；或(c)SEQ ID NO:26及27二者。在本发明的一实施方案中，包括SEQ ID NO:26的TCR不包括SEQ ID NO:28(α链的未取代鼠类恒定区)。在本发明的一实施方案中，包括SEQ ID NO:27的TCR不包括SEQ ID NO:29(β链的未取代鼠类恒定区)。
在本发明的一实施方案中，经取代的恒定区包含α及β链中的一或两者的恒定区中的半胱氨酸取代以提供经半胱氨酸取代的TCR。α链及β链中的相对半胱氨酸提供二硫键，该二硫键使经取代TCR的α链及β链的恒定区彼此连接且不存在于包括未取代鼠类恒定区的TCR中。就此而言，TCR可为经半胱氨酸取代的TCR，其中SEQ ID NO:28中位置48的天然Thr(Thr48)及SEQ ID NO:29中位置57的天然Ser(Ser57)中的一或两者可经Cys取代。优选地，SEQ ID NO:28的天然Thr48及SEQ ID NO:29的天然Ser57二者皆经Cys取代。经半胱氨酸取代的TCR恒定区序列的实例陈述于表2中。在本发明的一实施方案中，经半胱氨酸取代的TCR包括(i)SEQ ID NO:26、(ii)SEQ ID NO:27或(iii)SEQ ID NO:26及27二者，其中SEQ IDNO:26及27二者皆是如表2中所定义。除本文所阐述的任一CDR或可变区外，本发明的经半胱氨酸取代的TCR亦可包含经取代的恒定区。
在本发明的一实施方案中，经半胱氨酸取代的嵌合TCR包括全长α链及全长β链。经半胱氨酸取代的嵌合TCRα链及β链序列的实例陈述于表2中。在本发明的一实施方案中，TCR包括(i)SEQ ID NO:30、(ii)SEQ ID NO:31、(iii)SEQ ID NO:32、(iv)SEQ ID NO:33、(v)SEQ ID NO:30及31二者、(vi)SEQ ID NO:32及33二者、(vii)SEQ ID NO:45、(viii)SEQ IDNO:46、(ix)SEQ ID NO:47、(x)SEQ ID NO:48、(xi)SEQ ID NO:45及46二者或(xii)SEQ IDNO:47及48二者，其中SEQ ID NO:30-33及45-48皆是如表2中所定义。
表2
Figure BDA0003174855290000161
Figure BDA0003174855290000171
在本发明的一实施方案中，经取代的氨基酸序列在α及β链中的一或两者的恒定区的跨膜(TM)结构域中的一个、两个或三个氨基酸经疏水性氨基酸取代以提供经疏水性氨基酸取代的TCR(亦在本文中称为“经LVL修饰的TCR”)。与在TM结构域中没有疏水性氨基酸取代的TCR相比，TCR的TM结构域中的疏水性氨基酸取代可增加TCR的TM结构域的疏水性。就此而言，TCR是经LVL修饰的TCR，其中SEQ ID NO:28的天然Ser112、Met114及Gly115中的一者、两者或三者可独立地经Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp、优选地Leu、Ile或Val取代。优选地，SEQ ID NO:28的天然Ser112、Met114及Gly115三者皆可独立地经Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp、优选地Leu、Ile或Val取代。在本发明的一实施方案中，经LVL修饰的TCR包括(i)SEQ ID NO:26、(ii)SEQ ID NO:27或(iii)SEQ ID NO:26及27二者，其中SEQID NO:26及27二者皆是如表3中所定义。除本文所阐述的任一CDR或可变区外，本发明的经LVL修饰的TCR可包含经取代的恒定区。
在本发明的一实施方案中，经LVL修饰的TCR包括全长α链及a全长β链。经LVL修饰的TCRα链及β链序列的实例陈述于表3中。在本发明的一实施方案中，经LVL修饰的TCR包括(i)SEQ ID NO:30、(ii)SEQ ID NO:31、(iii)SEQ ID NO:32、(iv)SEQ ID NO:33、(v)SEQ IDNO:30及31二者、(vi)SEQ ID NO:32及33二者、(vii)SEQ ID NO:45、(viii)SEQ ID NO:46、(ix)SEQ ID NO:47、(x)SEQ ID NO:48、(xi)SEQ ID NO:45及46二者或(xii)SEQ ID NO:47及48二者，其中SEQ ID NO:30-33及45-48皆是如表3中所定义。
表3
Figure BDA0003174855290000181
Figure BDA0003174855290000191
在本发明的一实施方案中，经取代的氨基酸序列包含以下取代的组合：α及β链中的一或两者的恒定区中的半胱氨酸取代；及在恒定区α及β链中的一或两者的跨膜(TM)结构域中一个、两个或三个氨基酸经疏水性氨基酸取代(亦在本文中称为“经半胱氨酸取代、经LVL修饰的TCR”)。就此而言，TCR是经半胱氨酸取代、经LVL修饰的嵌合TCR，其中SEQ ID NO:28的天然Thr48经Cys取代；SEQ ID NO:28的天然Ser112、Met114及Gly115中的一者、两者或三者独立地经Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp、优选地Leu、Ile或Val取代；且SEQ IDNO:29的天然Ser57经Cys取代。优选地，SEQ ID NO:28的天然Ser112、Met114及Gly115三者皆可独立地经Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp、优选地Leu、Ile或Val取代。在本发明的一实施方案中，经半胱氨酸取代、经LVL修饰的TCR包括(i)SEQ ID NO:26、(ii)SEQ IDNO:27或(iii)SEQ ID NO:26及27二者，其中SEQ ID NO:26及27二者皆是如表4中所定义。除本文所阐述的任一CDR或可变区外，本发明的经半胱氨酸取代、经LVL修饰的TCR可包含经取代的恒定区。
在一实施方案中，经半胱氨酸取代、经LVL修饰的TCR包括全长α链及a全长β链。在本发明的一实施方案中，经半胱氨酸取代、经LVL修饰的TCR包括(i)SEQ ID NO:30、(ii)SEQID NO:31、(iii)SEQ ID NO:32、(iv)SEQ ID NO:33、(v)SEQ ID NO:30及31二者、(vi)SEQID NO:32及33二者、(vii)SEQ ID NO:45、(viii)SEQ ID NO:46、(ix)SEQ ID NO:47、(x)SEQID NO:48、(xi)SEQ ID NO:45及46二者或(xii)SEQ ID NO:47及48二者，其中SEQ ID NO:30-33及45-48皆是如表4中所定义。
表4
Figure BDA0003174855290000201
Figure BDA0003174855290000211
Figure BDA0003174855290000221
本发明亦提供包括本文所阐述的任一TCR的功能部分的多肽。本文所用的术语“多肽”包括寡肽且是指由一或多个肽键连结的氨基酸单链。
就本发明的多肽而言，功能部分可为任一包括作为其一部分的TCR的邻接氨基酸的部分，条件是功能部分特异性结合至G12R RAS。术语“功能部分”在提及TCR使用时是指本发明的TCR的任一部分或片段，该部分或片段保留作为其一部分的TCR(亲代TCR)的生物活性。功能部分涵盖(例如)TCR中仍能够与亲代TCR相比以类似程度、相同程度或较高程度特异性结合至G12R RAS(例如在HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01异二聚体或HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01异二聚体的背景内)或检测、治疗或预防癌症的那些部分。参照亲代TCR，功能部分可包括(例如)约10％、约25％、约30％、约50％、约68％、约80％、约90％、约95％或更多的亲代TCR。
功能部分可在该部分的氨基或羧基末端或两个末端包括其他氨基酸，所述其他氨基酸未发现于亲代TCR的氨基酸序列中。期望地，其他氨基酸并不干扰功能部分的生物功能(例如特异性结合至G12R RAS和/或能够检测癌症、治疗或预防癌症等)。更期望地，与亲代TCR的生物活性相比，其他氨基酸可增强生物活性。
多肽可包括本发明的TCR的α及β链中的任一者或两者的功能部分，例如包括本发明的TCR中α链和/或β链的可变区的CDR1、CDR2及CDR3中的一或多者的功能部分。在本发明的一实施方案中，多肽可包括SEQ ID NO:1(α链的CDR1)、SEQ ID NO:2(α链的CDR2)、SEQ IDNO:3(α链的CDR3)、SEQ ID NO:4(β链的CDR1)、SEQ ID NO:5(β链的CDR2)、SEQ ID NO:6(β链的CDR3)或其组合的氨基酸序列。在本发明的另一实施方案中，多肽可包括SEQ ID NO:7(α链的CDR1)、SEQ ID NO:8(α链的CDR2)、SEQ ID NO:9(α链的CDR3)、SEQ ID NO:10(β链的CDR1)、SEQ ID NO:11(β链的CDR2)、SEQ ID NO:12(β链的CDR3)或其组合的氨基酸序列。
就此而言，本发明多肽可包括选自SEQ ID NO:1-12的氨基酸序列中的任一者或多者。在本发明的一实施方案中，TCR包括以下氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:1-3的全部、(b)SEQID NO:4-6的全部、(c)SEQ ID NO:7-9的全部、(d)SEQ ID NO:10-12的全部、(e)SEQ ID NO:1-6的全部或(f)SEQ ID NO:7-12的全部。在一优选实施方案中，多肽包括以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:1-6的全部或(ii)SEQ ID NO:7-12的全部。
在本发明的一实施方案中，本发明多肽可包括(例如)包含上述CDR区的组合的本发明的TCR的可变区。就此而言，多肽可包括以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:13(α链的可变区)、(ii)SEQ ID NO:14(β链的可变区)、(iii)SEQ ID NO:13及14二者、(iv)SEQ ID NO:15(α链的可变区)、(v)SEQ ID NO:16(β链的可变区)、(vi)SEQ ID NO:15及16二者、(vii)SEQID NO:41(α链的可变区)、(viii)SEQ ID NO:42(β链的可变区)、(ix)SEQ ID NO:41及42二者、(x)SEQ ID NO:43(α链的可变区)、(xi)SEQ ID NO:44(β链的可变区)或(xii)SEQ IDNO:43及44二者。优选地，多肽包括以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:13及14二者、(ii)SEQID NO:15及16二者、(iii)SEQ ID NO:41及42二者或(iv)SEQ ID NO:43及44。
在本发明的一实施方案中，本发明多肽可进一步包括上述本发明的TCR的恒定区。就此而言，多肽可进一步包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:28(α链的WT鼠类恒定区)、SEQID NO:29(β链的WT鼠类恒定区)、SEQ ID NO:26(α链的经取代鼠类恒定区)、SEQ ID NO:27(β链的经取代鼠类恒定区)、SEQ ID NO:28及29二者或SEQ ID NO:26及27二者。优选地，多肽进一步包括SEQ ID NO:26及27二者或SEQ ID NO:28及29二者的氨基酸序列与本文针对本发明的其他方面所阐述的任一CDR区或可变区的组合。在本发明的一实施方案中，多肽的SEQ ID NO:26及27中的一或两者是如表2-4中的任一者中所定义。
在本发明的一实施方案中，本发明的多肽可包括本文所阐述TCR的α或β链的整个长度。就此而言，本发明的多肽可包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:30-31二者、SEQ ID NO:32-33二者、SEQ ID NO:34-35、SEQ ID NO:36-37二者、SEQID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:45及46二者、SEQ ID NO:47及48二者、SEQ ID NO:49及50二者或SEQ ID NO:51及52二者。或者，本发明多肽可包括本文所阐述TCR的两条链。
举例而言，本发明的多肽可包括(a)SEQ ID NO:30的氨基酸序列，其中：(i)SEQ IDNO:30的位置180处的X是Thr或Cys；(ii)SEQ ID NO:30的位置244处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)SEQ ID NO:30的位置246处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)SEQ ID NO:30的位置247处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b)SEQ ID NO:31的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:31的位置198处的X是Ser或Cys；(c)SEQ ID NO:32的氨基酸序列，其中：(i)SEQ ID NO:32的位置188处的X是Thr或Cys；(ii)SEQ ID NO:32的位置252处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)SEQ ID NO:32的位置254处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)SEQID NO:32的位置255处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(d)SEQ ID NO:33的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:33的位置191处的X是Ser或Cys；(e)(a)及(b)二者；(f)(c)及(d)二者；(g)SEQ ID NO:45的氨基酸序列，其中：(i)SEQ ID NO:45的位置161处的X是Thr或Cys；(ii)SEQ ID NO:45的位置225处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)SEQ ID NO:45的位置227处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)SEQID NO:45的位置228处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(h)SEQ ID NO:46的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:46的位置178处的X是Ser或Cys；(i)SEQ ID NO:47的氨基酸序列，其中：(i)SEQ ID NO:47的位置168处的X是Thr或Cys；(ii)SEQ ID NO:47的位置232处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)SEQ ID NO:47的位置234处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)SEQ ID NO:47的位置235处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(j)SEQ ID NO:48的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:48的位置171处的X是Ser或Cys；(k)(g)及(h)二者；或(l)(i)及(j)二者。在本发明的一实施方案中，多肽的SEQ ID NO:30-33及45-48中的任一者或多者是如表2-4中的任一者中所定义。
本发明另外提供包括本文所阐述的至少一种多肽的蛋白质。“蛋白质”意指包括一或多条多肽链的分子。
在一实施方案中，本发明的蛋白质可包括(a)包含SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:4-6的氨基酸序列的第二多肽链；或(b)包含SEQ ID NO:7-9的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:10-12的氨基酸序列的第二多肽链。
在本发明的另一实施方案中，蛋白质可包括(i)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第二多肽链；(ii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的第二多肽链；(iii)包含SEQID NO:41的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第二多肽链；或(iv)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第一多肽链及包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的第二多肽链。
本发明的蛋白质可进一步包括本文针对本发明的其他方面所阐述的任一恒定区。就此而言，在本发明的一实施方案中，(i)第一多肽链可进一步包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列且第二多肽链可进一步包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列；或(ii)第一多肽链可进一步包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列且第二多肽链可进一步包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在本发明的一实施方案中，蛋白质的SEQ ID NO:26及27中的一或两者是如表2-4中的任一者中所定义。
替代地或另外，本发明的一实施方案的蛋白质可包括(a)第一多肽链，其包括SEQID NO:30的氨基酸序列，其中：(i)SEQ ID NO:30的位置180处的X是Thr或Cys；(ii)SEQ IDNO:30的位置244处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)SEQ ID NO:30的位置246处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)SEQ ID NO:30的位置247处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b)第二多肽链，其包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:31的位置198处的X是Ser或Cys；(c)第一多肽链，其包括SEQID NO:32的氨基酸序列，其中：(i)SEQ ID NO:32的位置188处的X是Thr或Cys；(ii)SEQ IDNO:32的位置252处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)SEQ ID NO:32的位置254处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)SEQ ID NO:32的位置255处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(d)第二多肽链，其包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:33的位置191处的X是Ser或Cys；(e)(a)及(b)二者；(f)(c)及(d)二者；(g)第一多肽链，其包括SEQ ID NO:45的氨基酸序列，其中：(i)SEQ ID NO:45的位置161处的X是Thr或Cys；(ii)SEQ ID NO:45的位置225处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)SEQ ID NO:45的位置227处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)SEQ ID NO:45的位置228处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(h)第二多肽链，其包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:46的位置178处的X是Ser或Cys；(i)第一多肽链，其包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列，其中：(i)SEQ ID NO:47的位置168处的X是Thr或Cys；(ii)SEQ ID NO:47的位置232处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)SEQ ID NO:47的位置234处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)SEQ ID NO:47的位置235处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(j)第二多肽链，其包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:48的位置171处的X是Ser或Cys；(k)(g)及(h)二者；或(l)(i)及(j)二者。在本发明的一实施方案中，SEQ ID NO:30-33及45-48中的一或多者是如表2-4中的任一者中所定义。
本发明的蛋白质可为TCR。或者，举例而言，若蛋白质包括含有SEQ ID NO:30及31二者、SEQ ID NO:32及33二者的氨基酸序列的单一多肽链，或若蛋白质的第一和/或第二多肽链进一步包括其他氨基酸序列(例如编码免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列)，则本发明的蛋白质可为融合蛋白。就此而言，本发明亦提供包括本文所阐述的至少一种本发明的多肽以及至少一种其他多肽的融合蛋白。其他多肽可以融合蛋白的单独多肽形式存在，或可以与本文所阐述的一种本发明的多肽同框(串联)表达的多肽形式存在。其他多肽可编码任一肽或蛋白质分子或其部分(包括(但不限于)免疫球蛋白、CD3、CD4、CD8、MHC分子、CD1分子(例如CD1a、CD1b、CD1c、CD1d)等)。
融合蛋白可包括一或多个拷贝的本发明的多肽和/或一或多个拷贝的其他多肽。举例而言，融合蛋白可包括1、2、3、4、5或更多个拷贝的本发明的多肽和/或其他多肽。制备融合蛋白的适宜方法为本领域内已知，且包含例如重组方法。
在本发明的一些实施方案中，本发明的TCR、多肽及蛋白质可表达为包括连接α链及β链的接头肽的单一蛋白质。就此而言，本发明的TCR、多肽及蛋白质可进一步包括接头肽。接头肽可有利地促进重组TCR、多肽和/或蛋白质在宿主细胞中表达。接头肽可包括任一适宜氨基酸序列。接头肽可为可裂解接头肽。举例而言，接头肽可为包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列的弗林蛋白酶(furin)-SGSG-P2A接头。在藉由宿主细胞表达包含接头肽的构建体时，接头肽可裂解，产生分离的α及β链。在本发明的一个实施方案中，TCR、多肽或蛋白质可包括含有全长α链、全长β链及位于α链与β链的间的接头肽的氨基酸序列。
本发明的蛋白质可为包括至少一种本文所述的本发明多肽的重组抗体或其抗原结合部分。如本文中所使用，“重组抗体”是指包括至少一种本发明的多肽及抗体或其抗原结合部分的多肽链的重组(例如基因改造)蛋白。抗体或其抗原结合部分的多肽可为抗体的重链、轻链、重链或轻链的可变或恒定区、单链可变片段(scFv)，或Fc、Fab或F(ab)2'片段等。抗体或其抗原结合部分的多肽链可以重组抗体的分离多肽存在。或者，抗体或其抗原结合部分的多肽链可以与本发明的多肽同框(串联)表达的多肽存在。抗体或其抗原结合部分的多肽可为任一抗体或任一抗体片段(包含本文所述的任一抗体及抗体片段)的多肽。
本发明范围包含本文所阐述的本发明的TCR、多肽或蛋白质的功能变体。本文所用的术语“功能变体”是指与亲代TCR、多肽或蛋白质具有实质性或显著性序列一致性或类似性的TCR、多肽或蛋白质，所述功能变体保留作为其变体的TCR、多肽或蛋白质的生物活性。功能变体涵盖(例如)本文所阐述的TCR、多肽或蛋白质(亲代TCR、多肽或蛋白质)的仍能够与亲代TCR、多肽或蛋白质相比以类似程度、相同程度或较高程度特异性结合至G12R RAS(亲代TCR对其具有抗原特异性或亲代多肽或蛋白质与其特异性结合)的那些变体。参照亲代TCR、多肽或蛋白质，功能变体可(例如)分别与亲代TCR、多肽或蛋白质的氨基酸序列至少约30％、约50％、约75％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高程度一致。
功能变体可(例如)包括具有至少一种保守氨基酸取代的亲代TCR、多肽或蛋白质的氨基酸序列。保守氨基酸取代为本领域内所已知，且包含其中一种具有某些物理和/或化学性质的氨基酸交换为另一具有相同化学或物理性质的氨基酸的氨基酸取代。举例而言，保守氨基酸取代可为一种酸性氨基酸取代为另一酸性氨基酸(例如Asp或Glu)，一种具有非极性侧链的氨基酸取代为另一具有非极性侧链的氨基酸(例如Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)，一种碱性氨基酸取代为另一碱性氨基酸(Lys、Arg等)，一种具有极性侧链的氨基酸取代为另一具有极性侧链的氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)等。
替代地或另外，功能变体可包括亲代TCR、多肽或蛋白质中具有至少一种非保守氨基酸取代的氨基酸序列。在此情形下，优选地，非保守氨基酸取代并不干扰或抑制功能变体的生物活性。优选地，非保守氨基酸取代增强功能变体的生物活性，从而功能变体的生物活性大于亲代TCR、多肽或蛋白质。
TCR、多肽或蛋白质可基本上由本文所阐述的一或多个指定氨基酸序列组成，从而TCR、多肽或蛋白质的其他组分(例如其他氨基酸)并不实质性改变TCR、多肽或蛋白质的生物活性。就此而言，本发明的TCR、多肽或蛋白质可(例如)基本上由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:30-31二者、SEQ ID NO:32-33二者、SEQ IDNO:34-35二者或SEQ ID NO:36-37二者。同样，举例而言，本发明的TCR、多肽或蛋白质可基本上由以下氨基酸序列组成：(i)SEQ ID NO:13、(ii)SEQ ID NO:14、(iii)SEQ ID NO:15、(iv)SEQ ID NO:16、(v)SEQ ID NO:13及14二者或(vi)SEQ ID NO:15及16二者。另外，本发明的TCR、多肽或蛋白质可基本上由以下氨基酸序列组成：(a)SEQ ID NO:1-12中的任一者或多者；(b)SEQ ID NO:1-3的全部；(c)SEQ ID NO:4-6的全部；(d)SEQ ID NO:7-9的全部；(e)SEQ ID NO:10-12的全部；(f)SEQ ID NO:1-6的全部；或(g)SEQ ID NO:7-12的全部。
本发明的TCR、多肽及蛋白质可具有任一长度，即可包括任一数量的氨基酸，条件是TCR、多肽或蛋白质保留其生物活性(例如能够特异性结合至G12R RAS；检测哺乳动物的癌症；或治疗或预防哺乳动物的癌症等)。举例而言，多肽的长度可在约50至约5000个氨基酸的范围内，例如长约50、约70、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000或更多个氨基酸。就此而言，本发明多肽亦包含寡肽。
本发明的TCR、多肽及蛋白质可包括合成氨基酸来代替一或多种天然氨基酸。所述合成氨基酸为本领域内所已知，且包含(例如)胺基环己烷甲酸、正白氨酸、α-胺基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基胺基甲基-半胱氨酸、反式-3-及反式-4-羟基脯氨酸、4-胺基苯基丙氨酸、4-硝基苯基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、4-羧基苯基丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯基丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-甲酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、胺基丙二酸、胺基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-离氨酸、N’,N’-二苄基-离氨酸、6-羟基离氨酸、鸟氨酸、α-胺基环戊烷甲酸、α-胺基环己烷甲酸、α-胺基环庚烷甲酸、α-(2-胺基-2-降莰烷)-甲酸、α,γ-二胺基丁酸、α,β-二胺基丙酸、高苯基丙氨酸及α-第三丁基甘氨酸。
本发明的TCR、多肽及蛋白质可经由(例如)二硫桥发生糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、酯化、N-酰基化、环化，或转化成酸加成盐和/或视情况发生二聚合或聚合，或发生偶联。
可藉由本领域内已知方法(例如重新合成)获得本发明的TCR、多肽和/或蛋白质。另外，可以重组方式使用本文所阐述的核酸且使用标准重组方法来产生多肽及蛋白质。例如参见Green及Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第4版，Cold SpringHarbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2012)。或者，本文所阐述的TCR、多肽和/或蛋白质可以商业方式由公司(例如Synpep(Dublin,CA)、Peptide Technologies Corp.(Gaithersburg,MD)及Multiple Peptide Systems(San Diego,CA))合成。就此而言，本发明的TCR、多肽及蛋白质可为合成的、重组的、经分离和/或经纯化的。本发明的一实施方案提供由本文针对本发明的其他方面所阐述任一核酸或载体编码的经分离或经纯化的TCR、多肽或蛋白质。本发明的另一实施方案提供经分离或经纯化的TCR、多肽或蛋白质，其是藉由在细胞中表达本文针对本发明的其他方面所阐述的任一核酸或载体所产生。本发明的再一实施方案提供产生本文所阐述的任一TCR、多肽或蛋白质的方法，该方法包括培养本文所阐述的任一宿主细胞或宿主细胞群体，从而产生TCR、多肽或蛋白质。
本发明范围包含缀合物(例如生物缀合物)，其包括本发明的TCR、多肽或蛋白质(包含任一功能部分或其变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞、宿主细胞群体或抗体或其抗原结合部分中的任一者。一般而言，本领域内已知缀合物以及合成缀合物的方法。
本发明的一实施方案提供包括编码本文所阐述的任一TCR、多肽或蛋白质的核苷酸序列的核酸。本文所用的“核酸”包含“多核苷酸”、“寡核苷酸”及“核酸分子”，且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可为单链或双链，可含有天然、非天然或经改变的核苷酸，且可含有天然、非天然或经改变的核苷酸间键联(例如胺基磷酸酯键联或硫代磷酸酯键联)来代替发现于未修饰寡核苷酸的核苷酸的间的磷酸二酯。在一实施方案中，核酸包括互补DNA(cDNA)。通常优选地，核酸不包括任何插入、缺失、倒转和/或取代。然而，在一些情况下，如本文所论述，核酸可适宜地包括一或多种插入、缺失、倒转和/或取代。
优选地，本发明的核酸是重组的。如本文中所使用，术语“重组”是指(i)分子是藉由使天然或合成核酸区段接合至可复制于活细胞中的核酸分子而构建于活细胞外部，或(ii)分子是源自上文(i)中所阐述者的复制。出于本文的目的，复制可为活体外复制或活体内复制。
可基于化学合成和/或酶促连接反应使用本领域内已知程序来构建核酸。例如参见Green及Sambrook等人的上述文献。举例而言，核酸可以化学方式使用天然核苷酸或设计以增加分子的生物稳定性或增加在杂交时所形成双链体的物理稳定性的各种经修饰核苷酸(例如硫代磷酸酯衍生物及经吖啶取代的核苷酸)来合成。可用于生成核酸的经修饰核苷酸的实例包含(但不限于)5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫基尿苷、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫基尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫基胞嘧啶、5-甲基-2-硫基尿嘧啶、2-硫基尿嘧啶、4-硫基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-胺基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶及2,6-二胺基嘌呤。或者，本发明的一或多种核酸可购自诸如Macromolecular Resources(Fort Collins,CO)及Synthegen(Houston,TX)等公司。
核酸可包括任一编码本文所阐述的任一TCR、多肽或蛋白质的核苷酸序列。在本发明的一实施方案中，核酸包括编码本文所阐述的任一TCR、多肽或蛋白质的密码子优化核苷酸序列。不受限于任一特定理论或机制，据信，核苷酸序列的密码子优化增加了mRNA转录物的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可涉及使用另一编码相同氨基酸但可藉由更易于获得于细胞内的tRNA翻译的密码子取代天然密码子，由此增加翻译效率。核苷酸序列的优化亦可减少干扰翻译的二级mRNA结构，由此增加翻译效率。
本发明亦提供包括以下的核酸：与本文所阐述任一核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或在严格条件下杂交至本文所阐述任一核酸的核苷酸序列的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列优选地在高严格度条件下发生杂交。“高严格度条件”意指核苷酸序列以可检测地强于非特异性杂交的量特异性杂交至靶序列(本文所阐述任一核酸的核苷酸序列)。高严格度条件包含区分具有严格互补序列的多核苷酸或仅含少数零散失配者与恰好少数较小区域(例如3-10个碱基)匹配核苷酸序列的随机序列的条件。此类具有互补性的较小区域较14-17或更多个碱基的全长互补物更易于融化，且高严格度杂交使得其可容易地区分。相对较高严格度条件包含(例如)低盐和/或高温条件，例如由约0.02-0.1M NaCl或等效物在约50-70℃的温度下所提供。此类高严格度条件耐受核苷酸序列与模板或靶链的间的较少(若存在)失配，且尤其适于检测任一本发明的TCR的表达。通常应了解，可藉由添加增加量的甲酰胺来使条件更为严格。
本发明的一实施方案亦提供包括与本文所阐述的任一核酸至少约70％或一致(例如约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％一致)的核苷酸序列的核酸。就此而言，核酸可基本上由本文所阐述的任一核苷酸序列组成。
本发明的一实施方案提供自5’至3’包括第一核酸序列及第二核苷酸序列的经分离或经纯化的核酸，其中第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分别编码以下氨基酸序列：SEQID NO:13及14；14及13；15及16；16及15；30及31；31及30；32及33；33及32；34及35；35及34；36及37；37及36；41及42；42及41；43及44；44及43；45及46；46及45；47及48；48及47；49及50；50及49；51及52；或52及51。
在本发明的一实施方案中，经分离或经纯化的核酸进一步包括插入第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列编码可裂解接头肽。在本发明的一实施方案中，可裂解接头肽包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
本发明的核酸可并入重组表达载体中。就此而言，本发明提供包括本发明的任一核酸的重组表达载体。在本发明的一实施方案中，重组表达载体包括编码α链、β链及接头肽的核苷酸序列。
出于本文的目的，术语“重组表达载体”意指经基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，在该构建体包括编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列且使载体与细胞在足以使mRNA、蛋白质、多肽或肽表达于宿主细胞内的条件下接触时，该构建体允许藉由该细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽。本发明的载体整体而言并非天然的。然而，载体的一部分可为天然的。本发明的重组表达载体可包括任一类型的核苷酸，该核苷酸包含(但不限于)DNA及RNA，其可为单链或双链，经合成或部分地自天然来源获得，且可含有天然、非天然或经改变的核苷酸。重组表达载体可包括天然、非天然的核苷酸间键联或两种类型的键联。优选地，非天然或经改变的核苷酸或核苷酸间键联并不阻碍载体的转录或复制。
本发明的重组表达载体可为任一适宜重组表达载体，且可用于转化或转染任一适宜宿主细胞。适宜载体包含经设计用于繁殖及扩增或用于表达或用于二者的那些，例如质体及病毒。载体可选自：pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA)、pET系列(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列(PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)及pEX系列(Clontech,Palo Alto,CA)。亦可使用噬菌体载体，例如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4及λNM1149。植物表达载体的实例包含pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121及pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包含pEUK-Cl、pMAM及pMAMneo(Clontech)。优选地，重组表达载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体。在一特别优选的实施方案中，重组表达载体是MSGV1载体。在本发明的一实施方案中，重组表达载体是转座子或慢病毒载体。
可使用阐述于(例如)Greem及Sambrook等人的上述文献中的标准重组DNA技术来制备本发明的重组表达载体。可制备含有在原核或真核宿主细胞中发挥作用的复制系统的环形或线性表达载体的构建体。复制系统可衍生自(例如)ColEl、2μ质体、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
期望地，在适当时且考虑载体是基于DNA或RNA的，重组表达载体包括对拟引入载体的宿主细胞类型(例如细菌、真菌、植物或动物)具有特异性的调控序列，例如转录及翻译起始密码子及终止密码子。
重组表达载体可包含一或多种容许选择经转化或经转染宿主细胞的标记基因。标记基因包含杀生物抗性(例如对抗生素、重金属等的抗性)、营养缺陷宿主细胞中的互补作用(用以提供原养性)等。用于本发明表达载体的适宜标记基因包含(例如)新霉素(neomycin)/G418抗性基因、潮霉素(hygromycin)抗性基因、组胺醇(histidinol)抗性基因、四环素(tetracycline)抗性基因及胺苄西林(ampicillin)抗性基因。
重组表达载体可包括可操作地连接至编码TCR、多肽或蛋白质的核苷酸序列或互补于或杂交至编码TCR、多肽或蛋白质的核苷酸序列的核苷酸序列的天然或非天然启动子。本领域技术人员熟知启动子的选择(例如强、弱、可诱导、组织特异性及发育特异性)。类似地，本领域技术人员亦熟知核苷酸序列与启动子的组合。启动子可为非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子及发现于鼠类干细胞病毒的长末端重复中的启动子。
本发明的重组表达载体可经设计以用于瞬时表达、稳定表达或用于二者。同样，重组表达载体可经制备用于组成型表达或可诱导表达。
另外，可制备包含自杀基因的重组表达载体。如本文中所使用，术语“自杀基因”是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可为赋予表达基因的细胞药剂(例如药物)敏感性且在细胞接触或暴露于药剂时导致细胞死亡的基因。自杀基因为本领域内所已知且包含(例如)单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶去胺酶、嘌呤核苷磷酸化酶、硝基还原酶及可诱导半胱天冬酶(caspase)9基因系统。
本发明的另一实施方案另外提供包括本文所阐述的任一重组表达载体的宿主细胞。如本文中所使用，术语“宿主细胞”是指可含有本发明重组表达载体的任一类型的细胞。宿主细胞可为真核细胞(例如植物、动物、真菌或藻类细胞)，或可为原核细胞(例如细菌或原生动物细胞)。宿主细胞可为经培养细胞或原代细胞(即自生物体、例如人类直接分离)。宿主细胞可为附着细胞或悬浮细胞(即在悬浮液中生长的细胞)。适宜宿主细胞为本领域内所已知且包含(例如)DH5α大肠杆菌(E.coli)细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞及诸如此类。出于扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞优选是原核细胞，例如DH5α细胞。出于产生重组TCR、多肽或蛋白质的目的，宿主细胞优选是哺乳动物细胞。最优选地，宿主细胞系人类细胞。尽管宿主细胞可为任一细胞类型、可源自任一类型组织且可为任一发育阶段，但宿主细胞优选是外周血淋巴球(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。更优选地，宿主细胞系T细胞。在本发明的一实施方案中，宿主细胞系人类淋巴球。在本发明的另一实施方案中，宿主细胞选自：T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、不变(invariant)的自然杀伤T(iNKT)细胞及自然杀伤(NK)细胞。本发明的再一实施方案提供产生表达对SEQ IDNO:39的肽具有抗原特异性的TCR的宿主细胞的方法，该方法包括使细胞与本文所阐述的任一载体在容许将载体引入细胞中的条件下接触。
出于本文的目的，T细胞可为任一T细胞，例如经培养T细胞(例如原代T细胞，或来自经培养T细胞系(例如Jurkat、SupT1等)的T细胞，或自哺乳动物获得的T细胞)。若自哺乳动物获得，则T细胞可自多种来源获得，包含(但不限于)血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或流体。T细胞亦可经富集或经纯化。优选地，T细胞是人类T细胞。T细胞可为任一类型T细胞且可为任一发育阶段，包含(但不限于)CD4+/CD8+双重阳性T细胞、CD4+辅助性T细胞(例如Th1及Th2细胞)、CD4+T细胞、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润淋巴球(TIL)、记忆性T细胞(例如中央记忆性T细胞及效应记忆性T细胞)、幼稚T细胞等。
本发明亦提供包括本文所阐述的至少一种宿主细胞的细胞群体。细胞群体可为异质群体，其包括含有任一所阐述重组表达载体的宿主细胞以及至少一种其他细胞(例如不包括任一重组表达载体的宿主细胞(例如T细胞)或除T细胞外的细胞(例如B细胞、巨噬球、嗜中性球、红血球、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等))。或者，细胞群体可为实质上均质的群体，其中该群体主要包括含有重组表达载体的宿主细胞(例如基本上由其组成)。该群体亦可为克隆的细胞群体，其中该群体的所有细胞皆是包括重组表达载体的单一宿主细胞的克隆，从而该群体的所有细胞皆包括重组表达载体。在本发明的一实施方案中，细胞群体是包括含有如本文所阐述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。
在本发明的一实施方案中，群体中的细胞数可快速扩增。可藉由本领域内已知的诸多方法中的任一者来扩增T细胞数，如例如以下文献中所阐述：美国专利8,034,334；美国专利8,383,099；美国专利申请案公开案第2012/0244133号；Dudley等人，J.Immunother.,26:332-42(2003)；及Riddell等人，J.Immunol.Methods,128:189-201(1990)。在一实施方案中，藉由一起培养T细胞与OKT3抗体、IL-2及饲养PBMC(例如经辐照同种异体PBMC)来扩增T细胞数。
可分离和/或纯化本发明的TCR、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体及宿主细胞(包含其群体)。本文所用的术语“经分离”意指自其天然环境取出。本文所用的术语“经纯化”意指具有增加的纯度，其中“纯度”是相对术语，且无需解释为绝对纯度。举例而言，纯度可为至少约50％，可大于约60％、约70％、约80％、约90％、约95％，或可为约100％。
本发明的TCR、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体及宿主细胞(包含其群体，在下文中通称为“本发明的TCR材料”)可调配成组合物(例如药物组合物)。就此而言，本发明提供一种药物组合物，其包括本文所阐述的TCR、多肽、蛋白质、核酸、表达载体及宿主细胞(包含其群体)中的任一者及药学上可接受的载剂。含有任一本发明的TCR材料的本发明药物组合物可包括一种以上的本发明的TCR材料(例如多肽及核酸)或两种或更多种不同TCR。或者，药物组合物可包括本发明的TCR材料与另一药学活性剂或药物(例如化学治疗剂)的组合，所述化学治疗剂是(例如)天门冬酰胺酶、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲(hydroxyurea)、胺甲喋呤(methotrexate)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)等。
优选地，载剂是药学上可接受的载剂。对于药物组合物而言，载剂可通常用于所考虑特定本发明的TCR材料的任一者。制备可可施用组合物的方法是本领域技术人员所已知或明了的且更详细地阐述于(例如)Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第22版，Pharmaceutical Press(2012)。优选地，药学上可接受的载剂是在使用条件下无有害副效应或毒性者。
载剂的选择部分地取决于特定本发明的TCR材料以及用于施用本发明的TCR材料的特定方法。因此，本发明的药物组合物存在各种适宜制剂。适宜制剂可包含用于非经肠、皮下、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、肿瘤内或腹膜腔内施用的任一者。可使用一种以上途径来施用本发明的TCR材料，且在某些情况下，特定途径可提供较另一途径更迅速且更有效的反应。
优选地，本发明的TCR材料是藉由注射(例如经静脉内)来施用。当本发明的TCR材料是表达本发明的TCR的宿主细胞(或其群体)时，用于注射用细胞的药学上可接受的载剂可包含任一等渗载剂(例如生理盐水(于水中的约0.90％w/v NaCl、于水中的约300mOsm/LNaCl或约9.0g NaCl/公升水)、NORMOSOL R电解质溶液(Abbott,Chicago,IL)、PLASMA-LYTEA(Baxter,Deerfield,IL)、于水中的约5％右旋糖或林格氏乳酸盐(Ringer's lactate))。在一实施方案中，药学上可接受的载剂补充有人类血清蛋白。
出于本发明目的，所施用的本发明的TCR材料的量或剂量(例如在本发明的TCR材料是一或多种细胞时的细胞数)应足以在个体或动物中经适当时间范围产生一定效应(例如治疗性或防治性反应)。举例而言，本发明的TCR材料的剂量应足以在施用后于约2小时或更长(例如12至24或更多小时)的时段内结合至癌症抗原(例如G12R RAS)或检测、治疗或预防癌症。在某些实施方案中，该时间段甚至可以更长。剂量取决于特定本发明的TCR材料的效能及动物(例如人类)的病状以及拟治疗动物(例如人类)的体重。
本领域内已知用于测定施用剂量的许多分析。出于本发明目的，可使用包括以下过程的分析来测定拟施用哺乳动物的起始剂量：在一组各自给予不同剂量的T细胞的哺乳动物中，比较在向哺乳动物施用既定剂量的此类T细胞后靶细胞裂解或藉由表达本发明的TCR、多肽或蛋白质的T细胞分泌IFN-γ的程度。可藉由本领域内已知方法来分析在施用某一剂量后靶细胞裂解或IFN-γ分泌的程度。
本发明的TCR材料的剂量亦取决于任何可伴随施用特定本发明的TCR材料的不良副效应的存在、性质及程度。通常，在考虑各种因素(例如年龄、体重、整体健康状况、饮食、性别、拟施用的本发明的TCR材料、施用途径及所治疗癌症的严重程度)后，主治医师经决定拟治疗每一个别患者的本发明的TCR材料的剂量。在本发明的TCR材料是细胞群体的实施方案中，每一输注所施用的细胞数可一变化，例如约1×106至约1×1012个细胞或更多。在某些实施方案中，可施用少于1×106个细胞。
本领域技术人员易于了解，本发明的发明性TCR材料可以任一数量的方式来进行修饰，从而经由修饰来增加本发明的TCR材料的治疗性或防治性效能。举例而言，本发明的TCR材料可直接或经由桥间接缀合至化学治疗剂。本领域内已知使化合物缀合至化学治疗剂的实践。本领域技术人员认识到，本发明的TCR材料上并非本发明的TCR材料的功能所需的位点是用于附接桥和/或化学治疗剂的适宜位点，条件是桥和/或化学治疗剂在附接至本发明的TCR材料后并不干扰本发明的TCR材料的功能(即能够结合至G12R RAS或检测、治疗或预防癌症)。
本发明的药物组合物、TCR、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞及细胞群体预计可用于治疗或预防癌症的方法中。不受限于特定理论，据信，本发明的TCR特异性结合至G12R RAS，从而TCR(或相关的本发明多肽或蛋白质)在由细胞表达时能够介导针对表达G12R RAS的靶细胞的免疫反应。就此而言，本发明的一实施方案提供治疗或预防哺乳动物的癌症的方法，其包括以有效治疗或预防哺乳动物的癌症的量向哺乳动物施用本文所阐述的任一药物组合物、TCR、多肽或蛋白质、任一包括编码本文所阐述的任一TCR、多肽、蛋白质的核苷酸序列的核酸或重组表达载体或任一包括编码本文所阐述的任一TCR、多肽或蛋白质的重组载体的宿主细胞或细胞群体。
本发明的一实施方案提供在哺乳动物中诱导针对癌症的免疫反应的方法，其包括以在哺乳动物中有效诱导针对癌症的免疫反应的量向哺乳动物施用本文所阐述的任一药物组合物、TCR、多肽或蛋白质、任一包括编码本文所阐述的任一TCR、多肽或蛋白质的核苷酸序列的核酸或重组表达载体或任一包括编码本文所阐述的任一TCR、多肽或蛋白质的重组载体的宿主细胞或细胞群体。
本发明的一实施方案提供本文所阐述的任一药物组合物、TCR、多肽或蛋白质、任一包括编码本文所阐述的任一TCR、多肽、蛋白质的核苷酸序列的核酸或重组表达载体或任一包括编码本文所阐述的任一TCR、多肽或蛋白质的重组载体的宿主细胞或细胞群体，其用于治疗或预防哺乳动物的癌症。
本发明的一实施方案提供本文所阐述的任一药物组合物、TCR、多肽或蛋白质、任一包括编码本文所阐述的任一TCR、多肽或蛋白质的核苷酸序列的核酸或重组表达载体或任一包括编码本文所阐述的任一TCR、多肽或蛋白质的重组载体的宿主细胞或细胞群体，其用于在哺乳动物中诱导针对癌症的免疫反应。
本文所用的术语“治疗”及“预防”以及其源于其的词语未必意味着100％或完全治疗或预防。而是，存在本领域技术人员认为具有潜在益处或治疗效应的不同治疗或预防程度。就此而言，本发明方法可在哺乳动物中提供癌症的任何量的任何水平的治疗或预防。另外，由本发明方法提供的治疗或预防可包含治疗或预防所治疗或预防癌症的一或多种病状或症状。举例而言，治疗或预防可包含促进肿瘤消退。同样，出于本文中的目的，“预防”可涵盖延迟癌症或其症状或病状的发作。替代地或另外，“预防”可涵盖预防或延迟癌症或其症状或病状的发作。
亦提供检测哺乳动物中的癌症的存在的方法。该方法包括(i)使包括一或多种来自哺乳动物的细胞的样品与本文所阐述的任一本发明的TCR、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体或药物组合物接触，由此形成复合物，及检测复合物，其中复合物的检测指示在哺乳动物中存在癌症。
就检测哺乳动物的癌症的本发明方法而言，细胞样品可为包括全细胞、其溶解物或全细胞溶解物的一部分(例如细胞核或细胞质部分、全蛋白部分或核酸部分)的样品。
出于检测癌症的本发明方法的目的，接触可发生于哺乳动物的活体外或活体内。优选地，接触是在活体外进行。
同样，可经由本领域内已知的任一数量方式来检测复合物。举例而言，本文所阐述的本发明的TCR、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞或细胞群体可经可检测标记(例如放射性同位素、荧光团(例如荧光黄异硫氰酸酯(FITC)、藻红素(PE))、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)及元素颗粒(例如金颗粒))标记。
出于施用宿主细胞或细胞群体的本发明方法的目的，细胞可为哺乳动物的同种异体或自体细胞。优选地，细胞对哺乳动物是自体的。
就本发明方法而言，癌症可为任一癌症，包含以下中的任一者：急性淋巴球性癌症、急性骨髓样白血病、肺泡横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳癌、肛门癌、肛管癌或直肠肛门癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、阴道癌、外阴癌、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓样癌症、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、子宫颈癌、胃肠道类癌肿瘤、神经胶质瘤、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、口咽癌、卵巢癌、阴茎癌、胰脏癌、腹膜癌、网膜癌及隔膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睪丸癌、甲状腺癌、子宫癌、输尿管癌及膀胱癌。较佳癌症是胰脏癌、结肠直肠癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌或前列腺癌。优选地，肺癌是肺腺癌，卵巢癌是上皮卵巢癌，且胰脏癌是胰脏腺癌。在本发明的一实施方案中，癌症表达在位置12处的甘氨酸经精氨酸取代的突变人类RAS氨基酸序列，其中突变人类RAS氨基酸序列是突变人类KRAS、突变人类HRAS或突变人类NRAS氨基酸序列，且其中位置12分别参照WT人类KRAS、WT人类HRAS或WT人类NRAS蛋白所定义。由癌症表达的突变人类KRAS、突变人类HRAS及突变人类NRAS可如本文针对本发明的其他方面所阐述。
本发明方法中所提及的哺乳动物可为任一哺乳动物。如本文中所使用，术语“哺乳动物”是指任一哺乳动物，包含(但不限于)啮齿目的哺乳动物(例如小鼠及仓鼠)及兔形目的哺乳动物(例如兔)。优选地，哺乳动物是来自食肉目，包含猫科(猫)及犬科(狗)。更优选地，哺乳动物是来自偶蹄目(包含牛科(牛)及猪科(猪))或奇蹄目(包含马科(马))。最优选地，哺乳动物是灵长目、猿目或猴目(猴)或类人猿目(人类及类人猿)。特别优选的哺乳动物是人类。
下列实施例进一步阐释本发明，但当然不应解释为以任一方式限制其范围。
实施例1
此实施例显示对含有G12R突变且由HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01异二聚体呈递的人类KRAS具有抗原特异性的TCR的分离。
自转移性胰脏癌患者(患者4270)的TIL分离对含有G12R突变且由HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01异二聚体呈递的人类KRAS具有抗原特异性的TCR。自针对KRAS G12R展示特异性识别且针对WT KRAS并不展示特异性识别的TIL来分离TCR。
为对反应性4270TCR进行测序，藉由荧光活化细胞分选(FACS)基于T细胞活化标记物4-1BB的上调来分选反应性TIL。随后，裂解细胞，且对TCR转录物实施桑格测序(Sangersequenced)。4270TCRα及β链可变区的氨基酸序列展示于表5中。对CDR加下划线。
表5
Figure BDA0003174855290000441
实施例2
此实施例证实，经实施例1中所分离4270TCR转导的细胞特异性识别G12R RAS肽。
将编码实施例1的G12R RAS反应性4270TCR且包含经半胱氨酸取代、经LVL修饰的鼠类恒定区的核酸序列克隆至逆转录病毒表达载体中。α链鼠类恒定区包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列，其中位置48处的X是Cys，位置112处的X是Leu，位置114处的X是Ile，且位置115处的X是Val。β链恒定区包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列，其中位置57处的X是Cys。包括RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的接头位于α链恒定区与β链可变区之间。使用逆转录病毒表达载体转导同种异体PBMC。
将转导细胞与经WT RAS肽MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLI(SEQ ID NO:40)或G12RRAS肽MTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLI(SEQ ID NO:39)的连续稀释液脉冲化的自体DC一起共培养过夜。藉由酶联免疫斑点法(ELISpot)评价IFNγ分泌。结果展示于图1中。
如图1中所展示，经4270TCR转导的细胞特异性识别G12R RAS肽。
实施例3
此实施例证实，经实施例1中所分离4270TCR转导的细胞识别呈递于HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01异二聚体的背景中的G12R RAS肽。
使用实施例2的逆转录病毒表达载体以病毒方式转导同种异体PBMC。使用由患者4270表达且展示于图2中的HLA分子中的一者转染靶COS7细胞。然后使用G12R RAS肽MTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLI(SEQ ID NO:39)将经转染COS7细胞脉冲化。将4270TCR转导细胞与经脉冲化、转染的COS7细胞一起共培养过夜。藉由ELISA评价IFNγ分泌。结果展示于图2中。
如图2中所展示，经实施例1中所分离4270TCR转导的细胞特异性识别呈递于HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01异二聚体的背景中的G12R RAS肽。
实施例4
此实施例显示对含有G12R突变且由HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01异二聚体呈递的人类KRAS具有抗原特异性的TCR的分离。
自转移性结肠癌患者(患者4268)的TIL分离对含有G12R突变且由HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01异二聚体呈递的人类KRAS具有抗原特异性的TCR。自针对KRAS G12R展示特异性识别且针对WT KRAS并不展示特异性识别的TIL来分离TCR。
为对反应性4268TCR进行测序，基于T细胞活化标记物4-1BB的上调来对反应性TIL进行FACS分选。随后，裂解细胞，且对TCR转录物实施桑格测序。4268TCRα及β链可变区的氨基酸序列展示于表6中。对CDR加下划线。
表6
Figure BDA0003174855290000461
实施例5
此实施例证实，经实施例4中所分离的4268TCR转导的细胞特异性识别G12R RAS肽。
将编码实施例4的G12R RAS反应性4268TCR且包含经半胱氨酸取代、经LVL修饰的鼠类恒定区的核酸序列克隆至逆转录病毒表达载体中。α链鼠类恒定区包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列，其中位置48处的X是Cys，位置112处的X是Leu，位置114处的X是Ile，且位置115处的X是Val。β链恒定区包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列，其中位置57处的X是Cys。包括RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的接头位于α链恒定区与β链可变区的间。使用逆转录病毒表达载体转导同种异体PBMC。
将经转导细胞与经WT RAS肽MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLI(SEQ ID NO:40)或G12RRAS肽MTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLI(SEQ ID NO:39)的连续稀释液脉冲化的自体DC一起共培养过夜。藉由ELIspot评价IFNγ分泌。结果展示于图3中。
如图3中所展示，经4268TCR转导的细胞特异性识别G12R RAS肽。
实施例6
此实施例证实，经实施例4中所分离的4268TCR转导的细胞识别呈递于HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01异二聚体的背景中的G12R RAS肽。
使用实施例5的逆转录病毒表达载体以病毒方式转导同种异体PBMC。使用由患者4268表达且展示于图4中的HLA分子中的一者转染靶COS7细胞。然后使用G12R RAS肽MTEYKLVVVGARGVGKSALTIQLI(SEQ ID NO:39)将经转染COS7细胞脉冲化。将4268TCR转导细胞与经脉冲化、转染的COS7细胞一起共培养过夜。藉由ELISA评价IFNγ分泌。结果展示于图4中。
如图4中所展示，经实施例4中所分离的4268TCR转导的细胞特异性识别呈递于HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01异二聚体的背景中的G12R RAS肽。
本文所引用的所有参考文献(包含出版物、专利申请及专利)皆以引用方式并入本文中，其并入程度如同每一参考文献个别地且具体地指示为以引用方式并入且其全文陈述于本文中一般。
在阐述本发明的背景中(尤其在下列申请专利范围的背景中)，除非另外指示于本文中或与上下文明显矛盾，否则术语“一个(a及an)”及“所述(the)”及“至少一个”以及类似指示词的使用拟解释为涵盖单数及复数。除非另外指示于本文中或与上下文明显矛盾，否则后接有一或多个物项的清单的术语“至少一个”(例如“A及B中的至少一者”)拟解释为意指一个选自所列示物项的物项(A或B)或所列示物项中的两者或更多者的组合(A及B)。除非另有所述，否则术语“包括(comprising)”、“具有(having)”、“包含(including)”及“含有(containing)”拟解释为开放性术语(即意指“包含(但不限于)”)。除非另外指示于本文中，否则本文中值范围的列举仅意欲用作个别地提及落入该范围内的每一单独值的简写方法，且每一单独值并入本说明书中，如同其个别地列举于本文中一般。除非另外指示于本文中或另外与上下文明显矛盾，否则本文所阐述的所有方法皆可以任一适宜顺序来实施。除非另外主张，否则本文所提供的任何及所有实施例或示例性语言(如(例如))的使用仅意欲更佳地阐释本发明且并不对本发明范围施加限制。本说明书中的任何语言皆不应解释为指示对于本发明实践必不可少的任何未主张要素。
本文阐述本发明的优选实施方案，包含发明人已知用于实施方案本发明的最佳模式。本领域技术人员在阅读前述说明后可明了那些优选实施方案的变化形式。发明人期望本领域技术人员适宜地采用此类变化形式，且发明人期望较本文所具体阐述以其他方式来实践本发明。因此，本发明包含适用法律所允许的随附申请专利范围中所列举的目标物的所有修改及等效物。另外，除非另外指示于本文中或另外与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖其所有可能变化形式中的上述要素的任一组合。
序列表
<110> 美国卫生和人力服务部
<120> 针对含有G12R突变的RAS的HLA第II类限制性T细胞受体
<130> 746666
<150> US 62/795,203
<151> 2019-01-22
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Asp Arg Gly Ser Gln Ser
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Ile Tyr Ser Asn Gly Asp
1 5
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Cys Ala Val Glu Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe
1 5 10
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Asp Phe Gln Ala Thr Thr
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala
1 5
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Cys Ser Ala Ser Asn Arg Leu Ala Val Asn Glu Gln Phe Phe
1 5 10
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Asn Ser Met Phe Asp Tyr
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys
1 5
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Gly Thr Ala Ser Lys Leu Thr Phe
1 5 10 15
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Leu Asn His Asp Ala
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Ser Gln Ile Val Asn Asp
1 5
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Cys Ala Ser Ser Asn Gln Leu Val Thr Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe
1 5 10 15
<210> 13
<211> 132
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser
1 5 10 15
Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu
20 25 30
Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp
35 40 45
Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser
50 55 60
Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly
65 70 75 80
Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu
85 90 95
Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val
100 105 110
Glu Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Ser Val Ile Pro
130
<210> 14
<211> 141
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Ile Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Pro Gly Ser Leu Ala Gly Ser Gly Leu Gly Ala Val Val Ser Gln His
20 25 30
Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly Thr Ser Val Lys Ile Glu Cys
35 40 45
Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe Trp Tyr Arg Gln Phe
50 55 60
Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr Ser Asn Glu Gly Ser Lys
65 70 75 80
Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys Phe Leu Ile Asn His
85 90 95
Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr Ser Ala His Pro Glu
100 105 110
Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Ser Asn Arg Leu Ala Val Asn
115 120 125
Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
130 135 140
<210> 15
<211> 140
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Pro
1 5 10 15
Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln
20 25 30
Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn
35 40 45
Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys
50 55 60
Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys
65 70 75 80
Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala
85 90 95
Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Gly Thr Ala Ser Lys Leu
115 120 125
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Gln Val Thr Leu
130 135 140
<210> 16
<211> 134
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg
20 25 30
Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His
35 40 45
Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Asn Gln Leu Val Thr Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Val
130
<210> 17
<211> 189
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 18
<211> 188
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
180 185
<210> 19
<211> 189
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln His Lys Leu Arg Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu
165 170 175
Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser
180 185
<210> 20
<211> 189
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe Ala Asp Ile Asn Leu Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Met Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp
165 170 175
Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met
180 185
<210> 21
<211> 189
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185
<210> 22
<211> 188
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
180 185
<210> 23
<211> 189
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln His Lys Leu Arg Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu
165 170 175
Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser
180 185
<210> 24
<211> 189
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe Ala Asp Ile Asn Leu Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Met Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp
165 170 175
Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met
180 185
<210> 25
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile
20
<210> 26
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<220>
<221> SITE
<222> (48)..(48)
<223> X是Thr或Cys
<220>
<221> SITE
<222> (112)..(112)
<223> X是Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met或Trp
<220>
<221> SITE
<222> (114)..(114)
<223> X是Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe或Trp
<220>
<221> SITE
<222> (115)..(115)
<223> X是Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met或Trp
<400> 26
Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg
1 5 10 15
Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile
20 25 30
Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Xaa
35 40 45
Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr
65 70 75 80
Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr
85 90 95
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Xaa
100 105 110
Val Xaa Xaa Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
115 120 125
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135
<210> 27
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<220>
<221> SITE
<222> (57)..(57)
<223> X是Ser或Cys
<400> 27
Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Xaa Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys
50 55 60
Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
65 70 75 80
Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
85 90 95
His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro
100 105 110
Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly
115 120 125
Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu
130 135 140
Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser
145 150 155 160
Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
165 170
<210> 28
<211> 137
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 28
Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg
1 5 10 15
Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile
20 25 30
Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr
65 70 75 80
Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr
85 90 95
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser
100 105 110
Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
115 120 125
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135
<210> 29
<211> 173
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 29
Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys
50 55 60
Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
65 70 75 80
Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
85 90 95
His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro
100 105 110
Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly
115 120 125
Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu
130 135 140
Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser
145 150 155 160
Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
165 170
<210> 30
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<220>
<221> SITE
<222> (180)..(180)
<223> X是Thr或Cys
<220>
<221> SITE
<222> (244)..(244)
<223> X是Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met或Trp
<220>
<221> SITE
<222> (246)..(246)
<223> X是Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe或Trp
<220>
<221> SITE
<222> (247)..(247)
<223> X是Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met或Trp
<400> 30
Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser
1 5 10 15
Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu
20 25 30
Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp
35 40 45
Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser
50 55 60
Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly
65 70 75 80
Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu
85 90 95
Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val
100 105 110
Glu Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Ser Val Ile Pro Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu
130 135 140
Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe
145 150 155 160
Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile
165 170 175
Thr Asp Lys Xaa Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn
180 185 190
Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile
195 200 205
Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp
210 215 220
Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe
225 230 235 240
Gln Asn Leu Xaa Val Xaa Xaa Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
245 250 255
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265
<210> 31
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<220>
<221> SITE
<222> (198)..(198)
<223> X是Ser或Cys
<400> 31
Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Ile Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Pro Gly Ser Leu Ala Gly Ser Gly Leu Gly Ala Val Val Ser Gln His
20 25 30
Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly Thr Ser Val Lys Ile Glu Cys
35 40 45
Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe Trp Tyr Arg Gln Phe
50 55 60
Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr Ser Asn Glu Gly Ser Lys
65 70 75 80
Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys Phe Leu Ile Asn His
85 90 95
Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr Ser Ala His Pro Glu
100 105 110
Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Ser Asn Arg Leu Ala Val Asn
115 120 125
Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu
130 135 140
Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala
145 150 155 160
Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly
165 170 175
Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu
180 185 190
Val His Ser Gly Val Xaa Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn
195 200 205
Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp
210 215 220
His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu
225 230 235 240
Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln
245 250 255
Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser
260 265 270
Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile
275 280 285
Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val
290 295 300
Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
305 310
<210> 32
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<220>
<221> SITE
<222> (188)..(188)
<223> X是Thr或Cys
<220>
<221> SITE
<222> (252)..(252)
<223> X是Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met或Trp
<220>
<221> SITE
<222> (254)..(254)
<223> X是Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe或Trp
<220>
<221> SITE
<222> (255)..(255)
<223> X是Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met或Trp
<400> 32
Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Pro
1 5 10 15
Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln
20 25 30
Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn
35 40 45
Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys
50 55 60
Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys
65 70 75 80
Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala
85 90 95
Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Gly Thr Ala Ser Lys Leu
115 120 125
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Gln Val Thr Leu Asp Ile Gln Asn
130 135 140
Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser
145 150 155 160
Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys
165 170 175
Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Xaa Val Leu Asp Met
180 185 190
Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln
195 200 205
Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr
210 215 220
Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe
225 230 235 240
Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Xaa Val Xaa Xaa Leu
245 250 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
260 265 270
Arg Leu Trp Ser Ser
275
<210> 33
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<220>
<221> SITE
<222> (191)..(191)
<223> X是Ser或Cys
<400> 33
Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg
20 25 30
Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His
35 40 45
Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Asn Gln Leu Val Thr Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys
130 135 140
Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Xaa Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser
195 200 205
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe
210 215 220
Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro
225 230 235 240
Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp
245 250 255
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val
260 265 270
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
275 280 285
Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg
290 295 300
Lys Asn Ser
305
<210> 34
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 34
Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser
1 5 10 15
Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu
20 25 30
Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp
35 40 45
Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser
50 55 60
Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly
65 70 75 80
Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu
85 90 95
Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val
100 105 110
Glu Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Ser Val Ile Pro Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu
130 135 140
Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe
145 150 155 160
Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile
165 170 175
Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn
180 185 190
Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile
195 200 205
Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp
210 215 220
Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe
225 230 235 240
Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
245 250 255
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265
<210> 35
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 35
Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Ile Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Pro Gly Ser Leu Ala Gly Ser Gly Leu Gly Ala Val Val Ser Gln His
20 25 30
Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly Thr Ser Val Lys Ile Glu Cys
35 40 45
Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe Trp Tyr Arg Gln Phe
50 55 60
Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr Ser Asn Glu Gly Ser Lys
65 70 75 80
Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys Phe Leu Ile Asn His
85 90 95
Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr Ser Ala His Pro Glu
100 105 110
Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Ser Asn Arg Leu Ala Val Asn
115 120 125
Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu
130 135 140
Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala
145 150 155 160
Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly
165 170 175
Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu
180 185 190
Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn
195 200 205
Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp
210 215 220
His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu
225 230 235 240
Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln
245 250 255
Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser
260 265 270
Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile
275 280 285
Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val
290 295 300
Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
305 310
<210> 36
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 36
Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Pro
1 5 10 15
Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln
20 25 30
Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn
35 40 45
Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys
50 55 60
Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys
65 70 75 80
Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala
85 90 95
Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Gly Thr Ala Ser Lys Leu
115 120 125
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Gln Val Thr Leu Asp Ile Gln Asn
130 135 140
Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser
145 150 155 160
Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys
165 170 175
Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met
180 185 190
Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln
195 200 205
Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr
210 215 220
Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe
225 230 235 240
Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu
245 250 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
260 265 270
Arg Leu Trp Ser Ser
275
<210> 37
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 37
Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg
20 25 30
Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His
35 40 45
Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Asn Gln Leu Val Thr Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys
130 135 140
Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser
195 200 205
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe
210 215 220
Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro
225 230 235 240
Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp
245 250 255
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val
260 265 270
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
275 280 285
Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg
290 295 300
Lys Asn Ser
305
<210> 38
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 38
Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 39
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Arg Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile
20
<210> 40
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile
20
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn Ser Pro Ser
1 5 10 15
Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr
20 25 30
Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu
35 40 45
Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser
65 70 75 80
Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Gly Asn Thr Gly Thr Ala Ser Lys Leu Thr Phe Gly Thr
100 105 110
Gly Thr Arg Leu Gln Val Thr Leu
115 120
<210> 42
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys Glu Gly Gln
1 5 10 15
Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met Tyr
20 25 30
Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser
35 40 45
Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr Ser
50 55 60
Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val Thr Ser Ala
65 70 75 80
Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Asn Gln Leu
85 90 95
Val Thr Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Val
<210> 43
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro
1 5 10 15
Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser
20 25 30
Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu
35 40 45
Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp
65 70 75 80
Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Glu Gly Ala
85 90 95
Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Ile
100 105 110
Pro
<210> 44
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Ala Gly Ser Gly Leu Gly Ala Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val
1 5 10 15
Ile Cys Lys Ser Gly Thr Ser Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp
20 25 30
Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser
35 40 45
Leu Met Leu Met Ala Thr Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu
50 55 60
Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr
65 70 75 80
Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe
85 90 95
Tyr Ile Cys Ser Ala Ser Asn Arg Leu Ala Val Asn Glu Gln Phe Phe
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
115 120
<210> 45
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<220>
<221> SITE
<222> (161)..(161)
<223> X是Thr或Cys
<220>
<221> SITE
<222> (225)..(225)
<223> X是Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met或Trp
<220>
<221> SITE
<222> (227)..(227)
<223> X是Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe或Trp
<220>
<221> SITE
<222> (228)..(228)
<223> X是Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met或Trp
<400> 45
Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro
1 5 10 15
Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser
20 25 30
Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu
35 40 45
Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp
65 70 75 80
Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Glu Gly Ala
85 90 95
Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Ile
100 105 110
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro
115 120 125
Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
130 135 140
Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys
145 150 155 160
Xaa Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile
165 170 175
Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu
180 185 190
Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu
195 200 205
Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu
210 215 220
Xaa Val Xaa Xaa Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn
225 230 235 240
Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245 250
<210> 46
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<220>
<221> SITE
<222> (178)..(178)
<223> X是Ser或Cys
<400> 46
Ala Gly Ser Gly Leu Gly Ala Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val
1 5 10 15
Ile Cys Lys Ser Gly Thr Ser Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp
20 25 30
Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser
35 40 45
Leu Met Leu Met Ala Thr Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu
50 55 60
Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr
65 70 75 80
Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe
85 90 95
Tyr Ile Cys Ser Ala Ser Asn Arg Leu Ala Val Asn Glu Gln Phe Phe
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr
115 120 125
Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn
130 135 140
Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp
145 150 155 160
His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly
165 170 175
Val Xaa Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys
180 185 190
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg
195 200 205
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp
210 215 220
Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala
225 230 235 240
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln
245 250 255
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
260 265 270
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met
275 280 285
Val Lys Arg Lys Asn Ser
290
<210> 47
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<220>
<221> SITE
<222> (168)..(168)
<223> X at position 168是Thr或Cys
<220>
<221> SITE
<222> (232)..(232)
<223> X是Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met或Trp
<220>
<221> SITE
<222> (234)..(234)
<223> X是Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe或Trp
<220>
<221> SITE
<222> (235)..(235)
<223> X是Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met或Trp
<400> 47
Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn Ser Pro Ser
1 5 10 15
Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr
20 25 30
Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu
35 40 45
Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser
65 70 75 80
Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Gly Asn Thr Gly Thr Ala Ser Lys Leu Thr Phe Gly Thr
100 105 110
Gly Thr Arg Leu Gln Val Thr Leu Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala
115 120 125
Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu
130 135 140
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser
145 150 155 160
Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Xaa Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp
165 170 175
Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr
180 185 190
Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp
195 200 205
Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met
210 215 220
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Xaa Val Xaa Xaa Leu Arg Ile Leu Leu
225 230 235 240
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
245 250 255
Ser
<210> 48
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<220>
<221> SITE
<222> (171)..(171)
<223> X是Ser或Cys
<400> 48
Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys Glu Gly Gln
1 5 10 15
Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met Tyr
20 25 30
Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser
35 40 45
Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr Ser
50 55 60
Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val Thr Ser Ala
65 70 75 80
Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Asn Gln Leu
85 90 95
Val Thr Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Val Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe
115 120 125
Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val
130 135 140
Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp
145 150 155 160
Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Xaa Thr Asp Pro Gln Ala
165 170 175
Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val
180 185 190
Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val
195 200 205
Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro
210 215 220
Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp
225 230 235 240
Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr
245 250 255
Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu
260 265 270
Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
275 280 285
<210> 49
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 49
Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro
1 5 10 15
Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser
20 25 30
Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu
35 40 45
Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp
65 70 75 80
Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Glu Gly Ala
85 90 95
Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Ile
100 105 110
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro
115 120 125
Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
130 135 140
Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys
145 150 155 160
Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile
165 170 175
Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu
180 185 190
Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu
195 200 205
Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu
210 215 220
Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn
225 230 235 240
Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245 250
<210> 50
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 50
Ala Gly Ser Gly Leu Gly Ala Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val
1 5 10 15
Ile Cys Lys Ser Gly Thr Ser Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp
20 25 30
Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser
35 40 45
Leu Met Leu Met Ala Thr Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu
50 55 60
Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr
65 70 75 80
Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe
85 90 95
Tyr Ile Cys Ser Ala Ser Asn Arg Leu Ala Val Asn Glu Gln Phe Phe
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr
115 120 125
Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn
130 135 140
Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp
145 150 155 160
His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly
165 170 175
Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys
180 185 190
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg
195 200 205
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp
210 215 220
Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala
225 230 235 240
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln
245 250 255
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
260 265 270
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met
275 280 285
Val Lys Arg Lys Asn Ser
290
<210> 51
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 51
Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn Ser Pro Ser
1 5 10 15
Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr
20 25 30
Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu
35 40 45
Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser
65 70 75 80
Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Gly Asn Thr Gly Thr Ala Ser Lys Leu Thr Phe Gly Thr
100 105 110
Gly Thr Arg Leu Gln Val Thr Leu Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala
115 120 125
Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu
130 135 140
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser
145 150 155 160
Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp
165 170 175
Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr
180 185 190
Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp
195 200 205
Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met
210 215 220
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu
225 230 235 240
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
245 250 255
Ser
<210> 52
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 52
Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys Glu Gly Gln
1 5 10 15
Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met Tyr
20 25 30
Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser
35 40 45
Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr Ser
50 55 60
Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val Thr Ser Ala
65 70 75 80
Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Asn Gln Leu
85 90 95
Val Thr Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Val Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe
115 120 125
Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val
130 135 140
Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp
145 150 155 160
Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala
165 170 175
Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val
180 185 190
Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val
195 200 205
Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro
210 215 220
Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp
225 230 235 240
Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr
245 250 255
Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu
260 265 270
Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
275 280 285

Claims (43)

1.经分离或经纯化的T细胞受体(TCR)，其中所述TCR对于在位置12处甘氨酸经精氨酸取代的突变人类RAS氨基酸序列具有抗原特异性，
其中所述突变人类RAS氨基酸序列是突变人类Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)、突变人类Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)，或突变人类神经母细胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)氨基酸序列，且
其中位置12分别参照野生型人类KRAS蛋白、野生型人类HRAS蛋白或野生型人类NRAS蛋白定义。
2.如权利要求1所述的TCR，其中所述突变人类RAS氨基酸序列是SEQ ID NO:39。
3.如权利要求1或2所述的TCR，其中所述TCR对SEQ ID NO:40的野生型人类RAS氨基酸序列不具有抗原特异性。
4.如权利要求1至3中任一项所述的TCR，其中所述突变人类RAS氨基酸序列由人类白血球抗原(HLA)第II类分子呈递。
5.如权利要求4所述的TCR，其中所述HLA第II类分子是HLA-DR异二聚体或HLA-DQ异二聚体。
6.如权利要求4所述的TCR，其中所述HLA第II类分子是HLA-DRB5:HLA-DRA异二聚体或HLA-DQA1:HLA-DQB1异二聚体。
7.如权利要求4所述的TCR，其中所述HLA第II类分子是HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01异二聚体或HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01异二聚体。
8.如权利要求1至7中任一项所述的TCR，其包括以下氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:1至3的全部，
(b)SEQ ID NO:4至6的全部，
(c)SEQ ID NO:7至9的全部，
(d)SEQ ID NO:10至12的全部，
(e)SEQ ID NO:1至6的全部，或
(f)SEQ ID NO:7至12的全部。
9.如权利要求1至8中任一项所述的TCR，其包括以下氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:13，
(ii)SEQ ID NO:14，
(iii)SEQ ID NO:15，
(iv)SEQ ID NO:16，
(v)SEQ ID NO:13及14二者，
(vi)SEQ ID NO:15及16二者，
(vii)SEQ ID NO:41，
(viii)SEQ ID NO:42，
(ix)SEQ ID NO:43，
(x)SEQ ID NO:44，
(xi)SEQ ID NO:41及42二者，或
(xii)SEQ ID NO:43及44二者。
10.如权利要求1至9中任一项所述的TCR，其进一步包括：
(a)包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的α链恒定区，其中：
(i)SEQ ID NO:26的位置48处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:26的位置112处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:26的位置114处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:26的位置115处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(b)包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的β链恒定区，其中SEQ ID NO:27的位置57处的X是Ser或Cys；或
(c)(a)及(b)二者。
11.如权利要求1至10中任一项所述的经分离或经纯化的TCR，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的α链，其中：
(i)SEQ ID NO:30的位置180处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:30的位置244处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:30的位置246处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:30的位置247处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(b)包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的β链，其中SEQ ID NO:31的位置198处的X是Ser或Cys；
(c)包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的α链，其中：
(i)SEQ ID NO:32的位置188处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:32的位置252处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:32的位置254处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:32的位置255处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(d)包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列的β链，其中SEQ ID NO:33的位置191处的X是Ser或Cys；
(e)(a)及(b)二者；
(f)(c)及(d)二者；
(g)包括SEQ ID NO:45的氨基酸序列的α链，其中：
(i)SEQ ID NO:45的位置161处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:45的位置225处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:45的位置227处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:45的位置228处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(h)包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的β链，其中SEQ ID NO:46的位置178处的X是Ser或Cys；
(i)包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的α链，其中：
(i)SEQ ID NO:47的位置168处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:47的位置232处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:47的位置234处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:47的位置235处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(j)包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的β链，其中SEQ ID NO:48的位置171处的X是Ser或Cys；
(k)(g)及(h)二者；或
(l)(i)及(j)二者。
12.经分离或经纯化的多肽，其包括权利要求1至11中任一项所述的TCR的功能部分，其中所述功能部分包括以下氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:1至3的全部，
(b)SEQ ID NO:4至6的全部，
(c)SEQ ID NO:7至9的全部，
(d)SEQ ID NO:10至12的全部，
(e)SEQ ID NO:1至6的全部，或
(f)SEQ ID NO:7至12的全部。
13.如权利要求12所述的经分离或经纯化的多肽，其中所述功能部分包括以下氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:13，
(ii)SEQ ID NO:14，
(iii)SEQ ID NO:15，
(iv)SEQ ID NO:16，
(v)SEQ ID NO:13及14二者，
(vi)SEQ ID NO:15及16二者，
(vii)SEQ ID NO:41，
(viii)SEQ ID NO:42，
(ix)SEQ ID NO:43，
(x)SEQ ID NO:44，
(xi)SEQ ID NO:41及42二者，或
(xii)SEQ ID NO:43及44二者。
14.如权利要求12或13所述的经分离或经纯化的多肽，其进一步包括：
(a)SEQ ID NO:26的氨基酸序列，其中：
(i)SEQ ID NO:26的位置48处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:26的位置112处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:26的位置114处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:26的位置115处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(b)SEQ ID NO:27的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:27的位置57处的X是Ser或Cys；或
(c)(a)及(b)二者。
15.如权利要求12-14中任一项所述的经分离或经纯化的多肽，其包括：
(a)SEQ ID NO:30的氨基酸序列，其中：
(i)SEQ ID NO:30的位置180处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:30的位置244处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:30的位置246处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:30的位置247处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(b)SEQ ID NO:31的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:31的位置198处的X是Ser或Cys；
(c)SEQ ID NO:32的氨基酸序列，其中：
(i)SEQ ID NO:32的位置188处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:32的位置252处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:32的位置254处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:32的位置255处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(d)SEQ ID NO:33的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:33的位置191处的X是Ser或Cys；
(e)(a)及(b)二者；
(f)(c)及(d)二者；
(g)SEQ ID NO:45的氨基酸序列，其中：
(i)SEQ ID NO:45的位置161处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:45的位置225处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:45的位置227处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:45的位置228处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(h)SEQ ID NO:46的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:46的位置178处的X是Ser或Cys；
(i)SEQ ID NO:47的氨基酸序列，其中：
(i)SEQ ID NO:47的位置168处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:47的位置232处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:47的位置234处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:47的位置235处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(j)SEQ ID NO:48的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:48的位置171处的X是Ser或Cys；
(k)(g)及(h)二者；或
(l)(i)及(j)二者。
16.经分离或经纯化的蛋白质，其包括至少一种如权利要求12至15中任一项所述的多肽。
17.如权利要求16所述的经分离或经纯化的蛋白质，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:1至3的氨基酸序列的第一多肽链及包括SEQ ID NO:4至6的氨基酸序列的第二多肽链；或
(b)包括SEQ ID NO:7至9的氨基酸序列的第一多肽链及包括SEQ ID NO:10至12的氨基酸序列的第二多肽链。
18.如权利要求16或17所述的经分离或经纯化的蛋白质，其包括：
(i)包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第一多肽链及包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第二多肽链；
(ii)包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的第一多肽链及包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的第二多肽链；
(iii)包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列的第一多肽链及包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第二多肽链；或
(iv)包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第一多肽链及包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的第二多肽链。
19.如权利要求16至18中任一项所述的经分离或经纯化的蛋白质，其进一步包括：
(a)包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的第一多肽链，其中：
(i)SEQ ID NO:26的位置48处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:26的位置112处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:26的位置114处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:26的位置115处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(b)包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的第二多肽链，其中SEQ ID NO:27的位置57处的X是Ser或Cys；或
(c)(a)及(b)二者。
20.如权利要求16至19中任一项所述的经分离或经纯化的蛋白质，其包括：
(a)包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的第一多肽链，其中：
(i)SEQ ID NO:30的位置180处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:30的位置244处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:30的位置246处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:30的位置247处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(b)包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的第二多肽链，其中SEQ ID NO:31的位置198处的X是Ser或Cys；
(c)包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的第一多肽链，其中：
(i)SEQ ID NO:32的位置188处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:32的位置252处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:32的位置254处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:32的位置255处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(d)包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列的第二多肽链，其中SEQ ID NO:33的位置191处的X是Ser或Cys；
(e)(a)及(b)二者；
(f)(c)及(d)二者；
(g)包括SEQ ID NO:45的氨基酸序列的第一多肽链，其中：
(i)SEQ ID NO:45的位置161处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:45的位置225处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:45的位置227处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:45的位置228处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(h)包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的第二多肽链，其中SEQ ID NO:46的位置178处的X是Ser或Cys；
(i)包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的第一多肽链，其中：
(i)SEQ ID NO:47的位置168处的X是Thr或Cys；
(ii)SEQ ID NO:47的位置232处的X是Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)SEQ ID NO:47的位置234处的X是Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且
(iv)SEQ ID NO:47的位置235处的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(j)包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的第二多肽链，其中SEQ ID NO:48的位置171处的X是Ser或Cys；
(k)(g)及(h)二者；或
(l)(i)及(j)二者。
21.经分离或经纯化的核酸，其包括编码如权利要求1至11中任一项所述的TCR、如权利要求12至15中任一项所述的多肽或如权利要求16至20中任一项所述的蛋白质的核苷酸序列。
22.经分离或经纯化的核酸，其自5’至3’包括第一核酸序列及第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列及所述第二核苷酸序列分别编码以下氨基酸序列：SEQ ID NO:13及14；14及13；15及16；16及15；30及31；31及30；32及33；33及32；34及35；35及34；36及37；37及36；41及42；42及41；43及44；44及43；45及46；46及45；47及48；48及47；49及50；50及49；51及52；或52及51。
23.如权利要求22所述的经分离或经纯化的核酸，其进一步包括插入所述第一核苷酸序列及所述第二核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列编码可裂解接头肽。
24.如权利要求23所述的经分离或经纯化的核酸，其中所述可裂解接头肽包括SEQ IDNO:38的氨基酸序列。
25.重组表达载体，其包括如权利要求21至24中任一项所述的核酸。
26.如权利要求25的重组表达载体，其是转座子或慢病毒载体。
27.经分离或经纯化的TCR、多肽或蛋白质，其是由如权利要求21至24中任一项所述的核酸或如权利要求25或26所述的载体编码。
28.经分离或经纯化的TCR、多肽或蛋白质，其是由如权利要求21至24中任一项所述的核酸或如权利要求25或26所述的载体在细胞中表达产生。
29.产生表达对SEQ ID NO:39的肽具有抗原特异性的TCR的宿主细胞的方法，所述方法包括使细胞与如权利要求25或26所述的载体在容许所述载体引入所述细胞中的条件下接触。
30.经分离或经纯化的宿主细胞，其包括如权利要求21至24中任一项所述的核酸或如权利要求25或26所述的重组表达载体。
31.如权利要求30所述的宿主细胞，其中所述细胞系人类淋巴球。
32.如权利要求30或31所述的宿主细胞，其中所述细胞选自T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、不变的自然杀伤T(iNKT)细胞，及自然杀伤(NK)细胞。
33.经分离或经纯化的细胞群体，其包括如权利要求30至32中任一项所述的宿主细胞。
34.产生如权利要求1至11、27或28中任一项所述的TCR、如权利要求12至15、27或28中任一项所述的多肽或如权利要求16至20、27或28中任一项所述的蛋白质的方法，所述方法包括培养如权利要求30至32中任一项所述的宿主细胞或如权利要求33的宿主细胞群体，从而产生所述TCR、所述多肽或所述蛋白质。
35.药物组合物，其包括(a)如权利要求1至11、27或28中任一项所述的TCR、如权利要求12至15、27或28中任一项所述的多肽或如权利要求16至20、27或28中任一项所述的蛋白质、如权利要求21至24中任一项所述的核酸、如权利要求25或26所述的重组表达载体、如权利要求30至32中任一项所述的宿主细胞或如权利要求33所述的细胞群体，及(b)药学上可接受的载剂。
36.检测哺乳动物中癌症存在的方法，所述方法包括：
(a)使包括癌细胞的样品与如权利要求1至11、27或28中任一项所述的TCR、如权利要求12至15、27或28中任一项所述的多肽或如权利要求16至20、27或28中任一项所述的蛋白质、如权利要求21至24中任一项所述的核酸、如权利要求25或26所述的重组表达载体、如权利要求30至32中任一项所述的宿主细胞、如权利要求33所述的细胞群体或如权利要求35的药物组合物接触，由此形成复合物；及
(b)检测所述复合物，
其中检测到所述复合物指示所述哺乳动物中存在癌症。
37.如权利要求1至11、27或28中任一项所述的TCR、如权利要求12至15、27或28中任一项所述的多肽或如权利要求16至20、27或28中任一项所述的蛋白质、如权利要求21至24中任一项所述的核酸、如权利要求25或26所述的重组表达载体、如权利要求30至32中任一项所述的宿主细胞、如权利要求33所述的细胞群体或如权利要求35的药物组合物，其用于诱导对哺乳动物的癌症的免疫反应的用途中。
38.如权利要求1至11、27或28中任一项所述的TCR、如权利要求12至15、27或28中任一项所述的多肽或如权利要求16至20、27或28中任一项所述的蛋白质、如权利要求21至24中任一项所述的核酸、如权利要求25或26所述的重组表达载体、如权利要求30至32中任一项所述的宿主细胞、如权利要求33所述的细胞群体或如权利要求35的药物组合物，其用于治疗或预防哺乳动物的癌症的用途中。
39.如权利要求36所述的方法或用于权利要求37或38所述用途的TCR、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体或药物组合物，其中所述癌症表达在位置12处的甘氨酸经精氨酸取代的突变人类RAS氨基酸序列，
其中所述突变人类RAS氨基酸序列是突变人类Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)、突变人类Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)或突变人类神经母细胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)氨基酸序列，且
其中位置12分别参照野生型人类KRAS蛋白、野生型人类HRAS蛋白或野生型人类NRAS蛋白定义。
40.如权利要求39所述的方法或用于权利要求39所述用途的TCR、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体或药物组合物，其中所述突变人类RAS氨基酸序列是突变人类Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)氨基酸序列。
41.如权利要求39所述的方法或用于权利要求39所述用途的TCR、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体或药物组合物，其中所述突变人类RAS氨基酸序列是突变人类神经母细胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)氨基酸序列。
42.如权利要求39所述的方法或用于权利要求39所述用途的TCR、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体或药物组合物，其中所述突变人类RAS氨基酸序列是突变人类Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)氨基酸序列。
43.如权利要求36和39至42中任一项所述的方法或用于权利要求38至42中任一项所述用途的TCR、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体或药物组合物，其中所述癌症是胰脏癌、结肠直肠癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌或前列腺癌。
CN202080010373.0A 2019-01-22 2020-01-21 针对含有g12r突变的ras的hla第ii类限制性t细胞受体 Pending CN113412277A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962795203P 2019-01-22 2019-01-22
US62/795,203 2019-01-22
PCT/US2020/014382 WO2020154275A1 (en) 2019-01-22 2020-01-21 Hla class ii-restricted t cell receptors against ras with g12r mutation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113412277A true CN113412277A (zh) 2021-09-17

Family

ID=69591774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080010373.0A Pending CN113412277A (zh) 2019-01-22 2020-01-21 针对含有g12r突变的ras的hla第ii类限制性t细胞受体

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220089673A1 (zh)
EP (1) EP3914612A1 (zh)
JP (1) JP2022523024A (zh)
KR (1) KR20210118865A (zh)
CN (1) CN113412277A (zh)
AU (1) AU2020211922A1 (zh)
CA (1) CA3127096A1 (zh)
TW (1) TW202043262A (zh)
WO (1) WO2020154275A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022183167A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 Alaunos Therapeutics, Inc. Recombinant vectors comprising polycistronic expression cassettes and methods of use thereof
WO2023150562A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Alaunos Therapeutics, Inc. Methods for activation and expansion of t cells

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017048593A1 (en) * 2015-09-15 2017-03-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell receptors recognizing hla-cw8 restricted mutated kras
CN107223134A (zh) * 2014-11-26 2017-09-29 美国卫生和人力服务部 抗突变的kras的t细胞受体
CN108264550A (zh) * 2017-01-04 2018-07-10 广东香雪精准医疗技术有限公司 一种识别源自于prame抗原短肽的tcr
CN108395479A (zh) * 2017-02-06 2018-08-14 高军 一种有关kras基因突变的t细胞受体

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004021995A2 (en) 2002-09-06 2004-03-18 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Departement Of Health And Human Services Immunotherapy with in vitro-selected antigen-specific lymphocytes after nonmyeloablative lymphodepleting chemotherapy
US8383099B2 (en) 2009-08-28 2013-02-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adoptive cell therapy with young T cells
US20120244133A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Methods of growing tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable containers
DE102016115246C5 (de) * 2016-08-17 2018-12-20 Immatics Biotechnologies Gmbh Neue t-zellrezeptoren und deren verwendung in immuntherapie

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107223134A (zh) * 2014-11-26 2017-09-29 美国卫生和人力服务部 抗突变的kras的t细胞受体
US20170304421A1 (en) * 2014-11-26 2017-10-26 The United States of America, as represented by the Secretary, Dep. of Health and Human Services Anti-mutated kras t cell receptors
WO2017048593A1 (en) * 2015-09-15 2017-03-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell receptors recognizing hla-cw8 restricted mutated kras
CN108264550A (zh) * 2017-01-04 2018-07-10 广东香雪精准医疗技术有限公司 一种识别源自于prame抗原短肽的tcr
CN108395479A (zh) * 2017-02-06 2018-08-14 高军 一种有关kras基因突变的t细胞受体

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020154275A1 (en) 2020-07-30
JP2022523024A (ja) 2022-04-21
KR20210118865A (ko) 2021-10-01
CA3127096A1 (en) 2020-07-30
US20220089673A1 (en) 2022-03-24
EP3914612A1 (en) 2021-12-01
AU2020211922A1 (en) 2021-08-12
TW202043262A (zh) 2020-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11466071B2 (en) HLA class I-restricted t cell receptors against mutated RAS
JP7256794B2 (ja) 変異型ｒａｓに対するｈｌａクラスｉｉ拘束性ｔ細胞受容体
US20230159614A1 (en) Hla class ii-restricted t cell receptors against ras with g12v mutation
US20230080742A1 (en) Hla class i-restricted t cell receptors against ras with g12d mutation
CA3116749A1 (en) Hla-a3-restricted t cell receptors against mutated ras
US20220089673A1 (en) Hla class ii-restricted t cell receptors against ras with g12r mutation
US20230257440A1 (en) Hla class ii-restricted drb t cell receptors against ras with g12v mutation
CN116322734A (zh) 针对具有g12d突变的ras的hla ii类限制性drb t细胞受体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40060095

Country of ref document: HK